FI104954B - Menetelmä proteiinien tai polypeptidien ja hydrofobisten biologisesti hajoavien polymeerien väliseen vuorovaikutukseen perustuvan systeemin valmistamiseksi lääkeaineiden antamiseksi kontrolloidusti - Google Patents

Description

104954

Menetelmä proteiinien tai polvpeptidien ja hydrofobisten biologisesti hajoavien polymeerien väliseen vuorovaikutukseen perustuvan systeemin valmistamiseksi lääkeaineiden antamiseksi kontrolloidusti 5 Tämän keksinnön mukainen systeemi perustuu biologisesti hajoavien polymeerien käyttöön biologisesti aktiivisten aineiden antamiseksi siten, että näiden aineiden yhdessä edellä mainitun polymeerin kanssa muodostamasta systeemistä vapautuu kulloinkin käytettyä biologisesti vaikuttavaa ainetta kontrolloidusti. Edelleen tämän keksinnön piiriin kuuluu erityisesti menetelmä, jonka avulla voidaan edullisesti valmistaa erityisesti sellaisia hydrofobisia polymee-10 risiä aineita, joiden partikkelikoko on kontrolloitu, siten, että tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetuissa systeemissä on kussakin tapauksessa käytetyn hydrofobisen polymeerin ja siihen sitoutuneen proteiinin tai polypeptidin välillä fysikaalisia vuorovaikutuksia. Tässä tarkoitetun kaltainen fysikaalinen vuorovaikutus edistää kussakin tapauksessa käytetyn proteiinin tai polypeptidin sitoutumista käytettyyn polymeerimatriisiin ja tekee näin 15 ollen mahdolliseksi käytetyn proteiinin tai polypeptidin suojauksen ja kontrolloidun vapautumisen edullisesti mainitusta matriisista.

On yleisesti tiedossa, että entuudestaan tunnettuja lääkeaineiden aineiden antamiseksi tarkoitettuja erilaisia systeemejä, jotka perustuvat mikrokapselointiin ja joissa terapeuttisesti vaikut-20 tavien tai muiden aineiden vapautuminen käytetystä systeemistä tapahtuu kontrolloidulla nopeudella, on useanlaisia. Esimerkiksi, huomattavan laajoja tutkimuksia on tehty sellaisten : systeemien valmistamiseksi, joissa terapeuttisesti vaikuttavia aineita on liitetty polyesteri- matriiseihin, joissa matriisi koostuu esimerkiksi sellaisista polyestereistä kuten poly-epsilon-kaprolaktonista, epsilon-kaprolaktonin ja DL-maitohapon kopolymeeristä, johon myöhem-25 min tässä hakemuksessa viitataan poly-epsilon-kaprolaktoni-Co-DL-maitohappona, poly-DL-maitohaposta, DL-maitohapon ja glykolihapon kopolyesteristä, johon myöhemmin viitataan • \ poly-DL-maitohappo-Co-glykolihappona, sekä epsilon-kaprolaktonin ja glykolihapon kopo lymeeristä, johon myöhemmin viitataan poly-epsilon-kaprolaktoni-Co-glykolihappona. Näissä mainituissa tutkimuksissa vaikuttavien aineiden vapautuminen polymeerimatrisista on 30 diffuusion kontrolloimaa. Katso lähemmin esimerkiksi Pitt, C.G., Gratzl, M.M., Jeffcoat,

A.R., Zweidinger, R. ja Schindler, A., Sustained Drug Delivery Systems. Π. Factors Affecting Release Rates from Poly(epsilon-caprolactone) and Related Biodegradable Polyesters, L

2 104954

Pharm. Sei.. ££, 1534,1979. Nämä mainitussa viiteessä esitetyt systeemit muotoiltiin valmistettaessa filmeiksi ja kapseleiksi, ja näiden tutkimusten perusteella voidaan päätellä, että käytetyt polymeerimatriisit voidaan valmistaa sellaisiksi, että ne hajoavat itsestään sen jälkeen, kun vaikuttava aine tai lääkeaine on käytännöllisesti katsoen kokonaan vapautunut 5 matriisista. Kiijallisuudessa esitettyjen tulosten perusteella polyesterien hajoaminen on sellainen autokatalyyttinen prosessi, jossa esterisidokset lohkeavat satunnaisesti hydrolysoitumalla (random hydrolytic cleavage) siten, että polyesteriketjujen lohkeamisen reaktionopeus riippuu sekä kemiallisista että morfologisista tekijöistä.

10 Edelleen kiijallisuudessa on esitetty sellaisia jatkuvatoimisia lääkeaineiden annosteluun tarkoitettuja systeemejä esimerkiksi malarialääkkeille ja sulfadiatsiinille, joissa on käytetty gly-kolihapon ja maitohapon kopolymeerejä matriiseina. Katso esimerkiksi Wise, D.L., Gesser, J.D. ja McCormick, G.J., Sustained Release of a Dual Anti-malarial System, £ Phaim. Pharmacol.. li, 201,1979. Wise, D.L., McCormick, G.J., Willett, G.P., Anderson, L.C. ja Howes, 75 J.F., £ Pharm. Pharmacol.. 686, 1978. Edellä mainittujen tutkijoiden käyttämissä ja jul kaisemissa menetelmissä liuotettiin kussakin tapauksessa käytetyt aineet johonkin sopivaan ja edulliseen liuottimeen, minkä jälkeen näin saatu liuos joko sumutuskuivattiin tai valettiin kalvoiksi tavanomaisia menetelmiä käyttäen ja siten, että liuotin haihdutettiin pois. Useiden erilaisten narkoottisten aineiden antagonisteja sekä steroideja on liitetty sellaisiin matriisei-20 hin, jotka on valettu kalvoiksi (katso esimerkiksi Woodland, J.H.R., Yolles, S., Blake, D.A., Helrich, M. ja Meyer, F.J., Long-acting Delivery Systems for Narcotic Antagonists:!., £ : Med. Chem.. 16. 897, 1973 sekä Jackanicz, T.M., Nash, H.A., Wise, D.L. ja Gregory, J.B.,

Polylactic acid as a Biodegradable Carrier for Contraceptive Steroids, Contraception. £, 227, 1973. Anderson, L.C., Wise, D.L. ja Howes, J.F., An Injectable Sustained Release Fertility i j 25 Control System, Contraception. 13. 375, 1976) ja liitetty sellaisiin partikkeleihin, jotka on injektoitu subkutaanisesti (katso esimerkiksi Yolles, S., Time Release Depot for Anticancer j ’ Drugs: Release of Drugs Covalently Bonded to Polymers, £ Parent. Drug Assoc.. 21, 188, 1978). Lukuisien antituumorivaikutuksia omaavien yhdisteiden vapautumista erilaisista implantoitavista lääkeaineiden antamiseksi tarkoitetuista systeemeistä on tutkittu ja vertailtu. 30 Näiden tutkimusten tuloksia on raportoitu kiijallisuudessa (katso esimerkiksi Yolles, S., Time Release Depot for Anticancer Drugs: Release of Drugs Covalently Bonded to Polymers, £ Parent. Drug Assoc.. 32.188, 1978). Edelleen on antibioottisesti vaikuttavaa yhdistettä, mito- 3 104954 mysiini C:tä, samoin tutkittu aiemmin erityisesti siten, että mitomysiini C:tä on suljettu gelatiinista valmistettuihin mikrokapseleihin, jotka kirjallisuudessa raportoiduissa tutkimuksissa on annettu intravenöösisesti (katso esimerkiksi Yoshioka, T., Hashida, M., Muranishi, S. ja Sezaki, H., Specific Delivery of Mitomycin C to Liver, Spleen and Lung: Nano- and Micros-5 pherical Carriers of Gelatin, Intern. L Pharm.. Si, 131,1981). Näissä tutkimuksissa on kiinni tetty erityisesti huomiota käytettyjen mikrokapselien koon vaikutukseen aineiden jakautumaan in vivo sekä mahdollisuuksiin käytetyn antibioottisen yhdisteen ohjaamiseksi haluttuun kudokseen. Viimeksi manitussa yllä esitetyistä julkaisuista raportoiduissa tutkimuksissa käytettyjen pallomaisten mikrokapselien tai mikropartikkelien (microspheres tai spherical 10 microparticles) kokojakauma (5 - 30 mikrometriä) oli varsin suuri, erityisesti intravenöösistä käyttöä ajatellen. Aikaisemmin on kiijallisuudessa esitetty myös menetelmä paikallispuudutukseen käytettävän yhdisteen antamiseksi kontrolloidusti in vitro polylaktaattia olevista partikkeleista, joiden valmistuksessa käytettiin liuottimen haihduttamiseen perustuvaa menetelmää (katso esimerkiksi Wakiyama, N., Kaxuhiko, J. ja Nakano, M., Influence of Physi-15 cochemical Properties of Polylactic Acid on the Characteristics and In Vitro Release Patterns of Polylactic Acid Microspheres Containing Local Anesthetics, Chem. Pharm. Bull.. 30. 2621, 1982). Näissä viitteessä mainituissa tutkimuksissa vaikuttavien aineiden vapautumista polylaktaattipartikkeleista karakterisoitiin polymeerin hajoamisasteen muutoksen avulla sekä niiden sisältämien vaikuttavien aineiden liukoisuuden avulla, vaikka ilmeisestikään tätä pa-20 rametria ei edes yritetty sen tarkemmin evaluoida. Lisäksi on mitä ilmeisintä, että vaikuttavan aineen liukoisuuden merkitys on huomattava erityisesti asianomaisen yhdisteen vapautumis-• nopeuden ja suhteellisen vapautumisasteen suhteen. Pyyhkäisyelektronimikroskoopilla ote tuista kuvista kävivät lisäksi ilmi polymeeripartikkelien hajoamisasteen vaihtelut sekä näiden partikkelien muodonmuutokset vaikuttavien aineiden vapautumisen jälkeen.

