ES2911249T3

ES2911249T3 - Animales no humanos que comprenden una mutación de slc30a8 y métodos de uso

Info

Publication number: ES2911249T3
Application number: ES18808600T
Authority: ES
Inventors: Sandra Kleiner; Jose Rojas; Jesper Gromada
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2017-11-10
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2022-05-18
Anticipated expiration: 2038-11-09
Also published as: JP7097440B2; KR102444458B1; EP3585163A1; AU2018366290B2; US20190141966A1; AU2018366290A1; KR20200081377A; JP2021502089A; AU2018366290A8; CN111565566A; WO2019094735A1; CN111565566B; EP3585163B1; CA3076371C; CA3076371A1

Abstract

Un roedor cuyo genoma comprende un locus Slc30a8 endógeno que comprende un gen Slc30a8 mutado, en donde el gen Slc30a8 mutado comprende una mutación sin sentido en el extremo 3' del tercer exón del gen Slc30a8 y da como resultado que el roedor tenga una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un roedor sin la mutación.

Description

DESCRIPCIÓN

Animales no humanos que comprenden una mutación de slc30a8 y métodos de uso

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de los Estados Unidos núm. 62/584,228, presentada el 10 de noviembre de 2017, la solicitud de los Estados Unidos núm. 62/666,337, presentada el 3 de mayo de 2018, y la solicitud de los Estados Unidos núm. 62/689,945, presentada el 26 de junio de 2018.

Referencia a un listado de secuencias enviado como un archivo de texto a través de efs web

El listado de secuencias escrito en el archivo 523060SEQLIST.txt, de 39,2 kilobytes, se creó el 5 de noviembre de 2018.

Antecedentes

La diabetes es un trastorno caracterizado por defectos metabólicos en los tejidos que responden a la insulina y en las células beta pancreáticas productoras de insulina, lo que da como resultado una incapacidad para mantener niveles adecuados de azúcar en la sangre en el cuerpo. La diabetes en los seres humanos puede definirse como un trastorno que corresponde a una concentración de glucosa plasmática en ayunas superior a 125 mg/dl, o una concentración de glucosa plasmática superior a 199 mg/dl dos horas después de la ingestión de una carga de glucosa oral de 75 g. Dos formas principales de diabetes son la diabetes tipo 1 (T1D) y la diabetes tipo 2 (T2D). La T1D es un trastorno autoinmunitario que da como resultado la destrucción de las células beta pancreáticas y una deficiencia absoluta de insulina, la hormona que regula la utilización de la glucosa. Por el contrario, la T2D puede producirse con niveles normales o incluso elevados de insulina debido a la incapacidad de los tejidos para responder adecuadamente a la insulina. La mayoría de los pacientes con T2D tienen sensibilidad a la insulina alterada. La secreción de insulina no puede compensar la resistencia de los tejidos periféricos a responder a la insulina. Muchos pacientes con T2D son obesos. La diabetes tipo 1,5 (de aparición autoinmunitaria tardía en adultos) muestra algunas características de la T1D y la T2D.

El zinc es necesario para la biosíntesis y el procesamiento de la insulina. Dos iones de zinc forman un complejo en una forma hexamérica de proinsulina, que finalmente se procesa hacia insulina.

SLC30A8 codifica un transportador de zinc que se expresa principalmente en el islote pancreático, donde transporta zinc a los gránulos secretores que contienen insulina. Las mutaciones heterocigotas de pérdida de función (LOF) en SLC30A8 protegen de la diabetes tipo 2 en seres humanos. Se han caracterizado varias líneas de ratones con inactivación de Slc30a8, pero estas no recapitulan completamente el fenotipo humano protector. Más bien, los ratones con deficiencia de Slc30a8 tienen niveles reducidos de insulina plasmática y tolerancia a la glucosa alterada. Resumen

La presente invención se refiere a las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones adjuntas. En particular, se proporcionan animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 mutado, así como también métodos para generar y usar dichos animales no humanos, en donde el animal no humano es un roedor. También se proporcionan animales no humanos, es decir, genomas o células de roedores que comprenden un locus Slc30a8 mutado.

Dichos genomas de animales no humanos, células de animales no humanos o animales no humanos comprenden un gen Slc30a8 mutado, en donde el gen Slc30a8 mutado codifica una proteína SLC30A8 truncada y da como resultado que el animal no humano tenga una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un animal no humano sin la mutación.

En particular, se proporcionan animales no humanos cuyo genoma comprende un locus Slc30a8 endógeno que comprende un gen Slc30a8 mutado, en donde el gen Slc30a8 mutado codifica una proteína SLC30A8 truncada y da como resultado que el animal no humano tenga una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un animal no humano sin la mutación.

En algunos de dichos animales no humanos, los animales no humanos exhiben una capacidad potenciada para la secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia. Opcionalmente, el animal no humano tiene una mayor secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina con relación al animal no humano sin la mutación. Opcionalmente, el aumento de la secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina no está asociado con una mayor proliferación de células beta o masa de células beta con relación al animal no humano sin la mutación.

En algunos de dichos animales no humanos, se observa una capacidad potenciada para la secreción de insulina cuando los animales no humanos se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas. Opcionalmente, el animal no humano tiene una mayor secreción de insulina con relación al animal no humano sin la mutación cuando se alimenta con una dieta con alto contenido de grasas, en donde el aumento de la secreción de insulina está asociado con el aumento de la proliferación de células beta o de la masa de células beta con relación al animal no humano sin la mutación. Opcionalmente, el aumento de la proliferación de células beta es dependiente del receptor de insulina (por ejemplo, dependiente de un receptor de insulina en las células beta).

En dichos animales no humanos, células de animales no humanos o genomas de animales no humanos, el gen Slc30a8 mutado tiene un codón de terminación prematura. En dichos animales no humanos, células de animales no humanos o genomas de animales no humanos, el gen Slc30a8 mutado comprende una mutación en el tercer exón del gen Slc30a8, que está en el extremo 3' del tercer exón del gen Slc30a8.

En dichos animales no humanos, células de animales no humanos o genomas de animales no humanos, el gen Slc30a8 mutado comprende una mutación sin sentido. Opcionalmente, la mutación sin sentido está en un codón que corresponde al codón que codifica R138 en la SEQ ID NO: 14 cuando la proteína SLC30A8 codificada por el gen Slc30a8 mutado se alinea de manera óptima con la SEQ ID NO: 14. Opcionalmente, la mutación sin sentido está en una posición correspondiente al residuo 412 en la SEQ ID NO: 21 cuando la secuencia codificante del gen Slc30a8 mutado se alinea de manera óptima con la SEQ ID NO: 21.

En dichos animales no humanos, células de animales no humanos o genomas de animales no humanos, el gen Slc30a8 mutado es endógeno para el animal no humano. En algunos de dichos animales no humanos, células de animales no humanos o genomas de animales no humanos, el animal no humano es una rata o un ratón. Opcionalmente, el animal no humano es un ratón. Opcionalmente, el gen Slc30a8 mutado codifica una proteína SLC30A8 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13. Opcionalmente, el gen Slc30a8 mutado comprende la secuencia codificante expuesta en la SEQ ID NO: 22 o degeneraciones de la misma que codifican la misma secuencia de aminoácidos.

Algunos de dichos animales no humanos tienen una mayor secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina con relación al animal no humano sin la mutación. En algunos de dichos animales no humanos, el aumento de la secreción de insulina no está asociado con un aumento de la proliferación de células beta o de la masa de células beta con relación al animal no humano sin la mutación. Algunos de dichos animales no humanos tienen una expresión génica mitocondrial disminuida con relación al animal no humano sin la mutación. Algunos de dichos animales no humanos tienen una expresión de Hvcn1 aumentada con relación al animal no humano sin la mutación. En algunos de dichos animales no humanos, el animal no humano tiene una homeostasis de la glucosa y una secreción de insulina inducida por glucosa normales en una dieta de alimento balanceado de control con relación al animal no humano sin la mutación. En algunos de estos animales no humanos, el animal no humano tiene un fenotipo metabólico normal en una dieta de alimento balanceado de control con relación al animal no humano sin la mutación.

Algunos de dichos animales no humanos tienen una o más de las siguientes características con relación al animal no humano sin la mutación: (a) aumento de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimentan con la dieta con alto contenido de grasas; (b) aumento de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimentan con la dieta con alto contenido de grasas; (c) aumento del número de células beta pancreáticas cuando se alimentan con la dieta con alto contenido de grasas; y (d) aumento de los niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina. Opcionalmente, el animal no humano tiene todas las características siguientes con relación al animal no humano sin la mutación: (a) aumento de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimentan con la dieta con alto contenido de grasas; (b) aumento de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimentan con la dieta con alto contenido de grasas; (c) aumento del número de células beta pancreáticas cuando se alimentan con la dieta con alto contenido de grasas; y (d) aumento de los niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina.

Algunos de dichos animales no humanos tienen una o más de las siguientes características con relación al animal no humano sin la mutación: (a) aumento de los niveles de insulina circulante después de alimentarse con la dieta con alto contenido de grasas durante 20 semanas; (b) aumento del número de células beta pancreáticas después de alimentarse con la dieta con alto contenido de grasas durante 20 semanas; (c) disminución de la relación proinsulina/insulina cuando se alimentan con la dieta con alto contenido de grasas; y (d) aumento de los niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina. Opcionalmente, el animal no humano tiene todas las siguientes características con relación al animal no humano sin la mutación: (a) aumento de los niveles de insulina circulante después de alimentarse con la dieta con alto contenido de grasas durante 20 semanas; (b) amento del número de células beta pancreáticas después de alimentarse con la dieta con alto contenido de grasas durante 20 semanas; (c) disminución de la relación proinsulina/insulina cuando se alimentan con la dieta con alto contenido de grasas; y (d) aumento de los niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina.

En algunos de dichos animales no humanos, los niveles de expresión de ARNm de Slc30a8 en los islotes del animal no humano son al menos el 25 % de los niveles de expresión de ARNm de Slc30a8 en los islotes del animal no humano sin la mutación.

Algunos de dichos animales no humanos, células de animales no humanos o genomas de animales no humanos son heterocigotos para la mutación. Algunos de dichos animales no humanos, células de animales no humanos o genomas de animales no humanos son homocigotos para la mutación. Algunos de dichos animales no humanos, células de animales no humanos o genomas de animales no humanos son machos. Algunos de dichos animales no humanos, células de animales no humanos o genomas de animales no humanos son hembras.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para generar cualquiera de los animales no humanos anteriores, es decir, roedores. Algunos de dichos métodos comprenden: (a) poner en contacto el genoma de una célula pluripotente de un animal no humano que no es un embrión en etapa unicelular con: (i) una plantilla de reparación exógena que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado por un brazo de homología 5' que se hibrida con una secuencia objetivo 5' en el locus Slc30a8 y un brazo de homología 3' que se hibrida con una secuencia objetivo 3' en el locus Slc30a8, en donde el inserto de ácido nucleico comprende la mutación; y (ii) una proteína Cas9; y (iii) un ARN guía que se hibrida con una secuencia de reconocimiento de ARN guía dentro del locus Slc30a8, en donde el gen Slc30a8 está modificado para comprender la mutación; y (b) introducir la célula pluripotente de un animal no humano modificada en un embrión huésped; y (c) producir a partir del embrión huésped implantado en una madre sustituta un animal no humano de la generación F0 genéticamente modificado en el que el gen Slc30a8 está modificado para comprender la mutación, en donde la mutación da como resultado que el animal no humano de la generación F0 tenga una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un animal no humano sin la mutación cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas. Algunos de dichos métodos comprenden: (a) poner en contacto el genoma de una célula pluripotente de un animal no humano que no es un embrión en etapa unicelular con: (i) una plantilla de reparación exógena que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado por un brazo de homología 5' que se hibrida con una secuencia objetivo 5' en el locus Slc30a8 y un brazo de homología 3' que se hibrida con una secuencia objetivo 3' en el locus Slc30a8, en donde el inserto de ácido nucleico comprende la mutación; y (ii) una proteína Cas9; y (iii) un ARN guía que se hibrida con una secuencia de reconocimiento de ARN guía dentro del locus Slc30a8, en donde el gen Slc30a8 está modificado para comprender la mutación; y (b) introducir la célula pluripotente de un animal no humano modificada en un embrión huésped; y (c) gestar el embrión huésped en una madre sustituta para producir un animal no humano de la generación F0 genéticamente modificado en el que el gen Slc30a8 está modificado para comprender la mutación, en donde la mutación da como resultado que el animal no humano de la generación F0 tenga una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un animal no humano sin la mutación cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas. Opcionalmente, la célula pluripotente es una célula madre embrionaria. Opcionalmente, la plantilla de reparación exógena es un vector de direccionamiento grande que tiene al menos 10 kb de longitud, o en donde la plantilla de reparación exógena es un vector de direccionamiento grande en el que la suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' es al menos de 10 kb de longitud.

Algunos de dichos métodos comprenden: (a) poner en contacto el genoma de un embrión en etapa unicelular de un animal no humano con: (i) una plantilla de reparación exógena que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado por un brazo de homología 5' que se hibrida con una secuencia objetivo 5' en el locus Slc30a8 y un brazo de homología 3' que se hibrida con una secuencia objetivo 3' en el locus Slc30a8, en donde el inserto de ácido nucleico comprende la mutación; (ii) una proteína Cas9; y (iii) un ARN guía que se hibrida con una secuencia de reconocimiento de ARN guía dentro del locus Slc30a8, en donde el gen Slc30a8 está modificado para comprender la mutación; y (b) producir a partir del embrión en etapa unicelular del animal no humano modificado genéticamente implantado en una madre sustituta un animal no humano de la generación F0 modificado genéticamente en el que el gen Slc30a8 está modificado para comprender la mutación, en donde la mutación da como resultado que animal no humano de la generación F0 tenga una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un animal no humano sin la mutación cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas. Algunos de dichos métodos comprenden: (a) poner en contacto el genoma de un embrión en etapa unicelular de un animal no humano con: (i) una plantilla de reparación exógena que comprende un inserto de ácido nucleico flanqueado por un brazo de homología 5' que se hibrida con una secuencia objetivo 5' en el locus Slc30a8 y un brazo de homología 3' que se hibrida con una secuencia objetivo 3' en el locus Slc30a8, en donde el inserto de ácido nucleico comprende la mutación; (ii) una proteína Cas9; y (iii) un ARN guía que se hibrida con una secuencia de reconocimiento de ARN guía dentro del locus Slc30a8, en donde el gen Slc30a8 está modificado para comprender la mutación; y (b) gestar el embrión en etapa unicelular del animal no humano modificado en una madre sustituta para producir un animal no humano de la generación F0 modificado genéticamente en el que el gen Slc30a8 está modificado para comprender la mutación, en donde la mutación da como resultado que el animal no humano de la generación F0 tenga una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un animal no humano sin la mutación cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas.

En algunos de dichos métodos, la etapa (a) comprende además poner en contacto el genoma de la célula pluripotente de un animal no humano o el embrión en etapa unicelular no humano con un segundo ARN guía que se hibrida con una segunda secuencia de reconocimiento de ARN guía dentro del locus Slc30a8.

En algunos de dichos métodos, la plantilla de reparación exógena es un oligodesoxinucleótido monocatenario. Opcionalmente, la plantilla de reparación exógena tiene entre aproximadamente 80 nucleótidos a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud.

En otro aspecto, se proporcionan métodos para evaluar compuestos por su actividad para mejorar o exacerbar la diabetes tipo 2. Algunos de dichos métodos comprenden: (a) poner en contacto cualquiera de los animales no humanos sujeto anteriores, es decir, roedores, con el compuesto; y (b) medir uno o más de los siguientes en el animal no humano sujeto con relación a un animal no humano de control que no estuvo en contacto con el compuesto, en donde el animal no humano de control comprende la misma mutación de Slc30a8 que el animal no humano sujeto: (1) secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (2) niveles de proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (3) número de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; y (4) niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina, por lo cual la actividad para mejorar la diabetes tipo 2 se identifica mediante uno o más de los siguientes en el animal no humano sujeto en comparación con el animal no humano de control: (1) aumento de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (2) aumento de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (3) aumento del número de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; y (4) aumento de los niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina, y por lo cual la actividad para exacerbar la diabetes tipo 2 se identifica por uno o más de los siguientes en el animal no humano sujeto en comparación con el animal no humano de control: (1) disminución de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (2) disminución de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (3) disminución del número de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; y (4) disminución de los niveles de insulina plasmática después del bloqueo del receptor de insulina.

Algunos de dichos métodos comprenden: (a) poner en contacto cualquiera de los animales no humanos sujeto anteriores con el compuesto; y (b) medir uno o más de los siguientes en el animal no humano sujeto con relación a un animal no humano de control que no estuvo en contacto con el compuesto, en donde el animal no humano de control comprende la misma mutación de Slc30a8 que el animal no humano sujeto: (1) capacidad de secretar insulina en respuesta a la hiperglucemia; (2) eliminación de insulina; (3) expresión génica mitocondrial; y (4) expresión de Hvcn1, por cual la actividad para mejorar la diabetes tipo 2 se identifica mediante uno o más de los siguientes en el animal no humano sujeto en comparación con el animal no humano de control: (1) aumento de la capacidad para secretar insulina en respuesta a la hiperglucemia; (2) aumento de la eliminación de insulina; (3) disminución de la expresión génica mitocondrial; y (4) aumento de la expresión de Hvcn1, y por lo cual la actividad para exacerbar la diabetes tipo 2 se identifica mediante uno o más de los siguientes en el animal no humano sujeto en comparación con el animal no humano de control: (1) disminución de la capacidad para secretar insulina en respuesta a la hiperglucemia; (2) disminución de la eliminación de insulina; (3) aumento de la expresión génica mitocondrial; y (4) disminución de la expresión de Hvcn1.

En otro aspecto, se proporcionan células de animales no humanos, es decir, células de roedores cuyo genoma comprende un locus Slc30a8 endógeno que comprende un gen Slc30a8 mutado, en donde el gen Slc30a8 mutado codifica una proteína SLC30A8 truncada, y en donde un animal no humano que comprende el gen Slc30a8 mutado tiene una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un animal no humano sin la mutación.

En otro aspecto, se proporcionan genomas de animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 endógeno que comprende un gen Slc30a8 mutado, en donde el gen Slc30a8 mutado codifica una proteína SLC30A8 truncada, y en donde un animal no humano que comprende el gen Slc30a8 mutado tiene una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un animal no humano sin la mutación.

En otro aspecto, se proporcionan vectores de direccionamiento para generar un gen Slc30a8 mutado en un locus Slc30a8 endógeno en un animal no humano, en donde el vector de direccionamiento comprende un brazo de homología 5' dirigido a una secuencia objetivo 5' en el locus Slc30a8 endógeno y un 3' brazo de homología dirigido a una secuencia objetivo 3' en el locus Slc30a8 endógeno, en donde el vector de direccionamiento comprende una mutación en el gen Slc30a8, en donde el gen Slc30a8 mutado codifica una proteína SLC30A8 truncada, y en donde un animal no humano que comprende el gen Slc30a8 mutado tiene una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un animal no humano sin la mutación.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1A-1D muestran el análisis del ARN y la proteína de Slc30a8 en islotes de ratones R138X machos con dieta de alimento balanceado. La Figura 1A muestra la hibridación in situ del ARN de Slc30a8 de islotes pancreáticos aislados de ratones de tipo silvestre (WT), homocigotos con inactivación (KO) y homocigotos R138X. Los islotes KO se usaron como control negativo. Rojo: ARN de glucagón, verde: ARN de insulina, blanco: ARN de Slc30a8. La Figura 1B muestra la cuantificación de los niveles de ARN de Slc30a8 de los islotes mediante el análisis TAQMAN®. La Figura 1C muestra la inmunoelectrotransferencia de islotes aislados de ratones WT, KO y R138X alimentados con alimento balanceado. Los islotes KO se usaron como control negativo. Flecha: proteína SLC30A8; *indica bandas inespecíficas. La Figura ID muestra la tinción con ditizona de islotes pancreáticos aislados de ratones WT, KO y R138X.

Las Figuras 2A-2P muestran el fenotipo metabólico de ratones R138X homocigotos machos con dieta de alimento balanceado. Las Figuras 2A-2D y 2L muestran el peso corporal (Figura 2L), y los niveles de glucosa en sangre (Figura 2A), insulina plasmática (Figura 2B), proinsulina (Figura 2C) y péptido C (Figura 2D) en ratones WT y R138X alimentados y en ayunas. Las Figuras 2E-2F muestran la relación proinsulina/insulina (Figura 2E) y la relación péptido C/insulina (Figura 2F) en ratones WT y R138X alimentados y en ayunas. La Figura 2G muestra la prueba de tolerancia a la glucosa oral en ratones WT y R138X. Los datos se muestran como glucosa en sangre a lo largo del tiempo. La Figura 2H muestra los niveles de insulina plasmática en ratones WT o R138X después de un ayuno nocturno (tiempo 0) y en los tiempos indicados después de una inyección intraperitoneal de glucosa. Los datos se muestran como niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo. La Figura 21 muestra la histología para la insulina en páncreas aislado de ratones WT y R138X. La Figura 2J muestra la cuantificación de la tinción de insulina pancreática. La Figura 2K muestra la cuantificación del número de islotes. Los valores representan las medias ± SEM (n=6-20 ratones por genotipo). La Figura 2M muestra los resultados de una prueba de tolerancia a la insulina en ratones WT y R138X en ayunas durante 4 h. Los datos se muestran como niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo (n=6/genotipo). La Figura 2N muestra una cuantificación adicional de la tinción de insulina pancreática (masa de islotes; n=6/genotipo). Los valores representan las medias ± SEM. Las Figuras 2O-2P muestran la relación proinsulina/péptido C (Figura 2O) y la relación insulina/péptido C (Figura 2P) en ratones WT y R138X alimentados y en ayunas con una dieta de alimento balanceado. N=18-20 ratones por genotipo.

