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ES2904624T3 - Método para aislar ácido nucleico altamente puro con partículas magnéticas - Google Patents

Método para aislar ácido nucleico altamente puro con partículas magnéticas Download PDF

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ES2904624T3 ES17817733T ES17817733T ES2904624T3 ES 2904624 T3 ES2904624 T3 ES 2904624T3 ES 17817733 T ES17817733 T ES 17817733T ES 17817733 T ES17817733 T ES 17817733T ES 2904624 T3 ES2904624 T3 ES 2904624T3
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Qiagen GmbH
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Abstract

Un método para aislar ácido nucleico de una solución de muestra, en donde el ácido nucleico se separa de la solución de muestra por adsorción a partículas magnéticas, seguido de la separación de las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas de la solución de muestra mediante la aplicación de un campo magnético, seguido de al menos una etapa de lavado (w), que comprende (w1) suspender las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas en una solución de lavado, que es una solución acuosa, que tiene una concentración total de sal por debajo de 100 mM y no comprende un disolvente orgánico, (w2) incubar las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas en la solución de lavado, y (w3) separar las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido en ellas de la solución de lavado, en donde las partículas magnéticas se dejan caer en la solución de lavado en la etapa (w1) apagando, eliminando o reubicando el campo magnético.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para aislar ácido nucleico altamente puro con partículas magnéticas
La invención se refiere a métodos para aislar ácido nucleico de una solución de muestra, en donde el ácido nucleico se separa de la solución de muestra por adsorción a partículas magnéticas, seguido de la separación de las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas de la solución de muestra mediante la aplicación de un campo magnético. También son objeto de la invención los usos de tampones de lavado en dichos métodos.
Estado de la técnica
La obtención de ADN o ARN suficientemente libre de contaminantes para aplicaciones de biología molecular es difícil en vista de los complejos sistemas en los que se encuentra típicamente el ADN o ARN. Estos sistemas, como muestras biológicas, como tejido, células de fluidos corporales como sangre, células cultivadas o sistemas artificiales como geles de agarosa o muestras de reacción de PCR, normalmente incluyen cantidades significativas de contaminantes de los que se debe separar el ADN o ARN de interés antes de ser usado en un procedimiento de biología molecular.
Los protocolos convencionales para obtener ADN o ARN a partir de células implican suspender las células en una solución y usar enzimas y/o productos químicos para lisar las células, liberando así el ácido nucleico contenido dentro de las células en la solución de lisado resultante. Para el aislamiento de ARN, los procedimientos convencionales de lisis y solubilización que se aplican para liberar ADN incluyen medidas adicionales para la inhibición de ribonucleasas y contaminantes que se deben separar del ARN, incluido el ADN.
Los materiales de sílice, incluidas las partículas de vidrio, como el polvo de vidrio, las partículas de sílice y las microfibras de vidrio preparadas triturando papeles de filtro de fibra de vidrio, e incluida la tierra de diatomeas, se usan en la técnica en combinación, por ejemplo, con soluciones acuosas de sales caotrópicas para separar el ADN de otras sustancias y proporcionar el ADN adecuado para su uso en procedimientos de biología molecular.
Las partículas de vidrio, partículas de sílice, gel de sílice y mezclas de los anteriores se han configurado en varias formas diferentes para producir matrices capaces de unir materiales de ácido nucleico de manera reversible mediante la adsorción a la superficie cuando se ponen en contacto con un medio que contiene dichos materiales en presencia de agentes inductores de la unión como agentes caotrópicos. Dichas matrices están diseñadas para permanecer adsorbidas al material de ácido nucleico mientras la matriz se expone a una fuerza externa tal como centrifugación o filtración al vacío para separar la matriz y el material de ácido nucleico adsorbido a la misma de los componentes del medio restantes. El material de ácido nucleico generalmente se eluye después de la matriz exponiendo la matriz a una solución de elución, como agua o un tampón de elución. Numerosas fuentes comerciales ofrecen matrices a base de sílice diseñadas para su uso en sistemas de aislamiento en centrifugación y/o filtración (p. ej., las líneas QiaPrep®, QIAamp® y AllPrep® de sistemas de aislamiento de ácidos nucleicos de QIAGEN, Hilden, Alemania).
Se han desarrollado partículas magnéticamente sensibles (denominadas en esta memoria "partículas magnéticas") y métodos para usarlas para el aislamiento de materiales de ácido nucleico. En la bibliografía se describen varios tipos diferentes de partículas magnéticas diseñadas para su uso en el aislamiento de ácidos nucleicos y están disponibles en fuentes comerciales. Tales partículas magnéticas generalmente encajan en una de dos categorías, aquellas diseñadas para unir directamente de manera reversible materiales de ácido nucleico y aquellas diseñadas para hacerlo indirectamente, es decir, a través de al menos una sustancia intermedia. La sustancia intermedia se denomina en esta memoria "marcador". Por ejemplo, uno de tales marcadores comúnmente empleados, el oligonucleótido desoxitimidina biotinilado (oligo-dT), forma enlaces de hidrógeno con las colas de poliadenosina de las moléculas de ARNm en un medio.
Las partículas magnéticas que se unen directamente a los ácidos nucleicos se basan a menudo en sílice, como las partículas recubiertas de óxido de silicio magnéticamente sensibles (también denominadas perlas magnéticas; p. ej., disponibles bajo las marcas comerciales MagAttract® de QIAGEN, Hilden, Alemania; o MagneSil® de Promega, Madison, EE. UU.). Los ácidos nucleicos se adhieren a estas partículas en presencia de un agente inductor de la unión como una sal caotrópica, p. ej. cloruro de guanidinio o isotiocianato de guanidinio, solo o en combinación con un aditivo de unión, como un alcohol; p. ej. etanol. Después de la separación de las partículas, si se desea, se puede lograr fácilmente la elución de los ácidos nucleicos adsorbidos de las partículas mediante la incubación de las partículas en agua o en un tampón con baja fuerza iónica.
Se conocen en la técnica varios métodos diferentes de separación automática de partículas magnéticas. Un método consiste en insertar un dispositivo magnético o magnetizable, como una varilla, en el medio que contiene las partículas magnéticas, la unión de las partículas magnéticas al dispositivo magnético o magnetizable y la retirada del dispositivo magnético o magnetizable. Otro método consiste en aproximar espacialmente un dispositivo magnético o magnetizable al recipiente que contiene el medio y las partículas magnéticas. Las partículas magnéticas se unen a la pared del recipiente y el medio se puede eliminar sin que las partículas magnéticas se trasladen.
El documento WO 01/71732 A2 describe métodos para producir partículas magnéticas a base de sílice y óxido de hierro y su uso para aislar moléculas biológicas. Una molécula de interés, como los ácidos nucleicos del tipo ADN y/o ARN, se adhiere a las partículas magnéticas, seguido generalmente por la separación de las partículas magnéticas de la solución, el lavado y la elución de las moléculas. La unión de ácidos nucleicos a las partículas magnéticas se lleva a cabo preferiblemente en una solución acuosa que comprende una alta concentración de sal caotrópica y/o un alcohol de bajo peso molecular, tal como isopropanol o etanol. La elución del ácido nucleico de las partículas magnéticas se lleva a cabo preferiblemente con un tampón bajo en sal. En tal proceso, la molécula deseada, tal como el ácido nucleico, normalmente se desea obtener en forma relativamente pura. Por lo tanto, se necesita eliminar la sal caotrópica de la solución de partida tanto como sea posible. Con el fin de lograr esto, las etapas de lavado se llevan a cabo típicamente con uno o más tampones que tienen preferiblemente una concentración de sal más baja que la solución de partida. Con el fin de mantener las condiciones de unión en las múltiples etapas de lavado, los tampones generalmente comprenden niveles relativamente altos de etanol, como el 70% (p/p). En una etapa de lavado final, se puede usar etanol puro. Después de la etapa de lavado final, es común que la muestra con partículas magnéticas y la molécula unida a las mismas se deje en reposo a temperatura ambiente para que se seque, de modo que el etanol se elimine por volatilización. Sin embargo, en vista de la alta concentración de sal del material de partida, y dado que los tampones de lavado normalmente comprenden una sal, el ácido nucleico obtenido de acuerdo con dicho método aún puede incluir sal residual. Además, la evaporación del etanol por secado es relativamente lenta. En un proceso estándar, la evaporación a menudo no seca completamente la muestra y la agota completamente del etanol. Las etapas de lavado adicionales y el secado extenso pueden aumentar aún más la pureza, pero tal proceso consumiría aún más tiempo y ya no sería conveniente para el uso rutinario.
El documento WO 03/091452 A1 describe un método para aislar ácido nucleico de materiales biológicos con partículas magnéticas. Con el fin de prevenir la formación de agregados de partículas magnéticas, se usan soluciones de lavado específicas que comprenden alcoholes menores. Además, las soluciones de lavado pueden comprender sales caotrópicas en cantidades relativamente altas. Por tanto, sigue existiendo el problema de que el producto de ácido nucleico final pueda comprender impurezas de sal o alcohol no deseadas.
El documento WO 2005/021748 A1 describe un método adicional para aislar biopolímeros de una solución acuosa con partículas magnéticas. Los biopolímeros se unen a partículas magnéticas de una solución acuosa que comprende sal y etanol, seguido de lavado y elución. Con el fin de mejorar el manejo de las partículas magnéticas, se agrega un aditivo, como polietilenglicol. Las etapas de lavado se llevan a cabo con soluciones de lavado que comprenden cantidades relativamente altas de sal caotrópica y etanol, seguidas de secado para eliminar el etanol.
Los kits comerciales para aislar ácidos nucleicos de diversas fuentes y de varios tamaños con partículas magnéticas están disponibles, por ejemplo, en Qiagen, Hilden, Alemania, bajo la marca comercial MagAttract.®. El protocolo básico que se usa por ejemplo en el kit MagAttract® HMW DNA es similar al descrito anteriormente y comprende etapas de unión del ADN de una solución acuosa en presencia de sales caotrópicas y etanol, seguido de etapas de lavado y elución final del ADN. Las etapas de lavado estándar se llevan a cabo en presencia de una concentración de sal relativamente alta y de etanol. Sin embargo, con el fin de eliminar las impurezas de sal y etanol que podrían interferir con los procesos posteriores corriente abajo del producto de ADN, se incluye una etapa de lavado final, en la que el sedimento de partículas magnéticas con ADN unido a las mismas, cuando se fija a la pared del tubo de muestra mediante fuerza magnética, se lava brevemente con agua. Cuando se procede en consecuencia, el agua contacta principalmente solo con la superficie del sedimento adherido a la pared del tubo de muestra. De acuerdo con el manual, es importante que el agua no se añada directamente sobre las partículas, sino que se pipetee cuidadosamente en el tubo de muestra contra el lado opuesto al sedimento de partículas magnéticas con ADN unido. Además, todas las etapas de pipeteo se deben realizar con cuidado para evitar perturbar el sedimento de partículas magnéticas fijas. Estas precauciones se consideran necesarias ya que la etapa de lavado se lleva a cabo de hecho en condiciones de no unión, bajo las cuales el ácido nucleico normalmente se eluye de las partículas. Por tanto, se espera que un lavado intensivo dé como resultado una pérdida de ácidos nucleicos. Por consiguiente, en el mismo protocolo se indica que se puede usar agua pura como tampón de elución. Sin embargo, dado que el sedimento de partículas magnéticas, que se fija a la pared del tubo por fuerza magnética, no se desagrega bajo un procedimiento de lavado tan superficial, y dado que este lavado con agua solo se aplica durante un breve período de tiempo, puede quedar atrapado en el sedimento de partículas magnéticas una proporción de la sal y/o el etanol y, por lo tanto, no se pueda eliminar. Por tanto, se desea mejorar aún más la pureza del ácido nucleico finalmente purificado y aislado, ya sea en forma pura o disuelto.
