FI79551C - Foerfarande foer framstaellning av formenteringsmedier, som innehaoller aminoglykocid-antibiotika. - Google Patents

Description

79551

Menetelmä aminoglykosidi-antibiootteja sisältävien fermen-taatioliemien valmistamiseksi

Keksintö liittyy menetelmään antibiottituotannon lisäämiseksi kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti mikro-organismeissa in vivo-geneettisen rekombinaation avulla. Etenkin keksintö koskee patenttivaatimuksen 1 johdannon mukaista menetelmää aminoglykosidi-antibiootteja sisältävien fermentaatioliemien valmistamiseksi viljelemällä Streptomy-ces-kantoja, joissa on muunnettua geneettistä materiaalia ja muunnettu antibiootin tuotantokyky ja jotka saadaan antibioottia tuottavien Streptomyces-kantojen in vivo-geneettisen rekombinaation avulla.

Aminoglykosidi-antibiootteja käytetään nykyisin laajalti hu-maaniterapiassa ja niillä on suuri taloudellinen merkitys. Laajan vaikutusspektrinsä johdosta niitä ei käytetä ainoastaan humaaniterapiassa vaan myös eläinlääkinnässä.

On tunnettua, että Streptomyces tenebrarius tuottaa nebramy-siiniä, antibioottien monikomponenttiseosta (Stark, Hoehn ja Know, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1967, s. 314; GB-patenttijulkaisu 1 178 489; US-patenttijulkaisu 3 691 276 ja HU-patenttijulkaisu 176 103). Umezawa ja avustajat ovat esittäneet kanamysiinin valmistusta Streptomyceticus ATCC 12853-kannasta (J. Antibiotics 10A, 181 (1957), JP-patentti Kokai 8695 (1961)). Kanamysiinikomponentit A, B ja C ovat myös aminoglykosidi-antibiootteja.

On myös tunnettua, että Streptomycetaceae-heimon (Streptomyces ja mikromonosporia-kannat) mikro-organismisoluista muodostuu sopivissa olosuhteissa protoplasteja (soluseinämätön muoto), jotka voidaan regeneroida tämän jälkeen normaaleiksi soluiksi (US-patentti 4 294 927, Okanishi, Suzuki ja Umezawa, J. Gen. Microbiol. 80, 389 (1973)). Erilaisten kantojen protoplastien fuusio indusoi geneettisiä rekombinaatioita, jolloin muodostuu soluja, jotka ovat uusien geneettisten informaatioiden kantajia (esim. Hopwood, Wright ja Bibb, Natu- 2 79551 re 268, 171 (1977), Alföldi, Szavoboda ja avustajat, US-patentti 4 294 927 (1978), Godfrey, Ford ja Huber, Can. J. Microbiol. 24, 994 (1978), Oichi, Hitchcock ja Katz, J.

Bact. 139, 984 (1979)). Kokeet on suoritettu aminohappo-, nukleotidiemäs- ja vitamiinidefisienteillä auksotrofisillä kannoilla. Itse geneettinen rekombinaatio osoitetaan siten, että protoplastit, jotka on muodostettu soluista, jotka on kasvatettu toisaalta urasiiliä sisältävässä vähimmäiselatus-aineessa, toisaalta kysteiinin läsnäollessa, fuusioidaan ja regeneraation jälkeen eristetään ei-aminohappodesinfientit prototrofit (Oichi ja avustajat, ks. edellistä viitettä).

Baltz ja avustajat ovat esittäneet BE-patenteissa 868 472 ja 868 473 menetelmän Streptomyces-protoplastien valmistamiseksi ja regeneroimiseksi ja protoplastien fuusioimiseksi, mutta eivät ole maininneet tuloksia antibiootti-biosynteesin vaikutuksesta. Heidän kokeensa on aina suoritettu auksotro -fisillä kannoilla.

Antibiootti-biosynteesin aikaansaamista in vivo-geneettisel-lä rekombinaatiolla proplastifuusion avulla ei ole tietääksemme esitetty vielä kirjallisuudessa.

Keksinnön kohteena on uusi menetelmä antibiootti-biosyntee-sin aikaansaamiseksi kvalitatiivisesti ja kvantitatiivisesti in vivo-geneettisen rekombinaation avulla, jossa menetelmässä vaikutetaan edullisesti biologisesti aktiivisten yhdisteiden laatuun ja määrään, jotka yhdisteet on biosyntetisoi-tu antibiootteja tuottavilla mikro-organismeilla.

Odottamatta on todettu, että niiden rekombinanttien solujen määrätyn osan kyky tuottaa antibioottia, jotka on valmistettu menetelmän mukaisen protoplastifuusion avulla, on modifioitu verrattuna rekombinanttikantojen koko määrään yllättävän suuressa suhteessa. Osa rekombinanteista tuotti muuttuvan koostumuksen omaavia antibioottikomplekseja, muissa, verrattuna fuusiopartnereihin, tuotantokyky joko parani tai väheni huomattavasti.

l! 3 79551

Edelleen on todettu, että protoplastlfuusion tehokkuutta ja vielä paremmin rekombinaation tehokkuutta voidaan parantaa merkittävästi keksinnön mukaisen menetelmän avulla.

Kokeissamme on odottamatta todettu, että geneettinen rekombinaatio tapahtuu myös silloin kun toisen fuusiopartnerin protoplastit on inaktivoitu kemiallisen tai fysikaalisen käsittelyn avulla. Siten ei ole tarpeen merkitä molempia fuu-siopartnereita geneettisesti.

