FI82354C

FI82354C - Konservering av faerskfoder.

Info

Publication number: FI82354C
Application number: FI885252A
Authority: FI
Inventors: Jouko Setaelae; Aino Rauramaa; Martin Suominen; Seppo Sivelae
Original assignee: Valio Meijerien
Priority date: 1988-11-14
Filing date: 1988-11-14
Publication date: 1991-03-11
Also published as: HU207206B; ES2047089T3; DE68909743D1; AU626341B2; PL161142B1; FI885252A; NO175344C; EP0369198A3; NO894520D0; DK525089D0; US5053233A; JPH0547183B2; NO175344B; CA2001579A1; IE62850B1; FI82354B; CA2001579C; NO894520L; DE68909743T2; FI885252A0

Description

1 82354

Tuorerehun säilöntä Tämän keksinnön kohteena on menetelmä tuorerehun säilömiseksi, menetelmässä käytetty Lactobacillus planta-5 rum-bakteerikanta, kyseisen kannan käyttö rehun säilömiseen sekä menetelmän mukaisesti säilötty rehu.

Tuorerehun, kuten nurmirehun säilöntä perustuu siihen, että ruohosta valmistettu silputtu rehumassa suljetaan ilmatiiviisti siiloon, jolloin ruohon sisältämät hii-10 lihydraatit (pääasiassa glukoosi, fruktoosi ja fruktosaa-nit) käyvät siilossa hapoiksi. Suotuisissa olosuhteissa käymisissä muodostuu pääasiassa maitohappoa. Tällöin saadaan hyvälaatuista rehua ja käymistappiot ovat pienet. Yleensä rehuun muodostuu käymisen yhteydessä myös haihtu-15 via rasvahappoja, kuten etikkahappoa. Yhdessä käymishapot alentavat rehumassan pH:ta. Yleisesti on tunnettua, että rehumassa saadaan säilymään, jos sen pH alennetaan arvoon 4 tai sitä pienemmäksi, ja että pH:n alentaminen em. alueelle vaatii noin 100 happoekvivalenttia rehutonnia kohti. 20 Rehumassassa tapahtuvaa vapaata käymistä on vaikea ohjailla sellaiseksi, että käyminen olisi hyvälaatuista, so. mahdollisimman puhdasta maitohappokäymistä. Tästä johtuen rehun säilöntätulosta on pyritty parantamaan säilöntäaineiden avulla. Menetelmistä tunnetuin on A.I. Virtasen 25 ns. AIV-periaate, jonka mukaisesti rehuun lisätään joko orgaanisia tai epäorgaanisia happoja erikseen tai seokse na. Happo(j)a lisätään rehuun niin paljon, että rehumassan pH on 4 tai pienempi. Yleisesti happona käytetään nykyisin muurahaishappoa yksin tai seoksena muiden happojen kanssa. 30 Esimerkkejä muista säilöntäaineista ovat esittäneet mm. Vanbelle ja Bertin (ks. Ensilage - new biological aspects, Sanofi Sante Animale, 1985). Suoraan käymisen hillitsemiseen perustuvia säilöntäaineita ovat mm. formaliinia sisältävät säilöntäaineet, joista on esimerkkejä mm. edel-35 lisessä viitteessä, kuten myös FI-patenttijulkaisussa 68 949.

