ES2927803T3 - Curación de heridas mediante la movilización de células madre autólogas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al campo de la curación de heridas. Más específicamente, la presente invención proporciona métodos y composiciones útiles para mejorar la cicatrización de heridas mediante la movilización de células madre autólogas. En una realización, un método para mejorar la cicatrización de heridas en un paciente comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un movilizador de células madre y una dosis baja de un agente inmunosupresor. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Curación de heridas mediante la movilización de células madre autólogas

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n° 61/907.624, presentada el 22 de noviembre de 2013, y la solicitud provisional estadounidense n° 61/816.827, presentada el 29 de abril de 2013.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una cantidad terapéuticamente eficaz de AMD3100 y Tacrolimus para su uso como medicamento para mejorar la cicatrización de heridas en un paciente.

INCORPORACIÓN POR REFERENCIA DEL MATERIAL PRESENTADO

ELECTRÓNICAMENTE

Esta solicitud contiene un listado de secuencias. Se ha presentado electrónicamente a través de EFS-Web como un archivo de texto ASCII titulado "P12415-03_ST25.txt" El listado de secuencias tiene un tamaño de 2.713 bytes y se creó el 24 de abril de 2014. Se incorpora por referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Más de 1,25 millones de personas sufren quemaduras y 6,5 millones tienen úlceras cutáneas crónicas causadas por la presión, la estasis venosa o la diabetes mellitus cada año en los Estados Unidos (Singer y Clark, 1999). El tratamiento de estas afecciones sigue siendo imperfecto y caro. Existe la esperanza de que la terapia con células madre pueda resultar beneficiosa, ya que está cada vez más demostrado que las células madre desempeñan un papel importante en la cicatrización de las heridas. Por ejemplo, se ha demostrado que los sustitutos de la piel artificial son más eficaces cuando se incorporan células madre a estas membranas. La calidad de la cicatrización de las heridas por quemaduras mejora (Leonardi et al., 2012), reduciendo la formación de cicatrices y restableciendo los apéndices cutáneos (Mansilla et al., 2010; Tamai et al., 2011; Huang y Burd, 2012). Se ha mejorado el tratamiento de una úlcera diabética estática crónica mediante el uso de células madre mesenquimales (MSC) de la médula ósea (BM) del paciente en combinación con fibroblastos cutáneos autólogos incrustados en una membrana de colágeno biodegradable (ColadermR) (Vojtassak et al., 2006). Se ha demostrado que las células de la médula ósea, tanto de origen embrionario como postnatal, reparan los defectos genéticos en la síntesis de colágeno y los defectos de la membrana basal, promoviendo así la curación de las heridas de la piel (Chino et al., 2008; Tolar et al., 2009; Fujita et al., 2010). Recientemente, un ensayo clínico descubrió que el trasplante alogénico de médula ósea completa en seres humanos que sufrían un trastorno cutáneo ampolloso causado por la falta de Col dio lugar a la restauración de la integridad de la piel y la expresión de Col 7 en las membranas basales (Wagner et al., 2010).

Muchos estudios celulares básicos también han puesto de relieve las relaciones plásticas entre la piel y la BM. Las células similares a los fibroblastos de la dermis tienen linajes hematopoyéticos y mesenquimales, se derivan de la BM, y el número de estas células aumenta tras una herida en la piel (Fathke et a/., 2004; Ishii et al., 2005). Las células del donante han sustituido algunos queratinocitos tras el trasplante de BM y han persistido en la epidermis durante al menos 3 años (Korbling et al., 2002). Las células BM contribuyen al desarrollo de la piel fetal, ya que la infusión de células BM con proteína verde fluorescente (GFP) en el útero en ratones condujo a la acumulación de células GFP-positivas en la dermis en desarrollo, particularmente en asociación con los folículos pilosos en desarrollo (Chino et al., 2008).

Estos abundantes estudios documentan la importancia de las células madre de la médula ósea en la cicatrización de heridas y plantean la tentadora posibilidad de que los procesos celulares puedan aprovecharse para desarrollar protocolos terapéuticos prácticos para tratar grandes quemaduras de espesor total y lesiones masivas de tejidos blandos que exigen una terapia inmediata. La promesa de mejorar la reparación de las heridas mediante el aprovechamiento de las células madre queda atestiguada por la existencia de noventa ensayos clínicos con terapias basadas en MSC que figuran en el registro de los NIH (Cerqueira et al., 2012).

Para evitar la preparación de células madre endógenas, que es costosa y requiere mucho tiempo, en estos estudios propusimos movilizar las células madre endógenas farmacológicamente con AMD3100 y Tacrolimus. Se ha demostrado que el AMD3100 impulsa las células madre endógenas desde la médula ósea al torrente sanguíneo en animales y en el hombre. El tacrolimus en dosis bajas demostró tener efectos sinérgicos, y el tratamiento combinado promete un medio sencillo, seguro y rápido de presentar células madre en las zonas lesionadas. Aquí probamos esta hipótesis en la curación de heridas cutáneas de espesor total en ratones y ratas. Al descubrir que este tratamiento era capaz de reducir el tiempo de cicatrización completa en un 25%, caracterizamos las células madre/progenitoras y las citoquinas/factores de crecimiento relacionados en la herida y corroboramos el importante papel de las células madre CD133+ movilizadas en la angiogénesis y la regeneración del folículo piloso en las zonas de la herida utilizando el rastreo de linaje.

KIYAMA TERUO ET AL, "Tacrolimus enhances colon anastomotic healing in rats.", WOUND REPAIR AND REGENERATION, (200209), vol. 10, no. 5, ISSN 1067-1927, páginas 308 - 313 describe experimentos realizados para examinar la hipótesis de que el tacrolimus mejoraría la curación de una anastomosis de colon en ratas al reducir la respuesta inflamatoria.

YUKIHIDE NISHIMURA ET AL, "CXCR4 Antagonist AMD3100 Accelerates Impaired Wound Healing in Diabetic Mice", JOURNAL OF INVESTIGATIVE DERMATOLOGY, NL, (20120301), vol. 132, no. 3, doi:10.1038/jid.2011.356, ISSN 0022-202X, páginas 711 - 720 investigaron si el AMD3100 puede acelerar la curación de heridas deterioradas por la diabetes al aumentar el reclutamiento de células progenitoras endoteliales (EPC) de la médula ósea a la vasculatura en regeneración.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que un movilizador de células madre y un agente inmunosupresor pueden utilizarse para promover o mejorar la curación de las heridas en los pacientes. De hecho, la amplificación farmacológica de las células madre endógenas, como se describe en las realizaciones de la presente invención, es atractiva ya que proporciona un medio simple y rápido de presentar las células madre en las zonas lesionadas.

Como se ha descrito en este documento, los presentes inventores plantearon la hipótesis de que la movilización de las células madre de la médula ósea con AMD 3100 (es decir, plerixafor) en combinación con dosis bajas de Tacrolimus promoverá, en ciertas realizaciones, la reepitelización y, en otras realizaciones, facilitará la regeneración de los folículos pilosos, lo que dará lugar a una restauración más rápida de la piel normal. Para probar esta hipótesis, primero examinamos los efectos del plerixafor, el tacrolimus o los fármacos duales sobre la cicatrización de las heridas en un modelo de ratón de escisión de piel de grosor completo. En segundo lugar, caracterizamos las células madre/progenitoras y las citoquinas/factores de crecimiento relacionados en las zonas de la herida. Por último, evaluamos las contribuciones de las células madre CD133+ movilizadas a la angiogénesis y a la regeneración del folículo piloso en las zonas de las heridas mediante el rastreo de linaje.

Más específicamente, en realizaciones particulares, el Tacrolimus (FK-506) en dosis bajas, no en dosis altas, mejora la curación de la herida a través del reclutamiento de macrófagos productores de SDF-1 en las áreas de la herida. Además, la movilización de las células madre de la médula ósea con Plerixafor en combinación con dosis bajas de Tacrolimus acelera la curación de las heridas, promueve la reepitelización y facilita la regeneración del folículo piloso. De hecho, la combinación de dosis bajas de Tacrolimus y Plerixafor mejoró la cicatrización de la herida al promover tanto la reepitelización como la diferenciación de los componentes de la piel.

Por consiguiente, la presente invención proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de AMD3100 y Tacrolimus para su uso como medicamento para mejorar la cicatrización de heridas en un paciente. Las realizaciones preferidas se exponen en las subreivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Aceleración de la cicatrización de heridas en ratones tratados con la combinación de bajas dosis de Tacrolimus y AMD3100. (a) El modelo: en el día 0, se crearon cuatro heridas de escisión circulares en ratones C57BL/6 o CD133+/C-L. (b) Medidas de la herida. Las áreas de las heridas se determinaron con el programa Adobe Photoshop. (c) Curación temprana. Fotografías representativas de heridas en ratones (n=6) que muestran diferencias notables a partir del día 5. (d) Análisis cuantitativo del cierre de la herida en ratones (n=6). * p< 0,05. (e) Microfotografías H&E de las heridas en el día 5. Barra de escala: 200 pm. (f) El modelo de herida entablillada. (g) Análisis macroscópico de la cicatrización de la piel en los ratones entablillados. (h) Análisis cuantitativo del cierre de la herida en los ratones entablillados (n=6). * p<0,05. Todos los datos representan medias ± SEM.

FIG. 2. Aumento de la regeneración de los folículos pilosos y disminución de las cicatrices en la piel cicatrizada de ratones tratados con una terapia farmacológica dual. (a) Aspecto macroscópico representativo de las heridas reepitelizadas (día 15). (b) Secciones representativas teñidas con H&E del centro de las cicatrices muestran nuevos folículos pilosos dentro de las heridas curadas. La zona de la cicatriz está delimitada por líneas discontinuas. Dos líneas de puntos verticales ayudan a delimitar las regiones con la misma longitud que la zona de la cicatriz curada en el grupo tratado con solución salina. Barra de escala: 200 pm. (c) Secciones adyacentes teñidas con tricrómico de Masson. (d) Fotografías representativas de animales tratados con dos fármacos a los 15 días después de la herida que muestran el crecimiento del pelo en la herida reepitelizada. (e) Cuantificación de los folículos dentro de las cicatrices curadas (2 mm). Los datos representan la media ± SEM (n=9). * p <0,01.

FIG. 3. Reclutamiento de células madre de la médula ósea con terapia farmacológica dual. (a) Análisis cuantitativo de las células c-Kit+, CD34+ y CD133+ de linaje negativo (Lin-) en sangre periférica mediante citometría de flujo a los 5 días de la lesión. Los datos representan la media ± SEM (n=3). * p < 0,05. (b) Tinción de inmunofluorescencia para los marcadores de células madre c-Kit, CD34 y CD133 y el marcador de células endoteliales CD31 en secciones de tejido de ratones heridos a los 5 días de la lesión. Las áreas en recuadro demuestran, a mayor aumento, que los ratones que recibieron el tratamiento farmacológico dual tenían una disposición tubular de células CD133 que se tiñeron conjuntamente con CD31. Los núcleos celulares se tiñeron de azul con DAPI. Fotografías representativas de n=3 muestras individuales de piel lesionada por grupo. epi, epidermis; we, borde de la herida. Barra de escala: 200 pm.