El documento US2009/0191566 A1 describe un método para aislar biopolímeros de una solución acuosa con partículas magnéticas mediante unión por afinidad. Las perlas magnéticas están modificadas con un primer y un segundo grupo funcional. Específicamente, los grupos funcionales son ligandos de afinidad tales como oligo-dT o estreptavidina, que se unen específicamente a moléculas diana tales como ARNm o ADN marcado con biotina. Como es práctica común en el estado de la técnica, el tampón de lavado debe tener una "concentración de sal suficientemente alta”, tal que ”el ácido nucleico no eluya del transportador en fase sólida, sino que permanezca unido a las micropartículas". Por consiguiente, normalmente la sal se debe eliminar en una etapa de purificación posterior para evitar daños en las aplicaciones corriente abajo.
Hawkins y cols., Nucl. Acids Res. 1994, vol. 22, N°. 21,4543-4544, describen un método para la purificación de ADN con perlas magnéticas recubiertas de carboxilo. El documento describe una etapa de lavado final que usa una concentración de sal comparativamente baja. Sin embargo, la concentración real de sal en dicha etapa de lavado final realmente es relativamente alta debido a los restos de una etapa de lavado anterior con una concentración de sal bastante alta de NaCI 5M. En general, el proceso es ineficaz porque la etapa de lavado reduce el rendimiento a aproximadamente un 80%. Por tanto, el método no es adecuado para el aislamiento cuantitativo de ácidos nucleicos.
El documento WO2004/090132 A2 describe un método para aislar ácido nucleico genómico con transportadores de fase sólida que comprenden grupos funcionales para unir los ácidos nucleicos. En concreto, se usan perlas magnéticas que se modifican con grupos carboxilo. Las propiedades descritas de los tampones de lavado son básicamente las mismas que se describen en el documento US2009/0191566A1 como se discutió anteriormente. De nuevo, el tampón de lavado debe tener una concentración de sal suficientemente alta, de modo que el ácido nucleico permanezca unido a las micropartículas y, como consecuencia, la sal normalmente se tendrá que eliminar en una etapa de purificación posterior.
El documento WO99/58664 describe un proceso similar para aislar ácidos nucleicos con perlas magnéticas recubiertas de carboxilo. Los tampones adecuados deben tener propiedades y una concentración de sal relativamente alta como se describió anteriormente para los documentos US2009/0191566A1 o WO2004/090132, con el fin de asegurar que los ácidos nucleicos permanezcan unidos a las micropartículas.
En general, existe una continua necesidad en la técnica anterior de un proceso simple y eficaz para aislar ácidos nucleicos con partículas magnéticas, en el que el nivel de impurezas en el ácido nucleico finalmente aislado, en particular el ADN, sea bajo.
Problema subyacente a la invención
El problema subyacente a la invención es proporcionar un método para aislar ácido nucleico de una solución de muestra, que supere los inconvenientes mencionados anteriormente. Específicamente, el problema subyacente a la invención es proporcionar un método mejorado para aislar ácido nucleico, en el que el ácido nucleico finalmente aislado tenga una alta pureza, ya sea en forma pura o disuelta. El ácido nucleico, cuando no se obtiene en forma pura sino como un producto de aislamiento, debe contener básicamente, preferiblemente incluso consistir en el tampón de elución y el ácido nucleico deseado. El nivel de impurezas, como la sal y el disolvente orgánico, como el alcohol tipo etanol, debe ser bajo.
Otro problema subyacente a la invención es proporcionar un método simple para aislar ácido nucleico de alta pureza. El proceso comprenderá solo un pequeño número de etapas de proceso, que se deberían llevar a cabo de manera relativamente fácil y práctica. Por lo tanto, el método debe ser aplicable para uso rutinario en la práctica estándar de laboratorio, así como de forma automatizada, es decir, con robots y estaciones de trabajo. El método debe estar disponible con materiales y dispositivos de laboratorio estándar.
Descripción de la invención
De forma sorprendente, se encontró que el problema subyacente a la invención se supera mediante métodos de acuerdo con las reivindicaciones. Otras realizaciones de la invención se describen a lo largo de la descripción.
El objeto de la invención es un método para aislar el ácido nucleico de una solución de muestra, en donde el ácido nucleico se separa de la solución de muestra por adsorción en partículas magnéticas, seguido de la separación de las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas de la solución de muestra mediante aplicación de un campo magnético, seguido de al menos una etapa de lavado (w), que comprende
(w1) suspender las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas en una solución de lavado, que es una solución acuosa, que tiene una concentración total de sal por debajo de 100 mM y no comprende un disolvente orgánico,
(w2) incubar las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas en la solución de lavado, y
(w3) separar las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas de la solución de lavado, en donde las partículas magnéticas se dejan caer en la solución de lavado en la etapa (w1) apagando, eliminando o reubicando el campo magnético
El método de la invención se dirige en particular al aislamiento de ácidos nucleicos. Como se usa en esta memoria, "aislar ácido nucleico" se refiere a cualquier método en el que se eliminan contaminantes e impurezas del ácido nucleico diana y/o en el que se aumenta la concentración del ácido nucleico.
El término "ácido nucleico" o "ácidos nucleicos" como se usa en esta memoria, se refiere en particular a un polímero que comprende ribonucleósidos y/o desoxirribonucleósidos que están unidos covalentemente, típicamente por enlaces fosfodiéster entre subunidades, pero en algunos casos por fosforotioatos, metilfosfonatos y similares. Los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, todos los tipos de ADN y/o ARN, p. ej. ADNg; ADN plasmídico, ADN circular; ADN circulante; hnRNA; ARNm; ARN no codificante (ncRNA), que incluye, pero no se limitan a, rRNA, tRNA, lncRNA (ARN largo no codificante), lincRNA (ARN largo intergénico no codificante), miARN (micro ARN), siARN (ARN pequeño de interferencia), snoARN (ARN nucleolar pequeño), snRNA (ARN nuclear pequeño) y stRNA (ARN temporal pequeño), piRNA (ARN que interactúa con piwi), tiRNA (ARN de iniciación de la transcripción), PASR (ARN asociado al promotor), CUT (transcritos crípticos inestables), ARN extracelular o circulante; ácido nucleico fragmentado; ácido nucleico obtenido de orgánulos subcelulares como mitocondrias o cloroplastos; y ácido nucleico obtenido de microorganismos, parásitos o virus de ADN o ARN que pueden estar presentes en una muestra biológica. Las secuencias sintéticas de ácido nucleico que pueden incluir o no análogos de nucleótidos que se añaden o "pinchan" en una muestra biológica también están dentro del alcance de la invención. El ARN pequeño o el término especie de ARN pequeño se refiere en particular a ARN que tiene una longitud de menos de 500 nt. De acuerdo con una realización, el ácido nucleico es ADN.
Una muestra puede comprender más de un tipo de ácido nucleico. Dependiendo del uso previsto, puede ser deseoso aislar todos los tipos de ácidos nucleicos de una muestra ((p. ej., ADN y ARN) o solo ciertos tipos o un cierto tipo de ácido nucleico (p. ej., solo ARN pero no ADN o viceversa o se supone que el ADN y el ARN se obtienen por separado). Todas estas variantes están dentro del alcance de la presente invención. En la técnica anterior se conocen métodos adecuados para aislar ADN o ARN o ambos tipos de ácidos nucleicos en paralelo.
El término "muestra" se usa en esta memoria en un sentido amplio y se pretende que incluya una variedad de fuentes que contienen ácidos nucleicos. La muestra puede ser una muestra biológica, pero el término también incluye otros, p. ej. muestras artificiales que comprenden ácidos nucleicos. Las muestras ejemplares incluyen, pero no se limitan a, fluidos corporales en general, sangre completa; suero; plasma; células rojas de la sangre; células blancas de la sangre; capa leucocitaria; hisopos, que incluyen, pero no se limitan a, hisopos bucales, hisopos de garganta, hisopos vaginales, hisopos uretrales, hisopos cervicales, hisopos de garganta, hisopos rectales, hisopos de lesiones, hisopos de abscesos, hisopos nasofaríngeos y similares; orina; esputo; saliva; semen; fluido linfático; fluido; líquido amniótico; líquido cefalorraquídeo; derrames peritoneales; derrames pleurales; líquido de los quistes; líquido sinovial; humor vítreo; humor acuoso; líquido de bursa; lavados de ojos; aspirados oculares; plasma; suero; lavado pulmonar; aspirados pulmonares; y tejidos, que incluyen, pero no se limitan a, hígado, bazo, riñón, pulmón, intestino, cerebro, corazón, músculo, páncreas, cultivos celulares, así como lisados, extractos o materiales obtenidos de cualquier célula y microorganismo y virus que puedan estar presentes sobre o en una muestra y similares. Los materiales obtenidos de entornos clínicos o forenses que contienen ácidos nucleicos también están dentro del significado previsto del término muestra. Además, el experto en la materia apreciará que los lisados, extractos o materiales o partes de estos obtenidos de cualquiera de las muestras anteriores también están dentro del alcance del término muestra. Preferiblemente, la muestra es una muestra biológica derivada de un ser humano, animal, vegetal, bacteria u hongo. En particular, el término "muestra" se refiere a una muestra que contiene ácido nucleico que también comprende proteínas. Preferiblemente, la muestra se selecciona del grupo que consiste en células, tejido, bacterias, virus y fluidos corporales como, por ejemplo, sangre, productos sanguíneos como capa leucocitaria, plasma y suero, orina, fluido, esputo, heces, LCR y esperma, hisopos epiteliales, biopsias, muestras de médula ósea y muestras de tejido, preferiblemente muestras de tejido de órganos tales como pulmón e hígado. Preferiblemente, la muestra se selecciona de sangre completa y productos sanguíneos tales como capa leucocitaria, suero o plasma.
El ácido nucleico también puede ser un ácido nucleico sintetizado artificialmente, por ejemplo a partir de una reacción de PCR. La solución de muestra usada en el proceso se podría obtener directamente a partir del material biológico, por ejemplo, mediante lisis de células o tejido o mediante fraccionamiento y/o pretratamiento de líquidos corporales. De modo alternativo, la solución de muestra se podría obtener a partir de un método de procesamiento de ácido nucleico, que puede ser un método de purificación, síntesis o modificación, como PCR o purificación a partir de gel de agarosa.
En una realización preferida, el ácido nucleico aislado en el método inventivo se obtiene en forma pura, o en forma esencialmente pura o puede estar disuelto. Preferiblemente, solo las impurezas inevitables están comprendidas en el ácido nucleico puro o en el producto de ácido nucleico disuelto. Preferiblemente, la pureza del ácido nucleico aislado es al menos del 90%, más preferiblemente al menos del 90% y más preferiblemente más del 99% o 99,5% en peso, con referencia al ácido nucleico puro o en base a todos los sólidos en el producto de ácido nucleico disuelto excluidos los aditivos sólidos de la solución de elución.
