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ES2975750T3 - Anticuerpos multiespecíficos que facilitan el emparejamiento selectivo de las cadenas ligeras - Google Patents

Anticuerpos multiespecíficos que facilitan el emparejamiento selectivo de las cadenas ligeras Download PDF

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ES2975750T3
ES2975750T3 ES17758138T ES17758138T ES2975750T3 ES 2975750 T3 ES2975750 T3 ES 2975750T3 ES 17758138 T ES17758138 T ES 17758138T ES 17758138 T ES17758138 T ES 17758138T ES 2975750 T3 ES2975750 T3 ES 2975750T3
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Christian Lange
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Wulf-Dirk Leuschner
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Thomas Langer
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Abstract

Generalmente, la presente invención se relaciona con el campo de los anticuerpos. En particular, se refiere a anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo anticuerpos biespecíficos, que se modifican de tal manera que se produce el emparejamiento de cadenas deseado y/o se puede seleccionar. Específicamente, esto se logra utilizando diferentes dominios de dimerización para el emparejamiento de cadenas ligeras. La invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, vectores de expresión que comprenden estos ácidos nucleicos, células que los expresan y además a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos. La invención también se refiere a métodos para aislar los anticuerpos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos multiespecíficos que facilitan el emparejamiento selectivo de las cadenas ligeras
[0001]En general, la presente invención se refiere al campo de los anticuerpos. En particular, se refiere a los anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, que se modifican de forma que se produce y/o puede seleccionarse el emparejamiento de las cadenas deseadas. Específicamente, esto se consigue utilizando diferentes dominios de dimerización para el emparejamiento de las cadenas ligeras. La invención se refiere además a ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, vectores de expresión que comprenden estos ácidos nucleicos, células que los expresan, y además a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos. La invención también se refiere a métodos para el aislamiento de los anticuerpos.
[0002]Los anticuerpos IgG naturales son bivalentes y monoespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos, que tienen especificidades de unión para múltiples antígenos diferentes, pueden producirse mediante tecnologías recombinantes y se prevé que tengan amplias aplicaciones clínicas. Es bien sabido que las moléculas completas de anticuerpos IgG son moléculas en forma de Y que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Cada cadena ligera consiste en dos dominios, el dominio aminoterminal se conoce como dominio (o región) variable o V<l>, y el dominio carboxiterminal se conoce como dominio constante (o C<l>) (dominio kappa constante (C<k>) o lambda constante (C<a>)). Cada cadena pesada consiste en cuatro o cinco dominios, dependiendo de la clase del anticuerpo. El dominio aminoterminal se conoce como dominio (o región) variable (o V<h>), al que siguen el primer dominio constante (o C<h>1), la región de bisagra y, a continuación, el segundo y tercer dominios constantes (o C<h>2 y C<h>3). En un anticuerpo ensamblado, los dominios VL y V<h>se asocian para formar un sitio de unión al antígeno. Además, los dominios C<l>y C<h>1 se asocian para mantener una cadena pesada asociada a una cadena ligera. Los dos heterodímeros de cadena pesada y ligera se asocian mediante la interacción de los dominios C<h>2 y C<h>3 y la interacción entre las regiones de bisagra de las dos cadenas pesadas.
[0003]Ha sido de interés producir anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, anticuerpos biespecíficos (AcBe) que combinan los sitios de unión al antígeno de varios anticuerpos dentro de una única molécula, y por lo tanto, serían capaces de unirse a varios antígenos diferentes simultáneamente. Además de las aplicaciones con fines diagnósticos, dichas moléculas allanan el camino para nuevas aplicaciones terapéuticas, por ejemplo, redirigiendo potentes sistemas efectores a las zonas enfermas (donde las células cancerosas suelen desarrollar mecanismos para suprimir las respuestas inmunitarias normales desencadenadas por los anticuerpos monoclonales, tales como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)), o aumentar las actividades neutralizantes o estimulantes de los anticuerpos. Este potencial fue reconocido desde el principio, lo que dio lugar a una serie de enfoques para obtener dichos anticuerpos multiespecíficos. Los primeros intentos de acoplar las especificidades de unión de dos anticuerpos completos contra antígenos objetivo diferentes con fines terapéuticos utilizaron moléculas heteroconjugadas fusionadas químicamente (Staerz et al., 1985, Nature 314 (6012): 628-31).
[0004]La producción, por ejemplo, de IgG biespecíficas (IgGBe) mediante la coexpresión de las dos cadenas ligeras y las dos pesadas en una única célula hospedadora puede resultar muy complicada debido al bajo rendimiento de las IgGBe deseadas y a la dificultad de eliminar los contaminantes de IgG desemparejadas estrechamente relacionadas (Suresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 83, 7989-7993, 1986). Esto refleja que las cadenas pesadas forman homodímeros, así como los deseados heterodímeros: el problema del emparejamiento de cadenas pesadas. Además, las cadenas ligeras pueden emparejarse erróneamente con cadenas pesadas no análogas: el problema del emparejamiento de cadenas ligeras. En consecuencia, la coexpresión de dos anticuerpos puede dar lugar a hasta nueve especies de IgG no deseadas, además de la IgGBe deseada.