25

Kuten edellä esitetystä käy ilmi, on farmaseuttisesti käytettävien biologisesti aktiivisten sekä ' *. muiden aineiden kontrolloituun vapautumiseen matriisista perustuva antaminen siten, että käytetty yhdiste vapautuu edellä esitetyn kaltaisesta polymeerimatriisista, tähän saakka rajoittunut ensisijaisesti tapauksiin, joissa systeemi on perustunut oraalisen tai tooppisen antotien 30 hyväksi käyttöön tai on käytetty sellaista systeemiä, jossa on voitu käyttää hyväksi implantoi-tavaa valmistetta, jolloin huokoskokoon ja/tai partikkelikokoon käytetyn polymeerisen kanta-jamatriisin sisällä, annettavaksi tarkoitetun valmisteen sisältämien mikropartikkelien dimen- 4 104954 sioihin yleisesti sekä biologisesti aktiivisen aineen vapautumisnopeuteen ja suhteelliseen ab-sorptionopeuteen biosaatavuuden näkökulmasta liittyvät seikat ja arviointiperusteet ovat selvästi erilaiset kuin, mitä tulee niihin evaluaatioparametreihin, jotka liittyvät sellaisia mikro-partikkeleja hyväksi käyttäviin kontrolloituun antamiseen tarkoitettuihin systeemeihin, jotka 5 on tarkoitettu käytettäväksi parenteraalista antotietä. Parenteraalinen valmisteiden antaminen voi tapahtua intravenöösisesti, intra-arteriaalisesti, intramuskulaarisesti, subkutaanisesti tai intraokulaarisesti. Edelleen erityisesti tämän keksinnön mukaista systeemiä varten on inha-laatio yksi edullinen mahdollisuus valmisteen autotieksi.

Esimerkkinä viitataan yhdysvaltalaiseen patenttiin No. 4818542, jossa on esitetty menetelmä 10 mikrohuokoisen polymeerisen verkkomaisen rakenteen omaavien ja yhdistäviä mikrokanavia ^ sisältävien partikkelien hyväksi käyttöön kantajamatriisina perustuva systeemi lääkeaineiden antamiseksi kontrolloidulla tavalla.

Lisäksi proteiinien ja peptidien käyttö terapeuttisesti vaikuttavina aineina on yleisesti tunnettu 15 asia, ja niiden merkitys käyttökelpoisissa farmaseuttisissa menetelmissä käytettäviksi tarkoitettuina kasvaa jatkuvasti, koska niiden saatavuus on selvästi lisääntynyt ja lisääntyy koko ajan. Tämä johtuu ensisijaisesti bioteknologian ja geeniteknologian aloilla viime aikoina tapahtuneesta erittäin voimakkaasta kehityksestä. Valitettavasti proteiinipitoisten tai proteiini-pohjaisten lääkeaineiden ja lääkevalmisteiden käyttöä perinteisiä antoteitä hyväksi käyttäen 20 rajoittavat, haittaavat tai suorastaan estävät useat itse valmisteen antamiseen liittyvät ongel-_ mat. Muut kuin parenteraaliset antotiet, siis oraalinen ja perkutaaninen, ovat varsin tehotto- • mia johtuen proteiinipitoisten tai proteiinipohjaisten lääkeaineiden huonosta imeytymisestä verenkiertoon näitä antoteitä käytettessä sekä tällaisten lääkeaineiden hajoamisesta ruoansulatuskanavassa. Silloinkin kun mainitun tyyppistä proteiinipitoista tai proteiinipohjaista lääke-25 ainetta sisältävä edellä esitetyn kaltainen valmiste annetaan parenteraalisesti, tapahtuu vaikuttavan aineen nopea proteolyyttinen inaktivoituminen, minkä vuoksi mainitun aineen biosaatavuus pienenee huomattavasti. Edelleen, parenteraalista antotietä käytettäessä isäntäeliön im-munopuolustusjäijestelmä aktivoituu ja täten käytetty valmiste voi mahdollisesti aiheuttaa sivuvaikutuksinaan ei-toivottuja immunologisia reaktioita.

30

Edellä esitettyjen yleisesti tiedossa olevien tulosten perusteella voidaan todeta, että tutkimus-ponnistelut menetelmien kehittämiseksi sellaisten parenteraalisesta antotietä hyväksi käyttä- 5 104954 mään tarkoitettujen peptidejä ja/tai proteiineja sisältävien lääkeaineiden ja -valmisteiden antamiseksi tarkoitettujen systeemien, jotka soveltuisivat uudella tai olemassa oleville antome-netelmille vaihtoehtoisella tavalla annettaviksi, aikaan saamiseksi ovat olleet huomattavan suuria. Keskeisenä tavoitteena näiden entuudestaan tunnettujen menetelmien kehittämisessä 5 ja tutkimuksessa edellä esitettyjen parenteraalista antotietä hyväksi käyttämään tarkoitettujen systeemien aikaan saamiseksi on ollut näissä systeemeissä käytettävien vaikuttavien aineiden antotiehen liittyvien ongelmien, kuten esimerkiksi juuri proteolyyttiseen inaktivoitumiseen liittyvät ongelmat, ratkaiseminen edullisella tavalla. Esimerkiksi implantoitavia valmisteita on valettu tai muovattu polyhydroksietyylimetakrylaatista, polyvinyylialkoholista, ety-10 leenivinyyliasetaattikopolymeeristä, johon myöhemmin tässä hakemuksessa viitataan lyhenteellä EVA, ja silikonielastomeereista. Näissä valmisteissa on polymeerimatriisiin liitetty makromolekulaarisia lääkeainemolekyylejä. Tyypillisesti menetelmä tämän tapaisen valmisteen valmistamiseksi käsittää jauhemaisessa muodossa olevan makromolekulaarisen vaikuttavan aineen, kuten esimerkiksi kiinteän proteiinin tai peptidin saattamisen suspensioksi 15 matriisina käytettävää polymeeriä sisältävän liuoksen kanssa. Näin saatu kompositio kokonaisuudessaan valetaan tai muovataan halutun kokoiseksi ja muotoiseksi valmisteeksi joko haihduttamalla liuotin pois tai vulkanoimalla. Näin saaduista valmisteista tapahtuva makromolekyylien vapautuminen on ilmiönä tunnettu julkaistujen ja entuudestaan tunnettujen tulosten perusteella ja se on jatkuvaa tietyn ajanjakson aikana. Edellä kuvattujen entuudestaan 20 tunnetujen ja yleisesti tiedossa olevien menetelmien tekee erityisen edullisiksi ensisijaisesti niiden yksinkertaisuus.

Kuitenkaan aiemmin esitettyjen viitteiden mukaiset systeemit eivät ole ongelmattomia. Niihin liittyviin ongelmiinkin on yksityiskohtaisemmin viitattu jo edellä. Näiden ongelmien 25 voittamiseksi yhdysvaltalaisessa patentissa No. 4741872 on esitetty menetelmä sellaisten biologisesti hajoavien mikropartikkelien valmistamiseksi, joilla on kolmiulotteinen verkkomainen rakenne, jonka sisälle kulloinkin käytetty biologisesti aktiivinen makromolekulaari-nen ainesosa pidättyy fysikaalisen vuorovaikutuksen ansiosta.

30 Kiijallisuuden perusteella entuudestaan tunnetaan lukuisia muunkin tyyppisiä proteiini -polymeeri-systeemejä yleisesti. Muunmuassa esimerkiksi yhdysvaltalaisissa patenteissa No:t 3843446, 3977941 ja 4601981 on esitetty menetelmiä entsymaattisesti aktiivisen proteiini- 6 104954 entsyymi-kompleksimembraanin valmistamiseksi siten, että lähtöaineena olevana materiaalina käytetään proteiinimembraania, jota käsitellään entsyymin vesiliuoksella. Näitä edellä mainituissa viitteissä kuvatulla tavalla valmistettuja membraaneja käytetään hyväksi entsymaattisten reaktioiden suorittamiseksi.

5

Yhdysvaltalaisessa patentissa No. 3972776 on esitetty menetelmä sellaisen kompleksimem-braanien valmistamiseksi, jotka koostuvat entsymaattisesti aktiivisesta proteiinista ja käyttökelpoisen mikro-organismin kokonaisista soluista siten, että valmistetaan ensin dispersio, joka sisältää joko synteettisesti valmistetun tai luonnosta saadun proteiinin makromolekyyle-10 jä sekä kokonaisia mikrobisoluja, ja tämän jälkeen näin saadusta dispersiosta valetaan kalvo, joka kuivataan. Nämä kyseissä viitteessä kuvatulla tavalla valmistetut kompleksimembraanit soveltuvat enstymaattisten reaktioiden suorittamiseksi. Mainitussa viitteessä tarkoitettuja membraaneja voidaan valmistaa myös elektrokodeposition avulla sellaisesta dispersiosta, joka sisältää sekä käytetyt mikrobisolut että tarvittavaa makromolekyyliä.

15

Yhdysvaltalaisessa patentissa No. 4758342 on esitetty hypersuodatusmembraani, joka sisältää kantaj akerroksen j a erottamiskerroksen.

Yhdysvaltalaisissa patentteissa No:t 4494944 ja 4557855 on esitetty ligniinisulfonihappoja 20 sisältävä pinta-aktiivinen aine, ja vaihtoehtoisesti, vapaa alkyyliaryylisulfonihappo, jossa on vähintään kymmenen hiiliatomin mittainen hiiliketju sekä kahdeksan polypeptidiä, joiden f suhteelliset moolimassat ovat suuruusluokaltaan välillä 2500 - 15000.

Yhdysvaltalaisissa patenteissa No:t 4585797 ja 4591501 on esitetty jatkuva taipuisa ja jous-25 tava kalvo, joka koostuu polypeptidin, pehmittimen ja kalvon muodostavan joustavan polymeerin fysikaalisesta seoksesta. Kun näissä viitteissä esitettyä kalvoa kostutetaan, polypeptidi alkaa eksudoitua kalvosta sen ympäristöön käytetyn nesteen aikaan saaman vaikutuksen vuoksi.

30 Yhdysvaltalaisessa patenttissa No. 4873033 on esitetty sellainen hypersuodatusmembraani, joka koostuu kantajakerroksesta ja erottamiskerroksesta. Mainittu erottamiskerros sisältää ristisidoksia sisältävän monomolekulaarisen molekyylikalvon siten, että erottamiskerroksessa 7 104954 olevat sellaiset molekyylit, jotka eivät ole kiinnittyneet ristisidoksin, ovat pinta-aktiivisten aineiden kaltaisia lipoideja, joiden molekyylit puolestaan koostuvat vähintään yhdestä hydrofobisesta sivuketjusta ja vähintään yhdestä hydrofiilisestä ryhmästä. Pinta-aktiivisten aineiden kaltaiset lipoidimolekyylit ovat levittyneet tietyn suuruisen levittymispaineen vaikutuksen 5 alaisina tai ne ovat sijoittuneet keskimääräiseen tilaan vesiliuoksen pinnan yläpuolelle tai vesiliuoksen ja siihen upotettavan nesteen väliselle faasien rajapinnalle.

