FR2523155A1 - High yield prodn. of human T-cell growth factor - with human cells multiplied in non-human animal - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne un procédé pour la production d'un Facteur de Croissance des Cellules T humaines, ci-après désigné en abrégé par FCCTh. The present invention relates to a process for the production of a Human T Cell Growth Factor, hereinafter abbreviated as FCCTh.
FCCTh est une substance protéinique, de type hormonal, habituellement préparée à partir du sérum humain, qui stimule la croissance des cellules T, et se range en conséquence dans une famille des activités stimulantes de la multiplication, humaines. Les cellules T sont des lymphocytes qui jouent un rôle important dans l'immunité cellulaire in vivo, par exemple dans l'hypersensibilité à retardement et l'immunité antitumorale. FCCTh is a proteinaceous substance, hormonal type, usually prepared from human serum, which stimulates the growth of T cells, and is therefore classified in a family of stimulatory activities of multiplication, human. T cells are lymphocytes which play an important role in cellular immunity in vivo, for example in delayed hypersensitivity and anti-tumor immunity.
Comme le FCCTh stimule la croissance de ces cellules T et les active, elle constitue une possibilité intéressante pour l'étude thérapeutique et l'immunothérapie de maladies humaines comme l'asthme et les tumeurs malignes, en plus de son utilisation courante comme activeur de croissance in vitro des cellules T ; aussi espère-t-on beaucoup de la possibilité d'une production en masse du FCCTh.As the FCCTh stimulates the growth of these T cells and activates them, it constitutes an interesting possibility for the therapeutic study and immunotherapy of human diseases such as asthma and malignant tumors, in addition to its current use as a growth activator. in vitro T cells; so there is much hope for the possibility of mass production of the FCCTh.
Comme décrit par Hisashi Narimatsu dans The Metabolism, Vol.As described by Hisashi Narimatsu in The Metabolism, Vol.
17, pp. 2063-2077 (1980), "T-cell Growth Factor (TCGF) and its Applications", ce facteur (FCCT) est également appelé "Interleukin" et n'esfpas spécifique d'une espèce. Bien que ce fait suggère que l'on puisse utiliser un FCCT provenant d'une origine cellulaire animale au lieu de FCCTh, une telle substitution présente le danger de provoquer une réaction indésirable antigbne- anticorps, par exemple un choc anaphylactique. Il s'ensuit qu'il est préférable d'utiliser, pour le traitement des maladies humaines, du
FCCTh provenant de cellules humaines vivantes, pour des raisons de sécurité, car il n'y a alors pas de danger de provoquer une immunoréaction indésirable.Bien que l'on sache que le sérum humain constitue une bonne source pour la production de FCCTh, il est très difficile d'avoir un apport suffisant en sérum humain à bas prix, car on n'obtient ce dernier que par séparation à partir de sang humain frais, t sa conservation s'avère difficile. 17, pp. 2063-2077 (1980), "T-cell Growth Factor (TCGF) and its Applications", this factor (FCCT) is also called "Interleukin" and is not species specific. Although this fact suggests that FCCT from animal cell origin can be used instead of FCCTh, such substitution has the danger of causing an antigen-antibody adverse reaction, for example anaphylactic shock. It follows that it is preferable to use, for the treatment of human diseases,
FCCTh from living human cells, for safety reasons, as there is no danger of causing an adverse immunoreaction. Although it is known that human serum is a good source for the production of FCCTh, It is very difficult to have an adequate supply of human serum at a low price, because the latter is only obtained by separation from fresh human blood, t its conservation proves difficult.
Pour toutes ces raisons, on n'a pu réaliser à ce jour une production à l'échelle industrielle de FCCTh, en quantité suffisante pour satisfaire les besoins des traitements prophylactiques et thérapeutiques des maladies humaines.For all these reasons, it has not been possible to date to produce on an industrial scale FCCTh, in sufficient quantity to meet the needs of prophylactic and therapeutic treatments of human diseases.
La demanderesse a étudié des procédés pour la production de FCCTh facilement réalisable à l'échelle industrielle. Ces efforts ont conduit à la découverte inattendue que la production de FCCTh obtenue, lors de la multiplication des cellules humaines dans un animal à sang chaud, était bien supérieure, environ 2 à 10 fois supérieure et même plus, à la production obtenue à l'aide de cellules humaines multipliées par un procédé de culture de tissu in vitro.En particulier, l'invention concerne un procédé amélioré pour la production de FCCTh, caractérisé en ce qu'on transplante des cellules humaines capables de produire FCCTh dans un animal à sang chaud, ou bien dans un dispositif alimenté par le fluide nutritif corporel d' un animal à sang chaud, on laisse se multiplier les cellules dans l'animal ou le dispositif, et on laisse le
FCCTh se libérer dans les cellules ainsi multipliées.The Applicant has studied processes for the production of FCCTh which is easily achievable on an industrial scale. These efforts led to the unexpected discovery that the production of FCCTh obtained, when human cells multiplied in a warm-blooded animal, was much higher, about 2 to 10 times higher and even more, than the production obtained at using human cells multiplied by a tissue culture method in vitro. In particular, the invention relates to an improved method for producing FCCTh, characterized in that human cells capable of producing FCCTh are transplanted into a blood animal. warm, or in a device supplied with the nutritive body fluid of a warm-blooded animal, the cells are allowed to multiply in the animal or the device, and the
FCCTh is released in cells thus multiplied.