Keksinnön kohteena on siten patenttivaatimuksen 1 tunnus-merkkiosan mukainen menetelmä, jonka mukaan - valmistetaan sakkaroosia, kalsium- ja magnesiumioneja sisältävä kasvatusalusta, - kasvatetaan kasvatusalustassa geneettisesti merkittyjä, aminoglykosidi-antibiootteja tuottavia Streptomyces tenebrarius- tai Streptomyces kanamyceticus-kantoja, - kasvatetaan erikseen prototroofisia tai ei-merkittyjä, aminoglykosidi-antibiootteja tuottavia Streptomyces-tenebrarius- tai Streptomyces kanamyceticus-kantoja, - muodostetaan kasvatettujen geneettisesti merkittyjen Streptomyces-kantojen sekä kasvatettujen prototroofis-ten tai ei-merkittyjen Streptomyces-kantojen protoplastit, - inaktivoidaan kemiallisesti tai fysikaalisesti prototroofiset tai ei-merkityt Streptomyces-kantojen protoplastit niiden tekemiseksi elinkyvyttömiksi, - fuusioidaan geneettisesti merkittyjen Streptomyces-kantojen protoplastit ja prototroofisten tai ei-merkittyjen Streptomyces-kantojen inaktivoidut protoplastit, - regeneroidaan fuusioidut protoplastit, - tarkastetaan saatavien kantojen antibiootti-tuotantokyky, - valitaan parantuneen tuotantokyvyn omaavat kannat, ja - suoritetaan näillä uusilla kannoilla ilmastettuja fermentointeja submerssiviljelmissä orgaanisia hiili-ja typpilähteitä, epäorgaanisia suoloja, hivenaineita ja/tai eläin- tai kasviöljyjä ja/tai rasvoja sisältävässä kasvatusalustassa.

4 79551

Keksinnön erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti valmistetaan aminohappo- tai nukleotidiemäsdefisienttejä aukso-trofisia kantoja. Auksotrofit valmistetaan käsittelemällä mutageenisesti N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiinilla (Davis, J. Am. Chem. Soc., 7J), 1948)). Saatujen auksotro-fien tuotantokyky sekä geneettinen stabiilisuus tarkastetaan joukkotutkimuksissa. Geneettisesti vakaat isolaatit kasvatetaan nestemäisessä, orgaanisia hiili- ja typpilähteitä, sakkaroosia, kalsium- ja magnesiumioneja ja glysiiniä (glysiini on peräisin solukasvusta) sisältävässä elatusaineessa. Valitaan ne viljelmät, joissa glysiinin kasvua estävä vaikutus on vahvin, mutta ei vielä kokonaan täydellinen, ja solut sentrifugoidaan ja pestään. Pestyt solut suspendoidaan sakkaroosia ja lysotsyymejä sisältävään, fysiologiseen suolaliuokseen, jolloin muodostuu protoplasteja. Talteen otetut protoplastit pestään ja osa niistä siirretään kiinteälle re-generointi-agarille. Toinen osa protoplasteista yhdistetään suhteessa 1:1 geneettiseen rekombinaatioon valittujen, part-nerisoluista samoin valmistettujen protoplastien kanssa. Protoplastiseoksessa lisätään polyeteeniglykolia (molekyyli-paino 1000 - 20 000) ja suoloja, jotka dissosioituvat magnesium- ja kalsiumioneiksi protoplastifuusion indusoimiseksi. Tämän jälkeen solut regeneroidaan. Jos regeneraatio suoritetaan vähimmäiselatusaineessa, niin kasvupesäkkeitä voivat *: muodostaa vain ne hybridisolut, joissa on todella tapahtunut in vivo-geneettinen rekombinaatio. Regeneraatio voidaan suorittaa kuitenkin myös orgaanista typpeä sisältävässä elatus-aineessa. Silloin voidaan prototrofien määrä määrittää siten, että tässä väliaineessa kasvatetut kasvupesäkkeet siirretään vähimmäiselatusaineelle.

Yllä olevalla menetelmällä eristetään ne prototrofiset re-kombinantit protoplastien fuusion jälkeen, jotka on muodostettu yhdestä tai useammasta auksotrofista. Valitettavasti kuitenkin antibioottia tuottavien kantojen muunto auksotro-feiksi kannoiksi vähensi huomattavsti niiden tuotantokykyä. Taloudellisista syistä näytti toivottavalta, että ainakin li s 79551 toinen fuusiopartneri voisi biosyntetisoida suuria määriä antibioottia. Näin kehitettiin menetelmä, jossa vain toinen partnereista on auksotrofi, toinen sitä vastoin prototrofi, jonka protoplastit tehtiin elinkelvottomiksi ennen fuusiota joko kemiallisella tai fysikaalisella käsittelyllä. Fuusion jälkeen kaikista auksotrofeista tai tapetuista prototro-feista, jotka olivat läsnä, mutta jotka eivät voineet regeneroitua eivätkä kasvaa, regeneroitiin yksinään hybridi-solut, koska ne yksinään muodostivat kasvupesäkkeitä.

Tässä keksinnön mukaisessa menetelmässä protoplastit inakti-voidaan joko kemiallisilla tai fysikaalisilla menetelmillä, voidaan käyttää jokaista reagenssia, joka johtaa protoplas-tien regenerointikyvyn hävittämiseen ja säilyttää samalla niiden geneettisen koskemattomuuden, esim. kannabidiolihap-poa (3-metyyli-6-isopropenyyli-4'-n-pentyyli-2',6'-dihyd-roksi-l,2,3,6-tetrahydrodifenyyli-3'-karboksyylihappoa) tai sen suoloja, N-etyylimaleimidiä, pyrrolinitriiniä [3-kloori-4-(3-kloori-2-nitrofenyyli)-pyrroli], briljantti-vihreää [N-(4-(4-(dietyyliamino)fenyyli)-fenyylimetyleeni)- 2,5-sykloheksadien-l-ylideeni)-N-etyyli-etaaniaminiumsul-faatti] ja 2-merkaptoetanolia. Päättyneen kemiallisen inak-tivoinnin jälkeen protoplastit pestään ja käytetään fuusio-partnereina.

Menetelmän erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti protoplastit voidaan inaktivoida myös gamma-säteilyllä. Protoplas-teja säteilytetään 60Co-isotoopilla 30 - 120, sopivimmin 80 krad:n annoksella, sitten protoplastit sentrifugoidaan ja käytetään fuusiopartnereina.

Talteenotettujen prototrofisten isolaattien antibiootin tuotantokyky tarkastetaan joukkotutkimuksissa. Fuusion jälkeen määritetään myös kaksoisauksotrofien ja myös niistä segregaation avulla saatujen prototrofien tuotantokyky.

