FR2595946A1 - Compositions d'anticorps monoclonaux humains a protection multiple - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION A POUR OBJET UNE COMPOSITION UTILE DANS LE TRAITEMENT PROPHYLACTIQUE ETOU THERAPEUTIQUE DES INFECTIONS BACTERIENNES. CETTE COMPOSITION COMPRENANT UNE QUANTITE PROPHYLACTIQUE OU THERAPEUTIQUE EFFICACE D'UN CERTAIN NOMBRE D'ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS ET ETANT REACTIVE AVEC AU MOINS DEUX ESPECES BACTERIENNES D'AU MOINS DEUX GENRES, AU MOINS L'UN DE CES ANTICORPS OU FRAGMENT DE LIAISON DE CES ANTICORPS ETANT CAPABLE DE REAGIR SPECIFIQUEMENT AVEC UN EPITOPE D'HYDRATE DE CARBONE NE FAISANT PAS PARTIE DU NOYAU PARTAGE PAR DES SEROTYPES DE DEUX ESPECES DIFFERENTES. ELLE SE RAPPORTE A DES COMPOSITIONS D'ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS A PROTECTION MULTIPLE.

Description

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COMPOSITIONS D'ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS A PROTECTION MULTIPLE

La présente invention a pour objet l'application de techniques immunologiques à la préparation de nouveaux produits utiles au traitement et au diagnostic d'infections bactériennes et, plus particulièrement, à la préparation et à l'application d'anticorps monoclonaux humains capables de protéger contre les infections occasionnées par différents genres de bactéries.

Les bactéries gram-positives et gram-négatives peuvent occasionner 10 des maladies qui menacent la vie de patients qui en sont infectés.

Ces infections bactériennes occasionnent souvent une morbidité et une mortalité importantes. On constate l'apparition de plus en plus fréquente de ces infections chez les enfants nés avant terme, les patients âgés et les patients se trouvant dans un état médical sérieux et souffrant par exemple de brOlures, d'un traumastisme chirurgical, de blessures longues à guérir et d'atteintes malignes. Ces infections sont typiquement d'origine nosocomienne (c'est-à-dire acquises dans les hôpitaux), et elles frappent particulièrement les patients qui ont subi une hospitalisation prolongée associée à une intervention chirurgicale, une infection intrasvasculaire ou 20 une thérapeutique à long terme à l'aide d'agents immunosuppresseurs ou d'antibiotiques. En outre, les nouveaux- nés dont le système immunitaire est encore immature sont apparemment extrêmement susceptibles d'être exposés à une septicémie néonatale et à une méningite occasionnée par des bactéries

gram-négatives et gram-positives particulières.

Parmi les organismes que l'on rencontre le plus fréquemment dans les maladies gram-négatives et gram-positives, on peut citer: Escherichia coli (E. coli), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Serratia marcescens (S. marcescens), Enterobacter aerogenes et cloacae (E. aerogenes/cloacae), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Neisseria meningitidis (N. menin30 gitidis), le Streptococcus du groupe B et le Staphylococcus aureus (S. aureus) [Sonnenwirth A.C., "The Enteric Bacilli and Similar GramNegative Bacteria", pp. 753-790, dans Microbiologie, 2ème édition, Davis B.D., Dulbecco R., Eisen H.N., Ginserberg H.S., Wood W.B. et McCarty M., Eds., Harper and Row (1973); McCabe W.R., "Gram-Negative Bacteremia", Adv. Intern. Med. 19, 135-138 (1974); Kreger et coll., "Gram- Negative Bacteremia III. Reassessment of Etiology, Epidemiology, and Ecology in 612 Patients", Am. J. Med. 68, 332-343 (1980); Robbins J.B. et coll., "Escherichia coli K1 Capsular Polysaccharide Associated With Neonatal Meningitis", New Engl. J. Med., 290, 1216-1220 (1974); et

Hughs J.M. et coll., "Nosocomial Infection Surveillance, 1980-1982", Morb.

Mort. Weekly Reporti 32, 1SS-16SS (1983)]. Parmi ces infections, plusieurs sérotypes mais non pas tous, de certaines bactéries gram- négatives, par exemple E. coli, K. pneumoniae, E. aerogenes/cloacae, P. aeruginosa et S. marcescens, occasionnent des bactérémies dans la population adulte. Au 15 contraire des adultes, le nouveau-né immature du point de vue immunologique est particulièrement susceptible à la septicémie et à la méningite occasionnées par les souches encapsulées de E. coli, N. meningitidis du groupe B, Hemophilus influenzae du type B et les cinq types de souche du Streptococcus du groupe B. Bien que d'autres bactéries puissent également occasionner ces 20 infections, les bactéries citées ci-dessus sont les isolats prédominants

des infections du sang mentionnées ci-dessus.

Les antibiotiques ont représentés pendant longtemps l'outil thérapeutique primaire de contrôle et d'éradication des infections gram-positives et gram-négatives. Cependant, la permanence de l'apparition et la sévérité 25 de ces infections, la permanence de l'émergence de nouvelles souches bactériennes résistant aux antibiotiques et la toxicité inhérente de quelques antibiotiques, montrent les limites d'une thérapeutique par les antibiotiques. Ces observations ont amené à la pratique de la recherche

d'une prophylaxie et d'approches thérapeutiques nouvelles.

-On pense donc très généralement que les anticorps réactifs avec des structures accessibles (exposés à l'extérieur) de bactéries vivantes peuvent faciliter la destruction de ces bactéries par un mécanisme quelconque, mécanismes parmi lesquels on peut citer: (1) une lyse directe des bactéries en présence d'un complément de sérum, 35 (2) une bactériostase par blocage des récepteurs d'absorption des nutrients, (3) fixation d'opsonine et phagocytose ultérieure des bactéries en présence ou en l'absence de complément du sérum, ou (4) obstacle à l'adhésion des bactéries aux tissus de leur hi3te 9Mims, C.A., "Recovery from Infection", dans The Pathogenesis of Infectious

Disease, pages 198-222, Mins, C.A., Ed., Acadenmic Press (1982)].

Pour les bactéries qui possèdent en surface des molécules d'hydrate de carbone, telles que par exemple des lipopolysaccharides (LPS) et/ou des capsules, il apparaît qu'un anticorps est le plus efficace par des mécanismes de fixation d'opsonine [Kaijser B. et coll., "The Protective Effect Against E. coli of 0 and K Antibodies of Different Immunoglobulin Classes", Scand. J. Immunol. 1, 276 (1972)]. Donc, des anticorps orientés vers ces 10 structures d'hydrate de carbone accessibles peuvent procurer des moyens

efficaces pour l'élimination des bactéries.

En général, les mammifères qui sont exposés à des bactéries occasionnant des maladies produisent des anticorps spécifiques des LPS ou d'une capsule. Ces antigènes présentent différentes structures chimiques compo15 sées de molécules d'oligosaccharide se répétant fréquemment et dont la présence détermine le sérotype des souches bactériennes. Etant donné qu'ils représentent souvent les antigènes bactériens immunodominants, les anticorps spécifiques d'un sérotype (anti-LPS ou anti-capsule) ont été les plus

étudiés parmi les anticorps présentant une potentialité thérapeutique.

Cependant, en raison de la réactivité multiple limitée de ces anticorps, et de la nature apparente extrêmement diverse des antigènes d'hydrate de carbone existants sur les bactéries pathogènes gram-positives et gramnégatives, il serait extrêmement difficile et coûteux de réaliser une formation thérapeutique ne contenant que des anticorps spécifiques d'un sérotype [voir par exemple Kaijser B. et Ahlstedt S., "Protective Capacity of Antibodies Against Escherichia coli 0 and K Antigens", Infect. Immun. 17, 286-292 (1977); et Morrison D.C. et Ryan J.L., "Bacterial Endotoxins and Host Immune Response", Adv. Immunol. 28, 293-450 (1979)]. Néanmoins, diverses références ont donné à penser que l'on pouvait trouver des appro30 ches immunothérapeutiques pourtrouver des maladies occasionnées par des

bactéries gram-négatives.

Le plasma humain fractionné, enrichi en immunoglobulines contenant des anticorps spécifiques et protecteurs contre les organismes provoquant les infections, a montré une certaine efficacité contre les infections occasionnées par le P. aeruginosa [Collins M.S. et Robey R.E., "Protective Activity of an Intravenous Immune Globulin (Human) Enriched in Antibody Against Lipopolysaccharide Antigens of Pseudomonas aeruginosa", Amer. J. Med., 3, 168-174 (1984)]. Cependant, on ne dispose pas encore facilement de

produits sur le marché du fait de certaines limitations inhérentes qui ont empêché de répandre leur utilisation dans le traitement de maladies bactériennes susceptibles de menacer la vie.

L'une de ces limitations associée à la composition des innunoglobu5 lines est qu'elles sont rassemblées à partir d'ensembles importants d'échantillons de plasma présélectionnés pour la présence d'un nombre limité d'anticorps particuliers. Typiquement, ces ensembles sont constitués d'échantillons provenant d'un millier de donneurs qui peuvent ne présenter -que de faibles titres en quelques bactéries pathogènes. Ainsi, on ne

constate au mieux qu'un modeste accroissement du titre en anticorps souhaités finalement obtenu.

Une autre de ces limitations est que le procédé de présélection

nécessite par lui-même un criblage permanent et très coOteux de la population de donneurs pour garantir une permanence de la qualité du produit. En 15 dépit d'efforts considérables, les produits peuvent encore varier considérablement d'un lot et d'une région géographique à l'autre.

Une autre de ces limitations inhérentes à la composition des immunoglobulines est encore que leur utilisation conduit à l'administration simultanée de quantités importantes de substances protéinées exogènes (par 20 exemple des virus), représentant des causes potentielles d'effets biologiques néfastes. La combinaison des titres faibles en anticorps souhaités et de la teneur élevée en substances exogènes limitent souvent, à des niveaux inférieurs a l'optimum, la quantité d'immunoglobulines(s) spécifique(s) et donc bénéfique(s) que l'on peut administrer à un patient. 25 En 1975, Kohler et Milstein ont indiqué que certaines lignées de cellules de souris pouvaient être fusionnées avec des cellules de rate de souris pour créer des hybridomes capables de sécréter des anticorps "monoclonaux" purs [Kohler G. et Milstein C., "Continuous Cultures of Fused

Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity", Nature, 256, 495-497 30 (1975)]. Avec l'avènement de cette technologie, on a disposé de la possibilité de réaliser des anticorps de souris orientés contre n'importe quel déterminant ou déterminants particulier(s) existant sur des antigènes.

Avec cette technologie, on a réalisé des anticorps monoclonaux de souris à partir de souris immunisées à l'aide d'un polysaccharide provenant 35 de Neisseria meningitidis groupe B. On a observé que ces anticorps monoclonaux IgM de souris se liaient et se fixaient sur plusieurs souches de E. coli Kl-positives quelque soient leurs sérotypes LPS [Cross, Supra, Soderstrom, supra, et Cross A.S. et coll., "The Importance of the K1 Capsule in Invasive Infestions Cause by Escherichia coli", J. Inf. Dis., 149, 184-193 (1984)1. En outre, les anticorps monoclonaux étaient, chez la souris, protecteurs vis-à-vis d'attaques mortelles portées par le E. coli K1 et des organismes méningocoques du groupe B (Cross, supra, et Sunderstrom, 5 supra). Dans un autre exemple, il a été indiqué que des anticorps monoclonaux de souris spécifique du Streptococcus du groupe B type III étaient protecteurs vis-à-vis d'un modèle d'infection expérimental de la souris tEgan M.L. et coll., "Protection of Mice from Experimental Infection with

Type III Group B Streptococcus Using Monoclonal Antibodies", J. Exp. Med., 10 1, 1006-1011 (1983)].

Tout en étant utile pour le traitement des souris, un anticorps monoclonal de souris présente des inconvénients majeurs lorsqu'on veut l'utiliser chez les humains. Le système immunitaire humain est capable de reconnaître n'importe quel anticorps monoclonal de souris comme une pro15 téine étrangère. Ceci peut conduire à une élimination accélérée de l'anticorps et ainsi supprimer complètement son effet pharmacologique [Levy R. et Miller R.A., "Tumor Therapy with Monoclonal Antibodies", Fed. Proc., 42, 2650-2656 (1983)]. Plus sérieusement, on conçoit que ceci pourrait conduire à un choc et même à la mort à cause de réactions allergiques analogues à ce 20 que l'on appelle "la maladie du sérum". L'expérience clinique a montré que les réponses à l'immunoglobuline anti- souris avaient limitées l'utilité de ces anticorps chez approximativement la moitié des patients ayant reçu des anticorps monoclonaux de souris pour le traitement de diverses tumeurs [Sears H.F. et coll., "Phase I Clinical Trial of Monoclonal Antibody in

Treatment of Gastrointestinal Tumor", Lancet, 1, 762-764 (1982); et Miller R.A.

et coll., "Monoclonal Antibody Therapeutic Trials in seven Patients with

T-Cell Lymphoma", Blood, 62, 988-995 (1983)].

Il est par conséquent nécessaire de réaliser des anticorps monoclonaux humains qui soient protecteurs vis-à-vis des maladies bactériennes 30 gram-négatives et gram-positives. Cependant, la diversité des propriétés antigènes des bactéries pathogènes gram-positives et gram-négatives suggère fortement que la préparation d'anticorps monoclonaux humains spécifiques d'un sérotype vis-à-vis de chacune des nombreuses bactéries pathogènes

importantes serait impraticable.

La diversité des propriétés antigènes des bactéries gram-négatives est attribuée à des régions variables des lipopolysaccharide (LPS), molécules associées à la membrane extérieure des organismes gram-négatifs. On considère généralement que la molécule de LPS est composée de trois régions structurelles. La région la plus proche de la membrane extérieure est celle que l'on appelle la portion lipide A du LPS. Cette région conservée structurellement possède l'activité endotoxique associée aux maladies gramnégatives. La deuxième région structurelle que l'on appelle le noyau est 5 liée au lipide A, souvent par la voie d'un reste 2-céto-3déoxy-D-mannooctonate (KDO) et, de même que pour la région du lipide A, elle n'est habituellement pas accessible à l'anticorps lorsque la troisième région la plus extérieure du LPS est présente. Bien que cette région soit partiellement conservée au sein de quelques espèces de bactéries gram-négatives, on 10 a trouvé de nombreuses déviations dans le noyau complet parmi les membres de la famille des Entérobactériacées. La région la plus extérieure d'une molécule de LPS est constituée de motifs oligosaccharides répétitifs et elle est connue sous le nom de chalne latérale O-spécifique. Les sucres de ces motifs oligosaccharides comprennent des entités moléculaires qui présentent une grande diversité antigène structurelle de sérotype spécifique. Ainsi, les sucres eux-mêmes, leur séquence et leurs liaisons déterminent les propriétés antigéniques de la chaîne O-latérale par leur structure tertiaire. On a généralement trouvé que les anticorps dirigés contre ces groupes-O étaient spécifiques d'un sérotype. Les sérotypes se définissent 20 typiquement par leur réactivité avec des antisérums monospécifiques qui ne possèdent une activité de liaison que pour un seul déterminant antigène particulier. Voir en général Mayer et coll., Meths. Microbiology, 18,

157-201 (1985).

On a préparé des antisérums dirigés contre le noyau et les régions de 25 lipide A du LPS pour s'efforcer de démontrer une protection contre une infection gram-négative. Sakulramrung et Domingue, J. Inf. Dis, 151, 9551104 (1985); McCabe et coll., J. Infect. Dis. 1365, 516 (1977); et Mullan et coll., Infect. Immun., 10, 1195-1201 (1974). Plus récemment, on a préparé des anticorps monoclonaux de souris et d'homme réactifs avec les 30 régions conservées. Bien que ces anticorps aient quelquefois présenté une efficacité partielle in vivo chez des systèmes de modèle réalisés sur mesure (Teng et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 1790 (1985); et Bogard et Kung, Patent Application n W085/01659), d'autres laboratoires n'ont pas été en mesure de faire la démonstration d'effets semblables. Voir 35 Elkins et Metcalf, Infect. Immun. 48, 597 (1985); et Gigliotti et Shenap, J. Inf. Dis. 151, 1005-1011 (1985). En outre, ces anticorps ne réagissent généralement pas avec (ni ne se lient à) des bactéries gramnégatives viables intactes ou à des molécules de LPS purifiées. Ces constatations suggèrent qu'il est douteux que le noyau ou les portions de lipide A du lPS puissent être accessibles à un anticorps sur des bactéries se trouvant dans leur état naturel ou un état infectieux. Il est également généralement accepté que les anticorps antinoyau ou antilipide A ne réagissent pas avec des bactéries gram-positives parce que ces dernières ne possèdent pas de LPS. Du fait de ces constatations, il est improbable que des anticorps monoclonaux dirigés contre les régions du noyau conservées ou du lipide A du LPS puissent être efficaces dans le traitement des maladies bactériennes

humaines gram-négatives ou, à cet égard, gram-positives.

Il existe donc un besoin important d'anticorps monoclonaux humains qui soient largement (intergenres) réciproquement protecteurs contre des maladies occasionnées par des bactéries gram-positives et gram-négatives et le besoin existe aussi de méthodes de préparation et d'utilisation pratiques

de ces anticorps. La présente invention satisfait ces besoins.