Le procédé selon l'invention, tout en fournissant une grande quantité de FCCTh, ne nécessite que peu ou pas de milieu nutritif contenant du sérum coûteux, et rend plus facile le maintien du milieu de culture pendant la multiplication cellulaire, que dans le cas de la culture de tissu in vitro ; on peut aisément réaliser une multiplication efficace des cellules humaines, capables de produire du FCCTh, par transplantation directe de ces cellules dans un animal à sang chaud, ou bien en plaçant ces cellules dans une chambre de diffusion de type classique, conçue pour recevoir le fluide corporel nutritif de l'animal alimenté de manière habituelle. The method according to the invention, while providing a large amount of FCCTh, requires little or no nutrient medium containing expensive serum, and makes it easier to maintain the culture medium during cell multiplication, than in the case of tissue culture in vitro; one can easily achieve an efficient multiplication of human cells, capable of producing FCCTh, by direct transplantation of these cells in a warm-blooded animal, or by placing these cells in a diffusion chamber of conventional type, designed to receive the fluid nutritious body of the animal fed in the usual way.
En outre, le procédé selon l'invention permet une multiplication cellulaire plus stable et plus abondante et une production accrue de FCCTh par cellule, par rapport à la cul ture de tissu in vitro.In addition, the method according to the invention allows more stable and abundant cell multiplication and increased production of FCCTh per cell, compared to tissue culture in vitro.
Les cellules humaines, utilisables selon l'invention, sont les cellules capables de produire du FCCTh et de Sultiplier dans un animal à sang chaud, lorsqu'on les y transplante : conviennent par exemple des cellules humaines normales, comme celles du sang périphérique, de la rate et des amygdales ; des cellules de carcinome humain comme celles du carcinome du foie ou du poumon, et de l'abcès tonsillaire t ainsi que des lignées de cellules établies des cellules ci-dessus. Les lignées de cellules établies peuvent être choisies à partir de KS-5, MOLT-3, MT-1, Mono-1 et OUMS-19, comme décrit par exemple dans The Tissue Culture, Vol. 6, pp. 527-546 (1980).En particulier, -l'utilisation d'une lignée de cellules humaines établies, qui peut être aisément soumise à un repiquage, dans laquelle peut être introduit un gène codant une production élevée de FCCTh, au moyen d'une technique de fusion cellulaire utilisant du polyéthylène glycol ou du virus de Sendar, ou par une technique de recombinaison gé nétique utilisant la ligase, enzyme de restriction et 1'
ADN polymérase, aboutit avantageusement à un taux de multiplication cellulaire supérieur, et à une production plus élevée de FCCTh par cellule, c'est-à-dire environ 2 à 10 fois supérieure, ou même plus.En outre, comme la transplantation de cette lignée de cellules humaines dans un animal à sang chaud conduit à la formation d'une tumeur massive, qui peut être facilement désagrégée et n'est guère mélangée à des cellules de l'hôte animal, on peut facilement récolter les cellules humaines vivantes, multipliées.Human cells, which can be used according to the invention, are cells capable of producing FCCTh and of multiplying in a warm-blooded animal, when they are transplanted there: suitable, for example, normal human cells, such as those of peripheral blood, the spleen and tonsils; human carcinoma cells such as those of liver or lung carcinoma, and tonsillary abscess as well as established cell lines of the above cells. The established cell lines can be chosen from KS-5, MOLT-3, MT-1, Mono-1 and OUMS-19, as described for example in The Tissue Culture, Vol. 6, pp. 527-546 (1980). In particular, the use of an established human cell line, which can be easily subcultured, into which can be introduced a gene encoding a high production of FCCTh, by means of a cell fusion technique using polyethylene glycol or Sendar virus, or by a genetic recombination technique using ligase, restriction enzyme and 1 '
DNA polymerase, advantageously results in a higher cell multiplication rate, and in a higher production of FCCTh per cell, that is to say approximately 2 to 10 times higher, or even more. In addition, as the transplantation of this human cell line in a warm-blooded animal leads to the formation of a massive tumor, which can be easily disaggregated and is hardly mixed with animal host cells, living, multiplied human cells can easily be harvested .
A ces fins, on utilise avantageusement des lignées de lym phoblastoldes humains, dérivéeide leucémie humaine ou de lymphome malin humain, par exemple Namalwa, BALL-1, NALL-1,
TALL-1 et JBL.For these purposes, it is advantageous to use lines of human phoblastold lym, derivative of human leukemia or of human malignant lymphoma, for example Namalwa, BALL-1, NALL-1,
TALL-1 and JBL.