Las Figuras 3A-3M muestran el fenotipo metabólico de ratones homocigotos R138X machos con dieta HFD. Las Figuras 3A-3F muestran los niveles de glucosa en sangre (Figura 3A), insulina plasmática (Figura 3B), proinsulina (Figura 3C) y péptido C (Figura 3D) en ratones WT y R138X alimentados y en ayunas. Las Figuras 3E-3F muestran la relación proinsulina/insulina (Figura 3E) y la relación péptido C/insulina (Figura 3F) en ratones WT y R138X alimentados y en ayunas. La Figura 3G muestra la prueba de tolerancia a la glucosa oral en ratones WT y R138X. Los datos se muestran como glucosa en sangre a lo largo del tiempo. El área bajo la curva se muestra a la derecha. La Figura 3H muestra los niveles de insulina en sangre en ratones WT o R138X después de un ayuno nocturno (tiempo 0) y en los tiempos indicados después de una inyección intraperitoneal de glucosa. Los datos se muestran como niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo. La Figura 31 muestra la histología para la insulina en páncreas aislado de ratones WT y R138X. La Figura 3J muestra la cuantificación de la tinción de insulina pancreática. La Figura 3K muestra la cuantificación del número de islotes. La Figura 3L muestra la inmunohistoquímica para Ki67 (verde) e insulina (rojo). La Figura 3M muestra la cuantificación de células doblemente positivas para Ki67 e insulina. Los valores representan las medias ± SEM (n=4-17 ratones por genotipo). Las Figuras 4A-4K muestran el fenotipo metabólico de ratones homocigotos Slc30a8 KO machos con dieta HFD. Las Figuras 4A-4D muestran los niveles de glucosa en sangre (Figura 4A), insulina plasmática (Figura 4B), proinsulina (Figura 4C) y péptido C (Figura 4D) en ratones WT y Slc30a8 KO alimentados y en ayunas. Las Figuras 4E-4F muestran la relación proinsulina/insulina (Figura 4E) y la relación péptido C/insulina (Figura 4F) en ratones WT y Slc30a8 KO alimentados y en ayunas. La Figura 4G muestra la prueba de tolerancia a la glucosa oral en ratones WT y Slc30a8 KO. Los datos se muestran como niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo. La Figura 4H muestra los niveles de insulina en sangre en ratones WT o Slc30a8 KO después de un ayuno nocturno (tiempo 0) y en los tiempos indicados después de una inyección intraperitoneal de glucosa. Los datos se muestran como niveles de glucosa a lo largo del tiempo. La Figura 41 muestra la histología para la insulina en páncreas aislado de ratones WT y Slc30a8 KO. La Figura 4J muestra la cuantificación de la tinción de insulina pancreática. La Figura 4K muestra la cuantificación del número de islotes. Los valores representan las medias ± SEM (n=6-17 ratones por genotipo).

La Figura 5 muestra la expresión y estabilización in vitro de la proteína R138X humana mediante inhibición proteosómica. El análisis de inmunoelectrotransferencia de lisados HEK293 se muestra después de la sobreexpresión de la proteína R138X o WT SLC30A8 etiquetada con myc sola o juntas. Las células se trataron durante 6 h con los compuestos indicados y se sondearon con los anticuerpos respectivos.

Las Figuras 6A-6E muestran que la histología para el glucagón en condiciones de alimento balanceado y HFD no cambia en ratones homocigotos R138X machos. La Figura 6A muestra la histología para el glucagón en páncreas aislado de ratones WT y R138X alimentados con alimento balanceado. Las Figuras 6B y 6E muestran la cuantificación de la tinción de glucagón pancreático que se muestra en la Figura 6A. Los valores representan las medias ± SEM (n= 6 por genotipo). La Figura 6C muestra la histología para el glucagón en páncreas aislado de ratones WT y R138X alimentados con HFD. La Figura 6D muestra la cuantificación de la tinción de glucagón pancreático que se muestra en la Figura 6C (n=4-17 ratones por genotipo).

Las Figuras 7A-7K muestran el fenotipo metabólico de ratones homocigotos Slc30a8 KO machos con dieta de alimento balanceado. Las Figuras 7A-7D muestran los niveles de glucosa en sangre (Figura 7A), insulina plasmática (Figura 7B), proinsulina (Figura 7C) y péptido C (Figura 7D) en ratones WT y Slc30a8 KO alimentados y en ayunas. Las Figuras 7E-7F muestran la relación proinsulina/insulina (Figura 7E) y la relación péptido C/insulina (Figura 7F) en ratones WT y Slc30a8 KO alimentados y en ayunas. La Figura 7G muestra la prueba de tolerancia a la glucosa oral en ratones W^ty Slc30a8 KO. Los datos se muestran como niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo. La Figura 7H muestra los niveles de insulina plasmática en ratones WT o Slc30a8 KO después de un ayuno nocturno (tiempo 0) y en los tiempos indicados después de una inyección intraperitoneal de glucosa. Los datos se muestran como niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo. La Figura 71 muestra la histología para la insulina en páncreas aislado de ratones WT y Slc30a8 KO. La Figura 7j muestra la cuantificación de la tinción de insulina pancreática. La Figura 7K muestra la cuantificación del número de islotes. Los valores representan las medias ± SEM (n=6-10 ratones por genotipo).

Las Figuras 8A-8K muestran el fenotipo metabólico de ratones homocigotos R138X hembras en HFD. Las Figuras 8A-8D muestran los niveles de glucosa en sangre (Figura 8A), insulina plasmática (Figura 8B), proinsulina (Figura 8C) y péptido C (Figura 8D) en ratones WT y R138X alimentados y en ayunas. Las Figuras 8E-8F muestran la relación proinsulina/insulina (Figura 8E) y la relación péptido C/insulina (Figura 8F) en ratones WT y R138X alimentados y en ayunas. La Figura 8G muestra la prueba de tolerancia a la glucosa oral en ratones WT y R138X. Los datos se muestran como niveles de glucosa a lo largo del tiempo. La Figura 8H muestra los niveles de insulina plasmática en ratones WT o R138X después de un ayuno nocturno (tiempo 0) y en los tiempos indicados después de una inyección intraperitoneal de glucosa. Los datos se muestran como niveles de glucosa a lo largo del tiempo. La Figura 8I muestra la histología para la insulina en páncreas aislado de ratones WT y R138X. La Figura 8J muestra la cuantificación de la tinción de insulina pancreática. La Figura 8K muestra la cuantificación del número de islotes. Los valores representan las medias ± SEM (n=6-9 ratones por genotipo).

Las Figuras 9A-9M muestran que los ratones heterocigotos R138X (HET) en HFD tienen niveles más altos de insulina estimulada por glucosa. La Figura 9A muestra la inmunoelectrotransferencia de islotes aislados de ratones heterocigotos R138X y WT, alimentados con alimento balanceado. Flecha: proteína SLC30A8; *indica bandas inespecíficas. La Figura 9B muestra la tinción con ditizona de islotes pancreáticos aislados de ratones heterocigotos R138X y WT. Las Figuras 9C-9F muestran los niveles de glucosa en sangre (Figura 9C), insulina plasmática (Figura 9D), proinsulina (Figura 9E) y péptido C (Figura 9F) en ratones WT y R138X HET alimentados y en ayunas. Las Figuras 9G-9H muestran la relación proinsulina/insulina (Figura 9G) y la relación péptido C/insulina (Figura 9H) en ratones WT y HET alimentados y en ayunas. La Figura 9l muestra la prueba de tolerancia a la glucosa oral en ratones WT y HET R138X. Los datos se muestran como niveles de glucosa en sangre a lo largo del tiempo. La Figura 9J muestra los niveles de insulina plasmática en ratones WT o HET R138X después de un ayuno nocturno (tiempo 0) y en los tiempos indicados después de una inyección intraperitoneal de glucosa. Los datos se muestran como niveles de glucosa a lo largo del tiempo. La Figura 9K muestra la histología para la insulina en páncreas aislado de ratones WT y HET R138X. La Figura 9L muestra la cuantificación de la tinción de insulina pancreática. La Figura 9M muestra la cuantificación del número de islotes. Los valores representan las medias ± SEM (n=6-9 ratones por genotipo).

Las Figuras 10A-10C muestran esquemas para dirigirse al locus Slc30a8 de ratón para generar ratones R138X. La Figura 10A muestra el locus de ratón de tipo silvestre e indica la ubicación de la mutación puntual pArg137* C>T y la eliminación de 29 pb que se generan mediante el direccionamiento. Se muestran un ensayo de evaluación específica de alelo (8084 AS) y un ensayo de evaluación aguas abajo TAQMAN® (8084 TD). La Figura 10B muestra un esquema del locus objetivo. La Figura 10C muestra un esquema del locus objetivo después de la autosupresión del casete de selección de fármacos de autoeliminación.

La Figura 11 muestra un alineamiento de proteínas de la proteína SLC30A8 de ratón de tipo silvestre (SEQ ID NO: 12), la proteína SLC30A8 Arg137* truncada esperada en ratones R138X (SEQ ID NO: 13), y la proteína SLC30A8 humana de tipo silvestre (SEQ ID NO: 14).

La Figura 12 muestra los niveles de glucosa plasmática con alimentos y los niveles de insulina plasmática con alimentos en ratones WT (símbolos cerrados) y homocigotos R138X (símbolos abiertos) tratados con S961 (líneas discontinuas) o PBS (líneas continuas) mediante el uso de una infusión constante por minibomba. Se midieron los niveles de glucosa y los niveles de insulina plasmática con alimentos en los tiempos indicados a lo largo del experimento (21 días).

Las Figuras 13A-13I muestran que los ratones R138X secretan más insulina en hiperglucemia crónica provocada por el antagonista del receptor de insulina S961. La Figura 13A muestra los niveles de glucosa plasmática sin ayuno en ratones R138X y WT tratados continuamente con el antagonista del receptor de insulina S961 (20 nMol/semana) o PBS durante 22 días. La Figura 13B muestra la insulina plasmática sin ayuno los días 0, 4, 19 y 22 en ratones R138X y WT tratados con S961 (20 nMol/semana) o PBS. La Figura 13C muestra los niveles de GLP-1 activo en plasma en ratones WT y R138X después de 22 días de tratamiento. Las Figuras 13D y 13E muestran los niveles de glucosa (Figura 13D) e insulina (Figura 13E) con alimentos y en ayunas medidos los días 19 y 20 después del inicio del tratamiento. La Figura 13F muestra la inmunohistoquímica para KI-67 (blanco), insulina (verde) y glucagón (rojo). La Figura 13G muestra la cuantificación de células doblemente positivas para KI-67 e insulina. La Figura 13H muestra la cuantificación de la tinción para insulina pancreática que se muestra en la (Figura 13I). La Figura 13I muestra la histología para la insulina en páncreas aislado de ratones WT y R138X después de 22 días de tratamiento. Los valores representan las medias ± SEM (n=5-7 ratones por tratamiento y genotipo).

Las Figuras 14A-14G muestran los niveles hormonales y la histología para el glucagón después de 22 días de tratamiento con el antagonista del receptor de insulina S961 (20 nMol/semana) o PBS S961. Insulina (Figura 14A), proinsulina (Figura 14B), péptido C (Figura 14C), relación proinsulina/péptido C (Figura l4D), relación insulina/péptido C (Figura 14E) en ratones WT y R138X alimentados y en ayunas después de 22 días de tratamiento. La Figura 14F muestra la cuantificación de la tinción para glucagón pancreático que se muestra en la Figura 14G. La Figura 14G muestra la histología para el glucagón en páncreas aislado de ratones WT y R138X después de 22 días de tratamiento. Los valores representan las medias ± SEM (n=5-7 ratones por genotipo).

La Figura 15 muestra la expresión génica de Slc30a8, expresada en RPKM (lecturas por millón de kilobases).

Las Figuras 16A-16C muestran cambios en la expresión génica en islotes de ratones WT frente a R138X. La Figura 16A muestra los valores de RPKM para la insulina 2 (Ins2) y la insulina 1 (Ins1). La Figura 16B muestra los valores de RPKM para los reguladores de células beta. La Figura 16^cmuestra los valores de RPKM para Hvcn1.

La Figura 17 muestra los niveles circulatorios de zinc en ratones homocigotos R138X y WT machos alimentados y en ayunas después de 20 semanas con una dieta con alto contenido de grasas (HFD). Los ratones tenían aproximadamente 29 semanas de edad. Se evaluaron 12 ratones WT y 13 ratones R138X.

Definiciones

Los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido", usados indistintamente en la presente descripción, incluyen formas poliméricas de aminoácidos de cualquier longitud, lo que incluye aminoácidos codificados y no codificados y aminoácidos modificados o derivatizados química o bioquímicamente. Los términos también incluyen polímeros que se han modificado, tales como polipéptidos que tienen estructuras peptídicas modificadas. El término "dominio" se refiere a cualquier parte de una proteína o polipéptido que tiene una función o estructura en particular.

Se dice que las proteínas tienen un "extremo N-terminal" y un "extremo C-terminal". El término "extremo N-terminal" se refiere al inicio de una proteína o polipéptido, terminado por un aminoácido con un grupo amino libre (-NH2). El término "extremo C-terminal" se refiere al final de una cadena de aminoácidos (proteína o polipéptido), terminada por un grupo carboxilo libre (-COOH).

Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido", usados indistintamente en la presente descripción, incluyen formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, lo que incluye ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos o análogos o versiones modificadas de los mismos. Incluyen ^aDⁿo ARN monocatenario, bicatenario y multicatenario, ADN genómico, ADNc, híbridos de ADN-ARN y polímeros que comprenden bases de purina, bases de pirimidina u otras bases nucleotídicas naturales, químicamente modificadas, bioquímicamente modificadas, no naturales o derivatizadas.

Se dice que los ácidos nucleicos tienen "extremos 5'" y "extremos 3'" porque los mononucleótidos se hacen reaccionar para formar oligonucleótidos de manera que el fosfato 5' de un anillo de mononucleótido pentosa se une al oxígeno 3' de su vecino en una dirección a través de un enlace fosfodiéster. Un extremo de un oligonucleótido se denomina "extremo 5'" si su fosfato 5' no está unido al oxígeno 3' de un anillo de mononucleótido pentosa. Un extremo de un oligonucleótido se denomina "extremo 3'" si su oxígeno 3' no está unido a un fosfato 5' de otro anillo de mononucleótido pentosa. También puede decirse que una secuencia de ácido nucleico, incluso si es interna a un oligonucleótido más grande, tiene extremos 5' y 3'. En una molécula de ADN lineal o circular, los elementos discretos se denominan como que están "aguas arriba" o en dirección 5' de los elementos "aguas abajo" o en dirección 3'. El término "integrado genómicamente" se refiere a un ácido nucleico que se ha introducido en una célula de manera que la secuencia de nucleótidos se integra en el genoma de la célula. Puede usarse cualquier protocolo para la incorporación estable de un ácido nucleico en el genoma de una célula.

El término "vector de direccionamiento" se refiere a un ácido nucleico recombinante que puede introducirse mediante recombinación homóloga, ligadura mediada por unión de extremos no homólogos o cualquier otro medio de recombinación en una posición objetivo en el genoma de una célula.

El término "tipo silvestre" incluye entidades que tienen una estructura y/o actividad como la que se encuentra en un estado o contexto normal (por el contrario a mutante, enferma, alterada, etc.). Los genes y polipéptidos de tipo silvestre existen a menudo en múltiples formas diferentes (por ejemplo, alelos).

El término "secuencia endógena" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se produce naturalmente dentro de una célula o animal no humano. Por ejemplo, una secuencia endógena de Slc30a8 de un animal no humano se refiere a una secuencia nativa de Slc30a8 que se produce naturalmente en el locus Slc30a8 en el animal no humano. El término "locus endógeno" se refiere a una localización en un cromosoma en la que se encuentra naturalmente un elemento genético particular. Por ejemplo, un locus Slc30a8 endógeno de un animal no humano se refiere al locus Slc30a8 de origen natural en el animal no humano (es decir, la región del genoma del animal no humano en el que se encuentra naturalmente el gen Slc30a8). Como ejemplo, el locus Slc30a8 de ratón endógeno se mapea al cromosoma 15 (NCBI RefSeq IDGen 239436; ensamble GRCm38.p4; localización NC_000081.6 (52295553-52335733)). El término "locus Slc30a8 endógeno" de un animal no humano no se refiere a un gen Slc30a8 insertado aleatoriamente en el genoma del animal no humano o insertado en una región distinta de la región del genoma del animal no humano en la que se encuentra naturalmente el gen Slc30a8. Igualmente, el término "locus Slc30a8 endógeno" de un animal no humano no se refiere a un gen Slc30a8 localizado, por ejemplo, en células (por ejemplo, células beta humanas) injertadas en el animal no humano.

Las moléculas o secuencias "exógenas" incluyen moléculas o secuencias que normalmente no están presentes en una célula en esa forma. La presencia normal incluye la presencia con relación a la etapa particular de desarrollo y las condiciones ambientales de la célula. Una molécula o secuencia exógena, por ejemplo, puede incluir una versión mutada de una secuencia endógena correspondiente dentro de la célula o puede incluir una secuencia correspondiente a una secuencia endógena dentro de la célula pero en una forma diferente (es decir, no dentro de un cromosoma). Por el contrario, las moléculas o secuencias endógenas incluyen moléculas o secuencias que están presentes normalmente en esa forma en una célula particular en una etapa de desarrollo particular en condiciones ambientales particulares.

El término "heterólogo", cuando se usa en el contexto de un ácido nucleico o una proteína, indica que el ácido nucleico o la proteína comprende al menos dos segmentos que no se producen naturalmente juntos en la misma molécula. Por ejemplo, el término "heterólogo", cuando se usa con referencia a segmentos de un ácido nucleico o segmentos de una proteína, indica que el ácido nucleico o la proteína comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la naturaleza en la misma relación entre sí (por ejemplo, unidas). Como ejemplo, una región "heteróloga" de un vector de ácido nucleico es un segmento de ácido nucleico dentro o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra asociada con la otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de un vector de ácido nucleico podría incluir una secuencia codificante flanqueada por secuencias que no se encuentran asociadas con la secuencia codificante en la naturaleza. Igualmente, una región "heteróloga" de una proteína es un segmento de aminoácidos dentro o unido a otra molécula peptídica que no se encuentra asociada con la otra molécula peptídica en la naturaleza (por ejemplo, una proteína de fusión o una proteína con una etiqueta). De manera similar, un ácido nucleico o una proteína pueden comprender un marcador heterólogo o una secuencia de localización o secreción heteróloga.

La "optimización de codones" se aprovecha de la degeneración de los codones, como lo demuestra la multiplicidad de combinaciones de codones de tres pares de bases que especifican un aminoácido, e incluye generalmente un proceso de modificación de una secuencia de ácido nucleico para potenciar la expresión en células huésped particulares mediante el reemplazo de al menos un codón de la secuencia nativa con un codón que se usa más frecuentemente o con mayor frecuencia en los genes de la célula huésped a la vez que se mantiene la secuencia de aminoácidos nativa. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica una proteína Cas9 puede modificarse para sustituir codones que tienen una mayor frecuencia de uso en una célula procariota o eucariota determinada, lo que incluye una célula bacteriana, una célula de levadura, una célula humana, una célula no humana, una célula de mamífero, una célula de roedor, una célula de ratón, una célula de rata, una célula de hámster o cualquier otra célula huésped, en comparación con la secuencia de ácido nucleico de origen natural. Las tablas de uso de codones están fácilmente disponibles, por ejemplo, en la "Base de datos de uso de codones". Estas tablas pueden adaptarse de varias maneras. Ver Nakamura y otros (2000) Nucleic Acids Research 28:292. También están disponibles algoritmos informáticos para la optimización de codones de una secuencia en particular para la expresión en un huésped particular (ver, por ejemplo, Gene Forge).

El término "locus" se refiere a una localización específica de un gen (o secuencia significativa), secuencia de ADN, secuencia codificante de polipéptido o posición en un cromosoma del genoma de un organismo. Por ejemplo, un "locus Slc30a8 " puede referirse a la localización específica de un gen Slc30a8, una secuencia de ADN de Slc30a8, una secuencia codificante de SLC30a8 o una posición de Slc30a8 en un cromosoma del genoma de un organismo que se ha identificado en cuanto a dónde se encuentra dicha secuencia. Un "locus Slc30a8 " puede comprender un elemento regulador de un gen Slc30a8, lo que incluye, por ejemplo, un potenciador, un promotor, una región no traducida (UTR) 5' y/o 3', o una combinación de los mismos.

El término "gen" se refiere a una secuencia de ADN en un cromosoma que codifica un producto (por ejemplo, un producto de ARN y/o un producto polipeptídico) e incluye la región codificante interrumpida con intrones no codificantes y la secuencia localizada adyacente a la región codificante en los extremos 5' y 3' de manera que el gen corresponda al ARNm de longitud completa (lo que incluye las secuencias no traducidas 5' y 3'). El término "gen" también incluye otras secuencias no codificantes, lo que incluye secuencias reguladoras (por ejemplo, promotores, potenciadores y sitios de unión a factores de transcripción), señales de poliadenilación, sitios de entrada internos al ribosoma, silenciadores, secuencia aislante y regiones de unión a la matriz. Estas secuencias pueden estar cerca de la región codificante del gen (por ejemplo, dentro de 10 kb) o en sitios distantes, e influyen en el nivel o velocidad de transcripción y traducción del gen.

El término "alelo" se refiere a una forma variante de un gen. Algunos genes tienen una variedad de formas diferentes, que se localizan en la misma posición, o locus genético, en un cromosoma. Un organismo diploide tiene dos alelos en cada locus genético. Cada par de alelos representa el genotipo de un locus genético específico. Los genotipos se describen como homocigotos si hay dos alelos idénticos en un locus particular y como heterocigotos si los dos alelos difieren.

La "región codificante" o "secuencia codificante" de un gen consiste en la porción del ADN o ARN de un gen, compuesta de exones, que codifica una proteína. La región comienza en el codón de inicio en el extremo 5' y termina en el codón de parada en el extremo 3'.

Un "promotor" es una región reguladora de ADN que comprende generalmente una caja TATA capaz de dirigir a la ARN polimerasa II para iniciar la síntesis de ARN en el sitio de iniciación de la transcripción apropiado para una secuencia polinucleotídica particular. Un promotor puede comprender adicionalmente otras regiones que influyen en la velocidad de iniciación de la transcripción. Las secuencias promotoras descritas en la presente descripción modulan la transcripción de un polinucleótido unido operativamente. Un promotor puede estar activo en uno o más de los tipos de células descritos en la presente descripción (por ejemplo, una célula eucariota, una célula de mamífero no humano, una célula humana, una célula de roedor, una célula pluripotente, un embrión en etapa unicelular, una célula diferenciada, o una combinación de las mismas). Un promotor puede ser, por ejemplo, un promotor constitutivamente activo, un promotor condicional, un promotor inducible, un promotor temporalmente restringido (por ejemplo, un promotor regulado por el desarrollo) o un promotor espacialmente restringido (por ejemplo, un promotor específico de células o específico de tejidos). Pueden encontrarse ejemplos de promotores, por ejemplo, en el documento WO 2013/176772.

