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ES2902548T3 - Agentes de unión a esclerostina - Google Patents

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ES2902548T3
ES2902548T3 ES19211623T ES19211623T ES2902548T3 ES 2902548 T3 ES2902548 T3 ES 2902548T3 ES 19211623 T ES19211623 T ES 19211623T ES 19211623 T ES19211623 T ES 19211623T ES 2902548 T3 ES2902548 T3 ES 2902548T3
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seq
antibody
cdr
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sclerostin
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ES19211623T
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English (en)
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Christopher Paszty
Martyn Kim Robinson
Kevin Graham
Alistair James Henry
Kelly Sue Hoffman
John Latham
Alastair Lawson
Hsieng Sen Lu
Andy Popplewell
Wenyan Shen
David Winkler
Aaron George Winters
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Amgen Inc
Original Assignee
UCB Pharma SA
Amgen Inc
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Abstract

Un anticuerpo monoclonal que se une a esclerostina humana; aumenta al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero; y se une a una parte de la esclerostina humana que consiste en los aminoácidos 51-64, 73-90, 101-117 y 138-149 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha parte tiene las tres de: (a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111; (b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y (c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144.

Description

DESCRIPCIÓN
Agentes de unión a esclerostina
Campo técnico
La presente invención se refiere en general a epítopos de la proteína esclerostina humana, y a agentes de unión (tales como anticuerpos) capaces de unirse a esclerostina o a fragmentos de la misma.
Antecedentes de la invención
Durante la vida de un individuo suceden dos o tres fases de cambios distintas en la masa ósea (véase Riggs, West J. Med. 154: 63-77 (1991)). La primera fase se produce tanto en hombres como en mujeres y continúa hasta la consecución de una masa de hueso máxima. Esta primera fase se consigue mediante crecimiento lineal de las placas de crecimiento endocondriales y crecimiento radial debido a una tasa de aposición perióstea. La segunda fase comienza aproximadamente a los 30 años para el hueso trabecular (huesos planos tales como las vértebras y la pelvis) y aproximadamente a los 40 años para hueso cortical (por ejemplo, huesos largos hallados en las extremidades) y continúa hasta la vejez. Esta fase se caracteriza por pérdida de hueso lenta y se produce tanto en hombres como en mujeres. En mujeres, también se produce una tercera fase de pérdida de hueso, más probablemente debido a deficiencias de estrógenos posmenopáusicas. Durante esta fase solamente, las mujeres pueden perder una masa de hueso adicional del hueso cortical y del compartimento trabecular (véase, Riggs, mencionado anteriormente).
La pérdida de contenido mineral óseo puede estar provocada por una amplia diversidad de afecciones y puede dar como resultado problemas médicos significativos. Por ejemplo, la osteoporosis es una enfermedad debilitante en seres humanos y está caracterizada por reducciones notables de la masa ósea esquelética y densidad mineral, deterioro estructural del hueso, incluyendo degradación de la microarquitectura del hueso y aumentos correspondientes de la fragilidad ósea (es decir, reducciones de la fuerza ósea), y susceptibilidad a fractura en individuos aquejados. La osteoporosis en seres humanos está generalmente precedida de osteopenia clínica (densidad mineral ósea que es mayor de una desviación típica pero menor de 2,5 desviaciones típicas por debajo del valor medio para hueso adulto joven), una afección hallada en aproximadamente 25 millones de personas en los Estados Unidos. Se ha diagnosticado a otros 7-8 millones de pacientes en Estados Unidos con osteoporosis clínica (definida como contenido mineral óseo mayor de 2,5 desviaciones típicas por debajo de la del hueso de adulto joven maduro). La frecuencia de osteoporosis en la población humana aumenta con la edad. Entre los caucásicos, la osteoporosis es predominante en mujeres quienes, en los Estados Unidos, comprenden el 80 % del grupo de pacientes con osteoporosis. La fragilidad aumentada y susceptibilidad a fractura del hueso esquelético en los ancianos está agravada por el mayor riesgo de caídas accidentales en esta población. Las fracturas de caderas, muñecas y vértebras están entre las lesiones más habituales asociadas con la osteoporosis. Las fracturas de cadera en particular son extremadamente incómodas y caras para el paciente, y para las mujeres se correlacionan con altas tasas de mortalidad y morbilidad.
Aunque la osteoporosis se ha considerado como un aumento en el riesgo de fractura debido a la reducción de la masa ósea, pocos de los tratamientos actualmente disponibles para trastornos esqueléticos pueden aumentar la densidad ósea de los adultos, y la mayoría de los tratamientos disponibles en la actualidad actúa principalmente inhibiendo adicionalmente la resorción del hueso en lugar de estimular nueva formación de hueso. El estrógeno se está prescribiendo ahora para retardar la pérdida de hueso. Sin embargo, existe cierta controversia sobre si los pacientes obtienen algún beneficio a largo plazo y si el estrógeno tiene algún efecto en pacientes de más 75 años de edad. Además, se cree que el uso de estrógenos aumenta el riesgo de cáncer de mama y endometrio. También se ha sugerido calcitonina, osteocalcina con vitamina K o altas dosis de calcio dietético, con o sin vitamina D, para mujeres posmenopáusicas. Las altas dosis de calcio, sin embargo, tienen con frecuencia efectos secundarios gastrointestinales no deseados, y los niveles de calcio en suero y orina deben supervisarse continuamente (por ejemplo, Khosla y Riggs, Mayo Clin. Proc. 70: 978982, 1995).
Otros enfoques terapéuticos actuales para la osteoporosis incluyen bifosfonatos (por ejemplo, Fosamax™, Actonel™, Bonviva™, Zometa™, olpadronato, neridronato, skelid, bonefos), hormona paratiroidea, calcilíticos, calcimiméticos (por ejemplo, cinacalcet), estatinas, esteroides anabólicos, sales de lantano y estroncio y fluoruro sódico. Dichos compuestos terapéuticos, sin embargo, se asocian con frecuencia con efectos secundarios indeseables (véase Khosla y Riggs, mencionado anteriormente).
La esclerostina, el producto del gen SOST, está ausente en esclerosteosis, una enfermedad esquelética caracterizada por sobrecrecimiento del hueso y huesos densos fuertes (Brunkow et al., Am. J. Hum. Genet., 68: 577­ 589, 2001; Balemans et al., Hum. Mol. Genet., 10: 537-543, 2001). La secuencia de aminoácidos de la esclerostina humana se ha presentado en Brunkow et al. en la referencia anterior y se divulga en el presente documento como SEQ ID NO: 1.
El documento WO 2005/014650 describe anticuerpos específicos para esclerostina y métodos para aumentar la mineralización del hueso y el documento WO 2005/003158 describe composiciones y métodos para aumentar la mineralización del hueso.
Breve sumario de la invención
Se divulgan en el presente documento composiciones y métodos que pueden usarse para aumentar al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea, y que puede por lo tanto usarse para tratar una amplia diversidad de afecciones en las que sea deseable un aumento de al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea. La presente invención también ofrece otras ventajas relacionadas descritas en el presente documento. La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.
La divulgación se refiere a regiones (epítopos) de esclerostina humana reconocidas por los agentes de unión divulgados en el presente documento, métodos de uso de estos epítopos y métodos de preparación de dichos epítopos.
La divulgación también se refiere a epítopos específicos de la región de esclerostina identificada como Bucle 2, y agentes de unión que se unen específicamente a esa región.
La divulgación también se refiere a epítopos específicos de la región de nudo de cisteína de esclerostina, y agentes de unión tales como anticuerpos que se unen específicamente con esa región.
La divulgación se refiere a agentes de unión, tales como anticuerpos, que se unen específicamente a esclerostina. Los agentes de unión pueden caracterizarse por su capacidad para bloquear de forma cruzada la unión de al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina y/o para bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento. Los anticuerpos y otros agentes de unión también pueden caracterizarse por su patrón de unión con péptidos de esclerostina humana en un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídico de esclerostina humana” como se divulga en el presente documento.
La divulgación se refiere a agentes de unión, tales como anticuerpos, que pueden aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.
La divulgación se refiere a agentes de unión, tales como anticuerpos que pueden bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
La divulgación se refiere además a construcciones polipeptídicas que comprenden dos, tres o cuatro fragmentos polipeptídicos unidos por al menos un enlace disulfuro, que representa una región central del nudo de cisteína de esclerostina, y anticuerpos capaces de unirse específicamente con los mismos.
La divulgación se refiere a métodos para obtener epítopos adecuados para su uso como inmunógenos para generar, en mamíferos, agentes de unión, tales como anticuerpos capaces de unirse específicamente a esclerostina; en ciertos aspectos los agentes de unión generados son capaces de neutralizar la actividad de esclerostina in vivo. La divulgación se refiere a una composición para inducir un anticuerpo específico para esclerostina cuando la composición se administra a un animal, comprendiendo la composición un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68 o SEQ ID NO: 69.
La divulgación también se refiere a una composición para inducir un anticuerpo específico para esclerostina cuando la composición se administra a un animal, comprendiendo la composición al menos un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5; la composición puede comprender al menos dos o al menos tres de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5, y la composición puede comprender las cuatro secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
La divulgación también se refiere a una composición para inducir un anticuerpo específico para esclerostina cuando la composición se administra a un animal, comprendiendo la composición un polipéptido que tiene las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5; en donde SEQ ID NO: 2 y 4 se unen por un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 57 y 111 con referencia a SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 y 5 se unen por al menos uno de (a) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 82 y 142 con referencia a SEQ ID NO: 1, y (b) un enlace disulfuro en las posiciones de aminoácidos 86 y 144 con referencia a SEQ ID NO: 1; el polipéptido puede conservar la estructura terciaria de la región polipeptídica correspondiente de esclerostina humana de SEQ ID NO: 1.
La divulgación también se refiere al polipéptido T20.6 que consiste esencialmente en una proteína de esclerostina humana múltiplemente truncada de SEQ ID NO: 1, en donde los aminoácidos 1-50, 65-72, 91-100, 118-137 y 150­ 190 de SEQ ID NO: 1 están ausentes del polipéptido: este polipéptido puede obtenerse por digestión tríptica de esclerostina humana y la proteína puede aislarse por fraccionamiento de HPLC.
La divulgación se refiere además a la parte inmunogénica T20.6 de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 51-64, 73-90, 101-117 y 138-149 de SEQ ID NO: 1, en donde la parte inmunogénica comprende al menos uno de:
(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;
(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y
(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144;
la parte inmunogénica puede tener al menos dos de estos enlaces disulfuros; y la parte inmunogénica puede tener los tres enlaces disulfuros.
La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica T20.6 de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 57-64, 73-86, 111-117 y 138-144 de SEQ ID NO: 1, en donde la parte inmunogénica comprende al menos uno de:
(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;
(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y
(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144;
la parte inmunogénica puede tener al menos dos de estos enlaces disulfuros; y la parte inmunogénica puede tener los tres enlaces disulfuros.
La divulgación se refiere además a un polipéptido que consiste esencialmente en una proteína de esclerostina humana de SEQ ID NO: 1 truncada en los extremos C terminal y N terminal, en donde los aminoácidos 1-85 y 112­ 190 de SEQ ID NO: 1 están ausentes del polipéptido.
La divulgación también se refiere a una parte inmunogénica de esclerostina humana que comprende los aminoácidos 86-111 de SEQ ID NO: 1; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos CGPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO: 6).
La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica de esclerostina de rata, que comprende los aminoácidos 92-109 de SEQ ID NO: 98; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96).
La divulgación se refiere además a una parte inmunogénica de esclerostina de rata, que comprende los aminoácidos 99-120 de SEQ ID NO: 98; la parte inmunogénica puede consistir esencialmente en los aminoácidos contiguos KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).
La divulgación se refiere a un método para producir una parte inmunogénica de esclerostina humana, que comprende las etapas de:
(a) tratar la esclerostina humana para conseguir digestión tríptica completa:
(b) recoger la muestra de digestión tríptica que tiene un peso molecular promedio de 7122,0 Dalton (masa teórica 7121,5 Dalton) o tiempo de retención de aproximadamente 20,6 minutos como se determinó por elución de una columna de HPLC de fase inversa con gradiente lineal de ácido trifluoroacético 0,05 % a acetonitrilo 90 % en TFA 0,05 % a un caudal de 0,2 ml/min; y
(c) purificar la parte inmunogénica.
La divulgación se refiere a un método para generar un anticuerpo capaz de unirse específicamente con esclerostina, que comprende:
(a) inmunizar a un animal con una composición que comprende un polipéptido de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 97;
(b) recoger sueros del animal; y
(c) aislar de los sueros un anticuerpo capaz de unirse específicamente con esclerostina.
La divulgación también se refiere a un método para generar un anticuerpo capaz de unirse específicamente con esclerostina, que comprende:
(a) inmunizar a un animal con una composición que comprende el polipéptido T20.6 o un derivado de T20.6; (b) recoger sueros del animal; y
(c) aislar de los sueros un anticuerpo capaz de unirse específicamente con esclerostina.
La divulgación se refiere además a un método para detectar un anticuerpo anti esclerostina en una muestra biológica, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto la muestra biológica con un polipéptido que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 96 o SEQ ID NO: 97 en condiciones que permiten que se forme un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido; y
(b) detectar la presencia o ausencia del complejo,
en donde la presencia del complejo indica que la muestra biológica contiene un anticuerpo anti esclerostina.
La divulgación también se refiere a un método para detectar un anticuerpo anti esclerostina en una muestra biológica, que comprende las etapas de:
(a) poner en contacto la muestra biológica con el polipéptido T20.6 o un derivado de T20.6 en condiciones que permiten que se forme un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido; y
(b) detectar la presencia o ausencia del complejo,
en donde la presencia del complejo indica que la muestra biológica contiene un anticuerpo anti esclerostina.
La divulgación se refiere además a un agente de unión a esclerostina, tal como un anticuerpo, que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D a una proteína de esclerostina. También puede bloquearse de forma cruzada la unión con esclerostina del agente de unión a esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o similares.
La divulgación se refiere además a un agente de unión a esclerostina, tal como un anticuerpo, cuya unión con esclerostina se bloquea de forma cruzada por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D. El anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o similares.
La divulgación se refiere además a un agente de unión a esclerostina, tal como un anticuerpo aislado que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24) con una proteína de esclerostina. El agente de unión a esclerostina también puede bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24). El anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.
La divulgación también se refiere a un agente de unión a esclerostina, tal como un anticuerpo aislado que está bloqueado de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos 1-24 (Ab-1 a Ab-24); el anticuerpo aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.
La divulgación se refiere además a un agente de unión, tal como un anticuerpo aislado que muestra un patrón de unión similar con péptidos de esclerostina humana en un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” al que se muestra por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C o Ab-D; el anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, o un anticuerpo quimérico.
La divulgación se refiere además adicionalmente a un método para el tratamiento de un trastorno óseo asociado con al menos uno de baja formación de hueso, baja densidad mineral ósea, bajo contenido mineral óseo, baja masa ósea, baja calidad ósea y baja fuerza ósea en un sujeto mamífero que comprende proporcionar a un sujeto que necesite dicho tratamiento una cantidad de un agente de unión antiesclerostina suficiente para aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en donde el agente de unión antiesclerostina comprende un anticuerpo o fragmento de unión a esclerostina del mismo.
La divulgación también se refiere a un polipéptido de esclerostina aislado o fragmentos del mismo, en donde el polipéptido contiene 6 restos de cisteína conservados y los fragmentos del mismo comprenden de 7 a 14 aminoácidos de SEQ ID NO: 2; 8 a 17 aminoácidos de sEq ID NO: 3; 8 a 18 restos de SeQ ID NO: 4; y 6 a 12 restos de SEQ ID NO: 5, y el polipéptido o fragmentos del mismo se estabilizan por enlaces disulfuro entre SEQ ID NO: 2 y 4, y entre SEQ ID NO: 3 y 5; el polipéptido o fragmentos pueden comprender 10-14 aminoácidos de SEQ ID NO: 2: 14 a 17 aminoácidos de SEQ ID NO: 3; 13 a 18 aminoácidos de SEQ ID NO: 4: y 8 a 12 restos de SEQ ID NO: 5; y el polipéptido o fragmentos pueden comprender SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
Se proporcionan en el presente documento anticuerpos que se unen específicamente a esclerostina humana. Los anticuerpos se caracterizan por su capacidad de bloquear de forma cruzada la unión de al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina humana y/o de bloquearse de forma cruzada de la unión con esclerostina humana por al menos un anticuerpo divulgado en el presente documento.
También se proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que puede aumentar al menos uno de formación del hueso, densidad mineral ósea, contenido de mineral del hueso, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero.
También se proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células.
También se proporciona un agente de unión, tal como un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina humana y tiene al menos una secuencia de CDR seleccionada de SEQ iD NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 y 360, y variantes de las mismas, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo neutraliza la esclerostina.
También se proporciona un agente de unión, tal como un anticuerpo, que se une específicamente a esclerostina humana y tiene al menos una secuencia de CDR seleccionada de sEq iD NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 78, 79, 80, 81, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 351, 352, 353, 358, 359 y 360 y variantes de las mismas.
También se proporcionan regiones de esclerostina humana que son importantes para la actividad in vivo de la proteína.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 1A) (SEQ ID NO: 23) y cadena pesada (Figura 1B) (SEQ ID NO: 27) para el anticuerpo Ab­ A antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.
La Figura 2 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 2A) (SEQ ID NO: 31) y cadena pesada (Figura 2B) (SEQ ID NO: 35) para el anticuerpo Ab-B antiesclerostina.
La Figura 3 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 3A) (SEQ ID NO: 15) y la cadena pesada (Figura 3B) (sEq ID NO: 19) para el anticuerpo Ab-C antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.
La Figura 4 representa las secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptidos señal escindidos) de la cadena ligera (Figura 4A) (SEQ ID NO: 7) y la cadena pesada (Figura 4B) (sEq ID NO: 11) para el anticuerpo Ab-D antiesclerostina humana y antiesclerostina de ratón.
La Figura 5 representa la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 3 semanas de tratamiento con vehículo, PTH (1-34), Ab-A o Ab-B.
La Figura 6 muestra la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 2 semanas de tratamiento con vehículo, PTH (1-34) o Ab-C.
La Figura 7 representa la densidad mineral ósea en ratones medida en dos sitios esqueléticos (vértebras lumbares y metáfisis tibial) después de 3 semanas de tratamiento con vehículo o Ab-D.
La Figura 8 representa la secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal escindido) de esclerostina humana (SEQ ID NO: 1). También se representa la secuencia de nucleótidos de la región codificante de esclerostina humana que codifica la forma madura de esclerostina humana. Las ocho cistinas están numeradas C1 a C8. El nudo de cistina está formado por tres enlaces disulfuro (C1-C5; C3-C7; C4-C8). C2 y C6 también forman un enlace disulfuro, sin embargo, este disulfuro no es parte del nudo de cistina.
La Figura 9 representa un esquema de la estructura básica de la esclerostina humana. Hay una rama N-terminal (del primer Q a C1) y una rama C-terminal (de C8 al Y terminal). Entre estas ramas está la estructura de nudo de cistina (formada por tres disulfuros: C1-C5; C3-C7; C4-C8) y tres bucles que están designados Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. Las regiones distales del Bucle 1 y Bucle 3 están unidas por el disulfuro C2-C6. Se indican sitios de escisión de tripsina potenciales (arginina=R y lisina=K). Algunos de los sitios de escisión de AspN potenciales están indicados (solamente se muestran restos de ácido aspártico (D)).
La Figura 10 representa los mapas peptídicos de HPLC de esclerostina humana después de digestión con tripsina o AspN. Los péptidos de esclerostina humana generados por digestión con tripsina están indicados (T19,2, T20, T20,6 y T21-22) como lo están los péptidos de esclerostina humana generados por digestión con AspN (AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5).
La Figura 11 representa información de secuencia y masa para los péptidos con enlaces disulfuro de esclerostina humana aislados generados por digestión con tripsina. Pos. sec. = posición de secuencia. Obs. = observado. La masa observada se determinó por análisis de ESI-LC-MS.
La Figura 12 representa la información de secuencia y masa para los péptidos de esclerostina humana aislados generados por digestión con AspN. El péptido AspN22,7-23,5 contiene los 4 enlaces disulfuro. Pos. sec. = posición de secuencia. Obs. = observado. La masa observada se determinó mediante análisis de ESI-LC-MS. La Figura 13 representa un esquema lineal de cuatro péptidos de esclerostina humana (T19,2, T20, T20,6 y T21-22) generados por digestión con tripsina.
La Figura 14 muestra un esquema lineal de cinco péptidos de esclerostina humana (AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5) generados por digestión con AspN. El pico de HPLC de AspN14,6 está compuesto de tres péptidos no unidos por ningún enlace disulfuro.
La Figura 15 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a la unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-A. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 16 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-B. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 17 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-C. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 18 muestra la señal en unidades de resonancia (UR) del “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Se evaluó la unión de Mab relativa con diversos péptidos de esclerostina humana (en solución) frente a unión de Mab con esclerostina humana de forma madura intacta (inmovilizada en microplaca de Biacore). Los datos mostrados son para Ab-D. Los péptidos de esclerostina humana fueron T19,2, T20, T20,6, T21-22, AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5.
La Figura 19 muestra dos epítopos de unión a Mab de esclerostina humana. La Figura 19A muestra la secuencia del epítopo del Bucle 2 para unión de Ab-A y Ab-B con esclerostina humana (SEQ ID NO: 6). La Figura 19B muestra la secuencia, enlaces disulfuro y esquema del epítopo T20,6 para unión de Ab-C y Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 2-5).
La Figura 20 representa los mapas peptídicos de HPLC de esclerostina humana después de digestión con tripsina. La Figura 20A muestra la digestión del complejo de Ab-D de esclerostina humana. La Figura 20B muestra la digestión de la esclerostina humana sola. Se indican los picos de los péptidos T19,2, T20, T20,6 y T21-22.
La Figura 21 muestra la secuencia, enlace disulfuro y esquema del epítopo “derivado de T20,61 (nudo de cistina 4 ramas)” para unión de Ab-D con esclerostina humana (SEQ ID NO: 70-73).
La Figura 22 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) de ratón se usó a 1 |ig/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 y 5 |ig/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.
La Figura 23 representa resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina humana (Scl) se usó a 1 |ig/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 8 y 4 |ig/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.
La Figura 24 muestra resultados del ensayo de mineralización de la línea celular de osteoblastos MC3T3-E1-BF usado para identificar Mab neutralizantes anti-esclerostina. La esclerostina (Scl) humana se usó a 1 |ig/ml. Se usaron anticuerpos monoclonales a 10 |ig/ml. Se cuantificó el alcance de la mineralización (diversos tipos de fosfato cálcico insoluble) midiendo el calcio.
La Figura 25 representa resultados de un modelo de ratón SCID de pérdida de hueso inducida por inflamación. El tratamiento con Ab-A protegió a los ratones de pérdida de hueso relacionada con inflamación asociada con colitis cuando se midió como densidad mineral ósea total (Figura 25A), densidad de hueso vertebral (Figura 25B) y densidad de hueso fémur (Figura 25C).
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere a regiones de la proteína esclerostina humana que contienen epítopos reconocidos por anticuerpos que también se unen a esclerostina de longitud completa, y métodos para preparar y usar estos epítopos. La divulgación también proporciona agentes de unión (tales como anticuerpos) que se unen específicamente a esclerostina o parte de esclerostina, y métodos para la utilización de dichos agentes de unión. Los agentes de unión son útiles para bloquear o afectar a la unión de esclerostina humana con uno o más ligandos.
La esclerostina humana recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n.° 1406-ST-025). Adicionalmente, la esclerostina de ratón recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n.° 1589-ST-025). Anticuerpos monoclonales de unión a esclerostina de uso en investigación están disponibles en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; monoclonal de ratón 2006 cat. n.° MAB1406; monoclonal de rata: 2006 cat. n.° MAB1589). Las Patentes de Estados Unidos N.° 6.395.511 y 6.803.453 y Publicaciones de Patente de Estados Unidos 20040009535 y 20050106683 se refieren a anticuerpos anti-esclerostina en general.
Como se usa en el presente documento, se pretende que la expresión esclerostina humana incluya la proteína de SEQ ID NO: 1 y variantes alélicas de la misma. La esclerostina puede purificarse a partir de células hospedadoras 293T que se hayan transfectado por un gen codificante de esclerostina mediante elución de sobrenadante filtrado de fluido de cultivo de células hospedadoras usando una columna de Heparina HP, usando un gradiente salino. La preparación y purificación adicional usando cromatografía de intercambio catiónico se describen en los Ejemplos 1 y 2.
Los agentes de unión son preferentemente anticuerpos, como se define en el presente documento. El término “anticuerpo” se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de unión del mismo. Un anticuerpo puede comprender una molécula de anticuerpo completa (incluyendo versiones policlonal, monoclonal, quimérica, humanizada o humana que tienen cadenas de longitud completa pesadas y/o ligeras) o comprende un fragmento de unión a antígeno del mismo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fc y Fd, y pueden incorporarse en anticuerpos de dominio sencillo, anticuerpos de cadena sencilla, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (Véase, por ejemplo, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechonology, 23, 9, 1126-1136). También se divulgan polipéptidos de anticuerpo en la Patente de Estados Unidos N.° 6.703.199, incluyendo monocuerpos de polipéptidos de fibronectina. Otros polipéptidos de anticuerpos se divulgan en la Publicación de Patente de Estados Unidos 2005/0238646, que son polipéptidos de cadena sencilla.
Pueden obtenerse fragmentos de unión a antígeno derivados de un anticuerpo, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión con pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo con métodos convencionales. Como ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden producirse por escisión enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denominado F(ab')2. Este fragmento puede escindirse adicionalmente usando un agente reductor de tiol para producir fragmentos monovalentes Fab' 3,5S. Opcionalmente, la reacción de escisión puede realizarse usando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de escisión de enlaces disulfuro. Como alternativa, una escisión enzimática usando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fc directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Goldenberg, Patente de Estados Unidos N.° 4.331.647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89; 230, 1960; Porter, Biochem. J. 73; 119, 1959 Edelman et al., en Methods in Enzymology 1; 422 (Academic Press 1967); y en Andrews, S.M. y Titus, J.A. en Current Protocols in Immunology (Coligan J.E., et al., eds), John Wiley & Sons, Nueva York (2003), páginas 2.8.1-2.8.10 y 2.10A. 1-2.10A.5. También pueden usarse otros métodos para escindir anticuerpos, tales como separar cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes (Fd), escindir además fragmentos, u otras técnicas enzimáticas, químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se unan al antígeno que reconoce el anticuerpo intacto.
Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína modificada por ingeniería genética o sintética. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten en la región variable de cadena ligera, los fragmentos “Fv” que consisten en las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, moléculas polipeptídicas de cadena sencilla recombinantes en las que las regiones variables ligera y pesada están conectadas por un enlazador peptídico (proteínas scFv).
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Pueden obtenerse CDR (también denominadas “unidades de reconocimiento mínimas” o “región hipervariable”) construyendo polinucleótidos que codifiquen la CDR de interés. Dichos polinucleótidos se preparan, por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa para sintetizar la región variable usando ARNm de células productoras de anticuerpo como un molde (véase, por ejemplo, Larrick et al., Methods; A Companion to Methods in Enzymology 2; 106, 1991; Courtenay-Luck “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,” en Monoclonal Antibodies; Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); y Ward et al., “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies,” en Monoclonal Antibodies; Principles and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc.
1995)).
Por lo tanto, el agente de unión puede comprender al menos una CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR como se describe en el presente documento. El agente de unión puede comprender además al menos un dominio de región variable de un anticuerpo descrito en el presente documento. El dominio de región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y comprenderá en general al menos una secuencia de CDR responsable de la unión con esclerostina humana, por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 y/o las CDR de cadena ligera específicamente descritas en el presente documento y que está adyacente a o en fase con una o más secuencias marco conservadas. En términos generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier disposición adecuada de dominios variables de cadena pesada (Vh) y/o cadena ligera (Vl). Por lo tanto, por ejemplo, el dominio de región V puede ser monomérico y ser un dominio Vh y Vl, que es capaz de unirse independientemente con esclerostina humana con una afinidad al menos igual a 1 x 10-7 M o menos como se describe posteriormente. Como alternativa, el dominio de región V puede ser dimérico y contiene dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl, dímeros. El dímero de región V comprende al menos una cadena Vh y al menos una Vl que pueden no estar asociadas covalentemente (denominado en lo sucesivo en el presente documento Fv). Si se desea, las cadenas pueden estar acopladas covalentemente bien directamente, por ejemplo, mediante un enlace disulfuro entre los dos dominios variables, o a través de un enlazador, por ejemplo, un péptido enlazador para formar un Fv de cadena sencilla (scFv).
El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable de origen natural o una versión modificada por ingeniería genética del mismo. Por versión modificada por ingeniería genética se entiende un dominio de región variable que se ha creado usando técnicas de ingeniería de ADN recombinante. Dichas versiones modificadas por ingeniería genética incluyen las creadas, por ejemplo, a partir de una región variable de anticuerpo específico por inserciones, deleciones o cambios en o a las secuencias de aminoácidos del anticuerpo específico. Los ejemplos particulares incluyen dominios de región variable modificados por ingeniería genética que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos marco de un primer anticuerpo y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo.
El dominio de región variable puede estar unido covalentemente en un aminoácido C-terminal con al menos otro dominio de anticuerpo o un fragmento del mismo. Por lo tanto, por ejemplo, un dominio VH que está presente en el dominio de región variable puede estar unido a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. De forma similar un dominio Vl puede estar unido a un dominio Ck o un fragmento del mismo. De este modo, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab en donde el dominio de unión a antígeno contiene dominios Vh y Vl asociados unidos covalentemente en sus extremos C con un dominio CH1 y Ck, respectivamente. El dominio CH1 puede extenderse con aminoácidos adicionales, por ejemplo, para proporcionar una región bisagra o una parte de un dominio de región bisagra como se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tales como dominios CH2 y CH3 de anticuerpo.
Como se describe en el presente documento, los agentes de unión comprenden al menos una de estas CDR. Por ejemplo, una o más CDR pueden incorporarse en regiones marco conservadas de anticuerpos conocidas (IgG1, IgG2, etc.) o conjugarse con un vehículo adecuado para potenciar la semivida del mismo. Los vehículos adecuados incluyen, pero sin limitación, Fc, polietilenglicol (PEG), albúmina, transferrina y similares. Estos y otros vehículos adecuados se conocen en la técnica. Dichos péptidos de CDR conjugados pueden estar en forma monomérica, dimérica, tetramérica u otra. Uno o más polímeros solubles en agua están enlazados en una o más posiciones específicas, por ejemplo, en el extremo amino, de un agente de unión.
Un agente de unión puede comprender una o más uniones de polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitación, polietilenglicol, polioxietilenglicol o polipropilenglicol. Véase, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N.° 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 y 4.179.337. Un agente de unión derivado puede comprender uno o más de monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y alcohol polivinílico, así como mezclas de dichos polímeros. Uno o más polímeros solubles en agua pueden estar unidos aleatoriamente a una o más cadenas laterales. El PEG puede actuar para mejorar la capacidad terapéutica para un agente de unión, tal como un anticuerpo. Algunos de dichos procedimientos se analizan, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 6.133.426.
Se apreciará que un agente de unión puede tener al menos una sustitución de aminoácidos, siempre que el agente de unión conserve especificidad de unión. Por lo tanto, están abarcadas dentro del alcance de la divulgación modificaciones de las estructuras de agentes de unión. Estas pueden incluir sustituciones de aminoácidos, que pueden ser conservativas o no conservativas, que no destruyen la capacidad de unión esclerostina de un agente de unión. Las sustituciones de aminoácidos conservativas pueden abarcar restos de aminoácidos de origen no natural, que se incorporan típicamente por síntesis peptídica química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Estos incluyen peptidomiméticos y otras formas invertidas o revertidas de restos de aminoácidos. Una sustitución de aminoácidos conservativa también puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo con un resto normativo de modo que haya poco o ningún efecto en la polaridad o carga del resto de aminoácido en esa posición.
Las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase de aminoácidos o miméticos de aminoácidos por un miembro de otra clase con diferentes propiedades físicas (por ejemplo, tamaño, polaridad, hidrofobicidad, carga). Dichos restos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano que son homólogas de anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.
Además, un experto en la materia puede generar variantes de ensayo que contengan una sustitución de aminoácidos sencilla en cada resto de aminoácido deseado. Las variantes pueden después explorarse usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la materia. Dichas variantes podrían usarse para recopilar información acerca de variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubriera que un cambio en un resto de aminoácido particular diera como resultado actividad destruida, reducida de forma indeseable o inadecuada, podrían evitarse variantes con dicho cambio. En otras palabras, basándose en información recopilada de dichos experimentos rutinarios, un experto en la materia puede determinar fácilmente los aminoácidos donde deberían evitarse sustituciones adicionales solas o en combinación con otras mutaciones.
Un experto en la materia será capaz de determinar variantes adecuadas del polipéptido como se expone en el presente documento usando técnicas bien conocidas. Un experto en la materia puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden cambiarse sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se cree que sean importantes para la actividad. Se pueden identificar restos y partes de las moléculas que están conservados entre polipéptidos similares. Incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura pueden someterse a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar de forma adversa a la estructura polipeptídica.
Adicionalmente, un experto en la materia puede revisar estudios de función estructural que identifican restos en polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. A la vista de dicha comparación, se puede predecir la importancia de los restos de aminoácidos en una proteína que corresponden a restos de aminoácidos que son importantes para la actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la materia puede optar por sustituciones de aminoácidos químicamente similares para dichos restos de aminoácidos importantes predichos.
Un experto en la materia puede analizar también la estructura tridimensional y secuencia de aminoácidos en relación con esa estructura en polipéptidos similares. A la vista de dicha información, un experto en la materia puede predecir el alineamiento de restos de aminoácidos de un anticuerpo con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la materia puede elegir no hacer cambios radicales a los aminoácidos que se ha predicho que están en la superficie de la proteína, puesto que dichos restos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moléculas.
Se han dedicado varias publicaciones científicas a la predicción de la estructura secundaria. Véase Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4); 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2); 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry 113(2); 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47; 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47; 251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26; 367-384 (1979). Además, están disponibles en la actualidad programas informáticos para ayudar a la predicción de la estructura secundaria. Un método para predecir la estructura secundaria se basa en la realización de modelos de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tengan una identidad de secuencia mayor del 30 % o similitud mayor del 40 % tienen con frecuencia topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural proteica (PDB) ha proporcionado predictabilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el número potencial de plegamientos dentro de la estructura de un polipéptido o una proteína. Véase Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1); 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3); 369-376 (1997)) que hay un número limitado de pliegues en un polipéptido o proteína dado y que una vez que se ha resuelto un número de estructuras crítico, la predicción estructural se hará drásticamente más precisa.
Los métodos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen “reconocimiento de pliegues” (Jones, D., Curr., Opin. Struct. Biol., 7(3); 377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1); 15-19 (1996)), “análisis de perfil” (Bowie et al., Science, 253; 164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183; 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13); 4355-4358 (1987)) y “enlace evolutivo” (Véase Holm, mencionado anteriormente (1999) y Brenner, mencionado anteriormente (1997)).
Las variantes de agentes de unión incluyen variantes de glicosilación donde el número y/o tipo de sitio de glicosilación se ha alterado en comparación con las secuencias de aminoácidos de un polipéptido parental. Las variantes pueden comprender un número mayor o menor de sitios de glicosilación ligados a N que la proteína nativa. Un sitio de glicosilación ligado a N está caracterizado por la secuencia; Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el resto de aminoácido designado como X puede ser cualquier resto de aminoácido excepto prolina. La sustitución de restos de aminoácidos para crear esta secuencia proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidratos ligada a N. Como alternativa, las sustituciones que eliminen esta secuencia retirarán una cadena de carbohidratos ligada a N existente. También se proporciona un reordenamiento de cadenas de carbohidratos ligadas a N en donde se eliminan uno o más sitios de glicosilación ligados a N (típicamente los que son de origen natural) y se crean uno o más nuevos sitios ligados a N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales incluyen variantes de cisteína en donde uno o más restos de cisteína se suprimen de o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo, serina) en comparación con la secuencia de aminoácidos parental. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben replegarse en una conformación biológicamente activa tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos restos de cisteína que la proteína nativa, y típicamente tienen un número par para minimizar las interacciones resultantes de cisteínas no emparejadas.
Las sustituciones de aminoácidos deseadas (conservativas o no conservativas) pueden determinarse por los expertos en la materia en el momento en que se deseen dichas sustituciones. Las sustituciones de aminoácidos pueden usarse para identificar restos importantes de anticuerpos para esclerostina, o por aumentar o reducir la afinidad de los anticuerpos para esclerostina descritos en el presente documento.
Las sustituciones de aminoácidos preferidas son las que; (1) reducen la susceptibilidad a proteólisis, (2) reduce la susceptibilidad a oxidación, (3) alteran la afinidad de unión para formar complejos proteicos, (4) alteran las afinidades de unión, y/o (4) confieren o modifican otras propiedades fisioquímicas o funcionales en dichos polipéptidos. Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos individuales o múltiples (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos conservativas) en la secuencia de origen natural (por ejemplo, en la parte del polipéptido fuera del dominio o los dominios que forman contactos intermoleculares). Una sustitución de aminoácidos conservativa puede típicamente no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debería tender a romper una hélice que aparezca en la secuencia parental, o alterar otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Se describen ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptidos reconocidas en la técnica en Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman y Company, Nueva York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton et al. Nature 354; 105 (1991).
Los agentes de unión pueden enlazarse químicamente con polímeros, lípidos u otros restos.
Los agentes de unión pueden comprender al menos una de las CDR descritas en el presente documento incorporadas en una estructura marco biocompatible. En un ejemplo, la estructura marco biocompatible comprende un polipéptido o parte del mismo que es suficiente para formar un soporte estructural conformacionalmente estable, o marco, o armazón, que es capaz de presentar una o más secuencias de aminoácidos que se unen con un antígeno (por ejemplo, CDR, una región variable, etc.) en una región de superficie localizada. Dichas estructuras pueden ser un polipéptido de origen natural o “pliegue” polipeptídico (un motivo estructural) o pueden tener una o más modificaciones, tales como adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, en relación con un polipéptido o pliegue de origen natural. Estos armazones pueden derivar de un polipéptido de cualquier especie (o de más de una especie), tal como un ser humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, planta, bacteria o virus.
Típicamente las estructuras marco biocompatibles se basan en armazones proteicos o esqueletos distintos de dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, pueden usarse las basadas en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaína, citocromo b, dedo de cinc CP1, PST1, superenrollamiento, LACI-D1, dominio Z y dominios tendramisat (Véase, por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Current Opinion in Structural Biology, 7, 463-469).
Los agentes de unión incluyen los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento. Pueden producirse anticuerpos humanizados tales como los descritos en el presente documento usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (Zhang, W., et al., Molecular Immunology. 42(12); 1445-1451, 2005; Hwang W. et al., Methods. 36(1); 35-42, 2005; Dall'Acqua WF, et al., Methods 36(1); 43-60, 2005; y Clark, M., Immunology Today. 21 (8); 397-402, 2000).
Adicionalmente, un experto en la materia reconocerá que los agentes de unión adecuados incluyen partes de estos anticuerpos, tales como uno o más de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se divulga específicamente en el presente documento. Al menos una de las regiones de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 pueden tener al menos una sustitución de aminoácido, siempre que el agente de unión conserve la especificidad de unión de la CDR no sustituida. La parte no CDR del agente de unión puede ser una molécula no proteica, en donde el agente de unión bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza la esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede ser una molécula no proteica en la que el agente de unión muestra un patrón de unión similar con péptidos de esclerostina humana en un “ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana” al mostrado por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y/o neutraliza esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, en donde el agente de unión es una proteína de unión recombinante o un péptido sintético, y la proteína de unión recombinante bloquea de forma cruzada la unión de un anticuerpo divulgado en el presente documento con esclerostina y/o neutraliza esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, en donde el agente de unión es una proteína de unión recombinante, y la proteína de unión recombinante muestra un patrón de unión similar con péptidos de esclerostina humana en el ensayo de unión de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana (descrito en el presente documento posteriormente) al mostrado por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y/o neutraliza esclerostina.
Cuando un anticuerpo comprende CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 como se ha descrito anteriormente, puede obtenerse por expresión de una célula hospedadora que contiene ADN que codifica estas secuencias. Un ADN que codifica cada secuencia de CDR puede determinarse basándose en la secuencia de aminoácidos de la CDR y sintetizarse junto con cualquier secuencia de ADN de región constante y marco de región variable de anticuerpo deseada usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos, mutagénesis dirigida y técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) según sea apropiado. Está ampliamente disponible para los expertos en la materia ADN que codifica las regiones constantes y marcos de región variable a partir de bases de datos de secuencias genéticas tales como GenBank®. Cada una de las CDR anteriormente mencionadas se localizará típicamente en un marco de región variable en las posiciones 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) y 95-102 (CDR-H3) de la cadena pesada y las posiciones 24-34 (CdR-L1), 50-56 (CDR-L2) y 89-97 (CDR-L3) de la cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat et al., 1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).
Una vez sintetizado, el ADN que codifica un anticuerpo o fragmento del mismo puede propagarse y expresarse de acuerdo con cualquiera de una diversidad de procedimientos bien conocidos para escisión, ligación, transformación y transfección de ácido nucleico usando cualquier variedad de vectores de expresión conocidos. Por lo tanto, puede preferirse la expresión de un fragmento de anticuerpo en un hospedador procariota, tal como Escherichia coli (véase, por ejemplo, Pluckthun et al., 1989 Methods Enzymol. 178; 497-515). Puede preferirse la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo en una célula hospedadora eucariota, incluyendo levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe y Pichia pastoris), células animales (incluyendo células de mamífero) o células vegetales. Los ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero sin limitación, mieloma (tal como una línea NSO de ratón), COS, CHO o células de hibridoma. Los ejemplos de células vegetales incluyen tabaco, maíz, soja y células de arroz.
Pueden prepararse uno o más vectores de expresión replicables que contienen ADN que codifica una región variable y/o constante de anticuerpo y usarse para transformar una línea celular apropiada, por ejemplo, una línea celular de mieloma no productora, tal como una línea NSO de ratón o una bacteria, tal como E. coli, en la que se producirá producción del anticuerpo. Para obtener transcripción y traducción eficaz, la secuencia de ADN en cada vector debería incluir secuencias reguladoras apropiadas, particularmente un promotor y secuencia líder unidos operativamente con la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares para producir anticuerpos de este modo se conocen generalmente bien y se usan de forma rutinaria. Por ejemplo, se describen procedimientos de biología molecular básica en Maniatis et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; véase también Maniatis et al, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). Puede realizarse secuenciación de ADN como se describe en Sanger et al. (PNAS 74; 5463, (1977)) y el manual de secuenciación de plc de Amersham International, y puede llevarse a cabo mutagénesis dirigida de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12; 9441, (1984); Kunkel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 488-92 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154; 367-82 (1987); el manual de Anglian Biotechnology Ltd). Adicionalmente, numerosas publicaciones describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación y cultivo de células apropiadas (Mountain A y Adair, J R en Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (ed. Tombs, M P, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, Reino Unido); “Current Protocols in Molecular Biology”, 1999, F.M. Ausubel (ed.), Wiley Interscience, Nueva York).
Cuando se desee mejorar la afinidad de anticuerpos que contienen una o más de las CDR anteriormente mencionadas, puede obtenerse por varios protocolos de maduración de afinidad, incluyendo mantener las CDR (Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), combinación de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutación de E. coli (Low et al., J. Mol. Biol., 250, 350-368, 1996), barajado de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), presentación de fagos (Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 7-88, 1996) y PCR sexual (Crameri, et al., Nature, 391, 288-291, 1998). Todos estos métodos de maduración de afinidad se analizan en Vaughan et al., (Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998).
