Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

ES2912989T3 - Inmunoterapia para cáncer - Google Patents

Inmunoterapia para cáncer Download PDF

Info

Publication number
ES2912989T3
ES2912989T3 ES16790111T ES16790111T ES2912989T3 ES 2912989 T3 ES2912989 T3 ES 2912989T3 ES 16790111 T ES16790111 T ES 16790111T ES 16790111 T ES16790111 T ES 16790111T ES 2912989 T3 ES2912989 T3 ES 2912989T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
annexin
internalizing
conjugate according
cells
variant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES16790111T
Other languages
English (en)
Inventor
Missag Parseghian
Richard Richieri
Glenn Reynolds
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Rubicon Biotechnology LLC
Original Assignee
Rubicon Biotechnology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rubicon Biotechnology LLC filed Critical Rubicon Biotechnology LLC
Application granted granted Critical
Publication of ES2912989T3 publication Critical patent/ES2912989T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4721—Lipocortins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Un conjugado que comprende una variante no internalizante de una anexina, en la que la variante no internalizante de anexina comprende una o más sustituciones de aminoácidos polares a no polares; y un agente inmunoestimulante, en el que la variante no internalizante de anexina es capaz de unirse a al menos un fosfolípido expresado en la superficie de las células tumorales y/o células del microambiente tumoral en el sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Inmunoterapia para cáncer
Solicitudes relacionadas
La presente invención reivindica el beneficio de la prioridad de Solicitud Provisional de los Estados Unidos Número 62/157,395, presentada el 5 de mayo de 2015.
El contenido del siguiente envío en un archivo de texto ASCII se incorpora en este documento por referencia en su totalidad: un formulario legible por computadora (CRF) de la lista de secuencias (nombre de archivo: 48516-501001WO_SEQLIST.txt, fecha de registro: 5 de mayo de 2016, tamaño: 45,056 bytes).
Campo
La invención se refiere a composiciones inmunoterapéuticas y su uso en métodos de tratamiento del cáncer, específicamente tumores sólidos y células del microambiente tumoral.
Antecedentes
Una estrategia para generar nuevas terapias contra el cáncer implica identificar las diferencias entre las células sanas normales y las células tumorales y las células del microambiente tumoral. El objetivo es explotar esas diferencias para dirigir la terapia a las células tumorales y las células del microambiente tumoral, sin afectar a las células sanas normales.
Se han identificado diferencias entre células normales, sanas y células tumorales y células del microambiente tumoral en la composición de fosfolípidos en las membranas plasmáticas. Ciertos fosfolípidos que están en gran parte ausentes de la valva externa de la membrana plasmática de las células sanas normales quedan expuestos en la valva externa de las células tumorales y otras células del microambiente tumoral.
Un ejemplo de un fosfolípido que normalmente está ausente de la valva de membrana plasmática externa es la fosfatidilserina (PS). Sin embargo, en las células tumorales y en las células del microambiente tumoral, la PS está expuesta en la superficie. La exposición de la superficie de PS en las células tumorales suprime la respuesta inmune del cuerpo a esas células. Este efecto de la PS se logra a través de la señalización a los macrófagos para que engullan las células donde se encuentra la PS en la superficie externa de la membrana plasmática. El macrófago engulle una célula, en lugar de liberar citoquinas inflamatorias y otros agentes de señalización, previene una respuesta inmune a gran escala. Por consiguiente, esta exposición inhibe la señalización de citoquinas inflamatorias de los macrófagos y proporciona una vía por la cual el microambiente tumoral promueve la inmunosupresión.
Las anexinas son proteínas que se unen a los fosfolípidos. La anexina A5 tiene una afinidad de unión muy alta por PS, por lo que ofrece una potencial molécula dirigida a tumores. Una molécula tal como el fragmento Fc de una Ig unida a una anexina A5 podría ofrecer un conjugado que enmascare PS y así enmascare su efecto inmunosupresor y proporcione un efecto inmunoestimulante. Sin embargo, la anexina A5 se internaliza rápidamente después de unirse a la Ps expuesta a la superficie, lo que limita el efecto de dicha estrategia terapéutica.
El documento US2009/155170 proporciona derivados de anexina apropiados para la orientación previa en la terapia y el diagnóstico.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un conjugado anticancerígeno que comprende una anexina que enmascara un efecto inmunosupresor de un fosfolípido expuesto en la superficie de una célula tumoral o una célula del microambiente tumoral, provoca inmunoestimulación en el sitio del tumor y persiste en la superficie externa de una célula en el sitio del tumor para concentrar y/o prolongar estos efectos en comparación con las terapias anticancerígenas propuestas anteriormente que implican anexina. Adicionalmente, un solo conjugado de la invención puede proporcionar el enmascaramiento del efecto inmunosupresor de un fosfolípido y la inmunoestimulación.
La invención proporciona un conjugado que comprende una variante no internalizante de anexina que comprende una o más sustituciones de aminoácidos polares a no polares; y un agente inmunoestimulante, en el que la variante no internalizante de anexina es capaz de unirse a al menos un fosfolípido expresado en la superficie de las células tumorales y/o células del microambiente tumoral en el sujeto.
La divulgación proporciona además un polipéptido o una secuencia de nucleótidos que codifica el conjugado de la invención.
La divulgación también proporciona la secuencia conjugada, polipeptídica o de nucleótidos descrita en este documento para su uso en un método de tratamiento médico.
La divulgación proporciona además un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de un conjugado que comprende una anexina no internalizante capaz de unirse a al menos un fosfolípido y un agente inmunoestimulante. La divulgación también proporciona el conjugado, polipéptido o secuencia de nucleótidos descrita en este documento para su uso en un método de tratamiento del cáncer.
Ventajosamente, el fosfolípido al que se puede unir el conjugado de la invención se selecciona entre la fosfatidilserina (PS), la fosfatidil etanolamina (PE), el fosfatidilinositol (PI) y sus derivados fosfoinosítidos (PIP, PIP2, PIP3), y preferiblemente PS.
Preferiblemente, la anexina no internalizante es la anexina A5. Adecuadamente, uno o más aminoácidos seleccionados de aminoácidos polares His, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg y Lys en las hélices IA, ID, IIA, IID, IIIC, IIID e IVE y en los tramos que conectan las hélices IC e ID, IIE y IIIA, IIIC y IIID, IIID y IIIE, e IVA y IVB de anexina se reemplazan por aminoácidos no polares para proporcionar anexina no internalizante. Preferiblemente, la anexina no internalizante comprende al menos una porción de SEQ ID NO: 1 para la anexina A5 o las secuencias correspondientes para otras anexinas. Opcionalmente, el uno o más aminoácidos están ubicados en las posiciones 16-29, 59-74, 88-102, 135-145, 156-169, 202-231, 259-266 y 305-317 de SEQ ID NO: 1 para la anexina a 5, o las secuencias correspondientes para otras anexinas.
Preferiblemente, la anexina no internalizante comprende SEQ ID NO: 1 para la anexina A5 o las secuencias correspondientes para otras anexinas, en las que uno o más aminoácidos seleccionados de Glu, Gln, Asp, Asn, Arg, Lys e His en las posiciones 16-29, 59-74, 88-102, 135-145, 156-169, 202-231, 259-266 y 305-317, o las secuencias correspondientes para otras anexinas, se reemplazan por Gly, Ala, Val, lIe, Leu, Ser, Thr, Met, Pro, Phe o Tyr. Adecuadamente, al menos dos de dichos aminoácidos polares se reemplazan por aminoácidos no polares, preferiblemente al menos 3, 4, 5 o 6 de dichos aminoácidos polares se reemplazan por aminoácidos no polares.
