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ES2978111T3 - Métodos, aparatos y sistemas para analizar cepas de microorganismos de comunidades heterogéneas complejas, predecir e identificar relaciones funcionales e interacciones de las mismas, y seleccionar y sintetizar conjuntos microbianos basados en las mismas - Google Patents

Métodos, aparatos y sistemas para analizar cepas de microorganismos de comunidades heterogéneas complejas, predecir e identificar relaciones funcionales e interacciones de las mismas, y seleccionar y sintetizar conjuntos microbianos basados en las mismas Download PDF

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Abstract

Se describen métodos, aparatos y sistemas para cribar, analizar y seleccionar microorganismos de comunidades heterogéneas complejas, predecir e identificar relaciones funcionales e interacciones entre ellos y sintetizar conjuntos microbianos basados en ellos. También se describen métodos para identificar y determinar el recuento absoluto de células de tipos y cepas de microorganismos, junto con la identificación de las relaciones de red entre microorganismos activos y parámetros ambientales. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos, aparatos y sistemas para analizar cepas de microorganismos de comunidades heterogéneas complejas, predecir e identificar relaciones funcionales e interacciones de las mismas, y seleccionar y sintetizar conjuntos microbianos basados en las mismas
ANTECEDENTES
Los microorganismos coexisten en la naturaleza como comunidades y participan en una variedad de interacciones, lo que da como resultado tanto la colaboración como la competencia entre miembros individuales de la comunidad. Los avances en la ecología microbiana han revelado altos niveles de diversidad y complejidad de especies en la mayoría de las comunidades. Los microorganismos están omnipresentes en el medio ambiente, y habitan una amplia gama de ecosistemas dentro de la biosfera. Los microorganismos individuales, y sus respectivas comunidades, desempeñan papeles únicos en entornos tales como sitios marinos (tanto en aguas profundas como en superficies marinas), suelos, y tejidos animales, incluido el tejido humano.
Boaro et al, 2014. FEMS Microbiol Ecol, 90, 90(3), 802-815, describen un método que aplica pirosecuenciación, proteómica y metabolómica del gen 16S rDNA para analizar el efecto de la perturbación del pH sobre la degradación de la celulosa de una comunidad microbiana.
Muller et al, 2013. Trends in Microbiol, 21(7), 325-333, revelan la aplicación del enfoque de análisis sistémico de máxima información sobre datos metatranscriptómicos y metagenómicos de la comunidad microbiana para identificar rasgos de los miembros de la comunidad microbiana.
Ursell et al, 2013. Cell Metab, 17(3), 317-318, describen un método que analiza los efectos de xenobióticos y antibióticos en el microbioma intestinal, comprendiendo dicho método la tinción celular, la identificación y la cuantificación de las diferentes cepas presentes.
McCarren et al, 2010. PNAS, 107(38), 16420-16427, describen análisis metagenómicos y metatranscriptómicos de consorcios microbianos y los efectos de la materia orgánica disuelta de alto peso molecular en miembros individuales de la comunidad microbiana.
Kleinsteuber et al, 2006. Appl Environ Microbiol, 72(5), 3531-3542, describen el análisis de comunidades microbianas durante el crecimiento en combustibles diésel en diferentes condiciones de salinidad.
El documento US2013204831 describe el uso del enfoque de análisis de máxima información para datos de expresión genética y abundancia bacteriana de comunidades microbianas y las ventajas que proporciona esta metodología en los resultados obtenidos.
Bikel et al, 2015. Comp Struct Biotech J, 13, 390-401, describen el uso combinado de metagenómica y metatranscriptómica para identificar las tinciones de microorganismos activos en condiciones específicas.
SUMARIO
La invención es como se define en las reivindicaciones 1,7 y 16.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La FIG. 1A muestra un flujo de proceso de alto nivel ejemplar para detectar y analizar cepas de microorganismos de comunidades heterogéneas complejas, predecir relaciones funcionales e interacciones de las mismas, y seleccionar y sintetizar conjuntos microbianos basados en las mismas, según algunas realizaciones.
La FIG. 1B muestra un flujo de proceso general para determinar el recuento de células absoluto de una o más cepas de microorganismos activos, según una realización.
La FIG. 2 muestra un flujo de proceso general que determina la coexistencia de una o más cepas de microorganismos activos en una muestra o muestra con uno o más parámetros de metadatos (ambientales), según una realización.
La FIG. 3A es un diagrama esquemático que ilustra un sistema 300 de selección y análisis de interacción de microbios ejemplar, según una realización, y la FIG. 3B es un ejemplo de flujo de proceso para uso con tal sistema. Sistemas y procedimientos para determinar interacciones y dependencias multidimensionales entre especies dentro de comunidades microbianas naturales, identificar microbios activos, y seleccionar una pluralidad de microbios activos para formar un conjunto, agregado u otra agrupación sintética de microorganismos que alterarán parámetro o parámetros específicos y/o medidas relacionadas, se describen con respecto a las FIGs. 3A y 3B.
Las FIGs. 3C y 3D proporcionan datos ejemplares que ilustran algunos aspectos de la descripción.
La FIG.4 muestra la no linealidad de las libras de grasa láctea producidas en el transcurso de un experimento para determinar los constituyentes de la comunidad microbiana del rumen que impactan la producción de grasa láctea en vacas lecheras.
La FIG. 5 muestra la correlación del recuento de células absoluto con filtro de actividad de la cepa diana Ascus_713 con las libras (libras) de grasa láctea producida.
La FIG. 6 muestra el recuento de células absoluto con filtro de actividad de la cepa diana Ascus_7 y las libras (libras) de grasa láctea producidas en el transcurso de un experimento.
La FIG. 7 muestra la correlación de la abundancia relativa sin filtro de actividad de la cepa diana Ascus_3038 con las libras (libras) de grasa láctea producida.
La FIG. 8 muestra los resultados de una prueba de campo en la que a vacas lecheras se les administró un conjunto microbiano preparado según los métodos descritos; la FIG. 8A muestra el número promedio de libras de grasa láctea producidas a lo largo del tiempo; la FIG. 8B muestra el número promedio de libras de proteína láctea producidas a lo largo del tiempo; y la FIG. 8C muestra el número promedio de libras de leche con corrección energética (ECM) producidas a lo largo del tiempo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Las comunidades microbianas son fundamentales para los procesos ambientales en muchos tipos diferentes de ecosistemas y también en la biogeoquímica de la Tierra, por ejemplo mediante el ciclo de nutrientes y la fijación de carbono (Falkowski et al. (1998) Science 281, págs. 237-240). Sin embargo, debido a la complejidad de la comunidad y la falta de cultivabilidad de la mayoría de los miembros de una comunidad microbiana determinada, los detalles moleculares y ecológicos, así como los factores que influyen en estos procesos, aún no se comprenden bien.
Las comunidades microbianas difieren en su composición cualitativa y cuantitativa, y cada comunidad microbiana es única, y su composición depende del ecosistema y/o entorno en el que reside. El recuento de células absoluto de los miembros de la comunidad microbiana está sujeto a los cambios del entorno en el que reside la comunidad, así como a los cambios fisiológicos y metabólicos causados por los microorganismos (por ejemplo, división celular, expresión de proteínas, etc.). Los cambios en los parámetros ambientales y/o la cantidad de un microorganismo activo dentro de una comunidad pueden tener efectos de gran alcance en los otros microorganismos de la comunidad, y en el ecosistema y/o ambiente en el que se encuentra la comunidad. Para comprender, predecir y reaccionar ante los cambios en estas comunidades microbianas, es necesario identificar los microorganismos activos en una muestra y el número de microorganismos activos en la comunidad respectiva. Sin embargo, hasta la fecha, la gran mayoría de los estudios de los miembros de la comunidad microbiana se han centrado en las proporciones de microorganismos en una comunidad microbiana particular, en lugar del recuento de células absoluto (Segata et al. (2013). Molecular Systems Biology 9, pág. 666).
Aunque las composiciones de las comunidades microbianas se pueden determinar fácilmente, por ejemplo, mediante el uso de enfoques de secuenciación de alto rendimiento, se necesita una comprensión más profunda de cómo se ensamblan y mantienen las respectivas comunidades.
Las comunidades de microorganismos participan en procesos críticos tal como el ciclado biogeoquímico de elementos esenciales, por ejemplo el ciclado del carbono, oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo y diversos metales; y las estructuras, interacciones y dinámicas de la comunidad respectiva son fundamentales para la existencia de la biosfera (Zhou et al. (2015). mBio 6(1):e02288-14. Doi:10.1128/mBio.02288-14). Estas comunidades son muy heterogéneas, y casi siempre incluyen mezclas complejas de bacterias, virus, arqueas y otros microeucariotas tales como los hongos. Los niveles de heterogeneidad de la comunidad microbiana en entornos humanos tales como el intestino y la vagina se han relacionado con enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal y la vaginosis bacteriana (Nature (2012). Vo. 486, pág. 207). Sin embargo, cabe destacar que incluso los individuos sanos difieren notablemente en los microbios que ocupan los tejidos en tales entornos (Nature (2012). Vo. 486, pág. 207).
Como muchos microbios pueden no ser cultivables o ser difíciles o costosos de cultivar, los enfoques independientes del cultivo, tal como la secuenciación de ácidos nucleicos, han avanzado en la comprensión de la diversidad de diversas comunidades microbianas. La amplificación y secuenciación del gen del ARN ribosómico de subunidad pequeña (ARNr SSU o ARNr 16s) fue el enfoque fundamental para el estudio de la diversidad microbiana en una comunidad, basado en parte en la presencia universal del gen y su tasa de evolución relativamente uniforme. Los avances en métodos de alto rendimiento han llevado al análisis metagenómico, en el que se secuencian genomas completos de microbios. Tales métodos no requieren un conocimientoa prioride la comunidad, lo que permite el descubrimiento de nuevas cepas de microorganismos. La metagenómica, la metatranscriptómica, la metaproteómica y la metabolómica permiten sondear una comunidad para discernir estructura y función.
La capacidad no sólo de catalogar los microorganismos de una comunidad, sino también de descifrar qué miembros son activos, el número de esos organismos y la coexistencia de miembros de una comunidad microbiana entre sí y con parámetros ambientales, por ejemplo la coexistencia de dos microbios en una comunidad en respuesta a ciertos cambios en el entorno de la comunidad, permitiría comprender la importancia que tiene el factor ambiental respectivo (por ejemplo, clima, nutrientes presentes, pH ambiental) en la identidad de los microbios dentro de una comunidad microbiana (y sus respectivos números), así como la importancia que ciertos miembros de la comunidad tienen en el medio ambiente en el que reside la comunidad. La presente descripción aborda estas y otras necesidades.
Como se usan en esta memoria descriptiva, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la expresión "un tipo de organismo" pretende significar un único tipo de organismo o múltiples tipos de organismo. Para otro ejemplo, la expresión "un parámetro ambiental" puede significar un único parámetro ambiental o múltiples parámetros ambientales, de manera que el artículo indefinido "un" o "una" no excluye la posibilidad de que esté presente más de uno de los parámetros ambientales, a menos que el contexto requiere claramente que exista un sólo parámetro ambiental.
La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "una realización", "una realización", "un aspecto", o "un aspecto", "una implementación" o "una implementación" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización se incluye en al menos una realización de la presente descripción. Por lo tanto, las apariciones de las frases "en una realización" o "en una realización" en diversos lugares a lo largo de esta memoria descriptiva no necesariamente se refieren todas a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares se pueden combinar de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.
Como se usa aquí, en realizaciones particulares, las expresiones "alrededor de" o "aproximadamente", cuando preceden a un valor numérico, indican el valor más o menos un intervalo del 10 %.
Como se usa aquí, "aislar", "aislado", "microbio aislado", y términos similares, pretenden significar que uno o más microorganismos se han separado de al menos uno de los materiales con los que está asociado en un entorno particular (por ejemplo, suelo, agua, tejido animal). Por tanto, un "microbio aislado" no existe en su entorno natural; más bien, es a través de las diversas técnicas descritas aquí que el microbio se ha sacado de su entorno natural y colocado en un estado de existencia no natural. Por tanto, la cepa aislada puede existir, por ejemplo, como un cultivo biológicamente puro o como esporas (u otras formas de la cepa) en asociación con un vehículo aceptable.
Como se usa aquí, "conjunto microbiano" se refiere a una composición que comprende uno o más microbios activos identificados mediante métodos, sistemas y/o aparatos de la presente descripción y que no existe naturalmente en un entorno natural y/o en proporciones o cantidades que no existen en la naturaleza. Por ejemplo, se podría formar un conjunto o agregado microbiano a partir de una o más cepas de microbios aisladas, junto con un medio o vehículo apropiado. Los conjuntos microbianos se pueden aplicar o administrar a una diana, tal como un entorno, población y/o animal diana.
Los conjuntos microbianos según la descripción se seleccionan de conjuntos, subconjuntos y/o agrupaciones de especies microbianas individuales interrelacionadas activas, o cepas de una especie. Las relaciones y redes, como se identifican mediante los métodos de la descripción, se agrupan y/o vinculan basándose en la realización de una o más funciones comunes, o pueden describirse como participantes, conducentes o asociadas con un parámetro reconocible, tal como un rasgo fenotípico de interés (por ejemplo, aumento de la producción de leche en un rumiante). Los grupos de los cuales se selecciona el conjunto microbiano, y/o el conjunto microbiano en sí, pueden incluir dos o más especies, cepas de especies, o cepas de diferentes especies, de microbios. En algunos casos, los microbios pueden coexistir simbióticamente dentro de los grupos y/o conjuntos microbianos.
En ciertos aspectos de la descripción, los conjuntos microbianos son o se basan en uno o más microbios aislados que existen como cultivos aislados y biológicamente puros. Un experto en la técnica apreciará que un cultivo aislado y biológicamente puro de un microbio particular denota que dicho cultivo está sustancialmente libre (dentro de razones científicas) de otros organismos vivos, y contiene sólo el microbio individual en cuestión. El cultivo puede contener concentraciones variables de dicho microbio. La presente descripción señala que los microbios aislados y biológicamente puros a menudo "difieren necesariamente de materiales menos puros o impuros". Véase, por ejemplo, In re Bergstrom, 427 F.2d 1394, (CCPA 1970) (que analiza las prostaglandinas purificadas), véase también In re Bergy, 596 F.2d 952 (CCPA 1979) (que analiza los microbios purificados), véase también Parke-Davis & Co. contra HK Mulford & Co., 189 F. 95 (S.D.N.Y 1911) (Learned Hand analiza la adrenalina purificada), ratif. en parte, revoc. en parte, 196 F. 496 (2d Cir. 1912). Además, en algunos aspectos, la implementación de la descripción puede requerir ciertas medidas cuantitativas de la concentración, o limitaciones de pureza, que deben lograrse para que se use un cultivo microbiano aislado y biológicamente puro en los conjuntos microbianos descritos. La presencia de estos valores de pureza, en ciertas realizaciones, es un atributo adicional que distingue los microbios identificados mediante el método actualmente descrito de aquellos microbios que existen en un estado natural. Véase, por ejemplo, Merck & Co. contra Olin Mathieson Chemical Corp., 253 F.2d 156 (4th Cir. 1958) (que analiza las limitaciones de pureza para la vitamina B12 producida por microbios).
Como se usa aquí, "vehículo", "vehículo aceptable" o "vehículo farmacéutico" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo que se usa con o en el conjunto microbiano. Tales vehículos pueden ser líquidos estériles, tales como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético; tales como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo, y similares. Preferiblemente se emplean como vehículos agua, disoluciones salinas, disoluciones acuosas de dextrosa y glicerol, en algunas realizaciones como disoluciones inyectables. Alternativamente, el vehículo puede ser un vehículo en forma de dosificación sólida, que incluye, pero no se limita a, uno o más de un aglutinante (para píldoras comprimidas), un deslizante, un agente encapsulante, un aromatizante, y un colorante. La elección del vehículo puede seleccionarse con respecto a la vía de administración prevista y la práctica farmacéutica estándar. Véanse Hardee y Baggo (1998). Development and Formulation of Veterinary Dosage Forms. 2a ed. CRC Press. 504 pág.); EW Martin (1970. Remington's Pharmaceutical Sciences. 17a ed. Mack Pub. Co.); y Blaser et al. (publicación de EE. UU. US20110280840A1).
Los términos "microorganismo" y "microbio" se usan indistintamente aquí, y se refieren a cualquier microorganismo que sea del dominio Bacteria, Eukarya o Archaea. Los tipos de microorganismos incluyen, sin limitación, bacterias (por ejemplo, micoplasmas, cocos, bacilos, rickettsias, espirilos), hongos (por ejemplo, hongos filamentosos, levaduras), nematodos, protozoos, arqueas, algas, dinoflagelados, virus (por ejemplo, bacteriófagos), viroides y/o una combinación de los mismos. Las cepas de organismos son subtaxones de tipos de organismos, y pueden ser, por ejemplo, una especie, subespecie, subtipo, variante genética, patovar o serovar de un microorganismo particular.
El término "marcador" o "marcador único", como se usa aquí, es un indicador de un tipo de microorganismo, cepa de microorganismo o actividad de una cepa de microorganismo únicos. Un marcador puede medirse en muestras biológicas, e incluye, sin limitación, un marcador basado en ácido nucleico, tal como un gen de ARN ribosomal, un marcador basado en péptido o proteína, y/o un metabolito u otro marcador de molécula pequeña.
El término "metabolito", como se usa aquí, es un intermedio o producto del metabolismo. Un metabolito, en una realización, es una molécula pequeña. Los metabolitos tienen diversas funciones, incluidas las de combustible, estructurales, de señalización, estimulantes e inhibidoras de las enzimas, como un cofactor de una enzima, en defensa, y en interacciones con otros organismos (tales como pigmentos, odorantes y feromonas). Un metabolito primario participa directamente en el crecimiento, desarrollo y reproducción normales. Un metabolito secundario no participa directamente en estos procesos, pero suele tener una función ecológica importante. Los ejemplos de metabolitos incluyen, pero no se limitan a, antibióticos y pigmentos tales como resinas y terpenos, etc. Algunos antibióticos usan metabolitos primarios como precursores, tal como la actinomicina, que se crea a partir del metabolito primario triptófano. Los metabolitos, como se usan aquí, incluyen hidratos de carbono pequeños e hidrófilos; lípidos grandes e hidrófobos y compuestos naturales complejos.
En un aspecto de la descripción, se describe un método para identificar relaciones entre una pluralidad de cepas de microorganismos y uno o más metadatos y/o parámetros. Como se ilustra en la FIG. 1A, se reciben muestras y/o datos de muestra para al menos dos muestras de al menos dos fuentes de muestra 101, y para cada muestra se determina 103 la presencia de uno o más tipos de microorganismos. Se determina 105 el número (recuento de células) de cada tipo de microorganismo detectado de uno o más tipos de microorganismos en cada muestra, y se determina 107 un número de primeros marcadores únicos en cada muestra, y la cantidad de los mismos, siendo cada primer marcador único un marcador. de una cepa de microorganismo. El número de cada tipo de microorganismo y el número de los primeros marcadores se integran para producir el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo presente en cada muestra 109, y se determina 111 un nivel de actividad para cada cepa de microorganismo en cada muestra basándose en una medida de al menos un segundo marcador único para cada cepa de microorganismo que excede un umbral especificado, identificándose una cepa de microorganismo como activa si la medida de al menos un segundo marcador único para esa cepa excede el umbral correspondiente. Después, el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo se filtra según la actividad determinada para proporcionar una lista de cepas de microorganismos activos y sus respectivos recuentos de células absolutos para cada una de las al menos dos muestras 113. Se realiza 115 un análisis de red de la lista de recuentos de células absolutos filtrados de cepas de microorganismos activos para cada una de las al menos dos muestras con al menos un metadato medido o una cepa de microorganismo activo adicional, incluyendo el análisis de red determinar puntuaciones de coeficientes de informaciones máximas entre cada cepa de microorganismo activo y cualquier otra cepa de microorganismo activo, y determinar puntuaciones de coeficientes de informaciones máximas entre cada cepa de microorganismo activo y al menos un metadato medido o cepa de microorganismo activo adicional. Las cepas de microorganismos activos pueden categorizarse entonces basándose en su función, función prevista y/o química 117, e identificarse y generarse una pluralidad de cepas de microorganismos activos basándose en la categorización 119. En algunas realizaciones, el método comprende además ensamblar un conjunto de microorganismos activos a partir de la pluralidad identificada de cepas de microorganismos 121, estando configurado el conjunto de microorganismos para, cuando se aplica a una diana, alterar una propiedad correspondiente a al menos un metadato medido. El método puede comprender además identificar al menos un patógeno basándose en la pluralidad resultante de cepas de microorganismos activos identificadas (véase el Ejemplo 4 para obtener detalles adicionales). En algunas realizaciones, la pluralidad de cepas de microorganismos activos se puede utilizar para ensamblar un conjunto de microorganismos activos que está configurado para, cuando se aplica a una diana, abordar el al menos un patógeno identificado y/o tratar un síntoma asociado con el al menos un patógeno identificado.
En un aspecto de la descripción, se proporciona un método para determinar el recuento de células absoluto de una o más cepas de microorganismos activos en una muestra o pluralidad de muestras, en el que una o más cepas de microorganismos activos están presentes en una comunidad microbiana en la muestra. La una o más cepas de microorganismos es un subtaxón de uno o más tipos de organismos (véase el método 1000 en la FIG. 1B). Para cada muestra, se detecta la presencia de uno o más tipos de microorganismos en la muestra (1001). Se determina el número absoluto de cada uno de uno o más tipos de organismos en la muestra (1002). El número de primeros marcadores únicos se mide junto con la cantidad de cada uno de los primeros marcadores únicos (1003). Como se describe aquí, un primer marcador único es un marcador de una cepa de microorganismo única. Después, la actividad a nivel de proteína y/o ARN se evalúa midiendo el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos (1004). El segundo marcador único puede ser igual o diferente que el primer marcador único, y es un marcador de actividad de una cepa de organismo. Basándose en el nivel de expresión de uno o más de los segundos marcadores únicos, se determina qué cepas de microorganismos (si las hay) son activas (1005). Una cepa de microorganismo se considera activa si expresa el segundo marcador único en un nivel particular, o por encima de un nivel umbral (1005), por ejemplo al menos alrededor de 10 %, al menos alrededor de 20 %, al menos alrededor de 30 % o al menos alrededor de 40 % por encima de un nivel umbral (debe entenderse que los diversos umbrales pueden determinarse en función de la aplicación y/o implementación particular, por ejemplo los umbrales pueden variar según la o las fuentes de muestra, tal como una especie particular, ubicación de origen de la muestra, metadatos de interés, entorno, etc. El recuento de células absoluto de la una o más cepas de microorganismos activos se puede determinar basándose en la cantidad del uno o más primeros marcadores de la una o más cepas de microorganismos activos, y en el número absoluto de tipos de organismos de los cuales la una o más cepas de microorganismos son un subtaxón.
Como se proporciona en la FIG. 2, en otro aspecto de la descripción, el recuento de células absoluto de uno o más microorganismos activos se determina en una pluralidad de muestras, y el recuento de células absoluto se relaciona con un metadato (parámetro ambiental) (2001 -2008). Una pluralidad de muestras se somete a análisis para el recuento de células absoluto de una o más cepas de microorganismos activos, en el que la una o más cepas de microorganismos activos se considera activa si una medida de actividad está en un nivel umbral o por encima de un nivel umbral en al menos un de la pluralidad de muestras (2001-2006). El recuento de células absoluto de una o más cepas de microorganismos activos se relaciona después con un parámetro de metadatos de la implementación y/o aplicación particular (2008).
En una realización, la pluralidad de muestras se recolecta a lo largo del tiempo de la misma fuente ambiental (por ejemplo, el mismo animal durante un período de tiempo). En otra realización, la pluralidad de muestras proviene de una pluralidad de fuentes ambientales (por ejemplo, diferentes animales). En una realización, el parámetro ambiental es el recuento de células absoluto de una segunda cepa de microorganismo activo. En una realización adicional, los valores del recuento de células absoluto de una o más cepas de microorganismos activos se usan para determinar la coexistencia de una o más cepas de microorganismos activos con una segunda cepa de microorganismos activos de la comunidad microbiana. En una realización adicional, un segundo parámetro ambiental está relacionado con el recuento de células absoluto de la una o más cepas de microorganismos activos y/o con el recuento de células absoluto de la segunda cepa ambiental.
Las realizaciones de estos aspectos se analizan en todo momento.
Es importante destacar que las muestras para uso con los métodos proporcionados aquí pueden ser de cualquier tipo que incluya una comunidad microbiana. Por ejemplo, las muestras para uso con los métodos proporcionados aquí abarcan, sin limitación, una muestra de animal (por ejemplo, mamífero, reptil, ave), suelo, aire, agua (por ejemplo, marina, agua dulce, lodos de aguas residuales), sedimento, aceite, planta, producto agrícola, planta, suelo (por ejemplo, rizosfera), y muestra ambiental extrema (por ejemplo, drenaje ácido de minas, sistemas hidrotermales). En el caso de muestras marinas o de agua dulce, la muestra puede ser de la superficie del cuerpo de agua, o de cualquier profundidad del cuerpo de agua, por ejemplo una muestra de aguas profundas. La muestra de agua, en una realización, es una muestra de océano, río o lago.
La muestra animal, en una realización, es un fluido corporal. En otra realización, la muestra animal es una muestra de tejido. Las muestras animales no limitativas incluyen dientes, transpiración, uña, piel, cabello, heces, orina, semen, moco, saliva, tracto gastrointestinal). La muestra animal puede ser, por ejemplo, una muestra humana, de primate, bovina, porcina, canina, felina, de roedor (por ejemplo, ratón o rata), o ave. En una realización, la muestra de ave comprende una muestra de uno o más pollos. En otra realización, la muestra es una muestra humana. El microbioma humano comprende el conjunto de microorganismos que se encuentran en las capas superficiales y profundas de la piel, en las glándulas mamarias, la saliva, la mucosa oral, la conjuntiva y el tracto gastrointestinal. Los microorganismos que se encuentran en el microbioma incluyen bacterias, hongos, protozoos, virus y arqueas. Las diferentes partes del cuerpo exhiben una diversidad variable de microorganismos. La cantidad y el tipo de microorganismos pueden indicar un estado de salud o enfermedad de un individuo. El número de taxones de bacterias es de miles, y los virus pueden ser igualmente abundantes. La composición bacteriana de un lugar determinado del cuerpo varía de persona a persona, no sólo en tipo, sino también en abundancia o cantidad.
En otra realización, la muestra es una muestra ruminal. Los rumiantes, tal como el ganado vacuno, dependen de diversas comunidades microbianas para digerir su alimento. Estos animales han evolucionado para usar alimentos con escaso valor nutritivo al tener un tracto digestivo superior modificado (retículo-rumen o rumen) en el que se retiene el alimento mientras es fermentado por una comunidad de microbios anaeróbicos. La comunidad microbiana del rumen es muy densa, con alrededor de 3 x 1010 células microbianas por mililitro. Los microbios fermentadores anaeróbicos dominan en el rumen. La comunidad microbiana del rumen incluye miembros de los tres dominios de la vida: Bacterias, Archaea, y Eukarya. Los productos de la fermentación ruminal son requeridos por sus respectivos hospedantes para el mantenimiento y crecimiento del cuerpo, así como para la producción de leche (van Houtert (1993). Anim. Feed Sci. Technol. 43, págs. 189-225; Bauman et al. (2011). Annu. Rev. Nutr. 31, págs. 299-319). Además, se ha informado que la producción y composición de la leche están asociadas con las comunidades microbianas ruminales (Sandri et al. (2014). Animal 8, págs. 572-579; Palmonari et al. (2010). J. Dairy Sci. 93, págs. 279-287). Las muestras ruminales, en una realización, se recolectan mediante el procedimiento descrito en Jewell et al. (2015). Appl. Environ. Microbiol. 81, págs. 4697-4710.
