Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

FI113009B - Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan sekä Neisseria meningitidis -kanta - Google Patents

Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan sekä Neisseria meningitidis -kanta Download PDF

Info

Publication number
FI113009B
FI113009B FI912965A FI912965A FI113009B FI 113009 B FI113009 B FI 113009B FI 912965 A FI912965 A FI 912965A FI 912965 A FI912965 A FI 912965A FI 113009 B FI113009 B FI 113009B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
class
outer membrane
protein
membrane protein
purified
Prior art date
Application number
FI912965A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI912965A0 (fi
Inventor
Peter Hoogerhout
Peter R Paradiso
Jan T Poolman
Emmanuel J H J Wiertz
John Edward Heckels
Ian Nicholas Clarke
Jr Robert C Seid
Der Ley Peter Van
Original Assignee
American Cyanamid Co
Nederlanden Staat
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27352237&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI113009(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from NL8803111A external-priority patent/NL8803111A/nl
Application filed by American Cyanamid Co, Nederlanden Staat filed Critical American Cyanamid Co
Publication of FI912965A0 publication Critical patent/FI912965A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI113009B publication Critical patent/FI113009B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K14/255—Salmonella (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1217—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Neisseriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6037—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxoid [DT], tetanus toxoid [TT]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

113009
Menetelmiä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningiti-dis-bakteeria vastaan sekä Neisseria meningitidis -kanta
Kuvaus 5 Keksinnön tausta
Keksintö koskee menetelmää ulkomembraanivesikkeli-rokotteen valmistamiseksi Neisseria meninqitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää vähintään yhtä luokan 1 ulko-membraaniproteiinia tai sen immunogeenista osaa eikä sisäl-10 lä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, menetelmää rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää ainakin yhtä puhdistettua luokan 1 ulkomembraaniproteiinia tai sen fragmenttia eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraani-15 proteiinia, menetelmää rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää meningokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinin bakteerisidisen vasta-aineen sitovan vähintään yhden epitoopin eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, menetelmää 20 rokotteen valmistamiseksi Neisseria meninqitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää fuusioproteiinin tai -pep-j tidin, joka sisältää meningokokin luokan 1 ulkomembraani- : proteiinin epitoopin, joka on fuusioitu kantajaproteiiniin tai -peptiin, eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomem- .·. : 25 braaniproteiinia, menetelmiä rokotteen valmistamiseksi • ·
Neisseria meninqitidis-bakteeria vastaan, joka rokote si-,,, sältää ainakin yhtä luokan 1 ulkomembraaniproteiinia tai I I « * sen immunogeenista osaa eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, menetelmää rokotteen valmista- I * · • ’’ 30 miseksi Neisseria meninqitidis-bakteeria vastaan, joka ro- 1 ' kote sisältää puhdistettua luokan 1 ulkomembraaniproteiinia ·_ | eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteii- nia, menetelmää rokotteen valmistamiseksi Neisseria meninqitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää useampaa i « : 35 kuin yhtä puhdistettua luokan 1 ulkomembraaniproteiinin alatyyppiä eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomem- 2 113009 braaniproteiinia, menetelmää rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, menetelmää rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää fuusioproteiinin, joka käsit-5 tää meningokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinin fuusioituna kantajaproteiiniin tai -peptidiin sekä Neisseria me-ningtidis-kantaa.
Bakteerimeningiitti on keskushermoston tulehdustauti, jonka aiheuttaa bakteerin kasvu pehmyt- ja lukinkalvo-10 jen sisällä ja vieressä. Meningiitti on akuutti infektiotauti, joka vaikuttaa lapsiin ja nuoriin aikuisiin ja sen aiheuttaa muun muassa Neisseria meningitidis -bakteeri muiden aiheuttajien, sisältäen muut bakteeri- ja viruspatogee-nit, lisäksi.
15 Meningokokit jaetaan serologisiin alaryhmiin riip puen joko kapseli- tai soluseinäantigeenien läsnä olosta. Nykyään tunnistetut seroryhmät sisältävät ryhmät A, B, C, D, W-135, X, Y, Z ja 29E, jotka erotetaan seroagglutinaa-tiolla. Polysakkaridit, jotka ovat vastuussa ryhmien A, B, 20 C, X, W-135 ja Y seroryhmäspesifisyydestä, on puhdistettu.
Meningokokkikantajien määrä on paljon suurempi kuin : : taudin esiintymistiheys. Jotkin henkilöt ovat väliaikaisia ; kantajia, kun taas toiset ovat kroonisia kantajia vapautta- . en meningokokkia joko enemmän tai vähemmän jatkuvasti tai . : 25 satunnaisesti. Meningokokin kantajatila on immunisoiva pro sessi ja kahden viikon sisällä tartunnasta voidaan tunnis-, taa meningokokkivasta-aineiden tuotto. On ilmeistä, että bakteereja tappavia vasta-aineita suunnataan sekä kapseli-polysakkaridi- että muita soluseinän antigeenejä vastaan.
’ 30 Tutkimukset ovat osoittaneet, että meningokokin ul- ,* komembraaneissa on kolmesta viiteen pääasiallista proteiini nia, joista vallitsevat 41 000 tai 38 000 daltonin molekyy- ,lipainoiset proteiinit kantavat serotyyppispesifisiä deter-- minantteja. Ulkomembraaniproteiinien natriumdodekyylisul- I " 35 faatti-polyakryyliamidielektroforeesigeelien (SDS-PAGE) profiileissa on huomattavaa kantojen välistä heterogeniaa.
3 113009
Peptidikartoitustutkimuksilla määritettynä proteiinit sisältävät viisi luokkaa, joita merkitään 1:stä 5:een, perustuen yhteisiin peptidirakenteisiin. Bakteereita tappavia monoklonaalisia vasta-aineita on tuotettu 46 000 daltonin 5 molekyylipainoisia luokan 1 proteiineja vastaan, joita on mukana jonkin verran eri serotyyppien kannoissa. (Frasch, C.E. et ai., (1985), sivu 633, "New Developments in Meningococcal Vaccines", teoksessa The Pathogenic Neisseriae, jonka ovat toimittaneet G.K. Schoolnik et ai., American So-10 ciety for Microbiology, Washington, D.C.).
Meningokokkiryhmien A, C, W-135 ja Y kapselipolysakkaridia on käytetty organismia vastaan suunnattujen rokotteiden kehittämiseen. Vaikka nämä rokotteet ovat olleet tehokkaita lyhyellä aikavälillä, ne eivät indusoi im-15 munologista muistia ja kohteet täytyy rokottaa uudestaan noin 3 vuoden sisällä vastustuskyvyn säilyttämiseksi. Ryhmän B polysakkaridi on huonosti immunogeeninen ja onnistuneita rokotteita ei ole kehitetty. Mahdollinen selitys matalalle aktiivisuudelle voi olla toleranssi ryhmän B po-20 lysakkaridille, jonka toleranssin indusoivat ristireagoivat antigeenit, joita löytyy ihmisen kudoksista, kuten aivois-• t; ! ta. Tutkimukset osoittavat lisäksi, että suurin osa poti- ; Γ: laiden, joilla on ollut ryhmän B meningokokkitauti, toipu- misajan seerumin bakteereita tappavista vasta-aineista on : 2 5 suunnattu ulkomembraaniproteiineja vastaan.
On kehitetty rokotteita, jotka suojaavat ryhmän B meningokokkitautia vastaan, joissa rokotteissa on annettu ' ulkomembraaniproteiinien (OMP) ja ryhmän B polysakkaridin ei-kovalenttisia komplekseja. Beuvery et ai., (1983) In- ·' 30 fect. Immun. 40: 369 - 380. Kuitenkin, B polysakkaridin tiedetään indusoivan lyhytkestoisen IgM vasta-ainevasteen, • j joka ei anna immuunisuojaa. Lisäksi meningokokkien ulkomem- ,braaniproteiineissa on suurta antigeenistä erilaisuutta ja vaihtelevuutta kannasta kantaan. Lisäksi, OMP-proteiineissa : 35 on läsnä lipopolysakkarideja ja ne aiheuttavat antigeenistä * . ‘i vaihtelevuutta myöskin.
4 113009
On olemassa tarve meningokokkitauteja vastaan suunnatuista turvallisista ja tehokkaista rokotteista, jotka antavat immuniteetin infektiota vastaan erityisesti pienillä lapsilla ja vanhuksilla.
5 Keksinnön yhteenveto Tässä kuvataan eristettyjä ulkomembraanivesikkelei-tä (OMVj, Neisseria meningitidis -bakteerin oleellisesti puhdistettua luokan 1 ulkomembraaniproteiinia (OMP), luokan 1 OMP-proteiinin fragmentteja ja oligopeptidejä, jotka ovat 10 peräisin luokan 1 OMP-proteiinista, jotka oligopeptidit sisältävät jatkuvia tai epäjatkuvia, immunogeenisiä ja suo-jaavia B-soluepitooppeja, jotka reagoivat N. meningitidis -bakteeria vastaan suunnattujen bakteereita tappavien vasta-aineiden kanssa, ja eristettyjen OMV:den, meningokokin 15 luokan 1 OMP-proteiinin, sen fragmenttien tai oligopeptidi-en käyttöä N. meningitidis -bakteeria vastaan.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle ulkomembraani-vesikkelirokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää vähintään yhtä luo-20 kan 1 ulkomembraaniproteiinia tai sen immunogeenista osaa eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteii-nia on tunnusomaista se, mitä esitetään patenttivaatimuk-: : : sessa 1. Keksinnön mukaiselle menetelmälle rokotteen val- mistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka : 25 rokote sisältää ainakin yhtä puhdistettua luokan 1 ulkomem- braaniproteiinia tai sen fragmenttia eikä sisällä meningo- • » ... kokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia on tunnusomaista ’ se, mitä esitetään patenttivaatimuksessa 4. Keksinnön mu kaiselle menetelmälle rokotteen valmistamiseksi Neisseria : ·* 30 meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää menin- .* gokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinin bakteerisidisen •j vasta-aineen sitovan vähintään yhden epitoopin eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia on tunnusomaista se, mitä esitetään patenttivaatimuksessa 13. Kek-* 35 sinnön mukaiselle menetelmälle rokotteen valmistamiseksi ’. Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote si- 113009 5 sältää fuusioproteiinin tai -peptidin, joka sisältää menin-gokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinin epitoopin, joka on fuusioitu kantajaproteiiniin tai -peptiin, eikä sisällä me-ningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, on tunnus-5 omaista se, mitä esitetään patenttivaatimuksessa 22. Keksinnön mukaisille menetelmille rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää ainakin yhtä luokan 1 ulkomembraaniproteiinia tai sen immunogeenista osaa eikä sisällä meningokokin luokan 10 2/3 ulkomembraaniproteiinia on tunnusomaista se, mitä esi tetään patenttivaatimuksissa 26 ja 27. Keksinnön mukaiselle Neisseria meningtidis-kannalle on tunnusomaista se, mitä esitetään patenttivaatimuksessa 28. Keksinnön mukaiselle menetelmälle rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningiti-15 dis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää puhdistettua luokan 1 ulkomembraaniproteiinia eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia on tunnusomaista se, mitä esitetään patenttivaatimuksessa 29. Keksinnön mukaiselle menetelmälle rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningiti-20 dis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää useampaa kuin yhtä puhdistettua luokan 1 ulkomembraaniproteiinin alatyyp-·/ · piä eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraanipro- : teiinia on tunnusomaista se, mitä esitetään patenttivaati- muksessa 31. Keksinnön mukaiselle menetelmälle rokotteen : 25 valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, • · on tunnusomaista se, mitä esitetään patenttivaatimuksessa t.;. 33. Keksinnön mukaiselle menetelmälle rokotteen valmista- • » · ' miseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka ro kote sisältää fuusioproteiinin, joka käsittää meningokokin ·' *’ 3 0 luokan 1 ulkomembraaniproteiinin fuusioituna kantajaprote- ' iiniin tai -peptidiin on tunnusomaista se, mitä esitetään · patenttivaatimuksessa 38.
Eristettyjä OMV:tä, meningokokin luokan 1 OMP-pro- teiinia, siitä peräisin olevia fragmentteja tai oligopepti- “ 35 dejä voidaan käyttää univalentteina tai multivalentteina > · i · '· alayksikkörokotteina yksinään, seoksina tai kemiallisina 113009 6 konjugaatteinä tai geneettisinä fuusioina. Suositeltavissa rokotteissa käytetään epitooppeja epidemiologisesti varteenotettavista eri meningokokkikannoista. Lisäksi, eristettyjä OMV:tä, luokan 1 OMP-proteiinia, fragmentteja tai 5 oligopeptidejä voidaan käyttää yhdessä (seoksina, fuusioina tai konjugaatteina) muiden N. meningitidis -bakteerin antigeenien kanssa. Niitä voidaan esimerkiksi käyttää yhdessä N. meningitidis -bakteerin kapselipolymeerien tai oligomee-rien (tai niiden fragmenttien) kanssa tai eri alatyyppien 10 luokan 1 ulkomembraaniproteiinien (tai niiden epitooppien) kanssa. Niitä voidaan lisäksi käyttää muiden infektoivien bakteerien, virusten, sienten tai parasiittien, antigeenien kanssa. Luokan 1 OMP-proteiinin T-soluepitoopit on määritelty myös ja niitä voidaan käyttää yhdessä muiden rokote-15 komponenttien kanssa parantamaan rokotteiden suojaavaa immuunivastetta .
Tässä kuvataan myös menetelmiä eristettyjen 0MV:den, luokan 1 OMP-proteiinin, fragmenttien ja oligopep-tidien tuottamiseksi ja niitä sisältäviä eri rokoteformu-20 laatioita. Luokan 1 OMP-proteiinin eristetyt OMV:t voidaan tuottaa meningokokkien mutanttikannoilla, jotka eivät eks-: pressoi luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia. Fragmentit voi- ; ; daan tuottaa syanogenbromidikatkaisulla ja sitä seuraavalla ; puhdistuksella. Eristetyt OMV:t, luokan 1 OMP-proteiini, . . : 25 fragmentit tai oligopeptidit voidaan tuottaa yhdistelmä- DNA-menetelmillä, kemiallisella synteesillä tai kemialli-, sella tai entsymaattisella katkaisulla. Nämä materiaalit vuorostaan voidaan konjugoida tai fuusioida kantajapepti-deihin tai -proteiineihin, muihin N. meningitidis 30 -bakteerin antigeeneihin tai muiden mikro-organismien anti-geeneihin kemiallisilla tai geneettisillä liitosmenetelmil-lä tuottaen multivalentteja antigeenikonjugaatteja ja fuu-siopeptidejä tai -proteiineja. Niitä voidaan muuttaa konju- » · • gaatiota varten, kuten lisäämällä aminohappoja tai muita : “ 35 liitosryhmiä. Rokotusta varten missä tahansa esitetyssä • · \’*i muodossa olevat eristetyt OMV:t, luokan 1 OMP-proteiini, 113009 7 fragmentit tai oligopeptidit voidaan formuloida farmaseuttisesti hyväksyttäviin liuotteisiin yhdessä vaihtoehtoisten lisäaineiden, kuten adjuvanttien, kanssa.
Tässä kuvataan myös eristettyjä nukleiinihappoja, 5 jotka koodittavat luokan 1 OMP-proteiinia, fragmentteja tai oligopeptidejä. Nukleiinihapot voidaan viedä sisään sopiviin ekspressiosysteemeihin eristettyjen OMVrden, luokan 1 OMP-proteiinin, siitä peräisin olevien fragmenttien tai minkä tahansa oligopeptidien tuottamiseksi. Näitä nukle-10 iinihappoja voidaan muuttaa geneettisillä fuusioilla niin, että ne sisältävät sekvenssejä, jotka koodittavat lisäpoly-peptidejä, jotka ovat käyttökelpoisia immuunivasteen parantamiseksi rokoteformulaatiolle, joka sisältää ekpsressoidut fuusiopolypeptidit. Lisäksi, N. meningitidis -bakteerin 15 luokan 1 OMP-proteiini on homologinen aminohapposekvenssiltään ja rakenteeltaan muiden gram-negatiivisten patogeenien poriiniproteiineille ja näin ollen tässä kuvatut luokan 1 OMP-proteiini, fragmentit ja oligopeptidit sallivat rokotteiden kehittämisen muille gram-negatiivisille patogeeneil-20 le.
Kuvioiden lyhyt selitys jj : Kuvio 1. Kaavio meningokokin luokan 1 ulkomembraa- : niproteiinia koodittavien geenien amplifioimiseksi PCR me- netelmällä (polymeraasiketjureaktio) .
.·, : 25 Kuvio 2. Geenin 51-pään sekvenssit, jotka kooditta- • I · • ♦ vat useiden N. meningitidis -bakteerien alatyyppien luokan • · ... 1 ulkomembraaniproteiinien VRl-aluetta (ensimmäinen variaa- • * • · · ‘ beli alue).
Kuvio 3. Geenin 3'-pään sekvenssit, jotka kooditta- • * 30 vat useiden N. meningitidis -bakteerien alatyyppien luokan ..· 1 ulkomembraaniproteiinien VR2-aluetta (toinen variaabeli alue) .
Kuvio 4. Epitooppitutkimus, jossa monoklonaalisten • · vasta-aineiden annetaan reagoida kiinteässä faasissa olevi- • " 35 en dekapeptidien kanssa, jotka dekapeptidit kattavat kanto- • · '. jen Pl.7,16, P1.16 ja P1.15 luokan 1 proteiinien ennustetut 113009 8 aminohapposekvenssit. Vierekkäiset dekapeptidit eroavat viiden aminohappotähteen suhteen. Huomautukset esittävät kannan, josta sekvenssi on peräisin, käytetyn monoklonaali-sen vasta-aineen ja sen alatyyppispesifisyyden.
5 Kuvio 5. Monoklonaalisten vasta-aineiden reaktio toistensa kanssa päällekkäin menevien dekapeptidien sarjan kanssa, jotka dekapeptidit vastaavat variaabeleita alueita VR1 ja VR2, jossa vierekkäiset peptidit eroavat yhden aminohappotähteen suhteen. Huomautukset esittävät kannan, josio ta sekvenssi on peräisin, käytetyn monoklonaalisen vasta-aineen ja sen alatyyppispesifisyyden.
Kuvio 6. Sellaisten rekombinanttiflagelliinien rakentaminen, jotka ekspressoivat N. meningitidis -bakteerin luokan 1 OMP-proteiinin alatyypin Pl.6,16 variaabelin alu-15 een epitooppeja.
Kuvio 7. Sellaisten rekombinanttiflagelliinien rakenne, jotka ekspressoivat N. meningitidis -bakteerin luokan 1 OMP-proteiinin alatyypin Pl.6,16 variaabelin alueen epitooppeja.
20 Kuvio 8. Edustava kromatogrammi rekombinanttifla- gelliinin korkean erotuskyvyn omaavasta nestekromatografi- i » : : : asta.
«it · : Kuvio 9. Rekombinanttiflagelliinin edustava * * » .‘I*. SDS-PAGE-analyysi .
.·. : 25 Kuvio 10. Edustavat Western-blottaus analyysit kon- • i « '["I jugaatista, joka sisältää CRMi97:ään konjugoidun N. meningi- ... tidis -bakteerin luokan 1 OMP-proteiinin epitoopin.
* · · • · · * Kuvio 11. N. meningitidis -bakteerin luokan 1 OMP- proteiinin alatyypin P1.16 mahdollinen konformaatio.
* I
• ·’ 30 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö koskee menetelmiä sellaisten rokot-. I teiden valmistamiseksi, jotka sisältävät eristettyjä .. OMV:tä, meningokokin luokan 1 OMP-proteiinia, OMP- proteiinin fragmentteja (esim. syanogenbromidilla valmis-i ** 35 tettuja) ja oligopeptidejä, joissa on OMP-proteiinin epi-
I
;. ·· tooppeja; eristettyjen 0MV:den, puhtaiden luokan 1 ulkomem- 113009 9 braaniproteiinien, puhdistusta käyttäen mutanttikantoja, jotka eivät ekspressoi luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia; eristettyjen OMV:den, puhtaiden luokan 1 ulkomembraanipro-teiinien, valmistusta kloonatun DNA:n avulla yhdistelmä-DNA 5 ekspressiovektoreissa. Tässä kuvataan myös yhdistelmä-DNA-menetelmien sovellutuksia päämäärän ollessa eristettyjen OMV:den, luokan 1 OMP-proteiinin tai sen osien, luokan 1 OMP-proteiinin, sen osien tai epitooppien geneettisten fuusioiden tuottamisen; ja multivalenttisen luokan 1 ulkomem-10 braanirokotteen valmistuksen peptidisynteesin avulla, koska lyhyen peptidiketjun epitoopit voidaan valmistaa synteettisesti .
On tullut esiin, että meningokokkien luokan 1 ulko-membraaniproteiinit indusoivat vahvan bakteereita tappavan 15 immuunivasteen sellaisia kantoja vastaan, jotka sisältävät sopivat alatyyppiepitoopit riippumatta siitä, ovatko ne ryhmän A, B, C, W-135 ja Y kantoja. Polysakkaridirokotetta voidaan tehostaa tai se voidaan korvata keksinnön mukaisella rokotteella, jolloin syntyy rokote, jolla on laaja vai-20 kutus useimpia serotyyppejä vastaan. Suojaavat bakteereita tappavat monoklonaaliset vasta-aineet, jotka ovat spesifisi j siä luokan 1 ulkomembraaniproteiinille, reagoivat vahvasti : irrotettujen fragmenttien ja lyhyiden synteettisten pepti- ·’·*. dien kanssa, jotka peptidit on valmistettu käyttäen luokan : 25 1 ulkomembraaniproteiinien aminohapposekvenssiä. Koska me- • · ningokokkitaudin nykyään aiheuttaa pääasiassa ryhmän B me- ... ningokokki ja koska ryhmän B meningokokeissa esiintyvät • » · ' luokan 1 ulkomembraaniproteiinit esiintyvät myös ryhmien A, C, W-135 ja Y meningokokeissa, tämän keksinnön mukaisesti 30 saatujen rokotteiden, jotka sisältävät yhden tai useamman .· ryhmän B N. meningitidis -bakteerista peräisin olevan luo- kan 1 OMP-proteiinin epitoopin, pitäisi olla tehokkaita es-
tämään taudit, jotka aiheutuvat ryhmän A, C, W-135 ja Y
bakteereista. Suositeltavasti sellaisen rokotteen valmistus : ” 35 lähtee ainakin kahdesta erilaisesta immunogeenisesta ja * · \ ί suojaavasta epitoopista, jotka on valittu epidemiologisin 113009 10 perustein. Keksinnön mukaisesti saadut rokotteet sisältävät esimerkiksi ainakin yhden proteiinin, joka saadaan joko OMV formulaationa tai puhdistamalla mutanttikannoista, jotka tuottavat yhtä tai useampaa luokan 1 OMP-proteiinia tai ai-5 nakin kahta fragmenttia, jotka on valmistettu syanogenbro-midifragmentoinnilla tai ainakin kahta synteettistä peptidiä, jotka on valittu noin 10 pääasiallisen epitoopin joukosta, tai tuotteet, jotka saadaan geeniekspressiolla yh-distelmä-DNA menetelmien avulla, jotka tuotteet sisältävät 10 halutut epitoopit. Tehokkuuden maksimoimiseksi laajaa me-ningokokkikantaryhmää vastaan on parempi, mitä suurempi määrä erilaisia suojaavia epitooppeja rokotteessa on. Keksinnön mukaisesti saadut rokotteet voivat suositeltavasti sisältää meningokokki A- ja C- tai vaihtoehtoisesti W-135-15 ja Y-polysakkarideja ja/tai detergenttejä. Suositeltavasti A- ja C-polysakkaridit on kovalenttisesti kiinnitetty proteiini- tai polypeptidikantajaan. Nämä kantajat sisältävät esimerkiksi eristetyn OMV:n, luokan 1 OMP-proteiinin, T-auttajasoluepitoopit, bakteeritoksiinit, toksoidit, ei-20 toksiset mutantit (CRM), Salmonella-bakteerin rekombinant-tiflagelliinin ja viruspartikkelit, kuten rotaviruksen VP6 I i j proteiinin, hepatiitti B viruksen pinta-antigeenin tai par- : voviruksen VP1- ja VP2-proteiinit. Sekä zwitterionisia, ka- tionisia, anionisia ja ionittomia detergenttejä voidaan .·, : 25 käyttää. Esimerkit sellaisista detergenteistä ovat Zwitter- • » gent 3-10, Zwittergent 3-14 (N-tetradekyyli-N,N-dimetyyli- ... 3-ammonium-1-propaanisulfonaatti) , Tween-20, natriumdeoksi- > * · * kolaatti, natriumkolaatti ja oktyyliglukosidi. Keksinnön mukaisesti saadut rokotteet voivat sisältää myös adsorbent- • » · : ·’ 30 tia, kuten alumiinihydroksidia, kalsiumfosfaattia tai suo- » » > ’...· siteltavasti alumiinifosfaattia. Fragmentteja, proteiineja, ·;>*! peptidejä voidaan myös prosessoida immunostimuloivissa komplekseissa (ISCOMS) , liposomeissa tai mikropallosissa antoa varten ja/tai käyttää adjuvanttina tai yhdessä muiden • · : " 35 adjuvanttien kanssa niin, että saadaan suurempi immuno- • · · *. *: geenisyys.
113009 11 Tässä kuvataan myös eristettyä OMV:tä, oleellisesti puhtaita meningokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiineja (minkä tahansa alatyypin) ja näiden proteiinien fragmentteja, jotka sisältävät epitooppeja. Fragmentit voivat olla 5 mikä tahansa osa, jonka molekyylipaino on 25 kilodaltonia tai vähemmän, joka sisältää epitoopit, joihin suojaavat bakteereita tappavat N. meningitidis -bakteerien vasta-aineet sitoutuvat. Nämä sisältävät proteolyyttiset fragmentit ja synteettiset oligopeptidit, jotka sisältävät amino-10 happosekvenssit, jotka vastaavat ainakin osittain luokan 1 OMP-proteiinin epitooppeja.