Kantojen tuotantokyky tarkastetaan siten, että tartutetaan tarkoituksenmukaisesti orgaanisia hiili- ja typpilähteitä, 6 79551 epäorgaanisia suoloja ja kasviöljyjä sisältäviin elatusai-neisiin, ja viljelmät inkuboidaan. 16-24 tunnin kuluttua nämä istutusviljelmät käytetään saman koostumuksen omaavan pääfermentaatioväliaineen siirrostamiseen. Fermentaatiota jatketaan 140 - 160 tuntia. Kokeet otetaan vasta 96. tunnilla, sitten joka 24. tunti tuotettujen antibioottien antibi-oottipitoisuuden ja komponenttisuhteen määrittämiseksi.

Yllä olevalla menetelmällä valmistettuja, suuren antibioo-tintuotantokyvyn omaavia mutantteja kasvatetaan ilmastetuissa syväkulttuureissa orgaanisia hiili- ja typpilähteitä, epäorgaanisia suoloja, kasvi- ja/tai eläinöljyjä ja/tai rasvoja sisältävässä elatusaineessa 32 - 40eC:ssa, tarkoituksenmukaisesti 37eC:ssa niin kauan, kunnes muodostuu antibiootin sopiva määrä.

Rekombinantit voidaan valmistaa Streptomyces tenebrarius MNG 169 ja MNG 204-kannasta, jotka on talletettu kantapankkiin Stammbank des Landesinstitutes för Gesundheitswesen, Budapest. Streptomyces tenebrarius 169 voi biosyntetisoida nebramysiini-2:a, nebramysiini-4:ä ja nebramysiini-5':ä, Streptomyces tenebrarius MNG 204 sitä vastoin nebramysiini-5':ä nebraysiini:4:n pienten määrien lisäksi. Näistä kannoista muodostetaan käsittelemällä tavanomaisesti mutageeni-sesti N-metyyli-N'-nitro-N-nitrosoguanidiinilla auksotrofi-sia mutantteja ja niiden geneettinen stabiilisuus tarkastetaan useilla toistoilla ja niiden antibiootin tuotantokyky joukkotutkimuksissa. Valitaan geneettisesti stabiilit kannat ja niistä muodostetaan protoplasteja esimerkeissä määritetyn menetelmän mukaisesti. Protoplastit yhdistetään valittujen fuusiopartnereiden kanssa ja regeneroidaan tämän jälkeen. Sekä protoplastimuodostus että regeneraatio tapahtuvat kvantitatiivisesti, mikäli kasvatus, protoplastimuodostus ja regeneraatio suoritetaan sakkaroosin ja sellaisten suolojen läsnäollessa, jotka dissioituvat kalsium- ja magnesiumio-neiksi. Regeneroidut hybridit eristetään ja kasvatetaan viistoaagarissa. Prototrofimuodostuksen tiheys auksotrofi-sista kannoista, joka on spontaanissa mutaatiossa vain 10“®, li 7 79551 tuottaa keksinnön mukaisella fuusiomenetelmällä arvoiksi lxlO~3 - 5xl0~4.

Eristettyjen prototrofisten rekombinanttien tuotantokykyä analysoiden todettiin, että yksittäiset antibiootit, jotka olivat emäkannasta tuotetun antibioottikompleksin komponentteja, biosyntetisoidaan myös jokaisesta rekombinantista, mutta muuttuneessa komponenttisuhteessa ja muuttuneessa tuo-tantokonsentraatiossa. Emäkannat tuottavat kaksi (MNG 204) tai vastaavasti kolme (MNG 169) nebramysiini-komponenttia, MNG 204- tai vastaavasti MNG 169-protoplastien autodiffuusi-ossa ja MNG 204- ja MNG 169-protoplastien fuusiossa muodostuu sitä vastoin geneettisiä rekombinantteja, jotka verrattuna emäkantaan a. eivät biosyntetisoi antibioottia tai biosyntetisoivat vain hyvin alhaisia tai hyvin korkeita antibioottikon-sentraatioita, tai b. ne biosyntetisoivat yhden ainoan nebramysiini- komponentin: nebramysiini-2:n, nebramysiini-4:n tai nebramysiini-5':n; c. kaksi nebramysiini-komponenttia: nebramysiini-2:n ja nebramysiini-4:n tai nebramysiini-2:n ja nebramysii-ni-5:n, tai d. kolme nebramysiini-komponenttia: nebramysiini-2:n, nebramysiini-4:n ja nebramysiini-5':n.

Talteenotetuista kannoista talletettiin nebramysiini-2:a tuottava Streptomyces tenebrarius 35 TL-kanta numerolla MNG 00243, nebramysiini-4:ä tuottava Streptomyces tenebrarius F104 numerolla MNG 00244 ja nebramysiini-51:ä tuottava Streptomyces tenebrarius F77 numerolla 00242 kantapankkiin Stammbank des Landeninstitutes ftlr Gesundheitswesen, Budapest (National Collection of Microorganismus of the National Institute for Public Health).

Keksinnön mukaiset kannat voivat tuottaa nebramysiini-komponentteja sisältäviä fermentaatioliemiä. Itse fermen- 8 79551 tointi voidaan suorittaa mieluummin HU-patentin 176 103 mukaisella menetelmällä, kun taas antibiootit voidaan eristää mieluummin HU-patenttien 174 315 ja 176 103 mukaisilla menetelmillä.

Keksinnön mukaisen menetelmän erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti voidaan rekombinanttien muodostukseen käyttää Streptomyces kanamyceticus-kantaa. Mikro-organismien kasvatus, protoplastimuodostus, protoplastifuusio ja regeneroin-ti, edelleen valittujen kantojen tuotantokykyisyyden joukko-tarkastus voidaan suorittaa yllä olevan menetelmän tai esimerkeissä 3 ja 8 määritetyn menetelmän mukaisesti.

Keksinnön mukaisella menetelmällä on paljon etuja. Menetelmässä esitetyt rekombinaatoit ja diploidisaatiot vaikuttavat kantojen biosynteesiin joko muuttamalla komponent-tisuhteita tai parantamalla antibiootin tuotantokykyä.

Keksintöä selitetään lähemmin seuraavien esimerkkien avulla rajoittamatta suojan laajuutta näihin esimerkkeihin.