On prépare des nouvelles lignées de cellules qui fournissent des anticorps monoclonaux humains capables de réactions multiples spécifiques avec toute une série d'espèces bactériennes par liaison d'un épitope accessible comprenant un radical hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau présent sur au moins deux espèces bactériennes différentes. On 20 procure en outre des méthodes de traitement prophylactique d'un patient humain sujet à une infection bactérienne et de traitement thérapeutique d'un patient souffrant d'une telle infection par administration d'une quantité efficace d'une composition contenant une pluralité d'anticorps monoclonaux humains, dans laquelle au moins l'un de ces anticorps est 25 capable de réagir avec un déterminant antigénique à base d'hydrate de carbone, ne faisant pas partie du noyau, partagé par deux ou plus de deux espèces bactériennes. La composition comprend de préférence un support physiologiquement acceptable et elle peut également contenir l'un ou plusieurs des éléments suivants: des anticorps monoclonaux humains supplé30 mentaires capables de réagir avec d'autres genres bactériens; une fraction de gammaglobuline provenant de plasma de sang humain; une fraction de gammaglobuline provenant de plasma de sang humain dans laquelle le plasma

est obtenu à partir d'un être humain présentant des niveaux élevés d'immunoglobulines réactives avec un ou plusieurs agents antimicrobiens.

La présente invention concerne donc des nouvelles cellules capables de produire des anticorps monoclonaux humains et des compositions comprenant ces anticorps, ces compositions étant capables de réagir de façon sélective avec un certain nombre de genres de bactéries responsables d'infections nosocomiennes, néonatales et autres, dans lesquelles les anticorps individuels réagissent typiquement avec des épitopes à base d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau présent sur de multiples genres de bactéries. Les cellules selon l'invention présentent des chromosomes identifiables dans lesquels l'EDNA de la lignée du germe provenant d'eux-mêmes ou d'une cellule précurseur a été réarrangé pour encoder un anticorps ou un de ces fragments de liaison présentant un site de liaison pour un déterminant antigène (épitope) partagé par des molécules d'hydrate de carbone trouvées sur au moins quelques sérotypes de deux ou de 10 plus de deux genres bactériens. Ces anticorps monoclonaux humains peuvent être utilisés de toute sorte de facon, y compris pour le diagnostic, la

prophylaxie et la thérapeutique des maladies bactériennes.

Typiquement, les cellules selon l'invention la présente invention seront des cellules capables d'une production stable d'un anticorps humain 15 par culture, et en particulier des lymphocytes humains immortalisés qui donnent lieu à la formation d'anticorps monoclonaux humains protecteurs dirigés contre des déterminants hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau existant sur des molécules accessibles partagés par au moins deux espèces bactériennes. Par "accessible", on signifie que les déterminants 20 hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau sont physiquement disponibles dans l'environnement pour être utilisés à une interaction directe avec les anticorps monoclonaux. Les anticorps monoclonaux ainsi réalisés sont utiles dans le traitement ou la prophylaxie de maladies sérieuses occasionnées par tout une série d'infections bactériennes. En outre, ces 25 molécules d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau et qui sont libérées dans l'environnement immédiat, sont également libres d'interagir directement avec les molécules d'anticorps et susceptibles d'être éliminés

par la voie du système réticulo-endothélial.

Les compositions qui contiennent les anticorps monoclonaux selon la 30 présente invention sont typiquement utiles dans le traitement thérapeutique et prophylactique des infections nosocomiales, néonatales ou d'autres infections. Les infections nosocomiennes étant typiquement occasionnées par des infections provenant des bactéries suivantes: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/cloacae, 35 Serratia marcescens et Streptococcus agalactiae du groupe B. on devrait préférer des compositions d'anticorps qui soient protectrices vis-a-vis de deux, trois, quatre ou plus de quatre de ces bactéries. De même, pour l'usage néonatal, par exemple dans la septicémie et la méningite néonatale, il est souhaitable que les anticorps soient spécifiques de deux ou de plus de deux des organismes bactériens suivants: Escherichia coli K1, Neisseria meningitidis du Groupe B, Streptococcus agalactiae du Groupe B et Hemophilus influenzae du type-B. D'autres bactériennes infectieuses communes compren5 nent les suivantes: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Bacteroides fragilis, Pseudomonas cepacia, Mycobacterium tuberculosis, Providencia morganii, Salmonella typhi, Pneumocystis carinii, Acinetobacter herellea, Pasturella multocida, Klebsiella oxytoca. En ce qui concerne d'autres

bactéries pathogènes concernées connues des spécialistes, voir Hughs J.M.

et coll., "Nosocomial Infection Surveillance, 1980-1982", Morb. Mort.

Weekly Report, 32, 1SS-16SS (1983), et, généralement, Microbiology, 3ème Edition, Davis B.D., Dulbecco R., Eisen H.N., Ginserberg H.S., Wood W.B. et McCarty M., Eds. Harper and Row (1980), tous les deux étant incorporés ici 15 à titre de référence. Les anticorps monoclonaux vont réagir avec des éléments individuels ou avec tous les membres d'une espèce bactérienne particulière, ces membres pouvant se distinguer par leurs épitopes de surface, notamment les sites de LPS ou de capsules, par exemple leurs sérotypes. La constatation inattendue d'une réactivité multiple d'anticorps monoclonaux dirigée contre plusieurs espèces bactériennes, y compris les espèces cliniquement importantes énumérées ci- dessus, procure des nouveaux moyens de traitements thérapeutiques et prophylactiques. En utilisant des anticorps à réactivité multiple présélectionnés en combinaison, on peut préparer un mélange de quelques anticorps destinés à un traitement de lutte

contre un certain nombre de différentes espèces de bactéries infectieuses.

A titre d'exemple non limitatif, un mélange de deux anticorps monoclonaux, l'un d'eux à réactivité multiple vis-à-vis d'au moins deux espèces bactériennes d'importance clinique et le second à réactivité multiple visà-vis d'au moins deux ou trois espèces différentes sera utile dans un traitement de lutte contre quatre, cinq, six ou plus de six espèces différentes. L'addition d'un troisième ou d'un quatrième anticorps monoclonal, chacun d'entre eux possédant une réactivité multiple vis-àvis d'au moins deux espèces cliniquement importantes -même si l'une ou plus d'une de ces 35 espèces est la même que celle reconnue par le premier et/ou le second anticorps- augmentera son utilité dans un traitement de lutte contre cinq à dix ou plus de dix espèces. Naturellement, il peut être nécessaire d'ajouter encore un ou plusieurs anticorps monoclonaux, chacun n'étant spécifique que d'une seule espèce bactérienne présélectionnée, par exemple lorsque des anticorps monoclonaux à réactivité multiple vis-à-vis de cette espèce ne

sont pas disponibles.

De même, la présente invention procure également la base de nouvelles méthodes de traitement des infections bactériennes. A nouveau, à titre d'exemple non limitatif, une nouvelle méthode comprend le traitement d'un patient soupçonné d'être l'objet ou d'être susceptible d'une infection bactérienne occasionnée par une espèce bactérienne sélectionnée. Le traitement comprend l'administration d'une composition à base d'un anticorps monoclonal réactif vis-à-vis de l'espèce bactérienne soupçonnée d'occasionner l'infection, l'anticorps monoclonal étant caractérisé à l'origine par

sa réactivité avec une espèce bactérienne différente.

Comme autre exemple, on peut citer une méthode de traitement d'infection bactérienne par administration de compositions qui comprennent un certain nombre d'anticorps monoclonaux réactifs avec une proportion importante (c'est-à-dire supérieure à 50%, de préférence 60 à 80% ou plus, notamment d'environ 90%) d'espèces bactériennes cliniquement importantes présélectionnées, le nombre d'anticorps étant au moins inférieur de deux au nombre d'espèces bactériennes. Typiquement, si "n" représente le nombre d'espèces bactériennes, la composition comprendra environ n - 2 anticorps, plus typiquement environ n-4 ou n -8 ou moins d'anticorps pour un

traitement destiné à lutter contre environ 15 à 20 espèces bactériennes.

Dans des situations o le traitement destiné à la lutte contre un large

spectre (par exemple 25 à 50 ou plus) d'espèces bactériennes est souhaité, 25 la composition comprendra typiquement n -10 à n - 20 anticorps ou moins.

La préparation d'anticorps monoclonaux peut s'effectuer en immortalisant l'expression de séquences d'acide nucléique qui encodent pour des anticorps ou des fragments de liaison de ceux-ci spécifiques d'un épitope d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau présent sur plusieurs 30 espèces bactériennes. Typiquement, les anticorps monoclonaux se préparent par une transformation cellulaire provoquée par le virus d'Epstein-Barr (EBV) de lymphocytes obtenues à partir de donneurs humains qui sont ou qui ont été exposés aux bactéries gram-négatives respectives. Les lignées de cellules sécrétrices d'anticorps ainsi préparées sont caractérisées en ce 35 qu'elles donnent naissance en permanence à des cellules lymphoblastoides possédant un caryotype diploïde, en ce qu'elles sont positives vis-à-vis de l'antigène nucléaire d'Epstein-Barr (EBNA) et ce qu'elles secrètent un anticorps monoclonal du type soit IgG, IgM, IgA ou IgD. Le processus de transformation cellulaire est en lui-même une invention de Genetic Systems Corporation et il est décrit en détail dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique no 4 464 465 incorporé ici à titre de référence. Les anticorps monoclonaux peuvent s'utiliser intacts ou sous la forme de fragments, par exemple Fv, Fab, F(Ab')2, mais on les utilise habituellement intacts. Ou encore, on pourrait réaliser des lignées de cellules de production

des anticorps par fusion cellulaire entre des myélomes humains, des myélomes de souris ou des cellules lymphoblasto'des humaines convenablement marquées par un médicament avec des lymphocytes B humains pour réaliser des lignées 10 cellulaires hybrides.

Les lignées cellulaires selon la présente invention peuvent trouver une autre utilisation que celle de la préparation directe des anticorps monoclonaux humains. Les lignées cellulaires peuvent être fusionnées avec d'autres cellules (par exemple des myélomes humains, des myélomes de souris 15 ou des cellules lymphoblastofdes humaines convenablement marquées par un médicament) pour réaliser des hybridomes et ainsi réaliser le transfert de gènes encodant les anticorps monoclonaux humains. Ouencore, les lignées cellulaires peuvent s'utiliser comme source de DNA encodant les immunoglobulines que l'on peut isoler et transférer à des cellules par des techniques différentes d'une fusion. En outre, on peut isoler les gènes encodant les anticorps monoclonaux et les utiliser selon des techniques de recombinaison du DNA pour la préparation d'immunoglobulines spécifiques chez toute une variété d'hôtes. Notamment, en préparant des bibliothèques de cDNA pour du RNA messager, on peut isoler un clone unique de cDNA codant 25 pour l'immunoglobuline et exempt d'introns, et le placer dans des vecteurs d'expression procaryote ou eucaryote convenables et les transporter ensuite

dans un hôte pour une production de masse finale.

Les lignées de cellules lymphoblastoldes ou hybrides peuvent être clonées et criblées selon des techniques classiques à l'aide des anticorps 30 qui soient capables de se lier aux épitopes des différents genres de

bactéries détectés dans les surnageants de cellules.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention trouvent une utilité particulière comme constituants de compositions pharmaceutiques contenant une quantité thérapeutique ou prophylactique d'au moins l'un d'entre les anticorps monoclonaux selon la présente invention en association avec un support pharmaceutiquement efficace. Un support pharmaceutique peut être n'importe quelle substance compatible non toxique convenant à l'administration des anticorps monoclonaux aux patients. On peut inclure dans le support de l'eau stérile, un alcool, des matières grasses, des cires et des solides inertes. On peut également incorporer des adjuvants acceptés pharmaceutiquement (agents tampons, agents de dispersion) dans ces compositions pharmaceutiques. Ces compositions peuvent contenir un seul anticorps monoclonal à réactivité multiple vis-à-vis d'épitopes d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau partagés par deux ou plusieurs espèces bactériennes qui occasionnent par exemple des infections nosocomiennes et néonatales (par exemple septicémie ou méningite). Ou encore, une composition pharmaceutique peut contenir deux ou plus de deux anticorps monoclonaux pour former un "coktail". Par exemple, un coktail contenant des anticorps monoclonaux humains, chacun étant protecteur vis-à-vis de deux ou de plus de deux genres de bactéries gram-négatives responsables d'infections humaines, présenterait une activité vis-a-vis de la grande majorité des isolats cliniques communs. Si on le souhaite, on peut sélectionner un 15 ou plusieurs anticorps monoclonaux à réactivité multiple vis-à-vis de

bactéries gram-positives, ce qui rendrait possible de plus larges applications du produit.

Sont intéressantes les compositions prophylactiques et/ou thérapeutiques d'anticorps monoclonaux capables de réagir avec des déterminants 20 d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau partagés par trois ou plus de trois, habituellement au moins cinq et plus, habituellement au moins dix et jusqu'à quinze ou plus de sérotypes bactériens qui comprennent au moins deux, habituellement au moins trois, plus habituellement au moins

cinq et habituellement moins de dix genres bactériens.

Sont particulièrement intéressantes les compositions d'anticorps monoclonaux qui réagissent avec au moins environ trois, de préférence au moins environ cinq et jusqu'à et y compris toutes les bactéries communes nosocomiennes causes d'infections suivantes: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes/cloacae, Serratia 30 marcescens et Streptococcus agalactiae du Groupe B. Pour le traitement des infections néonatales, il est souhaitable que les compositions réagissent avec au moins deux, habituellement au moins trois, et plus habituellement au moins quatre et jusqu'à et y compris tous les genres suivants de bactéries causes d'infections: Escherichia coli K1, Neisseria meningitidis du 35 Groupe B, Streptococcus agalactiae du Groupe B, Hemophilus influenzae du

type B, Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis.

Chacune des compositions comprendra au moins deux, habituellement au moins trois à cinq, et plus habituellement de six à dix anticorps monoclonaux humains, l'un au moins de ces anticorps réagissant avec des épitopes d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau (par exemple des épitopes des molécules de LPS) partagés par deux ou plus de deux genres bactériens et procurant une protection. Typiquement, les anticorps ne se lieront pas à tous les sérotypes de chaque bactérien mais peuvent se lier à deux, trois ou plus de trois sérotypes. Il est souhaitable qu'il y ait au moins un anticorps monoclonal qui se lie à un radical hydrate de carbone ne

faisant pas partie du noyau accessible d'au moins deux genres de bactéries gram-négatives et au moins un anticorps monoclonal qui se lie à un radical 10 hydrate de carbone accessible d'une bactérie gram-négative et d'une bactérie gram-positive.

Les rapports molaires de divers composants d'un anticorps monoclonal ne diffèrent habituellement pas l'un de l'autre de plus d'un facteur de 10, habituellement pas plus d'un facteur de 5, et existeront habituellement 15 dans des rapports molaires d'environ 1/1 à 2 par rapport à chacun des

autres composants de l'anticorps.

Les anticorps monoclonaux humains peuvent également trouver leur application individuellement, surtout l'un o l'agent pathogène a été

identifié, ou lorsqu'il est limité à un nombre étroit d'agents pathogènes 20 situés à l'intérieur du spectre de liaison de l'anticorps particulier.

Les anticorps monoclonaux humains selon la présente invention peuvent également être utilisés en combinaison avec d'autres anticorps monoclonaux (voir la demande de la même demanderesse intitulée "Monoclonal Antibodies Cross-Reactive and Protective Against P. aeruginosa Serotypes" déposée sous 25 le numéro U.S.S.N. 807 394 déposée le 10 décembre 1985, incorporée ici à titre de référence) aussi bien qu'avec des produits de plasma sanguin existants, par exemple des gammaglobulines et des immunoglobulines disponibles dans le commerce utilisées dans le traitement prophylactique ou thérapeutique des maladies bactériennes des êtres humains. De préférence, 30 en ce qui concerne les immunoglobulines, le plasma sera obtenu à partir de donneurs humains présentant des niveaux élevés d'immunoglobulines réactives avec divers genres bactériens infectieux. Voir en général le compendium "Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med. 76(3a), 30 mars 1984, pages 1 à 231, incorporé ici à titre de référence. 35 Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent s'utiliser sous la forme de compositions administrées séparément en association avec des agents antibiotiques ou antimicrobiens. Typiquement, les agents antimicrobiens peuvent comprendre une pénicilline ou une céphalosporine (par exemple carbénicilline, pénicilline G, etc.) en association avec un

aminoglycoside (par exemple gentamicine, tobramycine, etc.), mais on peut également utiliser de nombreux autres agents (par exemple des céphalosporines, des sulfamides, etc.) bien connus des spécialistes.