Adecuadamente, la anexina es capaz de unirse al fosfolípido con una constante de disociación de aproximadamente 10'6 M o menos, preferiblemente 10'7 M o menos, más preferiblemente 10'8 M o menos, incluso más preferiblemente 10'9 M o menos.
Preferiblemente, el agente inmunoestimulante promueve una respuesta inflamatoria.
El agente inmunoestimulante puede ser una nanopartícula tal como un fullereno, un nanotubo de carbono, un dendrímero u otra estructura supramolecular construida sintéticamente. Por ejemplo, la nanopartícula puede ser una nanopartícula C60, tal como polihidroxi-C60 (poli-C60) o N-etil-poliamino-C60 (nepo-C60).
Adecuadamente, el agente inmunoestimulante se selecciona entre TNFa, ILla, IL10, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12, IL15, IL17A, IFNy, GM-CSF (CSF2), M-CSF (CSF1), G-CSF ( CSF 3), u otras citoquinas o quimioquinas aplicables, una inmunoglobulina y fragmentos, monómeros, multímeros, variantes, muteínas, versiones modificadas postraduccionalmente de los mismos y mezclas de los mismos.
Preferiblemente, el agente inmunoestimulante es una región del fragmento cristalizable (Fc) de una inmunoglobulina, monómero o fragmento del mismo, más preferiblemente IgG, incluso más preferiblemente IgG1 o IgG3 humana.
Preferiblemente, el agente inmunoestimulante es TNF-a.
Ventajosamente, la anexina no internalizante se une al agente inmunoestimulante a través de un enlazante. Preferiblemente, la anexina no internalizante se une al agente inmunoestimulante a través del extremo N- o C-, preferiblemente a través del extremo N. Adecuadamente, el conjugado comprende una pluralidad de agentes inmunoestimulantes y, opcionalmente, una pluralidad de enlazantes.
Alternativamente, la anexina no internalizante se une a un liposoma que contiene uno o más de los agentes inmunoestimulantes.
Opcionalmente, el cáncer tratable por un conjugado de la presente invención es un tumor sólido. El tumor se puede seleccionar de mama, mama triple negativo, ovario, próstata, próstata resistente a la castración, páncreas, vejiga, hueso, cabeza y cuello, pulmón, hígado, tiroides, esófago, estómago, intestino, cerebro, glioblastoma.
Breve descripción de los dibujos
La invención es como se define en las reivindicaciones. Cualquiera de las siguientes figuras que no estén dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención y se proporcionan únicamente con fines comparativos.
La figura 1 representa la secuencia de aminoácidos para la anexina A5 de tipo salvaje (SEQ TL1 NO: 1).
La figura 2 representa una alineación de la secuencia de aminoácidos entre las anexinas humanas A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11 y A13 (SEQ ID NOS: 2-13). Posiciones de aminoácidos 16-29, 59-74, 88-102, t35-t4S, 156-169, 202-231, 259-266 y 305-317 de la anexina A5 y las posiciones correspondientes de otras anexinas están subrayadas en la figura 1. Uno o más de estos aminoácidos pueden reemplazarse para proporcionar una variante no internalizante de anexina. Los aminoácidos ubicados en el lado cóncavo de la molécula de anexina están representados por símbolos de aminoácidos en cursiva en la figura 1. Posiciones de aminoácidos 1-15, 46-58, 86-87, 118-134, 170, 245-248 y 280-294 de la anexina A5 y los tramos correspondientes en otras anexinas son las posiciones en negrita y cursiva, en la figura 1.
La figura 3 representa un conjugado que comprende una anexina A5 no internalizante e IgG Fc.
La figura 4 representa un conjugado que comprende una anexina A5 no internalizante y TNF-a.
La figura 5 representa secuencias de aminoácidos para TNF-a SEQ ID NOS: 14-17.
Descripción detallada
La divulgación proporciona un conjugado que comprende una anexina no internalizante capaz de unirse a al menos un fosfolípido y un agente inmunoestimulante.
Como se usa en este documento, un "conjugado" es una molécula que comprende al menos dos partes asociadas de manera que las partes de la molécula permanecen asociadas si se transportan a una diana. Los conjugados incluyen proteínas de fusión unidas entre sí a través de su estructura polipeptídica, a través de la expresión genética de una molécula de ADN que codifica estas proteínas, proteínas sintetizadas directamente y proteínas acopladas en las que las secuencias preformadas se asocian mediante asociaciones o agentes de reticulación, tales como agregados de las partes de la molécula.
Una "anexina" es una proteína caracterizada por su capacidad para unir fosfolípidos, particularmente fosfolípidos aniónicos, de una manera dependiente del calcio. Las anexinas también se caracterizan por una secuencia repetida de 70 aminoácidos llamada repetición de anexina. La estructura básica de una anexina comprende dos dominios principales. La primera está ubicada en la terminal COOH y se denomina región "central". El segundo está ubicado en el NH.2 terminal y se denomina región de "cabeza". La región central consta de un disco helicoidal alfa. El lado convexo de este disco tiene sitios de unión de calcio tipo 2 importantes para permitir la interacción con los fosfolípidos en la membrana plasmática.
Como se usa en este documento, "no internalizante" en el contexto de una anexina no internalizante significa una anexina que, una vez unida al fosfolípido, permanecerá en la superficie celular durante un período de tiempo más largo en comparación con una anexina de tipo salvaje. Una anexina no internalizante puede tener una capacidad reducida para formar un trímero de anexina, o una capacidad reducida para que un trímero de anexina forme una red con otros trímeros de anexina o ambos. En el caso de la anexina A5, no se forma una red bidimensional que, de otro modo, doblaría nanomecánicamente la membrana plasmática para provocar el brote y la formación de vesículas endocíticas que conducen a la pinocitosis. Una anexina no internalizante por lo general tiene uno o más aminoácidos reemplazados en las hélices IA, ID, IIA, IID, IIIC, IIID y IVE y en los tramos que conectan las hélices IC e ID, IIE y IIIA, IIIC y IIID, IIID y IIIE, y IVA y IVB.
Por "agente inmunoestimulante" se entiende un agente que estimula el sistema inmunitario induciendo la activación o aumentando la actividad de cualquiera de sus componentes. Preferiblemente, el agente promueve una respuesta inflamatoria.
Como se usa en este documento, "modificado postraduccionalmente" o una "modificación postraduccional" incluye, pero no se limita a, fosforilación, acetilación, metilación, ubiquitinación, sumoilación, hidroxilación, citrulinación (desiminación), desamidación, oxidación, reducción o glicosilación. La modificación puede ocurrir a través de procedimientos biológicos (tal como enzimáticamente in vivo o in vitro) o a través de procedimientos sintéticos (como una reacción química in vitro).
Como se usa en este documento, "inmunoglobulina" (también conocida como "anticuerpo") es una proteína producida por células plasmáticas que el sistema inmunitario usa para identificar y neutralizar patógenos tales como bacterias y virus a través de una interacción específica con un antígeno. La proteína por lo general está formada por unidades estructurales básicas, cada una con dos cadenas pesadas grandes y dos cadenas ligeras pequeñas. La región del fragmento cristalizable (o Fc) de una inmunoglobulina está compuesta por dos cadenas pesadas que aportan dos o tres dominios constantes dependiendo de la clase del anticuerpo. La región Fc asegura que cada anticuerpo genere una respuesta inmune apropiada para un antígeno dado.
