FI79786C - Foerfarande foer framstaellning ett farmaceutiskt medel foer behandling av diabetes. - Google Patents

Description

1 79786

Menetelmä sokeritaudin hoitoon käytettävän farmaseuttisen aineen valmistamiseksi

Diabetes Mellitus eli sokeritauti on aineenvaihdun-5 tahäiriö, jossa esiintyy oleellisena oireena kohonnut ve-rensokeripitoisuus. Tämä johtuu siitä, että haiman hormonia, insuliinia ei vapaudu riittävässä määrin. Luonnollisen hormonin korvaaminen tapahtuu nykyään yleensä käyttäen eläinten insuliinia, joka eristetään teuraseläinten rauha-10 sista, tai ihmisen insuliinia, jota voidaan saada puolisynteettisestä sianinsuliinista tai geeniteknologisia menetelmiä käyttäen.

Geeniteknologisia menetelmiä käytettäessä on tähän menneessä otettu käyttöön kaksi periaatteessa erilaista 15 menetelmää: A- ja B-ketjujen erillinen synteesi ja niiden sen jälkeen tapahtuva kemiallinen rekombinaatio, sekä pre-proinsuliinin, insuliinin luonnollisen esiasteen synteesi. Proinsuliini-molekyylissä A- ja B-ketju ovat liittyneet toisiinsa liitoskappaleen C-peptidin kautta. Sen tärkeim-20 pänä toimintana on nykyisen käsityksen mukaan molempien ketjujen kiinnittäminen suhteessa toisiinsa, niin että voi muodostua virheetön poimuuntuminen. Sen jälkeen kun poi-muuntuminen on tapahtunut, liittyvät kolme disulfidisiltaa ja tällöin insuliinin luonnollinen kolmiulotteinen rakenne 25 vakiintuu. C-peptidin lohkeaminen tapahtuu tryptisen ja karboksipeptidaasi-B-aktiviteetin omaavien entsyymien vaikutuksesta. Katkaisukohdat on merkitty sekvenssillä Lys-Arg (ennen A-ketjun N-päätettä) tai Arg-Arg (B-ketjun C-päätteessä). Ainoastaan vapaalla insuliinilla on täydel-30 linen biologinen aktiviteetti, koska C-peptidin läsnäollessa todennäköisesti osa biologisesta tunnistamisalueesta molekyylin pinnalla on peittynyt.

Insuliinin erikoinen kemiallinen luonne aiheuttaa sen, että hoito tapahtuu yleensä parenteraalisesti; hormo-35 ni hajoaisi esimerkiksi mahan/suoliston läpi kulkeutues- 2 79786 saan täydellisesti, ennen kuin se pääsisi vaikuttamaan. Hajoamisreaktioita, pääasiallisesti erilaisten suhteellisen epäspesifisten proteolyyttisten entsyymien aiheuttamia, esiintyy kuitenkin myös injektiokohdassa ja veren-5 kierrossa. Tästä johtuva, ainoastaan noin 7 minuutin puoliintumisaika in vivo on fysiologisesti homeostaasin merkityksessä periaatteessa merkittävä; mutta hoito vaikeutuu tämän johdosta huomattavasti, koska diabeetikon täytyy normaalisti saada insuliiniruiske neljä kertaa päivässä, 10 yleensä juuri ennen aterioita.

Tämän johdosta on jo varhain yritetty kehittää insuliinivalmisteita, joilla olisi hidastettu vaikutus. Menestyksellisimpiä ovat tähän mennessä ollessa sellaiset menetelmät, joissa kestoapuainetta lisäämällä insuliini 15 muutetaan vaikealiukoiseksi muodoksi. Näihin kuuluvat ennen kaikkea kaksiarvoiset sinkki-ionit, joiden läsnä ollessa insuliini voi olla neutraalissa väliaineessa kiteisessä tai amorfisessa muodossa. Emäksisten proteiinien, esimerkiksi protamiinisulfaatin tai humaaniglobiinin li-20 säyksellä on sama vaikutus, koska insuliini hapan molekyyli, jonka isoelektrinen piste ρΣ = 5,4; emäksinen proteiini ja insuliini esiintyvät neutraalialueella kiteisenä tai amorfisena suolamaisena, vaikealiukoisena kompleksina.

Insuliinin hidas vapautuminen näistä retard-val-25 misteista tapahtuu, kuten kuvitellaan, laimentumisen kautta, so. yksittäisten, kiteiden tai amorfisen sakan muodostavien komponenttien diffuusion avulla tai siinä tapauksessa, että on kyse insuliini-komplekseista, jotka sisältävät emäksisiä proteiineja, kesto-kantaja-aineen 30 proteolyyttisellä hajotuksella.

Äskettäin on käyty keskustelua ihmisen proinsu-liinista, joko yksinään tai yhdistelmänä tavallisten kes-tolisäaineiden kanssa, hidastusperiaatteena (kts. DE-A-32-32 036). Oletetaan, että C-peptidin proteolyyttinen loh-35 keaminen tapahtuu in vivo hidastetusti ja tällöin sinän-

II

3 79786 sä biologisesti ainoastaan vähän aktiivisesta proinsulii-nista (noin 1/8 insuliinin aktiviteetista, proteiinien määrään nähden) vapautuu täysin aktiivinen hormoni. Mutta tällaiset proinsuliinit hyväksytään käytettäviksi ainoas-5 taan ihmisillä, koska niiden sekvenssit ovat identtisiä ihmisen sekvenssien kanssa (niitä on ilmeisesti useampia) tai ne ovat hyvin paljon vastaavanlaisia. Sian- tai nau-danproinsuliinit ovat, kuten on yleisesti tunnettua, im-munogeesia. Proinsuliinin tarkka vaikutustapa jää kuiten-10 kin vielä avoimeksi. Ei ole vielä osoitettu, että spesifisesti insuliinia vapautuu. Päinvastoin, hajoaminen in vivo tapahtuu useilla tavoilla tuottaen useimmiten inaktiivisia fragmentteja. Proinsuliinin terapeuttista hyötyä voisi siis etsiä pikemminkin, jos sitä ylipäätänsä etsitään, 15 reseptoritasolta.