Les anticorps monoclonaux humains et les compositions pharmaceutiques à base de ces anticorps selon la présente invention sont particulièrement utiles pour l'administration orale ou parentérale. On peut de préférence administrer les compositions pharmaceutiques par voie parentérale, c'estàdire par voie sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse. La présente 10 invention procure donc pour l'administration parentérale des compositions qui comprennent une solution de l'anticorps monoclonal humain ou un coktail de ces anticorps dissous dans un support acceptable, de préférence un support aqueux. On peut utiliser tout une série de supports aqueux, par exemple de l'eau, de l'eau tamponnée, une solution saline à 0,4%, une solution de glycine à 0,3%, etc. Ces solutions sont stériles et généralement exemptes de matière particulaire. On peut stériliser ces compositions par des techniques de stérilisation classiques et bien connues. Ces compositions peuvent contenir des substances auxiliaires pharmaceutiquement acceptables en tant que de besoin pour s'approcher des conditions physio20 logiques, par exemple des agents d'ajustement et de tamponnement du pH, des agents de réglage de la toxicité, etc., par exemple acétate de sodium, chlorure de sodium, chlorure de potassium, chlorure de calcium, lactate de sodium, etc. La concentration en anticorps de ces formulations peut varier largement, par exemple de moins d'environ 0,5%, habituellement à ou au 25 moins environ 1% jusqu'à 15 ou 20% en poids et on la sélectionne surtout sur la base des volumes de fluide, des viscosités, etc. en accord avec le

mode particulier d'administration choisie.

Ainsi, on peut préparer une composition pharmaceutique typique pour l'injection intramusculaire qui contienne jusqu'à 1 ml d'eau tamponnée stérile et 50 mg d'anticorps monoclonal. On pourrait préparer une composition typique pour injection intraveineuse qui contienne jusqu'à 250 ml de solution stérile de Ringer et 150 mg d'anticorps monoclonal. Les méthodes effectives de préparation de compositions susceptibles d'être administrées par voie parentérale sont bien connues ou évidentes pour le spécialistes et 35 elles sont décrites avec plus de détail par exemple dans Remington's Pharmaceutical Science, 15ème Edition, Mack Publishing Company, Easton,

Pennsylvania (1980), incorporé ici à titre de référence.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent être lyophilisés pour le stockage et être reconstitués dans un véhicule convenable avant l'utilisation. Il s'est avéré que cette technique était efficace avec des immunoglobulines classiques et que l'on pouvait employer des techniques de lyophilisation et de reconstitution connues dans l'état de la technique. Le spécialiste appréciera que la lyophilisation et la reconstitution peuvent conduire à divers degré de perte d'activité de l'anticorps (par exemple avec des immunoglobulines classiques, les anticorps IgM ont

tendance à perdre plus d'activité que les anticorps IgG) et qu'il peut être 10 nécessaire d'ajuster les niveaux d'utilisation pour opérer une compensation.

Les compositions contenant les anticorps monoclonaux humains selon la présente invention ou un coktail de ces anticorps peuvent s'administrer pour le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des infections bactériennes. Dans l'application thérapeutique, on administre ces composi15 tions à un patient qui est déjà infecté en quantité suffisante pour guérir ou au moins stopper partiellement l'infection et ces complications. La quantité adéquate pour y arriver est définie comme étant la "dose thérapeutiquement efficace". Des quantités efficaces a cet usage dépendent de la sévérité de l'infection et de l'état général du système immunitaire propre 20 du patient mais elles sont plus généralement comprises entre environ 1 et environ 200 mg d'anticorps par kilogramme de poids du corps, des doses comprises entre 5 et 25 mg par kg étant celles que l'on utilise le plus communément. Il faut garder à l'esprit que les produits selon la présente invention peuvent généralement s'employer dans le cas de maladies sérieuses, 25 c'est-à- dire ceux qui menacent la vie ou qui sont susceptibles de la menacer, notamment en cas de bactérémie ou d'endotoxémie. Dans ces cas là, étant donné l'absence de substances exogènes et l'absence de rejet de "substance étrangère" que l'on obtient grâce aux anticorps monoclonaux humains selon la présente invention, il est possible et on peut ressentir 30 qu'il est souhaitable pour le médecin traitant d'administrer des excès

importants de ces anticorps.

Dans les applications prophylactiques, les compositions contenant les anticorps selon la présente invention ou un coktail de ces anticorps sont administrées à un patient qui n'est pas encore infecté par les bactéries 35 correspondantes pour améliorer la résistance du patient à cette infection potentielle. Cette quantité est définie comme étant une "dose prophylactiquement efficace". Dans cette utilisation, les quantités précises dépendent à nouveau de l'état de santé du patient et de son niveau général d'immunité,

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mais elles sont généralement comprises entre 0,1 et 25 mg par kg, notamment

0,5 et 2,5 mg par kg.

On peut procéder à une seule ou à plusieurs administrations des compositions à des niveaux de dosage et selon un programme à choisir par le médecin traitant. En tout cas, les formulations pharmaceutiques doivent procurer une quantité d'anticorps selon la présente invention suffisante

pour traiter efficacement le patient.

Les anticorps monoclonaux selon la présente invention peuvent encore trouver toute une série d'utilisation in vitro. A titre d'exemple, on peut 10 utiliser les anticorps monoclonaux pour le typage des bactéries, pour la séparation de souches bactériennes spécifiques ou de leurs fragments, pour la préparation des vaccins, etc. A des fins de diagnostic, les anticorps monoclonaux peuvent être soit marqués, soit non marqués. Typiquement, les essais de diagnostic impliquent 15 la détection de la formation d'un complexe par la liaison de l'anticorps monoclonal avec le LPS de l'organisme. Lorsqu'ils sont non marqués, les anticorps trouvent leur application dans les essais d'agglutination. En outre, on peut utiliser les anticorps non marqués en combinaison avec d'autres anticorps marqués (anticorps secondaires) qui sont réactifs avec 20 l'anticorps monoclonal, par exemple des anticorps spécifiques de l'immunoglobuline humaine. Ou encore, les anticorps monoclonaux peuvent être marqués directement. On peut employer toute une série de marqueurs, par exemple des radio-éléments, des éléments fluorescents, des enzymes, des substrats d'enzyme, des cofacteurs d'enzyme, des inhibiteurs d'enzyme, des 25 liants (notamment des haptènes), etc. De nombreux types d'immuno-essais sont disponibles et, à titre d'exemple, quelques uns de ces essais sont décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n0 3 817 827, 3 850 752, 3 901 654, 3 935 074, 3 984 533, 3 996 345, 4 034 074 et 4 098 876, tous

étant incorporés ici à titre de référence.

On utilise communément les anticorps monoclonaux selon la présente invention dans des immuno-essais enzymatiques o les anticorps selon la présente invention, ou les anticorps secondaires provenant d'une espèce différente, sont associés à une enzyme. Lorsqu'un échantillon, par exemple du sang humain ou un lysat de sang humain, contenant une ou plusieurs bactéries d'un certain genre ou sérotype, est associé aux anticorps selon l'invention, il se produit une liaison entre les anticorps et ces molécules qui présentent les épitopes choisis. Ces cellules peuvent alors être séparées du réactif non lié et on peut ajouter un anticorps secondaire (marqué avec une enzyme). Après cela, la présence du conjugué anticorpsenzyme spécifiquement lié aux cellules est déterminée. On peut également

utiliser d'autres techniques classiques bien connues des spécialistes.

On peut également fournir des kits à utiliser avec les anticorps 5 selon l'invention pour la détection d'une infection bactérienne ou la détection de la présence d'un antigène choisi. Ainsi, la composition d'anticorps monoclonal selon la présente invention peut être fournie, habituellement sous forme lyophilisée dans un conteneur, soit seule, soit en association avec d'autres anticorps spécifiques d'autres bactéries gram-négatives. Les anticorps, qui peuvent être conjugués à un marqueur ou non conjugués, sont inclus dans les kits en même temps que des tampons tels que par exemple du Tris, du phosphate, du carbonate, etc., des agents de stabilisation, des biocides, des protéines inertes, par exemple de l'albumine de sérum bovin, etc. Généralement, ces produits seront présents en quantité inférieure à environ 5% en poids par rapport à la quantité d'anticorps actifs et habituellement présents en quantité totale d'au moins 0,001% en poids par rapport à nouveau à la concentration de l'anticorps. Il sera fréquemment souhaitable d'inclure un agent d'extension ou excipient inerte pour diluer les ingrédients actifs, l'excipient pouvant alors être 20 présent en quantité comprise entre environ 1 et 99% en poids par rapport au poids de la composition totale. Lorsque l'on emploie un anticorps secondaire capable de se lier à l'anticorps monoclonal, celui-ci sera habituellement présent dans une fiole séparée. Typiquement, l'anticorps secondaire est

conjugué à un marqueur et il entre dans la formulation de manière analogue 25 aux formulations d'anticorps décrites ci-dessus.

Les données expérimentales et les informations qui suivent sont

données à titre d'exemple non limitatif.

EXEMPLE I

Cet exemple fait la démonstration de méthodes de préparation d'un anticorps monoclonal humain qui possède une réactivité intergenre multiple vis-à-vis de membres des genres: Escherichia coli (E. coli), Serratia marcescens (S. marcescens), Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae) et Enterobacter aerogenes (E. aerogenes). Cet exemple donne en outre une démonstration de l'activité protectrice in vivo de cet anticorps vis-àvis 35 d'une attaque mortelle par des sérotypes homologues (à réactivité multiple)

de E. coli et E. aerogenes.

A. Obtention de cellules humaines convenables On obtient des cellules humaines B convenables à partir du sang périphérique d'un individu connu pour avoir été attaqué par une fibrose cystique. On sépare des cellules mononucléaires du sang périphérique par des techniques classiques de centrifugation sur Ficoll-Paque [Boyum A., "Isolation of Mononuclear Cells and Granulocytes From Human Blood", Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21, Suppl. 87, 77-89 (1968)] et on lave deux fois dans une solution saline tamponnée au phosphate exempte de calcium-magnésium (PBS) avant mise en suspension dans 1 ml de sérum bovin fétal à 90% 10 (FBS) et du diméthylsulfoxyde à 10% et congélation à -196 C dans l'azote liquide. Lorsque l'on doit transformer les cellules mononucléaires, on dégèle rapidement à 37 C une ampoule contenant 5 x 107 cellules. On ajoute la suspension de cellules à 10 ml de milieu d'Iscove contenant 15% de FBS et 15 on centrifuge à la température ambiante pendant 10 minutes à 250 x g. Les cellules mononucléaires sont débarrassées de leurs cellules T (lymphocytes) en utilisant un mode opératoire modifié de rosette-E. En bref, on remet les cellules en suspension à une concentration de 1 x 107 cellules/ml dans du PBS contenant 20% de FBS à 4 C. On place 1 ml de cette suspension dans un 20 tube à fond rond de polystyrène de 17 x 100 mm, auquel on a ajouté 1 x 109 cellules de sang rouge de mouton traité par du bromure de 2-aminoéthylisothiouronium (AET) à partir d'une solution à 10% (v/v) dans du milieu d'Iscove ÉMadsen M. et Johnson H.E. "A Methodological Study of E-rosette Formation Using AET Treated Sheep Red Blood Cells", J. Immun. Methodes 27, 61-74 (1979)]. On mélange vigoureusement la suspension pendant à 10 minutes à 4 C et les cellules de rosette-E sont éliminées par centrifugation par Ficoll-Paque pendant 8 minutes à 2500 x g à 4 C. Les cellules mononucléaires de sang périphérique négatives à la rosette-E (E'PMBC) se rassemblant à l'interface sont lavées une fois dans du milieu 30 d'Iscove et on les remet en suspension dans ce même milieu contenant % p/v de FBS (g/ml), de la L-glutamine (2 mM/l), du pyruvate de sodium (1 mM/l), de la pénicilline (100 IU/ml), de la streptomycine (100 Ig/ml), de l'hypoxanthine (1 x 10-4 M) et de la thymidine (1,6 x 10 S M). Ce milieu

est désigné ci-après sous le nom de milieu HAT.

B. Transformation cellulaire de cellules mononucléaires de sang périphérique La transformation cellulaire de E-PBMC s'effectue par coculture de E-PBMC en présence d'une lignée de cellules de transformation. La lignée de cellules de transformation est une lignée de cellules lymphoblastoides humaines EBNA positives provenant par mutagénèse au sulfonate d'éthyméthane de la lignée de cellules lymphoblastoides GM 1500. Une sélection en présence de 30 Pg/ml de 6-thioguanine rend les cellules déficientes en hypo5 xanthineguanine phosphoribosyl transférase et donc sensibles au HAT. La lignée de cellules est dénommée lignée de cellules 1A2 et elle a été déposée à l'American Type Culture Collection (A.T.C.C.) le 29 mars 1982 sous le n A.T.C.C. CRL 8119. Des cellules 1A2 en phase de croissance logarithmique sont mises en suspension dans du milieu HAT et combinées avec 10 le E-PBMC au rapport de 30 cellules 1A2 par E-PBMC. Le mélange de cellules est placé sur 10 plaques de microtitrage à 96 puits à fond rond, à une concentration de 62 000 cellules/puits à un volume de 200 pl/puits, et on incube la culture à 37 C dans une atmosphère humidifiée contenant 6% de CO 2. Les cultures sont entretenues cinq jours après la transformation par 15 remplacement de la moitié du surnageant par du milieu HAT neuf. On observe les puits tous les deux jours au microscope à inversion pour observer les signes de prolifération de cellules. Dix jours après ensemencement du mélange de cellules et après que les cellules 1A2 soient mortes à cause de la sélection par le HAT, l'alimentation des puits se fait à l'aide d'une 20 nouvelle formulation de milieu identique aux milieux HAT sauf qu'il lui manque le composant aminoptérine. Quinze jours après ensemencement, on observe que 100% des puits contiennent des cellules proliférantes et que, dans la plupart des puits, les cellules ont une densité suffisante pour

prélèvement et contrôle dans les supernageants de l'anticorps anti-E. coli 25 ou anti-S. marcescens.

C. Détection des cellules sécrétant un anticorps spécifique On crible les supernageants pour détecter la présence d'anticorps anti-E. coli ou antiS. marcescens en utilisant une technique d'essai d'immunosorption lié à une enzyme (ELISA) [Engvall E., "Quantitative Enzyme 30 Immunoassay (ELISA) in Microbiology", Med. Biol., 55, 193-200 (1977)]. Les plaques d'antigènes sont constituées d'une série de plaques de microtitrage Immunlon 2 à 96 puits à fond plat, dont les puits contiennent un mélange de l'un ou l'autre des sérotypes viables de E. coli ou S. marcescens fixés à la surface des puits par de la poly-L-lysine (PLL). En bref, on ajoute 50 Pl de PLL (1 Pg/ml) dans du PBS à chaque puits, pendant 30 minutes, à la température ambiante (RT). On lave les plaques trois fois avec du PBS et, soit du PBS, soit 50 Pl d'une suspension mixte de bactéries à'O.D.660 = 0,2 sont ajoutés à chaque puits. On incube les plaques à 37 C pendant 60 minutes et on lave trois fois avec une solution saline à 0,02% de Tween 20 (saline/T) pour éliminer les bactéries non attachées. Les diverses plaques d'antigènes utilisées dans le criblage comprennent: 1) un mélange des sérotypes de E. coli 01 (A.T.C.C. n 23499) , et 04 (A.T.C.C. n 12791); 2) un mélange des sérotypes 07, 015, 016 et 018 de S. marcescens (toutes les souches de tipage de référence sont obtenues du Communicable Disease Center (CDC), Atlanta, GA); et

3) une plaque de microtitrage exempte de bactéries.

Pour le mode opératoire ELISA, les puits d'essai sont tout d'abord bloqués avec 200 pl d'un mélange contenant 5% p/v de lait écrémé sec, 0, 0001% de Mousse A, et 0,01% p/v de Thimerosal dans 500 ml de PBS pour empêcher la liaison d'une protéine non spécifique. Après incubation pendant 1 heure à.la température ambiante, on lave les plaques trois fois a l'aide 15 de 200 Pl/puits/lavage de solution saline/T. A chaque puits, on ajoute Pl d'un mélange contenant 0,1% de Tween 20 et 0,2% d'albumine de sérum bovin dans du PBS (PTB). Les surnageants des puits de la plaque de culture sont des répliques ensemencées dans les puits correspondants des plaques d'antigènes et des plaques de contrôle (50 Pl/puits) et l'on incube les 20 plaques à la température ambiante pendant 30 minutes. On élimine ensuite les surnageants, on lave les plaques cinq fois avec une solution saline/T et l'on ajoute à chaque puits 50 1l d'immunoglobuline (Ig) de chèvre anti-humaine traitée au bio-étain (TAGO %9303040 à la dilution de 1/250 dans du PTB). Après une incubation de 30 minutes à la température ambiante, 25 on élimine le réactif à base de bio-étain, on lave les puits cinq fois avec une solution saline/T et on ajoute à chaque puits 50 Pl d'un complexe préformé avidine/peroxydase de réfort traité au bio-étain (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories). Après 30 minutes à température ambiante, on élimine le réactif Vectastain ABC, on lave les puits cinq fois avec une solution saline/T et on ajoute à chaque puits 100 Pl de substrat (0,8 mg/ml de dichlorhydrate d'orthophénylènediamine dans 100 mM de tampon de citrate, à pH 5,0 plus 0,03% d'H202 dans H20 déminéralisée, mélangés à volumes égaux juste avant ensemencement). Après 30 minutes d'incubation dans l'obscurité, on ajoute à chaque puits 50 Pl d'H2S04 3N pour mettre fin à la réaction. 35 Les surnageants de culture qui contiennent un anticorps réactif avec les

plaques revêtues de bactéries sont détectées par mesure d'indice d'absorption à 490 nm sur un lecteur micro-ELISA Dynatech MR 580.