Por "cáncer" se entiende una familia de enfermedades que implican un crecimiento celular anormal con el potencial de invadir o extenderse a otras partes del cuerpo. Un tumor es un grupo de células que se transforman y crecen sin una regulación celular normal. La referencia al tratamiento del cáncer o el tratamiento de un tumor puede incluir células de una masa tumoral y células del microambiente tumoral, tal como la vasculatura tumoral y las células del estroma (por ejemplo, fibroblastos y células inmunitarias), por ejemplo.
Los fosfolípidos son una clase de lípidos que tienen una "cabeza" de fosfato hidrofílico y dos "colas" hidrofóbicas que normalmente consisten en 2 cadenas largas de hidrocarburos de ácidos grasos. Los fosfolípidos son un componente importante de todas las membranas celulares, ya que pueden formar bicapas lipídicas. Una bicapa lipídica, también conocida como bicapa de fosfolípidos, es una lámina de lípidos de dos moléculas de espesor, dispuesta de modo que las cabezas hidrofílicas apunten “hacia afuera” hacia el agua a cada lado de la bicapa y las colas hidrofóbicas apunten “hacia adentro” del núcleo de la bicapa. Esta disposición da como resultado dos "valvas" ensambladas debido al efecto hidrofóbico.
En muchas bicapas naturales, las composiciones de las valvas de membrana interna y externa son diferentes.
Los fosfolípidos fosfotidilserina (PS) y fosfotidilinositol (PI) y sus derivados (PIP, PIP2, PIP3) están en gran medida ausentes de la superficie de las células sanas de los mamíferos en condiciones normales, con un 96 % o más en la valva interior de la membrana plasmática. La PE se encuentra principalmente en la valva interior de las células de mamíferos en reposo en condiciones normales, con aproximadamente un 20 % presente en la valva externa.
El secuestro de PS en la valva citosólica está impulsado por la hidrólisis de ATP y depende de una translocasa de aminofosfolípidos (APLT), cuyas acciones en ciertas condiciones, tal como la apoptosis, se contrarrestan con una actividad de "escramblasa" que interrumpe la asimetría de la membrana de PS. Otras condiciones en las que se detecta PS en la superficie celular exterior incluyen eritrocitos envejecidos, plaquetas y macrófagos activados y células necróticas. La interrupción de la asimetría de PS también parece ser una consecuencia de la hipoxia y el estrés oxidativo, como se demostró in vitro.
La exposición de la superficie celular de PS tiene varias funciones, incluida la promoción de la coagulación en los vasos sanguíneos dañados y la mediación de la unión de las células T a las células endoteliales activadas por trombina. También juega un papel en la supresión de una respuesta autoinmune contra los autoantígenos mediante la señalización de los macrófagos para que engullan las células en las que la PS está expuesta en la superficie mientras modula la producción de citoquinas.
La eliminación de las células apoptóticas por parte de los fagocitos, denominada eferocitosis, juega un papel fundamental en la homeostasis normal. La eferocitosis es importante para promover un cambio fenotípico antiinflamatorio en los macrófagos al provocar la liberación de citoquinas antiinflamatorias, antiproteinasas y factores de crecimiento. También se ha demostrado que reduce los mediadores proinflamatorios como el TNF-alfa. La fosfatidilserina (PS) está implicada en una vía para iniciar la eferocitosis. Las células apoptóticas pierden la asimetría de fosfolípidos de la membrana plasmática y la PS queda expuesta en la valva externa de la bicapa lipídica en la fase temprana de una célula apoptótica. Por lo tanto, la PS actúa como señal de eferocitosis. Además, la eferocitosis mediada por PS tiene efectos comprobados sobre la función de los macrófagos tanto in vitro como in vivo.
La exposición a PS en la superficie celular es una característica de las células cancerosas, particularmente las células tumorales sólidas y las células asociadas con la vasculatura tumoral. Las condiciones de hipoxia y estrés oxidativo también son comunes en el microambiente tumoral.
Los tumores evitan un asalto inmunológico completo mediante la manipulación de "puntos de control" clave diseñados para prevenir enfermedades autoinmunes. El bloqueo de estos "puntos de control" ha incluido el desarrollo y la aprobación de la FDA de ipilimumab, un anticuerpo dirigido a CTLA-4 para inhibir la regulación a la baja de la activación de las células T. También ha incluido el desarrollo de anticuerpos para interrumpir el complejo ligando-receptor PD-1/PD-L1. Sin embargo, estas terapias no localizan su actividad solo en los tumores y afectan el sistema inmunológico en general.
Si bien el papel de la PS expuesta en la superficie parece ser clave para ayudar a suprimir la respuesta inmunitaria contra las células muertas y moribundas, la exposición a PS en células tumorales vivas y sus vasculaturas proporciona una vía por la cual el microambiente tumoral promueve la inmunosupresión.
Un conjugado según la invención comprende una anexina no internalizante capaz de unirse a al menos un fosfolípido expresado en la superficie de las células tumorales y/o células del microambiente tumoral en el sujeto. Preferiblemente, el fosfolípido no se encuentra en la superficie de células de mamífero normales y sanas. Preferiblemente, el fosfolípido se expresa solo en la superficie de las células cancerosas, o se expresa en una cantidad diferente en la superficie de las células cancerosas en comparación con las células sanas normales de mamíferos.
Los fosfolípidos aniónicos aparecen en la superficie de las células cancerosas, en particular las células tumorales y las células del microambiente tumoral y ciertas células envejecidas o apoptóticas. Los fosfolípidos aniónicos incluyen fosfatidilserina (PS), ácido fosfátido (PA), fosfatidilglicerol (PG), cardiolipina (CL), fosfatidilinositol (PI) y sus derivados fosfoinosítidos (PIP, PIP2, PIP3).
Los fosfolípidos neutros incluyen fosfatidil etanolamina (PE), fosfatidilcolina (PC) y esfingomielina (SM).
Aminofosfolípidos. son fosfolípidos que incluyen dentro de su estructura al menos un primer grupo amino primario y se encuentran en las membranas celulares de los mamíferos. PS y PE son ejemplos de aminofosfolípidos.
En particular, las células cancerosas se pueden caracterizar por células que muestran fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI) o sus derivados fosfoinosítidos (PIP, PIP2, PIP3) extracelulares; o mostrando una cantidad diferente de fosfatidil etanolamina (PE) extracelular en comparación con las células sanas de mamíferos normales.
Preferiblemente, las células cancerosas se pueden caracterizar por células que presentan aminofosfolípido aniónico extracelular. Preferiblemente, el conjugado comprende una anexina no internalizante capaz de unirse a PS.
La anexina A5 (Anexina V) es una proteína natural de unión a PS de alta afinidad (Kd = 100 pM a la fuerza iónica fisiológica de 150 mM). Es una proteína no glicosilada de 36 kD que contiene cuatro dominios, solo uno de los cuales (Dominio I) se une a PS de manera dependiente de iones Ca2+. La anexina A5 está presente como monómero cuando está en solución, pero una vez unida a PS en la superficie de la membrana, se ensambla en estructuras triméricas; a su vez, cada trímero interactúa con otros trímeros en su proximidad para formar una red bidimensional que cubre la superficie expuesta al PS. La unión de anexina trimerizada de PS tiene múltiples funciones, incluida la inhibición de la coagulación desencadenada por PS en los vasos sanguíneos y la reparación de las membranas plasmáticas rotas. Una red bidimensional de anexina A5 doblará hacia adentro la membrana plasmática nanomecánicamente para provocar el brote y la formación de vesículas endocíticas que conducen a la pinocitosis.