Diabeteksen hoidossa on huomioitava yksilölliset vaikuttavat tekijät, kuten erot aterioiden hyväksikäytössä, erot ihonalaisessa kudoksessa, mutta näiden ohella myös spesifiset ruokatottumukset, ruumiillinen aktiviteet-20 ti ja paljon muuta. Hyvälle verensokerin säätelylle on täten ehdotonta, että käytettävissä on lukuisia insuliini-valmisteita, joiden vaikutuksen luonne on erilainen, ja jotka on sovitettu potilaan yksilöllisiä tarpeita vastaaviksi. Ei-optimaalisen säätelyn yhteydessä keskustellaan 25 välittömien subjektiivisten ja objektiivisten vaikutusten, kuten hyperglykemian eli veren liiallisen sokeripitoisuuden tai hypoglykemian eli alhaisen verensokerin ohella erityisesti diabeteksen myöhäiskomplikaatioiden muodoista. Näihin kuuluvat ennen kaikkea makro- ja mikroangiopatia 30 eli verisuonitauti, neuropatia eli hermosairaus, neftopa-tia eli munuaissairaus ja retinopatia eli verkkokalvosai-raus.

Valmisteiksi, jotka on sovitettu optimaalisesti kulloinkin potilaan tarpeita vastaaviksi, ovat osoittautu-35 neet puhtaiden hidastavan vaikutuksen omaavien insuliinien 4 79786 ohella ennen kaikkea niin sanotut keskipitkävaikutteiset insuliinit.

Ne ovat hidastetusti vaikuttavan komponentin ja nopeavaikutteisen komponentin seoksia. Tällaiset seokset 5 ovat komplisoituja monivaihesysteemejä, jotka pysyvät stabiileina pitkän aikaa ainoastaan suhteellisen tarkkaan rajoitetuissa sekoitussuhteissa. Niinpä esimerkiksi sian 2-sinkki-insuliini-kidesuspensio ei ole vapaasti sekoitettavissa liukoisen sianinsuliinin kanssa. Sekoitettu, liu-10 koinen insuliini saostuu heti tai ajan kuluessa suhteellisen korkean sinkkipitoisuuden johdosta, mikä tarvitaan kiteiden stabilointiin. Tällaiset seokset ovat kapean alueen sisällä stabiileja, jos liuenneena insuliinina käytetään naudaninsuliinia (tällä menetetään kuiteikin spesi-15 finen puhtaus, lääketieteellisesti haluttu ominaisuus) tai liuenneen sianinsuliinin ja fenyylialaniini (Bl)-sianinsuliinin seosta (DE-A-24 18 218 ja DE-A-24 59 515}. Mitä tulee sekoittuvuuteen liuenneen insuliinin kanssa, niin edullisimpia ovat protamiiniinsuliini-valmisteet, jos hi-20 dastavan vaikutuksen omaavana komponenttina käytetään pro-tamiinista ja insuliinista saatuja kiteitä ulkonaisesti vastaavassa suhteessa. Näitä valmisteita käyttäen voidaan valmistaa NPH-tyyppisiä vaikutusprofiilejä; protamiinisulfaatin läsnäoloa, keholle vieraana, mutta suhteellisen 25 hyvin hyväksyttävänä proteiinina voidaan puolustaa lisäaineena .

Keksinnön tehtävänä on asettaa käytettäväksi stabiili farmaseuttinen aine, jonka vaikutus on sovitettu diabeetikon yksilöllisiä tarpeita vastaavaksi.

30 Tämä tehtävä ratkaistiin nyt keksinnön mukaisesti vaikutusaineyhdistelmällä, joka koostuu insuliini-johdannaisesta, jonka B-ketju sisältää C-terminaalisesti emäksisen luonteen omaavan orgaanisen ryhmän, ja luonnollisesta insuliinista tai sen Des-Phe®31-analogeista.

35 Insuliini-johdannaisia, jotka sisältävät B-ketjun I! 5 79786 C-terminaalisessa päässä ryhmät Arg-OH tai Arg-Arg-OH, on jo kuvattu aikaisemmin. Näitä johdannaisia muodostuu tunnetusti, kun proinsuliini muutetaan entsymaattisesti insuliiniksi in vivo, luonnollisina välituotteina ja niitä 5 on löydetty pieninä määrinä myös haimauutteista. Mainitut ryhmät lohkeavat normaalisti trypsiinin ja/tai karboksi-peptidaasin B tai vastaavasti spesifisten entsyymien vaikutuksesta insuliinin vapautuessa: FI-patenttihakemuksen 842914 kohteena ovat toiset C-terminaalisesti emäksisesti 10 modifioidut insuliinijohdannaiset, menetelmä niiden valmistamiseksi ja niiden käyttö.

Keksinnön kohteena on menetelmä lääkeaineen valmistamiseksi, joka koostuu fysiologisesti hyväksyttävästä kantaja-aineesta ja vaikutusaineyhdistelmästä. Menetelmälle le on tunnusomaista, että

a) insuliinijohdannainen, jolla on kaava I

g _ g 20 C □_

H~i Gly A-Ketiu Asn I OH

s s m ! i l1'

S S

25 B

R1-(Val B-ketju |_r1-r2 3 4 5 6 jossa 2 R1 on H tai H-Phe, 3 R1 on Ala, Thr tai Ser ja 4 R2 on koliinitähde (-0CH2-CH2-N(CH3 )3 , Arg, Lys tai Arg- 5 ja/tai Lys-yksikköjen di- tai tripeptiditähde, jolloin 6

Arg- tai Lys-jäännösten terminaaliset COOH-ryhmät voivat 6 79786 olla myös esteröityjä koliinilla tai yksinkertaisilla alkoholeilla tai amidoituja yksinkertaisilla typpiemäksillä, isoelektrisen pisteen ollessa välillä 5,8-8,5 ja b) insuliini, jolla on kaava I, jossa 5 R1 on H tai H-Phe, R30 on Ala, Thr tai Ser ja R31 on OH, tai niiden fysiologisesti hyväksyttävä suola, sekä mahdollisesti proinsuliini ja mahdollisesti C-peptidi, 10 sekä fysiologisesti hyväksyttävä kantaja saatetaan sopivaan terapeuttisesti annettavaan muotoon.

