FI107733B - Menetelmä sekä välituote trombiini-inhibiittorivaikutuksen omaavien dipeptidijohdannaisten valmistamiseksi - Google Patents

Description

107733

Menetelmä sekä välituote tromkllnl-lnhlbllttorlvalkutuksen omaavlen dipeptldijohdannaisten valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää trombiini-" 5 inhibiittoreitten valmistamiseksi, jotka inhibiittorit ovat käyttökelpoisia antikoagulantteina ihmisillä ja eläimillä. Erityisesti keksintö koskee menetelmää dipeptidin L-proliini-L-arginiinialdehydin johdannaisten valmistamiseksi, joilla johdannaisilla on huomattava hyy-10 tyrnistä estävä vaikutus.

Trombiini-inbibitio saadaan nykyisin aikaan antamalla hepariineja ja kumariineja. Näiden aineiden vaikutusmekanismia on tutkittu paljon. Hepariinit ovat ainoita parenteraalisesti antökelpoisia ja määriä on 15 tarkkailtava huolellisesti. Kumariinit toimivat keskeyttämällä tai estämällä protrombiinin muodostumista ja tarvitsevat jonkin verran aikaa maksimitehonsa saavuttamiseen.

Vaikkakin sekä hepariinit että kumariinit ovat te- 20 hokkaita antikoagulantteja, esiintyy tarvetta aikaansaada hyytymistä estäviä aineita, jotka vaikuttavat nopeasti estäen hyytymän muodostuksen ja jotka eivät häiritse . plasmiinin vaikutusta olemassa olevien hyytymien • · · : ·*♦ liuottamiseksi.

• · · ··· : 25 Tässä julkaisussa esitetään trombiini- • · · • · · · · inhibiittoriyhdisteitä, joilla on seuraava kaava 1', ···« • · • «· • · · • · ·

OL O H L H NH

«i i il -c-N-CH —(CH2)3-N-C-NH2 | ♦ ·· I 1 I C=0 -L.

: c =o |

·*“· I H

·...· OI_ Jr tai RS n

. 35 A

• · • · • ♦ 2 107733 jossa A on 1) ryhmä, jonka kaava on

Ri R-C— 5 3 jossa R on fenyyliryhmä, jonka kaava on ,ö~ jossa a ja a' itsenäisesti ovat vety, alempialkyyli, 15 alempialkoksi, halogeeni, trifluorimetyyli, hydroksi, hyd-roksimetyyli, amino, tai aminometyyli, tai R on tienyyli, furyyli, naftyyli, tai naftyyli, jossa on mono- tai disubstituenttina alempialkyyli, alempialkoksi, halogeeni, amino, tai mono- tai di-(alempialkyyli)amino, tai 2 0 hydroksi; tai R on sykloheksadienyyli, sykloheksenyyli, sykloheksyyli tai syklopentyyli,

Rx on vety, metyyli tai etyyli, • #ftl B on alempialkyyli, alempialkoksi, hydroksi, tai : aminoryhmä, jonka kaava on : 25 -n(r2) (r3) • · · · jossa R2 ja R3 itsenäisesti ovat vety tai alempialkyyli, ··«» tai R2 on vety ja R3 on asetyyli-, halogeeniasetyyli- tai • · oksikarbonyyliryhmä, jonka kaava on R4-0C(0)- 30 jossa R4 on C1-C6 -alkyyli, C2-C6 -alkenyyli, C3-C7 -syklo- ’ ’ alkyyli, bentsyyli, nitrobentsyyli, difenyylimetyyli, tai • * * ...· edellä määritelty fenyyliryhmä, edellyttäen edelleen, että j kun Rx on metyyli tai etyyli, silloin B on muu kuin metyyli • · · · .···. tai etyyli tai A on • · ’·* 35 2) 1-aminosykloheksyyli tai 1-aminosyklopentyyli, • · • · • · · • « 3 107733 joissa aminoryhmä on edellä määritelty -N(R2) (R3) -ryhmä, tai A on 3) bisyklinen ryhmä, jonka kaava 2 on A · rRs

Re \ jossa Q on yksihiilinen radikaali, jolla on kaava C=0, 10 H / -CH2- tai -C- , tai kaksihiilinen radikaali, jolla on kaava

H

-CH2-CH2-, -CH2C=0 tai-cH2-C-' 15 Y on yksihiilinen radikaali, jolla on kaava

H

-CH2-, -C- ; tai kaksihiilinen radikaali, jolla on kaava H ^ -CH2-C-, edellyttäen, että toinen, mutta eivät mo-

20 1 H H

lemmat, Q:sta ja Y:stä on -C- tai -CH2-C-, ja, edellyttäen edelleen, että ainoastaan toinen Q:sta ja Y:stä on . kaksihiilinen radikaali, ··· ; R5 on vety tai edellä määritelty oksikarbonyyliryh- • · · : 2 5 mä, ja * · ·

Rs on vety, halogeeni, hydroksi, alempialkyyli tai alempialkoksi, ja katkoviiva-ympyrä 6-jäsenisen bisyklisen • « ... ryhmän sisällä merkitsee aromaattista rengasta tai perhyd- • · · *·1 ' ro-rengasta, 30 ja niiden farmaseuttisesti hyväksyttävät suolat.

*·2· Tämä keksintö koskee menetelmää trombiini- - · · 1 ’,,.ί inhibiittorivaikutuksen omaavan dipeptidi johdannaisen : .·. valmistamiseksi, jolla on kaava r> 1 1 1 • · · · • « · » • « 2 * · 3 5 • · • · • 1 · 4 107733

-V L O H L H NH

\ Il I I II

3-C--n-CH —(CH2)3-N-C-ΝΉ P

N I

| C —O

5 C=0 I

I H 1

A R tai RS

jossa A on 1) ryhmä, jolla on kaava

Ri 10 R-C- £ jossa R on fenyyliryhmä, jolla on kaava 15 , ___ D- jossa a on vety tai halogeeni ja a' on vety, halogeeni, 20 trif luorimetyyli, hydroksi, tai C-^-alkoksi; tienyyli, sykloheksyyli tai naftyyli, joka on mahdollisesti substituoitu C^-alkoksiryhmällä, . R3 on vety, metyyli tai etyyli, ja ··« . B on aminoryhmä, jolla on kaava • · · : 25 • · · • · · · . -nr2r, ·♦·* jossa R2 ja R3 itsenäisesti ovat vety tai C-^-alkyyli, tai • ♦ · R2 on vety tai metyyli ja R3 on asetyyliryhmä tai ryhmä, 30 jolla on kaava • · r4-o-co- ··· ’ • * • · · • · · “1/ jossa R4 on C^g-alkyyli, tai 1 • · 3 5 2) perhydroisokinolyyliryhmä tai 1,2,3,4- • · ♦ · • ·· 5 107733 tetrahydroisokinolyyliryhmä, ja P on vety tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien toksittomien suolojen valmistamiseksi.

5 Kaavan 1 ja 1' mukaiset peptidit ovat käyttö kelpoisia hyytymistä estäviä aineita ja niitä voidaan käyttää apuaineina kudoksen plasminogeeni -aktivaattori (tPA) -, streptokinaasi- tai urokinaasi-hoidon yhteydessä.

Yhdisteitä valmistetaan tavanomaisin kytkentämene-10 telmin. Esimerkiksi, Boc-D-Phg kytketään L-proliinin esterin kanssa Boc-D-Phg-Proesterin muodostamiseksi. Esteri-ryhmä poistetaan ja Boc-D-Phg-Pro kytketään L-arginiinin laktaamimuodon kanssa, jolloin saadaan Boc-D-Phg-Pro-Arg-laktaamia aminosuojatussa muodossa. Arg-laktaami-rengas 15 avataan pelkistämällä ja arginiiniaminoa suojaava ryhmä poistetaan, jolloin saadaan Boc-D-Phg-Pro-Arg-aldehydiä. Peptidit muutetaan sopiviin suolamuotoihin, kuten asetaa-teiksi ja sulfaateiksi.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle kaavan 1 20 mukaisten dipeptidijohdannaisten valmistamiseksi on tunnusomaista, että kaavan 1 mukaisesta yhdisteestä, jossa P on aminoa suojaava ryhmä, poistetaan suojaryhmä hydraamalla palladiumhiilellä ja muodostetaan tarvittaessa • suola.

• « · : 25 Keksintö koskee myös menetelmää välituotteena • · · · .·. käyttökelpoista yhdistettä, jolla on kaava 1, jossa P on aminoa suojaava ryhmä.

• · ... Tässä kuvataan myös menetelmä hyytymien muodostumi- • · · ·* ' sen estämiseksi ihmisillä ja eläimillä ja menetelmässä 30 käyttökelpoiset farmaseuttiset valmisteet.

Kaavan 1 mukaiset keksinnön yhdisteet ovat tri- ··· *...S peptidejä kun A on aminohappotähde, kuten fenyyliglysyyli : ,·. (Phg) . Kuten kaavassa 1 on esitetty, A(C=0) -osan <.· · · .·!·[ asymmetrinen keskus on R tai RS, kun taas proliini- ja • · *!* 35 arginiinialdehydiosien asymmetrinen keskus on L.

·· • · • ·» • · 6 107733

Kaavassa 1 käytetyt termit määritellään tässä seuraavasti :

Termi C-^-alkyyli merkitsee suora- ja haara-ketjuisia C^-alkyyliryhmiä, kuten metyyliä, etyyliä, n-5 propyyliä, isopropyyliä, n-butyyliä ja näiden kaltaisia ryhmiä.

Alempialkoksi tai C1.4-alkoksi merkitsee alkoksiryhmää, kuten metoksia, etoksia, n-propoksia, isopropoksia, n-butoksia, t-butoks'ia ja näiden kaltaisia 10 ryhmiä.

Halogeeni merkitsee fluoria, klooria, bromia tai jodia.

Kuten kaavassa 1 on määritelty, kun A on ryhmä (R) (Rj (B)C-, R voi olla fenyyliryhmä, joka voi olla mono-15 tai disubstituoitu. Esimerkkejä sellaisista fenyyliryhmistä ovat fenyyli (a ja a' = H) , 4-metoksifenyyli, 3- metoksifenyyli, 3-etoksifenyyli, 2-metoksifenyyli, 3- isopropoksifenyyli, 4-hydroksifenyyli, 4-kloorifenyyli, 3-kloorifenyyli, 2-fluorifenyyli, 3-fluorifenyyli, 3- 2 0 bromifenyyli, 4 - fluorifenyyli, 3-trifluorimetyylifenyyli, 4-trifluorimetyylifenyyli, 3,4-dikloorifenyyli, 3- hydroksi-4-fluorifenyyli, 3-kloori-4-etoksifenyyli, ja . näiden kaltaiset mono- tai disubstituoidut f enyyli ryhmä t.

··· • Esimerkkejä R-ryhmistä, kun R on naf tyyli tai ··· : .·. 25 substituoitu naftyyliryhmä, ovat 1-naftyyli, 2-naftyyli, ··· * .·] 6-metoksi-2-naftyyli, 3-metoksi-l-naftyyli, ja näiden [***. kaltaiset na f tyyli ryhmät.

• · ... Esimerkkejä kaavan 1 mukaisista ryhmistä, kun B on • · · aminoryhmä -N(R2) (R3) , ovat amino (R2 = R3 = H) , metyy-30 liamino, etyyliamino, isopropyyliamino, dimetyyliamino, ja « *:**· näiden kaltaiset aminoryhmät, ja kun R2 on vety ja R3 on ·»« *...J oksikarbonyyliryhmä R4-0-C(0)-, esimerkkejä sellaisista : .·. ryhmistä ovat ^-Cg-alkoksikarbonyyliaminoryhmät kuten me- • · · ]···[ toksikarbonyyliamino, etoksikarbonyyliamino, t-butoksikar- • · *Γ 35 bonyyliamino, isoamyylioksikarbonyyliamino ja näiden kai- ·· • · • · · « i 7 107733 täiset ryhmät.

