FI90082B - Foerfarande och kromatografikolonn foer rening av antikroppar - Google Patents

Description

1 90082

Menetelmä ja kromatografiakolonni vasta-aineiden puhdistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää ja kromatografiako-5 lonnia I(g)G3 vasta-aineiden puhdistamiseksi.

, Aiemmin on käytetty erilaisia menetelmiä vasta-ai neiden puhdistukseen. Vasta-aineita on puhdistettu esimerkiksi antigeeni-affiniteetti-kromatografialla tai proteiini A:n affiniteetti-kromatografialla. Yritettäessä puh-10 distaa alaluokan I(g)G3 vasta-aineita on kohdattu vaikeuksia, koska tällaisissa menetelmissä vasta-aine I(g)G3 usein saostuu liuoksesta, ja tällaiset sakat tulevat yleensä palautumattomasti liukenemattomiksi, ja näin menetetään puhdistettua vasta-ainetta.

15 Tämä keksintö kohdistetaan vasta-aineiden, ja eri tyisesti alaluokan I(g)G3 vasta-aineiden puhdistuksen ja varastoinnin parantamiseen. Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään.

20 Keksinnön mukaisesti alaluokan I(g)G3 vasta-ainetta puhdistetaan saattamalla affiniteettimatriisi kosketukseen nesteen kanssa, joka sisältää I(g)G3 -vasta-ainetta, ja tämä kosketus saadaan aikaan pH:ssa 9,0 - 9,6, vasta-aineen I(g)G3 sitomiseksi matriisiin. Sitten I(g)G3-vasta-25 aine vapautetaan matriisista, ja I(g)G3 kerätään nesteessä, joka on puskuroitu pH 9,0 - 9,6:een, ja useimmiten pH :ssa noin 9,3. Vasta-aine vapautetaan affiniteettimat-riisista käyttämällä vapautusainetta, ja I(g)G3-vasta-aine erotetaan välittömästi vapautusaineesta ja kerätään pusku-30 rin vesiliuokseen, jonka pH on 9,0 - 9,6.

Erityisen edullisen toteutustavan mukaisesti affi-niteettimatriisia käytetään kolonnissa, ja kolonnissa on myös suolanpoistomatriisi, ja affiniteettimatriisi on sijoitettu sellaiseen kohtaan kolonnissa, että se on suolan-····: 35 poistomatriisin tai -geelin yläpuolella. Tällä tavalla 2 ) J O 8 2 vapautunut vasta-aine kulkee suolanpoistomatriisiin tai -geeliin, jossa vapauttamisaine erotetaan I(g)G3 -vasta-aineesta.

Kolonni tasapainotetaan pH 9,0 - 9,6 välille, jol-5 loin puhdistuksen aikana vasta-aine pysyy tässä pHrssa, ja kosketus vasta-aineen ja vapauttamisaineen välillä minimoituu .

Keksinnön kohteena on myös kromatografiakolonni, jolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 5 10 esitetään. Kolonni sisältää sekä affiniteettimatriisin että suolanpoistomatriisin tai -geelin, ja affiniteetti-matriisi sijoitetaan kolonniin suolanpoistogeelin yläpuolelle, ja koko kolonni tasapainotetaan pH 9,0 - 9,6 välille, ja yleisimmin pH-arvoon noin 9,3.

15 Alaluokan I(g)G3-vasta-aine, joka puhdistetaan tä män keksinnön mukaisesti, voi olla läsnä osana polykloo-nista vasta-ainetta, tai keksinnön edullisen aspektin mukaisesti, puhdistettu vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine, alaluokkaa I(g)G3. Jos vasta-aine on polyklooninen 20 vasta-aine, puhdistettava vasta-aine voi sisältää muitakin vasta-aineita kuin I(g)G3-vasta-ainetta ja/tai se voi sisältää useamman kuin yhden alaluokan I(g)G3-vasta-aineen.

Alaluokan I(g)G3-vasta-ainetta, joka puhdistetaan tämän keksinnön mukaisesti, voidaan saada millä tahansa 25 erilaisista menetelmistä, ja se voi olla mikä tahansa hyvin suuresta määrästä vasta-aineita. Kuten on esitetty yllä, I(g)G3-vasta-aine on edullisesti monoklonaalinen vasta-aine. Menetelmiä monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi tunnetaan alalla yleisesti, ja tällaisia : 30 vasta-aineita voidaan puhdistaa tämän keksinnön mukaisesti.