Eristetyt 0MV:t, luokan 1 OMP-proteiini, siitä peräisin olevat fragmentit tai epitooppeja sisältävät oligopeptidit, voivat sisältää aminohapposekvenssit, jotka ovat 15 erilaisia, mutta olennaisesti biologisesti vastaavia luonnollisten sekvenssien kanssa. Nämä sekvenssit voivat sisältää sekvenssit, joissa toiminnallisesti vastaavat aminohappotähteet on korvattu sekvenssin sisällä tähteillä, jotka johtavat hiljaiseen muutokseen. Yksi tai useampi aminohap-20 potähde sekvenssin sisällä voidaan esimerkiksi korvata toisella aminohapolla, jolla on samanlainen polaarisuus, joka f, · aminohappo toimii toiminnallisesti vastaavalla tavalla joh- : : taen hiljaiseen muutokseen. Sekvenssin sisällä olevan ami- nohapon substituentit voidaan valita muista sen luokan ami-.* : 25 nohapoista, johon aminohappo kuuluu. Ei-polaariset (hydro- • i fobiset) aminohapot esimerkiksi sisältävät glysiinin, ala- • » §.;. niinin, leusiinin, isoleusiinin, valiinin, proliinin, fe- « » · nyylialaniinin, tryptofäänin ja metioniinin. Polaariset neutraalit aminohapot sisältävät seriinin, treoniinin, kys- i · * • ·' 30 teiinin, tyrosiinin, asparagiinin ja glutamiinin. Varatut (emäksiset) aminohapot sisältävät arginiinin, lysiinin ja •; ’ | histidiinin. Negatiivisesti varatut (happamat) aminohapot : sisältävät asparagiini- ja glutamiinihapon.
Eristettyjä OMV:tä, luokan 1 OMP-proteiinia, frag- • * : '* 35 mentteja tai oligopeptidejä voidaan lisäksi modifioida kon-
» · t I I
Ί jugoimalla muihin molekyyleihin (esim. kiinnittämällä lii- 113009 12 tosryhmiä, kuten aminohapot kysteiini ja/tai lysiini tai muita liitosryhmiä ja/tai väliryhmiä), joita ovat eri alatyyppien muut luokan 1 OMP-proteiinit, T-soluepitoopit, B-soluepitoopit, kantajapeptid.it tai -proteiinit tai adju-5 vanttimolekyylit.
Kuten alla on kuvattu yksityiskohtaisesti, luokan 1 OMP-proteiinin fragmentteja tai oligopeptidejä voidaan käyttää rokotteissa monina eri muotoina (esim. yksinään, seoksina tai konjugaatteina ja geneettisinä fuusioina, jot-10 ka on tuotettu yhdistelmä-DNA-vektoreista). Näitä tarkoituksia varten materiaalit voidaan tuottaa eristämällä ne N. meningitidis -bakteerista, proteolyyttisellä digestiolla, kemiallisella synteesillä tai ekspressoimalla rekombinant-timolekyyleinä. Tuottomenetelmät ja eristettyjen OMV:den, 15 luokan 1 OMP-proteiinin ja luokan 1 OMP-proteiinin fragmenttien ja oligopeptidien käyttö on kuvattu alla.
Luokan 1 OMP-proteiinien proteiinimallitus- ja rakenneanalyysit suoritettiin käyttäen useiden E. coli -bakteerin ulkomembraaniproteiinien periaatteita. (Vogel, 20 H. et ai., J. Mol. Biol. , 190: 191 (1986); Ference, T. et ai., J. Mol. Biol., 201: 493 (1988) ja Tommassen, J. teok-: : : sessa "Membrane Biogenesis", NATO ASI sarja H16, sivu 351, : Springer-Verlag, NY (1988)). Saatuja luokan 1 OMP- .’j’. proteiinien aminohapposekvenssejä käytettiin mallitustutki- .·. · 25 mukeissa ja vertailuissa. Aminohapposekvenssin homologiaa • * · i ( | verrattiin muiden gram-negatiivisten bakteereiden poriini- proteiineihin ja proteiinirakenteen samankaltaisuus vahvis-' tettiin. Ulostyöntyvät pintasilmukat ja membraanin läpäise vä rakenne olivat hyvin samankaltaisia näillä poriiniprote-30 iineilla. Niiden paljastuneiden tietojen avulla, jotka kos-• kevät N. meningitidis -bakteerin variaabelien ja vakioalu- : eiden suojaavia epitooppeja ja niiden rakennetta, voidaan : ennustaa aminohapposekvenssin perusteella, missä suojaavat epitoopit ehkä sijaitsevat muilla patogeenisillä gram-35 negatiivisilla bakteereilla, jotta niitä voidaan arvioida , ‘i ja sisällyttää näiden bakteerien vastaisiin rokotteisiin.
13 113009
Eristettyjen OMV:den tuotto OMV:t voidaan tuottaa joko viljelysupernatanteista tai bakteerisoluista fragmentaation jälkeen, kuten ovat kuvanneet Beuvery et ai., (1983) Infect. Immun. 40: 369 -380.
5 OMV:t, joissa on proteiineja useammasta kuin yhdestä menin-gokokista, voidaan eristää kannoista, joita on käsitelty niin, että ne ekspressoivat heterologisia proteiineja.
Luokan 1 OMP-proteiinin ja sen CNBr:lla tehtyjen fragmenttien tuotto ja puhdistus 10 Luokan 1 ja luokan 3 ulkomembraaniproteiinit voi daan eristää, kuten ovat kuvanneet Beuvery, E.C. et ai.,
Antonie wan Leeuvenhoek J. Microbiol., 52: 232 (1986). Oleellisesti puhtaan luokan 1 OMP-proteiinin, joka on vapaa luokan 2 ja luokan 3 OMP-proteiineista, tuotto 15 saadaan tällä menetelmällä käyttäen sellaisia meningokokki-en mutanttikantoja, jotka eivät ekspressoi luokan 2/3 OMP-proteiinia. Suositeltava luokan 1 OMP-proteiinin tuottokan-ta on HIII5-kanta, joka on talletettu numerolla CBS 636.89.
Fragmentit voidaan tuottaa syanogenbromidikat-20 kaisulia, kuten ovat kuvanneet gonokokkiproteiinille Teer-link, T. et ai., J. Exp. Med. 166: 63 (1987). N-pään frag- : : : menttia kutsutaan nimellä CB-1 ja C-pään fragmenttia nimel- : ; lä CB-2. Nämä CNBr:lla tehdyt fragmentit voidaan puhdistaa ; . käänteisfaasi-HPLC:lla Vydax™ C4 tai Aquapor™ R-300 pyl- : 25 väässä käyttäen vesi/asetonitriiligradienttia. Fragmentti voidaan puhdistaa vaihtoehtoisesti useilla kylmässä tapahtuvilla trikloorietikkahapposaostuksilla. Nämä menetelmät
» I
t » poistavat enemmän kuin 95 % häiritsevistä kontaminanteista (esim. puskurisuolat, detergentit ja fragmenttikontaminan-30 tit).
‘ Luokan 1 OMP-proteiinin epitooppeja sisältävien | fragmenttien ja oligopeptidien valmistus : A. Valmistus proteolyyttisellä digestiolla » » 113009 14
Oligopeptidit, jotka sisältävät epitooppeja, jotka reagoivat bakteereita tappavien N. meningitidis -bakteeria vastaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa, voidaan tuottaa digestoimalla luokan 1 OMP-proteiini, CB-1- tai CB-2-frag-5 mentit proteinaaseilla, kuten endoLys-C-, endoArg-C-, endo-Glu-C- ja stafylokokkien V8-proteaasilla. Digestoidut fragmentit voidaan puhdistaa esimerkiksi korkean erotuskyvyn omaavilla nestekromatografiamenetelmillä (HPLC).
B. Valmistus kemiallisella synteesillä 10 Tässä kuvatut oligopeptidit voidaan syntetisoida standardilla kiinteän faasin peptidisynteesillä (Barany, G. ja Merrifield, R.B., The Peptides 2: 1 - 284, Gross, E. ja Meienhofer, J. , toim., Academic Press, New York) käyttäen tert-butyylioksikarbonyyliaminohappoja ja fenyyliasetamido-15 metyyliresiinejä (Mitchell, A.R. et ai., J. Org. Chem., 43: 2845 - 2852 (1978) tai 9-fluorenyylimetyylioksi- karbonyyliaminohappoja polyamidikantajalla (Dryland, A. ja Sheppard, R.C., J. Chem. So. Perkin Trans. I, 125 - 137
(1986)). Synteettiset peptidit voidaan vaihtoehtoisesti 20 valmistaa pepskan-synteesillä (Geysen, H.M. et ai., J. Immunol . Methods 03: 259 (1987); Proc. Natl. Acad. Sei. USA
i : 81: 3998 (1984)), Cambridge Research Biochemicals, Cam- ; bridge, U.K., tai standardilla nestefaasipeptidisyntee- sillä. Aminohappojen deleetiot tai substituutiot (ja sisäl- • : 25 tää pidennykset ja lisäykset aminohappoihin) muilla tavoil- la, jotka eivät oleellisesti vähennä oligopeptidin immuno- • · ... logisia ominaisuuksia.
• · · ♦ ♦ · ' C. Valmistus yhdistelmä-DNA menetelmillä
Luokan 1 OMP-proteiini, fragmentit ja oligopepti-' .* 30 dit, jotka sisältävät luokan 1 OMP-proteiinin epitooppeja, , voidaan tuottaa yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Nämä sisältä- j vät yleisesti sellaisten DNA-sekvenssien saamisen, jotka koodittavat haluttua OMP-proteiinia (Barlow et ai., (1989) » • Mol. Micro., 3: 131), fragmenttia tai oligopeptidisekvens- : '* 35 sejä, ja yhden tai useamman samankaltaisen tai erilaisen • » 113009 15 luokan 1 OMP-proteiinin sekvenssin viemisen sisään sopivaan vektori/isäntä ekspressiosysteemiin, jossa sitä ekspressoi-daan. DNA voi koostua geenistä, joka koodittaa luokan 1 OMP-proteiinia tai mistä tahansa geenin alueesta, joka koo-5 dittaa OMP-proteiinin toiminnallista epitooppia. DNA voidaan liittää DNA.-han, joka koodittaa N. meningitidis -bakteerin muita antigeenejä (kuten joko saman tai eri luokan muut ulkomembraaniproteiinit) tai muiden bakteerien, virusten, parasiittien tai sienten antigeenejä geneettises-10 ti fuusioitujen (yhteinen peptidirunko) multivalenttien antigeenien luomiseksi. Luokan 1 OMP-proteiinifragmentit voidaan liittää esimerkiksi toiseen luokan 1 ulkomembraanipro-teiiniin, joka on eri N. meningitidis -luokkaa (tai sen fragmentteihin tai epitooppeihin) saaden fuusioproteiinit, 15 jotka sisältävät useita luokan 1 ulkomembraaniproteiinin alatyyppideterminanttej a.
Geeniteknologiamenetelmiä voidaan käyttää myös koo-ditettujen peptidien tai proteiinien karakterisoimiseen, modifioimiseen ja/tai muokkaamiseen. Esimerkiksi kohdennet-20 tu mutageneesi suojaavien domeenien ulkopuolella olevien alueiden modifioimiseksi OMP-proteiinifragmentissa esimer- » · : kiksi alafragmentin liukoisuuden kohottamiseksi, joka sal- ; lii helpomman puhdistuksen. DNA:ta voidaan myös käsitellä niin, että vaikutetaan OMP-proteiinifragmenttien tai niiden . : 25 yhdistelmien suurtuotantoon eri organismeissa.
DNA, joka koodittaa luokan 1 OMP-proteiinia, fragmentteja tai oligopeptidejä, voidaan syntetisoida tai eris-1 tää ja sekvensoida, kuten ovat kuvanneet Barlow, A.K. et ai., Infect. Immun. , 55: 2734 - 40 (1987) ja Barlow, A.K.
: ·' 30 et ai., Mol. Micro. , 3^: 131 (1989) . Luokan 1 OMP- '...· proteiinigeenejä voidaan amplifioida bakteeri-DNA: sta mene- telmillä, jotka ovat kuvanneet Mullis ja Faloona (1987) Method. Enzym. 155: 335 - 350, käyttäen tässä kuvattuja • alukesekvenssejä. Luokan 1 OMP-proteiinille sukua olevia • · • " 35 eri alatyyppiä olevia DNA-sekvenssejä voidaan saada kuva- • » • · · » · 113009 16 tuilla menetelmillä ja aminohapposekvenssit voidaan päätellä .
Useita eri isäntä-vektorisysteemejä voidaan käyttää tässä kuvattujen oligopeptidien ekspressoimiseksi. Vekto-5 risysteemin täytyy ensi sijassa olla yhteensopiva käytetyn isäntäsolun kanssa. Isäntä-vektorisysteemit sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, seuraavat: bakteriofaagin DNA:11a, plasmidin DNA:11a tai kosmidin DNA:11a transformoidut bakteerit; mikro-organismit, kuten hiivavektorit si-10 sältävät hiivat; nisäkässolusysteemit, jotka on infektoitu viruksella (esim. lehmänrokkovirus, adenovirus, jne.); hyönteissolusysteemit, jotka on infektoitu viruksella (esim. bakulovirus). Näiden vektoreiden ekspressioelementit vaihtelevat vahvuutensa ja spesifisyytensä suhteen. Riippu-15 en käytetystä isäntä-vektorisysteemistä, voidaan käyttää mitä tahansa useista sopivista transkriptio- ja translaa-tioelementeistä.
Jotta saavutettaisiin kloonatun DNA:n tehokas eks-pressio, ekspressiovektorissa täytyy olla läsnä promootto-20 ri. RNA polymeraasi sitoutuu normaalisti promoottoriin ja aloittaa geenin tai yhteenliittyneiden geenien ja säätelyjä' · elementtien ryhmän (jota kutsutaan operoniksi) transkripti- ; on. Promoottorit vaihtelevat "vahvuudeltaan", nimittäin ky- 2' j" j vyltään aloittaa transkriptio. On suositeltavaa käyttää : 25 vahvoja promoottoreita, jotta saadaan korkean tason tran- • i ,,.,2 skriptio ja näin ollen korkean tason DNA ekspressio. Riip- • · ... puen isäntäsolusysteemistä voidaan käyttää mitä tahansa • · i ‘ useista sopivista promoottoreista. Esimerkiksi E. coli -bakteerin bakteriofaageilla tai plasmideilla voidaan käyt-·* 30 tää sellaisia promoottoreita, kuten lac-promoottoria, trp- promoottoria, recA-promoottoria, ribosomaalisen RNA:n pro-·.· moottoria ja kolifaagi lambdan PR- tai PL-promoottoreita, ja muita, jotka sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, lacUV5-, ompF-, bla-, lpp- ja niiden kaltaiset promootto-: “ 35 rit, viereisten DNA alueiden korkean tason transkription ·.* ohjaamiseen. Lisäksi voidaan käyttää yhdistelmä-DNA tai 113009 17 muilla synteettisillä DNA menetelmillä tuotettuja trp-lacUV5-hybridipromoottoreita (tae) tai muita E. coli -bakteerin promoottoreita insertoidun DNA:n transkription aikaan saamiseen.
5 Voidaan valita sellaiset bakteerisoluisännät ja ekspressiovektorit, jotka inhiboivat promoottorin toimintaa ellei sitä indusoida spesifisesti. Tietyissä operoneissa spesifisten indusoijien lisäys on tarpeellista insertoidun DNA:n tehokkaalle transkriptiolle; esimerkiksi lac-operoni 10 indusoituu laktoosin tai IPTG:n (isopropyylitio-beeta-D-galaktosidi) lisäyksellä. Useat muut operonit, kuten esim. trp, ovat erilaisten säätelyjen alaisuudessa. Trp-operoni indusoituu, kun tryptofaania ei ole läsnä kasvualustassa ja lambdan PL-promoottori voidaan indusoida kohottamalla sel-15 laisten isäntäsolujen lämpötilaa, jotka sisältävät lämpö-herkän lambda repressorin, esim. cl857-repressorin. Tällä tavalla voidaan inhiboida enemmän kuin 95 % promoottorin ohjaamasta transkriptiosta indusoimattomissa soluissa. Näin ollen rekombinanttipeptidin tai -proteiinin ekspressiota 20 voidaan säädellä. Tämä on tärkeää, jos DNA:n ekspres-siotuote on isäntäsoluille tappava tai tuhoisa. Sellaisissa •t · tapauksissa transformantit voidaan viljellä olosuhteissa, : joissa promoottori ei indusoidu; sitten, kun solut saavut- tavat sopivan tiheyden kasvualustassa, promoottori voidaan : 25 indusoida proteiinin tuottoa varten.
t ·
Yksi sellainen promoottori/operaattorisysteemi on • φ ... "tae"- tai trp-lac-promoottori/operaattorisysteemi (Russell • · · ' ja Bennett, 1982, Gene 20: 2312 - 243; DeBoer, EP-patenttihakemus, 67 540, rekisteröity 18.5.1982). Tämä • · ·’ 30 hybridipromoottori on rakennettu yhdistämällä trp- ’...· promoottorin -35 emäspari (-35 alue) ja lac -promoottorin » ;.· -10 emäspari (-10 alue tai Pribnow-alue) (DNA sekvenssit, jotka ovat RNA-polymeraasin sitoutumiskohtia). Sen lisäksi, että tae pitää yllä tryptofaanipromooottorin vahvoja pro- • · ‘ “ 35 moottoriominaisuuksia, sitä voidaan myös säädellä lac- • · *: repressorin avulla.
113009 18
Kun kloonataan eukaryoottiseen isäntäsoluun, voidaan transktiption tehokkuuden kohottamiseksi insertoida tehostajasekvenssejä (esim. SV40-DNA:n 72 emäsparin pituinen peräkkäinen toistoalue tai retroviruksen pitkät termi-5 naaliset toistoalueet tai LTR:t, jne.). Tehostajasekvenssit ovat joukko eukaryoottisiä DNA elementtejä, jotka tuntuvat kohottavan transkription tehokkuutta tavalla, joka on suhteellisen riippumaton niiden sijainnista ja orientaatiosta läheisen geenin suhteen. Toisin kuin klassisten promootto-10 rielementtien (esim. polymeraasin sitoutumiskohta ja Gold-berg-Hogness'in TATA-alue), joiden täytyy sijaita juuri geenin 5'-päässä, tehostasekvensseillä on huomattava kyky toimia eukaryoottisten geenien ylävirrasta, sen sisältä tai alavirrasta käsin; sen vuoksi tehostajasekvenssin sijainti 15 insertoidun DNA:n suhteen on vähemmän kriittinen.
Spesifisiä aloitussignaaleja tarvitaan tehokkaalle geenin transkriptiolle ja translaatiolle myös prokaryootti-sissa soluissa. Nämä transkription ja translaation aloitus-signaalit voivat vaihdella "vahvuudeltaan" mitattuna geenin 20 spesifisen lähetti RNA:n määrän ja syntetisoituneen proteiinin suhteen, vastaavassa järjestyksessä. DNA ekspres-•j : siovektori, joka sisältää promoottorin, voi sisältää myös : minkä tahansa yhdistelmän erilaisia "vahvoja" transkription • · · ja/tai translaation aloitussignaaleja. Tehokas translaatio : 25 E. coli -bakteerissa tarvitsee esimerkiksi noin 7-9 emäk- , t>; sen pituisen Shine-Dalgarno (SD) sekvenssin alotuskodonin (ATG) 5'-puolella muodostamaan ribosomin sitoutumiskohdan. Näin ollen voidaan käyttää mitä tahansa SD-ATG yhdistelmää, jota isäntäsolun ribosomit voivat käyttää hyväkseen. Sei- i
30 laiset yhdistelmät sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet, SD-ATG yhdistelmän kolifaagi lambdan ero-geenistä tai .» N-geenistä tai E. coli -bakteerin tryptofaani E, D, C, B
tai A geeneistä. Lisäksi voidaan käyttää mitä tahansa yh-distelmä-DNA tai muilla menetelmillä, jotka sisältävät syn-35 teettisten nukleotidien lisäämisen, tuotettua SD-ATG-. *: yhdistelmää.
113009 19
Mitä tahansa kuvattuja menetelmiä DNA:n insertomi-seksi ekspressiovektoriin voidaan käyttää promoottorin ja muiden geneettisten säätelyelementtien ligoimiseksi vektorin spesifisiin kohtiin. N. meningitidis -bakteerin sek-5 venssit voidaan ligoida ekspressiota varten ekspressiovek-torin spesifiseen kohtaan vektorin promoottorin ja säätely-elementtien suhteen niin, että kun rekombinantti-DNA-molekyyli tuodaan isäntäsoluun, vieraat geneettiset sekvenssit voidaan ekspressoida (nimittäin transkriptoida ja 10 transloida) isäntäsolussa.
Yhdistelmä-DNA-vektori voidaan viedä sisään sopiviin isäntäsoluihin (bakteerit, virukset, hiivat, nisäkäs-solut tai niiden kaltaiset) transformaatiolla, transdukti-olla tai transfektiolla (riippuen vektori/isäntä-15 solusysteemistä). Vektorin sisältävät isäntäsolut valitaan perustuen yhden tai useamman sopivan geenimerkin ekspressi-oon, joka geenimerkki on normaalisti läsnä vektorissa, kuten ampisilliiniresistenssi tai tetrasykliiniresistenssi pBR322-vektorissa tai tymidiinikinaasiaktiivisuus euka-20 ryoottisissä isäntäsysteemeissä. Ekspressiovektorit voivat olla peräisin kloonausvektoreista, jotka tavallisesti si-j : sältävät merkkitoiminnon. Sellaiset kloonausvektorit sisäl- : tävät, mutta eivät ole rajoittuneet, seuraavat: SV40- ja adenovirusvektorit, lehmänrokkovirusvektorit, hyönteisvi-, ; 25 rukset, kuten bakulovirukset, hiivavektorit, bakteriofaagi- vektorit, kuten lambda gt-WES-lambda B, Charon 28, Charon . 4A, lambda gt-l-lambda BC, lambda gt-l-lambda B, M13mp7, M13mp8, M13mp9, tai plasmidi-DNA vektorit, kuten pBR322, pAC105, pVA51, pACYC177, pKH47, pACYC184, pUBHO, pMB9, 30 pBR32 5, ColEl, pSCIOI, pBR313, pML21, RSF2124, pCRl, RP4, pBR328 ja niiden kaltaiset.
·;' Ekspressiovektorit, jotka sisältävät DNA-insert it, voidaan tunnistaa kolmella yleisellä menetelmällä: (1) DNA- DNA -hybridisaatiolla käyttäen koettimia, jotka sisältävät 35 sekvenssit, jotka ovat homologisia insertoidulle geenille; 3 (2) merkkigeenitoimintojen (esim. resistenssi antibiooteil- 113009 20 le, transformaatiofenotyyppi, tymidiinikinaasiaktiivisuus, jne.) läsnä tai poissa olon perusteella ja (3) inser-toitujen sekvenssien ekspression perusteella perustuen gee-nituotteen fysikaalisiin, immunologisiin tai toiminnalli-5 siin ominaisuuksiin.
Kun mahdollinen rekombinanttiklooni, joka ekspres-soi haluttua luokan 1 OMP-proteiinin aminohapposekvenssiä, on tunnistettu, geenituote voidaan analysoida seuraavasti. Immunologinen analyysi on erikoisen tärkeä, koska lopulli-10 nen päämäärä on geenituotteiden käyttö rokoteformulaatiois-sa ja/tai antigeeneinä diagnostisissa immunotesteissä. Eks-pressoidun peptidin tai proteiinin tulee olla immunoreak-tiivinen N. meningitidis -bakteeria vastaan suunnattujen bakteeria tappavien vasta-aineiden kanssa. Tämä reaktiivi-15 suus voidaan osoittaa standardeilla immunologisilla menetelmillä, kuten radioimmuunisaostuksella, radioimmuunikil-pailutestillä, ELISA-testillä tai immuuniblottaustesteillä.
Kun geenituote on tunnistettu luokan 1 OMP-prote-iinifragmentiksi tai oligopeptidiksi, joka sisältää sen 20 epitoopin, se voidaan eristää ja puhdistaa standardeilla menetelmillä, jotka sisältävät kromatografiän (esim. ionin-jj vaihto-, affiniteetti- ja kokoerotukseen perustuvan pylväs- : kromatografiän), sentrifugaation, erilaiseen liukoisuuteen perustuvat menetelmät tai millä tahansa muulla standardilla : 25 proteiinipuhdistusmenetelmällä. On olemassa useita menetel- ii>t; miä heterologisten proteiinien puhdistukseen prokaryootti- sista soluista. Katso esim. Olson, US-patentti numero 4 518 526, Wetzel, US-patentti numero 4 599 197 ja Hung et ai., US-patentti numero 4 734 362. Millä tahansa tavalla ·* 30 tuotetun puhdistetun valmisteen tulisi kuitenkin olla oleellisesti vapaa isännän toksiineista, jotka voivat olla .1 haitallisia ihmisille. Erikoisesti, kun ekspressoidaan gram-negatiivisissa isäntäsoluissa, kuten E. coli- tai Sal- * monella-soluissa, puhdistetun peptidin tai proteiinin tuli-35 si olla oleellisesti vapaa endotoksiinikontaminaatiosta.
* · * · * · 113009 21 Tässä kuvatut luokan 1 OMP-proteiini, fragmentit ja oligopeptidit voidaan formuloida univalenteiksi ja multiva-lenteiksi rokotteiksi. Näitä materiaaleja voidaan käyttää sellaisina kuin ne on tuotettu tai ne voidaan eristää yllä 5 kuvatuilla menetelmillä. Ne voidaan sekoittaa, konjugoida tai liittää muiden antigeenien kanssa sisältäen B- tai T-solun muiden antigeenien epitoopit. Lisäksi ne voidaan konjugoida kantajaproteiiniin, kuten on kuvattu alla oligo-peptideille.
10 Kun käytetään hapteenista oligopeptidiä (se on pep tidi, joka reagoi sukulaisvasta-aineiden kanssa, mutta ei voi itse saada aikaan immuunivastetta), se voidaan konjugoida immunogeeniseen kantajamolekyyliin. Konjugointi immu-nogeeniseen kantajaan voi muuttaa oligopeptidin immuno-15 geeniseksi. Konjugointi voidaan suorittaa standardeilla menetelmillä. Suositeltavat kantajaproteiinit hapteenisille oligopeptideille ovat toksiinit, toksoidit tai mikä tahansa ristireagoiva materiaali (CRM) tetanus-, difteria-, pertussis-, Pseudomonas-, E. coli-, Staphylococcus- ja Strepto-20 coccus-toksiineista. Erikoisen suositeltava kantaja on difteriatoksiinin CRM197, joka on peräisin P. diphtheriae ·,· -kannasta C7 (beeta 197), joka tuottaa CRMigy-proteiinia.
: : ; Tämän kannan ATCC koodinumero on 53281. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää kantajaproteiinin tai muun immunogeenisen 25 proteiinin fragmenttia tai epitooppia. Hapteeni voidaan esimerkiksi liittää T-solun bakteeritoksiinin, toksoidin tai CRM:n epitooppiin. Katso US-patenttihakemus, jonka sarjanumero on 150 688, joka on rekisteröity 1.2.1988, nimeltään "Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope ’ 30 as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines". Muut kanta- ‘...· jät sisältävät viruspartikkelit, joihin kuuluu rotaviruksen ·;! VP6, hepatiitti B viruksen pinta-antigeeni tai parvoviruk- ....: sen VP1 ja VP2 .
Tässä kuvatut peptidit tai proteiinit voidaan antaa · J ” 35 multivalentteina alayksikkörokotteina yhdessä N. meninqiti- • * • · f \ *: dis -bakteerin antigeenien tai muiden organismien antigee- 113009 22 nien kanssa. Eräitä näitä muita organismeja ovat patogeeniset bakteerit H. influenzae, N. meningitidis, B. catarrha-lis, N. gonorrhoeae, E. coli, S. pneumoniae, jne. Ne voidaan antaa esimerkiksi yhdessä N. meningitidis -bakteerin 5 kapselin oligo- tai polysakkaridikomponenttien kanssa. Kap-selikomponentit voivat olla peräisin mistä tahansa serologisesta ryhmästä sisältäen ryhmät A, B, C, D, X, Y, Z, 29E ja W135.
Voidaan käyttää eri alatyyppejä olevia luokan 1 ul-10 komembraaniproteiineja. Näitä voidaan käyttää yhdessä bakteereita tappavien vasta-aineiden muodostamiseksi N. meningitidis -bakteeria vastaan. Esimerkiksi P1.7.16-alatyypin luokan 1 ulkomembraaniproteiinista peräisin olevaa fragmenttia voidaan käyttää yhdessä ulkomembraaniproteiinien 15 tai ulkomembraaniproteiinien fragmenttien kanssa, jotka ovat muuta alatyyppiä, kuten Pl.l, Pl.1,16, P1.2, P1.6, P1.9, P1.15, P1.16 tai P1.4 (Abdillahi, H. et ai., 1988
