ES2907877T3 - Dispositivo para la producción de racimos de células con un número de células y un tamaño de racimo definidos - Google Patents

Abstract

Dispositivo para la agregación de células, en el que el dispositivo comprende al menos una cavidad para recibir una o más células, en el que la cavidad es una pirámide con una punta redondeada y en el que la pirámide tiene bordes redondeados entre las paredes laterales de la pirámide.

Description

DESCRIPCIÓN

Dispositivo para la producción de racimos de células con un número de células y un tamaño de racimo definidos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a dispositivos para la agregación in vitro de células. Los dispositivos se caracterizan por contener cavidades del suelo especiales que permiten la formación de racimos cuando se siembra una suspensión de células en el dispositivo. Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para agregar células y al uso de los dispositivos de la presente invención para la agregación de células.

La presente invención permite la producción a gran escala de racimos celulares definidas con una pérdida mínima de células y la posibilidad de realizar cambios de medio, lo que no es posible con el clásico cultivo celular de gota colgante.

Antecedentes de la invención

La investigación con células madre estudia los principios de los procesos de regeneración de los tejidos para desarrollar procedimientos de medicina regenerativa. Un factor muy importante de la biología de las células madre es la comunicación constante entre las propias células madre y la interacción de éstas con el tejido circundante, el llamado "nicho" de las células madre. Juntas, estas células forman unidades organizativas, racimos de células o "microórganos" que, en gran número y con una arquitectura sofisticada, acaban formando un órgano completo.

Estos procesos se estudian en varios escenarios experimentales, de los cuales uno de los más clásicos es el uso de "gotas colgantes", donde se puede simular el desarrollo de células madre poniendo una cierta cantidad de células madre (y otras) juntas en una gota de manera que se desarrollen racimos de células que puedan ser analizados. Una de las principales desventajas de esta tecnología ampliamente utilizada es el número limitado de racimos celulares que se pueden generar y la imposibilidad de hacer un cambio de medio, que sería lo más deseable porque la diferenciación de las células madre depende del cambio secuencial de la señalización de las citoquinas, que podría hacerse proporcionando estas citoquinas con un cambio de medio.

En el ámbito clínico, la posibilidad de producción a gran escala de racimos de células de tamaño definido con la posibilidad de hacer un cambio de medio sería muy deseable para varios intentos terapéuticos como, por ejemplo, el trasplante de células de los islotes. En esta técnica, los islotes pequeños se comportan mejor que los grandes debido al limitado suministro de nutrientes y oxígeno basado en la difusión en el período inicial posterior al trasplante (Lehmann R. et al, Diabetes. 2007 Mar;56(3):594-603). Por lo tanto, sería deseable hacer pequeños los grandes islotes. Sin embargo, para la producción exitosa de islotes pequeños y su aplicación clínica, los islotes tendrían que ser disociados en células individuales y reagregados en pequeños "pseudoislotes". Para el trasplante se necesitarían unos 1'000'000 de pseudoislotes, un número imposible de alcanzar con la tecnología de la gota colgante.

El documento WO 2008/106771 A1 describe un dispositivo de micropocillos y un procedimiento para la producción y recuperación de agregados celulares.

El documento WO 01/02539 A1 describe un proceso y un aparato que utiliza pocillos especialmente desarrollados para el cultivo in vitro de una o más células.

El documento US 6027695 A describe un aparato para mantener un líquido durante un ensayo, como una placa de microtitulación, en la que se forma una pluralidad de micropocillos adyacentes. Cada uno de los pocillos tiene paredes laterales que se cruzan en un borde que define el límite entre los pocillos adyacentes.

En el documento WO 2008/106771 se describe un dispositivo para la producción de agregados celulares. El dispositivo vendido como Aggrewell (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Canadá V5Z 1B3) es, sin embargo, de uso limitado para la producción de racimos de células madre, así como para el trasplante de células de los islotes, porque en la producción de racimos de células madre el diseño de las cavidades del suelo juega un papel importante debido a la posibilidad de liberación de morfógenos inducida exógenamente y la posterior diferenciación incontrolada. En el dispositivo comercializado como Aggrewell, las células son empujadas hacia la alineación piramidal debido al diseño de la cavidad piramidal con puntas afiladas, lo que puede conducir a la mencionada liberación de morfógenos. Además, en este dispositivo los bordes entre las cavidades tienen una anchura que permite que las células individuales se apoyen en los bordes, un estado que debe evitarse de nuevo debido a la posibilidad de liberación incontrolada de citoquinas. Además, este dispositivo no tiene ninguna construcción de cambio de medio definida, lo que para las aplicaciones de células madre sería muy deseable, ya que la aplicación secuencial y rigurosamente definida de varias citoquinas aplicadas por cambios de medio es crucial para la correcta diferenciación de las células madre.