Käytettävä affiniteettimatriisi on sellainen, joka kykenee adsorboimaan I(g)G3-vasta-ainetta. Esimerkiksi affiniteettimatriisi voi sisältää A-proteiinia; antigeeniä 35 I(g)G3-vasta-aineelle, joka on puhdistettava, tai vasta- 3 ) il G 3 2 aineen I(g)G3-vasta-aineelle, joka on puhdistettava, immo-bilisoidussa muodossa (kiinteällä tuella, kuten esimerkiksi ristiinkytketyllä dekstraanilla). Sopivan affiniteetti-matriisin valintaan I(g)G3-vasta-aineen adsorboimiseksi 5 katsotaan alaa tuntevien kykenevän tässä olevien opetusten mukaan; näinollen lisäyksityiskohtia tässä suhteessa ei katsota tarpeellisiksi esittää, jotta alaa tuntevat kykenisivät toimimaan tämän keksinnön mukaan.

Tässä keksinnössä käytettävä suolanpoistomatriisi 10 tai -geeli on mikä tahansa suuresta määrästä matriiseja, jotka ovat sopivia suolanpoistoon (pienien suolaionien tai -molekyylien erotukseen suuremmista molekyyleistä). Tällaisia matriiseja nimitetään usein geeleiksi, ja tällaisten matriisien käyttömenetelmää kutsutaan usein geelisuo-15 datukseksi. Tämän keksinnön mukaisesti suolanpoistomatrii-sia käytetään I(g)G3-vasta-aineen, joka on vapautunut af-finiteettimatriisilta, ja materiaalin tai materiaalien, joita käytetään I(g)G3-vasta-aineen vapauttamiseen affini-teettimatriisista, erottamiseen. Edustavina esimerkkeinä 20 tällaisista suolanpoistomatriiseista voidaan mainita: ristiinkytketty dekstraani (esimerkiksi tyyppi, jota myydään merkillä "Sephadex G-25") ja polyakryyliamidihelmet (esimerkiksi tyyppiä, jota myydään merkillä "Bio-Rad P-2").

Kolonni voidaan tasapainottaa pH-arvoon, joka on 25 vähintään 9,0 ja enintään 9,6, käyttämällä laajaa valikoimaa puskureita, ja sopivan puskurin valinnan katsotaan käyvän alaa taitavalle ilmi tässä olevasta esityksestä. Puskuri voi olla esimerkiksi natriumbikarbonaatti, nat-riumboraatti tai Tris-puskuri. Edustava puskuri on 0,1M 30 natriumboraatti, joka antaa pH-arvoksi noin 9,3.

Vapauttamisaine, jota käytetään vapauttamaan vasta-ainetta affiniteettimatriisilta, voi olla mikä tahansa tällaisista vapauttamisaineista. Yleensä tällaiset vapaut-tamisaineet ovat vesipitoisia puskureita, jotka on pusku-35 roitu pH-arvoon enintään 4,0. Useimmissa tapauksissa pus- 4 '' u 8 2 kurin pH ei ole alle 2,0; on kuitenkin ymmärrettävä, että alhaisempaa pH:ta voidaan käyttää. Vapauttamisaine voi olla kaotrooppinen aine (esimerkiksi natrium- tai kalium-tiosyanaatti); tai denaturointiaine, kuten guanidiinivety-5 kloridi tai urea, jne. Katsotaan, että alaa taitava kykenee valitsemaan sopivan vapauttamisaineen tämän esityksen perusteella.

Kuten on esitetty yllä, tämän keksinnön mukaisesti kontakti vasta-aineen ja vapauttamisaineen välillä mini-10 moidaan, ja puhdistettaessa affiniteettimatriisia käyttäen vasta-aine pidetään ja kerätään pH:ssa vähintään noin 9,0 ja enintään noin 9,6.

Tätä keksintöä kuvataan edelleen liitteenä olevalla piirroksella, jossa: 15 Piirros esittää kaavakuvaa keksinnön mukaisesti kromatografiakolonnista.

Piirroksen mukaan esitetään kromatografiakolonni 10, joka sisältää suolanpoistogeelin 11 ja affiniteetti-geelin 12 suolanpoistogeelin 11 yläpuolella. Kuten on esi-20 tetty yllä, affiniteettigeeli on edullisesti proteiini Asta ja suolanpoistogeeli on edullisesti Sephadexia.