El "enlace operable" o estar "unido operativamente" incluye la yuxtaposición de dos o más componentes (por ejemplo, un promotor y otro elemento de secuencia) de manera que ambos componentes funcionen normalmente y permitan la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar en una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. Por ejemplo, un promotor puede estar unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores de la transcripción. El enlace operable puede incluir las secuencias que son contiguas entre sí o que actúan en trans (por ejemplo, una secuencia reguladora puede actuar a distancia para controlar la transcripción de la secuencia codificante).

El término "variante" se refiere a una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia más prevalente en una población (por ejemplo, en un nucleótido) o una secuencia de proteína diferente de la secuencia más prevalente en una población (por ejemplo, en un aminoácido).

"Identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos polinucleótidos o secuencias polipeptídicas hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una máxima correspondencia en una ventana de comparación especificada. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a las proteínas, las posiciones de los residuos que no son idénticas a menudo difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos, donde los residuos de aminoácidos se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por lo tanto, no cambia las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el por ciento de identidad de secuencia puede ajustarse al alza para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por dichas sustituciones conservadoras tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos. Típicamente, esto implica calificar una sustitución conservadora como un error de coincidencia parcial en lugar de total, lo que aumenta de esta manera el porcentaje de identidad de secuencia. De esta forma, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una puntuación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una puntuación de cero, una sustitución conservadora recibe una puntuación entre cero y 1. La calificación de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se implementa en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

El "porcentaje de identidad de secuencia" incluye el valor determinado mediante la comparación de dos secuencias alineadas de forma óptima (el mayor número de residuos perfectamente coincidentes) en una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las que aparecen residuos de aminoácidos o bases de ácidos nucleicos idénticas en ambas secuencias para producir el número de posiciones coincidentes, dividir el número de posiciones coincidentes por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. A menos que se especifique lo contrario (por ejemplo, la secuencia más corta incluye una secuencia heteróloga unida), la ventana de comparación es la longitud total de la más corta de las dos secuencias que se comparan.

A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia incluyen el valor obtenido mediante el uso de la versión 10 de GAP con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos mediante el uso de un peso de hueco de 50 y un peso de longitud de 3, y la matriz de puntuación nwsgapdna.cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos mediante el uso de un peso de hueco de 8 y un peso de longitud de 2, y la matriz de puntuación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente del mismo. "Programa equivalente" incluye cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera un alineamiento que tiene coincidencias idénticas de residuos de aminoácidos o nucleótidos y un por ciento de identidad de secuencia idéntico en comparación con el alineamiento correspondiente generado mediante la versión 10 de GAP.

El término "sustitución conservadora de aminoácidos" se refiere a la sustitución de un aminoácido que está presente normalmente en la secuencia con un aminoácido diferente de similar tamaño, carga o polaridad. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina o leucina por otro residuo no polar. Igualmente, los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, o entre glicina y serina. Adicionalmente, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro residuo ácido, son ejemplos adicionales de sustituciones conservadoras. Los ejemplos de sustituciones no conservadoras incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina, alanina o metionina por un residuo polar (hidrófilo) tal como cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina y/o un residuo polar por un residuo no polar. Las categorizaciones típicas de aminoácidos se resumen más abajo.

Tabla 1. Categorizaciones de aminoácidos.

Alanina Ala A No polar Neutral 1,8

Arginina Arg R Polar Positivo -4,5

Asparagina Asn N Polar Neutral -3,5

Ácido aspártico Asp D Polar Negativo -3,5

Cisteína Cys C No polar Neutral 2,5

Ácido glutámico Glu E Polar Negativo -3,5

Glutamina Gln Q Polar Neutral -3,5

Glicina Gly G No polar Neutral -0,4

Histidina His H Polar Positivo -3,2

Isoleucina Ile I No polar Neutral 4,5

Leucina Leu L No polar Neutral 3,8

Lisina Lys K Polar Positivo -3,9

Metionina Met M No polar Neutral 1,9

Fenilalanina Phe F No polar Neutral 2,8

Prolina Pro P No polar Neutral -1,6

Serina Ser S Polar Neutral -0,8

Treonina Thr T Polar Neutral -0,7

Triptófano Trp W No polar Neutral -0,9

Tirosina Tyr Y Polar Neutral -1,3

Valina Val V No polar Neutral 4,2

Una secuencia "homóloga" (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico) incluye una secuencia que es idéntica o sustancialmente similar a una secuencia de referencia conocida, de manera que es, por ejemplo, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de referencia conocida. Las secuencias homólogas pueden incluir, por ejemplo, secuencias ortólogas y secuencias parálogas. Los genes homólogos, por ejemplo, descienden típicamente de una secuencia de ADN ancestral común, ya sea mediante un evento de especiación (genes ortólogos) o un evento de duplicación genética (genes parálogos). Los genes "ortólogos" incluyen genes en diferentes especies que evolucionaron a partir de un gen ancestral común por especiación. Los ortólogos conservan típicamente la misma función en el curso de la evolución. Los genes "parálogos" incluyen genes relacionados por duplicación dentro de un genoma. Los parálogos pueden desarrollar nuevas funciones en el curso de la evolución.

El término "in vitro" incluye ambientes artificiales y procesos o reacciones que se producen dentro de un ambiente artificial (por ejemplo, un tubo de ensayo). El término "in vivo" incluye ambientes naturales (por ejemplo, una célula, un organismo o un cuerpo) y los procesos o reacciones que se producen dentro de un ambiente natural. El término "ex vivo" incluye células que se han extraído del cuerpo de un individuo y procesos o reacciones que se producen dentro de dichas células.

El término "gen indicador" se refiere a un ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica un producto génico (típicamente una enzima) que se analiza de manera fácil y cuantificable cuando un constructo que comprende la secuencia del gen informador unida operativamente a un elemento potenciador y/o promotor endógeno o heterólogo se introduce en células que contienen (o que se puede hacer que contengan) los factores necesarios para la activación de los elementos promotores y/o potenciadores. Los ejemplos de genes indicadores incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican beta-galactosidasa (lacZ), los genes bacterianos de cloranfenicol acetiltransferasa (cat), genes de luciferasa de luciérnaga, genes que codifican beta-glucuronidasa (GUS) y genes que codifican proteínas fluorescentes. Una "proteína indicadora" se refiere a una proteína codificada por un gen indicador.

El término "proteína indicadora fluorescente", como se usa en la presente descripción, significa una proteína indicadora que es detectable basado en la fluorescencia, en donde la fluorescencia puede provenir directamente de la proteína indicadora, la actividad de la proteína indicadora en un sustrato fluorogénico, o una proteína con afinidad para unirse a un compuesto etiquetado con fluorescencia. Los ejemplos de proteínas fluorescentes incluyen proteínas fluorescentes verdes (por ejemplo, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, eGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP y ZsGreenl), proteínas fluorescentes amarillas (por ejemplo, YFP, eYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP y ZsYellowl), proteínas fluorescentes azules (por ejemplo, BFP, eBFP, eBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire y T-sapphire), proteínas fluorescentes cian (por ejemplo, CFP, eCFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl y Midoriishi-Cyan), proteínas fluorescentes rojas (por ejemplo, RFP, mKate, mKate2, mPlum, monómero DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monómero, HcRed-Tándem, HcRedl, AsRed2, eqFP611, mRaspberry, mStrawberry y Jred), proteínas fluorescentes naranjas (por ejemplo, mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine y tdTomato) y cualquier otra proteína fluorescente adecuada cuya presencia en las células pueda detectarse mediante métodos de citometría de flujo.

La reparación en respuesta a rupturas de doble cadena (DSB) se produce principalmente mediante dos vías de reparación de ADN conservadas: recombinación homóloga (HR) y unión de extremos no homólogos (NHEJ). Ver Kasparek y Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897. Igualmente, la reparación de un ácido nucleico objetivo mediada por un ácido nucleico donante exógeno puede incluir cualquier proceso de intercambio de información genética entre los dos polinucleótidos.

El término "recombinación" incluye cualquier proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos y puede producirse por cualquier mecanismo. La recombinación puede producirse a través de la reparación dirigida por homología (HDR) o la recombinación homóloga (HR). La HDR o la HR incluyen una forma de reparación de ácido nucleico que puede requerir homología de secuencia de nucleótidos, usa una molécula "donante" como plantilla para la reparación de una molécula "objetivo" (es decir, la que experimentó la ruptura de doble cadena) y conduce a la transferencia de información genética del donante al objetivo. Sin pretender limitarse por ninguna teoría en particular, dicha transferencia puede implicar la corrección del error de coincidencia del ADN heterodúplex que se forma entre el objetivo roto y el donante, y/o la hibridación de la cadena dependiente de la síntesis, en la que el donante se usa para resintetizar la información genética que formará parte del objetivo y/o procesos relacionados. En algunos casos, el polinucleótido donante, una porción del polinucleótido donante, una copia del polinucleótido donante o una porción de una copia del polinucleótido donante se integra en el ADN objetivo. Ver Wang y otros (2013) Cell 153:910-918; Mandalos y otros (2012) PLOS ONE 7:e45768:1-9; y Wang y otros (2013) Nat Biotechnol. 31:530-532.

La NHEJ incluye la reparación de rupturas de doble cadena en un ácido nucleico mediante la ligadura directa de los extremos rotos entre sí o con una secuencia exógena sin necesidad de una plantilla homóloga. La ligadura de secuencias no contiguas mediante NHEJ a menudo puede dar como resultado eliminaciones, inserciones o translocaciones cerca del sitio de la ruptura de doble cadena. Por ejemplo, la NHEJ también puede dar como resultado la integración dirigida de un ácido nucleico donante exógeno mediante la ligadura directa de los extremos rotos con los extremos del ácido nucleico donante exógeno (es decir, captura basada en NHEJ). Puede preferirse dicha integración dirigida mediada por NHEJ para la inserción de un ácido nucleico donante exógeno cuando las vías de reparación dirigidas por homología (HDR) no son fácilmente utilizables (por ejemplo, en células que no se dividen, células primarias y células que realizan una deficiente reparación de ADN basada en homología). Además, a diferencia de la reparación dirigida por homología, no se necesita conocimiento sobre grandes regiones de identidad de secuencia que flanquean el sitio de escisión, lo que puede ser beneficioso cuando se intenta una inserción dirigida en organismos que tienen genomas de los que existe un conocimiento limitado de la secuencia genómica. La integración puede proceder mediante ligadura de extremos romos entre el ácido nucleico donante exógeno y la secuencia genómica escindida, o mediante ligadura de extremos adherentes (es decir, que tienen salientes 5' o 3') mediante el uso de un ácido nucleico donante exógeno que está flanqueado por salientes que son compatibles con los generados por un agente de nucleasa en la secuencia genómica escindida. Ver, por ejemplo, los documentos US 2011/020722, WO 2014/033644, WO 2014/089290, y Maresca y otros (2013) Genome Res.

23(3):539-546. Si se ligan los extremos romos, puede ser necesaria la extirpación del objetivo y/o del donante para generar regiones de microhomología necesarias para la unión de fragmentos, lo que puede crear alteraciones no deseadas en la secuencia objetivo.

El término "ratones R138X" se refiere a ratones que portan una mutación en el locus Slc30a8 de ratón correspondiente a la mutación LOF supuesta de SLC30A8 humano, R138X. La mutación en el locus Slc30a8 de ratón es c.409C>T (número de acceso del transcrito NM_172816.3), p.Arg137X, lo que significa una sustitución de C a T en el nucleótido 409 de la secuencia codificante que da como resultado que un codón que codifica el residuo de aminoácido 137 mute de un codón que codifica un residuo de arginina a un codón de parada (R137*parada). La mutación de SLC30A8 humano correspondiente es c.412 C>T (número de acceso del transcrito NM_173851), p.Arg138X, lo que significa una sustitución de C a T en el nucleótido 412 de la secuencia codificante que da como resultado que el codón que codifica el residuo de aminoácido 138 mute de un codón que codifica un residuo de arginina a un codón de parada (R138*parada). El residuo de aminoácido 137 de la proteína SLC30A8 de ratón se corresponde con el residuo de aminoácido 138 de la proteína SLC30A8 humana cuando los dos están óptimamente alineados. Ver la Figura 11. Aunque la mutación en el gen Slc30a8 de ratón está en el codón que codifica el residuo de aminoácido 137 de la proteína SLC30A8 de ratón, estos ratones se denominan en la presente descripción "ratones R138X" en referencia a la mutación de SLC30A8 humano correspondiente.

Las composiciones o métodos "que comprenden" o "que incluyen" uno o más elementos enumerados pueden incluir otros elementos no enumerados específicamente. Por ejemplo, una composición que "comprende" o "incluye" una proteína puede contener la proteína sola o en combinación con otros ingredientes. La frase de transición "que consiste esencialmente en" significa que el alcance de una reivindicación debe interpretarse como que abarca los elementos enumerados especificados en la reivindicación y aquellos que no afectan materialmente la o las características básicas y novedosas de la invención reivindicada. Por tanto, el término "que consiste esencialmente en" cuando se usa en una reivindicación de esta invención no pretende ser interpretado como equivalente a "que comprende".

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito subsecuentemente puede producirse o no y que la descripción incluye casos en los que se produce el evento o circunstancia y casos en los que no se produce.

La designación de un intervalo de valores incluye todos los números enteros dentro o que definen el intervalo, y todos los subintervalos definidos por números enteros dentro del intervalo.

A menos que sea evidente de otra manera por el contexto, el término "aproximadamente" abarca valores dentro de un margen estándar de error de medición (por ejemplo, SEM) de un valor indicado.

El término "y/o" se refiere y abarca todas y cada una de las combinaciones posibles de uno o más de los elementos enumerados asociados, así como también la ausencia de combinaciones cuando se interpreta en la alternativa ("o"). El término "o" se refiere a cualquier miembro de una lista en particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista.

Las formas singulares de los artículos "un", "una" y "el/la" incluye referencias en plural a menos que el contexto lo indique claramente de cualquier otra manera. Por ejemplo, el término "una proteína" o "al menos una proteína" puede incluir una pluralidad de proteínas, lo que incluye sus mezclas.

Estadísticamente significativo significa p <0,05.

Descripción detallada

I. Visión general

En la presente descripción se describen genomas de animales no humanos, células de animales no humanos y animales no humanos que comprenden en su genoma un locus Slc30a8 mutado y métodos para usar dichas células de animales no humanos y animales no humanos. La presente invención se refiere a las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones adjuntas, en particular a un animal no humano que de acuerdo con la invención es un roedor cuyo genoma comprende un locus Slc30a8 endógeno que comprende un gen Slc30a8 mutado, en donde el gen Slc30a8 mutado comprende una mutación sin sentido en el extremo 3' del tercer exón del gen Slc30a8 y da como resultado que el roedor tenga una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un roedor sin las mutaciones. El transportador de zinc SLC30A8 se expresa principalmente en los islotes del páncreas endocrino. SLC30A8 es solo uno de los tres genes hasta la fecha para los que se ha demostrado que mutaciones de pérdida de función supuestas protegen contra el desarrollo de diabetes tipo 2. Esta es una observación interesante pero también desconcertante, ya que los modelos de ratón con deficiencia de Slc30a8 tienen una homeostasis de la glucosa levemente alterada. Hemos generado un modelo de ratón que comprende un locus Slc30a8 mutado que imita un alelo SLC30A8 humano protector. Este modelo de ratón puede explicar por primera vez por qué los seres humanos están protegidos contra la diabetes tipo 2. Los ratones tienen una mayor capacidad secretora de insulina. En particular, los ratones tienen una mayor secreción de insulina inducida por glucosa, que puede estar mediada en parte por un mayor número de células beta pancreáticas. Estos datos de la mutación de SLC30A8 respaldan la idea de que la expansión de las células beta es una estrategia terapéutica válida para controlar la diabetes tipo 2.

Los modelos de células y animales no humanos descritos en la presente descripción pueden usarse para la evaluación de fármacos, así como también para proporcionar información sobre el mecanismo de la ^t2^d(por ejemplo, el mecanismo por el cual SLC30A8 contribuye al procesamiento de la insulina y la diabetes) y objetivos terapéuticos y de diagnóstico potencialmente nuevos.

II. Animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 mutado

Las células de roedores y animales no humanos, es decir, los roedores descritos en la presente descripción comprenden (por ejemplo, en su genoma) una mutación (por ejemplo, una mutación que no se produce naturalmente en animales no humanos) en el locus Slc30a8. El locus Slc30a8 mutado puede tener un codón de terminación prematura y/o puede codificar una proteína SLC30A8 truncada. Los animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 mutado tienen una capacidad potenciada para la secreción de insulina cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas con relación a un animal no humano sin la mutación cuando se alimentan con la misma dieta.

A. Slc30a8

Las células de roedores y animales no humanos, es decir, los roedores descritos en la presente descripción, comprenden un locus Slc30a8 mutado (familia de portadores de soluto 30, miembro 8). Otros nombres para SLC30A8 incluyen transportador de zinc 8, ZnT-8 y Znt8. La proteína codificada por Slc30a8 es un transportador de zinc implicado en la acumulación de zinc en vesículas intracelulares. Slc30a8 se expresa en un alto nivel en el páncreas, particularmente en los islotes de Langerhans. La proteína codificada se colocaliza junto con la insulina en los gránulos de la vía secretora de las células INS-1 secretoras de insulina.

SLC30A8 humano se mapea al 8q24.11 humano en el cromosoma 8 (NCBI RefSeq IDGen 169026; ensamble GRCh38.p7; localización 116950273-117176714). Se ha informado que el gen tiene ocho exones y siete intrones. Sin embargo, también son posibles las isoformas con más de ocho exones (lo que incluye exones no codificantes). A la proteína SLC30A8 humana de tipo silvestre se le ha asignado el número de acceso Q8IWU4 de UniProt. Se conocen dos isotermas, la isoterma 1 Q8IWU4 (SEQ ID NO: 14) y la isoterma 2 Q8IWU4. El ARNm que codifica la isoterma 1 se le asigna NCBI RefSeq NM_173851.2 (SEQ ID NO: 17). La proteína humana de longitud completa tiene 369 aminoácidos, lo que incluye seis regiones transmembrana, cuatro dominios topológicos intracelulares y tres dominios topológicos extracelulares. Las delimitaciones entre estos dominios son las designadas en UniProt. La referencia al SCL30A8 humano incluye las formas canónicas (de tipo silvestre), así como también todas las formas e isoformas alélicas. Cualquier otra forma de SLC30A8 humano tiene aminoácidos numerados para un alineamiento máximo con la forma de tipo silvestre, y los aminoácidos alineados se designan con el mismo número.

El Slc30a8 de ratón se mapea al cromosoma 15 (NCBI RefSeq IDGen 239436; ensamble GRCm38.p4; localización NC_000081.6 (52295553-52335733)). Se ha informado que el gen tiene ocho exones y siete intrones. A la proteína SLC30A8 de ratón de tipo silvestre se le ha asignado el número de acceso Q8BGG0 de UniProt (SEQ ID NO: 12). El ARNm que codifica la SLC30A8 de ratón se asigna a NCBI RefSeq NM_172816.3 (SEQ ID NO: 16). La proteína de ratón de longitud completa tiene 367 aminoácidos, lo que incluye seis regiones transmembrana, cuatro dominios topológicos intracelulares y tres dominios topológicos extracelulares. Las delimitaciones entre estos dominios son las designadas en UniProt. La referencia a la SCL30A8 de ratón incluye las formas canónicas (de tipo silvestre), así como también todas las formas alélicas e isoformas. Cualquier otra forma de SLC30A8 de ratón tiene aminoácidos numerados para un alineamiento máximo con la forma de tipo silvestre, y los aminoácidos alineados se designan con el mismo número.

Una proteína SLC30A8 de rata ilustrativa se designa con el número de acceso UniProt P0CE46.

Los polimorfismos en el gen SLC30A8 humano se asocian con un riesgo alterado de diabetes tipo 2 (T2D). Ver, por ejemplo, Sladek y otros (2007) Nature 445(7130):881-885 y Davidson y otros (2014) Trends Endocrinol. Metab.

25(8):415-424. Algunos de dichos polimorfismos o mutaciones en seres humanos pueden reducir el riesgo de T2D o protegen contra la T2D en seres humanos. Un polimorfismo o mutación en el gen SLC30A8 que reduce el riesgo de T2D incluye un polimorfismo o mutación que confiere protección contra la T2D, que confiere resistencia a la T2D o que está asociado con protección o resistencia a la T2D. Por ejemplo, diversas mutaciones del codón de parada, mutaciones de desplazamiento del marco, mutaciones del sitio de empalme o variaciones del codón iniciador que provocan el truncamiento en la SLC30A8 humana protegen contra la T2D cuando son heterocigotos. Uno de estos se designa c.412 C>T (número de acceso del transcrito NM_173851), p.Arg138X significa una sustitución de C a T en el nucleótido 412 de la secuencia codificante que da como resultado que el codón que codifica el residuo de aminoácido 138 mute de un codón que codifica un residuo de arginina a un codón de parada (R138*parada). Ver, por ejemplo, Flannick y otros (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363. Estos fenotipos no se han replicado en modelos animales anteriores, pero se replican en los animales no humanos descritos en la presente descripción.

B. Loci Slc30a8 mutados

Los loci Slc30a8 mutados descritos en la presente descripción dan como resultado que los animales no humanos tengan una capacidad potenciada para la secreción de insulina cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas con relación a un animal no humano sin la mutación cuando se alimenta con la misma dieta. Los loci Slc30a8 mutados pueden reducir el riesgo de T2D. Los animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 mutado pueden tener una o más o todas las siguientes características con relación al animal no humano sin la mutación (por ejemplo, un animal no humano de tipo silvestre): (1) aumento de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas; (2) aumento de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas; (3) aumento del número de células beta pancreáticas cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas; y (4) aumento de los niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina (por ejemplo, con S961). Adicional o alternativamente, los animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 mutado pueden tener una o más o todas las siguientes características con relación al animal no humano sin la mutación (por ejemplo, un animal no humano de tipo silvestre): (1) aumento de los niveles circulantes de insulina después de 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 semanas (por ejemplo, después de 20 o 30 semanas) de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas; (2) aumento del número de células beta pancreáticas después de 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 semanas (por ejemplo, después de 20 o 30 semanas) de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas; (3) disminución en la relación proinsulina/insulina cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas; (4) aumento de los niveles de insulina plasmática después del bloqueo del receptor de insulina (por ejemplo, después de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 días); y (5) células beta pancreáticas con mejor procesamiento de insulina y mejor salud (por ejemplo, como se evidencia por la disminución en la relación proinsulina/insulina cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas). Adicional o alternativamente, los animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 mutado pueden tener una expresión significativa de ARNm de Slc30a8 en los islotes (por ejemplo, al menos 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de los niveles de tipo silvestre, tal como al menos 25 % o 30 % de los niveles de tipo silvestre).