2 82354

Happojen ja happo-formaliini-seosten käyttöön liittyy kuitenkin ongelmia, joita ovat happojen yleinen tunnuspiirre, syövyttävyys, sekä formaliinin aiheuttamat allergiaoireet. Tästä syystä on pyritty ottamaan käyttöön 5 säilöntäaineita, joilla ei ole era. haitallisia ominaisuuksia. Käytettyjä vaihtoehtoisia aineita ovat kasvimassan kuituainesta pilkkovat entsyymit (esim. FI-patentti 66 282), joiden avulla rehuun tuotetaan lisää sokereita ruohon mikrobiston aiheuttaman käymisen raaka-aineeksi. Kos-10 ka ruohon mikrobisto on hyvin heterofermentatiivinen, ei pelkkä sokerien tuottaminen riitä takaamaan hyvän rehun laadun ja pienten varastointitappioiden tavoitteita (esim. Setälä, Enzymes in the forefront of food and feed industry, seminar at Espoo/Otaniemi, 16.6.-17.6.1988). Mikro-15 biston heterofermentatiivisyydestä johtuva ongelma on pyritty välttämään lisäämällä rehuun entsyymin kanssa samanaikaisesti pääasiassa homofermentatiivisia maitohappobakteereita, joiden käyttöä ja testausta ovat kuvanneet mm. Woolford ja Sawczyc (ks. Grass and Forage Science 39 20 (1984) 139-158). Myös eräitä bakteerikantoja on esitetty käytettäväksi rehun säilönnässä (EP-A2-0 250 786). Yleensä kantojen alkuperä, käyttäytyminen siilo-olosuhteissa ja kantojen ominaisuudet on kuitenkin identifioitu ja esitetty epäselvästi julkaisuissa, mistä johtuen eri kannoil-25 la ko. julkaisujen antamien tietojen perusteella suoritettujen kokeiden tulokset ovat olleet huonoja myös rehun laatukriteerien perusteella.

Säilörehussa käytettäville ymppibakteereille yleisesti asetettavat vaatimukset ovat vaihdelleet tutkijasta 30 riippuen paljonkin. Yleensä tärkeimpiä vaatimuksia ovat olleet: - hyvä kasvu laajalla lämpötila-alueella ja sekä aerobisissa että anaerobisissa oloissa - homofermentatiivisuus 35 - happamuuden sieto 3 82354 - nopea hapontuotto - ei proteolyyttisyyttä - fermentoi glukoosia, fruktoosia, sakkaroosia - ei tuota sakkaroosista dekstraania, eikä fruktoo-5 sista mannitolia - aktiivinen laajalla kuiva-ainealueella - omineisuuksiensa suhteen stabiili Säilörehussa sivukäymiset pyritään estämään säilöntäaineella, joka ei vaikuttaisi käytettävään homofermen- 10 tatiiviseen maitohappobakteeriin eikä sen ominaisuuksiin. Yleisimmin tunnettu säilöntäaine on muurahaishappo, jota ei kuitenkaan ole voitu käyttää yhdessä maitohappobakteerien kanssa, koska happo sinänsä vaikuttaa bakteerien toimintaa rajoittavasti.

15 Yllättäen on todettu, että säilötystä rehusta on eristettävissä erittäin toimintakykyinen, formiaattia sietävä homofermentatiivinen L. plantarum-maitohappobakteeri-kanta (AIV 755), joka on talletettu talletuslaitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen 20 talletusnumerolla DSM 4904 20.10.1988. Kantaa voidaan käyttää rehun säilömisessä, koska se toimii säilörehussa rehun säilymisen kannalta edullisella tavalla.

Tämän keksinnön mukaiselle menetelmälle tuorerehun säilömiseksi on tunnusomaista, että rehuun lisätään bak-25 teerikantaa Lactobacillus plantarum DSM 4904. Kanta on tunnistettavissa hakemuksen kohdissa I-IV mainituista ominaisuuksista.

Säilönnässä rehuun lisätään bakteeria noin 105-107 kpl/rehugramma, edullisesti 106 kpl/rehugramma. On edul-30 lista lisätä bakteerit yhdessä yhden tai useamman säilöntäaineen kanssa ja mahdollisesti yhdessä yhden tai useamman muun L. plantarum-kannan tai muun maitohappobakteeri-lajin kanssa. Bakteerit ja säilöntäaine (-aineet) voidaan lisätä yhtenä liuoksena. Säilöntäaineena voidaan käyttää 35 mm. kasvikuitua hajoittavia entsyymejä (esim. sellulaa-sia), ja formiaattia, bentsoaattia, propionihappoa ja/tai 4 82354 akryylihappoa. Formiaattia käytetään edullisesti noin 1500 g/rehutonni. Keksinnön kohteena oleva bakteerikanta tunnistetaan hakemuksen kohdissa I-IV esitetyistä ominaisuuksista, joita on esim. kannalla DSM 4904. Keksinnön piiriin 5 kuuluu myös kyseisten bakteerien käyttö rehun säilömiseen ja keksinnön mukaisella menetelmällä säilötty rehu.