FIG. 4. Aumento de la expresión de SDF-1 y CD133 en las heridas de la piel de los ratones tratados con el tratamiento farmacológico dual. Análisis semicuantitativo de RT-PCR de los tejidos de granulación en la piel herida a los 5 días después de la lesión, (a) La expresión de ARNm de la molécula atractora SDF-1 aumentó significativamente en el grupo de tratamiento con dosis bajas de Tacrolimus, y se elevó aún más en el grupo de tratamiento dual. (b) El nivel de ARNm del marcador de células madre CD133 también fue significativamente mayor en las heridas del grupo de tratamiento dual, paralelamente con la expresión del gen SDF-1.

Todos los datos representan medias ± SEM. (n=3). * p < 0,05. (c) Tinción de inmunofluorescencia doble para SDF-1 y F4/80 (un marcador de macrófagos) a los 5 días de la lesión, epi epidermis; we, borde de la herida. Barra de escala: 200 pm.

FIG. 5. Aumento de las expresiones de factores pro-angiogénicos en ratones lesionados tratados con una terapia farmacológica dual. (a) Análisis PCR semicuantitativo de los tejidos de granulación (día 5) que muestra la sobrerregulación del ARNm de VEGF, bFGF y HGF. (b) Representación gráfica del aumento de las expresiones de ARNm determinado mediante el cálculo de las relaciones entre el factor de crecimiento y la [3actina]. Los valores representan la media ± SEM (n=3). *p < 0,05. (c) La tinción de fluorescencia doble muestra que la mayor fracción de células que expresan HGF se tiñen conjuntamente con el marcador endotelial CD31 en los tejidos de granulación (día 5), y que estas células son más abundantes en el grupo de tratamiento dual. Los paneles de la fila inferior están teñidos para a-SMA y muestran la abundancia de estas células productoras de matriz, en paralelo a los hallazgos para CD31. epi, epidermis; we, borde de la herida. Barra de escala: 200 pm.

FIG. 6. Las células madre CD133+ generan folículos pilosos y epitelio en los ratones CD133+/C-L con grupo de tratamiento dual. (a) Protocolo para el análisis de la expresión de GFP dependiente de Cre inducida por tamoxifeno en el linaje CD133. (b) Los tejidos cutáneos intactos del ratón muestran una marcada expresión de GFP y CD133 (lacZ+) en los folículos pilosos. (c) Fluorescencia concurrente de GFP, [3-galactosidasa (lacZ) y tinción de H&E de la misma sección de piel herida CD133+/C-L-Rosa26EGFP el día 15 después de la lesión, (d) Fotomicrografías de mayor potencia. En las zonas recuadradas, las puntas de flecha marcan los folículos pilosos en la misma sección teñida para GFP+ (panel izquierdo), lacZ+ (panel central) y H&E (panel derecho). Las flechas señalan el epitelio GFP y lacZ positivo. epi, epidermis; we, borde de la herida. Barra de escala: 200 pm. (e) Representación esquemática del mecanismo terapéutico del tratamiento combinado en la curación de heridas de la piel.

FIG. 7. El tratamiento de AMD3100 con dosis bajas de Tacrolimus mejoró la tasa de cierre de la herida en ratas lesionadas. (a) Fotografías ilustrativas del modelo de rata de heridas de escisión de espesor total. Las áreas de las heridas de las biopsias en perforaciones de 5 mm se midieron en los intervalos de tiempo indicados hasta alcanzar el cierre completo. (b) Análisis cinético de la cicatrización de la piel de rata Se muestran imágenes representativas de n=6 animales por grupo. (c) Se mostró el porcentaje de área de la herida en cada punto de tiempo en relación con el área de la herida original. Los datos representan la media ± SEM de n=6 animales por grupo. * p < 0,05 ratas con tratamiento dual frente a las tratadas con vehículo.

FIG. 8. Efectos del Tacrolimus y del AMD3100 en dosis elevadas sobre la cicatrización de heridas en la piel del ratón. (a) Análisis cinético de la cicatrización de heridas por escisión de la piel. Los lugares de las heridas se fotografiaron en el momento indicado. Fotografías representativas de n=3 o 4 animales por grupo. (b) Cambios en el porcentaje del área de la herida en cada punto de tiempo en comparación con el área original de la herida. Los datos representan la media ± SEM de n=3 o 4 animales por grupo: La evaluación cuantitativa no pudo demostrar una diferencia significativa en el cierre de la herida en los ratones tratados con Tacrolimus (1,0 mg kg-1) o AMD3100 (5,0 mg kg-1) en comparación con los ratones tratados con solución salina.

FIG. 9. El tratamiento farmacológico doble estimula la neogénesis de los folículos pilosos y reduce las cicatrices en la piel de las ratas tras una herida. Un modelo de rata de escisión de piel de espesor total, como se ha descrito anteriormente. (a) La regeneración del folículo piloso se evaluó mediante tinción de H&E (paneles izquierdo y central) y tricrómica de Masson (paneles derechos) en el día 20 después de la herida. Se muestran imágenes representativas de n=12 muestras individuales de piel por grupo: la cicatriz se perfila con líneas discontinuas, y las puntas de flecha señalan los folículos pilosos neogénicos dentro de las cicatrices curadas. Barra de escala: 200 pm. (b) Cuantificación de los folículos regenerados dentro de las cicatrices curadas de ratas (2 mm) o de la piel intacta. Los datos representan la media ± SEM de n=12 muestras individuales por grupo. * p < 0,05.

FIG. 10. Las células madre CD133+ generan vasos sanguíneos en la piel herida de los ratones CD133+/C-L en el grupo de tratamiento dual. La fluorescencia GFP simultánea (paneles superiores), la p-galactosidasa (paneles centrales) y la tinción de H&E (paneles inferiores) de la misma sección de heridas CD133+/C-L en el día 5 después de la lesión señala a las células progenitoras CD133+ como una de las fuentes de capilares recién formados, en particular en los ratones CD133+/C-L con tratamiento dual. Las regiones en recuadro se muestran con mayor aumento a la derecha. Las flechas señalan los capilares GFP+ (panel superior) lacZ+ (panel central) (H&E, paneles inferiores) en la misma sección. epi, epidermis; we, borde de la herida. Barra de escala: 200 |jm.

FIG. 11. Fotografías del curso temporal bruto y microscópico de la piel quemada tras el tratamiento con solución salina, el tratamiento con dosis bajas de tacrolimus (0,1 mg/kg/dosis) solo, la monoterapia con AMD3100 (1,0 mg/kg/dosis) o una combinación de dosis bajas de tacrolimus y AMD3100. Fotografías representativas de heridas cutáneas en ratas diabéticas (n=4 o 5) que muestran un efecto notable de la terapia combinada en la mejora de la cicatrización de las heridas.

FIG. 12. La terapia combinada con dosis bajas de Tacrolimus y AMD3100 mejoró el cierre de la herida tras una lesión por quemadura en ratones. (a) Fotografías del curso temporal bruto y microscópico de la piel quemada tras el tratamiento con solución salina, el tratamiento con dosis bajas de tacrolimus (0,1 mg/kg/dosis) solo, la monoterapia con AMD3100 (1,0 mg/kg/dosis) o una combinación de dosis bajas de tacrolimus y AMD3100. Fotografías representativas de la piel quemada en ratones (n=7) que muestran un efecto notable de la terapia combinada en la mejora de la herida por quemadura. (b) Cuantificación del área de la herida en días consecutivos tras la lesión por quemadura. Se muestra la media ± SEM (n=7). * p < 0,05 ratones con tratamiento dual frente a los tratados con vehículo. (c) El cierre de la herida se analizó con un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier (n=7).

FIG. 13. El tratamiento farmacológico dual redujo la formación de cicatrices tras la quemadura. Tamaño de la cicatriz de los ratones tratados con solución salina y con doble fármaco a los 60 días de la quemadura (1,44 cm2) (n=3); se muestran la fotografía (paneles de la izquierda) y la cuantificación (panel de la derecha). La línea continua indica el borde de la cicatriz. *P < 0,05.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento se utiliza únicamente con el fin de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente invención. Cabe señalar que, tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen la referencia plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, una referencia a una "proteína" es una referencia a una o más proteínas, e incluye equivalentes de las mismas conocidos por los expertos en la materia, etc.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece esta invención. Se describen procedimientos, dispositivos y materiales específicos, aunque cualquier procedimiento y material similar o equivalente a los aquí descritos puede utilizarse en la práctica o en las pruebas de la presente invención.

I. Definiciones

"Agente" se refiere a todos los materiales que pueden ser utilizados como o en composiciones farmacéuticas, o que pueden ser compuestos tales como pequeños compuestos orgánicos sintéticos o derivados naturalmente, ácidos nucleicos, polipéptidos, anticuerpos, fragmentos, isoformas, variantes, u otros materiales que pueden ser utilizados independientemente para tales propósitos, todo de acuerdo con la presente invención.

"Antagonista" se refiere a un agente que subregula (por ejemplo, suprime o inhibe) al menos una bioactividad de una proteína. Un antagonista puede ser un compuesto que inhibe o disminuye la interacción entre una proteína y otra molécula, por ejemplo, un péptido objetivo o un sustrato enzimático. Un antagonista también puede ser un compuesto que subregula la expresión de un gen o que reduce la cantidad de proteína expresada presente.

"Hematopoyesis" se refiere al proceso altamente orquestado de desarrollo y homeostasis de las células sanguíneas. Prenatalmente, la hematopoyesis se produce en el saco vitelino, luego en el hígado y finalmente en la médula ósea. En los adultos normales se produce en la médula ósea y en los tejidos linfáticos. Todas las células sanguíneas se desarrollan a partir de células madre pluripotentes. Las células pluripotentes se diferencian en células madre comprometidas con tres, dos o una vía de diferenciación hematopoyética. Sin embargo, ninguna de estas células madre es morfológicamente distinguible.

El término "agente inmunosupresor" se refiere a un agente que inhibe, frena o revierte la actividad del sistema inmunitario. Los agentes inmunosupresores actúan suprimiendo la función de las células inmunitarias que responden (incluidas, por ejemplo, las células T), directamente (por ejemplo, actuando sobre la célula inmunitaria) o indirectamente (actuando sobre otras células mediadoras).

Los términos "células madre" y "células madre hematopoyéticas" se utilizan indistintamente en este documento. Las células madre se distinguen de otros tipos de células por dos características importantes. En primer lugar, las células madre son células no especializadas capaces de renovarse a sí mismas mediante la división celular, a veces tras largos periodos de inactividad. En segundo lugar, en determinadas condiciones fisiológicas o experimentales, las células madre pueden ser inducidas a convertirse en células específicas de un tejido u órgano con funciones especiales. En algunos órganos, como el intestino y la médula ósea, las células madre se dividen regularmente para reparar y sustituir los tejidos desgastados o dañados. Sin embargo, en otros órganos, como el páncreas y el corazón, las células madre sólo se dividen en condiciones especiales.

El término "células madre" puede referirse a las células madre multipotentes que son capaces de diferenciarse en todas las células sanguíneas, incluidos los eritrocitos, los leucocitos y las plaquetas. Por ejemplo, las "células madre hematopoyéticas" o "células madre", tal como se utilizan en la invención, están contenidas no sólo en la médula ósea, sino también en las células derivadas de la sangre del cordón umbilical.