Kolonni muodostetaan yleensä sillä tavalla, että suolanpoistomatriisin 11 tilavuus on vähintään kaksi kertaa, ja edullisesti vähintään neljä kertaa affiniteetti-25 matriisin 12 tilavuus. Tilavuuksien eroavaisuus edistää nopeaa erottumista vapauttamisaineen ja vapautuneen vasta-aineen välillä suolanpoistogeelissä 11.

Kolonni 10 tasapainotetaan pH-arvoon vähintään 9,0 ja enintään 9,6, kuten on esitetty yllä.

30 Vasta-ainetta I(g)G3 sisältävä näyte pannaan kolon nin 10 yläpäähän. Näyte voi olla seerumia, kudosviljely-liuosta, askiittiliuosta jne. Näyte sisältää edullisesti alaluokan I(g)G3 monokloonista vasta-ainetta. Näyte voidaan lisätä sellaisenaan tai kirkastettuna supernatantti-35 na.

5 90082

Vasta-aine adsorboidaan affiniteettimatriisiin 12 ja kolonni pestään vesipitoisella puskurilla, jonka pH on vähintään 9,0 ja enintään 9,6.

Pesun jälkeen vapauttamisainetta lisätään kolonnin 5 10 yläpäähän; esimerkiksi vesipitoista puskuria, jonka pH

on enintään 4,0. Muutos pH:ssa vapauttaa vasta-aineen af-finiteettimatriisilta 12, ja vapautunut vasta-aine kulkeutuu ennen vapauttamisainetta suolanpoistomatriisiin 11, jossa vapautunut vasta-aine, vesipitoisessa puskurissa, 10 joka on esitasapainotetussa pH arvossa vähintään 9,0 ja enintään 9,6, erotetaan vapauttamisaineesta. Tällä tavalla minimoidaan kontakti vapautetun vasta-aineen ja vapautta-misaineen välillä, ja vasta-aine pidetään tehokkaasti pHsssa, joka on vähintään 9,0, ja enintään 9,6, puhdistuk-15 sen aikana kolonnissa 10.

Kolonniin 10 lisättävän vapauttamisaineen tilavuutta kontrolloidaan siten, että aikaansaadaan vasta-aineen vapautuminen affiniteettimatriisista ja vapautuneen vasta-aineen erottuminen vapauttamisaineesta, ja pidetään vasta-20 aine vähintään 9,0 ja enintään 9,6 pH:ssa. Näinollen va-pauttamisainetta voidaan esimerkiksi lisätä tilavuus, joka on yksi tai kaksi kertaa affiniteettimatriisin 12 tilavuus .

Näinollen affiniteettimatriisin 12, suolanpoisto-25 matriisin 11 ja kolonniin lisättävän vapauttamisaineen suhteellisia tilavuuksia kontrolloidaan siten, että saadaan aikaan vapautuneen vasta-aineen erottuminen vapauttamisaineesta ja vapautuneen vasta-aineen talteenotto puskurin vesiliuoksessa, jonka pH on vähintään 9,0 ja enintään 30 9,6.

Kolonnia voidaan käyttää yllä kuvatulla tavalla vasta-aineen I(g)G3 puhdistukseen ja erityisesti alaluokan I(g)G3 monoklonaalisen vasta-aineen puhdistukseen.

Keksinnön lisäaspektin mukaan esitetään yhdistelmä, 35 joka sisältää vasta-ainetta I(g)G3 vesipitoisessa pusku- 6 10 O 3 2 rissa, jonka pH on vähintään noin 9,0 ja enintään noin 9,6 ja tavallisimmin noin 9,3. Vasta-aine I(g)G3 voi olla mo-noklonaalinen vasta-aine tai se voi olla polykloonisesta vasta-aineseoksesta. Tällaisen vesipitoisen puskurin käyt-5 tö parantaa I(g)G3 -vasta-aineiden varastointistabiili-suutta.

