FR2556840A1

FR2556840A1 - Method for the in vitro assay of immunoglobulins which are specific for one or more allergens, and reagents and means for implementing this method

Info

Publication number: FR2556840A1
Application number: FR8320319A
Authority: FR
Inventors: Alain Bourgois; Francine Anfosso; Michel Delaage
Original assignee: Immunotech SAS
Current assignee: Immunotech SAS
Priority date: 1983-12-16
Filing date: 1983-12-16
Publication date: 1985-06-21
Also published as: FR2556840B1

Abstract

This method essentially consists in having available an anti-immunoglobulin antibody on a solid phase, this antibody being capable of binding the range of immunoglobulins (of a given isotype) of a patient, regardless of their specificity, and in using an allergen so that it binds to the specific immunoglobulins attached to the said anti-immunoglobulin antibody, the said allergen being prepared so that it can serve directly or indirectly as a marker which can be subsequently visualised.

Description

La présente invention concerne un procédé de dosage des immunoglobulines qui fixent les allergènes ainsi que les réactifs et moyens pour la mise en oeuvre de ce procédé. The present invention relates to a method for assaying immunoglobulins which bind allergens as well as reagents and means for carrying out this method.

On sait en effet que l'identification de substances donnant lieu à des phénomènes d'allergie, pour un malade donné, est essentielle pour son traitement. We know that the identification of substances giving rise to allergy phenomena, for a given patient, is essential for its treatment.

Cette identification se fait, soit par un test cutané bien connu, soit par détection des immunoglobulines de type E (désignées ci-après dans le reste de la description par IgE) présentes chez le malade et capables de fixer l'allergène que l'on suspecte comme étant la cause de la maladie du patient. This identification is done either by a well-known skin test, or by detection of the type E immunoglobulins (designated below in the rest of the description by IgE) present in the patient and capable of fixing the allergen which is suspected to be the cause of the patient's illness.

Actuellement, le procédé principalement utilisé pour la recherche des IgE spécifiques fait appel, pour chaque test, à un allergène déterminé que l'on fixe sur un support solide et qui est destiné à se lier à l'IgE spécifique en cause. Ce test consiste alors à faire en sorte que ladite
IgE puisse également se lier à un anticorps anti-IgE marqué (soit à l'iode 125, soit avec une enzyme) et qui sert de traceur.Currently, the method mainly used for the search for specific IgE uses, for each test, a determined allergen which is fixed on a solid support and which is intended to bind to the specific IgE in question. This test then consists in ensuring that said
IgE can also bind to a labeled anti-IgE antibody (either with iodine 125 or with an enzyme) and which serves as a tracer.

Ce procédé offre un éventail de possibilités relativement étendu, étant donné que l'on peut disposer à l'heure actuelle de plus de 160 allergènes fixés sur phase solide. Il convient toutefois de noter que dans les réalisations industrielles auxquelles il a donné lieu, il est impossible de réutiliser l'échantillon si le test est négatif. I1 peut être nécessaire de réitérer les prélèvements si la recherche se prolonge, ce qui peut présenter des inconvénients notamment dans le cas de jeunes enfants. Au surplus, les réactifs et matériels utilisés ne permettent pas d'identifier plus d'un allergène à la fois, c'est-à-dire qu'ils ne permettent pas de mettre en évidence la reconnaissance de plusieurs allergènes sur le même échantillon lié.En outre, le procédé ne permet pas de quantifier avec exactitude les IgE spécifiques. This process offers a relatively wide range of possibilities, since more than 160 fixed phase allergens are available today. It should however be noted that in the industrial realizations to which it gave rise, it is impossible to reuse the sample if the test is negative. It may be necessary to repeat the samples if the search is prolonged, which can have drawbacks, particularly in the case of young children. In addition, the reagents and materials used do not make it possible to identify more than one allergen at a time, that is to say that they do not make it possible to demonstrate the recognition of several allergens on the same linked sample Furthermore, the method does not allow precise quantification of specific IgEs.

La présente invention constitue une solution plus simple, plus économique, et permettant le réemploi de l'échantillon. L'automatisation est d'autre part très facile à réaliser et permet la recherche rapide des spécificités ainsi que l'utilisation de mélanges d'allergènes. The present invention constitutes a simpler, more economical solution, allowing the reuse of the sample. Automation is also very easy to perform and allows the rapid search for specificities as well as the use of mixtures of allergens.