Comme animaux à sang chaud, utilisables dans le procédé suivant l'invention, on peut prendre tout animal pourvu que les cellules humaines se développent dans son organisme. Par exemple, on peut employer avantageusement des volailles, telles que poulets ou pigeons, et des mam misères comme chien, chat, singe, chèvre, porc, vache, cheval, lapin, cobaye, rat, hamster, souris ou souris nue. As warm-blooded animals, which can be used in the process according to the invention, any animal can be taken provided that human cells develop in its organism. For example, it is advantageous to use poultry, such as chickens or pigeons, and miserable mothers such as dog, cat, monkey, goat, pig, cow, horse, rabbit, guinea pig, rat, hamster, mouse or naked mouse.
Comme la transplantation des cellules humaines à l'animal provoque une réaction immunitaire indésirable, l'emploi d' un animal très jeune, nouveau-né ou au stade le plus précoce possible, par exemple d'oeuf, d'embryon ou de foetus, est souhaitable. Pour réduire autant que possible la réaction immunitaire, on peut traiter l'animal, avant la transplantation cellulaire, par irradiation avec des rayons
X ou Y à raison d'environ 200 à 600 rems, ou par injection d'un antisérum ou d'un agent immunosuppresseur. Comme la souris nue, lorsqu'on l'utilise comme animal hôte, présente une réaction immunitaire plus faible, même à l'état adulte, on peut de façon pratique lui transplanter des lignées cellulaires humaines établies, pour qu'elles se multiplient rapidement,sans qu'un prétraitement soit nécessaire.As the transplantation of human cells into the animal causes an undesirable immune reaction, the use of a very young animal, newborn or at the earliest possible stage, for example of egg, embryo or fetus, is desirable. To reduce the immune reaction as much as possible, the animal can be treated, before cell transplantation, by radiation with rays
X or Y at a rate of approximately 200 to 600 rems, or by injection of an antiserum or an immunosuppressive agent. Since the naked mouse, when used as a host animal, exhibits a weaker immune response, even in adulthood, it is practical to transplant established human cell lines to it, so that they multiply rapidly, without the need for pre-treatment.
On peut effectuer la multiplication cellulaire, stabilisée, et l'accroissement de la production de FCCTh par transplantation répétée avec une combinaison de diff4- rents animaux à sang chaud ; par exemple on peut atteindre les objectifs visés, en implantant d'abord les cellules humaines à des hamsters, pour qu'elles se multiplient, puis
multipliées en réimplantant ces cellules des souris nues. La transplan- tation répétée peut avoir lieu avec des animaux à sang chaud de la même classe, du même groupe, de la même espèce ou du même genre.Stabilized cell multiplication and increased FCCTh production can be achieved by repeated transplantation with a combination of different warm-blooded animals; for example we can achieve the objectives, by first implanting human cells in hamsters, so that they multiply, then
multiplied by re-implanting these cells from naked mice. Repeated transplantation can take place with warm-blooded animals of the same class, the same group, the same species or the same genus.
On peut implanter les cellules humaines en un site quelconque de l'animal, pourvu qu'elles s'y multiplient : par exemple, on peut effectuer l'implantation dans la cavité allantorque, par voie intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée. Human cells can be implanted in any site of the animal, provided that they multiply there: for example, implantation can be carried out in the allantoic cavity, intravenously, intraperitoneally or subcutaneously.
En dehors de la transplantation cellulaire directe, décrite, on peut faire se multiplier facilement des li gonzes cellulaires humaines, établies par inclusion, par exemple par voie intrapéritonéale, dans l'organisme d'un animal, d'une chambre de diffusion classique, de forme et de taille appropriées, munie d'une membrane filtrante poreuse, d'un ultrafiltre ou de fibres creuses ayant des pores d'environ 10 7 à 10 5 m de diamètre, empêchant la contamination de la chambre par les cellules de l'animal hôte et permettant l'apport du liquide nutritif de l'organisme de l'animal aux cellules.De plus, la chambre de diffusion peut, s'il le faut, être conçue pour être placée par exemple sur le corps de l'animal hôte, rendre possible la circulation du liquide de l'organisme de l'animal dans la chambre, permettre l'observation des cellules humaines contenues dans la chambre par une ou plusieurs fenêtres latérales, transparentes, dont sont munies une ou plusieurs parois de la chambre et permettre l'échange rapide de cette chambre avec une chambre neuve ; la multiplication cellulaire peut ainsi être poursuivie pendant la durée de vie de l'animal, sans qu'il soit nécessaire de sacrifier celui-ci et avec accroissement de la production cellulaire par hôte.De plus, par l'utilisation d'une telle chambre de diffusion, l'absence de contact direct des cellules humaines transplantées avec les cellules de l'animal hôte, a pour résultat de ne pas provoquer de réaction immunitaire, si bien que l'on peut employer divers animaux à sang chaud, comme hôtes, sans avoir à effectuer un prétraitement pour réduire leurs réactions immunitaires, et l'on peut recueillir facilement les cellules humaines multipliées. Apart from the direct cell transplantation described, it is possible to easily multiply human cell ligands, established by inclusion, for example intraperitoneally, in the organism of an animal, of a conventional diffusion chamber, of appropriate shape and size, provided with a porous filter membrane, an ultrafilter or hollow fibers having pores of about 10 7 to 10 5 m in diameter, preventing contamination of the chamber by animal cells host and allowing the supply of nutrient liquid from the animal's body to the cells. In addition, the diffusion chamber can, if necessary, be designed to be placed for example on the body of the host animal. , make possible the circulation of the liquid of the organism of the animal in the room, allow the observation of the human cells contained in the room by one or more side windows, transparent, which are provided with one or more walls of the room and allow l 'rapid exchange of this room with a new room; cell multiplication can thus be continued during the lifespan of the animal, without it being necessary to sacrifice the latter and with an increase in cell production per host. In addition, by the use of such a chamber diffusion, the absence of direct contact of the transplanted human cells with the cells of the host animal, results in not causing an immune reaction, so that various warm-blooded animals can be used as hosts, without having to perform a pretreatment to reduce their immune reactions, and one can easily collect multiplied human cells.