Les surnageants de culture provenant de six transformations sont analysés par la méthode ci-dessus, conduisant à l'identification d'un puits (7D7) qui présente une activité sur les plaques de sérotypes de E. coli et S. marcescens mais-non sur les plaques de contrôle. On détermine dans un essai ELISA ultérieur, à l'aide de sérotypes individuels de E. coli, que ce puits contient un anticorps réactif avec au moins les sérotypes de E. coli: 08 (A.T.C.C. n 23504), et 075 (A.T.C.C. n 12798), mais non 04, 06:K2, 08:K8, 09:K9 ou 022:K13 (A.T.C.C. n 12791, 19138, 23501, 23505 et 23517 respectivement). Ce puits contient en outre un anticorps réactif avec les 10 sérotypes de S. marcescens 012, 013 et 015 mais non avec aucun autre des

vingt sérotypes de LPS de S. marcescens connus.

D. Clonage de cellules spécifiques productrices d'anticorps Les cellules du puits 1D7 sont soumises à plusieurs cycles de clonage (quatre) jusqu'à ce que tous les surnageants clonaux essayés par le mode 15 opératoire ELISA ci-dessus donnent une réaction positive avec les sérotypes 08 et 075 de E. coli et avec les sérotypes 012, 013 et 015 de S. marcescens. Il n'y jamais un exemple o aucun surnageant clonal ne démontre une ségrégation dans son schéma de réactivité, ceci suggérant que le surnageant de culture provenant du puits 7D7 possède une vraie réacti20 vité multiple intergenre vis-à-vis des sérotypes de E. coli et de S. marcescens exposés et qu'il ne contient pas plus d'une lignée de cellules (chacune démontrant une réactivité pour un sérotype individuel). Les cellules sont clonées en limitant la dilution dans des plaques à 96 puits à fond rond, en l'absence de cellules d'alimentation. Les milieux sont constitués de milieu Iscove contenant 15% v/v de FBS, de la L-glutamine (2 mM/1), de pyruvate de sodium (1 mM/l), de la pénicilline (100 IU/ml) et de la streptomycine (100 Pg/ml). On alimente les cultures tous les trois jours en remplaçant la moitié du surnageant par des milieux neufs. En général, les puits présentent une densité de cellules lymphoblastoides

suffisante entre deux et trois semaines après l'ensemencement pour que l'on puisse faire l'analyse de la spécificité vis-à-vis du sérotype de l'antiE. coli et du S. marcescens.

Ainsi, dans cette expérience, on obtient une lignée de cellules humaines transformées clonées qui est continue (immortelle) et secrète un

35 anticorps monoclonal humain dirigé contre un déterminant superficiel des sérotypes de E. coli et S. marcescens.

Avant le dépôt de la présente demande de brevet, la lignée de cellules humaines transformées continues identifiée sous le nom de 7D7 a été déposée

à l'American Type Culture Collection, Rockville, MD sous le n A.T.C.C.

CRL 9009.

E. Caractérisation supplémentaire de la réactivité multiple intergenre On essaie un anticorps provenant de la lignée de cellules 7D7 clonées pour tester sa réactivité multiple intergenre supplémentaire par modification de la technique d'immunot1che classique. Spécifiquement, on étudie la réactivité multiple vis-à-vis des bactéries K. pneumoniae, E. aerogenes et 10 E. cloacae en déposant des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose grillagé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec cet anticorps et en développant les réactions d'anticorps à l'aide d'un système enzymatique phosphatase alcaline/tatrézolium nitroblue. En bref, on dépose 1,0 P1 de bactérie (O.E.660 = 0,4) par section de grille 15 d'un disque de papier de nitrocellulose (Schleicher et Schuell, disque de nitrocellulose de 37 mm, réseau de 0,45 Pm). Chaque disque commodément tenir 60 échantillons différents de bactéries. Les disques ensemencés sont séchés a l'air, on les fixe dans l'isopropanol à 25% v/v pendant 30 minutes et on les bloque pendant 10 minutes dans le réactif au lait écrémé sec, comme cela est décrit pour la méthode ELISA. Les disques bloqués sont lavés trois fois pendant 5 minutes chacun dans du PBS/Tween 20 et on les transfère sur les couvercles de bottes de culture de tissu de 35 x 10 mm. Le surnageant contenant l'anticorps (1,0 ml) est introduit sur le couvercle et on l'incube à température ambiante pendant 60 minutes. A la suite de trois lavages de 5 minutes dans du PBS/Tween 20, on ajoute pendant 60 minutes à la température ambiante 1 à 2 ml d'immunoglobuline chèvre-antihumaine (TAGO, Burlingame, CA) conjuguée avec de la phosphatase alcaline (PBS) diluée à 1/1000. Les disques sont lavés comme ci-dessus et on les submerge dans 1 à 2 ml de substrat neuf préparé de la façon suivante: on dissout 16,5 mg de bromo- chlorindolylphosphate et de 8,5 mg de tétrazolium nitroblue dans 50 ml de tampon de phosphatase alcaline (0,1 M Tris-HCl, pH 9,5 avec du NaCl 0,1M et du MgC12 5 mM), on maintient la solution dans l'obscurité et on filtre immédiatement avant utilisation. Après un développement coloré approprié (10 à 15 minutes), on stoppe la réaction par rinçage du disque dans plusieurs charges d'eau distillée. On peut stocker le disque développé

après séchage.

Les disques contiennent: 50 souches de référence de type capsule de K. pneumoniae, obtenues chez le Docteur George Kenney, Université de Washington, Département de Pathobiologie, Seattle, WA et de l'American Type Culture Collection, 4 isolats de sang clinique de E. aerogenes et 6 isolats de sang clinique de E. cloacae (isolats de sang obtenus à Harborview Hospital, Seattle, WA). Les isolats d'Enterobacter sont typés (détermination de l'espèce) en utilisant de Système API 20E de 23 tests biochimiques standardisés (API Analytab Products, Plainview, NY). Cette méthode identifie le genre et l'espèce des bactéries gram-négatives mais non leur 10 sérotype. De ce fait, à la différence des E. coli, S. marcescens et K. pneumoniae, on n'identifie pas le sérotype des Enterobacters, mais

seulement leur genre et leur espèce.

A partir de ces expériences, on observe que l'anticorps 7D7 possède une réactivité multiple intergenre supplémentaire. Cet anticorps réagit 15 avec les sérotypes suivants: K. pneumoniae E. coli S. marcescens E. aerogenes K14,47,60 08,75 012,13,15 isolats cliniques On observe donc que l'anticorps monoclonal humain 7D7 possède une réactivité multiple intergenre dirigée contre des bactéries appartenant aux 20 espèces E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes mais non

E. Cloacae.

F. Caractérisation des anticorps monoclonaux La constatation que l'anticorps monoclonal réagit avec divers genres de bactéries suggère que l'anticorps est dirigé contre une protéine ou un 25 hydrate de carbone partagée entre elle. Il a été démontré que ces deux espèces moléculaires étaient responsables de réactions multiples intragenres EMutharia L. et Hancock R.E.W., "Characterization of Two SurfaceLocalized Antigenic Sites on Porin Protein F of Pseudomonas aeruginosa", Canadian J. of Microbiol., 31, 381-386 (1985) et Orskov F. et Orskov I., 30 "Serotyping of Escherichia Coli", in Methods in Microbiology, Volume 14,

Bergan T., ed. Academic Press, Orlando, FL, 43-112 (1984)3.

Une caractérisation biochimique des espèces moléculaires reconnues par l'anticorps 7D7 s'effectue par analyse à l'immunotâche. En bref, des bactéries lavées provenant de 20 ml d'un bouillon de culture cultivé pendant la durée d'une nuit (pour les sérotypes de E. coli, S. marcescens et E. aerogenes) ou de plaques ayant poussé pendant la durée d'une nuit (K. pneumoniae) sont extraites dans 1,0 ml d'une solution convenant 64 ml

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de Tris 50 mM pH 7,6, 30 ml de glycérol, 0,3 g de déoxycholate (sel de sodium), 0,14 ml de béta-mercaptoéthanol et 6 ml d'eau déminéralisée [Schechter I. et Block K., "Solubilization and Purification of transFormesyl Pyrophosphate-Squalene Synthetase", J. Biol. Chem., 256, 7690-7696 (1971)]. Après 18 heures d'incubation a 4 C, on passe la suspension à la centrifugeuse à 10 000 x g pendant 10 minutes. On élimine le surnageant et on fait une analyse quantitative de la protéine en utilisant l'essai de protéine Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) . Entre 100 et 1000 ng de protéine (quantités diverses en fonction de chaque extrait bactérien) 10 provenant de chaque bactérie sont soumis à une électrophorèse en présence de dodécylsulphate de sodium (SDS)-gel de polyacrylamide [Kusecek B. et coll., "Lipopolysaccharide, Capsule, and fimbriae as Virulence Factors Among 01, 07, 016, 018 et 075 et K1, K5 ou K100, Escherichia coli", Infection and Immunity, 43, 368-379 (1984)]. Les espèces moléculaires 15 séparées sont transférées du gel à une membrane de nitrocellulose (NCM) comme cela est décrit ailleurs [Towbin H. et coll. , "Electrophoretic Transfer of Proteins From Polyacrylamide Gels to Nitrocellulose Sheets: Procedure and Some Applications", Proc. Natl. Acad. Sci., 76, 4350-4354 (1979)], et la tâche de NCM est bloquée pendant 1 heure dans du PBS-Tween 20 [Batteiger B. et coll., "The Use of Tween 20 as a Blocking Agent in the Immunological Detection of Proteins transferred to Nitrocellulose Membranes", J. Immunol. Meth. 55, 297-307 (1982)]. On incube la tâche pendant 1 heure à température ambiante dans 10 ml de surnageant de liqueur usée provenant de la lignée 7D7. Après quatre rinçages de 5 minutes dans du 25 PBS-Tween, on incube la tâche dans une Ig de chèvre anti-humaine conjuguée à de la phosphatase alcaline et développée conmne décrit ici pour l'essai de bactérie sur disque de nitrocellulose. On note des réactions positives sur toutes les pistes qui contiennent des extraits de déoxycholate des bactéries décrites ici. Dans ces pistes, il apparaît que l'anticorps 7D7 recon30 nalt une série d'entités moléculaires régulièrement espacées donnant lieu à un effet d'échelle sur l'immunotâche. Ce profil est entièrement cohérent avec celui rencontré dans l'analyse par électrophorèse sur gel de polyacrylamide du LPS en présence de SDS pour lequel il a été démontré que le profil de dimension hétérogène présenté par les raies était dO à une 35 population de molécules de LPS différant par des incréments pondéraux équivalents au nombre de motifs de chalne latérale d'oligosaccharide

O-antigénique présents par molécule [Pavia E.T. et Makela P.H., "Lipopoly-

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saccharide Heterogeneity in Salmonella typhimurium Analysed by Sodium Dodecyl Sulfate/Polyacrylamide Gel Electrophoresis", Eur. J. Biochem., 107, 137-143 (1980) et Goldman R.C. et Leive L., "Heterogeneity of AntigenicSide-Chain Length in Lipopolysaccharide from Escherichia coli 0111 and 5 Salmonella typhimurium LT2, Eur. J. biochem, 107, 143-154 (1980)]. Ces données indiquent que l'anticorps monoclonal 7D7 est dirigé contre un déterminant antigène partagé par les molécules de LPS rencontrées sur quelques sérotypes de E. coli, S. marcescens, K. pneumoniae et

E. aerogenes.

Pour mieux définir la nature moléculaire de l'antigène, on traite les extraits de déoxycholate avant leur électrophorèse par une enzyme protéolytique, la Protéinase K [Eberling W. et coll., "Proteinase K from Tritirachium album Limber", Eur. J. Biochem. 47, 91-97 (1974)]. Pour préparer l'échantillon, 10 P9 de protéinase K sont ajoutés à 50 hg de l'échantillon 15 de protéine et le mélange, est chauffé à 65 C pendant 60 minutes. On passe les échantillons en électrophorèse et en immunotâche comme ici. Les schémas d'immunotâche observés après traitement à la Protéinase K sont identiques aux schémas observés sans traitement et suggèrent ainsi que l'antigène

réactif avec l'anticorps 7D7 n'est pas la nature d'une protéine.

Pour déterminer spécifiquement si le 7D7 réagit avec un épitope d'hydrate de carbone, on soumet l'échantillon de déoxycholate électrotransféré à une oxydation modérée par le periodate avant de faire réagir le papier de nitrocellulose avec l'anticorps. Il a été démontré que cette réaction détruisait les déterminants à base d'hydrate de carbone et détrui25 sait donc leur réactivité ultérieure avec l'anticorps sans altérer les épitopes de protéine ou de lipide [Woodward M.P. et coll., "Detection of Monoclonal Antibodies Specific for Carbohydrate Epitopes Using Periodate Oxidation", J. of Immunol. Methods, 78, 143-153 (1985)]. En bref, après que l'on ait bloqué le papier de nitrocellulose marqué par électrotâche conte30 nant l'échantillon transféré par électrophorèse avec du PBS-Tween comme décrit ici, on rince le papier à l'aide d'un tampon à pH 4,5 d'acide acétique acétate de sodium 50 mM. On incube le papier de nitrocellulose dans de l'acide periodique 50 mM dissous dans le tampon d'acide acétique pendant 60 minutes, dans l'obscurité, à température ambiante. On rince le 35 papier traité trois fois dans du PBS-Tween et on le fait réagir avec l'anticorps comme décrit ici. Les extraits de déoxycholate transférés par électrotkche traités de cette façon ne sont plus réactifs avec l'anticorps monoclonal 7D7. Ces données indiquent fortement que l'épitope reconnu par cet anticorps est un hydrate de carbone présent sur la molécule de LPS des

bactéries décrites ici.

L'isotype de l'anticorps monoclonal 7D7 est déterminé dans un mode opératoire ELISA semblable aux tests de spécificité décrits ci-dessus sauf que l'on utilise une IgG de chève anti-humaine traitée au bio-étain (spécifique de chaîne gamma, TAGO) ou une IgM de chèvre anti-humaine traitée au bio-étain (spécifique de chaîne mu, TAGO) comme réactif de seconde étape au lieu de Ig de chèvre anti-humaine traitée au bio-étain plus largement réactive. Les réactifs sont utilisés tous les deux à une dilution de 1/500 et la plaque d'antigène contient des ensembles de souches de E. coli 08 et 075 immobilisées à la PLL. On observe une réaction positive de l'anticorps monoclonal 7D7 avec les souches de E. coli seulement en présence du réactif anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM pour l'anticorps monoclonal. Les 15 spécialistes apprécieront que si l'on répète plusieurs fois le processus ci-dessus et si l'on détermine les isotypes des anticorps monoclonaux à réactivité multiple intergenre ainsi obtenus, on trouverait d'autres isotypes supplementaires, par exemple IgM et IgG [Frosch M. et coll., "NZB Mouse System For Production of Monoclonal Antibodies to Weak Bacterial 20 Antigens: Isolation of an IgG Antibody to the Polysaccharide Capsules of Escherichia coli K1 and Grop Meningocci", Proc. Natl. Acad. Sci., 82,

1194-1148 (1985)].

G. Activité in vitro On examine l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps mono25 clonal 7D7 dans un essai d'opsono-phagocytose in vitro qui compare l'activité bactériocide de l'anticorps en présence et en l'absence à la fois de

neutrophiles humains et de complément humain.

On prépare les bactéries soit par inoculation de bouillon de soja tryptique (TSB) à l'aide de 50 Pl d'un bouillon de culture cultivé pendant 30 la durée d'une nuit (pour le E. coli, S. marcescens et E. aerogenes), soit, pour le K. pneumoniae, par ensemencement d'une boîte de Pétri contenant de l'agar-agar de Worfel-Ferguson. Pour les bouillons de culture, on incube les tubes à 37 C sur un secoueur pendant 3 heures, ce après quoi on centrifuge 1,5 ml de la culture pendant 1 minute à 10 000 x g, on jette le milieu 35 de culture usé et on met la pastille en suspension dans 3,5 ml d'une solution de sel équilibrée de Hank contenant 0,1% de gélatine et de l'HEPES mM (HBSS/gel). Pour les bactéries cultivées sur plaque d'agar-agar, on gratte les colonies pour les enlever de la plaque et les faire passer dans du gel de HBSS stérile. Les concentrations bactériennes des bactéries cultivées dans les deux conditions sont ajustées à 3 x 103 bactéries/ml en mesurant le 0O.D.660- et en faisant les dilutions appropriées (approximati5 vement 1/50 000). Les neutrophiles humains sont séparés selon une méthode de Van Furth et Van Zwet ["In Vitro Determination of Phagocytosis and Introcellular Killing by Polymorphonuclear and Mononuclear Phagocytes", dans Handbook of Experimental Immunology, Volume 2, D.M. Weir, Ed., 2ème Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 36.1-36.24 (1973)] 10 avec plusieurs modifications. Une couche surnageante provenant de 10 ml de sang héparinisé est mélangée avec du milieu de Ficoll-Paque et on passe à la centrifugeuse. La pastille de cellules de sang rouge (RBC) est lavée une fois avec du milieu RPMI 1640 et remise en suspension dans un volume égal de PBS à 37 C. On ajoute 3 ml de cette suspension à 6 ml de dextrane à 2% 15 (dans du PBS à 37 C) et on mélange les contenus modérément mais à fond end over end. Après une incubation de 20 minutes à 37 C pour laisser sêdimenter les RBC, on élimine le surnageant (contenant les neutrophiles), on lave

deux fois dans du PBS à 4 C, une fois dans du gel de HBSS et on met en suspension dans le même à une concentration de 5 x 107 neutrophiles/ml.