En comparación con animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado pueden tener un fenotipo metabólico normal cuando se alimentan con una dieta de alimento balanceado de control. En comparación con los animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado pueden tener una homeostasis normal de la glucosa y/o una secreción normal de insulina inducida por glucosa cuando se alimentan con una dieta de alimento balanceado de control. En comparación con los animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado también pueden tener una o más o todas las siguientes características cuando se alimentan con una dieta de alimento balanceado de control: no difieren significativamente en el peso corporal, no difieren significativamente en los niveles circulantes de glucosa en sangre, no difieren significativamente en los niveles circulantes de insulina, no difieren significativamente en los niveles circulantes de proinsulina, no difieren significativamente en los niveles circulantes de péptido C, no difieren significativamente en la relación proinsulina/péptido C, no difieren significativamente en la tolerancia a la glucosa, no difieren significativamente en la sensibilidad a la insulina, no difieren significativamente en la secreción de insulina inducida por glucosa, no difieren significativamente en la masa de células beta y no difieren significativamente en la masa de células alfa. En comparación con los animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado pueden tener una disminución en la relación insulina/péptido C cuando se alimentan con una dieta de alimento balanceado de control. Esto puede indicar una mayor eliminación de insulina.

En comparación con los animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado tienen una mayor capacidad para secretar insulina. Como ejemplo, los animales no humanos pueden tener una capacidad potenciada para la secreción de insulina cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas. Dichos animales no humanos pueden tener una mayor secreción de insulina con relación al animal no humano sin la mutación cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas, en donde el aumento de la secreción de insulina está asociado con un aumento de la proliferación de células beta o de la masa de células beta con relación a los animales no humanos sin la mutación. El aumento de la proliferación de células beta puede ser dependiente del receptor de insulina (por ejemplo, dependiente de un receptor de insulina en las células beta). Como otro ejemplo, los animales no humanos pueden tener una capacidad potenciada para la secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia, tal como la hiperglucemia grave. Dichos animales no humanos pueden tener una mayor secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina con relación al animal no humano sin la mutación. Por ejemplo, dichos animales no humanos pueden tener una mayor secreción de insulina con relación al animal no humano sin la mutación en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina, en donde el aumento de la secreción de insulina no está asociado con un aumento de la proliferación de células beta o de la masa de células beta con relación al animal no humano sin la mutación. El aumento de la secreción de insulina en comparación con los animales no humanos sin la mutación puede ser de al menos aproximadamente 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 % o 50 %. Por ejemplo, los animales no humanos pueden tener una mayor secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina, tal como la hiperglucemia provocada por el antagonista del receptor de insulina S961. En algunos animales no humanos, este efecto no está asociado con un aumento de la proliferación de células beta o un aumento de la masa de células beta. En algunos animales no humanos, el aumento de la insulina plasmática no es el resultado de uno, más o todos los siguientes: procesamiento mejorado de la proinsulina, disminución de la eliminación de insulina, aumento de la proliferación de células beta, aumento de la masa de islotes, aumento de la masa de células beta, aumento de la masa de células alfa o agotamiento de la insulina en las células beta.

En comparación con los animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado pueden tener una expresión génica mitocondrial disminuida (por ejemplo, disminución en la expresión de genes en el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS). Los ejemplos de dichos genes se describen con más detalle en el Ejemplo 2 y en las Tablas 7-9. En comparación con los animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado pueden tener una expresión aumentada de Hvcn1 (canal 1 dependiente de voltaje de hidrógeno o canal 1 de hidrógeno dependiente de voltaje).

En comparación con animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado pueden tener pérdida de acumulación de zinc en los islotes.

En comparación con los animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado también pueden tener una o más o todas las siguientes características cuando se alimentan con una dieta de alimento balanceado de control: no difieren en el peso corporal, la glucosa en sangre, la insulina o los niveles de péptido C (alimentados o en ayunas); ningún cambio en los niveles de proinsulina con alimentos; podrían tener los niveles de proinsulina en ayunas disminuidos; ningún cambio en la relación proinsulina/insulina (alimentados o en ayunas); tienen una mayor relación péptido C/insulina con alimentos; ningún cambio en la relación péptido C/insulina en ayunas; y ningún cambio en la tolerancia a la glucosa o la secreción de insulina inducida por glucosa.

En comparación con los animales no humanos sin la mutación (por ejemplo, animales no humanos de tipo silvestre), los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado también pueden tener una o más o todas las siguientes características cuando se les alimenta con una dieta con alto contenido de grasas: ningún cambio en la glucosa en sangre alimentados o en ayunas; tienen niveles de insulina circulante aumentados con alimentos; ningún cambio en los niveles de insulina circulante en ayunas; ningún cambio en los niveles de proinsulina con alimentos; tienen los niveles de proinsulina en ayunas disminuidos; tienen los niveles de péptido C circulante aumentado con alimentos; ningún cambio en los niveles de péptido C circulante en ayunas; tienen una relación proinsulina/insulina reducida (alimentados y en ayunas); ningún cambio en la relación péptido C/insulina; tienen un aumento del área positiva a insulina en el páncreas; tienen un aumento del número de islotes por área de páncreas; tienen un aumento de la proliferación de células beta; y tienen un aumento del número de células beta productoras de insulina. Además, en comparación con los animales no humanos sin la mutación, los animales no humanos con un locus Slc30a8 mutado pueden tener niveles de insulina plasmáticos aumentados después del bloqueo del receptor de insulina (por ejemplo, mediante el uso de S961).

Un locus Slc30a8 mutado descrito en la presente descripción puede ser un locus Slc30a8 que codifica una proteína SLC30A8 truncada (es decir, variantes de proteína truncada). La mutación que provoca el truncamiento puede ser, por ejemplo, una mutación de desplazamiento de marco, una mutación sin sentido, una mutación del sitio de empalme o un codón iniciador SNV. Ver, por ejemplo, Flannick y otros (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363. Una mutación sin sentido es una mutación en la que un codón con sentido que corresponde a uno de los veinte aminoácidos especificados por el código genético se cambia a un codón de terminación de cadena (es decir, codón de terminación o codón de parada). Una mutación de desplazamiento de marco surge cuando la secuencia normal de codones se interrumpe por la inserción o eliminación de uno o más nucleótidos, siempre y cuando el número de nucleótidos añadidos o eliminados no sea un múltiplo de tres. Una mutación de desplazamiento de marco es un cambio de secuencia entre el codón de iniciación de la traducción (codón de inicio) y el codón de terminación (codón de parada) en el que, en comparación con una secuencia de referencia, la traducción se desplaza a otro marco. Por ejemplo, el marco de lectura puede desplazarse un nucleótido en la dirección 5' (desplazamiento de marco -1) o un nucleótido en la dirección 3' (desplazamiento de marco 1). Una proteína codificada por un gen con una mutación de desplazamiento de marco será idéntica a la proteína codificada por el gen de tipo silvestre desde el extremo N terminal hasta la mutación de desplazamiento de marco, pero diferente más allá de ese punto. Dichos desplazamientos de marco pueden dar como resultado un codón de terminación prematura. Una mutación en el sitio de empalme puede dar como resultado, por ejemplo, la omisión de un exón y, potencialmente, un desplazamiento de marco posterior que da como resultado un codón de terminación prematura. En un ejemplo, un locus Slc30a8 mutado descrito en la presente descripción puede ser un locus Slc30a8 en el que el gen Slc30a8 tiene un codón de terminación prematura (es decir, un codón de parada). En un ejemplo específico, la mutación comprende, consiste esencialmente en o consiste en una mutación sin sentido.

La mutación puede estar en cualquier lugar dentro del locus Slc30a8. Por ejemplo, la mutación puede estar en el primer exón, el segundo exón, el tercer exón, el cuarto exón, el quinto exón, el sexto exón, el séptimo exón o el octavo exón del gen Slc30a8. De manera similar, la mutación puede estar en una región del gen Slc30a8 correspondiente al primer, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo u octavo exón del gen SLC30A8 humano cuando está óptimamente alineada con el gen SLC30A8 humano. En un ejemplo específico, la mutación está en el tercer exón del gen Slc30a8 o en una región del gen Slc30a8 correspondiente al tercer exón del gen SLC30A8 humano cuando está óptimamente alineada con el gen SLC30A8 humano. De acuerdo con la presente invención, la mutación está en el extremo 3' del tercer exón del gen Slc30a8 o en una región del gen Slc30a8 correspondiente al extremo 3' del tercer exón del gen SLC30A8 humano cuando está óptimamente alineada con el gen SLC30A8 humano.

En un ejemplo, la mutación está en un residuo que corresponde al residuo 412 de la secuencia codificante (CDS) de SLC30A8 humano expuesta en la SEQ ID NO: 21 (es decir, residuo c.412, número de acceso del transcrito NM_173851) cuando la secuencia codificante del gen Slc30a8 mutado está óptimamente alineada con la SEQ ID NO: 21. Alternativamente, la mutación está en un residuo dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos del residuo 412 de la secuencia codificante del SLC30A8 humano expuesta en la SEQ ID NO: 21 (es decir, residuo c.412, número de acceso del transcrito NM_173851) cuando la secuencia codificante del gen Slc30a8 mutado está óptimamente alineada con la SEQ ID NO: 21.

En otro ejemplo, la mutación se encuentra en un residuo que corresponde al residuo 409 de la secuencia codificante (CDS) de Slc30a8 de ratón expuesta en la SEQ ID NO: 20 (es decir, residuo c.409, número de acceso del transcrito NM_173851.2) cuando la secuencia codificante del gen Slc30a8 mutado está óptimamente alineada con la SEQ ID NO: 20. Alternativamente, la mutación está en un residuo dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 o 500 nucleótidos del residuo 409 de la secuencia codificante de Slc30a8 de ratón expuesta en la SEQ ID NO: 20 (es decir, residuo c.409, número de acceso del transcrito NM_173851.2) cuando la secuencia codificante del gen Slc30a8 mutado se alinea de manera óptima con SEQ ID NO: 20.

En otro ejemplo, la mutación da como resultado un codón de parada en un codón correspondiente al residuo 138 en la proteína SLC30A8 humana expuesta en la SEQ ID NO: 14 (es decir, el aminoácido 138 en el número de acceso Q8IWU4.2 de UniProt) cuando está óptimamente alineada con la SEQ ID NO: 14. Alternativamente, el codón de parada corresponde a un codón dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 aminoácidos del residuo 138 en la proteína SLC30A8 humana expuesta en la SEQ ID NO: 14 (es decir, aminoácido 138 en el número de acceso Q8IWU4.2 de UniProt) cuando está óptimamente alineada con la SEQ ID NO: 14.

En otro ejemplo, la mutación da como resultado un codón de parada en un codón correspondiente al residuo 137 en la proteína SLC30A8 de ratón expuesta en la SEQ ID NO: 12 (es decir, el aminoácido 137 en el número de acceso Q8BGG0.1 de UniProt) cuando está óptimamente alineada con la SEQ ID NO: 12. Alternativamente, el codón de parada corresponde a un codón dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 o 250 aminoácidos del residuo 137 en la proteína SLC30A8 de ratón expuesta en la SEQ ID NO: 12 (es decir, aminoácido 137 en el número de acceso Q8BGG0.1 de UniProt) cuando está óptimamente alineada con la SEQ ID NO: 12.

De acuerdo con la presente invención, el locus Slc30a8 mutado es endógeno para el animal no humano. En un ejemplo específico, el locus Slc30a8 mutado codifica un ARNm (ADNc) que comprende, consiste esencialmente en, o consiste en una secuencia que es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 18. La secuencia codificante del locus SLC30A8 mutado puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia que es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 22 o degeneraciones de la misma que codifican la misma secuencia de aminoácidos. La proteína SLC30A8 resultante codificada por el locus SLC30A8 mutado puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en una secuencia que es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la SEQ ID NO: 13.

Opcionalmente, un locus SLC30A8 mutado puede comprender otros elementos exógenos o heterólogos. Los ejemplos de dichos elementos pueden incluir casetes de selección, genes indicadores, sitios de reconocimiento de recombinasa u otros elementos. Como ejemplo, un locus SLC30A8 mutado puede comprender un casete de selección extraíble (por ejemplo, un casete de selección de autoeliminación) flanqueado por secuencias de reconocimiento de recombinasa (por ejemplo, sitios loxP). Alternativamente, el locus SLC30A8 mutado puede carecer de otros elementos (por ejemplo, puede carecer de un casete de selección y/o puede carecer de un gen indicador). Los ejemplos de genes indicadores y proteínas indicadoras adecuados se describen en otra parte en la presente descripción. Los ejemplos de marcadores de selección adecuados incluyen neomicina fosfotransferasa (neor), higromicina B fosfotransferasa (hygr), puromicina-N-acetiltransferasa (puror), blasticidina S desaminasa (bsrr), xantina/guanina fosforribosil transferasa (gpt) y timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-k). Los ejemplos de recombinasas incluyen las recombinasas Cre, Flp y Dre. Un ejemplo de un gen de recombinasa Cre es Crei, en el que dos exones que codifican la recombinasa Cre están separados por un intrón para evitar su expresión en una célula procariota. Dichas recombinasas pueden comprender además una señal de localización nuclear para facilitar la localización en el núcleo (por ejemplo, NLS-Crei). Los sitios de reconocimiento de recombinasa incluyen secuencias de nucleótidos que son reconocidas por una recombinasa específica de sitio y pueden servir como sustrato para un evento de recombinación. Los ejemplos de sitios de reconocimiento de recombinasa incluyen FRT, FRT11, FrT71, attp, att, rox y sitios lox tales como loxP, lox511, lox2272, lox66, lox71, loxM2 y lox5171.

Otros elementos, tales como genes indicadores o casetes de selección, pueden ser casetes de autoeliminación flanqueados por sitios de reconocimiento de recombinasa. Ver, por ejemplo, los documentos US 8,697,851 y US 2013/0312129. Como ejemplo, el casete de autoeliminación puede comprender un gen Crei (comprende dos exones que codifican una recombinasa Cre, que están separados por un intrón) unido operativamente a un promotor Prml de ratón y a un gen de resistencia a la neomicina unido operativamente a un promotor de ubiquitina humana. Mediante el empleo del promotor Prml, el casete de autoeliminación puede eliminarse específicamente en células germinales de animales F0 machos. El polinucleótido que codifica el marcador de selección puede estar unido operativamente a un promotor activo en una célula a la que se dirige. Los ejemplos de promotores se describen en otra parte en la presente descripción. Como otro ejemplo específico, un casete de selección de autoeliminación puede comprender una secuencia codificante del gen de resistencia a la higromicina unida operativamente a uno o más promotores (por ejemplo, promotores de ubiquitina humana y EM7) seguida de una señal de poliadenilación, seguida de una secuencia codificante Crei unida operativamente a uno o más promotores (por ejemplo, un promotor de mPrm1), seguido de otra señal de poliadenilación, en donde todo el casete está flanqueado por sitios loxP.

El locus SLC30A8 mutado puede ser también un alelo condicional. Por ejemplo, el alelo condicional puede ser un alelo multifuncional, como se describe en el documento US 2011/0104799. Por ejemplo, el alelo condicional puede comprender: (a) una secuencia activadora en orientación sentido con relación a la transcripción de un gen objetivo; (b) un casete de selección de fármacos (DSC) en orientación sentido o antisentido; (c) una secuencia de nucleótidos de interés (NSI) en orientación antisentido; y (d) un módulo condicional por inversión (COIN, que utiliza un intrón de división de exón y un módulo similar a una trampa de genes invertible) en orientación inversa. Ver, por ejemplo, el documento US 2011/0104799. El alelo condicional puede comprender además unidades recombinantes que se recombinan tras la exposición a una primera recombinasa para formar un alelo condicional que (i) carece de la secuencia de activación y la DSC; y (ii) contiene la NSI en orientación sentido y el COIN en orientación antisentido. Ver, por ejemplo, el documento US 2011/0104799.

C. Genomas de animales no humanos, células de animales no humanos y animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 mutado

Se proporcionan genomas de animales no humanos, células de animales no humanos y animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 mutado como se describe en otra parte en la presente descripción. Los genomas, células o animales no humanos pueden ser de machos o hembras. Los genomas, células o animales no humanos pueden ser heterocigotos u homocigotos para el locus Slc30a8 mutado. Un organismo diploide tiene dos alelos en cada locus genético. Cada par de alelos representa el genotipo de un locus genético específico. Los genotipos se describen como homocigotos si hay dos alelos idénticos en un locus particular y como heterocigotos si los dos alelos difieren.

Los genomas o células de animales no humanos proporcionados en la presente descripción pueden ser de cualquier animal no humano, es decir, genoma o célula de roedor que comprende un locus Slc30a8 o un locus genómico homólogo u ortólogo al locus SLC30A8 humano. Los genomas pueden ser de o las células pueden ser una célula de roedor, una célula de rata, una célula de ratón o una célula de hámster. El término "no humano" excluye los seres humanos.

Las células también pueden estar en cualquier tipo de estado indiferenciado o diferenciado. Por ejemplo, una célula puede ser una célula totipotente, una célula pluripotente (por ejemplo, una célula pluripotente humana o una célula pluripotente no humana, tal como una célula madre embrionaria de ratón (ES) o una célula ES de rata), o una célula no pluripotente. Las células totipotentes incluyen células indiferenciadas que pueden dar lugar a cualquier tipo de célula, y las células pluripotentes incluyen células indiferenciadas que poseen la capacidad de convertirse en más de un tipo de células diferenciadas. Dichas células pluripotentes y/o totipotentes pueden ser, por ejemplo, células ES o células similares a ES, tales como células madre pluripotentes inducidas (iPS). Las células ES incluyen células totipotentes o pluripotentes derivadas de embriones que son capaces de contribuir a cualquier tejido del embrión en desarrollo al introducirse en un embrión. Las células ES pueden derivarse de la masa celular interna de un blastocisto y son capaces de diferenciarse en células de cualquiera de las tres capas germinales de vertebrados (endodermo, ectodermo y mesodermo).

Las células proporcionadas en la presente descripción también pueden ser células germinales (por ejemplo, espermatozoides u ovocitos). Las células pueden ser células mitóticamente competentes o células mitóticamente inactivas, células meióticamente competentes o células meióticamente inactivas. De manera similar, las células también pueden ser células somáticas primarias o células que no son una célula somática primaria. Las células somáticas incluyen cualquier célula que no sea un gameto, una célula germinal, un gametocito o una célula madre indiferenciada. Por ejemplo, las células pueden ser células beta, células de los islotes pancreáticos o células pancreáticas.

Las células adecuadas proporcionadas en la presente descripción también incluyen células primarias. Las células primarias incluyen células o cultivos de células que se han aislado directamente de un organismo, órgano o tejido. Las células primarias incluyen células que no se transforman ni son inmortales. Incluyen cualquier célula obtenida a partir de un organismo, órgano o tejido que no se ha pasado previamente por un cultivo de tejidos o que ha pasado previamente por un cultivo de tejidos pero que no puede pasarse indefinidamente por un cultivo de tejidos. Dichas células pueden aislarse mediante técnicas convencionales e incluyen, por ejemplo, células beta.

Otras células adecuadas proporcionadas en la presente descripción incluyen células inmortalizadas. Las células inmortalizadas incluyen células de un organismo multicelular que normalmente no proliferarían indefinidamente pero, debido a mutaciones o alteraciones, han evadido la senescencia celular normal y, en cambio, pueden continuar su división. Dichas mutaciones o alteraciones pueden producirse naturalmente o ser inducidas intencionalmente. Ejemplos específicos de líneas celulares inmortalizadas son las líneas celulares EndoC-pH2, 1.1B4, 1.4E7, 1.1E7, RIN, HIT, MIN, INS-1 y PTC. Ver, por ejemplo, Scharfmann y otros (2014) J. Clin. Invest. 124(5):2087-2098 y McCluskey y otros (2011) J. Biol. Chem. 286(25):21982-21992. Son bien conocidos numerosos tipos de células inmortalizadas. Las células inmortalizadas o primarias incluyen células que se usan típicamente para cultivar o para expresar genes o proteínas recombinantes.

Las células proporcionadas en la presente descripción también incluyen embriones en etapa unicelular (es decir, ovocitos o cigotos fertilizados). Dichos embriones en etapa unicelular pueden ser de cualquier fondo genético (por ejemplo, BALB/c, C57BL/6, 129 o una combinación de los mismos para ratones), pueden ser frescos o congelados, y pueden derivarse de reproducción natural o fertilización in vitro.

Las células proporcionadas en la presente descripción pueden ser células normales, sanas, o pueden ser células enfermas o portadoras de mutantes.

Los animales no humanos que comprenden un locus Slc30a8 mutado como se describe en la presente descripción pueden generarse mediante los métodos descritos en otro lugar en la presente descripción. El término "animal" incluye cualquier miembro del reino animal, lo que incluye, por ejemplo, mamíferos, peces, reptiles, anfibios, pájaros y gusanos. En un ejemplo específico, el animal no humano es un mamífero no humano. Los mamíferos no humanos incluyen, por ejemplo, primates no humanos, monos, simios, orangutanes, gatos, perros, caballos, conejos, roedores (por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres y conejillos de Indias) y ganado (por ejemplo, especies bovinas tales como vacas y novillos; especies ovinas tales como ovejas y cabras; y especies porcinas tales como cerdos y jabalíes).

También se incluyen los animales domésticos y los animales de uso en la agricultura. El término "animal no humano" excluye a los seres humanos. De acuerdo con la presente invención, los animales no humanos son roedores, tales como ratones y ratas.