[0005]La biomodificación de las cadenas pesadas de anticuerpos para la heterodimerización ha surgido como una estrategia exitosa para superar el problema del emparejamiento de las cadenas pesadas de IgGBe. La homodimerización de las dos cadenas pesadas en una IgG está mediada únicamente por la interacción entre los dominios C<h>3. Las cadenas pesadas se biomodificaron por primera vez para la heterodimerización en la década de 1990 utilizando una estrategia de "botón en ojal". Partiendo de una mutación en "botón" (T366W) (Ridgway et al., 'Protein Eng. 9, 617-621, 1996) que desfavorece la homodimerización de C<h>3, se identificaron mutaciones compensadoras en "ojal" (T366S, L368A e Y407V) (Atwell et al., J. Mol. Biol. 270, 26-35, 1997) mediante expresión en fagos, proporcionando un emparejamiento eficaz con el "botón" al tiempo que desfavorecían la homodimerización. La promiscuidad en la interfaz del dominio IgG condujo en los últimos años a otras diversas estrategias exitosas para la heterodimerización de cadenas pesadas.
[0006]Además, se han desarrollado varias estrategias para superar el problema del emparejamiento de las cadenas ligeras. El mal emparejamiento de la cadena ligera puede obviarse utilizando anticuerpos con una cadena ligera común identificada a partir de bibliotecas de expresión en fagos con una diversidad limitada de cadenas ligeras (Merchant et al., Nat. Biotechnol. 16, 677-681, 1998). Más recientemente se han identificado anticuerpos con una cadena ligera común a partir de otras tecnologías, incluidos ratones transgénicos con una única cadena ligera (McWhirter et al., documento WO2011/097603). Otras estrategias incluyen mutaciones estéricamente complementarias, puentes de disulfuro, el formato CrossMab, el guiado electrostático y el uso de conectores peptídicos (Klein et al., MABS, vol. 4, n.° 6, pág. 653-663, 2012; Spiess et al., Molecular Immunology, vol. 67, n.° 2, pág. 95-106, 2015). Actualmente, la ruta más ampliamente utilizada para obtener IgGBe es mediante la expresión separada de los componentes del anticuerpo en dos células hospedadoras diferentes, seguida de la purificación y el ensamblaje en IgGBein vitro(Jackman et al., J. Biol. Chem. 285, 20850-20859, 2010). La mayor ventaja de las estrategias de dos células hospedadoras sobre el enfoque de la cadena ligera común es que son mucho más ampliamente aplicables a los anticuerpos preexistentes. Además, las dos cadenas ligeras diferentes suelen contribuir a la afinidad y la especificidad de unión al antígeno. Los inconvenientes de las estrategias de dos células hospedadoras en comparación con la cadena ligera común son que están asociadas a un gasto y una complejidad de fabricación significativamente mayores.
[0007]La presente invención aborda el problema del emparejamiento de cadenas ligeras y consigue el emparejamiento deseado de las cadenas ligeras de anticuerpos multiespecíficos en la misma célula con un mínimo o incluso sin subproductos no deseados, es decir, sin emparejamientos de cadenas ligeras distintos de los deseados. Esto se consigue utilizando el dominio C<h>2 de una IgM (MC<h>2) o de una IgE (EC<h>2) para emparejar un dominio variable de cadena ligera con un dominio variable de cadena pesada según se desee, y utilizando un dominio de dimerización diferente para emparejar el otro dominio variable de cadena ligera con un dominio variable de cadena pesada según se desee. Se desconoce la función de MCH2 y de ECH2, muy probablemente corresponden a la región de bisagra de las moléculas de IgG. El dominio C<h>2 de la IgM (MC<h>2) es un polipéptido de 111 aminoácidos (12,2 kDa) que forma un homodímero. El dímero tiene un enlace S-S formado entre las Cys110 de dos dominios y un enlace S-S interno entre las Cys30 y 93 dentro de un dominio. El MC<h>2 tiene un sitio de glicosilación en la Asn105. Los inventores descubrieron que los dominios MC<h>2 pueden utilizarse para reemplazar a los C<h>1/C<k>en un brazo del anticuerpo, y descubrieron que el pliegue MC<h>2 es tan estable como el C<h>1/C<k>y permite un emparejamiento correcto de los dominios variables. Esto es particularmente ventajoso en asociación con modificaciones que facilitan el emparejamiento deseado de las cadenas pesadas. El ECH2 es un dominio muy homólogo con la misma función en el anticuerpo IgE y, por tanto, será igual de adecuado para este fin.
[0008]A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen los mismos significados que los entendidos habitualmente por un experto habitual en la materia. Preferentemente, los términos utilizados en el presente documento se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y en Kolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza)).
Sumario de la invención
[0009]La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas y se basa en la enseñanza general que incluye los diferentes aspectos y facetas que se describen a continuación.
Antecedentes técnicos
[0010]A continuación, se describirán los elementos de la presente enseñanza. Estos elementos se enumeran con facetas específicas, sin embargo, debe entenderse que se pueden combinar en cualquier modo y en cualquier número para crear facetas adicionales. Los ejemplos y facetas preferidas descritos de diversas formas no se deben interpretar para limitar la presente enseñanza únicamente a las facetas explícitamente descritas. Se debe entender que esta descripción soporta y engloba facetas que combinan las facetas explícitamente descritas con cualquier número de elementos divulgados y/o preferidos. Además, cualquier permutación y combinación de todos los elementos descritos en esta solicitud se debe considerar divulgada por la descripción de la presente solicitud, salvo que el contexto indique lo contrario.