Micro. Pathol. 4: 27) tai meningokokkien polysakkaridien kanssa seoksina tai kemiallisina konjugaatteinä. Kun anne-20 taan yhdistettynä muiden ulkomembraaniproteiinien epitoop-pien kanssa, ne voidaan antaa erillään, seoksena tai konju-: : gaattina tai geneettisenä fuusiopeptidinä tai -proteiinina.
> Konjugaatit voidaan muodostaa standardeilla proteiinimate- > · riaalin liitosmenetelmillä tai menetelmillä, joilla liite- . : 25 tään sakkaridipolymeerejä proteiineihin. Fuusiot voidaan • · i#. ekspressoida fuusioiduista geenirakenteista, jotka on val mistettu yhdistelmä-DNA-menetelmillä, kuten on kuvattu.
• ·
Kuten on mainittu, luokan 1 OMP-proteiinia, fragmenttia tai siitä peräisin olevia mitä tahansa oligopepti-30 dejä voidaan käyttää yhdessä muiden patogeenisten organis-,.· mien (esim. bakteerit (kapselilliset tai kapselittomat) , •j virukset, sienet ja parasiitit) antigeenien (esim. polymee- rikapselit tai sakkaridiyksiköt, vaippa- tai pintaproteii-nit) kanssa. Lisäesimerkit muista organismeista sisältävät ” 35 'respiratory syncytial' -viruksen, rotaviruksen, malariapa- *: rasiitit ja Cryptococcus neoformans -bakteerin.
113009 23
Kun formuloidaan rokotekokoonpano peptidin tai proteiinin kanssa, yksinään tai kuvattuina eri yhdistelminä, immunogeeni säädetään sopivaan konsentraatioon ja formuloidaan millä tahansa sopivalla rokoteadjuvantilla. Sopivat 5 adjuvantit sisältävät, mutta eivät ole rajoittuneet: pinta-aktiiviset aineet, esim. heksadekyyliamiini, oktadekyyli-amiini, oktadekyyliaminohappoesterit, lysolesitiini, dime-tyylidioktadekyyliammoniumbromidi, metoksiheksadekyyligly-seroli ja pluroniset polyolit; polyamiinit, esim. pyraani, 10 dekstraanisulfaatti, poly IC, karbopoli; peptidit, esim. muramyylidipeptidi ja sen johdannaiset, dimetyyliglysiini, tuftsiini; öljyemulsiot ja mineraaligeelit, esim. alumiinihydroksidi, alumiinifosfaatti, jne., lymfokiinit ja immunisaatiota stimuloivat kompleksit (ISCOMS). Immunogeeni voi-15 daan myös sisällyttää liposomeihin, mikropallosiin tai kon-jugoida polysakkarideihin ja/tai muihin polymeereihin käytettäväksi rokoteformulaatiossa.
Rokotteet voidaan antaa ihmiselle tai eläimelle useilla eri tavoilla. Ne sisältävät ihon sisäisen, lihaksen 20 sisäisen, vatsaontelon sisäisen, laskimon sisäisen, ihon alaisen, suun ja sierainten kautta olevat antoreitit.
· Elävät rokotteet : : : Tässä kuvattavat peptidit ja proteiinit voidaan an- ; taa elävinä rokotteina. Tätä tarkoitusta varten on valmis- 25 tettu rekombinanttimikro-organismit, jotka ekspressoivat peptidejä tai proteiineja. Rokotteen vastaanottajalle anne- • i taan rekombinanttimikro-organismia, joka lisääntyy vastaanottajassa, ekspressoi luokan 1 OMP-proteiinia, fragmenttia tai sen oligopeptidiä ja saa aikaan immuunivasteen N. me-30 ninqitidis -bakteeria vastaan. Elävät rokotevektorit sisäl-, * tävät: adenoviruksen, sytomegaloviruksen ja suositeltavasti : rokkovirukset, kuten lehmänrokkoviruksen (Paoletti ja Pani- : cali, US-patentti numero 4 603 112) ja heikennetyt Salmo- neliä -kannat (Stocker, US-patentti numero 4 550 081 ja ·“ " 35 Curtiss et ai., Vaccine 6: 155 - 160 (1988)). Lisäksi, luo- i t 113009 24 kan 1 OMP-proteiinin epitoopit voidaan sisällyttää heikennettyjen bakteerikantojen flagellaan.
Elävät rokotteet ovat erikoisen edullisia, koska ne johtavat pidentyneeseen stimulukseen, joka voi aiheuttaa 5 oleellisesti pidemmän immuniteetin. Kun immuunivaste suojaa myöhempää N. meningitidis -bakteerin infektiota vastaan, elävää rokotetta itseään voidaan käyttää ehkäisevänä rokotteena N. meningitidis -bakteeria vastaan.
Multivalentit elävät rokotteet voidaan valmistaa 10 yhdestä tai muutamasta rekombinanttimikro-organismista, jotka ekspressoivat N. meningitidis --bakteerin eri epi-tooppeja (esim. muita alatyyppejä olevia muita ulkomembraa-niproteiineja tai niiden epitooppeja). Lisäksi, muiden patogeenisten mikro-organismien epitooppeja voidaan sisällyt-15 tää rokotteeseen. Esimerkiksi lehmänrokkovirus voidaan muuttaa niin, että se sisältää muita epitooppeja kooditta-via sekvenssejä N. meninigitidis -bakteerin epitooppeja koodittavien lisäksi. Sellaista rekombinanttivirusta itseään voidaan käyttää immunogeenina multivalentissa rokot-20 teessä. Vaihtoehtoisesti lehmänrokkovirusseos tai muiden virusten seos, joista kukin ekspressoi eri geeniä, jotka ! : j koodittavat N. meningitidis -bakteerin ulkomembraaniprote- : ;*; iinien eri epitooppeja ja/tai muiden tautia aiheuttavien organismien epitooppeja, voidaan formuloida multivalentiksi : 25 rokotteeksi.
• · · ,#>t· Voidaan valmistaa inaktivoitu virusrokote. Inakti- » · ... voidut rokotteet ovat "tapettuja", se tarkoittaa, että in- # · · ’ fektiokyky on tuhottu, tavallisesti kemiallisella käsitte lyllä (esim. formaldehydikäsittelyllä). Ihanteellisesti vi- • · · ' ·* 30 ruksen infektiokyky tuhotaan ilman, että vaikutetaan prote- iineihin, joissa viruksen immunoge en isyys on. Inaktivoitu-jen rokotteiden valmistamiseksi kasvatetaan suuria määriä haluttuja epitooppeja ekspressoivaa rekombinanttivirusta viljelmässä asianomaisten antigeenien tarpeellisten määrien ϊ *' 35 saamiseksi. Inaktivoitujen virusten, jotka ekspressoivat ·.*'! eri epitooppeja, seosta voidaan käyttää "multivalenttien" 113009 25 rokotteiden formuloimiseksi. Tietyissä tapauksissa nämä "multivalentit" inaktivoidut rokotteet voivat olla suositeltavampia kuin elävä rokoteformulaatio johtuen mahdollisista vaikeuksista, joita syntyy yhdessä annettujen elävien 5 virusten keskinäisestä häiriövaikutuksesta. Kummassakin tapauksessa inaktivoitu virus tai virusseos voidaan formuloida sopivaan adjuvanttiin immunologisen vasteen parantamiseksi antigeenejä kohtaan. Sopivat adjuvantit sisältävät: pinta-aktiiviset aineet, esim. heksadekyyliamiini, oktade-10 kyyliaminohappoesterit, oktadekyyliamiini, lysolesitiini, dimetyylidioktadekyyliammoniumbromidi, N,N-dioktadekyyli- N1 ,N' -bis-(2-hydroksietyylipropaanidiamiini) , metoksiheksa-dekyyliglyseroli ja pluroniset polyolit; polyamiinit, esim. pyraani, dekstraanisulfaatti, poly IC, karbopoli; peptidit, 15 esim. muramyylidipeptidi ja sen johdannaiset, dimetyyligly-siini, tuftsiini; öljyemulsiot ja mineraaligeelit, esim. alumiinihydroksidi, alumiinifosfaatti ja lymfokiinit. Esimerkit Esimerkki 1 20 Monoklonaaliset vasta-aineet luokan 1 OMP-proteii- nia vastaan ja niiden biologinen aktiivisuus j Meningokokin luokan 1 eri ulkomembraaniproteiineja : vastaan valmistettiin tyyppispesifiset monoklonaaliset vas- • * » ta-aineet. Nämä monoklonaaliset vasta-aineet tunnistavat • * · : 25 seuraavat alatyypit: Pl,l; Pl,2; Pl,6; Pl,7; Pl,9; Pl,10; • · · P1,15; Pl,16 ja Pl,17 (jota kutsutaan nyt nimellä Pl,14).
• * ... Monoklonaaliset vasta-aineet on saatavissa "Monoclonal Kit I t I • * · * Serotyping Meningococci" nimisenä käyttöpakkauksena RIVM:stä, Bilthoven, Alankomaat. Kaikki nämä monoklonaali- * » · ·’ ·* 30 set vasta-aineet reagoivat SDS:llä (natriumdodekyylisul- faatti) denaturoidun proteiinin kanssa, kun niitä testataan ...>j Western-blottauksella. Havaittiin myös, että useat näistä monoklonaalisista vasta-aineista reagoivat 42 kilodaltonin i · kokoisen luokan 1 ulkomembraaniproteiinin 25 kilodaltonin : ” 35 kokoisen CNBr-fragmentin kanssa (katso alla). Tämä tulos : vihjasi, että luokan 1 ulkomembraaniproteiinin epitoopit 26 113009 ovat pääasiassa lineaarista tyyppiä ja niitä voidaan sen vuoksi kopioida synteettisillä peptideillä. Patentinhakijoiden suorittamien testien antamat epidemiologiset tulokset osoittavat, että kuvatut monoklonaaliset vasta-aineet 5 voivat alatyypata useimmat ryhmien A, B, C meningokokit, joka antaa olettaa rajoitetun heterogeenisuuden olemassa olon. Kukin luokan 1 ulkomembraaniproteiini tuntuu myös sisältävän kaksi yksilöllistä tyyppispesifistä epitooppia (Äbdillahi ja Poolman, Microb. Pathogen., 1988, 4: 27 - 32; 10 samat FEMS Microbiol. Immunol. 47: 139 -144).
Puhdistettu luokan 1 ulkomembraaniproteiini (katso alla), alatyyppi Pl,7.16, joka on peräisin sellaisen mutan-tin viljelmästä, joka mutantti on vapaa luokasta 2/3 (HIII5), tuntui indusoivan bakteereja tappavan vasta-15 ainevasteen seerumilaimennoksella 1:64 annoksella 2,5 pg hiirissä. Meningokokkien luokan 1 ulkomembraaniproteiineja, luokan 2/3 ulkomembraaniproteiineja ja lipopolysakkarideja vastaan olevia monoklonaalisia vasta-aineita verrattiin niiden bakteereita tappavan vaikutuksen suhteen. Luokan 1 20 ulkomembraaniproteiineja vastaan olevat monoklonaaliset vasta-aineet tuntuivat omaavan vahvimman bakteereita tappa- • J f van aktiivisuuden (katso taulukko 1) . Bakteerivaste määri- : : : tettiin, kuten on kuvannut Poolman, J.T. (1985), teoksessa
Schoolnik et ai. (toim.) "The Pathogenic Neisseriae", ASM
• .·. : 25 Publications, Washington, D.C., sivu 562.
,,,,; Taulukko 1 • · ...# Monoklonaalisen vasta-ainekokoelman bakteereita • » » tappava aktiivisuus, jotka vasta-aineet on suunnattu menin-gokokin luokkaa 1 (cl 1), luokkaa 2/3 (cl 2/3) ja lipopo-30 lysakkaridia (LPS) vastaan. (ND = ei määritetty).
> * I
113009 27
Testikanta Vasta-aineyhdistelmän bakteereita tappava aktiivisuus (tiitteri)
Kanta (Gp:sero-
5 tyyppi:alatyyp- Cl 2/3 Cl 1 LPS
pi:LPS tyyppi) yhdistelmä yhdistelmä yhdistelmä
3006 ( B : 2 6 : P1.2 : L2 ) 1000 8000 ND
H981 (B:4P1.-:L5) 10 ND 2000
H990 (B;6:P1.6:L/) 10 2000 ND
M978 (B:8: PI.1:LI.8) ND 8000 1000 H9 8 2 (B:9:P!.9:L3.7) 500 2000 1000 H355 (B:15:P1.15:LI.8) 1000 8000 1000 H44/76 (B:15:P1.7.16:L3.7 ) 1000 8000 4000 10 Näiden monoklonaalisten vasta-aineiden bakteereita tappava aktiivisuus tuntuu korreloivan hyvin suojaavan in vivo aktiivisuuden kanssa mitattuna rotan meningiittimal-lissa, jonka ovat kuvanneet Saukkonen et ai., 1987, Microbial . Pathogen 3: 261.
15 Esimerkki IA
Useita luokan 1 geenejä sisältävien meningokokki-kantojen rakentaminen
Kromosomaalisten geenien korvauksesta klooneilla on hiukan erilaisia versioita kuvattu Neisseria qonorrhoeae ;*·,· 20 -bakteerille (Stein, D.C., Clin. Microbiol, Rev. 2 (Liite), .,,,: S146 - S149 (1989)). Olemme havainneet, että tätä menetel- » · mää voidaan soveltaa Neisseria meningitidis -bakteerin luo- • · · kan 1 geenille. Tämä suoritettiin seuraavalla tavalla: ,, , (i) Kannan 2996 (alatyyppi Pl,2) luokan 1 geeni » > · \ 25 kloonattiin vektoriin pTZ19R. (Mead, D.A. et ai., Protein '···* Engineering 1: 67 (1986)). Täydellinen geeni sijaitsee 2,2 Ί : kiloemäksen pituisessa Xbal-fragmentissa, joka ligoitiin ·; · Xbal-entsyymillä digestoituun vektori DNA:han.
(ii) Tuloksena syntynyttä plasmidia käytettiin • * \ t 30 transformoitaessa kanta H44/76 (alatyyppi Pl,7,16). Vas- • I > ** taanottajakannan soluja inkuboitiin plasmidi-DNA:n kanssa S 28 113C09
Mg2+:n läsnä ollessa ja normaalissa meningokokkialustassa, sen jälkeen ne laimennettiin ja maljattiin ja tuloksena syntyneet pesäkkeet testattiin niiden kyvyn suhteen sitoa P1,2-spesifistä monoklonaalista vasta-ainetta. Sellaisia 5 transformantteja löydettiin frekvenssillä noin 10'3. Lisä-karakterisointi osoitti, että kannan H44/76 luokan 1 geenin korvaus oli todella tapahtunut. Menetelmän oleellinen ominaisuus on luovuttajageenin läsnä olo rengasmaisessa plas-midi-DNA:ssa, joka ei kykene replikoitumaan N. meningitidis 10 -bakteerissa, koska linearisoidun DNA:n käyttö ei tuottanut yhtään transformantteja.
Sellaisen kannan rakentaminen, joka sisälsi kaksi luokan 1 geeniä, tehtiin yllä kuvatun menetelmän muunnelmalla. Tätä tarkoitusta varten Pl,2 luokan 1 geeni inser-15 toitiin luokan 5 geenien klooneihin. Luokan 5 geeniperheel-lä on kaksi ominaisuutta, jotka tekevät sen erikoisen sopivaksi tätä rakennusta varten. (Meyer, T.F. ja Van Putten, J.P.M., Clin. Microbiol. Rev., 2 (Liite) S139 - S145 (1989): (i) meningokokin genomissa on neljä tai viisi luo- 20 kan 5 geeniä läsnä ja (ii) näiden geenien ekspressio ei ole tarpeellista kasvua varten laboratorio-olosuhteissa. Luokan • ϊ 5 geeni kloonattiin kannasta H44/76 ja Pl, 2-geeni insertoi- : tiin SphI-kohtaan, joka sijaitsee hyvin lähellä luokan 5 geeniä. Tuloksena syntynyttä hybridiplasmidia pMC22 käytet-: 25 tiin transformoitaessa kanta HIII5, joka on kannan H44/76 • i* mutantti, jolta puuttuu luokka 3. Eristettiin ja karakteri- i « ... soitiin pesäkkeet, jotka reagoivat Pl,2-spesifisen monoklo- ’ naalisen vasta-aineen kanssa. Kymmenestä sellaisesta trans- formantista yhdeksän havaittiin menettäneen vastaanottaja- * ·* 30 kannan Pl,16-epitoopin. Tämä osoittaa, että kaikissa näissä ,· tapauksissa rekombinaatio oli tapahtunut ainoastaan luokan | 1 geenien välillä johtaen alatyypin vaihtumiseen. Löydet tiin kuitenkin yksi transformantti, joka teki molempia luo-kan 1 alatyyppejä, nimittäin Pl,7,16:tta ja Pl,2:ta, joka 35 antaa olettaa, että rekombinaation on täytynyt tapahtua *. ': plasmidissa olevien ja kromosomissa olevien luokan 5 gee- 113009 i 29 nisekvenssien välillä. Tämä vahvistettiin Western-blottauk-sella, joka paljasti molempien luokan 1 proteiinityyppien läsnä olon ja Southern-blottauksella, joka osoitti toisen luokan 1 geenin lisäyksen.
5 Jatkamalla tätä rakennusta muiden luokan 1 alatyyp pien suhteen on mahdollista muodostaa kanta, jolla on neljä tai viisi erilaista luokan 1 geeniä. Samaa luokan 5 geeniä voidaan käyttää kussakin seuraavassa transformaatiovaihees-sa, luokan 5 eri geenit voivat olla klooneja ja niitä voi-10 daan käyttää erillään. Näitä rekombinanttikantoja voidaan käyttää valmistettaessa puhdistettujen luokan 1 OMP-prote-iinien eri seokset.
Esimerkki IB
Eristettyjen OMVsden puhdistus bakteeriviljelmästä 15 Puhdistus suoritetaan, kuten ovat kuvanneet Beuvery et ai., (1983) Infect. Immun. 40: 369 - 380.
Tämä viljely voidaan suorittaa halutuilla villityy-pin kannoilla, meningokokin mutanttikannoilla, joilla ei ole luokan 2/3 ulkomembraaniproteiineja ja/tai homologisil-20 la ja heterologisilla rekombinanttimikro-organismeilla, jotka ekspressoivat yhtä tai useampaa haluttua meningokokin > luokan 1 ulkomembraaniproteiinia ja/tai epitooppia, yli- : : tuottamalla vektoreita joko läsnä olevien avointen lukuraa- mien avulla tai ilman niitä ja/tai käsittelemällä lukuraa-25 me ja niin, että voidaan valmistaa fuusioproteiineja tai proteiineja, joilla on muutetut epitoopit.
Helposti saatavia villikantoja ovat: H44/76 (B:15:P1,7.16) (Holten, E., Norja, talletettu koodilla CBS 635-89); 187 (B:4:P1,7) (Etienne, J., Ranska); M1080 30 (B:1:Pl,1.7) (Frasch, C., USA); Swiss4 (B:4:P1,15) (Hir- schel, B., Sveitsi); B2106I (B:4:P1,2) (Berger, U. , Länsi- | Saksa); 395 (B:NT:Pl,9)(Jonsdottir, K., Islanti); M990 : (B:6:Pl,6) (Frasch, C., USA); 2996 (B:2b:Pl,2)RIVM, Alankomaat; M982 (B:9:Pl,9) (Frasch, C. , USA); S3446 (B:14:P1,6) ” 35 (Frasch, C., USA); H355 (B:15:P1,15) (Holten, E., Norja); :.*·ί 6557 (B: 17: Pl, 17) (Zollinger, W. , USA) ja B40 (A:4:P1,10) 113009 30 (Achtman, M., Länsi-Saksa). Esimerkki luokan 3 suhteen negatiivisesta mutantista on HIII5 (B:-:P1.16), joka on talletettu numerolla CBS 636.89.
Nämä kannat ympättiin -70 °C:ssa olevista aiemmin 5 kasvatetuista viljelmistä ravistelijapulloihin ja siirrettiin näistä 40, 150 tai 350 litran fermentoriviljelmiin.
Puolisynteettisen alustan koostumus oli seuraava: L-glutamiinihappoa 1,3 g/1, L-kysteiini.HC1:oa 0,02 g/1, Na2HP04.2H20:oa 10 g/1, KCl:ia 0,09 g/1, NaCl: ia 6 g/1, 10 NH4C1: ia 1,25 g/1, MgS04.7H20: ia 0,6 g/1, glukoosia 5 g/1, Fe(NC>3)3:ia 100 μΜ, hiivan dialysaattia.
Fermentorikasvatuksen aikana pH:ta ja P02:ta tarkkailtiin ja säädeltiin automaattisesti niin, että pH oli 7,0 - 7,2 ja ilmakyllästys oli 10 %. Solut kasvatettiin ai-15 kaiseen stationäärivaiheeseen, kerättiin sentrifugoimalla ja pestiin steriilillä 0,1 M NaCl-.lla ja niitä säilytettiin -20 °C:ssa tai jäädytyskuivattuina.
Esimerkki 2
Luokan 1 ulkomembraaniproteiinien puhdistus baktee-20 riviljelmästä Tämä viljely voidaan tehdä halutuilla villityyppi- jt; · kannoilla, meningokokkien mutanttikannoilla, joilta puuttuu : ; : luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinit ja/tai homologisilla ja ; ‘ ’j heterologisilla rekombinanttimikro-organismeilla, jotka * ; 25 ekspressoivat yhtä tai useampaa haluttua meningokokin luo- 1 · kan 1 ulkomembraaniproteiinia ja/tai epitooppia, ylituotta- > « ... maila vektoreita joko läsnä olevien avointen lukuraamien » f » • » · avulla tai ilman niitä ja/tai käsittelemällä lukuraameja niin, että voidaan valmistaa fuusioproteiineja tai prote- 9 > » ’ ’ 30 iineja, joilla on muutetut epitoopit.
Helposti saatavia villikantoja ovat: H44/76 t
;·· (B: 15 :P1,7.16) (Holten, E., Norja, talletettu koodilla CBS
: 635-89); 187 (B:4:P1,7) (Etienne, J. , Ranska); M1080 » · --— (B:1:Pl,1.7) (Frasch, C. , USA); Swiss4 (B:4:P1,15) (Hir- 1 · *’ 35 schel, B., Sveitsi); B2106I (B:4:P1,2) (Berger, U. , Länsi- ; Saksa); 395 (B:NT:P1,9) (Jonsdottir, K., Islanti); M990 113009 I 31 t j j (B:6: PI,6) (Frasch, C., USA); 2996 (B:2b:PI,2) RIVM, Alankomaat; M982 (B:9: PI,9) (Frasch, C., USA); S3446 (B:14: PI,6) (Frasch, C. , USA); H355 (B:15:P1,15) (Holten, E., Norja); 6557 (B:17:P1,17) (Zollinger, W. , USA) ja B40 5 (A:4:P1,10) (Achtman, M. , Länsi-Saksa). Esimerkki luokan 3 suhteen negatiivisesta mutantista on HIII5 (B:-:P1.16), joka on talletettu numerolla CBS 636.89.
Nämä kannat ympättiin -70 °C:ssa olevista aiemmin kasvatetuista viljelmistä ravistelijapulloihin ja siirret-10 tiin näistä 40, 150 tai 350 litran fermentoriviljelmiin.
Puolisynteettisen alustan koostumus oli seuraava: L-gluta-miinihappoa 1,3 g/1, L-kysteiini.HC1:oa 0,02 g/1, Na2HP04.2H20: ia 10 g/1, KCl: ia 0,09 g/1, NaClria 6 g/1, NH4CI: ia 1,25 g/1, MgS04-7H20: ia 0,6 g/1, glukoosia 5 g/1, 15 Fe(N03)3.-ia 100 μΜ, hiivan dialysaattia.
Fermentorikasvatuksen aikana pH:ta ja P02:ta tarkkailtiin ja säädeltiin automaattisesti niin, että pH oli 7,0 - 7,2 ja ilmakyllästys oli 10 %. Solut kasvatettiin aikaiseen stationäärivaiheeseen, kerättiin sentrifugoimalla 20 ja pestiin steriilillä 0,1 M NaCl:lla ja säilytettiin -20 °C:ssa tai jäädytyskuivattuna.
: Bakteerimassa uutettiin esimerkkiä varten 0,5 M
Hi* \
CaCl2, 1 % (w/v) Zwittergent 3-14 (Zw 3-14) ja 0,14 M NaCl, » t ♦ -’:*. pH 4,0 liuoksen avulla käyttäen 100 ml liuosta per gramma : 25 jäädytyskuivattua bakteerimassaa. Suspensiota sekoitettiin ♦ » ! yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja sitten sentrifu- i goitiin (1 tunti, 3 000 x g), jonka jälkeen supernatantti t > ’ * kerättiin steriilisti. Supernatanttiin lisättiin 20 % eta nolia (v/v) ja kun oli sekoitettu 30 minuuttia, tuote sent-30 rifugoitiin (30 minuuttia, 10 000 x g) , jonka jälkeen supernatantti kerättiin aseptisesti. Sitten supernatantti : konsentroitiin diasuodatuksella Amicon Hollow Fiber System ; (HID x 50, erotusraja 50 000) välineistön avulla ja CaCl2 » ja etanoli poistettiin. Konsentraatti laimennettiin 0,1 M 35 natriumasetaatti, 25 mM EDTA, 0,05 % Zw 3-14 liuoksella, jonka pH oli 6,0, alkuperäiseen tilavuuteen ja sitten kon- 32 11200 9 sentroitiin jälleen diasuodatuksella. Tämä menetelmä toistettiin viisi kertaa. Lopullisen konsentraatin pH säädettiin arvoon 4,0. Konsentraattiin lisättiin 20 % etanolia (v/v) ja kun oli sekoitettu 30 minuuttia, tuote sentrifu-5 goitiin (30 minuuttia, 10 000 x g). Kokonaisproteiinit puh-i distetaan pylväskromatografiän avulla detergentin, esimer kiksi Zw 3-14:n, läsnä ollessa. Usein sovelletaan gee-lisuodatusta Sephacryl S-300:lla yhtä hyvin kuin ioninvaihtoa DEAE Sepharose:11a (Beuvery et ai., (1986), yllä). Käy-10 tetty uutosmenetelmä, detergentit, pylväskromatografia ei ole ainoa sovellettavissa oleva menetelmä vaan toimii ainoastaan esimerkkinä eikä sitä ole pidettävä rajoittavana.
Esimerkki 3
Luokan 1 OMP-proteiinin peptidifragmenttien valmis-15 tus ja karakterisointi
Syanogenbromidia käytettiin valmistettaessa menin-gokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinien fragmentit. Puhdistettu luokan 1 ulkomembraaniproteiini tai luokan 1 ja 3 ulkomembraaniproteiinien seokset laitettiin 70 % (v/v) muu-20 rahaishappoon ja käsiteltiin 10-kertaisella ylimäärällä CNBrtia 16 tuntia huoneenlämpötilassa. CNBr ja muurahais-: happo poistettiin haihduttamalla ja korvattiin liuoksella, • M | ; jossa oli 0,2 M Tris.HCl:ia, 6 M ureaa, pH 7,2. Superna- ( i tantti esipuhdistettiin geelisuodatuksella Sephacryl .·, ; 25 S-200:lla ja seuraavaksi puhdistettiin TSK-2000 geelisuoda- • * « * ! tuksella HPLC:llä. Beuvery et ai., (1986) yllä).
• · ... CB2-fragmenttien entsymaattinen digestio ’** * Epitooppien edelleen hahmottamiseksi meningokokin CB2-fragmentti alistettiin digestiolle endoArg-C-, endoGlu-! 30 C- tai V-8-entsyymeillä ja syntyneet fragmentit eristettiin ...· HPLC: llä. Lyhyesti, 20 nmoolia CB2-fragmenttia, joka oli 1 ml:ssa 25 mM fosfaatti/0,1 M tris-puskuria (pH 8,0), joka sisälsi 3 M ureaa, digestoitiin 37 °C:ssa 0,2 nmoolilla en-• doArg-C-entsyymiä (1 mg/ml tislatussa vedessä) tai 0,22 : " 35 nmoolilla endoGlu-C-entsyymiä tai V-8-entsyymiä (1 mg/ml « * 113009 33 tislatussa vedessä) 14 - 18 tuntia. Tuloksena syntyneet di-gestoidut fragmentit erotettiin käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen Vydac-C4 pylvästä ja trifluorietikkahappo-asetonitriiligradienttia. EndoArg-C digestiosta eluoituneen 5 pääasiallisen huipun ilmeinen molekyylipaino oli 7 - 9 ki-lodaltonia, kun taas pääasiallisen huipun, joka havaittiin endoGlu-C tai V-8 käsittelyn jälkeen, ilmeinen molekyyli-paino oli 4-6 kilodaltonia. Eristettyjen huippujen osoitettiin seuraavaksi Western-blottauksella reagoivan mono-10 klonaalisen vasta-aineyhdistelmän kanssa (Adam I, 62-D12-8, MN5-C11G ja MN14-C116).
P1.16 epitooppi tuntuu olevan läsnä kannan H44/76 (B:15:P1,7.16) luokan 1 ulkomembraaniproteiinin C-pään CNBr-fragmentissa. Pl,16-epitoopin lisäkarakterisointi suo-15 ritettiin tekemällä 17 kilodaltonin (N-pää) ja 25 kilodal-tonin (C-pää) CNBr-fragmenteille aminohapposekvenssin määritys. C-pään 25 kilodaltonin fragmentti fragmentoitiin edelleen V8-proteaasilla, endoLys-C-, endoGlu-C- ja endo-Arg-C-entsyymeillä. Fragmentit, jotka olivat positiivisia 20 Pl,16 monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, sekvensoitiin niin pitkälle kuin mahdollista. Saadut sekvenssit ovat seu-: : ; raavia:
« « » I
: Koko proteiinin N-pää: .1: ·. DVSLYGEIKAGVEDRNYQLQLTEAQUAAGN.. .
• i » .·. : 25 25 kilodaltonin painoisen C-pään CNBr-fragmentin N-pää: » · * ']mt\ (M) PVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPIONSKSAYTPAYYTKDTNNN. . .
• » ... Fragmentit, jotka reagoivat Pl,16 monoklonaalisten • · · ’* * vasta-aineiden kanssa, eristettiin käyttäen fragmentaatiota V8-proteaasilla ja endoArg-C-entsyymillä, 7-9 kilodalto-: 30 nin ja 4 - 6 kilodaltonin painoisina, vastaavassa järjes- tyksessä. Niiden N-pään sekvenssit ovat seuraavat: ....: V8 7 - 9 kilodaltonin fragmentti: ....: FSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAYYTKDTN...
i · • Arg-C 4-6 kilodaltonin fragmentti: ί ’* 35 PVSVRYDSPEFSGFSGSVQFVPIQNSKSAYTPAYYTK. . .
• * » » a 34 113009
Esimerkki 4
Luokan 1 OMP-geenien DNA sekvenssit