Erittäin edullisina pidetään kaavan I mukaisia insuliini-johdannaisia, jotka sisältävät Bl-asemassa fe-nyylialaniinin. Edelleen pidetään edullisina sellaisia in-15 suliinijohdannaisia, jotka sisältävät B30-asemassa Alain,

Thrrn tai Ser:in. Niiden A-ketju ja ketju (B 2-29) sisältävät tarkoituksenmukaisesti naudan- tai sian insuliinin, mutta erityisesti ihmisen insuliinin sekvenssit.

Aminohapporyhmät ja vastaavien johdannaisten ryh-20 mät voivat olla toisistaan riippumatta D- ja L-konfiguraa-tiossa. Edullisina pidetään kuitenkin kaikkien ryhmien L--konfiguraatiota.

Geneettisesti koodattavissa ovat seuraavat L-amino-hapot: Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asp, Asn, Glu, 25 Gin, Cys, Met, Arg, Lys, His, Tyr, Phe, Trp, Pro.

Neutraalilla, luonnollisena esiintyvällä aminohapolla tarkoitetaan erityisesti seuraavia: Gly, Ala, Ser, Thr, Vai, Leu, Ile, Asn, Gin, Cys, Met, Tyr, Phe, Pro tai Hyp. Emäksisellä, luonnollisena esiintyvällä aminohapolla 30 tarkoitetaan erityisesti seuraavia: Arg, Lys, Hyi, Orn, Cit tai His.

Ryhmillä, jotka mahdollisesti suojaavat keksinnön mukaisten insuliini-johdannaisten B-ketjun C-terminaali-sessa päässä olevaa vapaata karboksifunktiota, ymmärtetään 35 ennen kaikkea esteri- ja amidiryhmiä, edullisesti (C1-C6)-

II

7 79786 alkoksia, (C3-C6)-sykloalkyylioksia, NH2 :ta, (C^-CgJ-al-kyyliaminoa tai di-(Cx-C6)-alkyyliaminoa, tai emäksisiä ryhmiä, kuten amino(C2-C6)-alkoksia, (C2-C4 )alkyyliamino-(C2-C6 )-alkoksia, di-fC^-C^ )-alkyy li amino (C2-C6 )-alkoksia, 5 tri-(C:-C4 )-ammonio-(C2-C6 )-alkoksia, amino-(C2-C6 )-alkyy-liaminoa, (C1-Ci )-alkyyliamino)-(C2-C6 )-alkyyliaminoa, [di-(C1-C4 )-alkyyliamino]-(C2-C6)-alkyyliaminoa tai [tri-(C2-C4 )alkyyliammonio]-(C2-C6)-alkyyliaminoa, erityisesti -0-(CH2 )p -NR2 : ta, -0-(CH2 )p -NR3 ;a, -NH-(CH2 )p -NR2 :ta 10 tai -NH-(CH2 )p -NR3:a, jossa p = 2 -6 ja R on samanlainen tai erilainen ja merkitsee vetyä tai (C3-C4 )-alkyyliä.

Kaavan I mukaisten, keksinnön mukaisten insuliini-johdannaisten joukosta mainittakoon esimerkiksi seuraavat yhdisteet, rajoittamatta keksintöä kuitenkaan näihin.

15

humaani-insuliini - ArgB 31 -OH

sianinsuliini - Arg®31-OH

naudaninsuliini - Arg®31-OH

humaani-insuliini - Arg®31 -Arg®3 2-OH

20 sianinsuliini - Arg®31 -Arg®3 2-OH

naudaninsuliini - Arg®31 -Arg®3 2-OH Des-Phe®1-sianinsuliini - -Arg®1 -OH Des-Phe® 1 -humaani-insuliiniAgar ® 31-OH Des-Phe®1-sianinsuliini - Arg® 3 1 -Arg® 3 1 -OH 25 Des-Phe® 1 -humaani-insuliini Arg"3 1 -Ar® 3 2-OH sianinsuliini - Arg® 3 1 -0CH3 humaani-insuliini Arg® 3 1 -0CH3 naudaninsuliini - Arg® 31_ 0CH3 sianinsuliini - Arg® 3 1 -Arg® 3 2-0CH3 30 humaani-insuliini - Arg"3 1 -Arg®32-0CH3

Des-Thr®3 0-humaani-insuliini-Val®3 0-Arg® 3 2-0CH3 Des-Thr®30-humaani-insuliini - Vai®30-Arg®31-OH Des-Thr®30-humaani-insuliini - Vai®30-Ala®31-Arg®32-OH humaani-insuliini - LysB31-OH 35 humaani-insuliini- D-Arg®31-OH

8 79786 humaani-insuliini- D-ArgB 31-ArgB 3 2-OH humaani-insuliini- ArgB 31-D-ArgB 3 1 -OH humaani-insuliini- LysB 31-ArgB 3 2-OH humaani-insuliini- ArgB 31 -LysB 3 2-OH 5 humaani-insuliini- Argininol831

humaani-insuliini- ValB 31-ArgB 3 1 -OH humaani-insuliini- ValB 31-ArgB 3 2-ArgB 3 3-OH humaani-insuliini- ArgB 31-Argininol® 3 2 humaani-insuliini- LysB 31-ArgB 3 2-ArgB 3 3-OH