En el trasplante de islotes, este dispositivo no se puede utilizar debido al número limitado de cavidades del suelo por pocillo de la placa; en la técnica se necesitaría una placa con varios miles de cavidades del suelo por pocillo para hacer posibles las aplicaciones clínicas. Además, en el trasplante de islotes, la formación de racimos debe estar bien soportada por cavidades definidas, ya que la microarquitectura de los pseudo islotes reagregados en gotas colgantes se asemeja a la arquitectura original de los islotes, con una distribución espacial similar de las células alfa, delta y beta, lo que aparentemente tiene razones biológicas (Cavallari, Moritz et al., Ad a 2007 presentación número 2062-P).

En las cavidades del suelo de Aggrewell, de nuevo, los fondos afilados empujarían a las células a una forma no natural con consecuencias biológicas y clínicas desconocidas.

Además de Aggrewell, otros grupos realizaron experimentos con el principio de las cavidades a escala micrométrica y el cultivo de células madre y la generación de racimos de células (Khademhosseini 2006, Mohr 2006), pero debido a las paredes laterales verticales, las cavidades ampliamente espaciadas y los bordes amplios, la formación de racimos de células no tiene lugar de forma controlada y rendimientos con sustancial falta de uniformidad. Las posibles aplicaciones futuras de las células madre se dirigen a la regeneración y/o sustitución de tejidos dañados. Es de suma importancia asegurar que la diferenciación de las células madre esté rigurosamente controlada para evitar la diferenciación incontrolada y, por tanto, la formación de tumores. Por lo tanto, hay que evitar estrictamente la liberación incontrolada de citoquinas y/o morfógenos debido a condiciones experimentales como las de los dispositivos mencionados.

Por lo tanto, es una necesidad en la técnica proporcionar un dispositivo que permita la agregación de células, especialmente de células madre y de islotes, y que preferentemente permita la generación de racimos celulares uniformes con una mínima diferenciación o perturbación de la formación de racimos celulares por el diseño de la cavidad. Además, el número de cavidades debe ser elevado para producir un número considerable de agregados celulares. Además, los bordes entre las cavidades deben ser lo más pequeños posible para evitar el reposo incontrolado de células individuales además de los racimos. Además, el dispositivo debe estar diseñado de forma que sea posible un cambio de medio controlado. La presente invención cumple todos estos requisitos.

Un objeto de la presente invención es proporcionar dispositivos para la agregación de células y, preferentemente, para la producción in vitro de racimos de células de número y tamaño definidos para su uso en investigación, regeneración o sustitución de tejidos y trasplante de células.

Estos objetos se consiguen proporcionando los dispositivos según la presente invención tal y como se define en las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

El dispositivo es preferentemente una placa de cultivo celular con cavidades definidas en el suelo que permiten que un número definido de células descienda al suelo (por gravedad o centrifugación) y se acerquen unas a otras, haciendo posible la agregación.

El diseño de las cavidades maximiza el deslizamiento inicial de las células, maximiza el número de cavidades por superficie, promueve la formación fisiológica de racimos y apoya la posterior recolección de racimos mediante las siguientes especificaciones.

El tipo de suspensión para la siembra inicial de células debe determinarse individualmente según las necesidades experimentales o clínicas individuales. El número de células y el volumen de la suspensión deben calcularse en función del número de cavidades del suelo de las posibles realizaciones de la presente invención y del número de células deseado de los racimos individuales. El número posible de células por cavidad del suelo puede ir desde 0 (es decir, sembrar menos de 1 célula por cavidad para que cada 2 cavidades tenga 1 célula y se pueda estudiar el crecimiento clonal de 1 célula inicial individual) hasta varios miles de células por cavidad. El número exacto de células por cavidad necesario depende de las necesidades individuales y varía según el tipo de células utilizadas. Para alcanzar tamaños de racimo de entre 80 y 100 pm de diámetro, que consideramos el tamaño de racimo preferido para el trasplante de células de islote reagregadas, se necesita un número de 100 a 400 células beta, dependiendo del tamaño de las células, que varía entre especies y depende del diseño experimental. Con células muy pequeñas en otros entornos experimentales, pueden necesitarse 1000 células o más para alcanzar un diámetro de 100 pm; si se necesitan racimos más grandes, el número de células puede aumentar hasta 8000 células para un diámetro de 200 pm o 27'000 células para un diámetro de 300 pm (volumen ~ diámetro3) y así sucesivamente.