Esimerkkejä kaavan 1 ryhmistä A(C=0) kun A on kaavan (R) (Rx) (B)C- mukainen ryhmän.1 radikaali, ovat fenyyli-glysyyli, 3-metoksifenyyliglysyyli, 4-metoksifenyyligly-5 syyli, 4-kloorifenyyliglysyyli, 3,4-dikloorifenyyliglysyy li, 3-trifluorimetyylifenyyliglysyyli, N-(t-butyylioksi-karbonyyli)fenyyliglysyyli, N-(t-butyylioksikarbonyyli-N-metyyli)fenyyliglysyyli, a-metyylifenyyliasetyyli, a-etyy-lifenyyliasetyyli, α-metoksifenyyliasetyyli, a-isopropok- 10 sifenyyliasetyyli, 1-naftyyliglysyyli, 2-naftyyliglysyyli, N-(t-butyylioksikarbonyyli)-2-naftyyliglysyyli, 2-tienyy-liglysyyli, 3-tienyyliglysyyli, α-hydroksi-a-(2-naftyyli) asetyyli, α-hydroksi-a-(2-tienyyli)asetyyli, syklohek-syyliglysyyli, ja näiden kaltaiset A(C0)-ryhmät.

15 Esimerkkejä kaavan 1 mukaisista peptideistä, joissa A on bisyklinen ryhmä, ovat alla kuvatun Pro-Arg-H:n D-l,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-yylikarbonyyli- ja D- 1,2,3,4 -1etrahydroisokinolin- 3-yylikarbonyyli-N-asyylijohdannaiset ja niiden perhydrojohdannaiset.

20 . R6 j N-R5

Vv • · · Ν' • ♦ · 1

: · 25 I

:·· i C(O) -L-Pro-L-Arg-H

• · · ♦ ♦ · ··· • · · • · ·

. 30 s· -C (O) -L-Pro-L-Arg-H

····* ·..* Rö i n-r5 t·· · • · · • · • % * · · ·· • · • «· « • · 8 107733

Rs on ensisijaisesti vety, ja R6 on ensisijaisesti vety, metoksi, etoksi, kloori tai metyyli.

Keksinnön mukaisesti valmistettujen peptidien 5 farmaseuttisesti hyväksyttäviä suoloja ovat happoadditiosuolat, joita on muodostettu epäorgaanisten happojen ja karboksyylihappojen kanssa. Esimerkkejä suoloja muodostavista epäorgaanisista hapoista ovat halogeenivetyhapot kloorivety ja bromivety, fosforihappo 10 ja rikkihappo. Karboksyylihapposuoloja muodostetaan sellaisten happojen kuten etikkahapon, propionihapon, ma-lonihapon, maleiinihapon, sitruunahapon, meripihkahapon, omenahapon, bentsoehapon, fumaarihapon ja näiden kaltaisten karboksyylihappojen kanssa. Happoadditiosuoloja val- 15 mistetaan tavanomaisella tavalla esim. neutraloimalla yhdisteen 1 vapaa emäsmuoto hapolla. Ensisijaisia happoadditiosuoloja ovat sulfaatti- ja hydrokloridisuolat.

Keksinnön edullisen sovellusmuodon kaavan 1 mukaan valmistetaan kaavan I mukaisia yhdisteitä, joissa A on 20 R-C- « · • · « «·* • · · Ti • · .5 «·· : .·. 25 jossa R on fenyyliryhmä t. · « ··· ♦ « I D- 30 ***** tai naftyyli- tai substituoitu naftyyliryhmä, Rx on vety ja ··· '"J B on aminoryhmä -N(R2) (R3) . Edelleen edullisia ovat kuvatut • *«# yhdisteet, joissa R2 on vety ja R3 on oksikarbonyyliryhmä

Vt.1 R40-C(0)-.

• · * • · 35 Edelleen edullisia keksinnön mukaisesti saatavia ♦ · • ♦♦ + ···« • · 9 107733 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-yylikarbonyyli ja 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-3-yyli-karbonyyli.

Kaavan 1 mukaisia yhdisteitä valmistetaan tunnetuin peptidin kytkentämenetelmin. Erään sellaisen menetelmän 5 mukaisesti happo A-COOH, jossa A:11a on samat merkitykset, jotka on määritelty kaavan 1 osalta, kytketään karboksisuojatun proliinin kanssa dipeptidin (kun A on aminohappo) tai N-asyyliproliiniesterin (kun A on muu kuin aminohappo) muodostamiseksi. Tuotteen proliiniosan kar-10 boksia suojaava esteriryhmä poistetaan ja dipeptidin vapaa happomuoto kytketään arginiinin laktaamimuodon kanssa. Edellä esitettyä reaktiosarjaa valaistaan seuraavan kaavion avulla 15 ° /- '1 / .... A-C-N t i ACOOH + prolnniesteri -► ^ COO esteri 20 . (a) esterin lohkaisu A- (C=0) -Pro-OH (b) ·; --► • · · • · · 25 (b) J _._► A- (C=0)-Pro-Arg (P) laktaami cj nt ^ .·:·! 1

:·; : C=NH

·:··: äo nhp *...ί jossa P esittää aminosuojaryhmää.

: Kytketty Arg(P) -laktaamituote (c) pelkistetään li- • · · tiumaluminiumhydridillä inertissä liuottimessa laktaami- *!1 renkaan lohkaisemiseksi ja tripeptidin saamiseksi ar- • · • 1·· 3 5 giniinialdehydinä muodossa, jolla on kaava · 10 107733 giniinialdehydinä muodossa, jolla on kaava

A(C=0)-Pro-Arg(P)-H

5 jossa Arg(P)-H on aminosuojattu arginiinialdehydi.

Arginiinin laktaamimuotoa saadaan aminosuojatun arginiinin [Arg-OH] molekyylinsisäisen kytkennän avulla. Esimerkiksi, Boc-Arg(Cbz)OH, jolla on kaava 10 Boc-NH-CH-(CH2) 3-NH-C(=NH)-NHCbz

COOH

muutetaan ensin aktiiviseen esterimuotoon, kuten aktiiviseksi seka-anhydridiksi, klooriformiaattiesterin, esim. 15 etyyliklooriformiaatin kanssa isobutyyli-klooriformiaatik- si. Esterin muodostaminen suoritetaan tertiaarisen amiinin, kuten N-metyylimorfoliinin, läsnäollessa. Vahvemman tertiaarisen amiiniemäksen, kuten trietyyliamiinin, lisäys aiheuttaa sisäisen asyloitumisen, jolloin saadaan alla 20 esitettyä diaminosuojatun arginiinin laktaamimuotoa.

:¾ Xj • · ·

• · · · I

25 c —NH

• · · ·

....: I

* · NH-Cbz • · · ♦ · · • · ·

Ennen käyttämistä kytkennässä A(C=0)-Pro-0H:n 30 kanssa edellisessä kaaviossa esitetyllä tavalla, Boc-suo- »*· jaryhmä poistetaan selektiivisesti trif luorietikkahapon : .·. kanssa, jolloin saadaan tarvittava vapaa aminoryhmä.

• · · [•••j ACOOH-yhdisteen kytkentä proliiniesterin kanssa, • · *1* kun A on aminohappotähde, suoritetaan suojaamalla ensin • · • *·· 35 aminohapon aminoryhmä. Tällöin käytetään tavallisia amino- suojaryhmiä, joita yleensä käytetään aminoryhmän väliai- 11 107733 si-, sykloalkoksi- ja aryylioksikarbonyyliryhmät kuten etoksikarbonyyli, t-butyylioksikarbonyyli, sykloheksyliok-sikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli, trikloorietoksi-karbonyyli, bentsyylioksikarbonyyli, difenyylimetoksikar-5 bonyyli, ja näiden kaltaiset ryhmät. Esteriryhmä, jota käytetään suojaamaan proliinin karboksiryhmää kytkentä-reaktion aikana, voi olla mikä tahansa yleisesti käytetyistä helposti poistettavissa olevista esteriryhmistä, kuten t-butyyli-, bentsyyli-, p-nitrobentsyyli-, p-metok-10 sibentsyyli-, difenyylimetyyli-, trikloorietyyli-, fe-nasyyli-, tai trialkyylisilyyliesterit. Kytkentäreaktiota suoritettaessa käytetään proliinin esteriryhmää, joka on poistettavissa olosuhteissa, joissa aminosuojaryhmä jää koskemattomaksi. Asyloivan hapon ACOOH aminosuojaryhmä 15 pysyy täten paikallaan suojaamassa aminoryhmää seuraavan kytkennän aikana arginiini-laktaamiyhdisteen kanssa, jolloin muodostuu yhdistettä c.

Kaavan 1 mukaisia yhdisteitä, joissa A on ryhmä (R) (Rj (B)C- ja B on aminoryhmä -N(R2) (R3) , jossa R2 on 20 vety ja R3 on C^-alkyyli, valmistetaan vastaavan yhdisteen kanssa, jossa B on amino, käyttämällä tunnettuja alkyloin-. timenetelmiä. Esimerkiksi, N-metyyli-D-fenyyliglysyyli-L- • · φ ; j*; prolyyli-L-arginiinialdehydiä valmistetaan alkyloimalla • · · : pelkistämällä seuraavasti. Cbz - suojattu D-fenyyli-gly- • · · · .;. 25 syyli kytketään DMFrssa L-proliini-t-butyyliesterin kanssa käyttämällä disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC) ja hydrok- • · ... sibentsotriatsolia (HOBt) dipeptidi Cbz-D-fenyyliglysyyli- • · · *·* L-proliini-t-butyyliesterin muodostamiseksi. Peptidi hyd- rataan etyylialkoholissa palladium-hiili-katalyytillä.

***** 3 0 Cbz-suojaryhmän poistamiseksi, pelkistysseokseen lisätään • · · formaldehydiä ja hydrausta jatketaan N-metyli-D-fenyyli- : ,·. glysyyli-L-proliini-t-butyyliesterin muodostamiseksi. Fe- • · · ‘l·.| nyyliglysyyli-osan N-metyyli-sekundaarinen aminoryhmä suo- ·* · ♦ *!' jataan Cbz-ryhmällä antamalla dipeptidi-t-butyyliesterin • ♦ • ’·· 3 5 reagoida bentsyyliklooriformiaatin kanssa THF:ssa, jossa on N-metyylimorfoliinia, jolloin muodostuu N-Cbz-N-metyy- 12 107733 li-D-fenyyliglysyyli-L-proliini-t-butyyliesteriä. t-butyy-liesteriryhmä poistetaan huoneen lämpötilassa trifluori-etikkahapossa, jossa on anisolia, jolloin saadaan N-Cbz-N-metyyli-D-fenyyliglysyyli-L-proliinia. Jälkimmäinen dipep-5 tidi kytketään sitten Cbz-suojattuun Arg-laktaamiin ja laktaamirengas avataan pelkistämällä Arg-aldehydiksi edellä selostetulla tavalla. Tripeptidin molemmat Cbz-suoja-ryhmät poistetaan hydraamalla Pd/C-katalyytillä, jolloin saadaan N-metyyli-D-fenyyliglysyyli-L-propyyli-L-ar-10 giniinialdehydiä.

Kaavan 1 mukaisia yhdisteitä, joissa A on bisyklo-ryhmä (2) , valmistetaan samoin kytkentämenetelmin kuin edellä. Esimerkiksi kaavan 1 mukaista peptidiä, jossa A merkitsee 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-yyli-ryhmää, saa-15 daan asyloimalla proliinin esteriä, kuten bentsyylieste-riä, 1,2,3,4-tetrahydro-l-karboksi-isokinoliinin aktiivisen johdannaisen kanssa. Aktiivisia johdannaisia, joita voidaan käyttää, ovat happohalogenidit kuten kloridi tai bromidi, happoatsidi, samoin kuin aktiiviset esterit ja 20 anhydridit kuten ne, joita on muodostettu klooriformiaat- tien kanssa edellä selostetulla tavalla. Tetrahydroisoki-noliinin rengastyppi on suojattuna tai alkyloituna : asylointikytkennän aikana. Esimerkiksi N-Boc-1,2,3,4- • · · • tetrahydro-l-karboksi-isokinoliinin aktiivista esteriä, • ·· · 25 jota on muodostettu isobutyyliklooriformiaatin kanssa, • ·· · ....j käytetään proliini-esterin asylointiin. Peptidituotteen N- • · ...^ Boc-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-yylikarbonyyliproliini- * esterin esteri lohkaistaan, vapaa happo muutetaan aktiiviseksi esteriksi ja jälkimmäinen kytketään arginii- * * 30 nin laktaamimuotoon. Laktaamimuoto muutetaan sitten aide- * ·· *...· hydimuotoon edellä selostetulla tavalla, jolloin saadaan : .*. kaavan 1 mukaista yhdistettä, nimittäin yhdistettä Boc- • · · · .···. 1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-yyli-karbonyyli-Pro-Arg-H.