Yhdysvaltalainen patentti No. 4897444 käsittelee immobilisoitujen fluorogeenisten substraattien hyväksi käyttämistä. Käytetyillä substraateilla on seuraavan yleiskaavan mukai-10 nen rakenne

Rl-NH-R4-R2-R3 missä R, tarkoittaa entsyymispesifistä oligopeptidiä, R2 tarkoittaa väliryhmää, joka voi olla 15 metyleenikarboksyylioksiryhmä, metyleenikarboksamidoryhmä tai metyleenisul-fonamidoryhmä, joka on kiinnittynyt polymetyleeniketjuun, joka puolestaan on itse sellainen funktionaalinen ryhmä, että se kytkeytyy edullisesti polymeereihin, R3 tarkoittaa sellaista polymeeriä, joka ei ole biologisesti aktiivinen sekä R, tarkoittaa fluorogeenistä spesiestä.

20 Patentissa GB 2207050 on esitetty sellainen kompositio, joka koostuu lääkeaineen liuoksesta vedessä ja glukoosipolymeerien seoksesta, jossa ainakin 50 massaprosenttia spesieksistä on : ’ sellaisia, että niiden polymeroitumisaste on suurempi kuin 12. Tätä kompositiota voidaan antaa vatsaonteloon. Tällöin sen sisältämät glukoosipolymeerit toimivat osmoosia aikaansaavina aineina peritoneaalisessa dialyysissä.

Patentissa EP 0354714 on esitetty sellainen farmaseuttinen kompositio, joka vaikuttaa bioaktiivisten peptidien ja proteiinien, jotka ovat normaalisti sitoutuneet glyko-aminoglykaaneihin, uudelleen jakautumiseen eri kudoksiin sekä jäljittelee glykoaminogly-kaanien vaikutuksia biologisissa vuorovaikutuksissa. Mainittu kompositio koostuu farma-30 seuttisesti hyväksyttävästä polymeerisestä yhdisteestä, jossa on monomeerisiä yksiköitä ja jonka suhteellinen molekyylimassa on välillä 1000 - 20000 daltonia ja jossa olevat mono-meeriset yksiköt koostuvat kolmesta noin kymmeneen aromaattista rengasta.

8 104954

Patentissa EP 0187547 on käsitelty polymeerisiä lääkeaineita, jotka koostuvat inertistä synteettisestä polymeerisestä kantaja-aineesta, joka puolestaan on kovalenttisella sidoksella kiinnittynyt sellaisiin bioaktiivisiin molekyyleihin, joiden suhteellinen moolimassa on pieni. 5 Lääkkeen anto on tässä tapauksessa jossain määrin ohjattua, koska imeytyminen on rajoitettu sellaisiin soluihin, joilla esiintyy pinosytoosiksi kutsuttua substraattiselektiivistä mekanismia.

Vaikka edellä esitetyt entuudestaan tunnetut tutkimustulokset ovat monipuolisia ja tutkimuksia on julkaistu runsaasti, on niissä esitetyissä systeemeissä lääkeaineiden ja lääkkeiden an-10 tamiseksi vielä huomattavan epäedullisia haittapuolia, ja mainittujen tulosten kaupallistaminen ja teollinen soveltaminen on ollut varsin vaikeaa erityisesti johtuen riittävään lääkeaineen annoskokoon, valmisteen spesifikaatioiden toistettavuuteen ja mittakaavan kasvattamiseen (scale-up) liittyvien ongelmien vuoksi.

15 Näin ollen, edellä esitetyn vuoksi, on tämän keksinnön kohteena menetelmä, jonka avulla voidaan polypeptidejä ja proteiineja liittää hydrofobiseen biologisesti hajoavaan polymeeriin stabiilin koostumuksen aikaansaamiseksi ja polypeptidien tai proteiinien suojaamiseksi ja niiden antamiseksi kontrolloidusti polymeerimatriisista vapautumalla in vivo.

20 Kuvassa 1 on esitetty kuvaus saostusmenetelmästä tämän keksinnön mukaisen lääkeaineiden antamiseksi tarkoitetun systeemin valmistamiseksi.

Kuvassa 2 on esitetty kuvaus pallomaisten mikropartikkelien käyttöön perustuvasta menetelmästä tämän keksinnön mukaisen lääkeaineiden antamiseksi tarkoitetun systeemin valmis-25 tamiseksi.

Kuvassa 3 on esitetty lohen kalsitoniinin (sCT) vuorovaikutusta polyglykolihapon, polymai-tohapon sekä glykolidin ja L-laktidin välisen kopolymeerin kanssa kuvaava diagrammi polymeerien molaaristen konsentraatioiden vaihdellessa.

30

Kuvassa 4 on esitetty lohen kalsitoniinin ja polyglykolihapon muodostamien mikropartikkelien kokojakaumaa kuvaava diagrammi.

5 9 104954

Kuvassa 5 on esitetty lohen kalsitoniinin vapautumista polyglykolihaposta (M = 100000) ja lohen kalsitoniinista pakastekuivaamalla valmistetuista mikropartikkeleista kuvaava diagrammi. Käytetty vaikuttavan lääkeaineen osuus oli 10 %.

Kuvassa 6 on esitetty lohen kalsitoniinin vapautumista polyglykolihapon ja lohen kalsitoniinin muodostamasta saostumasta kuvaava diagrammi. Käytetty vaikuttavan lääkeaineen osuus oli 10%.

10 Kuvassa 7 on esitetty diagrammi, joka kuvaa seerumin kalsiumpitoisuutta lohen kalsitoniinia sisältäviä mikropartikkeleita käyttävän lääkeaineen antamiseksi tarkoitetun systeemin vaikutuksen aikana.

Tämän keksinnön mukaisissa menetelmässä voidaan edullisesti käyttää useita erilaisia hydro-15 fobisia biologisesti hajoavia polymeerejä. Tässä tarkoitetut polymerit ovat entuudestaan yleisesti tunnettuja. Käyttökelpoisia ovat esimerkiksi polyesterit, polyortoesterit ja polyanhyd-ridit.

Käytetty polymeeri voi koostua joko kopolymeerisistä tai homopolymeerisistä polyestereistä, 20 jotka voivat sisältää hydrolysoituvia polymeerin rakenteen sisällä olevien ryhmien välisiä sidoksia, minkä vuoksi ne ovat biologisesti hajoavia. Tyypillisesti erittäin edullisesti käytet-j täviksi soveltuvia tällaisista polyestereistä ovat polyglykolihappo (PGA) ja polymaitohappo (PLA) sekä glykolidin ja L-laktidin muodostamat kopolymeerit (PGL). Edellä mainitut polyesterit soveltuvat erityisen edullisesti käytettäviksi tämän keksinnön mukaisissa mentelnmis-25 sä ja kompositioissa sen vuoksi, että niille on tunnusomaista pieni toksisuus ihmiselle ja että ne ovat käytännöllisesti katsoen täydellisesti biologisesti hajoavia. Luonnollisesti on itsestään < selvää, että tämän keksinnön mukaisissa menetelmissä ja systeemeissä ei ole ratkaisevan tärkeää se, mitä nimenomaista polyesteriä tai muuta polymeeriä, oligomeeriä, kopolymeeriä tai vastaavaa ainetta käytetään, ja että edullisesti käytettäviksi soveltuvat useat erilaiset hydro-30 fobiset biologisesti hajoavat polymeerit tämän keksinnön piiriin kuuluvien uusien ja yllättävien tuotteeksi haluttujen lääkeaineiden antamiseksi tarkoitettujen systeemien valmistami- ίο 104954 seksi esitettyjen menetelmien ansiosta riippumatta siitä, mitä tahi mistä lähteestä saatua polymeeriä käytetään.

Tästä seuraa, että sellaisiin muihin biologisesti hajoaviin tai biologisesti rapautuviin polymee-5 reihin ja kopolymeereihin, joiden toksisuus ihmiselle on välttämättä riittävän alhainen, jotta ne soveltuisivat edullisesti käytettäviksi tässä keksinnössä, kuuluvat muunmuassa esimerkiksi gelatiini, agar, tärkkelys, arabinogalaktaani, albumiini, kollageeni, sellaiset luonnosta saatavat sekä synteettiset materiaalit ja polymeerit, kuten esimerkiksi poly-epsilon-kaprolaktoni, poly-epsilon-kaprolaktoni-Co-maitohappo, poly-epsilon-kaprolaktoni-Co-glykolihappo, poly-beta-10 voihappo, polyetyleenioksidi, polyetyleeni, poly(alkyyli-2-syanoakrylaatti), jossa alkyyli-ryhmänä voi olla esimerkiksi metyyli-, etyyli- tai butyyliryhmä tai jokin muu vastaava al-kyyliryhmä, hydrogeelit, kuten esimerkiksi poly(hydroksietyylimetakrylaatti-polyhydroksietyylimetakrylaatti), polyamidit, kuten esimerkiksi polyakryyliamidi, poly-aminohapot, kuten esimerkiksi L-leusiinin, L-asparagiinihapon, beta-metyyli-L-aspartaatin, 15 beta-bentsyyli-L-aspartaatin, glutaamiinihapon sekä vastaavien aminohappojen muodostamat polymeerit, poly(2-hydroksietyyli-DL-aspartamidi), poIy(esteriurea), poly(L-fenyyli-alaniini/etyleeniglykoli/1,6-di-isosyanaattoheksaani), poly(metyylimetakrylaatti), 3,9-bismetyleeni-2,4,8,10-tetraoksaspirol[5,5]undekaani, 1,6-heksadiolin polyortoesteri, poly(bis-p-karboksifenoksipropaanianhydridi), etyleeni-vinyyliasetaattikopolymeeri (EVA), poly-20 vinyylialkoholi (PV A) sekä silikonielastomeeri.

: ’ Edellä esitetyt esimerkit luonosta saatavista ja synteettisistä polymeereistä, jotka soveltuvat edullisesti käytettäviksi tämän keksinnön mukaisesti, ovat luonnollisesti joko kaupallisesti vapailta markkinoilta saatavissa tai niitä voidaan helposti valmistaa sopivia monomeerejä, 25 komonomeerejä tai oligomeerejä polymeroimalla näiden kondensaatioreaktiota hyväksi käyttäen. Esimerkiksi glykoli- ja maitohapon homopolymeerejä ja kopolymeerejä voidaan edullisesti valmistaa käyttäen hyväksi suoraa polykondensaatioreaktiota tai antamalla glyko-lidi- ja laktidimonomeerien reagoida keskenään (katso esimerkiksi Gilding, D.K ja Reed, A.M., Biodegradable Polymers for Use in Surgery - Polyglycolic/Poly(lactic acid) Homo-30 and Copolymers: 1. Polymer. 2ΰ, 1459,1979.