Keksintöä kuvataan edelleen seuraavan esimerkin avulla; sillä ei kuitenkaan rajoiteta keksinnön laajuutta:

Esimerkki 10 Kolonnia, jonka halkaisija oli noin 1 cm ja pituus 30 cm (tilavuus 24 ml), käytettiin monokloonisen vasta-aineaskiitin IgG(3) puhdistukseen. Kolonni konstruoitiin täyttämällä se ensin 19 ml:11a (24 cm) ristiinkytkettyä dekstraania (Sephadex G-25). Ristiinkytketylle dekstraa-15 nille (Sepharose C1-4B Sigma P-3391) tuettu proteiini A turvotettiin tislatussa vedessä ja noin 5 ml (6 cm) pantiin Sephadex G-25 päälle. Kolonni esitasapainotettiin useilla läpäisyillä 0,1M natriumboraattia (pH 9,3). As-kiittiseos pantiin kolonniin ja sitten se pestiin useilla 20 kolonnin tilavuuksilla natriumboraattipuskuria. Tämä poistaa askiitista eronneet jäljellä olevat proteiinit. Tämän pesuvaiheen jälkeen pantiin 10 ml 0,1M natriumsitraattia (pH 3,5) proteiini A/Sepharose CL-4B matriisiin, kunnes kaikki natriumsitraattipuskuri kulkeutui affiniteettimat-25 riisiin. 0, IM natriumboraattisäiliö yhdistettiin kolonniin, kun natriumsitraattipuskuri meni kolonniin, proteiinin eluoimiseksi. Vaihetta jatkettiin, kunnes kaikki vasta-aine eluoitui kolonnista, ja kolonni tasapainotettiin 0,1M natriumboraatilla pH 9,3:ssa. Tässä vaiheessa kolon-30 nia voidaan käyttää uudelleen vasta-aineen puhdistukseen. IgG(3) eluoitui fraktiossa 11, ja sitraattipuskuri eluoitui fraktiossa 24.

Tämä keksintö on erityisen edullinen, koska on mahdollista saada erittäin puhdasta vasta-ainetta nopealla ja : 35 toistettavalla tavalla ilman ongelmia, joita on aiemmin 7 -)0082 kohdattu vasta-aineen palautumattoman saostumisen muodossa. Lisäksi menetelmä sopii automaatiolle tietokoneohjatuissa ja ohjelmoitavissa puhdistussysteemeissä.

Edelleen on mahdollista ottaa talteen ja varastoida 5 I(g)G3-vasta-ainetta ilman ongelmia, joita alalla on tähän asti kohdattu, esim. ilman vasta-aineen palautumatonta saostumista.

Nämä ja muut edut käyvät alaa taitavalle ilmeisiksi tästä esityksestä.

10

Claims (6)

8 -ϊ ·;ι C: 8 2

1. Menetelmä I(g)G3-vasta-aineen puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 saatetaan I(g)G3-vasta-ainetta sisältävä neste kos ketukseen affiniteettimatriisin kanssa, joka pidetään pH-arvossa, joka on vähintään 9,0 ja enintään 9,6 I(g)G3-vas-ta-aineen adsorboimiseksi; vapautetaan adsorboitu l(g)G3-vasta-aine affiniteettimatriisista saattamalla affiniteet-10 timatriisi kosketukseen vapauttamisaineen kanssa ja erottamalla vapauttamisaine ja vapautunut I(g)G3-vasta-aine suolanpoistomatriisissa, jonka pH pidetään vähintään arvossa 9,0 ja enintään 9,6 ja jonka tilavuus on vähintään kaksi kertaa suurempi kuin affiniteettimatriisin tilavuus; 15 ja otetaan talteen vapautunut I(g)G3-vasta-aine eluaatis-sa, jonka pH on vähintään 9,0 ja enintään 9,6.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vapauttamisaine on vesipitoinen puskuri, jonka pH on enintään 4,0.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että I (g)G3-vasta-aine on mono-klonaalinen vasta-aine.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että suolanpoistomatriisin, affiniteet- 25 timatriisin ja eluaatin pH on noin 9,3.

5. Kromatografiakolonni I(g)G3-vasta-aineen puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää: kolonnin, joka sisältää affiniteettimatriisin ja suolanpoistomatriisin, jonka tilavuus on vähintään kaksi 30 kertaa suurempi kuin affiniteettimatriisin tilavuus, af-finiteettimatriisilta vapautuneen materiaalin vastaanottamiseksi, ja mainittu kolonni tasapainotetaan pH-arvoon, joka on vähintään 9,0 ja enintään 9,6.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen kolonni, t u n -35 n e t t u siitä, että affiniteettimatriisi on immobili- soitua A-proteiinia. 9 ') O O 8 2