En otra realización, la muestra es una muestra de suelo (por ejemplo, muestra de suelo a granel o de rizosfera). Se ha estimado que 1 gramo de suelo contiene decenas de miles de taxones bacterianos, y hasta mil millones de células bacterianas, así como alrededor de 200 millones de hifas fúngicas (Wagg et al. (2010). Proc Natl. Acad. Sci. USA 111, pp. 5266-5270). En el suelo se encuentran bacterias, actinomicetos, hongos, algas, protozoos y virus. La diversidad de la comunidad de microorganismos del suelo ha estado implicada en la estructura y fertilidad del microambiente del suelo, la adquisición de nutrientes por las plantas, la diversidad y el crecimiento de las plantas, así como el ciclo de recursos entre las comunidades superficiales y subterráneas. En consecuencia, la evaluación del contenido microbiano de una muestra de suelo a lo largo del tiempo, y la coexistencia de microorganismos activos (así como el número de microorganismos activos), proporciona información sobre los microorganismos asociados con un parámetro de metadatos ambientales, tal como la adquisición de nutrientes y/o la diversidad de las plantas.
La muestra de suelo, en una realización, es una muestra de rizosfera, es decir, la región estrecha de suelo que está directamente influenciada por las secreciones de las raíces y los microorganismos del suelo asociados. La rizosfera es un área densamente poblada en la que se han observado elevadas actividades microbianas, y las raíces de las plantas interactúan con los microorganismos del suelo mediante el intercambio de nutrientes y factores de crecimiento (San Miguel et al. (2014). Appl. Microbiol. Biotechnol. DOI 10.1007/s00253-014-5545-6. Como las plantas segregan muchos compuestos en la rizosfera, el análisis de los tipos de organismos en la rizosfera puede ser útil para determinar las características de las plantas que crecen en ella.
En otra realización, la muestra es una muestra marina o de agua dulce. El agua del océano contiene hasta un millón de microorganismos por mililitro y varios miles de tipos microbianos. Estas cifras pueden ser un orden de magnitud mayor en las aguas costeras, con su mayor productividad y mayor carga de materia orgánica y nutrientes. Los microorganismos marinos son cruciales para el funcionamiento de los ecosistemas marinos; mantener el equilibrio entre el dióxido de carbono producido y fijado; producción de más del 50% del oxígeno de la Tierra a través de microorganismos fototróficos marinos comoCyanobacteria,diatomeas y pico y nanofitoplancton; proporcionar nuevos compuestos bioactivos y vías metabólicas; garantizar un suministro sostenible de productos pesqueros ocupando el nivel trófico inferior crítico en las redes alimentarias marinas. Los organismos que se encuentran en el medio marino incluyen virus, bacterias, arqueas y algunos eukarya. Los virus marinos pueden desempeñar un papel importante en el control de poblaciones de bacterias marinas mediante la lisis viral. Las bacterias marinas son importantes como fuente de alimento para otros pequeños microorganismos, además de ser productoras de materia orgánica. Las arqueas que se encuentran en toda la columna de agua del océano son arqueas pelágicas, y su abundancia rivaliza con la de las bacterias marinas.
En otra realización, la muestra comprende una muestra de un entorno extremo, es decir, un entorno que alberga condiciones que son perjudiciales para la mayor parte de la vida en la Tierra. Los organismos que prosperan en ambientes extremos se llaman extremófilos. Aunque el dominio Archaea contiene ejemplos bien conocidos de extremófilos, el dominio bacteria también puede tener representantes de estos microorganismos. Los extremófilos incluyen: acidófilos, que crecen a niveles de pH de 3 o menos; alcalófilos, que crecen a niveles de pH de 9 o superiores; anaerobios comoSpinoloricus Cinzia,que no requiere oxígeno para crecer; criptoendolitos, que viven en espacios microscópicos dentro de rocas, fisuras, acuíferos y fallas llenas de agua subterránea en las profundidades del subsuelo; halófilos, que crecen en una concentración de sal de alrededor de al menos 0,2 M; hipertermófilos, que prosperan a altas temperaturas (alrededor de 80-122°C), como las que se encuentran en los sistemas hidrotermales; hipolitos, que viven debajo de las rocas en los desiertos fríos; litoautótrofos, comoNitrosomonas europaea,que obtienen energía de compuestos minerales reducidos como las piritas y están activos en el ciclo geoquímico; organismos metalotolerantes que toleran altos niveles de metales pesados disueltos tales como cobre, cadmio, arsénico y zinc; oligótrofos, que crecen en ambientes nutricionalmente limitados; osmófilos, que crecen en ambientes con alta concentración de azúcar; piezófilos (o barófilos), que prosperan a altas presiones, como las que se encuentran en las profundidades del océano o bajo tierra; psicrófilos/criófilos, que sobreviven, crecen y/o se reproducen a temperaturas de alrededor de -15°C o inferiores; organismos radiorresistentes, que son resistentes a altos niveles de radiación ionizante; termófilos, que prosperan a temperaturas entre 45 y 122°C; xerófilos, que pueden crecer en condiciones extremadamente secas. Los poliextremófilos son organismos que califican como extremófilos en más de una categoría, e incluyen termoacidófilos (prefieren temperaturas de 70-802C y pH entre 2 y 3). El grupo Crenarchaeota de Archaea incluye a los termoacidófilos.
La muestra puede incluir microorganismos de uno o más dominios. Por ejemplo, en una realización, la muestra comprende una población heterogénea de bacterias y/u hongos (también denominados aquí cepas bacterianas o fúngicas).
En los métodos proporcionados aquí para determinar la presencia y el recuento de células absoluto de uno o más microorganismos en una muestra, por ejemplo el recuento de células absoluto de uno o más microorganismos en una pluralidad de muestras recogidas del mismo o de diferentes entornos, y/o de más de múltiples puntos de tiempo, uno o más microorganismos pueden ser de cualquier tipo. Por ejemplo, uno o más microorganismos pueden ser del dominio Bacteria, Archaea, Eukarya, o una combinación de los mismos. Las bacterias y las arqueas son procarióticas, y tienen una estructura celular muy simple sin orgánulos internos. Las bacterias se pueden clasificar en grampositivas/sin membrana externa, gramnegativas/membrana externa presente, y filos no agrupados. Las arqueas constituyen un dominio o reino de microorganismos unicelulares. Aunque visualmente similares a las bacterias, las arqueas poseen genes y varias vías metabólicas que están más estrechamente relacionadas con las de los eucariotas, en particular las enzimas implicadas en la transcripción y la traducción. Otros aspectos de la bioquímica de las arqueas son únicos, tal como la presencia de éter lípidos en sus membranas celulares. Las Archaea se dividen en cuatro filos reconocidos: Thaumarchaeota, Aigarchaeota, Crenarchaeota y Korarchaeota.
El dominio de Eukarya comprende organismos eucariotas, que están definidos por orgánulos unidos a membranas, tal como el núcleo. Los protozoos son organismos eucariotas unicelulares. Todos los organismos multicelulares son eucariotas, incluidos los animales, las plantas y los hongos. Los eucariotas se han clasificado en cuatro reinos: Protista, Plantae, Hongos y Animalia. Sin embargo, existen varias clasificaciones alternativas. Otra clasificación divide a Eukarya en seis reinos: Excavata (varios protozoos flagelados); amebozoos (ameboideos lobosos y hongos filamentosos limosos); Opisthokonta (animales, hongos, coanoflagelados); Rhizaria (Foraminíferos, Radiolaria y varios otros protozoos ameboides); Chromalve olata (Stramenopiles (algas pardas, diatomeas), Haptophyta, Cryptophyta (o criptomonas) y Alveolata); Archaeplastida/Primoplantae (Plantas terrestres, algas verdes, algas rojas, y glaucofitos).
Dentro del dominio de Eukarya, los hongos son microorganismos predominantes en las comunidades microbianas. Los hongos incluyen microorganismos como levaduras y hongos filamentosos, así como las conocidas setas. Las células de los hongos tienen paredes celulares que contienen glucanos y quitina, una característica única de estos organismos. Los hongos forman un solo grupo de organismos relacionados, llamado Eumycota, que comparten un ancestro común. Se ha estimado que el reino Fungi tiene entre 1,5 y 5 millones de especies, de las cuales alrededor del 5% han sido clasificadas formalmente. Las células de la mayoría de los hongos crecen como estructuras tubulares, alargadas y filamentosas llamadas hifas, que pueden contener múltiples núcleos. Algunas especies crecen como levaduras unicelulares que se reproducen por gemación o fisión binaria. Los principales filos (a veces llamados divisiones) de los hongos se han clasificado principalmente en función de las características de sus estructuras de reproducción sexual. Actualmente, se proponen siete filos: Microsporidia, Chytridiomycota, Blastocladiomycota, Neocallimastigomycota, Glomeromycota, Ascomycota, y Basidiomycota.
Los microorganismos para la detección y cuantificación mediante los métodos descritos aquí también pueden ser virus. Un virus es un pequeño agente infeccioso que se replica sólo dentro de las células vivas de otros organismos. Los virus pueden infectar todo tipo de formas de vida en los dominios de Eukarya, Bacteria y Archaea. Las partículas de virus (conocidas como viriones) consisten en dos o tres partes: (i) el material genético que puede ser ADN o ARN; (ii) una cubierta proteica que protege estos genes; y en algunos casos (iii) una envoltura de lípidos que rodea la cubierta proteica cuando están fuera de una célula. Se han establecido siete órdenes de virus: losCaudovirales, Herpesvirales, Ligamenvirales, Mononegavirales, Nidovirales, Picomavirales,yTymovirales.Los genomas virales pueden ser monocatenarios (ss) o bicatenarios (ds), ARN o ADN, y pueden utilizar o no transcriptasa inversa (RT). Además, los virus ssRNA pueden ser sentido (+) o antisentido (-). Esta clasificación sitúa a los virus en siete grupos: I: virus dsDNA (tales como adenovirus, herpesvirus, poxvirus); II: (+) virus ssDNA (tales como parvovirus); III: virus dsRNA (tales como reovirus); IV: (+) virus ssRNA (tales como picornavirus, togavirus); V: (-) virus ssRNA (tales como ortomixovirus, rabdovirus); VI: (+) virus ssRNA-RT con ADN intermedio en el ciclo de vida (tales como los retrovirus); VII: virus dsDNA-RT (tales como hepadnavirus).
Los microorganismos para la detección y cuantificación mediante los métodos descritos aquí también pueden ser viroides. Los viroides son los patógenos infecciosos más pequeños conocidos, y consisten únicamente en hebras cortas de ARN monocatenario circular sin cubiertas proteicas. Se trata principalmente de patógenos vegetales, algunos de los cuales tienen importancia económica. Los genomas de viroides son de tamaño extremadamente pequeño, oscilando entre alrededor de 246 y alrededor de 467 nucleobases.
Según los métodos proporcionados aquí, una muestra se procesa para detectar la presencia de uno o más tipos de microorganismos en la muestra (FIG. 1B, 1001; FIG. 2, 2001). Se determina el número absoluto de uno o más tipos de organismos microorganismos en la muestra (FIG. 1B, 1002; FIG. 2, 2002). La determinación de la presencia de uno o más tipos de organismos y el número absoluto de al menos un tipo de organismo se puede realizar en paralelo o en serie. Por ejemplo, en el caso de una muestra que comprende una comunidad microbiana que comprende bacterias (es decir, un tipo de microorganismo) y hongos (es decir, un segundo tipo de microorganismo), el usuario en una realización detecta la presencia de uno o ambos tipos de organismos en la muestra (FIG. 1B, 1001; FIG. 2, 2001). El usuario, en una realización adicional, determina el número absoluto de al menos un tipo de organismo en la muestra; en el caso de este ejemplo, el número de bacterias, hongos o una combinación de los mismos en la muestra (FIG. 1B, 1002; FIG. 2, 2002).
En una realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a análisis de citometría de flujo (FC) para detectar la presencia y/o el número de uno o más tipos de microorganismos (FIG. 1B, 1001, 1002; FIG. 2, 2001,2002). En una realización de citómetro de flujo, las células microbianas individuales pasan a través de una zona de iluminación, a una velocidad de al menos alrededor de 300 *s-1, o al menos alrededor de 500 *s-1, o al menos alrededor de 1000 *s-1. Sin embargo, un experto en la técnica reconocerá que esta velocidad puede variar dependiendo del tipo de instrumento que se emplee. Los detectores controlados electrónicamente miden la magnitud de un pulso que representa la extensión de la luz dispersada. Las magnitudes de estos pulsos se clasifican electrónicamente en "contenedores" o "canales", lo que permite la visualización de histogramas del número de células que poseen una determinada propiedad cuantitativa (por ejemplo, propiedad de tinción celular, diámetro, membrana celular) frente al número de canal. Dicho análisis permite la determinación del número de células en cada "contenedor" que en las realizaciones descritas aquí es un contenedor de "tipo microorganismo", por ejemplo, una bacteria, un hongo, un nematodo, un protozoo, una arquea, un alga, un dinoflagelado, un virus, un viroide, etc.
En una realización, una muestra se tiñe con uno o más tintes fluorescentes, en el que un tinte fluorescente es específico de un tipo de microorganismo particular, para permitir la detección mediante un citómetro de flujo o algún otro método de detección y cuantificación que aproveche la fluorescencia, tal como la microscopía de fluorescencia. El método puede proporcionar la cuantificación del número de células y/o del volumen celular de un tipo de organismo determinado en una muestra. En una realización adicional, como se describe aquí, la citometría de flujo se aprovecha para determinar la presencia y cantidad de un primer marcador único y/o un segundo marcador único del tipo de organismo, tal como expresión de enzimas, expresión de proteínas de la superficie celular, etc. También se pueden generar histogramas de tres variables o diagramas de contorno de, por ejemplo, dispersión de la luz frente a fluorescencia de una tinción de membrana celular (frente a fluorescencia de una tinción de proteínas o tinción de ADN), y así se puede obtener una impresión de la distribución de una variedad de propiedades de interés entre las células de la población en su conjunto. Una serie de visualizaciones de tales datos de citometría de flujo multiparamétrico son de uso común, y se pueden usar con los métodos descritos aquí.
En una realización del procesamiento de la muestra para detectar la presencia y el número de uno o más tipos de microorganismos, se emplea un ensayo de microscopía (FIG. 1B, 1001, 1002). En una realización, la microscopía es microscopía óptica, en la que se utilizan luz visible y un sistema de lentes para ampliar imágenes de muestras pequeñas. Las imágenes digitales se pueden capturar mediante una cámara con dispositivo de carga acoplada (CCD). Otras técnicas microscópicas incluyen, pero no se limitan a, microscopía electrónica de barrido y microscopía electrónica de transmisión. Los tipos de microorganismos se visualizan y cuantifican según los aspectos aquí previstos.
En otra realización de la descripción, para detectar la presencia y el número de uno o más tipos de microorganismos, cada muestra, o una porción de la misma, se somete a microscopía de fluorescencia. Se pueden usar diferentes tintes fluorescentes para teñir directamente las células en muestras y cuantificar el recuento de células total usando un microscopio de epifluorescencia y citometría de flujo, descrito anteriormente. Los colorantes útiles para cuantificar microorganismos incluyen, pero no se limitan a, naranja de acridina (AO), 4,6-di-amino-2 fenilindol (DAPI) y cloruro de 5-ciano-2,3 ditolil tetrazolio (CTC). Las células viables se pueden estimar mediante un método de tinción de viabilidad como el kit de viabilidad bacteriana LIVE/DEAD° (Bac-Light™), que contiene dos tinciones de ácido nucleico: el tinte verde fluorescente SYTO 9™ penetra todas las membranas, y el tinte de yoduro de propidio (PI) fluorescente rojo penetra en las células con membranas dañadas. Por lo tanto, las células con membranas comprometidas se teñirán de rojo, mientras que las células con membranas intactas se teñirán de verde. La hibridación fluorescentein situ(FISH) amplía la microscopía de epifluorescencia, lo que permite la detección y enumeración rápidas de organismos específicos. FISH uaa sondas de oligonucleótidos marcadas con fluorescencia (generalmente de 15 a 25 pares de bases) que se unen específicamente al ADN del organismo en la muestra, lo que permite la visualización de las células mediante un microscopio de epifluorescencia o de barrido láser confocal (CLSM). La hibridaciónin situcon fluorescencia de deposición informadora catalizada (CARD-FISH) mejora el método FISH mediante el uso de sondas oligonucleotídicas marcadas con peroxidasa de rábano picante (HRP) para amplificar la intensidad de la señal obtenida de los microorganismos que se estudian. FISH se puede combinar con otras técnicas para caracterizar comunidades de microorganismos. Una técnica combinada es el ácido nucleico peptídico de alta afinidad (PNA)-FISH, en la que la sonda tiene una capacidad mejorada para penetrar a través de la matriz de sustancia polimérica extracelular (EPS). Otro ejemplo es LIVE/DEAD-FISH, que combina el kit de viabilidad celular con FISH y se ha usado para evaluar la eficiencia de la desinfección en sistemas de distribución de agua potable.
En otra realización, cada muestra, o una porción de la misma, se somete a microespectroscopia Raman para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número absoluto de al menos un tipo de microorganismo (FIG. 1B, 1001-1002; FIG. 2, 2001-2002). La microespectroscopia Raman es una tecnología no destructiva y sin marcadores capaz de detectar y medir un espectro Raman de una sola célula (SCRS). Un SCRS típico proporciona una "huella" bioquímica intrínseca de una sola célula. Un SCRS contiene rica información de las biomoléculas que contiene, incluidos ácidos nucleicos, proteínas, hidratos de carbono y lípidos, lo que permite la caracterización de diferentes especies celulares, cambios fisiológicos y fenotipos celulares. La microscopía Raman examina la dispersión de la luz láser por los enlaces químicos de diferentes biomarcadores celulares. Un SCRS es una suma de los espectros de todas las biomoléculas en una sola célula, lo que indica el perfil fenotípico de una célula. Los fenotipos celulares, como consecuencia de la expresión genética, suelen reflejar genotipos. Por lo tanto, en condiciones de crecimiento idénticas, diferentes tipos de microorganismos dan SCRS distintos correspondientes a diferencias en sus genotipos, y por lo tanto pueden identificarse mediante sus espectros Raman.
En aún otra realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a centrifugación para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número de al menos un tipo de microorganismo (FIG. 1B, 1001-1002; FIG. 2, 2001 2002). Este procedimiento sedimenta una mezcla heterogénea mediante el uso de la fuerza centrífuga creada por una centrífuga. Los componentes más densos de la mezcla se alejan del eje de la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. La centrifugación puede permitir el fraccionamiento de muestras en porciones citoplasmáticas, de membrana y extracelulares. También se puede usar para determinar información de localización de moléculas biológicas de interés. Además, la centrifugación se puede usar para fraccionar el ADN de la comunidad microbiana total. Los diferentes grupos procarióticos difieren en su contenido de guanina más citosina (G+C) de ADN, por lo que la centrifugación en gradiente de densidad basada en el contenido de G+C es un método para diferenciar los tipos de organismos y la cantidad de células asociadas con cada tipo. La técnica genera un perfil fraccionado de todo el ADN de la comunidad e indica la abundancia de ADN en función del contenido de G+C. El ADN comunitario total se separa físicamente en fracciones altamente purificadas, cada una de las cuales representa un contenido diferente de G+C que puede analizarse mediante técnicas moleculares adicionales, tal como la electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE)/análisis de restricción del ADN ribosómico amplificado (ARDRA) (véase la discusión aquí) para evaluar la diversidad total de la comunidad microbiana y la presencia/cantidad de uno o más tipos de microorganismos.
En otra realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a tinción para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número de al menos un tipo de microorganismo (FIG. 1B, 1001-1002; FIG. 2, 2001-2002). Se pueden usar colorantes y tintes para visualizar tejidos biológicos, células u orgánulos dentro de las células. La tinción se puede usar junto con microscopía, citometría de flujo o electroforesis en gel para visualizar o marcar células o moléculas biológicas que son exclusivas de diferentes tipos de microorganismos. La tinciónin vivoes el procedimiento de teñir tejidos vivos, mientras que la tinciónin vitroimplica teñir células o estructuras que han sido eliminadas de su contexto biológico. Ejemplos de técnicas de tinción específicas para uso con los métodos descritos aquí incluyen, pero no se limitan a: tinción de Gram para determinar el estado Gram de las bacterias, tinción de endosporas para identificar la presencia de endosporas, tinción de Ziehl-Neelsen, tinción con hematoxilina y eosina para examinar finas secciones de tejido, tinción de Papanicolaou para examinar muestras de células de diversas secreciones corporales, tinción de hidratos de carbono con ácido periódico de Schiff, tricrómico de Masson, que emplea un protocolo de tinción de tres colores para distinguir las células del tejido conjuntivo circundante, tinciones de Romanowsky (o variantes comunes que incluyen la tinción de Wright, tinción de Jenner, tinción de May-Grunwald, tinción de Leishman y tinción de Giemsa) para examinar muestras de sangre o médula ósea, tinción de plata para revelar proteínas y<a>D<n>, tinción de Sudán para lípidos y tinción de Conklin para detectar endosporas verdaderas. Las tinciones biológicas comunes incluyen naranja de acridina para la determinación del ciclo celular; marrón bismarck para mucinas ácidas; carmín para glucógeno; alumbre carmín para núcleos; azul de Coomassie para proteínas; violeta de cresilo para los componentes ácidos del citoplasma neuronal; violeta cristal para paredes celulares; DAPI para núcleos; eosina para material citoplasmático, membranas celulares, algunas estructuras extracelulares y glóbulos rojos; bromuro de etidio para ADN; fucsina ácida para colágeno, músculo liso o mitocondrias; hematoxilina para núcleos; tinciones de Hoechst para ADN; yodo para almidón; verde malaquita para bacterias en la técnica de tinción de Gimenez y para esporas; verde de metilo para la cromatina; azul de metileno para células animales; rojo neutro para sustancia Nissl; azul del Nilo para núcleos; rojo del Nilo para entidades lipofílicas; tetróxido de osmio para lípidos; la rodamina se usa en microscopía de fluorescencia; safranina para los núcleos. Las tinciones también se utilizan en microscopía electrónica de transmisión para mejorar el contraste, e incluyen ácido fosfotúngstico, tetróxido de osmio, tetróxido de rutenio, molibdato de amonio, yoduro de cadmio, carbohidrazida, cloruro férrico, hexamina, tricloruro de indio, nitrato de lantano, acetato de plomo, citrato de plomo, nitrato de plomo (II), ácido periódico, ácido fosfomolíbdico, ferricianuro de potasio, ferrocianuro de potasio, rojo de rutenio, nitrato de plata, proteinato de plata, cloroaurato de sodio, nitrato de talio, tiosemicarbazida, acetato de uranilo, nitrato de uranilo y sulfato de vanadilo.
En otra realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a espectrometría de masas (MS) para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número de al menos un tipo de microorganismo (FIG. 1B, 1001-1002; FIG. 2, 2001-2002). La MS, como se analiza a continuación, también se puede usar para detectar la presencia y expresión de uno o más marcadores únicos en una muestra (FIG. 1B, 1003-1004; FIG. 2, 2003-2004). La MS se usa, por ejemplo, para detectar la presencia y cantidad de marcadores proteicos y/o peptídicos exclusivos de los tipos de microorganismos, y por lo tanto para proporcionar una evaluación del número del tipo de microorganismo respectivo en la muestra. La cuantificación puede realizarse con marcaje con isótopos estables o sin marcadores. La secuenciación de novo de péptidos también puede ocurrir directamente a partir de espectros MS/MS o etiquetado de secuencia (produce una etiqueta corta que puede compararse con una base de datos). La MS también puede revelar modificaciones postraduccionales de proteínas e identificar metabolitos. La MS se puede usar junto con técnicas cromatográficas y otras técnicas de separación (tales como cromatografía de gases, cromatografía líquida, electroforesis capilar, movilidad iónica) para mejorar la resolución y determinación de masas.
En otra realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a análisis de lípidos para determinar la presencia de un tipo de microorganismo y el número de al menos un tipo de microorganismo (FIG. 1B, 1001-1002; FIG. 2, 2001 2002). Los ácidos grasos están presentes en una proporción relativamente constante de la biomasa celular, y existen ácidos grasos característicos en las células microbianas que pueden diferenciar los tipos de microorganismos dentro de una comunidad. En una realización, los ácidos grasos se extraen mediante saponificación, seguida de derivatización, para dar los respectivos ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME), que luego se analizan mediante cromatografía de gases. Después, el perfil FAME, en una realización, se compara con una base de datos FAME de referencia para identificar los ácidos grasos y sus firmas microbianas correspondientes mediante análisis estadísticos multivariados.
En los aspectos de los métodos proporcionados aquí, se mide el número de primeros marcadores únicos en la muestra, o porción de la misma (por ejemplo, alícuota de muestra), así como la cantidad de cada uno de los primeros marcadores únicos (FIG. 1B, 1003; Figura 2, 2003). Un marcador único es un marcador de una cepa de microorganismo. Un experto en la técnica debería entender que, dependiendo del marcador único que se esté probando y midiendo, no es necesario analizar toda la muestra. Por ejemplo, si el marcador único es exclusivo de las cepas bacterianas, entonces no es necesario analizar la porción fúngica de la muestra. Como se describió anteriormente, en algunas realizaciones, medir el recuento de células absoluto de uno o más tipos de organismos en una muestra comprende separar la muestra por tipo de organismo, por ejemplo mediante citometría de flujo.
Aquí se puede emplear cualquier marcador que sea exclusivo de una cepa de organismo. Por ejemplo, los marcadores pueden incluir, pero no se limitan a, genes de ARN ribosómico de subunidades pequeñas (ADNr 16S/18S), genes de ARN ribosómico de subunidades grandes (ADNr 23S/25S/28S), gen 5.8S intercalario, citocromo c oxidasa, betatubulina, factor de elongación, ARN polimerasa, y espaciador transcrito interno (ITS).
Los genes de ARN ribosómico (ADNr), especialmente los genes de ARN ribosómico de subunidad pequeña, es decir, genes de ARNr 18S (ADNr 18S) en el caso de eucariotas y ARNr 16S (ADNr 16S) en el caso de procariotas, han sido la diana predominante de la evaluación de tipos y cepas de organismos en una comunidad microbiana. Sin embargo, también se han seleccionado como dianas los genes del ARN ribosómico de subunidades grandes, los ADNr 28S. Los ADNr son adecuados para la identificación taxonómica debido a que: (i) son omnipresentes en todos los organismos conocidos; (ii) poseen regiones tanto conservadas como variables; (iii) existe una base de datos en expansión exponencial de sus secuencias disponible para comparación. En el análisis comunitario de muestras, las regiones conservadas sirven como sitios de hibridación para la PCR universal correspondiente y/o cebadores de secuenciación, mientras que las regiones variables pueden usarse para la diferenciación filogenética. Además, el alto número de copias del ADNr en las células facilita la detección en muestras ambientales.
También se ha apuntado al espaciador interno transcrito (ITS), ubicado entre el ADNr 18S y el ADNr 28S. El ITS se transcribe, pero se corta antes del ensamblaje de los ribosomas. La región ITS está compuesta por dos espaciadores muy variables, ITS1 e ITS2, y el gen intercalar 5.8S. Este operón de ADNr se produce en múltiples copias en los genomas. Debido a que la región ITS no codifica componentes ribosomales, es muy variable.
En una realización, el marcador de ARN único puede ser un marcador de ARNm, un marcador de ARNip o un marcador de ARN ribosómico.