• · 1

Perhydrobisykloryhmää valmistetaan hydraamalla • · : *" 35 tavallisin menetelmin joko osittain pelkistettyjä tai tyydyttämättömiä happoja. Esimerkiksi, 1,2,3,4-tetrahydro- 13 107733 isokinoliini-l-karboksyylihappo hydrataan platinaoksidilla liuottimessa kuten etanolissa tai etikkahapossa, jolloin saadaan perhydro(dekahydro)-isokinoliini-l-karboksyyli-happoa. Perhydrohappoja käytetään sitten edellä 5 selostetulla tavalla asyloitaessa proliiniesteriä. Esimerkkejä tällaisista kaavan I mukaisista perhydrojohdannaisista ovat N-(D-dekahydroisokinolin-l-oyyli)-L-pro-lyyli-L-arginiinialdehydi ja N-(D-dekahydroisokinolin-3-oyyli)-L-prolyyli-L-arginiinialdehydi.

10 Edellä selostetut kytkentäreaktiot suoritetaan kyl mässä ensisijaisesti lämpötilan ollessa välillä noin -20°C ja noin 15°C. Kytkentäreaktiot suoritetaan inertissä orgaanisessa liuottimessa kuten dimetyyliformamidissa, dime-tyyliasetamidissa, tetrahydrofiiraanissa, metyleeniklori-15 dissa, kloroformissa, ja näiden kaltaisissa liuottimissa. Yleensä käytetään vedettömiä olosuhteita kun, kytkentä-reaktiossa, käytetään asylointihapon aktiivista esteriä.

Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet eristetään parhaiten happoadditiosuolojen muodossa. Kaavan 20 1 mukaisten yhdisteiden suolat, joita on muodostettu happojen kuten edellä mainittujen happojen kanssa, ovat • β·β2 käyttökelpoisia farmaseuttisesti hyväksyttävinä suoloina : annettavaksi hyytymistä estävinä aineina, ja näitä aineita ··♦ • sisältävien valmisteiden valmistamiseksi. Muita happoaddi- • ·· · .:. 25 tiosuoloja voidaan valmistaa ja käyttää eristettäessä ja ♦ ··· puhdistettaessa peptidejä. Esimerkiksi suoloja, joita on • · ... muodostettu sulfonihappojen, kuten metaanisulfonihapon, n- • · ♦ * butaanisulfonihapon, p-tolueenisulfonihapon ja naftaleenisulfonihapon kanssa, voidaan käyttää tähän * 1 30 tarkoitukseen.

»·« *...♦ Ensisijainen menetelmä kaavan 1 mukaisten yhdis- — « : .2 3. teiden eristämiseen ja puhdistamiseen valmistettaessa sa- • · · · ,···, manaikaisesti haluttua stabiilia suolamuotoa, on menetel- • · t1 mä, jonka mukaisesti, stabiileja epäorgaanisten happojen 2 • · 3 : 4 35 suoloja kuten sulfaatti- ja hydrokloridisuoloja, saadaan preparatiivisen puhdistuksen avulla C18u-käänteisf aasi- 4 14 107733 kromatografiaa käyttäen. Vesipitoinen faasi sisältää rikkihappoa tai kloorivetyhappoa konsentraatiossa noin 0,01 % - 0,05 % ja asetonitriilin, THF:n, metanolin tai muun sopivan liuottimen ollessa orgaanisena osana. Happa-5 men eluentin pH säädetään välille noin pH 4 - pH 6, täsmällisen pH:n ollessa riippuvainen peptidistä, ja käyttäen emäksisen hartsin, esim. Bio-Rad AG-lx8-hartsin, hydrok-syylimuotoa. pH: n säätämisen jälkeen tripeptidisuolan, esim. sulfaatin tai hydrokloridin liuos tehdään lyofiili-10 seksi puhdistetun suolan saamiseksi kuivan jauheen muodossa. Esimerkkinä menetelmästä raaka D-Phg-L-Pro-L-Arg-H-sulfaatti, jossa on epäpuhtautena epimeeristä D-Arg-H-sul-faattia, liuotetaan noin 0,01 %:iseen rikkihappoon ja liuos pannaan Vydac C18RP-HPLC -kolonniin. Kolonnin eluoin-15 tiin käytettiin asetonitriiliä, jota lisättiin gradienttina 2 - 10 % 0,01-%:isesa H2S04-liuoksessa 10 tunnin aikana. Kerätään useita fraktioita ja fraktiot, jotka sisältävät haluttua analyyttisen RP-HPLC:n avulla määritettyä tuotetta, yhdistetään. Yhdistettyjen frak-2 0 tioiden pH säädetään välille noin 4,0 - 4,5 Bio-Rad AG-lx8-hartsilla hydroksyylijaksossa. Suodattamisen jälkeen liuos tehdään lyof iiliseksi, jolloin saadaan • puhdasta D-Phg-L-Pro-L-Arg-H-sulfaattia.

• · · • Keksinnön mukaisesti saadut kaavan 1 mukaiset *·· · 25 yhdisteet ehkäisevät trombiinin vaikutusta ihmisillä ja • · · · eläimillä. Trombiinin inhibitio osoitetaan trombiinin • » ... amidaasi-aktiivisuuden inhibioinnin avulla in vitro.

• · · 1 * Seuraavassa taulukossa l on luettelo näennäisesti tasapainovakiosta (Kass) koeyhdisteen (inhibiittorin) ja * ' 30 trombiinin välisessä vuorovaikutuksessa. Taulukon arvot * · · saatiin kokeessa, jossa trombiini hydrolysoi kromogeenista j .'. substraattia, N-bentsoyyli-D-fenyylialanyyli-L-valyyli-L- »·· · .···. arginyyli-p-nitroanilidia.

• · j·* Koe suoritettiin 50 /xlrssa puskuria (0,03 M Tris, : 35 0,15 M NaCl, Ph 7,4) 25 μ1:η kanssa trombiiniliuosta

(0,21 mg/ml trombostaattista jauhetta seoksessa 0,06 M

15 107733

Tris, 0,3 M NaCl, pH 7,4) ja 150 μ1:η kanssa kromogeenisen substraatin vesiliuosta konsentraation ollessa 0,25 mg/ml. Koeyhdisteen liuoksia (25 μΐ) lisättiin erilaisin konsentraatioin. Substraatin hydrolyysiarvot mitattiin 5 tarkkailemalla reaktioita aallonpituudella 405 nm p-nitro-aniliinin vapautumisen osalta. Standardikäyrät konstruoitiin piirtämällä vapaan trombiinin konsentraatio hydro-lyysiarvoa vastaan. Koeyhdisteillä havaitut hydrolyysiarvot muutetaan sitten "vapaa trombiini"-arvoiksi vastaavis-10 sa kokeissa käyttämällä standardikäyriä. Sitoutunut trombiini (sitoutunut koeyhdisteeseen) laskettiin vähentämällä kussakin kokeessa havaitun vapaan trombiinin määrä kokeessa käytetyn trombiinin tunnetusta alkuperäisestä määrästä. Vapaan inhibiittorin määrä kussakin kokeessa laskettiin 15 vähentämällä sitoutuneen trombiinin moolimäärä lisätyn inhibiittorin (koeyhdisteen) moolimäärästä.

Kass-arvo on hypoteettinen tasapainovakio trombiinin ja koeyhdisteen (I) välisen reaktion osalta.

. 20 Trombiini + I -—> Trombiini - I

<- • · • · · ··· • Kass = Γtrombiini II • · · • ;1j [ (trombiini) x (I) ] ··· « 25 ....j Kass laskettiin koeyhdisteiden eri konsentraatiolla • · ... ja keskiarvo on ilmoitettu yksikköinä litra moolia kohden.

• · · • · • · · • · • · · « 9 • · · • · · • · · · • · · • · • · ’ 1 · · • · · • · • ♦ · « 16 107733 TAULUKKO 1

Trombiiniamidaasi-aktiivisuuden inhibiointi

Trombiiniamidaasi 5 Koe-inhibiittori1 A(C=0)- Kass X106 (l/mooli) D-fenyyliglysyyli 75 N-Boc-D-fenyyliglysyyli 88 N-Boc-D-fenyyliglysyyli 73 N-Boc-D-f eiiyyliglysyyli (sulfaattisuola) 107 10 N-Boc-D-(4-hydroksi)fenyyliglysyyli 115 N-Boc-D-(4-metoksi)fenyyliglysyyli 75 N-Boc-DL-(3,4-dikloori)fenyyliglysyyli 40 N-asetyyli-D-(4-metoksi)fenyyliglysyyli 15,5 N-Boc-D-l-naftyyliglysyyli 52 15 N-Boc-D-2-naftyyliglysyyli 22,2 N-Boc-DL-l-naftyyliglysyyli 18,1 N-Boc-D-(6-metoksi)-2-naftyyliglysyyli 6,1 N-Boc-D-2-tienyyliglysyyli 14 N-Boc-D-sykloheksyyliglysyyli 120 20 N-metyyli-D-fenyyliglysyyli 91,5 N-Boc-N-metyyli-D-fenyyliglysyyli 5,2 ·.·.1 (R)-α-metyylif enyyliasetyyli 11,0 « (R)-a-etyylifenyyliasetyyli 7,5 * (R)-a-metoksi f enyyliasetyyli 4,2 *·· · ♦;· 25 (S)-a-me tyyli f enyyliasetyyli 0,2 ♦ ♦· · N-Boc-DL-l, 2,3,4-tetrahydroisokinolin- • « 1-yylikarbonyyli 3,8 « · · DL-1,2,3,4 -tetrahydroisokinolin-1- yylikarbonyyli 87,7 * ’ 30 ··· ' • · ··· j 1/ A(C=0) - viittaa kaavaan 1. Ellei toisin ole mainittu, ··· · .1··. koe-inhibiittorit olivat asetaattisuolojen muodossa.

• · *·♦ • · • · • · · « 17 107733

Keksinnön mukaisesti valmistettujen yhdisteiden antikoagulantti-aktiivisuus on määritetty standardikokein. Seuraava taulukko 2 esittää arvoja, jotka on saatu tyypillisillä keksinnön mukaisesti valmistetuilla yhdis-5 teillä kokeissa, joita on käytetty protrombiiniajan, trombiinpa jän ja aktivoidun osittaisen tromboplastiiniajan (APTT) määrittämiseen. Taulukon numeeriset arvot ovat koe-yhdisteiden konsentraatioita (ng/ml), jotka ovat tarpeen pidentämään koaguloitumisajan 2-kertaiseksi kolmessa kolo keessa. Trombiiniajan arviointi suoritettiin plasmassa ja määritettiin erikseen puskurisysteemissä pH:n ollessa 7,5.

• « aa· • aa • a a a • · ··· • 1 ♦ · ♦ • · · • 1· a • aa «»4« • • a a · · aa· • aa • • a ··· • « aa· * · • a a • a a • aa a aa • · • a - aa· • a · a « a aa a • a a 107733

o1 _« CN

k>

10 Γη ^ 00 CN LO CN VO ΓΟ 'H

w -d ra a 5 -rt — ε ο :ίΐ -H -g 4-) ^ n ö 3 P d) ^ id Ό ra E-1 -h (¾ ra “«s s 3 λ .2 ra -h p -h ra 5 ^ I ^ -rH o cnooooo o ra m 4-) .,_! rjHrHOCOCNrOrOVDVDCTiOrsiHn Ή

.d^HCOHr-OCNCNjH-tfr-mcrirHH O

-¾ -h d H I g •u ο. μ y 4-1 ai h Ä O ^

njkJnmm r-4 CN O O O Oi LC1 OI Lii CA R

,_(.,_( HroEDOiTir^ooonco^or^o d) rtijE-'r-lr-l'^OCNHCNEDOi'^LnCncNCn d) j-rpCUHH^HtNrOHC^CNir^^ACNA ft rt -H ^ ^ o] o o ^ rt M -H .