Π 104954

Mikä tahansa proteiini tai polypeptidi soveltuu käytettäväksi tämän keksinnön mukaisesti. Tämän keksinnön mukaisesti käytettäviksi tarkoitetut biologisesti aktiiviset proteiinit tai po-lypeptidit ovat sellaisia proteiineja tai polypeptidejä, joiden suhteellinen moolimassa on verrattain pieni. Esimerkkejä näistä tämän keksinnön mukaisesti erittäin edullisesti soveltuvista s biologisesti aktiivisista polypeptideistä ovat muunmuassa kalsitoniini, insuliini, angiotensiini, vasopressiini, desmopressiini, LH-RH (keltarauhashormonin erittymistä aiheuttava hormoni), somatostatiini, glukagoni, somatomediini, oksytosiini, gastriini, sekretiini, h-ANP (ihmisen atriaalinen natriureettinen polypeptidi), ACTH (adrenokortikotrooppinen hormoni), MSH (melanosyyttejä stimuloiva hormoni), beta-endorfiini, muramyylidipeptidi, enkefaliini, neuro-10 tensiini, bombesiini, VIP, CCK-8, PTH (paratyroidihormoni), GCRP (kalsitoniinigeeniin liittyvä peptidi), endoteliini, TRH (tyroidia vapauttava hormoni, thyroid releasing hormone), kasvuhormonit, kuten esimerkiksi erytropoietiini, lymfokiinit, kuten esimerkiksi makrofageja stimuloiva faktori, ja muut vastaavat aineet. Tämän keksinnön mukaisesti käytettäviin poly-peptideihin kuuluvat sellaisenaan luonnossa esiintyvien polypeptidien lisäksi niiden faimako-15 logisesti hyväskyttävät aktiiviset johdannaiset sekä itse mainittujen polypeptidien että niiden johdannaisten analogit. Esimerkiksi tämän keksinnön mukaisesti käytettävä kalsitoniini tarkoittaa sekä sellasia luonnossa esiintyviä aineita, kuten esimerkiksi lohen kalsitoniinin, ihmisen kalsitoniinin, sian kalsitoniinin, ankeriaan kalsitoniinin ja kanan kalsitoniinin, että myös näille analogiset yhdisteet, kuten esimerkiksi [Asul,7]-ankeriaan kalsitoniini-elastoniinin 20 (valmistaja: Toyo Jozo Company, Ltd.). Vastaavasti tämän keksinnön mukaisesti käytettäväksi tarkoitettu LH-RH käsittää sekä luonnosta saatavan aineen että sen farmaseuttisesti • aktiiviset johdannaiset sekä näiden analogit siten, kuin kiijallissuudessa on esitetty eri lähteis sä, joihin kuuluvat ne patentit ja julkaisut, joihin on edellä viitattu, esimerkiksi yhdysvaltalainen patentti (Matsuzawa et ai.) No. 3917825. Erityisen edullisia polypeptidejä käytettäviksi 25 tämän keksinnön mukaisesti ovat muunmuassa esimerkiksi kalsitoniini, insuliini, ACTH, LH-RH, PTH, CGRP, somatostatiini ja somatomediini. Kaikkein edullisin käytettäväksi tässä ' *. mainituista polypeptideistä on kalsitoniini.

Biologisesti hajoaviin synteettisiin polypeptideihin kuuluvat muunmuassa esimerkiksi poly-(N-hydroksialkyyli)-L-asparagiini, poly-(N-hydroksialkyyli)-L-glutamiini, N-30 hydroksialkyyli-L-asparagiinin ja N-hydroksialkyyli-L-glutamiinin kopolymeerit muiden aminohappojen kanssa.

12 104954

Edellä esiintyneiden termien ja ilmaisujen määritelmät ja tarkemmat kuvaukset ovat yleisesti tiedossa ja löytyvät mistä tahansa yleisesti käytössä olevasta biokemian alan viitejulkaisusta tai oppikirjasta, kuten esimerkiksi Lehninger, Albert L.,Biochemistrym, Worth Publishers, Inc. ja Stryer, Lubert, Biochemistry, W.H. Freeman and Company, joihin molempia käyte-5 tään tässä viitejulkaisuina.

Tämän keksinnön mukaisessa lääkkeen antamiseksi tarkoitetussa systeemissä olevan biologisesti aktiivisen peptidin määrä voi vaihdella riippuen kulloinkin käytetystä nimenomaisesta polypeptidistä, mutta joka tapauksessa käytetyn peptidin määrä on kuitenkin riittävä haluttu-10 jen farmakologisten vaikutusten aikaan saamiseksi. Näin ollen, kun käytettäväksi valittu po-lypeptidi on esimerkiksi kalsitoniini, sitä on riittävästi sellaisen tautitilan, kuten esimerkiksi Pagetin taudin eli hyperkalsemian eli osteoporoosin hoitamiseksi. Tyypillisesti käytettävä valmiste voi sisältää, esimerkiksi, noin 0,01 - 0,04 kansainvälistä yksikköä (I.U.) milligrammassa sian kalsitoniinin ollessa kyseessä. Insuliinin tapauksessa käytettävä määrä on tyyli pillisesti riittävä säätelemään veren sokeripitoisuutta ja siten riittävä diabeteksen annettavaksi hoidoksi. Kun käytettävä aine on LH-RH tai jokin sen analogi, sen määrä on tyypillisesti riittävä diabeteksen hoitamiseksi. Edelleen LH-RH:n tai jonkin sen analogin ollessa kyseessä käytettävä määrä on riittävä erilaisten naisten sukupuolielimistössä esiintyvien tautitilojen hoitoon, raskautta ehkäisevän vaikutuksen aikaansaamiseksi tai jonkin muun tunnetun LH-20 RH:n biologisen vaikutuksen aikaansaamiseksi. Kun käytetty aine on ΡΤΉ, CGRP, somato-mediini tai jokin näiden analogi, on tämän keksinnön mukaisesti käytettävä määrä riittävä ; ' erilaisten luun metaboliassa esiintyvien häiriöiden ja tautitilojen hoitamiseksi. Edelleen mui- j den tämän keksinnön piiriin kuuluvien biologisesti aktiivisten peptidien edullisesti käytettä viksi soveltuvat määrät määräytyvät vastaavalla tavalla. Näin ollen tämän keksinnön mukai-25 sesti edullisesti käytettäväksi soveltuvat määrät kutakin kulloinkin käytettävää proteiinia tai polypeptidiä ovat riittäviä, jotta saavutettaisiin haluttu terapeuttinen vaikutus. Halutun terapeuttisen vaikutuksen saavuttamiseksi tarvittavien määrien suhteen viitataan alan kirjallisuuteen, josta mikä tahansa yleisesti tunnettu perusteos antaa tarvittavat tiedot (katso esimerkiksi Goodman ja Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics).

30 Tämän keksinnön mukaisen lääkeaineiden antamiseksi tarkoitetun systeemin ominaisuuksien ja ulkonäön parantamiseksi voidaan käyttää yhtä tai useampaa kantaja-ainetta, väriainetta, 13 104954 isotoonista ainetta, antioksidanttia ja muuta vastaavaa ainetta, joka/jotka voidaan lisätä lääkkeen antamiseksi tarkoitettuun systeemiin. Näistä tässä mainitulla tavalla käytettävistä tämän keksinnön mukaiseen lääkkeen antamiseksi tarkoitettuun systeemiin lisättävistä aineista mainittujen parannusten aikaan saamiseksi käytettäviksi soveltuvia kantaja-aineita ovat esi-5 merkiksi tärkkelys, dekstriini, mannitoli, sorbitoli, syklodekstriini ja tragantti. Edelleen edullisesti käytettäviksi soveltuvia väriaineita ovat muunmuassa esimerkiksi beta-karoteeni, punainen No. 2 ja sininen No. 1. Edullisia reagensseja isotoonisuuden säätöön ovat esimerkiksi natriumkloridi ja glukoosi. Edullisia käytettäviksi soveltuvia hapettumisenestoaineita ovat esimerkiksi askorbiinihappo ja erytrobihappo sekä näiden suolat ja esterit. Varsinaisten an-10 nosmuotojen ja valmisteiden valmistamiseen tarvittavat menetelmät ovat joko yleisesti tiedossa tai itsestään selviä alan asiantuntijoille. Katso lähemmin esimerkiksi Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th painos, 1985, toimittanut Gennaro, Alfonso R., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042.

15 Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä saatujen valmisteiden kantaja-ainee(t) edesauttavat edullisissa tapuksissa valitun annosmuodon valmistusta. Joidenkin annosmuotojen tapauksessa biologisesti aktiivisen proteiinin tai polypeptidin vapautuminen tapahtuu pidemmän ajanjakson kuluessa kuin muiden. Nämä pitkävaikutteiset annosmuodot ovat erityisen käyttökelpoisia ja edullisia ja ne lisäävätkin tämän keksinnön mukaisesti suoritetun proteiini- tai 20 polypeptidilääkityksen avulla annetun hoidon joustavuutta.

• Tämän keksinnön kannalta tärkeä ja keskeinen ominaisuus on se, että tässä keksinnössä käy tetyn biologisesti hajoavan hydrofobisen polymeerin ja kussakin tapauksessa käytetyn polypeptidin tai proteiinin välillä oleva vuorovaikutus on luonteeltaan fysikaalinen. Tässä mainit-25 tua fysikaalista vuorovaikutusta voidaan luonnehtia affiniteetiksi tai eräänlaiseksi assosioitumiseksi tai käytetyn polymeerin ja kussakin tapauksessa käytetyn proteiinin/polypeptidin väliseksi vuorovaikutukseksi.

Tämän edellä kuvatun vuorovaikutuksen luonnetta ei ole täysin selvitetty, mutta sitä voidaan 30 edelleen luonnehtia ilmaisemalla, mitä se ei ainakaan voi olla. Kyseinen vuorovaikutus ei mitä ilmeisimmin ole luonteeltaan kemiallinen. Se ei siis täten ole kovalenttista sitoutumista, vetysidoksin tapahtuvaa sitoutumista eikä muutakaan vastaavaa kemiallista sitoutumista.

,4 104954 Tämä johtopäätös on voitu tehdä differentiaaliseen pyyhkäisykalorimetriaan (DSC, Differential Scanning Calorimetry), infrapunaspektroskopiaan (IR), Fourier-muunnosinfrapunaspektroskopiaan (FTIR, Fourier Transform Infrared Spectroscopy), Rani an-spektroskopiaan ja Fourier-muunnos Raman-spektroskopiaan perustuvien mittausten 5 tuloksista. Tässä suhteessa tämän keksinnön keksijä ei kuitenkaan halua sitoutua kannattamaan mitään teoriaa sinänsä, vaan on vakuuttunut siitä, että tarkasteltava vuorovaikutus on luonteeltaan hydrofobista ja että siihen osallistuvat erityisesti aminohappoketjujen sidokset. Sitä voidaan lyhyesti kuvata seuraavalla tasapainomekanismilla: 10 Kalsitoniini + Polymeeri <==> Kalsitoniini-polymeeri Tällainen mekanismi sallisi sekä proteiinin tai polypeptidin liittymisen polymeerimatriisiin että sen vapautumisen tästä matriisista silloin, kun proteiini/polypeptidi-polymeerisysteemi viedään kehon tai ruuminontelon sisälle, missä vapautuva proteiini tai polypeptidi diffrmdoi-15 tuu ympäristöönsä.