Los genes funcionales que codifican proteínas también se pueden usar aquí como primer marcador único. Dichos marcadores incluyen, pero no se limitan a: la familia de genes de la recombinasa A (RecA bacteriana, arqueas RadA y RadB, Rad51 y Rad57 eucarióticos, fago UvsX); gen de la subunidad p de la ARN polimerasa (RpoB), que es responsable del inicio y el alargamiento de la transcripción; chaperoninas. También se han identificado genes marcadores candidatos para bacterias y arqueas: proteína ribosomal S2 (rpsB), proteína ribosomal S10 (rpsJ), proteína ribosomal L1 (rplA), factor de elongación de la traducción EF-2, factor de iniciación de la traducción IF-2, metaloendopeptidasa, proteína ribosomal L22, proteína de partículas de reconocimiento de señales ffh, proteína ribosomal L4/L1e (rplD), proteína ribosomal L2 (rplB), proteína ribosomal S9 (rpsI), proteína ribosomal L3 (rplC), subunidad beta de fenilalanil-ARNt sintetasa, proteína ribosomal L14b /L23e (rplN), proteína ribosomal S5, proteína ribosomal S19 (rpsS), proteína ribosomal S7, proteína ribosomal L16/L10E (rplP), proteína ribosomal S13 (rpsM), subunidad a de fenilalanil-tRNA sintetasa, proteína ribosomal L15, proteína ribosomal L25/L23, proteína ribosomal L6 (rplF), proteína ribosomal L11 (rplK), proteína ribosomal L5 (rplE), proteína ribosomal S12/S23, proteína ribosomal L29, proteína ribosomal S3 (rpsC), proteína ribosomal S11 (rpsK), proteína ribosomal L10, proteína ribosomal S8, ARNt pseudouridina sintasa B, proteína ribosomal L18P/L5E, proteína ribosomal S15P/S13e, porfobilinógeno desaminasa, proteína ribosomal S17, proteína ribosomal L13 (rplM), fosforribosilformilglicinamidina cicloligasa (rpsE), ribonucleasa HII y proteína ribosomal L24. Otros genes marcadores candidatos para bacterias incluyen: proteína de elongación de la transcripción NusA (nusA), subunidad beta de la ARN polimerasa dirigida por ADN rpoB (rpoB), proteína de unión a GTP EngA, subunidad beta' de la ARN polimerasa dirigida por ADN rpoC, proteína de ensamblaje de primosoma priA, factor de acoplamiento de transcripción-reparación, CTP sintasa (pyrG), subunidad secY de translocasa de preproteína SecY, proteína de unión a GTP Obg/CgtA, ADN polimerasa I, proteína ribosomal rpsF 30S S6, subunidad alfa de ARN polimerasa dirigida por ADN poA, factor de liberación de cadena peptídica 1, rplI proteína ribosomal 50S L9, polirribonucleótido nucleotidiltransferasa, factor de elongación tsf Ts (tsf), rplQ proteína ribosomal 50S L17, ARNt (guanina-N(1)-)-metiltransferasa (rplS), rplY probable proteína ribosomal 50S L25, proteína reparadora de ADN RadA, proteína A de división inhibida por glucosa, factor A de unión a ribosomas, proteína de reparación de errores de coincidencia de ADN MutL, proteína de unión a smpB SsrA (smpB), N-acetilglucosaminil transferasa, S-adenosil-metiltransferasa MraW, UDP-N-acetilmuramoilalanina--D-glutamato ligasa, proteína ribosomal rplS 50S L19, proteína ribosomal rplT 50S L20 (rplT), ADN helicasa de unión Holliday ruvA, ADN helicasa B de unión Holliday ruvB, serS seril-ARNt sintetasa, proteína ribosomal rplU 50S L21, proteína ribosomal rpsR 30S S18, ADN proteína de reparación de desajustes MutS, proteína ribosomal rpsT 30S S20, proteína de reparación de ADN RecN, factor de reciclaje de ribosomas frr (frr), proteína de recombinación RecR, proteína de función desconocida UPF0054, isopenteniltransferasa de ARNt miaA, proteína de unión a GTP YchF, proteína iniciadora de replicación cromosómica DnaA, defosfo-CoA cinasa, proteína procesadora de ARNr 16S RimM, proteína de dominio de cono de ATP, 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa, 2C-metil-D-eritritol 2,4-ciclodifosfato sintasa, proteína de síntesis de ácidos grasos/fosfolípidos PlsX, tRNA(Ile)-lisidina sintetasa, dnaG ADN primasa (dnaG), resolvasa de unión ruvC Holliday, proteína ribosomal rpsP 30S S16, recombinasa A recA, proteína de biosíntesis de riboflavina RibF, subunidad beta de glicil-tRNA sintetasa, trmU tRNA (5-metilaminometil-2-tiouridilato)-metiltransferasa, proteína ribosomal L35 rpmI 50S, uroporfirinógeno descarboxilasa hemE, proteína determinante de la forma de la varilla, proteína ribosomal L27 rpmA 50S (rpmA), peptidil-ARNt hidrolasa, factor de iniciación de traducción IF-3 (infC), UDP-N-acetilmuramil-tripéptido sintetasa, proteína ribosomal L32 rpmF 50S, proteína ribosomal rpIL 50S L7/L12 (rpIL), leuS leucil-ARNt sintetasa, ADN ligasa dependiente de ligA NAD, proteína de división celular FtsA, proteína de unión a GTP TypA, dependiente de ATP Proteasa Clp, subunidad de unión a ATP ClpX, proteína de replicación y reparación de ADN RecF, y UDP-N-acetilenolpiruvoilglucosamina reductasa.
Los ácidos grasos fosfolípidos (PLFA) también se pueden usar como primeros marcadores únicos según los métodos descritos aquí. Debido a que los PLFA se sintetizan rápidamente durante el crecimiento microbiano, no se encuentran en las moléculas de almacenamiento y se degradan rápidamente durante la muerte celular, proporciona un censo preciso de la comunidad viva actual. Todas las células contienen ácidos grasos (FA) que pueden extraerse y esterificarse para formar ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME). Cuando los FAME se analizan mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas, el perfil resultante constituye una "huella digital" de los microorganismos de la muestra. Las composiciones químicas de las membranas de los organismos de los dominios Bacteria y Eukarya se componen de ácidos grasos unidos al glicerol mediante un enlace tipo éster (ácidos grasos fosfolípidos (PLFA)). Por el contrario, los lípidos de membrana de Archaea están compuestos por hidrocarburos largos y ramificados que están unidos al glicerol mediante un enlace de tipo éter (lípidos éter fosfolípidos (PLEL)). Este es uno de los criterios no genéticos más usados para distinguir los tres dominios. En este contexto, los fosfolípidos derivados de las membranas celulares microbianas, caracterizados por diferentes cadenas de acilo, son excelentes moléculas distintivas, porque dicha diversidad estructural de lípidos puede vincularse a taxones microbianos específicos.
Como se proporciona aquí, para determinar si una cepa de organismo está activa, se mide el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos, que pueden ser iguales o diferentes que el primer marcador (FIG. 1B, 1004; FIG. 2, 2004). Los primeros marcadores únicos se describen arriba. El segundo marcador único es un marcador de actividad de microorganismos. Por ejemplo, en una realización, la expresión de ARNm o proteína de cualquiera de los primeros marcadores descritos anteriormente se considera un segundo marcador único para los fines de esta descripción.
En una realización, si el nivel de expresión del segundo marcador está por encima de un nivel umbral (por ejemplo, un nivel de control) o en un nivel umbral, se considera que el microorganismo está activo (FIG. 1B, 1005; FIG. 2, 2005). La actividad se determina en una realización, si el nivel de expresión del segundo marcador se altera en al menos aproximadamente un 5 %, al menos alrededor de 10 %, al menos alrededor de 15 %, al menos alrededor de 20 %, al menos alrededor de 25 %, o al menos aproximadamente el 30 %, en comparación con un nivel umbral, que en algunas realizaciones es un nivel de control.
Los segundos marcadores únicos se miden, en una realización, a nivel de proteína, ARN o metabolito. Un segundo marcador único es igual o diferente que el primer marcador único.
Como se proporcionó anteriormente, se pueden detectar varios primeros marcadores únicos y segundos marcadores únicos según los métodos descritos aquí. Además, la detección y cuantificación de un primer marcador único se lleva a cabo según métodos conocidos por los expertos en la técnica (FIG. 1B, 1003-1004, FIG. 2, 2003-2004).
La secuenciación de ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNg, ADNc, ARNr, ARNm) en una realización se usa para determinar el recuento de células absoluto de un primer marcador único y/o un segundo marcador único. Las plataformas de secuenciación incluyen, pero no se limitan a, secuenciación Sanger y métodos de secuenciación de alto rendimiento disponibles en Roche/454 Life Sciences, Illumina/Solexa, Pacific Biosciences, Ion Torrent y Nanopore. La secuenciación puede ser secuenciación de amplicones de secuencias particulares de ADN o ARN o secuenciación de metagenoma/transcriptoma completo.
La secuenciación tradicional de Sanger (Sanger et al. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl. Acad. Ciencia. USA, 74, págs. 5463-5467) se basa en la incorporación selectiva de didesoxinucleótidos de terminación de cadena mediante la ADN polimerasa durante la replicación del ADN in vitro, y se puede utilizar con los métodos descritos aquí.
En otra realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a extracción de ácidos nucleicos, amplificación de ADN de interés (tal como el gen de ARNr) con cebadores adecuados y construcción de bibliotecas de clones usando vectores de secuenciación. Después, los clones seleccionados se secuencian mediante secuenciación Sanger y se recupera la secuencia de nucleótidos del ADN de interés, lo que permite calcular el número de cepas de microorganismos únicas en una muestra.
La pirosecuenciación 454 de Roche/454 Life Sciences produce lecturas largas, y se puede aprovechar en los métodos descritos aquí (Margulies et al. (2005) Nature, 437, págs. 376-380; patentes de EE. UU. Nos. 6.274.320; 6.258.568; 6.210.891). El ácido nucleico que se va a secuenciar (por ejemplo, amplicones o ADN genómico/metagenómico nebulizado) tiene adaptadores específicos fijados en cada extremo mediante PCR o mediante ligación. El ADN con adaptadores se fija a pequeñas perlas (idealmente, una perla tendrá un fragmento de ADN) que se suspenden en una emulsión de agua en aceite. Después se lleva a c abo una etapa de PCR en emulsión para hacer múltiples copias de cada fragmento de ADN, lo que da como resultado un conjunto de perlas en el que cada perla contiene muchas copias clonadas del mismo fragmento de ADN. Después, cada perla se coloca en un pocillo de un chip de fibra óptica, que también contiene enzimas necesarias para las reacciones de secuenciación por síntesis. La adición de bases (tales como A, C, G o T) desencadena la liberación de pirofosfato, que produce destellos de luz que se registran para inferir la secuencia de los fragmentos de ADN en cada pocillo. Se pueden lograr alrededor de 1 millón de lecturas por ejecución, con lecturas de hasta 1000 bases de longitud. Se puede realizar una secuenciación de extremos emparejados, que produce pares de lecturas, cada una de las cuales comienza en un extremo de un fragmento de ADN determinado. Se puede crear un código de barras molecular y colocarlo entre la secuencia adaptadora y la secuencia de interés en reacciones múltiples, lo que permite asignar bioinformáticamente cada secuencia a una muestra.
La secuenciación de Illumina/Solexa produce longitudes de lectura promedio de alrededor de 25 pares de bases (pb) a alrededor de 300 pb (Bennett et al. (2005) Pharmacogenomics, 6:373-382; Lange et al. (2014). BMC Genomics 15, p. 63; Fadrosh et al. (2014) Microbiome 2, p. 6; Caporaso et al. (2012) ISME J, 6, p. 1621-1624; Bentley et al. (2008) Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry. Nature, 456:53-59). Esta tecnología de secuenciación también es secuenciación por síntesis, pero emplea terminadores de colorantes reversibles y una celda de flujo con un campo de oligos adjunto. Los fragmentos de ADN que se van a secuenciar tienen adaptadores específicos en cada extremo, y se lavan sobre una celda de flujo llena de oligonucleótidos específicos que se hibridan con los extremos de los fragmentos. Después, cada fragmento se replica para formar un grupo de fragmentos idénticos. Los nucleótidos terminadores de colorante reversibles se lavan entonces sobre la celda de flujo y se les da tiempo para que se adhieran. Se elimina el exceso de nucleótidos, se obtienen imágenes de la celda de flujo, y se pueden eliminar los terminadores reversibles para que el proceso pueda repetirse y se puedan continuar añadiendo nucleótidos en ciclos posteriores. Se pueden lograr lecturas de extremos emparejados de 300 bases de longitud cada una. Una plataforma Illumina puede producir 4 mil millones de fragmentos en pares con 125 bases para cada lectura en una sola ejecución. También se pueden usar códigos de barras para la multiplexación de muestras, pero se usan cebadores de indexación.
El proceso SOLiD (Secuenciación por ligación y detección de oligonucleótidos, Life Technologies) es un enfoque de "secuenciación por ligación", y se puede usar con los métodos descritos aquí para detectar la presencia y cantidad de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG. 1B, 1003-1004; FIG. 2, 2003-2004) (Peckham et al. SOLiD™ Sequencing and 2-Base Encoding. San Diego, CA: American Society of Human Genetics, 2007; Mitra et al. (2013) Analysis of the intestinal microbiota using SOLiD 16S rRNA gene sequencing and SOLiD shotgun sequencing. BMC Genomics, 14 (suplemento 5): S16; Mardis (2008) Next-generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet, 9:387-402). Se prepara una biblioteca de fragmentos de ADN a partir de la muestra que se va a secuenciar, y se usa para preparar poblaciones de perlas clonales, en las que solo estará presente una especie de fragmento en la superficie de cada perla magnética. Los fragmentos unidos a las perlas magnéticas tendrán una secuencia adaptadora P1 universal, de modo que la secuencia inicial de cada fragmento sea conocida e idéntica. Los cebadores se hibridan con la secuencia del adaptador P1 dentro de la plantilla de la biblioteca. Un conjunto de cuatro sondas dibase marcadas con fluorescencia compiten por la ligación al cebador de secuenciación. La especificidad de la sonda dibase se logra interrogando cada 1a y 2a base en cada reacción de ligación. Se realizan múltiples ciclos de ligadura, detección y escisión, y el número de ciclos determina la longitud de lectura final. La plataforma SOLiD puede producir hasta 3 mil millones de lecturas por ejecución con lecturas de 75 bases de longitud. La secuenciación de extremos emparejados está disponible y se puede usar aquí, pero la segunda lectura en el par tiene sólo 35 bases de longitud. La multiplexación de muestras es posible a través de un sistema similar al usado por Illumina, con una ejecución de indexación separada.
El sistema Ion Torrent, al igual que la secuenciación 454, se puede usar con los métodos descritos aquí para detectar la presencia y cantidad de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG. 1B, 1003-1004; FIG. 2, 2003-2004) Usa una placa de micropocillos que contienen perlas a las que se unen fragmentos de ADN. Sin embargo, se diferencia de todos los demás sistemas en la forma en que se detecta la incorporación de bases. Cuando se añade una base a una cadena de ADN en crecimiento, se libera un protón que altera ligeramente el pH circundante. Microdetectores sensibles al pH están asociados a los pocillos de la placa y registran cuándo se producen estos cambios. Las diferentes bases (A, C, G, T) se lavan secuencialmente a través de los pocillos, lo que permite inferir la secuencia de cada pocillo. La plataforma Ion Proton puede producir hasta 50 millones de lecturas por ejecución con longitudes de lectura de 200 bases. La plataforma Personal Genome Machine tiene lecturas más largas en 400 bases. La secuenciación bidireccional está disponible. La multiplexación es posible mediante la secuenciación estándar de códigos de barras moleculares en línea.
La secuenciación SMRT de Pacific Biosciences (PacBio) usa un enfoque de secuenciación en tiempo real de una sola molécula, y, en una realización, se usa con los métodos descritos aquí para detectar la presencia y cantidad de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG. 1B, 1003-1004; FIG. 2, 2003-2004). El sistema de secuenciación PacBio no implica ninguna etapa de amplificación, lo que lo diferencia de otros sistemas importantes de secuenciación de próxima generación. En una realización, la secuenciación se realiza en un chip que contiene muchos detectores de guía de ondas en modo cero (ZMW). Las ADN polimerasas están unidas a los detectores ZMW, y la incorporación de nucleótidos marcados con colorantes fosfoenlazados se visualiza en tiempo real a medida que se sintetizan las cadenas de ADN. El sistema PacBio produce longitudes de lectura muy largas (con un promedio de alrededor de 4.600 bases) y una cantidad muy alta de lecturas por ejecución (alrededor de 47.000). El enfoque típico de "extremo emparejado" no se usa con PacBio, ya que las lecturas suelen ser lo suficientemente largas como para que los fragmentos, a través de CCS, puedan cubrirse varias veces sin tener que secuenciar desde cada extremo de forma independiente. La multiplexación con PacBio no implica una lectura independiente, sino que sigue el modelo de código de barras estándar "en línea".
En una realización, en la que el primer marcador único es la región genómica ITS, el análisis de espaciador intergénico ribosómico automatizado (ARISA) se usa en una realización para determinar el número y la identidad de las cepas de microorganismos en una muestra (FIG. 1B, 1003, FIG. 2, 2003) (Ranjard et al. (2003). Environmental Microbiology 5, págs. 1111-1120). La región ITS tiene una heterogeneidad significativa tanto en longitud como en secuencia de nucleótidos. El uso de un cebador directo marcado con fluorescencia y un secuenciador de ADN automático permite una alta resolución de separación y un alto rendimiento. La inclusión de un patrón interno en cada muestra proporciona precisión en el dimensionamiento general de los fragmentos.
En otra realización, el polimorfismo de la longitud de los fragmentos (RFLP) de fragmentos de ADNr amplificados por PCR, también conocido como análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), se usa para caracterizar primeros marcadores únicos y la cantidad de los mismos en muestras (FIG. 1B, 1003, FIG. 2, 2003) (para detalles adicionales, véase Massol-Deya et al. (1995). Mol. Microb. Ecol. Manual. 3.3.2, págs. 1 -18). Los fragmentos de ADNr se generan mediante PCR usando cebadores generales, se digieren con enzimas de restricción, se someten a electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, y se tiñen con bromuro de etidio o nitrato de plata.
Una técnica de toma de huellas usada para detectar la presencia y abundancia de un primer marcador único es el polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP) (véase Lee et al. (1996). Appl Environ Microbiol 62, págs. 3112 3120; Scheinert et al. (1996). J. Microbiol. Methods 26, págs. 103-117; Schwieger y Tebbe (1998). Appl. Environ. Microbiol. 64, págs. 4870-4876). En esta técnica, los fragmentos de ADN, tales como los productos de PCR obtenidos con cebadores específicos para el gen 16S rRNA, se desnaturalizan y se someten a electroforesis directa en un gel no desnaturalizante. La separación se basa en diferencias de tamaño y en la conformación plegada del ADN monocatenario, lo que influye en la movilidad electroforética. La reasociación de las cadenas de ADN durante la electroforesis se puede prevenir mediante una serie de estrategias, incluido el uso de un cebador fosforilado en la PCR, seguido de una digestión específica de las cadenas fosforiladas con exonucleasa lambda y el uso de un cebador biotinilado para realizar la separación magnética de una sola hebra después de la desnaturalización. Para evaluar la identidad de las poblaciones predominantes en una comunidad microbiana determinada, en una realización, las bandas se escinden y secuencian, o los patrones de SSCP se pueden hibridar con sondas específicas. Las condiciones electroforéticas, tales como la matriz del gel, la temperatura y la adición de glicerol al gel, pueden influir en la separación.
Además de los métodos basados en secuenciación, otros métodos para cuantificar la expresión (por ejemplo, expresión génica, proteica) de un segundo marcador se pueden usar con los métodos proporcionados aquí para determinar el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores (FIG. 1B, 1004; FIG. 2, 2004). Por ejemplo, RT-PCR cuantitativa, análisis de micromatrices, técnicas de amplificación lineal tales como amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA), son todas susceptibles de uso con los métodos descritos aquí, y se pueden llevar a cabo según métodos conocidos por los expertos en la técnica.
En otra realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) cuantitativa para detectar la presencia y cantidad de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG. 1B, 1003-1004; FIG. 2, 2003-2004). La actividad de cepas de microorganismos específicos se mide mediante la transcripción inversa del ARN ribosomal y/o mensajero (ARNr y ARNm) transcrito en ADN complementario (ADNc), seguido de PCR (RT-PCR).
En otra realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a técnicas de toma de huellas basadas en PCR para detectar la presencia y cantidad de un primer marcador y/o un segundo marcador (FIG. 1B, 1003-1004; FIG. 2, 2003-2004). Los productos de la PCR se pueden separar mediante electroforesis según la composición de nucleótidos. La variación de secuencia entre las diferentes moléculas de ADN influye en el comportamiento de fusión, y por lo tanto, las moléculas con diferentes secuencias dejarán de migrar a diferentes posiciones en el gel. Por lo tanto, los perfiles electroforéticos pueden definirse por la posición y la intensidad relativa de diferentes bandas o picos, y pueden traducirse a datos numéricos para el cálculo de índices de diversidad. También se pueden cortar bandas del gel y posteriormente secuenciarlas para revelar la afiliación filogenética de los miembros de la comunidad. Los métodos de electroforesis pueden incluir, pero no se limitan a: electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), electroforesis en gel con gradiente de temperatura (TGGE), polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP), análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) o análisis de restricción de ADN ribosómico amplificado (ARDRA), análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción terminal (T-RFLP), análisis automatizado de espaciadores intergénicos ribosómicos (ARISA), ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD), huellas de amplificación de ADN (DAF) y electroforesis de Bb-PEG.
En otra realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a una plataforma basada en chip, tal como micromatriz o microfluidos, para determinar la cantidad de un primer marcador único y/o la presencia/cantidad de un segundo marcador único (FiG. 1B, 1003-1004, FIG. 2, 2003-2004). Los productos de la PCR se amplifican a partir del ADN total de la muestra, y se hibridan directamente con sondas moleculares conocidas fijadas a micromatrices. Después de que los amplicones de PCR marcados fluorescentemente se hibridan con las sondas, las señales positivas se puntúan mediante el uso de microscopía de barrido láser confocal . La técnica de micromatrices permite evaluar rápidamente las muestras con replicación, lo cual es una ventaja significativa en los análisis de comunidades microbianas. La intensidad de la señal de hibridación en micromatrices puede ser directamente proporcional a la cantidad del organismo diana. La micromatriz 16S universal de alta densidad (por ejemplo, PHYLOCHIP) contiene alrededor de 30.000 sondas del gen 16SrRNA dirigidas a varias especies microbianas cultivadas y "divisiones candidatas". Estas sondas se dirigen a los 121 órdenes procarióticos demarcados, y permiten la detección simultánea de 8.741 taxones bacterianos y arqueales. Otra micromatriz que se usa para perfilar comunidades microbianas es el Functional Gene Array (FGA). A diferencia de los PHYLOCHP, las FGA están diseñadas principalmente para detectar grupos metabólicos específicos de bacterias. Por lo tanto, las FGA no sólo revelan la estructura de la comunidad, sino que también arrojan luz sobre el potencial metabólico de la comunidadin situ.Las FGA contienen sondas de genes con funciones biológicas conocidas, por lo que son útiles para vincular la composición de la comunidad microbiana con las funciones del ecosistema. Una FGA denominada GEOCHIP contiene >24.000 sondas de todos los genes metabólicos conocidos implicados en diversos procesos biogeoquímicos, ecológicos y ambientales, tales como la oxidación de amoníaco, la oxidación de metano, y la fijación de nitrógeno.
En una realización, se usa un ensayo de expresión de proteínas con los métodos descritos aquí para determinar el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores (FIG. 1B, 1004;
FIG. 2, 2004). Por ejemplo, en una realización, se usa espectrometría de masas o un inmunoensayo, tal como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), para cuantificar el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos, en el que el uno o más segundos marcadores únicos es una proteína.
En una realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a la incorporación de bromodesoxiuridina (BrdU) para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG. 1B, 1004; FIG. 2, 2004). BrdU, un nucleósido sintético análogo de la timidina, se puede incorporar al ADN recién sintetizado de células en replicación. Después, se pueden usar anticuerpos específicos para BRdU para la detección del análogo de base. Por tanto, la incorporación de BrdU identifica células que están replicando activamente su ADN, una medida de la actividad de un microorganismo según una realización de los métodos descritos aquí. La incorporación de BrdU se puede usar en combinación con FISH para proporcionar la identidad y actividad de las células diana.
En una realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a microautorradiografía (MAR) combinada con FISH para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG. 1B, 1004; FIG. 2, 2004). MAR-FlSH se basa en la incorporación de sustrato radiactivo a las células, la detección de las células activas mediante autorradiografía, y la identificación de las células mediante FISH. La detección e identificación de células activas con resolución unicelular se realiza con un microscopio. MAR-FISH proporciona información sobre el total de células, las células diana de la sonda, y el porcentaje de células que incorporan una determinada sustancia radiomarcada. El método proporciona una evaluación de la funciónin situde los microorganismos específicos, y es un enfoque eficaz para estudiar la fisiologíain vivode los microorganismos. Una técnica desarrollada para cuantificar la absorción de sustrato específico de cada célula en combinación con MAR-FISH se conoce como MAR cuantitativo (QMAR).
En una realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a espectroscopia Raman de isótopos estables combinada con FISH (Raman-FISH) para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG. 1B, 1004; FIG. 2, 2004). Esta técnica combina sondeo de isótopos estables, espectroscopia Raman y FISH para vincular procesos metabólicos con organismos particulares. La proporción de incorporación de isótopos estables por parte de las células afecta la dispersión de la luz, lo que da como resultado cambios de pico medibles para los componentes celulares marcados, incluidos los componentes de proteínas y ARNm. La espectroscopia Raman se puede usar para identificar si una célula sintetiza compuestos que incluyen, pero no se limitan a: aceite (tales como alcanos), lípidos (tales como triacilgliceroles (TAG)), proteínas específicas (tales como proteínas hemo, metaloproteínas), citocromo (tales como P450, citocromo c), clorofila, cromóforos (tales como pigmentos para la captación de luz, carotenoides y rodopsinas), polímeros orgánicos (tales como polihidroxialcanoatos (PHA), polihidroxibutirato (PHB)), hopanoides, esteroides, almidón, sulfuro, sulfato y metabolitos secundarios. (tal como la vitamina B 12).
En una realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a sondeo de isótopos estables (SIP) de ADN/ARN para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG. 1B, 1004; FIG. 2, 2004). SIP permite la determinación de la diversidad microbiana asociada con rutas metabólicas específicas, y se ha aplicado generalmente para estudiar microorganismos involucrados en la utilización de compuestos de carbono y nitrógeno. El sustrato de interés se marca con isótopos estables (tales como 13C o 15N), y se añade a la muestra. Sólo los microorganismos capaces de metabolizar el sustrato lo incorporarán a sus células. Posteriormente, el ADN 13C y el ADN 15N se pueden aislar mediante centrifugación en gradiente de densidad y usarse para análisis metagenómico. El SIP basado en ARN puede ser un biomarcador sensible para uso en estudios de SIP, ya que el ARN en sí es un reflejo de la actividad celular.
En una realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a una matriz de isótopos para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG. 1B, 1004; FIG. 2, 2004). Los conjuntos de isótopos permiten la detección funcional y filogenética de comunidades microbianas activas de manera de alto rendimiento. La técnica uaa una combinación de SIP para monitorizar los perfiles de absorción de sustrato, y tecnología de micromatrices para determinar las identidades taxonómicas de comunidades microbianas activas. Las muestras se incuban con un sustrato marcado con 14C, que durante el curso del crecimiento se incorpora a la biomasa microbiana. El ARNr marcado con 14C se separa del ARNr no marcado, y entonces se marca con fluorocromos. El ARNr marcado con fluorescencia se hibrida con una micromatriz filogenética, seguido de un barrido en busca de señales radiactivas y fluorescentes. Por tanto, la técnica permite el estudio simultáneo de la composición de la comunidad microbiana y el consumo de sustrato específico por parte de microorganismos metabólicamente activos de comunidades microbianas complejas.
En una realización, la muestra, o una porción de la misma, se somete a un ensayo metabolómico para determinar el nivel de un segundo marcador único (FIG. 1B, 1004; FIG. 2, 2004). La metabolómica estudia el metaboloma que representa la colección de todos los metabolitos, los productos finales de los procesos celulares, en una célula, tejido, órgano u organismo biológico. Esta metodología se puede usar para monitorizar la presencia de microorganismos y/o procesos mediados por microbios, ya que permite asociar perfiles de metabolitos específicos con diferentes microorganismos. Los perfiles de metabolitos intracelulares y extracelulares asociados con la actividad microbiana se pueden obtener usando técnicas tal como la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). La mezcla compleja de una muestra metabolómica se puede separar mediante técnicas como cromatografía de gases, cromatografía de líquidos de alta resolución, y electroforesis capilar. La detección de metabolitos puede realizarse mediante espectrometría de masas, espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), espectrometría de movilidad iónica, detección electroquímica (acoplada a HPLC) y radiomarcado (cuando se combina con cromatografía de capa fina).
