ES2908096T3

ES2908096T3 - Péptido con actividad inhibidora de la fibrosis y composición que lo contiene

Info

Publication number: ES2908096T3
Application number: ES15777036T
Authority: ES
Inventors: Sang Jae Kim
Original assignee: GemVax and Kael Co Ltd
Current assignee: GemVax and Kael Co Ltd
Priority date: 2014-04-11
Filing date: 2015-04-10
Publication date: 2022-04-27
Anticipated expiration: 2035-04-10
Also published as: CN106456697B; KR102373603B1; EP3130345B9; EP3130345A1; KR20160135358A; US20180207241A1; US20170028035A1; CN106456697A; WO2015156649A1; EP3130345B1; JP6748155B2; JP2017513941A; JP6420459B2; ES2908096T9; EP3130345A4; US9937240B2; JP2018193384A

Abstract

Una composición antifibrosis para su uso en la prevención o el tratamiento de la fibrosis, que comprende: al menos un péptido eficaz para inhibir la fibrosis y seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos.

Description

DESCRIPCIÓN

Péptido con actividad inhibidora de la fibrosis y composición que lo contiene

Campo técnico

La presente invención se refiere a un péptido que tiene un efecto antifibroso y a una composición que incluye el mismo, y más particularmente, a una composición antifibrosa que incluye un péptido derivado de la telomerasa y que, de este modo, es eficaz para inhibir la aparición de la fibrosis de diversos tipos de células tisulares.

Técnica anterior

La fibrosis es una enfermedad que provoca la formación anormal, la acumulación y la precipitación de una matriz extracelular, causada por los fibroblastos, y se refiere a la acumulación anormal de una matriz de colágeno debido a una lesión o a una inflamación que modifica las estructuras y las funciones de diversos tipos de tejidos. Independientemente de dónde surja la fibrosis, la mayoría de las etiologías de la fibrosis incluyen la acumulación excesiva de una matriz de colágeno que sustituye al tejido normal. En particular, la fibrosis que se produce en el riñón, el hígado, el pulmón, el corazón, el hueso o la médula ósea y la piel induce el fallo de los órganos y conduce a la muerte en el peor de los casos. El fibroblasto sirve para formar el tejido fibroso por medio de la producción de un precursor de la matriz extracelular en estado normal. La matriz extracelular, que es un material entre las células del tejido conjuntivo, existe en forma de una proteína tal como la fibronectina, la laminina, la condronectina o el colágeno.

Mientras tanto, el TGF-p desempeña diversas funciones en la formación y acumulación anormal de la matriz extracelular causada por los fibroblastos, la proliferación celular, la inflamación y la metástasis de las células cancerosas, y se han identificado numerosas vías de señalización celular y objetivos. En consecuencia, en numerosos modelos de enfermedad se ha estudiado el TGF-p, y los campos en los que el estudio sobre el TGF-p y el desarrollo de fármacos relacionados son más activos pueden ser las enfermedades fibróticas y el cáncer.

En el mecanismo del TGF-p, generalmente, el TGF-p se une a un receptor del TGF-p para inducir la fosforilación de las proteínas Smad en el citoplasma y transfiere señales a través de interacciones con diversas proteínas Smad. En este caso, Smad2 y Smad3 suelen estar implicadas, y Smadl y Smad5 participan en la señalización de la proteína morfogénica ósea (BMP). Además, se sabe que Smad4 es una sustancia de señalización común implicada en la activina y la BMP, así como en el TGF-p (Heldin, CH et al. Nature, 1997, 390, págs. 465 a 471 Massague J. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, págs. 753 a 791).

Dado que la inhibición de la invasión tumoral y la transición epitelio-mesénquima (EMT) están reguladas por la inhibición del mecanismo de señalización del TGF-p, cabe esperar excelentes efectos terapéuticos contra el cáncer. Además, teniendo en cuenta que el TGF-p es la citoquina crítica en la regulación de la proliferación y la diferenciación celular, también ha atraído la atención como procedimiento terapéutico para prevenir la fibrosis causada por la radiación, que se menciona como el principal efecto secundario de un tratamiento contra el cáncer (Zhang et al. JRadiat Res. 2013, 54, págs. 630 a 636).

Recientemente, Esbriet® (Pirfenidona) aprobado por la FDA (15 de octubre de 2014) como agente terapéutico para la fibrosis pulmonar idiopática es un inhibidor del TGF-p, que se sabe que tiene la inhibición de la formación del TGF-p como mecanismo de acción principal. Además, se ha informado de que el TGF-p es un factor regulador de la proliferación celular, que induce o suprime la proliferación celular y, de este modo, desempeña un papel importante en la patogénesis de diversas enfermedades, tales como el cáncer, las enfermedades cardíacas y la diabetes, y también se han comunicado diversas actividades fisiológicas del mismo. Por ejemplo, Esbriet® (Pirfenidona) actúa como un inhibidor de la síntesis del TGF-p (inhibición de la formación de un factor regulador de la proliferación celular), un antagonista del TGF-p (alteración de un receptor del TGF, alteración de la señalización) un antagonista del PDGF (factor de crecimiento derivado de las plaquetas) (inhibición del factor inductor de la angiogénesis), un inhibidor de la MAP quinasa p38 (inhibición de la enzima de señalización de la proliferación celular) y un agente antiinflamatorio (inhibición de la formación del TNF-alfa y de la MAPK). Por lo tanto, si se puede desarrollar una nueva composición farmacéutica que sea eficaz en la inhibición directa del TGF-p o en el bloqueo de un procedimiento de señalización implicado en el TGF-p e incluso que no tenga ningún efecto secundario, dicha composición farmacéutica puede prevenir y tratar diversas enfermedades y la senectud, que son causadas por la fibrosis.

En particular, en un entorno de cáncer, hay diversos factores que causan fibrosis, tales como el tejido canceroso, los agentes anticancerígenos y la radioterapia, y por lo tanto la inhibición de la fibrosis tiene más importancia en el entorno del cáncer. Se sabe que los tratamientos anticancerígenos más populares en la actualidad, la radioterapia y la quimioterapia, atenúan considerablemente la calidad de vida del paciente y empeoran gravemente el pronóstico del tratamiento anticancerígeno debido a los efectos secundarios causados por la fibrosis y otros.

Por esta razón, existe una demanda para desarrollar un agente terapéutico para inhibir el mecanismo de señalización del TGF-p asociado al cáncer que será útil no sólo para desarrollar vacunas contra el cáncer, sino también para ser nuevos agentes terapéuticos y procedimientos para maximizar los efectos del tratamiento anticancerígeno convencional. Por ejemplo, en el tratamiento anticancerígeno, la fibrosis causada por el tejido canceroso, un agente anticancerígeno o la exposición a la radiación interfiere con la administración y la eficacia de un fármaco diseñado para mostrar un efecto anticancerígeno cuando un agente anticancerígeno se administra a una región cancerosa e impide un tratamiento anticancerígeno eficaz al bloquear la transferencia de células inmunitarias anticancerígenas a la región cancerosa. Por lo tanto, si una nueva composición farmacéutica que no tiene ningún efecto secundario en el cuerpo humano y es capaz de inhibir la fibrosis causada por el tejido canceroso, un agente quimioterapéutico, o la exposición a la radiación, el tratamiento contra el cáncer puede ser más eficaz.