On peut alimenter l'animal hôte de façon classique, même après la transplantation cellulaire, et aucun soin particulier n'est nécessaire. The host animal can be fed conventionally, even after cell transplantation, and no special care is required.
La multiplication des cellules atteint gdnérale- ment un maximum 1 à 20 semaines après la transplantation. Cell multiplication generally reaches a maximum 1 to 20 weeks after transplantation.
Lorsque la lignée de cellules humaines, transplantées à 1' animal hôte, est une lignée de cellules tumorales ou lym phoblastoide établie, on peut obtenir la multiplication cellulaire maximale 1 à 5 semaines après la transplantation, par suite de la multiplication extrêmement intense de ces cellules. When the human cell line, transplanted to the host animal, is an established tumor cell or lym phoblastoid cell, maximum cell multiplication can be obtained 1 to 5 weeks after transplantation, due to the extremely intense multiplication of these cells .
Selon le procédé de l'invention, le nombre de cellules humaines, obtenues par hôte, est d'environ 107 à 1012 ou plus. En d'autres termes, le nombre de cellules humaines, transplantées à l'animal, s'accroît d'environ 102 à 107 fois ou plus : cela représente environ 10 à 106 fois plus par rapport à ce que l'on obtient par la méthode de culture in vitro. Les cellules humaines obtenues peuvent donc être avantageusement utilisées pour la production en masse de FCCTh, conformément à l'invention. According to the method of the invention, the number of human cells obtained per host is approximately 107 to 1012 or more. In other words, the number of human cells transplanted to the animal increases by approximately 102 to 107 times or more: this represents approximately 10 to 106 times more compared to what is obtained by in vitro culture method. The human cells obtained can therefore be advantageously used for the mass production of FCCTh, in accordance with the invention.
Pour laisser les cellules humaines, libérer FCCTh, on peut appliquer tout procédé conduisant à la libération de cette substance par les cellules. Par exemple, on met en suspension dans un milieu nutritif préchauffé entre 20 à 400C environ des cellules humaines, obtenues par multiplication en suspension dans le liquide d'ascite et récolte dans ce liquide, ou par extraction d'une tumeur massive, formée sous la peau, puis récolte après désagrégation de la tumeur, pour obtenir une concentration cellulaire d' environ 104 à 108 cellules/ml ; on met ensuite à incuber à même température pour produire le FCCTh. To let the human cells release FCCTh, any process leading to the release of this substance by the cells can be applied. For example, human cells are suspended in a nutritious medium preheated between 20 to 400C, obtained by multiplication suspended in the ascites liquid and harvested in this liquid, or by extraction of a massive tumor, formed under the skin, then harvest after disintegration of the tumor, to obtain a cell concentration of approximately 104 to 108 cells / ml; then incubated at the same temperature to produce the FCCTh.
Au cours de l'incubation, le milieu nutritif peut être, si nécessaire, additionné avec un inducteur de
FCCTh. Conviennent comme inducteurs de FCCTh les inducteurs qui suscitent la production de FCCTh par les cellules humaines multipliées dans le corps d'un animal à sang chaud ; on peut utiliser des inducteurs classiques, par exemple des mitogènes comme phytohémoagglutinine, concanavaline A, lipopolysaccharide, bactérie, virus, acide nucléique, polynucléotide, ou un mitogène végétal ("pokeweed").During the incubation, the nutritive medium can be, if necessary, added with an inducer of
FCCTh. Suitable inducers of FCCTh are inducers which induce the production of FCCTh by human cells multiplied in the body of a warm-blooded animal; conventional inducers can be used, for example mitogens such as phytohemoagglutinin, concanavalin A, lipopolysaccharide, bacteria, virus, nucleic acid, polynucleotide, or a plant mitogen ("pokeweed").