Seuraavassa keksintöä kuvataan yksityiskohtaisesti.

Bakteerikannan kuvaukseen liittyvät kuviot 1 ja 2.

Kuviossa 1 esitetään kannan DSM 4904 plasmidipro- 10 fiili.

Kuviossa 2 esitetään Bglll-restriktioentsyymillä (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Penzberg, F.R.G.) pilkotun plasmidi-DSM 4904-kannan sekä purkuvaiheessa eristettyjen viljelmien DNA:n elektroforeesikuvat.

15 Ilmoitetut prosenttiarvot ovat säilöntäainepitoi- suuksien kohdalla paino/tilavuus ja kuiva-ainepitoisuuksien kohdalla paino/paino.

L. plantarum-kannan DSM 4904 ominaisuudet 20 I. Säilörehusta eristetty kanta, L. plantarum seu-raavin ominaisuuksin: - gram-positiivinen - tasapaksu, suora, yksinoleva sauva 25 - katalaasinegatiivinen - homofermentatiivinen - kasvaa +15°C:ssa, ei kasvua +45°C:ssa - ei muodosta ammoniakkia arginiinista - tuottaa L- ja D-maitohappoa tai omaa rasemaasiak- 30 tiivisuutta; L-maitohapon määrä n. 45 % maitohapon kokonaismäärästä ja D-maitohapon määrä n. 55 % maitohapon kokonaismäärästä; MRS-liemessä (Difco Laboratories, Detroit, Michigan, U.S.A.) kasvatettaessa 30°C:ssa 17 tunnin ajan maitohapon kokonaismäärä on n. 2 g/100 ml MRS-lientä.

5 82354 II. Kannalla DSM 4904 on yksi suurehkon (35-40 kb) molekyylipainon omaava plasmidi (kuvio 1).

III. Kanta DSM 4904 fermentoi seuraavia sokereita 5 tai sokerialkoholeja API 50 CH:n mukaan (API System S.A.,

France): L-arabinoosi, riboosi, galaktoosi, D-glukoosi, D-fruktoosi, D-mannoosi, mannitoli, Of-metyyli-D-mannosidi, N-asetyyliglukosamiini, amygdaliini, arbutiini, eskuliini, 10 salisiini, sellobioosi, maltoosi, laktoosi, melibioosi, sakkaroosi, trehaloosi, meletsitoosi, D-raffinoosi,/3-gen-tiobioosi, D-turanoosi.

IV. Kannan DSM 4904 muita ominaisuuksia 15 A. Kanta sietää muurahaishappoa sekä ainakin bent- soe-, akryyli- ja propionihappoa - esimerkiksi natriumformiaatin vesiliuoksessa ((30 %) pH 6,25) kannan kylmäkuivattu preparaatti säilyi vähintään 4 h:n ajan samalla tasolla (109 kpl/ml) kuin 20 lähtötilanteessa - kasvaa bentsoehapon suhteen 0,3 % MRS-liemessä

(pH 6,8) erittäin hyvin, mitattuna Klett-lukemin (Klett-Summerson photoelectric colorimeter, Arthur H. Thomas comp. Philadelphia P.A., U.S.A.). Samassa liemessä pH

25 4:ssä 0,05 % liuoksessa on vielä tyydyttävää kasvua. In-kubointi 4 vrk 30°C:ssa.