Un "movilizador de células madre", "movilizador de células madre hematopoyéticas o células progenitoras" o "movilizar" (utilizados indistintamente), tal y como se describe en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto, ya sea una pequeña molécula orgánica, sintética o de origen natural, o un polipéptido, como un factor de crecimiento o un factor estimulante de colonias o un fragmento activo o imitación del mismo, un ácido nucleico, un carbohidrato, un anticuerpo o cualquier otro agente que actúe para mejorar la migración de las células madre desde la médula ósea a la sangre periférica. Un movilizador de células madre puede aumentar el número de células madre hematopoyéticas o células progenitoras/precursoras hematopoyéticas en la sangre periférica, permitiendo así una fuente más accesible de células madre para su uso en la curación de heridas. En particular, un movilizador de células madre se refiere a cualquier agente que movilice células madre CD34+ y/o CD133+. En otras realizaciones, un movilizador de células madre interrumpe la quimioatracción mediada por CXCL12 (SDF-1) de las células que expresan CXCR4.

Un "paciente", "sujeto" o "huésped" a tratar por los presentes procedimientos se refiere a un animal humano o no humano, como primates, mamíferos y vertebrados.

Una "molécula pequeña" se refiere a una composición que tiene un peso molecular de menos de 3 aproximadamente kilodaltons (kDa), menos de aproximadamente 1,5 kilodaltons, o menos de aproximadamente 1 kilodalton. Las moléculas pequeñas pueden ser ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas (que contienen carbono) o inorgánicas. Una "pequeña molécula orgánica" es un compuesto orgánico (o un compuesto orgánico complejado con un compuesto inorgánico (por ejemplo, un metal)) que tiene un peso molecular inferior a aproximadamente 3 kilodaltons, a aproximadamente 1,5 kilodaltons o menos de aproximadamente 1 kDa.

Tal y como se utiliza en este documento, los términos "tratamiento", "tratar" y similares, se refieren a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. Los términos también se utilizan en el contexto de la administración de una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, un movilizador de células madre y/o un agente inmunosupresor. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevención total o parcial de un resultado particular, enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de curación parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", tal y como se utiliza en el presente documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un sujeto, particularmente en un ser humano, e incluye: (a) evitar que la enfermedad se produzca en un sujeto que puede estar predispuesto a padecerla pero al que aún no se le ha diagnosticado; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la misma, por ejemplo, eliminar total o parcialmente los síntomas de la enfermedad. En particular, el término se utiliza en el contexto de la promoción o la mejora de la curación de heridas en los pacientes.

II. Movilizadores de células madre

La presente invención se refiere al tratamiento de heridas con un movilizador de células madre en combinación con un agente inmunosupresor. Según la presente invención, el movilizador de células madre es AMD3100.

III. Inmunosupresor

Agentes Junto con un movilizador de células madre, se pueden utilizar agentes inmunosupresores para mejorar la curación de las heridas en los pacientes. El término "agente inmunosupresor" se refiere a un agente que inhibe, frena o revierte la actividad del sistema inmunitario. Los agentes inmunosupresores actúan suprimiendo la función de las células inmunitarias que responden (incluidas, por ejemplo, las células T), directamente (por ejemplo, actuando sobre la célula inmunitaria) o indirectamente (actuando sobre otras células mediadoras).

Según la presente invención, el agente inmunosupresor es el tacrolimus (FK-506).

IV. Composiciones farmacéuticas y administración

En consecuencia, una composición farmacéutica de la presente invención comprende una cantidad eficaz de un movilizador de células madre y un agente inmunosupresor, como se define en la reivindicación 1. Tal y como se utiliza en este documento, el término "eficaz" significa adecuado para lograr un resultado deseado, esperado o previsto. Más concretamente, una "cantidad eficaz" o una "cantidad terapéuticamente eficaz" se utilizan indistintamente y se refieren a una cantidad de un movilizador de células madre y/o un agente inmunosupresor, quizás en combinación con otro agente terapéutico, necesaria para proporcionar el "tratamiento" deseado (definido en el presente documento) o el efecto terapéutico, por ejemplo, una cantidad que sea eficaz para prevenir, aliviar, tratar o mejorar los síntomas de una enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que está siendo tratado. La composición farmacéutica de la presente invención se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz para mejorar la cicatrización de la herida en un paciente. Como puede apreciar un experto en la materia, la cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro, dependiendo de la edad, el estado general del sujeto, la gravedad de la enfermedad que se está tratando, el compuesto y/o la composición administrada, y otros factores similares. Un experto en la materia puede determinar la "cantidad terapéutica eficaz" adecuada en cada caso individual consultando los textos y la bibliografía pertinentes y/o mediante la experimentación habitual.

En ciertas realizaciones, el agente inmunosupresor (por ejemplo, Tacrolimus) se administra en una cantidad de dosis baja. La expresión "dosis baja" o "cantidad de dosis baja" de Tacrolimus en el contexto de la presente invención (en combinación con un movilizador de células madre o solo) se refiere al uso de una cantidad particular de un inmunosupresor (por ejemplo, Tacrolimus) que es más baja que la utilizada típicamente para la inmunosupresión. En ciertas realizaciones, la dosis baja es aproximadamente 1/10 de la cantidad utilizada para la inmunosupresión. En otras realizaciones, la dosis baja de Tacrolimus es de aproximadamente 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8 o 1/9 de la cantidad utilizada para la inmunosupresión. En otras realizaciones, la dosis baja de Tacrolimus es de unas 0,9 veces, unas 0,8 veces, unas 0,7 veces, unas 0,6 veces, unas 0,5 veces, unas 0,4 veces, unas 0,3 veces, unas 0,2 veces, unas 0,1 veces, unas 0,09 veces, unas 0,08 veces, unas 0,07 veces, alrededor de 0,06 veces, alrededor de 0,05 veces, alrededor de 0,04 veces, alrededor de 0,03 veces, alrededor de 0,02 veces, alrededor de 0,01 veces, alrededor de 0,009 veces, alrededor de 0,08 veces o alrededor de 0,07 veces menos que la cantidad típica utilizada para una situación particular (es decir, las cantidades típicas de inmunosupresión pueden diferir). En realizaciones específicas, una dosis baja de un agente inmunosupresor (p. ej, Tacrolimus) es de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 0,5 mg/kg, más específicamente, de aproximadamente 0,01 mg/kg a 0,5 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 0,45 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 0,4 mg/kg, de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 035 mg/kg, entre 0,06 mg/kg y 0,45 mg/kg, entre 0,07 mg/kg y 0,4 mg/kg, entre 0,08 mg/kg y 0,35 mg/kg, entre 0,09 mg/kg y 0,3 mg/kg, entre 0,1 mg/kg y 0,25 mg/kg, etc. En una realización específica, la dosis baja de Tacrolimus es de aproximadamente 0,01 mg/kg a 0,074 mg/kg.

Una dosis normal de Tacrolimus para la inmunosupresión es de aproximadamente 0,1 mg/kg/día-0,3 mg/kg/día (oral) y de aproximadamente 0,01 mg/kg/día-0,05 mg/kg/día (IV). En ciertas realizaciones, una dosis baja de Tacrolimus es aproximadamente una décima parte de la dosis normal, por ejemplo, aproximadamente 0,01 mg/kg/día-0,03 mg/kg/día (oral) y aproximadamente 0,001 mg/kg/día-0,005 mg/kg/día (IV). En otras realizaciones, una dosis baja de Tacrolimus es aproximadamente 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9, 1/10, 1/11, 1/12, 1/13, 1/14, o al menos 1/15 de una dosis normal utilizada para la inmunosupresión.

En otras realizaciones, una dosis baja de Tacrolimus comprende cualquier cantidad inferior a unos 0,075 mg/kg/día para la administración oral. La dosis baja puede comprender cualquier cantidad inferior a aproximadamente 0,07, 0,065, 0,06, 0,055, 0,05, 0,045, 0,04, 0,035, 0,03, 0,029, 0,028, 0,027, 0,026, 0,025, 0,024, 0,023, 0,022, 0,021, 0,020, 0,019, 0,018, 0,017, 0,016, 0,05, 0,014, 0,013, 0,012, 0,011, 0,009, 0,008, 0,007, 0,006, 0,005, 0,004, 0,003, 0,002, o 0,001 mg/kg/día.

Para la administración intravenosa, una dosis baja de Tacrolimus comprende cualquier cantidad inferior a unos 0,01 mg/kg/día. La dosis baja puede comprender cualquier cantidad inferior a unos 0,01, 0,009, 0,008, 0,007, 0,006, 0,005, 0,004, 0,003, 0,002 o 0,001 mg/kg/día.

En otras realizaciones, una dosis baja de Tacrolimus resulta en un intervalo de concentración en sangre de aproximadamente 0,1 ng/ml a aproximadamente 10 ng/ml. La concentración puede ser inferior a unos 10 ng/ml, 9 ng/ml, 8 ng/ml, 7 ng/ml, 6 ng/ml, 5 ng/ml, 4 ng/ml, 3 ng/ml, 2 ng/ml, 1 ng/ml, 09 ng/ml, 0,8 ng/ml, 0,7 ng/ml, 0,6 ng/ml, 0,5 ng/ml, 0,4 ng/ml, 0,3 ng/ml, 0,2 ng/ml o 0,1 ng/ml. En una realización más específica, las concentraciones de tacrolimus en sangre son inferiores a aproximadamente 5ng/m1 tanto para la vía oral como para la vía intravenosa.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención están en una forma biológicamente compatible y adecuada para la administración in vivo en sujetos. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender además un portador farmacéuticamente aceptable. El término "farmacéuticamente aceptable" significa que ha sido aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o estatal o que figura en la Farmacopea de los Estados Unidos o en otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y, más concretamente, en humanos. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el movilizador de células madre y/o el agente inmunosupresor. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como el agua y los aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, entre ellos el aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite mineral, el aceite de sésamo y otros similares. El agua puede ser un portador cuando la composición farmacéutica se administra por vía oral. La solución salina y la dextrosa acuosa pueden ser portadores cuando la composición farmacéutica se administra por vía intravenosa. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol pueden emplearse como soportes líquidos para las soluciones inyectables. Entre los excipientes farmacéuticos adecuados se encuentran el almidón, la glucosa, la lactosa, la sacarosa, la gelatina, la malta, el arroz, la harina, la tiza, el gel de sílice, el estearato de sodio, el monoestearato de glicerol, el talco, el cloruro de sodio, la leche en polvo, el glicerol, el propileno, el glicol, el agua, el etanol y otros similares. La composición farmacéutica también puede contener pequeñas cantidades de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden adoptar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. La composición puede formularse como supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales como los triglicéridos. La formulación oral puede incluir portadores estándar como calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc. En una realización específica, una composición farmacéutica comprende una cantidad eficaz de un movilizador de células madre y/o un agente inmunosupresor junto con una cantidad adecuada de un portador farmacéuticamente aceptable para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse por cualquier vía particular de administración, incluyendo, pero sin limitarse a la oral, parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólica intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intrasinusal, intratorácica, intrauterina, intravesical, en bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, iontoforética o transdérmica. Las vías más adecuadas son la administración oral o la inyección. En ciertas realizaciones, se prefiere la inyección subcutánea.

En general, las composiciones farmacéuticas que comprenden un movilizador de células madre y/o un agente inmunosupresor divulgado en el presente documento pueden usarse solas (por ejemplo, un movilizador de células madre administrado con un agente inmunosupresor) o en conjunto con otros agentes terapéuticos en dosis apropiadas definidas por pruebas de rutina para obtener una eficacia óptima mientras se minimiza cualquier toxicidad potencial. El régimen de dosificación que utiliza una composición farmacéutica de la presente invención puede seleccionarse de acuerdo con una variedad de factores que incluyen el tipo, la especie, la edad, el peso, el sexo, la condición médica del paciente; la gravedad de la condición a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y la composición farmacéutica particular empleada. Un médico con conocimientos ordinarios puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de la composición farmacéutica (y potencialmente otros agentes, incluidos los terapéuticos) necesaria para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la enfermedad.