Documentos de la técnica anterior

(Documento de patente núm. 0001) KR1019930001915 A

(Documento de patente núm. 0002) KR1020040107492 A

(Documento de patente núm. 0003) WO 2013/135266 A1

Brunsvig et al. Clinical Cáncer Research vol. 17, núm. 21, 2011, págs. 6847 a 6857

WO 2013/135266 A1 y Brunsvig et al. (2011) informan de un estudio clínico en el que se utilizó GV1001 (SEQ ID NO: 1) para la vacunación de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) que habían recibido quimioterapia con docetaxel y radioterapia en las últimas 4 semanas.

Divulgación

Problema técnico

Con los antecedentes descritos anteriormente, los inventores intentaron desarrollar una composición antifibrosis que tuviera excelentes efectos sin un efecto secundario y, de este modo, completaron la presente invención.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una composición eficaz antifibrosis.

Solución técnica

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición antifibrosis para su uso en la prevención o el tratamiento de la fibrosis, que incluye al menos uno seleccionado del grupo que consiste en un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1 (en adelante en la presente memoria, denominado "PEP1") y una variante del mismo en la que uno, dos o tres aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos.

En la composición de uso de acuerdo con la presente invención, la fibrosis puede ser inducida por al menos una seleccionada del grupo que consiste en cáncer, administración de un agente anticancerígeno y exposición a la radiación.

En la composición para uso de acuerdo con la presente invención, la composición puede inhibir la fibrosis del tejido celular canceroso seleccionado del grupo que consiste en cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, melanoma y cáncer de ovario.

En la composición para uso de acuerdo con la presente invención, la composición se puede utilizar en combinación con un agente quimioterapéutico o una radioterapia para inhibir la fibrosis del tejido canceroso. El agente quimioterapéutico puede ser al menos uno seleccionado entre los análogos de desoxinucleótidos y las fluoropirimidinas, en los que el análogo de desoxinucleótidos puede ser gemcitabina, y la fluoropirimidina puede ser 5-fluorouracilo o capecitabina.

En la composición para uso de acuerdo con la presente invención, la composición puede ser una composición farmacéutica que incluye además excipientes y aditivos farmacéuticamente aceptables.

En la composición de uso de acuerdo con la presente invención, la composición puede ser una composición antifibrosis que interviene en un proceso de señalización del TGF-p y, por tanto, inhibe la fibrosis del tejido dérmico. En la composición para uso de acuerdo con la presente invención, la composición puede incluir además excipientes, lubricantes y aditivos aceptables, y puede ser una composición cosmética.

Efectos ventajosos

De acuerdo con la presente invención, un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1, una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos, y una composición que incluye la misma, tienen un excelente efecto antifibrosis sin efectos secundarios. Por lo tanto, la fibrosis tisular causada por un proceso de señalización del TGF-p, en particular, la fibrosis causada por el tejido canceroso o la fibrosis causada por agentes anticancerígenos o por la exposición a la radiación acompañada de un tratamiento anticancerígeno, etc., se puede inhibir eficazmente y es muy útil para prevenir y/o tratar una enfermedad fibrótica.

Descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama que ilustra un procedimiento experimental completo de preparación de modelos de xenoinjerto, en el que se inoculan ratones desnudos con células AsPCI y luego se les administra PEP1 y gemcitabina, a partir de 10 días después.

La FIG. 2 es un gráfico que muestra el peso de cada ratón de un control en el que los ratones desnudos inoculados con células AsPC1 no son tratados con nada, de grupos en los que se administra cada uno de PEP1 y gemcitabina a ratones desnudos inoculados con células AsPC1 a partir de 10 días después de la inoculación y de un grupo en el que se administra una combinación de PEP1 y gemcitabina a ratones desnudos inoculados con células AsPC1 desde 10 días después de la inoculación hasta 24 días después de la administración para detectar los efectos anticancerígenos in vivo de PEP1 y gemcitabina.

La FIG. 3 muestra imágenes de células del control en las que los ratones desnudos inoculados con células AsPC1 no son tratados con nada.

La FIG. 4 muestra imágenes de las células del grupo en el que se administra PEP1 por vía subcutánea a los ratones desnudos inoculados con células AsPC1 una vez al día, a partir de los 10 días después de la inoculación.

La FIG. 5 muestra imágenes de células del grupo en el que se administra gemcitabina por vía intraperitoneal a los ratones desnudos inoculados con células AsPC1 una vez cada tres días, a partir de los 10 días después de la inoculación.

La FIG. 6 muestra imágenes de las células del grupo en el que se administran tanto PEP1 (una vez al día, por vía subcutánea) como gemcitabina (una vez cada tres días, por vía intraperitoneal) a los ratones desnudos inoculados con células AsPC1 a partir de los 10 días después de la inoculación.

La FIG. 7 es un gráfico que muestra la expresión relativa de Sma2, que se evalúa por medio de qRT-PCR, en un control en el que una línea celular HepG2 no se trata con nada y un grupo experimental en el que una línea celular HepG2 no se trata con nada después del tratamiento con TGF-p1, un control positivo en el que se administra SB431542 en una línea celular HepG2, y grupos experimentales en los que se administra PEP1 en líneas celulares HepG2 a diferentes concentraciones (1, 5 y 10 |jM).

La FIG. 8 es un gráfico que muestra las relaciones de inhibición de Smad2 (%) en cada grupo del experimento en el que las líneas celulares HepG2 son tratadas con TGF-p1 y luego tratadas con PEP1 a diferentes concentraciones (1, 5 y 10 j M).

La FIG. 9 es un gráfico que muestra la expresión relativa de Smad4, que se evalúa por medio de qRT-PCR, en un control en el que una línea celular HepG2 no se trata con nada y un grupo experimental en el que una línea celular HepG2 no se trata con nada después del tratamiento con TGF-p1, un control positivo en el que se administra SB431542 en una línea celular HepG2, y grupos experimentales en los que se administra PEP1 en líneas celulares HepG2 a diferentes concentraciones (1, 5 y 10 ^jM).

La FIG. 10 es un gráfico que muestra las relaciones de inhibición de Smad4 (%) en los grupos de experimentación en los que se administra PEP1 en las líneas celulares HepG2 a diferentes concentraciones (1, 5 y 10 j M), tras el tratamiento con TGF-p1.

La FIG. 11 es un gráfico que muestra la expresión relativa de fibronectina, que se evalúa por medio de qRT-PCR, en un control en el que una línea celular HepG2 no se trata con nada y un grupo experimental en el que una línea celular HepG2 no se trata con nada después del tratamiento con TGF-p1, un control positivo en el que se administra SB431542 a una línea celular HepG2, y grupos experimentales en los que se administra PEP1 a líneas celulares HepG2 a diferentes concentraciones (1, 5 y 10 ^jM).

La FIG. 12 es un gráfico que muestra las relaciones de inhibición de la fibronectina (%) en un control positivo en el que las líneas celulares HepG2 son tratadas con SB431542 y los grupos de experimentación en los que se administra PEP1 a las líneas celulares HepG2 a diferentes concentraciones (1, 5 y 10 j M), después del tratamiento con TGF-p1.