10 humaani-insuliini -ArgB 31 -NH-t-v 15 humaani-insuliini-ArgB 31 -ArgB 3 2 -NH-t-\ X) humaani-insuliini- ArgB 31-NH2 20 humaani-insuliini- Arg31-ArgB32-NH2

humaani-insuliini- OrnB31-OH

humaani-insuliini- LeuB 31-CitB 3 2-OH

humaani-insuliini-(B30)-OCH2 CH2-NH2 humaani-insuliini-(B30)-NH-CH2 CH2-NH2 25 humaani-insuliini-ArgB31-0-CH2-CH2-NH2 humaani-insuliini-ArgB31-NH-CH2-CH2-N(CH3 )2 humaani-insuliini-(B30)-0-CH2 -CH2 -?i(CH3 )3 humaani-insuliini-(B30)-NH-CH, -CH, -N(CH), 2 2 © humaani-insuliini-LeuB 3 1.0-CH2-CH2-CH2-N (C2H5 )3 30 humaani-insuliini-TrpB 31 -TrpB 3 2 -TrpB 3 3 -NH( CH2 )6-^(nC4H9 )3

Kaavan I mukaisten insuliini-johdannaisten valmistus tapahtuu siten, että a) Des-Oktapeptidi (B-23-30)-insuliini, jolla on 35 kaava II,

II

9 79786 — S_ S_ AI____A21

S1- Gly A-ketju Asn |-0H

5 I I

s s I (II) s s 1 1 r-1-!-5«

S -R - B-ketnu Arg -OH

10 ---_ jossa R1 on Phe tai sidos ja S1 on protoni-solvolyytti-sesti tai β-eliminoinnilla lohkaistava aminosuojaryhmä 15 kuten tert.-butyylioksikarbonyyli-(Boc), tert.amyylioksi-karbonyyli-(AOc) tai metyylisulfonyyli-etyylioksikarbonyy- li-(Msc)ryhmä, kondensoidaan peptidin kanssa, jolla on kaava III, 20 H-Gly-Phe-Phe-Tyr(S2)-Thr(S2)-Pro-Lys(S3)-R30-R31 (III) jossa R3 0 ja R31 merkitsevät samaa kuin edellä, S2 on vety, Bzl tai Bu* ja S3 on uretaanisuojaryhmä, kuten Boc, Moc tai Z, jolloin ryhmissä R30 ja R31 mahdollisesti 25 esiintyvät vapaat COOH-, OH-, SH-, ί^-ΝΗ2-, guanidino- ja/-tai imidatsoli-ryhmät, ovat tarpeen vaatiessa sinänsä tunnetulla tavalla suojattuja, ja mahdollisesti esiintyvät suojaryhmät lohkaistaan sinänsä tunnetulla tavalla, b) kaavan I mukaisen Des-B30-insuliinin, jossa R1 30 on H tai Η-Phe ja C-pääte R30-R31 merkitsee yhdessä OH:ta, annetaan reagoida trypsiinin tai trypsiiniä vastaavan endo-peptidaasin läsnä ollessa yhdisteen kanssa, jolla on kaava IV, 35 H-R3 0 -R31 10 79786 jossa R30 ja R31 merkitsevät samaa kuin edellä ja jossa mahdollisesti esiintyvät vapaat COOH-, OH-, SH-, -NH2-, guanidino- ja/tai imidatso-funktiot ovat tarpeen vaatiessa sinänsä tunnetulla tavalla suojattuja ja lopuksi mahdolli-5 sesti esiintyvät suojaryhmät lohkaistaan sinänsä tunnetulla tavalla tai c) insuliini-johdannaisen valmistamiseksi, joka sisältää L-konfiguroituja aminohapporyhmiä ryhmässä R31 , proinsuliini, proinsuliini-analogi tai pre-proinsuliini-10 analogi tai näiden yhdisteiden väliaste lohkaistaan kemiallisesti ja/tai entsymaattisesti.

Menetelmävaihtoehdossa b) lähtöyhdisteinä käytetyt Des-B30-insuliinit tunnetaan esimerkiksi EP-A-46 979:stä tai julkaisusta "Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359 15 (1978) 799”. Vaihtoehdossa b) käytettyä kaavan IV mukaista lähtöainetta valmistetaan sinänsä tunnetulla tavalla pep-tidikemian menetelmien mukaisesti. Käyttökelpoisia suoja-ryhmiä kaavan IV mukaisille yhdisteille on kuvattu yksityiskohtaisesti julkaisussa "M. Bodanzky et ai.. Peptide 20 Synthesis 2an Wd. 1976, Wiley & Sons".

Geeniteknologisia menetelmiä käyttäen voidaan saada ihmisen tai kädellisten proinsuliinia lähtöaineena me-netelmävaihtoehdolle c): johdannaisia Arg (B31) ja Di-Arg(B31-32) voidaan saada niistä trypsiinin tai trypsiinin 25 kaltaisten entsyymien vaikutuksesta tapahtuvalla yksinkertaisella hajotuksella.

Tämän ohella voidaan kuitenkin syntetisoida myös suhteellisen yksinkertaisia plasmideja,jotka johtavat uusiin insuliinijohdannaisiin, koska ne koodaavat B31:ssä 30 tai B32:ssa luonnostaan sijaitsevien arginiinien paikalla muita neutraaleja tai emäksisiä aminohappoja.

Proinsuliinin valmistus rekombinaatio-DNA-tekniikkaa käyttäen vaatii proinsuliinin aminohappojaksoa koodaa-vaan DNA-sekvenssin muodostamista, joko eristämällä, syn-35 tetisoimalla tai molempien yhdistelmää käyttäen. Proinsu-

II

11 79786 liini-DNA viedään sitten lukuvaiheessa sopivaan kloonaus-ja ilmentämiskantajaan. Kantajaa käytetään sopivan mikro-organismin transformaatioon ja tällöin saatu transformoitu mikro-organismi viedään sitten fermentaatio-olosuhteisiin, 5 mitkä johtavat proinsuliinia sisältävän vektorin kopioiden edelleen muodostumiseen ja proinsuliinijohdannaisen proin-suliinin tai proinsuliinin esiasteen tai pre-proinsuliini-johdannaisen ilmentymiseen.