Pour la source de complément utilisée avec le E. coli et le S. marcescens, on adsorbe deux fois du sérum humain en présence de collections de bactéries vivantes [Bjornson A.B. et Michael J.G., "Factors in Human Serum Promoting Phagocytosis of Pseudomonas aeruginosa I. Interaction of Opsonins with the Bacterium", J. of Inf. Dis., 130 Suppl., S119-5126 (1974)] corres25 pondant aux organismes utilisés dans l'essai. Ce sérum est à nouveau adsorbé avec du Zymosan bouilli (Bjornson, supra) pour éliminer un comiposant du sérum, la propéridine, molécule nécessaire à l'activation de l'autre chemin de complément possible. Pour des essais opsonophagocytiques utilisant le K. pneumoniae et le E. aerogenes, la source de complément est 30 du sérum humain normal non adsorbé utilisé à une concentration finale de 1%. Les plaques utilisées pour quantifier le rapport des bactéries survivantes/détruites sont préparées au début par chauffage de 24 plaques de puits à 37 C pendant 3 à 5 heures. Une solution à 0,4% d'agarose dans du 35 TSB est préparée par passage à l'autoclave du mélange pendant 5 minutes et en le laissant refroidir à 50 C au bain-marie. Approximativement 15 minutes avant la fin de la période d'incubation finale dans l'essai d'opsonophagocytose, on retire une plaque à 24 puits de l'incubateur à 37 C, on la place

28 2595946

sur une plaque chaude à 42 C et on ajoute à chaque puits 0,4 ml de mélange TSB/agarose. On ramène immédiatement la plaque dans l'incubateur à 37 C de

telle sorte que l'agarose ne se refroidit jamais en-dessous de 37 C.

Pour l'essai, 25 Pl de surnagent de culture de 7D7 et25 Ul d'une souche bactérienne appropriée sont ajoutés en double à des plaques de microtitrage à 96 puits à fond rond et on incube à température ambiante pendant 30 minutes. On fait suivre ceci de l'addition de 15 P1 de complément humain, 15 Pl de neutrophiles humains (5 x 106/ml) et 70 91 de gel de HBSS. On essuie la surface entière de la plaque avec un tampon de coton 10 stérile et on applique une plaque de plastique adhésif pour recouvrir de façon sOre la plaque entière et les espaces existants entre les puits et l'on fait tourner la plaque à 37 C pendant 1 heure. Après incubation, on passe la plaque à la centrifugeuse pendant 5 minutes à 100 x g, on enlève délicatement le couvercle de la plaque et l'on sèche la surface de la 15 plaque avec un coton stérile plongé dans de l'éthanol à 70%. On prélève 1Pl de chaque puits de microtitrage et on les ajoute à des puits individuels de plaques de titrage quantitatif à 24 puits contenant déjà 0,4 m/puits de mélange à 0,4% de TSB/agarose (38 à 40 C). On place ces plaques sur un secoueur à fond plat pendant 1 minute à 150 tr/min et on laisse l'agarose durcir pendant 15 minutes à température ambiante. Finalement, on ajoute à chaque puits une surcouche de 0,4 ml de mélange TSB/agarose, ce que l'on fait suivre d'une période de durcissement de 15 minutes à

4 C avant de faire incuber les plaques à 37 C pendant la durée d'une nuit.

Après 18 heures, on dénombre les colonnes et l'on reporte les données en 25 tant que unités de formation de colonies (CFU) pour chaque condition.

Les sérotypes bactériens utilisés ici, sauf le K. pneumoniae, sont seulement inactivés en présence d'anticorps monoclonal 7D7, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (Tableau 1). Lorsque l'on répète cette expérience avec plusieurs sérotypes bactériens réactifs non 7D7, on n'observe pas de destruction de bactéries (donnée non indiquée), ce qui démontre la spécificité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal 707 et sa capacité à fixer l'opsonine sur les bactéries et favoriser leur phagocytose. Etant donné que les actions combinées des opsonines (anticorps spécifiques) et des leucocytes polymorphonucléaires (neutrophiles) apparais35 sent être le mécanisme primaire d'immunité de ces souches bactériennes, ces données suggèrent que, après une administration appropriée, l'anticorps 707 procurerait une protection contre des menaces mortelles portées par les

sérotypes de bactéries décrits ici.

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996S6SZ

L'anticorps IgM dans le précipité au sel de sulfate d'ammonium est purifié par chromatographie d'affinité sur une colonne d'affinité garnie d'anticorps IgM anti-humain monoclonal de souris. Pour préparer la colonne, un gramme de Sepharose 4B activé par du bromure de cyanogène déshydraté (Pharmacia) est mélangé avec 15 ml de HCl I mM refroidi à la glace dans de l'eau distillée. Le gel hydraté est lavé dans 30 ml de tampon de couplage (carbonate 0,1M (NaHCO3) dans NaCl 0,5M, pH 8,2), on draine pour préparer un gateau humide et on combine au précipité de sel d'ammonium dissous dans 1 à 3 ml de tampon de couplage. Le gel en suspension est mélangé bout à 10 bout pendant 2 heures à température ambiante et on passe ensuite à la centrifugeuse à 200 x g pendant 5 minutes. Pour bloquer les sites réactifs encore disponibles, on élimine le surnageant, on ajoute au gel 10 ml d'éthanolamine 1M et on poursuit le mélange comme ci-dessus. On passe la suspension à la centrifugeuse à 200 x g pendant 5 minutes et l'on jette le 15 surnageant. On prépare le gel pour son utilisation avec un lavage dans un tampon acétate O,1M/solution saline (6,8 g d'acétate de sodium trihydraté et 14,6 g de NaCl sont dissous dans 500 ml d'eau distillée contenant 2,9 ml d'acide acétique glacial, pH 4,0), deux lavages dans du tampon de couplage

et deux lavages dans du PBS. On verse le gel dans une colonne Pharmacia 20 CIO/10 et on stocke à 4 C jusqu'à utilisation.

Pour purifier l'immunoglobuline, 0,5 ml de matériau fractionné au sel est dilué à 2,0 ml dans du PBS et l'on ajoute à la colonne d'affinité. A la suite du chargement de l'échantillon, on lave la colonne avec du PBS, pH 8,0 jusqu'à ce que le dispositif de surveillance du coefficient d'absorp25 tion n'indique plus d'autre protéine dans ce qui s'écoule. L'anticorps lié est élué avec du MgCl 2M dans du PBS, on détermine la concentration en protéine pour chaque fraction à 0.D.280 et l'on rassemble les fractions de pics. La fraction contenant l'anticorps est dessalée sur une colonne Sephadex G-25 et, si nécessaire, on concentre à l'aide d'une centrifugation 30 de microconcentration (Centricon 30, Amicon Corp., Danver, MA) à 1 à 2 mg/ml. On teste la pureté de la préparation finale par électrophorèse sur SDS-gel de polyacrylamide que l'on fait suivre d'une révélation des protéines au nitrate d'argent (Morrissey J.H., "Silver Stain for Proteins in Polyacrylamide Gels: A Modified Procedure with Enhanced Uniform Sensitivity", 35 Anal. Biochem. (1981), 117, 307-310) et l'activité de l'anticorps par la

méthode ELISA telle qu'indiquée plus haut.

Pour chaque attaque par Swiss-Webster pesant entre 20 souris chacun. Une expérience suivante: des bactéries, des souris femelles de type et 22 g sont divisées en trois groupes de dix représentative est mise en oeuvre de la façon Groupe Bactérie Anticorps A E. coli 08 707 B E. coli 08 6Fll C S. marcescens 014 7D7 Chaque groupe recevant un anticorps reçoit une injection par voie

intraveineuse de 200 P1 de PBS stérile contenant 25 Pg d'anticorps purifié.

Deux heures plus tard, tous les animaux sont traités par voie intrapéritonéale par 300 Pl de bactéries vivantes contenant 3 LD50 de leur souche bactérienne respective. Les suspensions bactériennes ont été préparées à partir d'un bouillon de culture en phase de croissance logarithmique à partir duquel on a centrifugé les bactéries, on les a lavé deux fois dans le PBS et on les a remise en suspension à la concentration appropriée dans du PBS. On observe les animaux pendant une période de 5 jours. De 24 à 48 heures après l'attaque, tous les animaux du Groupe B (anticorps non pertinent) et du Groupe C (organisme non pertinent) sont morts. Au contrai20 re, les animaux qui ont recu l'anticorps 7D7 (Groupe A) sont tous vivants

et exempts de symptOmes.

Ce modèle de protection animale est utilisé pour démontrer l'effet thérapeutique de l'anticorps 7D7 vis-à-vis des attaques bactériennes par

des organismes appartenant aux trois genres exposés ci-dessus. Un résumé de 25 ces données est donné dans le Tableau 2.

TABLEAU 2

Bactérie d'attaque i Anticorps i Survie/Attaque! % de survie I

!! _ _ _ _ _ _ _ _ _ _!_ _;!

E. i 0 E. coli 08 i 7D7! 10/10! 100

I I I I.!

i E. coli 08 i 6Flla i 0/10! 0 i S. marcescens 014b! 707 1 0/10 i à!

!!! !

a L'anticorps 6Fll est spécifique du Pseudomonas aeruginosa Fisher

immunotype 2 et il sert d'anticorps de contrôle négatif.

b Le S. marcescens 014 n'est pas réactif avec l'anticorps 7D7 et il

sert d'organismes de contrôle non spécifique.

aeluownaud 'suaosaiew 'S ap san oLowoq4 sadúloJgs saL alJuo sdJoDlue ZaO ap oE^IA uL auLuosdo,p uowexI; ap oAIoe,[L ap uo0elsuowgp eL auuop SC aLdwaxa -a 'aalno u3 -saua6oJae uaaeqo.a8u3 la aeluownaud ettaLsqat suasaJeuw eQteaJas saedsa sap saiqwaw ap s!A-Q-slA ajua6Balul atdlLnw ILla[oega aun apessod tnb uLewnq tLeuoLaouow sdjoilue un,p uopDatgs ap la uow.euedgid ap sapo4lw ap uo4eJ4suoWp eL auuop II atdwaxa,l II 31dW3X3 OC -saua6OJae '3 la LLOD '3 sa^e6au-weJ5 sat.aoeq ap saDQdsa xne lueua-jedde sawslue6ao sap Jed saguuoLseQoo suooaJu4 sap aluoa gIJind sduoo -jluep 56 SZ ap aple,l ? uotiaaojd aun jaanoood ap aLqedeD 4sa aaua6Jalut aLdtVlnw ?4AI13ega LOI uewfn4 LeuotoDouow sdJoDLIue,t 'suLoWueaN '(sael -uasgadai uou sa"uuop) a4uap!^a sed 3sa,u aeiuownaud aet jed saeuuomsemDo SZ SUOt33aJu sap SLA-e-StA L L Sdao3DlUe,L jed uoIlDalo.d eL '(91-#tl (4861) 1i 'opue[LO 'ssaid [twape3V "'P3 "jL ueSjaa 't awunloA 'X6o[olqojDIw uy spoqiae ut '14,eLttsqaL Io 6utdXoia$S '"S 0SAo0sO 3a *I AOnSiO) saLqIssa33e suIow Zuos aeluOwnaud ' np Sdl ap saLnDpLOw saL anb slew $Sdl SaL ins 1uasa7d auoqiea ap aeupXq,p adolda un oa^e 4oegI D sa Z aLe a nb quuop oZ lue43 saAleg65u-weJi saLJ9aeq ap saDQdsa sa;uaaj4lp sko: g lueualedde saieaa-oq sap jed saLeq4[L sanbelle sap sJlnos saL Ja6gload apa[qedea 4sa LOZ ulewnq Leuotoouow sdJoj4ue,L anb 4uaJauowgp sauuop sa) snssap-o 34Jpop amuo) 'sai3Joeq saL la sdoaotlue,t 4uaAtoCai sfinos sat Si t Jnor al 6/6w O:z inop '6W/6 OSI:0 inop:alueAIns uo0e el ap aplweqdsoqdotK3 ap uoLlaarui ied anbiugdoi4nau npuai uo,L anb spnos ap apieL g aaAnao ua sasmw uos uotoa3oid ap 3a OSUa ap sapn; sal, iiii i i i i i ii ii i i i iiI i t? i 1v i 9 i 01 i Z I i tOZ i i ' i i i i i i I i i T i Z i Zi i IIJ9 i i i i i ú i I i _ i 0 i i i i i i.u i o.AflOf' sd.. o3uv

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i 3 atafns ap % j i. _ _ _ _ i i i nv3isIV O! S 9t6S6çZ et E. aerogenes. On répète le mode opératoire de l'exemple I (essentiellement comme celui décrit dans les parties A à G) pour préparer un anticorps monoclonal humain qui donne une protection multiple contre les infections

occasionnées par les bactéries décrites ci-dessus sauf qu'il est nécessaire 5 de faire des modifications spécifiques pour caractériser et essayer l'anticorps décrit dans cet exemple. Ce qui suit représente les changements des modes opératoires d'essai et les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal ici décrit.

1. Les surnageants de culture provenant de six transformations sont 10 analysés par la méthode ci-dessus et conduisent à l'identification d'unpuits (4F10) qui possède une activité sur la plaque de sérotype de S. marcescens mais non sur le E. coli ou sur la plaque de contrôle. On détermine dans une analyse ELISA ultérieure à l'aide de sérotype individuel de S. marcescens que ce puits contient un anticorps réactif avec les

sérotypes de S. marcescens 015 et 018 mais avec aucun autre des vingt sérotypes connues de LPS de S. marcescens.

Avant le dépôt de la demande de brevet prioritaire, la lignée de cellules humaines transformées continues (immortelles) identifiées sous le

* n 4F10 a été déposée à l'American Type Culture Collection, Rockville, MD 20 sous le n A.T.C.C. CRL 9007.

2. On essaie un anticorps provenant de la lignée de cellules 4F10 clonées pour en tester la réactivité multiple intergenre supplémentaire à l'aide d'une modification de la technique standard d'immunotkche. Spécifiquement, on étudie la réactivité multiple vis-à-vis des bactéries K. pneumo25 niae, E. aerogenes et E. cloacae en déposant des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose grillagé, en faisant réagir le disque contenant

les bactéries avec cet anticorps et en développant les réactions d'anticorps à l'aide d'un système enzymatique phosphatase alcaline/tétrazolium nitroblue.

A partir de ces expériences, on observe que l'anticorps 4F10 possède 30 une réactivité multiple intergenre supplémentaire. Cet anticorps réagit avec les sérotypes suivants: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes K3, 12,29,31,68,72 015,18 Isolats cliniques L'anticorps monoclonal humain 4F10 possède donc une réactivité

multiple intergenre vis-à-vis de bactéries appartenant aux espèces S. marcescens, K. pneumoniae, E. aerogenes.

3. En utilisant la technique d'immunotâche, on note des réactions positives dans toutes les pistes qui contiennent des extraits de déoxycholate des bactéries décrites ci-dessus. Il apparaît dans ces pistes que l'anticorps 4F10 reconnaît soit une large bande de composants, soit une certaine série d'entités moléculaires régulièrement espacées donnant lieu à un schéma à allure d'échelle. Ce profil est entièrement cohérent avec celui rencontré dans les analyses d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide des radicaux d'hydrate de carbone qui démontrent une importante hétérogénéité de poids moléculaire due à une séquence de sucre spécifique se répétant 10 souvent ou à des molécules de LPS différant par des incréments de poids équivalent au nombre de motifs de chaine latérale oligosaccharide antigénique O par molécule (Vimr E.R. et coll., "Use of Procaryotic-Derived Probes to Identify Poly (Sialic Acid) in Neonatal Neuronal Membranes", Proc. Natl. Acad. Sci., (1983), 81, 1971-1975; et Holden K.G. et coll., 15 "Gel Electrophoresis of Mucous Glycoproteins, I. Effect of Gel Porosity",

Biochemistry (1971) 10, 3105-3109). Ces données indiquent que l'anticorps monoclonal 4F10 est dirigé contre un déterminant antigénique partagé par des molécules d'hydrate de carbone que l'on rencontre sur quelques sérotypes de S. marcescens, K. pneumoniae et E. aerogenes.

Les schémas d'immunoteche observés après traitement à la Protéinase K sont identiques aux schémas observés sans traitement et suggèrent ainsi que

l'antigène réactif avec l'anticorps 4F10 n'a pas la nature d'une protéine.