En el proceso de la invención, el ácido nucleico preferiblemente se separa de la solución de muestra mediante unión a partículas magnéticas. Por tanto, el ácido nucleico debe ser accesible a las partículas magnéticas para su unión. En una realización preferida, la solución de muestra es una solución acuosa en la que el ácido nucleico normalmente se disuelve o suspende. En caso de que un material de partida anterior no comprenda ácido nucleico directamente accesible para la unión, preferiblemente se llevan a cabo etapas de tratamiento previo, como lisis y/o rotura de material biológico, como células o tejidos.
El ácido nucleico se separa de la solución por adsorción a las perlas magnéticas. En el método de la invención, se espera que la unión del ácido nucleico a las partículas magnéticas sea principalmente adsorbente. En este caso, la unión suele ser no covalente y reversible. La adsorción es la adhesión de moléculas de ácido nucleico a la superficie de las perlas magnéticas. En la etapa de unión, preferiblemente se ajustan las condiciones de modo que el ácido nucleico se una a las partículas magnéticas, típicamente añadiendo una o más sales caotrópicas, sales no caotrópicas y/o alcohol de bajo peso molecular ("condiciones de unión").
En el método inventivo, la fuerza de unión entre el ácido nucleico y las partículas magnéticas en la etapa (w) del proceso inventivo se basa preferiblemente solo en la adsorción. Preferiblemente, no se basa en otros mecanismos de unión, como la cromatografía de afinidad o la cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de afinidad requiere una interacción altamente específica entre dos moléculas específicas, como el antígeno y el anticuerpo, la enzima y el sustrato, o el receptor y el ligando, de acuerdo con el principio de llave-cerradura. La cromatografía de intercambio iónico se basa en interacciones específicas de moléculas diana con ligandos cargados en la superficie del sustrato. Más preferiblemente, el método no se basa en interacciones específicas del ácido nucleico con grupos carboxilo unidos a las partículas magnéticas.
En una realización preferida, las partículas magnéticas no se modifican con ligandos, especialmente ligandos orgánicos. Preferiblemente, no se unen ligandos a la superficie de las partículas. Por tanto, se prefiere que las partículas no se modifiquen con ligandos de afinidad, tales como estreptavidina o poli-dT. Además, se prefiere que las partículas no se modifiquen con ligandos de intercambio iónico, tales como ligandos de intercambio catiónico. Más preferiblemente, no están modificadas con grupos carboxilo y/o no comprenden grupos carboxilo en la superficie.
En otra realización, las partículas magnéticas son bifuncionales. Esto significa que son capaces de adsorber ácidos nucleicos como una primera funcionalidad, pero tienen una segunda funcionalidad. Por ejemplo, las partículas adsorbentes se pueden modificar con ligandos de afinidad, de modo que la segunda funcionalidad sería la unión por afinidad. Esta segunda funcionalidad se podría usar para unir un sustrato a las partículas en una etapa de unión diferente que durante (w).
La separación de las partículas magnéticas con ácido nucleico unido a las mismas de la solución de muestra se realiza mediante la aplicación de un campo magnético. Normalmente, se aplica un campo magnético fuera del tubo de muestra, de modo que las partículas magnéticas son atraídas a una ubicación definida y se acumulan allí, por ejemplo, en un lado del tubo de muestra. De modo alternativo, se puede insertar un dispositivo magnético en el tubo de muestra o cerca del tubo de muestra, al cual se adhieren las partículas magnéticas. Por ejemplo, el dispositivo podría ser una barra magnética. Preferiblemente, en la etapa de unión, las partículas magnéticas se acumulan en forma de un sedimento o agrupamiento. Después de acumular las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas, se separan de la solución de muestra, eliminando así la solución de muestra.
El método inventivo comprende al menos una etapa de lavado (w) que comprende al menos las etapas secundarias (w1), (w2) y (w3) como se describe anteriormente, que se llevan a cabo en orden consecutivo. Preferiblemente, la etapa (w) consta de las etapas secundarias (w1) a (w3).
En la etapa secundaria (w1), las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se suspenden en la solución de lavado. En esta etapa, las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas normalmente se desprenden de la ubicación predeterminada en el que se fijaron por el campo magnético. Preferiblemente, a menos que las partículas se transfieran a otro tubo, las partículas magnéticas se fijan por el campo magnético de manera que mantengan contacto con la mezcla líquida en el tubo. Normalmente, el campo magnético se inactiva antes o durante la etapa (w1), de modo que las partículas magnéticas se pueden suspender fácilmente en la solución de lavado. Por ejemplo, las partículas magnéticas se pueden unir a la pared del tubo de muestra mediante el campo magnético o a un dispositivo magnético dentro del tubo, después de lo cual se apaga, elimina o reubica el campo magnético y las partículas magnéticas se suspenden en la solución de lavado. Preferiblemente, las partículas magnéticas individuales se distribuyen en la solución, de modo que cualquier agrupamiento o sedimento esté al menos parcialmente, preferiblemente completamente disperso. Esto se puede favorecer con un movimiento suave.
En una realización preferida, la suspensión de las partículas magnéticas en la solución de lavado en la etapa (w1) se mantiene mediante agitación suave, preferiblemente en una dirección vertical, es decir, en más o menos la misma dirección que el eje del tubo. En una realización muy preferida, las partículas magnéticas son atraídas por un imán en una posición elevada en relación con el fondo del tubo y se dejan caer en la solución de lavado dentro del tubo en la etapa (w1) apagando, quitando o reubicando el imán. Se encontró que una agitación tan suave que en esta realización preferida se puede inducir, por ejemplo, por el movimiento de las partículas a través de la solución de lavado hasta el fondo del tubo, por ejemplo, por gravedad o una fuerza magnética adicional, en particular ligera, aplicada debajo de la posición elevada, puede favorecer la liberación de contaminantes de las perlas magnéticas. Sin embargo, se debe elegir la agitación aplicada de manera que no tenga lugar una liberación significativa del ácido nucleico de las partículas magnéticas. El movimiento suave se puede lograr, por ejemplo, mediante un dispositivo que se sumerge en el líquido del tubo y se mueve hacia arriba y hacia abajo, como una varilla magnética o un PickPen® proporcionado, p. ej., por BioControl. También es adecuado suspender las partículas magnéticas lavándolas cuidadosamente de la pared del tubo o de cualquier tipo de dispositivo magnético que se sumerja en el líquido del tubo con la solución de lavado una vez que se ha apagado, retirado o reubicado el dispositivo magnético. Se debe evitar la agitación intensa, es decir, inducida en particular por un medio mecánico como cualquier tipo de dispositivo de agitación.
Por tanto, preferiblemente, las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas no se someten a una fuerza mecánica. En una realización específicamente preferida, las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas no se someten a una fuerza mecánica ejercida de forma oscilante y/u horizontal. Ejemplos de dispositivos que ejercen fuerza mecánica oscilante y/u horizontal son los vórtices o agitadores de laboratorio habitualmente conocidos. La agitación manual suele ser también un ejemplo de tal fuerza. Sin embargo, también se puede aplicar una fuerza mecánica leve ejercida verticalmente, como la gravedad. Esto se puede realizar, por ejemplo, fijando las perlas magnéticas en la pared del tubo o en un dispositivo magnético sumergido en el líquido dentro del tubo en una posición extendida y luego apagando, retirando o reubicando el dispositivo magnético. Debido a la gravedad, las partículas magnéticas se hunden hacia el fondo del tubo, desaceleradas dependiendo de la viscosidad del líquido en el tubo. Además, se puede aplicar una fuerza magnética preferiblemente ejercida verticalmente, es decir, que tenga más o menos la misma dirección que el eje del tubo. Sin embargo, se debe elegir la fuerza del campo magnético de manera que el movimiento inducido dentro de la solución de lavado no libere significativamente el ácido nucleico de las partículas magnéticas. Esto se puede realizar colocando un dispositivo magnético fuera del tubo, por ejemplo, en o debajo de su fondo.
De la misma manera, preferiblemente, las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se suspenden en la solución de lavado sin aplicar una fuerza mecánica. En una realización específicamente preferida, las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se suspenden en la solución de lavado sin aplicar una fuerza mecánica ejercida de forma oscilante y/u horizontal. Sin embargo, se puede aplicar una fuerza mecánica suave ejercida verticalmente, como la gravedad, cuando se suspenden las partículas magnéticas en la solución de lavado. Además, se puede aplicar una fuerza magnética preferiblemente ejercida verticalmente, es decir, que tenga más o menos la misma dirección que el eje del tubo.
Por tanto, la pureza del ácido nucleico aislado se puede aumentar aún más mediante tal agitación suave. Además, se prefiere que no haya agitación, es decir, agitación o movimiento de agitación, en la etapa de incubación (w2).
En una realización preferida, las partículas magnéticas con ácido nucleico unido a las mismas en esta etapa de lavado (w) no se someten a fuerza mecánica, en particular a fuerza mecánica fuerte, que va más allá de una agitación suave. Se encontró que las fuerzas mecánicas, y en particular las fuerzas mecánicas fuertes, pueden mejorar la liberación del ácido nucleico de las partículas magnéticas. Específicamente, la muestra no se debe agitar ni moverse por agitación, en particular no se debe agitar ni mover mecánicamente en la etapa de lavado (w).
La solución de lavado usada en la etapa (w1) es una solución acuosa. Se caracteriza por una concentración de sal por debajo de 100 mM y por la ausencia de un disolvente orgánico. Por tanto, la solución de lavado es distinta de las soluciones de lavado comúnmente usadas en tales procesos con partículas magnéticas. La solución de lavado usada de acuerdo con la invención es única, porque de hecho se aplican condiciones que generalmente se consideran condiciones de "no unión". Por tanto, las etapas de lavado de la técnica anterior se llevan a cabo siempre con soluciones de lavado en "condiciones de unión", que se ajustan, por ejemplo, con una alta concentración de sal de 1 M o superior. De acuerdo con la técnica anterior, la sal es con frecuencia una sal caotrópica. Además, las soluciones de lavado típicas usadas en la técnica anterior comprenden grandes cantidades de disolvente orgánico, especialmente etanol o isopropanol. Añadiendo una o más sales y/o disolventes orgánicos a alta concentración, se asegurará en los procesos de la técnica anterior que el ácido nucleico no se desprenda de las partículas magnéticas y por tanto se pierda.