La composición del medio, la altura del medio, la actividad metabólica y el tamaño de los racimos determinan la tensión de oxígeno en el entorno de la cavidad y posteriormente el gradiente de oxígeno en los racimos formados. La tensión de oxígeno desempeña un papel crucial en el metabolismo celular, la diferenciación y la determinación del destino celular de las células madre y la supervivencia de las células metabólicamente activas, es decir, las células de los islotes. Los tamaños definidos de los racimos alcanzados por la presente invención permiten un excelente control de la tensión de oxígeno. Hemos estudiado ampliamente la relación entre el tamaño de los racimos, la oxigenación del núcleo y la muerte celular de los islotes trasplantados debido a la baja oxigenación en el periodo post-transplante temprano (Lehmann R. et al, Diabetes. 2007 Mar;56(3):594-603); en la presente invención, este problema clave del trasplante de células de los islotes puede superarse gracias a la posibilidad de generar "pseudoislotes" de tamaños de racimo definidos (pequeños) con una buena oxigenación del núcleo debido a las cortas distancias de difusión de oxígeno, como se ha mencionado anteriormente. Los racimos celulares pueden utilizarse para regenerar o reemplazar tejidos o huesos en mamíferos, preferentemente seres humanos.

La accesibilidad de los islotes reagregados permite, opcionalmente, un tratamiento adicional con factores de regeneración tales como, pero no limitados a, citoquinas u hormonas para mejorar la masa y la supervivencia de los islotes.

La forma básica de las cavidades consiste en una forma piramidal. Según la invención, la cavidad es una pirámide con una punta redondeada.

La forma de los fondos de las cavidades en general puede tener varias formas. En una realización (no según la invención), los fondos de las cavidades tienen un diámetro de 0 pm, lo que equivale a una punta afilada. En otra realización (no según la invención), los fondos de las cavidades son planos con un diámetro de 1 pm a 200 pm, lo que equivale a un tronco de cono. Sin embargo, la realización según la invención consiste en cavidades piramidales con fondos esféricos (puntas redondeadas) para favorecer la formación de racimos de forma fisiológica (Fig. 1D).

En el caso de que la cavidad sea una pirámide cuadrangular con una punta redondeada, el diámetro abierto está formado por cuatro bordes (c en la Figura 1C) que tienen una longitud que oscila preferiblemente entre 10 pm y 5 mm, más preferible entre 200 pm y 800 pm, más preferible entre 400 pm y 585 pm y lo más preferible entre 535 pm y 555 pm. La punta redondeada tiene preferentemente un diámetro d² de 1 pm a 350 pm, más preferible de 50 pm a 150 pm y más preferible de 75 pm a 100 pm (Detalle R, Fig. IE). En el caso de que la cavidad sea una pirámide con un tronco de cono (no según la invención), la pirámide tiene preferiblemente un área de fondo del tronco de cono A de 1 a 250000 pm2, más preferible de 5 a 100000 pm2, más preferible de 15 a 50000 pm2y lo más preferible de 1000 a 15000 pm2. Según el dispositivo de la presente invención, la cavidad es una pirámide con una punta redonda, en la que la pirámide tiene bordes redondeados entre las paredes laterales de la pirámide.

Es otra realización preferente del dispositivo de la presente invención cuando la cavidad es una pirámide cuadrangular o trilateral.

Es otra realización preferente del dispositivo de la presente invención cuando la punta redondeada de la cavidad tiene un radio r entre 0 y 250 pm, preferiblemente de 5 a 200 pm, más preferible de 20 a 100 pm y más preferible de 35 a 60 pm (Detalle R, Fig. IE).