[0011]En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones que siguen, salvo que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que la palabra "comprender", y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", implica la inclusión de un número entero establecido o etapa o grupo de números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. Como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un/o", "una", "el" y "la" incluyen referentes al plural, salvo que el contenido dicte claramente lo contrario.
[0012]En la descripción que sigue, los números de aminoácidos se utilizan con respecto a los anticuerpos, que no se refieren a una SEQ ID NO. Estos números se refieren a las posiciones de los aminoácidos en los anticuerpos de acuerdo con la base de datos UniProtKB (www.uniprot.org/uniprot) en la versión divulgada el 26 de agosto de 2016. A menos que se especifique lo contrario, el número o números corresponden a una posición en la IgG humana, en particular en la IgG1 humana. Las secuencias UniProtKB (en la versión divulgada el 26 de agosto de 2016) de los dominios de anticuerpos a los que se hace referencia en el presente documento, incluidas las de la IgG1 humana, son facetas particulares de los dominios descritos en el presente documento, así como variantes de los mismos, como se define a continuación.
[0013]En un primer aspecto, la presente enseñanza se refiere a una cadena pesada A, una cadena ligera A de un anticuerpo o un dímero de las mismas, en donde la cadena pesada comprende un dominio variable V<h>A unido a un dominio de dimerización CH2<h>, y la cadena ligera comprende un dominio variable V<l>A unido a un dominio de dimerización CH2<l>, y en donde tanto CH2<h>como CH2<l>son un dominio constante MC<h>2 de IgM o un dominio constante EC<h>2 de IgE. MC<h>2 y EC<h>2 son homólogos y tienen una secuencia de aminoácidos muy similar. Si CH2<h>y CH2<l>son un dominio constante MC<h>2 de IgM, se prefiere que MC<h>2 comprenda una mutación de la asparagina 209 a glutamina (posición de acuerdo con la numeración de UniProtKB - P01871 IgHM_HUMAN, modificada el 1 de julio de 2008 - v3). Si CH2<h>y CH2<l>son un dominio constante EC<h>2 de IgE, se prefiere que EC<h>2 comprenda una mutación de la cisteína 105 a alanina (evitando la reactividad indeseada de la cisteína) y/o una mutación de la asparagina 146 a glutamina (evitando la glicosilación) (posiciones de acuerdo con la numeración de UniProtKB - P01854 IgHE_HUMAN, modificada el 21 de julio de 1986 - v1).
[0014]En otras palabras, el primer aspecto de la enseñanza puede describirse como un fragmento de un anticuerpo o derivado del mismo que comprende una cadena pesada A de anticuerpo, una cadena ligera A de anticuerpo o un dímero de las mismas, como se ha definido anteriormente. El término "dímero" se refiere a un dímero de la cadena pesada A y la cadena ligera A.
[0015]El término "anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula que tiene la estructura general de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo IgG, que tiene los dominios de dimerización cadena ligera-cadena pesada reemplazados por dominios MC<h>2 o<e>C<h>2. También incluye moléculas que pueden tener más sustituciones de dominios quiméricos (es decir, al menos un dominio reemplazado por un dominio de un anticuerpo diferente), tal como un anticuerpo IgG1 que incluya un dominio IgG3 (por ejemplo, el dominio C<h>3 de la IgG3). Además, el término se refiere generalmente a anticuerpos multiespecíficos, por ejemplo, biespecíficos o triespecíficos. El anticuerpo puede denominarse alternativamente "proteína de tipo anticuerpo" o "anticuerpo quimérico". Un ejemplo es la "configuración IgG" con dominios constantes, como se describe en el presente documento.
[0016]Normalmente, al referirse a las IgG en general, se incluyen las IgG 1, IgG2, IgG3 e IgG4, salvo que se defina lo contrario. En concreto, la IgG es la IgG 1.
[0017]La expresión "derivado de anticuerpo", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende al menos los dominios que se especifica que comprende, pero que no tiene la estructura general de un anticuerpo tal como IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY o IgW, aunque sigue siendo capaz de unirse a una molécula objetivo. Dichos derivados pueden ser, pero sin limitación, fragmentos de anticuerpos funcionales (es decir, de unión al objetivo, en particular de unión específica al objetivo), tales como Fab2, o combinaciones de dichos derivados, por ejemplo, Fab bivalentes (por ejemplo, como se describe en el presente documento). También se refiere a un anticuerpo al que se han añadido más dominios de anticuerpo, tales como, por ejemplo, más dominios variables. Algunos ejemplos son la "configuración de inmunoglobulina en tándem biespecífica tetravalente (TBTI)" (denominada también, e igual a, la "configuración de dominio variable dual"), la "configuración CODV", la "configuración quimera CODV", en particular la "configuración trivalente", y la "configuración de araña tetravalente", como se describe en el presente documento.