Como se describió anteriormente, por ejemplo en el protocolo relacionado con el kit MagAttract® HMW DNA, se lleva a cabo una última etapa de lavado, en la que las partículas magnéticas con ácidos nucleicos adheridos a las mismas se lavan con agua pura. Sin embargo, la etapa de lavado solo se lleva a cabo muy brevemente cuando las partículas magnéticas se adhieren en forma de un sedimento a la pared del tubo de muestra. Se debe tener cuidado de que el sedimento no se rompa ni se altere mecánicamente cuando se añade el agua en una posición diferente en el tubo. Cuando se procede en consecuencia, el agua de lavado no tiene acceso al interior del sedimento de partículas magnéticas, de modo que el entorno con alto contenido de sal y etanol se mantiene básicamente dentro del sedimento. El método de la presente invención es sorprendentemente diferente porque las partículas magnéticas con los ácidos nucleicos unidos a las mismas se suspenden en la solución de lavado baja en sal. En la técnica anterior, se suponía que tal tratamiento no sería aplicable para el lavado, ya que debería provocar la elución de los ácidos nucleicos de las partículas. Sorprendentemente, se ha encontrado de acuerdo con la presente invención que se puede llevar a cabo el lavado en una suspensión bajo tales condiciones de "no unión", con un gran aumento en la pureza del producto, pero sin pérdida significativa de ácido nucleico. Esto es muy ventajoso, porque se puede lograr una eliminación eficaz de sal, etanol y/u otros contaminantes del ácido nucleico diana sin una reducción significativa del rendimiento de ácido nucleico. Sin ceñirse a la teoría, se supone que se forma un estado intermedio, en el que las fuerzas entre las partículas magnéticas y las moléculas de ácido nucleico previenen temporalmente la liberación de las moléculas de ácido nucleico de las partículas. Por el contrario, en un estado de equilibrio, que no se alcanza en el proceso inventivo, se obtendría una pérdida significativa de ácido nucleico. El proceso de la invención también es muy ventajoso, ya que ya no es necesaria una etapa de secado para evaporar disolventes orgánicos, como el etanol, aunque aún es posible,. En consecuencia, el proceso de la invención puede ahorrar un tiempo considerable, porque las etapas de secado para la eliminación de disolventes orgánicos, si se llevan a cabo a fondo, consumen relativamente mucho tiempo.
Como se indicó anteriormente, la concentración total de sal de la solución de lavado es preferible por debajo de 100 mM. En general, dicha concentración es insuficiente para la unión estable de ácidos nucleicos a partículas magnéticas por adsorción. Por el contrario, las concentraciones bajas de sal desestabilizan típicamente las interacciones no covalentes entre las superficies de las partículas magnéticas y el ácido nucleico polianiónico. En una realización preferida, la solución de lavado tiene una concentración total de sal por debajo de 50 mM, más preferiblemente por debajo de 25 mM o por debajo de 10 mM. En otra realización preferida, la solución de lavado no contiene ninguna sal. Esto significa que no se ha añadido sal a la solución de lavado. Por tanto, sólo pueden estar incluidas inevitablemente impurezas de sal como las ya incorporadas dentro del complejo de partículas magnéticas/ácido nucleico.
Preferiblemente, la solución de lavado es agua, más preferiblemente agua destilada. En principio, no se requiere incluir sal en la solución de lavado en una concentración de hasta 100 mM para estabilizar el complejo de partículas magnéticas/ácido nucleico en la etapa de lavado (w). Sin embargo, puede ser deseable una pequeña cantidad de sal en el producto final, por ejemplo en forma de una sustancia tampón para estabilizar el producto o facilitar su uso posterior. Por tanto, la sal podría ser una sustancia tampón, como TRIS (Tris(hidroximetil) aminometano). El pH de la solución de lavado puede estar entre 7 y 10, especialmente entre 7,5 y 9.
En una realización preferida, las condiciones en la fase líquida de la muestra (la suspensión) en la etapa (w1), después de la adición de la solución de lavado, son esencialmente las mismas que en la solución de lavado usada en la etapa (w1), al menos con respecto a la concentración de sal y la ausencia de un disolvente orgánico. Por lo tanto, se prefiere que antes de la adición de la solución de lavado en la etapa (w1), la muestra no comprenda cantidades significativas de sal residual o disolvente orgánico, lo que aumentaría significativamente la concentración de sal o el nivel de disolvente orgánico en la fase líquida. Por lo tanto, se prefiere que la concentración total de sal en la fase líquida, en la suspensión de la etapa (w1), después de la adición de la solución de lavado, sea inferior a 100 mM, más preferiblemente inferior a 25 mM o inferior a 10 mM. Además, se prefiere que la suspensión no comprenda disolvente orgánico, excepto por impurezas inevitables, por ejemplo por debajo del 2% en peso. En una realización preferida, la concentración de sal en la solución en la etapa del proceso que se lleva a cabo directamente antes de la etapa (w) (o si se repite la etapa (w), antes de la última etapa (w)) no sea más de 2 M, preferiblemente no más de 1 M.
Si se desea, la solución de lavado puede comprender aditivos diferentes de sales y disolventes orgánicos, como compuestos para estabilizar ácidos nucleicos, como proteasas o agentes acomplejantes como EDTA. En una realización preferida, la solución de lavado consiste en agua y opcionalmente sal a una concentración por debajo de 100 mM, y opcionalmente tales aditivos.
La solución de lavado en la etapa de lavado (w) preferiblemente no comprende un disolvente orgánico. Así, en una realización preferida no comprende alcoholes de bajo peso molecular que tengan de 1 a 5 átomos de carbono, tales como etanol o isopropanol. Por tanto, la solución de lavado es distinta de las soluciones de lavado convencionales típicas usadas en tales procesos que comprenden etanol o isopropanol. En una realización específica, la solución de lavado no comprende ningún compuesto orgánico. Preferiblemente, la solución de lavado no comprende un detergente.
Es altamente preferido que la etapa de lavado (w) sea la etapa de lavado final en el método inventivo. En una realización específicamente preferida, a la etapa de lavado (w) le sigue directamente la elución final del ácido nucleico de las partículas magnéticas. En general, se prefiere que la solución de lavado usada en la etapa (w) sea idéntica a la solución de elución. Sin embargo, también es posible liberar el ácido nucleico de las partículas magnéticas después de la etapa de lavado (w) no en una etapa de elución separada sino en el procedimiento posterior corriente abajo.
En una realización preferida de la invención, la etapa de lavado (w), es decir, la combinación de las etapas secundarias (w1) a (w3), se lleva a cabo en 5 minutos o menos, preferiblemente 2 minutos o menos. Esto significa que se debe realizar en el intervalo de tiempo definido. En otras palabras, el tiempo en el que las partículas magnéticas con ácido nucleico adsorbido en ellas están en contacto con la solución de lavado debe estar en el intervalo de tiempo definido.
En la etapa secundaria (w2), las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se incuban en la solución de lavado. Se adapta el tiempo de incubación con el fin de eliminar la mayor cantidad posible de contaminantes evitando al mismo tiempo una pérdida significativa de ácido nucleico. Cuanto más corto sea el tiempo de incubación, más contaminantes pueden permanecer en el producto. Por lo tanto, puede ser preferible que el tiempo de incubación en la etapa (w2), y/o el tiempo total para la etapa (w), que está determinado principalmente por el tiempo de incubación, sea al menos de 3, al menos de 5, al menos de 10, al menos de 20 o al menos de 30 segundos, o al menos 1 minuto. Cuanto mayor sea el tiempo de incubación, mayor será el riesgo de pérdida de ácido nucleico. Esto se aplica tanto más cuanto más corto sea el ácido nucleico. Por tanto, puede ser preferible que el tiempo de incubación y/o el tiempo de la etapa (w) sea 20 minutos o menos, 10 minutos o menos, 5 minutos o menos, 2 minutos o menos, 1 minuto o menos, 30 segundos o menos, 20 segundos o menos, 10 segundos o menos, preferiblemente 5 segundos. Por ejemplo, el tiempo podría estar entre 3 segundos y 20 minutos, preferiblemente entre 5 segundos y 10 minutos, entre 10 segundos y 5 minutos, entre 20 segundos y 2 minutos o entre 30 segundos y 1 minuto. En tales períodos de tiempo, se puede lograr un equilibrio relativamente bueno entre una alta pérdida de contaminantes y un alto rendimiento de ácido nucleico.
En la etapa secundaria (w3), las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se separan de la solución de lavado. Preferiblemente, las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se separan de la solución de lavado mediante la aplicación de un campo magnético. Preferiblemente, los medios para eliminar las partículas magnéticas de la solución son los mismos a lo largo de todo el proceso.
En el método inventivo, el ácido nucleico a aislar no está específicamente limitado. El ADN puede ser ADN genómico (ADNg), ADN plasmídico (ADNp), fragmentos de ADN de cualquier longitud, p. ej. producido a partir de la digestión con enzimas de restricción, ADN amplificado de cualquier longitud producido por una reacción de amplificación como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), ADN resultante de una muestra de bioproceso obtenido durante la producción de compuestos biotecnológicos como productos biofarmacéuticos o similares, en los que el ADN puede ser bicatenario o monocatenario. El término ARN, como se usa en la presente invención, comprende, pero no se limita a, ARN total, ARNm, ARNr o ARNt. Se han descrito anteriormente otros ácidos nucleicos adecuados.
De acuerdo con la invención, es posible la eliminación eficaz de contaminantes, tales como biomoléculas no diana, sales y disolventes orgánicos, con ácido nucleico de todas las longitudes de cadena. Por ejemplo, el ADN podría tener una longitud de cadena de 10 pb a 100 kpb, preferiblemente de 500 pb a 50 kpb, o de 1 kpb a 20 kpb, teniendo el ARN las longitudes de cadena correspondientes en bases o nucleótidos.
En una realización preferida de la invención, el ácido nucleico tiene una longitud de cadena de 2 kpb o más, preferiblemente 5 kpb o más, o más preferiblemente 10 kpb o más o la cantidad correspondiente de bases o nucleótidos, respectivamente. En una realización preferida, el ácido nucleico puede ser ADN genómico o ADN plasmídico. Cuando el ácido nucleico tiene una longitud de cadena más alta, como 10 kpb o más, más preferido 20 kpb o más, más preferido 50 kpb o más, la pérdida de ácido nucleico en la etapa de lavado se considera insignificante. Entonces, la etapa de lavado (w) puede llevar un tiempo total relativamente largo en el intervalo de minutos, como hasta 10 minutos. Sin embargo, en particular por razones de conveniencia, se puede preferir un tiempo de lavado total más corto como se indicó anteriormente.
Se puede observar alguna reducción del rendimiento con ácidos nucleicos, en particular ADN que tiene una longitud de cadena relativamente corta. Sin embargo, la pérdida de ácido nucleico se puede entonces evitar disminuyendo el tiempo de la etapa de lavado (w) y/o el tiempo de incubación en la etapa (w2), por ejemplo, a 2 minutos o menos, 1 minuto o menos, 30 segundos o menos, 20 segundos o menos, 10 segundos o menos, 5 segundos o menos o 3 segundos. En principio, cuanto más corto sea el ADN, menos tiempo debería llevar la etapa de lavado (w). En esas circunstancias, la pérdida de ácido nucleico puede ser de un orden de magnitud similar en el presente método de la invención que en el procedimiento de lavado del estado de la técnica, pero con la ventaja adicional de que se eliminan más contaminaciones lo que da como resultado un ácido nucleico de mayor pureza que en el estado de la técnica.
En una realización preferida de la invención, el ácido nucleico tiene una longitud de cadena de 30 kpb o menos, 20 kpb o menos, o 10 kpb o menos, o un número correspondiente de bases o nucleótidos, en donde la etapa de lavado (w) se lleva a cabo en 2 minutos o menos, 1 minuto o menos, 30 segundos o menos, 20 segundos o menos, 10 segundos o menos o preferiblemente 5 segundos. Preferiblemente, el ácido nucleico es ADN. En otras realizaciones preferidas, el ácido nucleico tiene una longitud de cadena de 5 kpb o menos, o 3 kpb o menos, 2 kpb o menos, 1 kpb o menos, más preferiblemente al menos 500 bp, o un número correspondiente de bases o nucleótidos, en donde la etapa de lavado se lleva a cabo en 1 minuto o menos, o 30 segundos o menos, 20 segundos o menos, 10 segundos o menos, 5 segundos o menos o 3 segundos. Preferiblemente, el ácido nucleico es ADN.