Jos ilmentymistuotteen kohdalla on kyse proinsulii-10 nin esiasteesta, niin tällainen tuote sisältää yleensä proinsuliiniaminohapposekvenssin, joka on terminaalisesta aminoryhmästä liittynyt proteiinin fragmenttiin, joka normaalisti ilmaistaan geenijaksolla, johon proinsuliini tai proinsuliinijohdannainen on viety. Proinsuliiniaminohap-15 pojakso on liittynyt proteiinifragmenttiin spesifisesti lohkaistavan kohdan kautta, jossa on kyse esimerkiksi me-tioniinista.

Saatu proinsuliiniaminohappojakso lohkaistaan hajotetusta geenituotteesta, esimerkiksi julkaisussa DE-A-20 32 32 036 kuvatulla tavalla ja proinsuliini eristetään puhdistuksen jälkeen.

Tällä tavalla saadun proinsuliinin tai proinsuliinijohdannaisen entsymaattinen lohkaisu tapahtuu julkaisussa "Excerptia Medica International Congress Series nro 25 231, sivulta 292 alkaen, tai saksalaisessa patenttihake muksessa P 32 09 184 (HOE 82/F 047) kuvattua menetelmäta-paa käyttäen.

Kuvattujen puolisynteettisten menetelmien avulla voidaan tällöin saada tunnettujen arginiini(B32)- ja diar-30 giniini(B31-32)-johdannaisten sekä geeniteknologisia me netelmiä käyttäen saatavien johdannaisten, jotka sisältävät R31:ssä luonnollisia L-aminohappoja, lisäksi myös joukko uusia insuliini-johdannaisia, joille on luonteenomaista, että ne sisältävät yhden tai useampia emäksisiä 35 ryhmiä ja/tai eivät sisällä vapaita karboksyyliryhmiä, 12 79786 joten molekyylin nettovaraus lisääntyy vähintään yhdellä positiivisella varauksella luonnolliseen insuliiniin tai Des-PheB1-insuliiniin nähden.

Näihin kuuluvat esimerkiksi johdannaiset, jotka 5 sisältävät B-31-asemassa luonnollisten aminohappojen sijasta L-lysiiniä, L-histidiiniä tai L-arginiinia, niiden D-enantiomeerejä tai tavallisia D- tai L-aminohappoanalo-geja, jotka sisältävät sivuketjussa emäksisen ryhmittymän (esim. ornitiinin, hydroksilysiinin). Aminohapon sijasta 10 voi B-31 aseman paikalla esiintyä esimerkiksi koliinieste-riryhmä, minkä johdosta saadaan kaksi positiivista netto-varausta. B-31 asemassa olevalla aminohapolla tai amino-happoanalogilla voi olla vapaa karboksyylipää tai se voi olla esteröity yksinkertaisilla alkoholeilla (esim. meta-15 noli11a, etanolilla) tai se voi olla amidoitu yksinkertai silla typpiemäksillä (esim. ammoniakilla, mono-tai dime-tyyliamiinilla); tämän ohella se voi olla esteröity esim. koliinilla. B-31-asemassa voi esiintyä esimerkiksi neutraali tai myös jokin muu luonnollinen emäksinen aminohappo 20 tai jokin edellä kuvatuista aminohappojohdannaisista; vastaavalla tavalla niiden karboksyyliryhmä voi olla vapaa tai esteröity tai amidoitu. Tässä voi seurata myös esimerkiksi koliiniesteriryhmä tai vielä jokin muu neutraali tai emäksinen aminohappo tai aminohappoanalogi.

25 Kaikille näille insuliinijohdannaisille on yhteis tä, että molekyylin pinnalla olevat (t) positiivinen varaus (positiiviset varaukset) aiheuttavat molekyylille neutraalialueelle saakka siirtyneen isoelektrisen pisteen. Aina johdannaisen mukaan mitataan isoelektristen pisteiden 30 arvoksi 5,8 - 8,5, erityisesti 6,2 - 8,2 isoelektrisellä tarkennuksella.

Tällöin johdannaiset liukenevat neutraalialueella huonommin kuin luonnollinen insuliini tai proinsuliini, joiden isoelektrinen piste ja tällöin maksimi-liukenemat-35 tomuuden alue on pH = 5,4:ssä, kun taas neutraalialueella

II

« 79786 ne ovat normaalisti liuenneina.

Tämän mukaisesti näillä kaavan 1 mukaisilla insu-liinijohdannaisilla on täysin uusi hidastusvaikutus, ja ne pystyvät vaikuttamaan ilman kesto-apuaineita, kuten 5 sinkkiä ja protamiinisulfaattia. Kestovaikutus johtuu luontaisesta, proteiineille tunnusomaisesta fysikaalisesta periaatteesta, vaikealiukoisuudesta isoelektrisessä pisteessä. Uudelleenliukeneminen fysiologisissa olosuhteissa tulisi saavuttaa, kuten oletetaan, lohkaisemalla ylimää-10 räiset emäksiset ryhmät, mikä tapahtuu kulloinkin aina johdannaisen mukaan tryptisen tai trypsiinin kaltaisen, ja/tai karboksipeptidaasi-B- tai karboksipeptidaasi-B:tä vastaavan ja/tai esteraasi-aktiviteetin vaikutuksesta. Kulloinkin lohkaistut ryhmät ovat joko puhtaasti fysiolo-15 gisia metaboliitteja, kuten aminohapot, ornitiini tai koliini, tai myös fysiologisesti hyväksyttäviä ja helposti metabilisoituvia aineita.

Sianinsuliini-ArgB31 -OH:11a ja vastaavalla diargi-niini-johdannaisella on julkaisussa "Chance, Exerpta Me-20 dica International Congress Series nro 231, sivu 292, 293" suoritettujen tutkimusten mukaan ainoastaan 62 % tai vastaavasti 66 % luonnollisen sianinsuliinin aktiviteetista.