[0018]El término "cadena pesada", como se utiliza en el presente documento, incluye también un fragmento de una cadena pesada que comprende al menos un dominio variable (normalmente de un anticuerpo IgG) unido a un dominio de dimerización con una cadena ligera, en donde el dominio de dimerización se define normalmente de forma más específica en el presente documento cuando se utiliza este término. Puede comprender además, aunque no necesariamente, un dominio constante C<h>2 y opcionalmente también un dominio constante C<h>3 (normalmente ambos de un anticuerpo IgG). En consecuencia, también puede denominarse "fragmento de una cadena pesada que comprende al menos un dominio variable unido a un dominio para la dimerización con una cadena ligera".
[0019]Normalmente. y salvo que uno esté más modificado que el otro, CH2<h>y CH2<l>son idénticos (es decir, son dominios de homodimerización), y en una faceta, cada uno tiene una secuencia de acuerdo con la SEQ Id NO: 1 o de acuerdo con la SEQ ID NO: 2 (estas secuencias corresponden a los dominios CH2 utilizados en los ejemplos) o una variante de cualquiera de ellas con al menos un 80 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 1 o 2, respectivamente. En comparación con la IgM humana, la SEQ ID NO: 1 tiene una mutación de asparagina a glutamina en la posición 105 de la SEQ ID NO: 1. Esta mutación es deseada pero no obligatoria. Por lo tanto, una variante de la SEQ ID NO: 1 puede conservar esta mutación. En comparación con la IgE humana, la SEQ ID NO: 2 tiene una mutación de cisteína a alanina en la posición 105 de la SEQ ID NO: 2 y una mutación de asparagina a glutamina en la posición 146 de la SEQ ID NO: 2. Una o ambas de estas mutaciones son deseables pero no obligatorias. Por lo tanto, una variante de la SEQ ID NO: 2 pueden conservar una o ambas de estas mutaciones. Opcionalmente, únicamente una de CH2<h>y CH2<l>es una variante, o las variantes de CH2<h>y CH2<l>difieren entre sí. En cualquier caso, las variantes siguen siendo capaces de dimerizar entre sí y/o con el dominio de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 o 2, respectivamente. Una variante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la que deriva, por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 o 2. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se realiza mediante el algoritmo matemático de Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90, 5873-5877, 1993. Dicho algoritmo está incorporado en los programas BLASTN y BLASTP de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215, 403-410. Para obtener alineaciones con huecos para fines comparativos, se utiliza Gapped BLAST como se describe en Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se usan los parámetros por defecto de los respectivos programas. Alternativamente, una variante también puede definirse como aquella que tiene hasta 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 sustituciones de aminoácidos, en particular sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). En la siguiente Tabla 1 se proporciona un resumen de las propiedades físicas y químicas de los aminoácidos. En una faceta particular, las sustituciones conservadoras son sustituciones realizadas con aminoácidos que tienen en común al menos una propiedad de acuerdo con la Tabla 1 (es decir, de la columna 1 y/o 2). El término "variante" también incluye fragmentos. Un fragmento tiene una deleción aminoterminal y/o carboxiterminal de hasta 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos en total. Además o alternativamente, la variante puede modificarse, por ejemplo, mediante adiciones de aminoácidos aminoterminales y/o carboxiterminales de hasta 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos en total.
Tabla 1:Pr i l r ín n r l .
[0020]El término "unido" se refiere generalmente, y salvo que se indique lo contrario, a un acoplamiento de dos dominios mediante un enlace peptídico. En él, los dos dominios pueden estar unidos con o sin un conector. En el presente documento, se hace referencia al enlace a través de un conector que tenga una longitud de 0-X aminoácidos ("aa"). 0 aa significa que el enlace es a través de un enlace peptídico que une directamente los dos dominios. Para esto también se puede utilizar el término "fusionado" en lugar de unido. Un X de 1 o mayor significa que el enlace se realiza a través de un conector peptídico. Un conector peptídico es, en particular, un conector peptídico flexible, es decir, que proporciona flexibilidad entre los dominios que se unen. Dicha flexibilidad suele aumentar si los aminoácidos son pequeños y no tienen cadenas laterales voluminosas que impidan la rotación o la flexión de la cadena de aminoácidos. Por tanto, preferentemente, el conector peptídico tiene un contenido aumentado de aminoácidos pequeños, en particular de glicinas, alaninas, serinas, treoninas, leucinas e isoleucinas. Preferentemente, al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % 70 %, 80 %, 90 % o más de los aminoácidos del conector peptídico son dichos aminoácidos pequeños. En una faceta particular, los aminoácidos del conector se seleccionan entre glicinas y serinas, es decir, dicho conector es un conector de poliglicina o de poliglicina/serina, donde "poli" significa una proporción de al menos un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o incluso 100 % de restos de glicina y/o de serina en el conector. Los conectores de las configuraciones CODV, como se describe en el presente documento, proporcionan la movilidad suficiente para que los dominios de las cadenas ligera y pesada se plieguen en inmunoglobulinas de región variable dual cruzadas. En general (sin limitarse a las configuraciones CODV), algunos conectores ilustrativos comprenden una secuencia de la fórmula de aminoácidos (GmSn)o, en donde m es un número entero de 0 a 4, n es 1 o 2, y o es un número entero de 0 a 5. Algunos ejemplos particulares son m=1, n=1, o=0-5; m=2, n=1, o=0-5; m=3, n=1, o=0-5; m=4, n=1, o=0-5; m=1, n=2, o=0-5; m=2, n=2, o=0-5; m=3, n=2, o=0-5; y m=4, n=2, o=0-5. Si o>1, cada m y n también pueden diferir de los m y n, respectivamente, de una o más reiteraciones (GmSn) adicionales. En otras palabras, para (GmSn)1, m y n pueden diferir de m y n, respectivamente, de cualquiera de (GmSn)2-5. Lo mismo es posible para cualquiera de los (GmSn)2-5 con respecto a los (GmSn)o.