Pueden obtenerse otros anticuerpos mediante inmunización convencional y procedimientos de fusión de células como se describen en el presente documento y se conocen en la técnica. Pueden generarse anticuerpos monoclonales usando una diversidad de técnicas conocidas. En general, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales que se unen a antígenos específicos mediante métodos conocidos por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Kohler et al., Nature 256; 495, 1975; Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, 1; 2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patentes de Estados Unidos N.° RE 32.011, 4.902.614, 4.543.439 y 4.411.993; Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn y Bechtol (eds.) (1980); y Antibodies; A Laboratory Manual, Harlow y Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley et al., “Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,” en DNA Cloning 2; Expression Systems, 2a Edición, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). Pueden derivarse fragmentos de anticuerpo de los mismos usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica u, opcionalmente, mediante digestión proteolítica (por ejemplo, usando papaína o pepsina) seguido de reducción suave de enlaces disulfuro y alquilación. Como alternativa, dichos fragmentos también pueden generarse mediante técnicas de ingeniería genética recombinante como se describe en el presente documento.
Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales inyectando a un animal, por ejemplo, una rata, hámster, un conejo o preferentemente un ratón, incluyendo por ejemplo un transgénico o un knock-out, como se conoce en la técnica, con un inmunógeno que comprende esclerostina humana de SEQ ID NO; 1, o un fragmento de la misma, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. La presencia de producción de anticuerpos específica puede supervisarse después de la inyección inicial y/o después de una inyección de refuerzo obteniendo una muestra de suero y detectando la presencia de un anticuerpo que se une a esclerostina humana o péptido usando uno cualquiera de varios métodos de inmunodetección conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. De animales que producen los anticuerpos deseados, se retiran células linfoides, más habitualmente células del bazo o ganglio linfático, para obtener linfocitos B. Los linfocitos B se fusionan después con un compañero de fusión de célula de mieloma sensibilizado a fármaco, preferentemente uno que sea singénico con el animal inmunizado y que tenga opcionalmente otras propiedades deseables (por ejemplo, incapacidad para expresar productos génicos de Ig endógenos, por ejemplo, p3x 63 - Ag 8.653 (ATCC N.° CRL 1580); NSO, SP20) para producir hibridomas, que son líneas celulares eucariotas inmortales. Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden combinarse durante varios minutos con un agente promotor de fusión de membrana, tal como polietilenglicol o un detergente no iónico, y después sembrarse a baja densidad en un medio selectivo que apoye el crecimiento de células de hibridoma, pero no células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, habitualmente de aproximadamente una a dos semanas, se observan colonias de células. Se aíslan colonias individuales, y pueden ensayarse anticuerpos producidos por las células con respecto a actividad de unión con esclerostina humana, usando una cualquiera de una diversidad de inmunoensayos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento. Los hibridomas se clonan (por ejemplo, mediante clonación de dilución limitada o mediante aislamiento en placa de agar suave) y se seleccionan y cultivan clones positivos que producen un anticuerpo específico para esclerostina. Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma pueden aislarse de los sobrenadantes de cultivos de hibridoma. Un método alternativo para producción de un anticuerpo monoclonal murino es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singénico, por ejemplo, un ratón que se ha tratado (por ejemplo, sensibilizado con pristano) para prolongar la formación de líquido ascítico que contiene el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden aislarse y purificarse por una diversidad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía de afinidad con Proteína-A Sepharose, cromatografía de exclusión por tamaños y cromatografía de intercambio iónico (véase, por ejemplo, Coligan en las páginas 2.7.1-2.7.12 y las páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG),” en Methods in Molecular Biology, Vol. 10, páginas 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Pueden purificarse anticuerpos monoclonales mediante cromatografía de afinidad usando un ligando apropiado seleccionado basándose en propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de unión, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizado en un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo anti-región constante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idiotipo y una proteína de unión a TGF-beta, o fragmento o variante de los mismos.
Un anticuerpo de la presente invención también puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse por cualquier variedad de técnicas que resultarán familiares para los expertos habituales en la materia. Dichos métodos incluyen, pero sin limitación, transformación por Virus de Epstein Barr (VEB) de células de sangre periférica humana (por ejemplo, que contienen linfocitos B), inmunización in vitro de linfocitos B humanos, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que portan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento de bibliotecas de fago de región V de inmunoglobulina humana, u otros procedimientos como se conocen en la técnica y basados en la divulgación del presente documento. Por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos de ratones transgénicos que se han modificado por ingeniería genética para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a presentación antigénica. Se describen métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos, por ejemplo, por Green et al., Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg et al., Nature 368: 856, 1994; Taylor et al., Int. Immun. 6: 579, 1994; Patente de Estados Unidos N.° 5.877.397; Bruggemann et al., 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58; Jakobovits et al., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 525-35. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivados de líneas de células madre embrionarias que contienen alteraciones dirigidas de los loci de cadena pesada y cadena ligera endógenos (véase también Bruggemann et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8: 455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser construcciones de minigenes, o transloci en cromosomas artificiales de levadura, que experimentan reordenación del ADN específica de linfocitos B e hipermutación en el tejido linfoide de ratón. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales humanos inmunizando los ratones transgénicos, que pueden después producir anticuerpos humanos específicos para esclerostina. Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados pueden usarse para producir hibridomas que secreten anticuerpos humanos de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento. También pueden obtenerse sueros policlonales que contienen anticuerpos humanos de la sangre de los animales inmunizados.
Otro método para generar anticuerpos humanos incluye inmortalizar células de sangre periférica humana por transformación con VEB. Véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.° 4.646.456. Dicha línea de linfocitos B inmortalizada (o línea celular linfoblastoide) que produce un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a esclerostina puede identificarse por métodos de inmunodetección como se proporcionan en el presente documento, por ejemplo, un ELISA, y después aislarse por técnicas de clonación convencionales. La estabilidad de la línea celular linfoblastoide que produce un anticuerpo antiesclerostina puede mejorarse fusionando la línea celular transformada con un mieloma murino para producir una línea celular híbrida de ratón-humano de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Glasky et al., Hybridoma 8: 377-89 (1989)). Otro método más para generar anticuerpos monoclonales humanos es la inmunización in vitro, que incluye sensibilizar linfocitos B esplénicos humanos con esclerostina humana, seguido de fusión de los linfocitos B sensibilizados con un compañero de fusión heterohíbrido. Véase, por ejemplo, Boerner et al., 1991 J. Immunol. 147: 86-95.
Puede seleccionarse un linfocito B que produce un anticuerpo antiesclerostina humana y pueden clonarse las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada a partir del linfocito B de acuerdo con técnicas de biología molecular conocidas en este campo (documento WO 92/02551; Patente de Estados Unidos 5.627.052; Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-48 (1996)) y descritas en el presente documento. Pueden aislarse linfocitos B de un animal inmunizado del bazo, ganglio linfático o muestra de sangre periférica seleccionando una célula que produce un anticuerpo que se une específicamente a esclerostina. Los linfocitos B también pueden aislarse de seres humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Se conocen bien en la técnica métodos para detectar linfocitos B individuales que producen un anticuerpo con la especificidad deseada, por ejemplo, mediante formación de placas, separación de células activadas por fluorescencia, estimulación in vitro seguida de detección de anticuerpo específico y similares. Los métodos para selección de linfocitos B productores de anticuerpos específicos incluyen, por ejemplo, preparar una única suspensión celular de linfocitos B en agar blando que contiene esclerostina humana. La unión del anticuerpo específico producido por el linfocito B con el antígeno da como resultado la formación de un complejo, que puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después de que se seleccionen los linfocitos B que producen el anticuerpo deseado, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento.
Un método adicional para obtener anticuerpos es por presentación de fagos. Véase, por ejemplo, Winter et al., 1994 Annu. Rev. Immunol. 12: 433-55; Burton et al., 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280. Pueden crearse bibliotecas combinatorias de región variable de inmunoglobulina humanas o murinas en vectores de fagos que pueden explorarse para seleccionar fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de los mismos) que se unen específicamente a proteína de unión a TGF-beta o variante o fragmento de la misma. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.223.409; Huse et al., 1989 Science 246: 1275-81; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-32 (1989); Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990); Kang et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4363-66; Hoogenboom et al., 1992 J. Molec. Biol. 227: 381-388; Schlebusch et al., 1997 Hybridoma 16: 47-52 y referencias citadas en las mismas. Por ejemplo, puede insertarse una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias polinucleotídicas que codifican fragmentos de región variable de Ig en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o una variante del mismo, en fase con la secuencia que codifica una proteína de cubierta de fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de cubierta con el dominio de región variable de cadena ligera y/o con el dominio de región variable de cadena pesada. También pueden presentarse fragmentos Fab de inmunoglobulina en una partícula de fago (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N.°: 5.698.426).
También pueden prepararse bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en fago lambda, por ejemplo, usando vectores MmmunoZap™ (H) y XImmunoZap™ (L) (Stratagene, La Jolla, California). Brevemente, se aísla ARNm de una población de linfocitos B y se usa para crear bibliotecas de expresión de ADNc de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores XImmunoZap(H) y MmmunoZap (L). Estos vectores pueden explorarse individualmente o pueden expresarse para formar fragmentos Fab o anticuerpos (véase Huse et al., mencionado anteriormente; véase también Sastry et al., mencionado anteriormente). Pueden convertirse posteriormente placas positivas en un plásmido no lítico que permita expresión de alto nivel de fragmentos de anticuerpo monoclonales de E. coli.
En un hibridoma, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal pueden amplificarse usando cebadores nucleotídicos. Estos cebadores pueden sintetizarse por un experto en la materia, o pueden obtenerse de fuentes disponibles en el mercado. (Véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California), que vende cebadores para regiones variables humanas y de ratón, incluyendo, entre otros, cebadores para las regiones VHa, VHb, Vhc, VHd, Ch1, Vl y Cl). Estos cebadores pueden usarse para amplificar regiones variables de cadena pesada o ligera, que pueden después insertarse en vectores tales como ImmunoZAP™H o ImmunoZAP™L (Stratagene), respectivamente. Estos vectores pueden introducirse después en sistemas de expresión basados en E. coli, levadura o mamífero. Pueden producirse grandes cantidades de una proteína de cadena sencilla que contiene una fusión de los dominios Vh y Vl usando estos métodos (véase Bird et al., Science 242: 423-426, 1988).
Una vez que se han obtenido células que producen anticuerpos usando cualquiera de las técnicas de inmunización y otras descritas anteriormente, los genes de anticuerpos específicos pueden clonarse aislando y amplificando ADN o ARNm del mismo de acuerdo con procedimientos convencionales como se describe en el presente documento. Los anticuerpos producidos de los mismos pueden secuenciarse y las CDR identificadas y el ADN que codifica las CDR pueden manipularse como se ha descrito previamente para generar otros anticuerpos.
Preferentemente los agentes de unión se unen específicamente a esclerostina. Como con todos los agentes de unión y ensayos de unión, un experto en la materia reconoce que los diversos restos con los que un agente de unión no debería unirse de forma detectable para ser terapéuticamente eficaz y adecuado serían extensos y difíciles de numerar. Por lo tanto, para un agente de unión divulgado en el presente documento, la expresión “se une específicamente” se refiere a la capacidad de un agente de unión para unirse a esclerostina, preferentemente esclerostina humana, con mayor afinidad que se une a una proteína de control no relacionada. Preferentemente la proteína de control es lisozima de clara de huevo de gallina. Preferentemente los agentes de unión se unen a esclerostina con una afinidad que es al menos 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por una proteína de control. Un agente de unión puede tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10-7 M, menor de o igual a 1 x 10-8 M, menor de o igual a 1 x 10-9 M, menor de o igual a 1 x 10-10 M, menor de o igual a 1 x 10-11 M o menor de o igual a 1 x 10-12 M
La afinidad puede determinarse por un ensayo de ELIA de afinidad. La afinidad puede determinarse por un ensayo de BIAcore. La afinidad puede determinarse por un método cinético. La afinidad puede determinarse por un método de equilibrio/solución. Dichos métodos se describen en más detalle en el presente documento o se conocen en la técnica.
Los agentes de unión de esclerostina preferentemente modulan la función de esclerostina en el ensayo basado en células descrito en el presente documento y/o el ensayo in vivo descrito en el presente documento y/o se unen a uno o más de los epítopos descritos en el presente documento y/o bloquean de forma cruzada la unión de uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud. En consecuencia, dichos agentes de unión pueden identificarse usando los ensayos descritos en el presente documento.
Pueden generarse agentes de unión identificando en primer lugar anticuerpos que se unan a uno o más de los epítopos proporcionados en el presente documento y/o se neutralizan en los ensayos basados en células y/o in vivo descritos en el presente documento y/o bloquean de forma cruzada los anticuerpos descritos en la presente solicitud y/o se bloquean de forma cruzada de la unión con esclerostina por uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud. Las regiones CDR de estos anticuerpos se usan después para insertar en marcos biocompatibles apropiados para generar agentes de unión a esclerostina. La parte no CDR del agente de unión puede estar compuesta de aminoácidos, o puede ser una molécula no proteica. Los ensayos descritos en el presente documento permiten la caracterización de agentes de unión. Preferentemente, los agentes de unión son anticuerpos como se definen en el presente documento.
Se entenderá por un experto en la materia que algunas proteínas, tales como anticuerpos, pueden experimentar una diversidad de modificaciones postraduccionales. El tipo y alcance de estas modificaciones depende con frecuencia de la línea celular hospedadora usada para expresar la proteína, así como las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en glicosilación, oxidación de metionina, formación de dicetopiperizina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un resto básico carboxilo-terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995).
Se describen posteriormente anticuerpos denominados Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1. “HC” se refiere a la cadena pesada y “LC” se refiere a la cadena ligera. Para algunos anticuerpos posteriores, las CDR están sombreadas en cajas y las regiones constantes (C) se muestran en negrita y cursiva.
Ab-D
El anticuerpo D (también denominado en el presente documento Ab-D y Mab-D) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-D se muestra en la Figura 18. La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena ligera de Ab-D:
1 DVQMIQSPSS LSASLGDIVT MTCQASQGTS INLNWFQQKP GKAPKLLIYG
51 SSÑLÉDGVPS RFSGSRYGTD FTLTISSLED EDLATYFCLQ HSYLPYTFGG 101 GTKLEIKJMZ) AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFYPKDINVKWKI 151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT 201 STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO:7)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-D es la siguiente:
1 GATGTCCAGA TGATTCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTTTGGGAGA
51 CATAGTCACC ATGACTTGCC AGGCAAGTCA GGGCACTAGC ATTAATTTAA
101 ACTGGTTTCA GCAAAAACCA GGGAAGGCTC CTAAGCTCCT GATCTATGGT 151 TCAAGCAACT TGGAAGATGG GGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTAGATA 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTGGAGGAT GAAGATCTGG 251 CAACTTATTT CTGTCTACAA CATAGTTATC TCCCGTACAC GTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO:8)
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-D incluyendo el péptido señal es la siguiente:
1 MNTRAPAEFL GFLLLWFLGA RCDVQMIQSP SSLSASLGDI VTMTCQASQG
51 TSINLNWFQQ KPGKAPKLLI YGSSNLEDGV PSRFSGSRYG TDFTLTISSL 101 EDEDLATYFC LQHSYLPYTF GGGTKLEIKR ADAAPTVSIF PPSSEQLTSG 151 G A SW C FL N N FYPKDINVKW KIDGSERQNG VLNSWTDQDS KDSTYSMSST 201 LTLTKDEYER HNSYTCEATH KTSTSPIVKS FNRNEC (SEQ ID NO:9)
Secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-D incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal:
1 ATGAACACGA GGGCCCCTGC TGAGTTCCTT GGGTTCCTGT TGCTCTGGTT
51 TTTAGGTGCC AGATGTGATG TCCAGATGAT TCAGTCTCCA TCCTCCCTGT 101 CTGCATCTTT GGGAGACATA GTCACCATGA CTTGCCAGGC AAGTCAGGGC
151 ACTAGCATTA ATTTAAACTG GTTTCAGCAA AAACCAGGGA AGGCTCCTAA 201 GCTCCTGATC TATGGTTCAA GCAACTTGGA AGATGGGGTC CCATCAAGGT 251 TCAGTGGCAG TAGATATGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGCCTG 301 GAGGATGAAG ATCTGGCAAC TTATTTCTGT CTACAACATA GTTATCTCCC 351 GTACACGTTC GGAGGGGGGA CCAAGCTGGA AATAAAACGG GCTGATGCTG 401 CACCAACTGT ATCCATCTTC CCACCATCCA GTGAGCAGTT AACATCTGGA 451 GGTGCCTCAG TCGTGTGCTT CTTGAACAAC TTCTACCCCA AAGACATCAA 501 TGTCAAGTGG AAGATTGATG GCAGTGAACG ACAAAATGGC GTCCTGAACA 551 GTTGGACTGA TCAGGACAGC AAAGACAGCA CCTACAGCAT GAGCAGCACC 601 CTCACGTTGA CCAAGGACGA GTATGAACGA CATAACAGCT ATACCTGTGA 651 GGCCACTCAC AAGACATCAA CTTCACCCAT TGTCAAGAGC TTCAACAGGA 701 ATGAGTGTTA G (SEQ ID NO: 10)
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la cadena pesada HC de Ab-D es la siguiente:
1 EVQLQQSGPE LVTPGASVKISCKASGYTFT DHYMSWVKQS HGKSLEWIGD
51 INPYSGETTY NQKFKGTATL TVDKSSSIAY MEIRGLTSED SAVYYCARDD
101 YDASPFAYWG QGTLVTVSAA KTTPPSVYPL APGSAAQTNSMVTLGCLVKG 151 YFPEPVTVTWNSGSLSSGVH TFPA VLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT 201 CNVAHPASSTKVDKKIVPRD CGCKPCICTVPEVSSVFIFP PKPKDVLTIT 251LTPKVTCWVDISKDDPEVQ FSWFVDD VEVHTAQTQPREE QFNSTFRSVS 301ELPIMHQDWL NGKEFKCR VNSPAFPAPIEK TISKTKGRPKAPQl'TTIPPP 351KEQMAKDKVS LTCMITDFFP ED1TVEWQWN GQPAENYKNT QPIMDTDGSY 401 FIYSKLNVQKSNWEAGNTFT CSVLHEGLHNH1ITEKSLSHS PGK (SEQ ID NO: 11)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-D es:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTGGTGACGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATA TCTTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACCACTACA 101 TGAGCTGGGT GAAGCAGAGT CATGGAAAAA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT 151 ATTAATCCCT ATTCTGGTGA AACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAC 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG TATAGCCTAC ATGGAGATCC 251 GCGGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGATGAT 301 TACGACGCCT CTCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC TGGTCACTGT 351 CTCTGCAGCC AAAACGACAC CCCCATCTGT CTATCCACTG GCCCCTGGAT . 401 CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC TGGGATGCCT GGTCAAGGGC 451 TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG AACTCTGGAT CCCTGTCCAG 501 CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA GTCTGACCTC TACACTCTGA 551 GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT GGCCCAGCGA GACCGTCACC 601 TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC AAGGTGGACA AGAAAATTGT 651 GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT ATGTACAGTC CCAGAAGTAT 701 CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA AGGATGTGCT CACCATTACT 751 CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA GACATCAGCA AGGATGATCC 801 CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA TGTGGAGGTG CACACAGCTC 851 AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA GCACTTTCCG CTCAGTCAGT 901 GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC AATGGCAAGG AGTTCAAATG 951 CAGGGTCAAC AGTCCAGCTT TCCCTGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA 1001 AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG TGTACACCAT TCCACCTCCC 1051 AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT CTGACCTGCA TGATAACAGA 1101 CTTCTTCCCT GAAGACATTA CTGTGGAGTG GCAGTGGAAT GGGCAGCCAG 1151 CGGAGAACTA CAAGAACACT CAGCCCATCA TGGACACAGA TGGCTCTTAC 1201 TTCATCTACA GCAAGCTCAA TGTGCAGAAG AGCAACTGGG AGGCAGGAAA 1251 TACTTTCACC TGCTCTGTGT TACATGAGGG CCTGCACAAC CACCATACTG 1301 AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGGTAAAT GA (SEQ ID NO: 12)
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-D incluyendo el péptido señal es:
1 MRCRWIFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL VTPGASVKIS CKASGYTFTD
51 HYMSWVKQSH GKSLEWIGDINPYSGETTYN QKFKGTATLT VDKSSSIAYM 101 EIRGLTSEDS AVYYCARDDY DASPFAYWGQ GTLVTVSAAK TTPPSVYPLA 151 PGSAAQTNSM VTLGCLVKGY FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY 201 TLSSSVTVPS STWPSETVTC NVAHPASSTK VDKJKJVPRDC GCKPCICTVP 251 EVSSVFIFPP KPKDVLTITL TPK V TC V W DISK DD PEV Q F SWFVDDVEVH 301 TAQTQPREEQ FNSTFRSVSE LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS PAFPAPIEKT 3 51 ISKTKGRPKA PQVYTIPPPK EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG 401 QPAENYKNTQ PIMDTDGSYF IYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH 451 HTEKSLSHSP GK (SEQ ID NO: 13)
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-D incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1 ATGAGATGCA GGTGGATCTT TCTCTTTCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTG GTGACGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATATCT TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151 CACTACATGA GCTGGGTGAA GCAGAGTCAT GGAAAAAGCC TTGAGTGGAT 201 TGGAGATATT AATCCCTATT CTGGTGAAAC TACCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCACGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CTTCCAGTAT AGCCTACATG 301 GAGATCCGCG GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 AGATGATTAC GACGCCTCTC CGTTTGCTTA CTGGGGCCAA GGGACTCTGG 401 TCACTGTCTC TGCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA TCCACTGGCC 451 CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG GTGACCCTGG GATGCCTGGT 501 CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC 551 TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTGCAGTC TGACCTCTAC 601 ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCGAGAC 651 CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG GTGGACAAGA 701 AAATTGTGCC CAGGGATTGT GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTCCCA 751 GAAGTATCAT CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC 801 CATTACTCTG ACTCCTAAGG TCACGTGTGT TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG 851 ATGATCCCGA GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG TAGATGATGT GGAGGTGCAC 901 ACAGCTCAGA CGCAACCCCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CTTTCCGCTC 951 AGTCAGTGAA CTTCCCATCA TGCACCAGGA CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT 1001 TCAAATGCAG GGTCAACAGT CCAGCTTTCC CTGCCCCCAT CGAGAAAACC 1051 ATCTCCAAAA CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT CCACAGGTGT ACACCATTCC 1101 ACCTCCCAAG GAGCAGATGG CCAAGGATAA AGTCAGTCTG ACCTGCATGA 1151 TAACAGACTT CTTCCCTGAA GACATTACTG TGGAGTGGCA GTGGAATGGG 1201 CAGCCAGCGG AGAACTACAA GAACACTCAG CCCATCATGG ACACAGATGG 1251 CTCTTACTTC ATCTACAGCA AGCTCAATGT GCAGAAGAGC AACTGGGAGG 1301 CAGGAAATAC TTTCACCTGC TCTGTGTTAC ATGAGGGCCT GCACAACCAC
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-D son las siguientes:
CDR-H1: DHYMS (SEQ ID NO: 39)
CDR-H2: DINPYSGETTYNQKFKG (SEQ ID NO: 40)
CDR-H3: DDYDASPFAY (SEQ ID NO: 41)
Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-D son:
CDR-L1: QASQGTSINLN (SEQ ID NO: 42)
CDR-L2: GSSNLED (SEQ ID NO: 43)
CDR-L3: LQHSYLPYT (SEQ ID NO: 44)
Ab-C
El anticuerpo C (también denominado en el presente documento Ab-C y Mab-C) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-C se muestra en la Figura 17. La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la Cadena Ligera de Ab-C es la siguiente:
1 DIVLTQSPAS LTVSLGLRATISCKASQSVD YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL
51 LIYAASNLES GIPARFSGNG SGTDFTLNIH PVEEEDAVTY YCQQSNEDPW 101 TFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLT SGGASW CFL NNFYPKDINV 151KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STLTLTKDEY ERHNSYTCEA 201 THKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 15)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-C es:
1 GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGACTGTGT CTCTAGGCCT 51 GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTG 101 ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC 151 CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG CCAGGTTTAG 201 TGGCAATGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG 251 AGGAGGATGC TGTAACCTAT TACTGTCAAC AAAGTAATGA GGATCCGTGG 301 ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGGGCTG ATGCTGCACC 351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG 401 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC 451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG 501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA 551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC 601 ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGGAATGA
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-C incluyendo el péptido señal es:
1 METDTILLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LTVSLGLRAT ISCKASQSVD
51 YDGDSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES GIPARFSGNG SGTDFTLNIH 101 PVEEEDAVTY YCQQSNEDPW TFGGGTKLEI KRADAAPTVS IFPPSSEQLT
151 SGGASWCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS 201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID NO:17)
La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-C incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1 ATGGAGACAG ACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG
51 CTCCACTGGT GACATTGTGC TGACCCAATC TCCAGCTTCT TTGACTGTGT 101 CTCTAGGCCT GAGGGCCACC ATCTCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT 151 TATGATGGTG ATAGTTATAT GAACTGGTAC CAGCAGAAAC CAGGACAGCC 201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GGGATCCCAG 251 CCAGGTTTAG TGGCAATGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT 301 CCTGTGGAGG AGGAGGATGC TGTAACCTAT TACTGTCAAC AAAGTAATGA 351 GGATCCGTGG ACGTTCGGTG GAGGCACCAA GCTGGAAATC AAACGGGCTG 401 ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA 451 TCTGGAGGTG CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA 501 CATCAATGTC AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC 551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC 601 AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC 651 CTGTGAGGCC ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA 701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID NO: 18)
Cadena pesada de Ab-C
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es:
1 EVQLQQSGPE LVKPGTSVKM SCKASGYTFT DCS'MNWVKQS HGKSLEWIGD
51 ÍNPFNGGTTY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MQLNSLTSDD SAVYYCARSH
101 YYFDGRVPWD AMDYWGQGTS VTVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGSLSSGVHTFPA VLQSDLYTLSSSVTVPSSTW 201 PSETVTCNVA HPASSTKVDKKIVPRDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK 251DVLTITLTPK VTCVWDISK DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS 301 TFRSVSELPIMHQDWLNGKE FKCRVNSAAFPAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401DTDGSYFIYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ ID NO: 19)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-C es la siguiente:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGACTTC 51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTGCTACA 101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGGAAGA GCCTTGAATG GATTGGAGAT 151 ATTAATCCTT TCAACGGTGG TACTACCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAC ATGCAGCTCA 251 ACAGCCTGAC ATCTGACGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATCCCAT 301 TATTACTTCG ATGGTAGAGT CCCTTGGGAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA 351 AGGAACCTCA GTCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT 401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG 451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA
501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT
551 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG
601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA
651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT
701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG
751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA
801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG
851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC
901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA
951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA
1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG 1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT 1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC 1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG 1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG 1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC 1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA (SEQ ID NO:20)
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-C incluyendo el péptido señal es:
1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE VQLQQSGPEL VKPGTSVKMS CKASGYTFTD
51 CYMNWVKQSH GKSLEWIGDINPFNGGTTYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM 101 QLNSLTSDDS AVYYCARSHY YFDGRVPWDA MDYWGQGTSV TVSSAKTTPP 151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV 201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAFIPASSTKVDKKIVPRDCGCKP 251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV TC VW D ISK D DPEVQFSWFV 301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM FIQDWLNGKEF KCRVNSAAFP 351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMI TDFFPEDITV 401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFIYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-C incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC TTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG 101 GGACTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151 TGCTACATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT GGGAAGAGCC TTGAATGGAT 201 TGGAGATATT AATCCTTTCA ACGGTGGTAC TACCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTACATG 301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGACGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATCCCATTAT TACTTCGATG GTAGAGTCCC TTGGGATGCT ATGGACTACT 401 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA 451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT 501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA 551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC 601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG 651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA 701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT 751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA 801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG 851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA 901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT 1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC 1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG 1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG 1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC 1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC 1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT 1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG 1401 TAAATGA (SEQ ID NO:22)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-C son como sigue:
CDR-H1: DCYMN (SEQ ID NO: 45)
CDR-H2: DINPFNGGTTYNQKFKG (SEQ ID NO: 46)
CDR-H3: SHYYFDGRVPWDAMDY (SEQ ID NO: 47)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-C son:
CDR-L1: KASQSVDYDGDSYN (SEQ ID NO: 48)
CDR-L2: AASNLES (SEQ ID NO: 49)
CDR-L3: QQSNEDPWT (SEQ ID NO: 50)
Ab-A
El anticuerpo A (también denominado en el presente documento Ab-A y Mab-A) es un anticuerpo quimérico de ratón-conejo que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-A se muestra en la Figura 15.
Cadena Ligera de Ab-A
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-A:
Figure imgf000023_0001
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-A:
1 GCGCAAGTGC TGACCCAGAC TCCAGCCTCC GTGTCTGCAG CTGTGGGAGG
51 CACAGTCACC ATCAATTGCC AGTCCAGTCA GAGTGTTTAT GATAACAACT 101 GGTTAGCCTG GTTTCAGCAG AAACCAGGGC AGCCTCCCAA GCTCCTGATT 151 TATGATGCAT CCGATCTGGC ATCTGGGGTC CCATCGCGGT TCAGTGGCAG 201 TGGATCTGGG ACACAGTTCA CTCTCACCAT CAGCGGCGTG CAGTGTGCCG 251 ATGCTGCCAC TTACTACTGT CAAGGCGCTT ATAATGATGT TATTTATGCT 301 TTCGGCGGAG GGACCGAGGT GGTGGTCAAA CGTACGGATG CTGCACCAAC 351 TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT GGAGGTGCCT 401 CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT CAATGTCAAG 451 TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA ACAGTTGGAC 501 TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC ACCCTCACGT 551 TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG TGAGGCCACT 601 CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA GGAATGAGTG 651 TTAG (SEQ ID NO:24)
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-A incluyendo el péptido señal es:
1 MDTRAPTQLL GLLLLWLPGA TFAQVLTQTP ASVSAAVGGT VTINCQSSQS
51 VYDNNW LAW F QQKPGQPPKL LIYDASDLAS GVPSRFSGSG SGTQFTLTIS 101 GVQCADAATY YCQ G AYNDVIYAFG G G TEW VKRTDAAPTV SIFPPSSEQL 151 T SG G A SW C F LNNFYPKDIN VKWKIDGSER QNGVLNSWTD QDSKDSTYSM 201 SSTLTLTKDE YERHNSYTCE ATHKTSTSPI VICSFNRNEC (SEQ IDNO :25)
La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-A incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1 ATGGACACGA GGGCCCCCAC TCAGCTGCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT
51 CCCAGGTGCC ACATTTGCGC AAGTGCTGAC CCAGACTCCA GCCTCCGTGT 101 CTGCAGCTGT GGGAGGCACA GTCACCATCA ATTGCCAGTC CAGTCAGAGT 151 GTTTATGATA ACAACTGGTT AGCCTGGTTT CAGCAGAAAC CAGGGCAGCC 201 TCCCAAGCTC CTGATTTATG ATGCATCCGA TCTGGCATCT GGGGTCCCAT 251 CGCGGTTCAG TGGCAGTGGA TCTGGGACAC AGTTCACTCT CACCATCAGC 301 GGCGTGCAGT GTGCCGATGC TGCCACTTAC TACTGTCAAG GCGCTTATAA 351 TGATGTTATT TATGCTTTCG GCGGAGGGAC CGAGGTGGTG GTCAAACGTA 401 CGGATGCTGC ACCAACTGTA TCCATCTTCC CACCATCCAG TGAGCAGTTA 451 ACATCTGGAG GTGCCTCAGT CGTGTGCTTC TTGAACAACT TCTACCCCAA 501 AGACATCAAT GTCAAGTGGA AGATTGATGG CAGTGAACGA CAAAATGGCG 551 TCCTGAACAG TTGGACTGAT CAGGACAGCA AAGACAGCAC CTACAGCATG 601 AGCAGCACCC TCACGTTGAC CAAGGACGAG TATGAACGAC ATAACAGCTA 651 TACCTGTGAG GCCACTCACA AGACATCAAC TTCACCCATT GTCAAGAGCT 701 TCAACAGGAA TGAGTGTTAG (SEQ ID NO:26)
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-A es:
1 QSLEESGGRL VTPGTPLTLT CTASGFSLSS YWMNWVRQAP GEGLEWIGTI
51 DSGGRTDYAS WAKGRFTISR TSTTMDLKMT SLTTGDTARY FCARNWNLWG 101 QGTLVTVSS/4 STKGPSVYPL APGSAAQTNSMVTLGCL VKG YFPEPVTVTW 151NSGSLSSGVH TFPAVLQSDL YTLSSSVTVP SSTWPSETVT CNVAHPASST 201KVDKKIVPRD CGCKPCICTV PE VSSVF1FP PKPKD VL TITLTPKVTCVW 251DISKDDPEVQ FSWFVDDVEVHTAOTQPREE QFNSTFRSVS ELPIMHQDWL 301NGKEFKCRVN SAAFPAPIEK TISKTKGRPK APQ VYTIPPP KEQMAKDKVS 351LTCMITDFFP EDITVEWQWN GQPAENYKNT QPIMNTNGSY FVYSKLNVQK 401SNWEAGNTFT CSVLHEGLHNHHTEKSLSHS PGK (SEQ ID NO:27)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-A:
1 CAGTCGCTGG AGGAGTCCGG GGGTCGCCTG GTCACGCCTG GGACACCCCT
51 GACACTCACC TGCACAGCCT CTGGATTCTC CCTCAGTAGT TATTGGATGA 101 ACTGGGTCCG CCAGGCTCCA GGGGAGGGGC TGGAATGGAT CGGAACCATT 151 GATTCTGGTG GTAGGACGGA CTACGCGAGC TGGGCAAAAG GCCGATTCAC 201 CATCTCCAGA ACCTCGACTA CGATGGATCT GAAAATGACC AGTCTGACGA 251 CCGGGGACAC GGCCCGTTAT TTCTGTGCCA GAAATTGGAA CTTGTGGGGC 301 CAAGGCACCC TCGTCACCGT CTCGAGCGCT TCTACAAAGG GCCCATCTGT 351 CTATCCACTG GCCCCTGGAT CTGCTGCCCA AACTAACTCC ATGGTGACCC 401 TGGGATGCCT GGTCAAGGGC TATTTCCCTG AGCCAGTGAC AGTGACCTGG 451 AACTCTGGAT CCCTGTCCAG CGGTGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTGCA 501 GTCTGACCTC TACACTCTGA GCAGCTCAGT GACTGTCCCC TCCAGCACCT 551 GGCCCAGCGA GACCGTCACC TGCAACGTTG CCCACCCGGC CAGCAGCACC 601 AAGGTGGACA AGAAAATTGT GCCCAGGGAT TGTGGTTGTA AGCCTTGCAT 651 ATGTACAGTC CCAGAAGTAT CATCTGTCTT CATCTTCCCC CCAAAGCCCA 701 AGGATGTGCT CACCATTACT CTGACTCCTA AGGTCACGTG TGTTGTGGTA 751 GACATCAGCA AGGATGATCC CGAGGTCCAG TTCAGCTGGT TTGTAGATGA 801 TGTGGAGGTG CACACAGCTC AGACGCAACC CCGGGAGGAG CAGTTCAACA 851 GCACTTTCCG CTCAGTCAGT GAACTTCCCA TCATGCACCA GGACTGGCTC 901 AATGGCAAGG AGTTCAAATG CAGGGTCAAC AGTGCAGCTT TCCCTGCCCC 951 CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAACCAAAGG CAGACCGAAG GCTCCACAGG 1001 TGTACACCAT TCCACCTCCC AAGGAGCAGA TGGCCAAGGA TAAAGTCAGT 1051 CTGACCTGCA TGATAACAGA CTTCTTCCCT GAAGACATTA CTGTGGAGTG 1101 GCAGTGGAAT GGGCAGCCAG CGGAGAACTA CAAGAACACT CAGCCCATCA 1151 TGGAC ACAGA TGGCTCTTAC TTCGTCTACA GCAAGCTCAA TGTGCAGAAG 1201 AGCAACTGGG AGGCAGGAAA TACTTTCACC TGCTCTGTGT TACATGAGGG 1251 CCTGCACAAC CACCATACTG AGAAGAGCCT CTCCCACTCT CCTGGTAAAT 1301 GA (SEQ ID NO:28)
La secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-A incluyendo el péptido señal es:
1 METGLRWLLL VAVLKGVHCQ SLEESGGRLV TPGTPLTLTC TASGFSLSSY
51 WMNWVRQAPG EGLEWIGTID SGGRTDYASW AKGRFTISRT STTMDLKMTS 101 LTTGDTARYF CARNWNLWGQ GTLVTVSSAS TKGPSVYPLA PGSAAQTNSM
151 VTLGCLVKGY FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPAVLQSDLY TLSSSVTVPS
201 STWPSETVTC NVAHPASSTK VDKKJVPRDC GCKPCICTVP EVSSVEIFPP
251 KPKDVLTITL TPKVTCVW DISKDDPEVQF SWFVDDVEVH TAQTQPREEQ
301 FNSTFRSVSE LPIMHQDWLN GKEFKCRVNS AAFPAPIEKTISKTKGRPKA
351 PQVYTIPPPK EQMAKDKVSL TCMITDFFPE DITVEWQWNG QPAENYKNTQ
401 PIMNTNGSYF VYSKLNVQKS NWEAGNTFTC SVLHEGLHNH HTEKSLSHSP
451 GK (SEQ ID NO:29)
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-A incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGAGACTG GGCTGCGCTG GCTTCTCCTG GTCGCTGTGC TCAAAGGTGT 51 CCACTGTCAG TCGCTGGAGG AGTCCGGGGG TCGCCTGGTC ACGCCTGGGA 101 CACCCCTGAC ACTCACCTGC ACAGCCTCTG GATTCTCCCT CAGTAGTTAT 151 TGGATGAACT GGGTCCGCCA GGCTCCAGGG GAGGGGCTGG AATGGATCGG 201 AACCATTGAT TCTGGTGGTA GGACGGACTA CGCGAGCTGG GCAAAAGGCC 251 GATTCACCAT CTCCAGAACC TCGACTACGA TGGATCTGAA AATGACCAGT 301 CTGACGACCG GGGACACGGC CCGTTATTTC TGTGCCAGAA ATTGGAACTT 351 GTGGGGCCAA GGCACCCTCG TCACCGTCTC GAGCGCTTCT ACAAAGGGCC 401 CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG CTGCCCAAAC TAACTCCATG 451 GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT TTCCCTGAGC CAGTGACAGT 501 GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG TGTGCACACC TTCCCAGCTG 551 TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC 601 AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC AACGTTGCCC ACCCGGCCAG 651 CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC CAGGGATTGT GGTTGTAAGC 701 CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA 751 AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG ACTCCTAAGG TCACGTGTGT 801 TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG 851 TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAGA CGCAACCCCG GGAGGAGCAG 901 TTCAACAGCA CTTTCCGCTC AGTCAGTGAA CTTCCCATCA TGCACCAGGA 951 CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG GGTCAACAGT GCAGCTTTCC 1001 CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT 1051 CCACAGGTGT ACACCATTCC ACCTCCCAAG GAGCAGATGG CCAAGGATAA 1101 AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT CTTCCCTGAA GACATTACTG 1151 TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG AGAACTACAA GAACACTCAG 1201 CCCATCATGG ACACAGATGG CTCTTACTTC GTCTACAGCA AGCTCAATGT 1251 GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC TTTCACCTGC TCTGTGTTAC 1301 ATGAGGGCCT GCACAACCAC CATACTGAGA AGAGCCTCTC CCACTCTCCT 1351 GGTAAATGA (SEQ ID NO:30)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-A son las siguientes:
CDR-H1: SYWMN (SEQ ID NO: 51)
CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID NO: 52)
CDR-H3: NWNL (SEQ ID NO: 53)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-A son:
CDR-L1: QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID NO: 54)
CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID NO: 55)
CDR-L3: QGAYNDVIYA (SEQ ID NO: 56)
Ab-A se humanizó y se denomina Anticuerpo 1 (también denominado en el presente documento Ab-1), que tiene las siguientes secuencias:
La secuencia de ácido nucleico de la región variable de LC de Ab-1 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGT GCCACATTTGCTCAAGTTCTGACCCAGAGTCCAAGCAGTCTCTCCGCCAGCGTAGGC GATCGTGTGACTATTACCTGTCAATCTAGTCAGAGCGTGTATGATAACAATTGGCTG GCGTGGTACCAGCAAAAACCGGGCAAAGCCCCGAAGCTGCTCATCTATGACGCGTC CGATCTGGCTAGCGGTGTGCCAAGCCGTTTCAGTGGCAGTGGCAGCGGTACTGACT TTACCCTCACAATTTCGTCTCTCCAGCCGGAAGATTTCGCCACTTACTATTGTCAAG GTGCTTACAACGATGTGATTTATGCCTTCGGTCAGGGCACTAAAGTAGAAATCAAA CGT (SEQ ID NO:74)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de LC de Ab-1 incluyendo el péptido señal es:
MDTRAPTOLLGLLLLWLPGATFAOVLTOSPSSLSASVGDRVTITCOSSOSVYDNNWLA WYQQKPGKAPKLLIYDASDLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQGAYN DVIYAFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:75)
La secuencia de ácido nucleico de la región variable de HC de Ab-1 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCACTGT GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGAGGCGGGCTTGTCCAGCCTGGAGGGAGCCTGCG TCTCTCTTGTGCAGCAAGCGGCTTCAGCTTATCCTCTTACTGGATGAATTGGGTGCG GCAGGCACCTGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTGGGCACCATTGATTCCGGAGGCCGTA CAGACTACGCGTCTTGGGCAAAGGGCCGTTTCACCATTTCCCGCGACAACTCCAAA AATACCATGTACCTCCAGATGAACTCTCTCCGCGCAGAGGACACAGCACGTTATTA CTGTGCACGCAACTGGAATCTGTGGGGTCAAGGTACTCTTGTAACAGTCTCGAGC
(SEQ ID NO:76)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de HC de Ab-1 incluyendo el péptido señal es:
METGLRWLLLVAVLKGVHCEVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFSLSSYWMNWVR QAPGKGLEWVGTIDSGGRTDYASWAKGRFTISRDNSKNTMYLQMNSLRAEDTARYYC ARÑWNLWGQGTLVTVSS (SEQ ID NÓ:77)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-1 son las siguientes:
CDR-H1: SYWMN (SEQ ID NO: 51)
CDR-H2: TIDSGGRTDYASWAKG (SEQ ID NO: 52)
CDR-H3: NWNL (SEQ ID NO: 53)
Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-1 son:
CDR-L1: QSSQSVYDNNWLA (SEQ ID NO: 54)
CDR-L2: DASDLAS (SEQ ID NO: 55)
CDR-L3: QGAYNDVIYA (SEQ ID NO: 56)
Ab-B
El anticuerpo B (también denominado en el presente documento Ab-B y Mab-B) es un anticuerpo de ratón que muestra unión de alta afinidad con esclerostina. El patrón de unión de BIAcore de Ab-B se muestra en la Figura 16.