Es otra realización preferente del dispositivo de la presente invención cuando la altura h de la cavidad es de 10 pm a 2000 pm, preferiblemente de 50 pm a 1000 pm, más preferible de 100 pm a 500 pm y más preferible de 200 a 400 pm (h, Fig. 1D). Es otra realización preferente del dispositivo de la presente invención cuando la longitud del borde de apertura superior c de la cavidad piramidal es de 10 pm a 5 mm, más preferible de 200 pm a 800 pm, más preferible de 400 pm a 585 pm y más preferible de 535 pm a 555 pm. En este contexto se prefiere especialmente que la pirámide sea una pirámide cuadrangular.

En una realización preferente de la presente invención, el fondo del dispositivo comprende de 1 a 1000000 cavidades, preferiblemente de 100 a 100000 cavidades, más preferible de 1000 a 50000 cavidades y más preferible de 10000 a 20000 cavidades. Las cavidades de la presente invención están diseñadas para estar muy cerca unas de otras, en particular los bordes superiores entre las cavidades son menos de 15 pm de ancho con el fin de aumentar el número de racimos agregados por superficie (Fig. 1C). En una realización preferente de la presente invención, el espacio entre las cavidades es por tanto inferior a 30 pm, más preferible inferior a 20 pm, más preferible inferior a 18 pm y más preferible inferior a 15 pm. Este diseño con bordes superiores estrechos ayuda además a evitar la pérdida de células o la liberación incontrolada de citoquinas de las células moribundas, al evitar que las células se apoyen en los bordes, de modo que cada una de ellas se deslice hacia el fondo de las cavidades.

Otra especificación de la presente invención es el uso de ángulos de pared definidos. Por lo tanto, es otra realización preferente del dispositivo de la presente invención cuando el ángulo de la pared a de la cavidad es de 35° a 75°, preferiblemente de 40° a 70°, más preferible de 50° a 60° y más preferible 54,7 (a, Fig. 1D).

La forma, las dimensiones del pocillo de cultivo de tejidos y la bandeja que contiene las cavidades descritas pueden variar en función de las necesidades del usuario. Por ejemplo, el pocillo de cultivo de tejidos puede ser circular, rectangular o similar. El tamaño del pocillo de cultivo de tejidos puede ser del tamaño de una placa típica de 384 pocillos (compartimentos), una placa típica de cultivo de tejidos de 96 pocillos, una placa típica de cultivo de tejidos de 24 pocillos, una placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos, una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos y similares. El sistema también puede tener la forma de un frasco de cultivo de tejidos. Además, las cavidades esmeriladas definidas pueden introducirse en otros soportes, como los insertos de placas de cultivo celular.

La realización más preferente de la presente invención comprende una placa de cultivo celular estándar con huella SBS (del mismo tamaño que las placas clásicas de 6, 12, 24 o 96 pocillos (compartimentos), de 127,76 mm de largo, 85,47 mm de ancho y 14 -15,5 mm de alto, dependiendo de si hay insertos de relleno o no) hecha de copolímeros de olefina cíclica (COC) o de polipropileno o poliestireno en la que el fondo de la placa está cubierto con las cavidades del suelo como se define en la Fig. 2. La placa está equipada con una tapa de placa estándar (Fig. 4) que garantiza un microambiente estable y un intercambio de gases controlado. La placa puede separarse en diferentes compartimentos/pocillos para ofrecer más posibilidades experimentales o clínicas de varios números de cavidades por compartimento. Por lo tanto, es particularmente preferible que la placa comprenda al menos un compartimento. En el caso de un compartimento, la placa en sí constituye el compartimento. En el caso de varios compartimentos, el compartimento puede comprender el mismo o diferente número de cavidades, mientras que las cavidades de cada compartimento pueden tener la misma o diferente forma y tamaño. Esta última característica también se aplica en el caso de un solo compartimento. Además, los compartimentos pueden comprender cavidades de igual o diferente forma y tamaño.

En esta realización más preferente, la placa de cultivo celular estándar con huella SBS es una sola placa con el fondo compuesto por las cavidades piramidales con puntas redondeadas o la placa de cultivo celular está dividida en diferentes compartimentos/pocillos con el fondo de los compartimentos compuesto por las cavidades descritas. El número de compartimentos/pocillos por placa de cultivo celular estándar con huella SBS puede variar de 1 a 384 por placa, más preferentemente de 1 a 96 compartimentos y más preferentemente de 1 a 24 compartimentos. El número de cavidades por compartimento depende del tamaño del compartimento y de la cavidad respectiva y alcanza de 10000 a 20000 cavidades si sólo hay un compartimento, de 5000 a 10000 cavidades por compartimento si hay dos compartimentos y así sucesivamente.