Le procédé de l'invention pour le dosage in vitro des immunoglobulines spécifiques d'un ou plusieurs allergènes est caractérisé par le fait qu'il consiste essentiellement à disposer d'un anticorps'anti-immunoglobulines sur une phase solide, cet anticorps étant capable de fixer l'ensem- ble des ir.munoglobulines (d'un isotype donné) d'un patient, quelles que soient leurs spécificités, et à utiliser un allergène en vue de sa fixation sur les immunoglobulines spécifiques fixées sur ledit anticorps anti-immunoglobulines, et conditionné pour servir directement ou indirectement de traceur ultérieurement reconnaissable. The method of the invention for the in vitro assay of specific immunoglobulins of one or more allergens is characterized in that it consists essentially in having an anti-immunoglobulin antibody on a solid phase, this antibody being capable of fix all the ir.munoglobulins (of a given isotype) of a patient, whatever their specificities, and use an allergen for the purpose of its fixation on the specific immunoglobulins fixed on said anti-immunoglobulin antibody, and conditioned to serve directly or indirectly as a later recognizable tracer.

De façon particulière 10) On dispose d'une phase solide sur laquelle est greffé un
anticorps anti-immunoglobulines (par exemple anti-IgE).In particular 10) There is a solid phase on which is grafted a
anti-immunoglobulin antibodies (e.g. anti-IgE).

20) Suivant une première variante, on dispose d'une collection
d'allergènes solubles, ou émulsifiés, portant un élément
servant de marqueur (radioélément, enzyme, fluorophore,
etc ...). L'échantillon est d'abord mis au contact de la
phase solide sur laquelle les IgE vont se fixer. Ensuite,
les IgE ainsi fixées sont successivement mises en présence
des différents allergènes et on note à chaque passage la
quantité de traceur retrouvé sur la phase solide, qui
représente la quantité d'IgE spécifique de l'allergène
correspondant (figure 1 variante a) 30) Suivant une autre variante, avantageusement le marquage
de l'allergène sera réalisé après la fixation à la phase
solide de la façon suivante
Les allergènes de la collection sont couplés (avant le
contact avec la phase solide) à une molécule H, toujours
la même.On dispose d'un ligand anti H, lui-même marqué
(radioélément, enzyme, fluorophore, etc...) (figure 2
variante b). C'est le réactif universel, reconnaissant
indifféremment tous les allergènes et capable de se lier
à ceux-ci par l'intermédiaire de H qui sert de révélateur
à l'ensemble de la chaîne réactionnelle (figure 2 variante
b). L'avantage est double : le marqueur est universel
la réaction est amplifiée. H peut être la biotine, anti H
est alors l'avidine. H est un antigène (haptène de préfé
rence), anti H est alors l'anticorps correspondant, les
rôles de H et anti H pourront être inversés.20) According to a first variant, we have a collection
soluble or emulsified allergens carrying an element
serving as a marker (radioelement, enzyme, fluorophore,
etc ...). The sample is first brought into contact with the
solid phase on which the IgE will bind. Then,
the IgEs thus fixed are successively brought into contact
different allergens and we note on each pass the
amount of tracer found on the solid phase, which
represents the amount of specific IgE of the allergen
corresponding (figure 1 variant a) 30) According to another variant, advantageously the marking
of the allergen will be produced after fixation in the phase
solid in the following way
Allergens from the collection are paired (before
contact with the solid phase) to an H molecule, always
the same. We have an anti H ligand, itself labeled
(radioelement, enzyme, fluorophore, etc ...) (figure 2
variant b). It is the universal reagent, recognizing
indifferently all allergens and able to bind
to these via H which serves as a developer
to the entire reaction chain (Figure 2 variant
b). The advantage is twofold: the marker is universal
the reaction is amplified. H can be biotin, anti H
then is avidin. H is an antigen (prefect hapten
rence), anti H is then the corresponding antibody,
roles of H and anti H can be reversed.

Dans la présente description, on entend par anticorps, soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux. In the present description, by antibody is meant either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.