Cadena Ligera de Ab-B
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-B es:
1 QIVLTQSPTI VSASPGEKVT LICSASSSVS FVDWFQQKPG TSPKRWIYRT
51 SNLGFGVPAR FSGGGSGTSH SLTISRMEAE DAATYYCQQR STYPPTFGAG
101 TKLELKRAm APTVSIFPPS SEQLTSGGAS WCFLNNFYP KDINVKWKID 15 1 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 2 01 TSPIVKSFNR NEC (SEQ ID NO:31)
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de LC de Ab-B es:
1 CAAATTGTTC TCACCCAGTC TCCAACAATC GTGTCTGCAT CTCCAGGGGA
51 GAAGGTCACC CTAATCTGCA GTGCCAGTTC AAGTGTAAGT TTCGTGGACT
10 1 GGTTCCAGCA GAAGCCAGGC ACTTCTCCCA AACGCTGGAT TTACAGAACA
15 1 TCCAACCTGG GTTTTGGAGT CCCTGCTCGC TTCAGTGGCG GTGGATCTGG
20 1 GACCTCTCAC TCTCTCACAA TCAGCCGAAT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA
25 1 CTTATTACTG CCAGCAAAGG AGTACTTACC CACCCACGTT CGGTGCTGGG
30 1 ACCAAGCTGG AACTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT
35 1 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT
40 1 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT
45 1 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG
50 1 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG
55 1 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA
60 1 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID N O :32)
La secuencia de aminoácidos de LC de Ab-B incluyendo el péptido señal es:
1 MHFQVQIFSF L L ISA SV IV S RGQIVLTQSP TIVSASPGÉK VTLICSASSS
51 VSFVDWFQQK PGTSPKRWIY RTSNLGFGVP ARFSGGGSGT SHSLTISRME
1 0 1 AEDAATYYCQ QRSTYPPTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG 1 51 ASW CFLNNF YPKDINVKWK IDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL 2 01 TLTKDEYERH NSYTCEATHK TSTSPIV K SF NRNEC (SEQ ID NO :33)
La secuencia de ácido nucleico de LC de Ab-B incluyendo la secuencia codificante del péptido señal es:
1 ATGCATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCCTCAGT
51 CATAGTGTCC AGAGGGCAAA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA ACAATCGTGT
1 01 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCCTAA TCTGCAGTGC CAGTTCAAGT 1 5 1 GTAAGTTTCG TGGACTGGTT CCAGCAGAAG CCAGGCACTT CTCCCAAACG 2 01 CTGGATTTAC AGAACATCCA ACCTGGGTTT TGGAGTCCCT GCTCGCTTCA 2 51 GTGGCGGTGG ATCTGGGACC TCTCACTCTC TCACAATCAG CCGAATGGAG 3 0 1 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAAAGGAGTA CTTACCCACC 351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAACT GAAACGGGCT GATGCTGCAC 401 CAACTG TATC C A TCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAG TTAAC ATCTGGAGGT 451 GCCTCAGTCG TG TG CTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATG T 501 CAAGTGGAAG ATTG ATG G CA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT 551 G GACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC 601 A C G TTG A CCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AAC A G C TA TA CCTGTGAGGC 651 CACTCACAAG A C A TC A A C TT CACCCATTG T CAAGAGCTTC AACAGGAATG 701 AG TG TTAG (SEQ ID NO:34)
Cadena Pesada de Ab-B
La secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-B:
1 QVTLKESGPG IL Q P SQ T L SL T C SF SG F SL S ’TSGMGVGWIR HPSGKNLEWL
5 1 AHIWWDDVKR YNPVLKSRLT ISK D TSN SQ V FLKÍANVDTA DTATYYCARI
101 EDFDYDEEYY AMDYWGQGTS VIVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL
151 GCLVKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPA VLQSDLYTLS SSVTVPSSTW
201 PSETVTCNVA HPASSTKVDK KIVPKDCGCK PCICTVPEVS SVFIFPPKPK
251 DVLTITLTPK VT CVWDI S K DDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS
301 TFRSVSELPI MHQDWLNGKE FKCRVNSAAF PAPIEKTISK TKGRPKAPQV
351 YTIPPPKEQM AKDKVSLTCM ITDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM
401 DTDGSYFVYS KLNVQKSNWE AGNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SE Q ID N O .35 )
La secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de HC de Ab-B:
1 CAGGTTACTC TGAAAGAGTC TGGCCCTGGG ATATTGCAGC CCTCCCAGAC
5 1 CCTCAGTCTG ACTTGTTCTT TCTCTGGGTT TTCACTGAGC ACTTCTGGTA
101 TGGGTGTAGG CTGGATTCGT CACCCATCAG GGAAGAATCT GGAGTGGCTG
151 GCACACATTT GGTGGGATGA TGTCAAGCGC TATAACCCAG TCCTGAAGAG
201 CCGACTGACT ATCTCCAAGG ATACCTCCAA CAGCCAGGTA TTCCTCAAGA
25 1 TCGCCAATGT GGACACTGCA GATACTGCCA CATACTACTG TGCTCGAATA
30 1 GAGGACTTTG ATTACGACGA GGAGTATTAT GCTATGGACT ACTGGGGTCA
35 1 AGGAACCTCA GTCATCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT
401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG
45 1 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA
501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT
55 1 CTGACCTCTA CACTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG
60 1 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA
65 1 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT
701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG
751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA
801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG
851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC
901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA
951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA
1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG
1 051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT
1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC
m u AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG
12 01 GACACAGATG GCTCTTACTT CGTCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG
125 1 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC
130 1 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA
(SE Q ID N O :36)
La secuencia de aminoácidos de HC de Ab-B incluyendo el péptido señal:
1 M G R L T SS F L L L IV P A Y V L S Q V T L K E S G P G I L Q P S Q T L S L T C S F S G F S L S T
51 SGMGVGWIRH PSG KNLEW LA HIWWDDVKRY N P V L K S R L T I S K D T S N S Q V F
101 L K IA N V D T A D T A T Y Y C A R IE D FD Y D E EY Y A MDYWGQGTSV IV S S A K T T P P 151 S V Y P L A P G S A AQ TNSM VTLG C L V K G Y FPE P V T V T W N SG SL S SG V H T F P A V 201 L Q S D L Y T L S S S V T V P S S T W P SET V T C N V A H P A SST K V D K K IV P R D C G C K P 251 C IC T V P E V S S V F IF P P K P K D V L T IT L T P K V T C V W D I S K D D PEVQ FSW FV 301 DDVEVHTAQT Q P R E E Q F N ST F R S V S E L P IM HQDWLNGKEF K C R V N SA A FP 351 A P I E K T I S K T KGRPKAPQVY T IP P P K E Q M A K D K V SLTC M I T D F F P E D IT V 401 EWQWNGQPAE N Y K NTQ PIM D T D G SY F V Y SK LNVQKSNW EA G N T FT C SV L H 451 EGLHNHHTEK S L S H S P G K (SEQ ID NO:37)
La secuencia de ácido nucleico de HC de Ab-B incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGCAGGC TTACTTCTTC ATTCCTGCTA CTGATTGTCC CTGCATATGT 51 CCTGTCCCAG GTTACTCTGA AAGAGTCTGG CCCTGGGATA TTGCAGCCCT
101 CCCAGACCCT CAGTCTGACT TG TTCTTTCT CTGGGTTTTC ACTGAGCACT
151 TCTGGTATGG GTGTAGGCTG GATTCGTCAC CCATCAGGGA AGAATCTGGA
201 GTGGCTGGCA CACATTTGGT GGGATGATGT CAAGCGCTAT AACCCAGTCC
251 TGAAGAGCCG ACTGACTATC TCCAAGGATA CCTCCAACAG CCAGGTATTC
301 CTCAAGATCG CCAATGTGGA CACTGCAGAT ACTGCCACAT ACTACTGTGC
351 TCGAATAGAG GACTTTGATT ACGACGAGGA GTATTATGCT ATGGACTACT
401 GGGGTCAAGG AACCTCAGTC ATCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA
451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT
501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA
551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC
601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG
651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA
701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT
751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA
801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG
851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA
901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT
951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCAGGACT
1001 GGCTCAATGG CAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC 1101 ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG 1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG 1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC 1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCGT CTACAGCAAG CTCAATGTGC 1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT 1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG 1401 TAAATGA (SEQ IDNO:38)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-B son las siguientes:
CDR-H1: TSGMGVG (SEQ ID NO: 57)
CDR-H2: HIWWDDVKRYNPVLKS (SEQ ID NO: 58)
CDR-H3: EDFDYDEEYYAMDY (SEQ ID NO: 59)
Las secuencias de CDR de región variable de cadena ligera de Ab-B son:
CDR-L1: SASSSVSFVD (SEQ ID NO: 60)
CDR-L2: RTSNLGF (SEQ ID NO: 61)
CDR-L3: QQRSTYPPT (SEQ ID NO: 62)
Los anticuerpos divulgados en el presente documento se unen a regiones de esclerostina humana que son importantes para la actividad in vivo de la proteína. La unión de un anticuerpo con esclerostina puede correlacionarse con aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea conseguida mediante el uso del anticuerpo in vivo tal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y en el Ejemplo 12 (mono). Los aumentos de al menos uno de formación de hueso, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea pueden también conseguirse mediante el uso del anticuerpo in vivo tal como se describe en los Ejemplos 5 y 9 (ratones) y Ejemplo 12 (mono). Puesto que la unión de un anticuerpo con esclerostina se determina principalmente por sus secuencias de CDR, puede generarse un anticuerpo con todas o algunas de las secuencias de CDR divulgadas en un marco apropiado, en donde el anticuerpo conserva la capacidad para unirse específicamente con esclerostina, y puede esperarse conseguir aumentos de, por ejemplo, la densidad mineral ósea. Dichos anticuerpos son útiles en el tratamiento de afecciones humanas o animales que están provocadas por, asociadas con, o dan como resultado al menos uno de baja formación de hueso, baja densidad mineral ósea, bajo contenido mineral óseo, baja masa ósea, baja calidad ósea y baja fuerza ósea. Se conocen por los expertos en la materia métodos para construir y expresar anticuerpos y fragmentos de los mismos que comprenden CDR de la presente divulgación.
La presente divulgación se refiere por lo tanto en un aspecto a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-A, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 51 para CDR-H1, SEQ ID NO: 52 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 53 para CDR-H3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 51 para CDR-H1, SEQ ID NO: 52 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 53 para CDR-H3.
Cuando en anticuerpos está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 54 para CDR-L1, SEQ ID NO: 55 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 56 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 54 para CDR-L1, SEQ ID NO: 55 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 56 para CDR-L3.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-B, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 57 para CDR-H1, SEQ ID NO: 58 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 59 para CDR-H3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 57 para CDR-H1, SEQ ID NO: 58 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 59 para CDR-H3.
Cuando en anticuerpos está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 60 para CDR-L1, SEQ ID NO: 61 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 62 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 60 para CDR-L1, SEQ ID NO: 61 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 62 para CDR-L3.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-C, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 45 para CDR-H1, SEQ ID NO: 46 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 47 para CDR-H3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 45 para CDR-H1, SEQ ID NO: 46 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 47 para CDR-H3.
Cuando en anticuerpos está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 48 para CDR-L1, SEQ ID NO: 49 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 50 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 48 para CDR-L1, SEQ ID NO: 49 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 50 para CDR-L3.
La presente divulgación se refiere además a un anticuerpo aislado, incluyendo Ab-D, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente con esclerostina y en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende al menos una c Dr que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 39 para CDR-H1, SEQ ID NO: 40 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 41 para CDR-H3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena pesada en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 39 para CDR-H1, SEQ ID NO: 40 para CDR-H2 y SEQ ID NO: 41 para CDR-H3.
Cuando en anticuerpos está presente una cadena ligera, la cadena ligera puede ser cualquier cadena complementaria adecuada y puede seleccionarse en particular de una cadena ligera en donde el dominio variable comprende al menos una CDR que tiene las secuencias proporcionadas en SEQ ID NO: 42 para CDR-L1, SEQ ID NO: 43 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 44 para CDR-L3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio variable de cadena ligera en el que las CDR consisten en al menos uno de los péptidos de SEQ ID NO: 42 para CDR-L1, SEQ ID NO: 43 para CDR-L2 y SEQ ID NO: 44 para CDR-L3.
Se describen posteriormente anticuerpos anti-esclerostina adicionales. Para algunas de las secuencias de aminoácidos las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están sombreadas en cajas y las regiones constantes están en negrita y cursiva.
Ab-2
Las secuencias de la LC y HC del Anticuerpo 2 (también denominado Ab-2) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-2:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-2:
1 QIVLSQSPAI LSTSPGEKVT MTCRASSSVY YMHWYQQKPG SSPKPWIYAT
51 SNLASGVPVR FSGSGSGTSY SLTITRVEAE DAATYYCQQW SSDPLTFGAG 101 TKLELKRADA APTVSIFPPSSEQLTSGGAS VVCFLNNFYPKDINVKWKID 151 GSERQNGVLN SWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEA THKTS 201 TSP1VKSFNR NEC (SEQ ID NO:l 17)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-2:
1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTACAT CTCCAGGGGA 51 GAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTATAT TACATGCACT 101 GGTACCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGTTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG 201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCACCAGAGT GGAGGCTGAA GATGCTGCCA 251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG 301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT 351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT 401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT 451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG 501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG 551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA 601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID NO: 118)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-2 incluyendo el péptido señal:
1 MDFQVQIFSF LLISASVIMS RGQIVLSQSP AILSTSPGEK VTMTCRASSS
51 VYYMHWYQQK PGSSPKPWIY ATSNLASGVP VRFSGSGSGT SYSLTITRVE
101 AEDAATYYCQ QWSSDPLTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG 151 AS W C FLN N F YPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL 201 TLTKDEYERH NSYTCEATFIK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO:l 19)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-2 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT
51 CATTATGTCC AGGGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCAATCCTGT 101 CTACATCTCC AGGGGAGAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151 GTATATTACA TGCACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAAACC 201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA 251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAC CAGAGTGGAG 301 GCTGAAGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT 351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC 401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT 451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT 501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT 551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC 601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC 651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG 701 AGTGTTAG (SEQ ID NO: 120)
Cadena Pesada de Ab-2
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-2:
1 EVQVQQSGPE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DYFIHWVKQR PEQGLEWIGR
51 LDPEDGESDY APKFQDKAIM TADTSSNTAY LQLRSLTSED TAIYYCERÉD
101 YDGTYTFFPY WGQGTLVTVS AAKTTPPSVY PLAPGSAAQT NSMVTLGCLV
151KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPA VLQS DLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAHPAS STKVDKK1VP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFIFPPKPKD VLT 251ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDVEVHTAQTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAP1EKTISKTKGR PKAPQVYTIP 351PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPED1TVEWQ WNGQPAENYKNTQPIMDTDG 401SYFIYSKLNV QKSNWEA GNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID NO: 121)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-2:
1 GAGGTTCAGG TGCAGCAGTC TG G G CCAG AA CTTG TG AAG C CAGGGGCCTC
51 AG TC A A G TTG TCCTG CACAG CTTCTGGCTT C A A C A T T A A A G A C TA C TTTA
101 TACACTG G G T G AAG C AG AG G CCTG AACAG G GCCTGGAGTG G ATTG G AAG G
151 CTTGATCCTG AG G ATG G TG A A A G T G A T T A T GCCCCGAAGT TC C AG G AC AA
201 G G C CATTATG A C A G C A G A C A C ATC ATC C AA C AC AG C C TAT CTTCAG CTCA
251 G AAG CCTG AC ATC TG AG G AC ACTG C C ATC T A T T A T T G T G A G AG AG AG G AC
301 TAC G ATG G TA CCTACACCTT TTTTC C TTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT
351 CACTGTCTCT G C A G C C A A A A CGACACCCCC A TC TG TC TA T CCACTGGCCC
401 CTGGATCTGC TG C C C AAAC T AAC TC C ATG G TGACCCTGGG ATGCCTGGTC 451 AA G G G C TA TT TCCCTGAGCC AG TG AC AG TG AC C TG G AAC T CTGGATCCCT
501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT G ACCTCTACA
551 CTCTGAGCAG CTCAG TG ACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC
601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC A G C AC C AAG G TG G A C A A G A A
651 AATTG TG CCC AG G G ATTG TG GTTG TAAG CC TTG C A TA TG T AC AG TCCCAG
701 A A G TA TC A TC TG TCTTCATC TTCCCCCCAA A G C C C AAG G A TGTGCTCACC
751 A TTA C TC TG A CTCCTAAG G T CACGTGTGTT G TG G TAG AC A TC AG C AAG G A
801 TGATCCCG AG G TCCAG TTCA GCTGGTTTGT A G A TG A TG TG GAG G TG CACA
851 CAG CTCAG AC GCAACCCCGG G AG G AG CAG T TC AAC AG C AC TTTCCGCTCA
901 G TCAG TG AAC TTC C C ATC AT G CACCAGGAC TG G CTCAATG G CAAG G AG TT
951 C A AATG C AG G G TC AAC AG TG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC G A G A A A A C C A
1001 TC TC C A A A A C C A A A G G C A G A CCGAAGGCTC CACAG G TG TA CACCATTCCA
1051 CCTCCCAAGG AG CAG ATG G C C A A G G A T A A A G TCAG TCTG A CCTG CATG AT
1101 A A C A G A C TTC TTCCCTG AAG A C A TTA C TG T G GAGTGGCAG TGGAATGGGC
1151 AGCCAG CG G A G A A C TA C A A G A A C AC TC AG C C C ATCATG G A CACAGATGGC
1201 TC TTAC TTC A TC TA C A G C A A G CTCAATG TG C A G A A G A G C A ACTGGGAGGC
1251 A G G A A A T A C T TTCACCTGCT CTG TG TTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC
1301 A T A C T G A G A A GAGCCTCTCC CACTCTCCTG G T A A A T G A (SEQ ID NO:122)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-2 incluyendo el péptido señal:
1 MKCSWVIFFL M A W T G V N SE VQVQQSGPEL VKPGASVKLS CTASGFNIKD
51 YFIHWVKQRP EQGLEWIGRL DPEDGESDYA PKFQDKAIMT ADTSSNTAYL 101 QLRSLTSEDT AIYYCEREDY DGTYTFFPYW GQGTLVTVSA AKTTPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT 251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCW VDISKDDPEV QFSWFVDDVE 301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCM TDFF PEDITVEWQW 401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLFI 451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID NO: 123)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-2 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT
51 CAATTCAGAG GTTCAGGTGC AGCAGTCTGG GCCAGAACTT GTGAAGCCAG
101 GGGCCTCAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCAA CATTAAAGAC
151 TACTTTATAC ACTGGGTGAA GCAGAGGCCT GAACAGGGCC TGGAGTGGAT 201 TGGAAGGCTT GATCCTGAGG ATGGTGAAAG TGATTATGCC CCGAAGTTCC 251 AGGACAAGGC CATTATGACA GCAGACACAT CATCCAACAC AGCCTATCTT 301 CAGCTCAGAA GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ATTGTGAGAG 351 AGAGGACTAC GATGGTACCT ACACCTTTTT TCCTTACTGG GGCCAAGGGA 401 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA 451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG
501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG
551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC
601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG
651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG
701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA
751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT
801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA
851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG 901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT
951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA
1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG 1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC 1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT 1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG 1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC 1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT 1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC 1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQ ID NO: 124)
Ab-3
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 3 (también denominado en el presente documento Ab-3) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-3
Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-3:
1 EIVLTQSPAL M AASPGEKVT1TCSVSSTIS SNHLHWFQQK SDTSPKPWIY
51 GTSNLÁSGVP VRFSGSGSGT SYSLTISSME AEDAATYYCQ QWSSYPLTFG 101 AGTKLELR&4 DAAPTVSIFP PSSEOLTSGG ASVVCFLNNF YPKDINVKWK 151IDGSERQNGVLNSWTDODSKDSTYSMSSTL TLTKDEYERHNSYTCEATHK 201 TSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 125)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-3:
1 GAAATTGTGC TCACCCAGTC TCCAGCACTC ATGGCTGCAT CTCCGGGGGA
51 GAAGGTCACC ATCACCTGCA GTGTCAGTTC AACTATAAGT TCCAACCACT
101 TGCACTGGTT CCAGCAGAAG TCAGACACCT CCCCCAAACC CTGGATTTAT 151 GGCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GTTCGCTTCA GTGGCAGTGG 201 ATCTGGGACC TCTTATTCTC TCACAATCAG CAGCATGGAG GCTGAGGATG 251 CTGCCACTTA TTACTGTCAA CAGTGGAGTA GTTACCCACT CACGTTCGGC 301 GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAGACGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC 351 CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG 401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG 451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA 501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA 551 AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG 601 ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGTTAG (SEQ ID NO: 126)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-3 incluyendo el péptido señal:
SGEIVLTQSP ALMAASPGEK YTITCSVSST
5 1 ISSNHLHWFQ QKSDTSPKPWIYGTSNLASG VPVRFSGSGS GTSYSLTISS
101 MEAEDAATYY CQQWSSYPLT FGAGTKLELR RADAAPTVSIFPPSSEQLTS 151 G G A SW C FLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS 201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID NO:127)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-3 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGATTTTC ATGTGCAGAT TTTCAGCTTC ATGCTAATCA GTGTCACAGT
51 CATTTTGTCC AGTGGAGAAA TTGTGCTCAC CCAGTCTCCA GCACTCATGG 101 CTGCATCTCC GGGGGAGAAG GTCACCATCA CCTGCAGTGT CAGTTCAACT 151 ATAAGTTCCA ACCACTTGCA CTGGTTCCAG CAGAAGTCAG ACACCTCCCC 201 CAAACCCTGG ATTTATGGCA CATCCAACCT GGCTTCTGGA GTCCCTGTTC 251 GCTTCAGTGG CAGTGGATCT GGGACCTCTT ATTCTCTCAC AATCAGCAGC 301 ATGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC TGTCAACAGT GGAGTAGTTA 351 CCCACTCACG TTCGGCGCTG GGACCAAGCT GGAGCTGAGA CGGGCTGATG 401 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT 451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT 501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA 551 ACAGTTGGAC TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC 601 ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA CGACATAACA GCTATACCTG 651 TGAGGCCACT CACAAGACAT CAACTTCACC CATTGTCAAG AGCTTCAACA 701 GGAATGAGTG TTAG (SEQ ID NO: 128)
Cadena pesada de Ab-3
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -3 :
1 EVQLQQSGAE LVRPGALVKL SCTASDFNIK DFYLHWMRQR PEQGLDWIGR
51 ÍDPENGDTLY DPKFQDKATL TTDTSSNTAY LQLSGLTSET TAVYYCSREA
101 DYFHDGTS Y W YFDVWGAGTTITVSSAKTTP PSVYPLAPGS AAQTNSMVTL 151 GCL VKGYFPE PVTVTWNSGS LSSGVHTFPÁ VLOSDLYTLS SSVTVPSSTW 201PSETVTCNVA HPASSTKVDKK1VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPK 251DVLTITLTPK VTCl'YVDISKDDPEVQFSWF VDDVEVHTAQ TQPREEQFNS 301 TFRSVSELPIMHQDWLNGKE FKCRVNSAAFPAPIEKTISK TKGRPKAPQV 351 YTIPPPKEQMAKDKVSLTCM1TDFFPEDIT VEWQWNGQPA ENYKNTQPIM 401DTDGSYFIYS KLNVOKSNWE A GNTFTCSVL HEGLHNHHTE KSLSHSPGK (SEQ ID NO: 129)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-3:
1 GAGGTTCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCTGAA CTTGTGAGGC CAGGGGCCTT
51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC
101 TACACTGGAT GAGGCAGCGG CCTGAACAGG GCCTGGACTG GATTGGAAGG
151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA
201 GGCCACTCTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC CTGCAGCTCA 251 GCGGCCTGAC ATCTGAGACC ACTGCCGTCT ATTACTGTTC TAGAGAGGCG 301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCGC 351 AGGGACCACA ATCACCGTCT CCTCAGCCAA AACGACACCC CCATCTGTCT 401 ATCCACTGGC CCCTGGATCT GCTGCCCAAA CTAACTCCAT GGTGACCCTG 451 GGATGCCTGG TCAAGGGCTA TTTCCCTGAG CCAGTGACAG TGACCTGGAA 501 CTCTGGATCC CTGTCCAGCG GTGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTGCAGT
• r 5 'fi5ní!1 MH Cir nT.m»G »•AC .m uC i imT i»CT t i A i | C ..u tAa CTCTGAGC AGCTCAGTGA CTGTCCCCTC CAGCACCTGG
601 CCCAGCGAGA CCGTCACCTG CAACGTTGCC CACCCGGCCA GCAGCACCAA
651 GGTGGACAAG AAAATTGTGC CCAGGGATTG TGGTTGTAAG CCTTGCATAT
701 GTACAGTCCC AGAAGTATCA TCTGTCTTCA TCTTCCCCCC AAAGCCCAAG 751 GATGTGCTCA CCATTACTCT GACTCCTAAG GTCACGTGTG TTGTGGTAGA
801 CATCAGCAAG GATGATCCCG AGGTCCAGTT CAGCTGGTTT GTAGATGATG
851 TGGAGGTGCA CACAGCTCAG ACGCAACCCC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC
901 ACTTTCCGCT CAGTCAGTGA ACTTCCCATC ATGCACCAGG ACTGGCTCAA
951 TGGCAAGGAG TTCAAATGCA GGGTCAACAG TGCAGCTTTC CCTGCCCCCA
1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGCA GACCGAAGGC TCCACAGGTG 1051 TACACCATTC CACCTCCCAA GGAGCAGATG GCCAAGGATA AAGTCAGTCT 1101 GACCTGCATG ATAACAGACT TCTTCCCTGA AGACATTACT GTGGAGTGGC 1151 AGTGGAATGG GCAGCCAGCG GAGAACTACA AGAACACTCA GCCCATCATG 1201 GACACAGATG GCTCTTACTT CATCTACAGC AAGCTCAATG TGCAGAAGAG 1251 CAACTGGGAG GCAGGAAATA CTTTCACCTG CTCTGTGTTA CATGAGGGCC 1301 TGCACAACCA CCATACTGAG AAGAGCCTCT CCCACTCTCC TGGTAAATGA (SEQ ID NO: 130)
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -3 in c lu y e n d o e l p é p tid o s e ñ a l:
1 MKCSWYIFFL M A W TG V N SE VQLQQSGAEL VRPGALVKLS CTASDFNIKD
51 FYLHWMRQRP EQGLDWIGRIDPENGDTLYD PKFQDKATLT TDTSSNTAYL 101 QLSGLTSETT AVYYCSREAD YFHDGTSYWY FDVWGAGTTITVSSAKTTPP 151 SVYPLAPGSA AQTNSMVTLG CLVKGYFPEP VTVTWNSGSL SSGVHTFPAV 201 LQSDLYTLSS SVTVPSSTWP SETVTCNVAH PASSTKVDKKIVPRDCGCKP 251 CICTVPEVSS VFIFPPKPKD VLTITLTPKV T C V W D ISK D DPEVQFSWFV 301 DDVEVHTAQT QPREEQFNST FRSVSELPIM PIQDWLNGKEF KCRVNSAAFP 351 APIEKTISKT KGRPKAPQVY TIPPPKEQMA KDKVSLTCMITDFFPEDITV 401 EWQWNGQPAE NYKNTQPIMD TDGSYFIYSK LNVQKSNWEA GNTFTCSVLH 451 EGLHNHHTEK SLSHSPGK (SEQ ID NO:131)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-3 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT 51 CAATTCAGAG GTTCAGCTGC AGCAGTCTGG GGCTGAACTT GTGAGGCCAG 101 GGGCCTTAGT CAAGTTGTCC TGCACAGCTT CTGACTTCAA CATTAAAGAC 151 TTCTATCTAC ACTGGATGAG GCAGCGGCCT GAACAGGGCC TGGACTGGAT 201 TGGAAGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TTTATATGAC CCGAAGTTCC 251 AGGACAAGGC CACTCTTACA ACAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTG 301 CAGCTCAGCG GCCTGACATC TGAGACCACT GCCGTCTATT ACTGTTCTAG 351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG ATGGTACCTC CTACTGGTAC TTCGATGTCT 401 GGGGCGCAGG GACCACAATC ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCCCCA 451 TCTGTCTATC CACTGGCCCC TGGATCTGCT GCCCAAACTA ACTCCATGGT 501 GACCCTGGGA TGCCTGGTCA AGGGCTATTT CCCTGAGCCA GTGACAGTGA 551 CCTGGAACTC TGGATCCCTG TCCAGCGGTG TGCACACCTT CCCAGCTGTC 601 CTGCAGTCTG ACCTCTACAC TCTGAGCAGC TCAGTGACTG TCCCCTCCAG 651 CACCTGGCCC AGCGAGACCG TCACCTGCAA CGTTGCCCAC CCGGCCAGCA 701 GCACCAAGGT GGACAAGAAA ATTGTGCCCA GGGATTGTGG TTGTAAGCCT 751 TGCATATGTA CAGTCCCAGA AGTATCATCT GTCTTCATCT TCCCCCCAAA 801 GCCCAAGGAT GTGCTCACCA TTACTCTGAC TCCTAAGGTC ACGTGTGTTG 851 TGGTAGACAT CAGCAAGGAT GATCCCGAGG TCCAGTTCAG CTGGTTTGTA 901 GATGATGTGG AGGTGCACAC AGCTCAGACG CAACCCCGGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACT TTCCGCTCAG TCAGTGAACT TCCCATCATG CACCÁGGACT
1001 GGCTÜÁAfG&'tAAGGAGTTC AAATGCAGGG TCAACAGTGC AGCTTTCCCT 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGCAGAC CGAAGGCTCC 1101ACAGGTGTAC ACCATTCCAC CTCCCAAGGA GCAGATGGCC AAGGATAAAG 1151 TCAGTCTGAC CTGCATGATA ACAGACTTCT TCCCTGAAGA CATTACTGTG 1201 GAGTGGCAGT GGAATGGGCA GCCAGCGGAG AACTACAAGA ACACTCAGCC 1251 CATCATGGAC ACAGATGGCT CTTACTTCAT CTACAGCAAG CTCAATGTGC 1301 AGAAGAGCAA CTGGGAGGCA GGAAATACTT TCACCTGCTC TGTGTTACAT 1351 GAGGGCCTGC ACAACCACCA TACTGAGAAG AGCCTCTCCC ACTCTCCTGG 1401 TAAATGA (SEQ ID NO: 132)
Ab-4
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 4 (también denominado en el presente documento Ab-4) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-4
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-4:
1 DIQMTQITSS LSASLGDRVSISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY
51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIKX4D ÁAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFYPKDINVKWKI 151DGSERQNGVL NSWTDODSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEA THKT 201STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO:133)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-4:
1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA
51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA
101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC 151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA c a a c t t c t a c c c c a a a g a c a t c a a t g t c a a GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 134)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-4 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS
51 NYLNWYQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSW TDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 135)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-4 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 101 CTCTGGGAGA CÁGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TC AATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID NO: 136)
Cadena Pesada de Ab-4
Secuencias de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKTLEWIGE
5 1 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG
101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC
151LVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201ETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV 251LTITLTPKVT CVWD1SKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAOTQ PREEQFNSTF 301RSVSELP1MH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 3511PPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPED1TVE WOWNGOPAEN YKNTQPIMDT 401DGSYF1YSKL NVQKSNWEA G NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID NO: 137)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-4:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA
101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGAGTG GATAGGAGAA
151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA
201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC
251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC
301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC
351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC
401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC
451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG
501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC
551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC
601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA
651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG
701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG
751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG
801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG
851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC
901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA
951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA
1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC
1051 ATTCCAC cT cf Cb AAGGAGC A GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG
1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA
1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA
1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG
1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA
1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID
NO: 138)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-4 incluyendo el péptido señal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD
51 YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEINPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTC V W D ISK D D P EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 35 1 IEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO: 139)
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la H C d e A b -4 in c lu y e n d o la s e c u e n c ia c o d if ic a n te d e l p é p tid o s e ñ a l:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGAGTGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG
1401 A (SEQ ID NO: 140)
Ab-4 se humanizó para generar Ab-5.
Ab-5
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 5 (también denominado en el presente documento Ab-5) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-5
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-5:
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCRASQDIS NYLNW YQQKP GKAPKLLIYY
51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKVEIKJ?TVAAPSVFÍFPP SDEQLKSGTA SW C LLN N F Y PREAKVQWKV 1 51DNÁLQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQG 2 01 LSSPVTKSFN RGEC (SEQ ID NO:141)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-5:
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA
51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA
101 ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT
151 ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC
201 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATTTCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG
251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC
301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA ACGTACGGTG GCTGCACCAT CTGTCTTCAT
351 CTTCCCGCCA TCTGATGAGC AGTTGAAATC TGGAACTGCC TCTGTTGTGT
401 GCCTGCTGAA TAACTTCTAT CCCAGAGAGG CCAAAGTACA GTGGAAGGTG
451 GATAACGCCC TCCAATCGGG TAACTCCCAG GAGAGTGTCA CAGAGCAGGA • 501 CAGCAAGGAC AGCACCTACA GCCTC AGCAG CACCCTGACG CTGAGCAAAG 551 CAGACTACGA GAAACACAAA GTCTACGCCT GCGAAGTCAC CCATCAGGGC
601 CTGAGCTCGC CCGTCACAAA GAGCTTCAAC AGGGGAGAGT GT (SEQ ID
NO: 142)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-5 incluyendo el péptido señal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQD
5 1 ISNYLNW YQQ KPGKAPKLLIYYTSRLLSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQGDTLPYTF GGGTKVEIKR TVAAPSVFIF PPSDEQLKSG 151 T A SW C L L N N FYPREAKVQW KVDNALQSGN SQESVTEQDS KDSTYSLSST 201 LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 143)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-5 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT
51 CCGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT
101 CCGCATCCGT AGGCGACCGC GTAACCATAA CATGTAGAGC ATCTCAAGAT 151 ATTTCCAACT ATTTGAATTG GTACCAACAA AAACCCGGCA AAGCACCTAA 201 ACTCCTCATT TACTATACAT CAAGACTCCT CTCCGGCGTT CCATCACGAT 251 TCTCAGGCTC CGGCTCCGGC ACAGATTTCA CACTCACTAT TTCCTCCCTC 301 CAACCAGAAG ATTTTGCAAC CTATTACTGT CAACAAGGCG ATACACTCCC 351 ATACACATTC GGCGGCGGCA CAAAAGTTGA AATTAAACGT ACGGTGGCTG 401 CACCATCTGT CTTCATCTTC CCGCCATCTG ATGAGCAGTT GAAATCTGGA 451 ACTGCCTCTG TTGTGTGCCT GCTGAATAAC TTCTATCCCA GAGAGGCCAA
Figure imgf000042_0001
Cadena Pesada de Ab-5
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la H C d e A b -5 :
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE
5 1 INPNSGGAGY NQKFKGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG
101 YDDIYDDWYF DVWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC
151LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSS WTVPSSNFG 201 TQTYTCNVDHKPSNTKVDKT VERKCCVECPIPCPAPPVAGP SVFLFPPKPK 251DTLMISRTPE VTC\/ W D VSH EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 TFRWSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAP1EKT1SK TKGQPREPQV 351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL WGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 401DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 145)
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5 sin lisina carboxi-terminal:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE
51 INPNSGGAGY NQKFKGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG
101 YDDIYDDWYF DVWGQGTTVT VSSASTKGPS VFPLAPCSRS TSESTAALGC 151 LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS WTVPSSNFG 201 TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECPPCPAPPVAGP SVFLFPPKPK 251 DTLMISRTPE VTCWl'DVSH EDPEVQFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQFNS 301 TFRWSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL PAPIEKTISK TKGQPREPQV 351 YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE NNYKTTPPML 401 DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPG (SEQ
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-5:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTAAAAAAAC CAGGAGCAAG 51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA TACATTTACA GATTACAACA 101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATTGGAATG GATGGGCGAA 151 ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC AATCAAAAAT TCAAAGGGAG 201 AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC AACAGCATAT ATGGAACTGC 251 GATCACTTAG AAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACTATTGCGC ACGACTTGGG 301 TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GATGTTTGGG GCCAGGGAAC 351 AACAGTTACC GTCTCTAGTG CCTCCACCAA GGGCCCATCG GTCTTCCCCC 401 TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC CCTGGGCTGC 451 CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT GGAACTCAGG 501 CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA CAGTCCTCAG 551 GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG CAACTTCGGC 601 ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGGT 651 GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA CCGTGCCCAG 701 CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG 751 GACÁCCfif C X f(jATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG TGGTGGTGGA 801 CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCG 851 TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA GTTCAACAGC 901 ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG ACTGGCTGAA 951 CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC CCAGCCCCCA 1001 TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG 1051 TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC AGGTCAGCCT 1101 GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC GTGGAGTGGG 1151 AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC TCCCATGCTG 1201 GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG 1251 CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC 1301 TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAA (SEQ ID NO: 146)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-5 incluyendo el péptido señal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD 51 YNMHWVRQAP GQGLEWMGEINPNSGGAGYN QKFKGRVTMT TDTSTSTAYM 101 ELRSLRSDDT AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGQGTTVTV SSASTKGPSV 151 FPLAPCSRST SESTAALGCL VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ 201 SSGLYSLSSV VTVPSSNFGT QTYTCNVDHK PSNTKVDKTV ERKCCVECPP 251 CPAPPVAGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVW DVSH E DPEVQFNWYV 301 DGVEVHNAKT KPREEQFNST F R W S V L T W HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP 351 APIEKTISKT KGQPREPQVY TLPPSREEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV 401 EWESNGQPEN NYKTTPPMLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH 451 EALPINHYTQK SLSLSPGK(SEQ IDNO:147)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-5 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC
51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG CGCCGAGGTA AAAAAACCAG 101 GAGCAAGCGT TAAAGTTTCT TGTAAAGCAA GCGGATATAC ATTTACAGAT 151 TACAACATGC ATTGGGTAAG ACAAGCGCCA GGACAAGGAT TGGAATGGAT 201 GGGCGAAATT AACCCTAATA GTGGAGGAGC AGGCTACAAT CAAAAATTCA 251 AAGGGAGAGT TACAATGACA ACAGACACAA GCACTTCAAC AGCATATATG 301 GAACTGCGAT CACTTAGAAG CGACGATACA GCTGTATACT ATTGCGCACG 351 ACTTGGGTAT GATGATATAT ATGATGACTG GTATTTCGAT GTTTGGGGCC 401 AGGGAACAAC AGTTACCGTC TCTAGTGCCT CCACCAAGGG CCCATCGGTC 451 TTCCCCCTGG CGCCCTGCTC CAGGAGCACC TCCGAGAGCA CAGCGGCCCT 501 GGGCTGCCTG GTCAAGGACT ACTTCCCCGA ACCGGTGACG GTGTCGTGGA 551 ACTCAGGCGC TCTGACCAGC GGCGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTACAG 601 TCCTCAGGAC TCTACTCCCT CAGCAGCGTG GTGACCGTGC CCTCCAGCAA 651 CTTCGGCACC CAGACCTACA CCTGCAACGT AGATCACAAG CCCAGCAACA 701 CCAAGGTGGA CAAGACAGTT GAGCGCAAAT GTTGTGTCGA GTGCCCACCG 751 TGCCCAGCAC CACCTGTGGC AGGACCGTCA GTCTTCCTCT TCCCCCCAAA 801 ACCCAAGGAC ACCCTCATGA TCTCCCGGAC CCCTGAGGTC ACGTGCGTGG 851 TGGTGGACGT GAGCCACGAA GACCCCGAGG TCCAGTTCAA CTGGTACGTG 901 GACGGCGTGG AGGTGCATAA TGCCAAGACA AAGCCAC GGG AGGAGCAGTT 951 CAACAGCACG TTCCGTGTGG TCAGCGTCCT CACCGTTGTG CACCAGGACT 1001 GGCTGAACGG CAAGGAGTAC AAGTGCAAGG TCTCCAACAA AGGCCTCCCA 1051 GCCCCCATCG AGAAAACCAT CTCCAAAACC AAAGGGCAGC CCCGAGAACC
"1 l'OÍ'AC AGGTGfXÜ ÁCCCTGCCCC CATCCCGGGA GGAGATGACC AAGAACCAGG 1151 TCAGCCTGAC CTGCCTGGTC AAAGGCTTCT ACCCCAGCGA CATCGCCGTG 1201 GAGTGGGAGA GCAATGGGCA GCCGGAGAAC AACTACAAGA CCACACCTCC 1251 CATGCTGGAC TCCGACGGCT CCTTCTTCCT CTACAGCAAG CTCACCGTGG 1301 ACAAGAGCAG GTGGCAGCAG GGGAACGTCT TCTCATGCTC CGTGATGCAT 1351 GAGGCTCTGC ACAACCACTA CACGCAGAAG AGCCTCTCCC TGTCTCCGGG 1401 TAAA (SEQ ID NO: 148)
Dominios variables de Ab-5:
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):
1 DIQM TQSPSS LSA SV G D R V T ITCRASQDÍS N YLNW YQ Q K P GKAPKLLIYY 51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKVEIK (SEQ ID NO :376)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-5 (sin secuencia señal):
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCCGCAT CCGTAGGCGA 51 CCGCGTAACC ATAACATGTA GAGCATCTCA AGATATTTCC AACTATTTGA 101 ATTGGTACCA ACAAAAACCC GGCAAAGCAC CTAAACTCCT CATTTACTAT 151 ACATCAAGAC TCCTCTCCGG CGTTCCATCA CGATTCTCAG GCTCCGGCTC 201 CGGCACAGAT TTCACACTCA CTATTTCCTC CCTCCAACCA GAAGATTTTG 251 CAACCTATTA CTGTCAACAA GGCGATACAC TCCCATACAC ATTCGGCGGC 301 GGCACAAAAG TTGAAATTAA A (SEQ ID NO:377)
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e d o m in io v a r ia b le d e la c a d e n a p e s a d a d e A b -5 (s in s e c u e n c ia s e ñ a l) :
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYNMHWVRQA PGQGLEWMGE 51 INPNSGGAGY NQKFKCjRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARLG 101 ;YDDIYDDWYF DVWGQGTTVT VSS (SEQ ÍD NO:378)
La secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-5 (sin secuencia señal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTAAAAAAAC CAGGAGCAAG
51 CGTTAAAGTT TCTTGTAAAG CAAGCGGATA TACATTTACA GATTACAACA 101 TGCATTGGGT AAGACAAGCG CCAGGACAAG GATTGGAATG GATGGGCGAA 151 ATTAACCCTA ATAGTGGAGG AGCAGGCTAC AATCAAAAAT TCAAAGGGAG 201 AGTTACAATG ACAACAGACA CAAGCACTTC AACAGCATAT ATGGAACTGC 251 GATCACTTAG AAGCGACGAT ACAGCTGTAT ACTATTGCGC ACGACTTGGG 301 TATGATGATA TATATGATGA CTGGTATTTC GATGTTTGGG GCCAGGGAAC 351 AACAGTTACC GTCTCTAGT (SEQ ID NO:379)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-5 son las siguientes:
CDR-H1: DYNMH (SEQ ID NO: 245)
CDR-H2: EINPNSGGAGYNQKFKG (SEQ ID NO: 246)
CDR-H3: LGYDDIYDDWYFDV (SEQ ID NO: 247)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-5 son:
CDR-L1: RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 78)
CDR-L2: YTSRLLS (SEQ ID NO: 79)
CDR-L3: QQGDTLPYT (SEQ ID NO: 80)
Ab-6
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 6 (también denominado en el presente documento Ab-6) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-6
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-6:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVTISCRASQDIS NYLÑWFQQKP DGTLKLLIFY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIR&42) AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 149)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-6:
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA
51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA
101 ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT GATCTTCTAC
151 ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC
201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA GAAGATATTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGGGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 150)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-6 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVTISCRASQDIS 51 NYLNWFQQKP DGTLKLLIFY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ 101 EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIRRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKW KIDGSERQNGVL NSW TDQDSKD STYSMSSTLT
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-6 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTTTCA GCAGAAACCA GATGGAACTC TTAAACTCCT 201 GATCTTCTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTTCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC 351 GTTCGGGGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAG ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID NO: 152)
Cadena Pesada de Ab-6
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-6:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKSLEWIGE
5 1 INPNSGGSGY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARLV
101 YDGSYEDWYF DVWGAGTTVT VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151 LVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201 ETVTCNVAHPASSTKVDKKI VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV 251 LTITLTPKVT CVVVD1SKDD PEVQFSWFVD D VEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPOVYT 351IPPPKEQMAK DKVSL TCMIT DFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEAGNTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID NO: 153)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-6:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA
101 TGCACTGGGT GAAACAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAGTG GATAGGAGAA
151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TAGTGGCTAC AACCAAAAGT TCAAAGGCAA
201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCTTCCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGTC 301 TACGATGGCA GCTACGAGGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG S5 I u •( M : M . M ¡< ■ 1 ( ’A l i.-U ■( K A A O U 'C ,( ¡( ¡ A( H ¡ A l ,( ' U A H A A l"AC ,1 A ( ■ I 1 K
'^ f^ d T é ^ S W Á é T G A A C T T C C CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA
951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA
1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID NO: 154)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-6 incluyendo el péptido señal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQNQ GKSLEWIGEINPNSGGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLVY DGSYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP RÉEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO: 155)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-6 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG
101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC
151 TACAACATGC ACTGGGTGAA ACAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAGTGGAT
201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTAG TGGCTACAAC CAAAAGTTCA
251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CTTCCAGCAC AGCCTACATG
301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG
351 ATTGGTCTAC GATGGCAGCT ACGAGGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG
401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC
451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT
501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA
551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG
601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG
651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA
701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA
751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA
801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG
851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT
901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG
951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA
1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG
iB'T''G'GacACáü^ti,ggctcttact tcatctacag caagctcaat gtgcagaaga 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC
1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG
1401 A (SEQ ID NO: 156)
Ab-7
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 7 (también denominado en el presente documento Ab-7) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-7
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-7:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVTICCRASQVIT NYLYW YQQKP DGTFKLLIYY
51 TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIKR4D AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFY PKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 157)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-7:
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA
51 CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGGCAAGTCA GGTCATTACC AATTATTTAT
101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT GATCTACTAC 151 ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAG GAAGATATTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ ID NO: 158)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-7 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ICCRASQVIT 51 NYLYW YQQKP DGTFKLLIYY TSRLHSGVPS RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ 101 EDIATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSW TDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ IDN O :159)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-7 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCTGTTGCA GGGCAAGTCA GGTCATTACC 151 AATTATTTAT ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 GATCTACTAC ACATCAAGAT TACACTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTAGCAA CCTGGAACAG 301 GAAGATATTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC
''35,1,í'GTTCGGiAG'GG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT C a d e n a P e s a d a d e A b -7
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWMKQN QGKSLEWIGE
51 TNPNSGGAGY NQQFKGKATL TVDKSSRTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG
101 YVGNYEDWYF DVWGAGTTVT VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151L VKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPA VL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201 ETVTCNVAHPASSTKVDKKI VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV 251LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD D VEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CR VNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351IPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE WOWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401 DGSYF1YSKL NVQKSNWEAGNTFTCSVLHE GLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-7:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA 101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAATG GATAGGAGAA 151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGCAGT TCAAAGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG GACAGCCTAC ATGGAGCTCC 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC 301 TACGTTGGTA ATTACGAGGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC 351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC 401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC 451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG 501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC 551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC 601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA 651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG 701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG 751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG 801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG 851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC 901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA 951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA
.... ¡3 ot A'CCACCATAC'TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA A (SEQ ID NO: 162)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-7 incluyendo el péptido señal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD
51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEINPNSGGAGYN QQFKGKATLT VDKSSRTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY VGNYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 35 1 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO: 163)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-7 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAGCTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG
101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC
151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAATGGAT
201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGCAGTTCA
251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCAGGAC AGCCTACATG
301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG
351 ATTGGGCTAC GTTGGTAATT ACGAGGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG
401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC
451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT
501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA
551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG
601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG
651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA
701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA
751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA
801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG
851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT
901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG
951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA
1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAA (SEQ ID NO: 164)
Ab-8
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 8 (también denominado en el presente documento Ab-8) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-8
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-8:
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRÁSQDIS NYLNWYQQKP DGTFKLLIFÍY
51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTÍYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIK/L4.D AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SW CFLNNFYPKDINVKW KI 151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLT LTKDEYERHN SYTCEA THKT 201STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 165)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-8:
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA
51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA
101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC
151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC
201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-8 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS 51 NYLNW YQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SW C F L N N FY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSW TDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 167)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-8 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID NO: 168)
C a d e n a P e s a d a d e A b -8
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-8:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKTLDWIGE
51 JNPNSGGAGY NQKJFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG
101 YDD1YDDWYF DYWGAGTTVT VSSAICTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151 LVKGYFPEPV TVTWNSGSLS SGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201 ETVTCNVAHPASSTKVDKKI VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV 251 LTITLTPKVT CVVVDISKDD PEVQFSWFVD D VEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRmSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351IPPPKEQMAKDKVSL TCMITDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEAGNTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID NO: 169)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-8:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA
101 TGCACTGGGT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA CCCTAGACTG GATAGGAGAA
151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA
201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC
251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC
301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC
351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC
401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC
451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG
501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC
551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC
601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA
651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG
701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG
751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG
801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG
851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC
901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA
951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA
1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC
1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG
1101 CATO ATA ACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID NO: 170)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-8 incluyendo el péptido señal:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD 51 YNMHWVKQNQ GKTLDWIGEINPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 'J 20rsb Y yfL ^ isiiv 'W p SST W P SE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI
251 CTVPEVSSVFIFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD
301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP
3 51 IEKTISKTKG RPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW
401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO: 171)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-8 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGACTGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG
Ab-9
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 9 (también denominado en el presente documento Ab-9) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-9
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la LC d e A b -9 :
1 DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS ÑYLNW YQQKP DGTFKLLIFY
51 TSRLFSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKVEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFYPKDINVKWKI 151 DGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT 201STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 173)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-9:
1 GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA
51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA
101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC
151 ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC
201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT 451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GT (SEQ ID
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-9 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQITSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS
51 NYLNW YQQKP DGTFKLLIFY TSRLFSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKVEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSW TDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 175)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-9 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAT TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ATTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TATTTTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAGG TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GT (SEQ ID NO: 176)
C a d e n a P e s a d a d e A b -9
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-9:
1 EVQLQQSGPE LMKPGTSVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQT QGKTLEWIGE
5 1 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCAKLG 101 YDDIYDDWYF DVWGAGTTVT VSSAKTTAPS VYPLAPVCGD TTGSSVTLGC 151 LVKGYFPEPV TLTWNSGSLS SDVHTFPALL QSGLYTLSSS VTVTTWPSQT 201ITCNVAHPAS STKVDKKIEP RGSPTHKPCP PCPAPNLLGG PSVFIFPPKI 251 KDVLMISLSPMVTCWVDVS EDDPDVHVSWFVNNVEVHTA QTQTHREDYN
301 STIR VÍ'SALP ÍQHQD WMSGKEFKCKVNNKA LPAPIERTIS KPKGPVRAPQ 351 VYVLPPPEEE MTKKQVTLTCMITDFMPEDIYVEWTNNGQTELNYKNTEPV 401 LDSDGSYFMYSKLRVEKKNW VERNSYSCSV VHEGLHNHHT TKSFSRTPGK
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-9:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGACTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA
101 TGCACTGGGT GAAGCAGACC CAAGGAAAGA CCCTAGAGTG GATAGGAGAA
151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA
201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC
251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAAATTGGGC
301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC
351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACAAC AGCCCCATCG GTCTATCCAC
401 TGGCCCCTGT GTGTGGAGAT ACAACTGGCT CCTCGGTGAC TCTAGGATGC
451 CTGGTCAAGG GTTATTTCCC TGAGCCAGTG ACCTTGACCT GGAACTCTGG
501 ATCCCTGTCC AGTGATGTGC ACACCTTCCC AGCTCTCCTG CAGTCTGGCC
551 TCTACACCCT CAGCAGCTCA GTGACTGTAA CCACCTGGCC CAGCCAGACC
601 ATCACCTGCA ATGTGGCCCA CCCGGCAAGC AGCACCAAAG TGGACAAGAA
651 AATTGAGCCC AGAGGGTCCC CAACACATAA ACCCTGTCCT CCATGCCCAG
701 CTCCTAACCT CTTGGGTGGA CCATCCGTCT TCATCTTCCC TCCAAAGATC
751 AAGGATGTAC TCATGATCTC CCTGAGCCCC ATGGTCACGT GTGTGGTGGT
801 GGATGTGAGC GAGGATGACC CAGATGTCCA TGTCAGCTGG TTCGTGAACA
851 ACGTGGAAGT ACACACAGCT CAGACACAAA CCCATAGAGA GGATTACAAC
901 AGTACTATCC GGGTGGTCAG TGCCCTCCCC ATCCAGCACC AGGACTGGAT
951 GAGTGGCAAG GAGTTCAAAT GCAAGGTCAA CAACAAAGCC CTCCCAGCGC
1001 CCATCGAGAG AACCATCTCA AAACCCAAAG GGCCAGTAAG AGCTCCACAG 1051 GTATATGTCT TGCCTCCACC AGAAGAAGAG ATGACTAAGA AACAGGTCAC 1101 TCTGACCTGC ATGATCACAG ACTTCATGCC TGAAGACATT TACGTGGAGT 1151 GGACCAACAA CGGGCAAACA GAGCTAAACT ACAAGAACAC TGAACCAGTC 1201 CTGGACTCTG ATGGTTCTTA CTTCATGTAC AGCAAGCTGA GAGTGGAAAA 1251 GAAGAACTGG GTGGAAAGAA ATAGCTACTC CTGTTCAGTG GTCCACGAGG 1301 GTCTGCACAA TCACCACACG ACTAAGAGCT TCTCCCGGAC TCCGGGTAAA (SEQ ID NO: 178)
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -9 in c lu y e n d o e l p é p tid o s e ñ a l:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGTSVKMS CKASGYTFTD
51 YNMHWVKQTQ GKTLEWIGEINPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCAKLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTAPSV 151 YPLAPVCGDT TGSSVTLGCL VKGYFPEPVT LTWNSGSLSS DVHTFPALLQ 201 SGLYTLSSSV TVTTWPSQTITCNVAHPASS TKVDKKIEPR GSPTHKPCPP 251 CPAPNLLGGP SVFIFPPKIK DVLMISLSPM V T C W V D V SE DDPDVHVSWF 301 VNNVEVHTAQ TQTHREDYNS TIRW SALPI QHQDWMSGKE FKCKVNNKAL 351 PAPIERTISK PKGPVRAPQV YVLPPPEEEM TKKQVTLTCMITDFMPEDIY 401 VEWTNNGQTE LNYKNTEPVL DSDGSYFMYS KLRVEKKNWV ERNSYSCSVV 451 HEGLHNHHTT KSFSRTPGK (SEQ ID NO: 179)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-9 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG
101 GGÁCTTCÁGt GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC
151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGACCCAA GGAAAGACCC TAGAGTGGAT
201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA
251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG
301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAA
351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTATTTCGAT GTCTGGGGCG
401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACAACAGC CCCATCGGTC
451 TATCCACTGG CCCCTGTGTG TGGAGATACA ACTGGCTCCT CGGTGACTCT
501 AGGATGCCTG GTCAAGGGTT ATTTCCCTGA GCCAGTGACC TTGACCTGGA
551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGT GATGTGCACA CCTTCCCAGC TCTCCTGCAG
601 TCTGGCCTCT ACACCCTCAG CAGCTCAGTG ACTGTAACCA CCTGGCCCAG
651 CCAGACCATC ACCTGCAATG TGGCCCACCC GGCAAGCAGC ACCAAAGTGG
701 ACAAGAAAAT TGAGCCCAGA GGGTCCCCAA CACATAAACC CTGTCCTCCA
751 TGCCCAGCTC CTAACCTCTT GGGTGGACCA TCCGTCTTCA TCTTCCCTCC
801 AAAGATCAAG GATGTACTCA TGATCTCCCT GAGCCCCATG GTCACGTGTG
851 TGGTGGTGGA TGTGAGCGAG GATGACCCAG ATGTCCATGT CAGCTGGTTC
901 GTGAACAACG TGGAAGTACA CACAGCTCAG ACACAAACCC ATAGAGAGGA
951 TTACAACAGT ACTATCCGGG TGGTCAGTGC CCTCCCCATC CAGCACCAGG
1001 ACTGGATGAG TGGCAAGGAG TTCAAATGCA AGGTCAACAA CAAAGCCCTC
1051 CCAGCGCCCA TCGAGAGAAC CATCTCAAAA CCCAAAGGGC CAGTAAGAGC
1101 TCCACAGGTA TATGTCTTGC CTCCACCAGA AGAAGAGATG ACTAAGAAAC
1151 AGGTCACTCT GACCTGCATG ATCACAGACT TCATGCCTGA AGACATTTAC
1201 GTGGAGTGGA CCAACAACGG GCAAACAGAG CTAAACTACA AGAACACTGA
1251 ACCAGTCCTG GACTCTGATG GTTCTTACTT CATGTACAGC AAGCTGAGAG
1301 TGGAAAAGAA GAACTGGGTG GAAAGAAATA GCTACTCCTG TTCAGTGGTC
1351 CACGAGGGTC TGCACAATCA CCACACGACT AAGAGCTTCT CCCGGACTCC
1401 GGGTAAA (SEQ ID NO: 180)
Ab-10
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 10 (también denominado en el presente documento Ab-10) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-10
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la LC d e A b -10 :
1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS ÑYLNWYQQKP DGTFKLLIFY
51 TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG 101 GTKLEIKRAD AAPTVSIFPL SSEQLTSGGA SVVCFLNNFYPKDINVKWKI 151DGSERQNGVL NSWTDQDSKD STYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT 201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 181)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-10:
1 GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA
51 CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC AATTATTTAA
101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT TATCTTCTAC
151 ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA GAAGATTTTG 251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC TTTCGGAGGG 301 GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT 351 CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT 401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT
H3 i U A i ü U L A ü i u AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA 501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG 551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA 601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID NO: 182)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-10 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGTRC DIQMTQTTSS LSASLGDRVS ISCRASQDIS
51 NYLNW YQQKP DGTFKLLIFY TSRLLSGVPS RFSGSGSGTD YSLTIYNLEQ 101 EDFATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPL SSEQLTSGGA 151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSW TDQDSKD STYSMSSTLT 201 LTKDEYERHN SYTCEATHKT STSPIVKSFN RNEC (SEQ ID NO: 183)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-10 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG 51 TACCAGATGT GATATCCAGA TGACACAGAC TACATCCTCC CTGTCTGCCT 101 CTCTGGGAGA CAGGGTCTCC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA AGACATTAGC 151 AATTATTTAA ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTT TTAAACTCCT 201 TATCTTCTAC ACATCAAGAT TACTCTCAGG AGTCCCATCA AGGTTCAGTG 251 GCAGTGGGTC TGGAACAGAT TATTCTCTCA CCATTTACAA CCTGGAGCAA 301 GAAGATTTTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGAGATACGC TTCCGTACAC 351 TTTCGGAGGG GGGACCAAAC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA 401 CTGTATCCAT CTTCCCACTA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC 451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA 501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA 551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG 601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC 651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT 701 GTTAG (SEQ ID NO: 184)
C a d e n a P e s a d a d e A b -10
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-10:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWVKQN QGKTLEWIGE
5 1 INPNSGGAGY NQKFKGKATL TVDKSSTTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG
101 YDDIYDD WYF DVWGAGTTVT MSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151LVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201ETVTCNVAHPASSTKVDKKI VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV 251LTITLTPKVT CWVDISKDD PEVQFSWFVD DVEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301 RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 3511PPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE WQWNGOPAEN YKNTQPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID NO: 185)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-10:
1 GAGGTCCAAC TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA TACATTCACT GACTACAACA
í g á ^ A 'u á a c c a %(Aa a t a a a ^ a g a a m .
151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TGCTGGCTAC AACCAGAAGT TCAAGGGCAA
201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAC CACAGCCTAC ATGGAGCTCC
251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC
301 TACGATGATA TCTACGACGA CTGGTACTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC
351 CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC
401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC
451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG
501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC
551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC
601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA
651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG
701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG
751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG
801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG
851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC
901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA
951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA
1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG 1101 CATGATAACA GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA 1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA 1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG 1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA 1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID NO: 186)
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -10 in c lu y e n d o el p é p tid o s e ñ a l:
1 MGWSWTFLFL LSGTAGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD
51 YNMHWVKQNQ GKTLEWIGEINPNSGGAGYN QKFKGKATLT VDKSSTTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY DDIYDDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC WVDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO: 187)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-10 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAACTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATATAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGGTGAA GCAGAACCAA GGAAAGACCC TAGAATGGAT 201 AGGAGAAATT AATCCTAACA GTGGTGGTGC TGGCTACAAC CAGAAGTTCA 251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCACCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC GATGATATCT ACGACGACTG GTACTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCAGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT Mil (,(,(, AIGl'ClG CMC \.\(,(K,C I VI I M
3 3 1 A u i t i ü ü A i L CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG 1401 A (SEQ ID NO:188)
Ab-11
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 11 (también denominado en el presente documento Ab-11) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-11
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la LC d e A b - 11:
1 QIVLSQSPAF LSVSPGDKVT MTCRASSSIS YIHWFQQKPG SSPRSWIYAT
51 SNLASGVPGR FSGSGSGTSY SLTISRVEAE DAATYYCQQW SSDPLTFGAG 101 TKLELKRADA APTVSIFPPS SEQLTSGGAS VVCFLNNFYPKDINVKWKID 151 GSERONGVLNSWTDQDSKDS TYSMSSTLTL TKDEYERHNS YTCEATHKTS 201 T SP im SF N R NEC (SEQ ID NO: 189)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-11:
1 CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCATTC CTGTCTGTAT CTCCAGGGGA
51 TAAGGTCACA ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT
101 GGTTTCAGCA GAAGCCAGGA TCCTCCCCCA GATCCTGGAT TTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGGTCGC TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG 201 GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAG GATGCTGCCA 251 CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGTGCTGGG 301 ACCAAGCTGG AGCTGAAACG GGCTGATGCT GCACCAACTG TATCCATCTT 351 CCCACCATCC AGTGAGCAGT TAACATCTGG AGGTGCCTCA GTCGTGTGCT 401 TCTTGAACAA CTTCTACCCC AAAGACATCA ATGTCAAGTG GAAGATTGAT 451 GGCAGTGAAC GACAAAATGG CGTCCTGAAC AGTTGGACTG ATCAGGACAG 501 CAAAGACAGC ACCTACAGCA TGAGCAGCAC CCTCACGTTG ACCAAGGACG 551 AGTATGAACG ACATAACAGC TATACCTGTG AGGCCACTCA CAAGACATCA 601 ACTTCACCCA TTGTCAAGAG CTTCAACAGG AATGAGTGTT AG (SEQ ID NO: 190)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-11 incluyendo el péptido señal:
1 M DFQVQIFSF LLISASVIM S RGQIVLSQSP AFLSVSPG DK VTMTCRASSS
• y iI s Y fH W t^ Q k PGSSPRSWIY ATSNLASGVP GRFSGSGSGT SYSLTISRVE 101 AEDAATYYCQ QWSSDPLTFG AGTKLELKRA DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG 151 ASVVCFLNNF YPKDINVKWKIDGSERQNGV LNSWTDQDSK DSTYSMSSTL 201 TLTKDEYERFINSYTCEATHK TSTSPIVKSF NRNEC (SEQ ID NO: 191)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-11 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGATTTTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTGCTAATCA GTGCTTCAGT
51 CATAATGTCC AGAGGACAAA TTGTTCTCTC CCAGTCTCCA GCATTCCTGT 101 CTGTATCTCC AGGGGATAAG GTCACAATGA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151 ATAAGTTACA TACACTGGTT TCAGCAGAAG CCAGGATCCT CCCCCAGATC 201 CTGGATTTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGAGTCCCT GGTCGCTTCA 251 GTGGCAGTGG GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGAGTGGAG 301 GCTGAGGATG CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT 351 CACGTTCGGT GCTGGGACCA AGCTGGAGCT GAAACGGGCT GATGCTGCAC 401 CAACTGTATC CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT 451 GCCTCAGTCG TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT 501 CAAGTGGAAG ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT 551 GGACTGATCA GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC 601 ACGTTGACCA AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC 651 CACTCACAAG ACATCAACTT CACCCATTGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG 701 AGTGTTAG (SEQ ID NO: 192)
C a d e n a P e s a d a d e A b - 11
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-11:
1 EVQLQQSGAD LVQPGASVKV SCTASGFDIK DYYIHWMKQR PDQGLEWIGR
51 VDPDNGETEF APKFPGKATF TTDTSSNTAY LQLRGLTSED TAIYYCGRED
101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS AAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLV 151KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPA VLQSDLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAHPAS STKVDKKIVP RDCGCKPCIC TVPEVSSVFIFPPKPKDVLT 251ITLTPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDDVEVHTAQTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAAFPAPIEKTISKTKGR PKAPOVYTIP 351PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYK NTQPIMDTDG 401 SYFIYSKLNV QKSNWEAGNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-11:
1 GAAGTTCAGC TGCAACAGTC TGGGGCAGAC CTTGTGCAGC CAGGGGCCTC 51 AGTCAAGGTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CGACATTAAG GACTACTATA 101 TACACTGGAT GAAACAGAGG CCTGACCAGG GCCTGGAGTG GATTGGAAGG 151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA 201 GGCCACTTTT ACAACAGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC CTACAACTCA 251 GAGGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCATCT ATTACTGTGG GAGAGAAGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT 351 CACTGTCTCT GCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC 401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC 451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT 501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA 551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC
601 UTUACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA 651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG 701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC 751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA 801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA 851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA 901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT 951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA 1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA 1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT 1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC 1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC 1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC 1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC 1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAATGA (SEQ ID NO: 194)
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -11 in c lu y e n d o el p é p tid o s e ñ a l:
1 MKCSWVIFFL MAVVTGVNSE VQLQQSGADL VQPGASVKVS CTASGFDIKD
51 YYIHWMKQRP DQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKATFT TDTSSNTAYL 101 QLRGLTSEDT AIYYCGREDY DGTYTWFPYW GQGTLVTVSA AKTTPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT 251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE 301 VI-ITAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW 401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH 451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID NO: 195)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-11 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGAAATGCA GCTGGGTCAT CTTCTTCCTG ATGGCAGTGG TTACAGGGGT
51 CAATTCAGAA GTTCAGCTGC AACAGTCTGG GGCAGACCTT GTGCAGCCAG 101 GGGCCTCAGT CAAGGTGTCC TGCACAGCTT CTGGCTTCGA CATTAAGGAC 151 TACTATATAC ACTGGATGAA ACAGAGGCCT GACCAGGGCC TGGAGTGGAT 201 TGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC TGAATTTGCC CCGAAGTTCC 251 CGGGCAAGGC CACTTTTACA ACAGACACAT CCTCCAACAC AGCCTACCTA 301 CAACTCAGAG GCCTGACATC TGAGGACACT GCCATCTATT ACTGTGGGAG 351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT TCCTTATTGG GGCCAAGGGA
401 CTCTGGTCAC TGTCTCTGCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA
451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG 501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG
551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC
601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG
651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG 701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA
751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT
801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA
851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG 901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT 951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA loo: agg .u . i k a \ a a ’k .ca gg gk aaí
1Ó5 ÍA A Á A W Á fC f tCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC 1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT 1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG 1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC 1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT 1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC 1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AATGA (SEQ ID NO: 196)
Ab-12
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 12 (también denominado en el presente documento Ab-12) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-12:
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la LC d e A b -12 :
1 DLQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS NYLNWYQQKP DGTVKLLIFY
51 TSTLQSGVPS RFSGSGSGTN YSLTITNLEQ DDAATYFCQQ GDTLPYTFGG
101 GTKLEIKJL4Z) AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA SVVCFLNNFYPKDINVKWKI
151DGSERQNGVL NSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKT
201 STSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO: 197)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-12:
5
1 GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT CTCTGGGAGA
51 CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC AATTATTTAA
101 ACTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT GATCTTCTAC
151 ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC
201 TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA GATGATGCTG
251 CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC GTTCGGAGGG
301 GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA CTGTATCCAT
351 CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC TCAGTCGTGT
401 GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA GTGGAAGATT
451 GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA CTGATCAGGA
501 CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG TTGACCAAGG
551 ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC TCACAAGACA
601 TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT GTTAG (SEQ ID
NO: 198)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-12 incluyendo el péptido señal:
1 MMSSAQFLGL LLLCFQGSRC DLQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS
51 NYLNWYQQKP DGTVKLLIFY TSTLQSGVPS RFSGSGSGTN YSLTITNLEQ
101 DDAATYFCQQ GDTLPYTFGG GTKLEIKRAD AAPTVSIFPP SSEQLTSGGA
151 SVVCFLNNFY PKDINVKWKI DGSERQNGVL NSW TDQDSKD STYSMSSTLT
,n
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-12 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGATGTCCT CTGCTCAGTT CCTTGGTCTC CTGTTGCTCT GTTTTCAAGG
51 TTCCAGATGT GATCTCCAGA TGACACAGAC TACTTCCTCC CTGTCTGCCT
101 CTCTGGGAGA CAGAGTCACC ATCAGTTGCA GGGCAAGTCA GGACATTAGC
5
15 rA A T T A T ÍT H ÁCTGGTATCA GCAGAAACCA GATGGAACTG TTAAGCTCCT
201 GATCTTCTAC ACATCAACAT TACAGTCAGG AGTCCCATCG AGGTTCAGTG
251 GCAGTGGGTC TGGAACAAAT TATTCTCTCA CCATTACCAA CCTGGAGCAA
301 GATGATGCTG CCACTTACTT TTGCCAACAG GGTGATACGC TTCCGTACAC
351 GTTCGGAGGG GGGACCAAGC TGGAAATAAA ACGGGCTGAT GCTGCACCAA
401 CTGTATCCAT CTTCCCACCA TCCAGTGAGC AGTTAACATC TGGAGGTGCC
451 TCAGTCGTGT GCTTCTTGAA CAACTTCTAC CCCAAAGACA TCAATGTCAA
501 GTGGAAGATT GATGGCAGTG AACGACAAAA TGGCGTCCTG AACAGTTGGA
551 CTGATCAGGA CAGCAAAGAC AGCACCTACA GCATGAGCAG CACCCTCACG
601 TTGACCAAGG ACGAGTATGA ACGACATAAC AGCTATACCT GTGAGGCCAC
651 TCACAAGACA TCAACTTCAC CCATTGTCAA GAGCTTCAAC AGGAATGAGT
701 GTTAG (SEQ ID NO:200)
C a d e n a P e s a d a d e A b -12
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-12:
1 EVQLQQSGPE LMKPGASVKM SCKASGYTFT DYNMHWMKQN QGKSLEWIGE
5 1 INPNSGGSGY NQKFKGKATL TVDKSSSTAY MELRSLTSED SAVYYCARLG
101 YYGNYEDWYF DVWGAGTTVT VSSAKTTPPS VYPLAPGSAA QTNSMVTLGC 151 LVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVL QSDLYTLSSS VTVPSSTWPS 201ETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDV 251 LTITLTPKVT CVWDISKDD PEVQFSWFVD D VEVHTAQTQ PREEQFNSTF 301RSVSELPIMH QDWLNGKEFK CRVNSAAFPA PIEKTISKTK GRPKAPQVYT 351IPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVE WQWNGQPAEN YKNTQPIMDT 401DGSYFIYSKL NVQKSNWEAG NTFTCSVLHE GLHNHHTEKS LSHSPGK (SEQ ID
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-12:
1 GAGGTCCAGT TGCAACAGTC TGGACCTGAA CTAATGAAGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGCAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACAACA
101 TGCACTGGAT GAAGCAGAAC CAAGGAAAGA GCCTAGAGTG GATAGGAGAG
151 ATTAATCCTA ACAGTGGTGG TTCTGGTTAC AACCAGAAGT TCAAAGGCAA
201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AGTCCTCCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTCC
251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGATTGGGC
301 TACTATGGTA ACTACGAGGA CTGGTATTTC GATGTCTGGG GCGCAGGGAC
351 CACGGTCACC GTCTCCTCTG CCAAAACGAC ACCCCCATCT GTCTATCCAC
401 TGGCCCCTGG ATCTGCTGCC CAAACTAACT CCATGGTGAC CCTGGGATGC
451 CTGGTCAAGG GCTATTTCCC TGAGCCAGTG ACAGTGACCT GGAACTCTGG
501 ATCCCTGTCC AGCGGTGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTG CAGTCTGACC
551 TCTACACTCT GAGCAGCTCA GTGACTGTCC CCTCCAGCAC CTGGCCCAGC
601 GAGACCGTCA CCTGCAACGT TGCCCACCCG GCCAGCAGCA CCAAGGTGGA
651 CAAGAAAATT GTGCCCAGGG ATTGTGGTTG TAAGCCTTGC ATATGTACAG
701 TCCCAGAAGT ATCATCTGTC TTCATCTTCC CCCCAAAGCC CAAGGATGTG
751 CTCACCATTA CTCTGACTCC TAAGGTCACG TGTGTTGTGG TAGACATCAG
801 CAAGGATGAT CCCGAGGTCC AGTTCAGCTG GTTTGTAGAT GATGTGGAGG
851 TGCACACAGC TCAGACGCAA CCCCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACTTTC
901 CGCTCAGTCA GTGAACTTCC CATCATGCAC CAGGACTGGC TCAATGGCAA
951 GGAGTTCAAA TGCAGGGTCA ACAGTGCAGC TTTCCCTGCC CCCATCGAGA
1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGCAGACCGA AGGCTCCACA GGTGTACACC 1051 ATTCCACCTC CCAAGGAGCA GATGGCCAAG GATAAAGTCA GTCTGACCTG
1101 CATfí‘A'fAA¿!A'"GACTTCTTCC CTGAAGACAT TACTGTGGAG TGGCAGTGGA
1151 ATGGGCAGCC AGCGGAGAAC TACAAGAACA CTCAGCCCAT CATGGACACA
1201 GATGGCTCTT ACTTCATCTA CAGCAAGCTC AATGTGCAGA AGAGCAACTG
1251 GGAGGCAGGA AATACTTTCA CCTGCTCTGT GTTACATGAG GGCCTGCACA
1301 ACCACCATAC TGAGAAGAGC CTCTCCCACT CTCCTGGTAA ATGA (SEQ ID NO:202)
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -12 in c lu y e n d o el p é p tid o s e ñ a l:
1 MGWSWTFLFL LSGTSGVLSE VQLQQSGPEL MKPGASVKMS CKASGYTFTD
51 YNMHWMKQNQ GKSLEWIGEINPNSGGSGYN QKFKGKATLT VDKSSSTAYM 101 ELRSLTSEDS AVYYCARLGY YGNYEDWYFD VWGAGTTVTV SSAKTTPPSV 151 YPLAPGSAAQ TNSMVTLGCL VKGYFPEPVT VTWNSGSLSS GVHTFPAVLQ 201 SDLYTLSSSV TVPSSTWPSE TVTCNVAHPA SSTKVDKKIV PRDCGCKPCI 251 CTVPEVSSVF IFPPKPKDVL TITLTPKVTC VVVDISKDDP EVQFSWFVDD 301 VEVHTAQTQP REEQFNSTFR SVSELPIMHQ DWLNGKEFKC RVNSAAFPAP 351 IEKTISKTKG RPKAPQVYTI PPPKEQMAKD KVSLTCMITD FFPEDITVEW 401 QWNGQPAENY KNTQPIMDTD GSYFIYSKLN VQKSNWEAGN TFTCSVLHEG 451 LHNHHTEKSL SHSPGK (SEQ ID NO:203)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-12 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA GCTGGACCTT TCTCTTCCTC CTGTCAGGAA CTTCGGGTGT
51 CCTCTCTGAG GTCCAGTTGC AACAGTCTGG ACCTGAACTA ATGAAGCCTG 101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGCAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC 151 TACAACATGC ACTGGATGAA GCAGAACCAA GGAAAGAGCC TAGAGTGGAT 201 AGGAGAGATT AATCCTAACA GTGGTGGTTC TGGTTACAAC CAGAAGTTCA 251 AAGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAGT CCTCCAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTCCGCA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATTGGGCTAC TATGGTAACT ACGAGGACTG GTATTTCGAT GTCTGGGGCG 401 CAGGGACCAC GGTCACCGTC TCCTCTGCCA AAACGACACC CCCATCTGTC 451 TATCCACTGG CCCCTGGATC TGCTGCCCAA ACTAACTCCA TGGTGACCCT 501 GGGATGCCTG GTCAAGGGCT ATTTCCCTGA GCCAGTGACA GTGACCTGGA 551 ACTCTGGATC CCTGTCCAGC GGTGTGCACA CCTTCCCAGC TGTCCTGCAG 601 TCTGACCTCT ACACTCTGAG CAGCTCAGTG ACTGTCCCCT CCAGCACCTG 651 GCCCAGCGAG ACCGTCACCT GCAACGTTGC CCACCCGGCC AGCAGCACCA 701 AGGTGGACAA GAAAATTGTG CCCAGGGATT GTGGTTGTAA GCCTTGCATA 751 TGTACAGTCC CAGAAGTATC ATCTGTCTTC ATCTTCCCCC CAAAGCCCAA 801 GGATGTGCTC ACCATTACTC TGACTCCTAA GGTCACGTGT GTTGTGGTAG 851 ACATCAGCAA GGATGATCCC GAGGTCCAGT TCAGCTGGTT TGTAGATGAT 901 GTGGAGGTGC ACACAGCTCA GACGCAACCC CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACTTTCCGC TCAGTCAGTG AACTTCCCAT CATGCACCAG GACTGGCTCA 1001 ATGGCAAGGA GTTCAAATGC AGGGTCAACA GTGCAGCTTT CCCTGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGC AGACCGAAGG CTCCACAGGT 1101 GTACACCATT CCACCTCCCA AGGAGCAGAT GGCCAAGGAT AAAGTCAGTC 1151 TGACCTGCAT GATAACAGAC TTCTTCCCTG AAGACATTAC TGTGGAGTGG 1201 CAGTGGAATG GGCAGCCAGC GGAGAACTAC AAGAACACTC AGCCCATCAT 1251 GGACACAGAT GGCTCTTACT TCATCTACAG CAAGCTCAAT GTGCAGAAGA 1301 GCAACTGGGA GGCAGGAAAT ACTTTCACCT GCTCTGTGTT ACATGAGGGC 1351 CTGCACAACC ACCATACTGA GAAGAGCCTC TCCCACTCTC CTGGTAAATG
Ab-13
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 13 (también denominado en el presente documento Ab-13) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-13
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la fo rm a m a d u ra (p é p t id o s e ñ a l re t ira d o ) d e la LC d e A b -13 :
1 QIVLTQSPAI MSASPGEKVT MTCRASSSVT SSYLNWYQQK PGSSPKLWIY
51 STSNLASGVP ARFSGSGSGT SYSLTISSVE AEDAATYYCQ QYDFFPSTFG
101 GGTKLEIK/M DAAPTVSIFP PSSEQLTSGG ASW CFLN N F YPKDINVKWK
151IDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTL TLTKDEYERHNSYTCEATHK
201 TSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:205)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-13:
1 CAGATTGTTC TCACCCAGTC TCCAGCAATC ATGTCTGCAT CTCCAGGGGA
51 GAAGGTCACC ATGACCTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAACT TCCAGTTACT
101 TGAACTGGTA CCAGCAGAAG CCAGGATCTT CCCCCAAACT CTGGATTTAT
151 AGCACATCCA ACCTGGCTTC AGGAGTCCCA GCTCGCTTCA GTGGCAGTGG
201 GTCTGGGACC TCTTACTCTC TCACAATCAG CAGTGTGGAG GCTGAGGATG
251 CTGCCACTTA TTACTGCCAG CAGTATGATT TTTTCCCATC GACGTTCGGT
301 GGAGGCACCA AGCTGGAAAT CAAGCGGGCT GATGCTGCAC CAACTGTATC
351 CATCTTCCCA CCATCCAGTG AGCAGTTAAC ATCTGGAGGT GCCTCAGTCG
401 TGTGCTTCTT GAACAACTTC TACCCCAAAG ACATCAATGT CAAGTGGAAG
451 ATTGATGGCA GTGAACGACA AAATGGCGTC CTGAACAGTT GGACTGATCA
501 GGACAGCAAA GACAGCACCT ACAGCATGAG CAGCACCCTC ACGTTGACCA
551 AGGACGAGTA TGAACGACAT AACAGCTATA CCTGTGAGGC CACTCACAAG
601 ACATCAACTT CACCCATCGT CAAGAGCTTC AACAGGAATG AGTGT (SEQ ID
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-13 incluyendo el péptido señal:
1 MDSQVQIFSF LLISALVKMS RGQIVLTQSP AIMSASPGEK VTMTCRASSS
51 VTSSYLNWYQ QKPGSSPKLWIYSTSNLASG VPARFSGSGS GTSYSLTISS
101 VEAEDAATYY CQQYDFFPST FGGGTKLEIK RADAAPTVSIFPPSSEQLTS
151 GGASVVCFLN NFYPKDINVK WKIDGSERQN GVLNSWTDQD SKDSTYSMSS
201 TLTLTKDEYE RHNSYTCEAT HKTSTSPIVK SFNRNEC (SEQ ID NO:207)
0
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-13 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGATTCTC AAGTGCAGAT TTTCAGCTTC CTTCTAATCA GTGCCTTAGT
51 CAAAATGTCC AGAGGACAGA TTGTTCTCAC CCAGTCTCCA GCAATCATGT
101 CTGCATCTCC AGGGGAGAAG GTCACCATGA CCTGCAGGGC CAGCTCAAGT
151 GTAACTTCCA GTTACTTGAA CTGGTACCAG CAGAAGCCAG GATCTTCCCC
201 CAAACTCTGG ATTTATAGCA CATCCAACCT GGCTTCAGGA GTCCCAGCTC
251 GCTTCAGTGG CAGTGGGTCT GGGACCTCTT ACTCTCTCAC AATCAGCAGT
301 GTGGAGGCTG AGGATGCTGC CACTTATTAC TGCCAGCAGT ATGATTTTTT
351 CCCATCGACG TTCGGTGGAG GCACCAAGCT GGAAATCAAG CGGGCTGATG
401 CTGCACCAAC TGTATCCATC TTCCCACCAT CCAGTGAGCA GTTAACATCT
451 GGAGGTGCCT CAGTCGTGTG CTTCTTGAAC AACTTCTACC CCAAAGACAT
501 CAATGTCAAG TGGAAGATTG ATGGCAGTGA ACGACAAAAT GGCGTCCTGA
551 ACAGTTGGAC TGATCAGGAC AGCAAAGACA GCACCTACAG CATGAGCAGC
601 ACCCTCACGT TGACCAAGGA CGAGTATGAA CG ACATA ACA GCTATACCTG
651 TGAGGCCACT CACAAGACAT CAACTTCACC CATCGTCAAG AGCTTCAACA
, 5
Cadena Pesada de Ab-13
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-13:
1 EVQLQQSGPE LVKPGASVKM SCKASGYTFT DYYMNWVKQS HGESLEWIGD
5 1 INPYNDDTTY NHKFKGKATL TVDKSSNTAY MQLNSLTSED SAVYYCARET
101 AVITTNAMDY WGQGTSVTVS SAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCL V
151KGYFPEPVTV TWNSGSLSSG VHTFPA VLQSDLYTLSSSVT VPSSTWPSET 201 VTCNVAHPAS STKVDKKIVPRDCGCKPCIC TVPEVSSVFIFPPKPKDVLT 251ITL TPKVTCV VVDISKDDPE VQFSWFVDD V E VHTA QTQPR EEQFNSTFRS 301 VSELPIMHQD WLNGKEFKCR VNSAA FPAPIEKTISKTKGR PKAPOVYT1P 351PPKEQMAKDK VSLTCMITDF FPEDITVEWQ WNGQPAENYKNTQPIMDTDG 401SYFIYSKLNV QKSNWEA GNT FTCSVLHEGL HNHHTEKSLS HSPGK (SEQ ID NO:209)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-13:
1 GAGGTCCAGC TGCAACAATC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGGCTTC
51 AGTGAAGATG TCCTGTAAGG CTTCTGGATA CACATTCACT GACTACTACA 101 TGAACTGGGT GAAGCAGAGC CATGGAGAGA GCCTTGAGTG GATTGGAGAT 151 ATTAATCCTT ACAACGATGA TACTACCTAC AACCACAAGT TCAAGGGCAA 201 GGCCACATTG ACTGTAGACA AATCCTCCAA CACAGCCTAC ATGCAGCTCA 251 ACAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCAGTCT ATTACTGTGC AAGAGAGACG 301 GCCGTTATTA CTACGAATGC TATGGACTAC TGGGGTCAAG GAACCTCAGT 351 CACCGTCTCC TCAGCCAAAA CGACACCCCC ATCTGTCTAT CCACTGGCCC 401 CTGGATCTGC TGCCCAAACT AACTCCATGG TGACCCTGGG ATGCCTGGTC 451 AAGGGCTATT TCCCTGAGCC AGTGACAGTG ACCTGGAACT CTGGATCCCT 501 GTCCAGCGGT GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTGCAGTCT GACCTCTACA 551 CTCTGAGCAG CTCAGTGACT GTCCCCTCCA GCACCTGGCC CAGCGAGACC 601 GTCACCTGCA ACGTTGCCCA CCCGGCCAGC AGCACCAAGG TGGACAAGAA 651 AATTGTGCCC AGGGATTGTG GTTGTAAGCC TTGCATATGT ACAGTCCCAG 701 AAGTATCATC TGTCTTCATC TTCCCCCCAA AGCCCAAGGA TGTGCTCACC 751 ATTACTCTGA CTCCTAAGGT CACGTGTGTT GTGGTAGACA TCAGCAAGGA 801 TGATCCCGAG GTCCAGTTCA GCTGGTTTGT AGATGATGTG GAGGTGCACA 851 CAGCTCAGAC GCAACCCCGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC TTTCCGCTCA 901 GTCAGTGAAC TTCCCATCAT GCACCAGGAC TGGCTCAATG GCAAGGAGTT 951 CAAATGCAGG GTCAACAGTG CAGCTTTCCC TGCCCCCATC GAGAAAACCA 1001 TCTCCAAAAC CAAAGGCAGA CCGAAGGCTC CACAGGTGTA CACCATTCCA 1051 CCTCCCAAGG AGCAGATGGC CAAGGATAAA GTCAGTCTGA CCTGCATGAT 1101 AACAGACTTC TTCCCTGAAG ACATTACTGT GGAGTGGCAG TGGAATGGGC 1151 AGCCAGCGGA GAACTACAAG AACACTCAGC CCATCATGGA CACAGATGGC 1201 TCTTACTTCA TCTACAGCAA GCTCAATGTG CAGAAGAGCA ACTGGGAGGC 1251 AGGAAATACT TTCACCTGCT CTGTGTTACA TGAGGGCCTG CACAACCACC 1301 ATACTGAGAA GAGCCTCTCC CACTCTCCTG GTAAA (SEQ ID NO:210)
S e c u e n c ia d e a m in o á c id o s d e la H C d e A b -13 in c lu y e n d o el p é p tid o s e ñ a l:
1 MGWNWIFLFL LSGTAGVYSE VQLQQSGPEL VKPGASVKMS CKASGYTFTD
51 YYMNWVKQSH GESLEWIGDINPYNDDTTYN HKFKGKATLT VDKSSNTAYM 101 QLNSLTSEDS AVYYCARETA VITTNAMDYW GQGTSVTVSS AKTTPPSVYP 151 LAPGSAAQTN SMVTLGCLVK GYFPEPVTVT WNSGSLSSGV HTFPAVLQSD 201 LYTLSSSVTV PSSTWPSETV TCNVAHPASS TKVDKKIVPR DCGCKPCICT 251 VPEVSSVFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCVV VDISKDDPEV QFSWFVDDVE 301 VHTAQTQPRE EQFNSTFRSV SELPIMHQDW LNGKEFKCRV NSAAFPAPIE 351 KTISKTKGRP KAPQVYTIPP PKEQMAKDKV SLTCMITDFF PEDITVEWQW 401 NGQPAENYKN TQPIMDTDGS YFIYSKLNVQ KSNWEAGNTF TCSVLHEGLH 451 NHHTEKSLSH SPGK (SEQ ID NO:211)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-13 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA ACTGGATCTT TCTCTTCCTC TTGTCAGGAA CTGCAGGTGT
51 CTACTCTGAG GTCCAGCTGC AACAATCTGG ACCTGAGCTG GTGAAGCCTG
101 GGGCTTCAGT GAAGATGTCC TGTAAGGCTT CTGGATACAC ATTCACTGAC
151 TACTACATGA ACTGGGTGAA GCAGAGCCAT GGAGAGAGCC TTGAGTGGAT
201 TGGAGATATT AATCCTTACA ACGATGATAC TACCTACAAC CACAAGTTCA
251 AGGGCAAGGC CACATTGACT GTAGACAAAT CCTCCAACAC AGCCTACATG
301 CAGCTCAACA GCCTGACATC TGAGGACTCT GCAGTCTATT ACTGTGCAAG
351 AGAGACGGCC GTTATTACTA CGAATGCTAT GGACTACTGG GGTCAAGGAA
401 CCTCAGTCAC CGTCTCCTCA GCCAAAACGA CACCCCCATC TGTCTATCCA
451 CTGGCCCCTG GATCTGCTGC CCAAACTAAC TCCATGGTGA CCCTGGGATG
501 CCTGGTCAAG GGCTATTTCC CTGAGCCAGT GACAGTGACC TGGAACTCTG
551 GATCCCTGTC CAGCGGTGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT GCAGTCTGAC
601 CTCTACACTC TGAGCAGCTC AGTGACTGTC CCCTCCAGCA CCTGGCCCAG
651 CGAGACCGTC ACCTGCAACG TTGCCCACCC GGCCAGCAGC ACCAAGGTGG
701 ACAAGAAAAT TGTGCCCAGG GATTGTGGTT GTAAGCCTTG CATATGTACA
751 GTCCCAGAAG TATCATCTGT CTTCATCTTC CCCCCAAAGC CCAAGGATGT
801 GCTCACCATT ACTCTGACTC CTAAGGTCAC GTGTGTTGTG GTAGACATCA
851 GCAAGGATGA TCCCGAGGTC CAGTTCAGCT GGTTTGTAGA TGATGTGGAG
901 GTGCACACAG CTCAGACGCA ACCCCGGGAG GAGCAGTTCA ACAGCACTTT
951 CCGCTCAGTC AGTGAACTTC CCATCATGCA CCAGGACTGG CTCAATGGCA
1001 AGGAGTTCAA ATGCAGGGTC AACAGTGCAG CTTTCCCTGC CCCCATCGAG
1051 AAAACCATCT CCAAAACCAA AGGCAGACCG AAGGCTCCAC AGGTGTACAC
1101 CATTCCACCT CCCAAGGAGC AGATGGCCAA GGATAAAGTC AGTCTGACCT
1151 GCATGATAAC AGACTTCTTC CCTGAAGACA TTACTGTGGA GTGGCAGTGG
1201 AATGGGCAGC CAGCGGAGAA CTACAAGAAC ACTCAGCCCA TCATGGACAC
1251 AGATGGCTCT TACTTCATCT ACAGCAAGCT CAATGTGCAG AAGAGCAACT
1301 GGGAGGCAGG AAATACTTTC ACCTGCTCTG TGTTACATGA GGGCCTGCAC
1351 AACCACCATA CTGAGAAGAG CCTCTCCCAC TCTCCTGGTA AA (SEQ ID
Ab-13 se humanizó para generar Ab-14.