Esimerkki 1

Protoplastimuodostus, protoplastifuusio ja \ regenerointi

Vinot agarit tartutetaan Streptomyces tenebrarius MNG 169-:· ja Streptomyces tenebrarius MNG 204-kantojen tai niistä muo- dostettujen auksotrofisten kantojen itiösuspensiolla tai syväjäähdytetyllä viljelmällä, vinoagarilla on seuraava koostumus:

Dekstriiniä 1,0% : Hiivauutetta 0,1%

Kaseiinihydrolysaattia (10%:sta)+ 2,0%

Lihauutetta 0,1%

Kobolttidikloridiheksahydraattia 0,001%

Agaria 2,5% : +Entsymaattisesti hydrolysoitu

II

9 79551

Ennen sterilointia säädetään elatuspohjan pH-arvo vesipitoisella natriumhydroksidi-liuoksella arvoon 7,2, tämän jälkeen se steriloidaan 121eC:ssa 20 minuuttia.

Vinoviljelmiä inkuboidaan 4 päivää 37°C:ssa, sitten itiöt pestään agarin pinnalta steriilillä, tislatulla vedellä. Saadulla itiösuspensiolla tartutetaan seuraavan koostumuksen omaava steriili siirrostuselatusaine:

Glukoosia 1,0%

Hiivauutetta 1,0% Väliaineen pH säädetään arvoon 7,2.

Viljelmiä inkuboidaan 48 tuntia 37°C:ssa, sitten 0,2 ml:n annokset tätä siirrostetta tartutetaan seuraavan koostumuksen omaavassa steriilissä elatusaineessa:

Glukoosia 1,0%

Hiivauutetta 1,0%

Sakkaroosia 20,5%

Kalsiumdiklorididihydraattia 0,3%

Magnesiumdikloridiheksa-hydraattia 0,6%

Glysiiniä 4, 5 tai 6% Väliaineiden pH säädetään arvoon 7,0 - 7,2.

Viljelmiä inkuboidaan tärykoneessa 48 tuntia 37°C:ssa, sitten valitaan ne viljelmät, joissa glysiinin kasvua estävä vaikutus on suurin, mutta ei kuitenkaan vielä täydellinen. Näillä viljelmillä tartutetaan yllä olevat, kasvaneen gly-siinipitoisuuden omaavat elatusaineet. Mikäli alunperin valittu viljelmä sisälsi 4% glysiiniä, niin tällä tartutetaan elatusaineet, jotka sisältävät 5 tai vastaavasti 6% glysiiniä.

Sitten muodostunut huovasto sentrifugoidaan (15 minuuttia 2300 g) ja pestään seuraavan koostumuksen omaavalla liuoksella: 10 79551

Sakkaroosi 20,5%

Kalsiumdiklorididihydraattia 0,3%

Magnesiumdikloridiheksa-hydraattia 0,6%

Kalsiumkloridia 0,0075%

liuoksen pH: 7,2, nimitys: M

Huovastomassa suspendoidaan sentrifugoinnin jälkeen uudestaan yllä olevaan liuokseen ja siihen lisätään 0,5%:sta lysotsyymiä (Serva, Feinbiochemica, Heidelberg). Huovastoa inkuboidaan ravistamalla hieman, ja protoplastimuodostus tarkastetaan joka 10. minuutti mikroskooppisesti. Kannan la-j in mukaan kestää kvantitatiivinen protoplastimuodostus huo-vastollisessa Streptomyces-viljelmässä noin 1-4 tuntia.

Viljelmä, joka on muunnettu kvantitatiivisesti protoplas-teiksi, sentrifugoidaan (25 minuuttia, 2300 g), pestään liuoksella M ja sentrifugoidaan uudelleen.

Pohjasakka suspendoidaan varovasti 0,05 ml:aan liuosta M, sitten protoplastit regeneroidaan.

Mahdollisesti jäljelle jääneiden huovasto-osien poistamiseksi protoplastisuspensio suodatetaan 2,5 cm paksun vanuker-roksen läpi. Suodos laimennetaan liuoksella M ja kerrostetaan seuraavan koostumuksen omaavalle steriilille regene-: rointiagarille:

Glukoosia 1,0%

Hiivauutetta 1,0%

Sakkaroosia 20,5%

Kalsiumdiklorididihydraattia 0,3%

Magnesiumdikloridiheksa-hydraattia 0,6%

Agaria 3,0% liuoksen pH-arvo 7,0 - 7,2 0,1 ml protoplastisuspensiota kerrostetaan 25 ml:n regene-rointiaagarin pinnalle Petri-maljassa, sitten se peitetään 3 li 11 79551 ml:11a regenerointiagarla. Agarilla, jota käytetään peittämiseen, on yllä esitetty koostumus, mutta kuitenkin käytetään 1,2% agaria 3%:n sijasta.

Viljelmiä inkuboidaan kosteassa kammiossa 35 - 37eC:ssa. Kolmantena tai neljäntenä päivänä voidaan havaita jo vapaasti regeneroituneet kasvupesäkkeet. Suhteessa protoplastimää-rään, joka levitettiin regenerointilevylle, voidaan regene-raatiota pitää kvantitatiivisena.

Molemmista auksotrofisista kannoista talteenotetut proto-plastit fuusioidaan. Mikäli on eristettävä hybrideistä vain prototrofiset rekombinantit, niin ne levitetään seuraavan koostumuksen omaavalle vähimmäiselatuspohjalle:

Diammoniumsulfaattia 0,5%

Kaliumdivetyfosfaattia 0,1%

Magnesiumsulfaattihepta- hydraattia 0,05%

Glukoosia 1,0%

Kalsiumklorididihydraattia 0,3%

Magnesiumkloridiheksa-hydraattia 0,6% : Sakkaroosia 20,5% : Wickerham®-vitamiiniliuosta 0,01%

Agaria 3,0% väliaineen pH 7,2.

Wickerham®-vitamiiniliuoksen koostumus:

Foolihappoa 0,2 mg

Biotiiniä 0,2 mg

Kalsiumpantotenaattia 40,0 mg

Inosiittiä 200,0 mg

Niasiiniä 40,0 mg p-amino-bentsoehappoa 20,0 mg

Pyridoksiinihydrokloridia 40,0 mg

Aneuriinihydrokloridia 40,0 mg 12 79551

Riboflaviinia 20,0 mg

Tislattua vettä 100,0 ml

Prototrofit voidaan eristää myös siten, että kasvupesäk-keet, jotka olivat kasvaneet täydellisen regenerointielatus-pohjan päällä, replikoidaan yllä olevan tai toisen koostumuksen omaavalla minimaalisella ravintopohjalla.