O -h rt g P ’d « 4-J tn-^ « rt « a rt d 0 '

P rt O _< -H

P ΛΙ ' ^ S ö

Id ö 1 "d °i ^ -h

Oajrt^ ededidooco en O -h

lp tH e -H !> mmCNOO^OQOt^OO -Γ-l 4J

uj-HrHEo<lEDHojcNcnLncNocnocn m

Qnj^CnEDigHHHH CO lii 01 00 O Λ - rt

Jj rH 6 -H ·— rH

Ij Qj o i—I -H i—I Qj

-H H >1 H £ O

-H 4-> >1 >1 \ £! o 0 ·η ra >i tn g -,-h ft -H r-ι d ra ö o rt ij ft i—I d >—I d -rt ' ’ R -Π rj d d Di r—li—I 4J0 .1. -H S OI -rt tn d O > *·· I ra >i i—I -rt ->ί -rt pj E4 ·'1 -H >i H d ·Η -rt CO 4-4 <D rt • ·1. rl d Dl —Id -rt rt Ei -rt *·1·1 CO -H Di -H -H Ei d d r—f -rt -rt r-i rt -rt ,ϋ _J -H -H r—I r—I -rt -rt d) 4-> d O) i—li—Id E-l CC 05 ··· O i—I d rrt 1—1'—I 14-4 4-4 Oi 1H d d d 4-J4JCL)

··· · EH in d d 1>1 d d—- Π5 d 1—Idid-EJ Ö 4-J

. 0'H -HdEdradd1HEirHdCD4->a) d) -rt •j1 lj m MEiradrararaitndddira ta m li ···· ftO dd)4-4MdddCN-r4CnHrart Ei OrtQ) ,. · 4-) dM-i—tniHrHOiiHQitnrt-H o rara . i 4-4 ra ^ -π -h tn tn 4J — d u-i -h -h h Λ rtm^i

-rt -— d "rt CO 1—I -rt -rt CL) -rt d I 1—I 1—I d t-HI 4-) -rt O

.1:·. -Ho-rtrHra^idHrrt£ramQddd ö -rt>>: ·.·· diin-iDi-yoddd'd^iddEi rt <u o rt

-rt CJ d-Ή O Ec 4-) dd'i1 O CL) -rt Ei ö d) > TS > 4J CO

-Ei — d'—I 4-) Ό M-i 4-) 4-4 4-4 d 1—I d) OJCp rt -rt -rt -rt rt

Eiril ra dd) d π) ή iH 1 a) o d m-i m -rt rt d) m .u rt 4J

. -rt dd£dEirtrtP£r-idi-rtm Λί 4-> Λ! ra rt ·;·1: | r-ifiiiifirtii^jjQrrt-ii; ra <u ns > d) tncu^-^Hii-rtEodaJidO ~-rt ra -rt o

·.. 0 -rt 14-4 -— I rH 04 1—I -— CQ £ -rt ^ 4J — Ό -rt H CD

*J ►1« 1—Il I I p I I d I I I 1—I 4-4 Cl) O -Ei rt 4-4 *·· dPPPPPPdPPSdiCDE Il d 4J En II 0 * d 1 1 1 1 i 1 4-4 1 1 1 d 1 1 C> 05 R H >

:.·. Eiooououcuuuu4-)öö '-'OdiftCM

aiooooooraooocDii ... mpQmEQmmcrirtmcQcQE^-' ·· 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 pj Qj W w \

'·..· HOI OW ITI

· • · · • ....; ITI O LD O LT) • · H H 04 C4 107733 19

Taulukossa 2 esitetyt arvot saatiin käyttämällä Tecan, Inc.'in CoaScreener-instrumenttia alla luetellun analyysiprotokollan mukaisesti.

Protrorabiini-aika: 50 μΐ plasma 5 50 μΐ suolaliuosta 7 μΐ koeliuosta 50 μΐ tromboplastiinia (Dade) Trombiini-aika: 50 μΐ plasmaa 50 μΐ suolaliuosta 10 7 μΐ koeyhdistettä 50 μΐ naudan trombiinia (2 NIH-yksikköä/ml)

Trombiini-ajassa, joka määritettiin puskurissa pH 7,4, plasman asemesta käytettiin fibrinogeenia.

15 APTT: 50 μΐ plasmaa 50 μΐ Actin'ia (Dade) 7 μΐ koeliuosta 50 μΐ CaCl2 (0,01 M)

Tyypillisten keksinnön mukaisesti valmistettujen 20 yhdisteiden hyytymistä estävä aktiivisuus määritettiin in vivo -kokeissa, jotka suoritettiin rotalla. Käytetyssä kokeessa aiheutettiin valtimotukos rotan yhteisessä .·. päävaltimossa ja mitattiin koeyhdisteen ruiskeannos, joka • · · #.t oli tarpeen ylläpitämään veren virtausta viisikymmentä • · · 25 minuuttia tukkeuma-ajan jälkeen. Koe suoritettiin • · · » · i **·.· seuraavasti.

• · »

Valtimotukos aiheutettiin rotalle vaurioittamalla * * yhteistä päävaltimoa. Suonen vaurioittamiseen käytettiin • · · *.· · ferrikloridiliuoksen antoa paikallisesti. Sprague-Dawley- 30 urosrotat (375-450 g) nukutettiin xylazine'lla (20 mg/kg, *:··· s.c.), minkä jälkeen annettiin ketamiini-HCl:a (100 mg/kg, ♦**'· s.c.). Eläimet asetettiin vesipitoiselle alustalle, jossa ··« . ·. kiertävän veden lämpötila pidettiin 37°C:ssa. Yhteinen „· · · päävaltimo avattiin puhkaisemalla kaulan keskiviivan läpi.

• · *···* 35 Suonen avaamiseen ja eristämiseen yhteisestä päävaltimo- tupesta käytettiin huolellista irrottamista erikoiskojeel- • · 107733 20 la. Valtimon alapuolelta vedettiin silkkiommel suonen nostamiseksi välitilan saamiseksi termoelementin asettamista varten sen alapuolelle. Suonen lämpötilamuutoksia tarkkailtiin tallentimen piirturisuikaleelta, jossa oli muste-5 kirjoitin-aikalaite. Whatman No. 1-suodatinpaperisten le vyjen (0 3 mm) FeCl3-liuokseen (35 %) kastamiseen käytettiin pieniä pihtejä. Levyt oli leikattu samankokoisiksi käyttämällä teroitettua ruostumatonta teräsputkea (sisälä-pimitta 3 mm) , joka oli kiinnitetty porakoneeseen. Kylläs-10 tetty levy pantiin kullekin yhteiselle päävaltimolle termoelementin yläpuolelle. FeCl3:n lisäämisen ja lämpötilan äkillisen alentumisen välinen aika tallennettiin aikana suonen tukkeutumiseen (TTO). Keskimääräistä aikaa, joka oli tarpeen kummankin suonen tukkimiseen, käytettiin esit-15 tämään TTO:ta kunkin eläimen osalta.

Koeyhdisteet liuotettiin isotooniseen suolaliuokseen. Rohdosliuosten ruiskutukseen käytettiin käsiruiskua aloittamalla 15 minuuttia ennen FeCl3:n lisäämistä ja jatkamalla 60 minuuttia FeCl3:n lisäämisen jälkeen. Piirret-20 tiin annos-reaktio-käyrät ruiskutettujen annosten log10-arvojen ja vaurioitettujen valtimoiden TTO-arvojen välisen suhteen määrittämiseksi. Hyytymisen vastaisen aktiivisuu- .·. den vertailuindeksi määritettiin käyristä laskemalla ruis- • · · l keannos, joka oli tarpeen verivirtauksen säilyttämiseksi • · · .“I 25 50 minuutin ajan (ED 50 min) .

• · · • 1 · **·/ Suonen tukkeutumisen ja äkillisen lämpötilan alen- • · · tumisen välinen yhteys todettiin tallentamalla samanaikai- • · 2 sesti lämpötila ja verivirtaus samalle piirturille. Puis- 2 • · · ·.· · si-Doppler-virtauskoetin pantiin yhteisen päävaltimon ym- 30 pärille termoelementin läheisyyteen. Koetin tallensi muu- *:1·· tokset virtausnopeudessa; sen vuoksi asennus suoritettiin ·3. kohdalle, jossa tukkeumaa ei ilmennyt ja suonen sisäläpi- • · 1 . 1. mitta pysyi vakaana johtuen laajentumisesta nestemäisellä • · · 3 ' verellä. Perusviiva-lämpötila ja virtausnopeus (määritetty • ♦ *·..1 35 laitteella Directional Pulsed Doppler Flowmeter, Model ·1·.. 545-C, University of Iowa Bioengineering) tallennettiin « 107733 21 ennen 35-%:isen ferrikloridin lisäämistä. Tulokset ilmoitettiin prosentuaalisena muutoksena alkuperäisistä perusviiva-arvioista (6 minuuttia ennen tukkeumaa). Aika, jolloin suonen lämpötila alentui nopeasti, todettiin mieli-5 valtaisesti nollana ja tukkeumaa edeltävänä ja sen jälkeisenä lämpötilana ja virtausarvot katsottiin tuolta kohdalta .

Seuraavassa taulukossa ovat tulokset, jotka on saatu koeyhdisteillä edellä selostetussa kemiallisesti aiheu-10 tetussa tukkeumakokeessa rotalla.

TAULUKKO 3

Hyytymistä estävä aktiivisuus versus valtimotukos rotalla EDgo1

Koevhdiste (A(C=Q). kaava 1 (ma/kq/tunti) 15 N-Boc-D-fenyyliglysyyli 2,9 N-Boc-D-sykloheksyyliglysyyli 11,3 N-Boc-D-l-naftyyliglysyyli 6,4 N-Boc-DL-l-naftyyliglysyyli 5,5 N-Boc-D-2-naftyyliglysyyli NA2 20 _ 1/ ED50 on ruiskeannos, joka tarvitaan verivirtauksen säilyttämiseksi 50 minuutin ajaksi.

.·. 2/ Ei aktiivinen annosten ollessa 4 mg/kg/tunti tai 7 mg/- kg/tunti, suurimmat kokeillut annokset.

• · · 25 • · · • · · *'*.* Keksinnön mukaisesti valmistetut yhdisteet estävät • · · ···* tulpan muodostumista häiritsemättä oleellisesti kehon aineiden luonnollista tulppaa liuottavaa kykyä, • · · *.· · yhdisteillä on esim. alhainen ehkäisevä vaikutus 30 fibrinolyysiin.

·;·*: Tässä kuvataan myös menetelmä veritulppien muodostumisen ehkäisemiseksi ihmisellä ja eläimillä, jossa • · · . ihmiselle tai eläimelle annetaan tehoava tulpan muodostu- • · · :*j#: mistä ehkäisevä ei-toksinen annos kaavan 1 mukaista yhdis- • · *···* 35 tettä. Hyytymistä ehkäisevää yhdistettä annetaan suun kautta, parenteraalisesti, esim. laskimoruiskeena (iv) , • · 107733 22 lihaksensisäisenä ruiskeena (im) tai ihonalaisesti (se). Ensisijaisesti anto suoritetaan iv-ruiskeena.

Tehokas tulppaa ehkäisevä annos on noin 5 mg - noin 1000 mg. Annosohje voi vaihdella, esim. ennalta ehkäisevää 5 käyttöä varten voidaan antaa yksi päivittäinen annos, tai useita annoksia, kuten 3 tai 5 kertaa päivässä, voi olla sopiva. Kriittisissä hoitotilanteissa keksinnön mukaisesti valmistettuna yhdistettä annetaan iv-ruiskeena määrässä noin 1 mg/kg/tunti - noin 50 mg/kg/tunti ja ensisijaisesti 10 noin 2,5 mg/kg/tunti - noin 25 mg/kg/tunti.