Los animales no humanos pueden ser de cualquier fondo genético. Por ejemplo, los ratones adecuados pueden ser de una cepa 129, una cepa C57BL/6, una mezcla de 129 y C57BL/6, una cepa BALB/c o una cepa Swiss Webster. Los ejemplos de cepas 129 incluyen 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1 y 129T2. Ver, por ejemplo, Festing y otros (1999) Mammalian Genome 10:836. Los ejemplos de cepas C57BL incluyen C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. Los ratones adecuados también pueden ser de una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente (por ejemplo, 50 % 129 y 50 % C57BL/6). Igualmente, los ratones adecuados pueden ser de una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente (por ejemplo, la cepa 129S6 (129/SvEvTac)).

De manera similar, las ratas pueden ser de cualquier cepa de rata, lo que incluye, por ejemplo, una cepa de ratas ACI, una cepa de ratas agutí negro (DA), una cepa de ratas Wistar, una cepa de ratas lEa , una cepa de ratas Sprague Dawley (SD), o una cepa de ratas Fischer tal como Fisher F344 o Fisher F6. Las ratas también pueden obtenerse a partir de una cepa derivada de una mezcla de dos o más cepas mencionadas anteriormente. Por ejemplo, una rata adecuada puede ser de una cepa DA o una cepa ACI. La cepa de ratas ACI se caracteriza por tener agutí negro, con vientre y patas blancas y un haplotipo RT1av1. Dichas cepas están disponibles en una variedad de fuentes, lo que incluye Harlan Laboratories. La cepa de rata agutí negro (DA) se caracteriza por tener un pelaje agutí y un haplotipo RT1av1. Dichas ratas están disponibles en una variedad de fuentes, lo que incluye Charles River y Harlan Laboratories. Algunas ratas adecuadas pueden ser de una cepa de rata endogámica. Ver, por ejemplo, el documento US 2014/0235933.

III. Métodos para generar animales no humanos que comprendan un locus Slc30a8 mutado

Se proporcionan diversos métodos para generar un genoma de animal no humano, una célula de animal no humano o un animal no humano que comprende un locus Slc30a8 mutado como se describe en otra parte en la presente descripción. Cualquier método o protocolo conveniente para producir un organismo genéticamente modificado es adecuado para producir dicho animal no humano genéticamente modificado. Ver, por ejemplo, Cho y otros (2009) Current Protocols in Cell Biology 42:19.11:19.11.1-19.11.22 y Gama Sosa y otros (2010) Brain Struct. Funct. 214(2-3):91-109. Dichos animales no humanos modificados genéticamente pueden generarse, por ejemplo, mediante la inserción de genes en un locus Slc30a8 objetivo.

Por ejemplo, el método para producir un animal no humano que comprende un locus Slc30a8 mutado, es decir, un roedor de la invención, puede comprender: (1) modificar el genoma de una célula pluripotente para que comprenda el locus Slc30a8 mutado; (2) identificar o seleccionar la célula pluripotente modificada genéticamente que comprende el locus Slc30a8 mutado; (3) introducir la célula pluripotente modificada genéticamente en un embrión del huésped animal no humano; y (4) gestar el embrión huésped implantado en una madre sustituta. Por ejemplo, el método para producir un animal no humano que comprende un locus Slc30a8 mutado puede comprender: (1) modificar el genoma de una célula pluripotente para que comprenda el locus Slc30a8 mutado; (2) identificar o seleccionar la célula pluripotente modificada genéticamente que comprende el locus Slc30a8 mutado; (3) introducir la célula pluripotente modificada genéticamente en un embrión del huésped animal no humano; y (4) gestar el embrión huésped en una madre sustituta. Opcionalmente, el embrión huésped que comprende una célula pluripotente modificada (por ejemplo, una célula E^sno humana) puede incubarse hasta la etapa de blastocisto antes de implantarse y gestarse en la madre sustituta para producir un animal no humano F0. La madre sustituta puede entonces producir un animal no humano de la generación F0 que comprenda el locus Slc30a8 mutado.

Los métodos pueden comprender además identificar una célula o un animal que tenga un locus genómico objetivo modificado (es decir, un locus Slc30a8 mutado). Pueden usarse diversos métodos para identificar células y animales que tengan una modificación genética objetivo.

La etapa de modificar el genoma puede, por ejemplo, utilizar plantillas de reparación exógenas (por ejemplo, vectores de direccionamiento) para modificar un locus Slc30a8 para que comprenda una mutación de Slc30a8 descrita en la presente descripción. Como ejemplo, el vector de direccionamiento puede ser para generar un gen Slc30a8 mutado en un locus Slc30a8 endógeno (por ejemplo, locus Slc30a8 endógeno de un animal no humano), en donde el vector de direccionamiento comprende un brazo de homología 5' dirigido a una secuencia objetivo 5' en el locus Slc30a8 endógeno y un brazo de homología 3' dirigido a una secuencia objetivo 3' en el locus Slc30a8 endógeno, en donde el vector de direccionamiento comprende una mutación en el gen Slc30a8, en donde el gen Slc30a8 mutado codifica una proteína SLC30A8 truncada. Como ejemplo específico, la mutación puede dar como resultado un codón de parada en un codón correspondiente al residuo 138 en la proteína SLC30A8 humana.

Las plantillas de reparación exógenas pueden ser para inserción mediada por unión de extremos no homólogos o recombinación homóloga. Las plantillas de reparación exógenas pueden comprender ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), pueden ser monocatenarias o bicatenarias, y pueden tener forma lineal o circular. Por ejemplo, una plantilla de reparación puede ser un oligodesoxinucleótido monocatenario (ssODN).

Las plantillas de reparación exógenas también pueden comprender insertos de ácido nucleico que incluyen segmentos de ADN a integrarse en el locus Slc30a8. La integración de un inserto de ácido nucleico en el locus Slc30a8 puede dar como resultado la adición de una secuencia de ácido nucleico de interés en el locus Slc30a8, la eliminación de una secuencia de ácido nucleico de interés en el locus Slc30a8 o el reemplazo de una secuencia de ácido nucleico de interés en el locus Slc30a8 (es decir, eliminación e inserción).

Las plantillas de reparación exógenas también pueden comprender una secuencia heteróloga que no está presente en un locus Slc30a8 endógeno no dirigido. Por ejemplo, una plantilla de reparación exógena puede comprender un casete de selección, tal como un casete de selección flanqueado por sitios de reconocimiento de recombinasa. Algunas plantillas de reparación exógenas comprenden brazos de homología. Si el ácido plantilla de reparación exógeno también comprende un inserto de ácido nucleico, los brazos de homología pueden flanquear el inserto de ácido nucleico. Para facilitar la referencia, los brazos de homología se denominan en la presente descripción como brazos de homología 5' y 3' (es decir, aguas arriba y aguas abajo). Esta terminología se refiere a la posición relativa de los brazos de homología con relación al inserto de ácido nucleico dentro de la plantilla de reparación exógena. Los brazos de homología 5' y 3' corresponden a regiones dentro del locus Slc30a8, que se denominan en la presente descripción "secuencia objetivo 5'" y "secuencia objetivo 3'", respectivamente.

Un brazo de homología y una secuencia objetivo "corresponden" o "se corresponden" entre sí cuando las dos regiones comparten un nivel suficiente de identidad de secuencia entre sí para actuar como sustratos para una reacción de recombinación homóloga. El término "homología" incluye secuencias de ADN que son idénticas o comparten identidad de secuencia con una secuencia correspondiente. La identidad de secuencia entre una secuencia objetivo dada y el brazo de homología correspondiente que se encuentra en la plantilla de reparación exógena puede ser cualquier grado de identidad de secuencia que permita que se produzca la recombinación homóloga. Por ejemplo, la cantidad de identidad de secuencia compartida por el brazo de homología de la plantilla de reparación exógena (o un fragmento de la misma) y la secuencia objetivo (o un fragmento de la misma) puede ser al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad de secuencia, de manera que las secuencias experimentan una recombinación homóloga. Además, una región de homología correspondiente entre el brazo de homología y la secuencia objetivo correspondiente puede tener cualquier longitud que sea suficiente para promover la recombinación homóloga. En algunos vectores de direccionamiento, la mutación prevista en el locus Slc30a8 se incluye en uno de los brazos de homología. En otros vectores de direccionamiento, la mutación prevista en el locus Slc30a8 se incluye en un inserto de ácido nucleico flanqueado por los brazos de homología.

En células que no sean embriones en etapa unicelular, la plantilla de reparación exógena puede ser un "vector de direccionamiento grande" o "LTVEC", lo que incluye vectores de direccionamiento que comprenden brazos de homología que corresponden y se derivan de secuencias de ácido nucleico más grandes que las usadas típicamente por otros enfoques destinados a realizar la recombinación homóloga en las células. Los LTVEC también incluyen vectores de direccionamiento que comprenden insertos de ácido nucleico que tienen secuencias de ácido nucleico más grandes que las usadas típicamente por otros enfoques destinados a realizar la recombinación homóloga en células. Por ejemplo, los LTVEC hacen posible la modificación de grandes loci que no pueden adaptarse a los vectores de direccionamiento tradicionales basados en plásmidos debido a sus limitaciones de tamaño. Por ejemplo, el locus objetivo puede ser (es decir, los brazos de homología 5' y 3' pueden corresponder a) un locus de la célula que no puede seleccionarse como objetivo mediante el uso de un método convencional o que solo puede seleccionarse como objetivo incorrectamente o solo con una eficiencia significativamente baja en la ausencia de una muesca o ruptura de doble cadena inducida por un agente de nucleasa (por ejemplo, una proteína Cas). Los LTVEC pueden tener cualquier longitud y, típicamente, tienen al menos 10 kb de longitud. La suma total del brazo de homología 5' y el brazo de homología 3' en un LTVEC es típicamente de al menos 10 kb.

La etapa de evaluación puede comprender, por ejemplo, un ensayo cuantitativo para evaluar la modificación de alelo (MOA) de un cromosoma parental. Por ejemplo, el ensayo cuantitativo puede llevarse a cabo a través de una PCR cuantitativa, tal como una PCR en tiempo real (qPCR). La PCR en tiempo real puede utilizar un primer conjunto de cebadores que reconoce el locus objetivo y un segundo conjunto de cebadores que reconoce un locus de referencia no objetivo. El conjunto de cebadores puede comprender una sonda fluorescente que reconoce la secuencia amplificada. Los ensayos de modificación de alelo (MOA) lo que incluye ensayos de pérdida de alelo (LOA) y ganancia de alelo (GOA) se describen, por ejemplo, en el documento US 2014/0178879 y Frendewey y otros (2010) Methods Enzymol. 476:295-307. También pueden usarse ensayos de retención como se describe en los documentos US 2016/0145646 y WO 2016/081923.

Otros ejemplos de ensayos cuantitativos adecuados incluyen hibridación in situ mediada por fluorescencia (FISH), hibridación genómica comparativa, amplificación isotérmica de ADN, hibridación cuantitativa con sonda(s) inmovilizada(s), sondas INVADER®, sondas TAQMAN® Molecular Beacon o tecnología de sonda ECLIPSE™ (ver, por ejemplo, el documento US 2005/0144655).

Un ejemplo de una célula pluripotente adecuada es una célula madre embrionaria (ES) (por ejemplo, una célula ES de ratón o una célula ES de rata). La célula pluripotente modificada puede generarse, por ejemplo, a través de recombinación mediante (a) introducir en la célula uno o más ácidos nucleicos donantes exógenos (por ejemplo, vectores de direccionamiento) que comprenden un inserto de ácido nucleico opcional flanqueado, por ejemplo, por brazos de homología 5' y 3' correspondientes a los sitios objetivo 5' y 3', en donde el inserto de ácido nucleico o uno de los brazos de homología comprende un locus Slc30a8 mutado o la mutación a realizar en el locus Slc30a8; y (b) identificar al menos una célula que comprende en su genoma el inserto de ácido nucleico integrado en el locus Slc30a8 endógeno. La célula pluripotente modificada puede generarse, por ejemplo, a través de recombinación mediante (a) introducir en la célula uno o más vectores de direccionamiento que comprenden un inserto de ácido nucleico flanqueado por brazos de homología 5' y 3' correspondientes a los sitios objetivo 5' y 3', en donde el inserto de ácido nucleico comprende un locus Slc30a8 mutado o la mutación a realizar en el locus Slc30a8; y (b) identificar al menos una célula que comprende en su genoma el inserto de ácido nucleico integrado en el locus Slc30a8 endógeno. Puede usarse cualquier vector de direccionamiento. En un ejemplo, se usa un vector de direccionamiento grande (LTVEC). El LTVEC puede tener, por ejemplo, al menos 10 kb de longitud o puede tener brazos de homología 5' y 3', cuya suma total es de al menos 10 kb de longitud. Como otro ejemplo, el vector de direccionamiento puede ser un oligodesoxinucleótido monocatenario (ssODN). El ssODN puede tener, por ejemplo, entre aproximadamente 80 a aproximadamente 200 nucleótidos de longitud.

Alternativamente, la célula pluripotente modificada puede generarse mediante (a) introducir en la célula: (i) un agente de nucleasa, en donde el agente de nucleasa induce una muesca o ruptura de doble cadena en un sitio de reconocimiento dentro del locus Slc30a8 endógeno; y (ii) uno o más ácidos nucleicos donantes exógenos (por ejemplo, vectores de direccionamiento) que comprenden opcionalmente un inserto de ácido nucleico flanqueado, por ejemplo, por brazos de homología 5' y 3' correspondientes a los sitios objetivo 5' y 3' localizados lo suficientemente cerca del sitio de reconocimiento, en donde el inserto de ácido nucleico o uno de los brazos de homología comprende el locus Slc30a8 mutado o la mutación a realizar en el locus Slc30a8; y (c) identificar al menos una célula que comprende una modificación (por ejemplo, integración del inserto de ácido nucleico) en el locus Slc30a8 endógeno. Alternativamente, la célula pluripotente modificada puede generarse mediante (a) introducir en la célula: (i) un agente de nucleasa, en donde el agente de nucleasa induce una muesca o ruptura de doble cadena en un sitio de reconocimiento dentro del locus Slc30a8 endógeno; y (ii) uno o más vectores de direccionamiento que comprenden un inserto de ácido nucleico flanqueado por brazos de homología 5' y 3' correspondientes a los sitios objetivo 5' y 3' localizados lo suficientemente cerca del sitio de reconocimiento, en donde el inserto de ácido nucleico comprende el locus Slc30a8 mutado o la mutación a realizar en el locus Slc30a8; y (c) identificar al menos una célula que comprende una modificación (por ejemplo, integración del inserto de ácido nucleico) en el locus Slc30a8 endógeno. Puede usarse cualquier agente de nucleasa que induzca una muesca o ruptura de doble cadena en un sitio de reconocimiento deseado. Los ejemplos de nucleasas adecuadas incluyen una nucleasa efectora similar a un activador de la transcripción (TALEN), una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), una meganucleasa y sistemas de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente intercaladas (CRISPR)/asociadas a CRISPR (Cas) (por ejemplo, sistemas CRISPR/Cas9) o componentes de dichos sistemas (por ejemplo, CRISPR/Cas9). Ver, por ejemplo, los documentos US 2013/0309670 y US 2015/0159175. Se describen ejemplos de métodos adecuados para realizar modificaciones dirigidas a las células, por ejemplo, en los documentos US 2016/0145646 y WO 2016/081923.

La célula donante puede introducirse en un embrión huésped en cualquier etapa, tal como la etapa de blastocisto o la etapa de premórula (es decir, la etapa de 4 células o la etapa de 8 células). Se genera descendencia que es capaz de transmitir la modificación genética a través de la línea germinal. Ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 7,294,754.

Alternativamente, el método para producir los animales no humanos descritos en otra parte en la presente descripción puede comprender: (1) modificar el genoma de un embrión en etapa unicelular de modo que comprenda el locus Slc30a8 mutado mediante el uso de los métodos descritos anteriormente para modificar células pluripotentes; (2) seleccionar el embrión modificado genéticamente; y (3) gestar el embrión genéticamente modificado implantado en una madre sustituta. Alternativamente, el método para producir los animales no humanos descritos en otra parte en la presente descripción puede comprender: (1) modificar el genoma de un embrión en etapa unicelular de modo que comprenda el locus Slc30a8 mutado mediante el uso de los métodos descritos anteriormente para modificar células pluripotentes; (2) seleccionar el embrión modificado genéticamente; y (3) gestar el embrión genéticamente modificado en una madre sustituta. Se genera descendencia que es capaz de transmitir la modificación genética a través de la línea germinal.

También se describen técnicas de transferencia nuclear que también pueden usarse para generar animales no humanos. Brevemente, los métodos para la transferencia nuclear pueden incluir las etapas de: (1) enuclear un ovocito o proporcionar un ovocito enucleado; (2) aislar o proporcionar una célula o núcleo donante para combinarlo con el ovocito enucleado; (3) insertar la célula o el núcleo en el ovocito enucleado para formar una célula reconstituida; (4) implantar la célula reconstituida en el útero de un animal para formar un embrión; y (5) permitir que el embrión se desarrolle. En dichos métodos, los ovocitos se recuperan generalmente de animales muertos, aunque también pueden aislarse de oviductos y/u ovarios de animales vivos. Los ovocitos pueden madurarse en una variedad de medios bien conocidos antes de la enucleación. La enucleación del ovocito puede realizarse de varias maneras bien conocidas. La inserción de la célula o el núcleo donante en el ovocito enucleado para formar una célula reconstituida puede realizarse mediante microinyección de una célula donante debajo de la zona pelúcida antes de la fusión. La fusión puede inducirse mediante la aplicación de un pulso eléctrico de CD a través del plano de contacto/fusión (electrofusión), mediante la exposición de las células a sustancias químicas que promueven la fusión, tal como el polietilenglicol, o mediante un virus inactivado, tal como el virus Sendai. Una célula reconstituida puede activarse por medios eléctricos y/o no eléctricos antes, durante y/o después de la fusión del núcleo donante y el ovocito receptor. Los métodos de activación incluyen pulsos eléctricos, choques inducidos químicamente, penetración de espermatozoides, niveles crecientes de cationes divalentes en el ovocito y reducción de la fosforilación de proteínas celulares (por medio de inhibidores de quinasa) en el ovocito. Las células reconstituidas activadas, o embriones, pueden cultivarse en medios bien conocidos y después transferirse al útero de un animal. Ver, por ejemplo, los documentos US 2008/0092249, WO 1999/005266, US 2004/0177390, WO 2008/017234, y la patente de los Estados Unidos núm. 7,612,250.

Los diversos métodos proporcionados en la presente descripción permiten la generación de un animal F0 no humano modificado genéticamente en donde las células del animal F0 modificado genéticamente comprenden el locus Slc30a8 mutado. En dependencia del método usado para generar el animal F0, variará el número de células dentro del animal F0 que tienen el locus Slc30a8 mutado. La introducción de las células ES donantes en un embrión en etapa premórula de un organismo correspondiente (por ejemplo, un embrión de ratón en etapa de 8 células) a través de, por ejemplo, el método VELOCIMOUSE®, permite que un mayor porcentaje de la población celular del animal F0 comprenda células que tengan la secuencia de nucleótidos de interés que comprende la modificación genética dirigida. Por ejemplo, al menos 50 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 85 %, 86 %, 87 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de la contribución celular del animal F0 no humano puede comprender una población celular que tenga la modificación objetivo.

Las células del animal F0 modificado genéticamente pueden ser heterocigotas para el locus Slc30a8 mutado o pueden ser homocigotas para el locus Slc30a8 mutado.

IV. Métodos de evaluación de compuestos

Los animales no humanos, es decir, los roedores que tienen los loci Slc30a8 mutados descritos en la presente descripción, pueden usarse para evaluar compuestos por su actividad potencialmente útil para inhibir, mejorar o reducir la diabetes tipo 2 o mejorar los síntomas similares a la diabetes tipo 2 o para evaluar compuestos por su actividad potencialmente dañina de promover o exacerbar la diabetes tipo 2 o los síntomas similares a la diabetes tipo 2. Los animales no humanos de tipo silvestre o los animales no humanos que no tienen los loci Slc30a8 mutados descritos en la presente descripción también pueden usarse para evaluar compuestos por su actividad potencialmente útil para inhibir, mejorar o reducir la diabetes tipo 2 o mejorar síntomas similares a la diabetes tipo 2 o para evaluar compuestos por su actividad potencialmente dañina de promover o exacerbar la diabetes tipo 2 o los síntomas similares a la diabetes tipo 2 mediante el monitoreo de aspectos fenotípicos asociados con los loci Slc30a8 mutados protectores descritos en la presente descripción. Los compuestos que tienen actividad para inhibir, mejorar o reducir la diabetes tipo 2 o mejorar los síntomas similares a la diabetes tipo 2 son potencialmente útiles como agentes terapéuticos o profilácticos contra la diabetes tipo 2. Los compuestos que tienen actividad para promover o exacerbar la diabetes tipo 2 o los síntomas similares a la diabetes tipo 2 se identifican como tóxicos y deben evitarse como productos terapéuticos o en otras circunstancias en las que puedan entrar en contacto con seres humanos (por ejemplo, en alimentos, agricultura, construcción, o suministro de agua).

Los ejemplos de compuestos que pueden evaluarse incluyen anticuerpos, proteínas de unión a antígeno, proteínas de unión a ADN específicas de sitio (por ejemplo, complejos CRISPR-Cas), polipéptidos, miméticos de giro beta, polisacáridos, fosfolípidos, hormonas, prostaglandinas, esteroides, compuestos aromáticos, compuestos heterocíclicos, benzodiazepinas, glicinas oligoméricas N-sustituidas y oligocarbamatos. Pueden construirse grandes bibliotecas combinatorias de los compuestos mediante el método de bibliotecas sintéticas codificadas (ESL) descrito en los documentos WO 1995/012608, WO 1993/006121, WO 1994/008051, WO 1995/035503 y WO 1995/030642. Las bibliotecas de péptidos pueden generarse también mediante métodos de presentación de fagos. Ver, por ejemplo, el documento US 5,432,018. El uso de bibliotecas de ARN guía para dirigir los sistemas CRISPR-Cas a diferentes genes se describe, por ejemplo, en los documentos WO 2014/204727, WO 2014/093701, WO 2015/065964 y WO 2016/011080.

Los ensayos basados en animales implican generalmente la administración de un compuesto al animal no humano que comprende el locus Slc30a8 mutado y la evaluación de signos o síntomas muy parecidos a los de la diabetes tipo 2, signos o síntomas relacionados con la diabetes tipo 2 o aspectos fenotípicos relacionados con la glucosa, la insulina, el metabolismo de la glucosa o diabetes tipo 2 en humanos para determinar cambios en la respuesta. El cambio puede evaluarse antes y después de poner en contacto al animal no humano con el compuesto o al realizar un experimento de control realizado con un animal de control que tenga la misma mutación de Slc30a8 (por ejemplo, hermano de la cohorte de tipo silvestre) sin el compuesto.