Tämän keksinnön mukainen systeemi lääkeaineiden antamiseksi voidaan valmistaa millä tahansa menetelmällä, jota käyttämällä käytetyn hydrofobisen biologisesti hajoavan polymeerin ja kussakin tapauksessa käytetyn proteiinin tai polypeptidin välisen fysikaalisen vuoro-20 vaikutuksen muodostuminen on mahdollista. Kahteen tällaiseen käyttökelpoiseen menetelmään tämän keksinnön mukaisen systeemin valmistamiseksi voidaan viitata kumpaankin j erikseen, yhteen polymeerisenä saostustekniikkana ja toiseen mikropartikkelitekniikkana.

Mainitussa polymeerisessä saostustekniikassa polypeptidi tai proteiini sekoitetaan sopivan 25 liuottimen kanssa siten, että saadaan homogeeninen nestefaasi (katso kuva 1).

Tässä tekniikassa voidaan edullisesti käyttää mitä tahansa orgaanista tai epäorgaanista liuotinta, johon sekä käytettävä polypeptidi että käytettävä polymeeri ovat liukoisia, kunhan asianomainen liuotin ei hajoita tai vaikuta haitallisesti polymeeriin tai polypeptidiin.

30 15 104954 Tämän keksinnön mukaisesti toimittaessa käyttökelpoisiin liuottimiin kuuluvat muunmuassa esimerkiksi metyleenikloridi, heksafluoriasetoni, heksafluori-isopropanoli, asetonitriili, hek-saani, sykloheksaani.

5 Edellä mainituista suositeltavia liuottimia ovat metyleenikloridi, heksafluoriasetoni, heksafluori-isopropanoli.

Menetellen edellä esitetyllä tavalla ja pakottamalla polymeeri ja proteiini/polypeptidi ulos liuoksesta saadaan aikaan saostuma. Saostaminen voidaan suorittaa millä tahansa entuudes-10 taan tunnetulla ja yleisesti tiedossa olevalla tekniikalla. Käyttökelpoisiin tekniikoihin kuuluvat muunmuassa esimerkiksi sellaisen liuottimen, johon käytetty polymeeri ei liukene, lisääminen tai liuoksen jäähdyttäminen saostumisen aikaansaamiseksi.

On erittäin edullista käyttää saostamiseen sellaista tekniikkaa, jossa polymeeri pakotetaan 15 ulos liuoksesta sellaisen liuottimen avulla, johon kulloinkin käytetty proteiini/polypeptidi on liukoinen mutta johon käytetty polymeeri taasen ei liukene. Tällaisia käyttökelpoisia liuottimia ovat esimerkiksi vesi, veteen valmistetut puskuriliuokset ja vesipitoiset alkoholiseokset. Sekoittamalla säestettäessä edullisesti valitulla tavalla voidaan saostuman hiukkaskoko säätää halutuksi. Tämän jälkeen saostuma suodatetaan ja kuivataan.

20

Saostuma käsittää sekä proteiinin/polypeptidin että polymeerin, ja siinä esiintyy proteii-: nin/polypeptidin ja polymeerin välillä fysikaalinen vuorovaikutus.

Tässä kuvatulla tavalla voidaan saada aikaan käytetyn proteiini/polypeptidin kontrolloitu 25 vapautuminen in vivo.

Mikäli käytetään kuvan 2 mukaista mikropartikkelitekniikkaa, voidaan sen avulla valmistaa pallomaisia polymeerimatriiseja tai mikropartikkeleita, joiden läpimitta on välillä noin 1 -150 mikrometriä ja joita voidaan valmistaa siten, että niiden koon vaihteluväli on kapea, jol-30 loin ne voidaan ohjata tiettyyn elimeen tai elinsysteemiin injektoimalla ne parenteraalisesti tai siten, että ne inhaloidaan, kuten on esitetty kuvassa 4. Erittäin edullisesti pallomaisten mikro- 104954 16 partikkelien muodostamat pallomaiset polymeerimatriisit ovat kooltaan noin 0,5 - 70 mikro-metriä.

Edelleen mikropartikkeleita voidaan valmistaa muodostamalla emulsiopisaroita tai -palloja, 5 jotka sisältävät homogeenista polymeerin (tai kopolymeerin) seosta ja liuotinta sisältävän ennalta valitun jatkuvan faasiin, joka ei kuitenkaan toimi liuotinfaasina, dispergoituneen polymeerin liuoksesta. Edellä esitetystä systeemistä saadaan mikropartikkeli poistamalla liuotin edellä esitetystä pisarasta käyttämällä yhtä tai useampaa seuraavista menetelmistä (1) pakas-tekuivaus ja (2) liuotinuutto. Tämän jälkeen voidaan suorittaa proteiinin tai polypeptidin lisä-10 ys.

Erityisesti käytettäessä mikropartikkelimenetelmää hyväksi liuotetaan edullisesti käytettäväksi soveltuva polymeeri tai kopolymeeri, proteiini tai polypeptidi sekä muut mahdollisesti käytettävät reagenssit erikseen johonkin käyttökelpoiseen liuottimeen. Käytetyt polymeeri-ja 15 polypeptidiliuokset sekoitetaan keskenään, jolloin saatavan liuoksen polymeeripitoisuus vaihtelee tyyppillisesti noin 2,5 massaprosentista 18 massaprosenttiin ja polypeptidi-ja po-lymeeripitoisuuksien suhde vaihtelee välillä noin 1:1 - 1:100. Yhdistetyn liuoksen lämpötila säädetään yleensä välille noin 35 - 45 °C. Polypeptidi-polymeeriliuos, joka käsittää disperssin faasin, dispergoidaan jatkuvaan faasiin, joka sisältää pinta-aktiivista ainetta termostaattisesti 20 säädetyssä lämpötilassa, joka on yleensä tyypillisesti lämpötilavälillä 10 - 20 °C. Mikä tahansa yleisesti tunnettu pinta-aktiivinen aine voi olla käyttökelpoinen tämän keksinnön mukai-: sesti käytettäväksi, kunhan se vain ei vaikuta polymeerin ja proteiinin/polypeptidin muodos taman systeemin aktiivisuuteen eikä vaikuta tässä systeemissä esiintyvään polymeerin ja proteiinin/polypeptidin välillä esiintyvään vuorovaikutukseen. Edellä esitetty voidaan suorit-25 taa tämän keksinnön mukaisesti millä tahansa yleisesti tiedossa menetelmällä, joka on alan asiantuntijoille entuudestaan tunnettu, mutta kuitenkin erityisen edullisesti siten, että dispers-siä faasia pakotetaan paineen alaisena hyvin hienoreikäisen suuttimen läpi. Tämän jälkeen jatkuvaa faasia, jota on massaltaan 5 - 20-kertainen määrä disperssiin faasiin verrattuna, sekoitetaan erityisellä laittella, joka on tarkoitettu edistämään dispergoitumista. Disperssin faa-30 sin lisäämisen jälkeen voidaan käyttää hyväksi jompaakumpaa kahdesta mahdollisesta erot-tamismenetelmästä lääkeaineetta sisältävien mikropartikkelin stabiloimiseksi ja talteen otta-. miseksi.

,7 104954

Edelleen erityisesti pakastekuivausmenetelmän mukaisesti dispergoimisen jälkeen on edullista, että lämpötila pidetään välillä 10 - 20 °C. Erityisen edullisesti se on 15 °C ja sen annetaan nousta kahden minuutin kuluttua välille 45 - 55 °C, jolloin on erityisen edullista käyttää 50 °C 5 lämpötilaa, kolmen minuutin ajanjakson kuluessa. Seoksen sekoittamista jatketaan voimakkaasti kaikkien edellä esitettyjen työvaiheiden ajan. Kun lämpötila on noussut 50 asteeseen, joko aletaan kierrättää jäähdytysliuosta jäähdytyshauteesta reaktioastian vaipan kautta tai upotetaan astia osittain jäähdytyshauteeseen, joka sisältää kiinteää hiilidioksidia ja metanolia, siten, että se jäähtyy sellaiseen lämpötilaan, että se faasi, joka sisältää lääkeainetta, polymee-10 riä ja liuotinta, jäätyy, mutta jatkuva faasi ei kuitenkaan jäädy. Tämän jälkeen suspensio tai emulsio (jatkuvassa nestefaasissa oleva kiinteä disperssi faasi) siirretään ripeästi esijäähdytet-tyihin ampulleihin (-40 - -60 °C) ja jäähdytetään lämpötilaan, joka on välillä -40 - -60 °C, pakastekuivaukseen tarkoitetussa laitteessa tai laitteistossa, pakatimessa tai jää-asetoni-hauteella. Pisaroihin (mikropartikkeleihin)suspendoitunut liuotin ja jatkuva liuotinfaasi pois-15 tetaan pakastekuivaamalla. Pakastekuivauksen päätyttyä mikropartikkelit pestään jollakin tähän tarkoitukseen soveltuvalla liuottimella, suodatetaan ja kuivataan ilmassa.

Disperssin faasin ja jatkuvan faasin sisältämät liuottimet ovat luonnollisesti eri aineita, jotta voitaisiin saada faasit erottumaan toisistaan, ja tämän vuoksi nämä liuottimet valitaan kum-20 mankin faasin asettamien liukoisuusvaatimusten perusteella. Edelleen erityisesti disperssin faasin liuotin on on erittäin edullista valita siten, että se liuottaa hyvin käytettyä polymeeriä ja 1' tähän liitettyä ainetta ja että kyseessä oleva liuotin jää emulgoituihin pisaroihin käytetyn lää keaineen ja jatkuvassa faasissa olevan polymeerin kanssa, kunnes se huuhtoutuu pois sitä laimentavan liuotimen vaikutuksen ansiosta tai se poistuu höyrystymällä tai haihtumalla. 25 Menetellen tässä kuvatulla tavalla on mahdollista saada tarpeen niin vaatiessa lääkeaine-polymeeri-matriisiin muodostumaan huokosia. Kun käytetty matriisi on polyglykolihappoa, jonka sisälle on liitetty vesiliukoisia merkkiaineita tai reagensseja, heksafluoriasetonin seskvihydraatti on käyttökelpoinen liuotin. Riippuen polymeerin ja siihen liitettyjen aineiden ominaisuuksista voivat käyttökelpoisia olla muutkin liuottimet, kuten muunmuassa esimer-30 leiksi vesi, heksafluori-isopropanoli, metyleenikloridi, asetonitriili, tetrahydrofuraani, hek-saani ja bentseeni. Jatkuvan faasin sisältämän liuottimen tai sen sisältämien liuottimien ei tulisi liuottaa käytettyä polymeeriä ja sen/niiden tulisi emulgoida disperssiä faasia. Tällaisiin is 104954 käyttökelpoisiin liuottimiin kuuluvat muunmuassa esimerkiksi bentseeni, dioksaani, asetoni, metyleenikloridi, kloroformi, hiilitetrakloridi, tolueeni, etyylialkoholi, asetonitriili, p-ksyleeni, tetrahydrofuraani, mineraaliöljy, glyseriini sekä näitä tässä mainittuja liuottimia sisältävät seokset.