La etapa de lavado (w) se puede repetir tantas veces como se desee, por ejemplo, se puede repetir una, dos, tres veces o incluso con más frecuencia. Sin embargo, se encontró que es posible una eliminación muy eficaz de impurezas en un proceso simple con un solo paso de lavado. Por tanto, es muy preferible realizar la etapa de lavado (w) solo una vez.
En una realización preferida, la etapa de lavado (w) se lleva a cabo a una temperatura de 30 °C o menos, preferiblemente entre 0 °C y 30 °C. Si la temperatura en la etapa de lavado (w) es demasiado alta, el ácido nucleico se puede liberar de las partículas magnéticas y perderse. En una realización preferida, se lleva a cabo a temperatura ambiente, por ejemplo entre aproximadamente 15 °C y 25 °C. Sin embargo, la muestra también se puede enfriar, por ejemplo, a 15 °C o menos, lo más preferiblemente a 5 °C o menos.
En una realización preferida, el método comprende etapas de lavado adicionales, que son diferentes de la etapa de lavado (w). Preferiblemente, tales etapas de lavado adicionales se llevan a cabo antes de la etapa de lavado (w). Estas etapas de lavado adicionales se pueden llevar a cabo con tampones o soluciones de lavado convencionales que comprenden etanol como se describe en la técnica anterior. Con tales etapas de lavado adicionales, se puede lograr una purificación previa, de manera que se reduzcan los niveles de sal, alcohol y/u otros contaminantes. En una realización altamente preferida, la etapa de lavado (w) es la última etapa de lavado antes de una etapa opcional de elución.
En una realización preferida, antes de la etapa de lavado (w), las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido en las mismas se someten al menos a una etapa de lavado previo (p) en la que se adapta la solución de lavado a las condiciones de unión del ácido nucleico. Esto significa que en la etapa de lavado previo (p), la concentración de sal es relativamente alta y/o se incluye disolvente orgánico. Tales etapas de lavado en condiciones de unión se usan comúnmente en métodos conocidos para eliminar contaminantes de la solución de muestra. También en el proceso de la invención, puede ser ventajoso incluir dichas etapas de lavado previas (p) para eliminar contaminantes, tales como proteínas u otros componentes celulares, o compuestos no deseados de bajo peso molecular, de la solución de muestra.
En una realización preferida de la invención, antes de la etapa de lavado (w), las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido en las mismas se lavan en al menos una etapa de lavado previa (p) con una solución de lavado, que es una solución acuosa que tiene una concentración total de sal por encima de 500 mM y/o comprende un disolvente orgánico. Más específicamente, en la etapa de lavado previa (p), la concentración total de sal de la solución de lavado de la etapa de lavado previa (p) podría ser superior a 1 M o incluso superior a 2 M. En la etapa de lavado previa (p), el disolvente orgánico es preferiblemente etanol o isopropanol. Específicamente, en la etapa de lavado previa (p), la solución de lavado puede comprender un alcohol menor, como etanol o isopropanol, a una concentración de al menos 10%, o al menos 50% en peso, o alcohol puro.
En una realización de la invención, se lleva a cabo una etapa de lavado adicional (p), en la que las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido, cuando se fijan por el campo magnético, se lavan con agua, o con un tampón bajo en sal como se usa en la etapa de lavado (w), de manera que el ácido nucleico permanece unido a las partículas. Sin embargo, dado que la etapa de lavado (w) es más eficaz que dicha etapa de aclarado, se prefiere que dicha etapa de aclarado no esté incluida.
En una realización preferida de la invención, después de la etapa de lavado (w), el ácido nucleico se eluye de las partículas magnéticas con una solución de elución. Preferiblemente, si se desea la elución, la etapa de elución se lleva a cabo directamente después de la etapa de lavado (w). En otras palabras, no se llevan a cabo otras etapas de tratamiento intermedias, y especialmente etapas de lavado, después de la etapa de lavado (w). La solución de elución es preferiblemente agua pura, normalmente agua destilada o un tampón de elución que tiene una baja concentración de sal. Normalmente, el tampón de elución tiene una concentración de sal de 25 mM o menos, en donde la sal es generalmente una sal tampón, tal como TRIS 10 mM. El pH de la solución de elución y/o tampón está típicamente entre 7 y 10, especialmente entre 7,5 y 9. Después de la elución, el ácido nucleico permanece preferiblemente en la solución de elución resultante mientras que las partículas magnéticas se eliminan de la solución de elución por fuerza externa, tal como centrifugación o campo magnético. Sin embargo, también es adecuado eluir el ácido nucleico según las condiciones aplicadas en un tratamiento posterior corriente abajo y no en una etapa de elución separada que precede al tratamiento corriente abajo.
Después de la etapa de lavado (w), el ácido nucleico diana se puede eluir de las perlas magnéticas con una solución de elución. Esta etapa de elución se debe distinguir claramente de la etapa de lavado (w), aunque la solución de elución puede ser idéntica a la solución de lavado usada en la etapa de lavado (w). En la etapa de lavado (w), el ácido nucleico permanecerá esencialmente unido a las partículas magnéticas, mientras que en la etapa de elución las condiciones se ajustan de manera que se supone que se eluye el ácido nucleico.
Preferiblemente, la elución se favorece mediante fuerza mecánica, tiempo de incubación prolongado y/o temperatura aumentada. En una realización preferida, la elución del ácido nucleico de las partículas magnéticas se mejora aplicando una fuerza mecánica. Específicamente, la elución se puede acelerar mediante agitación o movimiento de agitación intensivos, especialmente a alta velocidad, como la agitación con vórtex. La elución se puede favorecer incubando las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas en la solución de elución durante un período de tiempo prolongado, tal como más de 5 minutos, más de 10 minutos o más de 60 minutos. El aumento de la temperatura puede favorecer la liberación del ácido nucleico de las partículas magnéticas. Por tanto, la elución se puede llevar a cabo a una temperatura de 20 °C o superior, como la temperatura ambiente, o superior a 30 °C.
El término "partículas magnéticas" como se usa en esta memoria comprende partículas magnéticamente sensibles que son capaces de unirse reversiblemente a ácidos nucleicos en los términos de la presente invención, p. ej. mediante interacción iónica o similar. Tales partículas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Como se usa en esta memoria, el término "magnético" abarca materiales magnéticos, tales como materiales ferromagnéticos, ferrimagnéticos, paramagnéticos o superparamagnéticos. Estos materiales magnéticos son parte de las partículas magnéticas descritas anteriormente y se pueden incluir en las partículas a través de cualquier método adecuado.
En una realización preferida de la invención, las partículas magnéticas comprenden sílice. La sílice podría estar en forma de gel de sílice, óxido silíceo, sílice sólida como vidrio o tierra de diatomeas, o una mezcla de dos o más de los anteriores. La sílice debe estar presente al menos en parte en la superficie de las perlas. Para una unión eficaz, se prefiere que la sílice esté presente en toda la superficie de las partículas.
Las partículas magnéticas pueden ser partículas magnéticas recubiertas de sílice. El término "partículas magnéticas recubiertas de sílice" se refiere a partículas magnéticas recubiertas con sílice. Estas partículas son bien conocidas por el experto. Son principalmente adecuadas cualquier tipo de partículas magnéticas recubiertas de sílice para el método de la presente invención. Sin embargo, preferiblemente las partículas magnéticas no son partículas de intercambio aniónico.
El gel de sílice es preferiblemente gel de sílice de calidad cromatográfica, una sustancia que está disponible comercialmente de varias fuentes diferentes. El gel de sílice se prepara más comúnmente acidificando una solución que contiene silicato, p. ej. silicato de sodio, a un pH de menos de 10 u 11 y luego dejando que la solución acidificada gelifique (p. ej., discusión de la preparación de sílice en Enciclopedia de tecnología química de Kurt-Othmer, vol. 6, 4a ed., Mary Howe-Grant, ed., John Wiley & Sons, pub., 1993, págs. 773-775).
Las partículas de vidrio son preferiblemente partículas de sílice cristalina (p. ej., cuarzo a, sílice vítrea), aunque la sílice cristalina no es formalmente "vidrio" ya que no es amorfa, o partículas de vidrio hechas principalmente de sílice. Las partículas de vidrio también son bien conocidas por los expertos.
Las partículas magnéticas recubiertas con óxido de silicio son la forma más preferida de partículas magnéticas de sílice usadas en la presente invención. Las partículas magnéticas recubiertas con óxido silíceo están compuestas por un recubrimiento de óxido silíceo con un núcleo que comprende al menos una partícula de material ferrimagnético, ferromagnético, superparamagnético o paramagnético. Las partículas magnéticas recubiertas de óxido de silicio usadas en la presente invención también tienen una superficie adsorbente de óxido de silicio hidratado. El ácido nucleico diana, como el ADN o el ARN, se adhiere a la superficie adsorbente de las partículas, mientras que otros materiales de la fuente del ácido nucleico, en particular contaminantes nocivos como las nucleasas o similares, no se adhieren ni coeluyen de las partículas magnéticas recubiertas de óxido de silicio junto con el ácido nucleico. Las partículas magnéticas recubiertas de óxido de silicio son bien conocidas por el experto y están disponibles comercialmente (p. ej., partículas magnéticas MagAttract®, QIAGEN, Hilden, Alemania).
Las partículas magnéticas tienen la capacidad de formar un complejo con el ácido nucleico en la solución acuosa uniendo reversiblemente el ácido nucleico, p. ej. mediante interacción iónica o similar. La presente invención se puede realizar usando cualquier partícula magnética revestida de sílice que posea la propiedad de formar un complejo con el ácido nucleico. Incluso más preferiblemente, el método de la presente invención se realiza usando cualquier forma de partículas magnéticas recubiertas de óxido de silicio, p. ej., perlas magnéticas MagAttract® (QIAGEN, Hilden, Alemania). Las partículas magnéticas recubiertas de sílice usadas en los métodos de la presente invención pueden ser cualquiera de varios tamaños diferentes. Las partículas magnéticas de sílice más pequeñas proporcionan más área de superficie por unidad de peso para la adsorción, pero las partículas más pequeñas están limitadas en la cantidad de material magnético que se puede incorporar en tales partículas en comparación con las partículas más grandes.
El término "sal", como se usa en esta memoria, se refiere preferiblemente a sales caotrópicas y no caotrópicas. Normalmente, la solución de muestra y/o el tampón de lavado para las etapas de lavado previo (p) comprenden una sal caotrópica y/o una sal no caotrópica. Se encontró que tales sales se pueden eliminar de forma eficaz en el método inventivo mediante la etapa de lavado (w).