Keksinnön mukaisen menetelmän erään edullisen suoritusmuodon mukaisesti protoplastit fuusioidaan yllä esitetyn menetelmän mukaisesti siten, että protoplastit, jotka on muodostettu kahdesta tai useammasta kannasta, sekoitetaan mielivaltaisessa suhteessa, sopivimmin suhteessa 1:1, ja 0,2 ml:aan tätä protoplastiseosta lisätään 2 ml seuraavan koostumuksen omaavaa fuusiointiliuosta:

Polyeteeniglykolia, molekyylipaino 4000 35,0%

Kalsiumdiklorididihydraattia 0,3%

Magnesiumdikloridiheksahydraattia 0,6%

Liuoksen pH säädetään vesipitoisella natriumhydroksidiliuok-sella arvoon 7,2.

Sekoitus fuusiointiliuoksen kanssa indusoi protoplastien .* aggregaation, niiden membraanit sulavat, fuusio tapahtuu.

Kahden tai useamman solun DNA:t jotka ovat geneettisen in-formaation kantajia, tulevat lähemmäksi toisiaan ja niin voi : tapahtua geneettinen rekombinaatio.

Taulukossa l verrataan keksinnön mukaista menetelmää belgialaisten patenttien 868 472 ja 868 473 mukaisten menetelmien kanssa protoplastimuodostuksen ja regeneraatiotiheyden suhteen.

13 79551

Taulukko 1

Streptomyces tenebrarlus-protoplastlen muodostus -ja reqenerolntl tunnetun keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti

Menetelmä Protoplasti- Regeneraatlo- Intakteista muodostus kasvupesäke- soluista muodos- (90 min.) määrä % tuvat kasvupesäk- keet

Kasvupesäkemäärä %

Tunnettu 92,5 13 0,065 1500 7,5

Keksinnön 99,81 18000 90,0 38 0,19 mukainen menetelmä

Taulukosta nähdään selvästi, että keksinnön mukaisella menetelmällä, esikasvatuksen avulla kalsiumkloridin, magne-siumkloridin ja sakkaroosin läsnäollessa voidaan olennaisesti parantaa protoplastimuodostuksen tehokkuutta, vielä paremmin kuitenkin regeneroinnin tehokkuutta.

Seuraavissa esimerkeissä selitetään muutamia in vivo-geneet-tisiä rekombinaatiokokeita ja niiden tuloksia.

14 79551

Esimerkki 2

Auksotrofisien kantojen fuusio ja rekombinoitujen kantojen antibiootti-biosynteesi a. A222_his2-_ja 404 ura--auksotrofisten kantojen_fuusio

Nebramysiini-4:n pienten määrien lisäksi nebramysiini-5':ä biosyntetisoivasta Streptomyces tenebrarius MNG 204-kannasta ja nebramysiini-2a, nebramysiini-4:ä ja nebramysiini-5ä tuottavasta Streptomyces tenebrarius MNG 169-kannasta valmistetaan tunnetun, tavanomaisen mutageenisen käsittelyn avulla histidiiniriippuvaisia A222 his-- ja urasiiliriippu-vaisia 404 ura--kantoja.

Molemmista kannoista muodostetaan esimerkin 1 menetelmän mukaisesti protoplasteja, protoplastit fuusioidaan ja regeneroidaan. Osa prototrofisistä rekombinanteista eristetään. Rekombinaatiotiheys: 5xl0-5.

Eristettyjen prototrofisten kantojen antibiootintuotantoky-ky määritetään esimerkin 8 menetelmän mukaisesti. Taulukossa 2 esitetään 147 eristetyn rekombinantin fermentoinnin tulok-set.

li

Taulukko 2 is 79551

Protroflen antibloottltuotanto , jotka on saatu auk-sotroflen A222 hls~ ja 404 ura~ In vlvo DNA-rekombi-naatlon avulla

Tuotantokyky Kantojen % lukumäärä

Ei antibioottituotantoa 16 10,9

Nebramysiini-5' 24 16,3

Nebramysiini-4 11 7,5

Nebramysiini-4 ja -5' 57 38,8

Nebramysiini-2 ja -5' 7 4,7

Nebramysiini-2, -4 ja -5' 32 21,8

Puusiopartnerien tuotantokyky: A222 his-: nebramysiini-2 0 g/ml nebramysiini-4 30 g/ml : nebramysiini-5' 675 g/ml 404 ura~: nebramysiini-2 1120 g/ml : nebramysiini-4 75 g/ml 1' nebramysiini-5' 145 g/ml

Samanaikaisesti ylittää rekombinanttien osan tuotantokyky olennaisesti fuusiopartnereiden tuotantokyvyn. Näin biosyn-tetisoi esimerkiksi Streptomyces tenebrarius F 105 2140 g/ml nebramysiini-2:a, 380 g/ml nebramysiini-4:ä ja 1510 g/ml nebramysiini-5':ä, Streptomyces tenebrarius F 88 ’ 0 g/ml nebramysiini-2:a, 140 g/ml nebramysiini-4:ä ja 1440 g/ml nebramysiini-5':ä, Streptomyces tenebrarius F 77 840 g/ml nebramysiini-5':ä ja Streptomyces tenebrarius F 104 nebramysiini-5':n pienten määrien (alle 1%) lisäksi : 1520 g/ml nebramysiini-4:ä.

ie 79551

Niiden kantojen tuotantokyky, jotka eristettiin emäkannoista valmistettujen protoplastien autofuusion jälkeen, pysyi muuttumattomana.

Kannalla Streptomyces tenebrarius F 104 valmistetaan esimerkin 8 menetelmän mukaisesti 10 litraa fermenttilientä ja eristetään biologisesti aktiiviset yhdisteet HU-patentin 174 315 mukaisesti: Saanto: 13,8 g nebramysiini-5:ä (kana-mysiini-B) ja 9 mg nebramysiini-6:a (tobramysiini).