Luokan 1 OMP-proteiinien aminohapposekvenssit pääteltiin meningokokin neljän eri alatyyppiä olevan luokan 1 5 OMP-proteiinin rakennegeenien nukleotidisekvenssistä. Neljän aminohapposekvenssin vertailu teki mahdolliseksi näiden epitooppien koostumuksen ja sijainnin ennustamisen. Lisäksi Pl,7- ja P1,16-epitoopit varmistettiin peptidisynteesin avulla ja osoittamalla vastaavien monoklonaalisten vasta-10 aineiden sitoutuminen.
Luokan 1 OMP-proteiinien geenit kloonattiin lambda gtll-.een (kuten ovat kuvanneet Pl,16:lle Barlow et ai., (1987) Infect. Immun. 55: 2743 - 2740) ja jatkokloonattiin M13 sekvenvointivektoreihin ja DNA sekvenssi määritettiin 15 standardeilla dideoksinukleotideilla tapahtuvilla ketjulo-petusmenetelmillä.
Täydelliset saadut aminohapposekvenssit Pl,16-, Pl,15-, Pl,7.16- ja Pl,2-proteiineille ovat seuraavat: 20 10 20 30 40 50
: Pl.16: DVSLYGEIKAGVEGRNIQAQLTEQPQVTNGVQGNQV--KVTKARSRIHTRIS
; **************** 1 2 3 4 *************
LL1 pl.15: DVSLYGEIRAGVEGRNFQLQLTEPP-SKSQP---QV—KVTKARSRXRTK1S
**************** 1 4 ************* * · ·
Pl.7.16: dvslvgeikagvegrnyqlqlteaq^anggasgqvkvtkvtkaksrirtris • · **************** 1 4 ************* • »
... Pl.2: DVSLYGEIKAGVEGRNIQLQLTEPLQNIQQPQ-------VTRARSRIRTKIS
! ! 2 **************** 1 4 ************* » I · · 2 ' 1 · 3 »»· 4 • »» > · * 1 · 113009 35 60 70 80 90 100 110
DFGSFIGFK.GSEDLGEGLRAVWQI.EQDVSVAGGGASQWGNRESFIGL.AGEFGTLRAGRVA
*************** ******************* ******* *************** dfgsfigfkgsedlgeglravwqleqdvsvagggatqwgnresfvglagefgtlragrva *************** ******************* ******* *************** dfgsfigfrgsedlgdglkavwqleqdvsvagggatqwgnresfiglagefgtlragrva + * *★★****★★★*★**·**** ***<***
DFGSFIGFKGSEDLGEGLKAVKQLEQDVSVAGGGATRMGNRESFVGLAGEFGTLRAGRVA
*************** ******************* ******* *************** 120 130 140 150 160 170
NQFDDASQAINPWDSNNDVASQLGIFKRHDDKPVSVHrDSFEFSGrSGSVQFVPAQNSKS
******* ** ****************************** ************ *****
NQFDDASQAIDPWDSNNDVASQLGIFKRHDDMPVSVRYDSPDFSGFSGSVQFVPIQNSKS
******* ** ****************************** ************ ***** i nqfddasqaidpvtdsnndvasqlgifkrhddkpvsvrydspefsgfsgsvqfvpiqnsks ******* ** ****************************** ************ ***** nofddaskaidpwdsnnvvasqlgifkrmddmpvsvrydspefsgfsgsvqfvpaqnsks kit,****. *ft * **» ***· *t *********** * ********* * ************ ***** 180 190 200 210 220 230 aykpayytkdtnnnltlvpawgkpgsdvyyaglnyknggfagnyafkyarhanvgrnaf ** ** ************************** ************* ** : : aytpahytrqnntdv-fvpawgkpgsdvyyaglnyknggfagsyafkyarhanvgrdaf • * * ** ************************** ************* ** • · ·
: AYTPAYYTKNTmTOLTLVPAWGKPGSDVYYAGLNYKNGGFAGNYAFKYARHANVGRNAF
* * * * ************************** ************* it it • · ·
’ ; AYTPAHFVQQTPQQPTLVPAWGKPGSDVTYAGLNTKNGGFAGNYAFKYAKHAKVGRDAF
’»’ ‘ · S *f* ,., ** ** ************************** ************* ** * « · • · 5 » » < · * a » !·. : io * »· 113009 36 240 250 260 270 280 290 elfligsatsdeakgtdplknbqvhrltggyeegglnlajlaaqldlsengdkaktknstt * *r ★ Hr ** * ★ **1*,*r*£1k*1t*1t**r**‘***r***4**r***r**1lr'**Ar**** * *******
ELFLLGS-TSDEAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGDKAKTKNSTT
**** ** ** (k*****************************·******* * *******
ELFLIGS-GSDQAKGTDPLKNHQVHRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENGD—KTKNSTT
I **** ** ** ************************************* * *******
\ ELFLLGS-GSDEAKGTDPLKNHQVffRLTGGYEEGGLNLALAAQLDLSENAD—KTKNSTT
***★ * * *·★ ********************^***************** * ******* 300 310 320 330 340 350
EIAATAS YRFGNAVTRISYAI3GFDLIERGKKGENTSYDQIIAGVDYDFSKRTSAIVSGAW
it*********************** ****************★************·****** EIAATASYKFGNAVPRISYAHGFDLIERGKKGENTSYDQI IAGVDYDFSKRTSAIVSGAW ********** ************** *********************************** EIAATASYRFGNAVPRISYAHGFDFIERGKKGENTSYDQI IAGVDYDFSKRTSAIVSGAW ************************ *********************************** eiaatasyrfgnavprisyabgfdfiergkkgentsydqiiagvdydfskrtsaivsgaw ************************ *********************************** 360 370
LKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF
*****)ft**************AA*
LKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF
************************
LKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF
************************
’ LKRNTGIGNYTQINAASVGLRHKF
» } · *******«W*************** ’· + Huomaa, että tämä aminohappo 15 sijaitsee tämän sekvens- ' K t * * 5 sin aminohapposekvenssien 184 ja 185 välissä.
V * Esimerkki 5
Luokan 1 OMP-geenien DNA sekvensointi N. meninaiti-di s -bakteerin eri seroalatyypeistä
Polymeraasiketjureaktiomenetelmää (PCR), jonka ovat '. 10 kuvanneet Mullis ja Faloona (Methods in Enzymol. 155: 335 - ’ 350, 1987) , käytettiin amplifioimaan luokan 1 OMP- proteiinin koko geeni ja kuvassa 1 esitetyn kaavion mukai-set spesifiset fragmentit.
:\j Alukkeet syntetisoitiin Applied Biosystems 380A DNA
• · 15 syntetisoijalla ja niitä käytettiin standardeissa 30 syklin 113009 37 pituisissa PCR amplifikaatioreaktioissa käyttäen Taq-polymeraasia Thermal Cycler -laitteessa (Perkin-Elmer Ce-tus, Norwalk, CT) valmistajan suositusten mukaisesti. Kunkin seroalatyypin genomisesta DNA valmisteesta muodostet-5 tiin noin 1 300, 900 ja 450 emäsparin pituiset amplifioidut fragmentit kuviossa 1 esitetyillä alukeyhdistelmillä. Käytetyillä alukkeilla oli seuraavat sekvenssit: PR1: (41 emästä pidennettynä universaalilla alukeella) TGT AAA ACG ACG GCC AGT TTG AAG ACG TAT CGG GRG TTT GC 10 PR2: (42 emästä pidennettynä universaalilla alukkeella) TGT AAA ACG ACG GCC AGT GGC GAA TTC GGT ACG CTG CGC GCC PR3: (42 emästä pidennettynä universaalilla alukkeella) TGT AAA ACG ACG GCC AGT CAT CAG GTA CAC CGC CTG ACG GGC PR4: (40 emästä pidennettynä universaalilla alukkeella) 15 TGT AAA ACG ACG GCC AGT GCA GAT TGG CAG TCA GAT TGC A PR5 : (40 emästä pidennettynä universaalilla alukkeella) TGT AAA ACG ACG GCC AGT GGG ATC GGT ACC TTT GGC TTG A PR6: (50 emästä pidennettynä universaalilla alukkeella) TGT AAA ACG ACG GCC AGT AAC TGA TTC GCA ACG CGA CCG G 20 FWD: (24 emästä) TTG AAG GAC GTA TCG GGT GTT TCG : : REV: (23 emästä) * » i »
: GCA GAT TGG CAG TCA GAT TGC TT
. Ylimäärä yksijuosteista templaattia sekvensointia ,· : 25 varten syntetisoitiin "asymmetrisellä PCR" amplifikaatiolla t käyttäen 100-kertaista ylimäärää aluketta, jossa oli 18 , . emäksen pidennys 5'-päässä verrattuna universaaleihin fluo- ' resoiviin sekvensointialukkeisiin, joita käytettiin Model 370A Automated DNA Sequencer -laitteessa (Applied Biosys- ' ·’ 30 terns, Foster City, CA) . Taq-polymeraasia käytettiin stan- ·,,,· dardissa dideoksinukleotideillä tapahtuvassa ketjulopetus- » sekvensointireaktiossa käyttäen PCRrllä muodostettuja yksi-juosteisia luokan 1 geenin fragmentteja templaatteina. Saa- » · dut geenialueiden sekvenssit kannoille H44/76 (Pl,7.16), : 35 M1080 (Pl.1,7), H355 (P1.15), 6940 (P1.6), 6557 (P1.14), » · 870227 (P1.10) ja B40 (P1.10) on esitetty kuvioissa 2 ja 3.
113009
Esimerkki 6
Luokan 1 OMP-proteiinialatyypin epitooppien aminohapposekvenssien varmistus Näistä luokan 1 OMP-geenien geenisekvensseistä, ; 5 jotka varmistettiin suoralla sekvensoinnilla pääteltiin, että sekvenssit, jotka vastaavat P1.16:n aminohappoja 24 -34 ja 176 - 187, vaihtelevat merkittävästi neljässä luokan I 1 OMP-sekvenssissä. Näiden kohtien N-pään tai C-pään puo lella olevien kolmen aminohapposekvenssin mahdollista si-10 säilyttämistä näihin epitooppeihin tulisi myös harkita epi-toopin stabiliteetin maksimaaliseksi saavuttamiseksi ja luonnollisessa proteiinisekvenssissä olevien odottamattomien insertioiden tai deleetioiden vuoksi. Lisäksi muiden luokan 1 OMP-proteiinien DNA- ja aminohapposekvenssejä tu-15 lisi verrata P1.7,16:n sekvenssiin maksimaalista vertailua ja epitooppien ennustamista varten. Ensimmäistä variaabelin alueen epitooppia ja toista variaabelin alueen epitooppia kutsutaan VRl:ksi ja VR2:ksi, vastaavassa järjestyksessä. Nämä alueet koodittavat alatyyppiepitooppeja, joka vahvis-20 tettiin peptidisynteesin avulla ja antamalla peptidien reagoida P1.2-, P1.7-, P1.15- ja P1.16-spesifisten monoklonaa- t * • · | listen vasta-aineiden kanssa.
: Valmistettiin täydellinen sarja päällekkäin meneviä ; h dekapeptidejä viiden aminohapon porrastuksin käyttäen P1.16 25 proteiinin sekvenssiä. Anti-P1.16 monoklonaalinen vasta-aine reagoi P1.16:n dekapeptidin YYTKDTNNNL kanssa odote- > · ... tusti eikä minkään muun dekapeptidin kanssa (kuvio 4).
• · Päällekkäin menevistä dekapeptideistä, joilla oli yksi (1) aminohapposekvenssin siirros kantojen H44/76 • ·’’ 30 (Pl.7,16), MC50 (P1.16) ja MC51 (P1.15) luokan 1 OMP- t proteiinin alueella 24 - 34 ja 176 - 187, useampi kuin yksi >;··| peptidi reagoi alatyyppispesifisen monoklonaalisen vasta- aineen kanssa. Useimmissa tapauksissa yksi tai useampi näiden päällekkäin menevien peptidien ryhmästä reagoi alatyyp- » · : “ 35 pispesifisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa vahvemmin * » » · *. *: kuin muut (kuvio 5) .
ό 9 113009 Näitä peptidejä kutsutaan VR1- ja VR2-epitoopeiksi. Kannassa Pl.7,16, jossa sekvenssi YYTKNTNNNL on läsnä, muutoksella D:stä Ntksi tähteen 180 kohdalla vaikuttaa jonkin verran vasta-aineen sitoutumista alentavasti. Sekvenssi 5 HYTRQNNTDFV P1.15:ssä on suhteessa samassa kohdassa proteiinia kuin P1.16:n epitooppi ja on vastuussa sitoutumisesta anti-P1.15 monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Sekvenssillä AQAANGGASG on jonkin verran sitoutumista ja 1 - 3 aminohappoa alavirtaan olevilla peptideillä on paljon suurempi si-10 toutuminen P1.7 monoklonaaliseen vasta-aineeseen. VR2:n sekvenssi HFVQQTPQSQP on vastuussa sitoutumisesta anti-P1.2 monoklonaaliseen vasta-aineeseen. On mahdollista, että sekvenssit QPQVTNGVQGN ja PPSKSQP P1.16 ja P1.15 proteiineissa myös edustavat epitooppeja.
15 Esimerkki 6B
Luokan 1 OMP-proteiinin vakioalueen epitoopin tunnistus
Valmistettiin pintasilmukoita muodostavat peptidit ja konjugoitiin tetanustoksoidiin. Automatisoitua Biolynx 20 4170 peptidisyntetisoijaa (Pharmacia/LKB) käytettiin jatku- vavirtauksisessa kiinteätaasisynteesissä seuraavalla poik-
» I
l keuksella. Synteesin viimeisessä syklissä liitettiin SAMA- : OPfp (0,5 mmoolia) (Drijfhout, J.W. (1989) tohtorin väitös- ;1·1; kirja, Leiden, Alankomaat) 1-hydroksibentsotriatsolin (0,5 .·, ; 25 mmoolia) läsnä ollessa 30 minuutin ajan käyttäen standardia menetelmää jättäen pois piperidiinikäsittelyn (nimittäin "Fmoc-deblokkausvaiheen", joka tässä tapauksessa aiheuttai-' si epätoivottavan S-deasetylaation). Näitä nimitetään SAMA- peptideiksi.
30 Peptidit ja niiden TT:hen konjugoitujen pinta- alueiden sijainnit ovat seuraavat: II1 » · $ · · · · • 1 · • · 40 113 0 0 9
Nimi Peptidi Alue r.„ P1.16, silmukka 4
LBV 017 XGGYYTKDTNNNL
Ote 24 33 XGGAQAANGGASG Pl-7, silmukka 1 276 291 024 XGGLSENGDAAKTKNSTTE P1.16, silmukka 6 , 245 0Zt>a XGGNAFELFLIGSATSDEAKG P1.16, silmukka 5 223 0ZbD XANVGRNAFELFLIGSATSDEAAG P1.16, silmukka 5 124 137 026 XGGDSNNDVASOLQIFK P1.16, silmukka 3 027 XADLNTDAERVAVHTAKAEPV Luokka 2, silmukka 5 : : 329 , 028a XGGGKKGENTSYDQ Luokka 1, silmukka 7 :·:! ’ ' 028b XGGERGKKGENTSYDQ Luokka 1, silmukka 7 • » i • · » Γ*'.* XGGVKEAGTYXAQGGKSKTATQ Luokka 2, silmukka 1 * · 78 90 030 XGGWSVAEGGASQVGN pi.16/ silmukka 2 » » * * * • » 5 • · • # · » * » • · i f 4i 113009
Nimi Peptidi Alue 352 366 031 XRRNTG1GNYTQINAA PI.16, silmukka 8 16 34 132 XGGNIQAQLTEQPQVTNGVQGN PI.16, silmukka 1 SAMA-peptidien konjugointi tetanustoksoidiin suoritettiin seuraavasti. DMF-.ssä oleva N-sukkinimidyyli-bromiasetaattiliuos (4,7 mg, 10 pmoolia) (100 μΐ) sekoitet-5 tiin 0,1 M natriumfosfaattipuskurissa, pH 7,8, olevan te-tanustoksoidiliuoksen (TT) (20 mg) (3,5 ml) kanssa. Yhden tunnin kuluttua 1,8 ml reaktioseosta alistettiin geeli suodatukselle käyttäen Sephadex PD-10 pylvästä (Pharmacia) , joka oli tasapainotettu 0,1 M natriumfosfaatissa, jo-10 ka sisälsi 5 mM EDTA (PE-puskuri) , pH 6,1. Bromiasetyloitu tetanustoksoidi eluoitiin samalla puskurilla ja kerättiin 3,5 mlrssa. Bromiasetyloitua tetanustoksoidiliuosta (1,2 ml) lisättiin SAMA-peptidiin (4,5 mg, 3 pmoolia) ja ilma poistettiin heliumilla. Seuraavaksi lisättiin 150 μΐ . 15 0,2 M hydroksyyliamiinia (PE-puskurissa, pH 6,1). 16 tunnin » t * ' kuluttua jäljellä olevat bromiasetyyliryhmät blokattiin li- » t ‘•k' säämällä 2-aminoetaanitiolihydrokloridia (4 pmoolia) pusku- t I * V ’ rissa, pH 6,1 (150 μΐ) . 16 tunnin lisäajanjakson jälkeen i » ; peptidi-TT-konjugaatti puhdistettiin geelisuodatuksella PD- 20 10 pylväässä käyttäen eluenttina PE-puskuria, pH 6,1. Sopi- :T: vat fraktiot yhdistettiin ja säilytettiin 4 °C:ssa.
Immunologisen aktiivisuuden määrittämiseksi injek-V. toitiin peptidi-TT konjugaattia 25 pg (kokonaisproteiinia) ··, per annos ihon alaisesti viikolla 0 ja 4 6 - 8 viikon ikäi-
25 siin etäissiitettyihin NIH-hiiriin. (Huomaa: rokotteita LBV
017-TT ja LBV 018-TT käytettiin määränä 10 pg kokonaispro- > teiinia/annos) . Seerumit kerättiin kuuden viikon kuluttua ;·, ensimmäisestä annoksesta ja määritettiin vasta-ainevasteen * · · ; suhteen ELISA-testillä (Beuvery, E.C. et ai., (1983) In- » · · 30 fect. and Immun. 40: 369 - 380). Seuraavat antigeenit pääl- 42 113009 lystettiin mikrotiitterikuoppiin: ulkomembraaniproteiini (OMP), puhdistettu luokan 1 OMP (Poolman, J.T. et ai., (1989) Infect, and Immun. 57: 1005) ja ei-konjugoidut pep-) tidit. Seerumien bakteereita tappava aktiivisuus (BC) mi- j 5 tattiin myös (Poolman, J.T. et ai., (1985) yllä).
j Tulokset on esitetty alla olevassa taulukossa 2.
Taulukko 2
Luokan Synt. Bakterio-
Rokote OMC 1 OMP peptidi sidinen testi 10 LBV 018-TT 1:900 (0.05)* 1:2700 ND <1:64 LBV 017-rr 1:900 (1) i;900 KD <1:64 LBV 024-TT 1:100 1:100 1:900 (bomol.) <1:64 LBV 025a-TT - 1:ιοο 1:2700 (homol.) <1:64 LBV 025b-TT 1:2700 (4) ii300 1:6100 (homol.) <1:64 LBV 026-TT - _ (homol.) <1:64 LBV 027-TT - 1:300 1:300 (hotnol.) <1:64 LBV 028a-TT 1:100 _ 1:2700 (bomol.) <1:64 LBV 028b-TT 1:100 1;10o 1:900 (homol.) <1:64 LBV 029-TT - 1:100 1:8100 (homol.) <1:64 LBV 030-TT - 1:100 1:2700 (bomol.) <1:64 LBV 031-TT - 1:100 - (homol.) <1:64 LBV 032-TT - 1:100 1:900 (homol.) <1:64 » » » ' • * ( « I t t k »
• · I
• t > I >
• i I
• · » ! , *numerot suluissa osoittavat O.D.-tason, jolla on • ’ 15 tämä tiitteri.
• · * » · • V ’ Nämä tulokset antavat olettaa, että N. meningitidis -bakteerin luokan 1 ja 2 OMP-proteiinien testatuista pinnan i 'vakiosilmukoista silmukka 5 tuntuu edustavan ainakin yhtä 20 aluetta, joka tuottaa vasta-aineita, jotka ristireagoivat ’. monien N. meningitidis -bakteerikantojen luokan 1 ja luokan , 2 OMP-proteiinien kanssa.
» i · 25 » · 43 113C09
Esimerkki 7
Meningokokkien epitooppeja ekspressoivien rekombi-nanttiflagelliinien rakentaminen
Meningokokin luokan 1 epitooppeja sisältävän hybri-| 5 diflagellan luomiseksi suunniteltiin sarja oligonukleotide- ja perustuen proteiinin primaarisekvenssitietoihin ja epi-I tooppikartoitustietoihin. Suunniteltiin kaksi oligonukle- otidia, jotka perustuivat ulkomembraaniproteiinin Pl.7.16 VR1- tai VR2-epitooppeihin niin, että ne voitiin kloonata 10 yhtenä tai useana kopiona S. muenchen -bakteerin flagellii-nin geenin kloonausalueelle. Translaation lopetussignaalit sisällytettiin oligonukleotidin ei-koodittavaan juosteeseen tehostamaan ekspressiolla tapahtuvaa kloonattujen insertti-en seulontaa.
15 Plasmidivektoria pPX1650, joka sisältää Salmonella meunchen -bakteerin (talletettu ATCC kokoelmaan numerolla 67685) flagelliinin rakennegeenin Hl-d koko koodittavan alueen ja promoottorialueet, modifioitiin niin, että siihen sisällytettiin useita ainutlaatuisia kloonauskohtia, jotka 20 olivat sopivia joko oligonukleotidien tai geenifragmenttien insertoimiseksi kussakin kolmessa flagelliinigeenin luku-.1 raamissa (kuvio 6) . Ensiksi pPX1650 digestoitiin EcoRV- • entsyymillä, joka katkaisee pPX1650 vektorin kahdesta koh- : dasta, jotka sijaitsevat 48 emäsparin päässä toisistaan, ja : , | 25 ligoitiin uudelleen itsensä kanssa kiinni saaden plasmidi .1 pPX1651, jolla on yksi ainoa EcoRV-entsyymin kloonauskohta ja joka johti 16 aminohapon deleetioon flagelliiniprote- * » iinissa. Plasmidi pPX1651 tunnistettiin seulomalla E. coli ,. rekombinantteja Western-blottauksilla käyttäen koettimena ä · ! 30 polyklonaalista vasta-ainetta, joka oli suunnattu Hl-d fla- * gelliinia vastaan. Plasmidi pPX1651 tunnistettiin useiden : ehdokkaiden joukosta, joilla oli pienemmät flagelliinit i kuin villityypin flagelliini (plasmidin 1650) ja varmistet tiin sekvensoimalla. Toiseksi pPX1651 digestoitiin BamHI- 11 ' , 35 entsyymillä ja ligoitiin uudelleen itsensä kanssa kiinni sen jälkeen, kun epätasaiset päät oli täytetty tasaisiksi 44 113009
Klenow-entsyymillä, poistaen näin yksi ainoa vektorin poly-linkkerialueella oleva BamHI-restriktioentsyymin tunnistus-kohta. Lopullisena vaiheena tuloksena syntynyt vektori di-gestoitiin EcoRV-entsyymillä ja insertoitiin seuraava oli-5 gonukleotidiliitin: 5’ ATG ATC GAT GGA TTC 3' I 3' TAG TAG CTA CCT AAG 5'
Ehdokkaat seulottiin juuri muodostettujen BamHI-kohtien suhteen ja useita ehdokkaita, joilla oli BamHI-10 kohdat, seulottiin liittimen orientaation suhteen käyttäen kaksijuosteista DNA sekvensointimenetelmää. Yksi ehdokas, jolla oli liitin yllä kuvatussa orientaatiossa, säilytettiin nimellä pPX1647: 5' .... GAT ATC ATC GAT GGA TTC ATC ____
15 EcoRV Clal BamHI
Plasmidi pPX1647 (kuvio 7) digestoitiin BamHI-entsyymillä ja joko oligonukleotidit VRlrlle tai VR2:lle kloonattiin E. coli -soluihin. Haluttujen rekombinanttien seulonta suoritettiin digestoimalla nopealla plasmidieris-20 tyksellä saatu plasmidi DNA sopivilla määrittävillä re-striktioentsyymeillä ja seulonta ekspression suhteen ha-: * vainnoimalla hybridit1age11an alentunutta liikkuvuutta : SDS-PAGE geeleissä käyttäen koettimena flagellaspesifistä ; : antiseerumia (Hl-d). Useat tuloksena syntyneet kloonit oma- : · 25 sivat alentuneen liikkuvuuden SDS-PAGE geeleissä osoittaen .. j yhden tai useamman VR1- tai VR2-oligonukleotidin oikean in- sertion. Useita klooneja kustakin säilytettiin DNA sekven- • · sointianalyysiä varten. Kloonissa CB1-1 on kaksi VR1- ,, , oligonukleotidin kopiota insertoitunut peräkkäin ja kloo- ' · » » » 30 nissa CB1-4 on neljän oligonukleotidin insertio. Samalla * * ; ’ tavalla CB2 P sisälsi yhden insertin VR2-oligonukleotidia ' : ja CB2 W osoitti odotetun kolmen insertin olemassa olon.
* Klooni CB2 P sisälsi yhden emäsparin muutoksen, joka johti muutokseen Leu:sta Phe:ksi ekspressoidussa VR2 fuusioprote- • · · * , 35 iinissa eikä sitä säilytetty lisätutkimuksia varten. E. co li -bakteerissa olevien rekombinanttiflagelliinikloonien 113009 45 annettiin reagoida sellaisten monoklonaalisten vasta-aineiden (Abdillahi ja Poolman, Microbiol. Pathogenesis 4: 27 - 32, 1988; RIVM, Alankomaat) kanssa, joiden tiedetään reagoivan joko VR1 tai VR2 epitooppien kanssa. Monoklonaa-5 liset Adam-1 (P1.7) ja Mnl4-Cll-6 (P1.7) reagoivat sellaisen hybridiflagelliinin kanssa, joka sisältää 2 tai 4 peräkkäistä VR1 inserttiä, mutta eivät reagoi VR2:ta sisältävien kloonien kanssa. Molempien monoklonaalisten heikompi reaktio CBl-2:n kanssa kuin CBl-4:n kanssa johtuu luulta-10 vasti epitooppien tiheydestä. Samasta syystä monoklonaaliset 62 (P1.16) ja Mn5-cll-G (P1.16) reagoivat ainoastaan CB2 W:n kanssa, mutta eivät VRl-inserttien kanssa. Klooni CB2 P ei reagoi kummankaan VR2-vasta-aineen kanssa johtuen luultavasti siitä, että Leu on vaihtunut Phe-.ksi.
15 Kukin näistä klooneista transformoitiin aroA S.
dublin -kantaan (SL5927), jolla on TnlO insertio Hl-d lo-kuksessa, hybridiflagellan toiminnan tutkimiseksi. Kukin neljästä kloonista johti liikkuvan bakteerin olemassa oloon; transformanttien liikkuvuutta inhiboi vastaava mono-20 klonaalinen vasta-aine, sisältäen kloonin CB2 P, joka osoitti VR2 monoklonaalisen affiniteetin koskemattoman fla-:.· gellan epitooppiin. Tämä tulos osoittaa, että epitoopit ; ovat esillä solujen pinnalla ja vasta-aineen ulottuvissa.
Γ: Muodostettiin hybridiflagelliini, joka sisälsi sekä 25 VRl-että VR2-epitoopit, katkaisemalla joko CB1-2, CB1-4 tai CB2 W BamHI-entsyymillä ja kloonaamalla heterologinen epi-·. tooppi. Klooneissa CB12-7 ja CB12-10 on lukuraamissa oleva VR2 oligonukleotidin yhden kopion insertio joko 2 tai 4 pe-räkkäisen VRl-insertin takana, vastaavassa järjestyksessä; 30 kloonissa CB21-F on VR1 epitoopin yhden kopion insertio ;·’ kolmen VR2 peräkkäisen kopion takana. Kloonit CB12-7 ja CB12-10 tunnistetaan ainoastaan VR1 monoklonaalisella vas-• ta-aineella ja klooni CB21-F tunnistetaan ainoastaan VR2 7 monoklonaalisella. Nämä tulokset yhdessä DNA analyysin . 35 kanssa, joka paljasti ennustettujen sekvenssien olemassa ' * olon, osoitaa epitooppitiheyden olevan liian matala yhdis- 113009 46 tetyissä hybrideissä. Sellaisen hybridiflagelliinin muodostamiseksi, jolla on sekä VR1 että VR2 epitooppien kohonnut tiheys, klooni CB12-10 digestoitiin BamHI-entsyymillä ja insertoitiin VR2:ta koodittavat oligonukleotidit. Klooni 5 12-10-6 sisältää VR2 epitoopin kaksi peräkkäistä lisäin- serttiä johtaen hybridiflagelliinimolekyyliin, jossa neljää VR1:n peräkkäistä kopiota seuraa kolme VR2 kopiota. Kuten j kuvioissa 3a ja b on esitetty, kolmella hybridiflagelliini- rokotteen ehdokkaalla on odotetut molekyyliominaisuudet. 10 Flagelliini (pCBl x 4), joka sisältää neljä VR1 kopiota, reagoi anti-Hl-d (anti-flagelliini) ja anti-VRl monoklonaa-listen vasta-aineiden kanssa, mutta ei anti-VR2 monoklonaa-listen vasta-aineiden kanssa; flagelliini (pCB2-W), joka sisältää VR2:n kolme peräkkäistä kopiota, reagoi anti-Hl-d 15 ja anti-VR2 vasta-aineiden kanssa, mutta ei anti-VRl:n kanssa; yhdistetty hybridi, joka sisältää VR1 kopioita ja 3 VR2 kopiota, reagoi sekä anti-VRl että anti-VR2 monoklonaa-listen vasta-aineiden kanssa. Yhdistetty hybridi sai aikaan liikkuvuuden, kun se laitettiin sisään liikkumattomaan S. 20 dublin-vastaanottajakantaan.
Alayksikkörokotteessa päämääränä on saada sopivia • ; · alkurokotekandidaatteja suurina määrinä ja erittäin puhtai- na. Sopiva rokotekandidaatti voidaan valita yllä kuvatun tyyppisistä rakenteista, jotka perustuvat reaktioon mono-: 25 klonaalisten vasta-aineiden kanssa ja flagellan toimintaan liikkumattomissa Salmonella-isäntäkannoissa. Alayksikköro- , *, kotteen ei ehkä tarvitse säilyttää kaikkia emoflagelliinin * · toiminnallisia kykyjä, mutta sen tulisi säilyttää ainakin , , sijaintinsa solun pinnassa puhdistustarkoituksia varten.
30 Useita meningokokin flagelliinialayksikkörokotteita välit- * tiin yllä kuvatuista hybridimolekyyleistä perustuen niiden • reaktioon monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa ja niiden j oletettuun sijaintiin pinnalla, joka oletus perustui bak teerien liikkuvuuden aikaan saamiseen. Kolme flagelliiniro- *’ 35 kotekandidaattia sisälsivät joko VRl:n neljä peräkkäistä "> inserttiä, VR2:n kolme peräkkäistä inserttiä tai 4 VRl-in- 47 113009 serttiä, joita seurasi 3 VR2-inserttiä. Koska flagelliini on Salmonella-bakteerin pääasiallinen proteiini, on mahdollista helposti puhdistaa riittävästi materiaalia rokotetut-kimuksia varten käyttäen menetelmiä, jotka ovat vakiintu-5 neet flagellan puhdistukseen (Logan et ai., J. Bacteriol. 169: 5072 - 5077, 1987).