5

Polymeeriä ja polypeptidiä sisältävän liuoksen dispergoimisen jälkeen voidaan jatkuvan faasin laimentamiseen käyttää erityistä laimentavaa faasia, joka ei tässä toimi liuottimena. Tämän laimentavan faasin tulee olla sellainen, että se on jatkuvan faasin ja disperssin faasin sisältämien liuottimien kanssa sekoittuva, mutta se ei saa olla sellainen, että se liuottaa poly-10 meeriä tai siihen liitettyjä aineita. Tähän tarkoitukseen edullisesti käytettäviä liuottimia ovat muunmuassa esimerkiksi 1,4-dioksaani, sykloheksanoni, asetoni, etanoli, isopropanoli, asetonitriili, dimetyyliformamidi, tetrahydrofuraani ja sykloheksanoli.

Disperssin faasin sisältämän polymeerin pitoisuus vaikuttaa suoraan siihen, kuinka paljon 15 lopullisessa mikropartikkeleita sisältävässä valmisteessa on huokosia tai "tyhjää" tilaa, sekä siihen, minkä muotoisia mikropartikkeleista tulee. Kun polymeerin konsentraatio on 2,5 - 10 % (massaprosenttia), saadaan dimensioiltaan käyttökelpoisia pallomaisia mikrokapseleita (pallomaisia mikropartikkeleita). Käytetyn proteiinin tai polypeptidin konsentraation suhteen on todettu, että sen vaihdellessa aina 50 massaprosenttiin saakka käytetyn polymeerin mas-20 sasta saadut tulokset ovat yhtä pitäviä edellä esitetyn kanssa.

: On todettu, että tämän keksinnön mukaisia mikropartikkeleita valmistettaessa tietyt valmis tukseen liittyvät parametrit tai tekijät vaikuttavat menetelmiin, joita käytetään näiden partikkelien talteen ottamiseksi, sekä itse tuotteeksi saataviin mikropartikkeleihin. Tällaisia erik-25 seen mainittavia parametreja ovat polymeerin konsentraatio disperssissä faasissa, disperssin faasin lämpötila dispergoimisen aikana, pinta-aktiivisten aineiden konsentraatiot dispersissä faasissa sekä polymeeriin liitetyn aineen ja polymeerin ainemäärien suhde disperssissä faasissa. On selvää, että ne konsentraatioiden, lämpötilojen ja ainemäärien suhteiden numeeriset arvot, joihin edellä esitetyssä sekä myöhemmin esitettävissä esimerkeissä on viitattu, antavat 30 tämän keksinnön oikealle ja edulliselle suoritustavalle likimääräiset ja ohjeelliset toimintarajat ja että käytettäessä tämän keksinnön mukaisesti muunmuassa eri liuottimia, polymeerejä, 19 104954 proteiineja sekä polypeptidejä, näiden vaihdellessa voidaan kyseisille parametreille valita vastaavasti eri lukuarvoja muunmuassa kulloinkin käytettyjen aineiden edellyttämällä tavalla.

Tämän keksinnön keksijä haluaa erityisesti korostaa sitä seikkaa, että tässä keksinnössä pro-5 teiinin/polypeptidin ja polymeerin välillä esiintyvä vuorovaikutus on yllättävä ja ainutlaatuinen. Entuudestaan alan asiantuntijoiden tiedossa ei yleisesti ole ollut aktiivisen lääkeaineen ja polymeerin välistä affiniteettia. Itse asiassa entuudestaan on yleisesti tiedossa tapauksia, joissa käytetyn lääkeaineen affinitetti sen liuottimen kanssa, johon lääkeaine ja polymeeri oli yhdessä liuotettu, oli paljon huomattavasti suurempi kuin polymeerin ja lääkeaineen affini-10 teetti. Tällöin entuudestaan yleisesti tiedossa olevissa tunnetuissa systeemeissä suurin osa lääkeaineesta jäi liuokseen sen jälkeen, kun polymeeri oli saostettu pois tästä liuoksesta.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut systeemit soveltuvat erittäin edullisesti käytettäessä hyväksi parenteraalista, kuten esimerkiksi intravenöösistä, intra-15 arteriaalista, intramuskulaarista, subkutaanista tai intraokulaarisra, tai inhalatorista antotietä, mutta ne kuitenkin soveltuvat edullisesti annettaviksi myös oraalisesti ja intranasaalisesti, mikäli näitä antoteitä hyväksi käyttämällä voidaan lisätä vaikuttavan aineen biosaatavuutta tai vähentää sivuvaikutuksia. Erityisesti käyttökelpoisen kokojakauman (noin 0,5 - 5 mikrometriä) omaavat makropartikulaariset systeemit soveltuvat erityisen edullisesti annettaviksi oraa-20 lisesti joko adsorboitumalla ja/tai ruoansulatuskanavan pinnalla olevissa soluissa pinosytoo-sin kautta tapahtuvalla soluunotolla. Tällainen antotapa tekee mahdolliseksi viedä valmistees-• sa oleva vaikuttava aine sellaisenaan kehon systeemiseen, lymfaattiseen tai sisäeritykseen liittyvään systeemiin.

25

Kuten alan asiantuntijat hyvin ymmärtävät, tämän keksinnön mukaisesti valmistettu systeemi lääkeaineiden antamiseksi voidaan antaa sellaisenaan tai seoksena farmaseuttisesti käyttökelpoisten täyte-, kantaja-, lisä- tai apuaineiden kanssa, jotka on valittu pitäen silmällä sitä, mikä antotie on tarkoitettu käytettäväksi, sekä käytössä olevien farmaseuttisten menetelmien perus-30 teella. Esimerkiksi parenteraalista injektiota varten voidaan käyttää eri annosmuotoja silloin, kun systeemi on tarkoitettu annettavaksi intravenöösisesti, intramuskulaarisesti tai subkutaa-nisesti, ja tällaisia parenteraalisia antoteitä hyväksi käytettäessä voidaan valmisteessa käyttää 20 104954 sopivia steriilejä vesipitoisia tai vedettömiä liuoksia tai suspensioita, jotka voivat tarpeen niin vaatiessa sisältää myös isotoonisuuden säätöön tarkoitettuja liuenneita aineita. Edelleen inha-laatiota varten tarkoitetuissa annosmuodoissa, jotka on tarkoitettu annettaviksi nenän ja kurkun tai keuhkoputkien- ja rakkuloiden kudosten limakalvojen kautta, voidaan samoin käyttää 5 soveltuvia aerosoli-inhalaatiokompositiota tai ruiskutettavaa inhalaatiokompositiota sekä tähän tarkoitettuja laitteita.

Edelleen tämän keksinnön suositeltavaan ja edulliseen suoritustapaan kuuluu, että tämän keksinnön mukaisesti valmistettu systeemi lääkeaineiden antamiseksi voi edellä mainittujen 10 seikkojen lisäksi olla päällystetty jollakin käyttökelpoisella menetelmällä tai modifioitu systeemin sisältämän lääkeaineen vapautumisen ohjautumisen tiettyihin ennalta valittuihin koh-desoluihin, -kudokseen tai -elimeen edesauttamiseksi. Lääkeaineiden antamiseksi tarkoitetut mikropartikkelit voidaan esimerkiksi päällystää erilaisilla aineilla, kuten esimerkiksi polymeereillä, proteiineilla, pinta-aktiivisilla aineilla, vasta-aineilla tai reseptorikohdalle spesifisi 1-15 lä lääkeaineilla, jotka voivat koostua samasta tai eri lääkeaineesta kuin siitä, jota on liitetty mikropartikkelien sisälle, jolloin mikropartikkelien sisältämän lääkeaineen vapautuminen keskittyy valittuun kohdesysteemiin. Lisäksi päällystykseen käytetty materiaali voi olla pH-herkkää, jolloin se toimii suojaavasti oraalista antotietä käytettäessä sekä valmisteen kulkiessa mahan kautta.

20 Tätä keksintöä ja sen taijoamia etuja selitetään edelleen lähemmin seuraavien esimerkkien : ' avulla, jotka alan asiantuntijat luonnollisesti ymmärtävät kuvaileviksi esimerkeiksi siten, ettei tämä keksintö rajoitu yksinomaan seuraavissa esimerkeissä esitettyihin tapauksiin.

25

Esimerkki 1 Tässä esimerkissä käsitellään lohen kalsitoniinin molekulaarista vuorovaikutusta polyglyko-lihapon kanssa.

30 Tässä esimerkissä käsitellyissä tutkimuksissa oli tavoitteena kvantitoida lohen kalisitoniinin ja suhteelliselta moolimassaltaan 40000 daltonia olevan polyglykolihapon (PGA) välistä kemiallista ja/tai fysikaalista assosiaatiota.

21 104954

Noin viisi milligrammaa kalsitoniinia punnittiin tarkasti viiden millilitran mittapulloon. Hek-safluoriasetonin seskvihydraattia (HFA) lisättiin tämän jälkeen pisaroittain, kunnes kaikki kalsitoniini oli kokonaan liuennut. Vastaavia näytteitä valmistettin useampia näytteitä käsit-5 tävä saija. Kuhunkin mittapulloon lisättiin edellä esitetyn jälkeen PGA:n 5-prosenttista liuosta HFA:ssa pisaroittain kvantitatiivisesti siten, että näytesarjassa PGA:n pitoisuus kattoi massayksiköissä ilmaistuna vaihteluvälin 0 - 26,3 milligrammaa. Mittapulloja ravisteltiin viisi minuuttia liuosten sekoittamiseksi. Tämän jälkeen kukin mittapullo täytettiin fosfaattia sisältävällä puskuriliuoksella (pH 7,3) viiden millilitran merkkiin. Puskurin lisäys saosti 10 PGA:n sekä siihen liittyneen tai sitoutuneen kalsitoniinin. Näin syntynyt seos sentrifugoitiin ja supematantti analysoitiin spektrofotometrisesti sen sisältämän lohen kalsitoniinin pitoisuuden määrittämiseksi. 26 milligrammaa PGA:ta (M = 40000) poisti liuoksesta noin 4,1 milligrammaa (83 %) lohen kalsitoniinista. Kokeen tulokset on esitetty taulukossa 1.