A efectos ilustrativos, las figuras presentadas muestran la realización más preferente con cuatro compartimentos cuyos fondos contienen las cavidades descritas. Por razones técnicas, entre las paredes de los compartimentos y el comienzo de las cavidades en el fondo, quedan pequeños bordes, donde las células individuales podrían descansar después de la siembra en lugar de acumularse dentro de las cavidades. Esto debe evitarse para la uniformidad experimental (es decir, evitar la liberación incontrolada de citoquinas, etc.). Por ello, en la realización más preferente cada compartimento de la presente invención contiene opcionalmente al menos un inserto de relleno que permite el descenso de cada célula a las cavidades del suelo (Fig. 2). Esto es posible gracias al diseño de los insertos (Fig. 3, El tamaño preferible de los insertos se muestra en la figura con números dados en milímetros; un inserto tiene 62,05 mm de largo, 40,9 mm de ancho y 11,5 mm de alto con pequeños puentes adicionales de 0,5 mm para el intercambio controlado de gases, realizados aquí (mostrado) y en la placa (no mostrado) o en la propia tapa (no mostrado)). Los insertos se construyen preferentemente de manera que las paredes verticales de los insertos comienzan directamente después de las últimas cavidades en los bordes del extremo inferior. Esto significa que con la siembra inicial de la solución unicelular, cada célula de esta solución descenderá a una cavidad del suelo junto con otras células y formará racimos de células. Por lo tanto, se evita la "pérdida" de células individuales que no encuentran una cavidad del suelo. Después de esta etapa inicial, los insertos de relleno se pueden sacar para un posterior cambio de medio controlado, como se describe a continuación. Las plantillas pueden sacarse de los compartimentos con la ayuda de un pequeño asidero.

En otra realización preferente, cada compartimento contiene en al menos un borde al menos una superficie sin cavidades del suelo. Esta superficie está preferentemente separada de la región con cavidades por las paredes de los insertos de relleno. Una vez retirados los insertos, esta superficie permite la colocación de las clásicas puntas de pipeta de diversos tamaños sin dañar las cavidades y posibilita cambios de medio muy controlados (Fig. 5). El cambio de medio se realiza colocando la punta de la pipeta en esta superficie y aspirando lentamente el medio antiguo, que se reducirá por esta construcción hasta casi el nivel de los bordes superiores de las cavidades del suelo. El llenado del medio funciona al revés, colocando la pipeta de nuevo en esta superficie y dejando fluir lentamente el medio de vuelta. Con esta construcción se alcanzan tres objetivos: en primer lugar, el medio es aspirado en un alto grado, sólo queda poco volumen de medio en las propias cavidades. En segundo lugar, el cambio de medio se produce de manera uniforme, ya que al succionar el medio se obtiene siempre el mismo medio restante debido a esta construcción. En tercer lugar, las células que se encuentran en el fondo de las cavidades no son perturbadas y/o arrastradas durante el cambio de medio, como podría ocurrir cuando el cambio de medio se hiciera colocando la punta de la pipeta directamente sobre las cavidades.

En otra realización preferente, es posible un mayor refinamiento del cambio de medio modificando los insertos de relleno de manera que se coloquen de nuevo en los compartimentos para hacer un cambio de medio. Esto requeriría una modificación del diseño en el exterior de los insertos, a saber, la introducción de pequeños canales en el exterior de las paredes de los insertos con varias aberturas pequeñas en la parte inferior de las paredes de los insertos. Aquellos expertos en la materia entenderán que al succionar el medio desde (o llenar el medio en) el espacio entre el inserto y el compartimento (con los insertos de llenado colocados dentro de los compartimentos), los pequeños canales conducirían el medio desde y hacia las cavidades del suelo a través de las pequeñas aberturas en la parte inferior de las paredes del inserto desde los cuatro bordes y no sólo unilateralmente como se muestra aquí en la realización más preferente (donde el cambio de medio se hace sin los insertos en su lugar).