En una realización preferida, las sales caotrópicas son sales de iones caotrópicos de acuerdo con el 'Hoffmeister-Reihe'. Tales sales son muy solubles en soluciones acuosas. Los iones caotrópicos proporcionados por tales sales, en una concentración suficientemente alta en soluciones acuosas de proteínas o ácidos nucleicos, hacen que las proteínas se desplieguen, los ácidos nucleicos pierdan la estructura secundaria o, en el caso de los ácidos nucleicos bicatenarios, se deshagan (es decir, separación de cadenas). Se asume que los iones caotrópicos muestran estos efectos porque desorganizan los entramados de enlaces de hidrógeno que existen en soluciones acuosas y, por lo tanto, hacen que las proteínas desnaturalizadas y los ácidos nucleicos desnaturalizados sean termodinámicamente más estables que sus equivalentes correctamente plegados o estructurados. La sal caotrópica en la solución de muestra se puede seleccionar del grupo de isotiocianato de guanidinio, tiocianato de guanidinio, cloruro de guanidinio, yoduro de sodio, yoduro de potasio, cloruro de litio, perclorato de sodio, tricloroacetato de sodio o una mezcla de los estos. En una realización preferida de la invención, la sal no caotrópica en la solución de muestra se selecciona del grupo de cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de amonio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio o una mezcla de estos.
La concentración de sal en la solución de muestra de la presente invención se encuentra preferiblemente en un intervalo de 0,5 M a 10 M. Con cualquier sal usada en la invención, es deseable que la concentración de la sal, en cualquiera de las soluciones en las que se emplea la sal para realizar el método de la invención, permanezca por debajo de la solubilidad de la sal en la solución en todas las condiciones a las que se somete la solución al realizar el método de la invención. La concentración de la sal en la mezcla debe ser lo suficientemente alta para hacer que el biopolímero se adhiera a las partículas magnéticas de sílice en la mezcla, pero no tan alta como para sustancialmente desnaturalizar o degradar el ácido nucleico, o hacer que precipite el ácido nucleico fuera de la solución acuosa. Las proteínas y moléculas grandes de ADN bicatenario, como el ADN cromosómico, son normalmente estables a concentraciones de sal caotrópica entre 0,5 M y 2 M, pero se sabe que precipitan de la solución a concentraciones de sal caotrópica superiores a aproximadamente 2 M (p. ej. documento US 5.346.994, columna 2, líneas 56-63). Por el contrario, el ARN y las moléculas más pequeñas de a Dn , como el ADN plasmídico, los fragmentos de restricción o los fragmentos de PCR de ADN cromosómico, o el ADN monocatenario, generalmente permanecen sin degradar y en solución a concentraciones de sal caotrópica entre 2 M y 5 M, lo que es bien conocido por aquellos expertos en la técnica. Por tanto, la concentración de sal en un método de acuerdo con la invención es dependiente del área de aplicación y es evidente para los expertos en la técnica o se puede determinar fácilmente.
Si se desea, la solución de muestra puede comprender al menos un aditivo para mejorar la unión a las partículas magnéticas. Por ejemplo, el aditivo podría ser una sustancia no iónica que sea fuertemente hidratable y se seleccione del grupo de etilenglicol, tetraetilenglicol, polialquilenglicol, ciclodextrina, carragenano, dextrano, dextran sulfato, xantano, celulosa, hidroxipropil celulosa, amilosa, 2-hidroxipropil p-ciclodextrina, Agar o una mezcla de estos. Es preferible el polialquilenglicol, pero no se limita a polietilenglicol, polipropilenglicol o una mezcla de estos. En una realización preferida, el aditivo es polietilenglicol. Estos aditivos son capaces de inhibir sustancialmente la agrupación de las partículas magnéticas en una solución acuosa a concentraciones relativamente bajas, lo que permite un proceso automatizado sin problemas, p. ej., no se produce la obstrucción de las puntas de las pipetas debido a las partículas magnéticas agrupadas. Se proporciona más información sobre la selección y el uso de dichos aditivos en el documento WO2005/021748 A1.
En una realización preferida de la invención, el método comprende las etapas de
(a) añadir partículas magnéticas a una solución de muestra que comprende el ácido nucleico,
(b) incubar la solución de muestra de la etapa (a) para adsorber el ácido nucleico en las partículas magnéticas,
(c) aplicar un campo magnético a la solución de muestra para fijar las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido en ellas,
(d) retirar la solución de muestra,
(e) lavar las partículas magnéticas con una solución de lavado en una etapa de lavado (w) como se define anteriormente, y
(f) eluir el ácido nucleico de dichas partículas magnéticas con una solución de elución.
Preferiblemente, las etapas (a) a (f) se llevan a cabo en orden consecutivo. Se pueden incluir etapas adicionales en el proceso, como un tratamiento previo de la muestra original antes de la etapa (a), por ejemplo, con el fin de hacer que el ácido nucleico sea accesible para la unión, como un procedimiento de lisis que libera el ácido nucleico, y/o con el fin de ajustar las condiciones de unión. Antes de la etapa de lavado (e), se pueden llevar a cabo las etapas de lavado previo (p) con el fin de eliminar los contaminantes del ácido nucleico y las partículas magnéticas. La etapa de lavado (e), es decir, la etapa de lavado (w) en condiciones de no unión, se puede repetir hasta que la sal y el disolvente orgánico se eliminen según se desee. En una realización específica, el método puede consistir básicamente en las etapas (a) a (f) y (p), cada una de las cuales se puede repetir si se desea. En principio, los métodos con las etapas (a) a (d) y (f) son conocidos en la técnica y, por lo tanto, estas etapas del proceso se pueden llevar a cabo como se describe en la técnica anterior.
Preferiblemente, el proceso inventivo, o al menos las etapas de proporcionar una solución de muestra, unión y lavado, y opcionalmente también elución, se llevan a cabo en un solo tubo. Normalmente, después de que las partículas magnéticas se trataron con una solución y se eliminaron de la solución, la solución también se retira del tubo antes de que se lleve a cabo la siguiente etapa.
En una realización preferida de la invención, el método es un proceso automatizado. Dado que el proceso de la invención es relativamente sencillo de realizar, es especialmente adecuado para la automatización, por ejemplo, con robots o estaciones de trabajo como se usa comúnmente en la técnica anterior. Se conocen en la técnica varios métodos de separación automática de partículas magnéticas y todos deberían ser adecuados para su uso en la presente invención. Como un ejemplo, se puede insertar un dispositivo magnético o magnetizable en el medio que contiene las partículas magnéticas, las partículas magnéticas se unen al dispositivo magnético o magnetizable y el dispositivo magnético o magnetizable se retira de nuevo. En una segunda realización del método inventivo, la separación del medio y las partículas magnéticas, ambas aspiradas en una punta de pipeta, se facilita mediante un dispositivo magnético o magnetizable que se coloca en proximidad espacial a la punta de la pipeta. Las partículas magnéticas se mantienen alejadas en la punta de la pipeta, por ejemplo, en la pared o en la parte inferior de la punta cuando se retira el medio de la punta de la pipeta. La automatización de estos dos métodos generalmente requiere medios técnicos especiales, p. ej. un robot construido especialmente para uno de esos métodos. Sin embargo, los métodos también se pueden realizar manualmente. Un principio más general en la eliminación de partículas magnéticas es poner un dispositivo magnético o magnetizable en proximidad espacial al recipiente que contiene el medio y las partículas magnéticas. Las partículas magnéticas se adhieren a la pared del recipiente y el medio se puede eliminar sin que las partículas magnéticas se muevan.
El objeto de la invención es también el uso de una solución acuosa, que tiene una concentración total de sal por debajo de 100 mM y no comprende un disolvente orgánico, como una solución de lavado para lavar partículas magnéticas con ácido nucleico adsorbido a las mismas en un método para aislar ácido nucleico de una solución de muestra, en donde las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido en las mismas se suspenden en la solución de lavado. Preferiblemente, el uso es en un método como se describe anteriormente, y/o comprende etapas o características específicas como se describe anteriormente para el método inventivo.
El ácido nucleico que usa el método de la presente invención se puede obtener a partir de material biológico, tal como células eucariotas o procariotas en cultivo o de células tomadas u obtenidas de tejidos, células tumorales, exosomas, organismos multicelulares que incluyen animales y plantas; fluidos corporales como sangre, linfa, orina, heces o semen; productos alimentarios; productos cosméticos; o cualquier otra fuente de células o pueden ser extracelulares. Se han descrito anteriormente otros materiales de muestra adicionales adecuados. Algunos biopolímeros, tales como ciertas especies de ADN o ARN, se aíslan de acuerdo con el presente método a partir del ADN o ARN de orgánulos, virus, fagos, plásmidos, viroides o similares que infectan células. Las células pueden ser células bacterianas, como células E. coli. Las células se lisarán y el lisado se procesará normalmente de diversas formas conocidas para los expertos en la técnica para obtener una solución acuosa de ADN o ARN, a la que se aplican los métodos de separación o aislamiento de la invención. El ADN o ARN, en dicha solución, normalmente se encontrará con otros componentes, como proteínas, ARN (en el caso de separación de ADN), ADN (en el caso de separación de ARN) u otros tipos de componentes. Se han descrito anteriormente otros biopolímeros adicionales adecuados.
Antes de poner en contacto las partículas magnéticas con el ácido nucleico, puede ser necesario romper el material biológico en el que está contenido el ácido nucleico. Independientemente de la naturaleza de la fuente del ácido nucleico, el ácido nucleico a aislar con el método de la presente invención se proporciona en una solución acuosa que comprende el ácido nucleico y moléculas diferentes de los ácidos nucleicos, p. ej. restos celulares, polipéptidos, etc. Cuando el material de ácido nucleico que se va a aislar usando los métodos de la presente invención está contenido dentro de una célula, o tejido que comprende células, preferiblemente se procesa primero lisando o rompiendo la célula o tejido para producir un lisado (denominado en el esta memoria "lisado crudo"), y más preferiblemente se procesa adicionalmente limpiando el lisado de restos celulares (p. ej., mediante centrifugación o filtración al vacío). Cualquiera de los varios métodos conocidos diferentes para lisar o romper células para liberar materiales de ácido nucleico contenidos en estas es adecuado para su uso en la producción de una solución acuosa a partir de células para su uso en la presente invención. El método elegido para liberar el material de ácido nucleico de una célula dependerá de la naturaleza de la célula que contiene el material. Por ejemplo, con el fin de hacer que una célula con una pared celular relativamente dura, como una célula fúngica o una célula vegetal, libere el material de ácido nucleico contenido en ella, es posible que sea necesario usar tratamientos severos como proteasas potentes y cizallamiento mecánico con un molino de partículas o un homogeneizador, o la rotura con ondas de sonido usando un sonicador. Por el contrario, el material de ácido nucleico se puede liberar fácilmente de células con membranas de bicapa lipídica como bacterias E. coli o células sanguíneas animales simplemente suspendiendo dichas células en una solución acuosa y añadiendo un detergente a la solución. Una vez que el material de ácido nucleico se libera de las células lisadas o rotas como se describió anteriormente, los restos celulares que probablemente interfieran con la adhesión del material de ácido nucleico a las partículas magnéticas se pueden eliminar usando varias técnicas diferentes conocidas en la técnica o una combinación de estas técnicas. El lisado crudo se centrifuga preferiblemente para eliminar los restos celulares en partículas. Opcionalmente, el sobrenadante se procesa posteriormente añadiendo una segunda solución al sobrenadante que provoca una precipitación de otros constituyentes celulares, p. ej., polipéptidos, y luego eliminando el precipitado de la solución resultante por centrifugación. En una realización preferida, el lisado así obtenido, o el sobrenadante, se usa como solución de muestra en el proceso inventivo.