15 Taulukko 1.

PGA:nmas- Supematantin ab- Kalsitoniinin kon- Liuoksesta poistu- Liuoksesta sa (mg) sorptio (275 nm) sentraatio (mg/ml) neen kalsitoniin poistuneen massa (mg) kalsitoniinin osuus (%) 0,00 0,390 1,020 0,099 1,90 5,73 0,342 0,895 0,125 2,71 7,81 0,285 0,746 1,07 22,3 7,89 0,356 0,932 0,340 6,80 11.8 0,213 0,558 1,71 38,0 • ' 13,2 0,257 0,673 1,64 32,7 14.0 0,220 0,576 2,02 41,2 15.8 0,176 0,461 2,69 53,7 18.4 0,086 0,226 3,87 77,4 10.4 0,165 0,432 2,54 54,0 21.0 0,068 0,175 4,10 82,1 22.3 0,161 0,422 2,95 58,6 . v 23,7 0,105 0,276 3,62 72,4 26.3 0,066 0,174 4,13 82,6

Esimerkki 2.

Tässä esimerkissä käsitellään lohen kalsitoniinin ja poly(glykolihappo-Co-maitohapon) välis-20 tä vuorovaikutusta.

22 104954 Tässä esimerkissä käytettiin vastaavaa menetelmää kuin PGA:lle esimerkissä 1 suhteelliselta moolimassaltaan 50 000 daltonia olevasta poly(glykolihappo-Co-maitohaposta) (PGL) koostuvien mikropartikkeleiden valmistamiseksi kuitenkin siten, että heksafluori-2-5 propanolia käytettiin HFA:n sijasta liuottimena. Kun PGL:ää käytettiin enemmän kuin 8 milligrammaa, yli 80 % lohen kalsitoniinista saatiin pois liuoksesta. Tämän kokeen yksityiskohtaisemmat tulokset on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2.

10 PGL:n massa Supematantin Kalsitoniinin Liuoksesta Liuoksesta (mg) absorbanssi (275 pitoisuus poistuneen kaisi- poistuneen kalsi- nm) (mg/ml) toniinin massa toniinin osuus (mg) (%) 0,00 0,360 0,941 0,591 11,1 2,64 0,306 0,801 0,995 19,9 4,13 0,210 0,550 2,15 43,9 5,52 0,191 0,501 2,69 51,8 6,51 0,147 0,386 2,87 59,8 8,45 0,065 0,172 3,64 80,8 ] 11,53 0,047 0,125 4,37 87,5 f 13,57 0,027 0,0725 4,44 92,5 j 20,97 0,034 0,0908 4,95 91,6 i

Esimerkki 3, * • Tässä esimerkissä tarkastellaan lohen kalsitoniin ja polymaitohapon välistä molekulaarista 15 vuorovaikutusta.

Tässä käytetty menetelmä, jossa lähtöaineena oli dl-tyypisestä suhteelliselta moolimassaltaan 50000 oleva polymaitohappo (PLA), oli vastaava kuin PGA:n tapauksessa esimerkissä 1 käytetty sillä erolla, että HFA:n sijasta liuottimena käytettiin metyleenikloridia ja että kalsi-20 tornini pikemminkin suspendoitiin kuin liuotettiin käytettyyn metyleenikloridiin. Edelleen, koska metyleenikloridi ja käyetty puskuriliuos eivät ole keskenään sekoittuvia, lohen kalsi-toniini lisäksi uutettiin metyleenikloridista puskuriin. Vesipitoinen faasi erotettiin, sentrifu-goitiin ja supematantista mitattiin spektrofotometrisesti lohen kalsitoniinin pitoisuus. Kokeen yksityiskohtaiset tulokset on esitetty taulukossa 3.

23 104954

Taulukko 3.

PLA:n massa Supematantin Kalsitoniinin Liuoksesta Liuoksesta (mg),. absorptio (275 pitoisuus poistuneen poistuneen kalsi- nm),. (mg/ml), kalsitoniinin toniinin osuus massa (mg) (%).

0,00 0,401 1,05 0,055 1,03 2,68 0,226 0,592 2,04 40,8 4,81 0,186 0,488 2,36 47,2 10,28 0,147 0,386 2,77 55,4 14,95 0,105 0,276 3,62 72,4 20,40 0,159 0,417 3,02 60,3 5 Esimerkki 4.

Tässä esimerkissä esitetyssä kokeessa tutkittiin lohen kalsitoniinin vuorovaikutusta sellaisenaan käytettyjen puhtaiden polymeerien kanssa.

Noin 100 milligrammaa PGA:ta (M = 40000) punnittiin ampulliin. Kymmenen milligram-10 maa fosfaattipuskurin liuosta (pH 7,3), joka sisälsi yhden milligramman millilitrassa kalsi-toniinia, lisättiin ampulliin. Polymeeri suspendoitiin kalsitoniiniliuokseen pitämällä ampullia ultraäänihauteessa kymmenen minuutin ajan. Tämän jälkeen suspensio sentrifugoitiin ja su-pematantti analysoitiin spektrofotometrisesti. Edellä esitettyjen vaiheiden mukainen koejärjestely toistettiin käyttämällä polymeerinä PGA:n (M = 40000) sijasta PGA:a (M = 100000), 15 PGL:a ja dl-tyyppistä PLA:a, kuitenkin sillä erolla, että kaikkien aineiden kvantitatiiviset w • määrät puolitettiin niissä kokeissa, joissa käytettiin PGL:a ja PLA:a polymeereinä. Tämän kokeen yksityiskohtaiset tulokset on esitetty taulukossa 4.

Sellaisenaan puhtailla polymeereillä itsellään ilmeni sitoutumisaffiniteetti aina 5,5 prosenttiin 20 saakka, mikä oli vähemmän kuin aikaisemmin edellä esitetyn saostamiseen perustuvan mene-telmän mukaisesti toimittaessa ilmennyt molekulaarinen vuorovaikutus. Kun käytettiin PLA:a (dl-tyyppistä), havaittiin paras suurin affiniteetti lohen kalsitoniiniin sitoutumiseksi silloin, kun tutkittava aine suspendoitiin liuokseen, jonka pitoisuus oli yksi milligramma millilitraa kohden.

25 24 104954

Iaulukko.4,

Polymeeri. Massa Supematantti. Liuoksesta Liuoksesta poistunut (mg), poistuneen sCT:n määrä suhteessa kalsitoniinin polymeerin määrään määrä (mg),. (mg/mg).

PGA (40000) 99,1 0,4022 0,723 0,723/99,1 PGA (100000) 99,3 0,3501 1,143 1,143/99,3 PGL (50000) 50,0 0,4144 0,457 0,457/50,3 PLA (50000) (dl-tyyppi) 50,0 0,2474 2,772 2,772/50,0

Koska aiemmin kuvattujen mikropartikkelien valmistamiseksi pakastekuivaukseen perustuvaa tekniikkaa hyväksi käyttäen valittiin edullisesti siihen soveltuvana polymeerinä käy-5 tettäväksi PGA, yritettiin tällöin lääkeaineen ja polymeerin välillä esiintyvän assosiaation luonne määrittää tarkemmin. Kun tämän ilmiön tutkimiseksi käytettiin differentiaalista pyyh-käisykalorimetriaa (differential scanning calorimetry), havaittiin lohen kalsitoniinin ja PGA:n sulamispisteissä siirtymiä silloin, kun nämä aineet olivat assosioituneet yhteen mikropartikke-leissa. Lisäksi havaittiin muutoksia, jotka kävivät ilmi aineiden Raman- ja infrapunaspektreis-10 tä. Kaikki tässä edellä mainitut seikat tukevat käsitystä siitä, että kyseessä on jonkinasteinen assosioituminen, mutta eivät kiistatta selvitä kyseessä olevan vuorovaikutuksen luonnetta. Edelleen, tehdyissä FTIR-mittauksissa ei käynyt ilmi havaittavia eroja. Tämän perusteella voidaan päätellä, että kyseessä oleva vuorovaikutus ei ole luonteeltaan kemiallista tai kova-lenttista sitoutumista.

15

Esimerkki 5, » : Tässä esimerkissä käsitellään lohen kalsitoniinin ja PGA:n muodostamien saostuneiden sys teemien valmistusta.

20 1. Vesi saostamiseen käytettynä reagenssina.

49,3 milligrammaa lohen kalsitoniinia laitettiin ampulliin ja liuotettiin 0,35 millilitraan HFA:n seskvihydraattia. Tähän näin saatuun liuokseen lisättiin pisaroittani 4,5 g 10-prosenttista PGA-HFA-liuosta, jossa oli 450 milligrammaa PGA:a, samalla magneettisekoit-tajalla sekoittaen. Lisäyksen jälkeen sekoittamista jatkettiin vielä viiden minuutin ajan. Tähän 25 näin saatuun seokseen lisättiin tämän jälkeen fosfaattipuskurin liuosta (pH 7,3) polymeerin saostamiseksi. Liuoksen samenemisen perusteella voitiin päätellä polymeerin saostumisen tapahtuneen. Näiden työvaiheiden jälkeen seosta sekoitettiin vielä lisäksi kahden minuutin i j 25 104954 ajan vortex-sekoittajalla, minkä jälkeen sitä sentrifugoitiin kymmenen minuutin ajan kierros-luvun ollessa 3000 kierrosta minuutissa. Edellä kuvatulla tavalla saatu supematantti otettiin talteen analysoitavaksi ja saatua saostumaa kuivattiin alipainekammiossa muutamien tuntien ajan. Supematantin sisältämän kalsitoniinin pitoisuus määritettiin spektrofotometrisesti ja 5 tästä voitiin laskea polymeerin avulla liuoksesta poistetun aktiivisen aineen määrä. Polymeeriin liittyneen aineen suhteellinen määrä oli välillä 6,0 - 8,0 massaprosenttia polymeerin määrästä.

2. Etyylialkoholi saostamiseen käytettynä reagenssina.

10 Tämän esimerkin tapauksessa edellä käytetty puskuriliuos korvattiin etanolilla, minkä tarkoituksena oli yrittää parantaa saantoa. Tässä kokee käyttettiin kiinteitä reagensseja (polymeeri + lohen kalsiumiini) yhteensä 502 milligrammaa. Näin saatiin polymeeriin liittymään 6,4 - 8,0 prosenttia ainetta.