[0021]En cuanto al primer aspecto, el V<h>A está unido al CH2<h>a través de un conector de 0-30 aa, y el V<l>A está unido al CH2<l>a través de un conector de 0-30 aa. Independientemente o en ambos casos, la longitud de cada conector puede ser de 1-30, 5-25 o 10-20, por ejemplo, de aproximadamente 15 aa. En particular, los dos conectores tienen la misma longitud e incluso pueden ser idénticos, es decir, tener la misma secuencia de aminoácidos. En general y salvo que se indique lo contrario, cada enlace al que se hace referencia en el presente documento es a través de dicho conector.
[0022]En una faceta particular, el carboxiterminal de V<h>A está unido, en particular fusionado, al aminoterminal de CH2<h>, y el carboxiterminal de V<l>A está unido, en particular fusionado, al aminoterminal de CH2<l>. Además, el CH2<h>puede estar unido a través de una región de bisagra a un dominio constante C<h>2, en donde el dominio constante C<h>2 puede estar fusionado a un dominio constante C<h>3.
[0023]La expresión "región de bisagra", como se utiliza en el presente documento, se refiere al tramo flexible de aminoácidos en la parte central de las cadenas pesadas de las clases de inmunoglobulinas IgG e IgA, en particular la IgG (es decir, Ig1, IgG2, IgG3 o IgG4, especialmente IgG1), que une estas dos cadenas mediante enlaces de disulfuro.
[0024]En una faceta adicional, la cadena pesada A y la cadena ligera A derivan de IgG, por ejemplo, de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En particular, derivan de la IgG 1, cuyos dominios pueden mutarse y/o sustituirse por IgG2, IgG3 o IgG4, en particular por dominios IgG3, por ejemplo, como se describe en el presente documento.
[0025]En algunas facetas, la cadena pesada A tiene modificaciones como se describe en el segundo aspecto, en particular una o más modificaciones que facilitan el aislamiento del anticuerpo como se describe.
[0026]En un segundo aspecto, la presente enseñanza se refiere a un anticuerpo o derivado del mismo, que comprende una cadena pesada A y una cadena ligera A de acuerdo con el primer aspecto.
[0027]Normalmente, el anticuerpo o derivado del mismo está aislado y/o es recombinante. Además, el anticuerpo o derivado del mismo puede ser un anticuerpo de ratón, en particular un anticuerpo de ratón humanizado, o derivado del mismo. Alternativamente, el anticuerpo puede derivar de cualquier otra especie, en particular de una especie de vertebrado, por ejemplo, una especie de mamífero, tal como una especie de primate, incluidos el ser humano, el conejo o la rata.
[0028]Se contempla que en el anticuerpo o derivado del mismo, el dominio de dimerización CH2<h>y el dominio de dimerización CH2<l>formen un dímero. Además, en una faceta se contempla que V<h>A y V<l>A formen un dominio variable F<v>AA (es decir, F<v>A<h>A<l>) y de este modo, en particular, un parátopo AA (es decir, A<h>A<l>). En una faceta alternativa, V<h>A y V<l>A no forman un dominio variable FvAA (o un parátopo AA). En particular, en su lugar, V<h>A forma un dominio variable FvAX (es decir, F<v>A<h>X<l>), de este modo, en particular un parátopo AX (es decir, A<h>X<l>) con un dominio variable de cadena ligera adicional V<l>X comprendido en la cadena ligera A, y VL<a>forma un dominio variable XA (es decir, F<v>X<h>A<l>), en particular un parátopo XA (es decir, X<h>A<l>) con un dominio variable de cadena pesada adicional V<h>X comprendido en la cadena pesada A. Esta alternativa se ilustra mediante la "configuración CODV" como se describe a continuación (véase también la Fig. 1 D).
[0029]Como indican estas facetas, el anticuerpo o derivado del mismo del segundo aspecto suele ser multiespecífico, por ejemplo, biespecífico o triespecífico. Por consiguiente, el anticuerpo o derivado del mismo del segundo aspecto comprende además una cadena pesada B y una cadena ligera B, en donde la cadena pesada comprende un dominio variable V<h>B y la cadena ligera comprende un dominio variable V<l>B. Éstos pueden estar dispuestos con las cadenas pesadas y ligeras A en una configuración de IgG, es decir, las cadenas pesadas A y B dimerizan, y la cadena ligera A dimeriza con la cadena pesada A, y la cadena ligera B dimeriza con la cadena pesada B. Además, el anticuerpo multiespecífico, por ejemplo, biespecífico, o derivado del mismo, puede ser simétrico o asimétrico. Asimétrico significa que los dominios variables descritos anteriormente, por ejemplo, F<v>AA y FvBB y, en particular, los parátopos de los dos brazos del anticuerpo (es decir, de las dos cadenas pesadas) son diferentes entre sí. Simétrico, como se utiliza en el presente documento, significa que el anticuerpo o derivado del mismo comprende dominios variables idénticos en cada brazo de un anticuerpo IgG o derivado del mismo. En este anticuerpo se suele conseguir una multiespecificidad de mayor grado que la biespecificidad mediante más dominios variables en los mismos brazos.