La FIG. 13 muestra los estados de los cultivos celulares en los controles en los que los queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEKs) son tratados con un placebo (simulación) y los grupos experimentales tratados con 1 mM de PEP1 10 días después de que uno de cada grupo sea expuesto a la radiación (6 Gy, radiación ionizante (IR)) y el otro de cada grupo no sea expuesto.

La FIG. 14 son imágenes de electroforesis que muestran las expresiones de GRHL2, p63, N-Cad y P-Akt en las células de los controles en los que las NHEK son tratadas con un placebo (simulación) y los grupos del experimento tratados con 1 mM de PEP1 un día y 10 días después de que uno de cada grupo sea expuesto a la radiación (6 Gy, radiación ionizante (IR)) y el otro de cada grupo no sea expuesto.

La FIG. 15 son imágenes de western blot que muestran las expresiones de p-Smad2/3, Smad4, FN, Snail y N-Cad en las células de un control en el que las NHEK son tratadas con un placebo (simulación) y un grupo experimental tratado con 1 mM de PEP 1 después de ser expuestas a la radiación (6 Gy, IR).

Modos de la invención

En adelante en la presente memoria, la presente invención se describirá en mayor detalle con referencia a realizaciones ejemplares. Sin embargo, la presente invención no se limita a divulgaciones específicas. A fin de explicar la presente invención, se omitirán las descripciones detalladas sobre la tecnología relacionada conocida en la técnica cuando se determine que podrían oscurecer la esencia de la presente invención.

Se sabe que el telómero, que es un material genético repetitivo situado en cada extremo de un cromosoma, impide que se dañe el cromosoma correspondiente o que se acople a un cromosoma diferente. El telómero se acorta gradualmente con las divisiones celulares, por lo que llega a ser muy corto después de un cierto número de divisiones celulares, y la célula finalmente se deja de dividir y muere. Por otro lado, se sabe que el alargamiento de los telómeros prolonga la vida de una célula. Por ejemplo, se sabe que, en las células cancerosas, se segrega una enzima llamada telomerasa para evitar el acortamiento de los telómeros, lo que da lugar a una proliferación constante de las células cancerosas, sin que éstas mueran. Los inventores identificaron que un péptido derivado de la telomerasa es eficaz para inhibir la fibrosis y completaron de este modo la presente invención.

En un aspecto de la presente invención, un péptido de SEQ. ID. NO: 1 o una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos que incluye la telomerasa, en particular, un péptido derivado de la telomerasa de Homo sapiens.

El siguiente párrafo no forma parte de la invención, pero se desvela en la memoria descriptiva que el péptido puede incluir un péptido que tenga una homología de secuencia del 80% o superior, del 85% o superior, del 90% o superior, del 95% o superior, del 96% o superior, del 97% o superior, del 98% o superior, o del 99% o superior. Además, el péptido desvelado en la memoria descriptiva puede incluir un péptido de SEQ. ID. NO: 1, un fragmento del mismo y un péptido en el que se modifican al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete aminoácidos. El siguiente párrafo no forma parte de la invención pero se desvela en la memoria descriptiva que algunos aminoácidos en un péptido que hace que las características fisicoquímicas del péptido de SEQ. ID. NO: 1 cambiado puede ser modificado dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, los aminoácidos pueden ser modificados para permitir que el péptido tenga una mayor estabilidad térmica, cambie la especificidad del sustrato y cambie el pH óptimo.

El término "aminoácido" que se usa en la presente memoria incluye no sólo los 22 aminoácidos estándar que se integran naturalmente en el péptido, sino también los isómeros D y los aminoácidos transformados. Por lo tanto, en un aspecto de la presente invención, un péptido incluye en la presente memoria un péptido que tiene aminoácidos D. Por otra parte, en otro aspecto de la presente invención, un péptido puede incluir aminoácidos no estándar, tales como los que han sido modificados postraduccionalmente. Los ejemplos de modificación postraduccional incluyen la fosforilación, la glucosilación, la acilación (que incluye a la acetilación, la miristorilación y la palmitoilación), la alquilación, la carboxilación, la hidroxilación, la glicación, la biotinilación, la ubiquitinilación, una transformación de las propiedades químicas (por ejemplo, la desiminación que elimina p, la desaminación) y una transformación estructural (por ejemplo, la formación de un puente disulfuro). La modificación postraduccional también incluye los cambios de aminoácidos que se producen debido a las reacciones químicas cuando se acoplan con reticulantes para formar un conjugado peptídico, por ejemplo, un cambio de un aminoácido que se produce en un grupo amino, un grupo carboxilo o una cadena lateral.

El péptido desvelado en la presente memoria puede ser un péptido de tipo salvaje identificado y aislado de una fuente natural. Mientras tanto, el péptido desvelado en la memoria descriptiva puede ser una variante artificial que comprende una secuencia de aminoácidos en la que uno o más aminoácidos son sustituidos, eliminados y/o insertados, en comparación con los fragmentos del péptido de SEQ. ID. NO: 1. El cambio de aminoácidos en el polipéptido de tipo salvaje, así como en la variante artificial, es la sustitución de aminoácidos conservadores, que no tiene una influencia significativa en el plegamiento y/o la actividad de una proteína. La sustitución conservadora se puede llevar a cabo en el intervalo del grupo que consiste en aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutámico y ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina y asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina, valina y metionina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptófano y tirosina) y aminoácidos pequeños (glicina, alanina, serina y treonina). En general, la sustitución de aminoácidos que no cambia una actividad específica es conocida en la técnica. Los intercambios más frecuentes tienen lugar entre Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Tre/Ser, Ala/Gli, Ala/Tre, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gli, Tir/Fe, Ala/Pro, Lis/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu y Asp/Gli, y viceversa. Otros ejemplos de la sustitución conservadora se muestran en la Tabla 1.

En cuanto a las propiedades biológicas del péptido, se lleva a cabo una modificación sustancial por medio de la selección de una porción de sustitución que tiene un efecto considerablemente diferente en (a) el mantenimiento de la estructura de la columna vertebral, por ejemplo, una estructura tridimensional en forma de hoja o hélice, del polipéptido en una región sustituida, (b) el mantenimiento de la carga o la hidrofobicidad de la molécula en un sitio objetivo, o (c) el mantenimiento de la masa de una cadena lateral. Los residuos naturales se clasifican en los siguientes grupos, de acuerdo con las propiedades generales de la cadena lateral:

(1) Hidrofóbico: norleucina, met, ala, val, leu, ile;

(2) Hidrófilo neutro: cis, ser, tre;

(3) Ácido: asp, glu;

(4) Básico: asn, gln, his, lis, arg;

(5) Residuos que afectan a la conformación de la cadena: gli, pro; y

(6) Aromáticos: trp, tir, fe.

No de acuerdo con la invención pero desveladas en la presente memoria son sustituciones no conservativas llevadas a cabo por el intercambio de un miembro de uno de los grupos al de otro grupo. Cualquier residuo de cisteína, que no esté asociado al mantenimiento de la estructura tridimensional adecuada del péptido, se puede sustituir típicamente por serina, para de este modo aumentar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar enlaces cruzados inadecuados, y, a la inversa, se puede conseguir una mayor estabilidad por medio de la adición de enlace(s) de cisteína al péptido.