Esimerkki 8
Rekombinanttif lagelliinimolekyylien. esipuhdistus
Kolme hybridiflagelliinirokotekandidaattia ja vil-10 lityyppi (saatu plasmidista pPX1650) ympättiin neljän litran väliseinällisiin Fernbach-pulloihin, jotka sisälsivät yhden litran LB-lihalientä. Bakteeriviljelmiä inkuboitiin 37 °C:Ssa ravistellen (200 kierrosta minuutissa) 22 - 24 tuntia. Näissä viljelyolosuhteissa suurin osa flagelloista 15 irtosi bakteerisolujen pinnasta ja tulivat kasvatusalustan supernatanttiin. Jotta saatiin riittävästi materiaalia, flagellat eristettiin 6-8 litrasta viljelyalustaa. Jotta saatiin puhdistettuja flagelliinivalmisteita rokotetutki-muksia varten, flagellafilamentit kerättiin bakteeriviljel-20 mien supernatanteista seuraavalla menetelmällä: vilje- lysupernatanttiin lisättiin ammoniumsulfaattia niin, että ; lopullinen liuos oli 50 % kyllästetty; liuosta sekoitettiin : varovasti 4 °C:ssa useita tunteja ja saostunut materiaali kerättiin sentrifugoimalla GSA-roottorissa 5 000 kierrosta 25 minuutissa 30 minuuttia. Kerätty ammoniumsulfaatilla saos- • t tettu materiaali liuotettiin uudelleen PBS:ään dialysoi-tiin PBS:ää vastaan 4 °C:ssa 12 - 15 tuntia. Dialysoitu materiaali alistettiin korkeanopeuksiselle sentrifugaatiolle .. . 100 000 x g yhden tunnin ajaksi SW-27 roottorissa flagella- • · · 30 filamenttien pelletoimiseksi. Pelletoitu materiaali, joka i « ’·;·* koostui pääasiassa flagelliinista, alistettiin lisäpuhdis- Ί”: tukselle seuraavalla menetelmällä.
* » 48 113009
Esimerkki 9
Rekombinantt i f1age11i ini en HPLC-puhdis tus
Erittäin puhtaiden flagelliinien valmistamiseksi rakenteita ekspressoivia Salmonella-bakteereja, erikoisesti 5 kloonia pCB12-10-6, kasvatettiin, kuten yllä on kuvattu ja solut pelletoitiin 10 000 x g. Sitten viljelmän superna-tantti saostettiin 50 % ammoniumsulfaatilla, sentrifugoi-tiinlOOOOxgja suspendoitiin uudelleen 30 ml-.aan PBS:ää. Uudelleen suspendoitu pelletti dialysoitiin 10 mM 10 Tris-puskuria (pH 8,0), joka sisälsi 6 M ureaa, 1 mM PMSF:ää, 2 mM NEM:iä ja 5 mM EDTA:a, vastaan yli yön 4 °C:ssa. Sitten dialysoitu materiaali ajettiin DEAE Sepha-rose minipylväiden läpi (3,0 ml tilavuus, 4,0 ml eluenttia kuhunkin). Pylväät eluoitiin (5 kertaa) 50 mM NaCl:lla, jo-15 ka oli 10 mM Tris-puskurissa (pH 8,0), joka sisälsi 6 M ureaa, ja sitten 1 M NaCl-.lla, joka oli 10 mM Tris-puskurissa (pH 8,0), joka sisälsi 6 M ureaa. Neljä ensim-| mäistä eluutiokeräystä (20 ml) 50 mM NaCl.-lla yhdistettiin ja dialysoitiin yhtä litraa vastaan 10 mM asetaattipuskuria 20 (pH 4,0) 6 M ureassa huoneenlämpötilassa. Dialysoidut fraktiot ladattiin sitten TSK SP PW kationinvaihto HPLC-; pylvääseen (75 mm x 300 mm) . Pylväs eluoitiin liikkuvalla 10 mM asetaattifaasilla (pH 4,0), joka sisälsi 6 M ureaa.
: Suoritettiin 0 - 300 mM NaCl gradientti 10 mM asetaatissa 25 (pH 4,0), joka sisälsi 6 M ureaa, 5-30 minuutin ajan. 30 minuutin kuluttua gradientti muuttui 300 mM NaCl:sta 1 M « *. NaCl:ksi 10 mM asetaatissa, joka sisälsi 6 M ureaa, seuraa- van 5 minuutin ajaksi. Flagelliinirakenne kerättiin noin 24 , , minuutin kohdalla, joka vastaa noin 200 mM NaCl-.ia. Fraktio 30 dialysoitiin PBS:ää vastaan ja materiaalin puhtausmääritys suoritettiin Western-blottauksilla käyttäen anti-! flagelliini vasta-ainetta. Edustavat HPLC analyysit ja Ί SDS-PAGE esitetään kuvioissa 8 ja 9, vastaavassa järjestyk- ' sessä.
> i * « 113009
Esimerkki 10
Meningokokin flagelliiniglykokonjugaatin valmistus
Ryhmän C meningokokin kapselipolysakkaridi (GCM CPS: erä numero 86 NM 01) valmistettiin oleellisesti, kuten 5 ovat kuvanneet Bundle et ai., J. Biol. Chem. 249: 4797 - 4801, 1974).
Neisseria meningitidis -kanta Cll saatiin Walter Reed Army Institute1sta (Washington, DC). Kantaa esiviljel-tiin kahdesti lampaan veriagarmaljoilla, sitten käytettiin 10 nestemäisen siemenviljelyalustan ymppäykseen (Neisseria -bakteerin kemiallisesti määritelty alusta, NCDM, Kenney et ai., Bull. W.H.O. 3_7: 469 - 473, 1967). Lopuksi fermento- rissa oleva 40 litraa nestemäistä alustaa (NDCM) ympättiin nestemäisellä esiviljelmällä. Kannan puhtaus tarkistettiin 15 kussakin vaiheessa. Sentrifugaation jälkeen supernatantti saostettiin lisäämällä Cetavlon'ia 0,1 % loppukonsentraati-oksi ja liukenematon kompleksi liuotettiin uudelleen kylmään 1 M kalsiumkloridiin (CaCl2) (Gotschlich et ai., J. Exp. Med. 129: 1349 - 1365, 1969) . Lisättiin etanolia 20 (96 %) 25 % (v/v) loppukonsentraatioksi. Tunnin kuluttua suspensio sentrifugoitiin (1 tunti, 50 000 x g) , superna-; ; · tantti kerättiin ja sen etanolikonsentraatio kohotettiin : / 80 %:iin (v/v). Tunnin kuluttua sentrifugaatio (20 minuut tia, 5 000 x g) antoi saostuman, joka pestiin peräkkäin ab- • 25 soluttisella etanolilla, asetonilla ja dietyylieetterillä : ja sitten kuivattiin tyhjiökuivaajassa fosforipentoksidin , , (P2O5) yllä vakiopainoon. Tämä raaka CPS säilytettiin -20 °C:ssa.
Puhtaamman valmisteen saamiseksi CPS liuotettiin 30 sitten natriumasetaattipuskuriin (kyllästetyn liuoksen 1:10 laimennos, pH 7,0) ja uutettiin neljä kertaa kuumalla feno-: lilla (Westphal et ai., Z. Naturforsch. 7b: 148 - 155, • 1952). Kun yhdistettyjä vasifaaseja oli dialysoitu 0,1 M CaCl2:ia vastaan, jota seurasi sentrifugaatio (3-5 tun- * 1 · t 35 tia, 100 000 x g), suoritettiin lopullinen etanolisaostus '· kirkkaalle supernatant il le ja tuloksena syntynyt saostuma 113009 50 pestiin orgaanisilla liuottimilla ja kuivattiin, kuten yllä on kuvattu. Puhdas CPS säilytettiin sitten -20 °C:ssa.
Kussakin puhdistusmenetelmän vaiheessa CPS analysoitiin karbohydraatti-N-asetyylineuramiinihappo- (NANA) 5 (Svennerhold, Biochim. Biophys. Acta 24: 604, 1957), O-asetyyli- (Hestrin, J. Biol. Chem. 180: 249, 1949) ja proteiinisisällön (260 nm tunnistus) suhteen ja sen mole-kyylipaino tarkastettiin geelisuodatuksella.
Samanaikaisesti polymerisoitiin ryhmän C meningoko-10 kin kapselipolysakkaridi (GCM CPS) ja aktivoitiin natrium-periodaattihapetuksella (NaI04) vesipohjaisessa puskurissa (Anderson et ai., J. Immunol. 137: 1181 - 1186, 1986; Eby et ai., Pediat. Res. 20: 308A, 1986; Anderson et ai., J.
Pediatr. 111(5): 644 - 650, 1987; Anderson, US-patentti 15 4 762 713, 1988). Reaktiota tarkkailtiin korkean suoritus kyvyn omaavalla geeliläpäisykromatografiällä (HPGPC) vesipohjaisessa eluentissa käyttäen ultravioletti-(UV) ja tait-toindeksitunnistusta (Rl). Reaktio lopetettiin ja aktivoiduista oligosakkarideista (GCM OS) poistettiin suolat 20 matalapainegeeliläpäisyllä (GCP) vedessä ja sitten lyofili-soitiin. Sitten valmistettiin liuos veteen ja sen jälkeen • · jäädytettiin väliaikaista säilytystä varten. GCM OS ja fla- : : gelliini pCB12-10-6 sekoitettiin vesipohjaiseen neutraaliin puskuriin ja konjugointi aloitettiin lisäämällä natriumsy-'» 25 aaniboorihydridiä (NaBH3CN) (Anderson, US-patentti , 4 762 713, 1988; US-patentti 4 673 574, 1987; US-patentti .·, 4761283, 1988). Reaktiota suoritettiin viisi vuorokautta ♦ · samalla tarkkaillen HPGPC:llä. Lopulta se lopetettiin dia-,,, lyysi/konsentroinnilla sentrifuugikonsentraattoreissa. Lo-
I I
\ 30 pullista valmistetta säilytettiin kylmässä trimerosaalin i » ·> läsnä ollessa bakteerikasvun ehkäisemiseksi. Tuloksena syn- ;“I tynyt glykokonjugaatti ei ainoastaan anna keinoa ekspres- ·;·· soitujen meningokokin VR1- ja VR2-epitooppien tuomiseksi immuunisysteemiin vaan myös toimii kantajamolekyylinä me- ·_ 35 ningokokkien oligosakkaridille.
* » · * * t
I I
113009 51
Konjugaatin valmistuksessa käytettiin seuraavia olosuhteita. Puhdistettu flagelliini pCB12-10-6 liuotettiin 15 % sakkaroosiin (3,5 mg/ml) ja sitten säilytettiin -20 °C:ssa. GCM CPS (9,7 mg; lopullinen konsentraatio 5 5 mg/ml) hapetettiin 100 mM:ssa NaI04: ia 0,05 M natriumfos-
faattipuskurissa (pH 6,2 - 6,5) huoneenlämpötilassa pimeässä sekoittaen. Otettiin pienet määrät (100 μΐ) säännöllisin väliajoin, reaktio lopetettiin lisäämällä etyleeniglykolia (10 μΐ) ja analyysi suoritettiin HPGPC:llä Waters (Milford, 10 MA) Ultrahydrogel™ 250 + 120 pylväissä (2 pylvästä liitettynä; 2 x 300 mm x 7,8 mm) 0,2 M fosfaatti-suolaliuos-puskurissa (PBS; 0,2 M natriumfosfaatti, 0,9 % NaCl, pH
7,8) virtausnopeudella 0,8 ml/minuutissa käyttäen UV (206 nm) ja Rl-tunnistusta. 2 tunnin ja 30 minuutin kulut-15 tua reaktio lopetettiin lisäämällä etyleeniglykolia (1/10 reaktiotilavuudesta) ja GCM 0S:sta poistettiin suolat GPC:llä Bio-Rad (Richmond, CA) Bio-GelR P-2:lla (200 -400 mesh, 30 cm x 1,5 cm) vedessä virtausnopeudella noin 18 ml/tunti. Kerättiin fraktiot (1,2 ml) ja analysoitiin ne 20 hiilihydraatti-N-asetyylineuramiinihapon (NANA) (Barry et ai., J. Gen. Microbiol. 29: 335 - 352, 1962) ja aldehydien * (Porro et ai., Anal. Biochem. 118: 301 - 306, 1981) läsnä olon suhteen. Positiiviset fraktiot yhdistettiin ja lyofi-lisoitiin. Sitten GCM OS (4,7 mg), joista suolat oli pois-25 tettu, liuotettiin veteen (10 mg/ml) ja jäädytettiin -20 °C:ssa.
,··,·, Sekä GCM OS ja pCB12-10-6 liuokset analysoitiin * * t HPGPC:llä (UV 206 ja 280 nm:llä, vastaavassa järjestykses-, , sä) ennen jäädyttämistä ja ennen konjugointia. Säilytyksen 30 aikana ei tapahtunut yhtään hajoamista, jonka varmisti eluutioprofiilien täydellinen samankaltaisuus.
’*: GCM OS (2 mg; lopullinen konsentraatio 2,6 mg/ml) ·;"( ja flagelliini pCB12-10-6 (2,3 mg; lopullinen konsentraatio 3 mg/ml) sekoitettiin polypropyleeniputkessa 0,4 M natrium- • ’ 35 fosfaattipuskurissa (pH 7,0) ja lisättiin NaBH3CN:ää i * t ’· "· (12 Mmoolia) konjugaation aloittamiseksi (Anderson, 113009 52 US-patentti 4 762 713, 1988; US-patentti 4 673 574; US-patentti 4 761 283). Reaktioseos jätettiin yhdeksi vuorokaudeksi huoneenlämpötilaan, sitten 4 vuorokaudeksi 35 °C:seen ilman sekoitusta. Reaktiota tarkkailtiin 5 HPGPC:llä (UV 280 nm) eri vaiheissa ja lopulta lopetettiin dialyysi/konsentraatiolla mikrokonsentraattoreissa. Lopullinen valmiste analysoitiin NANA:n (Barry et ai., J. Gen. Microbiol. 29: 335 - 353, 1962) (0,09 mg konsentraationa 0,12 mg/ml) ja proteiinin (Lowry et ai., J. Biol. Chem. 10 193: 265 - 275, 1951) (1,12 mg konsentraationa 1,45 mg/ml) määrän suhteen. Sitten se säilytettiin 4 °C:ssa trimerosaa-lin läsnä ollessa (0,01 % w/v) bakteerikasvun ehkäisemiseksi .
Konjugaattivalmiste tarkistettiin myös SDS-PAGE-15 (hopeanitraattivärjäys) ja Western-blot-analyyseillä. Geelissä oli havaittavissa useita suurimolekyylipainoisia rintamia puhtaan pCB12-10-6 rintaman yläpuolella ja lähellä ! tiivistysgeelin kaivoa, jälkimmäisen ollessa todiste siitä, että konjugaation aikana tapahtui ristisitoutumista. Wes-20 tern-blot-analyysit osoittivat, että kukin rintama reagoi käytettyjen antiseerumeiden (anti-GCM, anti-VRl ja anti- • f i.i · VR2) kanssa todistaen konjugaattisidosten kovalenttisen ί : : luonteen.
* · »
Esimerkki 11 25 Meningokokin peptidien konjugaatio CRM:ään ja härän » » seerumialbumiiniin a ·
Peptidit, joita nimitettiin M20:ksi ja M21:ksi, a · a jotka tuotettiin ABI mallin peptidisyntetisoijalla kiinteän ,, , faasin synteesillä käyttäen t-Boc kemiaa, kiinnitettiin • i · 30 CRMi97:ään (valmistettu, kuten on kuvannut Anderson, i » ‘y* US-patentti 4 762 713) käyttäen kaksitoimista ristisitovaa ainetta sulfosukkinimidyyli-4-jodiasetyyliaminobentsoaattia ·;··> (Sulfo SLAB; valmistaja Pierce) seuraten julkaistun mene- telmän modifikaatiota (Weltman, J.K. et ai., (1983) Bio-
• I
*_ ” 35 Techniques 1, 148 - 152) . Lyhyesti, CRM197 aktivoitiin sulfo • » · SIAB:lla, joka johti amidisidoksen muodostumiseen SIAB:n ja 113009 53 CRMi97:n aminoryhmien välille. Kun reagoimaton ristisitoja oli poistettu aktivoidusta CRMi97:stä geelisuodatuksella, peptidi (M20 tai M21), joka sisälsi kiinnityskäsivarren (osoitettu alleviivatuilla kirjaimilla) karboksipään kyste-5 iinitähteessä, sekoitettiin aktivoidun CRM:n kanssa ja in-kuboitiin huoneenlämpötilassa 2-4 tuntia. Reaktion jälkeen konjugoitu materiaali dialysoitiin huolellisesti PBS:ää vastaan 4 °C.-ssa.
Peptidin M20 (VR2 epitooppi) sekvenssi on seuraava: 10 H-Tyr-Tyr-Thr-Lys-Asp-Thr-Asn-Asn-Asn-Leu-Thr-Leu-Vai-Pro-Ala-Gly-Ala-Cys-OH
Peptidin M21 (VR1 epitooppi) sekvenssi on: H-Ala-Gln-Ala-Ala-Asn-Gly-Gly-Ala-Ser-Gly-Gln-Val-Lys-Ala-Gly-Ala-Cys-QH.
15 Konjugoidut materiaalit alistettiin SDS-PAGE:lie, siirrettiin PVDF-membraaneille (Immobilon, Millipore) ja annettiin reagoida spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka tunnistavat VR1 ja VR2 epitoopit. Kuvat 10a ja 10b esittävät M20- ja M21 CRMi97-konjugaattien 20 Western-blot-analyysit VR1- ja VR2-spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmää (Adam I, G2-D12-8 (P1.7), !:! MN5-C11-G (P1.16) jaMN14-Cll-6 (P1.7)) vastaan.
\ Vasta-aineresponssin määrittämiseksi M20- ja M21- : peptidiä vastaan enstyymivälitteisellä immuunitestimenetel- : 25 mällä valmistettiin BSA-konjugaatit käyttäen erilaista kak- ·· sitoimista ristisitovaa ainetta, N-sukkinimidyyli- bromiasetaattia, kuten ovat kuvanneet Bernatowicz ja Mat-sueda (Anal. Biochem. 155: 95 - 102 (1986)). Peptidin kova- ·, lenttinen sitoutuminen proteiiniin varmistettiin elektrofo- * · 30 reesilla ajettujen näytteiden Western-blottauksella, kuten on kuvattu CRMi97 konjugaateille.
: Esimerkki 12 I M20- ja H21-CRMi97-konjugaateissa säilynyt T- soluaktiivisuus ’ . 3 5 Sen määrittämiseksi, vaikuttaako VR1 ja VR2 epi- ‘ » 1 * · ’ ' tooppien konjugaatio CRMi97:ään haitallisesti CRMi97-prote- 113009 54 iinin T-solun tunnistukseen, suoritettiin T-solukasva-tustesti, kuten aiemmin ovat kuvanneet Bixler ja Atassi (Immunol. Commun. 12: 593, 1983). Lyhyesti, SJL/j hiiret immunisoitiin 50 μg:lla luonnollista CRM197-proteiinia, jo-5 ka oli emulsifioitu CFA:han. Seitsemän vuorokautta myöhemmin poistettiin imusolmukkeet, viljeltiin RPMI:ssä ja altistettiin eri konsentraatioille proteiineja (0,05 -; 100,0 μ9/ιη1) ja peptidejä. Kolmen vuorokauden inkubaation jälkeen viljelmät leimattiin (3H)-tymidiinillä 16 tuntia ja 10 sitten kerättiin laskua varten.
Taulukko 3 T-soluresponssit meningokokin peptidi-CRM197 - konjugaatte ja vastaan.
15
In vitro altistus Suurin havaittu (3H)-inkorporaatio _gq/ml_deltaCPM_gl
Difteriatoksoidi 5 27 510 57 CRM197 50 108 631 221 20 CRM197-tyhjä-konjugaatti 100 116 326 236 M21-CRM197 100 182 499 370 ; : M20-CRM197 10 89 972 183 : ,· CON A 1 34 316 70 : LPS 50 61 579 126 : 25 Tetanustoksoidi 10 515 2
Tausta (cpm) - 494 1 * · » ·
Kuten taulukossa 3 on esitetty, CRM197 vertailu CRMi97-tyhjä-konjugaattiin osoittaa, että konjugaatiomene- s · 30 telmä itsessään ei muuta proteiinin T-solutunnistusta. M20- » ja M21-CRMi97-konjugaattien indusoimat T-soluresponssit oli-vat oleellisesti samanlaisia tai suurempia kuin CRM197 it-’;·· sensä aikaan saamat responssit osoittaen, että peptidikon- jugaatio ei vaikuta haitallisesti CRM197 proteiinissa olevi- < » » . 35 en T-soluepitooppien tunnistukseen. Kontrollimateriaalien 1 1 t • · · B5 113009
Con A, LPS ja tetanustoksoidin responssit olivat sellaisia kuin oli odotettu.
Esimerkki 13
Konjugaatti- ja meningokokin rekombinantti b rokot-5 teiden immunogeenisyys
Valmistettiin rekombinanttiflagelliini, joka eks-pressoi meningokokin VR1- ja/tai VR2-epitooppeja, ja puhdistettiin, kuten on kuvattu esimerkeissä 7, 8 ja 9. Lisäk-I si syntetisoitiin synteettiset peptidit, jotka edustivat 10 meningokokin epitooppeja VR1 ja VR2, kiinnitettiin ne kova-lenttisesti kantajamolekyyliin CRMi97 ja puhdistettiin, kuten esimerkissä 12. Kustakin näistä materiaaleista formuloitiin rokotteet niin, että proteiinikonsentraatiot olivat 10 tai 100 Mg/ml kunkin komponentin osalta. Rokotekokoonpa-15 not sisälsivät myös alumiinifosfaattia 1 mg/ml tai, silloin kun mainittu, yhdistettiin Freund'in täydellisen adjuvantin kanssa tai ilman lisämateriaaleja.
Immunogeenisyyden määrittämiseksi immunisoitiin etäissiitetyt Swiss Webster hiiret lihaksen sisäisesti vii-20 koilla 0 ja 2 proteiinimäärällä 1 tai 10 ^g/annos. Seerumit kerättiin kahden viikon välein, yhdistettiin testausta var- • · ten ja seulottiin vasta-aineaktiivisuuden suhteen ELISA:11a '· : ulkomembraanikompleksia (OMC) , puhdistettua OMP-proteiinia ; : (P1.16), härän seerumialbumiiniin kiinnitettyä VR1 peptidiä j 25 (M21-BSA), BSA:han kiinnitettyä VR2 peptidiä (M20-BSA), > j villityypin flagelliinia ja CRM197 proteiinia vastaan. Kuu- , , den viikon aikana saaduilla seerumeilla suoritettujen ELI- SA-testien tulokset on esitetty taulukossa 4.
f > * 1 « »
t I
• a 1 I ’ » «'»it i a »IMI * · I t » » » ♦ t » * * ♦ 113C09 1 Taulukko 4 I Rekombinantti- tai CRM197-konjugaattirokotteiden, jotka sisältävät meningokokin Pl-16 OMP epitoopit VR1 ja VR2, immunogeenisyys
Annos ELISA tiitterit 4 viikkoa toisen tehosteannoksen jälkeen1 μς OMC P1.16 M21-BSA M20-BSA Flagelliini CRM
pPxl650 (villityypin kontrolliflagelliini)2
1 <150 <100 171 100 427,781 ND
10 <150 100 154 <100 468,385 ND
pCBl-4
1 532 4,376 4,525 ND 787,120 ND
10 2,034 12,387 17,565 ND 887,861 ND
pCB2-W
1 150 308 ND 501 263,143 ND
10 1,350 12,190 ND 5,476 1,493,216 ND
pCBl2-10-6
1 615 3,374 4,651 824 299,889 ND
10 1,423 3,666 3,882 2,253 497,622 ND
pCBl2-10-6 ilman alumiinifosfaattia
1 409 739 505 597 139,147 ND
10 450 1,533 817 1,611 358,033 ND
M20-CRM197 1 <150 <100 217 <100 ND 42.27 10 50 <100 150 <100 ND 95.31 M21-CRM197 1 68 249 10,494 100 ND 17.41 10 110 311 26,807 191 ND 20.92 , ; M20 ja M21 konjugaattien seos 1 50 100 40,000 187 ND 37.32 10 50 227 15,539 132 ND 184.27 OMP Pl.16
1 12,630 17,714 100 764 ND ND
10 23,178 67,565 162 3,276 ND ND
t pCBl-4 CFArssa
10 1,665 10,606 19,945 ND 1,841,852 ND
: pCB2-W CFA:ssa
i 10 1,157 6,869 ND 17,749 1,217,063 ND
1 Kaikki ennen verenottoa olevat arvot olivat testin herkkyysrajalla tai sen ; *’ alapuolella 1/100 laimennoksella 2 Kaikki rokotteet formuloitiin 1 mg/ml alumiinifosfaatilla paitsi silloin, kun on mainittu 57 113C09
Vaihtoehtoisesti eri rokotteita arvioitiin immuno-geenisyyden suhteen 6-8 viikon ikäisissä etäissiitetyis-sä NIH hiirissä. Hiiret immunisoitiin 100 pg:lla kokonais-proteiinia/annos ihon alaisesti viikoilla 0 ja 4 ja seeru-5 mit kerättiin viikolla 6. Seerumit testattiin ELISA-tes-tissä käyttäen esimerkissä 6 kuvattuja antigeenejä. Bakteereita tappava aktiivisuus mitattiin, kuten esimerkissä 6. Tulokset on esitetty taulukossa 5.
( ti- « k I » • I i k t · k I · * · t ‘ } » !
I I
ί t i « E « > I » 58 113CC9
•H
' "5 , ^ < 'f 'T
Φ Ή Ή \Λ 4/v \Λ \/> »n ιΛ 4J ίΛ 4J ^ „
H H H »H H H
^HO) V V V V V ν' V
Ή
-H
o. 8 X i i 2 i lit ^ ·· r-t
-P
G
>i
Ui
Q
O
in
LO
O
y g O O Q
3Λ O O O O O O
,q ^ I O O r-. I r-.
G H rH O' ro o) CO CD
rrt P ······ *· **
EH CU G
•P nj P Λί H 0 •H 3
-P GI
<
Ui
; : M
P1 Λ
w IA
«Λ CM
;:; *···ϊ ·,£ ·· M ·» * · * ! »H ·Ή *> fv t , * o> Φ • » O r-4 *-i a) Λ _·>·* f'- 2 E2 , -pcu-hOcmi ι <τ> Ο υ
* H I I
Μ3-ηό«ρ>λ x ο «ί • ο --ι ·η ·-< υ y υ 2 cm «μ
,,: « (¾ rH Οι Ö, Λ. £* Ο X X
113009 59
Rekombinanttiflagelliinit, jotka sisälsivät joko VR1:n, VR2:n tai sekä VRl:n että VR2:n sisältävän kasetin, olivat tehokkaita vasta-ainevasteen aikaan saamisessa, joka vaste ristireagoi puhdistetun P1.16:n ja vähemmässä määrin 5 OMC:n kanssa. Seerumit eläimistä, jotka oli immunisoitu 10 Mg:11a joko pCBl-4:ää tai pCB2-W:tä, indusoivat vasta-aineet, jotka sitoutuivat niiden vastaaviin peptidi-BSA konjugaatteihin kuin myöskin ristireagoivat P1.16:n ja OMC:n kanssa. Samanlaiset tulokset saatiin rakennetun 10 pCB12-10-6:n kanssa, joka sisältää molemmat meningokokin epitoopit. Lisäksi, kukin rakenne indusoi merkittävät anti-flagelliinitiitterit myöskin. Päinvastaisesti villityypin kontrollitlagelliini indusoi ainoastaan vasta-ainevasteen flagelliinia itseään vastaan. Seerumit, jotka oli kerätty 15 ennen immunisaatiota, eivät osoittaneet mitään olemassa olevaa vastetta tutkittavia materiaaleja vastaan.
Tulokset osoittavat myös edut, jotka saadaan formuloitaessa rekombinanttiflagelliinit alumiinilla tai muilla adjuvanteilla, kuten CFArlla. Rakenne pCB12-10-6 formuloi-20 tiin ilman alumiinifosfaatin lisäystä ja sen kanssa. Kuten taulukko 2 osoittaa, pCB12-10-6 yksinään kykeni indusoimaan vasta-ainevasteen, joka reagoi peptidikonjugaatin kanssa '> : kuin myöskin puhdistetun P1.16:n ja OMC:n kanssa. Vertail- ; taessa sama rakenne formuloituna alumiinin kanssa kykeni * 25 saamaan aikaan suuremman vasta-ainevasteen samalla annok- : sella. Samalla tavalla rekombinanttiflagelliinit pCBl-4 ja pCB2-W formuloitiin myös CFA:n kanssa. Jälleen havaittiin samanlaiset tai korkeammat vasta-ainetiitterit CFA.-n läsnä ,, » ollessa.
f » » 3 0 Meningokokin VR1- ja VR2-konjugaattien immuno- I | geeni syys tutkimusten tulokset on esitetty myös taulukossa *;'': 4. Sekä M20- että M21-CRMi97-konjugaatit yhtä hyvin kuin U"· seos, joka sisälsi samat määrät molempia konjugaatteja, ky- kenivät indusoimaan anti-CRMi97 vasteen kuin myöskin anti-\ \ 35 luokka 1 OMP vasteen.
• · 113009 60 ! Nämä esitulokset osoittavat, että kantajaan joko kemiallisesti konjugoidut tai geneettisesti fuusioidut luokan 1 OMP-proteiinin variaabelin alueen epitoopit saavat aikaan immuunivasteen. Voidaan valmistaa uusia epitooppi-5 kantajakonjugaatteja käyttäen standardeja menetelmiä immuunivasteen tehostamiseksi rokotetta kohtaan esimerkiksi käyttäen 1) suurempia epitooppeja, 2) peptidejä, joissa on ; useita epitooppitoistoja ja/tai 3) erilaisia kantajia.
Esimerkki 14 10 Meningokokki-ihmisen seerumialbumiinin glykokonju- gaatin valmistus GCM CPS depolymerisoitiin happohydrolyysillä ja saadut GCM OS: t aktivoitiin sen jälkeen NaI04-hapetuksella vesipohjaisessa puskurissa. Reaktioita tarkkailtiin 15 HPGPC:llä vesipohjaisessa eluentissa käyttäen UV- ja RI-tunnistusta. Reaktioista kustakin poistettiin sen jälkeen suolat GPC:llä vedessä. GCM OS:t ja ihmisen albumiini (HA) j sekoitettiin ja konjugoitiin oleellisesti, kuten on kuvattu ! esimerkissä 10 meningokokki-flagelliini glykokonjugaatille.
20 Lopullinen valmiste säilytettiin kylmässä trimerosaalin läsnä ollessa bakteerikasvun ehkäisemiseksi.
* t| · Konjugaatin valmistuksessa käytettiin seuraavia ' koeolosuhteita. Ihmisen albumiini (HA; SigmaR, St. Louis, MO) liuotettiin 15 % sakkaroosiin (10 mg(ml) ja sitten säi-25 lytettiin -2 0 °C:ssa. GCM CPS (erä numero 86 NM 01; 106 mg;
: lopullinen konsentraatio 10 mg/ml) hydrolysoitiin 0,1 N
HCl:ssa 50 °C:ssa sekoittaen. Otettiin eroon pieniä määriä (25 μΐ) säännöllisin väliajoin, reaktio lopetettiin lisää-,, , mällä natriumhydroksidia (NaOH) ja analyysi suoritettiin * ’’ 30 HPGPCrllä, kuten on kuvattu. 3 tunnin ja 40 minuutin kulut- * » '· * tua reaktio lopetettiin lisäämällä NaOH:ia ja GCM OS:stä *: * · · poistettiin suolat GPC:llä. Kerättiin fraktiot (1,2 ml) ja ... | analysoitiin ne, kuten on kuvattu aiemmin. Positiiviset ,,· fraktiot yhdistettiin ja lyofilisoitiin. GCM OS:t (89 mg), ’ 35 joista suolat oli poistettu, säilytettiin sitten
-20 °C:ssa. Aktivoidut OS:t valmistettiin hapettamalla GCM
61 113009 j OS: t (11,8 mg; lopullinen konsentraatio 5 mg(ml) 2 mM NalCV.lla 0,05 M natriumfosfaattipuskurissa (pH 6,2 -6,5) huoneenlämpötilassa pimeässä sekoittaen. Reaktio lopetettiin 30 minuutin kuluttua lisäämällä etyleeniglykolia.