6 82354 TAULUKKO 1

Kannan DSM 4904 kasvu MRS-liemessä eri bentsoehap-popitoisuuksissa (4 vrk 30°C) 5 —---— bentsoehappopit. (%) pH 6,8 pH 4,0

Klett-lukema 0 600 500 0,05 600 460 10 0,1 600 190 0,2 600 15 0,3 550 6 0,4 510 0,5 470 15 - propionihapon sieto (MRS-liemi, pH 4,0)

Kanta DSM 4904 kasvaa 0,5 % pitoisuuden omaavassa liemessä hyvin - kanta sietää akryylihappoa (MRS; pH 4,0) 0, Ι Ο, 15 % pitoisuuksilla 20 _ kanta ei siedä heksametyylitetramiinia B. Kannan antibioottiherkkyys - DSM 4904 on täysin resistentti seuraaville antibiooteille: gentamysiini, kanamysiini, neomysiini, novo-biosiini, streptomysiini, sulfonamidit, vankomysiini 25 - jonkinasteista tai täydellistä anbibioottiherk- kyyttä seuraaville antibiooteille: ampisilliini, basitra-siini, kloramfenikoli, erytromysiini, penisilliini G, ri-famysiini, linkomysiini, tetrasykliini, virginiamysiini, spektinomysiini 30 V. Kannan säilyvyys säilörehussa - DSM 4904 säilyi säilörehussa hyvin. Vielä n. 5 kk:n kuluttua (ks. esim. 2) rehunteosta löytyi kannan DSM 4904 ominaisille ominaisuuksille identtisiä L. planta- 35 rumeja. Ne olivat yhdenmukaisia biokemiallisten reaktioiden ja plasmidiprofiiliensa suhteen sekä pilkkoutuvat 7 82354

BglII:lla yhdenmukaisesti (kuvio 2), - kasvatettaessa anaerobisesta kantaa MRS-liemessä yhdessä E.coli kannan NB kanssa (vedestä eristetty kanta) pystyi DSM 4904 tuhoamaan kolin 9 vrk:ssa, DSM 4904:n mää- 5 rän vielä ollessa 9 vrk:n jälkeen 9 χ 106 kpl/ml.

VI. Solujen tuotto - kanta kasvatetaan herapohjäisellä alustalla.

Kanta kylmäkuivataan ja kylmäkuivattu preparaatti 10 säilyy pakastimessa (-18°C) vähintään 6 kk:n ajan.

VII. Käyttö rehunsäilönnässä - kylmäkuivattu kanta sekoitetaan veteen toisten tuorerehun säilönnässä käytettävien aineiden, esimerkik- 15 si entsyymin kanssa ja käytetään n. 4 tunnin kuluessa sekoittamisesta annostelutason ollessa 105-107 kpl eläviä soluja/rehugramma. Suositeltavin taso on 106 kpl eläviä soluj a/rehugramma.

Keksintöä valaisevat seuraavat esimerkit: 20 Esimerkki 1

Silputtua ruohoa, jonka kuiva-ainepitoisuus oli 16,5 % ja kuiva-aineessa raakavalkuaista 16,2 %, raakakuitua 24,2 % sekä sokeria 12,4 %, säilöttiin 10 kilon lasi-siiloihin. Rehut tiivistettiin huolellisesti ja siilot 25 suljettiin ilmatiiviiksi muovin avulla. Lisäykset tehtiin yhtenä liuoksena ruiskuttamalla samalla rehumassaa pöy-hien. Koesiiloihin tehdyt lisäykset olivat seuraavat: A. ei säilöntäainetta B. AIV II-liuosta 5 litraa/rehutonni 30 C. DSM 4904 kantaa 106 kpl/rehugramma, entsyymi 150 ml/rehutonni D. kuten C, mutta lisäksi 1000 grammaa Na-formiaat-tia/rehutonni E. kuten C, mutta lisäksi 2000 grammaa Na-propio-35 naattia/rehutonni sekä Pediococcus pentosaceus (107 kpl/ g).

β 82354 AIV II-liuos sisältää 80 % muurahaishappoa ja 2 % ortofosforihappoa.