No de acuerdo con la invención pero desvelado en la presente memoria son un tipo diferente de variante de aminoácido del péptido se hace por medio del cambio de un patrón de glicosilación de un anticuerpo. El término "cambio" que se usa en la presente memoria se refiere a la supresión de uno o más residuos de carbohidratos que se encuentran en el péptido y/o la adición de uno o más sitios de glicosilación que no existen en el péptido.

La glicosilación en los péptidos es típicamente una glicosilación ligada a N u O. El término "glicosilación ligada al N" utilizado aquí se refiere a la unión de residuos de carbohidratos a las cadenas laterales de los residuos de asparagina. Como secuencias tripéptidas, la asparagina-X-serina y la asparagina-X-treonina (donde la X es cualquier aminoácido, a excepción de la prolina) son secuencias de reconocimiento para fijar enzimáticamente un residuo de carbohidrato a una cadena lateral de una asparagina. Por lo tanto, cuando una de estas secuencias tripéptidas está presente en un polipéptido, se crea un sitio potencial de glicosilación. La "glicosilación ligada a O" que se usa en la presente memoria se refiere a la unión de uno de los sacáridos, por ejemplo, la N-acetilgalactosamina, la galactosa o la xilosa, a hidroxiaminoácidos y, más típicamente, a la serina o la treonina, pero también se pueden utilizar la 5-hidroxiprolina o la 5-hidroxilisina.

No de acuerdo con la invención, pero desvelado en la presente memoria, la adición de un sitio de glicosilación al péptido se lleva a cabo convenientemente por medio del cambio de la secuencia de aminoácidos para que contenga la secuencia de tripéptidos descrita anteriormente (para un sitio de glicosilación ligado a N). Dicho cambio se puede realizar por medio de la adición de uno o más residuos de serina o treonina a la primera secuencia de anticuerpos o por medio de la sustitución en uno de estos residuos (para un sitio de glucosilación ligado a O).

No de acuerdo con la invención, pero desvelado en la presente memoria, es el hallazgo de que el péptido que comprende la secuencia de SEQ. ID. NO: 1 o un fragmento del mismo, o un péptido que tenga un 80% o más de homología de secuencia con la secuencia del péptido tiene baja citotoxicidad y alta estabilidad in vivo. En la presente invención, SEQ. ID. NO: 1 representa el péptido derivado de la telomerasa, que consta de 16 aminoácidos como sigue.

El péptido establecido en SEQ. ID. NO: 1 se muestra en la Tabla 2. El "nombre" que aparece en la Tabla 2 se da para distinguir un péptido de otro. En un aspecto de la presente invención, el péptido establecido en SEQ. ID. NO: 1 representa el péptido completo de la telomerasa humana. En otro aspecto de la presente invención, el péptido que comprende la secuencia de SEQ. ID. NO: 1 o una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos, incluye un "péptido sintético" sintetizado a partir de un péptido presente en un lugar correspondiente que se ha seleccionado entre los péptidos incluidos en la telomerasa. SEQ. ID. NO: 2 representa la secuencia completa de aminoácidos de la telomerasa.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que incluye un péptido con efecto antifibrosis, por ejemplo, un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1 o una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos, como principio activo.

La composición farmacéutica antifibrosis de acuerdo con un aspecto de la presente invención puede incluir un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1 o una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos, con un contenido de 0,01 mg/kg a 0,1 mg/kg, 1 mg/kg o 10 mg/kg, y cuando haya una diferencia de efecto de acuerdo con el contenido, éste se podrá ajustar convenientemente. Cuando la composición incluye el péptido en el intervalo anterior o en un intervalo menor, es adecuada para exhibir un efecto previsto por la presente invención y es capaz de satisfacer tanto los requisitos de estabilidad como de seguridad de la composición. Además, el intervalo anterior puede ser adecuado en términos de rentabilidad.

En un aspecto, la presente invención proporciona un uso de un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1 o una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos, para preparar cualquiera de las composiciones para inhibir las fibrosis descritas anteriormente.

La composición de acuerdo con un aspecto de la presente invención se puede aplicar a todo tipo de animales, que incluyen seres humanos, perros, pollos, cerdos, vacas, ovejas, cobayas y monos.

En un aspecto de la presente invención, la composición puede ser una composición farmacéutica que incluye un péptido que tiene un efecto antifibroso, en el que el péptido consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1 o es una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos. La composición farmacéutica de acuerdo con un aspecto de la presente invención puede ser para su administración por vía oral, rectal, percutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intramedular, intratecal o subcutánea.

La forma de dosificación para la administración oral puede ser, entre otras, comprimidos, píldoras, cápsulas blandas o duras, gránulos, un polvo, una solución o una emulsión. La forma de dosificación para la administración parenteral puede ser, entre otras, inyecciones, goteos, lociones, ungüentos, geles, cremas, suspensiones, emulsiones, un supositorio, un parche o un spray.

La composición farmacéutica de acuerdo con un aspecto de la presente invención, según sea necesario, puede incluir aditivos tales como diluyentes, excipientes, lubricantes, aglutinantes, desintegrantes, tampones, dispersantes, tensioactivos, agentes colorantes, aromatizantes o edulcorantes. La composición farmacéutica de acuerdo con un aspecto de la presente invención se puede preparar por medio de un procedimiento convencional utilizado en la técnica.

El ingrediente activo de la composición farmacéutica de acuerdo con un aspecto de la presente invención puede variar de acuerdo con la edad, el sexo, el peso, la condición patológica y la gravedad del paciente, la vía de administración o el criterio del prescriptor. Las dosis de administración se determinan en base a estos factores por un experto en la técnica, y una dosis diaria de la composición farmacéutica puede ser, por ejemplo, de 0,1 pg/kg/día a 1 g/kg/día, específicamente, de 1 pg/kg/día a 100 mg/kg/día, más específicamente, de 10 pg/kg/día a 10 mg/kg/día, y aún más específicamente, de 50 pg/kg/día a 1 mg/kg/día, pero cuando hay una diferencia en el efecto de acuerdo con la dosis, la dosis se puede ajustar adecuadamente. La composición farmacéutica de acuerdo con un aspecto de la presente invención puede ser para la administración de una a tres veces al día, pero la presente invención no está limitada a ello.

De acuerdo con la presente invención, la composición es una composición antifibrosis, que incluye un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ. ID. NO: 1 o una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos, como principio activo.

En un aspecto de la presente invención, la composición puede ser una composición para inhibir la fibrosis, que es causada por el tejido canceroso, en particular, el cáncer de páncreas, el cáncer de estómago, el carcinoma de células renales, el cáncer de próstata, el cáncer de laringe, el cáncer de esófago, el cáncer de tiroides, el cáncer de pulmón, el cáncer de mama, el cáncer de intestino grueso y delgado, el cáncer de útero, el cáncer de cuello uterino, el cáncer de vejiga urinaria, el cáncer genitourinario, el cáncer de vejiga y el tejido de cáncer de piel.

La composición de acuerdo con un aspecto de la presente invención se puede preparar en forma de comprimido, gránulo, polvo, líquido o sólido. Para cada forma, los ingredientes, distintos de un ingrediente activo, que se utilizan convencionalmente en el campo correspondiente, se pueden mezclar fácilmente según la forma o el propósito de uso por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica y pueden tener un efecto sinérgico cuando se aplican simultáneamente con un material base diferente.