Pour vérifier de façon spécifique si le 4F10 réagit avec un épitope d'hydrate de carbone, on soumet l'échantillon de déoxycholate électro25 transféré à une oxydation modérée au periodate avant de faire réagir le papier de nitrocellulose avec un anticorps. Les extraits de déoxycholate électro-déposé traités de cette facon ne sont plus réactifs avec l'anticorps monoclonal 4F10. Ces données indiquent intensément que l'épitope

reconnu par cet anticorps est un radical hydrate de carbone présent sur des 30 molécules faisant partie des bactéries décrites ci-dessus.

4. On détermine l'isotype de l'anticorps monoclonal 4F10 par un mode opératoire ELISA semblable aux tests de spécificité décrits dans l'exemple I, sauf que la plaque d'antigène contient un ensemble de sérotypes de S. marcescens 015 et 018 immobilisés par PLL. On n'observe une réaction positive de l'anticorps monoclonal 4F10 avec les sérotypes de S. marcescens seulement avec les réactifs anti-IgM, ce qui démontre un isotype IgM chez l'anticorps monoclonal. Les spécialistes apprécieront que si l'on répète À(saznutu og luspuad Do9;) inaluqn sI I gT4ae'U7 ulsmnq luamgldmoD - (-) i i i I i LcIL. - -- aliMnige 'l 1 i î i i i i S i i i i i i i î i i i i i o I o I i o i i o i i o i oi o I + i i + i i + I i + i i + i i + i i +i i - i i + i + i +i i L(IL i i t1i9 i L(GL i L i T119 i L iL MIL i i

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9M6S65Z

b (6F1l) - surnageant de culture contenant un anticoïrps iooc1lnal t;% ain IgM

dirigé contre le Pseudon:onas aeruginosa Fisher type 2.

EXEMPLE III

L'exemple III donne la démonstration de méthodes de pr4paration d'un anticorps humain qui soit réactif à la fois avec le polysaccharide de l'Escherichia coli capsulaire type K1 et du Neisseria manfngitidis (N. meningitidis) Groupe B et donne en outre la d(monostration de l'activité protectrice de cet anticorps in vivo contre une attaque mortelle des espèces bactériennes homologues E. coli et N. meningitidis. On répète le 10 processus de l'exemple I (essentiellement décrit dans les parties A à G) pour préparer un anticorps monoclonal humain qui donne une protection multiple contre les infections occasionnées par les bactéries décrites cidessus, sauf qu'il est nécessaire de faire des modifications spécifiques pour caractériser et tester l'anticorps décrit dans cet exemple. Ce qui suit représente les changements dans les modes opératoires d'essai et dans

les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal ici décrit.

1. On analyse les surnageants de culture provenant de cinq transformations par la méthode ci-dessus, ce qui conduit a l'identification de quatre puits (504, 2C10, 9B10 et 8A8) qui contiennent une spécificité anti-E. coli sur la plaque de sérotype de E. colt mais non sur le S. marcescens ou les plaques de contrôle. On détermine dans une analyse ELISA ultérieure conduite comme indiquée ci-dessus sur des sérotypes individuels de E. coli que ces puits contiennent un anticorps réactif au moins avec les sérotypes de E. coli: 01 (ATCC 23499); 07:K1 (ATCC 12792); 016:K1 (ATCC 23511) 25 et 050 (CDC 1113-83), mais non les 04 (ATCC 12791); 06:K2 (ATCC 19138); 08:K8 (ATCC 23501); 09:K9 (ATCC 23505) ou 022:K13 (ATCC 23517). A cause de ces meilleures performances pendant le clonage et la production accrue d'anticorps, l'anticorps monoclonal 9B10 est sélectionné pour la poursuite

de l'analyse.

Avant le dépôt de la demande de brevet prioritaire, la lignée de cellules humaines transformées continuées (immortalisées) identifiées ici sous le n 9B10 a été déposée à l'American Type Culture Collection, Rockville,

MD sous le n A.T.C.C. CRL 9006.

2. La constatation que les anticorps monoclonaux provenant de chacun 35 des clones que l'on a fait réagir avec le groupe identique de sérotypes d'antigène O de E. coli indiquent que ces anticorps sont dirigés contre une structure superficielle de bactéries commune à ces sérotypes. Plusieurs approches sont utilisées pour définir la structure superficielle commune à ces sérotypes de E. coli. Comme exposé ci-dessus, deux des quatre sérotypes de E. coli (07:K1 et 016:K1) identifiés par l'anticorps 9B10, possèdent le sérotype capsulaire K1 tandis que les deux autres (01 et 050) n'ont pas été typés pour détecteur leur sérotype antigène K. Il reste donc la possibilité 5 que l'anticorps 9B10 contienne une réactivité vis-à-vis de l'antigène K1 et que les souches de E. coli possédant les sérotypes antigène-O 01 et 050

possèdent également le sérotype capsulaire K1.

D'autres chercheurs ont profité de la thermolabilité de la capsule K1 pour établir sa présence. Le chauffage de sérotypes de E. coli positifs au 10 K1 dans un bain d'eau bouillante à 100 C pendant 60 minutes élimine l'aptitude ultérieure de ces souches à réagir avec des sérums anti-K1 et elle améliore leur aptitude à réagir avec des sérums antigènes anti-O (Orskov F. et Orskov I., "Serotyping of Escherichia coli" in Methods in Microbiology, Volume 14, T. Bergan, ed., Academic Press, London (1984) pp. 44-105). Il 15 est vraisemblable que les effets réciproques de l'ébullition sont dus à l'élimination de la capsule et à l'accessibilité accrue de l'anticorps aux molécules de lipopolysaccharide (LPS). Les sérotypes de E. coli positifs au K1 (07 et 016) et les sérotypes non typés pour le K1 (01 et 050) sont chauffés comme indiqué ci-dessus et on les fait réagir avec l'anticorps 20 9B10 et des sérums hétérologues spécifiques du sérotype LPS (Difco BactoE. coli Typing Reagents) selon le mode opératoire ELISA. Les organismes traités à la chaleur perdent toute leur réactivité vis-à-vis de l'anticorps 9B10 et ils voient augmenter leur réactivité avec leurs sérums spécifiques homologues du sérotype LPS tandis que les organismes (de contrôle non traité) restent fortement réactifs avec des surnageants de culture de 9B10 et faiblement réactifs avec leurs anti-sérums spécifiques

respectifs de sérotype LPS.

Il a été prouvé que le polysaccharide (hydrate de carbone) provenant des bactéries Neisseria meningitidis du Groupe B (un homopolymère d'acide 30 sialique, l'acide poly-N-acétyl neuraminique lié en position alpha 2,8) était d'un point de vue chimique et antigénique homogène avec le polysaccharide du E. coli K1 (Grados 0. et Ewing W.H., "Antigenic Relationship between Escherichia coli et Neisseria meningitidis", J. Immunol. (1973) , 262-268). Ces données suggèrent que, si l'anticorps monoclonal 9B10 35 contient une spécificité vis-à-vis de la capsule de E. coli K1, alors l'anticorps devrait également contenir une spécificité visà-vis du polysaccharide du N. meningitidis du Groupe B et, en outre, que les anticorps monoclonaux contenant une spécificité vis-à-vis du polysaccharide du Groupe B du N. meningitidis, devraient également démontrer une réactivité vis-à-vis des souches de E. coli possédant la capsule K1. Deux protocoles expérimentaux sont utilisés pour tester (1) l'aptitude de l'anticorps 9B10 à réagir avec le N. meningitidis; et (2) l'aptitude d'un anticorps dirigé contre un polysaccharide du N. meningitidis du Groupe B à réagir avec les quatre sérotypes

réactifs au 9B10 du E. coli.

On fait réagir un polysaccharide extrêmement purifié du Groupe b (Conaught Laboratories, Toronto, Canada) et des bactéries viables de N. meningitids du Groupe B avec l'anticorps 9810 dans un mode opératoire ELISA comme exposé ci-dessus. L'anticorps monoclonal 9B10 réagir fortement vis-à-vis des deux préparations d'antigène. Pour prouver la spécificité réciproque, on utilise un kit de test de méningite occasionné par une N. meningitidis du Groupe B disponible dans le commerce ("Directagène" système de détection directe d'un antigène, Hinson, Westcott, et Dunning, Baltimore, MD) qui utilise des sphères de latex revêtues d'un anticorps monoclonal de souris dirigé contre le polysaccharide du Groupe B. Dans des essais d'agglutination utilisant les sérotypes de E. coli positifs au 9B10, les quatre sérotypes démontrent tous une forte réactivité avec les sphères 20 revêtues d'anticorps. Les sérotypes de E. coli connus pour être négatifs à l'antigène K1 sont également négatifs dans ce système de tests. Collectivement, ces données indiquent que l'anticorps monoclonal 9B10 est réactif avec la capsule K1 de E. coli et avec l'hydrate de carbone spécifique du type existant sur le N. meningitidis du Groupe B. En outre, puisque ces 25 essais sont mis en oeuvre avec des bactéries intactes et viables, on peut en déduire que l'anticorps monoclonal 9B10 est spécifique de quelques

parties d'une région exposée à l'extérieur de la molécule d'acide polysialique.

3. On détermine l'isotype de l'anticorps monoclonal 9B10 dans un mode 30 opératoire ELISA semblable aux tests de spécificité décrits dans l'exemple I sauf que la plaque d'antigène contient un ensemble de sérotypes de E. coli positifs au K1 immobilisés par la PLL. On observe une réaction positive de l'anticorps monoclonal 9B10 avec les sérotypes de E. coli positifs au K1 seulement avec le réactif anti-IgM, ce qui démontre pour l'anticorps monoclonal un isotype IgM. Les spécialistes apprécieront que si l'on répète le processus de cet exemple plusieurs fois et que l'on détermine les isotypes d'anticorps monoclonaux spécifiques au K1 ainsi obtenus,

on trouverait d'autres isotypes, par exemple des isotypes IgM et IgG.

L LO * 3

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imrinunotype 2 et il sert d'anticorps de contrôle négatif.

b Le E. coli K2 n'est pas réactif avec l'anticorps 9B10 et il sert

d'organismes de contrôle non spécifique.

Ces données démontrent que l'anticorps monoclonal humain 9B10 est capable de protéger les souris des attaques mortelles par des bactéries appartenant à deux différentes espèces bactériennes gram-négatives. L'anticorps à protection multiple intergenre est capable de protéger passivement contre une infection occasionnée par des organismes appartenant aux espèces 10 bactériennes gram-négatives E. coli et N. meningitidis Groupe B.

EXEMPLE IV

L'exemple IV donne une démonstration de méthodes de préparation d'un anticorps monoclonal humain qui possède une réactivité multiple intergenre vis-à-vis de membres des espèces Escherichia coli (E. coli), Enterobacter i5 cloacae (E. cloacae) et du Streptococcus du Groupe B. Cet exemple donne en outre la démonstration d'un anticorps à réactivité multiple vis-à-vis d'espèces appartenant à deux principales divisions bactériennes: les gram-négatives (E. coli et E. cloacae) et les gram- négatives (Streptococcus du Groupe B). Et cet exemple donne même encore en plus la démonstration de 20 l'activité protectrice in vivo de cet anticorps vis-à-vis d'une attaque mortelle des sérotypes homologues de E. coli et de Streptococcus du Groupe B. On répète le processus de l'exemple I (essentiellement décrit dans les parties A à G) pour préparer un anticorps monoclonal humain qui soit capable de protection multiple vis-à- vis d'infections occasionnées par les 25 bactéries décrites ci-dessus sauf qu'il est nécessaire d'apporter des modifications spécifiques pour caractériser et essayer l'anticorps décrit dans cet exemple. Ce qui suit indique les changements dans les procédures d'essai et dans les résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal ici décrit. 1. On teste dans les surnageants la présence d'anticorps anti-Streptococcus du Groupe B en utilisant un essai d'immunosorption lié à une enzyme (ELISA) comme décrit dans l'exemple I. Les plaques d'antigène sont constituées d'une série de plaques de microtitrage Immunolon 2 à 96 puits à fond plat, dont les puits contiennent des mélanges de types de capsule de Streptocoque du Groupe B fixés aux surfaces des puits par de la poly-Llysine (PLL). Les diverses plaques d'antigène utilisées dans le criblable comprennent:

(1) un mélange de type Ia de Streptococcus du Groupe B (A.T.C.C.

n 12400); Ib (A.T.C.C. n 12401); Ic (A.T.C.C. n 27591); (2) un mélange d'isolats de types II (A.T.C.C. né 12973) et III (isolat clinique obtenu chez le Dr. C. Wilson, Children's Orthopedic Hospital, Dept; Infectious Disease, Seattle, WA); et

(3) une plaque de microtitrage ne supportant pas de bactéries.

Les surnageants de culture provenant de deux transformations sont analysés par la méthode ci-dessus, conduisant à l'identification d'un puit (489) qui possède une activité sur les deux plaques de typage de Streptococcus du Groupe B mais non sur les plaques de contrôle. On détermine dans une analyse ELISA ultérieure en présence de types individuels de Streptococcus du Groupe B que ce puits contient un anticorps réactif avec

chacune des cinq souches de typage de référence.

On obtient ainsi, dans cette expérience, une lignée de cellules humaines transformées clonées qui est continue (immnortelle) et secrète un anticorps monoclonal humain dirigé contre un déterminant existant à la

surface de types de Streptococcus du Groupe B exposés ci-dessus.

Avant le dépôt de la demande prioritaire, la lignée de cellules

humaines transformées continues identifiées sous le n 4B9 a été déposée à 20 l'American Type Culture Collection, Rockville, MD, sous le n A.T.C. C.

CRL 9008.

2. On essaie un anticorps provenant de la lignée de cellules 4B9 clonées pour en déterminer la réactivité multiple vis-à-vis des bactéries gramnégatives et gram-positives par une modification de la technique d'immunotâche standard. Spécifiquement, on étudie la réactivité multiple vis-à-vis des bactéries E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, Hemophilus influenzae et Staphylococcus aureus, en déposant des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose grillagé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec cet anticorps et en dévelop30 pant les réactions d'anticorps avec un système enzymatique phosphatase

alcaline/tétrazolium nitroblue (comme décrit dans l'exemple I).

A partir de ces expériences, on observe que l'anticorps 4B9 possède une réactivité multiple vis-à-vis d'espèces particulières de bactéries gramnégatives. Cet anticorps réagit avec les sérotypes 04, 07, 018 et 025 35 du LPS de E. coli et avec les isolats cliniques de E. cloacae. Ainsi, l'anticorps monoclonal 4B9 possède donc une réactivité multiple intergenre entre les bactéries gram-négatives et gram-positives appartenant aux espèces E. coli, E. cloacae et Streptococcus du Groupe B. 3. La constatation que l'anticorps monoclonal présente une réactivité multiple avec plusieurs genres de bactéries différents appartenant à la fois aux divisions bactériennes gram-positives et gram-négatives, suggère que cet anticorps est dirigé contre une protéine ou un hydrate de carbone partagée entre elle. La caractérisation biochimique de l'espèce moléculaire reconnu par l'anticorps 4B9 s'effectue par analyse par immunotâ[he. Pour l'analyse des genres gram-négatifs, on extraits des bactéries lavées dans du déoxycholate comme décrit dans l'exemple I. Pour les bactéries granpositives, 1,0 1 de bactéries cultivées pendant 6 heures dans du bouillon 10 Todd-Hewitt modifié (Difco, bouillon de Todd- Hewitt contenant 2,8 g/T de phosphate de sodium anhydre, pH 7,8) à 37 C, sont recueillies par centrifugation et lavées trois fois dans du PBS. On remet ces bactéries en suspension dans 85 ml de milieu de protoplast (sucrose à 40% p/v dans un tampon de phosphate de potassium 0,3M, pH 6,8, contenant du MgCl2 10 mM) et l'on 15 chauffe la suspension à 37 C pendant 10 minutes. On ajoute approximativement 3 000 unités de mutanolysine (SIGMA) et l'on secoue le mélange à 37 C pendant 90 minutes ou jusqu'à ce que le QD660 de la suspension ait été réduit de >90%. On passe le matériau digéré a la centrifugeuse à 2 000 x g pendant 15 minutes à la température ambiante et on dialyse le surnageant en présence de PBS pendant 48 heures (Young M.K. et Mattingly S.J., "Biosynthesis of Cell Wall Peptidoglycan and Polysaccharide Antigens by Protoplasts of Type III Group B Streptococcus", J. Bact., (1983) 154, 211-220). On concentre dix fois le dialysat par dialyse à pression positive à travers un filtre PM-10

(Amicon Corp. Danvers, MA).