Tässä kuvattua menetelmää käytetään myös tulppaa liuottavan aineen, esim. kudosplasminogeeni-aktivaattorin (tPA), modifioidun tPA:n, streptokinaasin tai urokinaasin kanssa. Tapauksissa, joissa tulppa on muodostunut 15 tapahtunut ja valtimo tai laskimo on salpautunut, joko osittain tai kokonaan, tavallisesti käytetään tulppaa liuottavaa ainetta. Keksinnön mukaisesti valmistettua yhdistettä voidaan antaa liuottavan aineen kanssa tai sen käyttämisen jälkeen estämään tulpan muodostumisen 20 uusiutuminen.

Kuvatussa menetelmässä keksinnön mukaisesti valmistetun edullisen yhdisteen käyttäminen on toivot-tavaa. Käytetään esimerkiksi edullista yhdistettä, joka on • * · . .·. kuvattu edellä. Edullisia peptidejä ovat N-Boc-D-fenyyli- * · · 25 glysyyli-L-propyyli-L-arginiinialdehydi ja N-metyyli-D- * · · ***.' fenyyliglysyyli-L-propyyli-L-arginiinialdehydi, jotka ovat • · · ***\ suolamuodossa, esim. sulfaatteina tai hydroklorideina.

Erityisen edullinen menetelmässä käytettävä yhdiste on N- • · « V ’ (D-l,2,3,4-tetrahydroisokxnolin-1-oyyli) -2-prolyyli-2 - 30 arginiinialdehydisulfaatti.

*ϊ’*ί Tässä kuvataan myös farmaseuttisten valmisteiden ·’**: käyttöä edellä selostetussa terapeuttisessa menetelmässä.

. Kuvattavat farmaseuttiset valmisteet sisältävät • · · * · · "*.* tehokkaasti tukosta ehkäisevän määrän kaavan 1 mukaista • · *·;·’ 35 yhdistettä ja farmaseuttisesti hyväksyttävää kantajaa.

• · j Suun kautta antoa varten hyytymistä ehkäisevä yhdiste on • · 107733 23 formuloitu gelatiinikapseleiksi tai tableteiksi, jotka voivat sisältää apuaineita kuten sideaineita, liukastavia aineita, hajoamista edistäviä aineita ja näiden kaltaisia aineita. Parenteraalista antoa varten hyytymistä estävä 5 aine formuloidaan farmaseuttisesti hyväksyttävään laimen-timeen, esim. fysiologiseen suolaliuokseen (0,9 %), 5-%:iseen glukoosiin, Ringer'in liuokseen ja näiden kaltaisiin liuoksiin.

Keksinnön mukaisesti valmistettu hyytymistä 10 ehkäisevä yhdiste voidaan formuloida annosyksikkö- valmisteiksi, jotka sisältävät noin 1 mg - noin 1000 mg olevan annoksen. Edullisesti yhdiste on farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan muodossa, kuten esimerkiksi sulfaattisuolan, asetaattisuolan tai fosfaattisuolan 15 muodossa. Eräs esimerkki annosyksikkövalmistemuodosta käsittää 5 mg N-Boc-D-fenyyliglysyyli-L-propyyli-L-arginiinialdehydisulfaattisuolaa 10 ml:n steriilissä lasiampullissa. Toinen esimerkki annosyksikkövalmistemuodosta käsittää noin 10 mg N-metyyli-D-20 fenyyliglysyyli-L-propyyli-L-arginiinialdehydisulfaattia 20 ml:ssa isotonista suolaliuosta, joka on steriilissä ampullissa.

Edullinen valmistemuoto on annosyksikkömuoto, joka • · · . .·. sisältää välillä 5 mg - 50 mg N-(D-l, 2,3,4-tetrahyd- • · · • · · ; 25 roisokinolin-l-oyyli)-L-prolyyli-L-arginiinialdehydisul- • · · "V faattia steriileissä ampulleissa.

• · · **·· Seuraavat esimerkit on tarkoitettu keksinnön kuvaamiseksi edelleen eikä niitä pidä katsoa sitä • · · • · · * rajoittaviksi.

30 Seuraavissa esimerkeissä esitetyt Rf-arvot määritettiin ohutlevykromatograf isesti silikageelillä ·**’: käyttämällä valmistetta Kieselgel 60F-254 (Merck, ··· . *. Darmstadt) seuraavissa liuotinsysteemeissä: ♦ · ♦ **·.· (A) kloroformi-metanoli-etikkahappo, 135:15:1, v:v:v, • · *···* 35 (B) etyyliasetaatti-etikkahappo-absoluuttinen etanoli, Γ·.. 90:10:10, V:V:V, • · 107733 24 (C) kloroformi-metanoli-etikkahappo, 90:30:5, v:v:v. Analyyttiset HPLC-menetelmät, joita käytettiin esimerkeissä, olivat seuraavat:

Menetelmä 1. Waters 600 E jossa Vydac C18-5 käänteisfaasikolonni, 0,46 cm x 10 cm. Kromatogrammia tarkkailtiin LDC:llä aallonpituudella 220 nM käyttämällä gradienttina A = 0,01 M ammoniumasetaattia ja B = asetonitriiliä.

Menetelmä 2. Pharmacia FPLC jossa PepRPC-kolonni, 10 mitoiltaan 0,5 cm x 5,0 cm. Tarkkailu tehtiin Pharmacia UV-M:llä aallonpituudella 214 nM käyttämällä gradienttina joko A = 0,01 M ammoniumasetaattia tai B = asetonitriiliä.

Esimerkeissä käytetyillä lyhenteillä on seuraavat merkitykset.

15 Aminohapot: Arg = arginiini, Pro = proliini, Phg = fenyyliglysiini

Boc = t-butyylioksikarbonyyli

Bzl = bentsyyli

Cbz = bentsyylioksikarbonyyli 20 DCC = disykloheksyylikarbodi-imidi DMF = dimetyyliformamidi DMSO = dimetyylisulfoksidi .·. FAB-MS = fast atom bombardment mass spectrum • · ♦ . #·# FD-MS = field desorption mass spectrum • · · .’1! 25 THF = tetrahydrofuraani • · · ***.’ TLC = ohutlevykromatograf ia ··♦ • · · · • · «·· ♦ · ♦ ♦ · · • · • · · • · • · # • « • · · • · · • · · · • · · • · • « • · · • · · • · • · · 107733 25

Esimerkki 1 N-Boc-D-fenyyliglysyyli-L-prolyyli-L-arginiinialdehydi (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H)-hemisulfaatti 1) Boc-D-Phg-Pro-OBzl 5 Liuos, jossa oli Boc-D-fenyyliglysiiniä (15,0 g, 59,7 mmoolia) ja proliini-bentsyyliesteri-hydrokloridia (14,43 g, 59,7 mmoolia) 60 ml:ssa DMF:a, jäähdytettiin 0°C:seen ja lisättiin N,N-di-isopropyylietyyliamiinia (10,3 ml, 59,7 mmoolia) ja sen jälkeen 1-hydroksibentsot-10 riatsolihydraattia (8,1 g, 59,7 mmoolia) ja DCC:tä (12,3 g, 59,7 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin 3 päivää huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen se suodatettiin ja suodos haihdutettiin öljyksi vakuumissa. Öljy liuotettiin 200 ml:aan etyyliasetaattia ja 150 ml:aan vettä ja ravistelun 15 jälkeen orgaaninen kerros erotettiin, pestiin kolme kertaa 100 ml:n erillä 0,1 N. HCl:a, kerran 150 ml:lla vettä, kolme kertaa 100 ml:n erällä 5-%:sta natriumkarbonaattia ja jälleen 150 ml :11a vettä. Pesty orgaaninen liuos kuivattiin MgS04:lla ja haihdutettiin sitten kuiviin 20 vakuumissa, jolloin saatiin 24,8 g yhdistettä Boc-D-Phg-Pro-OBzl kiinteänä aineena (95 % teoreettisesta): TLC Rf (A) 0,75; FAB-MS 439 (M+).

2) Boc -D - Phg- Pro -OH

• · · • · · . .·. Edellä selostetulla tavalla saatu tuote Boc-D-Phg- ♦ · · • 25 Pro-OBzl (24,5 g, 55,7 mmoolia) liuotettiin 40 ml: aan • · m ***.* DMF:a ja 225 ml:aan isopropyylialkoholia ja liuokseen li- • · · •***# sättiin 1,0 g 5-%:ista Pd/hiili-katalyyttiä. Reaktioseok- seen johdettiin kuplina kaasudispersioputken kautta typpeä • · « • · · *.· * ja sitten sen läpi johdettiin kuplina vetyä 16 tuntia ja 30 sen jälkeen huuhtelutyppeä 5 minuutin ajan. Katalyytti *:**: suodatettiin hyflosuodatinpatjän läpi ja suodos haihdutet- ·***: tiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin kiinteätä ««· . *. jäännöstä. Jäännös kiteytettiin dietyylieetteristä, jossa t · « **;/ oli pieni määrä etyyliasetaattia. Saatiin 10,35 g de-es- « · *·♦·* 35 teröityä tuotetta, Boc-D-Phg-Pro (2) , saanto 53 %; TLC Rf !*♦.. (A) 0,32; FAB-MS 349 (MH+) ; • · 107733 26 'H MR (DMSO-d6) , δΐ,35 (s, 9H) , 1,71-2,10 (m, 4H) , 3,10 (m, 1H) , 3,74 (M, 1H) , 4,20 (τη, 1H) , 5,45 (d, 1H), 7,09 (d, 1H), 7,25-7,40 (m, 5H), 12,50 (bs, 1H).

5 3) Boc-L-Arg(Cbz)-OH

N-Boc-arginiini-hydrokloridia (Boc-Arg-OH.HC1) (82,1 g, 250 mmoolia) liuotettiin 240 ml:aan 5 N. NaOHra 3-kaulaisessa pyöräpohjaisessa pullossa. Liuos jäähdytettiin -5°C:seen ja bentsyyliklooriformiaattia 10 (143 ml, 1,0 moolia, 4 ekv.) lisättiin tiputtamalla 55 mi nuutin aikana pitämällä seoksen pH välillä 13,2-13,5 5 N NaOH:lla (250 ml). Reaktioseosta sekoitettiin tunnin ajan -5°C:ssa klooritormiaatin lisäyksen päätyttyä. Reaktioseos laimennettiin 100 ml :11a vettä ja 500 ml :11a dietyylieet-15 teriä ja vesikerros erotettiin ja uutettiin kahdesti 40 ml:n erillä dietyylieetteriä. Vesikerros tehtiin happamek-si pH-arvoon 3,0 3 N H2S04:llä (560 ml) ja uutettiin 550 ml :11a etyyliasetaattia. Erotettu vesikerros uutettiin kerran etyyliasetaatilla ja uute yhdistettiin aikaisemman 20 etyyliasetaattiuutteen kanssa. Yhdistetyt uutteet pestiin vedellä, kuivattiin MgS04:lla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäännöstä trituroitiin .*· eetterin kanssa ja saostunut tuote suodatettiin erilleen ··· . .·, ja kuivattiin. Saatiin 66,1 g yhdistettä (3) • · • *].% 25 Boc-Arg (Dbz)-OH (65 % teoreettisesta): TLC Rf (C) 0,43; FD- J*Y MS 408 (M+) .

··· ***:. *Η NMR (CDC13) , Öl, 42 (s, 9H) , 1,61-1,91 (m, 4H) , 3,23-3,41 (m, 2H) , 4,17 (d, 1H) , 5,21 (s, 2H) , • · · : 5,62 (d, 1H) , 7,30-7,42 (m, 6H) , 8,37 (m, 1H) .