Le milieu de culture peut également, pendant la production de FCCTh, être additionné avec un agent'de stabilisation du FCCTh formé, qui augmente encore la production de celui-ci. The culture medium can also, during the production of FCCTh, be added with an agent for stabilizing the FCCTh formed, which further increases the production thereof.
On peut facilement recueillir FCCTh, ainsi obtenu, par des techniques de purification et de séparation utilisant des opérations classiques, telles que relargage, dialyse, filtration, centrifugation, concentration et lyo philisation. Si l'on désire une préparation plus purifiée, on peut y arriver en combinant les opérations précitées avec une ou plusieurs autres, telles qu'adsorption et désorption, avec échange d'ions, filtration sur gel, chromatographie par affinité, fractionnement au point isoélectrique et/ou électrophorèse. One can easily collect FCCTh, thus obtained, by purification and separation techniques using conventional operations, such as salting out, dialysis, filtration, centrifugation, concentration and lyophilization. If a more purified preparation is desired, this can be achieved by combining the above operations with one or more others, such as adsorption and desorption, with ion exchange, gel filtration, affinity chromatography, isoelectric point fractionation and / or electrophoresis.
La préparation de FCCTh, ainsi obtenue, est identique du point de vue immunologique à celles que l'on obtient à partir du sérum humain par des procédés classiques; elle n'est pas contaminée par le virus de l'hépatite et/ou des pyrogènes. Donc on peut utiliser la préparation de fa çon avantageuse, isolément ou en combinaison avec un ou plusieurs agents, par exemple vitamine, hormone ou agent carcinostatique, par administration par voie interne ou injection pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de diverses maladies humaines. The preparation of FCCTh, thus obtained, is identical from the immunological point of view to that which is obtained from human serum by conventional methods; it is not contaminated by the hepatitis virus and / or pyrogens. The preparation can therefore be used advantageously, alone or in combination with one or more agents, for example vitamin, hormone or carcinostatic agent, by internal administration or injection for the prophylactic and / or therapeutic treatment of various human diseases.
Dans la présente description, les titres de FCCTh sont déterminés par une modification de l'essai d'incorporation de thymidine (3H), exposé antérieurement par S,
Gillis et coll. dans J. Immunology, Vol. 120, pp. 2027-2932 (1978) : on place des cellules de thymus de souris BALB/c sur des microplaques de manière à avoir une concentration de 100 /litres (105 cellules) par creux, puis on addition ne ces microplaques avec 100 < litres de solutions de
FCCTh diluées en série ; on met ensuite à incuber ces mélanges à 370C pendant 2 jours. Puis onájoute aux micropla ques O,5 o i de thymidine (3H) par creux, et 4 heures après cette incorporation on mesure, à l'aide d'un compteur de scintillation liquide, la quantité de thymidine incorporée.In the present description, the titers of FCCTh are determined by a modification of the thymidine (3H) incorporation test, exposed previously by S,
Gillis et al. in J. Immunology, Vol. 120, pp. 2027-2932 (1978): cells of BALB / c mouse thymus cells are placed on microplates so as to have a concentration of 100 / liters (105 cells) per trough, then these microplates are added with 100 <liters of solutions of
FCCTh diluted in series; these mixtures are then incubated at 370C for 2 days. Then add to the microplates O, 5 oi of thymidine (3H) by hollow, and 4 hours after this incorporation, using a liquid scintillation counter, the amount of thymidine incorporated is measured.
Le titre de 1 unité de FCCTh est défini comme la dilution d'un échantillon de FCCTh qui donne un compte de scintillation de 5 000 cpm.The titer of 1 unit of FCCTh is defined as the dilution of a sample of FCCTh which gives a scintillation count of 5000 cpm.
Le procédé selon l'invention sera mieux compris à la lumière des exemples non limitatifs suivants. The process according to the invention will be better understood in the light of the following nonlimiting examples.
EXEMPLE I
On transplante par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, une lignée NT-1 de lymphoblastoldes humains du type cellule T, provenant du sang périphérique humain, et les animaux sont nourris de manière habituelle pendant 3 semaines.EXAMPLE I
Transplanted intraperitoneally into adult naked mice, an NT-1 line of human lymphoblastoldes of the T cell type, originating from the peripheral human blood, and the animals are fed in the usual manner for 3 weeks.
Après extraction des tumeurs massives résultantes, formées intrapéritonéalement, et pesant environ 10 g chacune, on les désagrège par hachage et mise en suspension dans du sérum physiologique contenant de la trypsine. Après lavage des cellules humaines avec du milieu RPMI 1640 exempt de sérum (pH 7,2), on les remet en suspension dans du milieu frais de composition identique, de manière à avoir une concentration de l'ordre de 105 cellules/ml, et l'on met à incuber à 370C pendant 3 jours, pour produire du FCCTh.After extraction of the resulting massive tumors, formed intraperitoneally, and weighing approximately 10 g each, they are disaggregated by chopping and suspended in physiological saline containing trypsin. After washing the human cells with serum-free RPMI 1640 medium (pH 7.2), they are resuspended in fresh medium of identical composition, so as to have a concentration of the order of 105 cells / ml, and incubate at 370C for 3 days to produce FCCTh.