La precisión óptima para lograr las concentraciones del régimen terapéutico (por ejemplo, las composiciones farmacéuticas que comprenden un movilizador de células madre y/o un agente inmunosupresor en combinación con otro agente terapéutico) dentro del intervalo que produce una eficacia máxima con una toxicidad mínima puede requerir un régimen basado en la cinética de la disponibilidad de la composición farmacéutica a uno o más sitios objetivo. La distribución, el equilibrio y la eliminación de una composición farmacéutica pueden considerarse al determinar la concentración óptima para un régimen de tratamiento. Las dosis de una composición farmacéutica divulgada en el presente documento pueden ajustarse cuando se combinan para lograr los efectos deseados. Por otra parte, las dosis de las composiciones farmacéuticas y de los diversos agentes terapéuticos pueden optimizarse de forma independiente y combinarse para lograr un resultado sinérgico en el que la patología se reduzca más de lo que lo haría si se utilizara cualquiera de ellos por separado.

En particular, la toxicidad y la eficacia terapéutica de una composición farmacéutica divulgada en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación, por ejemplo, para determinar la LD⁵⁰ (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED⁵⁰ (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación de dosis entre el efecto tóxico y el terapéutico es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD⁵⁰/ED⁵⁰. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que presentan grandes índices terapéuticos, excepto cuando la citotoxicidad de la composición es la actividad o el resultado terapéutico que se desea. Aunque se pueden utilizar composiciones farmacéuticas que presentan efectos secundarios tóxicos, un sistema de administración puede dirigir dichas composiciones al lugar del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por tanto, reducir los efectos secundarios. En general, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse de manera que se maximice la eficacia y se minimice la toxicidad.

Los datos obtenidos de los ensayos en cultivos celulares y los estudios en animales pueden utilizarse para formular una gama de dosis para su uso en humanos. Las dosis de dichas composiciones se encuentran preferentemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED⁵⁰ con poca o ninguna toxicidad. La dosis puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualquier composición utilizada en los procedimientos de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración plasmática circulante que incluya el IC⁵⁰ (la concentración de la composición de prueba que logra una inhibición semimáxima de los síntomas) según lo determinado en el cultivo celular. Esta información puede utilizarse para determinar con precisión las dosis útiles en los seres humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.

Además, la administración de dosificación de las composiciones de la presente invención puede optimizarse utilizando un sistema de modelado farmacocinético/farmacodinámico. Por ejemplo, se pueden elegir uno o más regímenes de dosificación y se puede utilizar un modelo farmacocinético/farmacodinámico para determinar el perfil farmacocinético/farmacodinámico de uno o más regímenes de dosificación. A continuación, se puede seleccionar uno de los regímenes de dosificación para la administración que logre la respuesta farmacocinética/farmacodinámica deseada en función del perfil farmacocinético/farmacodinámico particular. Véase WO 00/67776.

Más específicamente, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en una sola dosis diaria, o la dosis diaria total puede administrarse en dosis divididas de dos, tres o cuatro veces al día. En el caso de la administración oral, la dosis diaria de las composiciones puede variar en un amplio intervalo que va desde unos 0,1 ng hasta unos 1.000 mg por paciente, por día. El intervalo puede ser más particularmente de aproximadamente 0,001 ng/kg a 10 mg/kg de peso corporal por día, aproximadamente 0,1-100 |jg, aproximadamente 1,0-50 |jg o aproximadamente 1,0-20 mg por día para adultos (a aproximadamente 60 kg).

La dosis diaria de las composiciones farmacéuticas puede variar en un amplio intervalo que va desde unos 0,1 ng hasta unos 1000 mg por humano adulto al día. Para la administración oral, las composiciones pueden proporcionarse en forma de comprimidos que contengan desde aproximadamente 0,1 ng hasta aproximadamente 1000 mg de la composición o 0,1, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0, 15,0, 100, 150, 200,250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, o 1000 miligramos de la composición para el ajuste sintomático de la dosificación al paciente a tratar. Una cantidad eficaz de la composición farmacéutica se suministra normalmente a un nivel de dosificación de aproximadamente 0,1 ng/kg a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por día. En una realización, el intervalo es de aproximadamente 0,2 ng/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día. En otra realización, el intervalo es de aproximadamente 0,5 ng/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por día. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse en un régimen de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 veces al día.

En el caso de las inyecciones, suele ser conveniente administrarlas por vía intravenosa en una cantidad de aproximadamente 0,0001jg-30 mg, de aproximadamente 0,01 jg-20 mg o de aproximadamente 0,01-10 mg al día a los adultos (a unos 60 kg). En el caso de otros animales, puede administrarse también la dosis calculada para 60 kg. Más concretamente, en el caso de las inyecciones, suele ser conveniente administrar Tacrolimus por vía subcutánea en una cantidad de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 0,5 mg/kg de Tacrolimus, más concretamente, de aproximadamente 0,01 mg/kg a 0,5 mg/kg, de aproximadamente 0,02 mg/kg a aproximadamente 0,5 mg/kg, de aproximadamente 0,03 mg/kg a unos 0,5 mg/kg, unos 0,04 mg/kg a unos 0,45 mg/kg, unos 0,06 mg/kg a unos 0,45 mg/kg, unos 0,07 mg/kg a unos 0,4 mg/kg, unos 0,08 mg/kg a unos 0,35 mg/kg, unos 0,09 mg/kg a unos 0,3 mg/kg, unos 0,1 mg/kg a unos 0,25 mg/kg, etc.

Las dosis de una composición farmacéutica de la presente invención pueden incluir opcionalmente de 0,0001 jg a 1.000 mg/kg/administración, o de 0,001 jg a 100,0 mg/kg/administración, de 0,01 jg a 10 mg/kg/administración, de 0,1 jg a 10 mg/kg/administración, incluyendo, pero sin limitarse a, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 y/o 100-500 mg/kg/administración o cualquier intervalo, valor o fracción del mismo, o para alcanzar una concentración sérica de 01, 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,5, 1,9, 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3,5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7.9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5.9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18,5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20, 20,5, 20,9, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 96, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, y/o 5000 jg/m l de concentración sérica por administración única o múltiple o cualquier intervalo, valor o fracción del mismo.

Como ejemplo no limitante, el tratamiento de los sujetos puede proporcionarse como una dosificación única o periódica de una composición de la presente invención de 0,1 ng a 100 mg/kg, tal como 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 mg/kg, por día, al menos uno de los días 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40, o alternativamente o adicionalmente, al menos uno de la semana 1, 23, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51 o 52, o alternativamente o adicionalmente, al menos uno de los 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 años, o cualquier combinación de los mismos, utilizando dosis únicas, de infusión o repetidas.

En ciertas realizaciones, las dosis de una composición farmacéutica de la presente invención pueden incluir opcionalmente de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 0,5 mg/kg de Tacrolimus, incluyendo, pero sin limitarse a, 0,01, 0,0202, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, y/o 0,5 mg/kg/administración o cualquier intervalo, valor o fracción del mismo, o para lograr un nivel en sangre de aproximadamente 2,0, 2,5, 2,9, 3,0, 3.5, 3,9, 4,0, 4,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10,5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 20, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14,0, 14,5, 4,9, 5,0, 5,5, 5,9, 6,0, 6,5, 6,9, 7,0, 7,5, 7,9, 8,0, 8,5, 8,9, 9,0, 9,5, 9,9, 10, 10.5, 10,9, 11, 11,5, 11,9, 12, 12,5, 12,9, 13,0, 13,5, 13,9, 14, 14,5, 15, 15,5, 15,9, 16, 16,5, 16,9, 17, 17,5, 17,9, 18, 18.5, 18,9, 19, 19,5, 19,9, 20 ng/ml.

Específicamente, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse al menos una vez a la semana en el transcurso de varias semanas. En una realización, las composiciones farmacéuticas se administran al menos una vez a la semana durante varias semanas o varios meses. En otra realización, las composiciones farmacéuticas se administran una vez a la semana durante cuatro a ocho semanas. En otra realización, las composiciones farmacéuticas se administran una vez a la semana durante cuatro semanas.

Más específicamente, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse al menos una vez al día durante unos 2 días, al menos una vez al día durante unos 3 días, al menos una vez al día durante unos 4 días, al menos una vez al día durante unos 5 días, al menos una vez al día durante unos 6 días, al menos una vez al día durante unos 7 días, al menos una vez al día durante unos 8 días, al menos una vez al día durante unos 9 días, al menos una vez al día durante unos 10 días, al menos una vez al día durante unos 11 días, al menos una vez al día durante unos 12 días, al menos una vez al día durante unos 13 días, al menos una vez al día durante unos 14 días, al menos una vez al día durante unos 15 días, al menos una vez al día durante unos 16 días, al menos una vez al día durante unos 17 días, al menos una vez al día durante unos 18 días, al menos una vez al día durante unos 19 días, al menos una vez al día durante unos 20 días, al menos una vez al día durante unos 21 días, al menos una vez al día durante unos 22 días, al menos una vez al día durante unos 23 días, al menos una vez al día durante unos 24 días, al menos una vez al día durante unos 25 días, al menos una vez al día durante unos 26 días, al menos una vez al día durante unos 27 días, al menos una vez al día durante unos 28 días, al menos una vez al día durante unos 29 días, al menos una vez al día durante unos 30 días, o al menos una vez al día durante unos 31 días.

Como alternativa, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse aproximadamente una vez al día, aproximadamente una vez cada 2 días, aproximadamente una vez cada 3 días, aproximadamente una vez cada 4 días, aproximadamente una vez cada 5 días, aproximadamente una vez cada 6 días, aproximadamente una vez cada 7 días, aproximadamente una vez cada 8 días, aproximadamente una vez cada 9 días, aproximadamente una vez cada 10 días, aproximadamente una vez cada 11 días, aproximadamente una vez cada 12 días, aproximadamente una vez cada 13 días, aproximadamente una vez cada 14 días, una vez cada 15 días, una vez cada 16 días, una vez cada 17 días, una vez cada 18 días, una vez cada 19 días, una vez cada 20 días, una vez cada 21 días, una vez cada 22 días, una vez cada 23 días, una vez cada 24 días, una vez cada 25 días, una vez cada 26 días, una vez cada 27 días, una vez cada 28 días, una vez cada 29 días, una vez cada 30 días o una vez cada 31 días.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse alternativamente una vez cada semana, una vez cada 2 semanas, una vez cada 3 semanas, una vez cada 4 semanas, una vez cada 5 semanas, una vez cada 6 semanas, una vez cada 7 semanas, una vez cada 8 semanas, una vez cada 9 semanas, una vez cada 10 semanas, una vez cada 11 semanas, una vez cada 12 semanas, una vez cada 13 semanas, una vez cada 14 semanas, una vez cada 15 semanas, una vez cada 16 semanas, una vez cada 17 semanas, una vez cada 18 semanas, una vez cada 19 semanas, una vez cada 20 semanas.

Como alternativa, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse aproximadamente una vez al mes, aproximadamente una vez cada 2 meses, aproximadamente una vez cada 3 meses, aproximadamente una vez cada 4 meses, aproximadamente una vez cada 5 meses, aproximadamente una vez cada 6 meses, aproximadamente una vez cada 7 meses, aproximadamente una vez cada 8 meses, aproximadamente una vez cada 9 meses, aproximadamente una vez cada 10 meses, aproximadamente una vez cada 11 meses o aproximadamente una vez cada 12 meses.

Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse al menos una vez a la semana durante unas 2 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 3 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 4 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 5 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 6 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 7 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 8 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 9 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 10 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 11 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 12 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 13 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 14 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 15 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 16 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 17 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 18 semanas, al menos una vez a la semana durante unas 19 semanas, o al menos una vez a la semana durante unas 20 semanas.

Alternativamente, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse al menos una vez a la semana durante aproximadamente 1 mes, al menos una vez a la semana durante aproximadamente 2 meses, al menos una vez a la semana durante aproximadamente 3 meses, al menos una vez a la semana durante aproximadamente 4 meses, al menos una vez a la semana durante aproximadamente 5 meses, al menos una vez a la semana durante unos 6 meses, al menos una vez a la semana durante unos 7 meses, al menos una vez a la semana durante unos 8 meses, al menos una vez a la semana durante unos 9 meses, al menos una vez a la semana durante unos 10 meses, al menos una vez a la semana durante unos 11 meses, o al menos una vez a la semana durante unos 12 meses.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención (por ejemplo, un movilizador de células madre y/o un agente inmunosupresor) pueden administrarse simultánea o secuencialmente por la misma o diferentes vías de administración. Las composiciones farmacéuticas pueden combinarse además con uno o más agentes terapéuticos adicionales. La determinación de la identidad y la cantidad de las composiciones farmacéuticas para su uso en los procedimientos de la presente invención puede ser realizada fácilmente por médicos normalmente capacitados utilizando técnicas estándar conocidas en el arte. En realizaciones específicas, un movilizador de células madre de la presente invención puede administrarse en combinación con una cantidad eficaz de un agente inmunosupresor. En otras realizaciones específicas, un movilizador de células madre y un agente inmunosupresor pueden administrarse en combinación con una cantidad eficaz de otro movilizador de células madre, otro agente inmunosupresor u otro agente terapéutico.

En varias realizaciones, el movilizador de células madre de la presente invención en combinación con un agente inmunosupresor (y opcionalmente otro movilizador de células madre, otro agente inmunosupresor, u otro agente terapéutico) puede ser administrado aproximadamente al mismo tiempo, con menos de 1 minuto de diferencia, con menos de 2 minutos de diferencia, con menos de 5 minutos de diferencia, con menos de 30 minutos de diferencia, con 1 hora de diferencia, con 1 a 2 horas de diferencia, con 2 a 3 horas de diferencia, con 3 a 4 horas de diferencia, con 4 a 5 horas de diferencia, con una separación de entre 5 y 6 horas, con una separación de entre 6 y 7 horas, con una separación de entre 7 y 8 horas, con una separación de entre 8 y 9 horas, con una separación de entre 9 y 10 horas, con una separación de entre 10 y 11 horas, con una separación de entre 11 y 12 horas, con una diferencia de 12 horas a 18 horas, de 18 horas a 24 horas, de 24 horas a 36 horas, de 36 horas a 48 horas, de 48 horas a 52 horas, de 52 horas a 60 horas, de 60 horas a 72 horas, de 72 horas a 84 horas, de 84 horas a 96 horas o de 96 horas a 120 horas. En determinadas realizaciones, se administran dos o más terapias dentro de la misma visita al paciente.

En ciertas realizaciones, el movilizador de células madre de la presente invención en combinación con un agente inmunosupresor (y opcionalmente otro movilizador de células madre, otro agente inmunosupresor, u otro agente terapéutico) se administran cíclicamente. La terapia cíclica implica la administración de una primera terapia (por ejemplo, el movilizador de células madre) durante un periodo de tiempo, seguida de la administración de una segunda terapia (por ejemplo, el agente inmunosupresor) durante un periodo de tiempo, opcionalmente, seguida de la administración de quizás una tercera terapia durante un periodo de tiempo y así sucesivamente, y repitiendo esta administración secuencial, por ejemplo, el ciclo, para reducir el desarrollo de resistencia a una de las terapias, para evitar o reducir los efectos secundarios de una de las terapias, y/o para mejorar la eficacia de las terapias. En ciertas realizaciones, la administración de la terapia combinada de la presente invención puede repetirse y las administraciones pueden estar separadas por al menos 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, 30 días, 45 días, 2 meses, 75 días, 3 meses o al menos 6 meses.

Sin elaboración adicional, se cree que un experto en la materia, utilizando la descripción anterior, puede utilizar la presente invención en toda su extensión. Los siguientes ejemplos son meramente ilustrativos y no limitan en absoluto el resto de la divulgación.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completas de cómo se fabrican y evalúan los compuestos, composiciones, artículos, dispositivos y/o procedimientos descritos y reivindicados en el presente documento, y pretenden ser puramente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se ha procurado garantizar la exactitud de las cifras (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero hay que tener en cuenta algunos errores y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes en peso, la temperatura está en grados centígrados o está a temperatura ambiente, y la presión está en o cerca de la atmosférica. Existen numerosas variaciones y combinaciones de condiciones de reacción, por ejemplo, concentraciones de los componentes, disolventes deseados, mezclas de disolventes, temperaturas, presiones y otros intervalos y condiciones de reacción que pueden utilizarse para optimizar la pureza y el rendimiento del producto obtenido en el proceso descrito. Para optimizar las condiciones de este proceso, sólo será necesaria una experimentación razonable y rutinaria.

La movilización farmacológica de las células madre endógenas promueve significativamente la regeneración de la piel tras una escisión de espesor total: La actividad sinérgica de AMD3100 y Tacrolimus

La terapia con células madre se ha mostrado prometedora en el tratamiento de una variedad de patologías, incluyendo las heridas de la piel, pero las aplicaciones prácticas siguen siendo esquivas. Aquí, demostramos que la movilización de células madre endógenas producida por AMD3100 y dosis bajas de Tacrolimus es capaz de reducir en un 25% el tiempo de curación completa de las heridas de espesor total creadas por escisión quirúrgica. Igualmente importante, la cicatrización se acompañó de una menor formación de cicatrices y de la regeneración de los folículos pilosos. Buscando mecanismos, encontramos que el AMD3100 combinado con dosis bajas de Tacrolimus movilizó un mayor número de células madre c-Kitk, CD34t> y CD13311 de linaje negativo. Las dosis bajas de Tacrolimus también aumentaron el número de macrófagos portadores de SDF-1 en las zonas de la herida, amplificando la "atracción" de las células madre movilizadas hacia la herida. El rastreo del linaje demostró el papel fundamental de las células madre CD133 en la neogénesis de los capilares y los folículos pilosos, lo que contribuye a una curación más rápida y perfecta. Nuestros hallazgos ofrecen un importante enfoque terapéutico para la curación de heridas y la regeneración de tejidos.

Materiales y procedimientos

Animales. Los ratones C57BL/6J se adquirieron en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se designaron como ratones de tipo salvaje en este estudio. Los ratonesCD133+/C-L(Zhu et al., 2009) se obtuvieron del St Jude Children's Research Hospital (Memphis, TN). Los ratones mT/mG fueron proporcionados amablemente por el Dr. Steven D. Leach. mT/mG expresa tdTomato dirigido a la membrana ("mT") antes de la escisión de Cre y EGFP dirigido a la membrana ("mG") después de la escisión de Cre, permitiendo así la visualización en vivo y la distinción de las células recombinadas y no recombinadas (Muzumdar et a/., 2007). Cuando los ratones mT/mG se cruzaron con ratones CD133-Cre (Zhu et a/. , 2009), la GFP de etiquetado mG puede ser generada por líneas transgénicas CD133-Cre inducibles (Zhu et al., 2009). Las ratas DA (RT1Aa) se compraron a Harlan Sprague-Dawley (Indianápolis, IN, USA). Todos los animales se mantuvieron en las instalaciones libres de patógenos específicos de las Instituciones Médicas Johns Hopkins. Los animales se cuidaron de acuerdo con las directrices de los NIH y según un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins. Para los experimentos se utilizaron ratones y ratas de edad y sexo similares. Los animales que requirieron atención médica recibieron atención o tratamiento veterinario adecuado por parte de veterinarios autorizados y fueron excluidos de los estudios descritos.

Modelo de herida por escisión in vivo . Los animales de entre 8 y 12 semanas fueron anestesiados con isoflurano. La piel dorsal se afeitó y se limpió con betadine y etanol al 70 %. En los ratones se marcó con bolígrafo la línea media y cuatro puntos de 1 cm a cada lado de la línea media. Dos puntos se situaron a nivel del margen costal y dos en las crestas ilíacas designando los lugares de escisión (FIG. 1A). En las ratas, las cuatro heridas de escisión se colocaron a 1 cm a cada lado de la línea media y a 1 cm por encima y por debajo del punto medio entre el margen costal y las cretas ilíacas (FIG. 7a). El punzón de biopsia desechable estéril (5 mm de diámetro; Miltex) se alineó verticalmente sobre el centro de la marca y se perforó a través de la piel y el panículo carnoso aplicando presión y girando al mismo tiempo. Se repitió el mismo procedimiento, generando cuatro heridas en cada animal (Tomlinson y Ferguson, 2003). Los animales fueron alojados individualmente después de recuperar la conciencia. Para el modelo de herida entablillada en ratón, se realizó una escisión de 5 mm a cada lado de la línea media en la parte media de la espalda. Las férulas de silicona de 0,5 mm de grosor con forma de rosquilla y un diámetro dos veces superior al de la herida (Grace Bio-Laboratories, Bend, OR) se centraron, suturaron y pegaron (Krazy Glue®; Elmer's Inc., Columbus, OH) (FIG. IF; Galiano et al., 2004).

Los animales fueron inyectados por vía subcutánea con AMD3100 (AMD) (1,0 mg kg-1, cada dos días, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) o Tacrolimus (T) (0,1 mg kg-1, diariamente, adquirido en la farmacia del hospital Johns Hopkins). Se administraron dosificaciones más altas de DMAE (5,0 mg kg-1, cada dos días) o de T (1,0 mg kg-1, diariamente) a los ratones heridos desde el día 0 hasta el día del cierre completo para determinar la respuesta a la dosis.

Se fotografió digitalmente cada lugar de la herida en los intervalos de tiempo indicados, y se determinaron las áreas de la herida en las fotografías utilizando Adobe Photoshop (versión 7.0; Adobe Systems, San Jose, CA). Los cambios en las áreas de las heridas a lo largo del tiempo se expresaron como el porcentaje de las áreas iniciales de las heridas (FIG. 1B).

Inactivación del SDF-1 por inyección local intradérmica de anticuerpos anti-SDF-1. En otra serie de experimentos, tras la creación de la herida, antes del tratamiento con la terapia farmacológica dual (AMD más dosis bajas de T), se inyectaron por vía intradérmica 50 j l de 15 |jg ml-1 (Xu etal, 2013) de anticuerpos neutralizantes anti-SDF-1 (MAB310, R&D Systems, Minneapolis, MN) en solución salina se inyectaron por vía intradérmica en las dos heridas del lado derecho, mientras que las otras dos heridas del lado izquierdo se trataron con una cantidad igual de IgG de isotipo similar (MCA1209, AbD Serotec, Raleigh, NC) como control. El fluido se inyectó en la piel que bordeaba las heridas y en los lechos de las heridas una vez al día, seguido del tratamiento del régimen combinado hasta que las heridas se cerraron. Estas conductas fueron paralelas a otro grupo de control negativo (vehículo) tratado sólo con solución salina durante todo el periodo de observación.

Histología y microscopía. Se recogieron tejidos de las zonas de la herida en los días 3, 5, 7, 9 y 15 después de la lesión.