Con estas estructuras y una realización en placa de cultivo celular estándar con huella SBS es posible alcanzar un número de racimos de aproximadamente 10000 a 50000 por placa, dependiendo del tamaño de la cavidad.

La presente invención se refiere además a un procedimiento de agregación de células, que comprende las etapas:

a) proporcionar un dispositivo según la invención, tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones;

b) sembrar de 0 a 100'000 células por cavidad;

c) dejar que las células se agreguen dentro de las cavidades por gravedad o centrifugación;

d) antes de un primer cambio de medio, sacando los insertos de relleno;

e) realizar el cambio de medio de forma controlada colocando una punta de pipeta en la al menos una superficie sin cavidades ("superficie de llenado"), en la que se aspira un medio viejo y se pipetea un medio nuevo sin perturbar las células en las cavidades;

f) cultivar y experimentar con los racimos de células, la composición del medio, la tensión de oxígeno y otros parámetros según las necesidades experimentales;

g) recoger los racimos de células agregadas mediante un chorro de medio suave con una pipeta o por centrifugación negativa; y

h) usar racimos de células según las necesidades experimentales o clínicas.

Los expertos en la materia comprenderán que el procedimiento de producción de la presente invención puede consistir (pero no limitarse a) en varias tecnologías como la corrosión, el SU-8, el corte de alta velocidad, la estructuración del vidrio por láser o la estructuración directa del acero. En una realización preferente, la presente invención está diseñada mediante el uso de un inserto de herramienta que fue creado sobre la base de un patrón microestructurado a través de la separación galvánica. Los fondos de las cavidades se hacen esféricos mediante el uso de otras etapas de refinamiento químico y/o mecánico. En la realización más preferente, se corroe un máster de silicio, de este máster se separa galvánicamente una cuña de níquel y esta cuña de níquel es electropulida (lo que produce los fondos esféricos). A continuación, se introducen los níqueles en una herramienta para el moldeado de las placas de cultivo celular con huella SBS.

En otra realización, el pocillo de cultivo de tejidos con las cavidades del suelo definidas está hecho de al menos un material que comprende polipropileno, poliestireno, vinilo, otros plásticos, metales, aleaciones, minerales, minerales no metálicos, madera, fibras, tela y vidrio. La bandeja que comprende al menos uno o más pocillos de cultivo de tejidos, está hecha de al menos un material que comprende polipropileno, poliestireno, vinilo, otros plásticos, metales, aleaciones, minerales, minerales no metálicos, madera, fibras, tela y vidrio.

Finalmente, la presente invención se refiere al uso de un dispositivo como el definido anteriormente para la agregación de células.

Breve descripción de las figuras

Los expertos en la materia entenderán que los dibujos, descritos a continuación, tienen únicamente fines ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas en modo alguno.

La Figura 1 muestra un modelo en primer plano de las cavidades del suelo de la realización más preferente.

Las superficies sombreadas indican material sólido. La figura 1D muestra dos cavidades adyacentes desde una vista lateral. "h" indica la altura de la cavidad, "a" indica los posibles ángulos de la pared.

La Figura 1E muestra el fondo de las cavidades de la realización más preferente con "R" indicando el suelo del fondo esférico.

La Figura 1C muestra una vista superior de la realización más preferente con "c" indicando la longitud del borde de la abertura superior cuadrangular de las cavidades. En la realización más preferente, la altura de la cavidad h es de 350 pm, el ángulo de la pared a es de 54,7 grados, el fondo esférico R tiene un diámetro de 80 pm a 100 pm y la longitud de los bordes de la abertura superior c es de 546 pm, siendo estos bordes de menos de 15 pm de ancho para evitar el reposo de las células en estos bordes.

La Figura 2 muestra una visión general de la realización más preferente que comprende una placa de cultivo celular estándar con huella SBS (del mismo tamaño que las clásicas placas de 6, 12, 24 o 96 pocillos, de 127,76 mm de largo, 85,47 mm de ancho y 14 -15,5 mm de alto, dependiendo de si hay insertos de relleno o no) con cuatro compartimentos definidos de los cuales el suelo está cubierto con las cavidades definidas del suelo. Los números se indican en milímetros. En esta figura, los insertos de relleno están colocados y no hay tapa en la placa de cultivo celular.