Las variantes humanas de la anexina A5 que no se internalizan tras la unión de PS se han desarrollado como un agente de formación de imágenes de apoptosis. La mutación de residuos de aminoácidos clave responsables de la formación de puentes salinos entre los dominios I y III de la anexina A5 da como resultado una variante que aún se une a PS pero no forma una red bidimensional y/o no provoca la flexión hacia adentro de la membrana plasmática. Sin embargo, no se ha contemplado la conjugación de esta anexina con un agente terapéutico debido a los efectos secundarios tóxicos previstos.
La anexina A5 inhibe la eferocitosis mediada por PS. Esta proteína interfiere con el reconocimiento de las células apoptóticas por parte de los macrófagos, lo que conduce a una eferocitosis atenuada. Además, la anexina A5 mutante, que ha perdido la afinidad de unión a la PS, no afecta la eferocitosis de los macrófagos. Se ha demostrado que la anexina A5 atenúa la eferocitosis de los macrófagos in vitro e in vivo, altera el fenotipo de los macrófagos hacia uno más inflamatorio y da como resultado un aumento en la cantidad de enfermedad asociada a la inflamación.
Un conjugado según la invención puede comprender una anexina no internalizante A1; anexina A10; anexina A11; anexina A13; anexina A2; anexina A3; anexina A4; anexina A5; anexina A6; anexina A7; anexina A8; anexina A8L1; anexina A8L2; o anexina A9. Preferiblemente, la anexina es la anexina A5.
La anexina A5 de tipo salvaje puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 1 (véase, la figura 1). La presente invención abarca conjugados que comprenden variantes no internalizantes de las anexinas enumeradas anteriormente. Se hace referencia a la secuencia de aminoácidos y las posiciones de la anexina A5, pero lo que se aplica a la anexina A5 también se aplica a las otras anexinas, especialmente a las anexinas humanas, eligiendo la posición correspondiente encontrada con la alineación de cualquier anexina (véase la alineación de anexinas humanas A1 a A11 y A13 en la figura 2).
Preferiblemente, la anexina es capaz de unirse al fosfolípido con una constante de disociación de aproximadamente 10-6 M o menos, aproximadamente 10-7 M o menos, aproximadamente 10-8 M o menos, o aproximadamente 10-9 M o menos, preferiblemente aproximadamente 10-10 M o menos. Preferiblemente, la anexina es capaz de unirse al fosfolípido con una constante de disociación desde aproximadamente 10-8 M a aproximadamente 10-10 M, preferiblemente de unos 20-9 M a aproximadamente 10-10 M, preferiblemente aproximadamente 50-10 M.
Un conjugado según la invención comprende una anexina no internalizante. Las anexinas no internalizantes se describen en Ungethum et. al. (2011) the Journal of Biological Chemistry 286, 3, 1903-1910 y por lo general tienen uno o más aminoácidos reemplazados en las hélices IA, ID, IIA, IID, IIIC, IIID e IVE y en los tramos que conectan las hélices IC e ID, IIE y IIIA, IIIC y IIID, IIID y IIIE, y IVA y IVB. Preferiblemente, uno o más aminoácidos seleccionados de aminoácidos polares His, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg y Lys se reemplazan por aminoácidos no polares. Adecuadamente, el uno o más aminoácidos están ubicados en las posiciones 16-29, 59-74, 88-102, 135-145, 156­ 169, 202-231, 259-266 y 305-317 de SEQ ID NO: 1 para la anexina A5, o las secuencias correspondientes para otras anexinas.
Preferiblemente, uno o más aminoácidos seleccionados de Glu, Gln, Asp, Asn, Arg, Lys e His en las posiciones 16­ 29, 59-74, 88-102, 135-145, 156-169, 202-231, 259-266 y 305-317 de SEQ ID NO: 1 para la anexina A5 o las secuencias correspondientes para otras anexinas se sustituyen por Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Pro o Phe.
Un conjugado según la invención comprende preferiblemente una anexina no internalizante en la que uno o más, al menos 2, 3, 4, 5 o 6 de los aminoácidos polares están reemplazados por aminoácidos no polares.
Un conjugado según la invención puede comprender una anexina no internalizante que tiene un residuo de cisteína en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas entre 1-15, 46-58, 86-87, 118-134, 170, 245-248 y 280- 294 de la anexina A5 y los tramos correspondientes en otras anexinas, preferiblemente en la posición 2.
Una vez unido al fosfolípido, un conjugado según la invención que comprende una anexina no internalizante permanecerá en la superficie celular durante un período de tiempo más largo en comparación con una anexina de tipo salvaje. El conjugado puede proporcionar un enmascaramiento mejorado y/o sostenido de los efectos inmunosupresores de la PS expuesta en la superficie de las células cancerosas y la vasculatura tumoral, bloqueando así un "punto de control" usado por el cáncer, particularmente un tumor y células del microambiente tumoral.
Adecuadamente, la anexina no internalizante puede tener una capacidad alterada para formar trímeros. Adecuadamente, la anexina no internalizante puede tener una capacidad disminuida para formar una red bidimensional en la superficie celular. Preferiblemente, la anexina no internalizante puede tener una capacidad disminuida para formar trímeros y una red bidimensional en la superficie celular.
Un conjugado según la invención comprende uno o más agentes inmunoestimulantes. Preferiblemente, el agente inmunoestimulante promueve una respuesta inflamatoria. El agente inmunoestimulante se puede seleccionar de TNFa, ILla, IL1p, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12, IL15, IL17A, IFNy, GM-CSF (CSF2), M-CSF (CSF1), G-CSF (CSF 3), una inmunoglobulina y fragmentos, monómeros, multímeros, variantes, muteínas, versiones modificadas postraduccionalmente de los mismos y mezclas de los mismos.
El agente inmunoestimulante puede ser una región del fragmento cristalizable (Fc) de una inmunoglobulina, un monómero o un fragmento del mismo. La inmunoglobulina se puede seleccionar de IgG, IgM, IgA e IgE, en particular sus fragmentos. La inmunoglobulina puede ser IgG. La IgG se puede seleccionar de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferiblemente IgG1 o IgG3, incluso más preferiblemente IgG1. Los conjugados según la invención pueden comprender una región Fc de una inmunoglobulina en la forma humana o murina, preferiblemente humana.
Un conjugado según la invención comprende preferiblemente una o más regiones Fc de IgG1 humana, fragmentos, monómeros, multímeros, variantes, muteínas, versiones modificadas postraduccionalmente de los mismos o mezclas de los mismos.
Un conjugado según la invención puede comprender una región Fc de IgG con una secuencia de aminoácidos modificada, o carbohidratos modificados unidos a la región Fc, para potenciar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la fagocitosis celular dependiente de anticuerpos (ADCP). Para una revisión véase Liu et. al. (2008) Immunological Reviews 222, 9-27. Por ejemplo, las mutaciones de la región Fc de IgG, tal como la sustitución doble de aminoácidos Lys222Trp y Thr223Trp, o la sustitución doble de Cys220Asp y Asp221Cys, o la sustitución cuádruple de Cys220Asp y Asp22lCys y Lys222Trp y Thr223Trp, son algunos ejemplos de mutaciones que potencian la CDC. Como otro ejemplo, las sustituciones triples de Ser298Ala y Glu333Ala y Lys334Ala, o la sustitución de aminoácidos doble de Ser239Asp e Ile332Glu, potencian la ADCC.
De esta manera, un conjugado según la invención puede proteger simultáneamente a la PS de los receptores PS de los macrófagos y unirse a los receptores Fcy de los macrófagos. Dicha interacción ayuda a cambiar la polarización de los macrófagos asociados a tumores (TAM) hacia el fenotipo M i y altera el equilibrio de citoquinas dentro del tumor.