Les hydrates de carbone se liant à de l'agglutinine de germe de blé sont purifiés par chromatographie d'affinité sur une colonne Sepharose 6MB garnie de lectine de germe de blé (SIGMA). Le produit digéré lié, décrit ci-dessus, est élué de la colonne à l'aide de 10 ml de N-acétylglucosami. ne 0,1M et on dialyse l'éluat en présence d'eau distillée à 4 C. L'éluat purifié par affinité est séché par lyophilisation et l'on obtient le poids sec du matériau qui en résulte (Gray B.M. et coll., "Interaction of Group B Streptococcal Type-Specific Polysaccharides with Wheat Germ Agglutinn and Other Lectins", J. or Immunol. Meth., (1984) 72, 269-277). On note des réactions positives dans toutes les pistes qui contiennent les extraits au 35 déoxycholate des bactéries décrites ci-dessus. Dans les pistes contenant des extraits de bactéries gram-négatives, il apparaît que l'anticorps 4B9 reconnaît toute une série d'entités moléculaires régulièrement espacées, ce qui donne lieu à un schéma en forme d'échelle sur l'iriunotâche. Ce profil est entièrement cohérent avec celui que l'on renconitre dans l'analyse par électrophorèse sur gel de polyamide du LPS en présence de SDS, et là o il a été démontré que le profil de dimension hétérogène présenté par les -raies 5 était dû à une population de molécules de LPS différant par des incréments de poids équivalent au nombre d'unités de chaîne latérale d'oligosaccharide antigénique-O présentes par molécule (Pavla E.T. et Makela P.H., supra et Goldman, R.D. et Leive L., supra). Dans ces pistes contenant des essais de types de Streptococcus du Groupe B, il apparalt que l'anticorps 4B9 recon10 natt des composants présents sur une large bande. Ce profil est cohérent avec celui que l'on rencontre dans des analyses d'électrophorèse sur gel de polyamide de radicaux d'hydrate de carbone qui présentent une Importante hétérogénéité de poids moléculaire et une séquence de sucre spécifique se répétant fréquemment (Vmir E.R. et coll., supra et Holden K. G., supra). Ces 15 données indiquent que l'anticorps monoclonal 4B9 est dirigé contre un déterminant antigène partagé par des molécules rencontrées sur quelques sérotypes de E. coli, E. cloacae et Streptococcus du Groupe B. Pour mieux définir la nature moléculaire de l'antigène, on traite les extraits au dioxycholate avec une enzyme protéolytique, la Protéinase K, 20 avant leur électrophorèse (Eberling W., supra). Les schémas d'immunotâche observés après le traitement à la Protéinase K sont identiques aux schémas observés sans traitement et suggèrent donc que l'antigène réactif avec

l'anticorps 4B9 n'a pas la nature d'une protéine. Pour vérifier spécifiquement si le 4B9 réagit avec un épitope d'hy25 drate

de carbone, on soumet les échantillons de déoxycholate électrotransférés et purifiés par affinité d'agglutination sur germe de blé à une oxydation modérée au periodate avant de les faire réagir sur papier de nitrocellulose avec l'anticorps (voir exemple I). Les extraits au déoxycholate électrodéposés traités de cette façon ne sont plus réactifs avec l'anticorps monoclonal 4B9. Ces données suggèrent fortement que cet épitope reconnu par cet anticorps est un radical hydrate de carbone présent dans des molécules appartenant à la fois aux bactéries gram-négatives et aux

bactéries gram-positives décrites ci-dessus.

4. On détermine l'isotype de l'anticorps monoclonal 4B9 par un mode 35 opératoire ELISA semblable aux tests de spécificité décrits ci-dessus, sauf que la plaque d'antigène contient un ensemble de type II et de type III de i i i i i i I i i + i 1 8 + i 6911 i SIVIOSI aveDBpl a; 9 I i i; 09 i + i 6gi i - i siBlosI asl *a; I i; i i I; 0 i + 9 i + - s6;IOII aSIV oIo 3 *i i i6 i i i i O; + i 6I9 i + i sl0a 810 aIIo * a i i i i i; i 58; +; 61A9 i +; ZO la 810 S1W O 13i i i i i i i i o j +; 61 1- SZo la S10 9IOT10O3i ; i i i i i O i +; ql'T9 i +; j 0 ú la to tOD 3; alnpoliul ellzeiDt i Iuamgldmog sdioaluy sallqdolZnaN qaj1l3?qvgiS j e- i A i *.. i TA9O +o i1 úIOI9 OH' l i; u nasop i i i A j i; j; i i i i i i 9 nV319VI Àssat4laDp ILt saLaaoeq ap saqunos salt ed saa4 od saLLajo sanbe+le,p SLAe-StA uoL4ajoud aun JainnoJd 'apdoidde oz uoLesIuwupe sarde '4leianod 6M sdto:[ue,t anb luaia6 ns saauuop sao 6sauuaLJazeq satqnos sao ap SLA-eStA uLunuLtL ap ajLeuw!d awsLueDiu al a.uasaadai juassLedde (satlqdoaf+ nau) sOJLPDLnuoqdaowúLod sal úoDnaL sap 3a (sanbjL3ads sdaompue) sauLuosdo sap saauLqwoD suoLIDe sao anb auuop luPZ3 9soZoúo6eqd anal JoAnowoid e la saLaplaeq sal ans auLuoSdo,[ axLJ} 91 gaL3edeD es Wa 69t LeuoL3ouol SdaO3LUue,t ap aLLaUUOLVuoj qj3Lpjtads eL a4uowmap Lnb a3 '(aa4uasgdai uou auuop) saLia4Deq ap uoLIDnalsap ap sud a^Jasqo,u uo '6Si ne s4ll3eg uou suaLJaDIeq sadú3ois sJnaLsn[Ld 3aAP auaBLJadxa aZlaD aQdai uo,l anbsiol (g nealqel) suLuwnq saaLLqdolnau ap la 4uawatdwo3 ap aaunos aun,p '69t leuo[Douow sdi.oLIue,p aDuasaid OT ua SaAL43U[L JuawaLnas 3uos LD3 saas!L3n saL[aaxeq ap saqanos sal utemwnq 4uawaLdwoo3 ap la suLewnq saL!qdoilnau ap SLOJ. eL e a3uasqe,t ua la aDuasaid ua sdJoDLçuPL ap apOLLilaeq a9LAL13P,L aedwo3 tnb anbLiDo qdouosdo LeSSa un suPP 68M LQUOLDOUOw sdio313ue,[ ap O3L^A uL aLLaUuOLpuo4 P3,tALV33,L autLWxa u0 S LÀuo3LDouow sdio3nuie,[ ans WB1 adwost un,p amuasaJd eL aa4uowap Lnb ao 'W6I-j4ue IIIoeaJ aL DaA^,nb g adnoig np snDDo3oldailS ap saqDnos saL DaAe 6gb [LuoLDouow sdaoDLOUe,[ ap aALtsod uoLt43eJ aun aAaasqo,u uo 'l1d. ed asLtqouuîmL a adno9 np snioDoioda)lS

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EXEMPLE V

L'exemple V donne la démonstration de méthodes de préparation et de 10 sélection d'un anticorps monoclonal humain qui possède une réactivité multiple intergenre vis-à-vis de membres des genres Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae et Enterobacter aerogenes. En outre, cet exemple démontre l'activité in vitro de fixation d'opsonine de cet anticorps visa-vis des sérotypes homologues de S. marcescens, K. pneumoniae et 15 E. aerogenes. On répète le processus de l'exemple I (sensiblement comme décrit dans les parties A à G) sauf qu'il est nécessaire d'apporter des modifications spécifiques pour caractériser et essayer l'anticorps décrit dans cet exemple. Ce qui suit représente les changements apportés aux

procédures d'essai et aux résultats obtenus avec l'anticorps monoclonal 20 décrit ici.

1. On analyse les surnageants provenant de quatre transformations par la méthode ci-dessus qui conduit à l'identification d'un puits (7E10) possédant une activité de liaison sur au moins l'une d'entre les quatre plaques de sérotypes de K. pneumoniae contenant les sérotypes de capsule: 25 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 et 55, mais non sur la plaque de contrôle (sans bactérie). On essaie l'anticorps provenant de la

lignée de cellules 7E10 pour déterminer une réactivité multiple intergenre supplémentaire par une modification de la technique d'immunotache standard.

On étudie spécifiquement la réactivité multiple vis-à-vis des bactéries 30 K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli et P. aeruginosa en déposant des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose grillagé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec cet anticorps et en développant les réactions d'anticorps à l'aide d'un système enzymatique

phosphatase alcaline/tétrazolium nitroblue.

A partir de ces expériences, on observe que l'anticorps 7E10 possède une réactivité multiple intergenre supplémentaire. Cet anticorps réagit avec les espèces et sérotypes suivants: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes K2,8,11,12,13,21,26 04,12 Isolats cliniques

29,30,33,42,68,69

L'anticorps monoclonal humain 7E10 possède donc une réactivité multiple intergenre vis-à-vis de bactéries appartenant aux genres

K. pneumoniae, S. marcescens et E. aerogenes.

2. On détermine l'isotype de l'anticorps monoclonal 7E10 par un mode opératoire ELISA semblable aux tests de spécificité décrits dans l'exem10 ple I sauf que la plaque d'antigène contient un ensemble de sérotypes de K. pneumoniae K8 et Kll immobilisés à la PLL (poly-L-lysine). On n'observe une réaction positive de l'anticorps monoclonal 7E10 avec les sérotypes de K. pneumoniae qu'avec le réactif anti-IgM, ce qui démontre la présence d'un isotype IgM sur l'anticorps monoclonal. Le spécialiste appréciera que si 15 l'on répète plusieurs fois le processus de cet exemple et que l'on détermine les isotypes des anticorps monoclonaux à réactivité multiple intergenre ainsi obtenus, on trouverait d'autres isotypes supplémentaires, par

exemple des isotypes IgM et IgG.

3. On examine l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps monoclonal 7E10 dans un essai opsonophagocytique qui compare l'activité bactériocide de l'anticorps en présence et en l'absence à la fois de neutrophiles humains et de complément humain. Les sérotypes bactériens utilisés ici ne sont inactivés qu'en la présence d'anticorps monoclonal 7E10, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains 25 (Tableau 8). Lorsque l'on répète cette expérience avec des sérotypes ne réagissant pas avec l'anticorps 7EO10, on n'observe pas de destruction de bactéries (données non représentées). Ces expériences démontrent la spécificité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal 7E10 ainsi que sa capacité à fixer l'opsonine sur les bactéries et à promouvoir leur phagocytose. 30 TABLEAU 8

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os 9t6S6SZ provenant de la lignée de cellules 8C9 pour en déterminer encore la réactivité multiple intergenre par une modification de la technique d'immunotâche standard. On étudie spécifiquement la réactivité multiple vis-à-vis des bactéries K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli et P. aerugi5 nosa en déposant des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose grillagé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec cet anticorps et en développant les réactions d'anticorps à l'aide d'un système

enzymatique phosphatase alcaline/tétrazolium nitroblue.

A partir de ces expériences, on observe que l'anticorps 8C9 possède 10 une réactivité multiple intergenre supplémentaire. Cet anticorps réagit avec les espèces et sérotypes suivants: K. pneumoniae S. marcescens

K5,6,7,14,27,36,55,64 03

Ainsi, l'anticorps monoclonal humain 8C9 possède une réactivité 15 multiple intergenre dirigée contre les bactéries appartenant aux genres

K. pneumoniae et S. marcescens.

2. On détermine l'isotype de l'anticorps monoclonal 8C9 par un mode opératoire ELISA semblable aux tests de spécificité décrits dans l'exemple I sauf que la plaque d'antigène contient un ensemble de sérotypes de 20 K. pneumoniae K14 et K27 immobilisés par la PLL. On n'observe une réaction positive de l'anticorps monoclonal 8C9 avec les sérotypes de K. pneumoniae qu'avec le réactif anti-IgM, ce qui démontre l'existence d'un isotype IgM sur l'anticorps monoclonal. Le spécialiste appréciera que si l'on répète plusieurs fois le processus de cet exemple et si l'on détermine les iso25 types des anticorps monoclonaux à réactivité multiple intergenre ainsi obtenus, on trouverait d'autres isotypes supplémentaires, par exemple des

isotypes IgM et IgG.

3. On examine l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps monoclonal 7E10 dans un essai opsonophagocytique qui compare l'activité 30 bactériocide de l'anticorps en présence et en l'absence à la fois de neutrophiles humains et de complément humain. Les sérotypes bactériens utilisés ici ne sont inactivés qu'en la présence d'anticorps monoclonal 8C9, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (Tableau 9). Lorsque l'on répète cette expérience avec des sérotypes non réactifs avec l'anticorps 8C9, on n'observe pas de destruction de bactéries (données non représentées). Ces expériences démontrent la spécificité fonctionnelle de l'anticorps monoclonal 8C9 ainsi que sa capacité à fixer

l'opsonine sur les bactéries et à promouvoir leur phagocytose.

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cellules 1E4 pour en déterminer la réactivité multiple intergenre par une modification de la technique d'immunotâche standard. Spécifiquement, on étudie la réactivité multiple dirigée contre les bactéries K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli et P. aeruginosa en déposant des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose grillagé, en faisant

réagir le disque contenant les bactéries avec cet anticorps et en développant les réactions d'anticorps à l'aide d'un système enzymatique phosphatase alcaline/tétrazolium nitroblue.

A partir de ces expériences, on observe que l'anticorps 1E4 possède 10 une réactivité multiple intergenre supplémentaire. Cet anticorps réagit avec les espèces et sérotypes suivants: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes E. cloacae K1,3,8,9,13,15,29, 015 Isolats Isolats 31,33,36,68, 69 cliniques cliniques

L'anticorps monoclonal humain 1E4 possède donc une réactivité multiple intergenre dirigée contre les bactéries appartenant aux genres K. pneumoniae, S. marcescens, E. cloacae et E. aerogenes.

2. On détermine l'isotype de l'anticorps monoclonal 1E4 dans un mode opératoire ELISA semblable aux tests de spécificité décrits dans l'exem20 ple I sauf que la plaque d'antigène contient un ensemble de sérotypes de K. pneumoniae K3 et K8 immobilisés à la PLL. On n'observe une réaction positive de l'anticorps monoclonal 1E4 avec les sérotypes de K. pneumoniae qu'en présence du réactif anti-IgM, ce qui démontre la présence d'un isotype IgM sur l'anticorps monoclonal. Le spécialiste appréciera que si l'on répète plusieurs fois le processus de cet exemple et si l'on détermine les isotypes des anticorps monoclonaux à réactivité multiple intergenre ainsi obtenus, on trouverait d'autres isotypes supplémentaires, par exemple

des isotypes IgM et IgG.

3. On examine l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps 30 monoclonal 1E4 dans un essai opsonophagocytique qui compare l'activité bactériocide de l'anticorps en présence et en l'absence à la fois de neutrophiles humains et de complément humain. Les sérotypes bactériens utilisés ici ne sont inactivés qu'en la présence de l'anticorps monoclonal 1E4, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (Tableau 10). Lorsque l'on répète cette expérience avec des sérotypes non réactifs avec l'anticorps 1E4, on n'observe pas de destruction de bactéries (données non représentées). Ces expériences démontrent la spécificité sueDs3a.ew S ap san6oLowoq sadúloaps sap a.4uoD 96LaLp sdaoDLue JaD ap auLuosdop uoLIxXLI ap OUalA UL e PALPL1UL al.UOWgp aLdwaXa laD 'al4nO U3 -esouL6nJae seuowopnasd a saua60Joae.aa4eqoaxu3 'aeLuownaud etaLsqa[l 'sua3saDeu etPL4 aS sajua6 sap salqwaw sap aBIuoD P6LILp alua6Ja1uL aLdtLnw 9-4^1ALepa aun apessod Lnb uLPwnq LeuoLDouow sdjoDjLue un,p uoLvpa[gs ap 3a uoLledaid ap sapo ap spuoLleapsuowUp eL auuop IIIA aLdwaxa,1 IIIA 31dW3X3 E neaTqu np seq ua saiou sai joA la 0ú _ - i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i %08 o %09 o o 0 %09 o %98 I4.

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obtenus avec l'anticorps monoclonal ici décrit.

1. On analyse les surnageants de culture de quatre transformations par la méthode ci-dessus qui conduit à l'identification d'un puits (9D1) possédant une activité de liaison sur au moins l'une d'entre les quatre 10 plaques de sérotypes de K. pneumoniae contenant les sérotypes de capsule:

1, 2, 3, 4, 6, 8, 9, 19, 20, 21, 24, 27, 31, 43, 44 et 55, mais non sur la plaque de contrôle (sans bactérie). On essaie l'anticorps de la lignée de cellules 9D1 pour en déterminer la réactivité multiple intergenre supplémentaire par une modification de la technique d'immunotlche standard.

Spécifiquement, on étudie la réactivité multiple dirigée contre les bactéries K. pneumoniae, E. aerogenes, S. marcescens, E. coli et P. aeruginosa

en déposant des bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose grillagé, en faisant réagir le disque contenant les bactéries avec cet anticorps et en développant les réactions d'anticorps à l'aide d'un système 20 enzymatique phosphatase alcaline/tétrazolium nitroblue.

A partir de ces expériences, on observe que l'anticorps 9D1 possède une réactivité multiple intergenre supplémentaire. Cet anticorps réagit avec les espèces et sérotypes suivants: K. pneumoniae S. marcescens E. aerogenes P. aeruginosa E9,13,15,29,33 03,9,15,18 Isolats cliniques F6

L'anticorps monoclonal humain 9D1 possède donc une réactivité multiple intergenre dirigée contre les bactéries appartenant aux genres K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes et P. aeruginosa.