La Figura 2A-A muestra una sección transversal de la placa de cultivo celular a través del plano del corte A.

La Figura 2B-B muestra una sección transversal de la placa de cultivo celular a través del plano del corte B.

La Figura 2 G muestra el lado ancho visto desde el exterior y

La Figura H muestra el lado estrecho visto desde el exterior.

La Figura 2P muestra una vista en perspectiva de la placa de cultivo celular.

Figura 2D, 2E y 2C son iguales a las figuras 1D, 1E y 1C.

La Figura 3 muestra los insertos de relleno solos en las mismas vistas que en la figura 2. Además, los cuatro insertos se muestran por separado;

La Figura 3PL muestra una vista en perspectiva desde la inserción en la esquina superior izquierda

La Figura 3JL muestra una vista superior de la inserción en la esquina superior izquierda

La Figura 3S muestra una vista lateral del inserto de la esquina superior izquierda y la figura JR muestra una vista superior del inserto de la esquina superior derecha. El tamaño de los insertos se muestra en la figura con números dados en milímetros; un inserto tiene 62,05 mm de largo, 40,9 mm de ancho y 11,5 mm de alto con pequeños puentes adicionales de 0,5 mm para el intercambio controlado de gases, realizados aquí (mostrado) y en la placa (no mostrado) o en la propia tapa (no mostrado).

La Figura 4 muestra lo mismo que la figura 2 pero con la mitad de la tapa de la placa de cultivo celular añadida en el lado derecho.

La Figura 5 muestra lo mismo que la figura 2 pero sin los insertos de relleno en su lugar. Esta es la situación después de la siembra de las células y antes del primer cambio de medio. En los bordes exteriores de los cuatro compartimentos se puede ver la "superficie de llenado", donde se debe colocar la punta de la pipeta para realizar un cambio de medio controlado.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Dispositivo para la agregación de células, en el que el dispositivo comprende al menos una cavidad para recibir una o más células, en el que la cavidad es una pirámide con una punta redondeada y en el que la pirámide tiene bordes redondeados entre las paredes laterales de la pirámide.

2. Dispositivo según la reivindicación 1, en el que la punta redondeada tiene un diámetro d² entre 1 y 350 pm.

3. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la pirámide es una pirámide cuadrangular o trilateral.

4. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la altura h de la cavidad es de 10 pm a 2000 pm

5. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el ángulo de pared a de la cavidad es de 35° a 75°

6. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la longitud del borde de apertura superior c de la cavidad piramidal es de 50 pm a 2000 pm

7. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el dispositivo comprende de 1 a 1000000 cavidades.

8. Dispositivo según la reivindicación 7, en el que el dispositivo comprende de 10000 a 20000 cavidades.

9. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el dispositivo está separado en compartimentos de cavidades, en el que cada compartimento contiene al menos una cavidad que es una pirámide con una punta redondeada, en el que la pirámide tiene bordes redondeados entre las paredes laterales de la pirámide.

10. Dispositivo según la reivindicación 9, en el que cada compartimento comprende al menos un inserto de relleno colocado en él.

11. Dispositivo según la reivindicación 10, en el que cada compartimento comprende al menos una superficie sin cavidades.

12. Dispositivo según la reivindicación 11, en el que la al menos una superficie sin cavidades está situada en al menos un borde de cada compartimento.

13. Dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, en el que el espacio entre las cavidades es inferior a 20 pm.

14. Procedimiento de agregación de células, que comprende las etapas:

a) proporcionar un dispositivo como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13;

b) sembrar de 0 a 100'000 células por cavidad;

c) dejar que las células se agreguen dentro de las cavidades por gravedad o centrifugación;

d) antes de un primer cambio de medio, sacar los insertos de relleno;

e) realizar el cambio de medio de forma controlada colocando una punta de pipeta en la al menos una superficie sin cavidades, en la que se aspira un medio viejo y se pipetea un medio nuevo sin perturbar las células en las cavidades;

f) cultivar y experimentar con los racimos de células, la composición del medio, la tensión de oxígeno y otros parámetros según las necesidades experimentales;

g) recoger los racimos de células agregadas mediante un chorro de medio suave con una pipeta o por centrifugación negativa; y

h) usar racimos de células según las necesidades experimentales o clínicas.

15. Uso de un dispositivo como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la agregación de células.