Estudios de rastreo de linaje: La acumulación predominante de células CD133+ en las zonas de la herida de los ratones con tratamiento dual (Figura 3B) hizo que se utilizara un sistema de rastreo de linaje in vivo para seguir explorando el papel de las células madre/progenitoras CD133+ en la regeneración de la piel. Para activar el CreERT2 expresado desde el locus CD133C-L, activando así de forma irreversible la expresión de GFP en las células CD133+ y su progenie, 7 días antes de la cirugía, se inyectaron por vía intraperitoneal ratones adultos mT/mG;CD133+/C-L-RosaEGFP con 5,0 mg de tamoxifeno (Sigma) disuelto en aceite de maíz (Figura 6a; Muzumdar et al., 2007). La dosis y el momento de administración del tamoxifeno se definieron tomando como referencia los artículos que describen la generación de ratones de rastreo de linaje CD133 (Nature 2009; 457: 603-607 Génesis 2007; 45:593-605). Los animales fueron sacrificados mediante eutanasia con CO2 en los puntos de tiempo indicados y se extrajeron muestras de piel que incluían y rodeaban la zona de la herida, se fijaron en paraformaldehído al 2% durante una noche a 4°C, se crioprotegieron en sacarosa al 30% durante una noche a 4°C y se congelaron en OCT (temperatura óptima de corte). Se obtuvieron secciones congeladas utilizando un criostato Leica y los portaobjetos se lavaron en PBS durante 5 minutos. El análisis de lacZ se realizó con un kit comercial de tinción de p-Galactosidasa (BioVision Inc. Milpitas, CA) que utiliza X-gal como sustrato. Tras el montaje con glicerol al 70 %, las secciones se observaron en un microscopio Zeiss para comprobar el desarrollo del color azul. Para la microscopía de GFP, las secciones de piel se cubrieron con un medio de montaje con DAPI (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) y se obtuvieron imágenes con un microscopio de fluorescencia confocal (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY). Para identificar la estructura de los tejidos y las células positivas para lacZ y GFP, la misma sección se tiñó secuencialmente con DAPI para los estudios de fluorescencia de GFP, seguida de la tinción con X-gal y hematoxilina y eosina (H&E) (IHC World, Woodstock, MD), según las instrucciones del fabricante.

Análisis cuantitativo de los folículos pilosos: El número de folículos pilosos regenerados se cuantificó de forma doblemente ciega. En la piel no herida, se contó el número de folículos pilosos en la zona de la misma localización que la herida y se comparó con los grupos experimentales (FIG. 2A y FIG.9A; las líneas discontinuas indican el margen de la herida). Se utilizó el tricrómico de Masson (kit comercial de Polysciences, Inc. Warrington, PA) para detectar las fibras de colágeno (color azul).

Tinción de inmunofluorescencia: Para la tinción de inmunofluorescencia, las secciones congeladas se fijaron con acetona (-20-C) durante 10 minutos y se secaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Se utilizó PBS con un 1% de BSA y un 5% de suero normal de burro para bloquear el fondo inespecífico. Las secciones se incubaron durante 1,5 h a temperatura ambiente con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo policlonal de conejo específico para CD133 (1:100, ab19898, Abcam, Cambridge, MA), anticuerpo policlonal de conejo específico para c-Kit (1:100, sc-168, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anticuerpo policlonal de cabra específico para CD34 (1:100, AF4117, R&D Systems, Minneapolis, MN), anticuerpo monoclonal de ratón específico para SDF-1 (1100, MAB310, R&D Systems), anticuerpo monoclonal de rata conjugado con FITC específico para F4/80 (1:100, 11-4801, eBioscience, San Diego, CA), anticuerpo monoclonal de ratón específico para a-SMA (1100, ab7817, Abcam), anticuerpo monoclonal de rata específico para CD31 (1:100, 14-0311, eBioscience) o anticuerpo policlonal de conejo específico para HGF (1:100, sc-7949, Santa Cruz), o las combinaciones de dos de ellos para la tinción de fluorescencia doble. Después de enjuagarse con PBS, las secciones se incubaron adicionalmente durante 1 hora a temperatura ambiente con los anticuerpos secundarios de de IgG anti-conejo de burro Cy3 (1:200, 711-166-152, Jackson ImmunoResearch, West Grove, pA), IgG anti-cabra de burro Cy3 (1:200, 705-166-147, Jackson ImmunoResearch), IgG anti-ratón de burro Cy3 (1200, 715-615-151, Jackson ImmunoResearch), IgG antiratón de burro FITC (1:200, 715-096-150, Jackson ImmunoResearch) o IgG antirata de burro FITC (1:200, 712-097-003, Jackson ImmunoResearch), o las combinaciones de dos con diferentes colores (Cy3 y FITC) de ellos para la tinción de doble fluorescencia. Los núcleos celulares se tiñeron de azul con DAPI. Las secciones de tejido se analizaron mediante microscopía confocal (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, NY).

Citometría de flujo. La sangre periférica se extrajo antes del sacrificio mediante punción intracardíaca. Los glóbulos rojos se lisaron con el tampón de lisado de glóbulos rojos Hybri-MaxTM (sigma). Se lavaron las células residuales y se analizaron las suspensiones (1 x 106) para determinar la expresión de los marcadores de células madre c-Kit+, CD34+ y CD133+ de linaje negativo. Todos los anticuerpos utilizados eran de fuentes comerciales, incluidos los anticuerpos primarios: CD133(1:100, ab19898, Abcam), CD34 (1:100, AF4117, R&D Systems), c-K it(1:100, 14-1171, eBioscience), panel de linaje hematopoyético de ratón (eBioscience) incluido CD3 conjugado con biotina (1:100, 13­ 0031), CD45R/B220 (1:100, 13-0452), CD11b(1:100, 13-0112), TER-119 (1:200, 13-5921) y Ly-6G (1:200, 13-5931); los anticuerpos secundarios incluían IgG antirata Fitc (1:200, 712-096-150, Jackson ImmunoResearch), IgG anticonejo PE (1:200, 12-4739, eBioscience), IgG anticabra APC (1:200, 705-136-147, Jackson ImmunoResearch) y estreptavidina-PerCP (1:200, 554064, BD Pharmingen). La unión inespecífica de los anticuerpos se bloqueó con suero de burro normal (Sigma) durante 30 minutos. Las células se incubaron con anticuerpos primarios seguidos de anticuerpos secundarios durante 30 minutos a 4°C, y las células positivas se contaron por citometría de flujo (clasificación celular activada por fluorescencia [FACS]) utilizando el software CELLQuest (Becton- Dickinson, Bedford, 10 MA).

Reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa semicuantitativa. Las muestras de piel se mantuvieron congeladas a -80 °C hasta que se homogeneizaron para la extracción de ARN utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). A continuación, se realizó la síntesis de ADNc de primera cadena a partir de 5 |jg de ARN total utilizando el sistema de síntesis de primera cadena superscript para la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR; Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La PCR contenía 1 j l de mezcla de desoxinucleósidos trifosfato (10 mM de cada dNTP), 1 j l de 10 jM de cada cebador, 0,4 j l (5 IU jL-1) de Platinum Taq polimerasa (Invitrogen), 1,5 j l de 50 mM de MgC12 y 2 j l de ADN total como molde en una solución de reacción de 50 jl. El ciclo térmico se inició con un ciclo a 94°C durante 4 min. A esto le siguieron 25-35 ciclos a 94°C durante 30 s, 59°C durante 30 s, 72°C durante 30 s y 72°C para la extensión final durante 10 min. Los productos de la PCR se electroforizaron en geles de agarosa al 1,2% y se visualizaron con GelStar® Stain (Lonza Rockland Inc., Rockland, ME). Se utilizaron los siguientes cebadores para las muestras de ratón: SDF-1 (número de acceso del GenBank NM_021704.3): 5'-GACGGTAAACCAGTCAGCCT -3' (hacia adelante) (SEQ ID NO:1) y 5'-CACACTTGTGTTGTTCTTC-3' (hacia atrás) (SEQ ID NO:2); CD133 (NM_008935.2): 5'-TCCAGCAAACAAGCAACAAG-3' (hacia adelante) (SEQ ID NO:3) y 5'-CCTATGCCGAACCAGAACA-3' (hacia atrás) (SEQ ID NO:4); VEGF (NM 001025250.3): 5'-CACTGGACCCTGGCTTTACT-3' (hacia adelante) (SEQ ID NO:5) y 5'GGTGATGTTGCTCTCTGACG-3' (hacia atrás) (SEQ ID NO:6); b-FGF (NM 008006.2): 5'-CAAGGGAGTGTGTGCCAA-3' (hacia adelante) (SEQ ID NO:7) y 5'-TGCCCAGTTCGTTTCAGT-3' (hacia atrás) (SEQ ID NO:8); HGF (NM_010427.4): 5'-ATGAGAGGCGAGAAG-3' (hacia adelante) (SEQ ID NO:9) y 5'-GTAGCCCCAGCCGTAAATA-3' (hacia atrás) (SEQ ID NO:10); [3-actina (NM _007393.3): 5'-TGGCACCACCTTCTACAAT-3' (hacia adelante) (SEQ ID NO:11) y 5'-ACCAGAGGCATAGGACA-3' (hacia atrás) (SEQ ID NO:12). Los niveles de expresión del ARNm objetivo se cuantificaron por densitometría y se normalizaron con el control interno correspondiente.

Estadísticas. Las variables continuas se presentaron como la media ± SEM. Las variables dicotómicas se presentaron como valores numéricos y porcentuales. Se realizó un análisis de potencia utilizando conjuntos de datos preliminares para todos los análisis presentados con el fin de determinar los tamaños de muestra necesarios para una potencia estadística adecuada. Los ratones y las ratas fueron asignados al azar a los grupos de tratamiento para todos los estudios con animales. Los análisis del cierre de la herida y de la regeneración del folículo piloso se realizaron de forma ciega. Todos los criterios de inclusión/exclusión para los estudios con animales o para el análisis de las muestras fueron preestablecidos. Los datos de la citometría de flujo, la RT-PCR y el recuento de folículos de novo se analizaron mediante la prueba t de Student (de dos colas), y las variables dicotómicas se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher (de dos colas). Para el análisis cinético del cierre de la herida en la piel entre los grupos se utilizó el ANOVA de una vía con la prueba de Newman-Keuls. Para cada figura, se seleccionaron las pruebas estadísticas adecuadas en función de la distribución poblacional de los datos y del número de comparaciones (individuales o múltiples). Todos los datos cumplen los supuestos de las pruebas estadísticas utilizadas. Hay una estimación de la variación dentro de cada grupo de datos. La varianza entre los grupos es similar. Todos los análisis se realizaron con SPSS ® (SPSS, Chicago, IL, USA). La p < 0,05 se consideró significativa.

Resultados

Ejemplo 1: AMD3100 más dosis bajas de Tacrolimus aceleraron la cicatrización de la herida tras una escisión de piel de espesor total. Se generaron cuatro heridas de espesor total mediante escisiones circulares de 5 mm de diámetro en la espalda rasurada de un ratón C57/B6 de tipo salvaje (FIG. 1A). Se fotografió digitalmente cada zona de la herida en los intervalos de tiempo indicados y se calculó la superficie de la herida con el programa Adobe Photoshop. Los cambios en las áreas de las heridas a lo largo del tiempo se expresaron como el porcentaje de las áreas iniciales de las heridas (FIG. 1b). Los ratones heridos se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos experimentales y recibieron inyecciones subcutáneas de suero fisiológico o de fármacos inmediatamente después de la herida hasta su completa curación: 1) Grupo de control tratado con solución salina, 2) Grupo de Tacrolimus tratado diariamente con dosis bajas (0,1 mg kg-1), 3) Grupo de AMD3100 tratado en días alternos (1,0 mg kg-1) y 4) Grupo combinado que recibió dosis bajas de Tacrolimus y AMD3100. Todas las evaluaciones de las heridas fueron doblemente ciegas.