Streptomyces tenebrarius F 77 ja F 104 on talletettu numeroilla MNG 00242 ja MNG 00244 kantapankkiin Stammbank des Landensinstitutes fiir Gesundheitswesen, Budapest.

b. Auksotrof isten_kantoj_en 7_ - ,34_trp~ j_a_7^ lys~ fuusio_

Tryptofaaniriippuvaista Streptomyces tenebrarius 7-34 trp~-kannasta ja lysiiniriippuvaisesta Streptomyces tenebrarius 73 lys“-kannasta, jotka oli saatu tavanomaisella mutageeni-sellä käsittelyllä Streptomyces tenebrarius MNG 169-kannas-ta, muodostetaan esimerkin 1 menetelmän mukaisesti proto-plasteja ja tämän jälkeen protoplastit fuusioidaan ja regeneroidaan. Osa prototrofeista eristetään, ja niiden tuotantokyky tarkastetaan esimerkin 8 menetelmän mukaisesti. Re-kombinaatiotiheys: 1X10“5.

17 79551

Taulukko 3

Protroflen antlbloottltuotanto, jotka on saatu aukso-trofelsta 7-34 trp“ ja 73 lys~ In vlvo DNA-rekombi-naatlolla

Tuotantokyky Kantojen % lukumäärä

Ei antibioottituotantoa 1 2,9

Nebramysiini-2 2 5,9

Nebramysiini-2 ja -5' 16 47,3

Nebramysiini-2, -4 ja -5' 15 43,9

Itse fuusiopartnerit biosyntetisoivat kaikkia kolmea nebra-mysiini-komponenttia.

Fuusion ja regeneraation jälkeen huomattiin, että on olemassa muutamia kantoja, jotka eivät voineet kasvaa vähimmäis-elatusaineessa lysiinin tai tryptofaanin läsnäollessa, mutta . . jotka kasvoivat nopeasti kun sekä tryptofaania että lysiiniä oli läsnä samanaikaisesti. Alunperin auksotrofiset kannat muuttuivat rekombinaation avulla kaksoisauksotrofeiksi (trp~lys~). 13 kaksoisauksotrofin tuotantokyky tarkastettiin esimerkin 8 menetelmän mukaisesti ja tulokset koottiin taulukkoon 4. Jakautumisen jälkeen kaksoisauksotrofeista eristettiin kaksi prototrofia, ja niiden tuotantokyky on samoin esitetty.

Taulukko 4 ie 79551

Kaksolsauksotroflen trp~lys~ ja niistä eristettyjen seqreqanttien antibioottituotanto

Kanta Biosyntetisoidut % nebramysiini-komponentit

Streptomyces nebramysiini-2 23,1 tenebrarius nebramysiini-2 ja -4 7,7 trp“lys“ nebramysiini-2 ja -5' 30,7 nebramysiini-2, -4 ja -5' 38,5

Streptomyces nebramysiini-4 ja -5' 100,0 tenebrarius

35 W ja 40 W

Taulukko osoittaa selvästi, että niiden kantojen tuotantokyky, jotka on eristetty in vivo-geneettisen rekombinaation avulla, on olennaisesti muuttunut. On erittäin merkittävää, että kaksoisauksotrofeista eristetyt prototrofit olivat menettäneet kykynsä biosyntetisoida apramysiiniä, mutta samanaikaisesti niiden antibiootin tuotantokyky muuttui olennaisesti suuremmaksi verrattuna emäkantoihin. Näin kannat 7-34 trp~ ja 73 lys- tuottavat 1300 - 1700 g/ml nebra-mysiini-2:a, 200 g/ml nebramysiini-4:ä ja 1040 g/ml nebramysiini-5ä, kun taas rekombinantit 35 W ja 40 W bio-syntetisoivat 1040 g/ml nebramysiini-4:ä ja 1950 g/ml nebramysiini-5':ä.

Yksinomaan nebramysiini-2:a tuottava Streptomyces tenebrarius 35 TL-kanta talletettiin numerolla NMG 00243 kantapank-kiin Stammbank des Landesinstitutes fiir Gesundheitswesen, Budapest.

li is 79551 c. Auksotrofien_JlOO6-3ade-_j a J2^1/2ura~_fuusio

Streptomyces tenebrarius J1006-3ade" ja J211/2ura~ saatiin mutageenisellä käsittelyllä Streptomyces tenebrarius MNG 204-kannasta. Nämä kannat eivät biosyntetisoineet yhtään antibioottia tai ne biosyntetisoivat vain nebramysiini-5':n pieniä määriä (alle 5 g/ml). Niiden esimerkin 1 menetelmän mukaisesti suoritetun fuusion jälkeen tarkastettiin 150 pro-totrofisen rekombinantin tuotantokyky esimerkissä 8 esitetyn menetelmän mukaisesti. Rekombinaatiotiheys: lxlO-4.

60% (90) tutkituista kannoista eivät edelleen myöskään biosyntetisoineet yhtään antibioottia, 40% (60) tuottivat sitä vastoin joko nebramysiini-4:ä ja nebramysiini-51:ä tai yksinomaan vain nebramysiini-5':ä. 13% tuotantokykyisistä kannoista (8) biosyntetisoivat nebramysiini-5':ä yli 1500 g/ml:n määrinä.

Nämä tulokset osoittavat selvästi, että Streptomyces-kantojen antibiootintuotantokykyä voidaan lisätä huomattavasti keksinnön mukaisella menetelmällä.

Esimerkki 3

Auksotroflsten kantojen Streptomyces kanamyce-ticus leu~ ja arg~ fuusio Käytetään esimerkissä 1 esitettyä menetelmää sillä erotuksella, että geneettisesti merkittyjen kantojen kasvatusta jatketaan 28°C:ssa niin kauan, kunnes voidaan havaita 3% glysiiniä sisältävässä elatuspohjassa heikko kasvu. Aukso-trofiset kannat eristetään Streptomyces kanamyceticus ATCC 12,853-kannan mutageenisen käsittelyn jälkeen (Umezawa ja avustajat, J. Antibiotics, 10A, 181 - 188 (1957) ja Jpn. Kokai 8695/1961). Emäkanta tuottaa kanamysiiniä. Leusiini-· riippuvaiset mutantit eivät biosyntetisoi yhtään antibioot tia, vähimmäiselatusaineessa arginiinin läsnäollessa kasvava mutantti tuottaa sitä vastoin 15 g/ml kanamysiiniä.