También se pueden realizar modificaciones para ya sea potenciar o reducir la unión de Fc al receptor de Fc neonatal (FcRn) para modificar los tiempos de circulación de los conjugados in vivo. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos ubicados en la interfaz entre los dominios constantes Cy2 y Cy3 de IgG Fc están implicados en la unión de FcRn. Como ejemplo, se prevé que las modificaciones de uno o más aminoácidos, como Ile253, Ser254, Arg255, Lys288, Leu309, Ser415, His433, His435 y Tyr436 reduzcan la unión a FcRn humano. Se prevé que las modificaciones de uno o más aminoácidos tal como Pro238, Thr256, Glu272, Val305, Thr307, His310, Gln311, Asp312, Lys317, Asp376, Ala378, Glu380, Glu382, Ser424 y Asn434 potencien la unión a FcRn humano (véase la tabla 4 de Martin et al. (2001) Molecular Cell 7, 867-877).
El agente inmunoestimulante puede ser TNF-a. El término "TNF-a" se usa según su significado común y corriente en la técnica y se refiere a una proteína de señalización celular (citoquina) implicada en la inflamación sistémica y es una de las citoquinas que componen la reacción de fase aguda. TNF-a incluye proteínas modificadas y homólogos de las mismas. El TNF-a humano puede ser una proteína soluble no glicosilada de 17 kDa y una longitud de 157 aminoácidos. El TNF-a murino está N-glicosilado. La homología con TNF-beta es de aproximadamente un 30%. La forma de 17 kDa se produce mediante el procesamiento de una proteína precursora de 233 aminoácidos. También se ha descrito una forma transmembrana de TNF-a de 26 kDa.
Un conjugado según la invención puede comprender TNF-a en forma soluble o transmembrana, preferiblemente en forma soluble. Los conjugados según la invención pueden comprender TNF-a como proteína completa, precursor o fragmento del mismo (como se describe en el documento US 7,892,558). Los conjugados según la invención pueden contener TNF-a en forma humana o murina, preferiblemente humana. El TNF-a se puede modificar postraduccionalmente. Un conjugado según la invención puede comprender TNF-a glicosilado o no glicosilado. Preferiblemente, el conjugado según la invención comprende SEQ ID NO: 14, 15, 16 o 17 (véase, la figura 5).
Un conjugado según la invención puede comprender variantes de TNF-a. Las variantes se pueden modificar genéticamente (muteínas) o químicamente para que sean más o menos tóxicas. Por ejemplo, las mutaciones Ala84 a Val y Val91 a Ala reducen casi por completo la actividad citotóxica del factor. La eliminación de 7 aminoácidos N-terminales y la sustitución de Pro8Ser9Asp10 por ArgLysArg produce un factor mutado con una mejora de aproximadamente 10 veces en la actividad antitumoral, aumento de la unión al receptor (ensayo de células L-M) y toxicidad reducida. Otras variantes de TNF-a se describen en las Patentes US 7,446,174; US 7,056,695; US 7,118,750; US 6,878,370; US 7,642,340; solicitudes de patentes US20020110868A1, US20070172449A1 y US20070207961A1. Las variantes se pueden modificar químicamente con moléculas pequeñas o con polímeros artificiales (por ejemplo, polietilenglicol) o naturales (por ejemplo, carbohidratos). Las variantes de TNF-a pueden mejorar la trimerización de anexina y, así, potenciar la toxicidad.
Un conjugado según la invención comprende preferiblemente uno o más TNF-a humano, fragmento, monómero, multímero, variante, muteína, versiones modificadas postraduccionalmente del mismo o mezclas de los mismos.
De esta manera, un conjugado según la invención puede proteger simultáneamente a la PS de los receptores de PS de los macrófagos y promover una respuesta inflamatoria.
El conjugado de la presente invención proporciona efectos inmunoestimulantes mejorados y/o sostenidos.
Un conjugado según la invención puede comprender una anexina no internalizante y una pluralidad de agentes inmunoestimulantes, preferiblemente dos o tres agentes inmunoestimulantes.
La anexina no internalizante se puede unir al agente inmunoestimulante a través de un enlazante. Las unidades estructurales se pueden unir mediante la conjugación del extremo N o C de la proteína anexina, mediante la conjugación de aminas (lisina o arginina), sulfhidrilos (por ejemplo, cisteína), carboxilos (por ejemplo, extremo C), carbohidratos (por ejemplo, azúcares oxidados) o no selectivamente (por ejemplo, agentes de reticulación fotorreactivos, formaldehído, glutaraldehído). El enlace puede ocurrir con aminoácidos que se encuentran en la naturaleza o aminoácidos construidos artificialmente introducidos en la secuencia de la anexina no internalizante o el agente inmunoestimulante.
Los enlazantes pueden ser péptidos, proteínas, carbohidratos, ácidos nucleicos, morfolinos (análogos de oligonucleótidos sintéticos que contienen cadenas de morfolino-fosforodiimidato en lugar de cadenas de desoxirribosafosfodiéster), ácidos nucleicos peptídicos (análogos de oligonucleótidos sintéticos que contienen cadenas de N-aminoetil-glicina en lugar de cadenas de desoxirribosa-fosfodiéster, PNA).
El enlazante preferiblemente comprende un péptido que promueve la estabilidad del producto y la semivida in vivo. Ejemplos de tales enlazantes son enlazantes de glicina-serina: (GGGGS)n; enlazantes peptídicos formadores de hélice: A(EAAAK)nA (Arai et al. 2001 Protein Engineering); una secuencia de aminoácidos Pro, Ala y/o Ser: (PASn). Otros enlazantes peptídicos son proteínas o fragmentos de proteínas que funcionan como espaciadores. En un ejemplo, se pueden usar "etiquetas" para unir la anexina al agente inmunoestimulante. Estas etiquetas pueden ser una etiqueta de histidina (por ejemplo, 6X His) o más grandes (por ejemplo, c-myc, proteína de unión a quitina (CBP), proteína de unión a maltosa (MBP) y glutatión-S-transferasa (GST), hemaglutinina de influenza humana (HA) o la etiqueta FLAG DYKDDDDK)). Los enlazantes pueden ser colas en N de otras anexinas, preferiblemente una anexina seleccionada de cualquiera de las anexinas en la figura 2.
Preferiblemente, el enlazante puede ser un enlazante peptídico que comprende 1-50 aminoácidos, preferiblemente aproximadamente 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50; aproximadamente 20-30, 20-40, 20-50; aproximadamente 30-40, 30­ 50; aproximadamente 40-50 aminoácidos; preferiblemente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 aminoácidos.
Los enlazantes pueden ser no escindibles o escindibles (por ejemplo, escisión usando tioles, ácidos, bases, hidroxilaminas o peryodatos). Los enlazantes que consisten en un reactivo de reticulación pueden ser homobifuncionales (por ejemplo, de amina a amina) o heterobifuncionales (por ejemplo, de amina a sulfhidrilo). Estos reticulantes pueden tener longitudes que van desde cero angstroms (por ejemplo, formaldehído), una longitud definida de, por ejemplo, 95.2 angstroms (Reticuladores SM(PEG)n NHS-PEG-Maleimida de Life Technologies) y mayores (por ejemplo, glutaraldehído). Los enlazantes pueden ser un tioéter (por ejemplo, succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato), conocido también por su nombre enlazante TAP (profármaco activado por tumor).