Las heridas alcanzaron el cierre completo en el día 12 después de la cirugía en el grupo 1 (n=6) (FIG. lc y d), lo cual es consistente con la cinética de curación conocida en este modelo establecido (Shinozaki et al., 2009; Mack et al., 2012). Los 6 animales tratados sólo con Tacrolimus o AMD3100 mostraron una cicatrización significativa pero sólo moderadamente más rápida en comparación con el grupo de control con solución salina (FIG. 1d) cuando las heridas se cerraron por completo el día 11. El tiempo de curación se redujo a nueve días o en un 25% en los ratones del grupo 4 tratados con AMD3100 más dosis bajas de Tacrolimus. Las imágenes digitales mostraron que el tratamiento con la terapia farmacológica dual tenía efectos significativos en la reducción del tamaño del defecto cutáneo a partir del día 5 (FIG. 1d), que era el inicio de la fase de reepitelización de la curación de la herida. Macroscópicamente, se observó una ulceración mínima y un crecimiento epitelial temprano en los bordes de la piel el día posterior a la herida, en el grupo tratado con dos fármacos, mientras que las heridas de los otros tres grupos mostraron poca o ninguna epitelización y una ulceración continua (FIG. lc y h). Repetimos estos estudios en ratas y descubrimos que las ratas que recibían la terapia farmacológica dual también tenían el efecto equivalente reduciendo significativamente el tiempo para la curación completa de 18 a 13 días o el 28% (FIG. 7).

La piel de los ratones es móvil, y la contracción representa una gran parte del cierre de la herida. Para disuadir este mecanismo, realizamos el modelo de entablillado de heridas por escisión, en el que un anillo de entablillado se adhiere firmemente a la piel alrededor de la herida (FIG. 1 e). Por lo tanto, la herida se cura a través de la granulación y la reepitelización, un proceso similar a la curación de la mayoría de los defectos de la piel humana. Encontramos que la reparación de la herida se aceleró en las heridas entablilladas tratadas con dosis bajas de Tacrolimus o monoterapia con AMD3100 en comparación con el grupo de control (solución salina), mientras que la cicatrización más acelerada se encontró en los animales que recibieron el tratamiento dual (FIG. si y g). Por lo tanto, los efectos terapéuticos de AMD3100 más dosis bajas de Tacrolimus fueron principalmente en la epitelización de la herida de la piel. Otros grupos de ratones fueron tratados con altas dosis de AMD3100 (5,0 mg kg-1) o Tacrolimus (1,0 mg kg-1) y se comprobó que la alta dosis de Tacrolimus impedía la cicatrización de la piel, mientras que el aumento de la dosis de AMD3100 no mostraba diferencias significativas (FIG. 8).

Ejemplo 2: AMD3100 más dosis bajas de Tacrolimus mejoraron la formación de cicatrices y promovieron la regeneración del folículo piloso. La reparación de la herida dérmica comienza con la detención de la hemorragia, seguida de una respuesta inflamatoria, la formación de tejido de granulación dentro del espacio de la herida, la fibrosis y la reepitelización de la herida, que culmina con la producción de una cicatriz.

Histológicamente, la herida reepitelizada en los grupos de control en el día 15 mostraba una epidermis desorganizada, con una difuminación del límite entre la epidermis y la dermis (FIG. 2b). Había pocos folículos pilosos en los ratones de los grupos 1, 2 y 3 y el colágeno era abundante y desorganizado (FIG. 2c), lo que coincide con los resultados de los estudios publicados (Devine et al., 2004). Por el contrario, los animales tratados con el doble fármaco tenían una epidermis fina y bien organizada con folículos pilosos bien formados y un colágeno mucho mejor organizado (FIG. 2b y c; paneles inferiores). El hallazgo más llamativo fue que el pelo apareció sólo en la herida reepitelizada en los animales tratados con el fármaco dual después de 15 días (FIG. 2a y d). No es de extrañar que el número de folículos pilosos en las secciones de tejido de la herida reepitelizada fuera significativamente mayor en los animales tratados con el fármaco dual en comparación con los grupos de control (FIG. 2e). Comprobamos que el tratamiento con el doble fármaco también estimulaba la neogénesis de los folículos pilosos y reducía las cicatrices en las ratas (FIG. 9). Así, la combinación de dosis bajas de Tacrolimus y AMD3100 mejoró la cicatrización de la herida al promover tanto la reepitelización como la diferenciación de los componentes de la piel.

Ejemplo 3: El AMD3100 y la dosis baja de Tacrolimus movilizaron sinérgicamente las células madre de linaje negativo (Lin-) c- Kit+CD34+CD133+ mientras que la dosis baja de Tacrolimus aumentó el número de macrófagos productores de SDF- 1. Realizamos citometría de flujo en muestras de sangre para determinar los componentes de las células madre movilizadas por el tratamiento con Plerixafor y Tacrolimus. El número de células Lin-, c-Kit, CD34+, CD133+ y Lin- Triple positivo (c-Kit+ CD34+ CD133+) fue significativamente mayor en la sangre periférica (FIG. 3a) en los animales que recibieron el tratamiento farmacológico combinado a los 5 días de la lesión. La tinción de inmunofluorescencia de las secciones de tejido de la herida mostró que el número de CD133+ aumentó con el tratamiento combinado, al igual que las células c-Kit+ y CD34+ (FIG. 3b). Estas células se encontraron especialmente en los tejidos de granulación recién formados de las heridas. Curiosamente, en este punto de tiempo de 5 días, muchas células CD133+ se tiñeron conjuntamente con CD31, un marcador de células endoteliales (FIG. 3b; paneles de la derecha).

El análisis semicuantitativo por PCR de los tejidos de granulación mostró que la expresión de ARNm de la molécula atractora, el factor derivado de células estromales (SDF)-1 y el marcador de células madre CD133 aumentaron significativamente en los ratones del grupo 4 en comparación con los grupos 1, 2 y 3 a los 5 días de la herida (FIG. 4a y b). La tinción de inmunofluorescencia demostró que el número de células positivas a SDF-1 y F4/80 (un marcador de macrófagos) era significativamente mayor en las zonas de la herida en los animales que recibían dosis bajas de Tacrolimus solas o con tratamiento farmacológico dual a los 5 días de la lesión (FIG. 4c). Curiosamente, el SDF-1 se tiñó con algunas de las células F4/80+, lo que indica que estos macrófagos estaban produciendo o presentando SDF-1 (FIG. 4c; paneles inferiores).

Ejemplo 4: El tratamiento farmacológico doble aumentó la expresión de citoquinas angiogénicas a los cinco días de la herida. El análisis semicuantitativo por PCR de los tejidos de granulación mostró que la expresión de ARNm de las citoquinas angiogénicas, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos básico (b-FGF), y un importante factor de movilización y localización de células madre, el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), aumentaron significativamente en los ratones del grupo 4 en comparación con los de los grupos 1, 2 y 3 (FIG. 5a y b). La tinción de inmunofluorescencia demostró que el número de células positivas al HGF era significativamente mayor en los tejidos de granulación recuperados de los ratones del grupo 4, 5 días después de la lesión. Del mismo modo, el número de células endoteliales CD31+ en los tejidos de granulación aumentó notablemente en los ratones del grupo 4 en comparación con los del grupo 1, 2 y 3. Algunas de estas células CD31+ formaron estructuras de tipo tubular (FIG. 5c; paneles de la derecha) en los tejidos de granulación que también se tiñeron para el HGF enfatizando el importante papel del HGF en la neovascularización. Las estructuras tubulares también se tiñeron con CD133 (FIG. 3b; paneles de la derecha) lo que sugiere que el HGF puede estar implicado en la diferenciación de las células endoteliales a partir de los precursores CD133.

Buscamos pruebas de una mayor producción de células que contribuyen a la matriz y, de hecho, la tinción de inmunofluorescencia demostró que el número de células miofibroblásticas positivas a la actina muscular lisa (SMA) aumentó en los tejidos de granulación recuperados de los ratones del grupo 2 y 3 en comparación con el grupo 1, mientras que los ratones del grupo 4 reclutaron claramente más miofibroblastos en los tejidos de granulación a los cinco días (FIG. 5c; paneles inferiores).

Ejemplo 5: El rastreo de linaje demostró el papel crítico de las células madre CD133 en la mejora de la cicatrización de las heridas mediante la combinación de AMD3100 y dosis bajas de Tacrolimus. Se realizaron estudios de rastreo de linaje para confirmar el papel crítico de las células madre CD133 en la curación de heridas. Se utilizaron ratones adultos CD133+/C-L que contenían el alelo reportero Rosa26GFP ("descendientes de CD133+/CLX mTmG ). La actividad de CreERT2 se indujo con tamoxifeno 7 días antes de la herida (FIG. 6a). En este modelo de ratón, las células progenitoras CD133 eran positivas para lacZ mientras que la progenie CD133 era positiva para GFP. Sólo se observaron células positivas a LacZ y GFP en los folículos pilosos de las pieles intactas de los ratones (FIG. 6b), tal y como informan otros (Charruyer et al., 2012).

Tanto las células lacZ como las GFP positivas aumentaron en los tejidos de granulación a los 5 días de la herida (FIG.

10; paneles superior y central). El número de células lacZ y GFP positivas fue significativamente mayor en los tejidos de granulación recuperados de los ratones del grupo 2 y 3 en comparación con el grupo 1, pero el mayor número de células lacZ y GFP positivas se encontró en los tejidos de granulación de los ratones del grupo 4 (FIG. 10). La mayoría de las células LacZ positivas desaparecieron a los 15 días en los grupos 1, 2 y 3, mientras que sus células progenitoras CD133 GFP positivas permanecieron en los tejidos curados (FIG. 6c). Sin embargo, en los ratones del grupo 4 la vasculatura, la epidermis y los folículos pilosos recién generados siguieron siendo positivos tanto para LacZ como para GFP (FIG. 6d). Estos resultados implican que las células madre CD133 movilizadas farmacológicamente y su progenie son los principales contribuyentes a la regeneración de la piel.