Las dosis de administración del ingrediente activo son determinadas por un experto en la técnica, una dosis diaria de la composición farmacéutica puede ser, por ejemplo, específicamente de 1 pg/kg/día a 100 mg/kg/día, más específicamente de 10 pg/kg/día a 10 mg/kg/día, y aún más específicamente de 50 pg/kg/día a 1 mg/kg/día, y, cuando hay una diferencia en el efecto de acuerdo con el contenido, la dosis puede ser ajustada adecuadamente y puede variar dependiendo de diversos factores, que incluyen la edad del individuo, la condición de salud, complicaciones, etc.

Los términos utilizados en la memoria descriptiva se utilizan únicamente para explicar ejemplos específicos y no para limitar la presente invención. Los sustantivos sin número delante no limitan la cantidad e indican que existe al menos un artículo descrito por el sustantivo. Los términos "incluye", "tiene" y "contiene" se interpretan como términos abiertos (es decir, significa que "incluye pero no se limita").

La mención de un intervalo de valores se debe simplemente a que es una forma fácil de sustituir una alternativa a cada valor incluido en el intervalo. A menos que se indique lo contrario, cada valor se incorpora en la presente memoria como si se refiriera individualmente a la memoria descriptiva. Los valores finales de todos los intervalos se incluyen en cada uno de los intervalos y se pueden combinar independientemente. Todos los procedimientos mencionados en la presente memoria se pueden llevar a cabo en el orden adecuado, a menos que se indique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de alguna o de todas las realizaciones o del lenguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") no sólo sirve para describir mejor la presente invención, sino también para limitar el alcance de la misma. Ningún lenguaje en la memoria descriptiva debe ser interpretado como indicación de que un componente no reclamado es esencial para la implementación de la presente invención. A menos que se defina de otro modo, un término técnico o científico que se usa en la presente memoria tiene el mismo significado que el que suele entender un experto en la técnica.

Las realizaciones ejemplares de la presente invención incluyen el mejor modo conocido por los inventores a fin de poner en práctica la presente invención. Las variaciones de las realizaciones ejemplares pueden ser claramente comprendidas por aquellos expertos en la técnica al leer las descripciones anteriores. Los inventores esperan que aquellos expertos en la técnica utilicen adecuadamente tales variaciones, y esperan además que la presente invención se implemente en modos diferentes a los descritos en la memoria descriptiva. Además, todas las combinaciones de los componentes mencionados en todas las variaciones posibles están incluidas en la presente invención, a menos que se divulgue lo contrario o sea claramente contradictorio con el contexto.

En lo sucesivo, la configuración y el efecto de la presente invención se describirán con más detalle al hacer referencia a ejemplos y a ejemplos experimentales. Si bien los ejemplos y los ejemplos experimentales que se presentan a continuación se proporcionan simplemente para ayudar a comprender la presente invención, la categoría y el alcance de la presente invención no se limitan a ella.

Modos de la invención

Ejemplo 1: Síntesis de péptidos

1. Síntesis de péptidos

Un péptido de SEQ. ID. NO: 1 (en adelante en la presente memoria, "PEP1") se preparó de acuerdo con la síntesis de péptidos sólidos convencionalmente conocida. En concreto, los péptidos se sintetizaron al acoplar los aminoácidos uno a uno desde el C-terminal por medio de una síntesis peptídica en fase sólida (SPPS) de Fmoc mediante el uso de ASP48S (Peptron, Inc., Daejeon, Corea). Las resinas a las que se une el primer aminoácido del extremo C de los péptidos, que se utilizaron en la presente memoria, son las siguientes

Resina NH2-Lis(Boc)-2-cloro-Tritil

Resina NH2-Ala-2-cloro-Tritil

Resina NH2-Arg(Pbf)-2-cloro-Tritil

En todos los componentes de aminoácidos utilizados en la síntesis del péptido, el N-terminal se protegió con Fmoc, y todos los residuos se protegieron con Trt, Boc, t-butiléster (t-Bu), o 2,2,4,6,7-pentametil dihidro-benzofurano-5-sulfonilo (Pbf), que se eliminaron de los ácidos. Estos componentes de aminoácidos son los siguientes: Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Fe-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tre(tBu)-OH, Fmoc-Lis(Boc)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Tir(tBu)-OH, Fmoc-Ahx-OH, Trt-Mercaptoacético.

Como reactivos de acoplamiento, se utilizaron 2-(1H-Benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetametilaminio hexafluorofosfato (HBTU)/N-Hidroxxibenzotriazol (HOBt)/4-Metilmorfolina (NMM). Para la desprotección por Fmoc se utilizó piperidina al 20% en DMF. Para la separación del péptido sintetizado de la resina y la eliminación del grupo de protección del residuo, se utilizó un cóctel de escisión [TFA (ácido trifluoroacético)/TIS (triisopropilsilano)/EDT (etanoditiol)/H2O=92,5/2,5/2,5/2,5].

Cada péptido se sintetizó por medio de la repetición de un procedimiento de protección de los aminoácidos correspondientes con un aminoácido de inicio acoplado a un andamio en fase sólida, lavado con un disolvente y desprotección. Después de cortar el péptido sintetizado de la resina, el péptido se purificó por HPLC, se evaluó por MS para verificar la síntesis y se liofilizó.

De acuerdo con la evaluación por cromatografía líquida de alto rendimiento, todos los péptidos utilizados en el ejemplo tenían una pureza del 95% o superior.

Los procedimientos detallados para preparar el péptido PEP1 fueron los siguientes.

1) Acoplamiento

El aminoácido protegido (8 equivalentes) y los agentes de acoplamiento HBTU (8 equivalentes)/HOBt (8 equivalentes)/NMM (16 equivalentes) disueltos en DMF se añadieron a la resina NH2-Lys(Boc)-2-cloro-Tritil, y la mezcla de reacción se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 2 horas y luego se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.

2) Desprotección Fmoc

Tras la adición de piperidina al 20% en DMF, la mezcla de reacción se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 5 minutos dos veces, y luego se lavó secuencialmente con DMF, MeOH y DMF.

3) Las reacciones 1 y 2 se llevaron a cabo repetidamente para preparar la columna vertebral básica de un péptido, por ejemplo, NH2-E(OtBu)-A-R(Pbf)-P-A-L-L-T(tBu)-S(tBu)-R(Pbf)L-R(Pbf)-F-I-P-K(Boc)-2-cloro-tritilo. 4) Escisión: Se añadió un cóctel de escisión a la resina peptídica previamente sintetizada para separar un péptido de la resina.

5) Tras la adición de éter dietílico refrigerado a la mezcla obtenida, se precipitó el péptido obtenido por centrifugación.

6) Tras la purificación por Prep-HPLC, el péptido se analizó por LC/MS para comprobar el peso molecular y se liofilizó para obtener un polvo.

Ejemplo 2: Inhibición de la fibrosis por PEP1 en el modelo de xenoinjerto de células AsPCI

A fin de verificar los efectos anticancerígenos in vivo de PEP1 y gemcitabina en el cáncer de páncreas, se llevaron a cabo experimentos de xenoinjerto mediante el uso de líneas celulares AsPC1. Un procedimiento de xenoinjerto utilizado en la presente memoria es el siguiente.