Según las realizaciones descritas aquí, se determina la presencia y el número respectivo de una o más cepas de microorganismos activos en una muestra (FIG. 1B, 1006; FIG. 2, 2006). Por ejemplo, la información de identidad de cepa obtenida al analizar el número y la presencia de primeros marcadores se analiza para determinar cuántas apariciones de un primer marcador único están presentes, representando así una cepa de microorganismo única (por ejemplo, contando el número de lecturas de secuencia en una matriz de secuenciación). Este valor se puede representar en una realización como un porcentaje del total de lecturas de secuencia del primer creador para dar un porcentaje de cepas de microorganismos únicas de un tipo de microorganismo particular. En una realización adicional, este porcentaje se multiplica por el número de tipos de microorganismos (obtenidos en la etapa 1002 o 2002, véanse la FIG. 1B y la FIG. 2) para dar el recuento de células absoluto de una o más cepas de microorganismos en una muestra y una volumen dado.
La una o más cepas de microorganismos se consideran activas, como se describió anteriormente, si el nivel de expresión del segundo marcador único está en un nivel umbral, superior a un valor umbral, por ejemplo superior a al menos alrededor de 5%, al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20 % o al menos alrededor de 30 % sobre un nivel de control.
En otro aspecto de la descripción, se determina un método para determinar el recuento de células absoluto de una o más cepas de microorganismos en una pluralidad de muestras (FIG. 2, véase en particular, 2007). Para que una cepa de microorganismo sea clasificada como activa, basta con que esté activa en una de las muestras. Las muestras pueden tomarse en múltiples momentos de la misma fuente, o pueden ser de diferentes fuentes ambientales (por ejemplo, diferentes animales).
Los valores del recuento de células absoluto sobre las muestras se usan en una realización para relacionar una o más cepas de microorganismos activos con un parámetro ambiental (FIG. 2, 2008). En una realización, el parámetro ambiental es la presencia de una segunda cepa de microorganismo activo. La relación de una o más cepas de microorganismos activos con el parámetro ambiental, en una realización, se lleva a cabo determinando la coexistencia de la cepa y el parámetro mediante análisis de red.
En una realización, determinar la co-ocurrencia de una o más cepas de microorganismos activos con un parámetro ambiental comprende un método de análisis de red y/o de agrupaciones para medir la conectividad de cepas o una cepa con un parámetro ambiental dentro de una red, en el que la red es una colección de dos o más muestras que comparten un parámetro ambiental común o similar. En otra realización, el análisis de red comprende enfoques no paramétricos que incluyen información mutua para establecer una conectividad entre variables. En otra realización, el análisis de red comprende análisis de vinculación, análisis de modularidad, medidas de robustez, medidas de intermediación, medidas de conectividad, medidas de transitividad, medidas de centralidad, o una combinación de las mismas. En otra realización, el método de análisis de agrupaciones comprende construir un modelo de conectividad, un modelo subespacial, un modelo de distribución, un modelo de densidad, o un modelo de centroide, y/o usar algoritmos de detección de comunidades tales como los algoritmos de Louvain, Bron-Kerbosch, Girvan-Newman, Clauset-Newman-Moore, Pons-Latapy y Wakita-Tsurumi.
En una realización, el método de análisis de agrupaciones es un método heurístico basado en la optimización de la modularidad. En una realización adicional, el método de análisis de agrupaciones es el método de Louvain (véase, por ejemplo, el método descrito por Blondel et al. (2008) Fast unfolding of community in big network. Journal of Statistical Mechanics: Theory and Experiment, Volumen 2008, Octobre 2008).
En otra realización, el análisis de red comprende modelado predictivo de red a través de exploración y predicción de enlaces, clasificación colectiva, agrupamiento basado en enlaces, similitud relacional, o una combinación de los mismos. En otra realización, el análisis de red comprende modelado de poblaciones basado en ecuaciones diferenciales. En otra realización, el análisis de red comprende el modelado de Lotka-Volterra.
En una realización, relacionar la una o más cepas de microorganismos activos con un parámetro ambiental (por ejemplo, determinar la co-ocurrencia) en la muestra comprende crear matrices pobladas con enlaces que indican asociaciones de parámetros ambientales y cepas de microorganismos.
En una realización, se compilan los datos de múltiples muestras obtenidos en la etapa 2007 (por ejemplo, sobre dos o más muestras que pueden recolectarse en dos o más puntos de tiempo, en el que cada punto de tiempo corresponde a una muestra individual). En una realización adicional, el número de células de cada una de la una o más cepas de microorganismos en cada muestra se almacena en una matriz de asociación (que puede ser, en algunas realizaciones, una matriz cuantitativa). En una realización, la matriz de asociación se usa para identificar asociaciones entre cepas de microorganismos activos en una muestra de un momento específico usando enfoques de exploración de reglas ponderados con datos de asociación (por ejemplo, cantidad). En una realización se aplican filtros para eliminar reglas insignificantes.
En una realización, el recuento de células absoluto de una o más, o dos o más cepas de microorganismos activos está relacionado con uno o más parámetros ambientales (FIG. 2, 2008), por ejemplo mediante determinación de co ocurrencia. Los parámetros ambientales los escoge el usuario dependiendo de las muestras que se van a analizar, y no están restringidos por los métodos descritos aquí. El parámetro ambiental puede ser un parámetro de la propia muestra, por ejemplo pH, temperatura, cantidad de proteína en la muestra. Alternativamente, el parámetro ambiental es un parámetro que afecta un cambio en la identidad de una comunidad microbiana (es decir, en el que la "identidad" de una comunidad microbiana se caracteriza por el tipo de cepas de microorganismos y/o el número de cepas de microorganismos particulares en una comunidad), o se ve afectado por un cambio en la identidad de una comunidad microbiana. Por ejemplo, un parámetro ambiental en una realización es la ingesta de alimento de un animal o la cantidad de leche (o el contenido de proteína o grasa de la leche) producida por un rumiante lactante. En una realización, el parámetro ambiental es la presencia, actividad y/o cantidad de una segunda cepa de microorganismo en la comunidad microbiana, presente en la misma muestra.
En algunas realizaciones descritas aquí, un parámetro ambiental se denomina parámetro de metadatos, y viceversa.
Otros ejemplos de parámetros de metadatos incluyen, pero no se limitan a, información genética del hospedante del que se obtuvo la muestra (por ejemplo, información de mutación del ADN), pH de la muestra, temperatura de la muestra, expresión de una proteína o ARNm particular, condiciones de nutrientes (por ejemplo, nivel y/o identidad de uno o más nutrientes) del entorno/ecosistema circundante), susceptibilidad o resistencia a enfermedades, aparición o progresión de enfermedades, susceptibilidad o resistencia de la muestra a toxinas, eficacia de compuestos xenobióticos (fármacos), biosíntesis de productos naturales, o una combinación de los mismos.
Por ejemplo, según una realización, los cambios en el número de cepas de microorganismos se calculan en múltiples muestras según el método de la FIG. 2 (es decir, en 2001-2007). Se compilan los cambios en el número de cepas de una o más cepas activas a lo largo del tiempo (por ejemplo, una o más cepas que inicialmente se identificaron como activas según la etapa 2006), y se anota la direccionalidad del cambio (es decir, los valores negativos indican disminuciones, los valores positivos indican aumentos). El número de células a lo largo del tiempo se representa como una red, en la que las cepas de microorganismos representan nodos, y las reglas ponderadas por cantidad representan bordes. Se aprovechan las cadenas de Markov y los paseos aleatorios para determinar la conectividad entre nodos y definir clústeres. Los grupos en una realización se filtran usando metadatos para identificar grupos asociados con metadatos deseables (FiG. 2, 2008).
En una realización adicional, las cepas de microorganismos se clasifican según su importancia integrando los cambios en el número de células a lo largo del tiempo y las cepas presentes en los grupos diana, clasificándose los cambios más altos en el número de células los más altos.
El método de análisis de red y/o de agrupaciones, en una realización, se usa para medir la conectividad de una o más cepas dentro de una red, en el que la red es una colección de dos o más muestras que comparten un parámetro ambiental común o similar. En una realización, el análisis de red comprende análisis de vinculación, análisis de modularidad, medidas de robustez, medidas de intermediación, medidas de conectividad, medidas de transitividad, medidas de centralidad, o una combinación de las mismas. En otra realización, el análisis de red comprende modelado predictivo de red a través de exploración y predicción de enlaces, teoría de redes sociales, clasificación colectiva, agrupamiento basado en enlaces, similitud relacional, o una combinación de los mismos. En otra realización, el análisis de red comprende información mutua, cálculos de coeficientes de informaciones máximas, u otros métodos no paramétricos entre variables para establecer una conectividad. En otra realización, el análisis de redes comprende modelado de poblaciones basado en ecuaciones diferenciales. En otra realización más, el análisis de red comprende el modelado de Lotka-Volterra.
El método de análisis de agrupaciones comprende la construcción de un modelo de conectividad, un modelo subespacial, un modelo de distribución, un modelo de densidad, o un modelo de centroide.
El análisis basado en redes y clústeres, por ejemplo para llevar a cabo la etapa 2008 del método de la FIG. 2, se puede llevar a cabo a través de un procesador, componente y/o módulo. Como se usa aquí, un componente y/o módulo puede ser, por ejemplo, cualquier conjunto, instrucciones y/o conjunto de componentes eléctricos acoplados operativamente, y puede incluir, por ejemplo, una memoria, un procesador, trazas eléctricas, conectores ópticos, software (que se ejecuta en hardware) y/o similares.
La FIG. 3A es un diagrama esquemático que ilustra una plataforma y un sistema 300 de análisis, detección y selección de microbios, según una realización. Una plataforma según la descripción puede incluir sistemas y procedimientos para determinar interacciones y dependencias multidimensionales entre especies dentro de comunidades microbianas naturales, y se describe un ejemplo con respecto a la FIG. 3A. La FIG. 3A es un diagrama arquitectónico, y por lo tanto se omiten ciertos aspectos para mejorar la claridad de la descripción, aunque estos aspectos deberían ser evidentes para un experto cuando se los ve en el contexto de la descripción.
Como se muestra en la FIG. 3A, la plataforma y el sistema 300 de detección y selección de microbios pueden incluir uno o más procesadores 310, una base de datos 319, una memoria 320, una interfaz de comunicaciones 390, una interfaz de entrada/salida configurada para interactuar con los dispositivos de entrada del usuario 396 y los dispositivos periféricos 397 (incluidos, pero sin limitarse a, dispositivos de recopilación y análisis de datos, tales como los FAC, dispositivos de selección/incubación/formulación y/o bases de datos/fuentes de datos adicionales, dispositivos de recopilación remota de datos (por ejemplo, dispositivos que pueden recopilar metadatos de datos ambientales, tales como muestras características, temperatura, clima, etc., incluidos teléfonos inteligentes móviles que ejecutan aplicaciones para recopilar dicha información, así como otros dispositivos móviles o estacionarios), una interfaz de red configurada para recibir y transmitir datos a través de la red de comunicaciones 392 (por ejemplo, LAN, WAN y /o Internet) a los clientes 393b y usuarios 393a; un componente de recopilación de datos 330, un componente de recuento absoluto 335, un componente de relación de muestra 340, un componente de actividad 345, un componente de análisis de red 350, y un componente de selección de cepas/generación de conjuntos microbianos. 355. En algunas realizaciones, el sistema de detección de microbios 300 puede ser un único dispositivo físico. En otras realizaciones, el sistema de detección de microbios 300 puede incluir múltiples dispositivos físicos (por ejemplo, acoplados operativamente por una red), cada uno de los cuales puede incluir uno o múltiples componentes y/o módulos mostrados en la FIG. 3A.
Cada componente o módulo en el sistema de detección de microbios 300 puede acoplarse operativamente a cada componente y/o módulo restante. Cada componente y/o módulo en el sistema de detección de microbios 300 puede ser cualquier combinación de hardware y/o software (almacenado y/o ejecutado en hardware) capaz de realizar una o más funciones específicas asociadas con ese componente y/o módulo.
La memoria 320 puede ser, por ejemplo, una memoria de acceso aleatorio (RAM) (por ejemplo, una RAM dinámica, una RAM estática), una memoria flash, una memoria extraíble, un disco duro, una base de datos y/o así sucesivamente. En algunas realizaciones, la memoria 320 puede incluir, por ejemplo, una base de datos (por ejemplo, como en 319), proceso, aplicación, máquina virtual y/o algunos otros componentes de software, programas y/o módulos (almacenados y/o ejecutándose en hardware), o componentes/módulos de hardware configurados para ejecutar un proceso de detección de microbios y/o uno o más métodos asociados para la detección de microbios y generación de conjuntos (por ejemplo, a través del componente de recopilación de datos 330, el componente de recuento absoluto 335, el componente de relación de muestra 340, el componente de actividad 345, el componente de análisis de red 350, el componente de selección de cepas/generación de conjuntos microbianos 355 (y/o módulos similares)). En tales realizaciones, las instrucciones para ejecutar el proceso de selección de microbios y/o generación de conjuntos y/o los métodos asociados pueden almacenarse dentro de la memoria 320 y ejecutarse en el procesador 310. En algunas realizaciones, los datos recopilados a través del componente de recopilación de datos 330 se pueden almacenar en una base de datos 319 y/o en la memoria 320.
El procesador 310 puede configurarse para controlar, por ejemplo, las operaciones de la interfaz de comunicaciones 390, escribir datos y leer datos de la memoria 320, y ejecutar las instrucciones almacenadas dentro de la memoria 320. El procesador 310 también puede configurarse para ejecutar y/o controlar, por ejemplo, las operaciones del componente de recopilación de datos 330, el componente de recuento absoluto 335, el componente de relación de muestra 340, el componente de actividad, y el componente de análisis de red 350, como se describió con más detalle aquí. En algunas realizaciones, bajo el control del procesador(es) 310 y basándose en los métodos o procesos almacenados dentro de la memoria 320, el componente de recopilación de datos 330, el componente de recuento absoluto 335, el componente de relación de muestra 340, el componente de actividad 345, el componente de análisis de red 350, y el componente 355 de selección/generación de conjuntos de cepas se pueden configurar para ejecutar un proceso de detección, selección y generación de conjuntos sintéticos de microbios, como se describe con mayor detalle aquí.
La interfaz de comunicaciones 390 puede incluir y/o configurarse para gestionar uno o múltiples puertos del sistema de detección de microbios 300 (por ejemplo, a través de la o las interfaces de entrada y salida 395). En algunos casos, por ejemplo, la interfaz de comunicaciones 390 (por ejemplo, una tarjeta de interfaz de red (NIC)) puede incluir una o más tarjetas de línea, cada una de las cuales puede incluir uno o más puertos acoplados (operativamente) a dispositivos (por ejemplo, dispositivos periféricos 397 y/o dispositivos de entrada de usuario 396). Un puerto incluido en la interfaz de comunicaciones 390 puede ser cualquier entidad que pueda comunicarse activamente con un dispositivo acoplado o a través de una red 392 (por ejemplo, comunicarse con dispositivos de usuario final 393b, dispositivos host, servidores, etc.). En algunas realizaciones, dicho puerto no tiene por qué ser necesariamente un puerto de hardware, sino que puede ser un puerto virtual o un puerto definido por software. La red de comunicación 392 puede ser cualquier red o combinación de redes capaces de transmitir información (por ejemplo, datos y/o señales), y puede incluir, por ejemplo, una red telefónica, una red Ethernet, una red de fibra óptica, una red inalámbrica, y/o una red celular. La comunicación puede realizarse a través de una red tal como, por ejemplo, una conexión Wi-Fi o de red de área local inalámbrica ("WLAN"), una conexión de red de área amplia inalámbrica ("WWAN") y/o una conexión celular. Una conexión de red puede ser una conexión por cable, tal como, por ejemplo, una conexión Ethernet, una conexión de línea de suscripción digital ("DSL"), una conexión coaxial de banda ancha, y/o una conexión de fibra óptica. Por ejemplo, el sistema de detección de microbios 300 puede ser un dispositivo anfitrión configurado para que uno o más dispositivos informáticos 393b accedan a través de una red 392. De tal manera, los dispositivos informáticos pueden proporcionar información y/o recibir información del sistema de detección de microbios 300 a través de la red 392. Dicha información puede ser, por ejemplo, información para que el sistema de detección de microbios 300 recopile, relacione, determine, analice y/o genere conjuntos de microbios activos analizados en red, como se describe con mayor detalle aquí. De manera similar, los dispositivos informáticos se pueden configurar para recuperar y/o solicitar información determinada del sistema de detección de microbios 300.
En algunas realizaciones, la interfaz de comunicaciones 390 puede incluir y/o configurarse para incluir interfaces de entrada/salida 395. Las interfaces de entrada/salida pueden aceptar, comunicar y/o conectarse a dispositivos de entrada de usuario, dispositivos periféricos, dispositivos procesadores criptográficos y/o similares. En algunos casos, un dispositivo de salida puede ser una pantalla de vídeo, que puede incluir, por ejemplo, un tubo de rayos catódicos (CRT) o una pantalla de cristal líquido (LCD), un LED o un monitor basado en plasma con una interfaz (por ejemplo, circuitos y cables de interfaz visual digital (DVI)) que acepta señales de una interfaz de vídeo. En tales realizaciones, la interfaz de comunicaciones 390 se puede configurar para, entre otras funciones, recibir datos y/o información, y enviar modificaciones, comandos y/o instrucciones de detección de microbios.
El componente de recopilación de datos 330 puede ser cualquier componente y/o módulo de hardware y/o software (almacenado en una memoria tal como la memoria 320 y/o ejecutándose en hardware tal como el procesador 310) configurado para recopilar, procesar y/o normalizar datos para análisis sobre interacciones y dependencias multidimensionales entre especies dentro de comunidades microbianas naturales realizados por el componente de recuento absoluto 335, el componente de relación de muestra 340, el componente de actividad 345, el componente de análisis de red 350, y/o el componente de selección de cepa/generación de conjunto 355. En algunas realizaciones, el componente de recopilación de datos 330 se puede configurar para determinar el recuento de células absoluto de una o más cepas de organismos activos en un volumen determinado de una muestra. Basándose en el recuento de células absoluto de una cepa de microorganismo activo, el componente de recopilación de datos 330 puede identificar cepas activas dentro de conjuntos de datos de recuento de células absoluto usando secuencias marcadoras. El componente de recopilación de datos 330 puede recopilar datos continuamente durante un período de tiempo para representar la dinámica de las poblaciones microbianas dentro de una muestra. El componente de recopilación de datos 330 puede compilar datos temporales y almacenar el número de células de cada cepa de organismo activo en una matriz cuantitativa en una memoria tal como la memoria 320.
El componente de relación de muestra 340 y el componente de análisis de red 350 se pueden configurar para determinar colectivamente interacciones y dependencias multidimensionales entre especies dentro de comunidades microbianas naturales. El componente de relación de muestra 340 puede ser cualquier componente de hardware y/o software (almacenado en una memoria tal como la memoria 320 y/o ejecutándose en hardware tal como el procesador 310) configurado para relacionar un parámetro de metadatos (parámetro ambiental, por ejemplo a través de co ocurrencia) con la presencia de una o más cepas de microorganismos activos. En algunas realizaciones, el componente 340 de relación de muestras puede relacionar una o más cepas de organismos activos con uno o más parámetros ambientales.
El componente de análisis de red 350 puede ser cualquier componente de hardware y/o software (almacenado en una memoria tal como la memoria 320 y/o ejecutándose en hardware tal como el procesador 310) configurado para determinar la co-ocurrencia de una o más cepas de microorganismos activos en una muestra a un parámetro ambiental (metadatos). En algunas realizaciones, basándose en los datos recopilados por el componente de recopilación de datos 330, y la relación entre una o más cepas de microorganismos activos con uno o más parámetros ambientales determinados por el componente de relación de muestra 340, el componente de análisis de red 350 puede crear matrices pobladas con enlaces que indican parámetros ambientales y asociaciones de cepas de microorganismos, el recuento de células absoluto de una o más cepas de microorganismos activas y el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos para representar una o más redes de una población heterogénea de cepas de microorganismos. Por ejemplo, el análisis de red puede usar una matriz de asociación (cantidad y/o abundancia) para identificar asociaciones entre una cepa de microorganismo activo y un parámetro de metadatos (por ejemplo, las asociaciones de dos o más cepas de microorganismos activos) en una muestra usando enfoques de exploración de reglas ponderado con datos cuantitativos. En algunas realizaciones, el componente de análisis de red 350 puede aplicar filtros para seleccionar y/eliminar reglas. El componente de análisis de red 350 puede calcular cambios en el número de células de cepas activas a lo largo del tiempo, observando la direccionalidad del cambio (es decir, valores negativos indican disminuciones, valores positivos indican aumentos). El componente de análisis de red 350 puede representar la matriz como una red, representando las cepas de microorganismos nodos, y las reglas ponderadas por cantidad representando bordes. El componente de análisis de red 350 puede usar cadenas de Markov de apalancamiento y paseos aleatorios para determinar la conectividad entre nodos y definir clústeres. En algunas realizaciones, el componente de análisis de red 350 puede filtrar grupos usando metadatos para identificar grupos asociados con metadatos deseables. En algunas realizaciones, el componente de análisis de red 350 puede clasificar las cepas de microorganismos objetivo integrando los cambios en el número de células a lo largo del tiempo y las cepas presentes en los grupos diana, siendo los cambios más altos en el número de células los más altos.
En algunas realizaciones, el análisis de red incluye análisis de vinculación, análisis de modularidad, medidas de robustez, medidas de intermediación, medidas de conectividad, medidas de transitividad, medidas de centralidad o una combinación de las mismas. En otra realización, se puede usar un método de análisis de agrupaciones que incluye la construcción de un modelo de conectividad, un modelo subespacial, un modelo de distribución, un modelo de densidad, o un modelo de centroide. En otra realización, el análisis de red incluye modelado predictivo de red a través de exploración y predicción de enlaces, clasificación colectiva, agrupamiento basado en enlaces, similitud relacional, o una combinación de los mismos. En otra realización, el análisis de red comprende información mutua, cálculos de coeficientes de informaciones máximas, u otros métodos no paramétricos entre variables para establecer una conectividad. En otra realización, el análisis de red incluye modelado de poblaciones basado en ecuaciones diferenciales. En otra realización, el análisis de red incluye modelado Lotka-Volterra.
La FIG 3B muestra un flujo lógico ejemplar según una realización de la descripción. Para comenzar, se recogen y/o reciben 3001 una pluralidad de muestras y/o conjuntos de muestras. Debe entenderse que, como se usa aquí, "muestra" puede referirse a una o más muestras, un conjunto de muestras, una pluralidad de muestras (por ejemplo, de una población particular), de manera que cuando se analizan dos o más muestras diferentes, es decir, para facilitar la comprensión, y cada muestra puede incluir una pluralidad de submuestras (por ejemplo, cuando se analizan una primera muestra y una segunda muestra, la primera muestra puede incluir 2, 3, 4, 5 o más submuestras, recolectadas de una primera población, y la segunda muestra puede incluir 2, 3, 4, 5 o más submuestras recolectadas de una segunda población o, alternativamente, recolectadas de la primera población pero en un momento diferente, tal como una semana o un mes después de la recolección de la primera submuestra). Cuando se recolectan submuestras, se pueden monitorizar y almacenar indicadores de recolección individuales y parámetros para cada submuestra, incluidos parámetros ambientales, observaciones cualitativas y/o cuantitativas, identidad de los miembros de la población (por ejemplo, cuando se recolectan muestras de la misma población en dos o más momentos diferentes, las submuestras se emparejan por identificación, de modo que la submuestra en el momento 1 del animal 1 se vincula a una submuestra recolectada de ese mismo animal en el momento 2, y así sucesivamente).
Para cada muestra, conjunto de muestras y/o submuestra, las células se tiñen según el tipo de organismo diana 3002, cada muestra/submuestra o porción de la misma se pesa y se diluye en serie 3003, y se procesa 3004 para determinar el número de células de cada tipo de microorganismo en cada muestra/submuestra. En una implementación ejemplar, se puede usar un clasificador de células para contar células bacterianas y fúngicas individuales de muestras, tales como de una muestra ambiental. Como parte de la descripción, se desarrollaron colorantes específicos para permitir el recuento de microorganismos que anteriormente no eran contables según los métodos tradicionales. Siguiendo los métodos de la descripción, se usan tintes específicos para teñir las paredes celulares (por ejemplo, para bacterias y/u hongos), y se pueden contar poblaciones discretas de células diana a partir de una población mayor basándose en las características celulares usando láseres. En un ejemplo específico, se preparan muestras ambientales, se diluyen en una disolución amortiguadora isotónica y se tiñen con tintes: (a) para las bacterias, se pueden usar los siguientes colorantes para teñir el ADN: Sybr Verde, Respiración : Cloruro de 5-ciano-2,3-ditoliltetrazolio y/o CTC, Pared celular: Verde Malaquita y/o Violeta Cristal; (b) para los hongos, se pueden usar los siguientes colorantes para teñir - Pared celular: Blanco calcoflúor, rojo Congo, azul tripán, amarillo directo 96, amarillo directo 11, negro directo 19, naranja directo 10, rojo directo 23, rojo directo 81, verde directo 1, violeta directo 51, aglutinina de germen de trigo - WGA, amarillo reactivo 2, amarillo reactivo 42, negro reactivo 5, naranja reactivo 16, rojo reactivo 23, verde reactivo 19, y/o violeta reactivo 5.
En el desarrollo de esta descripción, se descubrió ventajosamente que aunque los tintes directos y reactivos se asocian típicamente con la tinción de materiales a base de celulosa (es decir, algodón, lino y rayón viscosa), también se pueden usar para teñir quitina y quitosano debido a la presencia de cadenas de N-acetilglucosamina unidas p-(1 —^ 4) y cadenas de D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina unidas p-(1—4), respectivamente. Cuando estas subunidades se ensamblan en una cadena, se forma una estructura plana similar a una fibra, muy similar a las cadenas de celulosa. Los tintes directos se adhieren a las moléculas de quitina y/o quitosano mediante fuerzas de Van der Waals entre el tinte y la molécula de fibra. Cuanta mayor superficie de contacto haya entre los dos, más fuerte será la interacción. Los colorantes reactivos, por el contrario, forman un enlace covalente con la quitina y/o el quitosano.
Cada muestra teñida se carga en los FAC 3004 para su recuento. La muestra se puede pasar a través de un chip de microfluidos con una boquilla de tamaño específico (por ejemplo, 100 gm, seleccionada según la implementación y aplicación) que genera una corriente de gotas individuales (por ejemplo, aproximadamente 1/10 de un microlitro (0,1 gl)). Estas variables (tamaño de la boquilla, formación de gotas) se pueden optimizar para cada tipo de microorganismo diana. Idealmente, en cada gota está encapsulada una célula, o "evento", y cuando cada gota es alcanzada por un láser, todo lo que está teñido se excita y emite una longitud de onda de luz diferente. Los FAC detectan ópticamente cada emisión, y pueden representarlas como eventos (por ejemplo, en un gráfico 2D). Un gráfico típico consta de un eje para el tamaño del evento (determinado por la "dispersión directa") y el otro para la intensidad de la fluorescencia. Se pueden dibujar "puertas" alrededor de poblaciones discretas en estos gráficos, y se pueden contar los eventos en estas puertas.
La FIG. 3C muestra datos de ejemplo de hongos teñidos con Amarillo Directo; incluye monocultivo de levadura 3005a (control positivo, izquierda), E. coli 3005b (control negativo, medio), y muestra ambiental 3005c (experimental, derecha). En la figura, la "retrodispersión" (BSC-A) mide la complejidad del evento, mientras que FITC mide la intensidad de la emisión fluorescente del amarillo directo. Cada punto representa un evento, y la densidad de los eventos se indica mediante el cambio de color de verde a rojo. La puerta B indica el área general en la que se espera encontrar eventos específicos, en este caso hongos teñidos con amarillo directo.