Los aspectos fenotípicos adecuados que pueden monitorearse incluyen, por ejemplo, la capacidad para secretar insulina. Por ejemplo, puede monitorearse la capacidad de secretar insulina cuando se alimenta con una dieta con alto contenido de grasas. Como alternativa, puede monitorearse la capacidad de secretar insulina en respuesta a la hiperglucemia, tal como una hiperglucemia grave. Por ejemplo, la secreción de insulina puede ser en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina, tal como la hiperglucemia provocada por el antagonista del receptor de insulina S961.

Otros aspectos fenotípicos adecuados que pueden monitorearse incluyen la expresión génica mitocondrial (por ejemplo, la expresión de genes en el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS)) o la expresión de Hvcn1. Los ejemplos de dichos genes mitocondriales se describen con más detalle en el Ejemplo 2 y en las Tablas 6-8. Otros aspectos fenotípicos adecuados que pueden monitorearse incluyen la relación insulina/péptido C cuando se alimentan con una dieta de alimento balanceado de control o la eliminación de insulina. Otros aspectos fenotípicos adecuados que pueden monitorearse incluyen la acumulación de zinc en los islotes.

Otros aspectos fenotípicos adecuados que pueden monitorearse incluyen, por ejemplo, (1) la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas (por ejemplo, niveles de insulina circulante después de 20 semanas de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas); (2) los niveles de proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas (por ejemplo, después de 20 semanas de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas); (3) el número de células beta pancreáticas cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas (por ejemplo, después de 20 semanas de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas); y (4) niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina (por ejemplo, mediante el uso de S961). Alternativa o adicionalmente, los aspectos fenotípicos adecuados que pueden monitorearse incluyen, por ejemplo, la relación proinsulina/insulina cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas o el procesamiento de insulina y la salud de las células beta pancreáticas.

Por ejemplo, la actividad para exacerbar la diabetes tipo 2 puede identificarse mediante uno o ambos de: (1) disminución de la capacidad para secretar insulina (por ejemplo, cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas o en respuesta a la hiperglucemia) o (2) reducción de la eliminación de insulina (por ejemplo, aumento de la relación insulina/péptido C cuando se alimentan con una dieta de alimento balanceado de control). La actividad para exacerbar la diabetes tipo 2 también puede identificarse mediante uno o ambos de (1) aumento de la expresión génica mitocondrial (por ejemplo, expresión de genes en el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS)) o (2) disminución en la expresión de Hvcn1.

La actividad para exacerbar la diabetes tipo 2 también puede identificarse mediante uno o más o todos de: (1) disminución de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas (por ejemplo, disminución de los niveles de insulina circulante después de 20 semanas de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas) (2) disminución de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas (por ejemplo, después de 20 semanas de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas); (3) disminución del número de células beta pancreáticas cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas (por ejemplo, después de 20 semanas de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas); y (4) disminución de los niveles de insulina plasmática después del bloqueo del receptor de insulina. Alternativa o adicionalmente, la actividad para exacerbar la diabetes tipo 2 puede identificarse mediante uno o más o todos de aumento en la relación proinsulina/insulina y el empeoramiento del procesamiento de la insulina y la salud de las células beta pancreáticas (por ejemplo, como lo evidencia el aumento de la relación proinsulina/insulina cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas).

Alternativamente, la actividad para mejorar la diabetes tipo 2 puede identificarse mediante uno o ambos de: (1) aumento de la capacidad para secretar insulina (por ejemplo, cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas o en respuesta a la hiperglucemia) o (2) aumento de la eliminación de insulina (por ejemplo, aumento de la relación insulina/péptido C cuando se alimentan con una dieta de alimento balanceado de control). La actividad para exacerbar la diabetes tipo 2 también puede identificarse mediante uno o ambos de: (1) disminución de la expresión génica mitocondrial (por ejemplo, expresión de genes en el sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS)) o (2) aumento de la expresión de Hvcn1.

La actividad para mejorar la diabetes tipo 2 también puede identificarse mediante uno o más o todos de (1) aumento de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas (por ejemplo, aumento de los niveles de insulina circulante después de 20 semanas de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas); (2) aumento de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas (por ejemplo, después de 20 semanas de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas); (3) aumento del número de células beta pancreáticas cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas (por ejemplo, después de 20 semanas de alimentación con una dieta con alto contenido de grasas); y (4) aumento de los niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina. Alternativa o adicionalmente, la actividad para mejorar la diabetes tipo 2 puede identificarse mediante uno o más o todos de reducción de la relación proinsulina/insulina y la mejora del procesamiento de insulina y la salud de las células beta pancreáticas (por ejemplo, como se evidencia por la disminución de la relación proinsulina/insulina cuando se alimentan con una dieta con alto contenido de grasas).

Dichos aspectos fenotípicos pueden evaluarse como se describe en los ejemplos proporcionados en la presente descripción. La disminución o el aumento pueden ser estadísticamente significativos. Por ejemplo, la disminución o el aumento pueden ser al menos aproximadamente el 1 %, al menos aproximadamente el 2 %, al menos aproximadamente el 3 %, al menos aproximadamente el 4 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o el 100 %.

Si se asocian diferentes versiones de una secuencia con un número de acceso en diferentes momentos, se entiende la versión asociada con el número de acceso en la fecha de presentación efectiva de esta solicitud. La fecha de presentación efectiva se refiere a la fecha de presentación anterior de la fecha de presentación concreta o la fecha de presentación de una solicitud de prioridad que se refiere al número de acceso, si es aplicable. Igualmente, si se publican diferentes versiones de una publicación, sitio web o similares en diferentes momentos, se entiende la versión más recientemente publicada en la fecha de presentación efectiva de la solicitud, a menos que se indique de cualquier otra manera. Cualquier característica, etapa, elemento, modalidad o aspecto de la invención puede usarse en combinación con cualquier otro a menos que se indique específicamente de cualquier otra manera. La presente invención se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad y comprensión. Breve descripción de las secuencias

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos enumeradas en el listado de secuencias adjunto se muestran mediante el uso de abreviaturas de letras estándar para las bases de nucleótidos y un código de tres letras para los aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos siguen la convención estándar de comenzar en el extremo 5' de la secuencia y avanzar (es decir, de izquierda a derecha en cada línea) hasta el extremo 3'. Solo se muestra una cadena de cada secuencia de nucleótidos, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por cualquier referencia a la cadena mostrada. Cuando se proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos, se entiende que también se proporcionan variantes de codones degenerados de la misma que codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos siguen la convención estándar de comenzar en el extremo amino de la secuencia y avanzar (es decir, de izquierda a derecha en cada línea) hasta el extremo carboxi.

Tabla 2. Descripción de Secuencias.

Ejemplos

Ejemplo 1. Generación de ratones que comprenden un locus Slc30a8 mutado

Para generar un modelo de ratón que porta un alelo correspondiente al alelo con LOF supuesta de SLC30A8 humano (c.412C>T (número de acceso del transcrito NM_173851.2), p.Arg138X), se generó un alelo Slc30a8 de ratón mutado (c.409C>T (número de acceso del transcrito NM_172816.3), p.Arg137X). La información sobre los genes Slc30a8 de ratón y SLC30A8 humano se proporciona en la Tabla 3. En la Figura 11 se muestra un alineamiento de las proteínas SLC30A8 humana y SLC30A8 de ratón. El alelo mutado tiene un reemplazo de dC por dT (c.409C>T) en el codón Slc30a8 de ratón que codifica R137 en el exón 3, lo que cambia el codón de CGA a TGA (p.Arg137X), lo que genera un codón de parada que se espera que produzca una proteína truncada. El alelo mutado también tiene un casete de selección de neomicina de autoeliminación flanqueado por sitios loxP (casete loxP-mPrm1-Crei-hUb1-em7-Neo-pA-loxP (4810 pb)) insertado en el intrón 3, lo que elimina 29 pb de la secuencia del intrón endógeno 3. El locus Slc30a8 endógeno se muestra en la Figura 10A, y el locus Slc30a8 objetivo se muestra en la Figura 10B. La secuencia esperada para la región que incluye los límites de intrón 2 Slc30a8 / exón 3 Slc30a8 pArg137* / intrón 3 Slc30a8 (indicado por la línea horizontal "A" en la Figura 10B) se expone en la SEQ ID NO: 8. La secuencia esperada para la región que incluye los límites del casete de autoeliminación de intrón 3 Slc30a8 / Xhol / (loxP) (indicado por la línea horizontal "B" en la Figura 10B) se expone en la SEQ ID NO: 9. La secuencia esperada para la región que incluye los límites del casete de autoeliminación (loxP) / ICEUI / NheI / intrón 3 Slc30a8 (indicado por la línea horizontal "C" en la Figura 10B) se expone en la SEQ ID NO: 10.

Tabla 3. Slc30a8 de ratón y SLC30A8 humano.

El locus Slc30a8 objetivo después de la eliminación del casete loxP-mPrm1-Crei-hUb1-em7-Neo-pA-loxP de autoeliminación se muestra en la Figura 10C. Después de la eliminación del casete, los sitios de clonación y loxP (77 pb) permanecen en el intrón 3 de Slc30a8. La secuencia esperada para la región que incluye los límites de intrón 2 Slc30a8 / exón 3 Slc30a8 pArg137* / intrón 3 Slc30a8 (indicado por la línea horizontal "A" en la Figura 10C) se expone en la SEQ ID NO: 8. La secuencia esperada para la región que incluye los límites de intrón 3 Slc30a8 / Xhol / loxP / ICEUI / Nhel / intrón 3 Slc30a8 (indicado por la línea horizontal "B" en la Figura 10C) se expone en la SEQ ID NO: 11.

Se generó un vector de direccionamiento grande que comprende un brazo de homología 5' que incluye 62 kb de secuencia (pero con la mutación puntual en el codón Slc30a8 de ratón que codifica R137) aguas arriba de la región en Slc30a8 objetivo para la eliminación y 136 kb de la secuencia aguas abajo de la región en Slc30a8 objetivo para la eliminación. El vector de direccionamiento grande se diseñó para introducir una mutación puntual en el codón Slc30a8 de ratón en el exón 3 que codifica R137 y para reemplazar la región de 29 pb en el intrón 3 con el casete de selección de neomicina de autoeliminación de 4810 pb. Ver la Figura 10B. El casete de selección de neomicina de autoeliminación incluía los siguientes componentes de 5' a 3': sitio loxP, promotor de protamina de ratón (Prm1), Crei (secuencia codificante Cre optimizada para incluir intrón), promotor de ubiquitina humana, promotor de EM7, secuencia codificante de neomicina fosfotransferasa (neor), poliA y sitio loxP. Para generar el alelo objetivo, los componentes CRISPR/Cas9 se introdujeron en células madre embrionarias de ratón F1H4 junto con el vector de direccionamiento grande. Se realizaron ensayos TAQMAN® de pérdida de alelo y ensayos específicos de alelo mediante el uso de los cebadores y sondas expuestos en la Tabla 4 para confirmar la modificación correcta del alelo Slc30a8. Los ensayos de pérdida de alelo se indican como "8084 TD" (ensayo aguas abajo TAQMAN®) y los ensayos específicos de alelo se indican como "8084 AS" (ensayo específico de alelo) en la Figura 10A. Dichos ensayos se describen, por ejemplo, en los documentos US 2014/0178879; US 2016/0145646; WO 2016/081923; y Frendewey y otros (2010) Methods Enzymol. 476:295-307.

Tabla 4. Ensayos para la detección del locus Slc30a8 objetivo.

A continuación, se generaron ratones F0 a partir de clones de células ES objetivo mediante el uso del método VELOCIMOUSE®. Ver, por ejemplo, los documentos US 7,576,259; US 7,659,442; US 7,294,754; US 2008/007800; y Poueymirou y otros (2007) Nature Biotech. 25(1):91-99.

La secuencia de la proteína SLC30A8 esperada expresada a partir del locus de ratón de tipo silvestre se expone en la SEQ ID NO: 12. La secuencia de la proteína SLC30A8 truncada esperada expresada a partir del locus de ratón objetivo (SLC30A8 Arg137*) se expone en la SEQ ID NO: 13. En la Figura 11 se muestra un alineamiento de las dos secuencias.

Ejemplo 2. Caracterización de ratones SLC30A8 R138X.

Resumen

SLC30A8 codifica un transportador de zinc que se expresa principalmente en los islotes pancreáticos de Langerhans. En las células beta, transporta zinc a los gránulos secretores que contienen insulina. Las mutaciones de pérdida de función (LOF) en SLC30A8 protegen contra la diabetes tipo 2 en seres humanos. Se han caracterizado varias líneas de ratones con inactivación de Slc30a8 pero no recapitulan completamente el fenotipo humano. De hecho, los ratones con deficiencia de Slc30a8 tienen niveles reducidos de insulina plasmática y tolerancia a la glucosa alterada, un fenotipo que replicamos aquí en ratones de control con deficiencia de Slc30a8. Generamos un modelo de ratón con inserción de genes que porta una mutación en el locus Slc30a8 de ratón (c.409C>T (número de acceso del transcrito NM_172816.3), p.Arg137X) correspondiente a la mutación LOF supuesta de SLC30A8 humano, R138X. Aunque la mutación en el gen Slc30a8 de ratón está en el codón que codifica el residuo de aminoácido 137 de la proteína SLC30A8 de ratón, estos ratones se denominan en la presente descripción "ratones R138X" en referencia a la mutación humana correspondiente. Curiosamente, los ratones R138X tuvieron un aumento de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimentaron con una dieta con alto contenido de grasas. Esto se asoció con un aumento de la proliferación de células beta y la expansión del área de células beta. Es importante destacar que los ratones heterocigotos R138X mostraron un aumento similar en la secreción de insulina inducida por glucosa. Por el contrario, los ratones R138X alimentados con alimento balanceado tuvieron un peso corporal, tolerancia a la glucosa y masa de células beta pancreáticas normal. Curiosamente, en condiciones hiperglucémicas inducidas por el antagonista del receptor de insulina S961, los ratones R138X mostraron un aumento de aproximadamente el 50 % en la secreción de insulina. Este efecto no se asoció con un aumento de la proliferación de células beta o de la masa de células beta. Estos datos sugieren que la mutación R138X en SLC30A8 en humanos protege contra la diabetes tipo 2 en parte al aumentar la capacidad de las células beta de secretar insulina. Esto puede estar mediado en parte por un aumento del número de células beta pancreáticas.

Introducción

SLC30A8 es un transportador de zinc (ZnT8) localizado en las células de los islotes del páncreas endocrino. En las células beta, SLC30A8 transporta zinc a los gránulos que contienen insulina. Dos iones de zinc se unen y estabilizan una forma hexamérica de insulina que desencadena la cristalización de la insulina. Ver, por ejemplo, Dodson y Steiner (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8(2):189-194. Si bien la pérdida de SLC30A8 de los islotes disminuye sustancialmente el contenido de zinc de los islotes y la cristalización de insulina, sus efectos sobre el procesamiento de proinsulina, la secreción y la regulación del metabolismo de la glucosa aún no están claros. Ver, por ejemplo, Lemaire y otros (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 106(35): 14872-14877 y Nicolson y otros (2009) Diabetes 58(9):2070-2083. Varios grupos han generado modelos de ratones con inactivación (KO) de Slc30a8, ya sea globalmente o restringido a las células beta pancreáticas. El fenotipo metabólico observado de estos modelos es débil y, aunque existen diferencias entre los estudios, la mayoría de los modelos no muestran cambios o muestran un deterioro leve de la tolerancia a la glucosa asociado con niveles de insulina plasmática reducidos o sin cambios. Ver, por ejemplo, Rutter y otros (2016) Proc. Nutr. Soc. 75(1):61-72. Lo que es más importante, ninguno de los estudios ha informado efectos beneficiosos asociados con la deficiencia de Slc30a8. Por lo tanto, fue una sorpresa cuando Flannick y sus colegas informaron que la haploinsuficiencia de SLC30A8 protege contra el desarrollo de diabetes tipo 2 (T2D) en seres humanos. Ver, por ejemplo, Flannick y otros (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363. Su estudio identificó 12 variantes de pérdida de función (LOF) supuestas que colectivamente redujeron el riesgo de T2D en un 65 %. Una de las variantes más abundantes, p.Arg138* (denominada R138X en la presente descripción), que provoca un codón de parada prematura, se asoció individualmente con la protección contra la T2D y se informó que codifica una proteína ZnT8 inestable. Ver, por ejemplo, Flannick y otros (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363. Por tanto, los datos de ratones y humanos aparentemente se contradicen entre sí, y actualmente no está claro cómo las raras variantes LOF supuestas reducen el riesgo de T2D.

Para investigar esta discrepancia entre el efecto de las variantes LOF supuestas de SLC30A8 humano y los modelos de ratón de Slc30a8 KO, así como también obtener información sobre por qué las variantes LOF supuestas de SLC30A8 son protectoras en seres humanos, generamos y fenotipamos un nuevo modelo de ratón de Slc30a8 que porta la mutación R138X como una variante LOF supuesta humana representativa. Curiosamente, descubrimos que las células beta en los ratones R138X tienen una capacidad extraordinaria para secretar insulina en respuesta a la hiperglucemia severa.

Resultados

Los islotes R138X parecen mostrar pérdida de la función de SLC30A8 a pesar de la protección parcial del transcrito R138X contra la degradación mediada por sin sentido. Para investigar cómo las variantes LOF supuestas de SLC30A8 humano influyen en el riesgo de T2D, alteramos el codón de Slc30a8 en el genoma del ratón que codifica el residuo de aminoácido 137 (codón 137, equivalente al codón 138 en seres humanos) de CGA a TGA, lo que cambia la arginina en un codón de parada (R138X) como se detalla en el Ejemplo 1. Los ratones R138X nacieron con la relación mendeliana esperada y sin anomalías de crecimiento evidentes. La hibridación in situ de ARN mostró una fuerte tinción de ARNm de Slc30a8 en islotes pancreáticos de ratones de tipo silvestre (WT), pero ninguna tinción en islotes de ratones homocigotos Slc30a8 KO, lo que valida la especificidad de la sonda (Figura 1A). A diferencia de los islotes de ratones Slc30a8 KO, los islotes de ratones R138X mostraron una cantidad sustancial de tinción de ARN de Slc30a8 (Figura 1A). La cuantificación del ARNm de Slc30a8 mediante PCR en tiempo real reveló una reducción del 70 % en los islotes de R138X, aunque el nivel absoluto de transcrito de Slc30a8 en los islotes de R138X (valor CT: 22,2) era aún alto y comparable con el nivel de expresión del gen de constitutivo Gapdh (valor CT: 22,1) (Figura 1B). La presencia de este alto nivel de ARN de Slc30a8 en los ratones R138X sugiere que el transcrito de R138X no puede degradarse de manera efectiva por la degradación del ARNm mediada por sin sentido, un proceso que degrada los ARNm que portan codones de terminación de la traducción prematura. Ver, por ejemplo, Holbrook y otros (2004) Nat. Genet. 36(8):801-808.

Para determinar si el ARN detectado en los ratones R138X se traduce en una proteína truncada, realizamos inmunoelectrotransferencia para determinar la proteína SLC30A8 mediante el uso de un anticuerpo generado contra un péptido N-terminal de la proteína de ratón. No pudimos identificar una proteína truncada con el peso molecular esperado (-16 kDa para el monómero) en lisados de islotes aislados en las condiciones actuales (Figura 1C), a pesar de poder detectar la proteína R138X y estabilizarla mediante inhibición proteosómica cuando se sobreexpresa en células HEK293 (Figura 5). De manera similar, el análisis de espectrometría de masas de lisados de células completas o inmunoprecipitados de islotes WT y R138X no identificó péptidos SLC30A8 en los islotes R138X (datos no mostrados). Además, la tinción de zinc mediante el uso de ditizona reveló que los islotes de los ratones KO y R138X tenían agotamiento de zinc, lo que demuestra la ausencia de una proteína SLC30A8 funcional en ambas líneas de ratones (Figura 1D). Sin embargo, no se observaron cambios significativos en los niveles circulantes de zinc (Figura 17). En resumen, la introducción de la variante LOF supuesta R138X humana en el gen Slc30a8 de ratón parece dar como resultado la pérdida de la función SLC30A8.

Los ratones R138X con dieta de alimento balanceado tienen un fenotipo metabólico normal. Primero investigamos si la introducción del codón de parada R138X alteraba los parámetros metabólicos en ratones alimentados con alimento balanceado. Los ratones WT y R138X no difirieron en su peso corporal ni en los niveles de glucosa e insulina en sangre circulante (Figuras 2A-2C, 2L; Tabla 5). Debido a que el zinc ha estado implicado en el procesamiento y la eliminación de la insulina, también medimos los niveles circulantes de proinsulina y péptido C y calculamos la relación de estas hormonas con respecto a la insulina (Figuras 2C-2F). Si bien no hubo diferencia en el péptido C circulante, los niveles de proinsulina en ayunas se redujeron ligeramente en los ratones R138X (Figura 2C). La relación proinsulina/insulina no difirió entre los ratones WT y R138X, pero la relación péptido C/insulina en el estado alimentado fue ligeramente elevada, lo que sugiere una reducción de la eliminación de insulina (Figuras 2E-2F). Los niveles circulantes de proinsulina y péptido C fueron similares entre los ratones WT y R138X (Figuras 2C-2D). Si bien la relación proinsulina/péptido C no cambió, sí observamos una leve disminución en la relación insulina/péptido C, lo que sugiere una mayor eliminación de insulina en ratones R138X similar a la observada en ratones Slc30a8 KO (Figura 2P). Ver, por ejemplo, Tamaki y otros (2013) J. Clin. Invest. 123(10):4513-4524. La tolerancia reducida a la glucosa no fue evidente en los ratones R138X, y no observamos cambios en la secreción de insulina inducida por glucosa (Figuras 2G-2H). La tolerancia a la glucosa y la sensibilidad a la insulina fueron similares en los ratones R138X y de control, y no observamos cambios en la secreción de insulina inducida por glucosa (Figuras 2G, 2H y 2M). Además, la ausencia de zinc en los islotes no afectó a la morfología de los islotes ya que la tinción de insulina y glucagón no se alteró (Figuras 2I-2K; Figuras 6A-6B). Además, la ausencia de zinc en los islotes no afectó la morfología de los islotes ya que las masas de células beta y alfa no se alteraron (Figuras 2I, 2N, 6A y 6E). Tomados en conjunto, estos datos muestran que la variante R138X no afecta la homeostasis de la glucosa o la secreción de insulina inducida por glucosa en ratones alimentados con alimento balanceado.