Preparación de reactivos y materiales

Los reactivos y materiales utilizados para el experimento son los siguientes. Después de disolver el PEP1 en polvo en agua estéril filtrada de 0,2 pm, se almacenaron alícuotas a -70 °C y se disolvieron antes de su uso, y la gemcitabina se disolvió en solución salina al 100%. el 5-fluorouracilo se disolvió en DMSO.

Preparación de líneas celulares

Las líneas celulares AsPCI (Célula núm. 6 x105 células/ 100 ml), que fueron las líneas celulares utilizadas en el experimento, son células metastásicas de cáncer de páncreas humano compradas al American Type Cell Culture (ATCC, Rockville, MD). Las líneas celulares se cultivaron a 37 °C para obtener una densidad celular de 1 a 2 x6/ml en un medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) que contenía un 10% de suero bovino fetal (FBS), 50 U/ml de penicilina y 50 pg/ml de estreptomicina.

Procedimientos experimentales

Se inyectaron células AsPC1 en cada uno de los grupos de experimentación de ratones desnudos ® a @. Los reactivos y materiales y el procedimiento de cultivo de las líneas celulares, que se utilizaron en el experimento, son los mismos que se describen en el Ejemplo 1.

Las 5 x 106 células AsPC1 cultivadas se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos (ratones desnudos BALB/c-nu/nu, adquiridos en Joongang Laboratory animal, Seúl, Corea). La inyección se llevó a cabo hasta que el cáncer alcanzó un tamaño de 100 mm3 (aproximadamente 10 días). Tras el injerto del cáncer, los ratones se dividieron en grupos, cada uno de los cuales tenía un peso medio similar, y a continuación se inyectaron por vía subcutánea e intraperitoneal la gemcitabina y el Pep1, o ambos, en los ratones de acuerdo con las condiciones de cada uno de los cuatro grupos de experimentación que se indican a continuación (véase la FIG. 1). El volumen del cáncer se midió con calibradores y se calculó por medio de la siguiente fórmula [anchura2 x longitud x 0,52].

Después del injerto, se administró Pep1 y gemcitabina, o ambos, a cada uno de los cuatro grupos del experimento. ® Control de injertos AsPC1

@ Grupo de injerto de AsPC1 PEP12 mg/kg (una vez al día, s.c) administrado

@ grupo de injerto de 2 mg/kg gemcitabina 125 mg/kg (una vez cada tres días, i.p) administrada

@ injerto de 2 mg/kg PEP12 mg/kg (una vez al día, s.c) grupo administrado de gemcitabina 125 mg/kg (una vez cada tres días, i.p)

Después, se cuantificó el peso de cada ratón cada vez. Además, se prepararon muestras de tejido canceroso y se llevó a cabo la tinción del marcador de proliferación celular (PCNA)/marcador de apoptosis (TUNEL).

Para el análisis de los resultados del experimento, se evaluaron llos promedios entre diversos grupos del experimento por medio de una prueba t de estudiante. La norma de significación estadística se ajustó en p=0,0002.

Resultados experimentales

De acuerdo con los análisis de los grupos de experimentos individuales, se puede observar que, cuando se administró una combinación de gemcitabina y PEP1, y gemcitabina, el peso de un ratón fue el más pequeño en el día 20 después de la administración (véase la FIG. 2).

Las FIGS. 3 a 6 células de muestra en cada grupo del experimento.

En el control inoculado con células AsPC1 (grupo ® ; véase la FIG. 3), se demostró que las porciones de colágeno se tiñeron de color azul (correspondientes a las porciones grises oscuras en la FIG. 3) se aumentaron entre las células cancerosas teñidas de color rojo (correspondientes a las partes de color gris claro en la FIG. 3). Es decir, se puede ver que la fibrosis se desarrolla considerablemente debido al cáncer.

En el grupo @ en el que las células AsPCI fueron tratadas con PEP1 (véase la FIG. 4), en comparación con la FIG.

3, partes teñidas de color azul (correspondientes a las partes grises oscuras de la FIG. 4) no se mostraron. Esto indica que el colágeno se redujo y, por lo tanto, la fibrosis se inhibió considerablemente con el PEP1.

Mientras tanto, en el grupo @ en el que las células AsPC1 fueron tratadas con gemcitabina (véase la FIG. 5), se puede ver que las partes teñidas de color rojo (correspondientes a las partes negras en la FIG. 5) se redujeron considerablemente, y las partes teñidas de color azul (correspondientes a las partes de color gris claro en la FIG. 5) se aumentaron. Esto indica que las células cancerosas fueron eliminadas por la gemcitabina, pero la fibrosis se desarrolló considerablemente.

En este caso, las células restantes de color rojo pueden ser probablemente un agente anticancerígeno contra las células madre cancerosas CD133+. En el cáncer de páncreas, se sabía que las células madre cancerosas CD133+ presentan resistencia a la gemcitabina, que es un agente anticancerígeno, y el desarrollo de fibrosis alrededor de estas células demuestra que la administración del fármaco no se lleva bien a cabo.

Sin embargo, en comparación con la FIG. 5, en el grupo @ en el que las células AsPC1 fueron tratadas con PEP1 y gemcitabina (véase la FIG. 6), se observó que las partes teñidas de color azul (correspondientes a las partes de color gris claro en la FIG. 6) se redujeron. Se observó que la fibrosis fue inhibida considerablemente por PEP1, y de este modo la inhibición de la entrega de fármacos debido a la fibrosis se redujo considerablemente, lo que indica que la entrega intracelular de gemcitabina, que es un agente anticancerígeno, puede ocurrir más fácilmente.

Ejemplo 3: Efecto inhibidor del TGF-p de PEP1 en líneas celulares HepG2

Para verificar el efecto inhibidor del TGF-p de PEP1, que se considera la causa principal de la fibrosis, se llevó a cabo un experimento para confirmar una acción inhibidora de la señalización del TGF-p en líneas celulares HepG2 como se indica a continuación.

Preparación de reactivos y materiales

Los reactivos y materiales utilizados en el experimento son los siguientes. Después de disolver el PEP1 en polvo en agua estéril filtrada de 0,2 pm, se almacenaron alícuotas a -70 °C y se disolvieron antes de su uso. Como línea celular se utilizó la HepG2 (ATCC HB-8065; American Type Culture Collection), y el TGF-p1 humano recombinante se disolvió en HCl 4 mM, para de este modo preparar una reserva de 10 pg/mL. El SB431542 (Sigma) utilizado como control positivo se preparó en un stock de 10 mM.

Preparación de líneas celulares

Se sembraron 2*106 células HepG2 (ATCC HB-8065) en una placa de Petri de 60 mm y se cultivaron en una incubadora deCO²durante 16 horas. Después, los medios se transfirieron a medios libres de suero (SFM) y las células se siguieron cultivando durante 24 horas. Posteriormente, se añadieron 10 ng/ml de TGF-p1 a los medios, y luego se trataron diversas concentraciones de PEP1 (0,1, 1, 5, 10 pM) a los medios, seguido de un cultivo durante 72 horas. Cada grupo tratado se cultivó además en una incubadora deCO²durante 1 hora a 37 °C.