30 4) Boc-Arg(Cbz)-laktaami *J**: Liuos, jossa oli edellä selostetulla tavalla val- ·***: mistettua yhdistettä Boc-Arg (Cbz)-OH (3) (66,0 g, 0,162 . moolia) 230 ml:ssa kuivaa THF:a, jäähdytettiin -10°C:seen • · · • · · ***.· jää-asetoni-hauteessa. Kylmään liuokseen lisättiin N-me- » · ***** 35 tyylimorfoliinia (18,7 ml, 1,05 ekv.) ja sen jälkeen iso- :**.. butyyliklooriformiaattia (22,5 ml, 1,05 ekv.) ja seosta • · 107733 27

sekoitettiin 5 minuuttia -10°C:ssa. Seuraavaksi lisättiin trietyyliamiinia (23,5 ml, 1,05 ekv.) ja seosta sekoitettiin tunnin ajan -10°C:ssa ja huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Reaktioseos kaadettiin litraan jää-vesi-seosta ja 5 tuote (4) saostui. Sakka suodatettiin erilleen, pestiin kylmällä vedellä, kuivattiin vakuumissa, ja kiteytettiin etyyliasetaatista. Saatiin 38,05 g (60 % teoreettisesta) tuotetta 4, Boc-Arg (Cbz)-laktaamia: TLC Rf (A) 0,77; FD-MS

391 (MH+).

10 ΧΗ NMR (CDC13) Ö1,48 (s, 9H) , 1,78-1,98 (m, 2H) , 2,50 (m, 1H), 3,41 (m, 1H), 4,43 (m, 1H), 4,90 (m, 1H), 4,16 (s, 2H), 5,27 (m, 1H), 7,28-7,45 (m, 6H), 9,41 (m, 1H), 9,68 (m, 1H).

5) Arg(Cbz)-laktaami-trifluoriasetaattisuola 15 Boc-Arg(Cbz)-laktaamia (4) (38,0 g, 0,097 moolia) sekoitettiin 200 ml:n kanssa trifluorietikkahappoa, jossa oli 2 0 ml anisolia ja seosta sekoitettiin 0°C-.ssa tunnin ajan. Reaktioseosta haihdutettiin vakuumissa lämmittämättä ja jäännökseen lisättiin 400 ml dietyylieetteriä. Muodos-20 tunut kiinteä aine suodatettiin erilleen, pestiin dietyy-lieetterillä ja kuivattiin vakuumissa. Saatiin 40,5 g tuotetta (5) trifluoriasetaattisuolana: TCL Rf (C) 0,29; FD-MS 291 (MH+) .

♦ · · ««· . 6) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz) -laktaami * ·· * j #·# 25 Yhdisteen Boc-D-Phg-Pro (14,6 mmoolia) , jota oli • ♦ ♦ **V valmistettu kuten on selostettu edellä osassa 2, liuokseen ··· *·**. 80 ml:ssa DMF:a, jäähdytettynä -15°C:seen, lisättiin 4,6 ml N-metyylimorfoliinia ja sen jälkeen 5,4 ml isobutyyli- • · ♦ * klooriformiaattia ja reaktioseosta sekoitettiin kaksi mi- 30 nuuttia -15°C:ssa.

*·’” Erillisessä pullossa TFA . Arg (Cbz) -laktaamia ·***: (15,3 g, 37,8 mmoolia, valmistettu kuten on selostettu ··» . *. edellä osassa 5) liuotettiin 30 ml:aan DMF:a, liuos jääh- • · · · · · *!*.’ dytettiin 0°C:seen ja lisättiin 4,6 ml N-metyylimorfolii- • · *···* 35 nia. Sen jälkeen kun liuosta oli sekoitettu 0°C:ssa kaksi : minuuttia, se kaadettiin edellä selostetulla tavalla vai- • · 107733 28 mistettuun Boc-D-Phg-Pro-liuokseen. Saatua reaktioseosta sekoitettiin 4 tuntia -15°C:ssa ja sitten sen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan yön aikana. NaHC03:n 5-prosenttista liuosta (5 ml) lisättiin reaktioseokseen, joka haih-5 dutettiin sitten kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin öljyä. Öljy liuotettiin 175 ml:aan etyyliasetaattia ja lisättiin 150 ml vettä. Ravistelun jälkeen organinen kerros erotettiin, pestiin 5-%:sella NaHC03:lla ja vedellä, kuivattiin MgS04:11a ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolio loin saatiin 23,0 g Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-laktaamia (6) amorfisena kiinteänä aineena (saanto 98 %) . TLC Rf (A) 0,72. FAB-MS 621 (MH+).

7) Boc-D-Phg-Pro-Arg(Cbz)-H

Laktaami (6) (23,0 g, 37 mmoolia), jota oli saatu 15 edellä osassa 6 selostetulla tavalla, liuotettiin 200 mitään kuivaa THF:a ja liuos jäähdytettiin -15°C:seen typ-piatmosfäärin suojaamana. Kylmään liuokseen lisättiin tiputtamalla 10 minuutin aikana 1 M litiumaluminiumhybridin THF-liuosta (37 ml, 37 mmoolia) ja lisäyksen 20 päätyttyä reaktioseos lämmitettiin 0°C:seen ja sekoitettiin tunnin ajan. Seokseen lisättiin 10 minuutin aikana hitaasti tiputtamalla liuos, jossa oli 12 ml THF:a ja 12 . ml 0,5 N H2S04:a. Reaktioseos laimennettiin 200 ml:lla ♦ ·· . etyyliasetaattia ja 200 ml:lla vettä ja, ravistelun 4·· j .·. 25 jälkeen, erotettiin orgaaninen kerros. Orgaaninen kerros * · · **V pestiin 3 kertaa 150 ml:n erillä vettä, kuivattiin **“. MgS04:lla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 19,2 g (saanto 83 %) yhdistettä Boc-D-Phg-Pro-Arg (Cbz) -H. FAB-MS 623 (MH+) . [aJD = -66,1°, C = 0,5, 3 0 CHClj.

8) Boc-D-Phg-Pro-Arg-Η -hemisulfaatti *[*[: Boc-D-Phg-Pro-Arg (Cbz)-H (7) (18,2 g, 29,2 mmoolia) • *· liuotettiin 100 ml:aan THF:a ja 100 ml:aan vettä ja liuok- * * · ^ seen lisättiin 29,2 ml 1 N H2S04:a ja 2 g • · **“* 35 10-%:sta Pd/C:tä. Suspensioon johdettiin kuplina typpeä 5 ·» • minuuttia kaasudispersioputken kautta ja sen jälkeen vetyä • · 29 107733 4 tunnin ajan. Pelkistyksen päätyttyä typpeä johdettiin jälleen kuplina 5 minuutin ajan. Reaktioseos suodatettiin hyflo-patjan läpi katalyytin poistamiseksi ja suodos konsentroitiin 100 ml:n tilavuiseksi haihduttamalla 5 vakuumissa. Vesipitoiseen konsentraattiin lisättiin 200 ml n-butanolia ja orgaaninen kerros erotettiin vesi- kerroksesta. Vesikerros uutettiin kolme kertaa 100 ml:n erillä n-butanolia ja uutteet yhdistettiin ja lisättiin orgaaniseen kerrokseen. Orgaaninen kerros haihdutettiin 10 kuiviin vakuumissa, jäännöstä trituroitiin dietyylieette- ri/di-isopropyyli-eetterillä, 1:1, v:v, ja kiinteä aine suodatettiin erilleen ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 10,26 g raakaa tuotetta (8). Raaka materiaali liuotettiin seokseen, jossa oli 10 % asetonitriiliä vedes- 15 sä ja liuos pantiin 7,5 cm x 53 cm:n kolonniin, jossa oli HP-20 hartsia, joka oli aikaisemmin tasapainotettu 10 % asetonitriiliä sisältävässä vedessä. Tuote eluoitiin kolonnista eluoimalla asteettain käyttämällä lisääntyvin konsentraatioin asetonitriiliä vedessä (10 % - 12 % - 15 20 %) . Useita fraktioita yhdistettiin ja analysoitiin tuote käänteisfaasi-HPLC:n avulla. Tuotetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin . ·*· 5,42 g puhdasta tuotetta, Boc-D-Phg-Pro-Arg-H-hemisul- . faattia (saanto 53 %) : [a]D = -125,6°, C = 0,5 CHC13; FAB- • · · j 25 MS 489 (MH+) ; retentioaika RP-HPLC:a käytettäessä ♦ · · ***.* (menetelmä 2, 10-50 % B:tä/45 min., aika = 32,3 min.

··· ···· • · ♦ ·· • · · • · · ♦ · ·«· • · ·· · ♦ · .» « · ··♦ · ·«· • · « · ··« 1 ♦ · • · • ·· ♦ 30 107733

Esimerkki 2 N- (t-butyylioksikarbonyyli) -D-fenyyliglysyyli-L-prolyyli-L-arginiinialdehydi (Boc-D-Phg-Pro-Arg-H) -diasetaattisuo-la 5 Liuokseen, jossa oli yhdistettä Boc-D-Phg-Pro-Arg- (Cbz)-H, jota oli valmistettu kuten on selostettu esimerkin 1 osassa 7 (38,0 g, 61 mmoolia) 500 ml:ssa isopropyy-lialkoholia, jossa oli 7,1 ml (2 ekv.) etikkahappoa, lisättiin 2,0 g 10-%:sta Pd-hiili-katalyyttiä. Seos huuhdel-10 tiin typellä johtamalla sitä kaasudispersiotuubin kautta 5 minuutin ajan ja sitten seoksen läpi johdettiin vetyä 24 tunnin ajan. Pelkistyksen päätyttyä typpeä johdettiin jälleen seoksen läpi 5 minuutin ajan. Reaktioseos suodatettiin Hyflo-kerroksen läpi katalyytin poistamiseksi 15 ja suodos haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 33,6 raakaa tuotetta amorfisena kiinteänä aineena. Tuote puhdistettiin 5 g:n erin 5 cm:n x 25 cm:n Vydac (^-kolonnissa. Tripeptidi-tuotetta eluoitiin 8 tuntia käyttäen gradientein 10-30 % asetonitriiliä 0,01 M ammoniumase- 20 taatissa. Kerättiin useita fraktioita ja fraktiot, jotka sisälsivät tuotetta käänteisfaasi-HPLC:n perusteella, yhdistettiin ja kuivattiin jäädyttämällä. Saatiin 11,7 g (35 ·'. %-.n saanto) otsikon tripeptidiä, jonka ominaisuudet olivat

»•I

. ,·, seuraavat: • · 25 FAB-MS 489 (MH+) f · « **V Aminohappo - analyysi: Phg = 1,07, Pro = 0,94 [a]D = -108,9° (C = 0,5, CHC13)

Alkuaineanalyysi laskettu yhdisteelle C28H44N609 : V *’ teoreettinen: C, 55,25; H, 7,29; H, 13,81 30 saatu: C, 55,52; H, 7,40; N, 13,93.

*ϊ1ί Retentioaika: 31,9 min, HPLC:ssa menetelmällä 2; ·*": 10-50 % B 45 min. aikana.

·«· .*. Yhdisteitä, jotka on luonnehdittu seuraavissa esi- • ♦ · * *!’,* merkeissä 3-4, saatiin noudattamalla esimerkissä 1 selos- • « ·;·’ 3 5 tettuja menetelmiä, jolloin esimerkin 1 fenyyliglysiini ·« j ·.. oli korvattu mainitulla naftyyliglysiinillä ja p-hydroksi- • · 31 107733 fenyyliglysiinillä.

Esimerkki 3 N-Boc-D-l-naftyyliglysyyli-Pro-Arg-H-diasetaatti [a]D = +18,87°, C = 0,5, 50-%:nen etikkahappo FAB-MS 5 (MH+) 539 HPLC-menetelmä 1, gradientein: 20 % - 60 % B:tä 60 min. aikana.

Retentioaika = 42,0 min.

Esimerkki 4 10 N-Boc-D-2-naftyyliglysyyli-Pro-Arg-H-diasetaatti HPLC-menetelmä 2, gradientein 3 0 % - 60 % B:tä 60 min. aikana.

Retentioaika = 18,0 min.

Alkuaineanalyysi laskettu yhdisteelle C32H46N609 : 15 teoreettinen: C, 58,35; H, 7,04; N, 12,76 saatu: C, 58,59; H, 6,83; N, 13,03.

Esimerkki 5 N-Boc-D- (4-hydroksifenyyliglysyyli)-Pro-Arg-H-diasetaatti HPLC-menetelmä 2, gradientein 10 % - 40 % B:tä 4 0 20 min. aikana.

Retentioaika = 26,5 min.

Aminohappoanalyysi: 4-hydroksifenyyliglysiini = .\ 0,99, ··· . proliini = 1,01.