La anexina no internalizante se puede unir al agente inmunoestimulante de forma covalente o no covalente. Los enlazantes pueden ser una combinación de estreptavidina/avidina y biotina, una combinación de oligonucleótidos de ADN y ARN complementarios, análogos de ADN y ARN complementarios como morfolinos (análogos de oligonucleótidos sintéticos que contienen cadenas de morfolino-fosforodiimidato en lugar de cadenas de desoxirribosafosfodiéster), ácidos nucleicos peptídicos (análogos de oligonucleótidos sintéticos que contienen cadenas de N-aminoetil-glicina en lugar de cadenas de desoxirribosa-fosfodiéster, PNA) y aptámeros (oligonucleótidos u oligopéptidos que se unen específicamente), la combinación de anticuerpo y hapteno, y la combinación de receptor y ligando.
Preferiblemente, el enlazante puede tener una longitud desde 0 a aproximadamente 200 angstroms; preferiblemente desde aproximadamente 0-100; aproximadamente 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90 o 1-100 angstroms de longitud; aproximadamente 10-20, 10-30, 10-40, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90 o 10-100 angstroms de longitud; aproximadamente 20-30, 20-40, 20-50, 20-60, 20-70, 20-80, 20-90 o 20-100 angstroms de longitud; aproximadamente 30-40, 30-50, 30-60, 30-70, 30-80, 30-90 o 30-100 angstroms de longitud; aproximadamente 40-50, 40-60, 40-70, 40-80, 40-90 o 40-100 angstroms de longitud; aproximadamente 50-60, 50-70, 50-80, 50-90 o 50-100 angstroms de longitud; aproximadamente 60-70, 60-80, 60-90 o 60-100 angstroms de longitud; aproximadamente 70­ 80, 70-90 o 70-100 angstroms de longitud; aproximadamente 80-90 o 80-100 angstroms de longitud; o aproximadamente 90-100 angstroms de longitud; preferiblemente aproximadamente 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 angstroms de longitud.
Preferiblemente, el enlazante puede tener una longitud de aproximadamente 17, aproximadamente 24, aproximadamente 32, aproximadamente 39, aproximadamente 53 o aproximadamente 95 angstroms.
Preferiblemente, la anexina no internalizante se puede unir al agente inmunoestimulante a través del extremo N o C de la anexina, preferiblemente a través del extremo N. Preferiblemente, el enlace es covalente.
Un conjugado según la invención puede comprender una pluralidad de enlazantes. Cuando el conjugado comprende una pluralidad de agentes inmunoestimulantes, uno o más enlazantes pueden unir cada agente inmunoestimulante a la anexina o entre sí.
Las bicapas de fosfolípidos pueden formar además liposomas o vesículas. Los liposomas son estructuras similares a burbujas formadas a partir de las bicapas lipídicas. Los liposomas pueden contener pequeñas cantidades de otras moléculas (por ejemplo, agentes inmunoestimulantes). Los liposomas pueden variar en intervalo de tamaño desde micrómetros hasta decenas de micrómetros. Los liposomas pueden comprender cualquiera de los fosfolípidos divulgados en este documento.
Un conjugado según la invención puede incluir un liposoma. En algunas realizaciones, la anexina se conjuga con un liposoma. En algunas realizaciones, el liposoma puede incluir otras moléculas (por ejemplo, agentes inmunoestimulantes).
La divulgación se refiere a un polipéptido que comprende una anexina no internalizante y un agente inmunoestimulante como se define en este documento y una secuencia de nucleótidos que codifica dicho polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido comprende un enlazante como se define en este documento.
La presente divulgación proporciona conjugados para su uso en tratamientos médicos. En particular, se puede usar un conjugado de la invención para tratar el cáncer. La invención es particularmente útil en el tratamiento del cáncer caracterizado por células que presentan PS, PI, PIP, PIP2 o PIP3 extracelulares; o que presentan una cantidad diferente de PE extracelular en comparación con las células de mamífero normales y sanas. Preferiblemente, las células cancerosas presentan más del 20 % de PE en la valva externa de la membrana celular. Preferiblemente, las células cancerosas muestran más del 30 % de PE en la valva externa de la membrana celular.
Preferiblemente, la divulgación proporciona conjugados para tratar células tumorales y células del microambiente tumoral. Las células del microambiente tumoral incluyen la vasculatura tumoral y las células del estroma (por ejemplo, fibroblastos y células inmunitarias) que sustentan el tumor. Las células tumorales y las células del microambiente tumoral presentan PS, PI, PIP, PIP2 o PIP3 de forma anormal en su valva externa, preferiblemente PS; o presentan una cantidad diferente de PE extracelular en comparación con las células de mamífero normales y sanas. Adecuadamente, el tumor se selecciona entre mama, mama triple negativo, ovario, próstata, próstata resistente a la castración, páncreas, vejiga, hueso, cabeza y cuello, pulmón, hígado, tiroides, esófago, estómago, intestino, cerebro, glioblastoma.
Las células de mamífero sanas y normales se pueden distinguir de las células cancerosas en base a la presencia de fosfatidilserina (PS), fosfatidilinositol (PI) o sus derivados fosfoinosítidos (PIP, PIP2, PIP3) en la valva externa de la bicapa de la membrana; o una cantidad diferente de fosfatidil etanolamina (PE) en la valva externa de la bicapa de la membrana. PS, por ejemplo, se puede detectar en la superficie extracelular de las células usando anexina A5 marcada radiactiva o fluorescentemente usando citometría de flujo de células desagregadas, microscopía fluorescente de secciones de tejido o imágenes in vivo de células expuestas a PS con imágenes SPECT. Otra técnica es agregar un agente de conjugación para modificar cualquier PS que esté expuesto en la valva externa. A continuación, las células se rompen para cuantificar la PS modificada frente a la no modificada. PS sin modificar representaría PS en la valva interna, mientras que la PS modificada representaría PS en la valva externa.
Los métodos de tratamiento del cáncer implican administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del conjugado según la invención a un animal o paciente que necesite dicho tratamiento, opcionalmente con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
Adecuadamente, el cáncer se puede tratar administrando solo un único agente terapéutico. Por ejemplo, si el conjugado según la invención se administra por vía intravenosa, el tratamiento puede consistir en un único procedimiento para el paciente.
En otra realización, la divulgación proporciona un método de preparación de un conjugado según la invención que comprende conjugar una anexina no internalizante que tiene un residuo de cisteína en una o más posiciones de aminoácidos seleccionadas entre 1-15, 46-58, 86-87, 118 -134, 170, 245-248 y 280-294 de la anexina A5 y los tramos correspondientes en otras anexinas, preferiblemente en la posición 2, a un agente inmunoestimulante; opcionalmente a través de un enlazante como se describe en este documento.
La divulgación proporciona un método de preparación de una proteína de fusión o un ácido nucleico como se describe en este documento usando métodos conocidos en la técnica.
Ejemplos
La invención es como se define en las reivindicaciones. Cualquiera de los siguientes ejemplos que no estén dentro del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención y se proporcionan únicamente con fines comparativos.
Anexina A5 no internalizante IgG Fc
La anexina A5 no internalizante se fabrica en un sistema microbiano, se purifica mediante métodos cromatográficos y luego se conjuga químicamente en el sitio de cisteína N-terminal con IgG Fc adquirida comercialmente.
El constructo génico que codifica una cadena polipeptídica que comprende una anexina A.5 no internalizante fusionada con Fc se transfecta en sistemas de expresión microbianos y de mamíferos.
Anexina A5 no internalizante TNF-a
La anexina A5 no internalizante se fabrica en un sistema microbiano, se purifica mediante métodos cromatográficos y luego se conjuga químicamente en el sitio de cisteína N-terminal con TNF-a adquirido comercialmente.