Entsyymi on kasvikuitua hajoittava entsyymiprepa-5 raatti, joka sisältää pääasiassa sellulaasia ja lisäksi muutakin akviivisuutta esim. hemisellulaasia.

Säilöntätulokset osoittavat lisäysten C, D ja E säilöneen rehut erittäin hyvin (taulukko 2). Rehuissa C, D ja E on enemmän sokereita ja vähemmän valkuaisen hajoa-10 mistuotteita, ammoniakkia, kuin rehuissa A ja B. Voimakas maitohappokäyminen on lisäksi ollut hyvin homofermentatii-vista käymistä, mitä kuvaa korkea maitohappo/etikkahappo-suhde rehuissa C, D ja E.

15 TAULUKKO 2

Koesäilörehujen kemiallinen koostumus, säilöntäaika 60 vrk

Koe- pH maito- etikka- voi- sokeri NH3 rehu happo happo happo 20 % kuiva-aineesta g/1 A 3,86 10,8 2,3 - 1,2 0,32 B 3,95 4,4 1,8 - 2,1 0,18 C 3,72 10,4 0,9 - 2,7 0,10 25 D 3,77 10,0 0,8 - 3,3 0,12 E 3,80 11,0 1,2 - 2,9 0,17

Koerehujen mikrobiologinen koostumus osoittaa edel-2q leen, että kanta DSM 4904 on kestänyt formiaatti-lisäyksen ja maitohappobakteerien kokonaismäärä on säilynyt samalla tasolla kuin ilman formiaattilisäystä (taulukko 3).

9 82354 TAULUKKO 3

Koesäilörehujen mikrobiologinen koostumus, säi-löntäaika 60 vrk 5

Koe- MHB hiivat homeet kölit klostridit rehu (xlO6 ) (xlO3 ) kpl/rehugramma A 6 1,5-510 <100 <10 3-7 10 B 12 2-110 100-500 <10 3-15 C 11 11-100 100-3000 <10 4 D 7 17-110 400-1100 <10 3-40 E 10 1900-3900 <100 <10 3-30 15 (MHB = maitohappobakteerit)

Esimerkki 2

Ruoho, jonka kuiva-ainepitoisuus oli 18,0 %, ja kuiva-aineessa raakavalkuaista 15,3 %, raakakuitua 27,1 % 20 sekä sokeria 10,6 %, silputtiin kelasilppurissa ja säilöttiin 500 kilon siiloon. Kutakin koerehua varten oli kaksi rinnakkaista siiloa, joissa rehu tiivistettiin huolellisesti, minkä jälkeen siilot suljettiin muovilla ja painotettiin vedellä täytetyillä astioilla (paine noin 250 kg/m2). 25 Lisäykset tehtiin rehuun silppurissa. Lisäykset olivat seuraavat: A. ei säilöntäainetta B. AIV II-liuosta 5 litraa/rehutonni (ks esimerkki 1) C. DSM 4904 kantaa 106 kpl/rehugramma, entsyymiä 300 30 ml/rehutonni D. kuten C, mutta lisäksi 1000 grammaa Na-formiaat- tia/rehutonni.

Erot koerehujen koostumuksissa vastaavat eroja esimerkin 1 mukaisten koerehujen koostumuksissa (taulukko 4). 35 Mikrobiologisessa koostumuksessa saavutettiin formiaatilla ίο 82354 edullinen vaikutus rehussa olevien hiivojen ja homeiden suhteen, kun verrataan rehuja C ja D (taulukko 5).