Volviendo a la FIG. 3B, comenzando con las dos o más muestras 3001 recolectadas de una o más fuentes (incluidas las muestras recolectadas de un animal individual o de una única ubicación geográfica a lo largo del tiempo; de dos o más grupos que difieren en geografía, raza, rendimiento, dieta, enfermedad, etc.; de uno o más grupos que experimentan una perturbación o evento fisiológico; y/o similares), las muestras pueden analizarse para establecer recuentos absolutos usando citometría de flujo, incluida la tinción 3002, como se analizó anteriormente. Las muestras se pesan, se diluyen en serie 3003, y se procesan usando un FAC 3004. Después, la salida de los FAC se procesa para determinar el número absoluto del tipo de organismo deseado en cada muestra 3005. El siguiente fragmento de código muestra una metodología ejemplar para dicho procesamiento, según una realización:
# variables definidas por el usuario
#
# volumen = volumen de la muestra medido con FAC
# dilución = factor de dilución
# num_perlas= factor de recuento de perlas
# volumen_total = volumen total de la muestra en ml (si corresponde)
#
# Observación de volumen_total: Esto se puede medir de forma directa (es decir,
# evacuación de rumen para medir el contenido volumétrico total del rumen),
# o mediante un rastreador estable (es decir, uso de un marcador no digerible administrado
# en una cantidad conocida para retrocalcular el volumen del intestino
# delgado).
Lectura del producto de FAC como x
para i en el rango(ext(x)):
contenedor = x[¡]
mulo=[]
para j en el rango(ext(contenedor)):
perlas = contenedor[-1]
si perlas == 0:
temp =
(((contenedor[j]/num_perlas)*(51300/volumen))*1000)*dilución*100*volumen_total
mulo.adición(temp)
de lo contrario:
temp = (((contenedor[j]/portador[-1 ])*(51300/volumen))*1000)*dilución*100*volumen_total
mulo.adición(temp)
tipo_organismo_1 = mulo[ubicación_columna]
indicación = nombres_muestra[i]
recuento_celular= [indicación, tipo_organismo_1]
guardartxt(producto_archivo,recuento_celular)
archivo_de salida.cerrar()
Los ácidos nucleicos totales se aíslan de cada muestra 3006. El eluido de la muestra de ácido nucleico se divide en dos partes (normalmente, dos partes iguales), y cada parte se purifica enzimáticamente para obtener ADN 3006a purificado o ARN 3006b purificado. El ARN purificado se estabiliza mediante una conversión enzimática a ADNc 3006c. Se preparan bibliotecas de secuenciación (por ejemplo, bibliotecas de secuenciación ILLUMINA) tanto para el ADN purificado como para el ADNc purificado, mediante PCR, para unir los códigos de barras y las regiones adaptadoras apropiadas, y para amplificar la región marcadora apropiada para medir el tipo de organismo 3007 deseado. La calidad de la biblioteca se puede evaluar y cuantificar, y luego todas las bibliotecas se pueden agrupar y secuenciar.
Las lecturas de secuenciación sin procesar se recortan y fusionan con calidad 3008. Las lecturas procesadas se eliminan de la replicación y se agrupan para generar una lista de todas las cepas únicas presentes en la pluralidad de muestras 3009. Esta lista se puede usar para la identificación taxonómica de cada cepa presente en la pluralidad de muestras 3010. Se pueden identificar bibliotecas de secuenciación derivadas de muestras de ADN, y las lecturas de secuenciación de las bibliotecas de ADN identificadas se asignan nuevamente a la lista de cepas no replicadas para identificar qué cepas están presentes en cada muestra, y cuantificar el número de lecturas para cada cepa en cada muestra 3011. La lista de lecturas cuantificadas se integra entonces con el recuento de células absoluto del tipo de microorganismo diana para determinar el número absoluto o recuento celular de cada cepa 3013. El siguiente fragmento de código muestra una metodología ejemplar para dicho procesamiento, según una realización:
# variables definidas por el usuario
#
# comunicación = producto de recuento cuantificado del análisis de secuencia
# recuento = recuento celular absoluto calculado del tipo de organismo
# taxonomía = taxonomía prevista de cada cepa
#
Leer el archivo de recuentos celulares absolutos como recuentos
Leer archivo de taxonomía como tax
ncols= ext(recuentos) cant_muestras= ncols/2
nivel_tax= []
nivel_tax.append(exclusivo(taxonomía[‘reino’].valores.ravelO)) nivel_tax.append(exclusivo(taxonomía[‘filo’].valores.ravelO)) nivel_tax.append(exclusivo(taxonomía[‘clase’].valores.ravelO)) nivel_tax.append(exclusivo(taxonomía[‘orden’].valores.ravel())) nivel_tax.append(exclusivo)taxonomía[’familia’].valores.ravelO)) nivel_tax.append(exclusivo(taxonomía[‘género’].valores.ravelO)) nivel_tax.append(exclusivo(taxonomía[‘especie’].valores.ravelO))
recuentos_tax= fusión(izquierda=recuentos,derecha=tax)
# Análisis de nivel de especie
recuentos_tax.a_csv(especie.txt’)
# Solamente tomar muestras de ADN
datos_mulo= cargarcsv(‘especie.txt’, usarcols=xrango(2,ncols,2))
datos_mulo_normalizado = datos_mulo/suma(datos_mulo)
datos_mulo_con_recuentos = datos_mulo_recuentos*normalizados
Repetir para cada nivel taxonómico
Se identifican 3014 bibliotecas de secuenciación derivadas de muestras de ADNc. Después, las lecturas de secuenciación de las bibliotecas de ADNc identificadas se asignan nuevamente a la lista de cepas no replicadas para determinar qué cepas están activas en cada muestra. Si el número de lecturas está por debajo de un umbral especificado o designado 3015, la cepa se considera o identifica como inactiva y se elimina del análisis posterior 3015a. Si el número de lecturas excede el umbral 3015, la cepa se considera o identifica como activa y permanece en el análisis 3015b. Después, las cepas inactivas se filtran desde la salida 3013 para generar una lista de cepas activas y los respectivos números absolutos/recuentos de células para cada muestra 3016. El siguiente fragmento de código muestra una metodología ejemplar para dicho procesamiento, según una realización:
# continuar utilizando las variables anteriores
# Solamente tomar muestras de ARN
mulo_datos_activo= cargarcsv(‘especie.csv’, usarcols=xrango(3,ncols+1,2))
límite = percentil(mulo_datos_activo, 70)
para i en el rango(ext(mulo_datos_activo)):
si actividad mulo datos >= límite
multiplicador[i] = 1
de lo contrario
multiplicador[i] = 0
mulo_datos_activo_con_recuentos= multiplicador*mulo_datos_con_recuentos
Repetir para cada nivel taxonómico
Los metadatos cualitativos y cuantitativos (por ejemplo, parámetros ambientales, etc.) se identifican, recuperan y/o recopilan para cada muestra 3017 (conjunto de muestras, submuestras, etc.) y se almacenan 3018 en una base de datos (por ejemplo, 319). Se pueden identificar metadatos apropiados, y la base de datos se consulta para extraer metadatos identificados y/o relevantes para cada muestra que se analiza 3019, dependiendo de la aplicación/implementación. Después, el subconjunto de metadatos se fusiona con la lista de cepas activas y sus correspondientes números absolutos/recuentos de células para crear una especie y metadatos grandes por matriz de muestra 3020.
El coeficiente de informaciones máximas (MIC) se calcula entonces entre las cepas y los metadatos 3021a, y entre las cepas 3021b. Los resultados se combinan para crear una lista de todas las relaciones y sus correspondientes puntuaciones MIC 3022. Si la relación obtiene una puntuación inferior a un umbral determinado 3023, la relación se considera/identifica como irrelevante 3023b. Si la relación está por encima de un umbral determinado 3023, la relación se considera/identifica como relevante 2023a, y está sujeta además al análisis de red 3024. El siguiente fragmento de código muestra una metodología ejemplar para dicho análisis, según una realización:
Leer lista total de archivo de relaciones como vínculos
límite = 0.8
para i en el rango(ext(vínculos)):
si vínculos >= límite
multiplicador[i] = 1
de lo contrario
multiplicador[i] = 0
finalizar si
temp_vínculos = multiplicador*vínculos
final_vínculos = vínculos_temp[tem_vínculos != 0]
guardartxt(producto_archivo,final_vínculos)
archivo_de salida.cerrar()
En base al resultado del análisis de red, se seleccionan cepas activas 3025 para preparar productos (por ejemplo, conjuntos, agregados y/u otros agrupamientos sintéticos) que contienen las cepas seleccionadas. El resultado del análisis de red también se puede usar para informar la selección de cepas para pruebas adicionales de composición del producto.
El uso de umbrales se analiza anteriormente para análisis y determinaciones. Los umbrales pueden ser, según la implementación y la aplicación: (1) determinados empíricamente (por ejemplo, basado en niveles de distribución, estableciendo un límite en un número que elimina una porción específica o significativa de lecturas de bajo nivel); (2) cualquier valor distinto de cero; (3) basado en porcentaje/percentiles; (4) sólo cepas cuyas lecturas del segundo marcador normalizado (es decir, actividad) son mayores que las lecturas del primer marcador normalizado (recuento de células); (5) cambio log2 veces entre actividad y cantidad o recuento de células; (6) las lecturas normalizadas del segundo marcador (actividad) son mayores que las lecturas medias del segundo marcador (actividad) para toda la muestra (y/o conjunto de muestras); y/o cualquier umbral de magnitud descrito anteriormente además de un umbral estadístico (es decir, prueba de significancia). El siguiente ejemplo proporciona detalles de umbrales para distribuciones de medidas de segundos marcadores basadas en ARN con respecto a medidas de primeros marcadores basadas en ADN, según una realización.
Se recogió el contenido del intestino delgado de un Cobb500 macho y se sometió a análisis según la descripción. Brevemente, el número total de células bacterianas en la muestra se determinó usando FAC (por ejemplo, 3004). Se aislaron ácidos nucleicos totales (por ejemplo, 3006) de la muestra de intestino delgado fijada. Se prepararon bibliotecas de secuenciación de ADN (primer marcador) y ADNc (segundo marcador) (por ejemplo, 3007), y se cargaron en un ILLUMINA MISEQ. Las lecturas de secuenciación sin procesar de cada biblioteca se filtraron, eliminaron, agruparon y cuantificaron por calidad (por ejemplo, 3008). Las listas de cepas cuantificadas de las bibliotecas basadas en ADN y en ADNc se integraron con los datos del recuento de células para establecer el número absoluto de células de cada cepa dentro de la muestra (por ejemplo, 3013). Aunque el ADNc no es necesariamente una medida directa de la cantidad de cepa (es decir, las cepas altamente activas pueden tener muchas copias de la misma molécula de ARN), la biblioteca basada en ADNc se integró con los datos de recuento de células en este ejemplo para mantener el mismo procedimiento de normalización usado para la biblioteca de ADN.
Después del análisis, se identificaron 702 cepas (46 únicas) en la biblioteca basada en ADNc, y se identificaron 1140 cepas en la biblioteca basada en ADN. Si se usa 0 como umbral de actividad (es decir, se mantiene cualquier valor distinto de cero), el 57 % de las cepas dentro de esta muestra que tenían un primer marcador basado en ADN también se asociaron con un segundo marcador basado en ADNc. Estas cepas se identifican o se consideran la parte activa de la comunidad microbiana, y sólo estas cepas continúan en análisis posteriores. Si el umbral se hace más estricto y sólo se consideran activas las cepas cuyo segundo valor de marcador supera el primer valor de marcador, sólo 289 cepas (25 %) alcanzan el umbral. Las cepas que alcanzan este umbral corresponden a aquellas que se encuentran por encima de la línea de ADN (primer marcador) en la FIG. 3D.
La descripción incluye una variedad de métodos que identifican una pluralidad de cepas de microbios activos que influyen entre sí, así como en uno o más parámetros o metadatos, y seleccionan microbios identificados para uso en un conjunto microbiano que incluye un subconjunto seleccionado de una comunidad microbiana de especies microbianas individuales, o cepas de una especie, que están vinculadas para llevar a cabo o influir en una función común, o que pueden describirse como participantes, conducentes o asociadas con un parámetro reconocible, tal como un rasgo fenotípico de interés (por ejemplo, aumento de producción de leche en un rumiante). La descripción también incluye una variedad de sistemas y aparatos que realizan y/o facilitan los métodos.
En algunas realizaciones, el método comprende: obtener al menos dos muestras que comparten al menos una característica común (tal como geolocalización de la muestra, tipo de muestra, fuente de la muestra, individuo fuente de la muestra, animal diana de la muestra, tiempo de la muestra, raza, dieta, temperatura, etc.) y que tiene al menos una característica diferente (tal como geolocalización/ubicación temporal de la muestra, tipo de muestra, fuente de la muestra, individuo fuente de la muestra, animal diana de la muestra, momento de la muestra, raza, dieta, temperatura, etc., diferente de la característica común). Para cada muestra, detectar la presencia de uno o más tipos de microorganismos, determinar un número de cada tipo de microorganismo detectado de uno o más tipos de microorganismos en cada muestra; y medir un número de primeros marcadores únicos en cada muestra, y la cantidad de los mismos, siendo cada primer marcador único un marcador de una cepa de microorganismo. A esto le sigue la integración del número de cada tipo de microorganismo y el número de los primeros marcadores para producir el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo presente en cada muestra; medir al menos un segundo marcador único para cada cepa de microorganismo basándose en un umbral específico para determinar un nivel de actividad para esa cepa de microorganismo en cada muestra; filtrar el recuento de células absoluto por la actividad determinada para proporcionar una lista de cepas de microorganismos activos y sus respectivos recuentos de células absolutos para cada una de las al menos dos muestras; comparar los recuentos de células absolutos filtrados de las cepas de microorganismos activos para cada una de las al menos dos muestras entre sí y con al menos un metadato medido para cada una de las al menos dos muestras, y clasificar las cepas de microorganismos activos en al menos dos grupos basándose en la función y/o química predichas. Por ejemplo, la comparación puede ser un análisis de red que identifique los vínculos entre las respectivas cepas microbianas y entre cada cepa microbiana y metadatos, y/o entre los metadatos y las cepas microbianas. Se puede seleccionar al menos un microorganismo de al menos dos grupos, y combinarse para formar un conjunto de microorganismos configurados para alterar una propiedad correspondiente a al menos un metadato (por ejemplo, una propiedad en una diana, tal como la producción de leche en una vaca o población de vacas). Formar el conjunto puede incluir aislar la o cada cepa de microorganismo, seleccionar una cepa de microorganismo previamente aislada en función del análisis, y/o incubar/cultivar cepas de microorganismos específicas en función del análisis, y combinar las cepas para formar el conjunto microbiano. El conjunto puede incluir un medio, vehículo, y/o vehículo farmacéutico apropiado que permita la administración de los microorganismos en el conjunto de tal manera que puedan influir en el receptor (por ejemplo, aumentar la producción de leche).
La medida del número de primeros marcadores únicos puede incluir medir el número de marcadores de ADN genómico únicos en cada muestra, medir el número de marcadores de ARN únicos en cada muestra, medir el número de marcadores de proteínas únicos en cada muestra, y/o medir el número de marcadores de metabolitos únicos en cada muestra (incluida la medida del número de marcadores de lípidos únicos en cada muestra y/o la medida del número de marcadores de hidratos de carbono únicos en cada muestra).
En algunas realizaciones, medir el número de primeros marcadores únicos, y la cantidad de los mismos, incluye someter el ADN genómico de cada muestra a una reacción de secuenciación de alto rendimiento y/o someter el<a>D<n>genómico de cada muestra a una secuenciación del metagenoma. Los primeros marcadores únicos pueden incluir al menos uno de un marcador de ARNm, un marcador de ARNip, y/o un marcador de ARN ribosómico. Los primeros marcadores únicos pueden incluir adicional o alternativamente al menos uno de un factor sigma, un factor de transcripción, una proteína asociada a nucleósidos, y/o una enzima metabólica.
En algunas realizaciones, medir el al menos un segundo marcador único incluye medir un nivel de expresión del al menos un segundo marcador único en cada muestra, y puede incluir someter el ARNm de la muestra a un análisis de expresión génica. El análisis de la expresión génica puede incluir una reacción de secuenciación, una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), secuenciación del metatranscriptoma, y/o secuenciación del transcriptoma.
En algunas realizaciones, medir el nivel de expresión de al menos un segundo marcador único incluye someter cada muestra o una porción de la misma a análisis de espectrometría de masas, y/o someter cada muestra o una porción de la misma a un perfil de metaribosoma o perfil de ribosoma. El uno o más tipos de microorganismos incluye bacterias, arqueas, hongos, protozoos, plantas, otros eucariotas, virus, viroides, o una combinación de los mismos, y la una o más cepas de microorganismos incluye una o más cepas bacterianas, cepas de arqueas, cepas de hongos, cepas de protozoos, cepas de plantas, otras cepas eucariotas, cepas virales, cepas viroides, o una combinación de las mismas. La una o más cepas de microorganismos pueden ser una o más especies o subespecies de hongos, y/o la una o más cepas de microorganismos pueden ser una o más especies o subespecies bacterianas.
En algunas realizaciones, determinar el número de cada uno de uno o más tipos de microorganismos en cada muestra incluye someter cada muestra o una porción de la misma a secuenciación, centrifugación, microscopía óptica, microscopía fluorescente, tinción, espectrometría de masas, microfluidos, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), electroforesis en gel, y/o citometría de flujo.
Los primeros marcadores únicos pueden incluir un marcador filogenético que comprende un gen de la subunidad ribosómica 5S, un gen de la subunidad ribosómica 16S, un gen de la subunidad ribosómica 23S, un gen de la subunidad ribosómica 5.8S, un gen de la subunidad ribosómica 18S, un gen de la subunidad ribosómica 28S, un gen de subunidad de la citocromo c oxidasa, un gen de p-tubulina, un gen de factor de elongación, un gen de subunidad de ARN polimerasa, un espaciador transcrito interno (ITS), o una combinación de los mismos. Medir el número de marcadores únicos, y la cantidad de los mismos, puede incluir someter el ADN genómico de cada muestra a una reacción de secuenciación de alto rendimiento, someter el ADN genómico a una secuenciación genómica, y/o someter el ADN genómico a una secuenciación de amplicones.
En algunas realizaciones, la al menos una característica diferente incluye: un tiempo de recolección en el que se recolectó cada una de las al menos dos muestras, de manera que el tiempo de recolección para una primera muestra es diferente del tiempo de recolección de una segunda muestra, un lugar de recolección (ya sea diferencia de ubicación geográfica y/o diferencias de diana de muestra individual/recogida de animales) en el que se recogió cada una de las al menos dos muestras, de manera que la ubicación de recogida para una primera muestra sea diferente de la ubicación de recogida de una segunda muestra. La al menos una característica común puede incluir un tipo de fuente de muestra, de manera que el tipo de fuente de muestra para una primera muestra sea el mismo que el tipo de fuente de muestra de una segunda muestra. El tipo de fuente de muestra puede ser uno de tipo animal, tipo de órgano, tipo de suelo, tipo de agua, tipo de sedimento, tipo de aceite, tipo de planta, tipo de producto agrícola, tipo de suelo a granel, tipo de rizosfera del suelo, tipo de parte de planta, y/o similares. En algunas realizaciones, la al menos una característica común incluye que cada una de las al menos dos muestras son muestras gastrointestinales, que pueden ser, en algunas implementaciones, muestras ruminales. En algunas implementaciones, las características comunes/diferentes proporcionadas aquí pueden ser, en cambio, características diferentes/comunes entre ciertas muestras. En algunas realizaciones, la al menos una característica común incluye el tipo de fuente de muestra animal, teniendo cada muestra una característica común adicional tal que cada muestra es una muestra de tejido, una muestra de sangre, una muestra de diente, una muestra de transpiración, una muestra de uña, una muestra de piel, una muestra de cabello, una muestra de heces, una muestra de orina, una muestra de semen, una muestra de moco, una muestra de saliva, una muestra de músculo, una muestra de cerebro, o una muestra de órgano.
En algunas realizaciones, el método anterior puede comprender además obtener al menos una muestra adicional de una diana, basándose en al menos un metadato medido, en el que la al menos una muestra adicional de la diana comparte al menos una característica común con al menos dos muestras. Después, para la al menos una muestra adicional de la diana, detectar la presencia de uno o más tipos de microorganismos, determinar un número de cada tipo de microorganismo detectado del uno o más tipos de microorganismos, medir un número de primeros marcadores únicos y la cantidad de los mismos, integrar el número de cada tipo de microorganismo y el número de los primeros marcadores para producir el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo presente, medir al menos un segundo marcador único para cada cepa de microorganismo para determinar un nivel de actividad para esa cepa de microorganismo, filtrar el recuento de células absoluto por la actividad determinada para proporcionar una lista de cepas de microorganismos activos y sus respectivos recuentos de células absolutos para la al menos una muestra adicional de la diana. En tales realizaciones, la selección de la al menos una cepa de microorganismo de los al menos dos grupos se basa en la lista de la o las cepas de microorganismos activos y el o los respectivos recuentos de células absolutos para la al menos una muestra adicional de la diana, de manera que el conjunto formado esté configurado para alterar una propiedad de la diana que corresponde al al menos un metadato. Por ejemplo, usando una implementación de este tipo, se podría identificar un conjunto microbiano a partir de muestras tomadas de vacas Holstein y una muestra diana tomada de una vaca Jersey o un búfalo de agua, en la que el análisis identificó las mismas relaciones de red, sustancialmente similares, o similares, entre las cepas de microorganismos iguales o similares de la muestra original y la o las muestras diana.
En algunas realizaciones, comparar los recuentos de células absolutos filtrados de cepas de microorganismos activos para cada una de las al menos dos muestras con al menos un metadato medido o una cepa de microorganismo activo adicional para cada una de las al menos dos muestras incluye determinar la co-ocurrencia de la una o más cepas de microorganismos activos en cada muestra con el al menos un metadato medido o cepa de microorganismo activo adicional. El al menos un metadato medido puede incluir uno o más parámetros, en el que el uno o más parámetros es al menos uno de pH de la muestra, temperatura de la muestra, abundancia de una grasa, abundancia de una proteína, abundancia de un hidrato de carbono, abundancia de un mineral, abundancia de una vitamina, abundancia de un producto natural, abundancia de un compuesto específico, peso corporal de la fuente de muestra, consumo de alimento de la fuente de muestra, ganancia de peso de la fuente de muestra, eficiencia alimenticia de la fuente de muestra, presencia o ausencia de uno o más patógenos, características físicas o medidas de la fuente de la muestra, características de producción de la fuente de la muestra, o una combinación de las mismas. Los parámetros también pueden incluir abundancia de proteína de suero, abundancia de proteína de caseína, y/o abundancia de grasas en la leche producida por la fuente de muestra.
En algunas realizaciones, determinar la co-ocurrencia de la una o más cepas de microorganismos activos y el al menos un metadato medido o cepa de microorganismo activo adicional en cada muestra puede incluir la creación de matrices pobladas con enlaces que denotan metadatos y asociaciones de cepas de microorganismos en dos o más conjuntos de muestras, el recuento de células absoluto de la una o más cepas de microorganismos activos y la medida del uno o más segundos marcadores únicos para representar una o más redes de una comunidad o comunidades microbianas heterogéneas. Determinar la co-ocurrencia de la una o más cepas de microorganismos activos y el al menos un metadato medido o cepa de microorganismo activo adicional, y categorizar las cepas de microorganismos activos, pueden incluir análisis de red y/o análisis de agrupaciones para medir la conectividad de cada cepa de microorganismo dentro de una red, representando la red una colección de las al menos dos muestras que comparten una característica común, metadatos medidos, y/o parámetro ambiental relacionado. El análisis de red y/o el análisis de agrupaciones pueden incluir análisis de vinculación, análisis de modularidad, medidas de robustez, medidas de intermediación, medidas de conectividad, medidas de transitividad, medidas de centralidad, o una combinación de las mismas. El análisis de agrupaciones puede incluir la construcción de un modelo de conectividad, un modelo subespacial, un modelo de distribución, un modelo de densidad, y/o un modelo de centroide. El análisis de red puede, en algunas implementaciones, incluir modelado predictivo de red o redes a través de exploración y predicción de enlaces, clasificación colectiva, agrupamiento basado en enlaces, similitud relacional, una combinación de los mismos, y/o similares. El análisis de red puede comprender modelado de poblaciones basado en ecuaciones diferenciales y/o modelado de Lotka-Volterra. El análisis puede ser un método heurístico. En algunas realizaciones, el análisis puede ser el método de Lovaina. El análisis de red puede incluir métodos no paramétricos para establecer una conectividad entre variables, y/o cálculos de coeficientes de informaciones mutuas y/o informaciones máximas entre variables para establecer una conectividad.
Para algunas realizaciones, el método para formar un conjunto de cepas de microorganismos activos configurados para alterar una propiedad o característica en un ambiente basado en dos o más conjuntos de muestras que comparten al menos un parámetro ambiental común o relacionado entre los dos o más conjuntos de muestras y que tienen al menos un parámetro ambiental diferente entre los dos o más conjuntos de muestras, comprendiendo cada conjunto de muestras al menos una muestra que incluye una comunidad microbiana heterogénea, en el que la una o más cepas de microorganismos es un subtaxón de uno o más tipos de organismos, comprende: detectar la presencia de una pluralidad de tipos de microorganismos en cada muestra; determinar el número absoluto de células de cada uno de los tipos de microorganismos detectados en cada muestra; y medir el número de primeros marcadores únicos en cada muestra, y la cantidad de los mismos, en el que un primer marcador único es un marcador de una cepa de microorganismo. Después, a nivel de proteína o ARN, medir el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos, en el que un segundo marcador único es un marcador de actividad de una cepa de microorganismo, determinar la actividad de las cepas de microorganismos detectadas para cada muestra basándose en la nivel de expresión del uno o más segundos marcadores únicos que exceden un umbral específico, calcular el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo activo detectado en cada muestra en función de la cantidad de uno o más primeros marcadores y el número absoluto de células del microorganismo tipos de los cuales la una o más cepas de microorganismos es un subtaxón, en el que la una o más cepas de microorganismos activos expresan el segundo marcador único por encima del umbral especificado. La co-ocurrencia de las cepas de microorganismos activos en las muestras con al menos un parámetro ambiental se determina entonces basándose en un análisis de red de coeficientes de informaciones máximas para medir la conectividad de cada cepa de microorganismos dentro de una red, en el que la red es la colección de los al menos dos o más conjuntos de muestras con al menos un parámetro ambiental común o relacionado. Se selecciona una pluralidad de cepas de microorganismos activos de una o más cepas de microorganismos activos basándose en el análisis de red, y se forma un conjunto de cepas de microorganismos activos a partir de la pluralidad seleccionada de cepas de microorganismos activos, estando configurado el conjunto de cepas de microorganismos activos para alterar selectivamente una propiedad o característica de un ambiente cuando el conjunto de cepas de microorganismos activos se introduce en ese ambiente. Para algunas implementaciones, al menos un indicio medido de al menos un factor ambiental común o relacionado para un primer conjunto de muestras es diferente de un indicio medido de al menos un factor ambiental común o relacionado para un segundo conjunto de muestras. Por ejemplo, si las muestras/conjuntos de muestras son de vacas, el primer conjunto de muestras puede ser de vacas alimentadas con una dieta de pasto, mientras que el segundo conjunto de muestras puede ser de vacas alimentadas con una dieta de maíz. Si bien un conjunto de muestras podría ser una muestra única, alternativamente podría ser una pluralidad de muestras, y un indicio medido de al menos un factor ambiental común o relacionado para cada muestra dentro de un conjunto de muestras es sustancialmente similar (por ejemplo, todas las muestras de un conjunto tomados de un rebaño que se alimenta con pasto), y los indicios medidos promedio para un conjunto de muestras son diferentes de los indicios medidos promedio de otro conjunto de muestras (el primer conjunto de muestras es de un rebaño que se alimenta con pasto, y el segundo conjunto de muestras son muestras de un rebaño alimentado con maíz). Puede haber diferencias y similitudes adicionales que se tengan en cuenta en el análisis, tales como diferentes razas, diferentes dietas, diferentes rendimientos, diferentes edades, diferentes aditivos alimentarios, diferentes etapas de crecimiento, diferentes características fisiológicas, diferentes estados de salud, diferentes elevaciones, diferentes temperaturas ambientales, diferentes estaciones, diferentes antibióticos, etc. Mientras que en algunas realizaciones cada conjunto de muestras comprende una pluralidad de muestras, y un primer conjunto de muestras se recoge de una primera población, y un segundo conjunto de muestras se recoge de una segunda población, en realizaciones adicionales o alternativas, cada conjunto de muestras comprende una pluralidad de muestras, y se recolecta un primer conjunto de muestras de una primera población en un primer momento, y se recolecta un segundo conjunto de muestras de la primera población en un segundo momento diferente del primero. Por ejemplo, el primer conjunto de muestras podría tomarse por primera vez de un rebaño de ganado mientras se alimentaban con pasto, y un segundo conjunto de muestras podría tomarse por segunda vez (por ejemplo, 2 meses después), cuando el rebaño se cambió a alimento de maíz inmediatamente después de que se tomó el primer conjunto de muestras. En tales realizaciones, las muestras pueden recolectarse y realizarse el análisis en la población, y/o pueden incluir referencias específicas a animales individuales para que se puedan identificar los cambios que ocurrieron en animales individuales durante el período de tiempo, y un nivel más fino de granularidad de datos proporcionada.