2. On détermine l'isotype de l'anticorps monoclonal 9D1 dans un mode 30 opératoire ELISA semblable aux tests de spécificité décrits dans l'exemple I sauf que la plaque d'antigène contient un ensemble de sérotypes de K. pneumoniae K13 immobilisés à la PLL. On n'observe une réaction positive de l'anticorps monoclonal 9D1 avec les sérotypes de Ko pneumoniae qu'en présence du réactif anti-IgM, ce qui démontre la présence d'un isotype IgM 35 sur l'anticorps monoclonal. Le spécialiste appréciera que si l'on répète plusieurs fois le processus de cet exemple et si l'on détermine les isotypes des anticorps monoclonaux à réactivité multiple intergenre ainsi obtenus, on trouverait d'autres isotypes supplémentaires, par exemple des

isotypes IgM et IgG.

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EXEMPLE IX

L'exemple IX donne la démonstration de méthodes de préparation et de sélection d'un anticorps monoclonal humain qui possède une réactivité multiple intergenre dirigé contre des membres des genres Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), Escherichia coli (E. coli), et Serratia marcescens (S. marcescens). En outre, cet exemple démontre l'activité in vitro de fixation d'opsonine de cet anticorps dirigé contre des sérotypes homologues de P. aeruginosa, E. coli et P. marcescens. On répète le processus de l'exemple I (sensiblement comme décrit dans les parties A à G), sauf qu'il 10 est nécessaire d'apporter des modifications spécifiques pour caractériser et essayer l'anticorps décrit dans cet exemple. Ce qui suit représente les changements dans les modes opératoires d'essai et dans les résultats

obtenus avec l'anticorps monoclonal ici décrit.

1. On examine dans les surnageants la présence d'anticorps anti15 P. aeruginosa en utilisant une technique ELISA telle que décrite dans l'exemple I. La plaque d'antigène est constituée d'une plaque de microtitrage Immunolon 2 à 96 puits à fond plat (Dynatech, Alexandria, VA) , dont les puits contiennent un mélange de bactéries immobilisées à la poly-Llysine (PLL) appartenant aux sept souches de référence de P. aeruginosa 20 Fisher (Fisher M.W. et coll., J. of Bacteriology (I969) 98, 835-836,

n A.T.C.C. 27312-27318).

Les surnageants de culture provenant d'une transformation sont analysés par la méthode ci-dessus qui conduit à l'identification d'un puits

possédant une activité sur la plaque de P. aeruginosa, mais non sur la 25 plaque de contrôle à la PLL. On détermine dans une analyse ELISA ultérieure, en présence de dix sept sérotypes de P. aeruginosa individuels appartenant au schéma de typage antigène international (IATS, A.T.C.C. n 33348-33364), qu'un puits maitre 9C3 contient des anticorps qui se

lient

au sérotype IATS type 1 (Liu P.V., Int. J. Syst. Bacteriol. (1983) 33, 30 256-264, qui est incorporé ici à titre de référence).

On obtient donc, dans cette expérience, une lignée cellulaire humaine transformée qui est continue (immortelle) et secrète un anticorps monoclonal humain unique se liant à un déterminant existant à la surface du

P. aeruginosa IATS type 1.

Avant le dépôt de la demande prioritaire, la lignée cellulaire humaine transformée continue identifiée sous le n 9C3 a été déposée à

l'American Type Culture Collection, Rockville, MD, sous le n0 A.T.C.C.

CRL 9239.

2. On essaie également l'anticorps provenant de la lignée cellulaires 9C3 clonée pour en déterminer la réactivité multiple vis-à-vis de bactéries gram-positives et gram-négatives par une modification de la technique d'immunotâche classique. On étudie spécifiquement la réactivité multiple vis-à-vis des bactéries E. coli, K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes, E. cloacae, Haemophilus influenzae et Staphylococcus aureus en déposant les bactéries sur un disque de papier de nitrocellulose grillagé, en faisant 10 réagir le disque contenant les bactéries avec l'anticorps 9C3 et en visualisant les réactions de l'anticorps à l'aide d'un système enzymatique

phosphatase alcaline/tétrazolium nitroblue (comme décrit dans l'exemple I) .

A partir de ces expériences, on observe que l'anticorps 9C3 se lie au sérotype 06 du E. coli et aux sérotypes 012 et 014 du S. marcescens. 15 L'anticorps monoclonal humain 9C3 possède donc une réactivité multiple intergenre vis-à-vis des bactéries gram-négatives appartenant aux sérotypes

spécifiques des espèces E. colis, S. marcescens et P. aeruginosa.

3. La constatation que l'anticorps monoclonal présente une réaction multiple avec plusieurs genres bactériens différents suggère que l'anti20 corps peut se lier à un déterminant antigène partagé entre ces genres. La caractérisation biochimique de l'espèce moléculaire reconnu par l'anticorps 9C3 s'effectue par analyse par immunotache comme décrit dans l'exemple I. On note les réactions dans les extraits au déoxycholate des sérotypes négatifs provenant du P. aeruginosa et E. coli mais non du S. marces25 cens. Bien que la raison pour laquelle l'anticorps 9C3 est réactif avec la préparation de S. marcescens ne soit pas bien claire, il est possible que l'anticorps reconnaisse un épitope de conformation qui a été décrit par le traitement de préparation. Pour les extraits bactériens de E. coli et P. aeruginosa, il apparaît que l'anticorps 9C3 reconnaît toute une série 30 d'entités moléculaires régulièrement espacées, ce qui donne lieu à un schéma à allure d'échelle sur l'immunotâche. Ce profil est entièrement cohérent avec celui que l'on rencontre dans l'analyse par électrophorèse sur gel de polyamide du LPS en présence de SDS pour lequel il a été démontré que le profil de dimension hétérogène présenté est dU à une population 35 de molécules de LPS différant par des incréments pondéraux équivalents au nombre de motifs de chaîne latérale d'oligosaccharide antigène-O présents par molécule (Pavla E.T. et Makela P.H., supra, et Goldman R.D. et

Leive L., supra).

Pour définir plus en détail la nature moléculaire de l'antigène, on traite les extraits au déoxycholate à l'aide d'une enzyme protéolytique, la Protéinase K, avec leur électrophorèse (Eberling W., supra). Les schémas

d'immunotUche observés après le traitement à la Protéinase K sont identiques aux schémas observés sans traitement et suggèrent ainsi que l'antigène réactif avec l'anticorps 9C3 n'a pas la nature d'une protéine.

4. On détermine l'isotype de l'anticorps monoclonal 9C3 dans un mode 10 opératoire ELISA semblable aux tests de spécificité décrits ci-dessus sauf que la plaque d'antigène contient quatre bactéries de sérotypes de P. aeruginosa Fisher immobilisées à la PLL. On n'observe une réaction positive de l'anticorps monoclonal 9C3 avec la souche de P. aeruginosa qu'avec le

réactif anti-IgM, ce qui démontre la présence d'un isotype IgM sur l'anti15 corps monoclonal.

5. On examine l'activité fonctionnelle in vitro de l'anticorps monoclonal 9C3 dans un essai opsonophagocytique qui compare l'activité bactériocide de l'anticorps en présence et en l'absence à la fois de

neutrophiles humains et de complément humain.

Les souches bactériennes utilisées ici ne sont tuées qu'en présence de l'anticorps monoclonal 9C3, d'une source de complément actif et de neutrophiles humains (Tableau 12). Lorsque l'on répète cette expérience avec plusieurs sérotypes bactériens non réactifs au 9C3, on n'observe pas de destruction de bactéries, ce qui démontre la spécificité fonctionnelle 25 de l'anticorps monoclonal 9C3 et sa capacité à fixer l'opsonine sur les bactéries et à promouvoir leur phagocytose. Etant donné que l'action combinée des opsonines (anticorps spécifiques) et des leucocytes polymorphonucléaires (neutrophiles) apparalt être le mécanisme primaire d'immunité vis-à-vis de ces souches bactériennes, ces données indiquent que l'anticorps 9C3 pourrait, après une administration appropriée, procurer une protection contre des attaques mortelles portées par des souches de bactéries décrites ci-dessous: 6. Pour tester les caractéristiques de protection de l'anticorps 9C3,

on effectue des études de protection sur les animaux avec au moins un 35 organisme provenant de chaque genre ici décrit.

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62 2595946

a L'anticorps 6F11 est spécifique du Pseudomonas aeruginosa Fisher

immunotype 2 et il sert d'anticorps de contrôle négatif.

b Le P. aeruginosa F2 n'est pas réactif avec l'anticorps 9C3 et il sert

d'organismes de contrôle non spécifique.

Les données démontrent que l'anticors monoclonal humain 9C3 est capable de protéger les souris des attaques mortelles portées par les bactéries appartenant à trois genres gram-négatifs. L'anticorps monoclonal humain 9C3 à réactivité multiple intergenre est capable de procurer une protection à l'aide de surnageant de culture contenant l'anticorps ou 10 d'anticorps purifié contre une infection occasionnée par les organismes

appartenant aux genres gram-négatifs de E. coli, S. marcescens et P. aeruginosa.

D'après ce qui précède, on peut apprécier que les lignées cellulaires selon la présente invention procure des compositions d'anticorps monoclo15 naux humains et des fragments de ceux-ci à réactivité multiple pour et à réactivité multiple contre diverses espèces bactériennes à la fois gramnégatives et gram-positives. Ceci permet de mettre plus facilement-au point des compositions prophylactiques et thérapeutiques qui peuvent être efficaces contre des infections nosocomiennes et néonatales dues à la plupart, 20 sinon à tous les genres de bactéries. En combinant les anticorps, il est possible d'obtenir une protection large contre une grande partie habituellement pas tout les anticorps cliniquement significatifs. En outre, les lignées cellulaires procurent des anticorps qui trouvent leurs applications

* dans des immuno-essais dans d'autres modes opératoires bien connus.

Bien que la présente invention ait été décrite avec quelque détail à titre d'illustration et à l'aide d'exemple aux fins de clarté et de compréhension, il est évident que l'on peut apporter certains changements et

certaines modifications tout en restant dans le cadre des revendications

jointes.

Claims (19)

REVENDICATIONS

1.- Une composition utile dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique des infections bactériennes, cette composition comprenant une quantité prophylactique ou thérapeutique efficace d'un certain nombre 5 d'anticorps monoclonaux humains et étant réactive avec au moins deux espèces bactériennes d'au moins deux genres, au moins l'un de ces anticorps ou fragment de liaison de ces anticorps étant capable de réagir spécifiquement avec un épitope d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau

partagé par des sérotypes de deux espèces différentes.

2.- Une composition selon la revendication 1, dans laquelle au moins l'un de ces anticorps ou l'un de ses fragments de liaison réagit avec des

sérotypes d'espèces d'au moins trois espèces et genres bactériens.

3.- Une composition selon la revendication 1, dans laquelle au moins

l'une de ces espèces bactériennes est gram-positive et la seconde est 15 gram-négative.

4.- Une composition selon la revendication 1, dans laquelle chacun d'au moins deux de ces anticorps est protecteur contre des infections

occasionnées par des bactéries appartenant a au moins deux genres différents.

5.- Une composition utile dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'infections bactériennes, cette composition comprenant une quantité proprylactique ou thérapeutique d'au moins deux anticorps monoclonaux humains ou des fragments de liaison de ceux-ci dans lesquels chacun de ces anticorps réagit spécifiquement avec un épitope d'hydrate de carbone 25 ne faisant pas partie du noyau partagé par des sérotypes de deux ou de plus de deux espèces bactériennes de différents genres et une pluralité de sérotypes dans au moins une espèce, dans lequel ces espèces comprennent: Escherichia coli, Neisseria meningitidis, Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Pseudomonas 30 aeruginosa et Streptococcus agalactiae du Groupe B.

6.- Une composition selon la revendication 1, possédant au moins un anticorps monoclonal humain qui réagit avec au moins l'une des combinaisons d'espèces bactériennes suivantes: (a) E. coli, S. marcescens et E. aerogenes; 35 (b) E. coli et N. meningitidis; (c) E. coli, E. cloacae et Streptococcus agalactiae du Groupe B; (d) K. pneumoniae, S. marcescens et E. aerogenes; (e) K. pneumoniae et S. marcescens; (f) K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes et E. cloacae; (g) K. pneumoniae, S. marcescens, E. aerogenes et P. aeruginosa; ou (h) E. coli, S. marcescens et P. aeruginosa;

7.- Une composition pharmaceutique comprenant une composition selon 5 l'une quelconque des revendications 1 à 6 et un support physiologiquement acceptable.

8.- Une lignée cellulaire immortelle qui secrète un anticorps monoclonal humain ou un de ses fragments de liaison présentant une réactivité multiple spécifique avec un épitope comprenant un radical d'hydrate de carbone accessible ne faisant pas partie du noyau présent sur au moins deux

sérotypes ou deux différentes espèces de différents genres de bactéries.

9.- Une lignée cellulaire selon la revendication 8 dans laquelle ces espèces bactériennes représentent au moins deux des espèces Escherichia coli, Serratia marcescens, Neisseria meningitidis, Klebsiella pneumoniae, 15 Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa et Streptococcus agalactiae du Groupe B.

10.- Une lignée cellulaire selon la revendication 8 désignée sous le

n A.T.C.C. n CRL 9006, CRL 9007, CRL 9008, CRL 9009 et CRL 9239.

11.- Un anticorps monoclonal humain ou un de ses fragments de liaison 20 capable de se lier à un épitope d'hydrate de carbone réactif avec un

anticorps monoclonal préparé par une lignée cellulaire selon la revendication 10.

12.- Un kit à utiliser pour détecter la présence d'au moins deux membres d'espèces de différents genres bactériens, ce kit comprenant une 25 composition d'anticorps monoclonal contenant au moins un anticorps monoclonal, dans lequel cet anticorps réagit avec un déterminant d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau partagé par au moins deux membres d'espèces bactériennes différentes et un marqueur procurant un signal

détectable lié par covalence à cet anticorps ou lié à un second anticorps 30 réactif avec cet anticorps monoclonal.

13.- Une composition utile dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de la septicémie ou méningite néonatale, cette composition comprenant une quantité prophylactique ou thérapeutique d'au moins deux

anticorps monoclonaux humains ou de la fragment de liaison, dans laquelle 35 chacun de ces anticorps réagit de façon spécifique avec un épitope d'hy-

drate de carbone ne faisant pas partie du noyau partagé par des sérotypes

de deux ou de plus de deux espèces bactériennes de différents genres, dans laquelle ces espèces comprennent: Escherichia coli K1, Neisseria meningi-

tidis du Groupe B, Hemophilus influenzae du Type B et Streptococcus agalactiae du Groupe B.

14.- Une composition utile dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique d'un certain nombre présélectionné d'espèces bactériennes, cette composition comprenant une quantité prophylactique ou thérapeutique efficace de deux ou de plus de deux anticorps monoclonaux humains ou de leurs fragments de liaison, ces anticorps étant capables de réagir avec un

total d'au moins quatre espèces bactériennes, et un support compatible.

15.- Une méthode de préparation d'une composition pharmaceutique utile 10 dans le traitement prophylactique ou thérapeutique d'infections bactériennes, cette méthode consistant à: - combiner un certain nombre d'anticorps monoclonaux humains dans lequel cette composition réagit avec au moins deux espèces bactériennes d'au moins deux genres, dans laquelle au moins l'un de ces 15 anticorps monoclonaux et de ses fragments de liaison est capable de réagir spécifiquement avec un épitope d'hydrate de carbone ne faisant - pas partie du noyau partagé par des sérotypes de deux différentes espèces.

16.- Une méthode de préparation d'une composition pharmaceutique utile 20 dans le traitement prophylactique et/ou thérapeutique de la septicémie ou méningite néonatale dans lequel cette méthode consiste à combiner une quantité prophylactique ou thérapeutique d'au moins deux anticorps monoclonaux humains ou de leurs fragments de liaison, dans laquelle chacun de ces anticorps réagit spécifiquement avec un épitope d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau partagé par des sérotypes de deux ou de plus de deux espèces bactériennes de genres différents dans lequel ces espèces comprennent: E. coli K1, Neisseria meningitidis, Hemophilus influenzae et Streptococcus agalactiae du Groupe B.

17.- Un procédé de production d'anticorps monoclonaux humains présen30 tant une réactivité multiple spécifique avec un épitope comprenant un radical d'hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau présent sur ou moins deux sérotypes d'au moins deux différentes espèces de différents

genres de bactéries, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver l'une des lignées cellulaires telles que définies dans l'une quelconque des revendi35 cations 8, 9 ou 10 et à récupérer lesdits anticorps.

18.- Un procédé de production d'anticorps monoclonaux humains susceptibles de se lier spécifiquement à un épitope consistant en un hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau, partagé par des sérotypes de deux différents genres de bactéries, ce procédé consistant: - à isoler les cellules B d'un individu, - à immortaliser ces cellules B pour former une pluralité de clones producteurs d'anticorps, - à sélectionner ces clones pour la production d'anticorps spécifiques d'un épitope consistant en un hydrate de carbone ne faisant pas partie du noyau, partagé par des sérotypes de deux différents genres de bactéries, - et à cultiver ces clones cultivés puis à recueillir les anticorps

monoclonaux ainsi produits.

19. Un procédé selon la revendication 18, caractérisé en ce que

lesdites cellules B sont immortalisées par transformation EBV.