5 HPGPC analyysit osoittivat, ettei aktivoinnin aikana tapahtunut yhtään OS:n molekyylipainon hajoamista. Sitten suoritettiin suolojen poisto ja kolorimetriset analyysit, kuten on kuvattu aiemmin yllä. Tuloksena syntyneet aktivoidut GCM OS:t (8,8 mg) liuotettiin veteen (10 mg(ml) ja jäädytettiin 10 -20 °C:ssa.
Sekä GCM OS- että HA-liuokset analysoitiin HPGPC:llä (UV 206 ja 280 nm, vastaavassa järjestyksessä) ennen jäädyttämistä ja ennen konjugointia. Säilytyksen aikana ei tapahtunut yhtään hajoamista, jonka varmisti eluu-15 tioprofiilien täydellinen samankaltaisuus.
GCM OS (6 mg; lopullinen konsentraatio 2,5 mg/ml) ja HA (12 mg; lopullinen konsentraatio 5 mg/ml) sekoitettiin polypropyleeniputkessa 0,4 M natriumfosfaattipuskuriin (pH 7,0) ja lisättiin NaBH3CN:ää (60 ^moolia) konjugaation 20 aloittamiseksi (Anderson, US-patentti 4 762 713, 1988; US-patentti 4 673 574, 1987; US-patentti 4 761 283, 1988) .
i ; Reaktioseos jätettiin yhdeksi vuorokaudeksi huoneeniämpöti- : : laan, sitten 4 vuorokaudeksi 35 °C:seen ilman sekoitusta.
; ; : Reaktiota tarkkailtiin HPGPCrllä (UV 280 nm) eri vaiheissa 25 ja lopulta lopetettiin dialyysi/konsentraatiolla mikrokon-sentraattoreissa. Lopullinen valmiste analysoitiin NANA:n (Barry et ai, J. Gen. Microbiol. 29: 335 - 51, 1962) (2,07 mg konsentraationa 0,86 mg/ml) ja proteiinin (Lowry .. , et ai., J. Biol. Chem. 193: 265 - 75, 1951) (9,51 mg kon- 30 sentraationa 3,96 mg/ml) määrän suhteen. Sitten se säily-tettiin 4 °C:ssa trimerosaalin (0,01 % w/v) läsnä ollessa I bakteerikasvun ehkäisemiseksi.
» > I
62 113009
Konjugaattivalmiste tarkistettiin myös SDS-PAGE-(hopeanitraattivärjäys) ja Western-blot-analyyseillä. Geelissä oli havaittavissa diffuusi rintama, joka peitti merkittävästi laajemman molekyylipainoalueen kuin puhdas HA.
5 Western-blot-analyysi osoitti, että tämä rintama reagoi käytetyn antiseerumin (anti-GCM) kanssa todistaen konju-gaattisidosten kovalenttisen luonteen.
Esimerkki 15
Meningokokin oligosakkaridi-rekombinanttiflagellii-10 nirokotteiden immunogeenisyys
Valmistettiin meningokokin oiigosakkaridi-rekombinanttif lagelliinirokote, kuten on kuvattu yllä ja formuloitiin niin, että proteiinia oli 100 μg/ml. Valmistettiin myös rokotekokoonpanot, jotka sisälsivät alumiinifosfaattia 15 (1 mg/ml) tai täydellisen Freund'in adjuvantin glykokonju- gaatin lisäksi.
Immunogeenisyyden määrittämiseksi etäissiitetyt Swiss Webster -hiiret immunisoitiin lihaksen sisäisesti 10 μg:lla proteiinia viikoilla 0 ja 2. Seerumit kerättiin 20 viikoilla 0, 2 ja sitten viikon välein 6 viikkoon asti. Keräyksen jälkeen seeruminäytteet testattiin vasta-aine-; aktiivisuuden suhteen ELISA:11a ihmisen seerumialbumiiniin konjugoidun meningokokin C oligosakkaridia, OMC:tä, ; P1.16:tta, CB1- ja CB2-BSA- konjugaatteja ja flagelliinia 25 vastaan.
MenC-CB12-10-6 glykokonjugaatti oli tehokas saamaan aikaan immuunivasteen, joka reagoi sekä oligosakkaridin että rekombinanttiflagelliinissa ekspressoituvien meningoko- .. . kin B OMP-epitooppien kanssa. Kuten taulukossa 5B on esi- * * ; 30 tetty, niinkin pienenä tutkimusaikana kuin kolme viikkoa, » > ’ ·’ hiirillä, jotka oli immunisoitu 1 ug:lla MenC-CB12-10-6 ; konjugaattia Freund1in täydellisessä adjuvantissa, oli tun- ·; * nistettava vasta-aine MenC-HSA:ta, OMP-proteiinia ja sekä CB1- että CB2-epitooppeja vastaan. Lisäksi, kaikki MenC-. 35 CB12-10-6 valmisteet, riippumatta adjuvantista, saivat ai- 63 113009 kaan vasta-ainevasteen MenC-HSA:ta vastaan, joka vaste oli suurempi kuin vaste, joka havaittiin immunisoitaessa MenC-CRM197:llä.
j i i > » » » » 64 113009 ]
0*1 I
X t I | V I I I o
H I I O
Ή I ! rH
> * I I
I II lv
! H I I I
» I, I r~ m vo m r- m | +1 r I 1. I Φ <Tl <P VD OtN I 5 ^ 1^ ,H l<»in r- rn m vo op DO Ι.ί m 1 o> G I * *· - - -- 2 Z Z Z I p >1 I Λ H I HVP ΜΙΛ 10 >1 I I If M r~ «Η rr> m | « I I m tn -r rs r-* *—t i+j c J ! p (D I I Id) 01 I < I Nin Wff no Oh I μ O' I in I mo r- -e* co ·—i p O o r— I p 2 I Λ1«β·\£> vo <N m <N Z2 h w § I I I - -- v - I £ e f M I r*t fN w-i mi S Ι·Η 01 I H | •H I jP U I I o g p o o) I os I I x
ω I^<|olT) mol vom o o I P
fj I p «Λ I vh m v fN fM P Q ooi'j o I :1 Ö I N« co fN VOH zz —* —i I >
X I p I I - - - V V I — rH
O I rl I into rH I e P I C ta I I G \ •h J m Π I ω S’
Lfl-H I μι I 00 V m Ό Ο ΓΟ Mil I -H
H I H Oh I O rH mm fN CO D O O O I 0) rH
0 I—I 1 E I VO VO fN <-H Ον NT 22 Ov VJ I P
ΛίΓ-ι ιοι- --I-F5
3 £ } · «» I £ -S
rH (Ö 1 I *N ·“< I c -P
o h I I I -μ (Π μη i < I I a c
eh Ί I wiocn in in r-o ui m ι P
iJ e I a I m \o vr H OvfN oo l 3 g c S I 1 I m o co -a· -τον o>w D ft I jj -n
<3 <d IOI--------Z2I+JO
: PI X I c I »Mil rH -J H V "vrco 10)(0 HH I ¢) I (S rH rH I £ ,_
P «Ö I s* I I o C
e ·π ! *· : h ' * 0 11 I (0 -rl
I M I © rH OH OH O rH O «Η 1 P P
. * Q) O I O I rH H rH rH rH I 0 -P
* · P -H I G I I -rl 0)
P G G P P
' I (0 J < *, !aS r- rt J (0 >( 1 (0 I I «ί 6 :(0 E θ I (0 :(0
um I IU. 3 P 3 3 I ω X
, ' „ ’d I I υ rH -p rH rH I -P
.: .5 § { ; « s * * J § -p
, X s * -p * §j P
. , OB I t vo W IBP
·, · x -p lii I -p 5 o i i o _ ,<e O' G Zi r- C ^ C(U 1 * M * <u ω HM » 11 Ον VO 1 G o
.. G-P I | <N rH rH | G P
: : Oi O i i -I S * I ω G
a+J I IM SrHl^.P
·. Il I O O A» I ra -H
«Oli I -r I M E
i s -p i o o i 5 .3 J E Φ s
. i g 0) I *> fti S I
I H CP I a E o I rH (M
65 113 0 0 9
Esimerkki 16
Luokan 1 OMP-proteiinin T-soluepitoopit ja niiden tunnistus
Tehokkaan rokotteen täytyy sisältää yksi tai useam-5 pia T-soluepitooppeja. Proteiinissa olevat T-soluepitoopit voidaan ennustaa, kuten ovat kuvanneet Margalit et ai., J. Immunol. 138: 2213 (1987) tai Rothbard ja Taylor, EMBO J.
7: 93 (1988) . Näitä ennustavia menetelmiä käytettiin N. meningitidis -bakteerin kantojen Pl.7,16, P1.16 ja P1.15 luo-10 kan 1 OMP-proteiinin aminohapposekvenssin kanssa. Näillä menetelmillä tunnistetut sekvenssialueet, jotka sisältävät mahdolliset T-soluepitoopit, on esitetty taulukoissa 6 ja 7. Ennustetut peptidit syntetisoitiin standardeilla FMOC-menetelmillä, puhdistettiin standardeilla menetelmillä ja 15 tunnistettiin, kuten on esitetty taulukossa 8.
Sen määrittämiseksi, mikä ennustetuista peptideistä todella sisältää T-soluepitoopit, niiden kyky stimuloida ihmisen perifeerisen veren lymfosyyttejä (PBL) testattiin lymfosyyttikasvatustestillä. Lyhyesti, perifeerinen veri 20 kerättiin HLA-tyypitetyistä normaaleista vapaaehtoisista, jotka oli aiemmin immunisoitu MPC-2:lla (Poolman, J.T. et ·. ai., Antonie van Leeuwenhoek S3: 413 - 419 (1987)), joka sisälsi P1.16, 15, luokan 4 OMP ja ryhmän C polysakkaridia.
: Lymfosyytit eristettiin perifeerisestä verestä Ficoll- :’* 25 Hypaque (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Ruotsi) ... : eristyksellä ja viljeltiin tiheytenä 1 x 105 solua/kuoppa täydennetyssä RPMI 1640 alustassa (Gibco Laboratories, Paisly, Skotlanti), joka sisälsi 10 % lämmöllä inaktivoitua .. , yhdistettyä ihmisen AB-seerumia. Viljelmät altistettiin eri *,,* 30 konsentraatioille ennustettuja T-soluepitooppeja (0,05 - \ 10 Mg/ml). Kun oli altistettu in vitro, viljelmiä inkuboi- *. tiin kuusi vuorokautta ja sitten pulssileimattiin (18 tun- ·; tia) 0,5 MCirllä (3H) -tymidiiniä. Sitten viljelmät kerät- tiin ja laskettiin nestetuikelaskijalla. Tulokset on esi- * > 1 *, , 35 tetty stimulaatioindekseinä, jotka laskettiin antigeenin • < >
* I
66
11300P
läsnä ollessa saatujen cpm-arvojen suhteena cpm-arvoihin, jotka saatiin antigeenin poissa ollessa.
Kuten taulukossa 9 on esitetty, 10 kuudestatoista ennustetusta peptidistä omasi jonkin verran kykyä stimuloi -5 da T-soluja. Nämä sisälsivät peptidit, jotka oli tunnistettu kohdille 16 - 34, 47 - 59, 78 - 90, 103 - 121, 124 -137, 151 - 158, 176 - 185, 223 - 245, 276 - 291 ja 304 -322. Joissain tapauksissa peptidit stimuloivat responssin sekä immunisoiduissa että ei-immunisoiduissa yksilöissä. 10 Ei-immunisoitujen yksilöiden responssi voi johtua aiemmasta oireettomasta infektiosta.
Tapauksessa, jossa T-soluepitooppi tunnistettiin alueelle 176 - 185, havaittiin T-solun responssin tehostuminen sen jälkeen, kun lisättiin monoklonaalista vasta-15 ainetta MN5C11G (P1.16). Lyhyesti, PBL:t altistettiin in vitro synteettisellä peptidillä, joka sisälsi alueen 175 -185 tai tällä peptidillä, joka oli sekoitettu vaihtelevien I MN5C11G-laimennosten kanssa. Kuten taulukossa 10 on esitet- ty, T-solun responssin tehostuminen havaittiin sen jälkeen, 20 kun oli lisätty MN5CllG:tä, joka osoittaa, että monoklonaa-linen vasta-aine tunnisti B-soluepitoopin alueella 176 - 185 ja tehosti peptidin tarjontaa immuunisysteemille. Näin ollen näytettiin toteen, että T- ja B-soluepitoopit joko ; ovat samassa kohdassa tai viereisissä sekvensseissä luokan 25 1 OMP-proteiinissa.
Useissa tapauksissa muodostettiin T-solulinjoja ja . . klooneja yksilöistä, jotka respondoivat eri peptideille.
Lyhyesti, T-solulinjat saatiin viljelemällä eristettyjä ,, , lymfosyyttejä 24-kuoppaisilla levyillä tiheytenä 1 x 106 30 solua/ml. Kasvatusalusta RPMI 1640, johon oli lisätty 10 % • » *··' ihmisen seerumia, sisälsi myös rekombinantti IL-2:ta (Boeh- ringer) 12 yksikköä/ml. Lisäksi kuhunkin kuoppaan lisättiin ·: 5 x 104 homologista, säteilytettyä (3000 R) antigeeniä si- sältävää solua (APC) . Joissain tapauksissa APC:t saatiin • # *t 35 HLA-tyypin suhteen yhteensopivista luovuttajista. Soluiin- h joista eristettiin T-solukloonit rajoittavalla laimennok- 113009 67 s sella tiheydellä 0,5 solua/ml. Klooneja ylläpidettiin stimuloimalla kahdesti viikossa antigeenillä säteilytettyjen APC:den ja IL-2:n (2 yksikköä/ml) läsnä ollessa. Kloonit testattiin lymfosyyttikasvatustestillä oleellisesti, kuten 5 on kuvattu yllä paitsi, että kloonit viljeltiin tiheydellä 1 x 104 solua/ml säteilytettyjen APCrden läsnä ollessa.
Kuvatulla tavalla saadut kloonit altistettiin in vitro 7 eri meningokokkikannan OMP-.lla. Kuten on esitetty taulukossa 11, kloonit tunnistivat T-soluepitoopin tai epi-10 toopit, jotka olivat yhteisiä tutkituilla seitsemällä OMP:lla. Vaikka näiden kloonien reaktiivisuus eri peptidejä kohtaan jää määritettäväksi, tulokset kuitenkin osoittavat T-soluepitooppien yhteisyyden eri kannoilla. Nyt kun nämä kloonit on saatu aikaan ja tunnistettu, niiden peptidireak-15 tiivisuus osoittaa T-soluepitooppien käyttökelpoisuuden rokotteeksi .
i * * • | I i t « » * ' » i » 68 113 0 0 9
Taulukko 6 N. meningitidis-bakteerin Pl.16 OMP-sekvenssin analyysi amfipaattisten alfa-heliksien läsnä olon suhteen menetelmällä/ jonka ovat kuvanneet Margalit et ai. (J. Immunol. 5 138: 2213/ 1987).
Lohkojen keski- Kulmat AS
_kohdat_ 10 P 47-50 85-105 9,4 69-74 105-135 16,0 K 79-88 90-120 23,0 127-135 100-120 22,4 15 ' * 199-202 90-120 8,4 p 208-211 85-95 8,7 260-263 90-125 8,8 P 265-269 90-120 11,3 20 7 274-277 105-120 9,8 297-300 100-135 9,1 p 320-324 80-100 10,9 25 * 338-342 105-135 12,3 * 346-351 80-115 11,9 * 376-379 85-120 9,5 :· . 30 I » » » » ' · » i · t » • » 69 113009
Taulukko 7
Mahdollisten T-soluepitooppeja edustavien alueiden (alleviivatut alueet) läsnä olo N. meningitidis -bakteerin Pl.16 OMP proteiinin sekvensseissä tunnistettuna menetel-5 mällä, jonka ovat kuvanneet Rothbard ja Taylor (EMBO J. 7: 93, 1988).
HRKKLTALVLSALFLAAVADVSLYOEIKAGVEGllNI 10 QAQLTEQFQVTKQVQGNQV X V T K A K Ht Π Π I D F G SrXQrXGSEDlGEGL IAVKQ L I Q D V I V A 0 O G A S O V C N A E S Γ X 0 L A O E F QTtl A G IVAN QFDDAI{A1NFNDI N N D V A 8 0 L C I F K IIDOAFViVIFDI FtFIOFlGiVQ
FVFA0N8XSAYKFAYYTRDTNNMLTLVFAVVQXF0S
15
DVYYAGLNYKNG O F A O N Y A F K Y A A BAMVOXNAFEIF L X GSATiDEAXGTDFlXNlOVniTGeYEXeeiXLA LAAQLDLSENGDXARTKNSTT E I A A T AfYXFGNAVF XX S Y A H G F DL 1 E RCXKGENTSYDQ1 IAGVOYDF8KX
20 T 8 A X V 8 G A W L K I N T G I G N Y T Q 1 N A A I V G L Π I Γ » * * t • t • » > » · » • > • · 70 113009
Taulukko 8
Ennustettujen syntetisoitujen T-soluepitooppien yhteenveto.
5 _Tähde numero_Sekvenssi_
1. 16-34 NIQAQLTEQPQVTNGVQGN
2. 47-59 TKISDFGSFIGFK
3. 57-71 GFKGSEDLGEGLRAV
10
4. 78-90 VSVAGGGASQWGH
5. 103-121 TLRAGRVANQFDDASQAIN
6. 124-137 DSNNDVASQLGIFK
15 7. 151-158 GGFSGFSG
8. 176-185 YYTKDTNNNL
9. 190-202 AWGKPGSDVYYA
10. 215-228 YAFKYARNAHVGRN
20 11. 223-245 ANVGRNAFELFLIGSATSDEAKG
12. 241-261 DEAKGTDPLKNHQVHRLTGGY
13. 276-291 LSENGDKAKTKNSTTE
14. 304-322 VPRISYAHGFDLIERGKKG
25 15. 317-329 ERGKKGENTSYDQ
16. 352-366 KRNTGIGNYTQINAA
, 30 »
? = I
71 113009 :rö tn tn •h Ρ <u i «· · i i i ♦! ι ι ι ι ι ι · i · * ^ I Ml ' PII *
ft I I I
>< I in i tilli·!· {
>i I «< I J
Pii 1 • i i ; < I Φ * I I ♦ ♦ liitit·'·'* ' rf ! 'Ί 1 ! m W I h 1 Ja ο I Ό Λ ! I ΉΙΙΙΙΙΙ· ♦ 5w p i p *· i ; ω i p i · > | Q * + c 1 O «*» | I I I I I I I I I I I I j $ } 0 ~ J J .« p J οι I i ? i p -4 i ♦ i ♦ ·| ι·| i ♦ i i i *1 **l ! ia ω -* i h c en i ω
H ί O I I I 1 I I I I I I I I I ; V
tn p J i tn | cu { i S I 2 Ok I 1 I I I I I I I I I I I · « I +1 j dl · e I | j % i : . ! · · · · ·| i i i ♦ i ♦ · i ♦ ++·♦· * } <n y Ϊ * 'h
I !μ I '5 Γ- I I ♦ I I I I I I I I I M
j σι P J en J | o >ι Ιο»! ♦ +J ♦ · · I ' ♦ | 1 X tn I o I φ | 3 w J S y* « i i i ........... *J J xl h g I « I O tn 3 >1 I I P . ! «j 5 ρ i *r ι .e ♦ l ι ♦ } >
Mil a> m C I I «3 I fö en I ·ηιι ill «ill lii··· J <, p · » a fl Ή J Μ I Ρ I I · >1111 ♦ I I I ♦ 1¾ • i p I I <u p } <u J H !” ♦ ρ I I I till J p ft { JO p |p
C ! £ *5 ΰ £* « tJ
M { S »Λ^-ίη S Μ « t 0) tn I I i§ 8 «* «* «nm***·» «η »£ } Ρ ρ I I n, mtm · n in ia hhdidia in ! J?
P I .3« X-XO+J *«»*** * P
£ a, ‘ · j “ φ I Sip* «λ x - -·η«*ο »e. m * *«Λ«η * «mmina: * * ·5>ηη J q Ρ I I >t I 3 o r* X ·— ~t o *· * ** *· ···*» p * * ** ·*» X X x »omo·* ϊ ·ηη I 1¾
C » P >1 l Ό —< vr> «kO.4.4 to >< * -< H * * *5SSC«»** ! -P
>13 I op IP X*o.***p *··>** H X* r*· ** X* XX X X*·»» *.* · £ tnen I PI iO ....... η ·Η ............. · *·· ω pp J O p ρ §οκκ*οκ^ΐ£***κ·:55ίί«55*κ I c
P in , «333 |3 ΟΟΟΟΟΟ&ΖΟβ ZQOOOQDDOQOOOQOOOQI Q
,, , -¾ ρ ϊ 5 \ ϊ g ρ I Q, * » 0 q |ftd|g I •••••••••••••••••••ten * ϋ ϊ ,52 i,h . · . - . -p · . ·θΗΓ»«'ηη<ρΓ*··ο·<Ν<»ι*ιηιβΐ'β i qj * pp iHl4nnvnwii]^e|lMHHt4rtHHHHHrmrii4rtnNiin I (¾ ; : cm • s * ή (d a ft » 0) rd ,,,-. s > 72 113009 i ! i Taulukko 10 ! ! Synteettisen peptidin tarjonta perifeerisen veren lymfo- syyteille tehostuu monoklonaalisen vasta-aineen avulla, joka vasta-aine tunnistaa alueen 179 - 184 meningokokin 5 luokan 1 OMP proteiinissa.
In vitro altistus cpm GGYYTKDTNNNL 3017 10 GGYYTKDTNNNL1 + MN5C11G (1:200) 22836 GGYYTKDTNNNL1 + MN5C11G (1:1 000) 12608
Alusta 330 * Alleviivattu alue osoittaa sekvenssin, jonka monoklonaa-15 linen vasta-aine MN5C11G tunnistaa.
j
Taulukko 11
Eri meningokokkikantojen 0MP:den tunnistus ihmisen T-solu-20 klooneilla.
Ihmisen T-solukloonien responssi (cpm x 10"3) Kanta Alatyyppi 5-5 5-7 5-9 5-12 5-13 5-14 5-15
* I
» < I
;T 25 H44-76 n.16 6)0 1,2 6,6 2,6 2,3 9,5 1,5 SWISS 4 Γ1.15 4)9 1,0 10;1 6,9 3,6 10,5 1,4 :· 395 P1.9 5,2 1,5 4,6 1,5 6,1 11,1 l,« , : 2996 Π.2 5,4 i,o 3,7 2,3 3,4 11,· 10 M990 M.6 3,6 0,4 3,5 2,5 0,9 4,7 0,6 ;·.· 30 187 Pl.l 4,4 0,7 4,5 3,1 1,6 6,2 1,4 V 6557 n.n 3,7 2,0 6,2 4,2 1,7 6,2 0,6
Alusta — <0,1 <o,i <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 • · » I * · · t » » · • · « » 73 113009
Esimerkki 17
Luokan 1 OMP-proteiinin membraanitopologian prote-iinimallin luominen ja sen vertaaminen muiden patogeenisten gram-negatiivisten poriiniproteiineihin rokotteen kehitystä 5 varten
Rakennettiin malli käyttäen niitä periaatteita, ; jotka on tunnistettu useiden Escherichia coli -bakteerin ulkomernbraaniproteiinien (Vogel, H. et ai., (1986) yllä; Ferenci, T., et ai., (1988) yllä, ja Tommassen, J. (1988) 10 yllä) rakenteille. Keskeinen oletus on, että ulkomembraa-nista ulostyöntyvät proteiinialueet muodostavat beeta-laskoksia. Erikoisesti luokan 1 proteiinin tapauksessa ulostyöntyvien ja membraanin läpimenevien alueiden jako saatiin seuraavalla tavalla: 15 1. Luokan 1 proteiinin (alatyyppi P1.16) aminohap posekvenssin vertailu gonokokin PIA- ja PIB-proteiinien (Carbonetti, N.H. et ai., (1987) PNAS 84: 9084; Carbonetti, N.H. et ai., (1988) PNAS 85: 6841 ja Gotschlich, E.C. et ai. (1987) PNAS 84: 8135) vastaaviin paljastaa 34 % ident-20 tisyyden. Mallissa variaabelit sekvenssit muodostavat pinnalle työntyvät osat, kun taas vakioalueet sijoittuvat : useimmiten ulkomembraaniin ja periplasmaan. Näin ollen jäl kimmäiset kaksi aluetta muodostuvat 58 %:sti tähteistä, jotka ovat konservoituneita kaikissa proteiineissa.
; 2 5 2. Hydropaattisuusprofiilissa (Kyte, J. et ai.
; l ! (1982) J. Mol. Biol. 157: 105) havaitut hydrofiiliset hui put vastaavat ulostyöntyviä alueita.
» ' 3. Membraanin läpi menevien alueiden tulisi suosi teltavasta kyetä muodostamaan 9-12 tähteen pituiset amfi-
t I
: ,· 30 paattiset beeta-juosteet, joissa ainakin yksi sivu sisältää ’,,,· ainoastaan hydrofobisia tähteitä. Nämä olosuhteet ovat voi- .massa 12 : ssa 16:sta membraanin läpimenevässä alueessa.
i » ; 4. Periplasmisella puolella olevien tähteiden luku- > määrä on minimoitu.
: ’· 35 i » i t 113009 74
Kuvio 11 esittää mallin luokan 1 proteiinin laskostumiselle ulkomembraanissa. Esitetty sekvenssi on alatyypille P1.16. Kuvion yläosa esittää pinnalle työntyviä alueita, kun taas keskiosa kuvaa ennustettuja membraanin läpi 5 meneviä alueita, joiden pituus on asetettu kymmeneksi. Aminohapot on esitetty vuorottain siellä, missä ne voivat muodostaa amfipaattisen beeta-juosteen. Tämä malli sisältää kahdeksan pintasilmukkaa, jossa ensimmäinen ja neljäs silmukka sisältävät tyyppispesifiset ja suojaavat variaabelin 10 alueen epitoopit. Nämä epitoopit voivat saada aikaan suo-jaavan immuunivasteen, joka on osoitettu, kun on formuloitu rokotteeksi. Silmukka 5 on vakio ja sen on osoitettu saavan aikaan muiden OMP-proteiinien kanssa ristireagoivia vasta-aineita ja se on käyttökelpoinen rokoteformulaatioksi.
15 Yksittäisten proteiinien yksi tai kaksi variaabelia epitooppialuetta sijaitsevat näiden membraaniproteiinien niin kutsutuissa pintasilmukoissa. Sellaiset poriiniulko-membraaniproteiinit sisältävät useamman kuin kaksi pintasilmukkaa. Tämä vihjaa sellaisten pintasilmukoiden ole-20 massa oloon, joilla on lähes identtinen aminohapposekvenssi myöskin eri luokan 1 ulkomembraaniproteniineissa. Tämä avaa ; mahdollisuuden käyttää luokan 1 ulkomembraaniproteiinin yh- ; teisiä peptidejä myöskin rokotekohteina. Kuviossa 11 on ; esitetty erikoisesti kaksiulotteinen kaaviomalli meningoko- 25 kin luokan 1 ulkomembraaniproteiinista Pl,16. Tämä malli : sisältää kahdeksan pintasilmukkaa, joista ensimmäinen ja neljäs silmukka sisältävät tyyppispesif iset epitoopit, joka on osoitettu perustuen kantojen alatyypitystuloksiin. Vii-des pintasilmukka edustaa yllä kuvattua vakioaluetta. Sil-30 mukan 5 vakioaluetta vastaan oleva vasta-aine tuntuu reagoivan N. meningitidis -bakteerin OMP-kompleksin kanssa. Luokan 1 OMP-proteiinin saatua aminohapposekvenssiä verrattiin N. meningitidis-bakteerin luokan OMP (Murakami, K. et ai. (1989) Infect. Immun. 57: 2318) ja N. gonorrhoeae 35 -bakteerin PIA ja PIB poriiniproteiineihin. Samaa periaa- 113009 75 tetta noudattaen, jota käytettiin luokan 1 OMP-proteiinin mallituksessa, sekvenssit asetettiin alekkain seuraavasti: 1 · » 113009
Silmukka 1
luokka I DVSLYGEIKAG VEGRNIQAQLTEQFQVTNGVQGN
5 AA AAA AAAA A
luokka IB DVTLYGAIKAG V-----------QTYRSVEHT
A1 AAA A A A A A
luokka IA DVTLYGTIKAG VEGRNIQAQLTEQPETSRSVAHH
AA AA A A A A A A
luokka II DVTLYGTIKAGV EGRNXQAQLTEQPEVSRVKDAG
JO ** A** *****
QVKVTKAK5RIRTKI SDFGSTIGFKGSEDLGEGL
A A AA A A A A A AAAA AA"
DGKVSKVET—GSEI ADFGSKXGFKGQEDLGNGL
A AA A A A A A AA A A1
GAQADRVKT—ATEI ADLGSKIGFKGQEDLGNGL
A A AA A A A A A AA A AA
15 ___
TYKAQGGKSKTATQ IADFGSKIGFKGQEDLGNGL
A A AA A A A A A AA A AA
Silmukka 2
KAVWQLEQD VSVAGGGASQWGN RESFIGLAGEFG
AA A A A A A A A A A AA AA A AA
20 KAVWQLEQG ASVAGTNTG-WGN RQSFVGLKGGFG
AA A A A A A A AAA AA AA A AA
KAIWQLEQK AYV5GTDTG-WGN RQSFIGLKGGFG
AA A A A A A A AAA AA AA A AA
KAIWQLEQ KASIAGTNSG-MGNRQSFIGLRGGFG
A1 "1AAAA A AAA AA AA A AA
ί : · 25 Silmukka 3 TLRAGRVANQFDD ASQAINFWDSNNDVASQLQI— a 1
TIRAGSLNSPLKN TGANVNA.VTE6GKFTGNVLEI S
AA
KVRVGRLNSYLKD TGGFNFWEGKSYYLPLSNIAQ
A A
30 -
TVRAGNLNTVLKDSGDNVNAWESGSNTEDVLGLG
AA
» I * 35 77 113009
Silmukka 4 5 - -
—FKRHDD MPV SVRYDSPEFSGFSGSVQFV PAQNS
******* ** * * AA
GMAQREH RYL 5VRYDSPEFAGFSGSVQYA PKDNS
******* AA * * A A
PEERHV----SVRYDSPEFAGFRAV-QYV PNDNS
******* AA * A AA
10 TIGRVESEEI SVRYDSPVFAGFSGSVQ YVPRDNA
******* ** * A A*
KSAYKPAYYTKDTNNNLTLVPAWGKPGS DVYYA
*
GS---------------------NG ESYHV
* 15 GK------------------NHS ES YHÄ * ND-----------VDKYKHTKSSR E S YHÄ
A
Silmukka 5
20 GLNYKNGGFAGNYAFKYA RHANVGRNAFELFLIG
********
GLNYQNSGFFAQYAGLFQ RYGEGTKK----IE
****** ** GFNYKNSGFFVQYAGFYK RH5YTTEKHFELFL— , . ********
25 GLKYENAGFFGQYA GSFAKYADLNTD-----AE
A ** * * * **
, : N
SATSDEAKGTDPLKH QVHRLTGGYEEGGLNLALA
***** AA* A A
DDQTYSIPSEFVEKL QVHRLVGGYDNNALYVSVA
***** *** A *
30 -----------L QVHRLVGGYDHDALYASVA
***** *** * *
RVAVNTANAHPVKDY QVHRWAGYDANDLYVSVA
***** AA* A A
35 78 1 13 0 0 9
Silmukka 6
5 AQLD LSE—NGDKAXTKNSTTE IAATASYRFGNA
* 1 **** ***** AQQQ DAKLYGAMSGNSHNSQTE VAATAAYRFGNV * 1 **** ***** VQQQ DAXLTWRND-NSENS QTE VAATAAYRFGNV * 1 1 **** ****
GQ YEAAKNNEVGSTKGKKHQTQ VAATAAYRFGNV
10 1 g 1 **** *****
Silmukka 7
VPRISYAHGFDLI ERGKKGENTSYDQ IIAGVDYD
VtWVC»·**»** 1 1 A
TPRVSYAHGFKGT VDSANHDNT-YDQ WVGAEYD ** ****** 1 1 1 **
15 TPRVSYAHGFKGS VYDADNDNT-YDQ VWGAEYE
** ****** 1 1 1 ** TPRVSYAHGF KAKVNGVKDANYQQDQ VIVGADYD ** ****** 1 1 1 **
Silmukka 8 FSKRTSAIVSGAWL KRNTGIGNYTQIN AASVGLREKF 20 ******* ** ** 1 1 ***** FSKRTSALVSAGWL QGGKGADKIV-ST ASAWLRHRF ******* ** ** 1 1 *****
.·. FSKRTSALVSAGWL QRGKGTEKFV-AT VGGVGLRBKF
*********** 1 ******
Γ. FSKRTSALVSAGWL KQGKGTGKVEQ—TASM VGLRHKF
· 25 ******* ** ** 1 1 ***** 113009 79
Rakenteelliset samankaltaisuudet on osoitettu mem-braanin läpi meneville ja pintasilmukka-alueille. Niiden tietojen, joita nyt on käytettävissä luokan 1 OMP-prote-iinista ja tietojen, jotka perustuvat tietyn poriiniprote-5 iinin pintasilmukan kokoon, sijaintiin, lajien väliseen aminohappohomologiaan ja silmukka-alueiden heterologiaan, pohjalta on mahdollista tehdä ennustuksia rokotteisiin laitettavista epitoopeista muiden patogeenisten gram-negatiivisten bakteerien kohdalla, sisältäen N. gonorrhoeae 10 -bakteerin. Käyttäen samoja menetelmiä kuin mitä käytettiin luokan 1 OMP-proteiinille, näitä epitooppeja voidaan arvioida rokotekäyttöä varten.
Mikro-organismien tallennus N. meningitidis -kanta H4476 (B:15:P1.7,16) talle- 15 tettiin 11.12.1989 kokoelmaan Centraal Bureau voor Schim-melculturen (CBS), Baarn, Alankomaat, ja se on talletettu numerolla CBS 63 5.89. N. meningitidis -mutantti HUI-5, jolta puuttuu luokan 2/3 OMP, talletettiin 11.12. 1989 CBS:ään, Baarn, Alankomaat, ja se on tallettu numerolla 20 CBS 636.89.
Vastineet * : Alan asiantuntijat tunnistavat tai kykenevät saa- : maan ainoastaan rutiinitutkimuksia käyttäen selville monia , : vastineita tässä kuvatun keksinnön spesifisille suoritusta- ,· 25 voille. Sellaisten vastineiden on tarkoitettu sisältyvän » seuraaviin patenttivaatimuksiin.
» > · - · 1 » ' »