TAULUKKO 4 5 Koesäilörehujen kemiallinen koostumus, säilöntäaika 140 vrk

maitohappo etikkahappo voihappo sokeri NH3-N

Koe- ___

rehu pH % kuiva-aineesta %N

10___’__ A 3,92 11,2 2,6 - 0,2 10,9 B 4,15 5,2 2,0 0,9 0,5 8,7 C 3,71 10,3 1,0 - 3,3 1,8 D 3,69 10,5 1,0 - 3,7 1,8 15 ----- TAULUKKO 5

Koesäilörehujen mikrobiologinen koostumus 20 Koe- MHB hiivat homeet kölit klostridit rehu (xlO6) (xlO3) kpl/rehugramma A 67-110 35-51 10-100 <10 14-45 25 B 12-55 300-440 100-200000 10-6700 450-45000 C 1-8 150-46000 10-12000 10-60 <3 D 1 25-170 <10 <10 3-20

Rehujen aerobista kestävyyttä ja säilyvyyttä tut-30 kittiin pitämällä rehut 24°C:een lämpötilassa ja mittaamalla lämpötilan kehitystä rehumassassa. Korkeammasta sokeripitoisuudesta huolimatta rehut C ja D pysyvät stabiileina kaksi vuorokautta (taulukko 6).

n 82354 TAULUKKO 6 Lämpötilan kehitys rehussa (°C) --1 5 Koerehu 1 vrk 2 vrk 7 vrk i ! - ----- -- - | A 14 18 30 B 10 18 20 C 11 18 34 10 D 10 18 31

Formiaatti paransi rehun stabiilisuutta ja lämpötilan nousu rehussa D oli hitaampaa kuin rehussa C.

15 Esimerkki 3

Ruohoa, jonka kuiva-ainepitoisuus oli 20-22 % ja kuiva-aineessa raakavalkuaista 17,3 %, raakakuitua 24,3 % sekä sokeria 12,2 % säilöttiin 90 tonnin laakasiiloihin. Rehut korjattiin kelasilppurilla ja lisäykset tehtiin 20 rehuun silppuamisen yhteydessä. Rehut tiivistettiin polkemalla traktorilla ja peitettiin ilmatiiviisti muovilla. Lisäykset olivat seuraavat: A. ei säilöntäainetta B. AIV II-liuosta 5 litraa/tonni (vrt. esimerkki 1) 25 C. DSM 4904 kantaa 106 kpl/rehugramma, entsyymiä 300 ml/rehutonni D. kuten C, mutta lisäksi 1500 grammaa Na-formiaattia/ rehutonni E. kuten C, mutta lisäksi Pedlococcus pentosaceus 103 30 kpl/g.

Rehujen laadun suhteen tulokset ovat yhdensuuntai sia esimerkeissä 1-2 mainittujen tulosten kanssa (taulukko 7 ) .

12 82354 TAULUKKO 7

Koesäilörehujen kemiallinen koostumus, säilöntäaika 56 vrk 5 maitohappo etikkahappo voihappo sokeri NH3

Koe- __ rehu pH % kuiva-aineesta g/1 A 3,89 10,1 1,6 0 1,8 0,51 B 4,05 1,9 0,8 0,1 10,2 0,16 10 C 3,87 10,7 1,6 0 4,5 0,37 D 3,84 10,4 1,2 0 4,0 0,30 E 3,78 10,8 0,8 0 5,3 0,21 15 Esimerkki 4

Esimerkissä 2 mainitun koekaavion mukaan säilöttynä pH:n alenemisnopeus, L- ja D-maitohapon tuotannon nopeus eri säilörehuissa on esitetty taulukossa 8.

i3 82354 TAULUKKO 8

Rehumassan pH:n aleneminen ja maitohapon tuotanto 0-14 vuorokauden aikana säilönnästä (hapot % kuiva-aineesta) 5 | aika, vrk