[0030]Un anticuerpo o derivado multiespecífico es capaz de unirse a varios antígenos diferentes, y un anticuerpo o derivado biespecífico es capaz de unirse a dos antígenos diferentes. Para todos los anticuerpos o derivados descritos en el presente documento, el antígeno se selecciona, por ejemplo, de forma independiente para cada especificidad, del grupo que consiste en B7.1, B7.2, BAFF, BlyS, C3,C5,CCL11 (eotaxina), CCL15 (MIP-1d), CCL17 (TARC), CCL19 (MIP-3b), CCL2 (MCP-1), CCL20 (MIP-3a), CCL21 (MIP-2), SLC, CCL24 (MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (TECK), CCL26 (eotaxina-3), CCL3 (MIP-1a), CCL4 (MIP-1 b), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CD3, CD19, CD20, CD24, CD40, CD40L, CD80, CD86, CDH1 (E-cadherina), quitinasa, CSF 1 (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), CTLA4, CX3CL1 (SCYD1), CXCL12 (SDFI), CXCL13, EGFR, FCER1A, FCER2, HER2, IGF1R, IL-I, IL-12, IL13, IL15, IL17, IL18, IL1A, IL1B, IL1F1O, IL1 p, IL2, IL4, IL6, IL7, IL8, IL9, IL12/23, IL22, IL23, IL25, IL27, IL35, ITGB4 (integrina b 4), LEP (leptina), MHC de clase II, TLR2, TLR4, TLR5, TNF, TNF-a, TNFSF4 (ligando OX40), TNFSF5 (ligando CD40), receptores de tipo Toll, TREM1, TSLP, TWEAK, XCRI (GPR5/CCXCR1), DNGR-1 (CLEC91) y HMGB1. En particular, es del grupo que consiste en CD3, CD4, CD8, CD28, CD16, NKp46. Para todos los anticuerpos biespecíficos o derivados descritos en el presente documento, el par de antígenos se selecciona, por ejemplo, del grupo que consiste en los pares de antígenos IL4 e IL13, IGF1R y HER2, IGF1R y EGFR, EGFR y HER2, BK e IL13, PDL-1 y CTLA-4, CTLA4 y MHC de clase II, IL-12 e IL-18, IL-Ia e IL-p, TNFa e IL12/23, TNFa e IL-12p40, TNFa e IL-p, TNFa e IL-23, e IL17 e IL23. Para todos los anticuerpos triespecíficos o derivados descritos en el presente documento, dos antígenos se seleccionan, por ejemplo, del grupo que consiste en los pares de antígenos IL4 e IL13, IGF1R y HER2, IGF1R y EGFR, EGFR y HER2, BK e IL13, PDL-1 y CTLA-4, CTLA4 y MHC de clase II, IL-12 e IL-18, IL-Ia e IL-p, TNFa e IL12/23, TNFa e IL-12p40, TNFa e IL-p, TNFa e IL-23, e IL17 e IL23. El tercer antígeno puede ser otro antígeno seleccionado de la lista anterior. A continuación se enumeran otros antígenos con respecto al sexto aspecto, que también pueden utilizarse para el anticuerpo multiespecífico o derivado.
[0031]Un ejemplo de anticuerpo multiespecífico simétrico es una "configuración de araña tetravalente" (véase la Figura 1 E), que se define por el anticuerpo o derivado del mismo del segundo aspecto que comprende una primera y una segunda cadena pesada A y una primera y una segunda cadena ligera A, cada una de acuerdo con el primer aspecto, en donde (i) el dominio CH2<l>de la primera cadena ligera A está unido al dominio V<h>1 o V<l>1 (por ejemplo, V<h>B o V<l>B) de un anticuerpo IgG o derivado del mismo, y el dominio CH2<l>de la segunda cadena ligera A está unido al otro dominio V<h>1 o V<l>1 (por ejemplo, V<h>B o V<l>B) del anticuerpo IgG o derivado del mismo (por ejemplo, en ambos casos al dominio V<h>1 o al dominio V<l>1 ), o ii) el dominio CH2<h>de la primera cadena ligera A está unido al dominio V<h>1 o V<l>1 (por ejemplo, V<h>B o V<l>B) de un anticuerpo IgG o derivado del mismo, y el dominio CH2<h>de la segunda cadena ligera A está unido al otro dominio V<h>1 o V<l>1 (por ejemplo, V<h>B o V<l>B) del anticuerpo IgG o derivado del mismo (por ejemplo, en ambos casos al dominio V<h>1 o al dominio V<l>1). A este respecto, el enlace es normalmente a través de un conector de 0-10 aa. Independientemente, la longitud de cada conector puede ser de 1-10 o de 2-6 aa. En particular, los dos conectores pueden tener la misma longitud e incluso ser idénticos, es decir, tener la misma secuencia de aminoácidos. A este respecto, un "derivado" de un anticuerpo IgG es, en particular, un fragmento de IgG de unión al antígeno, tal como un fragmento Fab2.