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 14 (también denominado en el presente documento Ab-14) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-14
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-14:
1 DIQLTQSPSF LSASVG DRVTITCRÁSSSVT SSYLNW YQQK PGKAPKLLIY
51 STSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTÍSSLQ PEDFATYYCQ QYDFFPSTFG 101 GGTKVEIKRJ VÁAPSVFIFP PSDEQLKSGTAS VVCLLNNF YPREÁKVQWK 151 VDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ 201 GLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:213)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-14:
1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA
51 CCGAGTAACA ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA TCTTCTTATC
101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC
151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG 201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT 251 TCGCCACTTA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA 301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAGCGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT 351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG 401 TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG 451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG TCACAGAGCA 501 GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG ACGCTGAGCA 551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQ ID
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-14 incluyendo el péptido señal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VTITCRASSS
51 VTSSYLNW YQ QKPGKAPKLL IYSTSNLASG VPSRFSGSGS GTEFTLTISS 101 LQPEDFATYY CQQYDFFPST FGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKS 151 GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS 201 TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC (SEQ ID NO:215)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-14 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT 51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGCTGAC CCAGAGCCCC AGCTTCCTTT 101 CCGCATCCGT TGGTGACCGA GTAACAATCA CATGCCGCGC CTCATCTTCA 151 GTTACATCTT CTTATCTTAA TTGGTATCAA CAAAAACCAG GAAAAGCACC 201 TAAACTTCTT ATATACTCTA CATCTAATCT CGCATCAGGA GTTCCCTCTC 251 GATTTTCAGG ATCTGGATCA GGCACAGAAT TTACACTTAC TATATCATCA 301 CTCCAACCAG AAGACTTCGC CACTTATTAC TGCCAACAAT ACGATTTTTT 351 TCCAAGCACA TTCGGAGGAG GTACAAAAGT AGAAATCAAG CGTACGGTGG 401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT 451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC 501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG 551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC 601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG 651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA 701 GGGGAGAGTG T (SEQ ID NO:216)
Cadena Pesada de Ab-14
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMNWVRQA PGQRLEWMGD
51 INPYNDDTTY ÑHKFKGRVTITRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET
101 AVITTNAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTS ESTAALGCL V
151KDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPA VLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVA GPS V FLFPPKPKDT 251LMISRTPEVT CVVl^DVSHED PEVQFNUTVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTF 301RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT 351LPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIA VE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401DGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:217)
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14 sin lisina carboxiloterminal:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMNWVRQA PGQRLEWMGD.
51 INPYNDDTTY ÑHKFKGRVTI TRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET
101 AVITTNAMDY WGQGTTVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCL V
151 KDYFPEPVTVS1VNSGALTSG VHTFPA VLQS SGLYSLSSVV TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVA GPSV FLFPPKPKDT 251 LMISRTPEVT CVVJ'D VSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTF 301 RVVSVLTVVH QD WLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT 351 LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIA VE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPG (SEQ ID NO:393)
Secuencia de ácido de nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-14:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTCAAGAAAC CTGGAGCAAG
51 CGTAAAGGTT AGTTGCAAAG CATCTGGATA CACATTTACC GACTACTACA 101 TGAATTGGGT ACGACAAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC 151 ATTAACCCTT ATAACGACGA CACTACATAC AATC ATAAAT TTAAAGGAAG 201 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGC ATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT 251 CCTCATTGAG ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT 301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGGTCAAG GAACCACTGT 351 TACCGTCTCT AGTGCCTCCA CCAAGGGCCC ATCGGTCTTC CCCCTGGCGC 401 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CGGCCCTGGG CTGCCTGGTC 451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT CAGGCGCTCT 501 GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTACAGTCC TCAGGACTCT 551 ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAACTT CGGCACCCAG 601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA 651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCCACCGTGC CCAGCACCAC 701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC 751 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG 801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG 851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTTC 901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTTGTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA 951 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCAGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC 1051 CTGCCCCCÁÍ CCCGGGAGGA GATGACC AAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG 1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA 1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC 1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA 1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (SEQ ID NO:218)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-14 incluyendo el péptido señal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTD
51 YYMNWVRQAP GQRLEWMGDINPYNDDTTYN HKFKGRVTIT RDTSASTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARETA VITTNAMDYW GQGTTVTVSS ASTKGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 201 GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP 251 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP 351 IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 401 ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-14 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC
51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGAGCGG CGCCGAGGTC AAGAAACCTG 101 GAGC AAGCGT A AAGGTTAGT TGCAAAGCAT CTGGATAC AC ATTTACCGAC 151 TACTAC ATGA ATTGGGTACG ACAAGCCCCT GGACAAAGAC TTGAATGGAT 201 GGGAGAC ATT AACCCTTATA ACGACGACAC TACATACAAT CATAAATTTA 251 AAGGAAGAGT TACAATTACA AGAGATACAT CCGCATCAAC CGCCTATATG 301 GAACTTTCCT CATTGAGATC TGAAGACACT GCTGTTTATT ACTGTGC AAG 351 AGAAACTGCC GTTATTACTA CTAACGCTAT GGATTACTGG GGTCAAGGAA 401 CCACTGTTAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG 551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG 651 CACCC AGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG 701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA 751 GCACCACCTG TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA 801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG 851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC 901 GTGG AGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA 1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT 1101 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC 1151 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG 1201 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT 1251 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA 1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT 1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID NO: 220)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-14 son:
CDR-H1: DYYMN (SEQ ID NO: 296)
CDR-H2: DINPYNDDTTYNHKFKG (SEQ ID NO: 297)
CDR-H3: ETAVITTNAMD (SEQ ID NO: 298)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-14 son:
CDR-L1: RASSSVTSSYLN (SEQ ID NO: 284)
CDR-L2: STSNLAS (SEQ ID NO: 285)
CDR-L3: QQYDFFPST (SEQ ID NO: 286)
Dominios variables de Ab-14
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-14 (sin secuencia señal):
1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVTITCRÁSSÍSVt SSYLNWYQQK PGKAPKLLIY 51 stsn la s!g v p SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QYDFFPSTFG 101 GGTKVEIK (SEQ ID NO:380)
Secuencia de ADN del dominio variable de cadena ligera de Ab-14 (sin secuencia señal):
1 GACATCCAGC TGACCCAGAG CCCCAGCTTC CTTTCCGCAT CCGTTGGTGA
51 CCGAGTAACA ATCACATGCC GCGCCTCATC TTCAGTTACA TCTTCTTATC 101 TTAATTGGTA TCAACAAAAA CCAGGAAAAG CACCTAAACT TCTTATATAC 151 TCTACATCTA ATCTCGCATC AGGAGTTCCC TCTCGATTTT CAGGATCTGG 201 ATCAGGCACA GAATTTACAC TTACTATATC ATCACTCCAA CCAGAAGACT 251 TCGCCACTTA TTACTGCCAA CAATACGATT TTTTTCCAAG CACATTCGGA 301 GGAGGTACAA AAGTAGAAAT CAAG (SEQ ID NO:381)
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DYYMNWVRQA PGQRLEWMGD 51 INPYNDDTTY NHKFKGRVTITRDTSASTAY MELSSLRSED TAVYYCARET 101 AVITTNAMDY WGQGTTVTVS S (SEQ IDNO:382)
Secuencia de ADN del dominio variable de cadena pesada de Ab-14 (sin secuencia señal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGAG CGGCGCCGAG GTCAAGAAAC CTGGAGCAAG 51 CGTAAAGGTT AGTTGCAAAG CATCTGGATA CACATTTACC GACTACTACA 101 TGAATTGGGT ACGAC AAGCC CCTGGACAAA GACTTGAATG GATGGGAGAC 151 ATTAACCCTT ATAACGACGA C ACTACATAC AATCATAAAT TTAAAGGAAG 201 AGTTACAATT ACAAGAGATA CATCCGC ATC AACCGCCTAT ATGGAACTTT 251 CCTCATTGAG ATCTGAAGAC ACTGCTGTTT ATTACTGTGC AAGAGAAACT
301 GCCGTTATTA CTACTAACGC TATGGATTAC TGGGGTCAAG GAACCACTGT 351 TACCGTCTCT AGT (SEQ ID NO:383)
Ab-3 se humanizó para generar Ab-15.
Ab-15
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 15 (también denominado en el presente documento Ab-15) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-15:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15:
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCSVSSTIS SNHLHWFQQK PGKAPKSLIY
51 GTSNLASGVP SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QWSSYPLTFG 101 GGTKVEIKR T VAAPSVFIFP PSDEQLKSGTASVVCLLNNF YPREAKVQWK 151 VDNALQSGNS QESVTEQDSKDSTYSLSSTL TLSKADYEKHKJ'TACEVTHQ 201 GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO:221)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-15:
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAGGCGA
51 TAGAGTTACA ATAACATGCA GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC
101 TTCATTGGTT CCAACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC 151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCGTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG 201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT 251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC 301 GGCGGCACAA AAGTAGAAAT TAAACGTACG GTGGCTGCAC CATCTGTCTT 351 CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT GCCTCTGTTG 401 TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT ACAGTGGAAG 451 GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG TCACAGAGCA 501 GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG ACGCTGAGCA 551 AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT CACCCATCAG 601 GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG AGTGT (SEQ ID NO:222)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-15 incluyendo el péptido señal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCSVSST
5 1 ISSNHLHWFQ QKPGKAPKSLIYGTSNLASG VPSRFSGSGS GTDFTLTISS 101 LQPEDFATYY CQQWSSYPLT FGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKS 151 GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD SKDSTYSLSS
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-15 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TACTCTGGCT 51 •• C•» C •***•*■G wA <G• G nitiTw *Ginrt*C tCi A ir l G U in ATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTCT
101 CAGCATCCGT AGGCGATAGA GTTACAATAA CATGCAGCGT ATCATCAACT
151 ATATCATCAA ATCATCTTCA TTGGTTCCAA CAGAAACCCG GCAAAGCACC
201 TAAATCACTT ATATACGGCA CATCAAATCT CGCATCAGGC GTTCCTTCAA
251 GATTTTCAGG CTCTGGCTCA GGCACCGACT TTACTCTTAC AATATCCTCC
301 CTCCAACCCG AAGACTTCGC AACCTATTAC TGTCAACAAT GGTCCTCATA
351 TCCACTCACA TTTGGCGGCG GCACAAAAGT AGAAATTAAA CGTACGGTGG
401 CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA GTTGAAATCT
451 GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC CCAGAGAGGC
501 CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT AACTCCCAGG
551 AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG CCTCAGCAGC
601 ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG TCTACGCCTG
651 CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG AGCTTCAACA
701 GGGGAGAGTG T (SEQ ID N O :224 )
Cadena Pesada de Ab-15
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLHWVRQA PGQGLEWIGR 51 IDPENGDTLY DPKFQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREÁ 101 DYFHDGTSYW YFDVWGRGTL WTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL 151 GCLVKDYFPEPVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN 201 FGTQTYTCNVDHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK 251 PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQF 301NSTFRWSVL TVVHQDWLNGKEYKCKVSNK GLPAPIEKTISKTKGQPREP 351 QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIA VEWESNGQ PENNYKTTPP 401 MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 451K (SEQ ID NO:225)
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15 sin lisina carboxiloterminal:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLHWVRQA PGQGLEWIGR
51 IDPENGDTLY DPKFQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREÁ
101 DYFHDGTSYW YFDVWGRGTL VTVSSASTKG PSVFPLAPCS RSTSESTAAL 151 GCLVKDYFPE PVTVSWNSGA LTSGVHTFPA VLQSSGLYSL SSVVTVPSSN 201 FGTQTYTCNV DHKPSNTKVD KTVERKCCVE CPPCPAPPVA GPSVFLFPPK 251 PKDTLMISR T PE VTCVVVD V SHEDPE VQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF 301NSTFR VVSVL TW HQD WLNG KEYKCKVSNK GLPAPIEKTI SKTKGQPREP 351 QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CL VKGFYPSD LA VEWESNGQ PENNYKTTPP 401 MLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG 451 (SEQ ID NO:394)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-15:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATTGGAAGG 151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG 301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCCG 351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGTGCCTC CACCAAGGGC CCATCGGTCT 401 TCCCCCTGGC GCCCTGCTCC AGGAGCACCT CCGAGAGCAC AGCGGCCCTG 451 GGCTGCCTGG TCAAGGACTA CTTCCCCGAA CCGGTGACGG TGTCGTGGAA 501 CTCAGGCGCT CTGACCAGCG GCGTGCACAC CTTCCCAGCT GTCCTACAGT 551 CCTCAGGACT CTACTCCCTC AGCAGCGTGG TGACCGTGCC CTCCAGCAAC 601 TTCGGCACCC AGACCTACAC CTGCAACGTA GATCACAAGC CCAGCAACAC 651 CAAGGTGGAC AAGACAGTTG AGCGCAAATG TTGTGTCGAG TGCCCACCGT 701 GCCCAGCACC ACCTGTGGCA GGACCGTCAG TCTTCCTCTT CCCCCCAAAA 751 CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA CGTGCGTGGT 801 GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCCGAGGT CCAGTTCAAC TGGTACGTGG 851 ACGGCGTGGA GGTGCATAAT GCCAAGACAA AGCCACGGGA GGAGCAGTTC 901 AACAGCACGT TCCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTTGTGC ACCAGGACTG 951 GCTGAACGGC AAGGAGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA GGCCTCCCAG 1001 CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAACCA AAGGGCAGCC CCGAGAACCA 1051 CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA AGAACCAGGT 1101 CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA CCCCAGCGAC ATCGCCGTGG 1151 AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC CACACCTCCC 1201 ATGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TACAGCAAGC TCACCGTGGA 1251 CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC GTGATGCATG 1301 AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT GTCTCCGGGT 1351 AAA (SEQ ID NO:226)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-15 incluyendo el péptido señal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASDFNIKD 51 FYLHWVRQAP GQGLEWIGRIDPENGDTLYD PKFQDKVTMT TDTSTSTAYM 101 ELRSLRSDDT AVYYCAREAD YFHDGTSYWY FDVWGRGTLV TVSSASTKGP 151 SVFPLAPCSR STSESTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV 201 LQSSGLYSLS SVVTVPSSNF GTQTYTCNVD HKPSNTKVDK TVERKCCVEC 251 PPCPAPPVAG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EV TC V W D V S HEDPEVQFNW 301 YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VVHQDWLNGK EYKCKVSNKG 351 LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI 401 AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-15 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGACTTCAA CATTAAAGAC 151 TTCTATCTAC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 TGGAAGGATT GATCCTGAGA ATGGTGATAC TTTATATGAC CCGAAGTTCC 251 AGGACAAGGT CACCATGACC ACAGACACGT CCACCAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGAGGCGGAT TATTTCCACG ATGGTACCTC CTACTGGTAC TTCGATGTCT 401 GGGGCCGTGG CACCCTGGTC ACCGTCTCTA GTGCCTCCAC CAAGGGCCCA 451 TCGGTCTTCC CCCTGGCGCC CTGCTCCAGG AGCACCTCCG AGAGCACAGC 501 GGCCCTGGGC TGCCTGGTCA AGGACTACTT CCCCGAACCG GTGACGGTGT 551 CGTGGAACTC AGGCGCTCTG ACCAGCGGCG TGCACACCTT CCCAGCTGTC 601 CTACAGTCCT CAGGACTCTA CTCCCTCAGC AGCGTGGTGA CCGTGCCCTC 651 CAGCAACTTC GGCACCCAGA CCTACACCTG CAACGTAGAT CACAAGCCCA 701 GCAACACCAA GGTGGACAAG ACAGTTGAGC GCAAATGTTG TGTCGAGTGC 751 CCACCGTGCC CAGCACCACC TGTGGCAGGA CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC 801 CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACGT 851 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAACTGG 901 TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CACGGGAGGA 951 GCAGTTCAAC AGCACGTTCC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTTGTGCACC 1001 AGGACTGGCT GAACGGCAAG GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGGC 1051 CTCCCAGCCC CCATCGAGAA AACCATCTCC AAAACCAAAG GGCAGCCCCG 1101 AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCGGGAGGAG ATGACCAAGA 1151 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTACCC CAGCGACATC 1201 GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACCAC 1251 ACCTCCCATG CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAAGCTCA 1301 CCGTGGACAA GAGCAGGTGG CAGCAGGGGA ACGTCTTCTC ATGCTCCGTG 1351 ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCACTACACG CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC 1401 TCCGGGTAAA (SEQ ID NO:228)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-15 son:
CDR-H1: DFYLH (SEQ ID NO: 290)
CDR-H2: RIDPENGDTLYDPKFQD (SEQ ID NO: 291)
CDR-H3: EADYFHDGTSYWYFDV (SEQ ID NO: 292)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-15 son:
CDR-L1: SVSSTISSNHLH (SEQ ID NO: 278)
CDR-L2: GTSNLAS (SEQ ID NO: 279)
CDR-L3: QQWSSYPLT (SEQ ID NO: 280)
Dominios variables de Ab-15
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal):
1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVTITCSVSSTIS SNHLHWFQQK PGKAPKSLIY 51 GTSNLASGVP SRFSGSGSGT DFTLTISSLQ PEDFATYYCQ QWSSYPLTFG 101 GGTKVEIK (SEQ ID NO:384)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-15 (sin secuencia señal):
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTCTCAGCAT CCGTAGGCGA 51 TAGAGTTAC A ATAACATGC A GCGTATCATC AACTATATCA TCAAATCATC
101 TTCATTGGTT CCAACAGAAA CCCGGCAAAG CACCTAAATC ACTTATATAC 151 GGCACATCAA ATCTCGCATC AGGCGTTCCT TCAAGATTTT CAGGCTCTGG 201 CTCAGGCACC GACTTTACTC TTACAATATC CTCCCTCCAA CCCGAAGACT 251 TCGCAACCTA TTACTGTCAA CAATGGTCCT CATATCCACT CACATTTGGC Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):
1 EVQLYQSGAE VKKPGASVKV SCKASDFNIK DFYLHWVRQA PGQGLEWIGR 5 11DPENGDTLY DPKFQDKVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCAREA 101 DYFHDGTSYW YFDVWGRGTL VTVSS (SEQ ID NO:386)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-15 (sin secuencia señal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGACTT CAACATTAAA GACTTCTATC 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATTGGAAGG 151 ATTGATCCTG AGAATGGTGA TACTTTATAT GACCCGAAGT TCCAGGACAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCACCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GGAGCCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAGGCG 301 GATTATTTCC ACGATGGTAC CTCCTACTGG TACTTCGATG TCTGGGGCCG 351 TGGCACCCTG GTCACCGTCT CTAGT (SEQ ID NO:387)
Ab-11 se humanizó para generar Ab-16.
Ab-16
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 16 (también denominado en el presente documento Ab-16) son las siguientes:
Cadena Ligera de Ab-16:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:
1 DIQLTQSPSF LSASVGDRVT ITCRASSSÍS YIHWYQQKPG KAPKLLIYAT
51 SNLÁSGVPSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE DFATYYCQQW SSDPLTFGGG 101 TKWYIKRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD 151NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 201 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO:229)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-16:
1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT 101 GGTATCAGCA AAAACCAGGG AAAGCCCCTA AGCTCCTGAT CTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAGCGGCA GTGGATCTGG 201 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA 251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG 301 ACCAAGGTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT 351 CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC 401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT 451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG 501 CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAG 551 ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG 601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ ID NO:230)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-16 incluyendo el péptido señal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLPGA RCDIQLTQSP SFLSASVGDR VTITCRASSS
5 1 ISYIHWYQQK PGKAPKLLIY ATSNLASGVP SRFSGSGSGT EFTLTISSLQ 101 PEDFATYYCQ QWSSDPLTFG GGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 151 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL 201 TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO:231)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-16 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACATGA GGGTCCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTCTGGCT 51 CCCAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGTTGAC CCAGTCTCCA TCCTTCCTGT 101 CTGCATCTGT AGGAGACAGA GTCACCATCA CTTGCAGGGC CAGCTCAAGT 151 ATAAGTTACA TACACTGGTA TCAGCAAAAA CCAGGGAAAG CCCCTAAGCT 201 CCTGATCTAT GCCACATCCA ACCTGGCTTC TGGGGTCCCA TCAAGGTTCA 251 GCGGCAGTGG ATCTGGGACA GAATTCACTC TCACAATCAG CAGCCTGCAG 301 CCTGAAGATT TTGCAACTTA TTACTGTCAG CAGTGGAGTA GTGACCCACT 351 CACGTTCGGC GGAGGGACCA AGGTGGAGAT CAAACGTACG GTGGCTGCAC 401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT 451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT 501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG 551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT 651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG
Cadena Pesada de Ab-16
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIKDYYIHWVRQA PGQGLEWIGR
51 VDPDÑ GETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED
101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV
151KDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPA VLQSSGLYSLSSW TVPSSNFGTQ
201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251LMISRTPEVT CWVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTF 301 RVVSVLTVVH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPA PIEKTISKTK GOPREPQVYT 351LPPSREEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPMLDS
4U1 mjSJPtLYSKL 1 VDKSR WQQG NVFSCSVMHE A LHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO:233)
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16 sin lisina carboxiloterminal:
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIKDYYIHWVRQA PGQGLEWIGR
51 VDPDNGETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED
101 YDGTYTWFPY WGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV
151KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSW TVPSSNFGTQ 201 TYTCNVDHKP SNTKVDKTVE RKCCVECPPC PAPPVAGPSV FLFPPKPKDT 251LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTF 301RVVSVLTVVH QDWLNGKEYKCKVSNKGLPA PIEKTISKTKGQPREPQVYT 351 LPPSREEMTKÑQVSLTCLVK GFYPSDIA VE WESNGQPENN YKTTPPMLDS 401 DGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHE ALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO:395)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-16:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC
51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT CGACATTAAG GACTACTATA
101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATCGGAAGG 151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT 351 CACCGTCTCT AGTGCCTCCA CCAAGGGCCC ATCGGTCTTC CCCCTGGCGC 401 CCTGCTCCAG GAGCACCTCC GAGAGCACAG CGGCCCTGGG CTGCCTGGTC 451 AAGGACTACT TCCCCGAACC GGTGACGGTG TCGTGGAACT CAGGCGCTCT 501 GACCAGCGGC GTGCACACCT TCCCAGCTGT CCTACAGTCC TCAGGACTCT 551 ACTCCCTCAG CAGCGTGGTG ACCGTGCCCT CCAGCAACTT CGGCACCCAG 601 ACCTACACCT GCAACGTAGA TCACAAGCCC AGCAACACCA AGGTGGACAA 651 GACAGTTGAG CGCAAATGTT GTGTCGAGTG CCCACCGTGC CCAGCACCAC 701 CTGTGGCAGG ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACC 751 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG 801 CCACGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAC GGCGTGGAGG 851 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCACGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTTC 901 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTTGTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA 951 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCAGCC CCCATCGAGA 1001 AAACCATCTC CAAAACCAAA GGGCAGCCCC GAGAACCACA GGTGTACACC 1051 CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG AACCAGGTCA GCCTGACCTG 1101 CCTGGTCAAA GGCTTCTACC CCAGCGACAT CGCCGTGGAG TGGGAGAGCA 1151 ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA CACCTCCCAT GCTGGACTCC 1201 GACGGCTCCT TCTTCCTCTA CAGCAAGCTC ACCGTGGACA AGAGCAGGTG 1251 GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT GATGCATGAG GCTCTGCACA 1301 ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT CTCCGGGTAA A (SEQ ID
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-16 incluyendo el péptido señal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEVICKPGASVKVS CKASGFDIKD
51 YYIHWVRQAP GQGLEWIGRV DPDNGETEFA PKFPGKVTMT TDTSISTAYM 101 ELSRLRSDDT AVYYCAREDY DGTYTWFPYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP 151 LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS 201 GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP 251 APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG 301 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP 35 1 IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW 401 ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA 451 LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO:235)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-16 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC
51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG
101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGATTCGA CATTAAGGAC 151 TACTATATAC ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 CGGAAGGGTT GATCCTGACA ATGGTGAGAC TGAATTTGCC CCGAAGTTCC 251 CGGGCAAGGT CACCATGACC ACAGACACGT CCATCAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGCA GGCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGAAGACTAC GATGGTACCT ACACCTGGTT TCCTTATTGG GGCCAAGGGA 401 CTCTGGTCAC CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC 451 CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG 501 CCTGGTCAAG GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG 551 GCGCTCTGAC CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA 601 GGACTCTACT CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG 651 CACCCAGACC TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG 701 TGGACAAGAC AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA 751 GCACCACCTG TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA 801 GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG 851 ACGTGAGCCA CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC 901 GTGGAGGTGC ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG 951 CACGTTCCGT GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA 1001 ACGGCAAGGA GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC 1051 ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT 1101 GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC 1151 TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG 1201 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT 1251 GGACTCCGAC GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA 1301 GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT 1351 CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID NO:236)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-16 son:
CDR-H1: DYYIH (SEQ ID NO: 293)
CDR-H2: RVDPDNGETEFAPKFPG (SEQ ID NO: 294)
CDR-H3: EDYDGTYTWFPY (SEQ ID NO: 295)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-16 son:
CDR-L1: RASSSISYIH (SEQ ID NO: 281)
CDR-L2: ATSNLAS (SEQ ID NO: 282)
CDR-L3: QQWSSDPLT (SEQ ID NO: 283)
Dominios variables de Ab-16
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-16 (sin secuencia señal):
1 DIQLTQSPSF L SA SV G D R V T IT C R A SSSIS YIHW YQQKPG KAPK LLIYAT 51 SN L A SG V PSR FSGSGSGTEF TLTISSLQPE D FA TYYCQ Q W SSDPLTFGGG 101 TKVEIK (SEQ ID N O :388)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-16 (sin secuencia señal):
1 GACATCCAGT TGACCCAGTC TCCATCCTTC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA 51 CAGAGTCACC ATCACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTATAAGT TACATACACT 101 GGTATCAGCA AAAACCAGGG AAAGCCCCTA AGCTCCTGAT CTATGCCACA 151 TCCAACCTGG CTTCTGGGGT CCCATCAAGG TTCAGCGGCA GTGGATCTGG 201 GACAGAATTC ACTCTCACAA TCAGCAGCCT GCAGCCTGAA GATTTTGCAA 251 CTTATTACTG TCAGCAGTGG AGTAGTGACC CACTCACGTT CGGCGGAGGG 301 ACCAAGGTGG AGATCAAA (SEQ ID NO:389)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-16 (sin secuencia señal):
1 EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFDIKDYYIHW VRQA PGQGLEWIGR 51 VDPDNGETEF APKFPGKVTM TTDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARED 101 YDGTYTW FPY WGQGTLVTVS S (SEQ ID N O :390)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-16 (sin secuencia señal):
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGGCCTC 51 AGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGATT CGACATTAAG GACTACTATA 101 TACACTGGGT GCGACAGGCC CCTGGACAAG GGCTTGAGTG GATCGGAAGG 151 GTTGATCCTG ACAATGGTGA GACTGAATTT GCCCCGAAGT TCCCGGGCAA 201 GGTCACCATG ACCACAGACA CGTCCATCAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GCAGGCTGAG ATCTGACGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GAGAGAAGAC 301 TACGATGGTA CCTACACCTG GTTTCCTTAT TGGGGCCAAG GGACTCTGGT 351 CACCGTCTCT AGT (SEQ ID NO:391)
Los anticuerpos adicionales se denominan en el presente documento Anticuerpos 17-22 (también denominados en el presente documento Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21 y Ab-22). La región constante Kappa para todas las regiones VK de Ab-17, Ab-19 y Ab-21 es la siguiente:
TDAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQD SKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (SEQ ID NO:323)
La Región Constante Pesada para todas las regiones VH de los anticuerpos, 17, 19 y 21 es la siguiente:
AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQS DLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIF PPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRS VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKD KVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEA GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (SEQ ID NO:324)
En las siguientes secuencias de aminoácidos de anticuerpos, los aminoácidos sombreados en cajas representan regiones determinantes de complementariedad (CDR) y los aminoácidos subrayados representan péptidos señal.
Ab-17
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
MDFOVOIFSFMLISVTVILSSGEIVLTOSPALMAASPGEKVTITCSVSSSTSSSNLHWSOOK SGTSPKLWIYGTSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWTTTYTFG SGTKLELKR (SEQ ID ÑO:299)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
ATGGATTTTCAGGTGCAGATTTTCAGCTTCATGCTAATCAGTGTCACAGTCATATTG TCCAGTGGAGAAATTGTGCTCACCCAGTCTCCAGCACTCATGGCTGCATCTCCAGGG GAGAAGGTCACCATCACCTGCAGTGTCAGCTCGAGTATAAGTTCCAGCAACTTACA CTGGTCCCAGCAGAAGTCAGGAACCTCCCCCAAACTCTGGATTTATGGCACATCCA ACCTTGCTTCTGGAGTCCCTGTTCGCTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACCTCTTATTC TCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGTCAACAGT GGACTACTACGTATACGTTCGGATCGGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID NO:300)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
MGWNWIIFFLMAVVTGVNSEVQLRQSGADLVKPGASVKLSCTASGFNIKDYYIHWVK QRPEQGLE WIGRIDPDNGÉSTYVPKFQGKATITADTS SNT A YLQLRSLTSEDT AIY Y CGR EGLDYGDYYAVDYWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO:301)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-17 incluyendo el péptido señal:
ATGGGATGGAACTGGATCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCA GAGGTGCAGTTGCGGCAGTCTGGGGCAGACCTTGTGAAGCCAGGGGCCTCAGTCAA GTTGTCCTGCACAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATACACTGGGTGAA GCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGATAATGGTG AAAGTACATATGTCCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCACTATAACAGCAGACACATCA TCCAACACAGCCTACCTACAACTCAGAAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCATCTA
Figure imgf000085_0001
Ab-17 se humanizó para generar Ab-18.
Ab-18
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
MDMRVPAOLLGLLLLWLPGARCDIOLTOSPSFLSASVGDRVTITCSVSSSISSSNLHWYO QKPGKAPKLLIYGTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTTTYTF GQGTKLEIKR (SEQ ID NO:303)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCCGGG CGCGCGCTGCGATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCGTGG GCGATCGCGTGACCATTACCTGCAGCGTGAGCAGCAGCATTAGCAGCAGCAACCTG CATTGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCACCAG CAACCTGGCGAGCGGCGTGCCGAGCCGGTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAAT TTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGC AGTGGACCACCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT (SEQ ID NO:304)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
MDWTWSILFLVAAPTGAHSBVOLVOSGABVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYIHWVR QAPGQGLEWMGRIDPDNGÉSTYVPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYY CAREGLDYGDYYAVDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:305)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-18 incluyendo el péptido señal:
ATGGATTGGACCTGGAGCATTCTGTTTCTGGTGGCGGCGCCGACCGGCGCGCATAG CGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTG AAAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATTCATTGGGT GCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGCATTGATCCGGATAACG GCGAAAGCACCTATGTGCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACC AGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGT GTATTATTGCGCGCGCGAAGGCCTGGATTATGGCGATTATTATGCGGTGGATTATTG GGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ IDNO:306)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-18 (sin secuencia señal):
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSVSSSISSSNLHWYQQKPGKAPKLL1YGTSNLASGVPS RFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQWTTTYTFGQGTKLEIKR (SEQ ID NO:368)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena ligera de Ab-18 (sin secuencia señal):
GATATTCAGCTGACCCAGAGCCCGAGCTTTCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGT GACCATTACCTGCAGCGTGAGCAGCAGCATTAGCAGCAGCAACCTGCATTGGTATC AGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATGGCACCAGCAACCTGGCG AGCGGCGTGCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGAATTTACCCTGAC CATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTGGACCA CCACCTATACCTTTGGCCAGGGCACCAAACTGGAAATTAAACGT (SEQ ID NO:369)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-18 (sin secuencia señal):
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYIHWVRQAPGQGLEWMGRIDPDNGE STYVPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAREGLDYGDYYAVDYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO:370)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-18 (sin secuencia señal): GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGA AAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATTCATTGGGTG CGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATGGGCCGCATTGATCCGGATAACGG CGAAAGCACCTATGTGCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACCA GCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTG TATTATTGCGCGCGCGAAGGCCTGGATTATGGCGATTATTATGCGGTGGATTATTGG GGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ IDNO:371)
Ab-19
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
MMSSAOFLGLLLLCFOGTRCPIOMTOTTSSLSASLGDRVNISCRASODJSSYLNWYOQK PDGTVKLLIYSTSRLÑSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLAQEDIATYFCQQDIKHPTFGGG TKLELKR (SEQ ID NO:307)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
ATGATGTCCTCTGCTCAGrrCCrrGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGAT GTGATATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAG T C AAC ATCAGCTGC AGGGC AAGTC AGG AC ATT AGC AGTTATTT AAACTGGT ATC AG CAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTCCACATCAAGATTAAACTC AGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCACTAT TAGCAACCTGGCACAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGATATTAAGC ATCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGTTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID NO:308)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
MEWIWIFLFLLSGTÁGVHSEVOLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGFTFTDYIMHWVKQ KPGQGLEWIGYíNPYNDDTEYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMDLSSLTSEGSAVYYCA RSIYYYDAPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:309)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-19 incluyendo el péptido señal:
ATGGAATGGATCTGGATATTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCT GAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAA GATGTCCTGCAAGGCTTCTGGGTTCACATTCACTGACTACATTATGCACTGGGTGAA GCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGGATTGGATATATTAATCCTTACAATGATG ATACTGAATACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCC TCCAGCACAGCCTACATGGATCTCAGCAGTCTGACCTCTGAGGGCTCTGCGGTCTAT TACTGTGCAAGATCGATTTATTACTACGATGCCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGG ACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO:310)
Ab-19 se humanizó para generar el Anticuerpo 20 (también denominado en el presente documento Ab-20) y el Anticuerpo 23 (también denominado en el presente documento Ab-23).
Ab-20
Versión de IgG4
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
MMSSAOFLGLLLLCFOGTRCDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISSYLNWYQQK PGKAPKLLIYSTSRLNSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDIKHPTFGQG Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
ATGATGTCCTCTGCTCAGTTCCTTGGTCTCCTGTTGCTCTGTTTTCAAGGTACCAGAT GTGATATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTGACCGTG TCACCATCACTTGCCGCGCAAGTCAGGATATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGC AGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATTCTACTTCCCGTTTGAATAGTG GGGTCCCATCACGCTTCAGTGGCAGTGGCTCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCA GCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGGATATTAAACACC CTACGTTCGGTCAAGGCACCAAGGTGGAGATCAAACGT (SEQ ID NO:312) Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
MEWIWIFLFLLSGTAGVHSEVOLVOSGAEVKKPGSSVKVSCKASGFTFTbYlMHWVRO APGQGLEWMGYINPYNDDfEYNEkFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCA RSIYYYDAPFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:313)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-20 incluyendo el péptido señal:
ATGGAATGGATCTGGATATTTCTCTTCCTCCTGTCAGGAACTGCAGGTGTCCACTCT
"'GAGGTGC'AG'CTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAA
GGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTTTACCTTCACCGACTATATTATGCACTGGGTGCG
TCAGGCCCCTGGTCAAGGGCTTGAGTGGATGGGCTATATCAACCCTTATAATGATG
ACACCGAATACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGTGTCACGATTACCGCGGACAAATCC
ACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCCGTGTA
TTACTGTGCGCGTTCGATTTATTACTACGATGCCCCGTTTGCTTACTGGGGCCAAGG
GACTCTGGTCACAGTCTCGAGC (SEQ ID NO:349)
Ab-23
Versión de IgG2
Cadena Ligera:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-23:
1 DIQMTQSPSS LSASVG DRVTITCRASQ DIS SYLÑjWYQQKP GKAPKLLIYS 51 TSRLNSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ DIKHPTFGQG 101 TKVE1KRTVA APSVFIFPPS DEQLKSGTAS VVCLLNNFYP REAKVQWKVD 1 51NALQSGNSQE SVTEQDSKDS TYSLSSTLTL SKADYEKHKV YACEVTHQGL 2 01 SSPVTKSFNR GEC (SEQ ID NO:341)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-23:
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGTGA 51 CCGTGTCACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA GGATATTAGC AGCTATTTAA 101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCT 151 ACTTCCCGTT TGAATAGTGG GGTCCCATCA CGCTTCAGTG GCAGTGGCTC 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG 251 CAACTTACTA CTGTCAACAG GATATTAAAC ACCCTACGTT CGGTCAAGGC 301 ACCAAGGTGG AGATCAAACG TACGGTGGCT GCACCATCTG TCTTCATCTT 351 CCCGCCATCT GATGAGCAGT TGAAATCTGG AACTGCCTCT GTTGTGTGCC 401 TGCTGAATAA CTTCTATCCC AGAGAGGCCA AAGTACAGTG GAAGGTGGAT 451 AACGCCCTCC AATCGGGTAA CTCCCAGGAG AGTGTCACAG AGCAGGACAG 501 CAAGGACAGC ACCTACAGCC TCAGCAGCAC CCTGACGCTG AGCAAAGCAG 551 ACTACGAGAA ACACAAAGTC TACGCCTGCG AAGTCACCCA TCAGGGCCTG 601 AGCTCGCCCG TCACAAAGAG CTTCAACAGG GGAGAGTGT (SEQ ID NO:342)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-23 incluyendo el péptido señal:
1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQMTQSP SSLSASVGDR VTITCRASQD
51 ISSYLNWYQQ KPGKAPKLLI YSTSRLNSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL 101 QPEDFATYYC QQDIKHPTFG QGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT 151 ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-23 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACATGA GGGTGCCCGC TCAGCTCCTG GGGCTCCTGC TGCTGTGGCT 51 GAGAGGTGCC AGATGTGACA TCCAGATGAC CCAGTCTCCA TCCTCCCTGT ---- .— •InU* i | U 'u tlU . __
101 CTGCATCTGT AGGTGACCGT GTCACCATCA CTTGCCGCGC AAGTCAGGAT
151 ATTAGCAGCT ATTTAAATTG GTATCAGCAG AAACCAGGGA AAGCCCCTAA
201 GCTCCTGATC TATTCTACTT CCCGTTTGAA TAGTGGGGTC CCATCACGCT 251 TCAGTGGCAG TGGCTCTGGG ACAGATTTCA CTCTCACCAT CAGCAGTCTG 301 CAACCTGAAG ATTTTGCAAC TTACTACTGT CAACAGGATA TTAAACACCC 351 TACGTTCGGT CAAGGCACCA AGGTGGAGAT CAAACGTACG GTGGCTGCAC 401 CATCTGTCTT CATCTTCCCG CCATCTGATG AGCAGTTGAA ATCTGGAACT 451 GCCTCTGTTG TGTGCCTGCT GAATAACTTC TATCCCAGAG AGGCCAAAGT 501 ACAGTGGAAG GTGGATAACG CCCTCCAATC GGGTAACTCC CAGGAGAGTG 551 TCACAGAGCA GGACAGCAAG GACAGCACCT ACAGCCTCAG CAGCACCCTG 601 ACGCTGAGCA AAGCAGACTA CGAGAAACAC AAAGTCTACG CCTGCGAAGT 651 CACCCATCAG GGCCTGAGCT CGCCCGTCAC AAAGAGCTTC AACAGGGGAG 701 AGTGT (SEQ ID NO:344)
Cadena Pesada:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23:
1 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWYRQA PGQGLEWMGY
5 1 INPYNDDTEY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSI
101 YYYDAPFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCL VK
151DYFPEPVTVS WNSGALTSGVHTFPA VLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT
201 YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVA GPSVFLFPPKPKDTL
251MISRTPEVTC WVDVSHEDP EVQFNJVYVDG VEVHNAKTKPREEQFNSTFR
301 VVSVLTVVHQ DIVLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTL
351PPSREEMTKN QVSLTCL VKG FYPSDIA VEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD
401 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO:345)
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23 sin lisina carboxiloterminal:
1 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGFTFT DYIMHWVRQA PGQGLEWMGY
51 INPYNDDTEY NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARSI
101 YYYDAPFAYW GQGTLVTVSS ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCL VK
151 DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPA VLQSS GLYSLSSWT VPSSNFGTQT
201 YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVFLFPPKPKDTL
251 MISRTPEVTC W VD VSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFNSTFR
301 W S VL TW H Q D WLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQ VYTL
351 PPSREEMTKN QVSLTCL VKG FYPSDIA VEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD
401 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPG (SEQ ID NO:396)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-23:
1 GAGGTGCAGC TGGTGCAGTC TGGGGCTGAG GTGAAGAAGC CTGGGTCCTC 51 GGTGAAGGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGTTT TACCTTCACC GACTATATTA 101 TGCACTGGGT GCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGGCTAT I M A l t ' \ A t V t i : A l W I G A I t i A ( 'A( ( < T A A l ' A t ' A A t '( .At . AAt i I I V A A u A u U t.