Lorsque l'incubation est terminée, on centrifuge le milieu de culture à environ 8 000 tours/minute pendant 30 minutes, et l'on essaye le titre en FCCTh de la partie surnageante résultante. La production de FCCTh est d'environ 1 600 uni tés/100/Llitre de suspension cellulaire.When the incubation is complete, the culture medium is centrifuged at about 8000 revolutions / minute for 30 minutes, and the titer in FCCTh of the resulting supernatant is tested. The production of FCCTh is approximately 1,600 units / 100 / liter of cell suspension.
L'expérimentation témoin s'effectue comme suit : la lignée
MT-1 de lymphoblastoldes humains est cultivée in vitro à 370C dans du milieu de Eagle (pH 7,2), additionné de 1% en volume/volume de sérum foetal de veau et 20% en volume/volume d'extrait de viande, et les cellules humaines, multipliées, sont traitées comme plus haut, en vue de la production de FCCTh . Cette production n'est que d'environ 40 u nités/100 rclitre de suspension cellulaire.The control experiment is carried out as follows: the line
MT-1 of human lymphoblastold is cultured in vitro at 370C in Eagle's medium (pH 7.2), supplemented with 1% by volume / volume of fetal calf serum and 20% by volume / volume of meat extract, and the human cells, multiplied, are treated as above, for the production of FCCTh. This production is only about 40 units / 100 liters of cell suspension.
EXEMPLE 2
On met en suspension ensemble des cellules humaines d'abcès tonsillaire désagrégé obtenues par extraction et hachage et des cellules de la lignée lymphoblastolde, humaine,
Namalwa, dans un récipient avec une solution salée contenant 140 mM Nazi, 54 mM KCl, 1 mM en NaH2PO4et 2 mM Cal2, pour obtenir une concentration de chaque type de cellules d'environ 1 x 103 cellules par ml.On mélange la suspension cellulaire, en refroidissant par la glace, avec une préparation fratche de la même solution salée contenant du virus Sondai préalablement inactivé par irradiation par les ultraviolets ; on transfère dans une étuve à 370C au bout de 5 minutes, après le mélange, et on agite pendant 30 minutes, pour effectuer la fusion cellulaire et introduire la capacité de production de FCCTh des cellules humaines de la lignée MT-1 dans les cellules de Namalwa.EXAMPLE 2
Human cells of disaggregated tonsillary abscess obtained by extraction and hashing are suspended together with cells of the human lymphoblastold line,
Namalwa, in a container with a saline solution containing 140 mM Nazi, 54 mM KCl, 1 mM in NaH2PO4 and 2 mM Cal2, to obtain a concentration of each type of cell of approximately 1 x 103 cells per ml. The cell suspension is mixed , while cooling with ice, with a fresh preparation of the same salt solution containing Sondai virus previously inactivated by ultraviolet irradiation; it is transferred to an oven at 370C after 5 minutes, after mixing, and the mixture is stirred for 30 minutes, to effect cell fusion and introduce the capacity for production of FCCTh of human cells of the MT-1 line in the cells of Namalwa.
Les cellules de Namalwa hybrides, résultantes, sont alors transplant8és par voie intrapéritonéale chez des souris nues adultes, que l'on nourrit de manière habituelle pendant 5 semaines. Les tumeurs massives, formées intrapéritonéalement, et pesant environ 15 g chacune, sont extraites et traitées comme dans l'exemple 1 pour produire FCCTh, à ceci près que le milieu RPMI 1640, exempt de sérum, contient 1/ > g de phytohdmoagglutinine/ml. La production de FCCTh est de l'ordre de 5 800 unités/100?litre de suspension cellulaire.Dans l'expérimentation témoin, au cours de laquelle les cellules hybrides de Namalwa sonsscultivdes in vitro comme dans l'expérimentation témoin de l'exemple 1, et les cellules humaines multipliées sont soumises à la production de
FCCTh, la production de celui-ci n'est que de l'ordre de 90 unités/100 / litre de suspension cellulaire.The resulting hybrid Namalwa cells are then transplanted intraperitoneally into adult nude mice, which are usually fed for 5 weeks. The massive tumors, formed intraperitoneally, and weighing approximately 15 g each, are extracted and treated as in Example 1 to produce FCCTh, except that the medium RPMI 1640, free of serum, contains 1 /> g of phytohdmoagglutinin / ml . The production of FCCTh is of the order of 5,800 units / 100? Liter of cell suspension. In the control experiment, during which the hybrid cells of Namalwa are grown in vitro as in the control experiment of Example 1 , and the multiplied human cells are subjected to the production of
FCCTh, the production thereof is only of the order of 90 units / 100 / liter of cell suspension.