En algunas realizaciones, al menos un factor ambiental común o relacionado incluye información sobre nutrientes, información dietética, características animales, información sobre infecciones, estado de salud, y/o similares.
Al menos un indicio medido puede incluir pH de la muestra, temperatura de la muestra, abundancia de una grasa, abundancia de una proteína, abundancia de un hidrato de carbono, abundancia de un mineral, abundancia de una vitamina, abundancia de un producto natural, abundancia de un compuesto específico, peso corporal de la fuente de muestra, consumo de alimento de la fuente de muestra, ganancia de peso de la fuente de muestra, eficiencia alimenticia de la fuente de muestra, presencia o ausencia de uno o más patógenos, características físicas o medidas de la muestra fuente, características de producción de la fuente de muestra, abundancia de proteína de suero en la leche producida por la fuente de muestra, abundancia de proteína de caseína producida por la fuente de muestra, y/o abundancia de grasas en la leche producida por la fuente de muestra, o una combinación de las mismas.
Medir el número de primeros marcadores únicos en cada muestra puede, dependiendo de la realización, comprender medir el número de marcadores de ADN genómico únicos, medir el número de marcadores de ARN únicos, y/o medir el número de marcadores de proteínas únicos. La pluralidad de tipos de microorganismos puede incluir una o más bacterias, arqueas, hongos, protozoos, plantas, otros eucariotas, virus, viroides, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, determinar el número absoluto de cada uno de los tipos de microorganismos en cada muestra incluye someter la muestra o una porción de la misma a secuenciación, centrifugación, microscopía óptica, microscopía fluorescente, tinción, espectrometría de masas, microfluidos, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), electroforesis en gel y/o citometría de flujo. En algunas realizaciones, una o más cepas de microorganismos activos es un subtaxón de uno o más tipos de microbios seleccionados de una o más bacterias, arqueas, hongos, protozoos, plantas, otros eucariotas, virus, viroides, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, una o más cepas de microorganismos activos es una o más cepas bacterianas, cepas de arqueas, cepas de hongos, cepas de protozoos, cepas de plantas, otras cepas de eucariotas, cepas virales, cepas de viroides, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, una o más cepas de microorganismos activos es una o más especies o subespecies bacterianas. En algunas realizaciones, una o más cepas de microorganismos activos es una o más especies o subespecies de hongos.
En algunas realizaciones, al menos un primer marcador único comprende un marcador filogenético que comprende un gen de la subunidad ribosómica 5S, un gen de la subunidad ribosómica 16S, un gen de la subunidad ribosómica 23S, un gen de la subunidad ribosómica 5.8S, un gen de la subunidad ribosómica 18S, una subunidad ribosómica 28S gen, un gen de la subunidad de la citocromo c oxidasa, un gen de beta-tubulina, un gen del factor de elongación, un gen de la subunidad de la ARN polimerasa, un espaciador transcrito interno (ITS), o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, medir el número de primeros marcadores únicos, y la cantidad de los mismos, comprende someter el ADN genómico de cada muestra a una reacción de secuenciación de alto rendimiento, y/o someter el ADN genómico de cada muestra a una secuenciación del metagenoma. En algunas implementaciones, los primeros marcadores únicos pueden incluir un marcador de ARNm, un marcador de ARNip, y/o un marcador de ARN ribosómico. En algunas implementaciones, los primeros marcadores únicos pueden incluir un factor sigma, un factor de transcripción, una proteína asociada a nucleósidos, una enzima metabólica, o una combinación de los mismos.
En algunas realizaciones, medir el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos comprende someter el ARNm en cada muestra a un análisis de expresión génica, y en algunas implementaciones, el análisis de expresión génica comprende una reacción de secuenciación. En algunas implementaciones, el análisis de la expresión génica comprende una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), secuenciación del metatranscriptoma, y/o secuenciación del transcriptoma.
En algunas realizaciones, medir el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos incluye someter cada muestra o una porción de la misma a análisis de espectrometría de masas, perfiles de metaribosomas, y/o perfiles de ribosomas.
En algunas realizaciones, medir el nivel de expresión de al menos uno o más segundos marcadores únicos incluye someter cada muestra o una porción de la misma a un perfil de metaribosoma o perfil de ribosoma (Ribo-Seq) (Ingolia, NT, S. Ghaemmaghami, JR Newman, y J.S. Weissman. 2009. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science 324:218-223; Ingolia, N.T. 2014. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat. Rev. Genet. 15:205-213). Ribo-seq es una técnica molecular que se puede usar para determinar la síntesis de proteínasin vivoa escala del genoma. Este método mide directamente qué transcripciones se traducen activamente a través de los ribosomas de huellas a medida que se unen e interactúan con el ARNm. Después, las regiones de ARNm unidas se procesan y se someten a reacciones de secuenciación de alto rendimiento. Se ha demostrado que Ribo-seq tiene una fuerte correlación con la proteómica cuantitativa (Li, GW, D. Burkhardt, C. Gross, y J.S. Weissman. 2014. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell 157:624-635).
El tipo de fuente de las muestras puede ser animal, suelo, aire, agua salada, agua dulce, lodos de aguas residuales, sedimentos, aceite, plantas, un producto agrícola, suelo a granel, rizosfera del suelo, parte de una planta, vegetal, un ambiente extremo, o un combinación de los mismos. En algunas implementaciones, cada muestra es una muestra del tracto digestivo y/o ruminal. En algunas implementaciones, las muestras pueden ser muestras de tejido, muestras de sangre, muestras de dientes, muestras de transpiración, muestras de uñas, muestras de piel, muestras de cabello, muestras de heces, muestras de orina, muestras de semen, muestras de moco, muestras de saliva, muestras de músculos, muestras de cerebro, muestras de tejido, y/o muestras de órganos.
Dependiendo de la implementación, un conjunto microbiano de la descripción puede comprender dos o más microbios o cepas de microbios sustancialmente puros, una mezcla de microbios/cepas de microbios deseados, y también puede incluir cualquier componente adicional que pueda administrarse a una diana, por ejemplo para restaurar la microbiota de un animal. Los conjuntos microbianos elaborados según la descripción se pueden administrar con un agente para permitir que los microbios sobrevivan en un entorno diana (por ejemplo, el tracto gastrointestinal de un animal, en el que el conjunto está configurado para resistir un pH bajo y crecer en el entorno gastrointestinal). En algunas realizaciones, los conjuntos microbianos pueden incluir uno o más agentes que aumentan el número y/o la actividad de uno o más microbios o cepas de microbios deseados, estando dichas cepas presentes o ausentes en los microbios/cepas incluidos en el conjunto. Los ejemplos no limitativos de dichos agentes incluyen fructooligosacáridos (por ejemplo, oligofructosa, inulina, fructanos de tipo inulina), galactooligosacáridos, aminoácidos, alcoholes, y mezclas de los mismos (véase Ramírez-Farias et al. 2008. Br. J. Nutr. 4:1-10 y Pool-Zobel y Sauer 2007. J. Nutr.
137:2580-2584 y suplementarios).
Las cepas microbianas identificadas mediante los métodos de la descripción pueden cultivarse/crecerse antes de su inclusión en un conjunto. Se pueden usar medios para dicho crecimiento, y pueden incluir cualquier medio adecuado para soportar el crecimiento de un microbio, incluyendo, a modo de ejemplo no limitativo, natural o artificial, incluyendo agar suplementario con gastrina, medio LB, suero sanguíneo, y/o geles de cultivo de tejidos. Debe apreciarse que los medios pueden usarse solos o en combinación con uno o más medios diferentes. También se pueden usar con o sin la adición de nutrientes exógenos. El medio puede modificarse o enriquecerse con compuestos o componentes adicionales, por ejemplo un componente que puede ayudar en la interacción y/o selección de grupos específicos de microorganismos y/o cepas de los mismos. Por ejemplo, podrían estar presentes antibióticos (tal como penicilina) o esterilizantes (por ejemplo, sales de amonio cuaternario y agentes oxidantes), y/o las condiciones físicas (tal como salinidad, nutrientes (por ejemplo minerales orgánicos e inorgánicos (tales como fósforo, sales de nitrógeno, amoníaco, potasio, y micronutrientes tales como cobalto y magnesio), pH y/o temperatura) podrían modificarse.
Como se analizó anteriormente, los sistemas y aparatos se pueden configurar según la descripción, y en algunas realizaciones pueden comprender un procesador y una memoria, almacenando la memoria instrucciones legibles/emitibles por el procesador para realizar los métodos. En una realización, un sistema y/o aparato están configurados para realizar el método. También se describen implementaciones de procesador de los métodos, como se analiza con referencia a la FIG 3A. Por ejemplo, un método implementado por un procesador puede comprender: recibir datos de muestra de al menos dos muestras que comparten al menos una característica común y que tienen al menos una característica diferente; para cada muestra, determinar la presencia de uno o más tipos de microorganismos en cada muestra; determinar un número de células de cada tipo de microorganismo detectado de uno o más tipos de microorganismos en cada muestra; determinar un número de primeros marcadores únicos en cada muestra, y la cantidad de los mismos, siendo cada primer marcador único un marcador de una cepa de microorganismo; integrar, mediante uno o más procesadores, el número de cada tipo de microorganismo y el número de los primeros marcadores para producir el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo presente en cada muestra; determinar un nivel de actividad para cada cepa de microorganismo en cada muestra basándose en una medida de al menos un segundo marcador único para cada cepa de microorganismo que excede un umbral específico, identificándose una cepa de microorganismo como activa si la medida de al menos un segundo marcador único para esa la tensión excede el umbral correspondiente; filtrar el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo según la actividad determinada para proporcionar una lista de cepas de microorganismos activos y sus respectivos recuentos de células absolutos para cada una de las al menos dos muestras; analizar mediante uno o más procesadores los recuentos absolutos filtrados de cepas de microorganismos activos para cada una de las al menos dos muestras con al menos un metadato medido o una cepa de microorganismo activo adicional para cada una de las al menos dos muestras y categorizar las cepas de microorganismos activos en función de su función, función prevista, y/o química; identificar una pluralidad de cepas de microorganismos activos basándose en la categorización; y generar la pluralidad identificada de cepas de microorganismos activos para ensamblar un conjunto de microorganismos activos configurado para, cuando se aplica a una diana, alterar una propiedad de la diana correspondiente a al menos un metadato medido. En algunas realizaciones, el resultado se puede utilizar en la generación, síntesis, evaluación y/o prueba de microbios y cepas de microbios sintéticos y/o transgénicos. Algunas realizaciones pueden incluir un medio legible por computadora no transitorio legible por procesador que almacena instrucciones para realizar y/o facilitar la ejecución del o de los métodos. En algunas realizaciones, se pueden usar métodos, aparatos y sistemas de análisis y detección según la descripción para identificar microorganismos y cepas problemáticos, tales como patógenos, como se analiza en el Ejemplo 4 a continuación. En tales situaciones, en el análisis de red de las muestras se usarían metadatos de síntomas conocidos, tal como la puntuación de la lesión.
Se pretende que los sistemas y métodos descritos aquí puedan realizarse mediante software (almacenado en la memoria y/o ejecutado en hardware), hardware, o una combinación de los mismos. Los componentes y/o módulos de hardware pueden incluir, por ejemplo, un procesador de propósito general, una matriz de puertas programables en campo (FPGA) y/o un circuito integrado de aplicación específica (ASIC). Los componentes y/o módulos de software (ejecutados en hardware) se pueden expresar en una variedad de lenguajes de software (por ejemplo, código informático), incluidas utilidades Unix, C, C++, Java™, JavaScript (por ejemplo, ECMAScript 6), Ruby, SQL, SAS®, el entorno de software/lenguaje de programación R, Visual Basic™, y otros lenguajes de programación y herramientas de desarrollo orientados a objetos, procedimentales u otros lenguajes de programación. Los ejemplos de código informático incluyen, pero no se limitan a, microcódigo o microinstrucciones, instrucciones de máquina, tales como las producidas por un compilador, código usado para producir un servicio web, y archivos que contienen instrucciones de nivel superior ejecutadas por un computadora usando un intérprete. Ejemplos adicionales de código informático incluyen, pero no se limitan a, señales de control, código cifrado, y código comprimido.
Algunas realizaciones descritas aquí se refieren a dispositivos con un medio no transitorio legible por computadora (también puede denominarse medio o memoria no transitorio legible por procesador) que tiene instrucciones o código de computadora en el mismo para realizar diversas operaciones implementadas por computadora. El medio legible por computadora (o medio legible por procesador) no es transitorio, en el sentido de que no incluye señales de propagación transitorias per se (por ejemplo, una onda electromagnética en propagación que transporta información en un medio de transmisión tal como el espacio o un cable). Los medios y el código informático (también pueden denominarse código) pueden ser aquellos diseñados y construidos para el fin o fines específicos. Ejemplos de medios no transitorios legibles por computadora incluyen, pero no se limitan a: medios de almacenamiento magnético tales como discos duros, disquetes y cintas magnéticas; medios de almacenamiento óptico tales como discos compactos/discos de vídeo digital (CD/DVD), memorias de disco compacto de sólo lectura (CD-ROM) y dispositivos holográficos; medios de almacenamiento magnetoópticos tales como discos ópticos; componentes y/o módulos de procesamiento de señales de ondas portadoras; y dispositivos de hardware que están especialmente configurados para almacenar y ejecutar código de programa, tales como circuitos integrados de aplicaciones específicas (ASIC), dispositivos lógicos programables (PLD), memoria de sólo lectura (ROM) y dispositivos de memoria de acceso aleatorio (RAM). Otras realizaciones descritas aquí se refieren a un producto de programa informático, que puede incluir, por ejemplo, las instrucciones y/o el código informático analizados aquí.
Si bien diversas realizaciones de la FIG. 3A se han descrito anteriormente, debe entenderse que se han presentado a modo de ejemplo únicamente y no de limitación. Cuando los métodos y pasos descritos anteriormente indican ciertos eventos que ocurren en cierto orden, el orden de ciertas etapas puede modificarse. Además, algunas de las etapas pueden realizarse simultáneamente en un proceso paralelo cuando sea posible, así como realizarse secuencialmente como se describe anteriormente. Aunque se ha descrito que diversas realizaciones tienen características y/o combinaciones de componentes particulares, son posibles otras realizaciones que tengan cualquier combinación o subcombinación de cualesquiera características y/o componentes de cualquiera de las realizaciones descritas aquí. Además, aunque se describe que diversas realizaciones tienen una entidad particular asociada con un dispositivo informático particular, en otras realizaciones se pueden asociar diferentes entidades con otros y/o diferentes dispositivos informáticos.
DATOS EXPERIMENTALES Y EJEMPLOS
La presente descripción inventiva se ilustra adicionalmente con referencia a los siguientes datos experimentales y ejemplos.
Ejemplo 1
Se hace referencia a las etapas proporcionadas en la FIG. 2.
2000: Se cortan células de una muestra de rumen de vaca de la matriz. Esto se puede hacer mezclando o mezclando la muestra vigorosamente mediante sonicación o agitación vorticial, seguido de centrifugación diferencial para eliminar la matriz de las células. La centrifugación puede incluir una etapa de centrifugación en gradiente usando Nycodenz o Percoll.
2001: Los organismos se tiñen con tintes fluorescentes que se dirigen a tipos de organismos específicos. La citometría de flujo se usa para discriminar diferentes poblaciones según las propiedades de tinción y el tamaño.
2002: El número absoluto de organismos en la muestra se determina, por ejemplo, mediante citometría de flujo. Esta etapa proporciona información sobre cuántos tipos de organismos (tales como bacterias, arqueas, hongos, virus o protistas) hay en un volumen determinado.
2003: Se obtiene una muestra de rumen de vaca, y las células adheridas a la matriz se lisan directamente mediante batido de perlas. Los ácidos nucleicos totales se purifican. Los ácidos nucleicos purificados totales se tratan con ARNasa para obtener ADN genómico purificado (ADNg). La qPCR se usa para amplificar simultáneamente marcadores específicos del ADNg masivo y para conectar adaptadores de secuenciación y códigos de barras a cada marcador. La reacción de qPCR se detiene al comienzo de la amplificación exponencial para minimizar el sesgo relacionado con la PCR. Las muestras se agrupan y se realiza una secuenciación multiplexada en las muestras agrupadas usando un Illumina Miseq.
2004: Las células de una muestra de rumen de vaca adheridas a la matriz se lisan directamente mediante batido de perlas. Los ácidos nucleicos totales se purifican mediante un método basado en columnas. Los ácidos nucleicos purificados totales se tratan con ADNasa para obtener ARN purificado. El ARN total se convierte en ADNc mediante transcriptasa inversa. La qPCR se usa para amplificar simultáneamente marcadores específicos del ADNc masivo y para conectar adaptadores de secuenciación y códigos de barras a cada marcador. La reacción de qPCR se detiene al comienzo de la amplificación exponencial para minimizar el sesgo relacionado con la PCR. Las muestras se agrupan y se realiza una secuenciación multiplexada en las muestras agrupadas usando un Illumina Miseq.
2005: La salida de secuenciación (archivos fastq) se procesa eliminando pares de bases de baja calidad y lecturas truncadas. Los conjuntos de datos basados en ADN se analizan mediante un proceso UPARSE personalizado, y las lecturas de secuenciación se comparan con las entradas de la base de datos existentes para identificar cepas dentro de la población. Se añaden secuencias únicas a la base de datos. Los conjuntos de datos basados en ARN se analizan mediante un proceso UPARSE personalizado. Las cepas activas se identifican mediante una base de datos actualizada.
2006: Utilizando los datos de identidad de cepas obtenidos en la etapa anterior (2005), se determina el número de lecturas que representan cada cepa, y se representa como un porcentaje del total de lecturas. El porcentaje se multiplica por el recuento de células (2002) para calcular el recuento de células absoluto de cada tipo de organismo en una muestra y un volumen determinado. Las cepas activas se identifican dentro de conjuntos de datos de recuento de células absoluto usando las secuencias marcadoras presentes en los conjuntos de datos basados en ARN junto con un umbral apropiado. Las cepas que no alcanzan el umbral se eliminan del análisis.
2007: Repetir 2003-2006 para establecer cursos de tiempo que representen la dinámica de las poblaciones microbianas dentro de múltiples rúmenes de vacas. Compile datos temporales y almacene el número de células de cada cepa de organismo activo y metadatos para cada muestra en una matriz de cantidad o abundancia. Use una matriz cuantitativa para identificar asociaciones entre cepas activas en una muestra de un momento específico usando enfoques de exploración de reglas ponderados con datos cuantitativos. Aplique filtros para eliminar reglas insignificantes.
2008: Calcule los cambios en el número de células de las cepas activas a lo largo del tiempo, observando la direccionalidad del cambio (es decir, los valores negativos denotan disminuciones, los valores positivos denotan aumentos). Represente la matriz como una red, con las cepas de organismos representando nodos, y las reglas ponderadas por cantidad representando bordes. Aproveche las cadenas de Markov y los paseos aleatorios para determinar la conectividad entre nodos y definir clústeres. Filtre grupos usando metadatos para identificar grupos asociados con metadatos deseables (parámetros ambientales). Clasifique las cepas de organismos diana integrando los cambios en el número de células a lo largo del tiempo y las cepas presentes en los grupos diana, siendo los cambios más altos en el número de células los más altos.
Ejemplo 2
Diseño experimental y materiales y métodos.
Objetivo:Determinar los constituyentes de la comunidad microbiana del rumen que impactan la producción de grasa láctea en vacas lecheras.
Animales:Ocho vacas Holstein lactantes, canuladas ruminalmente, se alojaron en establos individuales para uso en el experimento. Las vacas eran alimentadas dos veces al día, ordeñadas dos veces al día, y tenían acceso continuo a agua dulce. Una vaca (vaca 1) fue retirada del estudio después de la primera Depresión de Grasa Láctea en la dieta debido a complicaciones derivadas de un aborto antes del experimento.
Diseño y tratamiento experimental:El experimento usó un diseño cruzado con 2 grupos y 1 período experimental. El período experimental duró 38 días: 10 días para el período de covariable/lavado y 28 días para la recopilación de datos y el muestreo. El período de recopilación de datos consistió en 10 días de Depresión de Grasa Láctea (MFD) en la dieta y 18 días de recuperación. Después del primer período experimental, todas las vacas se sometieron a un período de reposo farmacológico de 10 días antes del comienzo del período 2.
La MFD dietética se indujo con una ración mixta total (TMR) baja en fibra (29 % NDF) con alta degradabilidad del almidón (70 % degradable) y altos niveles de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA, 3,7 %). La fase de Recuperación incluyó dos dietas variables en la degradabilidad del almidón. Cuatro vacas se asignaron aleatoriamente a una dieta de recuperación alta en fibra (37 % FND), baja en PUFA (2,6 %) y alta en degradabilidad del almidón (70 % degradable). Las cuatro vacas restantes se alimentaron con una dieta de recuperación rica en fibra (37 % FDN), baja en PUFA (2,6 %), pero baja en degradabilidad del almidón (35 %).
Durante los períodos de covariable de 10 días y de reposo farmacológico de 10 días, las vacas se alimentaron con una dieta alta en fibra, baja en PUFA y baja degradabilidad del almidón.
Muestras y Medidas:La producción de leche, el consumo de materia seca y la eficiencia alimenticia se midieron diariamente para cada animal durante los períodos de covariable, de reposo y de recolección de muestras. Se midieron muestras de TMR para determinar la composición de nutrientes. Durante el período de recolección, se recolectaron y analizaron muestras de leche cada 3 días. Las muestras se analizaron para determinar las concentraciones de los componentes de la leche (grasa de la leche, proteína de la leche, lactosa, nitrógeno ureico de la leche, recuentos de células somáticas, y sólidos) y composiciones de ácidos grasos.
Se recolectaron y analizaron muestras de rumen para determinar la composición y actividad de la comunidad microbiana cada 3 días durante el período de recolección. Se tomaron muestras intensivas del rumen 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 horas después de la alimentación durante los días 0, 7 y 10 de la MFD en la dieta. De manera similar, se tomaron muestras intensivas del rumen 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 y 22 horas después de la alimentación los días 16 y 28 durante el período de recuperación. Los contenidos ruminales se analizaron para determinar el pH, la concentración de acetato, la concentración de butirato, la concentración de propionato, la concentración de isoácidos, y las concentraciones de isómeros de CLA y de cadena larga.
Preparación y secuenciación de muestras de rumen:Después de la recolección, las muestras de rumen se centrifugaron a 4000 rpm en una centrífuga de cubeta oscilante durante 20 minutos a 4°C. El sobrenadante se decantó, y se añadió una alícuota de cada muestra de contenido de rumen (1 -2 mg) a un tubo estéril de 1,7 ml prellenado con perlas de vidrio de 0,1 mm. Se recogió una segunda alícuota, y se almacenó en un tubo vacío y estéril de 1,7 ml para el recuento celular.
Se homogeneizaron muestras de rumen con perlas de vidrio (1a alícuota), batiendo las perlas para lisar los microorganismos. El ADN y el ARN se extrajeron y purificaron de cada muestra, y se prepararon para la secuenciación en un Illumina Miseq. Las muestras se secuenciaron mediante química de extremos pares, con 300 pares de bases secuenciados en cada extremo de la biblioteca. Se tiñeron muestras de rumen en tubos vacíos (2a alícuota), y se sometieron a un citómetro de flujo para cuantificar el número de células de cada tipo de microorganismo en cada muestra.
Secuenciación, procesamiento de lectura y análisis de datos:Las lecturas de secuenciación se recortaron y procesaron con calidad para identificar especies bacterianas presentes en el rumen en función de un gen marcador. Se integraron conjuntos de datos de recuento y de actividad con las lecturas de secuenciación para determinar el número absoluto de células de especies microbianas activas dentro de la comunidad microbiana del rumen. Las características de producción de la vaca a lo largo del tiempo, incluidas las libras de leche producidas, se vincularon con la distribución de microorganismos activos dentro de cada muestra durante el transcurso del experimento usando información mutua. Los puntajes del coeficiente de informaciones máximas (MIC) se calcularon entre las libras de grasa láctea producidas y el recuento de células absoluto de cada microorganismo activo. Los microorganismos se clasificaron según su puntuación MIC, y los microorganismos con las puntuaciones MIC más altas se seleccionaron como las especies diana más relevantes para las libras de leche producidas.
Los casos de prueba para determinar el impacto de los datos de recuento, los datos de actividad y el recuento y la actividad en el resultado final se ejecutaron omitiendo los conjuntos de datos apropiados del análisis de secuenciación. Para evaluar el impacto del uso de una correlación lineal en lugar de la MIC en la selección de dianas, también se calcularon los coeficientes de Pearson para las libras de grasa láctea producidas en comparación con la abundancia relativa de todos los microorganismos y el recuento de células absoluto de los microorganismos activos.
Resultados y discusión
Abundancias relativas frente a recuentos de células absolutos
Las 15 especies diana principales se identificaron para el conjunto de datos que incluía datos de recuento de células (recuento de células absoluto, Tabla 2) y para el conjunto de datos que no incluía datos de recuento de células (abundancia relativa, Tabla 1) según las puntuaciones de MIC. Los datos de actividad no se usaron en este análisis, para aislar el efecto de los datos del recuento de células en la selección final de las dianas. Al final, las 8 dianas principales fueron las mismas en los dos conjuntos de datos. De las 7 restantes, 5 cepas estaban presentes en ambas listas en diferente orden. A pesar de las diferencias en la clasificación de estas cinco cepas, la puntuación MIC calculada para cada cepa fue idéntica en las dos listas. Las dos cepas presentes en la lista de recuento de células absoluto pero no en la lista de abundancia relativa, ascus_111 y ascus_288, ocuparon el puesto 91 y el puesto 16, respectivamente, en la lista de abundancia relativa. Las dos cepas presentes en la lista de abundancia relativa pero no en la lista de recuento de células absoluto, ascus_102 y ascus_252, ocuparon el puesto 50 y el puesto 19, respectivamente, en la lista de recuento de células absoluto. Estas cuatro cepas tenían puntuaciones MIC diferentes en cada lista, lo que explica su cambio de clasificación y el impacto posterior en las otras cepas de la lista.
Tabla 1: Las 15 principales cepas diana que usan abundancia relativa sin filtro de actividad
Tabla 2: Las 15 principales cepas diana que usan el recuento de células absoluto sin filtro de actividad
La integración de los datos del recuento celular no siempre afectó la puntuación MIC final asignada a cada cepa. Esto puede atribuirse al hecho de que, aunque la población microbiana cambió dentro del rumen diariamente y durante el transcurso del experimento de 38 días, siempre estuvo dentro de 107-108 células por mililitro. Sin duda, cambios mucho mayores en las cifras de población tendrían un impacto más amplio en los puntajes finales de los MIC.
Especies inactivas frente a especies activas
Para evaluar el impacto del filtrado de cepas en función de los datos de actividad, se identificaron especies diana a partir de un conjunto de datos que aprovechó la abundancia relativa con (Tabla 3) y sin (Tabla 1) datos de actividad, así como un conjunto de datos que aprovechó los recuentos de células absolutos con (Tabla 4) y sin datos de actividad (Tabla 2).
Para el caso de abundancia relativa, ascus_126, ascus_1366, ascus_1780, ascus_299, ascus_1139, ascus_127, ascus_341 y ascus_252 se consideraron cepas diana antes de aplicar los datos de actividad. Estas ocho cepas (53 % de las 15 dianas principales iniciales) cayeron por debajo del puesto 15 después de integrar los datos de actividad. Se observó una tendencia similar para el caso del recuento de células absoluto. Ascus_126, ascus_1366, ascus_1780, ascus_299, ascus_1139, ascus_127 y ascus_341 (46 % de las 15 dianas principales iniciales) cayeron por debajo del intervalo 15 después de la integración del conjunto de datos de actividad.
Los conjuntos de datos de actividad tuvieron un efecto mucho más severo en la clasificación y selección de dianas que los conjuntos de datos de recuento de células. Al integrar estos conjuntos de datos, si se descubre que una muestra está inactiva, esencialmente se cambia a "0" y no se considera parte del análisis. Debido a esto, la distribución de puntos dentro de una muestra puede verse muy alterada o sesgada después de la integración, lo que a su vez afecta en gran medida la puntuación MIC final y, por lo tanto, el orden de clasificación de los microorganismos diana.