[0032]En la "configuración de araña tetravalente", normalmente el dominio CH2<l>de la primera cadena ligera A forma un dímero con el dominio CH2<h>de la primera cadena pesada A, y el dominio CH2<l>de la segunda cadena ligera A forma un dímero con el dominio CH2<h>de la segunda cadena pesada A. Además, normalmente V<h>A y V<l>A de la primera cadena pesada y ligera A forman un dominio variable F<v>AA (es decir, F<v>A<h>A<l>), en particular un parátopo AA (es decir, A<h>A<l>), y V<h>A y V<l>A de la segunda cadena pesada y ligera A forman un dominio variable F<v>AA (es decir, F<v>A<h>A<l>), en particular un parátopo AA (es decir, A<h>A<l>). Además, los dominios V<h>1 y V<l>1 de la parte de IgG también son simétricos, es decir, forman un dominio variable Fv cada uno que es el mismo para ambos (por ejemplo, FvBB).
[0033]Un anticuerpo multiespecífico asimétrico o derivado del mismo, en particular un anticuerpo biespecífico asimétrico o derivado del mismo, comprende generalmente una cadena pesada B y una cadena ligera B, en donde la cadena pesada comprende un dominio variable V<h>B y la cadena ligera comprende un dominio variable V<l>B.
[0034]Algunos ejemplos de este anticuerpo asimétrico o derivado del mismo son la "configuración Fab bivalente" (véase la Figura 1 B) y la "configuración IgG" (véase la Figura 1 A). En él, V<h>B está unido a un dominio de dimerización DIM<h>, y V<l>B está unido a un dominio de dimerización DIM<l>. En la "configuración Fab bivalente", los dos Fab pueden estar unidos entre sí a través de los dominios CH2<h>y DIM<h>, como se muestra en la Figura 1B, o uno de los dominios DIM puede estar unido a uno de los dominios VA (por ejemplo, DIM<h>a V<h>A), o uno de los dominios CH2 puede estar unido a uno de los dominios VB (por ejemplo, VH2<h>a V<h>B). A este respecto, el enlace es normalmente a través de un conector de 0-30 o de 1 -30 aa. Independientemente, la longitud de cada conector puede ser de 5-25 o de 10-20, por ejemplo, de aproximadamente 15 aa. En particular, los dos conectores tienen la misma longitud e incluso pueden ser idénticos, es decir, tener la misma secuencia de aminoácidos.
[0035]El término "DIM" no se utiliza en el presente documento como un término conocido en la técnica para un dominio de anticuerpo, sino como una denominación general para un dominio de dimerización, en particular un dominio de homodimerización. DIM<h>y DIM<l>normalmente forman un dímero. Además, DIM<h>y DIM<l>no son dominios constantes C<h>2, es decir, son diferentes del par CH2<h>y CH2<l>. En particular, no son un dominio constante MC<h>2 de IgM ni un dominio constante EC<h>2 de IgE. En una faceta, un dominio DIM deriva de un anticuerpo. En una faceta específica, DIM<h>y DIM<l>son C<h>1 y C<l>, respectivamente, de un anticuerpo IgG. Además, se contempla que tanto la cadena pesada B como la cadena ligera B deriven de la IgG, salvo que se indique lo contrario. En particular, el anticuerpo o derivado del mismo es biespecífico. También se contempla que V<h>A y V<l>A puedan formar un dominio variable F<v>AA (es decir, F<v>A<h>A<l>), en particular un parátopo AA (es decir, A<h>A<l>), y V<h>B y V<l>B formen un dominio variable F<v>BB (es decir, F<v>B<h>B<l>), en particular un parátopo BB (es decir, B<h>B<l>)).
[0036]En la "configuración Fab bivalente", normalmente el DIM<h>está unido al CH2<h>o al CH2<l>, o el DIM<l>está unido al CH2<h>o al CH2<l>. Alternativamente, uno de los dominios DIM puede estar unido a uno de los dominios VA (por ejemplo, DIM<h>a V<h>A), o uno de los dominios CH2 puede estar unido a uno de los dominios VB (por ejemplo, VH2<h>a V<h>B). A este respecto, el enlace es normalmente a través de un conector de 0-30 o de 1-30 aa. La longitud del conector puede ser de 5-25 o de 10-20, por ejemplo, de aproximadamente 15 aa.