201 TGTCÁCGÁTT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGA 251 GCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGTTCGATT 301 TATTACTACG ATGCCCCGTT TGCTTACTGG GGCCAAGGGA CTCTGGTCAC 351 CGTCTCTAGT GCCTCCACCA AGGGCCCATC GGTCTTCCCC CTGGCGCCCT 401 GCTCCAGGAG CACCTCCGAG AGCACAGCGG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG 451 GACTACTTCC CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCTCTGAC 501 CAGCGGCGTG CACACCTTCC CAGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT 551 CCCTCAGCAG CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAACTTCGG CACCCAGACC 601 TACACCTGCA ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAC 651 AGTTGAGCGC AAATGTTGTG TCGAGTGCCC ACCGTGCCCA GCACCACCTG 701 TGGCAGGACC GTCAGTCTTC CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC 751 ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACGTGC GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA 801 CGAAGACCCC GAGGTCCAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC GTGGAGGTGC 851 ATAATGCCAA GACAAAGCCA CGGGAGGAGC AGTTCAACAG CACGTTCCGT 901 GTGGTCAGCG TCCTCACCGT TGTGCACCAG GACTGGCTGA ACGGCAAGGA 951 GTACAAGTGC AAGGTCTCCA ACAAAGGCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA 1001 CCATCTCCAA AACCAAAGGG CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG 1051 CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT 1101 GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG 1151 GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACAC CTCCCATGCT GGACTCCGAC 1201 GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA 1251 GCAGGGGAAC GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC 1301 ACTACACGCA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC CGGGTAAA (SEQ ID NO:346)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-23 incluyendo el péptido señal:
1 MDWTWRILFL VAAATGAHSE VQLVQSGAEV KKPGSSVKVS CKASGFTFTD 51 YIMHWVRQAP GQGLEWMGYINPYNDDTEYN EKFKGRVTIT ADKSTSTAYM 101 ELSSLRSEDT AVYYCARSIY YYDAPFAYWG QGTLVTVSSA STKGPSVFPL 151 APCSRSTSES TAALGCLVKD YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG 201 LYSLSSVVTV PSSNFGTQTY TCNVDHKPSN TKVDKTVERK CCVECPPCPA 251 PPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCV VVDVSHEDPE VQFNWYVDGV 301 EVHNAKTKPR EEQFNSTFRV VSVLTVVHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPAPI 351 EKTISKTKGQ PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE 401 SNGQPENNYK TTPPMLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL 451 HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ ID NO:347)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-23 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGACTGGA CCTGGAGGAT CCTCTTCTTG GTGGCAGCAG CCACAGGAGC 51 CCACTCCGAG GTGCAGCTGG TGCAGTCTGG GGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGTCCTCGGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTTTAC CTTCACCGAC 151 TATATTATGC ACTGGGTGCG TCAGGCCCCT GGTCAAGGGC TTGAGTGGAT 201 GGGCTATATC AACCCTTATA ATGATGACAC CGAATACAAC GAGAAGTTCA 251 AGGGCCGTGT CACGATTACC GCGGACAAAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GAGCTGAGCA GCCTGCGCTC TGAGGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGCG 351 TTCGATTTAT TACTACGATG CCCCGTTTGC TTACTGGGGC CAAGGGACTC 401 TGGTCACCGT CTCTAGTGCC TCCACCAAGG GCCCATCGGT CTTCCCCCTG 451 GCGCCCTGCT CCAGGAGCAC CTCCGAGAGC ACAGCGGCCC TGGGCTGCCT 501 GGTCAAGGAC TACTTCCCCG AACCGGTGAC GGTGTCGTGG AACTCAGGCG 551 CTCTGACCAG CGGCGTGCAC ACCTTCCCAG CTGTCCTACA GTCCTCAGGA
601 CTCTACTCCC TCAGCAGCGT GGTGACCGTG CCCTCCAGCA ACTTCGGCAC 651 CCAGACCTAC ACCTGCAACG TAGATCACAA GCCCAGCAAC ACCAAGGTGG 701 ACAAGACAGT TGAGCGCAAA TGTTGTGTCG AGTGCCCACC GTGCCCAGCA 751 CCACCTGTGG CAGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 801 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACGTGCGTG GTGGTGGACG 851 TGAGCCACGA AGACCCCGAG GTCCAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG 901 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCACGG GAGGAGCAGT TCAACAGCAC 951 GTTCCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTTGT GCACCAGGAC TGGCTGAACG 1001 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGGCCTCCC AGCCCCCATC 1051 GAGAAAACCA TCTCCAAAAC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA 1101 CACCCTGCCC CCATCCCGGG AGGAGATGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 1151 CCTGCCTGGT CAAAGGCTTC TACCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1201 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACACCTC CCATGCTGGA 1251 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA 1301 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 1351 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTCTCCGG GTAAA (SEQ ID NO:348)
Las secuencias de CDR (región determinante de complementariedad) en la región variable de la cadena pesada de Ab-23 son las siguientes:
CDR-H1: DYIMH (SEQ ID NO: 269)
CDR-H2: YINPYNDDTEYNEKFKG (SEQ ID NO: 270)
CDR-H3: SIYYYDAPFAY (SEQ ID NO: 271)
Las secuencias de CDR de región variable de la cadena ligera de Ab-23 son:
CDR-L1: RASQDISSYLN (SEQ ID NO: 239)
CDR-L2: STSRLNS (SEQ ID NO: 240)
CDR-L3: QQDIKHPT (SEQ ID NO: 241)
Dominios variables de Ab-23:
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera de Ab-23 (sin secuencia señal):
D IQ M T Q SP SS L S A S V G D R V T IT C R A S Q D IS SY L N W Y Q Q K P G K A PK LL IY S T SR L N SG V P S R FSG SG SG T D FTLTISSLQ P E D FA T Y Y C Q Q DIK H PTFG Q G T K V EIK (SE Q ID N O :364)
S e c u e n c ia d e A D N d e d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra d e A b -23 (s in s e c u e n c ia s e ñ a l) :
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGTGACCGTGTC ACC ATCACTTGCC GCGCAAGTCA GGATATTAGC AGCTATTTAAATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCTACTTCCCGTT TGAATAGTGG GGTCCCATCA CGCTTCAGTG GCAGTGGCTCTGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTGCAACTTACTA CTGTCAACAG GATATTAAAC ACCCTACGTT CGGTCAAGGCACCAAGGTGG AGATCAAA (SEQ ID NO:365)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-23 (sin secuencia señal):
EVQLVQSGAE V K K PG SSV K V SCKASGFTFT DYIM H W VRQ A
PG QGLEW M G YINPYNDDTEY N EK FK G R V TITA D K STSTA Y M ELSSLRSED
TA V Y Y C A R SIY Y Y D APF A Y W GQGTLVTVSS (SEQ ID NO :366)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-23 (sin secuencia señal):
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAA GGTC TCCTGCAAGG CTTCTGGTTT TACCTTCACC GACTATATTATGCACTGGGT GCGTCAGGCC CCTGGTCAAG GGCTTGAGTG GATGGGCTATATCAACCCTT ATAATGATGA CACCGAATAC AACGAGAAGT TCAAGGGCCGTGTCACGATT ACCGCGGACA AATCCACGAG CACAGCCTAC ATGGAGCTGAGCAGCCTGCG CTCTGAGGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC GCGTTCGATTTATTACTACG ATGCCCCGTT TGCTTACTGG GGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTCTCTAGT (SEQ ID NO: 367)
Ab-21
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:
MKSOTOVFVYMLLWLSGVEGDIVMTOSHKFMSTSVGDRVTITCKÁSODYFTAVAWYO QKPGQSPKLLIYW ASTRHTG VPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDL ADYFCQQY S S YPLT FGAGTKLELKR (SEQ ID NO:315)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:
ATGAAGTCACAGACCCAGGTCTTTGTATACATGTTGCTGTGGTTGTCTGGTGTTGAA GGAGACATTGTGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACGTCAGTAGGAGACAG GGTCACCATCACCTGCAAGGCCAGTCAGGATGTCTTTACTGCTGTAGCCTGGTATCA ACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTACTGATTTACTGGGCATCCACCCGGCACA CTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCA TTAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGTCAACAATATAGCAGCT ATCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGTTGGAGCTGAAACGT (SEQ ID NO:316)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-21 incluyendo el péptido señal:
MGWNWIIFFLMAVVTGVNSEVOLOOSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKDYYMHWV KQRPEQGLEWIGRIDPENGDÍIYDPKFQGKASITTDTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCA YDAGDPAWFTYWGQGTLVTVSS (SEQ IDNO:317)
S e c u e n c ia d e á c id o n u c le ic o d e la H C d e A b -21 in c lu y e n d o el p é p tid o se ñ a l:
ATGGGATGGAACTGGATCATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTCAATTCA GAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGGCCTTAGTCAA GTTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCTTCAATATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAA GCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAGTGGATTGGAAGGATTGATCCTGAGAATGGTG ATATTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGTATAACAACAGACACATCC TCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACGTCTGAGGACACTGCCGTCTAT TACTGTGCTTACGATGCTGGTGACCCCGCCTGGTTTACTTACTGGGGCCAAGGGACT CTGGTCACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:318)
Ab-21 se humanizó para producir Ab-22.
Ab-22
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
MDMRVPAOLLGLLLLWLRGARCDIOMTOSPSSLSASVGDRVTITCKASODVFTAVAW Y QQKPGKAPKLLIYW ASTRHTG VPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFATYY CQQ Y S S YP LTFGGGTKVEIKR (SEQ ID NO:319)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
ATGGATATGCGCGTGCCGGCGCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGCTGCGCGG CGCGCGCTGCGATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGG GCGATCGCGTGACCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGTTTACCGCGGTGGCG TGGTATCAGCAGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAGCAC CCGCCATACCGGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTA CCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGT ATAGCAGCTATCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT (SEQ ID NO:320)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
MDWTWSILFLVAAPTGAHSEVOLVOSGAEVKKPGASVKVSCKASGFNIKDYYMHWV RQAPGQGLEWIGRIDPENGDIIYDPKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYC AYDAGDPAWFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:321)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-22 incluyendo el péptido señal:
ATGGATTGGACCTGGAGCATTCTGTTTCTGGTGGCGGCGCCGACCGGCGCGCATAG CGAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTG AAAGTGAGCTGCAAAGCG AGCGGCTTTA AC ATT AAAGATT ATT AT ATGC ATTGGGT GCGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCCGCATTGATCCGGAAAAC GGCGATATTATTTATGATCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACC AGCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGT GTATTATTGCGCGTATGATGCGGGCGATCCGGCGTGGTTTACCTATTGGGGCCAGGG CACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:322)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera de Ab-22 (sin secuencia señal):
DIQ M TQ SPSS L SA SV G D R V T IT C K A SQ D V F TA V A W Y Q Q K P GKAPKLLIYW ASTRH TG VPS RFSG SG SG TD FTLTISSLQP ED FA TYY C Q Q YSSYPLTFGG GTKVEIKR (SEQ ID N O :336)
S e c u e n c ia d e A D N d e d o m in io v a r ia b le d e c a d e n a lig e ra d e A b -22 (s in s e c u e n c ia s e ñ a l) : GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAGCGCGAGCGTGGGCGATCGCGT GACCATTACCTGCAAAGCGAGCCAGGATGTGTTTACCGCGGTGGCGTGGTATCAGC AGAAACCGGGCAAAGCGCCGAAACTGCTGATTTATTGGGCGAGCACCCGCCATACC GGCGTGCCGAGTCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCAT TAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTATAGCAGCT ATCCGCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAAGTGGAAATTAAACGT (SEQ IDNO:337)
Secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena pesada de Ab-22 (sin secuencia señal):
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGFNIK DYYMHWVRQA
PGQGLEWIGRIDPENGDIIY DPKFQGRVTM TTDTSTSTAY MELRSLRSDD
TAVYYCAYDAGDPAWFTYWG QGTLVTVSS (SEQ ID NO:338)
Secuencia de ADN de dominio variable de cadena pesada de Ab-22 (sin secuencia señal):
GAAGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCGGAAGTGAAAAAACCGGGCGCGAGCGTGA AAGTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTTTAACATTAAAGATTATTATATGCATTGGGTG CGCCAGGCGCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATCGGCCGCATTGATCCGGAAAACG GCGATATTATTTATGATCCGAAATTTCAGGGCCGCGTGACCATGACCACCGATACCA GCACCAGCACCGCGTATATGGAACTGCGCAGCCTGCGCAGCGATGATACCGCGGTG TATTATTGCGCGTATGATGCGGGCGATCCGGCGTGGTTTACCTATTGGGGCCAGGGC ACCCTGGTGACCGTCTCGAGC (SEQ ID NO:339).
Para Ab-18, Ab-20 y Ab-22, la región constante kappa humana de cadena ligera es la siguiente:
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQD
y la región constante gamma-4 humana de cadena pesada es la siguiente:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK* (SEQ ID NO:326)
La región bisagra contiene la mutación Ser-241-Pro para mejorar la estabilidad de la bisagra (Angal S et al., (1993), Mol Immunol, 30 (1), 105-108).
Ab-24
Las secuencias de las LC y HC del Anticuerpo 24 (también denominado en el presente documento Ab-24) son las siguientes:
Cadena Ligera:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-24:
1 DIVLTQSPAS LAVSLGQRATIACKASQSVD YDGTSYMNW Y QQKPGQPPKL
51 LIYAASNLES EIPARFSGTG SGTDFTLNIH PVEEEDITTY YCQQSNEDPF 101 TFGGGTKLÉf'KiL4Z)/L4PrKS' IFPPSSEQL T SGGASVVCFL NNFYPKDINV
151 KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS STLTL TKDEY ERHNSYTCEA
201 THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID NO:350)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la LC de Ab-24:
1 GACATTGTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT CTCTAGGGCA 51 GAGGGCCACC ATCGCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT TATGATGGTA 101 CTAGTTATAT GAATTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC ACCCAAACTC 151 CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GAGATCCCAG CCAGGTTTAG 201 TGGCACTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT CCTGTGGAGG 251 AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA GGATCCGTTC 301 ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG ATGCTGCACC 351 AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA TCTGGAGGTG 401 CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA CATCAATGTC 451 AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGA ACGACAA AATGGCGTCC TGAACAGTTG 501 GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC AGCACCCTCA 551 CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC CTGTGAGGCC 601 ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA ACAGGAATGA 651 GTGTTAG (SEO ID NO:354)
Secuencia de aminoácidos de la LC de Ab-24 incluyendo el péptido señal:
1 METDTILLWV LLLWVPGSTG DIVLTQSPAS LAVSLGQRATIACKASQSVD 51 YDGTSYMNWY QQKPGQPPKL LIYAASNLES EIPARFSGTG SGTDFTLNIH 101 PVEEEDITTY YCQQSNEDPF TFGGGTKLEIKRADAAPTVS IFPPSSEQLT 151 SGGASVVCFL NNFYPKDINV KWKIDGSERQ NGVLNSWTDQ DSKDSTYSMS 201 STLTLTKDEY ERHNSYTCEA THKTSTSPIV KSFNRNEC (SEQ ID NO:355)
Secuencia de ácido nucleico de la LC de Ab-24 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGAGACAG ACACAATCCT GCTATGGGTG CTGCTGCTCT GGGTTCCAGG
51 CTCCACTGGT GACATTGTGT TGACCCAGTC TCCAGCTTCT TTGGCTGTGT 101 CTCTAGGGCA GAGGGCCACC ATCGCCTGCA AGGCCAGCCA AAGTGTTGAT 151 TATGATGGTA CTAGTTATAT GAATTGGTAC CAACAGAAAC CAGGACAGCC 201 ACCCAAACTC CTCATCTATG CTGCATCCAA TCTAGAATCT GAGATCCCAG 251 CCAGGTTTAG TGGCACTGGG TCTGGGACAG ACTTCACCCT CAACATCCAT 301 CCTGTGGAGG AGGAGGATAT CACAACCTAT TACTGTCAGC AAAGTAATGA 351 GGATCCGTTC ACGTTCGGAG GGGGGACCAA GTTGGAAATA AAACGGGCTG 401 ATGCTGCACC AACTGTATCC ATCTTCCCAC CATCCAGTGA GCAGTTAACA 451 TCTGGAGGTG CCTCAGTCGT GTGCTTCTTG AACAACTTCT ACCCCAAAGA 501 CATCAATGTC AAGTGGAAGA TTGATGGCAG TGAACGACAA AATGGCGTCC 551 TGAACAGTTG GACTGATCAG GACAGCAAAG ACAGCACCTA CAGCATGAGC 601 AGCACCCTCA CGTTGACCAA GGACGAGTAT GAACGACATA ACAGCTATAC 651 CTGTGAGGCC ACTCACAAGA CATCAACTTC ACCCATTGTC AAGAGCTTCA 701 ACAGGAATGA GTGTTAG (SEQ ID NO:356)
Cadena Pesada de Ab-24:
Secuencia de aminoácidos de la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-24:
1 QVQLQQPGTE LVRPGTSVKL SCKASGYIFT TYWMNWVKQR PGQGLEWIGM 51 IHPSASEIRL DQKFKDKATL TLDKSSSTAY MHLSGPTSVD SAVYYCARSG
101 EWGSMDYWGQ GTSVTVSSAK TTPPSVYPLA PGSAA QTNSM VTLGCL VKGY 151 FPEPVTVTWN SGSLSSGVHT FPA VLQSDLY TLSSSVTVPS STWPSETVTC 201 NVAHPASSTK VDKKIVPRDC GCKPCICTVP EVSSVFIFPPKPKDVLTITL
251 TPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDD VEVH TA QTQPREEQ FNSTFRSVSE 301 LPIMHQDWLN GKEFKCR VNS AAFPAPIEKTISKTKGRPKA PQVYTIPPPK 351 EQMAKDKVSL TCMITDFFPEDITVEWQWNG QPAENYKNTQ PIMDTDGSYF 401 IYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSP G K (SEQ ID NO:357)
Secuencia de ácido nucleico que codifica la forma madura (péptido señal retirado) de la HC de Ab-24:
1 CAGGTCCAAC TACAGCAGCC TGGGACTGAG CTGGTGAGGC CTGGAACTTC
51 AGTGAAGTTG TCCTGTAAGG CTTCTGGCTA CATCTTCACC ACCTACTGGA 101 TGAACTGGGT GAAACAGAGG CCTGGACAAG GCCTTGAGTG GATTGGCATG 151 ATTCATCCTT CCGCAAGTGA AATTAGGTTG GATCAGAAAT TCAAGGACAA 201 GGCCACATTG ACTCTTGACA AATCCTCCAG CACAGCCTAT ATGCACCTCA 251 GCGGCCCGAC ATCTGTGGAT TCTGCGGTCT ATTACTGTGC AAGATCAGGG 301 GAATGGGGGT CTATGGACTA CTGGGGTCAA GGAACCTCAG TCACCGTCTC 351 CTCAGCCAAA ACGACACCCC CATCTGTCTA TCCACTGGCC CCTGGATCTG 401 CTGCCCAAAC TAACTCCATG GTGACCCTGG GATGCCTGGT CAAGGGCTAT 451 TTCCCTGAGC CAGTGACAGT GACCTGGAAC TCTGGATCCC TGTCCAGCGG 501 TGTGCACACC TTCCCAGCTG TCCTGCAGTC TGACCTCTAC ACTCTGAGCA 551 GCTCAGTGAC TGTCCCCTCC AGCACCTGGC CCAGCGAGAC CGTCACCTGC 601 AACGTTGCCC ACCCGGCCAG CAGCACCAAG GTGGACAAGA AAATTGTGCC 651 CAGGGATTGT GGTTGTAAGC CTTGCATATG TACAGTCCCA GAAGTATCAT 701 CTGTCTTCAT CTTCCCCCCA AAGCCCAAGG ATGTGCTCAC CATTACTCTG 751 ACTCCTAAGG TCACGTGTGT TGTGGTAGAC ATCAGCAAGG ATGATCCCGA 801 GGTCCAGTTC AGCTGGTTTG TAGATGATGT GGAGGTGCAC ACAGCTCAGA 851 CGCAACCCCG GGAGGAGCAG TTCAACAGCA CTTTCCGCTC AGTCAGTGAA 901 CTTCCCATCA TGCACCAGGA CTGGCTCAAT GGCAAGGAGT TCAAATGCAG 951 GGTCAACAGT GCAGCTTTCC CTGCCCCCAT CGAGAAAACC ATCTCCAAAA 1001 CCAAAGGCAG ACCGAAGGCT CCACAGGTGT ACACCATTCC ACCTCCCAAG 1051 GAGCAGATGG CCAAGGATAA AGTCAGTCTG ACCTGCATGA TAACAGACTT 1101 CTTCCCTGAA GACATTACTG TGGAGTGGCA GTGGAATGGG CAGCCAGCGG 1151 AGAACTACAA GAACACTCAG CCCATCATGG ACACAGATGG CTCTTACTTC 1201 ATCTACAGCA AGCTCAATGT GCAGAAGAGC AACTGGGAGG CAGGAAATAC 1251 TTTCACCTGC TCTGTGTTAC ATGAGGGCCT GCACAACCAC CATACTGAGA 1301 AGAGCCTCTC CCACTCTCCT GGTAAATGA (SEQ ID NO:361)
Secuencia de aminoácidos de la HC de Ab-24 incluyendo el péptido señal:
1 MGWSSIILFL VATATGVHSQ VQLQQPGTEL VRPGTSVKLS CKASGYIFTT 51 YWMNWVKQRP GQGLEWIGMIHPSASEIRLD QKFKDKATLT LDKSSSTAYM 101 HLSGPTSVDS AVYYCARSGE WGSMDYWGQG TSVTVSSAKT TPPSVYPLAP 151 GSÁAQTNSMV TLGCLVKGYF PEPVTVTWNS GSLSSGVHTF PAVLQSDLYT 201 LSSSVTVPSS TWPSETVTCN VAHPASSTKV DKKIVPRDCG CKPCICTVPE 251 VSSVFIFPPK PKDVLTITLT PKVTCVVVDI SKDDPEVQFS WFVDDVEVHT 301 AQTQPREEQF NSTFRSVSEL PIMHQDWLNG KEFKCRVNSA AFPAPIEKTí 351 SKTKGRPKAP QVYTIPPPKE QMAKDKVSLT CMITDFFPED ITVEWQWNGQ 401 PAENYKNTQP IMDTDGSYFIYSKLNVQKSN WEAGNTFTCS VLHEGLHNHH 451 TEKSLSHSPG K (SEQ ID NO:362)
Secuencia de ácido nucleico de la HC de Ab-24 incluyendo la secuencia codificante del péptido señal:
1 ATGGGATGGA GCTCTATCAT CCTCTTCTTG GTAGCAACAG CTACAGGTGT
51 CCACTCCCAG GTCCAACTAC AGCAGCCTGG GACTGAGCTG GTGAGGCCTG 101 GAACTTCAGT GAAGTTGTCC TGTAAGGCTT CTGGCTACAT CTTCACCACC 151 TACTGGATGA ACTGGGTGAA ACAGAGGCCT GGACAAGGCC TTGAGTGGAT 201 TGGCATGATT CATCCTTCCG CAAGTGAAAT TAGGTTGGAT CAGAAATTCA 251 AGGACAAGGC CACATTGACT CTTGACAAAT CCTCCAGCAC AGCCTATATG 301 CACCTCAGCG GCCCGACATC TGTGGATTCT GCGGTCTATT ACTGTGCAAG 351 ATCAGGGGAA TGGGGGTCTA TGGACTACTG GGGTCAAGGA ACCTCAGTCA 401 CCGTCTCCTC AGCCAAAACG ACACCCCCAT CTGTCTATCC ACTGGCCCCT 451 GGATCTGCTG CCCAAACTAA CTCCATGGTG ACCCTGGGAT GCCTGGTCAA 501 GGGCTATTTC CCTGAGCCAG TGACAGTGAC CTGGAACTCT GGATCCCTGT 551 CCAGCGGTGT GCACACCTTC CCAGCTGTCC TGCAGTCTGA CCTCTACACT 601 CTGAGCAGCT CAGTGACTGT CCCCTCCAGC ACCTGGCCCA GCGAGACCGT 651 CACCTGCAAC GTTGCCCACC CGGCCAGCAG CACCAAGGTG GACAAGAAAA 701 TTGTGCCCAG GGATTGTGGT TGTAAGCCTT GCATATGTAC AGTCCCAGAA 751 GTATCATCTG TCTTCATCTT CCCCCCAAAG CCCAAGGATG TGCTCACCAT 801 TACTCTGACT CCTAAGGTCA CGTGTGTTGT GGTAGACATC AGCAAGGATG 851 ATCCCGAGGT CCAGTTCAGC TGGTTTGTAG ATGATGTGGA GGTGC ACACA 901 GCTCAGACGC AACCCCGGGA GGAGCAGTTC AACAGCACTT TCCGCTCAGT 951 CAGTGAACTT CCCATCATGC ACCAGGACTG GCTCAATGGC AAGGAGTTCA 1001 AATGCAGGGT CAACAGTGCA GCTTTCCCTG CCCCCATCGA GAAAACCATC 1051 TCCAAAACCA AAGGCAGACC GAAGGCTCCA CAGGTGTACA CCATTCCACC 1101 TCCCAAGGAG CAGATGGCCA AGGATAAAGT CAGTCTGACC TGCATGATAA 1151 CAGACTTCTT CCCTGAAGAC ATTACTGTGG AGTGGCAGTG GAATGGGCAG 1201 CCAGCGGAGA ACTACAAGAA CACTCAGCCC ATCATGGACA CAGATGGCTC 1251 TTACTTCATC TACAGCAAGC TCAATGTGCA GAAGAGCAAC TGGGAGGCAG 1301 GAAATACTTT CACCTGCTCT GTGTTACATG AGGGCCTGCA CAACCACCAT 1351 ACTGAGAAGA GCCTCTCCCA CTCTCCTGGT AAATGA (SEQ ID NO:363)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena ligera de Ab-24 son las siguientes:
CDR-L1: KASQSVDYDGTSYMN (SEQ ID NO: 351)
CDR-L2: AASNLES (SEQ ID NO: 352)
CDR-L3: QQSNEDPFT (SEQ ID NO: 353)
Las secuencias de CDR en la región variable de la cadena pesada de Ab-24 son las siguientes:
CDR-H1: TYWMN (SEQ ID NO: 358)
CDR-H2: MIHPSASEIRLDQKFKD (SEQ ID NO: 359)
CDR-H3: SGEWGSMDY (SEQ ID NO: 360)
La Tabla 1 a continuación proporciona la SEQ ID NO y secuencias de aminoácidos de las CDR de Ab-A, Ab-B, Ab­ C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24. L1, L2 y L3 se refieren a las CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 y H1, H2 y H3 se refieren a las CDR de cadena pesada 1, 2 y 3 de acuerdo con el sistema de numeración Kabat (Kabat et al., 1987 en Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos).
Figure imgf000099_0001
continuación
Figure imgf000100_0001
Un oligopéptido o polipéptido puede tener una secuencia de aminoácidos que es al menos 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a al menos una de las CDR de la Tabla 1 anterior; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que bloquea de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24 con esclerostina, y/o está bloqueada de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24; y/o con una CDR de un agente de unión a esclerostina en donde el agente de unión puede bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o a una c Dr de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo de Bucle 2; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo T20,6; y/o a una CDR de un agente de unión a esclerostina que se une a un epítopo “derivado de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)”.
Los polipéptidos y anticuerpos del agente de unión a esclerostina pueden tener secuencias de aminoácidos que son al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a una región variable de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24, y bloquean de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24 con esclerostina, y/o están bloqueados de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24; y/o pueden bloquear el efecto inhibidor de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o unirse a un epítopo de bucle 2; y/o unirse a un epítopo T20,6; y/o unirse a un epítopo “derivado de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)”.
Los polinucleótidos que codifican agentes de unión a esclerostina pueden tener secuencias polinucleotídicas que son al menos 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idénticas a un polinucleótido que codifica una región variable de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21; Ab-22, Ab-23 y Ab-24 y en donde los agentes de unión a esclerostina codificados bloquean de forma cruzada la unión de al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23, y Ab-24 con esclerostina, y/o están bloqueados de forma cruzada de la unión con esclerostina por al menos uno de los anticuerpos Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D, Ab-1, Ab-2, Ab-3, Ab-4, Ab-5, Ab-6, Ab-7, Ab-8, Ab-9, Ab-10, Ab-11, Ab-12, Ab-13, Ab-14, Ab-15, Ab-16, Ab-17, Ab-18, Ab-19, Ab-20, Ab-21, Ab-22, Ab-23 y Ab-24; y/o pueden bloquear el efecto de esclerostina en un ensayo de mineralización basado en células (es decir, un agente de unión neutralizante de esclerostina); y/o se unen a un epítopo de bucle 2; y/o se unen a un epítopo T20,6; y/o se unen a un epítopo “derivado de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)”.
Los anticuerpos pueden tener una afinidad de unión por esclerostina humana de menos de o igual a 1 x 10'7 M, menos de o igual a 1 x 10'8 M, menos de o igual a 1 x 10'9 M, menos de o igual a 1 x 10'10 M, menos de o igual a 1 x 10'11 M o menos de o igual a 1 x 10'12 M.
La afinidad de un agente de unión tal como un anticuerpo o compañero de unión, así como el grado en el que un agente de unión (tal como un anticuerpo) inhibe la unión, puede determinarse por un experto habitual en la materia usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas en Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660-672 (1949)) o por resonancia de plasmón superficial (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, NJ). Para resonancia de plasmón superficial, las moléculas diana se inmovilizan en una fase sólida y se exponen a ligandos en una fase móvil que se desplaza a lo largo de una celda de flujo. Si se produce unión de ligando con la diana inmovilizada, el índice refractario local cambia, lo que conduce a un cambio en el ángulo de SPR, que puede supervisarse en tiempo real detectando cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las tasas de cambio de la señal de SPR pueden analizarse para producir constantes de velocidad aparente para las fases de asociación y disociación de la reacción de unión. La relación de estos valores proporciona la constante en equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53: 2560-65 (1993)).
Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD o IgA. Puede obtenerse o derivar de un animal, por ejemplo, ave de corral (por ejemplo, pollo) y mamíferos, que incluye, pero sin limitación un ratón, rata, hámster, conejo u otro roedor, vaca, caballo, oveja, cabra, camello, ser humano u otro primate. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de internalización. La producción de anticuerpos se divulga en general en la Publicación de Patente de Estados Unidos N.° 2004/0146888 A1.
Ensayos de caracterización
En los métodos descritos anteriormente para generar anticuerpos, incluyendo la manipulación de las CDR de Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Anticuerpo 1-24 (Ab-1 a Ab-24) específicas en nuevas regiones marco conservadas y/o constantes, están disponibles ensayos apropiados para seleccionar los anticuerpos o agentes de unión deseados (es decir, ensayos para determinar la afinidad de unión con esclerostina; ensayos de bloqueo cruzado; “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore; ensayo basado en células MC3T3-E1; ensayos in vivo).
Ensayos de unión de epítopos
La esclerostina humana de forma madura es una glicoproteína de 190 aminoácidos con una estructura de nudo de cistina (Figuras 8 y 9). Además de la estructura en nudo de cistina, la proteína se caracteriza porque tiene tres bucles designados como Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. La esclerostina humana se sometió a digestión proteolítica para producir fragmentos. Brevemente, usando diferentes proteasas, incluyendo tripsina, aspN y lysC, se generaron fragmentos con diversos sitios de escisión y tamaños. Se determinaron las secuencias y la masa para diversos péptidos de esclerostina humana. Se evaluó la protección de anticuerpos para determinar el efecto sobre la accesibilidad para proteólisis, incluyendo el enmascaramiento de sitio cortado y desplazamiento peptídico. Finalmente, se realizó un “ensayo de competición de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en BIAcore.
La exposición de esclerostina a escisión por tripsina dio como resultado un patrón de fragmentos peptídicos como se resumen en la Figura 13. Los fragmentos se denominan T19,2, T20, T20,6 y T21-22. Como se muestra de forma esquemática en la Figura 19B, el epítopo T20,6 es un complejo de cuatro secuencias peptídicas separadas que se unen por los tres enlaces disulfuro de la región del nudo de cistina. Dos de los péptidos están unidos por dos enlaces disulfuro. Los otros dos péptidos están unidos por un enlace disulfuro que, esquemáticamente, divide en dos los primeros dos polipéptidos.
El epítopo T20,6 que se generó por digestión con tripsina conserva la estructura de nudo de cistina del polipéptido nativo y está reconocido por los anticuerpos Ab-C y Ab-D. Un derivado del epítopo T20,6 consiste en la región del nudo de cistina y los aminoácidos 58-64, 73-81, 112-117 y 138-141 en posición de secuencia con referencia a SEQ ID NO: 1. Este epítopo derivado se muestra en la Figura 21. Un epítopo que comprende la región de nudo de cistina puede tener uno o más aminoácidos que están presentes en el epítopo T20,6 (Figura 19B) pero no presentes en el epítopo derivado de T20,6 (Figura 21).
Otra región que contiene epítopos se identificó en la región de Bucle 2 de esclerostina humana (Figura 19A) y se reconoce por los anticuerpos Ab-A y Ab-B. Un epítopo de Bucle 2 comprende los aminoácidos 86-111 de SEQ ID NO: 1 (C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5, SEQ ID NO: 6). De forma estérica, con referencia a esclerostina de longitud completa de SEQ ID NO: 1, la estructura que contiene el Bucle 2 se define en un extremo por un enlace disulfuro entre cisteína en la posición 86 (C4) y cisteína en la posición 144 (C8) y en el otro extremo por un enlace disulfuro entre cisteína en la posición 111 (C5) y cisteína en la posición 57 (C1).
Los péptidos generados por escisión de aspN de esclerostina humana se muestran en la Figura 12. En la Figura, estos péptidos se designan AspN14,6, AspN18,6 y AspN22,7-23,5 y también se denominan en el presente documento N14,6, N18,6 y N22,7-23,5, respectivamente.
Un grupo de anticuerpos muestra un patrón específico de unión con ciertos epítopos como se demuestra por un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Brevemente, el anticuerpo se preincuba con el epítopo para ensayar, a concentraciones que saturarán los sitios de unión a epítopo en el anticuerpo. El anticuerpo se expone después a esclerostina unida a una superficie de microplaca. Después de los procedimientos de incubación y lavado apropiados, se establece un patrón de unión competitiva. Como se muestra en la Figura 18, el anticuerpo ejemplar Ab-D se unió a moléculas de esclerostina unidas a la superficie de la microplaca. La preincubación del anticuerpo Ab-D con esclerostina redujo la unión del anticuerpo con la esclerostina en la microplaca hasta casi cero. La preincubación con un péptido que consistía en el epítopo T19,2 mostró que T19,2 no competía con la esclerostina por la unión con el anticuerpo. Sin embargo, la preincubación con uno cualquiera de los epítopos designados t20, T20,6, T21-22 o N22,7-23,5 suprimió una gran proporción de la unión del anticuerpo con la esclerostina en la microplaca. Por el contrario, la preincubación del anticuerpo con uno cualquiera de los epítopos designados T19,2, N14,6 o N18,6 no suprimió la capacidad del anticuerpo para unirse a esclerostina. Un segundo anticuerpo ejemplar con este perfil de unión (Fig. 17) es Ab-C.
El anticuerpo Ab-D es por lo tanto ejemplar y representativo de un grupo de anticuerpos que se unen a los epítopos T20, T20,6, T21-22 y N22,7-23,5 y tienen unión detectable mínima con los epítopos T19,2, N14,6 y N18,6, como se mide por la capacidad para bloquear la unión del anticuerpo con esclerostina. Los anticuerpos que tienen este patrón de unión característico pueden compartir o no secuencia de aminoácidos en una o más regiones de la molécula de anticuerpo. La similitud del anticuerpo se determina funcionalmente tal como mediante la capacidad para unirse con esclerostina después de la preincubación con cada uno de los epítopos descritos anteriormente. Se incluyen en la invención anticuerpos que muestran un patrón de unión similar o idéntico al del anticuerpo Ab-D. Por “similar a” se entiende, por ejemplo, que el anticuerpo mostrará unión con cada uno de los polipéptidos T20, T20,6, T21-22 y N22,7-23,5 por lo que esta unión superará en competición al menos el 50 % de la unión del anticuerpo con esclerostina que se produciría de otro modo en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina. El anticuerpo también mostrará poca o ninguna unión detectable con los polipéptidos T19,2, N14,6 y N18,6, dando como resultado una reducción del 30 % o menos de la unión que se produciría en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina.
Por ejemplo, sin quedar ligado a un mecanismo particular, el patrón de unión del anticuerpo de la Figura 18 sugiere que el espacio epitópico con el que el anticuerpo Ab-D y otros anticuerpos que tienen el patrón de unión a epítopos de Ab-D se unen consiste en un polipéptido que comprende la región de nudo de cistina de esclerostina.
Por lo tanto, como se divulga en el presente documento y con referencia a la Figura 19B, un epítopo T20,6 ejemplar comprende cuatro cadenas peptídicas unidas mediante tres enlaces disulfuro separados. La cadena peptídica SAKPVTELVC3SGQC4GPAR (SEQ ID NO: 3) está unida a la cadena peptídica LVASC7KC8KRLTR (SEQ ID NO: 5) por enlaces disulfuro de C3 a C7 y de C4 a C8. La cadena peptídica DVSEYSC1RELHFTR (SEQ ID NO: 2) está unida a la cadena peptídica WWRPSGPDFRC5IPDRYR (SEQ Id NO: 4) por un enlace disulfuro de C1 a c 5. Los polipéptidos de SEQ ID NO: 3 y 5 permanecen asociados con los polipéptidos de SEQ ID NO: 2 a 4 mediante una construcción estérica por la que el enlace C1-C5 cruza el plano de los enlaces C4-C8 y C3-C7 y se localiza entre ellos, como se ilustra en la Figura 19B.
Como se divulgan en el presente documento y con referencia a la Figura 21, un epítopo derivado ejemplar de T20,6 comprende cuatro cadenas peptídicas unidas mediante tres enlaces disulfuro separados. La cadena peptídica SAKPVTELVC3 SGQC4 (SEQ ID NO: 70) está unida a la cadena peptídica LVASC7KC8 (SEQ ID NO: 71) por enlaces disulfuro de C3 a C7 y de C4 a C8. La cadena peptídica C1RELHFTR (SEQ ID nO: 72) está unida a la cadena peptídica C5IPDRYR (SEQ ID NO: 73) por un enlace disulfuro de C1 a C5. Los polipéptidos de SEQ ID NO: 70 y 71 permanecen asociados con los polipéptidos de SEQ ID NO: 72 y 73 mediante una construcción estérica por la que el enlace C1-C5 cruza el plano de los enlaces C4-C8 y C3-C7 y se localiza entre ellos, como se ilustra en la Figura 21.
El anticuerpo Ab-A es ejemplar y representativo de un segundo grupo de anticuerpos que tienen un patrón de unión característico con péptidos de esclerostina humana que es distinto del obtenido para los anticuerpos Ab-C y Ab-D. Ab-A y el grupo de anticuerpos que representa se unen al epítopo N22,7-23,5 y tienen unión detectable mínima con los epítopos T19,2, T20, T20,6, T21-22, N14,6 o N18,6, como se mide mediante la capacidad para bloquear la unión de anticuerpo con esclerostina (Fig. 15). Un segundo anticuerpo ejemplar con este perfil de unión (Fig. 16) es Ab-B. Los anticuerpos que tienen este patrón de unión característico pueden compartir o no secuencias de aminoácidos en una o más regiones de la molécula de anticuerpo. La similitud de anticuerpo se determina funcionalmente tal como por la capacidad de unirse con esclerostina después de preincubación con cada uno de los epítopos descritos anteriormente. Los anticuerpos pueden mostrar un patrón de unión similar o idéntico al del anticuerpo Ab-A. Por “similar a” se entiende, por ejemplo, que el anticuerpo mostrará unión con el polipéptido N22,7-23,5 por la que esta unión superará por competición al menos el 50 % de la unión del anticuerpo con esclerostina que se produciría de otro modo en ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina. El anticuerpo también mostrará poca o ninguna unión detectable con los polipéptidos T19,2, T20, T20,6, T21-22, N14,6 y N18,6 dando como resultado una reducción del 30 % o menos de la unión que se produciría en la ausencia de preincubación con esclerostina o un péptido de esclerostina.
Por ejemplo, sin quedar ligado a un mecanismo particular, el patrón de unión de anticuerpo de la Figura 15 sugiere que el espacio epitópico con el que el anticuerpo Ab-A y otros anticuerpos que tienen el patrón de unión de epítopo de Ab-A se unen consiste en un polipéptido que comprende la región de Bucle 2 de la esclerostina. Por lo tanto, como se divulga en el presente documento y con referencia a la Figura 19A, la región de Bucle 2 puede describirse como un péptido lineal, pero adquiere una estructura terciaria cuando está presente en una esclerostina nativa o una parte que contiene nudo de cistina de esclerostina en la que la estructura de enlace disulfuro nativo se mantiene. La estructura lineal o terciaria del epítopo de Bucle 2 puede afectar a la unión del anticuerpo con el mismo, como se analiza en los Ejemplos. Una región de Bucle 2 puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos: C4GPARLLPNAIGRGKWWRPSGPDFRC5 (SEQ ID No : 6). “C4” se refiere a un resto de cisteína localizado en la posición 86 con referencia a SEQ ID NO: 1. “C5” se refiere a un resto de cisteína localizado en la posición 111 con referencia a SEQ ID NO: 1. En la proteína de esclerostina nativa, C4 está unido a una cisteína en la posición 144 (C8) por un enlace disulfuro y C5 está ligado a una cisteína en la posición 57 (C1) por un enlace disulfuro. Los epítopos derivados de la región de Bucle 2 incluyen CGPa RlLPNAIGrGkWWr PS (SEQ ID NO: 63); GPARLLPNAIGRG KWWRPSG (SEQ ID NO: 64); PARLLPNAIGRGKWWRPSGP (SEQ ID NO: 65); ARLLPNAIGRGKWWRPSGPD (SEQ ID NO: 66); RLLPNAIGRGKWWRPSGPDF (SEQ ID NO: 67); LLPNAIGRGKWWRPSGPDFR (SEQ ID NO: 68); y LP NAIGRGKWWRPSGPDFRC (SEQ ID NO: 69).
ENSAYOS DE BLOQUEO CRUZADO
Las expresiones “bloqueo cruzado”, “bloqueado de forma cruzada” y “bloquear de forma cruzada” se usan de forma intercambiable en el presente documento para indicar la capacidad de un anticuerpo u otro agente de unión para interferir con la unión de otros anticuerpos o agentes de unión con esclerostina.
El alcance en el que un anticuerpo u otro agente de unión es capaz de interferir con la unión de otro con esclerostina y por lo tanto si puede decirse que bloquea de forma cruzada, puede determinarse usando ensayos de unión competitiva. Un ensayo cuantitativo particularmente adecuado usa una máquina de Biacore que puede medir el alcance de las interacciones usando tecnología de resonancia de plasmón superficial. Otro ensayo de bloqueo cruzado cuantitativo adecuado usa un enfoque basado en ELISA para medir la competición entre anticuerpos u otros agentes de unión con respecto a su unión con esclerostina.
ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO DE BIACORE
A continuación, se describe en general un ensayo de Biacore adecuado para determinar si un anticuerpo u otro agente de unión bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de forma cruzada. Por conveniencia se hace referencia a dos anticuerpos, pero se apreciará que el ensayo puede usarse con cualquiera de los agentes de unión a esclerostina descritos en el presente documento. La máquina de Biacore (por ejemplo, el Biacore 3000) se maneja en línea con las recomendaciones del fabricante.
Por lo tanto, en un ensayo de bloqueo cruzado, la esclerostina se acopla a una microplaca CM5 Biacore usando química de acoplamiento de aminas convencional para generar una superficie recubierta con esclerostina. Típicamente se acoplarían 200-800 unidades de resonancia de esclerostina a la microplaca (una cantidad que proporciona niveles fácilmente medibles de unión pero que puede saturarse fácilmente por las concentraciones de reactivo de ensayo usadas).
Los anticuerpos (denominados A* y B*) para ensayar con respecto a su capacidad para bloquearse de forma cruzada entre sí se mezclan a una relación molar de uno a uno de sitios de unión en un tampón adecuado para crear la mezcla de ensayo. Cuando se calculan las concentraciones basándose en el sitio de unión, se asume que el peso molecular de un anticuerpo es el peso molecular total del anticuerpo dividido por el número de sitios de unión de esclerostina en ese anticuerpo.
La concentración de cada anticuerpo en la mezcla de ensayo debería ser suficientemente alta para saturar fácilmente los sitios de unión para ese anticuerpo en las moléculas de esclerostina capturadas en la microplaca de Biacore. Los anticuerpos en la mezcla están a la misma concentración molar (basándose en la unión) y esa concentración típicamente sería entre 1,00 y 1,5 micromolar (basándose en un sitio de unión).
También se preparan soluciones separadas que contienen anticuerpo A* solamente y anticuerpo B* solamente. El anticuerpo A* y anticuerpo B* en estas soluciones deberían estar en el mismo tampón y a la misma concentración que en la mezcla de ensayo.
La mezcla de ensayo se pasa sobre la microplaca de Biacore recubierta de esclerostina y se registra la cantidad total de unión. La microplaca se trata después de tal modo que se retiren los anticuerpos unidos sin dañar a la esclerostina unida a la microplaca. Típicamente esto se realiza tratando a la microplaca con HCl 30 mM durante 60 segundos.
La solución de anticuerpo A* solamente se pasa después sobre la superficie recubierta con esclerostina y se registra la cantidad de unión. La microplaca se trata de nuevo para retirar todo el anticuerpo unido sin dañar a la esclerostina unida a la microplaca.