El constructo génico que codifica una cadena polipeptídica que comprende una anexina A5 no internalizante fusionada con TNF-a se transfecta en sistemas de expresión microbianos y de mamíferos.
Caracterización del producto
Los conjugados se prueban para determinar la degradación usando SDS-PAGE, la agregación del producto usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), la identidad y la estabilidad del producto usando espectrometría de masas. Estas son técnicas estándar. La potencia de unión a PS se evalúa usando ensayos descritos en la literatura.
Formato de ensayo no basado en células: PS se disuelve en n-hexano a una concentración de 50 pg/mL, y se aplicó a una placa de 96 pozos en alícuotas de 100 pL. Después de la evaporación del solvente en una campana extractora, las placas se bloquean con un agente de bloqueo y luego se incuban con diluciones en serie de conjugados de anexina A5 (AnxA5) durante 2 horas a 25 °C antes de enjuagarse con solución reguladora de lavado (solución salina regulada con Tris con 0.1 % de Tween 20) y se incubó con un anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 30 minutos a 25 °C (IgG de cabra anti-ratón para AnxA5-Fc; anti-TNFa y luego IgG de cabra anti-ratón para AnxA-TNFa). Tras un lavado adicional, las placas se revelan con sustrato TMB y se leen a una longitud de onda de 450 nm.
Formato de ensayo basado en células: La exposición a PS se induce en la superficie de las células cultivadas, sin causar apoptosis, mediante el tratamiento de las células con H2O2200 pM en medios sin suero durante 1 hora a 37 °C o docetaxel 20 pM en medios durante 24 horas a 37 °C. Las células se lavan con PBS, se incuban con conjugados de AnxA5 en medio sin suero durante 1 hora a 25 °C antes de volver a lavarlas y luego se fijan con paraformaldehído al 4 % (v/v) en PBS durante 15 minutos. La unión de AnxA5 o los conjugados a las células inducidas se compara con las células no tratadas usando un anticuerpo anti-Anexina A5 (por ejemplo, Abcam cat. # ab14196) y un anticuerpo secundario apropiado conjugado con una sonda fluorescente. Las células fijadas también se pueden contrateñir con DAPI para detectar ADN en los núcleos.
Estudio de toxicidad: Usando ratones hembra BALB/c, grupos de ratones (n=3) reciben 0, 0.3, 1, 3 y 10 mg/kg de conjugados de AnxA5 el día 1. Examen físico y capacidad de supervivencia (en el pretratamiento (-1), Día 1, Día 7); Pesos corporales (en los días -14, -7, -1,1, 7); Observaciones clínicas (dos veces al día en los días -7 a 7 más antes de la dosis y 1,6 h después de la dosis); Consumo de alimentos y agua (en el día -7 a 7); Se registra la patología macroscópica y el peso de los órganos (incluidos el corazón, el hígado, los riñones, el tracto GI, el cerebro, los pulmones, etc.) y se identifica una dosis máxima tolerada (MTD). Los tejidos recolectados se conservan en formalina para el trabajo de histopatología.
Estudio PK: Las muestras de suero desde 6 puntos de tiempo (3 ratones/punto de tiempo) se analizan usando un ensayo de captura ELISA tipo sándwich. Los estudios se realizarán con administración IP, práctica estándar para estudios de toxicidad en ratones.
Estudios preclínicos en un modelo singénico de cáncer de mama
Se determina la capacidad de los conjugados de AnxA5 para dirigir y provocar la reducción de un tumor xenoinjertado generado por una línea celular de cáncer de mama cultivada isogénica (4T1). Los ratones BALB/c que tienen tumores se tratan IV con conjugados de AnxA5 candidatos cuando la carga tumoral alcanza su valor medio máximo predeterminado. La distribución farmacológica de los conjugados se determina en el momento de la inyección y en el momento del sacrificio. El crecimiento del tumor y la respuesta al tratamiento se controlan longitudinalmente mientras que la histología del tumor y la composición de las células inmunitarias se determinan tras el sacrificio. Estos estudios determinan que una malignidad mamaria agresiva puede dirigirse y disminuirse en tamaño usando los conjugados de la invención.
Diseño experimental: Se inyectan células de cáncer de mama de ratón (4T1) en la almohadilla de grasa mamaria de ratones hembra BALB/c y se les permite crecer hasta la mitad del volumen tumoral máximo. En ese momento, los

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un conjugado que comprende
una variante no internalizante de una anexina, en la que la variante no internalizante de anexina comprende una o más sustituciones de aminoácidos polares a no polares; y
un agente inmunoestimulante,
en el que la variante no internalizante de anexina es capaz de unirse a al menos un fosfolípido expresado en la superficie de las células tumorales y/o células del microambiente tumoral en el sujeto.
2. El conjugado según la reivindicación 1, en el que el fosfolípido se selecciona de fosfatidilserina (PS), fosfatidil etanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI) y derivados fosfoinosítidos seleccionados de PIP, PIP2 y PIP3, donde opcionalmente el fosfolípido es PS.
3. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la variante no internalizante de anexina es una variante no internalizante de la anexina A5.
4. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la una o más sustituciones de aminoácidos polares a no polares se seleccionan entre los aminoácidos polares His, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg y Lys en las hélices IA, ID, IIA, IID, IIIC, IIID y IVE y en los tramos que conectan las hélices IC e ID, lIE y IIIA, IIIC y IIID, IIID y IIIE, y IVA y IVB de la secuencia de anexina, y/o
en el que la variante no internalizante de anexina comprende una o más sustituciones de aminoácidos polares a no polares en posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácidos 16-29, 59-74, 88-102, 135-145, 156-169, 202-231, 259-266 y 305-317 de SEQ ID NO:1, y/o
en el que la una o más sustituciones de aminoácidos polares a no polares se seleccionan entre Glu, Gln, Asp, Asn, Arg, Lys e His en las posiciones correspondientes a las posiciones de aminoácidos 16-29, 59-74, 88-102, 135-145, 156-169, 202-231, 259-266 y 305-317 de SEQ ID NO:1 que han sido reemplazados por Gly, Ala, Val, Ile, Leu, Met, Pro o Phe; opcionalmente en el que la variante no internalizante de anexina comprende al menos dos sustituciones de aminoácidos polares a no polares.
5. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la variante no internalizante de anexina se une al fosfolípido con una constante de disociación de aproximadamente 10'6 M o menos, preferiblemente 10'7 M o menos, más preferiblemente 10'8 M o menos, incluso más preferiblemente 10'9 M o menos.
6. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente inmunoestimulante promueve una respuesta inflamatoria.
7. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente inmunoestimulante se selecciona del grupo que consiste en una nanopartícula, TNFa, IL1a, IL1p, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12, IL15, IL17A, IFNy, GM-CSF (c Sf2), M-CSF (CSF1), G-CSF (CSF 3), una inmunoglobulina; y fragmentos, monómeros, multímeros, variantes, muteínas y versiones modificadas postraduccionalmente de cualquiera de estos,
opcionalmente en el que el agente inmunoestimulante es una región del fragmento cristalizable (Fc) de una inmunoglobulina, monómero o fragmento del mismo;
opcionalmente en el que la inmunoglobulina es IgG, preferiblemente IgG1 o IgG3 humana; o
en el que el agente inmunoestimulante es TNF-a.
8. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la variante no internalizante de anexina está unida al agente inmunoestimulante a través de un enlazante, opcionalmente en el que la anexina no internalizante está unida al agente inmunoestimulante a través del extremo N o C, preferiblemente a través del extremo N.