Yllättävää kyllä nyt todettiin, että (myös erona 25 proinsuliiniin nähden) johdannaisten biologinen aktiviteetti on suunnilleen vastaava kuin luonnollisen insuliinin aktiviteetti. Ne eivät myöskään ole, erona kirjallisuudessa kuvattuihin väliasteinsuliineihin nähden, jotka sisältävät vielä heterologisen C-peptidin osia, 30 enemmän immunogeenisia kuin vastaava insuliini itse.

Mahdollisesti edellä mainitut von Chance'n liian alhaiset arvot johtuvat siitä, että nämä peptidit eivät ole olleet riittävän puhtaita tai että mittauksessa on tapahtunut systemaattinen virhe.

35 Kuvattujen johdannaisten lisäksi, jolloin niiden 14 79786 käyttö tapahtuu yksinään tai seoksena puhtaina, hidastavan vaikutuksen omaavina insuliineina tai yhdistelmänä tunnettujen kestokantaja-aineiden kanssa, on nyt mahdollista valmistaa monenlaisella tavalla stabiileja seoksia, jotka 5 sisältävät nopeasti käytettävissä olevaa insuliinia, esimerkiksi liuenneita osia. Tällöin voidaan saada hyvin tarkkaan yhteensovitetut vaikutusprofiilit omaava valmiste.

Erityisesti tulevat kyseeseen neutraalit seokset, 10 jotka koostuvat yhdestä tai useammasta johdannaisesta, jotka vaikuttavat hidastavana komponenttina, liuenneen, luonnollisen insuliinin kanssa, edullisesti samaa lajia olevan kanssa. Mutta näiden ohella voidaan myös käyttää proinsuliinia ja/tai C-peptidiä, kulloinkin yksinään tai 15 yhdistelmänä insuliinin kanssa liuenneena komponenttina. Luonteenomaista näille valmisteille on, että ne ovat stabiileja kaikissa sekoitussuhteissa. Tämä on edellytyksenä nykyään diabeteksen hoidossa hyvin tavallisten, keskipit-kävaikutteisten insuliinivalmisteiden valmistukselle.

20 Keksinnön mukaiset aineet voivat sisältää myös useampia erilaisia kaavan I mukaisia insuliini-johdannai-sia ja/tai useampia erilaisia kaavan I mukaisia insuliineja. Tämän lisäksi voidaan myös käyttää muita terapeuttisesti mielenkiintoisia yhdistelmiä, kuten esim. johdannai-25 sen ja insuliinin ja/tai proinsuliinin ja/tai Des-PheB1-insuliinin ja/tai C-peptidin seosta liuenneessa muodossa tai NPH-kiteinä tai muita klassisia hidastavia muotoja. Tällä tavalla voidaan valmistaa mm. hyvin pitkään vaikuttavia valmisteita, joilla on erilainen perusprofiili. Juu-30 ri ihmisen insuliinin kohdalla tämä olisi tämä toivottavaa, koska tähänastisten kokemusten perusteella sen vai-kutuksenkestolla ei ole sinkkikiteiden eikä NPH-kiteiden muodossa oikeata ultra-retard-profiilia, kuten esimerkiksi vastaavilla naudaninsuliinivalmisteilla.

35 Insuliinia ja/tai proinsuliinia ja/tai Des-Phe®1 - 15 79786 insuliinia ja/tai C-peptidiä ja kaavan I mukaista insuliini- johdannaista voidaan käyttää myös alkalisuolan tai ammoniumsuolan muodossa.

Luonnollisen insuliinin ja/tai proinsuliinin ja/ 5 tai Des-PheB1-insuliinin ja/tai C-peptidin ja insuliini-johdannaisen väliset sekoitussuhteet voivat olla alueella: 0-99 % insuliinia ja 0-99 % proinsuliinia ja 0-99 % fenyylialaniini-(Bl)-insuliinia ja 0-99 % C-peptidiä ja 1-100 % insuliinijohdannaista (näiden peptidien kokonais-10 määrästä).

Keksinnön mukainen käyttömuoto on myös esimerkiksi insuliini-johdannaisen ja insuliinin tai proinsuliinin hapan liuos, jonka pH on insuliinin isoelektrisen pisteen alapuolella.

15 Edullisena pidettyjen aineiden pH-arvot ovat välil lä 2,5-8,5 ja aineet ovat tällöin liuoksena tai suspensiona.

Kuvatut käyttömuodot on normaalisti liuotettu tai suspendoitu vesipitoiseen väliaineeseen, joka sisältää 20 lisäksi sopivaa isotoniseksi tekevää ainetta, esimerkiksi glyseriiniä tai keittosuolaa ja sopivaa mikrobeja vastustavaa ainetta, esimerkiksi fenolia, m-kresolia tai p-hyd-roksibentsoehappoesteriä sopivana annostuksena. Tämä fysiologisesti hyväksyttävä kantaja-aine voi sisältää 5,0:n 25 ja 8,5:n välisellä pH-alueella lisäksi puskuriainetta, esim. natriumasetaattia, natriumsitraattia, natriumfos-faattia tai tris-hydroksimetyyli-aminometaania. Liuottamiseen ja pH:n säätämiseen käytetään laimennettuja happoja, tyypillisesti suolahappoa tai laimennettuja emäksiä, 30 tyypillisesti NaOH:ta.

Insuliini ja/tai proinsuliini ja/tai desPhe®1 -insuliini ja/tai C-peptidi ja kaavan I mukainen insuliini-johdannainen voivat olla toisistaan riippumatta kulloinkin liuenneessa, amorfisessa ja/tai kiteisessä muodossa. Kul-35 loinkin haluttu osa insuliinista ja/tai proinsuliinista 16 79786 loinkin haluttu osa insuliinista ja/tai proinsuliinista ja/tai desPhe-insuliinista ja/tai C-peptidistä ja kaavan I mukaisesta insuliinijohdannaisesta voi olla kiteisessä muodossa, kulloinkin toinen haluttu osa insuliinista 5 ja/tai proinsuliinista ja/tai desPhe-insuliinista ja/tai C-peptidistä ja kaavan I mukaisesta insuliinijohdannaista voi olla amorfisessa muodossa sekä kulloinkin loput insuliinista ja/tai proinsuliinista ja/tai desPhe-insuliinista ja/tai C-peptidistä ja kaavan I mukaisesta insuliinijoh-10 dannaisesta voi olla liuenneessa muodossa.