Tabla 5. Peso corporal de ratones SLC30A8 KO y R138X.

Tabla 6. Composición corporal de ratones SLC30A8 KO y R138X alimentados con alimento balanceado.

También generamos ratones Slc30a8 KO en los que se eliminó la secuencia codificante desde el codón de inicio de Slc30a8 hasta el codón de parada Slc30a8 (es decir, la secuencia codificante completa). A continuación fenotipamos ratones Slc30a8 KO con dieta de alimento balanceado (Figuras 7A-7K). De acuerdo con los resultados publicados, los ratones Slc30a8 KO mostraron una leve alteración de la tolerancia a la glucosa y niveles reducidos de insulina plasmática inducidos por la glucosa (Figuras 7B, 7G, 7H). Ver, por ejemplo, Lemaire y otros (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 106(35):14872-14877; Nicolson y otros (2009) Diabetes 58(9):2070-2083; y Rutter y otros (2016) Proc. Nutr. Soc. 75(1):61-72. Además, los ratones Slc30a8 KO tenían una relación más alta de péptido C/insulina, lo que sugiere un aumento de la eliminación de insulina similar a un informe reciente y presumiblemente refleja una secreción de zinc alterada a partir de los islotes Slc30a8 KO. Ver, por ejemplo, Tamaki y otros (2013) J. Clin. Invest.

123(10):4513-4524 y Mitchell y otros (2016) Mol. Endocrinol. 30(1):77-91.

En conjunto, estos datos muestran que la introducción de la variante LOF supuesta R138X tiene efectos menores en el procesamiento de proinsulina y no altera la homeostasis de la glucosa o la secreción de insulina inducida por glucosa en ratones mantenidos con una dieta de alimento balanceado regular. Por tanto, este fenotipo R138X difiere del observado en ratones Slc30a8 KO, que tienen tolerancia a la glucosa alterada y niveles reducidos de insulina plasmática inducidos por glucosa cuando se mantienen con una dieta de alimento balanceado regular.

Los ratones R138X con una dieta con alto contenido de grasas tienen una mayor secreción de insulina y un mayor número de células beta. Dado que los portadores del R138X humano están protegidos contra el desarrollo de la T2D, desafiamos a los ratones con una dieta con alto contenido de grasas (HFD). El peso corporal y los niveles de glucosa con alimentos no difirieron entre los ratones WT y R138X (Tabla 5, Figura 3A). Sin embargo, después de 20 semanas con HFD, observamos niveles de insulina circulante más altos en ratones R138X alimentados en comparación con ratones WT (Figura 3B). Mientras que los niveles de péptido C circulante imitaban los niveles de insulina, los niveles de proinsulina en ayunas eran más bajos en los ratones R138X, lo que dio como resultado una disminución de la relación proinsulina/insulina (Figuras 3C-3F). A pesar del aumento de la insulina con alimentos, la tolerancia a la glucosa no mejoró significativamente en ratones R138X (Figura 3G). Para examinar la secreción de insulina con más detalle, medimos la insulina circulante después de una prueba de tolerancia a la glucosa oral (oGTT). En ratones R138X, un bolo de glucosa oral duplicó la cantidad de insulina circulante a los 15 min en comparación con los ratones WT (Figura 3H). Sorprendentemente, esto se asoció con un aumento del número de células beta productoras de insulina (Figura 3I). La cuantificación de la tinción de insulina mostró una duplicación del área positiva para insulina, así como también del número de islotes (Figuras 3J-3K). Por el contrario, no detectamos cambios en el número de células alfa mediante el uso de tinción para glucagón (Figuras 6C-6D). La tinción con Ki67 sugirió que el aumento en el área de las células beta era secundario a un aumento de la proliferación de células beta. El número de células doblemente positivas para insulina y Ki67 aumentó dos veces en el páncreas de los ratones R138X en comparación con los ratones WT. Se observó un fenotipo metabólico similar, aunque menos pronunciado, en ratones hembras R138X (Figuras 8A-8K). Después de más de 20 semanas con HFD, los ratones hembras R138X mostraron una relación reducida proinsulina/insulina cuando estaban en ayunas y un aumento en los niveles de insulina circulante asociados con un mayor número de islotes (Figuras 8B-8K).

Debido a que el fenotipo protector de la variante R138X se observó en portadores heterocigotos, también analizamos ratones heterocigotos R138X en HFD (Figuras 9A-9M). El análisis de inmunoelectrotransferencia mostró una fuerte reducción de la proteína SLC30A8 en los islotes de ratones heterocigotos R138X (Figura 9A), mientras que los niveles de zinc en los islotes fueron comparables a los de los ratones WT cuando se examinaron mediante tinción con ditizona (Figura 9B). Aunque el fenotipo fue más leve en comparación con los ratones homocigotos R138X, los ratones heterocigotos R138x mostraron un aumento en la secreción de insulina inducida por glucosa (Figura 9J) asociado con una expansión del área de células beta después de más de 20 semanas con HFD (Figura 9K-9M). En conjunto, estos datos sugieren que los ratones con HFD que portan la mutación humana R138X tienen una mayor capacidad para secretar insulina, lo que es el resultado en parte de un aumento del número de células beta.

Como una forma alternativa de inducir la resistencia a la insulina y aumentar la secreción de insulina de las células beta, usamos el antagonista del receptor de insulina S961 para bloquear el receptor de insulina en ratones R138X y ratones WT. El bloqueo del receptor de insulina aumentó los niveles de glucosa e insulina circulantes como se esperaba tanto en ratones R138X como en ratones WT. Sin embargo, observamos una duplicación de la insulina circulante en ratones R138X en comparación con ratones WT. Ver la Figura 12. Los ratones SLC30A8 KO no muestran este aumento en la secreción de insulina por sobre los ratones WT (datos no mostrados). Estos datos son consistentes con los datos que sugieren que los ratones con HFD que portan la mutación humana R138X tienen una mayor capacidad para secretar insulina.

Los ratones Slc30a8 KO con una dieta con alto contenido de grasas no tienen niveles aumentados de insulina circulante o número de células beta. También examinamos nuestros ratones Slc30a8 KO después de 20 semanas con HFD (Figuras 4A-4K). Estos ratones no mostraron un aumento en los niveles de insulina circulante con alimentos, pero tenían niveles reducidos de insulina, proinsulina y péptido C en ayunas (Figuras 4B-4D). De manera similar a los ratones R138X, la relación proinsulina/insulina fue menor en los ratones Slc30a8 KO (Figura 4E). Sin embargo, la relación péptido C/insulina se elevó en los ratones Slc30a8 KO de manera similar a lo que se observó con la dieta de alimento balanceado. Si bien la tolerancia a la glucosa no cambió, los ratones Slc30a8 KO mostraron niveles más bajos de insulina circulante inducida por glucosa. A diferencia de lo que observamos en los ratones R138X, el número de células beta no cambió en los ratones Slc30a8 KO (Figuras 4I-4K).

Los ratones R138X tienen una mayor secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina. A continuación, queríamos investigar un efecto potencial de la mutación R138X en ratones desafiados metabólicamente. Usamos el antagonista del receptor de insulina S961 para inducir resistencia severa a la insulina e hiperglucemia. Ver, por ejemplo, Schaffer y otros (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 376(2):380-383. Como se esperaba, S961 provocó hiperglucemia (aproximadamente 600 mg/dl) en todos los animales tratados, mientras que los animales de control mantuvieron niveles normales de glucosa con alimentos (aproximadamente 200 mg/dl) (Figura 13A). Los niveles de insulina circulante aumentaron en respuesta al S961 en todos los ratones tratados. Sorprendentemente, los ratones R138X tenían niveles de insulina circulante más del 50 % (WT: 42,33 ± 5,03 ng/ml; R138X: 67,75 ± 19,16 ng/ml) más altos tras la hiperglucemia inducida por S961 en comparación con los ratones WT tratados con S961 (Figura 13B). El aumento de la insulina plasmática no fue el resultado de un procesamiento mejorado de la proinsulina o una eliminación reducida de la insulina (Figuras 14A-14E), o cambios en los niveles circulantes de GLP-1 entre los ratones R138X y WT (Figura 13C). La insulina circulante fue mayor en condiciones con alimentación y en ayunas en ratones R138X tratados con S961, pero los niveles de glucosa en sangre no difirieron entre genotipos debido a la inhibición de la acción de la insulina sobre el receptor de insulina por S961 (Figuras 13D-13E). Es de destacar que los niveles de insulina en ayunas se elevaron sustancialmente con el tratamiento con S961 en ratones WT y R138X en comparación con los ratones tratados con PBS a pesar de los niveles normales de glucosa en sangre en ayunas.

Para investigar si los niveles más altos de insulina en los ratones mutantes eran consecuencia de un aumento de la proliferación de células beta, medimos las células beta positivas para Ki-67 / insulina. Si bien la proliferación de células beta aumentó claramente con el tratamiento con S961, no hubo diferencia en la proliferación de células beta entre los ratones R138X y WT (Figuras 13F-13G). Consistente con los datos de proliferación, no hubo diferencia en los islotes o la masa de células alfa en ratones WT y R138X tratados con S961 (Figuras 13F y 13H, Figuras 14F-14G). A pesar del gran aumento de la insulina en sangre, las células beta de los ratones R138X tratados con S961 no parecían estar más agotadas de insulina que las células beta de los ratones WT tratados con S961 (Figura 13F). En resumen, estos datos sugieren que los islotes de los ratones R138X tienen una mayor capacidad para secretar insulina cuando se desafían con hiperglucemia.

Los islotes de ratones R138X tienen una expresión del gen mitocondrial disminuida y una expresión de Hvcnl aumentada. Para comprender las diferencias entre los islotes WT y R138X con más detalle, realizamos la secuenciación de ARN en islotes aislados de ratones alimentados con alimento balanceado. En confirmación con nuestros datos de RNAscope y TAQMAN® (Figuras 1A-1B), la cantidad de ARNm de Slc30a8 se redujo fuertemente (de aproximadamente 500 RPKM en WT a aproximadamente 100 RKPM en R138X), pero no estuvo ausente (Figura 15). Encontramos que 61 genes (19 genes aumentaron, 43 genes disminuyeron) estaban regulados diferencialmente en los islotes R138X (Tabla 7). Curiosamente, esta lista de genes no contiene genes implicados en el metabolismo del zinc o la biosíntesis de insulina. Sin embargo, la expresión de insulina 2 (Ins2) se reguló negativamente de manera significativa y la expresión de insulina 1 (Ins1) también tendió a disminuir (Figura 16A). Esto nos llevó a analizar más detenidamente los niveles de expresión de los reguladores de las células beta, lo que incluye los factores de transcripción para la insulina. Como se muestra en la Figura 16B, Mafa se reguló positivamente de manera significativa en los islotes de ratones R138X pero sobrepasó nuestro valor de corte de 1,5 veces. Dado que Mafa regula positivamente la transcripción de insulina y su expresión se asocia generalmente de manera positiva con la expresión de la hormona, no explica la reducción de la expresión del gen Ins2. De los 43 genes regulados negativamente, 12 genes eran proteínas mitocondriales y 7 pertenecían al grupo de genes Oxphos (Tabla 7). Por lo tanto, analizamos el nivel de expresión de todos los genes Oxphos y notamos que la expresión de la mayoría de estos genes se redujo (Tabla 8, Tabla 9). Los complejos I, III y V se vieron afectados principalmente con una reducción en la expresión génica de aproximadamente el 40 %, lo que sugiere una capacidad reducida para generar ATP.

Tabla 7. Genes regulados diferencialmente en islotes de ratones WT y R138X alimentados con alimento balanceado (genes mitocondriales marcados en negritas).

Tabla 8. Resumen de los cambios en la expresión de genes Oxphos en islotes de ratones WT y R138X.

Tabla 9. Cambio en la expresión de todos los genes Oxphos en islotes aislados de ratones WT y R138X (genes que cambiaron significativamente en negritas).

Es de destacar que la expresión del canal de protones dependiente de voltaje Hv1 (Hvcnl, nombres alternativos VSOP, HV1) se reguló positivamente en islotes de ratones R138X. Dado que este canal está regulado por Zn2+ y está presente en los gránulos secretores de insulina, y la pérdida de expresión de Hvcn1 altera la secreción de insulina in vivo e in vitro, esto podría ser importante para el fenotipo observado en los ratones R138X. Ver, por ejemplo, Zhao y otros (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun. 468(4):746-751; Wang y otros (2017) "The Voltagegated Proton Channel Hv1 Is Required for Insulin Secretion in Pancreatic p Cells", bioRxiv 097816, doi.org/10.1101/097816; y Qiu y otros (2016) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 113(40):E5962-E5971.

Discusión

En este estudio, generamos un nuevo modelo de ratón con LOF supuesta de Slc30a8 (ratones R138X) que imita una de las LOF supuestas de SLC30A8 humano más comunes (p.Arg138*). Ver, por ejemplo, Flannick y otros (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363. Los datos obtenidos de estos ratones pueden explicar por primera vez por qué las mutaciones LOF supuestas de SLC30A8 en seres humanos protegen contra el desarrollo de T2D. La introducción de la mutación R138X dio como resultado un aumento del número de células beta lo que permitió un aumento de la secreción de insulina en un estado de resistencia a la insulina. Estos datos indican que las células beta R138X pueden, por lo tanto, compensar mejor el aumento de la demanda de insulina al prevenir y/o retrasar el fallo de las células beta y la aparición de T2D. Mediante el uso de este modelo, mostramos que la introducción de la mutación R138X da como resultado la secreción de un 50 % más de insulina en respuesta a la hiperglucemia. Estos datos sugieren que la protección contra la T2D en los seres humanos está mediada, al menos en parte, por un aumento en la capacidad secretora de insulina que permite que las células beta compensen el aumento de la demanda de insulina, lo que previene o retrasa de esta manera el fallo de estas células y la aparición de la T2D. Por tanto, el presente enfoque demuestra la viabilidad de usar la genética del ratón para explorar los mecanismos de cómo actúan los genes humanos de riesgo o protectores de la T2D identificados. El presente enfoque también enfatiza la utilidad de la genética del ratón para explorar los mecanismos de las variantes genéticas que afectan el riesgo de T2D en humanos.

Se han informado más de ocho modelos diferentes de ratones con inactivación de Slc30a8. Ver, por ejemplo, Lemaire y otros (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 106(35):14872-14877; Nicolson y otros (2009) Diabetes 58(9):2070-2083; Tamaki y otros (2013) J. Clin. Invest. 123(10):4513-4524; Pound y otros (2009) Biochem. J.

421(3):371-376; Pound y otros (2012) PLoS One 7(7):e40972; Wijesekara y otros (2010) Diabetologia 53(8):1656-1668; y Hardy y otros (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302(9):E1084-E1096. Estos modelos varían en el fondo genético, la estrategia de direccionamiento a Slc30a8 y la línea Cre específica que se usó cuando se generaron ratones con eliminaciones específicas de células beta. Los fenotipos metabólicos de estos ratones también varían. Se han informado diferencias en el aumento de peso corporal, la tolerancia a la glucosa y la secreción de insulina con dieta de alimento balanceado y con alto contenido en grasas (HFD). Ver, por ejemplo, Rutter y otros (2016) Proc. Nutr. Soc. 75(1):61-72. Sin embargo, todos los fenotipos con inactivación de Slc30a8 publicados apuntan a un empeoramiento del control de la glucosa con tolerancia a la glucosa alterada observada en al menos seis publicaciones. Por razones comparativas, también generamos una línea de ratón con inactivación de Slc30a8 en un fondo C57BL/6 al 100 %, igual que la R138X. Este ratón con inactivación fenocopió en gran medida los datos publicados que muestran tolerancia a la glucosa alterada (con dieta de alimento balanceado), menor secreción de insulina inducida por glucosa (con alimento balanceado y HFD) y eliminación de insulina alterada (con alimento balanceado y HFD). Por el contrario, no observamos un fenotipo metabólico importante, lo que incluye el empeoramiento del control de la glucosa en los ratones R138X con dieta de alimento balanceado. La diferencia entre las líneas de ratones con inactivación y R138X se hizo aún más evidente después de más de 20 semanas con HFD. La secreción de insulina y la cantidad de células beta aumentó en los ratones R138X, pero no en los ratones con inactivación de Slc30a8. La aparición tardía del fenotipo observado sugiere que el aumento compensatorio en la proliferación y el número de células beta se produjo bastante tarde en la alimentación con HFD. Sin embargo, no podemos excluir la posibilidad de que el número de células beta ya difiriera después de 10 semanas con HFD cuando no se observaron cambios en la secreción de insulina. Hardy y otros observaron un aumento en el número de células beta e insulina circulante en su ratón con inactivación deSlc30a8 global después de un tratamiento con HFD de 16 semanas. Ver, por ejemplo, Hardy y otros (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302(9):E1084-E1096. Sin embargo, esto fue más probablemente una consecuencia del control de glucosa deteriorado con obesidad marcada, hiperglucemia y mayor resistencia a la insulina en sus ratones KO en comparación con los ratones de tipo silvestre, un efecto no observado en el presente estudio. Es importante destacar que, mientras que Hardy y otros observaron un aumento en la relación proinsulina/insulina en los ratones Slc30a8 KO, observamos una disminución en esta relación en los ratones R138^xcon HFD, lo que sugiere que las células beta tenían un procesamiento de insulina mejorado y una mejor salud que las células beta WT. Ver, por ejemplo, Hardy y otros (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302(9):E1084-E1096. Curiosamente, la mejora en la relación proinsulina/insulina también se observó en nuestros ratones Slc30a8 KO, lo que demuestra que los ratones con inactivación y R138X no difieren en todos los aspectos metabólicos. Dado que una relación alta proinsulina/insulina está asociada con la progresión a T2D en seres humanos, esto también podría contribuir a la protección contra T2D mediada por LOF de SLC30A8. Ver, por ejemplo, Kirchhof y otros (2008) Diabetologia 51(4):597-601; LoopstraMasters y otros (2011) Diabetologia 54(12):3047-3054; y Saad y otros (1990) J. Clin. Endocrinol. Metab. 70(5):1247-1253.

Todos los fenotipos Slc30a8 KO no muestran cambios o muestran una disminución en la insulina circulante, que en algunos casos se asoció con un empeoramiento de la tolerancia a la glucosa. Ver, por ejemplo, Nicolson y otros (2009) Diabetes 58(9):2070-2083; Libra y otros (2009) Biochem. J. 421(3):371-376; y Mitchell y otros (2016) Mol. Endocrinol. 30(1):77-91. Por el contrario, se ha observado un aumento en la secreción de insulina in vitro en islotes de tres modelos KO. Ver, por ejemplo, Nicolson y otros (2009) Diabetes 58(9):2070-2083; Tamaki y otros (2013) J. Clin. Invest. 123(10):4513-4524; y Hardy y otros (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302(9):E1084-E1096. No observamos un fenotipo metabólico importante, incluido un cambio en la secreción de insulina inducida por glucosa, en ratones R138X con alimento balanceado. Sin embargo, cuando se los desafió con S961, estos ratones pudieron secretar mucha más insulina que sus contrapartes WT. Este aumento en la secreción de insulina no fue secundario a un aumento en la masa de células beta y no se ha informado en ningún modelo con inactivación de Slc30a8.

No está claro por qué el fenotipo metabólico de los ratones R138X difiere tanto de los ratones con inactivación de Slc30a8, pero los datos sugieren una posible ganancia de función para el alelo R138X. Actualmente, no está claro si los ratones R138X son como los ratones con inactivación de Slc30a8, ya que no podemos descartar que el ARNm restante se traduzca en una proteína truncada. No pudimos detectar una versión truncada de la proteína SLC30A8 que pudiera explicar fácilmente las diferencias de fenotipo en los islotes de los ratones R138X. Sin embargo, el ARN está claramente presente y se detectó proteína R138X sobreexpresada en células HEK293 y se acumuló mediante inhibición proteosómica (Figura 5), lo que difiere a lo que se observó previamente en células HeLa. Ver, por ejemplo, Flannick y otros (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363. Por tanto, no podemos excluir la existencia de bajos niveles de proteína, quizás en un subconjunto de las células de los islotes de los ratones R138X. Independientemente de la expresión potencial de la proteína SLC30A8 en ratones R138X, la tinción con ditizona indicó claramente que la introducción de la mutación LOF supuesta R138X dio como resultado una pérdida de acumulación de zinc en los islotes consistente con lo que se describe en los ratones Slc30a8 KO. Otra posibilidad es que el ARNm de Slc30a8 truncada, aunque ya no codifique un péptido, ahora cumple una función como ARN largo no codificante, lo que afecta la transcripción de genes relacionados (que posiblemente incluyan otros miembros de la familia Slc30a) in trans. Ver, por ejemplo, Batista y Chang (2013) Cell 152(6):1298-1307.

Los cambios en el Zn2+ libre subcelular pueden conducir a un aumento de la proliferación y/o secreción de insulina por varias razones. Una gran cantidad de sistemas de señalización intracelular se ven afectados por el Zn2+ libre en células de mamíferos con casi el 10 % del proteoma celular capaz de unirse a estos iones. Ver, por ejemplo, Rutter y otros (2016) Proc. Nutr. Soc. 75(1):61-72. Aunque es probable que las concentraciones de Zn2+ libre disminuyan globalmente en el citosol por la inactivación de Slc30a8 en la célula beta, los aumentos muy localizados del Zn2+ libre cerca de la membrana plasmática en las células beta R138X podrían mejorar la señalización por parte de los receptores de tirosina quinasas (por ejemplo, receptores de insulina o IGF1) mediante la inhibición de las proteínas tirosina fosfatasas, lo que promueve por tanto el crecimiento celular. Ver, por ejemplo, Gerber y otros (2014) Diabetologia 57(8):1635-1644 y Bellomo y otros (2014) Metallomics 6(7):1229-1239. Por otro lado, se espera que los niveles citosólicos de Zn2+ reducidos globalmente reduzcan las tasas de apoptosis, por ejemplo, mediante la interacción con caspasas. Ver, por ejemplo, Fukamachi y otros (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 246(2):364-369.