Koe- ___ rehu määritys 0 2 3 7 14 A pH 5,8 5,6 4,6 4,1 4,1 j L-maitohappo 0,1 1,4 2,7 3,9 4,7 1® i D-maitohappo 0,1 0,4 2,2 3,3 3,9 etikkahappo 0,0 0,5 0,7 1,0 1,2 B j pH 4,1 4,2 4,1 4,2 4,3 L-maitohappo 0,1 0,0 0,1 0,1 0,4 15 : D-maitohappo 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 etikkahappo 0,0 0,0 0,0 0,1 0,3 C pH 5,7 3,9 3,8 3,9 3,8 L-maitohappo 0,1 3,1 4,1 4,4 4,7 2Q D-maitohappo 0,1 5,3 5,6 5,3 5,4 etikkahappo 0,0 0,4 0,5 0,9 1,0 D pH 5,8 4,0 3,9 3,8 3,8 I L-maitohappo 0,1 2,5 2,8 3,9 4,0 j D-maitohappo 0,1 5,7 5,7 5,5 5,6 J etikkahappo 0,0 0,4 0,4 0,7 0,9 -i----- , I-

Kahden vuorokauden kuluttua DSM 4904-kanta ja entsyymi ilman tai formiaatin kanssa on alentanut rehun pH:n 30 alle arvoon 4, mikä on rehun säilymisen kannalta haluttu taso. Myös maitohapon tuotantonopeus on ollut suuri, sillä maitohapon kokonaismäärä kahden päivän kuluttua oli jo noin 8 % kuiva-aineesta.

Säilörehuissa käyminen on ollut lisäksi heti alusta 35 lähtien hyvin homofermentatiivista, mikä on tunnusomaista DSM 4904-kannalle. Käymisen puhtautta kuvaa pieni etikka- 14 82354 hapon määrä säiliörehussa. Formiaatin lisäys on lisäksi edelleen vähentänyt etikkahappoa tuottavaa käymistä säilörehussa.

Esimerkki 5a 5 Timotei-valtainen ruoho säilöttiin 10 kilon labora- toriosiiloihin. Lisäykset tehtiin rehumassaan käsiruiskul-la, massa tiivistettiin, painotettiin ja suljettiin ilmatiiviisti. Säilöntäaika oli 60 vrk. Säilöntätulokset taulukossa 9 osoittavat DSM 4904-kannan antavan hyvän säilönkö tätuloksen. Käymishappojen suhteen ilman säilöntäainetta tehty rehu oli hyvin samankaltainen kuin DSM 4904-rehu, mutta haitallisen NH3-pitoisuuden osalta DSM 4904-rehu oli selvästi parempi.

TAULUKKO 9 15 AIV II-liuos ja DSM 4904-kanta nurmirehun säilönnässä (AIV II, 5 litraa rehutonnille, DSM 4904-kanta 106 kpl/rehu-gramma)

Rehuun pH maito- etikka- voi- sokeri NH3 tehdyt happo happo happo 20 lisäyk- __ set % kuiva-aineesta g/1 ei lisäystä 4,0 8,3 1,8 0 1,3 0,39 AIV II 4,1 3,6 0,9 0 7,1 0,24 25 DSM 4904 3,9 7,5 1,8 0 1,4 0,12 -kanta

Esimerkki 5b

Timotei-valtainen ruoho säilöttiin noin 10 tonnin 30 laakasäiliöihin. Rehut korjattiin niittosilppurilla ja säilöntäaine lisättiin rehuun korjuun yhteydessä. Siilot suljettiin muovilla ilmatiiviisti, ja painotettiin vesi-painoilla.

Taulukossa 10 esitettyjen tulosten mukaan entsyy-35 millä säilötty rehu oli hyvin samanlainen kuin ilman säi- is 82354 löntäainetta tehty rehu. Kun verrataan taulukoissa 9 ja 10 esitettyjä tuloksia, nähdään, että entsyymillä säilötty rehu on selvästi huonompi rehun NH3-pitoisuuden suhteen kuin DSM 4904-kannalla säilötty rehu.

5 TAULUKKO 10

Sellulaasi-entsyymin vaikutus nurmirehun käymiseen, säi-löntäaika 140 vrk 1® Säil. pH maito- etikka- voi- sokeri NH3 aine happo happo happo % kuiva-aineesta g/1 ei säilöntä- 3,89 7,4 1,0 0 2,7 0,77 15 ainetta entsyymi 3,82 9,5 0,9 0 3,1 0,59

Esimerkki 6

Timotei-valtäinen ruoho säilöttiin 10 kilon labora-toriosiiloihin esimerkissä 5 selostetulla tavalla.