20 79551

Streptomyces kanamyceticus-kannan antibiootintuotantokyky tarkastetaan esimerkissä 8 esitetyllä menetelmällä sillä erotuksella, että kasvatus suoritetaan 37eC:n sijasta 28eC:ssa, ja biologiseen aktiivisuustarkastukseen käytetään Bacillus subtilistä testiorganismina.

Fuusion ja fuusioituneiden protoplastien regeneraation jälkeen prototrofit eristetään ja 144 kannan tuotantokyky tarkastetaan. 12 kantaa voi biosyntetisoida kymmenen kertaa enemmän (keskimäärin 155 g/ml kanamysiiniä), kuin arginii-niriippuvaiset, auksotrofiset mutantit.

Rekombinaatiotiheys: x-8xl0-4.

Esimerkki 4

Intaktien, mutta elinkelvottomien protoplastien valmistus ja niiden käyttö fuusiopartnereina

Streptomyces tenebrarius MNG 169-kannasta ja sen 404 ura--auksotrofeista muodostetaan esimerkin 1 menetelmän mukaisesti protoplasteja. Prototrofisen Streptomyces tenebrarius MNG 169-kannan inaktivoimiseksi niistä muodostettuun proto-plastisuspensioon (1O8 protoplastia/ml liuosta M) lisätään 50 - 10 g/ml kannabidioli-trietyyliamiinisuolaa dimetyyli-: sulfoksidin liuoksessa 30°C:ssa. Nelituntisen käsittelyn jälkeen protoplastit sentrifugoidaan (2300 g, 25 minuuttia), ·: sitten ne pestään ylimääräisen inaktivointiaineen poistami- seksi liuoksella M ja sentrifugoidaan toistamiseen. Kemiallisesti inaktivoitujen ja Streptomyces tenebrarius MNG 169-prototrofeista muodostettujen protoplastien ja 404 ura“-auksotrofeista muodostettujen protoplastien fuusio suoritetaan esimerkin 1 menetelmän mukaisesti. Fuusiotulok-set on esitetty taulukossa 5.

Il

Taulukko 5 21 79551

Kanta Regenerointilevy Minimaalinen Rekombinaa- (kasvupesäke/ml) ravintoväli- tiotiheys ennen KANABIODIO- aine LIHAPPO käsitte- (Kasvupesäke-lyä ja sen jälkeen määrä/ml) MNG 169 2xl04 0 2,lxl04 404 ura" 1,5xl04 0 MNG 169x404 - 30 2xl03

Esimerkki 5

Intaktlen, mutta elinkelvottomien protoplastien valmistus ja niiden käyttö fuusiopartnerelna

Suoritetaan esimerkissä 4 esitetty menetelmä sillä erotuksella, että kannabidioli-trietyyliamiini-suolan sijasta käy-. tetään kemiallisena inaktivointiaineena 80 - 240 g/ml pyrrolinitriiniä tai 100 - 300 g/ml briljanttivihreää. Kokeissa protoplastien inaktivointi tapahtui kvantitatiivisesti. Saadut elinkelvottomat protoplastit käytettiin fuusio-partnereina.

Esimerkki 6

Intaktien, mutta elinkelvottomien protoplastien valmistus ja niiden käyttö fuusioon osallistujina

Protoplastit valmistetaan esimerkin 3 menetelmän mukaisesti sillä erotuksella, että emäkantana käytettiin merkitsemättömiä Streptomyces kanamyceticus ATCC 12,853-kantoja. Saadut Streptomyces kanamyceticus-protoplastit inaktivoidaan esimerkissä 4 esitetyn menetelmän mukaisesti sillä erotuksella, että kannabidiolihapon sijasta käytetään kemiallisena inak- 22 79551 tivointiaineena 400 ja 800 g/ml N-etyylimaleimidiä (EM). Tulokset on esitetty taulukossa 6.

Taulukko 6

Kanta Regenerointilevy Käsittely (kasvupesäke/ml) 800 g/ml:11a Käsitte- Käsitelty EM:ä lemät- 400 g/ml:11a tömät EM:ä

Streptomyces 3,2xl08 4,2xl05 0

Kanamyceticus ATCC 12853 800 g/ml:llä N-etyylimaleimidiä käsitellyt ja inaktivoidut protoplastit käytetään fuusiopartnereina.

Esimerkki 7 • *

Elinkelvottomien protoplastien valmistus fysikaalisen : inaktivoinnin avulla

Esimerkin 1 mukaisesti valmistettu Streptomyces kanamyceti-cus-protoplastisuspensio (108 solua/ml) alistetaan muoviputkessa gammasäteilyyn (60CO). 80 krad:n annoksella inaktivoidut solut käytetään fuusiopartnereina.

Esimerkki 8

Nebramysiini-komponentteja blosyntetisoivlen kantojen antibiootintuotantokyvyn tarkastus ja antibiootti-' fermenttiliemlen valmistus

Vinoagarit, jotka tehtiin tislatulla vedellä, tartutetaan tarkastettavan kannan itiöillä tai vegetatiivisella viljelmällä. Vinoagarin koostumus:

II

23 79551 dekstriiniä 1,0 % hiivauutetta 0,1 % kaseiinihydroly- saattia (10 %:sta)+ 2,0 % llhauutetta 0,1 % kobolttidikloridiheksahydraattia 0,001 % agaria 2,5 % "•"entsymaattisesti hydrolysoitu

Ravintoväliaineen pH säädetään ennen sterilointia vesipitoisella natriumhydroksidi-liuoksella arvoon 7,2, sitten se steriloidaan 20 minuuttia 121°C:ssa.

Viljelmiä inkuboidaan 4 päivää 37eC:ssa, sitten erotetaan itiöt elatuspohjan pinnalta steriilillä, tislatulla vedellä, ja tällä itiösuspensiolla tartutetaan kaksi 100 ml:n vesijohtovedellä tehtyä siirroste-elatusainetta, jotka oli steriloitu 500 ml:n erlemeyerpullossa. Väliaineen koostumus: soijajauhoa 2,0 % kaseiinihydroly- saattia (10 %:sta)+ 3,0 % " ammoniumnitraattia 0,1 % .: : ammoniumkloridia 0,3 % kalsiumkarbonaattia 0,3 % :·· magnesiumsulfaatti- ··· heptahydraattia 0,5 % ·.*. palmuöljyn ja pellava- öljyn l:l-seosta 3,0 % glukoosia (erotettu, 50%:sena liuoksena steriloitu) 2,0 % "•"entsymaattisesti hydrolysoitu.