Claims (37)

113009
1. Menetelmä ulkomembraanivesikkelirokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka 5 rokote sisältää vähintään yhtä luokan 1 ulkomembraaniprote-iinia tai sen immunogeenista osaa eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, tunnettu siitä, että viljellään Neisseria meningitidis-bakteerin luokka 2/3-miinus-kantaa, eristetään vesikkeleitä viljelmästä 10 tuottaen ulkomembraanivesikkeleitä, ja ulkomembraanivesik-kelit lisätään farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan, rokotteen saamiseksi.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Neisseria meningitidis-bakteerin 15 luokka 2/3-miinus-mutantti saadaan ryhmän A, B, C, W-135 tai Y meningokokista.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Neisseria meningitidis-bakteerin luokka 2/3-miinus-mutantti ilmentää enemmän kuin yhtä me- 20 ningokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinialaryhmää.
4. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria me- ; ningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää ainakin yhtä puhdistettua luokan 1 ulkomembraaniproteiinia tai sen = fragmenttia eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomem- 25 braaniproteiinia, tunnettu siitä, että viljellään > · .: Neisseria meningitidis-bakteerin luokka 2/3-miinuskantaa, . puhdistetaan luokan 1 ulkomembraaniproteiini viljelmästä * * · puhdistetun luokan 1 ulkomembraaniproteiinin tuottamiseksi, puhdistettuun luokan 1 ulkomembraaniproteiiniin lisätään ‘ ; 30 lipidejä tai farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan muita komponentteja, jotka säilyttävät luokan 1 ulkomembraanipro-* teiinin antigeenisen konformaation, tai pilkotaan puhdis- j tettu luokan 1 ulkomembraaniproteiini CNBr:lla tai proteaa- silla luokan 1 ulkomembraaniproteiinin fragmenttien tuotta-’ 35 miseksi, puhdistetaan yksi tai useampi proteiinifragmentti : ja yhteen tai useampaan puhdistettuun proteiinifragmenttiin 113009 lisätään lipidejä tai farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan muita komponentteja, jotka säilyttävät luokan 1 ulko-membraaniproteiinifragmenttien antigeenisen konformaation.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, t u n-5 n e t t u siitä, että luokan 1 ulkomembraaniproteiinilla on aminohapposekvenssi SEQ ID NO:5, 6, 7 tai 8.
6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Neisseria meningitidis-bakteerin luokka 2/3-miinus-kanta ilmentää enemmän kuin yhtä meningo- 10 kokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinialaryhmää.
7. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettuun luokan 1 ulkomembraa-niproteiiniin tai puhdistettuihin proteiinifragmentteihin edelleen lisätään Neisseria meningitidis-bakteerin puhdis- 15 tettuja kapselipolysakkarideja.
8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettu luokan 1 ulkomembraani-proteiini edelleen konjugoidaan kemiallisesti toiseen antigeeniin tai kantajaproteiiniin tai sen epitooppiin.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että kantajaproteiini on tetanustoksoidi ·, tai difteriatoksiini CRM197.
10. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettu luokan 1 ulkomem- ;\j 25 braaniproteiini tai puhdistetut proteiinifragmentit edel- leen konjugoidaan kemiallisesti meningokokin polysakkaridi·, diin. * » ·
11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteaasi on endoproteinaasi
30 Lys-C, endoproteinaasi Arg-C tai endoproteinaasi Glu-C. ’ ·* 12. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, • tunnettu siitä, että luokan 1 ulkomembraaniprote- • iinilla on aminohapposekvenssi, joka vastaa selityksen si vuilla 34 - 36 esitettyä proteiinialatyyppiä P1.16, P1.15, : ” 35 Pl.7.16 tai P1.2. » > » > · • 32 113009
13. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää menin-gokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinin bakteerisidisen vasta-aineen sitovan vähintään yhden epitoopin eikä sisällä 5 meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, tunnettu siitä, että syntetisoidaan kemiallisesti yksi tai useampi oligopeptidi, joka vastaa yhtä tai useampaa meningokokin luokan 1 membraaniproteiinin bakterisidista vasta-ainetta sitovaa epitooppia, puhdistetaan oligopeptidit, 10 ja puhdistettuihin oligopeptideihin lisätään lipidejä tai muita farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan komponentteja, jotka säilyttävät oligopeptidien antigeenisen konfor-maation.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 15 tunnettu siitä, että oligopeptideillä on aminohapposekvenssi QPQVTNGVQGN, PPSKSQP, QAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP tai HYTRQNNTDVF.
15. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että epitooppi tai epitoopit sijaitsevat meningokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinin : · pintasilmukoissa aminohappojen 24-34 ja 176-187 alueella. ! : 16. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi tai useampi oligopeptidi .'.t; 25 sisältää meningokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinin epi- • » toopin, jonka aminohapposekvenssi on säilynyt eri meningo- * i kokkiporiiniproteiinien kesken. • > i
17. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, ,,, tunnettu siitä, että yksi tai useampi oligopeptidi • » · * 30 sisältää meningokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinin epi toopin, joka vaihtelee eri meningokokkiporiiniproteiinien • kesken. >! 18. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisätään lipidejä liposomien ' ” 35 muodostamiseksi. i * * 1 » » 83 1 13009
19. Patenttivaatimuken 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi tai useampi puhdistettu oligopeptidi edelleen konjugoidaan kemiallisesti Neisseria mengnitidis-bakteerin puhdistettuihin kapselipolysakkari- 5 deihin.
20. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksi tai useampi puhdistettu oligopeptidi edelleen konjugoidaan kemiallisesti toiseen antigeeniin, kantajapeptidiin tai kantajaproteiiniin edel- 10 lyttäen, että kantajaproteiini ei ole β-galaktosiaasi.
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantajaproteiini tai -peptidi on bakteeritoksiini tai sen epitooppi.
22. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria 15 meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää fuu- sioproteiinin tai -peptidin, joka sisältää meningokokin luokan 1 ulkomembraaniproteiinin epitoopin, joka on fuusioitu kantajaproteiiniin tai -peptiin, eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, tunnettu 20 siitä, että rakennetaan ilmentämisvektori, joka koodaa fuu-sioproteiinia tai -peptidiä, edellyttäen ettei kantajapro-_ j teiini ole β-galaktosidaasi, ilmentämisvektori viedään so- : : piviin isäntäsoluihin, isäntäsolut viljellään fuusioprote- iinin tai -peptidin ilmentämiselle sopivissa olosuhteissa, 25 puhdistetaan ilmennetty fuusioproteiini tai -peptidi ja » · puhdistettu fuusioproteiini tai -peptidi lisätään lipidei- ,-;*t hin tai farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajan muihin kom- » » ♦ ponentteihin, jotka säilyttävät fuusioproteiinin tai ,,. -peptidin antigeenisen konformaation. • 30 23. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, » * ‘ tunnettu siitä, että kantajaproteiini on Salmonel- • lan flagelliiniproteiini.
24. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epitooppi on QPQVTNGVQGN, : ' 35 PPSKSQP, AQAANGGASG, YYTKDTNNNLTL, YYTKNTNNNLTL, : YYTKDTNNNL, YYTKNTNNNL, HFVQQTPQSQP tai HYTRQNNTDVF. 113009
25. Patenttivaatimuksen 22 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puhdistettuun fuusioproteii-niin tai -peptidiin edelleen konjugoidaan meningokokin kap-selioligosakkardia tai -polysakkaridia.
26. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää ainakin yhtä luokan 1 ulkomembraaniproteiinia tai sen immuno-geenista osaa eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, tunnettu siitä, että DNA, joka 10 koodaa luokan 1 ulkomembraaniproteiinin yhden tai useamman epitoopin, viedään lukukehyksessä geeniin, joka koodaa heikennetyn Salmonella-kannan falgelliiniproteiinia, viljellään saatu muunneltu kanta ja lisätään muunneltu kanta farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan elävän rokotteen 15 muodostamiseksi.
27. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää ainakin yhtä luokan 1 ulkomembraaniproteiinia tai sen immuno-geenista osaa eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomem-20 braaniproteiinia, tunnettu siitä, että rakennetaan virus, joka ilmentää luokan 1 ulkomembraaniproteiinien yh-f den tai useamman epitoopin, inaktivoidaan saatu virus ja ij : lisätään virus farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan heikennetty virus -rokotteen muodostamiseksi.
28. Neisseria meningtidis-kanta, tunnettu • · siitä, että se on HIII5, jonka talletus nro on CBS 636.89.
29. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää puh- . distettua luokan 1 ulkomembraaniproteiinia eikä sisällä me- » · · >t; 30 ningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, t u n - n e t t u siitä, että viljellään Neisseria meningitidis-;"· bakteerin luokan 2/3-miinus-kantaa, puhdistetaan luokan 1 -;*·· ulkomembraaniproteiini viljelmästä tuottaen siten puhdis tettu luokan 1 ulkomembraaniproteiini, joka ei sisällä me- • ’ 35 ningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, ja lisätään * » » 85 1 13009 puhdistettu luokan 1 ulkomembraaniproteiini farmaseuttisesti hyväksyttävään kantajaan.
30. Patenttivaatimuksen 29 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Neisseria meningitidis-kanta 5 koodittaa luokan 1 ulkomembraaniproteiinin alatyyppiä P1.16, P1.15, Pl.7.16 tai P1.2.
31. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää useampaa kuin yhtä puhdistettua luokan 1 ulkomembraaniproteiinin 10 alatyyppiä eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomem-braaniproteiinia, tunnettu siitä, että rakennetaan Neisseria meningitidis-kanta, joka koodittaa useampaa kuin yhtä luokan 1 ulkomembraaniproteiinia, viljellään mainittua Neisseria meningitidis-kantaa, puhdistetaan luokan 1 ulko-15 membraaniproteiini viljelmästä tuottaen siten puhdistettu luokan 1 ulkomembraaniproteiini, joka sisältää useampaa kuin yhtä luokan 1 ulkomembraaniproteiinin alatyyppiä eikä sisällä meningokokin luokan 2/3 ulkomembraaniproteiinia, ja lisätään puhdistettu luokan 1 ulkomembraaniproteiini far-20 maseuttisesti hyväksyttävään kantajaan.
32. Patenttivaatimuksen 31 mukainen menetelmä, ·, j tunnettu siitä, että Neisseria meningitidis-kanta : : : koodittaa ainakin yhtä luokan 1 ulkomembraaniproteiinin :*·*: alatyyppiä valittuna ryhmästä, joka käsittää P1.16:n, •
25 P1.15 : n, P1.7.16 : n ja P1.2 :n. » ·
33. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria i · — — meningitidis-bakteeria vastaan, tunnettu siitä, I t | että eristetään luokan 1 ulkomembraaniproteiinia koodittava ,, , DNA ja insertoidaan se ilmennysvektoriin, viedään ilmennys- » s » • 30 vektori soluihin, eristetään luokan 1 ulkomembraaniproteii- ··* nia tuottavat solut eristäen siten isäntäsolut, viljellään "· isäntäsoluja olosuhteissa, joissa luokan 1 ulkomembraani- | proteiinia tuotetaan, puhdistetaan luokan 1 ulkomembraani proteiini ja lisätään se farmaseuttisesti hyväksyttävään • 35 kantajaan tuottaen siten rokote. > » 113009
34. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että luokan 1 ulkomembraaniprote-iinilla on alatyypin P1.16, P1.15, Pl.7.16 tai P1.2 sek venssi .
35. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäksi lisätään yksi tai useampia puhdistettuja erilaisten alatyyppien luokan 1 ulko-membraaniproteiinej a.
36. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että isäntäsolu on gram- negatiivinen bakteerilaji.
37. Patenttivaatimuksen 33 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on Escherichia coli tai Salmonella-laj i.
38. Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan, joka rokote sisältää fuu-sioproteiinin, joka käsittää meningokokin luokan 1 ulkomem-braaniproteiinin fuusioituna kantajaproteiiniin tai peptidiin, tunnettu siitä, rakennetaan ilmennys-20 vektori, joka koodittaa fuusioproteiinia, edellyttäen ettei kantajaproteiini ole β-galaktoosidaasi, viedään ilmennys-; · vektori sopiviin isäntäsoluihin, viljellään isäntäsoluja : ' fuusioproteiinin ilmentämiselle sopivissa olosuhteissa, ; ; puhdistetaan ilmennetty fuusioproteiini ja lisätään puhdis- j 25 tettu fuusioproteiini farmaseuttisesti hyväksyttävään kan- • » . : tajaan. , ·, 39. Patenttivaatimuksen 38 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fuusioproteiini käsittää alatyypin P1.16, P1.15, Pl.7.16 tai P1.2 luokan 1 ulkomembraa- ' ' 30 niproteiinin. » » > i » ’ I 113009
FI912965A 1988-12-19 1991-06-18 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan sekä Neisseria meningitidis -kanta FI113009B (fi)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NL8803111 1988-12-19
NL8803111A NL8803111A (nl) 1988-12-19 1988-12-19 Multivalent meningococcen klasse i buitenmembraaneiwit vaccin.
NL8900036 1989-01-06
NL8900036A NL8900036A (nl) 1988-12-19 1989-01-06 Multivalent meningococcen klasse 1 buitenmembraaneiwit vaccin.
NL8901612A NL8901612A (nl) 1988-12-19 1989-06-26 Multivalent meningococcen klasse i buitenmembraaneiwit vaccin.
NL8901612 1989-06-26
PCT/US1989/005678 WO1990006696A2 (en) 1988-12-19 1989-12-19 Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
US8905678 1989-12-19