• · · .’’I 25 Esimerkit 6-23 ♦ · · —.......

• 1 · **V Seuraavassa taulukossa 4 lueteltuja yhdisteitä vai- ··· ···· mistettiin esimerkissä 1 selostetuin kytkentämenetelmin korvaamalla esimerkissä 1 käytetty D-fenyyliglysiini mai- ·.· · nitulla aminohapolla tai substituoidulla etikkahapolla 30 [A(C=0)]. Kaikki taulukon 4 yhdisteet ovat asetaatti-suo- *I**t lamuotoja.

* ··· • · i: : ··· · ··1 • · • · ··· ·· • · • tt « 107733 π5 λ; ^ ^ffiNricnovDooiiiLnmwjcDiirn σ νο η< oq ο in 23 ^r-cNCNioHowoiooHCNmcor- σι o ιο oq lo η -h-h ^(N^oinojHroHm^tNtNoimm η< σ oq oq oq lo

B-S

(ϋ Ρ 0) oi 0·β..ββββ*βββ*ββββ β *|I! β ·Η β G -H ·Η ‘H ·γΗ -H -H -H ·Η -H -H -H -H G £} £ Ch ε ·η e -h -h e ε ε ε e e e ε e e ε e -h -h -h -h _ ε ε e ε ε ε ε ° m oloooloololoooo o ^Ο'^ΟΟ'ψ^^^'ίΙΰ'ϊ^ΙΟΙϋΙί VD o oo o σ ιο ^ io io ie io rs 'M Ή Ή -H -M -H Ή -H -H -H -H -H -H "H :fd :tÖ -H 'H -H i—I -H -H i—I r—I ι—I i—li—li—li—li—I rH i—li—I ' i—| -H -H -H -H £

E -M -Η, I κΗ 1—I I—I t-H r-H r-H rH t>S rH iH rH ΪΗ iH ^H 1—I I—I I—I I—I i—I

^ ^ m ^ ^ ^ · >1 >1 >1 Q> d> Ö W CQ CQCQCQCQCQCQCQPQCQPQCQ CQ p j_)(D cQcqa mmmcQtu CL) -rH o\° 0\o 0\o 0\o „\o o\o 0\o 0\o o\o 0\o „\o 0\o 0\o 0\o g

β TS O „\o o o\° o\° O O IX) O O O O O O O O O o\° o\° o\° o\° <D

a> tö ^oiiioosfin^^LfiM/uiiioirun 10 o oo o g HM 1 lti ι ^t· lti ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι ι i m lo lo id I Ö o\° I o\° I I o\° o\° o\° o\<> o\° o\° o\° o\° o\° o\° o\° o\° I II I pj U ° o\° O o\° o\° O O O O O O O O O O O O o\° o\° o\° o\° p ι-Q ^ Ι/ΙΗΙ/ΙΙΠγΙΗγΙγΙΗγΙγΙγΙγΙγΙΗ CN σ l/l LH LO p MS ^HtNHMNNC^MNOJOqNHCNCN iH CN O] oq CN p m

ffi O

I ι—I

p σσσοισ'Ρ<χ)σΓΗΐοι>ιχΐ(ηιοι>[^· lo σ in h c- <u sji co σ ld o o o co rH lo σ lo co oo σ o o i-ι rH iHcn σ cq pH h. '},ιηιη^ιη^πιη'ί'ίΐηιηθί}ΐι/ιιη lo ^ lo

O ι s :tC

« O ^ -H -h

r*S M , T1 -M 1 rH

O p-ι ‘M L1 1— -H -H d) ι Ί | ι I »>1 rH i—I ι—I 'Φ Ö — >i CQ>, I iH IH d) 3 O ^ -H >1 ω -H β ΪΗ >i II ro Ή rH rH >1 -H rH -H β β β cj ϊ>ιι—ι tn η ι—ι ϊη,—ι on) o

—- Ή £h rH-Η tj) >,SO ι I Λ W

<C tn >h Μιη-η :h ω β β β μ ι =m •Η ζβ *H rH tH-H ι—I ·Η Ή CQ |Η·Η ·Η -H (¾ -— £

ι—I Ή tHi—I rH PHi—I |Hi—I ι—I jHrH Pi ι—I ι—I Psri -ιΗ j—I

-H -H fHrH H N Ö1 β tH >s >s |H H tJlO Ο Ο -H rH d) hh SNtnS h d) S ö S >s-h cd-h cq β β ih >i p >i >i P >vH P Η Ή CO (DP-PrH-rlrH-H -H -H !>, >i d) . 1H >r«P P rH d) tH — ίΗΡ d) d> >iH in O Pi Pi [h Ρ β .:: co cq m u in ro ;h-h rH — m m >, ^ O o id) d)

··· >1 >, β CQ S OS βωθ1·Η(Ι)(ΐ![Ι!>,βΌ CQ CQ H E B

• iH rH I m β ·Η 1) Pi Η MH ·Η >, fi J) ·Η H I -H I

ί.: tJlCnCN-Hd)rH4HOrHOiHrHHd)4HX3 O O β M U

·*· -h -h ·—- h h N — p >1 o >i >, trm — β M M -H O J

: .·. rv, rH ι—I H S l -H d) SrH S S'H — -HM T3 "Ö H p (¾ : ίη >i >, ω sp ö -h m ε co Pi β β h -h m p n >h o^h k >r Sa; β I (UH A! ιρί-ΗφίϋΜιΜΟω-Η,β-Η,β-ΗβΡ ··· CP O dJ-HUH l>i O r# <U Γ0 *4H HH S O βΡι—I (CSrH CÖrH-H-H \

...: Φ'ΡΡΡΡ·Η^Ρ'-'Λΐ-Η-ΗββΓΗΙ^ιΜ>ιΜ>ΊΡ:Μ CM

. MiUdJ-dSmaio) ι o^i—ii—ι d)i—ι h ^ Sp S P S O P

·:**: I β H rH >iPi >-r E Q H -S >h-H Pl ^ β (ϋ β d) β Μ ι

— Q i ι t>s P O ι—I ι ipiro>i>spiH<r<-iOPOPO-HrO

... O I HU) SiB-P tJI'rf-H >1-^ ppl\p—'v.QlXiiXlO'-'

..: Il "H I - P E d) Ή ,—I CQ I d) d) CN I OI M Hi M ^i M M I CN

* CJ Hk|l(l)lEHlSilJ£pl lp — fÖ 'β 'βΤ3ιΜ-Η

-- >iPPlSl>,Pi>sQQllQQPHPi|mPimPi>sPP -H

r< Si I β I ö I P I lööl I I l -H - -H ~-Η,βΐ>·ι —Pi PUU I U I CUdJUU ι I UUUUrHCSrHCMrHMUS +Pi a) o o — o-jiOKoo - — o o o o S ' S ' >i cd o ro wm * · Emm+ffi+ppQcöcQm+ifDmpqfri^HSH^i&cciiH gu

... I I 1-1-1 I 1 I I —— I I 1 I I I | i | | t ,—t — E

• : S’z^ni’zKoa^Siaaira^aggiHOHQoDgtn -H

... co ro

• O SM

: s ι

• · · CQ

··* * ^

.···. E M

• · ._J

* · · ^ . 03 OHCNrO^Ln^hCO(TiOH^ m ^ LT) tsD \

·· Ρΰ VDC^CX)a\HHHHHHHHHH03CNJCN <N CNJ 03 CM H

• · • · ·

LO O LO O LO O

c-i rH 03 03 CO

• · 33 107733 D-l, 2,3,4-tefcrahydraisokinolin-l-oyyli-L-propyyli-L-ar-giniinialdehydisulfaatti

Liuokseen, jossa oli isokinoliini-l-karboksyylihap-poa (12,5, 0,072 moolia) 185 ml:ssa jääetikkahappoa, li- 5 sättiin 2 g platinaoksidia ja suspensiota hydrattiin huoneen lämpötilassa 60 psi:n vetypaineessa Parr'in hydraus-laitteessa 24 tuntia. Reaktioseos suodatettiin suodatin-kerroksen läpi (Celite) katalyytin poistamiseksi ja suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Kiinteätä jäännöstä tri-10 turoitiin veden kanssa, suodatettiin ja kuivattiin, jolloin saatiin 8 g (saanto 63 %) DL-1,2,3,4-tetrahydro-iso-kinoliini-l-karboksyylihappoa. FD-massaspektri 178 (MH+); XH NMR (DMSO-dg) : 02,80-3,00 (m, 3H) , 3,15 (m, 1H) , 3,30- 3,40 (m, 2H), 7,05-7,25 (m, 4H), 7,70 (m, 1H).

15 Tuote (7,08 g, 0,04 moolia) liuotettiin 2 N NaOH- liuokseen (40 ml, 0,08 moolia) ja 40 ml:aan t-butyy-lialkoholia ja liuokseen lisättiin 10,5 g (0,048 moolia) di-tert-butyylidikarbonaattia. 24 tunnin sekoittamisen jälkeen huoneen lämpötilassa t-butyylialkoholi-osa haihdu-.20 tettiin reaktioseoksesta. Muodostunut vesiliuos uutettiin dietyylieetterillä, vesikerros erotettiin ja tehtiin hap- . pameksi 2 N HCl:lla pH-arvoon 2,0. Happameksi tehty • * '···' vesifaasi uutettiin etyyliasetaatilla, uute kuivattiin • · · *·!.* MgS04:lla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäljelle • · · 25 jäänyt öljy liuotettiin dietyylieetteriin ja liuokseen ,,*·* lisättiin 7,9 ml (0,04 moolia) disykloheksyyliamiinia. 4 ·;·*: tunnin paikoillaan pitämisen jälkeen 4°C:ssa N-Boc-DL-l,- 2,3,4-tetrahydro-isokinoliini-l-karboksyylihapon disyklo- heksyyliamiinisuola-sakka suodatettiin erilleen, pestiin ,,t>; 30 dietyylieetterillä ja kuivattiin vakuumissa. Saatiin 15,7 • · g (saanto 86 %) puhdasta suolaa. FD-massaspektri 459 ' *:** (mh+) .

• · ·.· · Alkuaineanalyysi laskettu yhdisteelle C27H42N204 : : teoreettinen: C, 70,71; H, 9,23; N, 6,11 • · · ./ 35 saatu: C, 71,07; H, 9,37; N, 5,87.

• M

Boc-suojattu johdannainen (73,4 g, 160 mmoolia) • · 34 107733 suspendoitiin 200 ml:aan etyyliasetaattia ja suspensio pestiin 1,5 N sitruunahapolla ja vedellä, kuivattiin MgS04:lla ja haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäljelle jäänyt öljy liuotettiin etyyliasetaattiin, liuos jäähdy-5 tettiin 0°C:seen ja liuokseen lisättiin 2,4,5-trikloori-fenolia (31,5 g, 150 mmoolia) ja sen jälkeen DCC:tä (33 g, 160 mmoolia). Reaktioseosta sekoitettiin tunnin ajan 0°C:ssa ja huoneen lämpötilassa 1,5 tuntia. Reaktioseos jäähdytettiin 0°C:seen, sakka suodatettiin erilleen ja 10 suodos haihdutettiin kuiviin vakuumissa. Jäljelle· jäänyt öljy liuotettiin 100 ml:aan pyridiniä ja liuokseen lisättiin proliinia (18,42 g, 160 mmoolia) ja trietyyliamiinia (22,3 ml, 160 mmoolia). 24 tunnin sekoittamisen jälkeen huoneen lämpötilassa reaktioseos haihdutettiin kuiviin 15 vakuumissa. Jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin, lisättiin vettä ja pH säädettiin arvoon 9,5 2 N NaOHrlla.

Vesikerros erotettiin, tehtiin happameksi pH-arvoon 2,0 2 N HCl:lla, ja uutettiin etyyliasetaatilla. Uute kuivattiin MgS04:lla, suodatettiin ja haihdutettiin kuiviin 20 vakuumissa. Öljyjäännös liuotettiin metyleenikloridiin ja etyyliasetaattiin. 4 tuntia paikoillaan pitämisen jälkeen 4°C:ssa liuoksessa muodostunut sakka suodatettiin eril- • · *.:·* leen, pestiin etyyliasetaatilla ja kiteytettiin uudelleen metyleenikloridi/etyyliasetaatti-seoksesta.