9. El conjugado según la reivindicación 1, en el que la variante no internalizante de anexina se conjuga con un liposoma.
10. El conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende una pluralidad de agentes inmunoestimulantes y opcionalmente una pluralidad de enlazantes.
11. El conjugado según la reivindicación 10, en el que el agente inmunoestimulante se selecciona del grupo que consiste en:
una nanopartícula, TNFa, IL1a, IL1p, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12, IL15, IL17A, IFNy, GM-CSF (CSF2), M-CSF (CSF1), G-CSF (CSF 3), una inmunoglobulina; y
fragmentos, monómeros, multímeros, variantes, muteínas y versiones modificadas postraduccionalmente de cualquiera de los mismos.
12. Una secuencia de nucleótidos que codifica un conjugado según la reivindicación 1.
ES16790111T 2015-05-05 2016-05-05 Inmunoterapia para cáncer Active ES2912989T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562157395P 2015-05-05 2015-05-05
PCT/US2016/031049 WO2016179430A1 (en) 2015-05-05 2016-05-05 Cancer immunotherapeutic

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2912989T3 true ES2912989T3 (es) 2022-05-30

Family

ID=57218396

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES16790111T Active ES2912989T3 (es) 2015-05-05 2016-05-05 Inmunoterapia para cáncer

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20180154012A1 (es)
EP (2) EP3292140B1 (es)
AU (2) AU2016256876B2 (es)
CA (1) CA2985108A1 (es)
DK (1) DK3292140T3 (es)
ES (1) ES2912989T3 (es)
WO (1) WO2016179430A1 (es)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2985108A1 (en) 2015-05-05 2016-11-10 Rubicon Biotechnology Llc Cancer immunotherapeutic
CA3056630A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
CA3064435A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Pandion Therapeutics, Inc. Targeted immunotolerance
US10174091B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
EP3692984A1 (en) * 2019-02-08 2020-08-12 Deutsches Krebsforschungszentrum, Stiftung des öffentlichen Rechts Annexin-coated particles
CA3141327A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 Pandion Operations, Inc. Madcam targeted immunotolerance
US11357823B2 (en) * 2019-08-30 2022-06-14 Suzhou Yabao Pharmaceutical R&D Co., Ltd Method for treating cerebral stroke
WO2021168079A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Pandion Operations, Inc. Tissue targeted immunotolerance with a cd39 effector

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EE9900461A (et) 1997-04-15 2000-06-15 Farmaceutisk Laboratorium Ferring A/S Modifitseeritud TNFa molekulid, neid kodeeriv DNA ning selliseid TNFa molekule ja DNA sisaldavad vaktsiinid
FR2792639B1 (fr) 1999-04-26 2003-06-06 Neovacs Nouveaux immunogenes anti-vih (toxoides), nouveaux procedes de preparation et application a la prevention et au traitement du sida
US7101974B2 (en) 2000-03-02 2006-09-05 Xencor TNF-αvariants
US20070172449A1 (en) 2000-03-02 2007-07-26 Xencor, Inc. TNF-alpha VARIANT FORMULATIONS FOR THE TREATMENT OF TNF-alpha RELATED DISORDERS
US7446174B2 (en) 2001-03-02 2008-11-04 Xencor, Inc. Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders
US7244823B2 (en) 2000-03-02 2007-07-17 Xencor TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders
US7056695B2 (en) 2000-03-02 2006-06-06 Xencor TNF-α variants
US7642340B2 (en) 2003-03-31 2010-01-05 Xencor, Inc. PEGylated TNF-α variant proteins
WO2005084198A2 (en) 2004-02-27 2005-09-15 Vaxconsulting Peptides of il1 beta and tnf alpha and method of treatment using same
JP5127043B2 (ja) * 2005-01-24 2013-01-23 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム ホスファチジルセリンに結合するｆｃ融合構築物およびそれらの治療用途
DK1960790T3 (en) 2005-12-12 2017-03-06 Mosamedix Bv ANNEXIN DERIVATIVES SUITABLE FOR PREGNANCY FOR TREATMENT AND DIAGNOSIS
WO2007100904A2 (en) * 2006-02-28 2007-09-07 The Board Of Regent Of The University Of Oklahoma Conjugate for the specific targeting of anticancer agents to tumor cells or tumor vasculature and production thereof
DK2437773T3 (en) * 2009-06-03 2017-02-06 Mosamedix Bv PROCEDURE FOR IMPROVING PHAGOCYTOSIS OF PHOSPHATIDYLSERINE-EXPOSING CELLS
CA2985108A1 (en) 2015-05-05 2016-11-10 Rubicon Biotechnology Llc Cancer immunotherapeutic

Also Published As

Publication number Publication date
EP3292140B1 (en) 2022-04-20
US20180154012A1 (en) 2018-06-07
EP3292140A4 (en) 2019-01-02
DK3292140T3 (en) 2022-05-23
WO2016179430A1 (en) 2016-11-10
AU2016256876B2 (en) 2021-02-04
EP4079328A1 (en) 2022-10-26
CA2985108A1 (en) 2016-11-10
AU2016256876A1 (en) 2017-11-16
EP3292140A1 (en) 2018-03-14
AU2021202789A1 (en) 2021-06-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2912989T3 (es) Inmunoterapia para cáncer
Zhou et al. The role of cell‐penetrating peptides in potential anti‐cancer therapy
US8318912B2 (en) Targeted immune conjugate comprising an antibody to glycophorin A and a M2e peptide
de Figueiredo et al. Cell‐penetrating peptides: a tool for effective delivery in gene‐targeted therapies
US11273206B2 (en) Targeting of pharmaceutical agents to pathologic areas using bifunctional fusion polypeptides
Bidwell Peptides for cancer therapy: a drug-development opportunity and a drug-delivery challenge
ES2855169T3 (es) Conjugados de polipéptido-anticuerpo derivados de aprotinina
JP6876618B2 (ja) 治療目的のための抗体−ウレアーゼコンジュゲート
Parrasia et al. Peptides as pharmacological carriers to the brain: promises, shortcomings and challenges
Yang et al. Targeting interleukin-4 receptor α with hybrid peptide for effective cancer therapy
Zhang et al. Polypeptide-engineered DNA tetrahedrons for targeting treatment of colorectal cancer via apoptosis and autophagy
WO2015051001A2 (en) Composition and method for therapeutic agent delivery during pregnancy
Maeng et al. Systemic and brain delivery of antidiabetic peptides through nasal administration using cell-penetrating peptides
Zhang et al. Human Serum Albumin‐Based Drug‐Free Macromolecular Therapeutics: Apoptosis Induction by Coiled‐Coil‐Mediated Cross‐Linking of CD20 Antigens on Lymphoma B Cell Surface
US10138273B2 (en) Peptide ligands for hepatic stellate cells
Asrorov et al. Cell penetrating peptides: Highlighting points in cancer therapy
Fu et al. Three rounds of stability-guided optimization and systematical evaluation of oncolytic peptide LTX-315
Chang et al. One new acid-activated hybrid anticancer peptide by coupling with a desirable ph-sensitive anionic partner peptide
US20220125934A1 (en) Linkers
Zhu et al. Emerging self-assembling peptide nanomaterial for anti-cancer therapy
EP3068797A1 (en) Epha3 and multi-valent targeting of tumors
JP7456676B2 (ja) 新規な細胞透過性ペプチド及びその用途
CN113597318A (zh) 治疗性纳米缀合物及其用途
US11447525B2 (en) Peptide and use therefor
Langel General Targeting Strategies