La solución de anticuerpo B* solamente se pasa después sobre la superficie recubierta con esclerostina y se registra la cantidad de unión.
A continuación, se calcula la unión teórica máxima de la mezcla de anticuerpo A* y anticuerpo B*, y es la suma de la unión de cada anticuerpo sobre la superficie de esclerostina solo. Si la unión registrada real de la mezcla es menor que este máximo teórico entonces los dos anticuerpos están bloqueándose de forma cruzada entre sí.
Por lo tanto, en general, un anticuerpo u otro agente de unión de bloqueo cruzado es uno que se unirá a esclerostina en el ensayo de bloqueo cruzado de Biacore anterior de modo que durante el ensayo y en presencia de un segundo anticuerpo u otro agente de unión de la divulgación la unión registrada sea entre 80 % y 0,1 % (por ejemplo, 80 % a 4 %) de la unión teórica máxima, específicamente entre 75 % y 0,1 % (por ejemplo, 75 % a 4 %) de la unión teórica máxima y más específicamente entre el 70 % y 0,1 % (por ejemplo 70 % a 4 %) de la unión teórica máxima (como se acaba de definir anteriormente) de los dos anticuerpos o agentes de unión en combinación.
El ensayo de Biacore descrito anteriormente es un ensayo primario usado para determinar si los anticuerpos u otros agentes de unión se bloquean de forma cruzada entre sí. En pocas ocasiones los anticuerpos u otros agentes de unión particulares pueden no unirse con esclerostina acoplada mediante química de amina a una microplaca de Biacore CM5 (esto sucede habitualmente cuando el sitio de unión relevante en la esclerostina se enmascara o se destruye por el acoplamiento a la microplaca). En dichos casos el bloqueo cruzado puede determinarse usando una versión marcada de Esclerostina, por ejemplo, Esclerostina marcada con His N terminal (R & D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2005 cat. n.° 1406-ST-025). En este formato particular, un anticuerpo anti-His se acoplaría a la microplaca de Biacore y después la Esclerostina marcada con His se pasaría sobre la superficie de la microplaca y se capturaría por el anticuerpo anti-His. El análisis de bloqueo cruzado se llevaría a cabo esencialmente como se ha descrito anteriormente, excepto que después de cada ciclo de regeneración de microplaca, se cargaría nueva esclerostina marcada con His de nuevo en la superficie recubierta con anticuerpo anti-His. Además del ejemplo proporcionado usando Esclerostina marcada con His N terminal, podría usarse como alternativa Esclerostina marcada con His C terminal. Además, podrían usarse diversos otros marcadores y combinaciones de proteínas de unión a marcador que se conocen en la técnica para dicho análisis de bloqueo cruzado (por ejemplo, marcador HA con anticuerpos anti-HA; marcador FLAG con anticuerpos anti-FLAG; marcador de biotina con estreptavidina).
ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO BASADO EN ELISA
Lo siguiente describe en general un ensayo de ELISA para determinar si un anticuerpo anti-esclerostina u otro agente de unión a esclerostina bloquea de forma cruzada o es capaz de bloquear de formar cruzada. Por conveniencia, se hace referencia a dos anticuerpos (Ab-X y Ab-Y), pero se apreciará que el ensayo puede usarse con cualquiera de los agentes de unión a esclerostina descritos en el presente documento.
El principio general de del ensayo es tener un anticuerpo anti-esclerostina recubriendo los pocillos de una placa de ELISA. Se añade una cantidad en exceso de un segundo anticuerpo anti-esclerostina que potencialmente bloquea de forma cruzada en la solución (es decir, no unido a la placa de ELISA). Se añade después una cantidad limitada de esclerostina a los pocillos. El anticuerpo recubierto y el anticuerpo en solución compiten por la unión del número limitado de moléculas de esclerostina. La placa se lava para retirar esclerostina que no se haya unido al anticuerpo de recubrimiento y también para retirar el segundo anticuerpo en fase de solución, así como cualquier complejo formado entre el segundo anticuerpo en fase de solución y la esclerostina. La cantidad de esclerostina unida se mide después usando un reactivo de detección de esclerostina apropiado. Un anticuerpo en solución que sea capaz de bloquear de forma cruzada el anticuerpo de recubrimiento será capaz de provocar una reducción del número de moléculas de esclerostina a las que se puede unir el anticuerpo de recubrimiento en relación con el número de moléculas de esclerostina con las que se puede unir el anticuerpo de recubrimiento en ausencia del segundo anticuerpo en fase de solución.
Este ensayo se describe en más detalle adicionalmente posteriormente con respecto a Ab-X y Ab-Y. En el caso en el que Ab-X se selecciona para ser el anticuerpo inmovilizado, este se usa para recubrir los pocillos de la placa de ELISA, después de lo cual las placas se bloquean con una solución de bloqueo adecuada para minimizar la unión no específica de reactivos que es añaden posteriormente. Se añade después una cantidad en exceso de Ab-Y a la placa de ELISA de modo que los moles de sitios de unión de esclerostina Ab-Y por pocillo sean al menos 10 veces mayores que los moles de sitios de unión de esclerostina Ab-X que se usaron, por pocillo, durante el recubrimiento de la placa de ELISA. Después se añade esclerostina de modo que los moles de esclerostina añadidos por pocillo sean al menos 25 veces menores que los moles de sitios de unión de esclerostina de Ab-X que se usaron para recubrir cada pocillo. Después de un periodo de incubación adecuado la placa de ELISA se lava y se añade un reactivo de detección de esclerostina para medir la cantidad de esclerostina unida específicamente por el anticuerpo anti-esclerostina de recubrimiento (en este caso Ab-X). La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente tampón de esclerostina (es decir, sin esclerostina) y reactivos de detección de esclerostina. El ensayo de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), solamente tampón del segundo anticuerpo en fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), esclerostina y reactivos de detección de esclerostina. Es necesario procesar el ensayo de ELISA de tal manera que la señal de control positivo sea al menos 6 veces la señal de fondo.
Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para esclerostina) resultante de la elección de qué anticuerpo usar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál usar como el segundo anticuerpo (competidor), es necesario que el ensayo de bloqueo cruzado se procese en dos formatos:
1) formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en solución
y
2) el formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.
Ab-X y Ab-Y se definen como bloqueadores cruzados si, en el formato 1 o en el formato 2, el anticuerpo antiesclerostina en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60 % y el 100 %, específicamente entre el 70 % y el 100 % y más específicamente entre el 80 % y el 100 %, de la señal de detección de esclerostina (es decir, la cantidad de esclerostina unida por el anticuerpo de recubrimiento) en comparación con la señal de detección de esclerostina obtenida en ausencia del anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución (es decir, los pocillos de control de positivo).
Un ejemplo de dicho ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA puede hallarse en el Ejemplo 7 (“ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA”).
ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS
Se usa mineralización por células de linaje de osteoblastos en cultivo, bien células primarias o bien líneas celulares, como un modelo in vitro de formación de hueso. La mineralización tarda de aproximadamente una a seis semanas en producirse comenzando con la inducción de diferenciación de células de linaje de osteoblastos por uno o más agentes de diferenciación. La secuencia global de acontecimientos implica proliferación celular, diferenciación, producción de matriz extracelular, maduración de la matriz y finalmente deposición de mineral, que se refiere a cristalización y/o deposición de fosfato cálcico. Esta secuencia de acontecimientos que comienza con la proliferación y diferenciación celular, y que termina con la deposición mineral se denomina en el presente documento mineralización. La medición de calcio (mineral) es el resultado del ensayo.
Las células MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96:191-198) y subclones de la línea celular original pueden formar mineral en cultivo tras el crecimiento en presencia de agentes de diferenciación. Dichos subclones incluyen MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J. Biol. Chem. 275: 19992-20001). Tanto para el subclon MC3T3-E1-BF, así como para las células originales MC3T3-E1, la esclerostina puede inhibir uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibe la mineralización). Los anticuerpos anti-esclerostina que son capaces de neutralizar la actividad inhibidora de esclerostina posibilitan la mineralización del cultivo en presencia de esclerostina de modo que hay un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir sin anticuerpo). Los anticuerpos usados en los experimentos de ensayo de mineralización basado en células mostrados en las Figuras 22, 23 y 24 tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 Kd y tienen 2 sitios de unión a esclerostina por molécula de anticuerpo.
Cuando se ejecuta el ensayo con el objetivo de determinar si un anticuerpo anti-esclerostina o agente de unión antiesclerostina particular puede neutralizar la esclerostina (es decir, es un anticuerpo neutralizante de esclerostina o derivado del mismo, o es un agente de unión a esclerostina neutralizante), es necesario que la cantidad de esclerostina usada en el ensayo sea la cantidad mínima de esclerostina que provoca al menos una reducción del 70 %, estadísticamente significativa, en la deposición de fosfato cálcico (medida como calcio) en el grupo de solamente esclerostina, en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo sin esclerostina. Un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina o un agente de unión neutralizante anti-esclerostina se define como uno que provoca un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medido en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir sin anticuerpo, sin agente de unión). Para determinar si un anticuerpo anti-esclerostina o agente de unión anti-esclerostina es neutralizante o no, la cantidad de anticuerpo anti-esclerostina o agente de unión anti-esclerostina usado en el ensayo debe ser tal que haya un exceso de moles de sitios de unión de esclerostina por pocillo en comparación con el número de moles de esclerostina por pocillo. Dependiendo de la potencia del anticuerpo, el exceso en veces que puede requerirse puede ser de 24, 18, 12, 6, 3 o 1,5, y un experto en la materia está familiarizado con la práctica rutinaria de ensayos de más de una concentración de agente de unión. Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante anti-esclerostina o agente de unión neutralizante anti-esclerostina muy potente será capaz de neutralizar la esclerostina incluso cuando haya un exceso menor de 6 veces de moles de sitios de unión de esclerostina por pocillo en comparación con el número de moles de esclerostina por pocillo. Un anticuerpo neutralizante antiesclerostina o agente de unión neutralizante anti-esclerostina menos potente será capaz de neutralizar la esclerostina solamente en un exceso de 12, 18 o 24 veces. Los agentes de unión a esclerostina con este intervalo completo de potencias son adecuados como agentes de unión a esclerostina neutralizantes. Se describen en detalle en el Ejemplo 8 ensayos de mineralización basados en células ejemplares.
Los anticuerpos anti-esclerostina y derivados de los mismos que pueden neutralizar esclerostina humana, y agentes de unión a esclerostina que pueden neutralizar esclerostina humana pueden ser útiles en el tratamiento de afecciones/trastornos humanos que están provocados por, asociados con, o dan como resultado al menos uno de formación de hueso baja, densidad mineral ósea baja, contenido mineral óseo bajo, masa ósea baja, calidad ósea bajo y fuerza ósea baja.
ENSAYO DE NEUTRALIZACIÓN IN VIVO
Pueden medirse los aumentos de diversos parámetros asociados con, o que resultan de, la estimulación de nueva formación de hueso como un resultado de ensayos in vivo de agentes de unión a esclerostina para identificar los agentes de unión que son capaces de neutralizar esclerostina y por lo tanto son capaces de provocar estimulación de nueva formación de hueso. Dichos parámetros incluyen diversos marcadores anabólicos del suero [por ejemplo osteocalcina, P1NP (propéptido n-terminal de procolágeno de tipo 1)], marcadores histomorfométricos de formación del hueso (por ejemplo, superficie de osteoblasto/superficie de hueso; tasa de formación de hueso/superficie de hueso; grosor trabecular), densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea. Un anticuerpo neutralizante de esclerostina se define como uno capaz de provocar un aumento estadísticamente significativo en comparación con animales tratados con vehículo, en cualquier parámetro asociado con, o que resulta de, la estimulación de nueva formación de hueso. Dicho ensayo in vivo puede realizarse en cualquier mamífero adecuado (por ejemplo, ratón, rata, mono). Un ejemplo de dichos ensayos in vivo puede encontrarse en el Ejemplo 5 (“ensayos in vivo de anticuerpos monoclonales anti-esclerostina”).
Aunque la secuencia de aminoácidos de esclerostina no es 100 % idéntica en todas las especies de mamífero (por ejemplo, la esclerostina de ratón no es 100 % idéntica a esclerostina humana), se apreciará por un experto en la materia que un agente de unión a esclerostina que puede neutralizar, in vivo, la esclerostina de una cierta especie (por ejemplo, ratón) y que también puede unirse a esclerostina humana in vitro es muy probable que sea capaz de neutralizar la esclerostina humana in vivo. Por lo tanto, dicho agente de unión a esclerostina humana (por ejemplo, anticuerpo anti-esclerostina humana) puede ser útil en el tratamiento de afecciones/trastornos humanos que están provocados por, asociados con, o dan como resultado al menos uno de formación de hueso baja, densidad mineral ósea baja, contenido mineral óseo bajo, masa ósea baja, calidad ósea baja y fuerza ósea baja. Los ratones en los que se ha usado recombinación homóloga para suprimir el gen de esclerostina de ratón e insertar el gen de esclerostina humana en su lugar (es decir, ratones knock-in para el gen de esclerostina humana o ratones knock-in para SOST humana) serían un ejemplo de un sistema in vivo adicional.
Se proporcionan composiciones farmacéuticas, que comprenden uno de los agentes de unión descritos anteriormente, tal como al menos uno del anticuerpo Ab-A, Ab-B, Ab-C, Ab-D y Ab-1 a Ab-24 para la esclerostina humana, junto con un vehículo, excipiente o diluyente farmacéutica o fisiológicamente aceptable. Se divulgan composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento en la Solicitud relacionada N.° Serie N.° 10/868.497, presentada el 16 de junio de 2004, que reivindica el beneficio de prioridad de N.° de Serie 60/478.977.
Se conoce bien en la técnica, el desarrollo de regímenes de dosificación y tratamiento adecuados para usar las composiciones particulares descritas en el presente documento en una diversidad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración subcutánea, oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular y formulación, algunos de los cuales se analizan brevemente posteriormente para fines generales de ilustración.
En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento pueden suministrarse mediante administración oral a un animal. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden incluirse en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en comprimidos, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta.
En ciertas circunstancias será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas divulgadas en el presente documento por vía subcutánea, por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intramuscular o incluso por vía intraperitoneal. Dichos enfoques se conocen bien por los expertos en la materia, algunos de los cuales se describen adicionalmente, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 5.543.158; Patente de Estados Unidos N.° 5.641.515 y Patente de Estados Unidos N.° 5.399.363. Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como sales farmacológicamente aceptables o de base libre en agua mezclada adecuadamente con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones habituales de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, véase Patente de Estados Unidos N.° 5.466.468). En todos los casos la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en que exista fácil inyectabilidad. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. Puede mantenerse fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse mediante el uso en las composiciones de agentes que retarden la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Para administración parenteral en una solución acuosa, la solución debe tamponarse de forma adecuada si es necesario y el diluyente líquido en primer lugar se hace isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, los expertos en la materia conocerán un medio acuoso estéril que puede emplearse a la luz de la presente divulgación. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 ml de solución de NaCI isotónica y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio propuesto de infusión, (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a ed., págs. 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá cierta variación en la dosificación necesariamente dependiendo de la afección del sujeto que se trate. Además, para administración humana, las preparaciones por supuesto preferentemente cumplirán los patrones de esterilidad, pirogenicidad y seguridad y pureza generales como se requiere por la Oficina de Patrones Biológicos de la FDA.
Las composiciones divulgadas en el presente documento pueden formularse en una forma neutra o salina. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. También pueden derivarse sales formadas por los grupos carboxilo libres de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en la cantidad que sea terapéuticamente eficaz.
Los vehículos pueden comprender además todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, tampones, soluciones transportadoras, suspensiones, coloides y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas se conocen bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. También pueden incorporarse principios activos complementarios en las composiciones. La frase “farmacéuticamente aceptable” se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o desafortunada similar cuando se administra a un ser humano.
Se pueden usar liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas lipídicas, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente invención en células/organismos hospedadores adecuados. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para el suministro encapsulado en una partícula lipídica, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similar. Como alternativa, las composiciones pueden unirse, covalente o no covalentemente, con la superficie de dichos vehículos transportadores.
La formación y uso de liposoma y preparaciones de tipo liposomal como vehículos farmacéuticos potenciales generalmente se conoce por los expertos en la materia (véase, por ejemplo, Lasic, Trends Biotechnol. 16(7): 307-21, 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56 (3):691-95, 1998; Chandran et al., Indian J. Exp. Biol. 35(8): 801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3): 233-61, 1995; Patente de Estados Unidos N.° 5.567.434; Patente de Estados Unidos N.° 5.552.157; Patente de Estados Unidos N.° 5.565.213; Patente de Estados Unidos N.° 5.738.868 y Patente de Estados Unidos N.° 5.795.587). El uso de liposomas no parece estar asociado con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después del suministro sistémico. Los liposomas pueden formarse a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas de bicapas concéntricas multilamelares (también denominadas vesículas multilamelares (MLV)).
Alternativamente, se divulgan formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de las composiciones divulgadas en el presente documento. Las nanocápsulas pueden generalmente atrapar compuestos de un modo estable y reproducible (véase, por ejemplo, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1113-28, 1998). Para evitar efectos secundarios debido a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (de tamaños de aproximadamente 0,1 |im) pueden diseñarse usando polímeros capaces de degradarse in vivo. Dichas partículas pueden prepararse como se describe, por ejemplo, por Couvreur et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.
5(1): 1-20, 1988; zur Muhlen et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1998; Zambaux et al., J. Controlled Release 50(1-3): 31-40, 1998; y Patente de Estados Unidos N.° 5.145.684.
Además, las composiciones farmacéuticas pueden situarse dentro de recipientes, junto con material de envasado que proporciona instrucciones con respecto al uso de dichas composiciones farmacéuticas. Generalmente, dichas instrucciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como dentro de ciertos aspectos, cantidades relativas de ingredientes excipientes o diluyentes (por ejemplo, agua, solución salina o PBS) que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.
La dosis administrada puede variar de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal. Como resultará evidente para un experto en la materia, la cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y gravedad de la indicación que se trate, la respuesta deseada, la afección del paciente y así sucesivamente. Típicamente, las composiciones pueden administrarse por una diversidad de técnicas, como se ha observado anteriormente.
Los aumentos del contenido mineral óseo y/o densidad mineral ósea pueden determinarse directamente mediante el uso de rayos X (por ejemplo, Absorciometría de rayos X de Energía Dual o “DEXA”) o por interferencia mediante la medición de 1) marcadores de formación de hueso y/o actividad de osteoblastos, tales como, pero sin limitación, fosfatasa alcalina específica de osteoblastos, osteocalcina, propéptido C' de procolágeno de tipo 1 (PICP), fosfatasa alcalina total (véase Comier, Curr. Opin. in Rheu. 7: 243(1995)) y propéptido N terminal de procolágeno 1 de suero (P1NP) y/o 2) marcadores de reabsorción de hueso y/o actividad de osteoclastos incluyendo, pero sin limitación, piridinolina, desoxipiridinolina, N-telopéptido, hidroxiprolina urinaria, fosfatasas ácidas resistentes a tartrato de plasma y galactosil hidroxilisina; (véase Comier, misma referencia), TRAP 5b de suero (fosfatasa ácida resistente a tartrato isoforma 5b) y telopéptido C reticulado en suero (sCTXI). La cantidad de masa ósea también puede calcularse a partir de los pesos corporales o mediante el uso de otros métodos (véase Guinness-Hey, Metab. Bone Dis. Relat. Res. 5: 177-181, 1984). Se usan animales y modelos animales particulares en la técnica para ensayar el efecto de las composiciones y métodos divulgados en el presente documento sobre, por ejemplo, parámetros de pérdida de hueso, reabsorción del hueso, formación de hueso, fuerza ósea o mineralización del hueso que imitan las condiciones de enfermedad humana tales como osteoporosis y osteopenias. Los ejemplos de dichos modelos incluyen el modelo de rata ovariectomizada (Kalu, D.N., The ovariectomized rat model of postmenopausal bone loss. Bone and Mineral 15: 175-192 (1991); Frost, H.M. y Jee, W.S.S. On the rat model of human osteopenias and osteoponosis. Bone and Mineral 18: 227-236 (1992); y Jee, W.S.S. y Yao, W., Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis. J. Musculoskel. Neuron. Interact. 1: 193-207 (2001)).
Las afecciones particulares que pueden tratarse por las composiciones divulgadas en el presente documento incluyen displasias, en donde el crecimiento o el desarrollo del hueso es anómalo y una amplia diversidad de causas de osteopenia, osteoporosis y pérdida de hueso. Los ejemplos representativos de dichas afecciones incluyen acondroplasia, disostosis cleidocraneal, encondromatosis, displasia fibrosa, Enfermedad de Gaucher, raquitismo hipofosfatémico, síndrome de Marfan, exostosis hereditarias múltiples, neurofibromatosis, osteogénesis imperfecta, osteopetrosis, osteopoiquilosis, lesiones escleróticas, pseudoartrosis y osteomielitis piógena, enfermedad periodontal, pérdida de huesa inducida por fármaco anti-epiléptico, hiperparatiroidismo primario y secundario, síndromes de hiperparatiroidismo familiar, pérdida de peso inducida por ingravidez, osteoporosis en hombres, pérdida de hueso posmenopáusica, osteoartritis, osteodistrofia renal, trastornos infiltrantes del hueso, pérdida ósea oral, osteonecrosis de la mandíbula, enfermedad de Paget juvenil, melorreostosis, enfermedades ósea metabólicas, mastocitosis, enfermedad/anemia falciforme, pérdida de hueso relacionada con trasplante de órganos, pérdida de hueso relacionada con trasplante de riñón, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, epilepsia, artritis juvenil, talasemia, mucopolisacaridosis, enfermedad de Fabry, síndrome de Turner, Síndrome de Down, Síndrome de Klinefelter, lepra, Enfermedad de Perthes, escoliosis idiopática adolescente, enfermedad inflamatoria multisistémica de aparición infantil, Síndrome de Winchester, Enfermedad de Menkes, Enfermedad de Wilson, enfermedad de hueso isquémico (tal como enfermedad de Legg-Calve-Perthes, osteoporosis migratoria regional), estados anémicos, afecciones provocadas por esteroides, pérdida de hueso inducida por glucocorticoides, pérdida de hueso inducida por heparina, trastornos de la médula ósea, escorbuto, malnutrición, deficiencia de calcio, osteopenia u osteoporosis idiopática, osteopenia u osteoporosis congénita, alcoholismo, enfermedad hepática crónica, estado posmenopáusico, afecciones inflamatorias crónicas, artritis reumatoide, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, colitis inflamatoria, enfermedad de Crohn, oligomenorrea, amenorrea, embarazo, diabetes mellitus, hipertiroidismo, trastornos tiroideos, trastornos paratiroideos, enfermedad de Cushing, acromegalia, hipogonadismo, inmovilización o inactividad, síndrome de distrofia simpática refleja, osteoporosis regional, osteomalacia, pérdida de hueso asociada con reemplazo de articulaciones, pérdida de hueso asociada con VIH, pérdida de hueso asociada con pérdida de hormona del crecimiento, pérdida de hueso asociada con fibrosis quística, displasia fibrosa, pérdida de hueso asociada con quimioterapia, pérdida de hueso inducida por tumor, pérdida de hueso relacionada con cáncer, pérdida de hueso ablativa hormonal, mieloma múltiple, pérdida de hueso inducida por fármaco, anorexia nerviosa, pérdida de hueso facial asociada con enfermedad, pérdida de hueso craneal asociada con enfermedad, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con enfermedad, pérdida de hueso del cráneo asociada con enfermedad, y pérdida de hueso asociada con viaje espacial. Más afecciones se relacionan con pérdida de hueso asociada con el envejecimiento, incluyendo pérdida de hueso facial asociada con el envejecimiento, pérdida de hueso craneal asociada con el envejecimiento, pérdida de hueso de la mandíbula asociada con el envejecimiento y pérdida de hueso del cráneo asociada con el envejecimiento.
Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser útiles para mejorar resultados en procedimientos ortopédicos, procedimientos dentales, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto óseo, cirugía cosmética ósea y reparación del hueso tal como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada y reconstrucción facial. Puede administrarse uno o más anticuerpos antes, durante y/o después del procedimiento, reemplazo, injerto, cirugía o reparación.
También se divulga un kit de diagnóstico que comprende al menos un agente de unión anti-esclerostina. El agente de unión puede ser un anticuerpo. Además, dicho kit puede comprender opcionalmente uno o más de los siguientes:
(1) instrucciones para usar el o los agentes de unión para exploración, diagnóstico, pronóstico, supervisión terapéutica o cualquier combinación de estas aplicaciones;
(2) un compañero de unión marcado para el agente o los agentes de unión anti-esclerostina;
(3) una fase sólida (tal como una tira de reactivo) sobre la que se inmovilizan el agente o agentes de unión antiesclerostina; y
(4) un marcador o inserto que indica la aprobación reguladora para uso de exploración, diagnóstico, pronóstico o terapéutico o cualquier combinación de los mismos.
Si no se proporciona compañero de unión marcado para el agente o los agentes de unión, el agente o los agentes de unión en sí mismos pueden marcarse con uno o más de un marcador o marcadores detectables, por ejemplo, un resto quimioluminiscente, enzimático, fluorescente o radiactivo.
Los siguientes ejemplos se ofrecen como ilustración y no como limitación.
Ejemplos
EJEMPLO 1
Expresión recombinante de esclerostina
La esclerostina recombinante humana/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n.° 1406-ST-025). Adicionalmente, la esclerostina de ratón recombinante/SOST está disponible en el mercado de R&D Systems (Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2006 cat. n.° 1589-ST-025).
Como alternativa, las diferentes especies de esclerostina pueden expresarse de forma transitoria en células 293T o 293EBNA adaptadas para suspensión sin suero. Pueden realizarse transfecciones como cultivos de 500 ml o 1 l. Los siguientes reactivos y materiales están disponibles de Gibco BRL (ahora Invitrogen, Carlsbad, CA). Los números de catálogo se enumeran entre paréntesis: DMEM sin suero (21068-028); DMEM/F12 (3:1) (21068/11765); Complemento de Selenio-Transferrina-Insulina 1X (51500-056); Pen Strep Glut 1X (10378-016); I-Glutamina 2 mM (25030-081); HEPES 20 mM (15630-080); Pluronic F68 al 0,01 % (24040-032). Brevemente, el inóculo celular (5,0­ 10,0 X 105 células/ml por volumen de cultivo) se centrifuga a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C para retirar el medio acondicionado.
Las células se resuspenden en DMEM sin suero y se centrifugan de nuevo a 2.500 RPM durante 10 minutos a 4 °C. Después de aspirar la solución de lavado, las células se resuspenden en medio de crecimiento [DMEM/F12 (3:1) Complemento de Insulina-Transferrina-Selenio 1X Pen Strep Glut 1X L-Glutamina 2 mM HEPES 20 mM Pluronic F68 al 0,01 %] en un cultivo de matraz en agitación de 1 l o 3 l. El cultivo del matraz en agitación se mantiene en una placa de agitación magnética a 125 RPM que se sitúa en un incubador humidificado mantenido a 37 °C y CO2 al 5 %. El ADN plasmídico de expresión de mamífero (por ejemplo, pcDNA3.1, pCEP4, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA), que contiene la región codificante completa (y codón de parada) de esclerostina con una secuencia consenso de Kozak (por ejemplo, CCACC) directamente 5' del sitio de inicio ATG, está en complejo con el reactivo de transfección en un tubo cónico de 50 ml.
El complejo de reactivo de transfección de ADN puede prepararse en 5-10 % del volumen de cultivo final en DMEM u OPTI-MEM sin suero. Los reactivos de transfección que pueden usarse para este fin incluyen X-tremeGene RO-1539 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), FuGene6 (Roche Applied Science, Indianápolis, IN), Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 293fectin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se añade en primer lugar 1,5 |ig de ADN plasmídico/ml de cultivo a DMEM sin suero, seguido de 1-5 |il de reactivo de transfección/ml de cultivo. Los complejos pueden incubarse a temperatura ambiente durante aproximadamente 10-30 minutos y después añadirse a las células en el matraz de agitación. La transfección/expresión puede realizarse durante 4-7 días, después de lo cual el medio acondicionado (CM) se recoge por centrifugación a 4.000 RPM durante 60 minutos a 4 °C.
EJEMPLO 2
PURIFICACIÓN DE ESCLEROSTINA RECOMBINANTE
La esclerostina recombinante se purificó de células hospedadoras de mamífero como sigue. Todos los procesos de purificación se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se usó un esquema de purificación para purificar diversas especies de esclerostina, incluyendo esclerostina murina y humana. El esquema de purificación usó cromatografía de afinidad seguido de cromatografía de intercambio catiónico.
Cromatografía de heparina
El medio acondicionado de célula hospedadora de mamífero (CM) se centrifugó en una centrífuga Beckman J6-M1 a 4000 rpm durante 1 hora a 4 °C para retirar residuos celulares. El sobrenadante de CM se filtró después a través de un filtro de 0,2 |im estéril. (En este punto el CM filtrado estéril puede almacenarse opcionalmente congelado hasta su purificación). Si el CM se congeló, este se descongeló a las siguientes temperaturas, o combinación de las mismas: 4 °C, temperatura ambiente o agua templada. Después de la congelación el CM se filtró a través de un filtro de 0,2 |im estéril y se concentró opcionalmente por ultrafiltración de flujo tangencial (TFF) usando una membrana de punto de corte de 10 kD de peso molecular. El concentrado de CM se filtró a través de un filtro de 0,2 |im estéril y después se cargó en una columna de Alto Rendimiento de Heparina (Heparina HP) (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences) equilibrada en PBS. Como alternativa, el sobrenadante de CM filtrado puede cargarse directamente en la columna de Heparina HP equilibrada en PBS.
Después de cargar, la columna de Heparina HP se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo continuo volvió a la línea basal (es decir, absorbancia medida antes de cargar el sobrenadante de CM). La esclerostina se eluyó después de la columna usando un gradiente lineal de cloruro sódico de 150 mM a 2 M en PBS. La absorbancia a 280 nm del eluato se supervisó y se recogieron las fracciones que contenían proteína. Las fracciones se ensayaron después mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie para identificar fracciones que contenían un polipéptido que migra al tamaño de esclerostina glicosilada. Las fracciones apropiadas de la columna se combinaron para realizar el grupo de Heparina HP.
Cromatografía de Intercambio Catiónico
La esclerostina eluida de la columna de Heparina HP se purificó adicionalmente por cromatografía de intercambio catiónico usando medio de cromatografía de Alto Rendimiento SP (SPHP) (GE Healthcare, anteriormente Amersham Biosciences). Se cambió el tampón del grupo de heparina HP a PBS por diálisis usando membranas de 10.000 de PCPM (Pierce-Slide-A-Lyzer). El grupo de Heparina HP dializado se cargó después en una columna de SPHP equilibrada en PBS. Después de cargar, la columna se lavó con PBS hasta que la absorbancia a 280 nm del flujo continuo volvió a la línea basal. La esclerostina se eluyó después de la columna SPHP usando un gradiente lineal de cloruro sódico de 150 mM a 1 M en PBS. La absorbancia a 280 nm de eluato se supervisó y se recogió la esclerostina eluida en fracciones. Las fracciones se ensayaron después mediante SDS-PAGE teñido con Coomassie para identificar fracciones que contenían un polipéptido que migra al tamaño de esclerostina glicosilada. Las fracciones apropiadas de la columna se combinaron para realizar el grupo de SPHP.
Formulación
Después de la purificación, el grupo de SPHP se formuló en PBS mediante diálisis usando membranas de 10.000 de PCPM (Pierce-Slide-A-Lyzer). Si fue necesaria la concentración de esclerostina, se usó un dispositivo de centrífuga (Amicon Centricon o Centriprep) con una membrana de 10.000 de PCPM. Después de la formulación la esclerostina se filtró a través de un filtro de 0,2 |im estéril y se almacenó a 4 °C o se congeló.
EJEMPLO 3
ELISA DE UNIÓN DE PÉPTIDOS
Se sintetizó una serie de péptidos solapantes (siendo cada péptido de aproximadamente 20-25 aminoácidos de longitud) basándose en la secuencia de aminoácidos conocida de la esclerostina de rata (SEQ ID NO: 98). Los péptidos se diseñaron de modo que todos contuvieran un resto de cisteína reducido; se incluyó una cisteína adicional en el extremo C terminal de cada péptido que no contenía ya una en su secuencia. Esto permitió a los péptidos unirse a las placas de ensayo mediante acoplamiento covalente, usando placas de unión de sulfhidrilo disponibles en el mercado (Costar), a una concentración de 1 |ig/ml, en solución salina tamponada con fosfato (PBS: pH 6,5) que contenían EDTA 1 mM. Después de la incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las placas se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween 200,5 %. Las placas se bloquearon mediante incubación con una solución de PBS que contenía gelatina de piel de pescado 0,5 % (Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente y después se lavaron tres veces en PBS que contenía Tween 200,5 %.
Los anticuerpos para ensayar se diluyeron a 1 |ig/ml en PBS que contenía gelatina de piel de pescado al 0,5 % y se incubaron con las placas recubiertas de péptido durante 1 hora a temperatura ambiente. Se retiró el anticuerpo en exceso mediante tres lavados con PBS, Tween 20 0,5 %. Las placas se incubaron después con un anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano rusticano (diluido de forma apropiada en PBS que contenía Tween 200,5 %) y capaz de unirse al anticuerpo de interés. Las placas se lavaron después tres veces: una vez con PBS que contenía Tween 20 0,5 % y dos veces con PBS. Finalmente, las placas se incubaron con un sustrato cromogénico de peroxidasa de rábano rusticano (TMB-Stable Stop, RDI) durante 5 minutos a temperatura ambiente, el desarrollo del color se detuvo con ácido y se midió la densidad óptica de las placas a 450 nm.
Materiales
Placas de Unión de Sulfhidrilo de Costar (VWR n.° 29442-278)
Tampón de recubrimiento: PBS 1X pH 6,5 EDTA 1 mM
Tampón de bloqueo: PBS 1X Gelatina de Piel de Pescado 0,5 % (PBS de CS; FSG de Sigma n.° G 7765) Tampón de lavado: PBS 1X Tween 200,5 %
Péptidos de Esclerostina de Rata
Muestras de anticuerpo: Ab transitorio, Ab recombinante Purificado, Suero de conejo, etc.
Ab secundario apropiado: de Cabra-anti-HRP de Ratón/Conejo (Jackson Immuno Research, 115-036-072) TMB-Stable Stop (RDI n.° RDI-TMBSX-1L)
Los métodos fueron los siguientes:
1. Recubrir placas con 100 |il/pocillo de péptido de esclerostina de rata diluido en PBS 1x pH 6,5 EDTA 1 mM a 1 |ig/ml. Incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente. (Las placas deberían usarse en un periodo de 30 minutos desde la apertura).
2. Lavar placas 3X con tampón de lavado.
3. Bloquear las placas con 200 |il/pocillo de tampón de bloqueo. Incubar las placas durante 30 minutos a temperatura ambiente.
4. Repetir el lavado como se ha descrito en (2).
5. Incubar las placas con 50 |il/pocillo de muestras diluidas en tampón de bloqueo - los títulos de suero comienzan a 1:100; uso de Ab Recombinante Transitorio puro; uso de Ab recombinante Purificado a 1 |ig/ml (todas las muestras se procesan por duplicado). Incubar las placas durante 1 h a temperatura ambiente.
6. Lavar las placas como se ha descrito en (2).
7. Incubar las placas con 50 |il/pocillo de Anticuerpo Secundario apropiado (marcado con HPR) diluido 1:1600 en Tampón de bloqueo. Incubar las placas durante 1 hora a temperatura ambiente.
8. Lavar las placas con tampón de lavado 1X, PBS 2X.
9. Incubar las placas con 50 |il/pocillo de TMB, 5 minutos a temperatura ambiente.
10. Detener la reacción con 50 |il/pocillo de HCl 0,5 M.
11. Leer placas a 450 nm de longitud de onda.
Las siguientes secuencias peptídicas se exploraron como se ha descrito anteriormente:
QGWQAFKNDATEIIPGLREYPEPP (SEQ ID NO: 82)
TEIIPGLREYPEPPQELENN (SEQ ID NO: 83)
PEPPQELENNQTMNRAENGG (SEQ ID NO: 84)
ENGGRPPHHPYDTKDVSEYS (SEQ ID NO: 85)
CRELHYTRFVTDGP (SEQ ID NO: 86)
CRELHYTRFVTDGPSRSAKPVTELV (SEQ ID NO: 87)
CRSAKPVTELVSSGQSGPRARLL (SEQ ID NO: 88)
CGPARLLPNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 89)
RAQRVQLLCPGGAAPRSRKV (SEQ ID NO: 90)
PGGAAPRSRKVRLVAS (SEQ ID NO: 91)
KRLTRFHNQSELKDFGPETARPQ (SEQ ID NO: 92)
IPDRYAQRVQLLSPGG (SEQ ID NO: 93)
SELKDFGPETARPQKGRKPRPRAR (SEQ ID NO: 94)
KGRKPRPRARGAKANQAELENAY (SEQ ID NO: 95)
PNAIGRVKWWRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96)
KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).
Un anticuerpo neutralizante de alta afinidad (Ab-19) se unió a dos secuencias peptídicas solapantes: PNAIGRVKW­ WRPNGPDFR (SEQ ID NO: 96) y KWWRPNGPDFRCIPDRYRAQRV (SEQ ID NO: 97).
Este procedimiento permite el reconocimiento de epítopos por anticuerpos que reaccionan con epítopos aparentemente lineales. Los péptidos que contienen todo o parte del sitio de unión a anticuerpo se unirán al anticuerpo y de este modo se detectarán.
EJEMPLO 4
IDENTIFICACIÓN DE EPÍTOPOS DE ESCLEROSTINA HUMANA
Estructura de esclerostina
La esclerostina humana de forma madura (péptido señal retirado) es una proteína de 190 aminoácidos (Figura 8). La Figura 9 muestra un esquema de la estructura general de la esclerostina con una rama N terminal (de la Q N terminal a Cisteína 1) y una rama C terminal (de Cisteína 8 a la Y terminal). Intercalada entre estas dos ramas hay una estructura de nudo de cistina y tres bucles que se designan Bucle 1, Bucle 2 y Bucle 3. Los cuatro enlaces disulfuro en esclerostina son Cys1 en la posición de secuencia 57 unida a Cys5 en la posición de secuencia 111 (denominado C1-C5), Cys2 en la posición de secuencia 71 unida a Cys6 en la posición de secuencia 126 (denominado C2-C6), Cys3 en la posición de secuencia 82 unida a Cys7 en la posición de secuencia 142 (denominado C3-C7), Cys4 en la posición de secuencia 86 unida a Cys8 en la posición de secuencia 144 (denominado C4-C8). La estructura en anillo de ocho miembros se forma mediante enlaces disulfuro C3-C7 y C4-C8. Esa estructura en anillo, junto con el enlace disulfuro C1-C5 que penetra a través del anillo, forma un nudo de cistina típico. C2-C6, que no es parte del nudo de cistina, pone dos estructuras en bucle grandes, bucle 1 (restos 57 a 82) y bucle 3 (restos 111 a 142) juntos entre sí. El bucle 2 va de C4 (resto 86) a C5 (resto 111).
Experimental
El enfoque general para caracterizar los epítopos unidos por anticuerpos monoclonales anti-esclerostina implicó fragmentar la Esclerostina humana en péptidos con diferentes proteasas, determinar la secuencia de los diversos péptidos de esclerostina humana, aislar estos péptidos y ensayar cada uno de ellos con respecto a su capacidad para unirse a un anticuerpo monoclonal particular usando un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore. Los datos resultantes permitieron que se determinara la localización del epítopo de unión.
Las digestiones peptídicas se sometieron a mapeo de péptidos por HPLC; los picos individuales se recogieron y los péptidos se identificaron y se mapearon mediante espectrometría de masas por desorción de láser asistida por matriz (MALDI-MS) y análisis de LC-MS de ionización por electronebulización (ESI-LC-MS) y/o mediante secuenciación N terminal. Todos los análisis de HPLC para estos estudios se realizaron usando una columna C8 de fase inversa (2,1 mm i.d. x 15 cm de longitud). El mapeo de péptidos por HPLC se realizó con un gradiente lineal de ácido tricloroacético 0,05 % (fase móvil A) a acetonitrilo al 90 % en ácido trifluoroacético al 0,05 %. Las columnas se desarrollaron durante 50 minutos a un caudal de 0,2 ml/min.
Digestiones con tripsina y AspN Endoproteinasa
La esclerostina humana en forma madura se digirió con tripsina, que escinde después de arginina y lisina, o con AspN. Se incubaron aproximadamente 200 |ig de esclerostina a 0,5-1,0 mg/ml en PBS (pH 7,2) durante 20 h a 37 °C con 8 |ig de tripsina o AspN.
Digestión de tripsina
La cromatografía de HPLC de las digestiones de tripsina produjo varios picos importantes (Fig. 10A). Se realizó análisis de secuencia en los picos peptídicos recuperados de HPLc después de digestión con tripsina. El análisis de ESI LC-MS en línea del producto de digestión peptídica también se realizó para determinar la masa precisa de los péptidos que se separaron por HPLC. Se determinó de este modo la identidad de los péptidos presentes en los picos peptídicos (Fig. 11). La Figura 13 muestra el alineamiento de diversas secuencias peptídicas (T19,2, T20, T20,6, T21-22) junto con la secuencia de esclerostina. El número después de cada T (por ejemplo, T19,2) refleja el tiempo de retención. T19,2 contiene dos péptidos (uno del bucle 1 y uno del bucle 3) unidos por el enlace disulfuro C2-C6. T20 contiene dos péptidos mantenidos juntos por la estructura de nudo de cistina, con los bucles intactos 1 y 3 mantenidos juntos por el disulfuro C2-C6 y con la mayor parte del bucle 2 ausente. T20,6 contiene cuatro secuencias mantenidas juntas por la estructura de nudo de cistina, pero carece de parte del bucle 1 y bucle 3 (la parte T19,2) y carece de la mayoría del bucle 2. T21-22 es casi idéntico a T20, pero tiene 3 aminoácidos adicionales en la región del bucle 2.
Digestión con AspN
La cromatografía de HPLC de los productos de digestión de AspN produjo varios picos principales (Fig. 10B). Se realizó análisis de secuencia de los picos peptídicos recuperados de HPLC. También se realizó análisis de ESI LC-MS en línea del producto de digestión peptídico para determinar la masa precisa de los péptidos que se separaron por HPLC. La identidad de los péptidos presentes en los picos peptídicos del producto de digestión de AspN se determinó de este modo (Fig. 12). La Figura 14 muestra el alineamiento de diversas secuencias peptídicas (AspN14,6, AspN18,6, AspN22,7-23,5) junto con la secuencia de esclerostina. El número después de cada AspN (por ejemplo, AspN 18,6) refleja el tiempo de retención. AspN14,6 contiene tres péptidos cortos de las ramas tanto N como C terminales de esclerostina, mientras que AspN 18,6 es un péptido mayor de la rama N terminal de esclerostina. AspN22,7-23,5 contiene un único fragmento peptídico de 104 aminoácidos que abarca las ocho cisteínas (los cuatro enlaces disulfuro), el nudo de cistina y todos los bucles 1, 2 y 3.
La estrategia para caracterizar los epítopos fue usar estos diversos péptidos de esclerostina humana generados por tripsina y AspN y determinar qué péptidos podían aún unirse a los diversos anticuerpos (Ab-A, Ab-B, Ab-C y Ab-D). Específicamente esto se ensayó en un “ensayo de unión competitiva de epítopos peptídicos de esclerostina humana” basado en Biacore en donde la unión de un anticuerpo monoclonal particular con esclerostina humana inmovilizada en la microplaca de Biacore se determinó en presencia o ausencia de cada una de las diversas fracciones peptídicas de HPLC de tripsina y AspN aisladas. En ausencia de cualquier péptido competidor, el anticuerpo monoclonal particular fue capaz de unirse a la esclerostina humana en la microplaca y producir una respuesta en unidades de resonancia, UR. La preincubación del anticuerpo monoclonal particular con esclerostina humana intacta en solución, seguida de ensayo de la unión con la microplaca, demostró que la unión del Mab con esclerostina humana en solución evitó la unión del Mab con la esclerostina humana en la microplaca, validando de este modo el principio general de este ensayo de competición.