El ácido nucleico también se puede obtener de una fuente artificial. El material de ácido nucleico puede ser el producto de una reacción de amplificación, tal como ADN amplificado producido mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA), o similares. El material de ácido nucleico también puede estar en forma de fragmentos de cualquier longitud, p. ej., producido a partir de la digestión con enzimas de restricción. La solución acuosa de acuerdo con la invención también puede ser una solución acuosa que comprende gel de electroforesis y material de ácido nucleico fundido o digerido enzimáticamente.
El ácido nucleico aislado mediante el método de la presente invención es adecuado, sin más aislamiento o purificación, para análisis o procesamiento adicional por procedimientos de biología molecular, los ácidos nucleicos aislados se pueden analizar mediante, por ejemplo, secuenciación, análisis de restricción o hibridación con sonda de ácido nucleico. Por tanto, los métodos de la invención se pueden aplicar como parte de métodos, basados en análisis de ADN o ARN, para, entre otras cosas, genotipificación, diagnóstico de enfermedades, identificación de patógenos, análisis de alimentos, cosméticos, sangre o productos sanguíneos u otros productos para contaminación por patógenos, pruebas forenses, pruebas de paternidad e identificación del sexo de fetos o embriones u otras pruebas prenatales preferiblemente no invasivas (NIPT).
El ADN o ARN aislado mediante el método de la presente invención se puede procesar mediante cualquiera de las diversas exonucleasas y endonucleasas que catalizan reacciones con ADN o ARN, respectivamente, y, en el caso del ADN, se puede digerir con enzimas de restricción, que cortan los sitios de restricción presente en el ADN. Los fragmentos de restricción del ADN eluidos se pueden ligar en vectores y transformarse en huéspedes adecuados para clonación o expresión. Los segmentos del ADN o ARN eluidos se pueden amplificar mediante cualquiera de los diversos métodos conocidos en la técnica para amplificar segmentos de ácido nucleico diana. Si el ADN eluido es un plásmido u otro tipo de ADN de replicación autónoma, se puede transformar en un hospedador adecuado para la clonación o para la expresión de genes en el ADN que es capaz de expresarse en el hospedador transformado.
El método inventivo resuelve el problema subyacente a la invención. Se proporciona un método eficaz para el aislamiento de ácidos nucleicos, que supera los inconvenientes de los métodos conocidos. El ácido nucleico se puede aislar en forma pura y con alto rendimiento en un proceso relativamente simple y cómodo. Las impurezas, como las sales, los disolventes orgánicos y los contaminantes de la solución de muestra se eliminan de forma eficaz. Se pueden aislar ácidos nucleicos de diferentes longitudes de cadena con alto rendimiento al adaptar el tiempo de incubación en la etapa de lavado (w). El proceso no requiere una etapa de secado para la evaporación de disolventes orgánicos que consume mucho tiempo. Los productos químicos y componentes para la etapa de lavado (w) son simples, ya que la solución de lavado puede ser agua o una solución acuosa baja en sal, e incluso puede ser idéntica a la solución de elución.
En las figuras se muestran otros aspectos de la invención.
La Figura 1 muestra los resultados del ejemplo 3 de forma gráfica. Las impurezas en los eluyentes se analizaron espectrométricamente en el intervalo de 220 a 350 nm. Las líneas de puntos se refieren a dos sondas con ADN aislado mediante el método de triple lavado (comparativo) de acuerdo con el ejemplo 1. Las líneas continuas se refieren a dos sondas con ADN aislado mediante un método de gota de agua de acuerdo con la invención del ejemplo 2.
La Figura 2 muestra los resultados del ejemplo 4 de forma gráfica. Las impurezas en los eluyentes se analizaron espectrométricamente en el intervalo de 220 a 350 nm. Las líneas de puntos se refieren a tres sondas con ADN aislado por el método de triple lavado (comparativo). Las líneas continuas se refieren a una sonda con ADN aislado mediante un método de gota de agua de acuerdo con la invención.
La Figura 3 muestra un gel de agarosa del ejemplo 5 con ADN genómico aislado de E. co lide acuerdo con el ejemplo 2. Se analizó el ADN del eluido (carril a) y del agua usada en la etapa de lavado con gota de agua (carril b).
La Figura 4 muestra un gel de agarosa del ejemplo 6 con el plásmido pCMVp aislado de E. coli de acuerdo con el ejemplo 2. Se analizó el ADN del eluido ("elución") y del agua usada en la etapa de lavado con gota de agua ("gota de agua").
La Figura 5 muestra un gel de agarosa del ejemplo 6 con el plásmido pCMVp aislado de E. coli de acuerdo con el ejemplo 2. Se analizó el ADN del eluido ("B: Eluido") y del agua usada en la etapa de lavado con gota de agua ("A: Agua de gota de agua") después de diferentes tiempos de incubación de 0, 6, 12, 18 y 24 h. En la sección C se muestran más resultados de la segunda etapa de elución posterior a la etapa de elución en B., en donde se aplicó fuerza mecánica y calor moderado a las suspensiones en la segunda etapa de elución.
La Figura 6 muestra un gel de agarosa del ejemplo 8 con el plásmido pCMVp y pUC21 aislados de E. coli de acuerdo con los ejemplos 1 y 2. Se analizó el ADN del eluido ("elución") y del agua usada en la etapa de lavado con gota de agua ("gota") o en la etapa de lavado ("lavado"), respectivamente.
Ejemplos
Ejemplos 1 y 2: Purificación de ADN
Se aisló ADN de células bacterianas de acuerdo con el método de la invención (ejemplo 2) y con un método de la técnica anterior (ejemplo 1). Las condiciones y soluciones de trabajo se enumeran en la tabla 1 a continuación. La lisis de células E. coli o de sangre completa se realizó de acuerdo con el protocolo estándar con un kit disponible bajo la marca comercial QlAamp® (Qiagen AG, Hilden, Alemania; n° cat. 51304). El ADN se purificó con partículas magnéticas con el kit MagAttract® de acuerdo con el protocolo estándar (Qiagen AG, Hilden, Alemania; n° cat. 67563) usando una plataforma de extracción de perlas magnéticas (marca comercial Gilson Extractman®; Gilson Inc., Middleton, Estados Unidos/Salus Discovery). En el proceso estándar del ejemplo 1, el ADN se unió a partículas de sílice magnéticas a partir de un tampón que comprendía una alta concentración de sal caotrópica para establecer las condiciones de unión. Las partículas magnéticas se separaron de la solución de muestra mediante la aplicación de un campo magnético. Específicamente, las partículas magnéticas se sacaron de la solución, seguido de la eliminación de la solución de muestra. En la etapa de lisis 1 (tabla), solo se recogieron las perlas y no se suspendieron nuevamente en el lisado. Las partículas magnéticas con ADN unido a las mismas se lavaron de acuerdo con el protocolo con varios tampones de lavado estándar mediante la liberación de las partículas a un tampón de lavado en un pocillo de muestra, lavando y volviendo a atraer/reunir las partículas magnéticas con el ADN unido. La liberación se llevó a cabo apagando, eliminando o reubicando el campo magnético, de modo que las perlas magnéticas con ácido nucleico unido a las mismas cayeran en la solución inferior. En la mayoría de las etapas de lavado, este ciclo de unir las partículas y "dejarlas caer" se repitió con el fin de imponer alguna fuerza mecánica suave sobre las partículas. El número de "gotas" de las perlas magnéticas en cada etapa también se muestra en la tabla.
En el ejemplo comparativo 1, antes de la elución, las partículas magnéticas con ADN unido a las mismas, que se fijaron al tubo de muestra mediante una fuerza magnética, se lavaron cuidadosamente con agua destilada en la etapa (5a). En esta etapa de lavado no se aplicó ninguna fuerza mecánica adicional, como sacudir o agitar. A continuación, esta etapa se denomina etapa de "lavado con agua".
En el ejemplo de la invención, la etapa final de lavado con agua se reemplazó por una etapa final de lavado (5b) en la que las partículas magnéticas con ADN unido a las mismas se suspendieron en agua destilada. Las partículas magnéticas se liberaron eliminando el campo magnético y dejando caer las partículas magnéticas en la solución de lavado, seguido de incubación durante 5-10 segundos. En esta etapa de lavado no se aplicó ninguna fuerza mecánica adicional, como sacudir o agitar. Posteriormente, las partículas magnéticas con ácidos nucleicos unidos a las mismas se separaron de la solución de lavado volviendo a iniciar la fuerza magnética. En lo que sigue, tal etapa de lavado (w) se denomina etapa de "gota de agua", ya que las partículas magnéticas se dejan caer a gotas en el agua para el lavado.
La elución se llevó a cabo dejando caer repetidamente las perlas en la solución de elución con el fin de mejorar la liberación del ácido nucleico. La elución se mantuvo mediante agitación magnética durante 3 minutos.
Tabla 1: Condiciones experimentales con el tampón usado y número de etapas de lavado. En cada etapa, las partículas magnéticas se separaron de la solución y se eliminó la solución. También se indica el número de "gotas", es decir, la liberación repetida de partículas magnéticas en la misma solución.
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Ejemplo 3: Pureza del ADN genómico de E. coli
Se determinaron espectrométricamente las impurezas en el ADN genómico de E. coli preparado de acuerdo con los ejemplos 1 y 2 anteriores. Con el fin de eliminar los contaminantes de las partículas magnéticas, se llevó a cabo la elución sometiendo las partículas magnéticas durante tres minutos a un agitador magnético. Se analizaron las impurezas en los eluyentes con un espectrómetro en el intervalo de 220 nm a 350 nm, en donde se determina principalmente el remanente de sal. Los resultados se muestran en la Fig. 1. Las líneas de puntos muestran los valores detectados para dos sondas con ADN aislado de acuerdo con un protocolo de lavado con agua del ejemplo 1 (comparativo). Las líneas continuas muestran valores detectados para dos sondas con ADN aislado de acuerdo con un protocolo de lavado con agua del ejemplo 2. Un valor de DO alto en el intervalo entre 220 y 245 nm es generalmente indicativo de sal y otros contaminantes. Los resultados demuestran que el proceso de la invención, con el lavado de partículas magnéticas con ADN unido en agua destilada en condiciones de no unión, elimina muchos más contaminantes que el método comparativo con una etapa de lavado con agua de la técnica anterior.
Ejemplo 4: Pureza del ADN a partir de sangre
Se preparó ADN de sangre humana completa de acuerdo con el protocolo del ejemplo inventivo 2 y el ejemplo comparativo 1 modificado. En el proceso del ejemplo 1 descrito anteriormente, la etapa 5a de lavado con agua (véase la tabla) se reemplazó por una tercera etapa de lavado con tampón PE. Como en la primera y segunda etapas 3, 4 de lavado con tampón PE, también en la tercera etapa de lavado con tampón de PE, las partículas magnéticas se dejaron caer tres veces en la solución. Se compararon las purezas de los productos de ADN aislados. El objetivo era determinar si la etapa de lavado adicional en el proceso comparativo, con 3 gotas en tampón de etanol PE, puede eliminar las impurezas de manera más eficiente que el proceso inventivo con una sola gota de las partículas en agua.