Valmiste voi sisältää sopivissa määrissä apuainetta, jolla on hidastava vaikutus (kesto-apuaine) kuten esim. protamiinisulfaattia, globiinia tai sinkkiä (0-100 pg/100 kansainvälistä yksikköä).

15 Tätä hidastusperiaatetta voidaan käyttää yhdistel mänä koko vaikutusaineosuuden tai sen osan kanssa. Valmiste voi myös sisältää useampia erilaisia hidastavasti vaikuttavia apuaineita.

Usein on edullista lisätä keksinnön mukaiseen val-20 misteeseen sopiva määrä sopivaa stabilointiainetta, joka estää proteiinin saostumisen termis-mekaanisessa rasituksessa erilaisten materiaalien vaikutuksesta. Tällaisia stabilointiaineita on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa EP-A-18609 DE-A-32 40 177 ja W0-83/00288.

25 Seuraavat esimerkit selventävät edelleen keksintöä, rajoittamatta sitä kuitenkaan näihin esimerkkeihin.

Esimerkki 1

Sian insuliini-ArgB31-ArgB32-OH, valmistettu tryp-siinihajotuksella sian proinsuliinista neutraaliksi val-30 misteeksi, pitoisuus 40 KY/ml, sekoitettuna 20 %:n tai 40 %:n kanssa liukoista sian insuliinia (40KY/ml): Liuotetaan 10 ml:n kokonaistilavuuteen veden kanssa:

Sian insuliini-ArgB31-ArgB32-OH:ta 14,8 mg (27,0 KY/mg) 35 Natriumdivetyfosfaatti-dihydraatti 21,0 mg

Glyseriiniä 160,0 mg

II

17 79786

Fenolia 6,0 mg m-Kresolia 15,0 mg pH säädetään arvoon 7,3 lisäämällä 1 N HCl:ää tai 5 IN NaOH:ta. Vastaavassa tai samassa väliaineessa olevaa, 40 KY/ml sisältävää sian insuliiniliuosta sekoitetaan joukkoon, niin että sen tilavuudenmukainen osuus on 20 % tai 40 %. Nestekromatografian eli HPLC:n avulla määritetään kulloinkin heti ja 4°C:ssa tapahtuneen 3 kuukautta 10 kestäneen säilytyksen jälkeen kokonaispitoisuus sekä su-pernatantin pitoisuus.

Kokonaismääritys Supernatantti t - 0 3 kuukautta t = 0 3 kuukautta 15 _4^C_4 8C_ 20 % 40 KY/ml 40 KY/ml 7,5 KY/ml 7,8 KY/ml 40 % 40 KY/ml 40 KY/ml 16,5 KY/ml 15,6 KY/ml

Sian insuliini-ArgB31-ArgB32-OH erottuu HPLC:ssä 20 sian insuliinista. Supernatantissa ei voida todeta mitään johdannaista, ts. liukenematon osuus ei liukene.

Päinvastoin ei sakan pesun jälkeen voida havaita insuliinia, so. insuliini ei myöskään saostu.

Esimerkki 2 25 Sian insuliini-ArgB3 1-OH, valmistettu trypsiiniha- jotuksella sian proinsuliinista, seoksena 25 %:n (aktiviteetti) kanssa liuennutta sian proinsuliinia neutraaliksi valmisteeksi, jonka aktiivisuus on 40 KY/ml, ja jolla on kestovaikutus: 30 Sekoitetaan 10 ml:n kokonaistilavuuteen veden kanssa:

Sian insuliini-ArgB31-OH:ta 10,9 mg 27,5 KY/mg

Sian proinsuliinia 30,3 mg 3,3 KY/mg 35 Natriumasetaattia 14,0 mg 18 79786 p-hydroksibentsoehappometyyliesteriä 10,0 mg keittosuolaa 80,0 mg

Lisäämällä 1 N HCl:ää tai 1 N NaOH:ta säädetään pH 5 arvoon 7,0.

Tällainen suspensio saa aikaan koiralla kestovaiku-tuksen, joka on vastaavanlainen kuin depot-vertailuvalmis-teen kesto-vaikutus (0ptisulin(R 1 Depot CS).

Esimerkki 3 10 Sian insuliini-ArgB31-ArgB32-OH, valmistettu sian proinsuliinista trypsiinihajotuksella NHP-kiteinä, seoksena 25 %:n kanssa des-fenyylialaniini-(Bl)-sianinsulii-nia, valmistettu sian insuliinista Edmann-hajotuksella, neutraaliksi valmisteksi, jonka aktiivisuus on 40 KY/ml 15 ja jolla on hidastettu vaikutus.

Sekoitetaan 10 ml:n kokonaistilavuuteen veden kanssa:

Sian insuliini-ArgB31-ArgB32-OH:ta 11,1 mg 27.0 KY/mg 20 des-fenyylialaniini-Bl)-sianinsuliinia 3,6 mg 28.0 KY/mg

Protamiinisulfaattia 1,0 mg

Natriumvetyfosfaatti-dihydraattia 21,0 mg

Fenolia 6,0 mg 25 m-Kresolia 16,0 mg

Glyseriiniä 160,0 mg

Lisäämällä 1 N HCl:ää tai 1 N NaOH:ta saatetaan pH arvoon 7,3.

Tällainen suspensio saa aikaan koiralla kestovaiku-30 tusta vastaavan vaikutuksen.