Experimento para analizar la expresión de los genes relacionados con la inhibición del TGF-p

El ARN se extrajo de las células tratadas con péptidos mediante el uso de un RNeasy® Plus Mini Kit (Qiagen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se cuantificó el ARN extraído y, a continuación, se sintetizó el ADNc a partir de 1 pg de ARN total por medio de un sistema de transcripción inversa (Promega). Posteriormente, se llevó a cabo la qRT-PCR mediante el uso de un sistema CFX96 en tiempo real (Bio-rad). Como biomarcadores relacionados con el TGF-p, se analizó la expresión de ARNm de la fibronectina (FN), Smad2 y Smad4, y como gen de referencia se utilizó el GAPDH. Para la PCR, los cebadores de cada gen se construyeron como sigue. Los genes se amplificaron en tiempo real mediante el uso de los cebadores de la Tabla 3 que figuran a continuación con 40 ciclos (95 °C, 15 seg, 57 °C, 30 seg, 72 °C, 30 seg). Las secuencias de nucleótidos de los cebadores son las siguientes.

Resultados del experimento

Los efectos inhibidores del TGF-p de PEP1 se evaluaron por medio de qRT-PCR. Tras un cultivo de 48 horas de PEP1 en presencia de TGF-p, se midieron los niveles de expresión de ARNm de los genes relacionados con el TGF-p, tales como Smad2 y Smad4, y se compararon con el gen de referencia GAPDH (véanse las FIGS. 7, 8, 9 y 10). En comparación con el control no tratado, la expresión de Smad2 y Smad4 aumentó en el grupo tratado con TGF-P, y en el control positivo SB431542, en comparación con el grupo tratado con TGF-p, al aumentar la concentración de PEP1, la Smad2 y Smad4, como biomarcadores de TGF-p, se inhibieron de forma dependiente de la concentración. Asimismo, la disminución de la expresión de fibronectina, que es un gen de fibrosis relacionado con el TGF-p, mostrada tras el cultivo de 48 horas de PEP1 en presencia de TGF-p se evaluó comparando los niveles de expresión de ARNm de fibronectina y GAPDH (véase la FIG. 11). En comparación con el control negativo no tratado, en el grupo tratado con TGF-p aumentó la expresión de fibronectina. Mientras tanto, en el control positivo SB431542, en comparación con el grupo tratado con TGF-p, el grupo tratado con PEP1 mostró una inhibición de la fibronectina a medida que se aumentaba la concentración de PEP1. El control positivo (SB431542) mostró una relación de inhibición del 60,7%, y PEP1 mostró una relación de inhibición del 22,8% al 47,5% (véase la FIG. 12).

Tales resultados pueden mostrar que PEP1 tiene un efecto directo de inhibición de la expresión de Smad2 y Smad4, que son genes descendentes implicados en el mecanismo de señalización del TGF-p, e inhibe la expresión de fibronectina inducida por el TGF-p y, de este modo, tiene una posibilidad como agente para prevenir y tratar la fibrosis.

Ejemplo 4: Efecto inhibidor de TGF-4 de PEP1 en líneas celulares NHEK expuestas a la radiación

Para confirmar los efectos de PEP1 en la fibrosis inducida por la exposición a la radiación para el tratamiento anticancerígeno y otros tratamientos tumorales, se llevó a cabo un experimento para confirmar un efecto inhibidor de TGF-p de PEP1 en NHEKs expuestos a la radiación.

Preparación de reactivos y líneas celulares

Se preparó el PEP1 sintetizado de acuerdo con el Ejemplo 1 y un placebo (simulación) como control. Se cultivaron queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK) en una monocapa para utilizarlos en un experimento de exposición a la radiación. Para el experimento de exposición a la radiación, se utilizó radiación ionizada a una intensidad de 6 Gy.

Procedimiento de experimentación

Para examinar la diferenciación celular de las líneas celulares NHEK de acuerdo con la exposición a la radiación, las NHEK fueron tratadas con cada uno de los placebos y 1 mM de PEP1, y luego se dividieron en grupos expuestos a la radiación y grupos no expuestos, seguidos de un cultivo durante 10 días (véase la FIG. 13).

Además, para examinar el cambio en los niveles de expresión de los biomarcadores para las líneas celulares NHEK debido a la exposición a la radiación, las NHEK fueron tratadas con cada uno de los placebos y 1 mM de PEP1 y divididas en grupos no expuestos (-) y grupos expuestos a la radiación (+), y luego se examinaron los niveles de expresión de los biomarcadores en el día 1 y en el día 10 después de la exposición a la radiación (véase la FIG. 14). En la medición de los niveles de expresión de los biomarcadores, se utilizó GAPDH como control de referencia. Además, para observar exactamente la inhibición de la señalización de TGF-p por PEP1 cuando las NHEK se cultivaron continuamente después de la exposición a la radiación, las células se dividieron en un grupo en el que las NHEK expuestas a la radiación (6 Gy, IR) se trataron con un placebo (simulación) y un grupo tratado con 1 pM de PEP1 y luego se cultivaron durante 10 días. Los niveles de expresión de los respectivos marcadores se observaron por medio de la realización de western blot de los biomarcadores relacionados con el TGF-p y la fibrosis (véase la FIG. 15).

Los procedimientos de western blot fueron los siguientes. Las células tratadas con péptidos se lavaron con PBS dos veces, se recogieron en un tubo de centrífuga de 1,5 mL mediante el uso de un rascador de células, y se centrifugaron (1.000 rpm, 4 °C, 2 minutos). Tras eliminar el sobrenadante obtenido, se añadieron 100 pl de tampón RIPA a las NHEK. Las células se cultivaron en hielo durante 40 minutos y se agitaron en vórtex cada 10 minutos (la microcentrífuga se había enfriado previamente a 4 °C), y después se agitó la muestra con una jeringa de 1 ml de 40 a 50 veces. Por último, la muestra se centrifugó a 13.000 rpm durante 15 minutos para obtener un sobrenadante. Se transfirieron 30 g de proteína a una membrana de PVDF (Millipore) por medio de electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida al 8% (SDS-PAGE). La membrana de PVDF se bloqueó con leche desnatada al 5% y se incubó con anticuerpos primarios específicos. Los anticuerpos utilizados en el experimento fueron los siguientes: fibronectina (285 kDa, 5% BSA 1:3000, ab2413, Abcam), N-Cadherina (140 kDa, 5% BSA 1:1000, núm. 4061, Cell Signaling), Smad4 (70 kDa, 5% BSA 1:1000, núm. 9515, Cell Signaling), Smad 2/3 (60, 52 kDa, 5% BSA 11000, núm. 3102, Cell Signaling), P-Akt (60 kDa, 5% BSA 1:1000, núm. 9271, Cell Signaling), pSmad 2/3 (Cell Signaling núm. 3102), GRHL2 (Abcam núm. ab15532), GAPDH (37 kDa, 5% BSA 1:1000, núm. 2118, Cell Signaling).

Posteriormente, la membrana de PVDF se lavó con solución salina tamponada con tris que contenía 0,1% de Tween-20 (TBST) y se hizo reaccionar con anticuerpos anti-conejo conjugados con h Rp (Jackson Immuno Research Laboratories, INC.). Posteriormente, se llevó a cabo la detección con ECL (Amersham Pharmacia Biotech) y las imágenes obtenidas se analizaron con un analizador de imágenes (GE Healthcare, ImageQuant LAS 4000). Resultados experimentales

En un experimento de diferenciación celular en líneas celulares NHEK de acuerdo con la exposición a la radiación, después de una exposición a la radiación, un control mostró diferenciación (desarrollo de fibrosis), pero el grupo tratado con PEP1 apenas mostró diferenciación incluso después de la exposición a la radiación. Estos resultados muestran que la progresión de la fibrosis causada por la exposición a la radiación puede ser inhibida por la administración de PEP1.