TAULUKKO 11

Na-propionaatin vaikutus rehun käymisiin 25 ___

Rehuun teh- pH maito- etikka- voi- so- NH3 MHB

dyt lisäyk- happo happo happo- keri set ___ % kuiva-aineesta g/1 106/g 30 DSM 4904 + 3,8 12,1 1,3 0 2,4 0,15 9,5 entsyymi DSM 4904 + 3,8 12,6 1,1 0 2,9 0,13 160 entsyymi + 0,2 % Na-propionaatti 35 i6 82354

Na-propionaatti ei vaikuttanut haitallisesti maitohappobakteerien (MBH) määrään, mutta käymisen laatu (maitohappo: etikkahappo-suhde, NH3-määrä) muuttui paremmaksi (taulukko 11).

5 Esimerkki 7

Timotei-nurminata-valtaista ruohoa säilöttiin noin 45 tonnia laakasäilöön. Ruoho silputtiin silppurilla, jossa lisäykset tehtiin rehuun korjuun aikana. Ruohomassa tiivistettiin siilossa traktorilla, peitettiin muovilla 20 ilmatiiviisti ja painotettiin.

TAULUKKO 12

Na-bentsoaatin vaikutus rehun käymiseen, 56 vrk 25 Rehuun pH maito- etikka- voi- so- NH3 tehdyt happo happo happo keri lisäykset > ‘ % kuiva-aineesta g/1 —1 — — r*" - , — — — - — 20 dSM 4904 + ! 3,9 10,7 1,6 0 4,5 0,37 entsyymi DSM 4904 + 3,9 10,3 1,5 0 3,0 0,37 entsyymi + 0,05 %

Na-bents.

25 DSM 4904 + 3,8 11,1 1,1 0 4,7 0,24 entsyymi + 0,1 %

Na-bents.

30 Na-bentsoaatti ei vaikuttanut haitallisesti maito happobakteerien (MHB) määrään. Kaikissa rehuissa MBH:n määrä oli välillä 106-108 kpl/g. Bentsoaattikäsittely vähensi hiivojen määrää merkittävästi. Ilman bentsoaattia hiivoja oli 100 kpl/g. Bentsoaatilla käsitellyssä rehussa 35 hiivoja ei ollut. Käymisen laatu oli parempi vielä 0,1 % Na-bentsoaatin annostustasolla (taulukko 12).

Claims

1. Menetelmä tuorerehun säilömiseksi maitohappoa tuottavien bakteerien avulla, tunnettu siitä, 5 että rehuun lisätään bakteerikantaa Lactobacillus planta-rum DSM 4904.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteeria lisätään noin 105 -107 kpl/rehugramma, edullisesti 106 kpl/rehugramma.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että rehuun lisätään bakteerikantaa yhdessä yhden tai useamman säilöntäaineen kanssa.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että bakteerikanta ja säilöntäaine 15 tai säilöntäaineet lisätään edullisesti yhtenä liuoksena.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että säilöntäaine on kasvikuitua hajoittava entsyymi, esim. sellulaasi.

6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että säilöntäaine sisältää orgaanisia happoja tai niiden suoloja, esim. formiaattia, bent-soaattia, propionihappoa tai akryylihappoa.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että formiaattia käytetään edulli- 25 sesti noin 1500 grammaa/rehutonni.

8. Jonkin patenttivaatimuksista 1 - 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytetään lisäksi yhtä tai useampaa muuta L. plantarum-kantaa tai muuta maitohappobakteerilajia.

9. Tuorerehun säilöntään tarkoitettu maitohappobak- teerikanta, tunnettu siitä, että se on L. plantarum DSM 4904.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukaisen bakteerin käyttö tuorerehun säilömiseen.

11. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukaisen mene telmän avulla säilötty tuorerehu. is 82354