EXEMPLE 3
Après avoir injecté à des hamsters nouveau-nés un antisérum préparé à partir du lapin selon un procédé classique, pour réduire leur réaction immunitaire, on implante aux animaux, par voie sous-cutanée, des cellules de la lignée lymphoblas tolde,humaine, JBL auxquelles on a conféré, comme dans l'e xemple 2, la capacité de production de FCCTh des cellules humaines de l'abcès tonsillaire, puis on alimente les animaux de facon habituelle pendant 3 semaines extrait les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau et pesant environ 18 g chacune, et les cellules sont traitées comme dans l'exemple 1 pour produire du FCCTh, à ceci près que le milieu RPMI 1640, exempt de sérum, est remplacé par du milieu de Eagle (pH 7,2) additionné de 20% en volume/volume d'extrait de viande, et de 50 /trg/ml de milieu, de concanavaline A. La production de FCCTh est voisine de 12 000 unités/100 / litre de suspension cellulaire.EXAMPLE 3
After injecting newborn hamsters with an antiserum prepared from rabbits according to a conventional method, in order to reduce their immune reaction, cells of the lymphoblas tolde, human, JBL line are implanted in the animals, subcutaneously. we conferred, as in Example 2, the production capacity of FCCTh of human cells of the tonsillary abscess, then the animals are fed in the usual way for 3 weeks extracting the resulting massive tumors, formed under the skin and weighing approximately 18 g each, and the cells are treated as in Example 1 to produce FCCTh, except that the RPMI 1640 medium, free of serum, is replaced by Eagle medium (pH 7.2) supplemented with 20 % by volume / volume of meat extract, and of 50 / trg / ml of medium, of concanavalin A. The production of FCCTh is close to 12,000 units / 100 / liter of cell suspension.
Au cours de l'expérimentation témoin, dans laquelle les cellules JBL hybrides sont cultivées in vitro comme dans l'expérimentation témoin de l'exemple 1, et les cellules humaines multipliées sont ensuite soumises à la production de
FCCTh, la production de ce dernier n'est que de 150 unités/ 100?litre de suspension cellulaire.During the control experiment, in which the hybrid JBL cells are cultured in vitro as in the control experiment of Example 1, and the multiplied human cells are then subjected to the production of
FCCTh, the production of the latter is only 150 units / 100 liters of cell suspension.
EXEMPLE 4
On implante par voie intraveineuse à des rats nouveau-nés une lignée de lymphoblastoldes hybrides, humains, BALL-1, auxquels on a conféré, comme dans l'exemple 2, la capacité de production de FCCTh de cellules humaines d'abcès tonsillaire, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait les tumeurs massives résultantes pesant environ 35 g chacune et on traite ces cellules humaines comme dans l'exemple 2 pour produire FCCTh.EXAMPLE 4
A hybrid human lymphoblastold line, BALL-1, is implanted intravenously into newborn rats, to which, as in Example 2, the production capacity of FCCTh of human cells of tonsillary abscess has been conferred, then the animals are fed in the usual way for 4 weeks. The resulting massive tumors weighing about 35 g each are extracted and these human cells are treated as in Example 2 to produce FCCTh.
La production de ce produit est de l'ordre de 5 300 unités/ 100 t litre de suspension cellulaire.The production of this product is around 5,300 units / 100 t liter of cell suspension.
Au cours de l'expérimentation témoin, dans laquelle les cellules hybrides BALL-1 sont cultivées in vitro, et les cellules humaines multipliées sont soumises à la production de FCCTh, la production de ce dernier n'est que de 110 unités/100Litre de suspension cellulaire.During the control experiment, in which the BALL-1 hybrid cells are cultured in vitro, and the multiplied human cells are subjected to the production of FCCTh, the production of the latter is only 110 units / 100 liters of suspension cellular.
EXEMPLE 5
Après avoir irradié des souris adultes avec un équivalent de dose de rayons g d'environ 400 rems pour réduire leurs réactions immunitaires, on implante aux animaux par voie sous-cutanée une lignée établie de cellules humaines de type monocyte-macrophage, Mono-i, provenant de sang humain périphérique, puis on alimente les animaux de façon habituelle pendant 4 semaines. On extrait les tumeurs massives résultantes, formées sous la peau, pesant environ 20 g chacune, et on traite les cellules humadeincTRmme dans l'exemple 3 pour produire FCCTh. La production/est d'environ 3 500 unités/100 litre de suspension cellulaire.EXAMPLE 5
After irradiating adult mice with an equivalent dose of g rays of about 400 rems to reduce their immune reactions, animals are implanted subcutaneously with an established line of human cells of the monocyte-macrophage type, Mono-i, from peripheral human blood, then the animals are fed in the usual way for 4 weeks. The resulting massive tumors, formed under the skin, weighing about 20 g each, are extracted, and the humadeincTRm cells are treated in Example 3 to produce FCCTh. The production / is approximately 3,500 units / 100 liters of cell suspension.
Au cours de l'expérimentation témoin, dans laquelle la lignée Mono-1 est cultivée in vitro, et les cellules humaines multipliées sont ensuite soumises à la production de
FCCTh, la production de ce dernier n'est que de 30 unités/ 100 litre de suspension cellulaire.During the control experiment, in which the Mono-1 line is cultured in vitro, and the multiplied human cells are then subjected to the production of
FCCTh, the production of the latter is only 30 units / 100 liter of cell suspension.