Esimerkki 4

Humaani-insuliini-(B30)-koliiniesteri, valmistettu sianinsuliinista puolisynteettisesti, seoksena 40 %:n kanssa humaani-insuliinia ja 20 %:n kanssa (määrä) ihmisen 35 C-peptidiä, neutraaliksi valmisteeksi, jonka aktiivisuus

II

19 79786 on 40 KY/ml ja jolla on keskipitkä vaikutus:

Sekoitetaan 10 ml:n kokonaistilavuuteen veden kanssa:

Ihmisen insuliini-(B30)-koliiniesteriä 7,2 mg 5 (28 KY/ml)

Ihmisen insuliinia 7,2 mg (28 KY/mg)

Ihmisen C-peptidiä 3,6 mg

Natriumdivetyfosfaatti-dihydraattia 21,0 mg 10 Glyseriiniä 160,0 mg pH säädetään arvoon 7,3 lisäämällä 1 N HCl:ää tai 1 N NaOH:ta.

Tällainen suspensio saa aikaan koiralla vaikutus-profiilin, joka on verrattavissa yhdistelmävalmisteen 15 (esim. Kokb-H-Insulin(R>Hoechst) vaikutusprofiiliin. Esimerkki 5

Humaani-insuliini-Arg"3 1 -Lys® 3 2-0CH3, valmistettu puolisynteettisesti sianinsuliinista, seoksena 50 %:n kanssa sinkki-ihmisinsuliini-kiteitä valmisteeksi, jonka 20 aktiivisuus on 40 KY/ml ja jolla on hidastettu vaikutus.

Sekoitetaan 10 ml:n kokonaistilavuuteen veden kanssa:

Ihmisen insuliini-Arg831 -LysB32-0CH3 7,4 mg (27,0 KY/mg) 25 Ihmisen insuliinia 7,4 mg (28 KY/mg)

Sinkkikloridia, vedetöntä 0,23 mg

Natriumasetaattia 14,0 mg p-hydroksibentsoehappometyyliesteriä 10,0 mg 30 Keittosuolaa 80,0 mg

Lisäämällä 1 N HCl:ää tai 1 N NaOH:ta säädetään pH arvoon 7,0.

Tällainen valmiste saa aikaan kaniinilla (0,4 KY/kg) selvän retard-vaikutuksen eli hidastetun vai-35 kutuksen.

20 79786

Esimerkki 6

Humaani-insuliini-ArgB31-OH seoksena 30 %:n kanssa ihmisen insuliini-ArgB 3 1 -ArgB 3 2 -OH: ta molemmat: valmistettu trypsiinihajotuksella kädellisten pre-proinsulii-5 nista. E.soli'ssa, seoksena 40 %:n kanssa kiteistä NPH-ihmisinsuliinia valmisteeksi, jonka aktiivisuus on 40 KY/ml ja joilla on selvä retard-vaikutus eli hidastettu vaikutus.

Sekoitetaan 10 ml:n kokonaistilavuuteen veden kansio sa:

Ihmisen insuliini-ArgB31-OH:ta 4,4 mg (27,5 KY/mg)

Ihmisen insuliini-ArgB31 -Arg8 3 2 -OH:ta 4,4 mg 15 Ihmisen insuliinia 5,7 mg (28 KY/mg)

Protamiinisulfaattia 0,5 mg

Natriumdivetyfosfaatti-dihydraattia 21,0 mg m-Kresolia 15,0 mg 20 Fenolia 160,0 mg

Lisäämällä 1 N NaOH:ta tai 1 N HCl:ää säädetään pH arvoon 7,3.

Tällainen suspensio saa aikaan kaniinilla voimak-25 kaasti hidastetun ja pitkään kestävän vaikutuksen.

Il

Claims (6)

21 79786

1. Menetelmä lääkeaineen valmistamiseksi, joka koostuu fysiologisesti hyväksyttävästä kantaja-aineesta ja vai-5 kutusaineyhdistelmästä, tunnettu siitä, että a) insuliinijohdannainen, jolla on kaava I S_ S AI_C_H_A21

10. HGly A-Ketiu Asnf—OH S S S s i:c)

15. B2 B29 R^Val B-Ketju t~ r30-r1 2 3 4 5 jossa R^· on H tai H-Phe, 30 20. on Ala, Thr tai Ser, ja . . 2 R on kolimitähde (-OCH2-CH2-N(CH^)^, Arg, Lys tai Arg-ja/tai Lys-yksikköjen di- tai tripeptiditähde, jolloin Arg-tai Lys-jäännösten terminaaliset COOH-ryhmät voivat olla myös esteröityjä koliinilla tai yksinkertaisilla alkoho-25 leiliä tai amidoituja yksinkertaisilla typpiemäksillä, isoelektrisen pisteen ollessa välillä 5,8-8,5, ja 3 b) insuliini, jolla on kaava I, jossa R^· on H tai H-Phe, R^ on Ala, Thr tai Ser ja 30 R1 on OH, 4 tai niiden fysiologisesti hyväksyttävä suola, sekä mahdollisesti proinsuliini ja mahdollisesti C-peptidi, sekä fysiologisesti hyväksyttävä kantaja saatetaan sopivaan terapeuttisesti annettavaan muotoon. 5

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 22 79786 tunnettu siitä, että lääkeaine sisältää insuliini-B 31-Arg-0H:ta tai insuliini-B 31-Arg-Arg-OH:ta

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lääkeaine sisältää proinsulii- 5 nia tai proinsuliini-analogia ja/tai ihmisen C-peptidiä.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lääkeaineen pH-arvc on 2,5- 8,5 ja että se esiintyy tällöin liuoksena tai suspensiona ja että se sisältää tarkoitukseen soveltuvaa isotoniseksi 10 tekevää ainetta tavanomaisessa määrässä sekä tarkoitukseen soveltuvaa säilöntäainetta sopivassa määrässä.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lääkeaine sisältää sinkkiä sopivan määrän, joka voi olla 0-100 pg/100 yksikköä kohti.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetel mä, tunnettu siitä, että valmiste sisältää sopivissa määrissä jotakin tunnetuista apuaineista, joilla on hidastava vaikutus. II 23 79786