Los resultados se muestran en la Fig. 2. Las líneas de puntos se refieren al ADN aislado mediante el método comparativo de triple lavado. Las líneas continuas se refieren al ADN del ejemplo 2 aislado por el método de la gota de agua. Los resultados demuestran que el proceso inventivo puede eliminar significativamente más contaminantes de la muestra que un proceso convencional. Cada gota de las partículas magnéticas en el tampón de lavado se asocia con una fuerza mecánica suave que ayuda a lavar el ADN unido a las partículas magnéticas libres de contaminantes. Siguiendo esa lógica, una gota de muestra triple en un tampón de lavado debería ser superior a una única gota en la eliminación de sales y otros contaminantes de la muestra. Por lo tanto, fue inesperado que una sola gota en agua limpiara la muestra de ADN de manera similar o mejor que una etapa de lavado triple, en donde se dejaron caer las partículas en tampón de lavado estándar.
Ejemplo 5: Rendimiento de ADN genómico de E. coli
La etapa de "gota de agua" en el proceso inventivo se llevó a cabo con agua, que normalmente impone condiciones de elución al ADN unido a partículas magnéticas. Por lo tanto, se determinó si se produce una pérdida de ADN en el método descrito en los ejemplos anteriores. Se preparó ADN genómico (ADNg; aproximadamente de 20 kpb de longitud) a partir de E. coli en el método del ejemplo 2 anterior. Se analizaron el ADN del eluido y del agua restante usada en la etapa de lavado de gota de agua mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se muestran en la Fig. 3. Se visualiza una banda intensa de ADNg para el producto en el eluido (carril a), mientras que el ADN no es detectable en el agua usada en la etapa de gota de agua (carril b). Los resultados demuestran que la pérdida de ADN en la etapa de lavado del método inventivo, aunque se lleva a cabo en condiciones de no unión, es insignificante.
Ejemplo 6: Rendimiento de ADN plasmídico
Se preparó ADN de células de E. coli que portaban el plásmido pCMVp de acuerdo con el protocolo estándar descrito en el ejemplo 2. En la etapa de lavado final (etapa de gota de agua), el tiempo de incubación fue de 10 segundos. Después de la incubación, las partículas se recogieron y se eluyeron como se describe en el ejemplo 2.
Se analizó el ADN del eluido y del agua usada en la etapa de lavado con gota de agua mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se muestran en la Fig. 4. Una intensa banda de ADN plasmídico es visible para el producto ("elución", carriles de la derecha). Una tenue banda de ADN también es visible en el agua usada en la etapa de la gota de agua ("gota de agua", carriles de la izquierda). Los resultados demuestran que se puede producir una pequeña pérdida de ADN plasmídico en la etapa de lavado del método inventivo (etapa de gota de agua). Estos hallazgos sugieren que el rendimiento del ADN depende de la longitud de los ácidos nucleicos, de modo que los ácidos nucleicos más cortos eluyen más fácilmente de las partículas magnéticas de sílice. Sin embargo, la pérdida absoluta de ADN aún sigue siendo baja para el ADN plasmídico y, por tanto, el método de la invención es aplicable para producir excelentes rendimientos de ADN plasmídico de alta pureza.
Ejemplo 7: Efecto del tiempo de incubación y la fuerza mecánica sobre el rendimiento de ADN
Se preparó ADN de células E. coli que portaban el plásmido pCMVp de acuerdo con el protocolo estándar descrito en el ejemplo 2. En la etapa de lavado final (etapa de gota de agua), el tiempo de incubación se varió de 0 a 24 horas. Durante ese período de tiempo, las partículas no se movieron ni agitaron, sino que se dejaron reposar en el fondo del tubo. Después de la incubación, las partículas se recogieron de nuevo y se eluyeron como se describe en el ejemplo 2.
El ADN del eluido y del agua usada en la etapa de lavado con gota de agua se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa. Los resultados se muestran en la Fig. 5. Las bandas de ADN plasmídico intensas son visibles para el ADN aislado ("B: Eluido"). Para el agua usada en la etapa de lavado, sólo fueron visibles bandas de ADN muy tenues después de 0 y 6 horas ("A: Agua de gota de agua"). La cantidad de ADN en el agua aumentó en 24 horas y alcanzó niveles significativos. En general, la elución del ADN aumentó durante el tiempo de incubación, aunque no se aplicó fuerza mecánica para eliminar los ácidos nucleicos de las partículas. Los resultados sugieren que la pérdida de ADN se puede reducir en el proceso inventivo reduciendo el tiempo de incubación.
Con el fin de determinar el efecto de la fuerza mecánica y el calentamiento moderado en la etapa de elución, se aplicó, es decir, una segunda etapa de elución adicional en la que las partículas magnéticas se suspendieron durante 3 minutos a 50 °C en un agitador a 1400 rpm. Tales condiciones representan condiciones de elución comunes que normalmente dan como resultado una elución cuantitativa. De este modo, se pudo verificar si y cuánto ADN había permanecido unido a las partículas magnéticas después del primer procedimiento de elución. La Fig. 5 demuestra que después del primer procedimiento de elución con condiciones de elución bastante moderadas todavía quedaba algo de ADN unido a las partículas magnéticas. Sin embargo, la aplicación adicional de fuerza mecánica y calentamiento moderado libera aún más el ADN de las partículas magnéticas ("C: Eluido después del segundo procedimiento de elución con fuerza mecánica y calentamiento moderado"). Los resultados sugieren que se deben evitar las fuerzas mecánicas fuertes y el calentamiento en la etapa de lavado inventiva con el fin de obtener un alto rendimiento. Después de la incubación durante un tiempo prolongado de hasta 24 horas, la cantidad de ADN en el eluido disminuyó, lo que indica que el ADN se debería haber liberado cuantitativamente.
Ejemplo 8 Comparación del lavado con agua y de gota de agua para ADN plasmídico
Se preparó en paralelo ADN de células E. coli que portaban por un lado el plásmido pCMVp (aproximadamente 7,2 kpb) y por otro lado el plásmido UC21 (aproximadamente 2,7 kpb) de acuerdo con los protocolos estándar descritos en los ejemplos 1 y 2. En la etapa de lavado final (etapa de gota de agua), el tiempo de incubación fue de 5 segundos. Después de la incubación, las partículas se recogieron y eluyeron como se describe en los ejemplos 1 y 2. Los resultados se muestran en la Figura 6.
Se sabe que los ácidos nucleicos cortos eluyen de las partículas magnéticas a un ritmo más rápido que los ácidos nucleicos largos. Se supone que esto se debe al menor número de puntos de contacto entre los ácidos nucleicos y las perlas. Por lo tanto, se podría haber esperado que para los plásmidos indicados, el método de gota de agua de la presente invención diera como resultado una enorme pérdida de ácido nucleico. Sin embargo, sorprendentemente los resultados de la Figura 6 muestran que, aunque las partículas magnéticas con el ADN plasmídico unido están suspendidas en la solución de lavado, la pérdida de ácido nucleico es muy baja y en un orden de magnitud similar a la observada en el caso del procedimiento de lavado corto y bastante superficial del estado de la técnica. De todos modos, al mismo tiempo se incrementa la pureza del ADN plasmídico obtenido con el procedimiento de lavado con gota de agua de acuerdo con la presente invención en comparación con el procedimiento de lavado del estado de la técnica ya que debido a la suspensión de las partículas se eliminan más contaminaciones. En consecuencia, el método inventivo da como resultado una pureza mejorada sin pérdida adicional de ácido nucleico que en el estado de la técnica.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para aislar ácido nucleico de una solución de muestra, en donde el ácido nucleico se separa de la solución de muestra por adsorción a partículas magnéticas, seguido de la separación de las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas de la solución de muestra mediante la aplicación de un campo magnético, seguido de al menos una etapa de lavado (w), que comprende
(w1) suspender las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas en una solución de lavado, que es una solución acuosa, que tiene una concentración total de sal por debajo de 100 mM y no comprende un disolvente orgánico,
(w2) incubar las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas en la solución de lavado, y (w3) separar las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido en ellas de la solución de lavado, en donde las partículas magnéticas se dejan caer en la solución de lavado en la etapa (w1) apagando, eliminando o reubicando el campo magnético.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico es ADN, ARN o ambos, ADN y ARN, preferiblemente ADN.
3. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de lavado tiene una concentración total de sal por debajo de 25 mM.
4. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de lavado consiste en agua y opcionalmente sales.
5. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa de lavado (w) se lleva a cabo durante 5 minutos o menos.
6. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde el ácido nucleico, preferiblemente ADN, tiene una longitud de cadena de al menos 10 kb o kpb respectivamente.
7. El método de al menos una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el ácido nucleico, preferiblemente ADN, tiene una longitud de cadena de menos de 10 kb o kpb respectivamente, en donde la etapa de lavado (w) se lleva a cabo durante 2 minutos o menos.
8. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, con una o más de las siguientes características que se aplican en la etapa de lavado (w):
- las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas no están sometidas a una fuerza mecánica las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas no están sometidas a una fuerza mecánica ejercida de forma oscilante y/u horizontal,
- las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se someten a una fuerza mecánica ejercida verticalmente, preferiblemente a la gravedad,
- las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se someten a una fuerza magnética, preferiblemente ejercida verticalmente,
- las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se suspenden en la solución de lavado sin aplicar una fuerza mecánica
- las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se suspenden en la solución de lavado sin aplicar una fuerza mecánica ejercida de forma oscilante y/u horizontal
- las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se suspenden en la solución de lavado aplicando una fuerza mecánica ejercida verticalmente, preferiblemente la gravedad,
- las partículas magnéticas con el ácido nucleico unido a las mismas se suspenden en la solución de lavado aplicando una fuerza magnética, preferiblemente ejercida verticalmente.
9. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde, antes de la etapa de lavado (w), las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas se lavan en al menos una etapa de lavado previo (p) con una solución de lavado, que es una solución acuosa que tiene una concentración total de sal superior a 500 mM y/o comprende un disolvente orgánico.
10. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde, después de la etapa de lavado (w), el ácido nucleico se eluye de las partículas magnéticas con una solución de elución.
11. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde las partículas magnéticas comprenden sílice.
12. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de muestra comprende una sal caotrópica y/o un alcohol.
13. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, que comprende las etapas de
(a) añadir partículas magnéticas a una solución de muestra que comprende el ácido nucleico,
(b) incubar la solución de muestra de la etapa (a) para permitir la adsorción del ácido nucleico a las partículas magnéticas,
(c) aplicar un campo magnético a la solución de muestra de la etapa (b) para fijar las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido a las mismas,
(d) retirar la solución de muestra,
(e) lavar las partículas magnéticas con una solución de lavado en una etapa de lavado (w) de la reivindicación 1, y (f) eluir opcionalmente el ácido nucleico de dichas partículas magnéticas con una solución de elución.
14. El método de al menos una de las reivindicaciones anteriores, en donde el método es un proceso automatizado.
15. Uso de una solución acuosa, que tiene una concentración total de sal por debajo de 100 mM y no comprende un disolvente orgánico, como una solución de lavado para lavar partículas magnéticas con ácido nucleico adsorbido a las mismas en un método para aislar el ácido nucleico de una solución de muestra, en donde las partículas magnéticas con el ácido nucleico adsorbido en las mismas se suspenden en la solución de lavado, en donde las partículas magnéticas se dejan caer en la solución de lavado apagando, eliminando o reubicando el campo magnético.
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