Tabla 3: Las 15 principales cepas diana que usan abundancia relativa con filtro de actividad
Tabla 4: Las 15 principales cepas diana que usan el recuento de células absoluto con filtro de actividad
Abundancias relativas e inactivos frente a recuentos de células absolutos y activos
En última instancia, el método definido aquí aprovecha tanto los datos de recuento de células como los de actividad para identificar microorganismos altamente vinculados a características de metadatos relevantes. Dentro de las 15 dianas principales seleccionadas mediante ambos métodos (Tabla 4, Tabla 1), sólo se encontraron 7 cepas en ambas listas. Ocho cepas (53 %) fueron exclusivas del recuento de células absoluto y la lista de actividad. Las 3 dianas principales en ambas listas coincidieron tanto en cepa como en intervalo. Sin embargo, dos de las tres no tuvieron el mismo puntaje MIC en ambas listas, lo que sugiere que fueron influidas por la integración del conjunto de datos de actividad, pero no lo suficiente como para alterar su orden de clasificación.
Correlaciones lineales frente a enfoques no paramétricos
Los coeficientes de Pearson y las puntuaciones de MIC se calcularon entre las libras de grasa láctea producidas y el recuento de células absoluto de microorganismos activos dentro de cada muestra (Tabla 5). Las cepas se clasificaron según MIC (Tabla 5a) o coeficiente de Pearson (Tabla 5b) para seleccionar las cepas dianas más relevantes para la producción de grasa láctea. En cada caso, se informa tanto la puntuación MIC como el coeficiente de Pearson. Se encontraron seis cepas en ambas listas, lo que significa que se identificaron nueve (60 %) cepas únicas mediante el enfoque MIC. El orden de clasificación de las cepas entre las listas no coincidía: las 3 principales cepas diana identificadas por cada método también eran únicas.
Al igual que los coeficientes de Pearson, la puntuación MIC se informa en un intervalo de 0 a 1, en el que 1 sugiere una relación muy estrecha entre las dos variables. Aquí, las 15 dianas principales exhibieron puntuaciones de MIC que oscilaron entre 0,97 y 0,74. Sin embargo, los coeficientes de Pearson para el caso de prueba de correlación oscilaron entre 0,53 y 0,45, sustancialmente más bajos que el caso de prueba de información mutua. Esta discrepancia puede deberse a las diferencias inherentes a cada método de análisis. Si bien las correlaciones son una estimación lineal que mide la dispersión de puntos alrededor de una línea, la información mutua aprovecha las distribuciones de probabilidad y mide la similitud entre dos distribuciones. Durante el transcurso del experimento, las libras de grasa láctea producidas cambiaron de forma no lineal (FIG. 4). Esta función particular puede representarse y aproximarse mejor mediante información mutua que mediante correlaciones. Para investigar esto, se representaron gráficamente las principales cepas diana identificadas mediante correlación e información mutua, Ascus_713 (Fig. 5) y Ascus_7 (Fig. 6), respectivamente, para determinar qué tan bien cada método predijo las relaciones entre las cepas y la grasa de la leche. Si dos variables muestran una fuerte correlación, se representan mediante una línea con poca o ninguna dispersión de puntos cuando se comparan entre sí. En la Fig. 5, Ascus_713 se correlaciona débilmente con la grasa láctea, como lo indica la amplia distribución de puntos. La información mutua, nuevamente, mide qué tan similares son dos distribuciones de puntos. Cuando se representa Ascus_7 con grasa láctea (Fig. 6), es evidente que las dos distribuciones de puntos son muy similares.
El presente método en su totalidad frente a enfoques convencionales
El enfoque convencional de analizar comunidades microbianas se basa en el uso de datos de abundancia relativa sin incorporación de información de actividad, y en última instancia termina con una simple correlación de especies microbianas con metadatos (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n° 9.206.680). Aquí, hemos mostrado cómo la incorporación de cada conjunto de datos influye incrementalmente en la lista final de dianas. Cuando se aplicó en su totalidad, el método descrito aquí seleccionó un conjunto de dianas completamente diferente en comparación con el método convencional (Tablas 5a y 5c). Ascus_3038, la cepa diana principal seleccionada mediante el enfoque convencional, se representó gráficamente frente a la grasa de la leche, para visualizar la fuerza de la correlación (Fig. 7). Al igual que el ejemplo anterior, Ascus_3038 también mostró una correlación débil con la grasa láctea.
Tabla 5: Las 15 principales cepas diana que usan información mutua o correlaciones
Tabla 5a. MIC usando recuento de células absoluto con filtro de actividad
Tabla 5b. Correlación usando el recuento de células absoluto con filtro de actividad
Tabla 5c. Correlación usando abundancia relativa sin filtro de actividad
Ejemplo 3
Aumento de la grasa láctea total, la proteína láctea y la leche con corrección energética (ECM) en vacas
El Ejemplo 3 muestra una implementación específica con el objetivo de aumentar la cantidad total de grasa láctea y proteína láctea producida por un rumiante lactante, y la ECM calculada. Como se usa aquí, ECM representa la cantidad de energía en la leche en función del volumen de leche, la grasa de la leche y la proteína de la leche. ECM ajusta los componentes de la leche a 3,5 % de grasa y 3,2 % de proteína, igualando así el rendimiento animal y permitiendo comparar la producción a nivel individual del animal y del rebaño a lo largo del tiempo. Una ecuación usada para calcular la ECM, en relación con la presente descripción, es:
ECM = (0,327 x libras de leche) (12,95 x libras de grasa) (7,2 x libras de proteína)
La aplicación de las metodologías presentadas aquí, que usan los métodos descritos para identificar microbios/cepas de microbios interrelacionados activos y generar conjuntos microbianos a partir de ellos, demuestra un aumento en la cantidad total de grasa láctea y proteína láctea producida por un rumiante lactante. Estos aumentos se realizaron sin necesidad de añadir hormonas adicionales.
En este ejemplo, se administró un conjunto microbiano que comprende dos microbios aislados, Ascusb_X y Ascusf_Y, identificados y generados según la descripción anterior, a vacas Holstein en etapa media de lactancia durante un período de cinco semanas. Las vacas se asignaron aleatoriamente en 2 grupos de 8, en los que uno de los grupos era un grupo de control que recibió un amortiguador que carecía de conjunto microbiano. Al segundo grupo, el grupo experimental, se le administró un conjunto microbiano compuesto por Ascusb_X y Ascusf_Y una vez al día durante cinco semanas. Cada una de las vacas se alojó en establos individuales, y se les dio libre acceso a alimento y agua. La dieta fue una dieta de alto rendimiento lácteo. Las vacas se alimentaron ad libitum, y el alimento se pesó al final del día, y los rechazos del día anterior se pesaron y descartaron. El pesaje se realizó con una báscula PS-2000 de Salter Brecknell (Fairmont, MN).
Las vacas se canularon de manera que una cánula se extendiera hasta el rumen de las vacas. Además, a las vacas se les proporcionó al menos 10 días de recuperación después de la canulación antes de administrar dosis de control o dosis experimentales.
La administración al grupo de control consistió en 20 ml de disolución salina amortiguada neutra, mientras que la administración al grupo experimental consistió en aproximadamente 109 células suspendidas en 20 ml de disolución salina amortiguada neutra. El grupo de control recibió 20 ml de disolución salina una vez al día, mientras que el grupo experimental recibió 20 ml de disolución salina que comprendía además 109 células microbianas del conjunto microbiano descrito.
Se tomaron muestras del rumen de cada vaca los días 0, 7, 14, 21 y 35, en el que el día 0 fue el día anterior a la administración microbiana. Tenga en cuenta que las administraciones experimental y de control se realizaron después de que se tomó la muestra del rumen ese día. Se insertó un muestreo diario del rumen, comenzando el día 0, con un medidor de pH de Hanna Instruments (Woonsocket, RI) en el fluido del rumen recolectado, para realizar registros. El muestreo del rumen incluyó muestreo de partículas y fluidos de las regiones central, dorsal, ventral, anterior y posterior del rumen a través de la cánula, y las cinco muestras se agruparon en viales cónicos de 15 ml que contenían 1,5 ml de disolución de parada (95 % de etanol, 5 % de fenol). También se recogió una muestra fecal cada día de muestreo, en la que las heces se recogieron del recto con el uso de una manga de palpación. Las vacas se pesaron en el momento de cada muestreo.
Las muestras fecales se colocaron en un vial de 2 onzas, se almacenaron congeladas, y se analizaron para determinar los valores de digestibilidad aparente de fibras detergentes neutras (NDF), digestibilidad aparente de almidón, y digestibilidad aparente de proteínas. El muestreo del rumen consistió en tomar muestras de porciones de líquido y partículas del rumen, cada una de las cuales se almacenó en un tubo cónico de 15 ml. Las células se fijaron con una disolución de parada al 10 % (mezcla de 5 % de fenol/95 % de etanol), y se mantuvieron a 4°C y se enviaron a Ascus Biosciences (San Diego, California) en hielo.
La producción de leche se midió dos veces al día, una por la mañana y otra por la noche. La composición de la leche (% de grasas y % de proteínas, etc.) se midió dos veces al día, una vez por la mañana y otra por la noche. Las muestras de leche se analizaron adicionalmente con espectroscopia de infrarrojo cercano para grasas proteicas, sólidos, análisis de nitrógeno ureico en leche (MUN), y recuentos de células somáticas (SCC) en la Tulare Dairy Herd Improvement Association (DHIA) (Tulare, California). El consumo de alimento de cada vaca y el pH del rumen se determinaron una vez al día.
Se recogió una muestra de la ración mixta total (RTM) el último día del período de adaptación, y después se recogió sucesivamente una vez por semana. El muestreo se realizó con el método de despiece, en el que las muestras se almacenaron en bolsas selladas al vacío que se enviaron a Cumberland Valley Analytical Services (Hagerstown, MD) y se analizaron con el paquete NIR1. El último día de administración del amortiguador y/o bioconjunto microbiano fue el día 35; sin embargo, todas las demás medidas y muéstreos continuaron como se describe hasta el día 46.
La FIG. 8A demuestra que las vacas que recibieron el conjunto microbiano según los métodos descritos exhibieron un aumento del 20,9 % en la producción promedio de grasa láctea en comparación con las vacas a las que se les administró la disolución amortiguada sola. La FIG. 8B demuestra que las vacas a las que se les administró el conjunto microbiano exhibieron un aumento del 20,7% en la producción promedio de proteína de la leche en comparación con las vacas a las que se les administró la disolución amortiguada sola. La FIG. 8C demuestra que las vacas a las que se les administró el conjunto microbiano exhibieron un aumento del 19,4% en la producción promedio de leche con corrección energética. Los aumentos vistos en la FIG. 8A-C se volvió menos pronunciado después de que cesó la administración del conjunto, como lo muestra la línea vertical que cruza los puntos de datos.
Ejemplo 4
Detección de Clostridium perfringens como agente causal de formación de lesiones en pollos de engorde
160 machos Cobb 500 se expusieron a diversos niveles deClostridium perfringens(Tabla 6a). Se criaron durante 21 días, se sacrificaron, y se puntuaron las lesiones para cuantificar la progresión de la enteritis necrótica y el impacto deC. perfringens.
Tabla 6a
Diseño experimental
Las aves se alojaron dentro de una instalación ambientalmente controlada en corrales con piso de madera (~ 4' x 4', menos 2,25 pies cuadrados para el espacio del comedero), proporcionando espacio de piso y densidad de aves de [~0.69 pies2/ave], temperatura, iluminación, comedero y agua. Las aves se colocaron en corrales limpios que contenían una profundidad adecuada de virutas de madera para proporcionar un ambiente cómodo para los polluelos. Se añadieron virutas adicionales a los corrales si se humedecían demasiado, para que las condiciones de las aves de prueba fueran cómodas durante el estudio. La iluminación se realizó mediante luces incandescentes, y se usó un programa de iluminación comercial de la siguiente manera.
Tabla 6b
Las condiciones ambientales para las aves (es decir, densidad de aves, temperatura, iluminación, comedero y espacio para el agua) fueron similares para todos los grupos de tratamiento. Para evitar la migración de aves y la propagación bacteriana de un corral a otro, cada corral tenía un divisor sólido (plástico) de aproximadamente 24 pulgadas de altura entre los corrales.
Vacunas y Medicación Terapéutica:
Las aves fueron vacunadas para Mareks en el criadero. Al recibirlas (día de estudio 0), las aves fueron vacunadas contra Newcastle y Bronquitis Infecciosa mediante aplicación por aspersión. Con el informe final se proporcionó la documentación del fabricante de la vacuna, el número de lote y la fecha de vencimiento.
Agua:
El agua se proporcionó ad libitum durante todo el estudio a través de un bebedero Plasson por corral. Los bebederos se revisaron dos veces al día, y se limpiaron según fuera necesario para asegurar un suministro de agua limpia y constante a las aves.
Alimentación:
La alimentación se proporcionó ad libitum durante todo el estudio a través de un alimentador de tubo colgante de ~17 pulgadas de diámetro por corral. Se colocó una bandeja de alimentación para pollitos en cada corral durante aproximadamente los primeros 4 días. Las aves se colocaron en sus respectivas dietas de tratamiento al recibirlas (día 0) de acuerdo con el Diseño Experimental. Se pesó y registró el alimento añadido y retirado de los corrales desde el día 0 hasta el final del estudio.
Observaciones diarias:
Las instalaciones de prueba, los corrales y las aves se observaron al menos dos veces al día para determinar el estado general de la bandada, la iluminación, el agua, el alimento, la ventilación y los eventos imprevistos. Si se observaron condiciones anormales o comportamiento anormal en cualquiera de las observaciones dos veces al día, se documentaron, y la documentación se incluyó en los registros del estudio. Las temperaturas mínimas y máximas de las instalaciones de prueba se registraron una vez al día.
Tarjetas de corrales:
Había 2 tarjetas adheridas a cada corral. Una tarjeta identificaba el número de corral, y la segunda el número de tratamiento.
Manipulación de animales:
Los animales se mantuvieron en condiciones ideales para su habitabilidad. Los animales se manipularon de tal manera que se redujeran las lesiones y el estrés innecesario. Se aplicaron estrictamente medidas humanas.
Atención Veterinaria, Intervención y Eutanasia:
Las aves que desarrollaron enfermedades concurrentes clínicamente significativas no relacionadas con los procedimientos de prueba fueron, a discreción del investigador del estudio o una persona designada, retiradas del estudio y sacrificadas de acuerdo con los SOP del sitio. Además, las aves moribundas o heridas también fueron sacrificadas por autorización de un veterinario del sitio o un técnico calificado. Se documentaron los motivos de cualquier retirada. Si un animal moría, o era retirado y sacrificado por razones humanitarias, se registraba en la hoja de mortalidad del corral, y se realizaba y archivaba la necropsia para documentar el motivo de la retirada.
Si el investigador del estudio consideraba necesaria la eutanasia, los animales eran sacrificados mediante dislocación cervical.
Mortalidad y sacrificios:
A partir del día 0 del estudio, cualquier ave encontrada muerta o retirada y sacrificada se pesó y se sometió a necropsia. Las aves sacrificadas que no pudieron alcanzar el alimento o el agua se sacrificaron, se pesaron y se documentaron. El peso y la causa probable de la muerte y los hallazgos de la necropsia se registraron en el registro de mortalidad del corral.
Pesos corporales e ingesta de alimento:
Las aves se pesaron, por corral e individualmente, aproximadamente los días 14 y 21. El alimento restante en cada corral se pesó y se registró los días 14 y 21 del estudio. Se calculó el consumo de alimento durante los días 14-21.
Aumento de peso y conversión alimenticia:
Se resumió el peso promedio de las aves, por corral e individualmente, en cada día de pesaje. La conversión alimenticia promedio se calculó el día 21 del estudio (es decir, los días 0-21) usando el consumo total de alimento del corral dividido entre el peso total de las aves supervivientes. La conversión alimenticia ajustada se calculó usando el consumo total de alimento en un corral dividido entre el peso total de las aves supervivientes y el peso de las aves que murieron o fueron retiradas de ese corral.
EXPOSICIÓN A CLOSTRIDIO PERFRINGENS
Método de administración:
Los cultivos deClostridium perfringens(toxinas CL-15, tipo A, a y p2) en este estudio se administraron a través del alimento. Se usó alimento del comedero de cada corral para mezclar con el cultivo. Antes de colocar los cultivos en los corrales, se retiró el alimento de tratamiento de las aves durante aproximadamente 4 - 8 horas. Para cada corral de aves, se mezcló una cantidad fija basada en el diseño del estudio del caldo de cultivo a una concentración de aproximadamente 2,0 - 9,0 X108 ufc/ml con una cantidad fija de alimento (~25 g/ave) en la bandeja del comedero, y todos los corrales expuestos se trataron de la misma manera. La mayor parte del alimento del cultivo se consumió en 1 a 2 horas. Para que las aves en todos los tratamientos reciban un trato similar, a los grupos no expuestos también se les retiró el alimento durante el mismo período de tiempo que a los grupos expuestos.
Exposición a Clostridium:
El cultivo deClostridium perfringens(CL-15) se cultivó ~5 horas a ~37°C en medio tioglicolato fluido que contenía almidón. CL-15 es una cepa de campo deClostridium perfringensprocedente de un brote de pollos de engorde en Colorado. Se preparó y usó un cultivo de caldo reciente cada día. Para cada corral de aves, una cantidad fija del caldo de cultivo nocturno se mezcló con una cantidad fija de alimento de tratamiento en la bandeja del comedero (véase administración). La cantidad de alimento, el volumen y la cuantificación del inóculo del cultivo, y el número de días de dosificación se documentaron en el informe final, y todos los corrales recibirán el mismo tratamiento. Las aves recibieron el cultivo deC. perfringensdurante un día (día de estudio 17).
DATOS RECOLECTADOS:
- Contenido intestinal para análisis con los métodos de la plataforma Ascus según descripción.
- Pesos de las aves, por corral e individualmente, y eficiencia alimenticia, por corral, aproximadamente en los días 14 y 21.
- Cantidades de alimento añadidas y retiradas de cada corral desde el día 0 hasta el final del estudio.
- Mortalidad: sexo, peso y causa probable de muerte desde el día 0 hasta el final del estudio.
- Aves eliminadas: motivo del sacrificio, sexo y peso día 0 al final del estudio.
- Observación diaria de instalaciones y aves, temperatura diaria de instalaciones.
- Puntuación de la lesión 5 aves/corral en aproximadamente el día 21
Puntuación de la lesión:
Cuatro días después de la última administración del cultivo deC. perfringens, se seleccionaron al azar cinco aves de cada corral según se capturaban primero, se sacrificaron, y se puntuaron las lesiones intestinales para detectar enteritis necrótica. Las lesiones se clasificaron de la siguiente manera:
- 0 = normal: sin lesiones NE, el intestino delgado tiene una elasticidad normal (vuelve a su posición normal después de abrirse)
- 1 = leve: la pared del intestino delgado es delgada y flácida (permanece plana cuando se abre, y no vuelve a su posición normal después de abrirse); exceso de moco que cubre la membrana mucosa
- 2 =moderado: enrojecimiento e hinchazón notables de la pared intestinal; ulceración menor y necrosis de la membrana intestinal; exceso de moco
- 3 = grave: área o áreas extensas de necrosis y ulceración de la membrana del intestino delgado;
hemorragia significativa; capa de fibrina y restos necróticos en la membrana mucosa (aspecto de toalla turca)
- 4 =muerto o moribundo: ave que probablemente moriría dentro de las 24 horas y tiene una puntuación de lesión NE de 2 o más
RESULTADOS
Los resultados se analizaron usando los métodos descritos anteriormente (por ejemplo, como se analiza con referencia a las FIGs. 1A, 1B y 2, así como en toda la memoria descriptiva), así como el enfoque de correlación convencional (como se analizó anteriormente). Se determinó la abundancia y actividad microbiana a nivel de cepa para el contenido del intestino delgado de cada ave, y estos perfiles se analizaron con respecto a dos características diferentes de las aves: puntuación de lesión individual y puntuación de lesión promedio del corral.
Se utilizaron 37 aves en el análisis de puntuación de lesiones individuales; aunque se puntuaron 40 aves, sólo 37 tenían suficiente material intestinal para el análisis. Se usaron las mismas lecturas de secuenciación y el mismo procedimiento de análisis de secuenciación tanto para el enfoque Ascus de la descripción como para el enfoque convencional. Sin embargo, el enfoque de Ascus también integró información de actividad, así como información de recuento de células para cada muestra, como se detalló anteriormente.
Se usó el enfoque de información mutua de Ascus para calificar las relaciones entre la abundancia de las cepas activas y las puntuaciones de lesiones individuales de los 37 pollos de engorde. Se calcularon correlaciones de Pearson entre las cepas y las puntuaciones de lesiones individuales de los 37 pollos de engorde para el enfoque convencional. La cepa causante,C. perfringens,se confirmó mediante una búsqueda de alineación global con la lista de organismos identificados en el conjunto de muestras. El intervalo de esta cepa específica se identificó entonces en el resultado de cada método de análisis. El enfoque de Ascus identificó laC. perfringensadministrada en el experimento como la cepa número uno relacionada con la puntuación de lesión individual. El enfoque convencional identificó esta cepa como la 26a cepa más alta relacionada con la puntuación de lesión individual.
Se utilizaron 102 aves en el análisis de puntuación de lesión promedio. Como en el caso anterior, se usaron las mismas lecturas de secuenciación y el mismo procedimiento de análisis de secuenciación tanto para el enfoque Ascus como para el enfoque convencional. Nuevamente, el enfoque de Ascus también integró información de actividad, así como información de recuento de células para cada muestra.
Se usó el enfoque de información mutua de Ascus para calificar las relaciones entre la abundancia de las cepas activas y la puntuación promedio de lesión de cada corral. Se calcularon correlaciones de Pearson entre las cepas y la puntuación de lesión promedio de cada corral para el enfoque convencional. La cepa causante,C. perfringens,se confirmó mediante una búsqueda de alineación global con la lista de organismos identificados en el conjunto de muestras. El intervalo de esta cepa específica se identificó entonces en el resultado de cada método de análisis. El enfoque de Ascus identificó laC. perfringensadministrada en el experimento como la cuarta cepa más alta relacionada con la puntuación promedio de lesión del corral. El enfoque convencional identificó aC. perfringenscomo la decimoquinta cepa más relacionada con la puntuación promedio de lesión del corral. La puntuación de lesión promedio del corral es una medida menos precisa que la puntuación de lesión individual debido a que los niveles variables de infección porC. perfringensquedan enmascarados por la medida global/promedio. Se esperaba una caída en la clasificación al comparar el análisis de puntuación de lesiones individuales con el análisis de puntuación de lesiones promedio en corrales. Los metadatos recopilados se proporcionan a continuación.
Tabla 7
Ejemplo 5
Capacidad para detectar relaciones en comunidades microbianas complejas usando un enfoque basado en información mutua en comparación con un enfoque basado en correlación
Se recogió una serie de muestras de rumen de tres vacas Holstein en mitad de la lactancia mediante una cánula durante un episodio de depresión de la grasa láctea. Las muestras de rumen se recolectaron a las 4 a.m. los días 0, 7, 10, 16 y 28. Se prepararon bibliotecas de secuenciación a partir de ADN purificado del contenido del rumen, y se secuenciaron.
Se usaron lecturas de secuenciación sin procesar para identificar todas las cepas microbianas presentes en el conjunto de muestras: se identificaron 4729 cepas únicas en el conjunto de muestras. Después se calculó la abundancia relativa de cada cepa microbiana y se usó para análisis posteriores.
Tabla 8a
Las libras medidas de grasa láctea producidas por cada animal en cada momento se dan en la Tabla 8a. Se creó una cepa simulada para usar en este análisis tomando los valores de grasa de la leche y restando 1 para garantizar que la cepa simulada y los valores de grasa de la leche tengan una tendencia idéntica a lo largo del tiempo, es decir, existe una tendencia/relación lineal conocida entre la cepa simulada y los valores de grasa láctea. Después, esta cepa simulada se añadió a la matriz de todas las cepas identificadas previamente en la comunidad. Los valores de MIC y los coeficientes de Pearson se calcularon simultáneamente entre las libras de grasa láctea producidas y todas las cepas dentro de la matriz para diversas condiciones (descritas a continuación) para establecer la sensibilidad y solidez de estas medidas como predictores de relaciones.
Para probar la capacidad de los métodos inventivos descritos para detectar relaciones relativas a los métodos tradicionales, los puntos de datos para la cepa simulada se eliminaron uno por uno (la abundancia relativa se estableció en 0). El MIC y el coeficiente de Pearson se volvieron a calcular después de eliminar cada punto de datos, y se registró el intervalo de la cepa simulada (Tabla 8b). Como puede verse, el MIC fue una medida mucho más sólida que el coeficiente de Pearson. Ambos métodos pudieron identificar la cepa simulada como la cepa número uno relacionada con las libras de grasa láctea producidas cuando no se eliminaron puntos. Sin embargo, cuando se eliminó un punto, el método de correlación redujo la cepa simulada al puesto 55, y luego al puesto 2142 cuando se eliminó un punto adicional. El MIC continuó prediciendo la cepa simulada como la cepa mejor clasificada hasta que se eliminaron 6 puntos.
Tabla 8b
Información mutua Correlación
Número de Punto de tiempo MIC Clasificación Pearson Clasificación puntos de datos retirado
retirados
0 Ninguno 0,99679 1 1 1
1 Vaca 1, día 0 0,99679 1 0,61970925 55
2 Vaca 1 y 2, día 0 0,99679 1 0,14684153 2142
3 Vaca 1, 2, 3, día 0 0,99679 1 0,14684153 2142 4 Vaca 1, 2, 3, día 0; 0,99679 1 0,12914465 2209
Vaca 1 día 16
5 Vaca 1, 2, 3, día 0; 0,99679 1 0,12169253 2240
Vaca 1 y 2, día 16
6 Vaca 1, 2, 3, día 0; 0,73678 335 0,18252417 2019
Vaca 1, 2, 3 día 16
9 Vaca 1, 2, 3, día 0; 0,6473 867 -0,16308112 3438
Vaca 1, 2, 3 día 16;
Vaca 1.2, 3 día 28
Una razón detrás de la eliminación de puntos para probar la sensibilidad es que al observar un microbioma de un grupo de dianas (por ejemplo, animales), hay cepas específicas que son comunes a todas ellas, a las que se puede hacer referencia como el microbioma central. Este grupo puede representar una minoría de la población microbiana de una diana específica (por ejemplo, un animal específico), y puede haber una población de cepas separada del conjunto que sólo se encuentran en un subconjunto/pequeña porción de dianas/animales. En algunas realizaciones, las cepas más singulares (es decir, aquellas que no se encuentran en todos los animales) pueden ser las de particular relevancia. Algunas realizaciones de los métodos descritos se desarrollaron para abordar tales "lagunas" en los conjuntos de datos, y así apuntar a microorganismos y cepas particularmente relevantes.
Ejemplo 6
Selección de un conjunto de cepas de microorganismos activos para mejorar la eficiencia alimentaria en pollos de engorde
Se criaron 96 Cobb 500 machos durante 21 días. Se determinaron el peso y el consumo de alimento de cada ave, y se recogieron raspados de ciego después del sacrificio. Las muestras de ciego se procesaron usando los métodos de la presente descripción para identificar un conjunto de microorganismos que mejorarán la eficiencia alimenticia cuando se administren a pollos de engorde en un entorno de producción.
DISEÑO EXPERIMENTAL
Se dividieron 120 pollitos Cobb 500, y se colocaron en corrales según el tratamiento dietético. Las aves se colocaron en corrales de piso mediante tratamiento del 0 al 14D. La instalación de prueba se dividió en 1 bloque de 2 corrales y 48 bloques de 2 jaulas individuales cada uno. Los tratamientos se asignaron a los corrales/jaulas usando un diseño de bloques completos al azar; los corrales/jaulas mantuvieron sus tratamientos durante todo el estudio. Los tratamientos se identificaron mediante códigos numéricos. Las aves se asignaron a las jaulas/corrales al azar. Los grupos de tratamiento específicos fueron los siguientes en la Tabla 9.