Discusión

El AMD3100 (Plerixafor o Mozobil), es un antagonista directo del CXCR4 y se ha utilizado clínicamente para expulsar las células madre hematopoyéticas de la médula ósea a la sangre periférica de los seres humanos, donde pueden recuperarse y conservarse hasta la finalización de la irradiación ablativa y/o la quimioterapia. El AMD3100 también ha encontrado aplicación en la reparación de lesiones tisulares (Jujo et al., 2010, 2013; Nishimura et al., 2012). La inyección de una dosis única aumentó la movilización de las células progenitoras endoteliales (EPC) derivadas de la BM, lo que se asoció con una neovascularización más rápida y una recuperación funcional tras un infarto de miocardio en ratones (Jujo et al., 2010). Tras una lesión por isquemia/reperfusión (Jujo et al., 2013), las inyecciones agudas redistribuyeron las células proangiogénicas de BM al miocardio isquémico de una manera dependiente de la óxido nítrico sintasa endotelial y promovieron la recuperación de la función cardíaca en ratones. Una única aplicación tópica de AMD3100 promovió la cicatrización de heridas en ratones diabéticos (Nishimura et al., 2012), lo que se asoció con un aumento de la producción de citoquinas, un mayor número de EPC de la médula ósea y una mayor actividad de los fibroblastos y los monocitos/macrófagos. Tanto la angiogénesis como la vasculogénesis aumentaron (Nishimura eta/., 2012). Nuestros resultados confirmaron y ampliaron significativamente esos hallazgos. De hecho, la monoterapia con AMD3100 mejoró la cicatrización de la herida en un grado moderado, lo que se asoció con un reclutamiento relativamente leve de células madre en los lugares de la herida (FIG. 3b). Nuestra importante contribución es el hallazgo de que la combinación de dosis bajas de Tacrolimus con AMD3100 condujo a una acumulación mucho mayor de células madre y a una regeneración más rápida de la piel normal en nuestros modelos de roedores de escisión de piel de espesor total. El tacrolimus administrado a una décima parte de la dosis inmunosupresora tuvo efectos profundos y sinérgicos con el AMD3100 en el reclutamiento de células madre en el torrente sanguíneo y en las heridas, en particular las que llevan marcadores combinados de monocitos y SDF-1.

El Tacrolimus, es un potente fármaco inmunosupresor, pero sorprendentemente también aumenta la regeneración y reparación celular en dosificaciones subinmunosupresoras (Francavilla et al., 1989; Carroll et al., 1994; Gold, 1997). Las dosificaciones bajas (0,1 mg kg-1), pero no las dosificaciones inmunosupresoras estándar (1,0 mg kg-1) de Tacrolimus promovieron la curación de las anastomosis de colon en ratas (Kiyama et al., 2002). El tratamiento con tacrolimus facilitó la curación de las úlceras cutáneas de las extremidades inferiores en una mujer de 75 años con liquen plano y diabetes mellitus (Miller, 2008). Bai et a/. (Bai et a/., 2010) demostraron in vitro que el tratamiento con Tacrolimus a dosis bajas (20 ng m1-1), pero no a dosis altas (2.000 ng ml -1), desviaba la polarización de los macrófagos derivados de la BM hacia un fenotipo activo de macrófagos M2. En nuestro estudio, también demostramos que una dosis baja de Tacrolimus mejoraba la cicatrización de la herida cutánea relacionada con un aumento significativo del número de macrófagos productores de SDF-1 en la herida cutánea en el quinto día postoperatorio. Los mensajes de estas células contribuyen a los múltiples mensajes producidos por otras células inflamatorias y las plaquetas que reúnen a las células que conducen a la curación. Así pues, un fuerte "empuje" de las células madre desde sus nichos de BM por parte de AMD3100 y una fuerte "atracción" de las células madre circulantes por parte de factores en los lugares de la herida potenciados por dosis bajas de Tacrolimus explican mejor por qué hubo una mayor acumulación de células madre en los lugares de la herida y una restauración más rápida de la piel normal con el tratamiento dual AMD3100/Tacrolimus.

El reclutamiento de células madre por parte de los fármacos duales se asoció con una elevada expresión de ARNm de VEGF, b-FGF y HGF en las heridas. Curiosamente, el anticuerpo anti-HGF se tiñó conjuntamente con células CD31+ que también eran CD133+ (FIG. 5c). El HGF tiene muchas acciones estimulantes y ha demostrado ser un potente regulador de la proliferación y diferenciación de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (Nishino et a/., 1995), así como un potente estimulador de la angiogénesis (Ding et al., 2003). También se ha demostrado que el HGF ejerce un fuerte efecto quimiotáctico sobre las MSC en un modelo de curación de heridas (Neuss et al., 2004). Así, el tratamiento farmacológico dual facilitó la acumulación de macrófagos productores de SDF-1, lo que condujo al reclutamiento de más células madre. A su vez la elaboración de HGF, y otros mediadores autocrinos o paracrinos produjeron más factores proangiogénicos completando bucles de retroalimentación positiva (FIG. 6e).

Las células madre CD133 desempeñaron un papel vital en la neovascularización y la regeneración del folículo piloso, lo cual es esencial para la perfecta regeneración de la piel (Sun et al., 2011). Dichas células tienen el potencial de diferenciarse a lo largo de linajes endoteliales in vitro (Hollemann et al., 2012) y se sabe que migran a sitios de neovascularización en respuesta a mediadores (VEGF y SDF-1). La doble tinción de inmunofluorescencia demostró que muchas células CD133 se tiñeron conjuntamente con CD31 (FIG. 2b), un marcador de células endoteliales tempranas. Durante el proceso de maduración, el marcador CD133 disminuyó y ganó el fenotipo CD31 (Hollemann et al., 2012). El aumento de la angiogénesis se asoció a un mayor número de células progenitoras CD133+CD31 infiltradas en las zonas de la herida y refuerza el papel de estas células en la neovascularización.

Las células madre epidérmicas y del folículo piloso pueden someterse a reprogramación para convertirse en células progenitoras epidérmicas repobladoras tras una herida (Ito et al., 2005). El análisis de linaje también ha demostrado que los folículos pueden surgir de células fuera del nicho de células madre del folículo piloso, lo que sugiere que las células que se encuentran en la epidermis pueden asumir un fenotipo de células madre del folículo piloso (Ito et al., 2007). Un estudio reciente informó de que el CD133 es un marcador de células madre epidérmicas murinas repobladoras a largo plazo y que los queratinocitos CD133+ formaron tanto folículos pilosos como epidermis tras su inyección en ratones inmunodeficientes (Charruyer et al., 2012). De nuestros estudios de rastreo de linaje se desprende que el aumento del número de células madre CD133 resultante del tratamiento farmacológico dual contribuyó a la regeneración del folículo piloso.

En conclusión, informamos aquí que una estrategia terapéutica novedosa movilizó células madre endógenas en las heridas de la piel, lo que resultó en una curación mejor y más rápida. La magnitud de las diferencias cuantitativas y cualitativas es muy significativa y es mayor que la encontrada en cualquier otro estudio sobre la curación de heridas en animales normales. Nuestros estudios no revelan los mecanismos moleculares que diferencian estas células maleables en componentes tisulares como los reportados para Fgf9 (Gay et a/., 2013) o Sept4/ARTS (Fuchs et a/., 2013). El hallazgo interesante fue que los pasos de diferenciación procedían sin problemas cuando había abundantes células madre, lo que daba lugar a una piel casi normal. Este es el primer informe que demuestra los profundos efectos sinérgicos de AMD3100 y de una dosis baja de Tacrolimus en la movilización, el reclutamiento y la retención de las células madre endógenas que conducen a una curación más rápida y a la diferenciación en todos los tejidos presentes en la piel normal. Estos resultados pueden aplicarse fácilmente en la clínica-

La movilización farmacológica de las células madre endógenas acelera la cicatrización de las heridas de la piel en ratas diabéticas y mejora la cicatrización de las heridas por quemaduras en ratones

Materiales y procedimientos.

Animales. Las ratas Lewis y los ratones C57BL/6J se adquirieron en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en las instalaciones libres de patógenos específicos de las Instituciones Médicas Johns Hopkins. Los animales se cuidaron de acuerdo con las directrices de los NIH y según un protocolo aprobado por el Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Johns Hopkins.

Modelo de rata diabética. La estreptozotocina (STZ) es un antibiótico que puede provocar la destrucción de las células beta del páncreas, por lo que se utiliza ampliamente de forma experimental como agente capaz de inducir la diabetes mellitus dependiente de la insulina (IDDM), también conocida como diabetes mellitus de tipo 1 (T1DM). El modelo animal más común de la diabetes humana es la diabetes inducida por estreptozotocina (STZ) en la rata. Modelo de rata diabética inducida por estreptozotocina (STZ) utilizado para determinar la cicatrización de la piel. Todas las ratas (de 12 a 16 semanas de edad) desarrollaron diabetes (glucosa en sangre >450mg/dL) 2 semanas después de la inyección de STZ (50mg/kg, i.p.). Las cuatro heridas de escisión se colocaron 1 cm a cada lado de la línea media y 1 cm por encima y por debajo del punto medio entre el margen costal y las crestas ilíacas. El punzón de biopsia desechable estéril (5 mm de diámetro; Miltex) se alineó verticalmente sobre el centro de la marca y se perforó a través de la piel y el panículo carnoso aplicando presión y girando al mismo tiempo. Se repitió el mismo procedimiento, generando cuatro heridas en cada animal.

Modelo de herida por quemadura en ratones. Los ratones de 24 a 30 meses de edad fueron anestesiados con isoflurano al 3% (Baxter Healthcare Co., Deerfield, IL, EE.UU.) utilizando una máquina de anestesia, afeitados en el dorso y depilados con crema Nair (Church & Dwight Co., Princeton, NJ, EE.UU.). La herida por quemadura se generó como se informó previamente (Arch Surg 2010; 145: 259-266). En resumen, se calentó una varilla de aluminio de 100 g hecha a medida en un baño de agua a 100 °C durante 5 minutos. Se produjo una quemadura de 1,2 cm de diámetro en el dorso de cada ratón. Para asegurar la uniformidad de la quemadura, sólo el peso de la varilla proporcionó presión a la superficie de la piel. Se eligió un tiempo de contacto de 4s medido con un metrónomo para producir una quemadura estandarizada de espesor total. Las quemaduras eran de tercer grado e incluían la destrucción de la piel, el tejido subcutáneo y el carnoso panículo. Se administró buprenorfina (0,1mg/kg) por vía subcutánea para la analgesia.

Tratamiento y medición de la herida. Los animales fueron alojados individualmente después de recuperar la conciencia y se les inyectó por vía subcutánea AMD3100 (AMD) (1,0 mg/kg, cada dos días, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) o/y Tacrolimus (T) (0,1 mg/kg, diariamente, adquirido en la farmacia del hospital Johns Hopkins) desde el día 0 hasta el día del cierre completo.

Se fotografió digitalmente cada lugar de la herida en los intervalos de tiempo indicados, y se determinaron las áreas de la herida en las fotografías utilizando Adobe Photoshop (versión 7.0; Adobe Systems, San Jose, CA). Los cambios en las áreas de las heridas a lo largo del tiempo se expresaron como porcentaje de las áreas iniciales de las heridas. Todas las evaluaciones de las heridas fueron doblemente ciegas.

Resultados

Ejemplo 6: AMD3100 más dosis bajas de Tacrolimus aceleraron la cicatrización de la piel en ratas diabéticas. Las heridas se cerraron por completo el día 18 después de la cirugía en el grupo de control de ratas no diabéticas, lo que coincide con la cinética de curación conocida en este modelo establecido. Sin embargo, la cicatrización se retrasó significativamente en las ratas diabéticas tratadas con solución salina, ya que las heridas alcanzaron el cierre completo el día 23 después de la cirugía. Los animales (n=4 o 5) tratados sólo con Tacrolimus o AMD3100 mostraron una

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Una cantidad terapéuticamente eficaz de AMD3100 y Tacrolimus para su uso como medicamento para mejorar la cicatrización de heridas en un paciente.

2. El AMD3100 y Tacrolimus para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el AMD3100 moviliza células madre CD34+y/o CD133+.

3. El AMD3100 y Tacrolimus para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el intervalo de dosificación de Tacrolimus es suficiente para movilizar células madre CD34+ y/o CD133+ a la sangre periférica.

4. El AMD3100 y Tacrolimus para el uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-3, en el que el paciente es diabético o sufre una lesión por quemadura.