Este procedimiento general se repitió individualmente para cada péptido. Se interpretó que una respuesta de UR robusta indicaba que el péptido particular ensayado no podía unirse al Mab en solución (por lo tanto, el Mab era libre para unirse a la esclerostina humana que se había inmovilizado en la microplaca). Por el contrario, la ausencia de una respuesta de UR robusta indicó que el Mab era capaz de unirse al péptido de esclerostina en solución. Estos patrones de unión, acoplados con la identidad conocida de los diversos péptidos de esclerostina, se usaron para determinar los epítopos de esclerostina que se unían a anticuerpos anti-esclerostina Ab-A, Ab-B, Ab-C y Ab-D. ENSAYO DE UNIÓN COMPETITIVA DE EPÍTOPOS PEPTÍDICOS DE ESCLEROSTINA HUMANA BASADO EN BIACORE
Preparación de superficie de esclerostina humana:
Se realizó inmovilización de esclerostina humana en forma madura en una superficie de microplaca sensora BIAcore (CM5) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se activaron grupos carboxilo en las superficies de la microplaca sensora inyectando 60 |il de una mezcla de contenía N-etil-N'-(dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) 0,2 M y N-hidroxisuccinimida (NHS) 0,05 M. La esclerostina humana se diluyó en acetato sódico 10 mM, pH 4,0 a una concentración de 20 |ig/ml seguido de inyección sobre la superficie de CM5 activada. Los grupos reactivos en exceso en la superficie se desactivaron inyectando 60 |il de etanolamina 1 M. Los niveles inmovilizados finales fueron de ~ 5000 unidades de resonancia (UR) para la superficie de esclerostina humana. También se preparó una superficie de referencia acoplada a simulación blanca en las microplacas sensoras.
Análisis de especificidad de unión:
La solución salina tamponada con fosfato 1X sin cloruro cálcico o cloruro de magnesio fue de Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA. La albúmina de suero bovino, fracción V, sin IgG fue de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. Cada Mab (2 nM) se incubó por separado con esclerostina humana 20 nM o un péptido de esclerostina humana particular (nota: hay 3 péptidos no unidos en AspN14,6) en el tampón de muestra (p Bs 1X P-200,005 % BSA 0,1 mg/ml) antes de inyección sobre la superficie de esclerostina humana inmovilizada. El caudal para la inyección de muestra fue de 5 |il/min seguido de regeneración de superficie usando NaCl 1 M en Glicina 8 mM, pH 2,0 a 30 |il/min durante 30 segundos. Los datos se analizaron usando BIAevaluación 3.2 y se presentan en la Figura 15 (Ab-A), Figura 16 (Ab-B), Figura 17 (Ab-C) y Figura 18 (Ab-D).
Epítopos T20,6 y Bucle 2:
Los patrones de unión del péptido de esclerostina para dos anticuerpos representativos (Ab-A y Ab-B) fueron prácticamente idénticos (Fig. 15 y Fig. 16) y mostraron que ambos de estos Anticuerpos podían unirse solamente al péptido AspN22,7-23,5. La única diferencia entre AspN22,7-23,5 y todos los demás péptidos de esclerostina es que AspN22,7-23,5 contiene un bucle 2 intacto. Esto muestra que Ab-A y Ab-B se unen a la región de bucle 2 de esclerostina definiendo de este modo el epítopo de bucle 2 (Fig. 19A). Los patrones de unión del péptido de esclerostina para Ab-C y Ab-D fueron prácticamente idénticos entre sí (Fig. 17 y Fig. 18) pero completamente distintos del hallado para Ab-A y Ab-B. De los péptidos ensayados en este Ejemplo, el péptido más pequeño al que pudieron unirse Ab-C y Ab-D fue el péptido T20,6. Este resultado define el epítopo T20,6 (Fig. 19B).
Ensayo de protección de proteasa:
El principio general de este ensayo es que la unión de un Mab con esclerostina puede dar como resultado la protección de ciertos sitios de escisión de proteasa específicos y esta información puede usarse para determinar la región de esclerostina con la que se une el Mab.
Epítopo “derivado de T20,61 (nudo de cistina 4 ramas)”:
La Figura 20 muestra los mapas peptídicos de HPLC para un complejo de Ab-D de esclerostina humana (Fig. 20A: la esclerostina humana se preincubó a una relación molar de 1:1 con Ab-D antes de digestión con tripsina como se ha descrito anteriormente) y esclerostina humana solamente (Fig. 20B: la esclerostina humana se digirió con tripsina como se ha descrito anteriormente). Los picos peptídicos de T19,2 y T20,6 en la Figura 20A mostraron una clara reducción de su altura de pico respectiva, en comparación con la Figura 20B. Esta reducción en las alturas de los picos se vio acompañada de un aumento de la altura de los picos para los péptidos T20 y T21-22. Esto datos indican que los restos de aminoácidos básicos en el bucle 1 y bucle 3, que en ausencia de Ab-D se escindieron mediante tripsina para generar los péptidos T19,2 y T20,6, fueron resistentes a escisión por tripsina cuando Ab-D se preunió a esclerostina. La presencia de T20, T20,6 y T21-22 indica que el bucle 2 aún se escindía eficazmente cuando Ab-D estaba preunido a esclerostina. Estos datos indican que Ab-D se unió al lado del bucle 1 y bucle 3 del epítopo T20,6 definiendo de este modo el epítopo más pequeño “derivado 1 de T20,6 (nudo de cistina 4 ramas)” mostrado en la Figura 21.
EJEMPLO 5
ENSAYOS IN VIVO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-ESCLEROSTINA EN RATONES
Se obtuvieron ratones macho BDF1 de cuatro semanas de edad de Charles River Laboratories (Raleigh, NC) y se alojaron en jaulas limpias, con cinco animales por jaula. La temperatura ambiente se mantuvo entre 20 y 22,22 °C, y la humedad relativa se mantuvo entre 34 y 73 %. El laboratorio que alojaba las jaulas tuvo un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas y cumplía todas las especificaciones de AAALAC. Se realizaron observaciones clínicas en todos los ratones en el estudio una vez al día.
Los anticuerpos monoclonales anti-esclerostina purificados (Ab-A Fig. 1; Ab-B Fig. 2; Ab-C Fig. 3; Ab-D Fig. 4) se diluyeron en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco estéril. Se inyectaron anticuerpos anti-esclerostina o vehículo PBS a los ratones por vía subcutánea a 21 |il por gramo de peso corporal, dos veces por semana (lunes y martes) a 25 mg/kg. Se diluyó PTH humano (1-34) en tampón de PTH (HCl O,o0l, NaCl 0,15, BSA 2 %) y se dosificó por vía subcutánea a 21 |il por gramo de peso corporal cinco veces a la semana (lunes, martes, miércoles, jueves, viernes) a 100 |ig/kg como un control positivo (Figuras 5 y 6). El número de ratones por grupo fue de N=5 en las Figs. 5 y 6, y N=6 en la Figura 7.
Densitometría de hueso in vivo PIXImus
La densidad mineral ósea (DMO) se determinó semanalmente en la metáfisis tibial proximal y vértebras lumbares mediante Absorciometría de rayos X de Energía Dual periférica (pDEXA) con el sistema PlXlmus2 de GE/Lunar Medical Systems, Madison, Wl. Se situó una región de interés (ROl) de 25 mm2 para incluir la superficie articular proximal, la epífisis y el extremo proximal en la metáfisis de la tibia. Se situó una región de interés (ROI) para incluir las vértebras lumbares (L1-L5). Las regiones lumbar y tibial proximales se analizaron para determinar la densidad mineral ósea total. Se presentaron las medidas de los grupos Desviación Típica y se compararon con el grupo de tratamiento con vehículo para análisis estadístico.
Análisis estadístico
Se realizó análisis estadístico con un Dunnett y Tukey-Kramer (usando MS Excel y JMP v. 5.0 para los datos de DMO). Las medidas de los grupos para cada conjunto de datos se consideraron significativamente diferentes cuando el P valor fue menor de 0,05 (P < 0,05).
Actividad neutralizante de esclerostina de anticuerpos
Los aumentos estadísticamente significativos de DMO en comparación con el vehículo vistos para cada uno de Ab-A (Figura 5), Ab-B (Figura 5), Ab-C (Figura 6) y Ab-D (Figura 7) demuestran que estos cuatro anticuerpos son anticuerpos neutralizantes de esclerostina. Además, estos datos muestran que, para anticuerpos anti-esclerostina que se unen a esclerostina de ratón, puede usarse tratamiento y análisis de ratones como se ha descrito anteriormente para identificar anticuerpos neutralizantes de esclerostina.
EJEMPLO 6
ENSAYO DE EXPLORACIÓN PARA ANTICUERPOS QUE BLOQUEAN LA UNIÓN DE UN ANTICUERPO CON ESCLEROSTINA HUMANA
La esclerostina humana se acopló a una microplaca de Biacore CM5 usando química de acoplamiento de amina convencional para generar una superficie recubierta de esclerostina. Se acoplaron 300 unidades de resonancia de esclerostina a la superficie.
Los anticuerpos para ensayar se diluyeron a una concentración de 200 |ig/ml en tampón HBS-EP (que es HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005 % (v/v)) y después se mezcló en una relación molar de uno a uno (basándose en el sitio de unión) para generar la mezcla de ensayo. Esta mezcla de ensayo contenía por lo tanto cada anticuerpo a una concentración de 100 |ig/ml (1,3 |im basándose en un sitio de unión). También se prepararon soluciones separadas que contenían cada uno de los anticuerpos en la mezcla de ensayo solamente. Estas soluciones contenían los anticuerpos individuales en tampón HBS-EP a una concentración de 100 |ig/ml (1,3 |im basándose en un sitio de unión).
Se pasaron 20 |il de la mezcla de ensayo sobre la microplaca recubierta con esclerostina a un caudal de 10 |il/min y se registró la cantidad de unión. La microplaca se trató después con dos pulsos de 60 segundos de HCl 30 mM para retirar todo el anticuerpo unido. Después se pasó una solución que contenía solamente uno de los anticuerpos de la mezcla de ensayo (a 1,3 |iM en el mismo tampón que la mezcla de ensayo basándose en un sitio de unión) sobre la microplaca del mismo modo que la mezcla de ensayo y se registró la cantidad de unión. La microplaca se trató de nuevo para retirar todo el anticuerpo unido y finalmente se pasó una solución que contenía el otro anticuerpo de la mezcla de ensayo solamente (a 1,3 |iM en el mismo tampón que la mezcla de ensayo basándose en un sitio de unión) sobre la microplaca y se registró la cantidad de unión.
La tabla posterior muestra los resultados de ensayos de bloqueo cruzado en una serie de anticuerpos diferentes. Los valores en cada celda de la tabla representan la cantidad de unión (en UR) vista cuando los anticuerpos (a 1,3 |iM basándose en un sitio de unión) o tampón indicado en la fila superior de la tabla se mezclaron con los anticuerpos (a 1,3 |iM basándose en un sitio de unión) o tampón indicados en la primera columna de la tabla.
Figure imgf000116_0001
Usando el valor de unión medio (en UR) para cada combinación de anticuerpos de la tabla anterior (puesto que cada combinación aparece dos veces) es posible calcular el porcentaje de la unión teórica mostrado por cada combinación de anticuerpos. La unión teórica se calcula como la suma de los valores medios para los componentes de cada mezcla de ensayo cuando se ensayan solos (es decir, anticuerpo y tampón).
Figure imgf000116_0002
A partir de los datos anteriores resulta evidente que Ab-4, Ab-A y Ab-19 se bloquean de forma cruzada entre sí. De forma similar Ab-13 y Ab-3 se bloquean de forma cruzada entre sí.
EJEMPLO 7
ENSAYO DE BLOQUEO CRUZADO BASADO EN ELISA
Los volúmenes líquidos usados en este ejemplo serían los usados típicamente en ELISA de placa de 96 pocillos (por ejemplo 50-200 |il/pocillo). En este ejemplo se supone que Ab-X y Ab-Y tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 kD y tienen 2 sitios de unión de esclerostina por molécula de anticuerpo. Un anticuerpo antiesclerostina (Ab-X) se usa para recubrir (por ejemplo 50 |i de 1 |ig/ml) una placa de ELISA de 96 pocillos [por ejemplo, Microplaca de Fondo Plano ElA/RlA de 96 Pocillos de Corning (Producto n.° 3590), Corning Inc., Acton, Ma ] durante al menos una hora. Después de esta etapa de recubrimiento se retira la solución de anticuerpo, la placa se lava una vez o dos veces con solución de lavado (por ejemplo, PBS y Tween 200,05 %) y después se bloquea usando una solución de bloqueo apropiada (por ejemplo, PBS, BSA 1 %, suero de cabra 1 % y Tween 200,5 %) y procedimientos conocidos en la técnica. La solución de bloqueo se retira después de la placa de ELISA y se añade un segundo anticuerpo anti-esclerostina (Ab-Y) que se ensaya con respecto a su capacidad para bloquear de forma cruzada el anticuerpo de recubrimiento, en exceso (por ejemplo 50 |il de 10 |ig/ml) en solución de bloqueo a los pocillos apropiados de la placa de ELISA. A continuación, se añade después una cantidad limitada (por ejemplo 50 |il de 10 ng/m) de esclerostina en solución de bloqueo a los pocillos apropiados y la placa se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente en agitación. La placa se lava después 2-4 veces con solución de lavado. Se añade una cantidad apropiada de un reactivo de detección de esclerostina [por ejemplo, anticuerpo policlonal anti-esclerostina biotinilado que se ha unido en complejo previamente con una cantidad apropiada de un conjugado de peroxidasa de rábano rusticano-esclerostina (h Pr )] en solución de bloqueo a la placa de ELISA y se incuba durante al menos una hora a temperatura ambiente. La placa se lava después al menos cuatro veces con solución de lavado y se desarrolla con un reactivo apropiado [por ejemplo, sustratos de HRP tales como TMB (colorimétrico) o diversos sustratos luminiscentes de HRP]. La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase de solución (en este caso Ab-Y), solamente tampón de esclerostina (es decir sin esclerostina) y reactivos de detección de esclerostina. La señal de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en pocillos con el anticuerpo de recubrimiento (en este caso Ab-X), solamente tampón del segundo anticuerpo en fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo en fase de solución), esclerostina y reactivos de detección de esclerostina. Es necesario que el ensayo de ELISA se procese de tal modo que la señal de control de positivo sea al menos 6 veces la señal de fondo.
Para evitar cualquier artefacto (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para esclerostina) resultantes de la elección de qué anticuerpo usar como el anticuerpo de recubrimiento y cuál usar como el segundo anticuerpo (competidor), es necesario que el ensayo de bloqueo cruzado se procese en dos formatos:
1) el formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en solución
y
2) el formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se usa para recubrir la placa de ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.
Ab-X y Ab-Y se definen como de bloqueo cruzado si, en el formato 1 o en el formato 2, el anticuerpo antiesclerostina en fase de solución es capaz de provocar una reducción de entre el 60 % y el 100 %, específicamente entre el 70 % y el 100 %, y más específicamente entre el 80 % y 100 %, de la señal de detección de esclerostina (es decir la cantidad de esclerostina unida por el anticuerpo de recubrimiento) en comparación con la señal de detección de esclerostina obtenida en ausencia del anticuerpo anti-esclerostina en fase de solución (es decir los pocillos de control positivos).
En el caso de que se use una versión marcada de esclerostina en el ELISA, tal como una Esclerostina marcada con His N terminal (R&D Systems, Minneapolis, MN, Estados Unidos; 2005 cat n.° 1406-ST-025) entonces un tipo apropiado de reactivo de detección de esclerostina incluiría un anticuerpo anti-His marcado con HROP. Además de usar Esclerostina marcada con His N terminal, también podría usarse Esclerostina marcada con His C terminal. Además, podrían usarse diversos otros marcadores y combinaciones de proteínas de unión a marcador conocidos en la técnica en este ensayo de bloqueo cruzado basado en ELISA (por ejemplo, marcador HA con anticuerpos anti­ HA; marcador FLAG con anticuerpos anti-FLAG, marcador de biotina con estreptavidina).
EJEMPLO 8
ENSAYO DE MINERALIZACIÓN BASADO EN CÉLULAS PARA IDENTIFICAR AGENTES CAPACES DE ANTAGONIZAR LA ACTIVIDAD DE ESCLEROSTINA
Introducción
Se usa mineralización por células de linaje de osteoblastos en cultivo, bien células primarias o bien líneas celulares, como un modelo in vitro de formación de hueso. La mineralización tarda de aproximadamente una a seis semanas en producirse comenzando con la inducción de la diferenciación de células de linaje de osteoblastos mediante uno o más agentes de diferenciación. La secuencia global de acontecimientos implica proliferación celular, diferenciación, producción de matriz extracelular, maduración de matriz y finalmente deposición de minerales, que se refiere a la cristalización y/o deposición de fosfato cálcico. Esta secuencia de acontecimientos que comienza con la proliferación y diferenciación celular, y que termina con la deposición de mineral se denomina en el presente documento mineralización. La medición de calcio (mineral) es el resultado del ensayo.
La deposición de mineral tiene una fuerte característica biofísica, porque una vez que las “semillas” minerales comienzan a formarse, la cantidad total de mineral que se depositará en el cultivo completo puede en ocasiones depositarse con bastante rapidez, tal como en un periodo de unos pocos días después. El momento y alcance de la deposición mineral en cultivo están influidos, en parte, por las células/línea celular de linaje de osteoblastos particular que se use, las condiciones de crecimiento, la elección de agentes de diferenciación y el número de lote particular del suero usado en el medio de cultivo celular. Para cultivos de mineralización de línea celular/célula de linaje de osteoblastos, deberían ensayarse al menos de ocho a quince lotes de suero de más de un proveedor para identificar un lote de suero particular que permita que se produzca la mineralización.
Las células MC3T3-E1 (Sudo H et al., In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J. Cell Biol. 96: 191-198) y subclones de la línea cellular original pueden formar mineral en cultivo tras su crecimiento en presencia de agentes de diferenciación. Dichos subclones incluyen MC3T3-E1-BF (Smith E, Redman R, Logg C, Coetzee G, Kasahara N, Frenkel B. 2000. Glucocorticoids inhibit developmental stage-specific osteoblast cell cycle. J Biol Chem 275: 19992-20001).
Identificación de Anticuerpos Neutralizantes de Esclerostina
Se usaron células MC3T3-E1-BF para el ensayo de mineralización. Se usaron ácido ascórbico y B-glicerofosfato para inducir diferenciación de células MC3T3-E1-BF que conduzca a deposición mineral. El protocolo de exploración específico, en formato de 96 pocillos, implicó sembrar células en placas un miércoles, seguido de siete cambios de medio (como se describe adicionalmente posteriormente) durante un periodo de 12 días, teniendo lugar la mayor parte de la deposición mineral aproximadamente en las dieciocho horas finales (por ejemplo, del domingo por la noche al lunes). Para cualquier tratamiento dado, se usaron 3 pocillos (N=3). El momento y alcance específicos de la deposición mineral pueden variar dependiendo, en parte, del número de lote de suero particular que se use. Los experimentos de control permitirán explicar dichas variables, como se conoce bien en la técnica de la experimentación de cultivo celular en general.
En este sistema de ensayo la esclerostina inhibió uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducían a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibió la mineralización). Los anticuerpos anti-esclerostina que fueron capaces de neutralizar la actividad inhibidora de esclerostina posibilitaron la mineralización del cultivo en presencia de esclerostina de modo que hubo un aumento estadísticamente significativo de la deposición de fosfato cálcico (medido como calcio) en comparación con la cantidad de calcio medida en el grupo de tratamiento solamente con esclerostina (es decir, sin anticuerpo). Para análisis estadístico (usando MS Excel y JMP) se usó un ANOVA de 1 vía seguido de comparación de Dunnett para determinar diferencias entre grupos. Las medias de grupo para cada conjunto de datos se consideraron significativamente diferentes cuando el P valor fue menor de 0,05 (P < 0,05). Se muestra un resultado representativo del procesamiento de este ensayo en la Figura 22. En ausencia de esclerostina de ratón recombinante, la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral sucedieron con normalidad. Se muestran los niveles de calcio en cada grupo de tratamiento como medias Error Típico de la Media (ETM). En este experimento ejemplar los niveles de calcio del ensayo de calcio fueron ~31 |ig/ml. Sin embargo, la adición de esclerostina de ratón recombinante provocó inhibición de la mineralización y el calcio se redujo en ~85 %. La adición de anticuerpo monoclonal anti-esclerostina Ab-19 o Ab-4 junto con la esclerostina recombinante dio como resultado un aumento estadísticamente significativo en la deposición mineral, en comparación con el grupo solamente de esclerostina, debido a que la actividad inhibidora de esclerostina se neutralizó por uno de los anticuerpos. Los resultados de este experimento indican que Ab-19 y Ab-4 son anticuerpos monoclonales neutralizantes de esclerostina (Mab).
La Figura 23 muestra un resultado muy similar usando esclerostina humana recombinante y dos Mab antiesclerostina humanizados. La Figura 24 también muestra un resultado muy similar usando esclerostina humana recombinante y Mab anti-esclerostina de ratón y humanizados según se indica.
Los anticuerpos usados para los experimentos mostrados en la Fig. 22, 23 y 24 tienen pesos moleculares de aproximadamente 145 kD y tienen 2 sitios de unión a esclerostina por molécula de anticuerpo.
Se describe a continuación un protocolo de cultivo de células MC3T3-E1-BF.
Reactivos y Medios
Reactivos Compañía N.° de catálogo
Alfa-MEM Gibco-Invitrogen 12571-048
Ácido ascórbico Sigma A4544
Beta-glicerofosfato Sigma G6376
PenStrepGlutamina 100X Gibco-Invitrogen 10378-016
Dimetilsulfóxido (DMSO) Sigma D5879 o D2650
Suero fetal bovino (FBS) Cansera CS-C08-500 (n.° de lote SF50310) o suero fetal bovino (FBS) TerraCell Int. CS-C08-1000A (n.° de lote SF-20308) Alfa-MEM se fabrica habitualmente con una fecha de caducidad de 1 año. Para el cultivo celular se usó Alfa-MEM que no tenía más de 6 meses después de la fecha de fabricación.
Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu) se preparó como sigue:
Se descongeló un frasco de 500 ml de FBS y se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 micrómetros. Se añadieron 100 ml de este FBS a 1 litro de Alfa-MEM seguido de la adición de 10 ml de PenStrepGlutamina 100x.
El FBS no usado se separó en alícuotas y se volvió a congelar para uso posterior.
El Medio de Diferenciación (Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu ácido ascórbico 50 |ig/ml beta-glicerofosfato 10 mM) se preparó como sigue:
Se prepararon 100 ml de Medio de Diferenciación complementando 100 ml de Medio de Expansión con ácido ascórbico y beta-glicerofosfato como sigue:
Conc. de reserva (véase posteriormente) Volumen Conc. Final
Ácido ascórbico 10 mg/ml 0,5 ml 100 |ig/ml (50 |ig/ml 50 |ig/ml) P-glicerofosfato 1 M 1,0 ml 10 nM
Se preparó Medio de Diferenciación complementando Medio de Expansión solamente el día en que el Medio de Diferenciación iba a usarse para cultivo celular. La concentración final de ácido ascórbico en el Medio de Diferenciación es de 100 |ig/ml debido a que Alfa-MEM ya contiene ácido ascórbico 50 |ig/ml. Se preparó solución madre de ácido ascórbico (10 mg/ml) y se separó en alícuotas para congelar a -80 °C. Cada alícuota se usó solamente una vez (es decir no se volvió a congelar). Se preparó solución madre de betaglicerofosfato (1 M) y se separó en alícuotas para congelar a -20 °C. Cada alícuota se congeló y se descongeló un máximo de 5 veces antes de descartarse.
Cultivo Celular para expansión de células MC3T3-E1-BF.
Se realizó cultivo celular a 37 °C y CO25 %. Se generó un banco de células para los fines de explorar con respecto a anticuerpos neutralizantes de esclerostina. El banco de células se creó como sigue:
Se descongeló un recipiente de células MC3T3-E1-BF congeladas mediante agitación en un baño de agua a 37 °C. Las células descongeladas se pusieron en 10 ml de Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu) en un tubo de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos. Las células se resuspendieron después en 4 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, se sembraron 1 x 106 células en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu en un matraz T175.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente a los 7 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05 %; EDTA 0,532 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 células en placas con 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces de T175 usados para sembrar en este punto dependió del número de células totales disponible y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90 %/DMSO 10 %.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05 %; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces T175 usados para sembrar en este punto dependió del número total de células disponibles y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90 %/DMSO 10 %.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05 %; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se sembraron a 1 x 106 en 50 ml de medio Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu por cada matraz T175. El número de matraces T175 usados para sembrar en este punto dependió del número total de células disponibles y el número deseado de matraces que debían llevarse al siguiente pase. Las células extra se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90 %/DMSO 10 %.
Cuando este pase fue confluyente (aproximadamente 3-4 días), las células se tripsinizaron con tripsina/EDTA (Tripsina 0,05 %; EDTA 0,53 mM), se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos y después se resuspendieron en 5 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células usando azul de tripano y un hemacitómetro, las células se congelaron a 1-2x106 células vivas/ml en FBS 90 %/DMSO 10 %. Este “pase final” de células congeladas fue el pase que se usó para el ensayo de exploración.
Cultivo celular para mineralizar células MC3T3-E1-BF.
Se realizó cultivo celular a 37 °C y CO25 %. Es deseable minimizar las fluctuaciones de temperatura y % de CO2 durante el procedimiento de cultivo celular de mineralización. Esto puede conseguirse minimizando el tiempo que las placas pasan fuera del incubador durante la alimentación y también minimizando el número de veces que se abre y se cierra la puerta del incubador durante el procedimiento de cultivo celular de mineralización. A este respecto puede ser útil tener un incubador de cultivo tisular que esté dedicado exclusivamente al cultivo celular de mineralización (y por lo tanto no se abra o cierre más de lo que es necesario).
Se descongeló un número apropiado de recientes de “pase final” preparados como se ha descrito anteriormente mediante agitación en un baño de agua a 37 °C. Las células descongeladas se pusieron en 10 ml de Medio de Expansión (Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu) en un tubo de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación suavemente durante 5 minutos. Las células se resuspendieron después en 4 ml de Alfa-MEM/FBS 10 %/PenStrepGlu. Después de determinar el número de células por azul de tripano y hemacitómetro, se sembraron 2500 células en placas en 200 microlitros de medio de Expansión por pocillo en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno I (Becton Dickinson Labware, cat. n.° 354407).
Para evitar un efecto de mineralización de borde de placa, las células no se sembraron en las placas en la columna/fila más externa en todo el borde de la placa. En su lugar se añadieron 200 microlitros de PBS a estos pocillos.
Procedimiento de cultivo celular ejemplar
En el siguiente procedimiento, se indica que el día de partida para la siembra de las células en placas es un miércoles. Si se usa un día de la semana diferente como el día de partida para la siembra de las células en placas, ese día dará inicio al programa diario de retirada y adición de medio durante el proceso completo como se indica posteriormente. Por ejemplo, si las células se siembran un martes, el medio no debería retirarse y añadirse el primer viernes y sábado, ni el segundo viernes y sábado. Con un comienzo en martes, las placas se prepararían para el ensayo de calcio el domingo final.
Las células se sembraron un miércoles a 2500 células en 200 |il de medio de Expansión.
El jueves se retiró todo el medio de Expansión y se añadieron 200 |il de Medio de Diferenciación.
El viernes se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El lunes se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El martes se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El miércoles se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El jueves se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo.
El viernes se retiraron 100 |il de medio y se añadieron 100 |il de Medio de Diferenciación nuevo. El lunes siguiente se prepararon placas para el ensayo de calcio como sigue:
Las placas se lavaron una vez con Tris 10 mM, HCl pH 7-8.
Trabajando bajo una campana de humos, se añadieron 200 |il de NHC 0,5 N por pocillo. Las placas se congelaron después a -80 °C.
Justo antes de medir el calcio, las placas se congelaron-descongelaron dos veces y después se usó trituración con una pipeta multicanal para dispersar los contenidos de la placa. Después se permitió que los contenidos de la placa reposaran a 4 °C durante 30 minutos momento en el cual se retiró una cantidad apropiada de sobrenadante para medir el calcio usando un kit de calcio disponible en el mercado. Un kit ejemplar y no limitante es Calcium (CPC) Liquicolor, Cat. N.° 0150-250, Stanbio Laboratory, Boerne, TX.
En este ensayo basado en células, la esclerostina inhibe uno o más de la secuencia de acontecimientos que conducen a e incluyendo la deposición mineral (es decir, la esclerostina inhibe la mineralización). Por lo tanto, en experimentos en los que se indujo esclerostina en el experimento de cultivo celular particular, se añadió la esclerostina recombinante al medio comenzando el primer jueves y cada día de alimentación a continuación. En los casos en los que se ensaya un anticuerpo monoclonal anti-esclerostina (Mab) con respecto a la capacidad para neutralizar esclerostina, es decir, permitir la mineralización neutralizando la capacidad de la esclerostina para inhibir la mineralización, el Mab se añadió al medio comenzando el primer jueves y cada día de alimentación a continuación. De acuerdo con el protocolo, eso se consiguió como sigue: el Mab se preincubó con la esclerostina recombinante en medio de Diferenciación durante 45-60 minutos a 37 °C y después este medio se usó para alimentar a las células.
Se ha descrito anteriormente un protocolo de mineralización de 12 días para las células MC3T3-E1-BF. Usando los mismos reactivos y protocolo de alimentación, las células originales MC3T3-E1 (Sudo H, Kodama H-A, Amagai Y, Yamamoto S, Kasai S. 1983. In vitro differentiation and calcification in a new clonal osteogenic cell line derived from newborn mouse calvaria. J Cell Biol 96: 191-198) que los inventores obtuvieron del Banco de Células RIKEN (RCB 1126, RIKEN BioResource Center 3-1-1 Koyadai, Tsukubashi, Ibaraki 305-0074, Japón) tardaron más en mineralizarse (20 días totales para la mineralización) que las células MC3T3-E1-BF. La mineralización de las células MC3T3-E1 originales se inhibió mediante esclerostina recombinante y esta inhibición se bloqueó usando un anticuerpo neutralizante de esclerostina.
EJEMPLO 9
EL ANTICUERPO ANTI-ESCLEROSTINA PROTEGE DE LA PÉRDIDA DE HUESO INDUCIDA POR INFLAMACIÓN EN EL MODELO DE TRANSFERENCIA DE CD4 CD45RBHI DE COLITIS EN RATONES SCID
Sumario del modelo
La inyección del subconjunto CD45RBalto de linfocitos T CD4+ en ratones scid C.B-17 da como resultado la inflamación intestinal crónica con características similares a las de enfermedad inflamatoria del intestino humana (IBD). Se observa diarrea y enfermedad de debilitamiento 3-5 semanas después de la transferencia celular con infiltración de leucocitos grave en el colon acompañado de hiperplasia de células epiteliales y formación de granuloma. Los ratones scid C.B-17 que reciben el subconjunto recíproco de células CD4+, las que expresan CD45RBbajo, no muestran colitis y tienen un aumento de peso indistinguible de ratones scid no inyectados. Además de los síntomas de colitis, el modelo de transferencia de linfocitos T CD4+ CD45RBalto de colitis está acompañado de una reducción de la densidad mineral ósea (DMO), que se cree que es principalmente mediante mecanismos inflamatorios en lugar de malabsorción dietética (Byrne, F. R. et al, Gut 54: 78-86, 2005).
Inducción de colitis y pérdida de hueso inducida por inflamación
Se tomaron bazos de ratones balb/c hembra y se rompieron mediante un tamiz celular de 70 |im. La población de CD4+ se enriqueció después mediante selección negativa con Dynabeads usando anticuerpos contra B220, MAC-1, CD8 e I-Ad. La población enriquecida se tiñó después con anti-CD4 conjugado con FITC y anti-CD45RB conjugado con PE y se fraccionó en poblaciones CD4+CD45RBalto y CD4+CD45RBbajo por separación de dos colores en un Moflo (Dakocytomation). Las poblaciones de CD45RBalto y CD45RBbajo se definieron como el 40 % de tinción más brillante y el 20 % de tinción más pálida de células CD4+ respectivamente. Se inyectaron después 5x105 células i.p. en ratones scid C.B-17 el día 0 y se supervisó el desarrollo de colitis mediante la aparición de heces blandas o diarrea y pérdida de peso. Se tomaron mediciones de densidad mineral ósea al final del estudio (día 88).
Efecto del tratamiento anti-Esclerostina en síntomas de colitis y DMO
Se dosificó IgG Ab-A a 10 mg/kg s.c. desde el día antes de la transferencia de células CD4+CD45RBalto y se comparó con ratones que recibieron el anticuerpo de control negativo 101.4 también dosificado a 10 mg/kg s.c. Los anticuerpos se dosificaron semanalmente a continuación. Un grupo de ratones que recibió células CD4+CD45RBbajo no patógenas y se dosificaron con 10 mg/kg de 101.4 se estudió como un control. Al final del estudio (día 88) se midió la densidad mineral ósea y se tomaron secciones del colon para análisis de infiltración celular y evaluación de daño histológico.
a) Sin efecto en síntomas de colitis
Los síntomas de colitis típicos tales como pérdida de peso e infiltración de células inflamatorias en el colon no se vieron afectados por el tratamiento con Ab-A. De forma similar no hubo mejora de daño histológico al colon después del tratamiento con Ab-A.
b) Inhibición de pérdida inducida por inflamación de densidad mineral ósea.
El día 88 después de la transferencia de células en ratones scid C.B-17, se midió la densidad mineral ósea (DMO total, DMO de vértebras y DMO del fémur). En comparación con ratones de control que recibieron células no patógenas CD4+CD45RBbajo, los ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y el anticuerpo de control negativo 101.4 tuvieron densidad mineral ósea reducida, como se muestra en la Figura 25. Por el contrario, no se observó reducción de DMO después de tratamiento con Ab-A. Las mediciones totales, de vértebras y de fémur de DMO fueron significativamente mayores en ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y se trataron con Ab-A que los ratones que recibieron linfocitos T CD4+ CD45RBalto y se trataron con 101.4 (P<0,001 por ensayo de comparación múltiple de Bonferroni).
EJEMPLO 10
DETERMINACIÓN BASADA EN KINEXA DE AFINIDAD (Kd) DE ANTICUERPOS ANTI-ESCLEROSTINA POR ESCLEROSTINA HUMANA
La afinidad de varios anticuerpos anti-esclerostina por esclerostina humana se evaluó mediante un análisis de unión en equilibrio en solución usando KinExA® 3000 (Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID). Para estas mediciones, se pre-recubrieron perlas Reacti-Gel 6x (Pierce, Rockford, IL) con esclerostina humana 40 |ig/ml en Na2C0350 mM, pH 9,6 a 4 °C durante una noche. Las perlas se bloquearon después con BSA 1 mg/ml en Tris-HCl 1 M, pH 7,5 a 4 °C durante dos horas. Se mezclaron 10 pM, 30 pM o 100 pM del anticuerpo con diversas concentraciones de esclerostina humana, que varió en concentración de 0,1 |iM a 1 nM, y se equilibró a temperatura ambiente durante más de 8 horas en PBS con BSA 0,1 mg/ml y P20 0,005 %. Las mezclas se pasaron después sobre las perlas recubiertas con esclerostina humana. La cantidad de anticuerpo anti esclerostina unido a perlas se cuantificó usando anticuerpos anti-IgG de ratón de cabra marcados con Cy5 fluorescente o anti-IgG humana de cabra marcados con Cy5 fluorescente (Jackson Immuno Research, West Grove, PA) para las muestras de anticuerpo de ratón o humano, respectivamente. La cantidad de señal fluorescente medida fue proporcional a la concentración de anticuerpo antiesclerostina libre en cada mezcla de reacción en equilibrio. La constante de disociación en equilibrio (Kd) se obtuvo a partir de regresión no lineal de las curvas de competición usando un modelo de unión homogénea de un sitio de curva n proporcionado en el software KinExA Pro. Los resultados de los ensayos de KinExA para los anticuerpos seleccionados se resumen en la siguiente tabla.
Anticuerpos Antígeno Ko (pM) intervalo de confianza al 95 %
Ab-13 Esclerostina Humana 0,6 0,4 ~ 0,8 pM
Ab-4 Esclerostina Humana 3 1,8 ~ 4 pM
Ab-19 Esclerostina Humana 3 1,7 ~ 4 pM
Ab-14 Esclerostina Humana 1 0,5 ~ 2 pM
Ab-5 Esclerostina Humana 6 4,3 ~ 8 pM
Ab-23 Esclerostina Humana 4 2,1 ~ 8 pM
EJEMPLO 11
MÉTODO DE BIACORE PARA DETERMINAR LA AFINIDAD DE ANTICUERPOS ANTI-ESCLEROSTINA HUMANIZADOS POR ESCLEROSTINA HUMANA.
La tecnología BIAcore supervisa la unión entre biomoléculas en tiempo real y sin la necesidad de marcaje. Uno de los que interaccionan, denominado el ligando, se inmoviliza directamente o se captura en la superficie inmovilizada mientras que el otro, denominado el analito, fluye en solución sobre la superficie capturada. El sensor detecta el cambio de masa en la superficie sensora a medida que el analito se une al ligando para formar un complejo en la superficie. Esto corresponde al proceso de asociación. El proceso de disociación se supervisa cuando el analito se reemplaza por tampón. En el ensayo de BIAcore de afinidad, el ligando es el anticuerpo anti-esclerostina y el analito es esclerostina.
Instrumento
Biacore® 3000, Biacore AB, Uppsala, Suecia
Microplaca sensora
CM5 (uso de investigación) Número de Catálogo: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Las microplacas se almacenaron a 4 °C.
Solución de BIAnormalización
Glicerol al 70 % (p/p). Parte del Kit de BIAmantenimiento Número de Catálogo: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. El kit de BIAmantenimiento se almacenó a 4 °C.
Kit de Acoplamiento de Amina
Número de Catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Suecia.
Clorhidrato de etil-3-(e-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC). Compuesto hasta 75 mg/ml en agua destilada y almacenado en alícuotas de 200 |il a -70 °C.
N-hidroxisuccinimida (NHS). Compuesto hasta 11,5 mg/ml en agua destilada y almacenado en alícuotas de 200 |il a -70 °C.
Clorhidrato de etanolamina 1 M - NaOH pH 8,5. Almacenado en alícuotas de 200 |il a -70 °C.
Tampones
Tampón de ejecución para inmovilizar el anticuerpo de captura: HBS-EP (que es HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005 %). Número de Catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampón almacenado a 4 °C.
Tampón de inmovilización: Acetato 5.0 (que es acetato sódico 10 mM pH 5,0). Número de Catálogo: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Suecia. Tampón almacenado a 4 °C.
Tampón de ejecución para ensayo de unión: HBS-EP (que es HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005 %, Número de Catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suecia) con CM-Dextrano añadido a 1 mg/ml (Número de Catálogo 27560, Fluka BioChemika, Buchs, Suiza). Tampón almacenado a 4 °C.
Captura de ligando
IgG anti-humano de cabra fragmento F(ab')2 Affinipure, específico de fragmento Fc. Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, Estados Unidos) número de Catálogo: 109-006-098. Reactivo almacenado a 4 °C.
Ligando
Anticuerpos anti-esclerostina humana humanizados Ab5, Ab14 y Ab20.
Analito
Esclerostina humana recombinante. Alícuotas almacenadas a -70 °C y descongeladas una vez para cada ensayo. Solución de regeneración
HCl 40 mM preparado por dilución con agua destilada a partir de una solución madre 11,6 M (BDH, Poole, Inglaterra. Número de catálogo: 101254H).
NaOH 5 mM preparado mediante dilución con agua destilada a partir de una solución madre 50 mM. Número de catálogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suecia.
Método de Ensayo
El formato de ensayo fue captura del anticuerpo anti-esclerostina mediante Fc anti-IgG humano inmovilizado, después valoración de la esclerostina sobre la superficie capturada.
Se proporciona a continuación un ejemplo del procedimiento:
Se realizó BIA (Análisis de Interacción Biamolecular) usando un BIAcore 3000 (BIAcore AB). Se inmovilizó IgG anti­ humano de cabra Fragmento F(ab')2 Affinipure, específico de fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch) en una microplaca sensora CM5 mediante química de acoplamiento de amina hasta un nivel de captura de ~4000 unidades de respuesta (UR). Se usó tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 0,005 %, BIAcore AB) que contenía CM-Dextrano 1 mg/ml como el tampón de ejecución con un caudal de 10 |il/min. Se usó una inyección de 10 |il del anticuerpo anti-esclerostina a ~5 |ig/ml para captura por el Fc anti-IgG humano inmovilizado. Los niveles de captura de anticuerpo fueron típicamente 100-200 UR. La esclerostina se valoró sobre el anticuerpo anti-esclerostina capturado a diversas concentraciones a un caudal de 30 |il/min. La superficie se regeneró por dos inyecciones de 10 |il de HCl 40 mM, seguido de una inyección de 5 |il de NaOH 5 mM a un caudal de 10 |il/min.
Se analizaron curvas de unión con resta de fondo usando el software BIAevaluation (versión 3.2) siguiendo procedimientos convencionales. Se determinaron los parámetros cinéticos a partir del algoritmo de ajuste.
Los datos cinéticos y las constantes de disociación calculadas se proporcionan en la Tabla 2.
TABLA 2: Afini ni r ni- l r in r clerostina
Figure imgf000123_0001
EJEMPLO 12
ENSAYOS IN VIVO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-ESCLEROSTINA EN MONOS CYNOMOLGUS Se usaron treinta y tres monos cynomolgus hembra de aproximadamente 3-5 años de edad (Macaca fascicularis) en este estudio de 2 meses. El estudio contenía 11 grupos:
Grupo 1: vehículo (N=4)
Grupo 2: Ab-23 (N=2, dosis 3 mg/kg)
Grupo 3: Ab-23 (n =3, dosis 10 mg/kg)
Grupo 4: Ab-23 (n =3, dosis 30 mg/kg)
Grupo 5: Ab-5 (N=3, dosis 3 mg/kg)
Grupo 6: Ab-5 (n=3, dosis 10 mg/kg)
Grupo 7: Ab-5 (n=3, dosis 30 mg/kg)
Grupo 8: Ab-14 (N=3, dosis 3 mg/kg)
Grupo 9: Ab-14 (n=3, dosis 10 mg/kg)
Grupo 10: Ab-14 (N=3, dosis 30 mg/kg)
Grupo 11: Hormona paratiroidea (1-34) [PTH (1-34)] (N=3, dosis 10 |ig/kg)

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal que se une a esclerostina humana; aumenta al menos uno de formación de hueso, densidad mineral ósea, contenido mineral óseo, masa ósea, calidad ósea y fuerza ósea en un mamífero; y se une a una parte de la esclerostina humana que consiste en los aminoácidos 51-64, 73-90, 101-117 y 138-149 de la SEQ ID NO: 1, en donde dicha parte tiene las tres de:
(a) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 57 y 111;
(b) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 82 y 142; y
(c) un enlace disulfuro entre los aminoácidos 86 y 144.
2. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1, en donde la parte de la esclerostina humana consiste en los aminoácidos 57-64, 73-86, 111-117 y 138-144 de la SEQ ID NO: 1 y tiene los tres de dichos enlaces disulfuro.
3. El anticuerpo monoclonal de la reivindicación 1 o 2 que es un fragmento F(ab')2, Fab, Fab' o Fv.
4. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
5. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se une a esclerostina humana con una afinidad, determinada por resonancia de plasmón superficial, que es al menos 50, 100, 250, 500, 1000 o 10.000 veces mayor que la afinidad por la lisozima de clara de huevo de gallina.
6. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento de la osteoporosis o la osteopenia.
7. El anticuerpo monoclonal de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 para su uso en la mejora de los resultados en procedimientos ortopédicos, procedimientos dentales, cirugía de implante, reemplazo de articulaciones, injerto de hueso, cirugía cosmética de hueso o reparación de hueso tal como curación de fracturas, curación sin unión, curación de unión retardada o reconstrucción facial.
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