Tabla 9
Alojamiento:
La asignación de tratamientos a jaulas/corrales se realizó mediante un programa informático. La asignación generada por computadora fue la siguiente:
Las aves se alojaron en una instalación ambientalmente controlada en un gran corral con piso de hormigón (4' x 8') construido con plástico sólido (4' de alto) con cama limpia. El día 14, se instalaron 96 aves en jaulas dentro de la misma instalación ambientalmente controlada. Cada jaula medía 24"x18"x24".
La iluminación se realizó mediante luces incandescentes, y se usó un programa de iluminación comercial. Las horas de luz continua para cada período de 24 horas fueron las siguientes en la Tabla 10.
Tabla 10
Las condiciones ambientales para las aves (es decir, 0,53 ft2), temperatura, iluminación, espacio para comederos y agua) fueron similares para todos los grupos de tratamiento.
Para evitar la migración de las aves, se revisó cada corral para garantizar que no existieran aberturas de más de 1 pulgada en aproximadamente 14 pulgadas de altura entre los corrales.
Vacunaciones:
Las aves fueron vacunadas para Mareks en el criadero. Al recibirlas (día de estudio 0), las aves fueron vacunadas contra Newcastle y Bronquitis Infecciosa mediante aplicación por aspersión. Con el informe final se proporcionó la documentación del fabricante de la vacuna, el número de lote y la fecha de vencimiento.
Agua:
El agua se proporcionóad libitumdurante todo el estudio. El agua del suelo del corral se obtenía mediante bebederos de campana automáticos. El agua de la jaula en batería se suministraba a través de un bebedero con tetina. Los bebederos se revisaron dos veces al día, y se limpiaron según fuera necesario para asegurar un suministro de agua limpia a las aves en todo momento.
Alimentación:
El alimento se proporcionóad libitumdurante todo el estudio. La alimentación del corral en el piso se realizó mediante alimentadores de tubo colgantes de ~17 pulgadas de diámetro. La alimentación de la jaula en batería se realizaba a través de un comedero de 9"x4". Se colocó una bandeja de alimentación para pollitos en cada corral de piso durante aproximadamente los primeros 4 días.
Observaciones diarias:
Las instalaciones de prueba, los corrales y las aves se observaron al menos dos veces al día para determinar el estado general de la bandada, la iluminación, el agua, el alimento, la ventilación y los eventos imprevistos. La temperatura mínima y máxima de la instalación de prueba se registró una vez al día.
Mortalidad y sacrificios:
A partir del día 0 del estudio, se realizó la necropsia a cualquier ave que se encontró muerta o que se retiró y se sacrificó. Las aves sacrificadas que no pudieron alcanzar el alimento o el agua se sacrificaron y se sometieron a necropsia. La causa probable de la muerte y los hallazgos de la necropsia se registraron en el registro de mortalidad del corral.
Pesos corporales e ingesta de alimento:
~96 aves se pesaron individualmente cada día. El alimento restante en cada jaula se pesó y registró diariamente durante los días 14 a 21. Se determinó el consumo de alimento para cada jaula para cada día.
Aumento de peso y conversión alimenticia:
La ganancia de peso corporal por jaula y la ganancia de peso corporal promedio por tratamiento se determinaron entre 14 y 21 días. La conversión alimenticia se calculó para cada día, y en general para el período 14-21D usando el consumo total de alimento para la jaula dividido entre el peso de las aves. La conversión alimenticia promedio del tratamiento se determinó para el período de 14 a 21 días, promediando las conversiones alimenticias individuales de cada jaula dentro del tratamiento.
Atención Veterinaria, Intervención y Eutanasia:
Los animales que desarrollaron enfermedades concurrentes significativas, resultaron heridos y cuya condición puede afectar el resultado del estudio se retiraron del estudio y se sacrificaron en el momento en que se tomó la determinación. Seis días después de la exposición, se retiraron todas las aves de las jaulas y se puntuaron las lesiones.
Datos recolectados:
Pesos de las aves y conversión alimenticia, individualmente cada día desde los días 14 al 21.
Cantidades de alimento añadidas y retiradas del corral y de la jaula desde el día 0 hasta el final del estudio.
Mortalidad: causa probable de muerte día 0 hasta el final del estudio.
Aves retiradas: motivo del sacrificio el día 0 hasta el final del estudio.
Observación diaria de instalaciones y aves, temperatura diaria de instalaciones.
Contenido de ciego de cada ave el día 21.
RESULTADOS
Los resultados se analizaron usando los métodos descritos anteriormente (por ejemplo, como se analiza con referencia a las FIGs. 1A, 1B y 2, así como en toda la memoria descriptiva). Se determinó la abundancia y actividad microbiana a nivel de cepa para el contenido cecal de cada ave. Se detectaron un total de 22.461 cepas únicas en las 96 muestras de ciego de pollos de engorde. Los recuentos de células absolutos de cada cepa se filtraron según el umbral de actividad para crear una lista de cepas de microorganismos activos y sus respectivos recuentos de células absolutos. En promedio, sólo el 48,3 % de las cepas se consideraron activas en cada pollo de engorde en el momento del sacrificio. Después del filtrado, los perfiles de microorganismos activos en cada ave se integraron con diversos metadatos de las aves, incluidos la eficiencia alimenticia, el peso corporal final y la presencia/ausencia de salinomicina en la dieta, con el fin de seleccionar un conjunto que mejore el rendimiento de todos estos rasgos.
El enfoque de información mutua de la presente descripción se usó para calificar las relaciones entre los recuentos de células absolutos de las cepas activas y las medidas de rendimiento, así como las relaciones entre dos cepas activas diferentes, para las 96 aves. Después de aplicar un umbral, 4039 relaciones metadatos-cepas se consideraron significativas, y 8842 relaciones cepa-cepa se consideraron significativas. Estos enlaces, ponderados por la puntuación MIC, se usaron después como bordes (con los metadatos y las cepas como nodos) para crear una red para el posterior análisis de detección de la comunidad. Se aplicó a la red un algoritmo de detección de comunidades del método de Louvain para categorizar los nodos en subgrupos.
El método Louvain optimiza la modularidad de la red eliminando primero un nodo de su subgrupo actual y colocándolo en subgrupos vecinos. Si la modularidad de los vecinos del nodo ha mejorado, el nodo se reasigna al nuevo subgrupo. Si varios grupos han mejorado la modularidad, se selecciona el subgrupo con el cambio más positivo. Esta etapa se repite para cada nodo de la red hasta que no se realicen nuevas asignaciones. La siguiente etapa implica la creación de una nueva red de grano grueso, es decir, los subgrupos descubiertos se convierten en nuevos nodos. Los bordes entre nodos están definidos por la suma de todos los nodos de nivel inferior dentro de cada subgrupo. A partir de aquí, la primera y segunda etapas se repiten hasta que no se puedan realizar más cambios para optimizar la modularidad. Se pueden investigar máximos tanto locales (es decir, grupos formados en las etapas iterativas) como globales (es decir, agrupación final) para resolver subgrupos que se producen dentro de la comunidad microbiana total, así como para identificar posibles jerarquías que puedan existir.
Modularidad:
Cuando A es la matriz de relaciones metadatos-cepa y cepa-cepa;k= I¡Aijes el peso total del enlace adjunto al nodo i; y m = % ZijAij. El delta de Kronecker5(a,cj)es 1 cuando los nodosiyjestán asignados a la misma comunidad, y 0 en caso contrario.
Calcular el cambio en la modularidad al mover nodos:
AQ es la ganancia en modularidad en el subgrupo C. lin es la suma de los pesos de los enlaces en C, Itot es la suma de los pesos de los enlaces incidentes a los nodos en C, ki es la suma de los pesos de los enlaces incidentes al nodoi,ki,in es la suma de los pesos de los enlaces deIa los nodos en C, ymes la suma de los pesos de todos los enlaces de la red.
Se detectaron cinco subgrupos diferentes en la comunidad microbiana de pollos usando el método de detección de la comunidad de Louvain. Aunque en la naturaleza existe una gran cantidad de diversidad microbiana, hay mucha menos diversidad funcional. Las similitudes y superposiciones en la capacidad metabólica crean redundancias. Es probable que las cepas de microorganismos que responden a los mismos estímulos ambientales o nutrientes tengan una tendencia similar - esto se captura mediante los métodos de la presente descripción, y estos microorganismos finalmente se agruparán juntos. La categorización y jerarquía resultantes revelan predicciones de la funcionalidad de las cepas en función de los grupos en los que se encuentran después del análisis de detección comunitaria.
Una vez completada la categorización de las cepas, se cultivan cepas de microorganismos a partir de las muestras. Debido a las dificultades técnicas asociadas con el aislamiento y el crecimiento de cultivos axénicos a partir de comunidades microbianas heterogéneas, sólo una pequeña fracción de las cepas que superan los umbrales de actividad y relación de los métodos de la presente descripción se propagarán axénicamente en un entorno de laboratorio. Una vez completado el cultivo, el conjunto de cepas de microorganismos se selecciona en función de si existe o no un cultivo axénico y en qué subgrupos se clasificaron las cepas. Los conjuntos se crean para contener la mayor diversidad funcional posible, es decir, las cepas se seleccionan de manera que una amplia gama de subgrupos estén representados en el conjunto. Estos conjuntos se prueban entonces en estudios de eficacia y de campo para determinar la efectividad del conjunto de cepas como producto; y si el conjunto de cepas demuestra una contribución a la producción, el conjunto de cepas podría producirse y distribuirse como un producto.

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Un método para formar un conjunto de cepas de microorganismos activos, que comprende:
obtener al menos dos muestras que comparten al menos una característica común y que tienen al menos una característica diferente, en el que la al menos una característica diferente incluye un tiempo de recolección en el que se recopiló cada una de las al menos dos muestras, de manera que el tiempo de recolección para una primera muestra es diferente del tiempo de recolección de una segunda muestra, o un lugar de recolección en el que se recolectó cada una de las al menos dos muestras, de manera que el lugar de recolección para una primera muestra es diferente del lugar de recolección de una segunda muestra, y la al menos una característica común incluye un tipo de fuente de muestra, de manera que el tipo de fuente de muestra para una primera muestra es el mismo que el tipo de fuente de muestra de una segunda muestra;
para cada muestra, detectar la presencia de uno o más tipos de microorganismos en cada muestra; determinar un número de células de cada tipo de microorganismo detectado de uno o más tipos de microorganismos en cada muestra;
medir un número de apariciones de cada primer marcador único de un conjunto de primeros marcadores únicos en cada muestra, siendo cada primer marcador único un marcador de una cepa de microorganismo;
representar el número de apariciones de cada primer marcador único, del conjunto de primeros marcadores únicos, como un porcentaje del total de primeros marcadores únicos, para dar un porcentaje de cada cepa de microorganismo de cada tipo de microorganismo;
multiplicar el número de células de cada tipo de microorganismo por el porcentaje de cada cepa de microorganismo para producir el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo presente en cada muestra; medir al menos un segundo marcador único para cada cepa de microorganismo basándose en un umbral específico para determinar un nivel de actividad para esa cepa de microorganismo en cada muestra, siendo cada segundo marcador único para cada cepa de microorganismo diferente del primer marcador único para esa cepa de microorganismo;
filtrar el recuento de células absoluto por la actividad determinada para proporcionar una lista de cepas de microorganismos activos y sus respectivos recuentos de células absolutos para cada una de las al menos dos muestras;
comparar los recuentos de células absolutos filtrados de cepas de microorganismos activos para cada una de las al menos dos muestras con al menos un metadato medido para cada una de las al menos dos muestras, y categorizar las cepas de microorganismos activos en al menos dos grupos basándose en el análisis de red;
seleccionar al menos una cepa de microorganismo de al menos dos grupos; y
combinar al menos una cepa de microorganismo seleccionada de al menos dos grupos para formar un conjunto de microorganismos configurados para alterar una propiedad correspondiente al al menos un metadato.
2. El método de la reivindicación 1, en el que el tipo de fuente de muestra es uno de tipo animal, tipo de órgano, tipo de suelo, tipo de agua, tipo de sedimento, tipo de aceite, tipo de planta, tipo de producto agrícola, tipo de suelo a granel, tipo de rizosfera del suelo, o tipo de parte de planta.
3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, que comprende además:
obtener al menos una muestra adicional de una diana, en base al menos a un metadato medido, en el que la al menos una muestra adicional de la diana comparte al menos una característica común con las al menos dos muestras; y para la al menos una muestra adicional de la diana, detectar la presencia de uno o más tipos de microorganismos, determinar un número de cada tipo de microorganismo detectado del uno o más tipos de microorganismos, medir un número de primeros marcadores únicos y la cantidad de los mismos, integrar el número de cada tipo de microorganismo y el número de los primeros marcadores para producir el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo presente, medir al menos un segundo marcador único para cada cepa de microorganismo para determinar un nivel de actividad para esa cepa de microorganismo, filtrar el recuento de células absoluto por la actividad determinada para proporcionar una lista de cepas de microorganismos activos y sus respectivos recuentos de células absolutos para la al menos una muestra adicional de la diana;
en el que la selección de la al menos una cepa de microorganismo de cada uno de los al menos dos grupos se basa en la lista de las cepas de microorganismos activos y sus respectivos recuentos de células absolutos para la al menos una muestra adicional de la diana, de manera que el conjunto formado esté configurado para una propiedad que corresponde al al menos un metadato.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que comparar los recuentos de células absolutos filtrados de cepas de microorganismos activos para cada una de las al menos dos muestras con al menos un metadato medido para cada una de las al menos dos muestras incluye determinar la co-ocurrencia de la una o más cepas de microorganismos activos en cada muestra con el al menos un metadato medido; opcionalmente
en el que el al menos un metadato medido incluye uno o más parámetros, en el que el uno o más parámetros es al menos uno de pH de la muestra, temperatura de la muestra, abundancia de una grasa, abundancia de una proteína, abundancia de un hidrato de carbono, abundancia de un mineral, abundancia de una vitamina, abundancia de un producto natural, abundancia de un compuesto específico, peso corporal de la fuente de muestra, consumo de alimento de la fuente de muestra, ganancia de peso de la fuente de muestra, eficiencia alimenticia de la fuente de muestra, presencia o ausencia de uno o más patógenos, característica o características físicas o medida o medidas de la fuente de la muestra, características de producción de la fuente de la muestra, o una combinación de las mismas; opcionalmente en el que uno o más parámetros es al menos uno de abundancia de proteína de suero, abundancia de proteína de caseína, y/o abundancia de grasas en la leche.
5. El método de la reivindicación 4, en el que:
(i) determinar la co-ocurrencia de la una o más cepas de microorganismos activos y el al menos un metadato medido en cada muestra incluye la creación de matrices pobladas con enlaces que indican metadatos y asociaciones de cepas de microorganismos, el recuento de células absoluto de la una o más cepas de microorganismos activos, y la medida del uno o más segundos marcadores únicos para representar una o más redes de una comunidad o comunidades microbianas heterogéneas; opcionalmente en el que el al menos un metadato medido comprende una presencia, actividad y/o cantidad de una segunda cepa de microorganismo; y/o
(ii) determinar la co-ocurrencia de la una o más cepas de microorganismos activos y el al menos un metadato medido, y categorizar las cepas de microorganismos activos, incluyen análisis de red y/o análisis de agrupaciones para medir la conectividad de cada cepa de microorganismos dentro de una red, en el que la red representa una colección de las al menos dos muestras que comparten una característica común, metadatos medidos, y/o parámetro ambiental relacionado; opcionalmente en el que el al menos un metadato medido comprende una presencia, actividad y/o cantidad de una segunda cepa de microorganismo.
6. El método de la reivindicación 5(ii), en el que:
(i) el análisis de red y/o análisis de agrupaciones incluye análisis de vinculación, análisis de modularidad, medidas de robustez, medidas de intermediación, medidas de conectividad, medidas de transitividad, medidas de centralidad, o una combinación de las mismas; o
(ii) el análisis de agrupaciones incluye la construcción de un modelo de conectividad, un modelo subespacial, un modelo de distribución, un modelo de densidad, o un modelo de centroide; o
(iii) el análisis de la red incluye modelado predictivo de la red a través de exploración y predicción de enlaces, clasificación colectiva, agrupamiento basado en enlaces, similitud relacional, o una combinación de los mismos; o (iv) el análisis de redes comprende modelos de poblaciones basados en ecuaciones diferenciales; opcionalmente en el que el análisis de red comprende modelado de Lotka-Volterra; o
(v) el análisis de agrupaciones es un método heurístico; opcionalmente el método de Luovain; o
(vi) el análisis de redes incluye métodos no paramétricos para establecer una conectividad entre variables; o (vii) el análisis de red incluye cálculos de coeficientes de informaciones mutuas y/o de informaciones máximas entre variables para establecer una conectividad.
7. Un método para formar un conjunto de cepas de microorganismos activos configurado para alterar una propiedad o característica en un ambiente basado en dos o más conjuntos de muestras que comparten al menos un parámetro ambiental común o relacionado entre los dos o más conjuntos de muestras y que tienen al menos un parámetro ambiental diferente entre los dos o más conjuntos de muestras, comprendiendo cada conjunto de muestras al menos una muestra que incluye una comunidad microbiana heterogénea, en el que la una o más cepas de microorganismos es un subtaxón de uno o más tipos de organismos, que comprende:
detectar la presencia de una pluralidad de tipos de microorganismos en cada muestra;
determinar el número absoluto de células de cada uno de los tipos de microorganismos detectados en cada muestra; medir el número de primeros marcadores únicos en cada muestra, y la cantidad de los mismos, en el que un primer marcador único es un marcador de una cepa de microorganismo;
a nivel de proteína o ARN, medir el nivel de expresión de uno o más segundos marcadores únicos, en el que un segundo marcador único es un marcador de actividad de una cepa de microorganismo;
determinar la actividad de las cepas de microorganismos detectadas para cada muestra basándose en el nivel de expresión del uno o más segundos marcadores únicos que exceden un umbral especificado;
calcular el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo activo detectada en cada muestra en base a la cantidad del uno o más primeros marcadores y el número absoluto de células de los tipos de microorganismos de los cuales la una o más cepas de microorganismos es un subtaxón, en el que la o más cepas de microorganismos activos expresan el segundo marcador único por encima del umbral especificado;
determinar la co-ocurrencia de las cepas de microorganismos activos en las muestras con al menos un parámetro ambiental basado en el análisis de red de coeficientes de informaciones máximas para medir la conectividad de cada cepa de microorganismo dentro de una red, en el que la red es la colección de los al menos dos o más conjuntos de muestras con al menos un parámetro ambiental común o relacionado;
seleccionar una pluralidad de cepas de microorganismos activos a partir de la una o más cepas de microorganismos activos basándose en el análisis de red; y
formar un conjunto de cepas de microorganismos activos a partir de la pluralidad seleccionada de cepas de microorganismos activos, el conjunto de cepas de microorganismos activos configurado para alterar selectivamente una propiedad o característica de un entorno cuando el conjunto de cepas de microorganismos activos se introduce en ese entorno.
8. El método de la reivindicación 7, en el que:
(i) el al menos un parámetro ambiental comprende una presencia, actividad y/o cantidad de una segunda cepa de microorganismo; o
(ii) al menos un indicio medido de al menos un factor ambiental común o relacionado para un primer conjunto de muestras es diferente de un indicio medido del al menos un factor ambiental común o relacionado para un segundo conjunto de muestras; opcionalmente en el que al menos un indicio medido es el pH de la muestra, la temperatura de la muestra, la abundancia de una grasa, la abundancia de una proteína, la abundancia de un hidrato de carbono, la abundancia de un mineral, la abundancia de una vitamina, la abundancia de un producto natural, la abundancia de un compuesto específico, peso corporal de la fuente de muestra, consumo de alimento de la fuente de muestra, ganancia de peso de la fuente de muestra, eficiencia alimenticia de la fuente de muestra, presencia o ausencia de uno o más patógenos, característica o características físicas o medida o medidas de la muestra fuente, características de producción de la fuente de muestra, o una combinación de ellas; o
(iii) el al menos un parámetro es al menos uno de abundancia de proteína de suero, abundancia de proteína de caseína, y/o abundancia de grasas en la leche.
9. El método de la reivindicación 7 u 8(i), en el que cada conjunto de muestras comprende una pluralidad de muestras, y:
(i) un indicio medido de al menos un factor ambiental común o relacionado para cada muestra dentro de un conjunto de muestras es sustancialmente similar, y un indicio medido promedio para un conjunto de muestras es diferente del indicio medido promedio de otro conjunto de muestras; o
(ii) se recolecta un primer conjunto de muestras de una primera población, y se recoge un segundo conjunto de muestras de una segunda población; o
(iii) se recolecta un primer conjunto de muestras de una primera población en una primera vez, y se recolecta un segundo conjunto de muestras de la primera población en una segunda vez, diferente de la primera.
10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que al menos un factor ambiental común o relacionado incluye información sobre nutrientes, información dietética, características animales, información sobre infecciones, o estado de salud.
11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 7-10, en el que:
(i) medir el número de primeros marcadores únicos en cada muestra comprende medir el número de marcadores de ADN genómico, ARN o proteínas únicos; o
(ii) medir el número de primeros marcadores únicos, y la cantidad de los mismos, comprende someter el ADN genómico de cada muestra a una reacción de secuenciación de alto rendimiento o a una secuenciación de metagenoma; o (iii) un primer marcador único comprende un marcador de ARNm, un marcador de ARNip, un marcador de ARN ribosómico, un factor sigma, un factor de transcripción, una proteína asociada a un nucleósido, una enzima metabólica, o una combinación de los mismos.
12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que:
(i) el uno o más tipos de microorganismos o la pluralidad de tipos de microorganismos incluye una o más bacterias, arqueas, hongos, protozoos, plantas, otros eucariotas, virus, viroides, o una combinación de los mismos; o
(ii) determinar el número absoluto de células de cada uno de los tipos de microorganismos en cada muestra incluye someter la muestra o una porción de la misma a secuenciación, centrifugación, microscopía óptica, microscopía fluorescente, tinción, espectrometría de masas, microfluidos, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), electroforesis en gel y/o citometría de flujo; o
(iii) una o más cepas de microorganismos activos es un subtaxón de uno o más tipos de microbios seleccionados de una o más bacterias, arqueas, hongos, protozoos, plantas, otros eucariotas, virus, viroides, o una combinación de los mismos; o
(iv) la una o más cepas de microorganismos o la una o más cepas de microorganismos activos es una o más cepas bacterianas, cepas de arqueas, cepas de hongos, cepas de protozoos, cepas de plantas, otras cepas de eucariotas, cepas virales, cepas de viroides, o una combinación de las mismas; o
(v) la una o más cepas de microorganismos o la una o más cepas de microorganismos activos es una o más especies de hongos, subespecies de hongos, especies bacterianas y/o subespecies bacterianas.
13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 7-12, en el que al menos un primer marcador único comprende un marcador filogenético que comprende un gen de la subunidad ribosómica 5S, un gen de la subunidad ribosómica 16S, un gen de la subunidad ribosómica 23S, un gen de la subunidad ribosómica 5.8S, un gen de la subunidad ribosómica 18S, un gen de la subunidad ribosómica 28S, un gen de la subunidad de citocromo c oxidasa, un gen de beta-tubulina, un gen del factor de elongación, un gen de la subunidad de ARN polimerasa, un espaciador transcrito interno (ITS), o una combinación de los mismos; opcionalmente, en el que medir el número de marcadores únicos, y la cantidad de los mismos, incluye someter el ADN genómico de cada muestra a una reacción de secuenciación de alto rendimiento, a una secuenciación genómica, o a una secuenciación de amplicones.
14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que medir el al menos un segundo marcador único incluye medir un nivel de expresión del al menos un segundo marcador único en cada muestra; opcionalmente, en el que medir el nivel de expresión del al menos un segundo marcador único incluye:
(i) someter el ARNm de la muestra a análisis de expresión génica; opcionalmente, en el que el análisis de la expresión génica incluye una reacción de secuenciación, una reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), secuenciación del metatranscriptoma, y/o secuenciación del transcriptoma; o
(ii) someter cada muestra o una porción de la misma a análisis de espectrometría de masas; o
(iii) someter cada muestra o una porción de la misma a un perfil de metaribosoma, y/o un perfil de ribosoma.
15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14, en el que:
i) el tipo de fuente de las muestras es animal, suelo, aire, agua salada, agua dulce, lodos de aguas residuales, sedimentos, aceite, plantas, un producto agrícola, suelo a granel, rizosfera del suelo, partes de plantas, vegetales, un entorno extremo, o una combinación de los mismos; o
(ii) cada muestra es una muestra gastrointestinal; o
(iii) cada muestra es una muestra de tejido, muestra de sangre, muestra de dientes, muestra de transpiración, muestra de uñas, muestra de piel, muestra de cabello, muestra de heces, muestra de orina, muestra de semen, muestra de moco, muestra de saliva, muestra de músculo, muestra de cerebro, muestra de tejido, o muestra de órgano.
16. Un método implementado por un procesador, que comprende:
recibir datos de muestra de al menos dos muestras que comparten al menos una característica común y que tienen al menos una característica diferente, en el que la al menos una característica diferente incluye un momento de recolección en el que se recolectó cada una de las al menos dos muestras, de manera que el tiempo de recolección para una primera muestra es diferente del tiempo de recolección de una segunda muestra, o un lugar de recolección en el que se recolectó cada una de las al menos dos muestras, de manera que el lugar de recolección para una primera muestra es diferente del lugar de recolección de una segunda muestra, y la al menos una característica común incluye un tipo de fuente de muestra, de modo que el tipo de fuente de muestra para una primera muestra es el mismo que el tipo de fuente de muestra de una segunda muestra;
para cada muestra, determinar la presencia de uno o más tipos de microorganismos en cada muestra; determinar un número de cada tipo de microorganismo detectado del uno o más tipos de microorganismos en cada muestra;
determinar un número de primeros marcadores únicos en cada muestra, y la cantidad de los mismos, siendo cada primer marcador único un marcador de una cepa de microorganismo;
integrar, mediante un procesador, el número de cada tipo de microorganismo y el número de los primeros marcadores para producir el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo presente en cada muestra; determinar un nivel de actividad para cada cepa de microorganismo en cada muestra basándose en una medida de al menos un segundo marcador único para cada cepa de microorganismo que excede un umbral específico, identificándose una cepa de microorganismo como activa si la medida de al menos un segundo marcador único para esa la cepa excede el umbral correspondiente, siendo cada segundo marcador único para cada cepa de microorganismo diferente del primer marcador único para esa cepa de microorganismo;
filtrar el recuento de células absoluto de cada cepa de microorganismo según la actividad determinada para proporcionar una lista de cepas de microorganismos activos y sus respectivos recuentos de células absolutos para cada una de las al menos dos muestras;
realizar un análisis de red, a través de al menos un procesador, de los recuentos de células absolutos filtrados de cepas de microorganismos activos para cada una de las al menos dos muestras con al menos un metadato medido para cada una de las al menos dos muestras, incluyendo el análisis de red la determinación de puntuaciones de coeficiente de informaciones máximas entre cada cepa de microorganismo activo y cualquier otra cepa de microorganismo activo, y determinar puntuaciones de coeficiente de informaciones máximas entre cada cepa de microorganismo activo y el respectivo al menos un metadato medido;
categorizar las cepas de microorganismos activos basándose en la función y/o química prevista;
identificar una pluralidad de cepas de microorganismos activos basándose en la categorización; y
generar la pluralidad identificada de cepas de microorganismos activos.
17. El método implementado por un procesador de la reivindicación 16:
(i) que comprende además ensamblar un conjunto de microorganismos activos configurado para, cuando se aplica a una diana, alterar una propiedad correspondiente al al menos un metadato medido; o
(ii) en el que la pluralidad de salida de cepas de microorganismos activos se usa para ensamblar un conjunto de microorganismos activos configurado para, cuando se aplica a una diana, alterar una propiedad correspondiente al al menos un metadato medido; o
(iii) que comprende además identificar al menos un patógeno basándose en la pluralidad resultante de cepas de microorganismos activos identificadas.
18. El método implementado por un procesador de cualquiera de las reivindicaciones 16-17, en el que la pluralidad de salida de cepas de microorganismos activos se usa además para ensamblar un conjunto de microorganismos activos configurado para, cuando se aplica a una diana, dirigirse contra el al menos un patógeno identificado, y tratar y/o prevenir un síntoma asociado con al menos un patógeno identificado.
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