De façon pratique, on dispose essentiellement d'une phase solide par exemple un tube de laboratoire, une plaque de titration, etc, et on fixe sur cette phase,conformément à l'invention, l'anticorps anti-IgE. A cet effet, on peut faire appel à tout procédé connu de fixation et notamment à un procédé du type de celui décrit dans le brevet français nO 83 05618. In practice, there is essentially a solid phase, for example a laboratory tube, a titration plate, etc., and the anti-IgE antibody is fixed on this phase, in accordance with the invention. For this purpose, use can be made of any known method of fixing and in particular a method of the type described in French patent No. 83 05618.

Pour la mise en oeuvre de la variante a) on procède de la façon suivante - incubation de l'échantillon à analyser avec la phase solide
porteuse de l'anti-IgE - rinçage - incubation d'un (ou plusieurs) allergène soluble marqué avec
ladite phase solide sur laquelle-sont fixés aussi bien les
IgE non spécifiques que les éventuelles IgE spécifiques
dudit allergène - rinçage et comptage de la radioactivité (allergène marqué
avec un radioélément) ou mesure de l'activité enzymatique
(allergène marqué avec une enzyme). For the implementation of variant a) proceed as follows - incubation of the sample to be analyzed with the solid phase
carrier of anti-IgE - rinsing - incubation of one (or more) soluble allergen labeled with
said solid phase on which are fixed both
Non-specific IgE than any specific IgE
said allergen - rinsing and counting of radioactivity (marked allergen
with a radioelement) or measurement of enzyme activity
(allergen labeled with an enzyme).

Pour la variante b) on procède de la façon suivante - incubation de l'échantillon avec la phase solide porteuse
de l'anti-IgE - rinçage - incubation d'un (ou plusieurs) allergène couplé à une molécule
H avec ladite phase solide - rinçage - incubation de l'anti-H marqué avec la phase solide résultant
de ce rinçage et qui porte par conséquent l'anti-IgE qui a
fixé les IgE aussi bien spécifiques que non spécifiques et
sur les IgE spécifiques s'il y en a, l'al-lergène couplé à
la molécule H sur laquelle s'est alors fixé l'anti-H marqué - rinçage et comptage de la radioactivité (anti H marqué-avec
un radioélément) ou évaluation de l'activité enzymatique
(anti H marqué avec une enzyme).For variant b) proceed as follows - incubation of the sample with the solid carrier phase
anti-IgE - rinsing - incubation of one (or more) allergen coupled to a molecule
H with said solid phase - rinsing - incubation of the labeled anti-H with the resulting solid phase
of this rinse and which therefore carries the anti-IgE which has
fixed both specific and non-specific IgE and
on specific IgEs if there are any, al-lergene coupled to
the H molecule to which the labeled anti-H is then attached - rinsing and counting of radioactivity (anti H labeled -with
radioelement) or evaluation of enzyme activity
(anti H labeled with an enzyme).

Dans les deux cas (variantes-a) et b)), si l'échantillon se révèle négatif vis-d-vis d'un allergène donné, la même phase solide peut être immédiatement réincubée avec un autre allergène, et ainsi de suite jusqu'à ce qu'un allergène testé soit reconnu. In both cases (variants-a) and b)), if the sample turns out to be negative for a given allergen, the same solid phase can be immediately reincubated with another allergen, and so on until that a tested allergen is recognized.

Un tel système peut être automatisé et le traceur récupéré et réutilisé à chaque cycle. On peut donc ainsi avec une seule phase solide, une seule dose d'échantillon à analyser,et une seule dose de traceur, tester autant d'allergènes que l'on. peut effectuer de cycles. Such a system can be automated and the tracer recovered and reused at each cycle. It is therefore possible with a single solid phase, a single dose of sample to be analyzed, and a single dose of tracer, to test as many allergens as there are. can perform cycles.

De plus, comme le procédé permet d'incuber et donc de tester plusieurs allergènes à la fois, il est possible en utilisant un système binaire de discrimination d'identifier rapidement une spécificité contre un allergène (par exemple pour les 128 spécificités testées, 8 étapes sont suffisantes pour identifier l'allergène reconnnu par les
IgE d'un patient : 128, 2 x 64, 2 x 32, 2 x 16, 2 x 8, 2 x 4, 2 x 2, 2 x 1 - les chiffres soulignés correspondant au nombre d'allergènes dans le mélange testé). In addition, as the method makes it possible to incubate and therefore to test several allergens at the same time, it is possible using a binary system of discrimination to quickly identify a specificity against an allergen (for example for the 128 specificities tested, 8 steps are sufficient to identify the allergen recognized by the
Patient's IgE: 128, 2 x 64, 2 x 32, 2 x 16, 2 x 8, 2 x 4, 2 x 2, 2 x 1 - the underlined numbers correspond to the number of allergens in the mixture tested) .