Elatusaineen pH säädetään vesipitoisella natriumhydroksidi-liuoksella arvoon 7,2, sitten se steriloidaan 121eC:ssa 20 minuuttia autoklaavissa.

24 79551

Tartutettuja viljelmiä inkuboidaan vaakasuoralla tärypöydäl-lä (läpimitta 2,4 cm, 280 min.-1) 37°C:ssa.

Tämä kypsä siirroste tartutetaan joko 100 ml:ssa 500 ml:n erlemeyerpullossa steriloitua ravintoväliainetta tai 5 litrassa 10 litran laboratoriofermentaattorissa 45 minuuttia 121eC:ssa steriloituun väliaineeseen. Tämän vesijohtovedellä tehdyn pääfermentointiväliaineen koostumus on: soijajauhoa 3,0 % kaseiinihydrolysaattia (10%:sta)+ 5,0 % ammoniumnitraattia 0,1 % ammoniumkloridia 0,5 % L-glutamiinihappoa 0,8 % kalsiumkarbonaattia 0,5 % magnesiumsulfaatti- heptahydraattia 0,5 % kobolttidinitraatti- heksahydraattia 0,001 % palmuöljyn ja pellava- öljyn l:l-seosta 3,0 % glukoosia (erotettuna, *: 50%:sessa liuoksessa steriloitu) 4,2 % ♦entsymaattisesti hydrolysoitu.

Elatusväliaineen pH säädetään ennen sterilointia vesipitoi-:· sella ammoniumhydroksidi-liuoksella arvoon 7,2.

Fermentointi suoritetaan 37°C:ssa. Solut kasvatetaan erlen-meyerpullossa vaakasuorassa tärykoneessa. Fermentaattorise-koittimen kierrosluku säädetään arvoon 360 min.-1 ja 3 lit-raa/min. steriiliä ilmaa johdetaan ravintoväliaineen läpi.

. Viljelmien antibioottipitoisuus määritetään tunnetulla • menetelmällä biologisesti tai ohutkerroskromatografian mukaan bioautografiällä. Biologisen määrityksen testiorganis- • minä käytetään Staphylococcus epidermistä, nebramysiini-51:n . erityistä määritystä varten muiden nebramysiini-komponentti- 25 79551 en lisäksi käytetään nebramysiini-2- ja nebramysiini-4-re-sistenttiä Rhizobium melilotia.

Määritettäessä komponenttikoostumus ohutkerroskromatografi-alla 0,1 - 0,5 g/ml:n antibioottimääriä tiputetaan silika-geeli-(Merck, Darmstadt)ohutkerroslevyjen päälle ja levy kehitetään etyylialkoholin, metyylietyyliketonin ja 25%:sen ammoniumhydroksidin l:l:l-seoksella. Geelin täydellisen kuivumisen jälkeen kerrostetaan levypinnalle Bacillus subtilis ATCC 6633-bakteeria sisältävää elatusainetta, sitten levyä inkuboidaan 16 tuntia 37°C:ssa. Tämän jälkeen määritetään estoalueiden koko verrattuna vakioon. Tämä menetelmä soveltuu sekä kvalitatiiviseen että kvantitatiiviseen määritykseen.

Claims (4)

26 79551

1. Menetelmä aminoglykosidi-antibiootteja sisältävien fer-mentaatioliemien valmistamiseksi sellaisista Streptomyces tenebrarius tai Streptomyces kanamyceticus -kannoista, joiden antibiootti-tuotantokyky on modifioitu in vivo-geneet-tisen rekombinaation avulla, tunnettu siitä, että - valmistetaan sakkaroosia, kalsium- ja magnesiumioneja sisältävä kasvatusalusta, - kasvatetaan kasvatusalustassa geneettisesti merkittyjä, aminoglykosidi-antibiootteja tuottavia Streptomyces tenebrarius- tai Streptomyces kanamyceticus-kantoja, - kasvatetaan erikseen prototrofisiä tai ei-merkittyjä, aminoglykosidi-antibiootteja tuottavia Streptomyces-tenebrarius- tai Streptomyces kanamyceticus-kantoja, - muodostetaan kasvatettujen geneettisesti merkittyjen Streptomyces-kantojen sekä kasvatettujen prototrofis-ten tai ei-merkittyjen Streptomyces-kantojen protoplas-tit, - inaktivoidaan kemiallisesti tai fysikaalisesti prototrofiset tai ei-merkityt Streptomyces-kantojen protoplastit niiden tekemiseksi elinkyvyttömiksi, : - fuusioidaan geneettisesti merkittyjen Streptomyces- kantojen protoplastit ja prototrofisten tai ei-merkit-·: tyjen Streptomyces-kantojen inaktivoidut protoplastit, -- - regeneroidaan fuusioidut protoplastit, - tarkastetaan saatavien kantojen antibiootti-tuotantokyky, - valitaan parantuneen tuotantokyvyn omaavat kannat, ja - suoritetaan näillä uusilla kannoilla ilmastettuja fermentointeja submerssiviljelmissä orgaanisia hiili-ja typpilähteitä, epäorgaanisia suoloja, hivenaineita ja/tai eläin- tai kasviöljyjä ja/tai rasvoja sisältävässä kasvatusalustassa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että protoplastimuodostus ja protoplastifuusio suoritetaan 0,1 - 0,5 % kalsiumsuolaa, 0,3 - 0,8 % magnesiumsuolaa ja 12 - 34 % sakkaroosia sisältävässä kasvatusalustassa. li 27 79551

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kemialliseen inaktivointiin käytetään kannabidiolihappoa tai sen suoloja, N-etyylimale-imidiä, pyrrolinitriiniä, briljanttivihreää tai 2-merkapto-etanolia.

4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, t u n n e t tu siitä, että fysikaaliseen inaktivointiin käytetään gamma-säteilyä. 28 7 9 5 51