15 Esimerkki 6.

Tässä esimerkissä esitetään tuloksia kokeista, joiden tarkoituksena oli karakterisoida lohen kalsitoniinin ja PGA:n muodostamia mikropartikkeleja ja saostumaa.

1. Pelkät mikropartikkelit 20 a) Lääkeaineen pitoisuus.

Tässä käytetyt mikropartikkelit valmistettiin esimerkissä 5 kuvatulla tavalla käyttämällä suh-: teelliseltä moolimassaltaan 100000 olevaa polyglykolihappoa. Koska lohen kalsitoniinilla on taipumus assosioitua polyglykolihapon kanssa, ei saostamiseen perustuvaa tekniikkaa voitu käyttää, kun haluttiin määrittää todellisia lääkeaineen pitoisuuksia. Kolmenkymmenen mi-25 nuutin uuttoon perustuva tekniikka puskuriliuoksessa oli paremmin suuntaa antava, kun haluttiin tutkia tosiasiallisia lohen kalsitoniinin pitoisuuksia. Uuttomenetelmää ja HPLC-analyysiä hyväksi käyttäen voitiin määrittää lääkeaineen pitoisuudeksi 8,21 massaprosenttia, mikä vastaa laskennallisesti 82 prosentin liittymistehokkuutta.

30 b) In vitro tapahtuva lohen kalsitoniinin vapautuminen.

Kaksikymmentä milligrammaa PGA:n ja lohen kalsitoniinin muodostamia mikropartikkeleita annosteltiin koeputkeen. Tähän lisättiin kymmenen millilitraa 0,1 M fosfaattia sisältävää pus- 26 104954 kuriliuosta (pH 7,4), joka sisälsi lisäksi EDTA:ta, ja käytetyt koeputket siirrettiin vesihauteeseen (37 °C). Tämän koesaijan yksityiskohtaisemmat tulokset on esitetty kuvassa 5. Ensimmäisessä vaiheessa vapautui yhdeksäntoista mikrogrammaa lohen kalsitoniinia milligrammaa mikropartikkeleita kohden yhdellä kertaa. Tätä ensimmäisessä vaiheessa tapahtunutta vapau-5 tumista seurasi nopea vapautuminen, joka vastasi 50 prosenttia lääkeaineen kokonaismäärästä, alle kahden tunnin aikana. Tässä vaiheessa seurasi hitaampi vapautuminen ja 22 mikrogrammaa lohen kalsitoniinia milligrammaa mikropartikkeleita kohden (22 prosenttia käytetystä lääkeaineen kokonaismäärästä) vapautui seuraavien yhdeksäntoista tunnin aikana. Tämän kokeen tulosten perusteella voidaan päätellä, että lohen kalsitoniini säilyy stabiilina 10 fosfaattipuskurissa noin 35 tunnin ajan.

2. Saostuma a) Kokojakauma.

Lääkeainetta sisältävän saostuman kokojakauman määrittämiseksi käytettiin HIAC/ROYCO 15 hiukkaslaskija-kokoanalysaattoria. Kuten kuvasta 2 käy ilmi, D50, lukumäärän mediaania vastaava läpimitta, oli suurin piirtein 2,8 mikrometriä ja 99 % hiukkasista oli kooltaan välillä 2-10 mikrometriä. Geometrinen keskihajonta, sigmag, oli 1,83, minkä perusteella saostuma on ilmeisen monodisperssi. Massan mediaania vastaava läpimitta (MMD, mass median diameter) laskettiin ja sen arvoksi saatiin 4,39 mikrometriä.

20 b) Lohen kalsitoniinin vapautuminen saostumasta in vitro.

·' Kaksi kahdeksantoista milligramman näytettä lohen kalsitoniinin ja PGA:n muodostamaa saostumaa siirrettiin kvantitatiivisesti koeputkiin. Kymmenen millilitraa 0,1 M fosfaattipuskuria (pH 7,4), joka sisälsi myös EDTA:a, lisättiin erikseen kumpaankin näytteeseen, 25 jotka asetettiin ravisteluhauteeseen (37 °C). Koeputkista otettiin näytteitä ennalta määritellyin aikavälein ja nämä näytteet analysoitiin käytetyn lääkeaineen pitoisuuden määrittämiseksi. Kuten kuvasta 6 ilmenee, lääkeaineen vapautuminen kokeen alussa oli nopeaa. Ajan nolla-hetkellä vapautui 22 prosenttia lääkeaineesta ja tätä seurasi seuraavan alle kahden tunnin mittaisen ajanajakson kuluessa vielä 21 prosenttia lääkeaineen kokonaismäärästä vastaavan 30 määrän vapautuminen. Tätä seuraavassa vaiheessa seuraavien kolmenkymmenen tunnin aikana lääkeaineen vapautuminen oli tuskin huomattavaa vastaten noin 0,1 prosenttia tunnissa.

27 104954 Näin ollen varsin huomattava määrä lohen kalsitoniinista oli vielä matriisin sisällä tai sitoutuneena polymeeriin kokeen loppuvaiheeessa.

Esimerkki 7, 5 In vivo tapahtuvan lohen kalsitoniinin pitkäaikaisen vapautumisen biologisesti hajoavista mikropartikkeleista selvittämiseksi tehdyt tutkimukset.

Tässä esimerkissä esitetyissä kokeissa käytetyt biologisesti hajoavat mikropartikkelit, jotka sisälsivät lohen kalsitoniinia, valmistettiin polyglykolihaposta (40000 daltonia) käyttämällä 10 hyväksi kuvan 2 mukaista pakastekuivaustekniikkaa. Lohen kalsitoniinia sisältävät mikro-partikkelit, jotka sisälsivät vaihtelevia määriä lohen kalsitoniinia, karakterisoitiin määrittämällä niiden hiukkaskoko, huokoisuus, spesifinen pinta-ala ja in vitro tapahtuva vaikuttavan aineen vapautuminen niistä. Pitkäaikaista hypokalseemista efektiä tutkittiin antamalla urospuolisille laboratoriorotille (Wistar rats) subkutaanisia ruiskeita, joiden jälkeen otettiin veri-15 näytteitä eläinten reisilaskimoon asetetun katetrin kautta määrätyin aikavälein ja edelleen määrittämällä näistä näytteistä seerumin kalsiumpitoisuus. Lääkeaineen annoksena käytettiin seuraavia suhteellisia määriä mikropartikkeleissa: 0,3, 4,5 ja 7,5 prosenttia. Näiden käytettyjen lääkeaineen suhteellisten määrien vaikutuksia arvioitaessa voitiin todeta, että 0,3 prosentin suhteellinen määrä riitti efektiivisesti tuottamaan käytetyissä koe-eläimissä pitkäaikaisen 20 hypokalseemisen efektin. Tätä lääkeaineen suhteellista määrä vastaavalla tasolla annettiin lohen kalsitoniinia sisältäviä mikropartikkeleita, joissa oli 40, 120 ja 360 mU (tuhannesosaa ·* ' kansainvälisestä yksiköstä) lohen kalsitoniinia sataa koe-eläimen elopainogrammaa kohti siten kuin kuvassa 7 on esitetty. Tästä seurannut pitkäaikainen hypokalseeminen efekti kesti 24 tunnin ajan lohen kalsitoniinia sisältävien mikropartikkelien ansiosta, kun vertailukohtana 25 käytettiin vapaalla lohen kalsitoniinilla saavutettua 2 -3 tunnin ajan jatkunutta hypokalseemista efektiä. Edelleen lohen kalsitoniinin pitoisuudet veressä pysyivät lisäksi pohjaviivan tasoa vastaavaa pitoisuutta korkeammalla viiden päivän mittaisen ajanjakson ajan.

Kuten edellä esitetystä ilmenee, alan asiantuntijat voivat helposti vakuuttua tämän keksinnön 30 tärkeimmistä tunnusmerkeistä, ja edelleen on mahdollista ilman, että tämän keksinnön mukaisesta menetelmästä tai keksinnön käyttötarkoituksesta poiketaan, tehdä tähän keksintöön sen hengen mukaisesti erilaisia muutoksia ja/tai modifikaatioita, jotta se paremmin soveltuisi

Claims (5)

104954 eri käyttötarkoituksiinsa ja eri olosuhteissa käytettäväksi. Sellaisenaan nämä muutokset ja/tai modifikaatiot kuuluvat oikeutetusti, kohtuullisesti ja tarkoituksenmukaisesti täysin seuraavis-sa patenttivaatimuksissa esitettyjen vaatimusten piiriin. 5 Patenttivaatimukset

1. Menetelmä kalsitoniinia hitaasti vapauttavan lääkkeenantojäijestelmän valmistamiseksi, tunnettu siitä että se käsittää seuraavat vaiheet: a) kalsitoniini ja hydrofobinen, biohajoava polymeeri joka on valittu ryhmästä joka koostuu / 0 polyglykolihaposta, polymaitohaposta, glykolihapon j a L- tai D,L-maitohapon kopolymee-reista, ja glykolidin ja L-tai D,L-laktidin kopolymeereista, liuotetaan ensimmäiseen Iiuotti-meen, johon kalsitoniini ja polymeeri liukenevat ja joka ei hajota polymeeriä tai kalsitoniinia eikä vaikuta niihin haitallisesti, b) vaihtoehtoisesti 15 i) dispergoidaan liuos toiseen liuottimeen johon polymeeri ei ole liukoinen ja joka emulgoi ensimmäisen liuottimen jolloin syntyy mikropisaroita, jonka jälkeen ensimmäinen liuotin poistetaan mikropisaroista uuttamalla tai haihduttamalla siten, että polymeerin j a veden välisessä raj akerroksessa syntyy vuorovaikutus joka aiheuttaa kalsitoniinin sitoutumisen polymeeriin, ja kove-20 tetaan polymeeri siten että muodostuu kalsitoniinipitoisia mikropalloja; tai , ii) lisätään toista liuotinta johon kalsitoniini liukenee mutta polymeeri ei liu- j : kene, polymeerin saostamiseksi muodostamaan mikropartikkeleita joihin kalsitoniini on adsorboitimut.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että mainitut ensimmäinen ja toinen liuotin poistetaan niiden muodostamasta dispersiosta pakastekuivaarnalla.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että mikropartikkeleiden kokoa pienennetään. 30 29 104954

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että ensimmäinen liuotin on valittu ryhmästä joka koostuu metyleenikloridista, heksafluoriasetonista ja heksa-fluori-isopropanolista.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä että toinen liuotin on valittu ryhmästä joka koostuu vedestä, vesipohjaisesta puskuriliuoksesta ja vesi-alkoholiseoksesta. Patentkray 10