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI912965A0 FI912965A0 (fi) 1991-06-18
FI113009B true FI113009B (fi) 2004-02-27

Family

ID=27352237

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI912965A FI113009B (fi) 1988-12-19 1991-06-18 Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan sekä Neisseria meningitidis -kanta

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0449958B9 (fi)
JP (1) JP3436756B2 (fi)
AT (1) ATE120093T1 (fi)
AU (1) AU640118B2 (fi)
DE (1) DE68921895T3 (fi)
DK (1) DK175788B1 (fi)
ES (1) ES2070312T5 (fi)
FI (1) FI113009B (fi)
NO (1) NO305463B1 (fi)
WO (1) WO1990006696A2 (fi)

Families Citing this family (82)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7118757B1 (en) 1988-12-19 2006-10-10 Wyeth Holdings Corporation Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
NZ239643A (en) * 1990-09-17 1996-05-28 North American Vaccine Inc Vaccine containing bacterial polysaccharide protein conjugate and adjuvant (c-nd-che-a-co-b-r) with a long chain alkyl group.
DE69333110T2 (de) 1992-03-02 2004-05-06 Chiron S.P.A. Mit dem cytotoxin von helicobacter pylori assoziiertes, immunodominantes antigen verwendbar in impfstoffen und zur diagnose
NL9201716A (nl) * 1992-10-02 1994-05-02 Nederlanden Staat Buitenmembraanvesikel dat voorzien is van een groep polypeptiden welke ten minste de immuunwerking van aan membraan gebonden buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben, werkwijze ter bereiding ervan alsmede een vaccin dat een dergelijk buitenmembraanvesikel omvat.
JPH08505128A (ja) * 1992-10-26 1996-06-04 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ，アズ リプリゼンテッド バイ ザ セクレタリー，デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ ＮｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対する免疫感作
DE69423383T2 (de) 1993-05-13 2000-08-24 American Cyanamid Co., Wayne Herstellung und Verwendungen von LOS-verminderten Aussenmembran-Proteinen von Gram-negativen Kokken
US5439808A (en) * 1993-07-23 1995-08-08 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US6153406A (en) * 1993-07-23 2000-11-28 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane protein P2 from Haemophilus influenzae type B
US5747287A (en) * 1995-04-28 1998-05-05 North American Vaccine, Inc. Method for the high level expression, purification and refolding of the outer membrane group B porin proteins from Neisseria meningitidis
US5811102A (en) 1995-06-07 1998-09-22 National Research Council Of Canada Modified meningococcal polysaccharide conjugate vaccines
US20020028215A1 (en) 1999-08-09 2002-03-07 Jagath L. Kadurugamuwa Novel vaccines and pharmaceutical compositions using membrane vesicles of microorganisms, and methods for preparing same
WO1997005899A2 (en) * 1995-08-04 1997-02-20 University Of Guelph Novel vaccines and pharmaceutical compositions using membrane vesicles of microorganisms, and methods for preparing same
US6476201B1 (en) * 1995-09-18 2002-11-05 Id Biomedical Corporation Of Quebec Methods for the production of non-covalently complexed and multivalent proteosome sub-unit vaccines
PT909323E (pt) 1996-01-04 2007-06-04 Novartis Vaccines & Diagnostic ''bacterioferritina de helicobacter pilori''
GB9611673D0 (en) * 1996-06-05 1996-08-07 Peptide Therapeutics Ltd Meningococcal vaccine
US6048527A (en) * 1996-08-27 2000-04-11 Chiron Corporation Antibodies that define unique Meningococcal B epitopes and vaccine compositions
US6558677B2 (en) * 1996-10-15 2003-05-06 Wendell D. Zollinger Vaccine against gram negative bacteria
GB9701489D0 (en) 1997-01-24 1997-03-12 Auspharm Int Ltd Antigen
DK1093517T3 (da) 1998-05-01 2008-06-23 Novartis Vaccines & Diagnostic Neisseria-meningitidis-antigener og præparater
CA2332963C (en) * 1998-05-29 2013-07-23 Chiron Corporation Combination meningitidis b/c vaccines
AU2003213540B8 (en) * 1998-05-29 2006-09-28 Novartis Vaccines And Diagnostic Inc. Combination meningitidis B/C vaccines
EP1741443B1 (en) * 1998-05-29 2014-05-21 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Combination meningitidis B/C vaccines
GB9814902D0 (en) * 1998-07-10 1998-09-09 Univ Nottingham Screening of neisserial vaccine candidates against pathogenic neisseria
US7252828B2 (en) 1998-07-15 2007-08-07 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections
US6693186B2 (en) * 1998-09-01 2004-02-17 Antex Biologics Inc Neisseria meningitidis polypeptide, nucleic acid sequence and uses thereof
US6756493B1 (en) 1998-09-01 2004-06-29 Antex Biologics, Inc. Nucleic acid sequence and uses thereof
US10967045B2 (en) 1998-11-02 2021-04-06 Secretary of State for Health and Social Care Multicomponent meningococcal vaccine
GB9823978D0 (en) 1998-11-02 1998-12-30 Microbiological Res Authority Multicomponent meningococcal vaccine
US6797273B1 (en) 1999-01-15 2004-09-28 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Neisseria meningitidis antigen
MXPA01010924A (es) 1999-04-30 2002-05-06 Chiron Spa Antigenos de neisseria conservados.
EP1069133A1 (en) * 1999-07-13 2001-01-17 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Neisseria meningitidis compounds and anti-infection applications thereof
GB9916529D0 (en) * 1999-07-14 1999-09-15 Chiron Spa Antigenic peptides
GB9918319D0 (en) * 1999-08-03 1999-10-06 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
RU2281956C2 (ru) * 1999-10-29 2006-08-20 Чирон С.Р.Л. Антигенные пептиды neisseria
GB9928196D0 (en) 1999-11-29 2000-01-26 Chiron Spa Combinations of B, C and other antigens
AU1875301A (en) * 1999-11-29 2001-06-04 Chiron S.P.A. 85kda neisserial antigen
PT1112747E (pt) * 1999-12-28 2004-10-29 Akzo Nobel Nv Vacina de salmonella que nao induz anticorpos contra flagelina ou flagelos
ES2588917T3 (es) * 2000-01-17 2016-11-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Vacuna de VME suplementada contra meningococo
EP1252182B1 (en) 2000-01-25 2012-06-20 The University Of Queensland PROTEINS COMPRISING CONSERVED REGIONS OF NEISSERIA MENINGITIDIS SURFACE ANTIGEN NhhA
EP1947187B9 (en) 2000-02-28 2011-09-21 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Hybrid expression of neisserial proteins
US6936261B2 (en) * 2000-07-27 2005-08-30 Children's Hospital & Research Center At Oakland Vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by Neisseria meningitidis
GB0103170D0 (en) * 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
ES2892316T3 (es) 2001-01-23 2022-02-03 Sanofi Pasteur Inc Vacuna meningocócica polivalente preparada con un conjugado de polisacárido y proteína
DE60235155D1 (de) 2001-04-17 2010-03-11 Childrens Hosp Oak Res Inst Monoklonale antikörper gegen molekulare mimetika von meningokokken-b-epitopen
GB0115176D0 (en) 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
GB0118249D0 (en) * 2001-07-26 2001-09-19 Chiron Spa Histidine vaccines
GB0121591D0 (en) 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
GB0130123D0 (en) * 2001-12-17 2002-02-06 Microbiological Res Agency Outer membrane vesicle vaccine and its preparation
US7405039B2 (en) 2002-02-07 2008-07-29 Austin Health Viral variants with altered susceptibility to nucleoside analogs and uses thereof
EP1499712A4 (en) 2002-04-12 2008-04-16 Melbourne Health HEPATITIS B VIRUS VARIANTS WITH REDUCED SENSITIVITY TO NUCLEOSIDANALOGES AND USE THEREOF
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
SI1549338T1 (sl) 2002-10-11 2011-04-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Polipeptidna cepiva za ĺ iroko zaĺ äśito pred hipervirulentnimi miningokoknimi rodovi
AU2003295520B8 (en) 2002-11-12 2011-05-19 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Polysaccharide vaccine for Staphylococcal infections
EP1583517B1 (en) 2002-11-12 2019-06-12 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Methods and products for treating staphylococcal infections
EP2279746B1 (en) 2002-11-15 2013-10-02 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Surface proteins in neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
PT1587537E (pt) 2003-01-30 2012-05-30 Novartis Ag Vacinas injetáveis contra múltiplos serogrupos meningocócicos
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
WO2005042564A1 (en) * 2003-10-20 2005-05-12 Sidney Kimmel Cancer Center Flagellin fusion proteins as adjuvants or vaccines and methods of use
ES2415358T3 (es) 2004-04-21 2013-07-25 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Péptidos de fijación a la poli-N-acetil glucosamina (PNAG/DPNAG) y procedimientos para el uso de los mismos
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
LT2682126T (lt) 2005-01-27 2017-02-27 Children`s Hospital & Research Center at Oakland Gna1870 pagrindu gaminamos pūslelių pavidalo vakcinos, skirtos plataus spektro apsaugai nuo neisseria meningitidis sukeltų ligų
SG161255A1 (en) 2005-04-08 2010-05-27 Melbourne Health Variants of hepatitis b virus with resistance to anti-viral nucleoside agents and applications thereof
AU2006230802A1 (en) 2005-04-08 2006-10-12 Austin Health Variants of hepatitis B virus with resistance to anti-viral nucleoside agents and applications thereof
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
GB0611914D0 (en) 2006-06-15 2006-07-26 Teti Giuseppe Peptides that mimic non-human cross-reactive protective epitopes of the group Bmeningococcal capsulsar polysaccharide
NZ587382A (en) 2008-02-21 2012-01-12 Novartis Ag Meningococcal fhbp polypeptides
GB0809659D0 (en) * 2008-05-28 2008-07-02 Univ Nottingham Polypeptides
AU2009262893B2 (en) 2008-05-30 2015-05-21 The U.S.A., as represented by The Secretary of the Army, on behalf of Walter Reed Army Institute Of Research Meningococcal multivalent native outer membrane vesicle vaccine, methods of making and use thereof
KR101573648B1 (ko) 2008-07-21 2015-12-01 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 합성 베타-1,6 글루코사민 올리고당에 관한 방법 및 조성물
US9475864B2 (en) 2008-09-05 2016-10-25 University Of Massachusetts Methods, compositions and vaccines relating to Neisseria meningitidis antibodies
CN102596240B (zh) 2009-08-27 2015-02-04 诺华股份有限公司 包括脑膜炎球菌fHBP序列的杂交多肽
US20130022639A1 (en) 2009-09-30 2013-01-24 Novartis Ag Expression of meningococcal fhbp polypeptides
JP5960055B2 (ja) 2009-10-27 2016-08-02 ノバルティス アーゲー 改変髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチド
US9259462B2 (en) 2010-09-10 2016-02-16 Glaxosmithkline Biologicals Sa Developments in meningococcal outer membrane vesicles
JP2012090571A (ja) * 2010-10-27 2012-05-17 Sekisui Chem Co Ltd 動物の免疫方法、免疫用組成物、抗体の製造方法、並びに、ハイブリドーマの製造方法
MX357538B (es) 2012-06-14 2018-07-13 Novartis Ag Vacunas para meningococo de serogrupo x.
EP3782643A1 (en) 2014-02-28 2021-02-24 GlaxoSmithKline Biologicals SA Modified meningococcal fhbp polypeptides
PL3132020T3 (pl) * 2014-04-17 2020-06-29 Corning Inc. Naczynie do hodowli komórek i jego zastosowanie
AU2015296555B2 (en) * 2014-07-30 2020-05-21 Genome Protection, Inc. Flagellin compositons and uses
JP2023542141A (ja) * 2020-09-15 2023-10-05 ザ ユニバーシティー オブ モンタナ 繊維状バクテリオファージを標的化する組成物および方法

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4673574A (en) * 1981-08-31 1987-06-16 Anderson Porter W Immunogenic conjugates
WO1983003354A1 (en) * 1982-03-30 1983-10-13 Us Army Neisseria gonorrhoeae vaccine
JPH0720878B2 (ja) * 1983-11-21 1995-03-08 ザ ウエルカム フアウンデ−シヨン リミテツド 改善された複合体、それらの製造法および該複合体を含有する製剤
US4601903A (en) * 1985-05-01 1986-07-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vaccine against Neisseria meningitidis Group B serotype 2 invasive disease
RU2023448C1 (ru) * 1987-07-30 1994-11-30 Сентро Насьональ Де Биопрепарадос Способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в
AU637049B2 (en) * 1988-05-05 1993-05-20 American Cyanamid Company Recombinant flagellin vaccines

Also Published As

Publication number Publication date
ATE120093T1 (de) 1995-04-15
NO912369D0 (no) 1991-06-18
JP3436756B2 (ja) 2003-08-18
WO1990006696A3 (en) 1990-07-12
ES2070312T5 (es) 2003-05-16
DK175788B1 (da) 2005-02-21
NO912369L (no) 1991-08-06
DE68921895D1 (de) 1995-04-27
AU4821990A (en) 1990-07-10
ES2070312T3 (es) 1995-06-01
JPH06503465A (ja) 1994-04-21
DE68921895T2 (de) 1995-09-07
WO1990006696A2 (en) 1990-06-28
FI912965A0 (fi) 1991-06-18
AU640118B2 (en) 1993-08-19
EP0449958B9 (en) 2003-05-28
EP0449958A1 (en) 1991-10-09
EP0449958B2 (en) 2002-11-13
NO305463B1 (no) 1999-06-07
EP0449958B1 (en) 1995-03-22
DK117491D0 (da) 1991-06-18
DK117491A (da) 1991-08-15
DE68921895T3 (de) 2003-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI113009B (fi) Menetelmä rokotteen valmistamiseksi Neisseria meningitidis-bakteeria vastaan sekä Neisseria meningitidis -kanta
US7238345B1 (en) Recombinant microorganism expressing meningococcal class 1 outer membrane protein
RU2235128C2 (ru) Гены рецептора трансферрина moraxela
JP4827196B2 (ja) 髄膜炎菌類タンパク質ｎｍｂ１８７０のドメインおよびエピトープ
AU648251B2 (en) Vaccines for nontypable haemophilus influenzae
Barlow et al. The class 1 outer membrane protein of Neisseria meningitidis: gene sequence and structural and immunological similarities to gonococcal porins
AU4934396A (en) Proteinase k resistant surface protein of neisseria meningitidis
US20070148729A1 (en) Methods for increasing neisseria protein expression and compositions thereof
van der Ley et al. Use of transformation to construct antigenic hybrids of the class 1 outer membrane protein in Neisseria meningitidis
KR0170752B1 (ko) 혈호균속 인플루엔자용 백신과 진단검사법
AU744733B2 (en) Neisseria lactoferrin binding protein
CA2007248C (en) Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
Blake et al. Developing a gonococcal protein I vaccine
EP0815234A1 (en) Proteinase k resistant surface protein of neisseria meningitidis

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: AMERICAN CYANAMID COMPANY