• · ·.· · 25 Kiinteä tuote, Boc-D-1,2,3,4-tetrahydroisokinolin-l-oyyli- *:* L-proliini (Boc-D-l-Tiq-Pro-OH) , kuivattiin vakuumissa, ♦ ··· ♦;··· jolloin saatiin 19,6 g 33 %:n saannoin puhdasta tuotetta.

TLC Rf (A) 0,44; FAB-MS, 375 (MH+) ;

Alkuaineanalyysi laskettu yhdisteelle C2oH26N205 : 30 teoreettinen: C, 64,15; H, 7,00; N, 7,48 ... saatu: C, 63,26; H, 6,98; N, 7,52.

• · ·;·* [a]D = +43,14°, C = 0,5, metanoli.

Ensimmäisessä pullossa Boc-D-l-Tiq-Pro (17,8 g, :***; 47,5 mmoolia) liuotettiin 100 ml:aan DMF:a, liuos jäähdy- ..* 35 tettiin -15°C:seen ja lisättiin 5,3 ml (52,3 mmoolia) N- • ♦ * ” metyylimorfoliinia ja 6,2 ml (47,5 mmoolia) isobutyyli- • · 35 107733 klooriformiaattia. Seosta sekoitettiin -15°C:ssa kaksi minuuttia.

Toisessa pullossa Cbz-suojattu arginiinilaktaami trifluoriasetaattisuolana [Arg(Z)-laktaami.TFA] (19,2 g, 5 47,5 mmoolia) liuotettiin 40 ml:aan DMF:a, liuos jäähdy tettiin 0°C:seen ja lisättiin 5,3 ml (52,3 mmoolia) N-me-tyylimorfoliinia. Seosta sekoitettiin 2 minuuttia 0°C:ssa ennen lisäämistä ensimmäiseen pulloon. Reaktioseosta sekoitettiin 4 tuntia -15°C:ssa, lämmitettiin sitten hitaas-10 ti huoneen lämpötilaan yön aikana ja lisättiin 5 ml 5-%:sta NaHC03:a. Reaktioseos haihdutettiin kuiviin vakuumis-sa, jolloin saatiin öljyä. Öljy liuotettiin 175 ml:aan etyyliasetaattia ja liuokseen lisättiin 150 ml vettä. Orgaaninen kerros erotettiin, pestiin 5-%:sella 15 NaHC03:lla, vedellä, 0,1 N HClrlla ja jälleen vedellä ennen kuivaamista MgS04:lla. Pesty ja kuivattu liuos haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 24,3 g (saanto 79 %) tuotetta, Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg (Z)-laktaamia amorfisena kiinteänä aineena.

2 0 TLC Rf (A) 0,71 FAB-MS 647 (MH+) [a]D = -32,8°, C = 0,5 kloroformi.

• ·

Edellä saatu Arg (Z)-laktaami tuote (23,4 g, 36,2 mmoolia) liuotettiin 300 ml:aan kuivaa THF:a ja liuos suo- • · :.· · 25 jättiin N2:lla. Liuos jäähdytettiin - 20°C:seen ja a *i* kylmään liuokseen lisättiin tiputtamalla 3 0 minuutin ai- ·;··: kana 37 ml litiumaluminiumhybridin 1 M liuosta THF:ssa (37 ;*·*. mmoolia) . Lisäyksen päätyttyä seosta sekoitettiin 20°C:ssa 30 minuuttia, ja 10 minuutin aikana lisättiin

tt<>. 30 tiputtamalla liuos, jossa oli 20 ml THF:a ja 20 ml 0,5 N

• · ... H2S04: a. Reaktioseos laimennettiin 400 ml :11a etyy- **· liasetaattia ja lisättiin 400 ml vettä. Orgaaninen kerros • · ♦.· j erotettiin, pestiin kahdesti 150 ml:n erillä vettä ja kuivattiin MgS04:lla. Pesty ja kuivattu orgaaninen kerros «1« ./ 35 haihdutettiin kuiviin vakuumissa, jolloin saatiin 21 g ’ . (saanto 89 %) tuotetta, Boc-D-l-Tiq-Pro-Arg(Z)-H, amorfi- a · 36 107733 sena kiinteänä aineena.

TLC Rf (A) 0,28

Arg(Z)-H-tuotetta, jota oli saatu edellä selostetulla tavalla, hydrattiin seuraavalla tavalla Cbz-suoja-5 ryhmän poistamiseksi. Tuote (18,1 g 27,9 mmoolia) liuotettiin 200 ml:aan THF:a ja 80 mitään vettä ja lisättiin 28 ml 1 N H2S04: a ja 3,0 g 5-%:sta Pd/hiiltä. Suspension läpi johdettiin kuplina typpeä kaasudispersioputken kautta 5 minuutin ajan, sen jälkeen vetyä 5 tunnin ajan ja sen 10 jälkeen typpeä 5 minuutin ajan. Katalyytti suodatettiin pois ja suodos konsentroitiin 100 ml:n tilavuiseksi. Kon-sentraatti laimennettiin 200 ml :11a n-butanolia ja kerrokset erotettiin. Vesikerros uutettiin kolme kertaa 100 ml:n erillä n-butanolia ja uutteet yhdistettiin orgaanisen ker-15 roksen kanssa. Orgaaninen kerros haihdutettiin kuiviin vakuumissa, ja reaktiotuote-jäännöstä trituroitiin seoksen dietyylieetteri:di-isopropyylieetteri kanssa, 1:1, v-.v, kiinteä aine suodatettiin erilleen ja kuivattiin vakuumissa, jolloin saatiin 11,08 g raakaa 20 tuotetta.

Tuote puhdistettiin ja saatiin sulfaat,tisuolana seuraavalla tavalla. Edellä selostetulla tavalla saatu • ♦

**··* raaka tuote liuotettiin 20 ml:aan vettä ja 20 ml:aan 10 N

H2S04:a. Liuosta lämmitettiin 50°C:ssa 25 minuuttia, • * : 25 jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja liuoksen pH säädet- #<*ί* tiin arvoon 4,0 Bio-Rad AGl-X8-hartsilla (hydroksi-muodol- *:··· la) . Hartsi erotettiin liuoksesta suodattamalla ja liuos .*j*; lyof ilisoitiin, jolloin saatiin 8,44 g raakaa tuotetta sulfaattisuolana, D-l-Tiq-Pro-Arg-H.H2S04.

30 Sulf aattisuola (4,2 g) liuotettiin 0,01-%: seen • · ... H2S04:ään ja liuos pantiin kahteen sarjana olevaan, kool- « « ' *" taan 5 cm x 25 cm olevaan HPLC-kääntei sf aasi-kolonnaan • · \ (Vydac C18-hartsia) . Tuotesuolan eluointiin käytettiin kas- :***; vavin konsentraatioin asetonitriiliä gradientein 2 % - 10 ··· ..] 35 %. Kerättiin fraktioita ja yhdistettiin analyyttisen RP- ♦ · ·

* . HPLC-profiilin perusteella. Yhdistettyjen fraktioiden pH

···· 37 107733 säädettiin arvoon 4,0 käyttämällä AGl-X8-hartsia (Bio-Rad analyyttistä anioninvaihtaja-hartsia, kokoa 50-100 mesh) J hydroksi-syklissä. Liuos suodatettiin hartsin poistamisek si ja suodos lyofilisoitiin. Saatiin 2,4 g (57 % teoreet-5 tisesta) puhdistettua tuotetta.

FAB-MS 415 (MH+) [a] D = -76,12°, C = 0,5/0,01 N H2S04 Aminohappo-analyysi: Pro, 0,92; Tiq, 1,00 Alkuaineanalyysi laskettu yhdisteelle C21H32N607S 10 teoreettinen: C, 49,21; H, 6,29; N, 16,29; S, 6,26 saatu: C, 51,20; H, 6,17; N, 16,88; S, 5,37.

• · • · I aaa • • · · • · · a · · • a • a » • aa a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a a • a a a a a a a a a m a a a a a a a • a a • a a aaa a 1· a a a' · a a aaa a a a a a a aa a a a a

Claims (8)

1. 38 107733 Pa-tentti vaatimukset
2. 1. Menetelmä trombiini-inhibiittorivaikutuksen omaavan dipeptidijohdannaisen valmistamiseksi, jolla on 5 kaava /-V L 0 H L H NH / \ Il I l II C J-c-N-CH —(CH2)3-N-C-NH-P ^ I I C =0 io c=o I I H 1 A R tai RS jossa A on 1) ryhmä, jolla on kaava f1
3. 15 I R-C- B jossa R on fenyyliryhmä, jolla on kaava 20 rv v ,x=V *·· a V*: jossa a on vety tai halogeeni ja a' on vety, halogeeni, ··· 25 trifluorimetyyli, hydroksi, tai C1.4-alkoksi; tienyyli, syk- ···» loheksyyli tai naftyyli, joka on mahdollisesti substituoi-tu C-L^-alkoksiryhmällä, • · · R-l on vety, metyyli tai etyyli, ja . B on aminoryhmä, jolla on kaava « · ·*· • · 30 • · · *.··: -nr2r3 • · • · · • · · ··· » jossa R2 ja R3 itsenäisesti ovat vety tai C^-alkyyli, tai ·· · ./ R2 on vety tai metyyli ja R3 on asetyyliryhmä tai ryhmä, • · • *| 35 jolla on kaava r4-o-co- 39 107733 jossa R4 on C^g-alkyyli, tai > 2) perhydroisokinolyyliryhmä tai 1,2,3,4-tetrahyd- roisokinolyyliryhmä, ja P on vety 5 tai niiden farmaseuttisesti hyväksyttävien toksittomien suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että kaavan 1 mukaisesta yhdisteestä, jossa P on aminoa suojäävä ryhmä, poistetaan suojaryhmä hydraamalla palladiumhii-lellä ja muodostetaan tarvittaessa suola.
4. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan kaavan 1 mukainen yhdiste, jossa A on ryhmä, jonka kaava on Ri
5. 15 R-C- B ja B on kaavan -NR2R3 mukainen aminoryhmä, jolloin ryhmillä R, Rlt R2, R3 ja B on patenttivaatimuksessa 1 annetut merki-20 tykset.
6. 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, » tunnettu siitä, että valmistetaan N-Boc-D-f enyy-liglysyyli-L-propyyli-L-arginaalia ja sen farmaseuttisesti [ hyväksyttäviä toksittomia suoloja. ··· 25 4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan N-metyyli-D-fenyyliglysyyli-L-propyyli-L-arginaalia ja sen farmaseut- • · · tisesti hyväksyttäviä toksittomia suoloja. . 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, ··1·· 30 tunnettu siitä, että valmistetaan DL-1,2,3,4-tet- • ♦ ···* rahydroisokinolin-l-oyyli-L-prolyyli-L-arginiinialdehydi- • sulfaattia. • ·· · '.***. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, .,· tunnettu siitä, että valmistetaan D-l, 2,3,4-tetra- • · • ** 35 hydroisokinolin-l-oyyli-L-prolyyli-L-arginiinialdehydisul- ' faattia. 40 107733
7. 7. Patenttivaatimuksessa 1 määritelty yhdiste, jossa P on aminoa suojaava ryhmä.
8. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että muodostetaan sulfaattisuola 5 kromatografoimalla yhdiste käyttäen suuren erotuskyvyn käänteisfaasinestekromatografiaa ja gradienttieluointia gradientilla, joka käsittää orgaanisen faasin, jossa on noin 2-10 til-% asetonitriilieluenttia, vesipitoisessa faasissa, joka sisältää rikkihappoa, pH-arvossa noin 2 -10 3, eluentin pH säädetään arvoon noin 4-6 veteen liukene mattomalla emäksisellä hartsilla, hartsi erotetaan eluaa-tista ja vesi poistetaan eluaatista. • · • * · • · « • · · • · · »·· • · • · · • · · • · i · • · · ·»«· • · • · · • · · • · · ····· • · • « · • · w • M • · • · · • · · • · · · ··· • · • · • · · • · • · • · · ·*··· • · 41 107733