On notera par ailleurs que dans la variante b), le quantité d'IgE spécifique, déterminée selon le modèle précédent, peut être comparée à celle des IgE totales, déterminée à l'aide d'une phase solide identique et d'anticorps anti-IgE greffés avec la molécule H, d'où une quantité fication possible lorsque le nombre de molécules H fixées est déterminé. It will also be noted that in variant b), the amount of specific IgE, determined according to the previous model, can be compared with that of total IgE, determined using an identical solid phase and anti- IgE grafted with the H molecule, hence a possible fication amount when the number of H molecules attached is determined.

Il va du reste de soi que la présente invention n'a été décrite qu'd titre purement explicatif et nullement limitatif et que toute modification utile pourra y être apportée sans sortir de son cadre ;' en particulier pour le dosage des immunoglobulines anti-allergènes appartenant à une classe autre qu'IgE (IgG par exemple dans ce cas on remplace l'anticorps anti IgE par un anticorps anti IgG). It goes without saying that the present invention has only been described in a purely explanatory and in no way limiting manner and that any useful modification may be made without departing from its scope; in particular for the assay of anti-allergen immunoglobulins belonging to a class other than IgE (IgG for example in this case the anti IgE antibody is replaced by an anti IgG antibody).

De même plusieurs molécules d'allergènes pourront être liées entre elles afin d'être reconnues dans leur ensemble et d'entrainer une forte amplification du signal, en particulier lorsque 1' identification se fait par l'intermédiaire des molécules H. Likewise, several allergen molecules may be linked together in order to be recognized as a whole and to cause a strong amplification of the signal, in particular when the identification is made by means of the H molecules.

Claims

1. In vitro assay method for specific immunoglobulins of one or more allergens, characterized in that it essentially consists of having an anti-immunoglobulin antibody on a solid phase, this antibody being capable of fixing all of the immunoglobulins (of a given isotype) of a patient, whatever their specificities, and to use an allergen with a view to its fixation on the specific immunoglobulins fixed on said anti-immunoglobulin antibody, and conditioned to serve directly or indirectly as a tracer subsequently recognizable.

2. Method according to claim 1, characterized in that the anti-immunoglobulin antibody is an anti IgE.

3. Method according to claim 1 or 2, characterized in that an anti-immunoglobulin antibody is fixed on a solid support, by any known means, which the resulting material is incubated with the sample to be analyzed to fix the possible immunoglobulins present, that after elimination of said unbound substances, the resulting material is incubated with one or more labeled allergens directly or indirectly and that after separation of the solid and liquid phases the proportion of the quantity of products is determined marked, either fixed, or found in solution.

4. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the allergen (s) are coupled to a radioactive element, to a fluorophore or to an enzyme.

5. Method according to claim 1, 2 or 3, characterized in that the allergen (s) are coupled to one or more H molecules capable of binding to a ligand (anti H), itself labeled with a radioactive element or coupled with a fluorophore or an enzyme.

6. Method according to one of claims 1, 2, 3 or 5, characterized in that the molecule (s)

H is biotin and anti H is avidin coupled to a radioactive element, a fluorophore or an enzyme.

7. Method according to one of claims 1, 2, 3 or 5, characterized in that the molecule (s)

H is a haptenic antigen (hormone, drug and the like) and anti H is a high affinity antibody coupled to a radioactive element, a fluorophore or an enzyme.

8. Reagents for implementing the method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that they comprise a solid support on which is coupled an anti-immunoglobulin antibody, soluble allergens judiciously coupled so that '' they can either serve as a tracer in themselves (coupling with a radioactive element, a fluorophore or an enzyme), or be recognized by a tracer (coupling with one or more H molecules), the tracer being a ligand (anti H) itself labeled (by coupling with a radioactive element, a fluorophore or an enzyme).

9. Method according to any one of claims 1 or 3 to 8, wherein the immunoglobulins belong to a class other than IgE.

10. Method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that several molecules (identical or distinct) of allergens are linked together to be recognized as a whole by the specific IgE of one of they.

11. Method according to any one of claims 1 to 10 ,. characterized in that the antibody bound to the solid phase is a monoclonal antibody.