En un experimento para observar los cambios en los niveles de expresión de los biomarcadores en las líneas celulares NHEK de acuerdo con la exposición a la radiación, se observaron niveles de aumento de la expresión de los biomarcadores GRHL2, p63 y N-Cad 10 días después de la exposición a la radiación en cada grupo del experimento. Esto demostró que los niveles de expresión de los biomarcadores GRHL2 y p63, que tenían efectos inhibidores de la señalización del TGF-p, disminuyeron en el grupo tratado con placebo y aumentaron en el grupo tratado con PEP1. Dichos resultados demuestran que la expresión de GRHL2 y p63, que tienen efectos inhibitorios sobre la señalización del TGF-p implicada en el desarrollo de la fibrosis tras la exposición a la radiación, fueron aumentados por PEP1.

Mientras tanto, el nivel de expresión de un biomarcador N-Cad expresado en el tejido fibrótico aumentó en el grupo tratado con placebo (simulado) y disminuyó en el grupo tratado con PEP1. El nivel de expresión de P-Akt (fosforilación de Akt (proteína quinasa B)), que es un biomarcador que indica un grado de supervivencia celular, aumentó en el grupo tratado con PEP1. Estos resultados demuestran que PEP1 no sólo puede inhibir el desarrollo de la fibrosis por la exposición a la radiación, sino que también puede participar en un mecanismo de supervivencia celular.

A partir de los resultados del experimento, PEP1 elevó la expresión de GRHL2 y p63 para inhibir el proceso de señalización de TGF-p, y así se pudo inhibir la fibrosis por la señalización de TGF-p causada por la exposición a la radiación. Por lo tanto, se puede ver que el PEP1 tiene una posibilidad como fármaco para prevenir o tratar la fibrosis causada por la exposición a la radiación y la fibrosis de las células del tejido.

Ejemplo 5: Verificación de los efectos defensivos de la radiación in vitro e in vivo y de los efectos inhibidores de la fibrosis tisular de PEP1

Preparación de reactivos, líneas celulares y animales de experimentación

Se preparó el PEP1 sintetizado de acuerdo con el Ejemplo 1 y un placebo (simulado) utilizado como control. Las NHEK se cultivaron en monocapa para preparar un experimento de exposición a la radiación in vitro. Para los experimentos de exposición a la radiación in vitro, in situ e in vivo , se utilizaron radiaciones ionizadas a distintas intensidades que iban de 0 a 10 Gy (0, 2, 4, 6, 8 y 10 Gy).

Mientras tanto, los animales experimentales se dividieron en dos modelos animales. El primer modelo fue un modelo de mucositis oral, que se preparó induciendo una úlcera en la lengua de cada ratón C3H por medio de la exposición de la cabeza y el cuello a la radiación (6 Gy, IR) durante 5 días seguidos. El segundo modelo es un modelo de fibrosis dérmica, que se preparó al inducir la esclerodermia local por medio de la inyección subcutánea de 0,1 cc de una dilución de bleomicina, conocida como causante de la fibrosis pulmonar, en una solución acuosa de NaCl al 0,9% a una concentración de 0,5 mg/ml, una vez al día durante 24 a 28 días.

Procedimiento experimental y resultados

Se llevaron a cabo experimentos in vitro e in situ en líneas celulares NHEK para confirmar un efecto defensivo de PEP1 sobre el daño por exposición a la radiación y mostraron que, cuando las NHEK se dividieron en grupos, cada uno de ellos tratado con un placebo o con PEP1 y luego expuestos a la radiación a diversas intensidades que iban de 0 a 10 Gy (0, 2, 4, 6, 8 y 10 Gy), se confirmaron los niveles de expresión de un marcador de daño por exposición a la radiación representado por la senescencia prematura inducida por la radiación (RIPS), una proteína de respuesta al daño del ADN (^dD^r) y marcadores de focos de heterocromatina asociados a la senescencia (SAHF). El nivel de expresión de cada marcador se midió mediante el uso de qRT-PCR, western blot y tinción de inmunofluorescencia. Para la medición de los niveles, se utilizaron como marcadores la p-galactosidasa asociada a la senescencia (SA p-Gal), p16INK4A, p-p53Ser15, p-ATM, Y-H2AX, 53BP1, H3K9me3, HP1^yy HMGA2.

Mientras tanto, para confirmar un efecto inhibidor de PEP1 sobre la fibrosis tisular inducida por el tratamiento con TGF-p o bleomicina en líneas celulares NHEK por medio de un experimento in vitro , las NHEK se trataron con cada uno de un placebo y PEP1 para dar una concentración final de 10 pg/ml, se cultivaron y se trataron con TGF-p y bleomicina cada 48 horas, seguido de la medición de los niveles de expresión de fibronectina (FN) y colágeno tipo 1 (Col 1a1) mediante el uso de qRT-PCR y western blotting. Para el experimento in vivo, en primer lugar, en el primer

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición antifibrosis para su uso en la prevención o el tratamiento de la fibrosis, que comprende: al menos un péptido eficaz para inhibir la fibrosis y seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos.

2. Una composición antifibrosis para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición comprende además excipientes y aditivos farmacéuticamente aceptables, y es una composición farmacéutica.

3. Una composición antifibrosis para uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la composición comprende además excipientes, lubricantes y aditivos aceptables, y es una composición cosmética.

4. Una composición antifibrosis para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la prevención o el tratamiento de una enfermedad fibrótica, que comprende la administración de la composición antifibrosis a un individuo que requiere tratamiento.

5. Una composición antifibrosis para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la fibrosis es inducida por al menos uno seleccionado del grupo que consiste en el cáncer, la administración de un agente anticancerígeno y la exposición a la radiación.

6. Una composición antifibrosis para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la composición inhibe la fibrosis del tejido de una célula cancerosa seleccionada del grupo que consiste en cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de estómago, cáncer de próstata, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de mama, melanoma y cáncer de ovario.

7. Una composición antifibrosis para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, en la que la composición es para su uso en combinación con un agente quimioterapéutico o una radioterapia para inhibir la fibrosis del tejido de la célula cancerosa.

8. Una composición antifibrosis para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el agente quimioterapéutico es al menos uno seleccionado entre los análogos de desoxinucleósidos y las fluoropirimidinas.

9. Una composición antifibrosis para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el desoxinucleósido análogo es gemcitabina, y la fluoropirimidina es 5-fluorouracilo o capecitabina. Inspicos/15/09/2020/14:56

10. Una composición antifibrosis para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la composición interviene en un procedimiento de señalización del TGF-p para inhibir la fibrosis del tejido dérmico.

11. Un péptido para uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el péptido es eficaz para inhibir la fibrosis y se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 y una variante de la misma en la que se modifican uno, dos o tres aminoácidos, en la que, en la variante, los aminoácidos se modifican por sustitución conservadora de aminoácidos.