EXEMPLE 6
On met une suspension de lignée de lymphoblastoldes humains de type. cellule T, MT-1, provenant de sang humain périphérique, dans du sérum physiologique, dans une chambre de diffusion cylindrique, en matière plastique, ayant un volume intérieur d'environ 10 ml et munie d'une membra ne filtrante ayant des pores d'environ 0,5 05 m de diamètre. EXAMPLE 6
One suspends a line of type human lymphoblastoldes. T cell, MT-1, from peripheral human blood, in physiological saline, in a cylindrical diffusion chamber, of plastic material, having an internal volume of approximately 10 ml and provided with a filtering membrane having pores d '' about 0.5 05 m in diameter.
Après inclusion intrapéritonéale de la chambre à un rat adulte, on alimente l'animal de façon habituelle pendant 4 semaines puis on retire la chambre. La densité des cellules humaines dans la chambre obtenue dans l'opération ci-dessus est d'environ 109 cellules par ml ce qui est environ 102 fois ou plus supérieur à ce que l'on obtient par culture de tissu in vitro, avec un incubateur à C02.After intraperitoneal inclusion of the chamber in an adult rat, the animal is fed in the usual way for 4 weeks and then the chamber is removed. The density of human cells in the chamber obtained in the above operation is approximately 109 cells per ml which is approximately 102 times or more greater than that obtained by tissue culture in vitro, with an incubator to C02.
On traite les cellules humaines ainsi obtenues comme dans l'exemple 3 pour produire FCCTh. La production de FCCTh est d'environ 3 200 unités/100 litre de suspension cellulaire.The human cells thus obtained are treated as in Example 3 to produce FCCTh. The production of FCCTh is approximately 3,200 units / 100 liters of cell suspension.
EXEMPLE 7
On implante dans les cavités allantorques d'oeufs embryonnés que l'on a préincubés à 370C pendant 5 jours, une lignée de lymphoblastoIdes humains BALL-1 auxquels on a con féré comme dans l'exemple 4 la capacité de production de
FCCTh des cellules d'abcès tonsillaire humains. Après incubation des oeufs à cette température pendant encore une semaine, on récolte les cellules humaines multipliées.EXAMPLE 7
Is implanted in the allantoic cavities of embryonated eggs which have been preincubated at 370C for 5 days, a line of human lymphoblastoid BALL-1 which has been conferred as in Example 4 the production capacity of
FCCTh of human tonsillary abscess cells. After incubating the eggs at this temperature for another week, the multiplied human cells are harvested.
On traite les cellules ainsi obtenues comme dans l'exemple 1 pour produire FCCTh. La production de FCCTh est d' environ 2400 unités/100litre de suspension cellulaire. The cells thus obtained are treated as in Example 1 to produce FCCTh. The production of FCCTh is approximately 2400 units / 100liter of cell suspension.
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8204099A FR2523155B1 (en) | 1982-03-11 | 1982-03-11 | PREPARATION OF HUMAN T CELL GROWTH FACTOR |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8204099A FR2523155B1 (en) | 1982-03-11 | 1982-03-11 | PREPARATION OF HUMAN T CELL GROWTH FACTOR |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2523155A1 true FR2523155A1 (en) | 1983-09-16 |
| FR2523155B1 FR2523155B1 (en) | 1987-10-16 |
Family
ID=9271872
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| FR8204099A Expired FR2523155B1 (en) | 1982-03-11 | 1982-03-11 | PREPARATION OF HUMAN T CELL GROWTH FACTOR |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2523155B1 (en) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2040292A (en) * | 1979-01-18 | 1980-08-28 | Ashida S | Type ii interferon and therapeutic and prophylactic compositions |
| FR2487852A1 (en) * | 1980-07-31 | 1982-02-05 | Hayashibara Biochem Lab | PRODUCTION OF HUMAN GROWTH HORMONE |
-
1982
- 1982-03-11 FR FR8204099A patent/FR2523155B1/en not_active Expired
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2040292A (en) * | 1979-01-18 | 1980-08-28 | Ashida S | Type ii interferon and therapeutic and prophylactic compositions |
| FR2487852A1 (en) * | 1980-07-31 | 1982-02-05 | Hayashibara Biochem Lab | PRODUCTION OF HUMAN GROWTH HORMONE |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 78, no. 12, décembre 1981, pages 7717-7721, Washington, D.C., US; M. OKADA et al.: "Establishment and characterization of human T hybrid cells secreting immunoregulatory molecules" * |
| THE JOURNAL OF IMMUNOLOGY, vol. 128, no. 2, février 1982, pages 935-940, The American Association of Immunologists, Baltimore, MD, US; S.M. FRIEDMANN et al.: "OT-CLL: a human T cell chronic lymphocytic leukemia that produces IL 2 in high titer" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2523155B1 (en) | 1987-10-16 |
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