La secreción de insulina puede regularse positivamente en ratones R138X mediante la regulación positiva del canal de protones dependiente de voltaje Hvcn1. Hvcn1 está presente en gránulos secretores y es inhibido por iones de zinc. Ver, por ejemplo, Qiu y otros (2016) Proc. Nat. Acad. Sci. EE. UU. 113(40):E5962-E5971. Además, los ratones Hvcn1 KO tienen disminuida la secreción de insulina y alterado el control de la glucosa. Wang y otros (2017) "The Voltage-gated Proton Channel Hv1 Is Required for Insulin Secretion in Pancreatic p Cells", bioRxiv 097816, doi.org/10.1101/097816. Dado que los islotes de los ratones R138X están agotados de zinc, cabría esperar un aumento en la actividad de este canal. Además de eso, vemos una regulación positiva de 3 veces del transcrito de Hvcn1 en islotes de ratones R138X. Si bien estos datos sugieren que el aumento en la secreción de insulina está mediado, al menos en parte, por Hvcn1, experimentos adicionales deben validar esta hipótesis. Otro hallazgo interesante es la reducción de la expresión génica mitocondrial en ratones R138X. Esto parece bastante contradictorio, ya que se requiere la síntesis de ATP para la secreción adecuada de insulina. Ver, por ejemplo, Wiederkehr y Wollheim (2012) Mol. Cell. Endocrinol. 353(1-2):128-137. Sin embargo, un estudio reciente describió una vía alternativa para activar la secreción de insulina en las células beta. Ver, por ejemplo, De Marchi y otros (2017) J. Cell. Sci. 130(11):1929-1939. Esta vía es independiente de la síntesis de ATP (resistente a la oligomicina), depende del Ca2+ citosólico permisivo, se acompaña de una menor reducción del glutatión mitocondrial y se logra mediante la activación del complejo mitocondrial II. Esto es interesante si se tiene en cuenta que la expresión de Gpx2 (glutatión peroxidasa 2) (Tabla 7) y solo un gen del complejo II de Oxphos se redujo en los ratones R138X. En consecuencia, la eliminación selectiva de la proteína quinasa quinasa hepática B1 (LKB1) en las células beta conduce a defectos mitocondriales marcados y a una alteración de la dinámica del Ca2+, mientras que la secreción de insulina estimulada por la glucosa aumenta probablemente debido a la regulación positiva de esta última vía. Ver, por ejemplo, Swisa y otros (2015) J. Biol. Chem. 290(34):20934-20946. Pueden realizarse más experimentos que examinen la respiración y la secreción de insulina para investigar si esta vía alternativa se usa predominantemente en células beta de ratones R138X.

La restauración del número de células beta es una estrategia clave para el desarrollo de nuevos medicamentos para la T2D. Uno de los mayores desafíos de este enfoque es que los factores que promueven la replicación de las células beta en roedores a menudo no lo han logrado en células beta humanas. Sin embargo, nuestros datos en ratones que modelan la mutación R138X de SLC30A8 humano sugieren que un aumento en el número de células beta es uno de los mecanismos que subyacen a los efectos protectores contra la T2D de algunas mutaciones de SLC30A8 en humanos. Por lo tanto, comprender los mecanismos que subyacen a la expansión observada del área de células beta en ratones R138X podría conducir a la identificación de nuevos objetivos terapéuticos con mayor probabilidad de trasladarse a los seres humanos.

En conclusión, nuestros datos de los ratones R138X ofrecen por primera vez una explicación de por qué los seres humanos que portan la mutación R138X están protegidos contra la T2D. Ver, por ejemplo, Flannick y otros (2014) Nat. Genet. 46(4):357-363. Por lo tanto, es un modelo relevante para estudiar el mecanismo subyacente a esta protección. Esto es especialmente importante dado que el aumento de la secreción de insulina es una estrategia terapéutica destacada para combatir la T2D. Por lo tanto, comprender el mecanismo subyacente al aumento de la secreción de insulina en ratones R138X podría conducir a la identificación de nuevos objetivos terapéuticos.

Mecanismo de acción

Hemos generado un nuevo modelo de ratón (R138X) que imita la mutación LoF de SLC30A8 humano p.Arg138* que protege a los seres humanos del desarrollo de diabetes tipo 2. Los ratones R138X en condiciones de dieta con alto contenido de grasas tienen un aumento de la secreción de insulina asociada con un aumento de la masa y proliferación de células beta. Alternativamente, cuando inducimos la hiperglucemia mediante el uso de S961 (inhibidor del receptor de insulina), los ratones R138X tienen un aumento del 50 % en la secreción de insulina que es independiente de los cambios en la proliferación y la masa de células beta en comparación con los ratones WT. Esto sugiere que el receptor de insulina es necesario para el aumento de la proliferación en ratones R138X. Además, se ha demostrado que el receptor de insulina en las células beta es necesario para aumentar la proliferación de células beta en ratones con una dieta con alto contenido de grasas. Dado que los ratones R138X tienen una mayor capacidad para secretar insulina, el nivel más alto de insulina puede actuar sobre el receptor de insulina en las células beta e inducir la proliferación en mayor medida que en los ratones WT. Para investigar esto, se examina la activación de la vía de la insulina al hacer histología para p-Akt, p-S6 y p-Erk en páncreas de ratones WT y R138X tratados con una dieta con alto contenido de grasas o S961. Además, se examinan los islotes aislados para determinar si tienen niveles más altos de p-AKT y p-Erk y si proliferan más in vitro.

Métodos

Animales. Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Regeneron Pharmaceuticals. Las líneas de ratones Slc30a8 R138X e inactivados se generaron en un fondo C57BL/6NTac puro mediante el uso de la tecnología VELOCIGENE. Ver, por ejemplo, Valenzuela y otros (2003) Nat. Biotechnol. 21(6):652-659. Para la generación de la línea de ratón con inactivación, se eliminó toda la región codificante de Slc30a8 y se reemplazó con un gen LacZ. El gen de neomicina se eliminó mediante el uso de un casete de selección de neomicina de autoeliminación. Para la generación de ratones R138X, el nucleótido 409 se cambió de T a C en el exón 3, lo que cambia la arginina en un codón de parada. El alelo mutado tiene un casete de selección de neomicina de autoeliminación flanqueado por sitios loxP insertado en el intrón 3, al eliminar 29 pb de la secuencia del intrón 3 endógeno (CAGCTGACAGCAAGATTAATGGAAGTACC (SEQ ID NO: 24)). Los ratones se alojaron (hasta cinco ratones por jaula) en un ambiente controlado (ciclo de luz/oscuridad de 12 h, 22 ± 1 °C, 60-70 % de humedad) y se alimentaron a libertad con alimento balanceado (Dieta para roedores 5001 Purina Laboratory 23, LabDiet) o una dieta con alto contenido de grasas (Research Diets, D12492; 60 % de grasa por calorías) a partir de las 12-18 semanas de edad. Todos los datos mostrados se comparan con compañeros de camada WT.

Prueba de tolerancia a la glucosa. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante la noche (16 horas) seguido de sonda gástrica oral de glucosa (Sigma) a 2 g/kg de peso corporal. Se obtuvieron muestras de sangre de la vena de la cola en los tiempos indicados y se midieron los niveles de glucosa mediante el uso del glucómetro AlphaTrak2 (Abbott). Se realizaron sangrados submandibulares para determinar insulina a los 0, 15 y 30 min después de la inyección en experimentos separados para no interferir con las mediciones de glucosa.

Prueba de tolerancia a la insulina. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 4 h seguido de una inyección intraperitoneal de 0,75 U/kg (alimentados con alimento balanceado) o 1,5 U/kg (alimentados con alto contenido de grasas) de insulina humana (Eli Lilly). Se obtuvieron muestras de sangre de la vena de la cola en los tiempos indicados y se midió la glucosa mediante el uso del glucómetro AlphaTrak2 (Abbott).

Mediciones de insulina plasmática, proinsulina y péptido C. Los sangrados submandibulares de animales alimentados o en ayunas durante la noche se realizaron por la mañana o después de una oGTT. La insulina se analizó con el ELISA de insulina de ratón (Mercodia). La proinsulina se analizó con el ELISA de proinsulina de ratón (Mercodia). El péptido C se analizó con el ELISA de péptido C de ratón (ALPCO). Todos los ELISA se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Histología. Los páncreas se fijaron en una solución de formalina tamponada neutra al 10 % durante 48 horas y después se incluyeron en parafina. Se tiñeron dos secciones del páncreas de cada animal con un anticuerpo aglucagón (REGN745, un anticuerpo monoclonal de a-glucagón generado internamente) o un anticuerpo a-insulina (Dako), y se midieron las áreas de células positivas para glucagón e insulina mediante el uso del software de análisis de imágenes digitales Halo (Indica Labs). Se calculó el por ciento de áreas positivas a glucagón e insulina en proporción al área de páncreas total. Se contó el número de islotes por lámina y se normalizó para área total del páncreas. El análisis se configuró para capturar cada grupo de células positivas para insulina hasta una resolución de una sola célula. Excluimos los artefactos (por ejemplo, detritos) más pequeños que una sola célula beta (<150 |jm2; área calculada mediante el uso de un diámetro de aproximadamente 14 jm). Para la tinción con fluorescencia, las secciones de páncreas se tiñeron con una combinación de anticuerpo a-insulina (Dako, A0564) y anticuerpo a-KI67 (R&D) seguido de anticuerpos secundarios apropiados. La señal fluorescente se detectó mediante el uso de un escáner de láminas de microscopio (Zeiss Axio Scan.ZI). Los tipos de células de los islotes se cuantificaron mediante el uso del análisis de imágenes HALO mediante el uso del módulo Cytonuclear Fluorescence (Indica Labs). Se calculó el por ciento de áreas positivas para glucagón e insulina con relación al área total del páncreas. Al tomar el área como base, se calculó la masa de células a al multiplicar el área de células a de cada animal por el peso del páncreas del animal. Para cuantificar la masa de los islotes, se midió el número y el tamaño de los islotes mediante el conteo del número de islotes positivos para insulina en una sección. Cada área teñida de más de 150 jm se contó como un islote. El número de islotes se normalizó al área total del páncreas multiplicada por el peso del páncreas individual para obtener la masa de los islotes.

Hibridación in situ de ARN. Para el análisis de ARN, el tejido pancreático se permeabilizó y se hibridó con combinaciones de sondas de ARNm para Gcg, Ins2 y Slc30A8 de ratón de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Advanced Cell Diagnostics). Se usó un kit de fluorescencia para amplificar la señal de ARNm. La señal de fluorescencia se detectó mediante el uso de un escáner de láminas de microscopio (Zeiss Axio Scan.Z1).

Aislamiento de islotes y tinción con ditizona. Los islotes de ratón se aislaron mediante separación por gradiente de densidad después de perfundir el páncreas con Liberase TL (Roche, #05401020001) a través del conducto biliar común. Después de una digestión de 13 min a 37 °C, la solución de páncreas se lavó y filtró a través de un filtro de malla de alambre de 400 jm y los islotes se separaron mediante centrifugación en gradiente Histopaque (Sigma-Aldrich, #H 1077) o mediante selección manual bajo un microscopio de disección. Los islotes aislados se cultivaron durante la noche en medio RPMI-1640 (Gibco), complementado con FBS al 10 % (v/v), HEPES 10 mM, pmercaptoetanol 50 jM, piruvato de sodio 1,0 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 jg/ml a 37 °C con 5 % de CO2 en atmósfera de aire. Se seleccionaron a mano hasta 50 islotes y se transfirieron a una placa nueva que contenía una solución de ditizona de 100 jg/ml. Los islotes se tiñeron durante un máximo de 10 min y se volvieron a transferir a una solución de PBS para microscopía (microscopio confocal Zeiss).

Análisis de inmunoelectrotransferencia. Los islotes se lisaron en tampón de lisis RIPA y se determinó la concentración de proteína. Se resolvieron 20 jg del lisado celular total mediante SDS/PAGE mediante el uso de gel prefabricado Criterion TGX 4-20 % (Bio-Rad) en condiciones reductoras y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se sondearon con un anticuerpo policlonal de conejo a-SLC30A8 de ratón (hecho a medida en Thermo Fisher) y se detectaron mediante el uso de un sistema de detección quimioluminiscente potenciado. El Ab policlonal SLC30A8 se generó frente a un péptido que abarca los aminoácidos 29-43 de la proteína SLC30A8 de ratón.

Sobreexpresión de R138X e inhibición proteosómica. El SLC30A8 WT humano y los primeros 137 aminoácidos seguidos de un codón de parada se clonaron con una etiqueta myc C-terminal. Se sembraron células HEK293 (0,4 * 106 células/pocillo) en una placa de 6 pocillos. Al día siguiente, las células se transfectaron con 0,1 jg de ADN/pocillo mediante el uso de Mirus TransIT-TL1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Dos días después de la transfección, se añadió DMSO, inhibidores proteosómicos (MG-132 10 jM o epoxomicina 1 jM ) o lisosomales (sal de cloroquina 10 jg/ml). Las células se recolectaron después de 6 h de tratamiento en tampón RIPA. Se analizaron 30 jg de los lisados celulares mediante inmunoelectrotransferencia.

Análisis qPCR. Se mezclaron entre 37,5 nanogramos y 375 nanogramos de ARN, por ensayo de RT-qPCR a ejecutar, con mezcla maestra SuperScript® VILO™ (ThermoFisher, núm. cat. 11755500) y se sometieron a ciclos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se diluyó con agua libre de nucleasas a entre 0,5 nanogramos por microlitro y 5 nanogramos por microlitro. Los ensayos de RT-qPCR se realizaron mediante la combinación de agua, mezcla maestra (ThermoFisher, núm. cat. 4370074 o Bioline, núm. cat. CSA-01113) y una mezcla de ensayo 20X. La mezcla de ensayo era una mezcla disponible comercialmente de cebadores directos e inversos combinados con una secuencia de sonda marcada con fluorescencia y apagada (ThermoFisher, núm. cat. 351372 o LGC BioSearch, núm. cat. DLO-RFBL-MIX). Las muestras se analizaron por triplicado en una placa de 384 pocillos (ThermoFisher, núm. cat. 4343370) al pipetear 5 microlitros de ADNc diluido y 10 microlitros del ensayo de RT-PCR apropiado en cada pocillo. La placa de 384 pocillos se cubrió con un sello ópticamente transparente (Agilent, núm. cat. 16985-001), se centrifugó y se leyó en un sistema de PCR rápido en tiempo real ABI 7900HT con módulo de bloque de 384 pocillos y accesorio de automatización (ThermoFisher, núm. cat. 4329002) durante 40 ciclos de acuerdo con las especificaciones de la mezcla maestra usada. Las secuencias de la sonda y los cebadores de

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un roedor cuyo genoma comprende un locus Slc30a8 endógeno que comprende un gen Slc30a8 mutado, en donde el gen Slc30a8 mutado comprende una mutación sin sentido en el extremo 3' del tercer exón del gen Slc30a8 y da como resultado que el roedor tenga una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un roedor sin la mutación.

2. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la capacidad potenciada para la secreción de insulina es en respuesta a la hiperglucemia,

opcionalmente, en donde el roedor tiene una mayor secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina con relación al roedor sin la mutación, y

opcionalmente, en donde el aumento de la secreción de insulina en respuesta a la hiperglucemia inducida por la inhibición del receptor de insulina no está asociado con el aumento de la proliferación de células beta o de la masa de células beta con relación al roedor sin la mutación.

3. El roedor de cualquier reivindicación anterior, en donde la capacidad potenciada para la secreción de insulina es cuando se alimenta con una dieta con alto contenido de grasas,

opcionalmente, en donde el roedor tiene una mayor secreción de insulina con relación al roedor sin la mutación cuando se alimenta con una dieta con alto contenido de grasas, en donde el aumento de la secreción de insulina está asociado con un aumento de la proliferación de células beta o de la masa de células beta con relación al roedor sin la mutación, y

opcionalmente, en donde el aumento de la proliferación de células beta es dependiente del receptor de insulina.

4. El roedor de cualquier reivindicación anterior, en donde:

(I) la mutación sin sentido está en un codón que corresponde al codón que codifica R138 en la SEQ ID NO: 14 cuando la proteína SLC30A8 codificada por el gen Slc30a8 mutado está óptimamente alineada con la SEQ ID NO: 14; y/o

(II) la mutación sin sentido está en una posición que corresponde al residuo 412 en la SEQ ID NO: 21 cuando la secuencia codificante del gen Slc30a8 mutado está óptimamente alineada con la SEQ ID NO: 21.

5. El roedor de cualquier reivindicación anterior, en donde el gen Slc30a8 mutado es endógeno al roedor.

6. El roedor de cualquier reivindicación anterior, en donde el roedor es una rata o un ratón.

7. El roedor de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el roedor es el ratón.

8. El roedor de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el gen Slc30a8 mutado codifica una proteína SLC30A8 que comprende la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 13 y/o en donde el gen Slc30a8 mutado comprende la secuencia codificante expuesta en la SEQ ID NO: 22.

9. El roedor de cualquier reivindicación anterior, en donde:

(I) el roedor tiene una expresión del gen mitocondrial disminuida con relación al roedor sin la mutación; y/o

(II) el roedor tiene una expresión de Hvcn1 aumentada con relación al roedor sin la mutación; y/o (III) el roedor tiene una homeostasis de la glucosa normal y una secreción de insulina inducida por glucosa en una dieta con alimento balanceado de control con relación al roedor sin la mutación; y/o (IV) el roedor tiene un fenotipo metabólico normal con una dieta de alimento balanceado de control con relación al roedor sin la mutación; y/o

(V) los niveles de expresión del ARNm de Slc30a8 en los islotes del roedor son al menos el 25 % de los niveles de expresión del ARNm de Slc30a8 en los islotes del roedor sin la mutación.

10. El roedor de cualquier reivindicación anterior, en donde el roedor tiene una o más o todas las siguientes características con relación al roedor sin la mutación:

(a) aumento de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas;

(b) aumento de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas;

(c) aumento del número de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; y

(d) aumento de los niveles de insulina plasmática después del bloqueo del receptor de insulina.

11. El roedor de cualquier reivindicación anterior, en donde el roedor tiene una o más o todas de las siguientes características con relación al roedor sin la mutación:

(a) aumento de los niveles de insulina circulante después de alimentarse con la dieta con alto contenido de grasas durante 20 semanas;

(b) aumento del número de células beta pancreáticas después de alimentarse con la dieta con alto contenido de grasas durante 20 semanas;

(c) disminución de la relación proinsulina/insulina cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; y

12. El roedor de cualquier reivindicación anterior, en donde el roedor es heterocigoto para la mutación.

13. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el roedor es homocigoto para la mutación.

14. El roedor de cualquier reivindicación anterior, en donde el roedor es macho.

15. El roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el roedor es hembra.

16. Un método para evaluar un compuesto por su actividad para mejorar o exacerbar la diabetes tipo 2, que comprende:

(a) poner en contacto un sujeto roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15 con el compuesto; y

(b)

(I) medir uno o más de los siguientes en el sujeto roedor con relación a un roedor de control que no estuvo en contacto con el compuesto, en donde el roedor de control comprende la misma mutación de Slc30a8 que el sujeto roedor: (1) secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimenta con una dieta con alto contenido de grasas; (2) niveles de proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (3) número de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; y (4) niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina,

por lo que la actividad para mejorar la diabetes tipo 2 se identifica mediante uno o más de los siguientes en el sujeto roedor en comparación con el roedor de control: (1) aumento de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (2) aumento de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (3) aumento del número de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; y (4) aumento de los niveles de insulina plasmática con alimentos después del bloqueo del receptor de insulina, y

por lo que la actividad para exacerbar la diabetes tipo 2 se identifica mediante uno o más de los siguientes en el sujeto roedor en comparación con el roedor de control: (1) disminución de la secreción de insulina inducida por glucosa cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (2) disminución de la proliferación de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; (3) disminución del número de células beta pancreáticas cuando se alimenta con la dieta con alto contenido de grasas; y (4) disminución de los niveles de insulina plasmática después del bloqueo del receptor de insulina; o

(II) medir uno o más de los siguientes en el sujeto roedor con relación a un roedor de control que no entró en contacto con el compuesto, en donde el roedor de control comprende la misma mutación de Slc30a8 que el sujeto roedor: (1) capacidad para secretar insulina en respuesta a la hiperglucemia; (2) eliminación de insulina; (3) expresión génica mitocondrial; y (4) expresión de Hvcn1,

por lo que la actividad para mejorar la diabetes de tipo 2 se identifica mediante uno o más de los siguientes en el sujeto roedor en comparación con el roedor de control: (1) aumento de la capacidad para secretar insulina en respuesta a la hiperglucemia; (2) aumento de la eliminación de insulina; (3) disminución de la expresión génica mitocondrial; y (4) aumento de la expresión de Hvcn1, y

por lo que la actividad para exacerbar la diabetes de tipo 2 se identifica mediante uno o más de los siguientes en el sujeto roedor en comparación con el roedor de control: (1) disminución de la capacidad para secretar insulina en respuesta a la hiperglucemia; (2) disminución de la eliminación de insulina; (3) aumento de la expresión génica mitocondrial; y (4) disminución de la expresión de Hvcnl.

17. Una célula de roedor cuyo genoma comprende un locus Slc30a8 endógeno que comprende un gen Slc30a8 mutado, en donde el gen Slc30a8 mutado comprende una mutación sin sentido en el extremo 3' del tercer exón del gen Slc30a8, y en donde un roedor que comprende el gen Slc30a8 mutado tiene una capacidad potenciada para la secreción de insulina con relación a un roedor sin la mutación.

18. Un método para generar el roedor de una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende:

(I)

(a) modificar el genoma de una célula pluripotente de roedor para comprender el locus Slc30a8 endógeno que comprende el gen Slc30a8 mutado que comprende la mutación sin sentido en el extremo 3' del tercer exón del gen Slc30a8;

(b) identificar o seleccionar la célula pluripotente de roedor modificada genéticamente que comprende el locus Slc30a8 endógeno que comprende el gen Slc30a8 mutado;

(c) introducir la célula pluripotente de roedor modificada genéticamente en un embrión huésped de roedor; y

(d) gestar el embrión huésped de roedor en una madre sustituta de roedor; o

(II)

(a) modificar el genoma de un embrión en etapa unicelular de roedor de modo que comprenda el locus Slc30a8 endógeno que comprende el gen Slc30a8 mutado;

(b) seleccionar el embrión en etapa unicelular de roedor modificado genéticamente que comprende el locus Slc30a8 endógeno que comprende el gen Slc30a8 mutado; y

(c) gestar el embrión en etapa unicelular de roedor modificado genéticamente en una madre sustituta de roedor.