[0037]En la "configuración IgG", normalmente el CH2<h>está unido a través de una región de bisagra a un dominio constante C<h>2A, y el DIM<h>está unido a través de una región de bisagra a un dominio constante C<h>2B. C<h>2A puede estar unido, en particular fusionado, a un dominio constante C<h>3A, y C<h>2B puede estar unido, en particular fusionado, a un dominio constante C<h>3B. Además, se contempla que la cadena pesada A esté unida a la cadena pesada B a través de enlaces de disulfuro, en particular dos de ellos, entre la región de bisagra de la cadena pesada A y la región de bisagra de la cadena pesada B. Alternativamente, en la configuración IgG, CH2<h>no está unido a través de una región de bisagra a un dominio constante C<h>2A, y DIM<h>no está unido a través de una región de bisagra a un dominio constante C<h>2B, sino que CH2<h>está unido a un dominio CH2<h>diferente (por ejemplo, un dominio ECH2<h>si el CH2<h>del dominio Fab es un dominio MCH2<h>, o viceversa), y DIM<h>está unido a un dominio CH2<h>capaz de emparejarse con ese dominio CH2H diferente, en particular con un dominio CH2<h>que es el mismo (en tanto que del mismo tipo) que ese dominio CH2<h>diferente (por ejemplo, un dominio ECH2<h>si el otro dominio CH2<h>es un dominio ECH2<h>; o un dominio MCH2<h>si el otro dominio CH2<h>es un dominio MCH2<h>).
[0038]Otro ejemplo del anticuerpo asimétrico o derivado del mismo descrito anteriormente es la "configuración TBTI" (véase la Figura 1 C). Esta configuración se define como la "configuración IgG", pero
- la cadena pesada A comprende además otro dominio variable de cadena pesada V<h>X unido al V<h>A, - la cadena ligera A comprende además otro dominio variable de cadena ligera V<l>X unido a V<l>A,
- la cadena pesada B comprende además otro dominio variable de cadena pesada V<h>Y unido a V<h>B, y - la cadena ligera B comprende además otro dominio variable de cadena ligera V<l>Y unido a V<l>B. Estos enlaces son a través de un conector de 0-15 o normalmente de 1-15 aa cada uno. Independientemente, la longitud de cada conector puede ser de 5-10 o de aproximadamente 7 u 8 aa. En particular, los conectores tienen la misma longitud e incluso pueden ser idénticos, es decir, tener la misma secuencia de aminoácidos. En una faceta, los extremos carboxílicos de V<h>X, V<l>X, V<h>Y y V<l>Y están fusionados a los extremos amínicos de V<h>A, V<l>A, V<h>B y V<l>B, respectivamente. Para esta configuración se contempla que
- V<h>A y V<l>A formen un dominio variable F<v>AA (es decir, F<v>A<h>A<l>), en particular un parátopo AA (es decir, A<h>A<l>), - V<h>B y V<l>B formen un dominio variable F<v>BB (es decir, F<v>B<h>B<l>), en particular un parátopo BB (es decir, B<h>B<l>), - V<h>X y V<l>X formen un dominio variable F<v>XX (es decir, F<v>X<h>X<l>), en particular un parátopo XX (es decir, X<h>X<l>), y
- V<hy>y V<l>Y formen un dominio variable FvYY (es decir, FvY<h>Y<l>), en particular un parátopo YY (o Y<h>Y<l>).
[0039]Otro ejemplo más del anticuerpo asimétrico o derivado del mismo descrito anteriormente es la "configuración variable dual cruzada" o "configuración CODV". Una configuración CODV general se describe en el documento WO 2012/2135345 A1 y comprende como "configuración TBTI" una
- cadena pesada A que comprende otro dominio variable de cadena pesada V<h>X unido al V<h>A,
- cadena ligera A que comprende otro dominio variable de cadena ligera V<l>X unido al V<l>A,
- cadena pesada B que comprende otro dominio variable de cadena pesada V<h>Y unido al V<h>B, y
- cadena ligera B que comprende otro dominio variable de cadena ligera V<l>Y unido al V<l>B.
[0040]En una faceta, los extremos carboxílicos de V<h>X, V<l>X, V<h>Y y V<l>Y están fusionados a los extremos amínicos de V<h>A, V<l>A, V<h>B y V<l>B, respectivamente
[0041]Sin embargo, en la "configuración CODV",
- V<h>A forma un dominio variable FvAX (es decir, F<v>A<h>X<l>), en particular un parátopo AX (es decir, A<h>X<l>)) con VLX,
- V<l>A forma un dominio variable FvXA (es decir, F<v>X<h>A<l>), en particular un parátopo XA (es decir, X<h>A<l>)) con VHX,
- V<h>B forma un dominio variable FvBY (es decir, F<v>B<h>Y<l>), en particular un parátopo (es decir, B<h>Y<l>)) con V<l>Y, - V<l>B forma un dominio variable YB (es decir, F<v>Y<h>B<l>), en particular un parátopo YB (es decir, Y<h>B<l>)) con V<h>Y.
[0042]Así, al contrario que en la "configuración TBTI", V<h>A y V<l>A, V<h>B y V<l>B, V<h>X y V<l>X, V<h>Y no forman parátopos AA, BB, XX, YY, respectivamente.
[0043]Esto se consigue mediante los siguientes enlaces (L1: conector 1, L2: conector 2, L3: conector 3, L4: conector 4):
1. (i)
o CH2<h>a V<h>A a través de un conector de 1 -3 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa (L4),
o CH2<l>a V<l>A a través de un conector de 3-14 aa, en particular de 5-8 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente de 10 aa (L2),
o DIM<h>a V<h>B a través de un conector de 1 -3 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa (L4),
o DIM<l>a V<l>B a través de un conector de 3-14 aa, en particular de 5-8 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente de 10 aa (L2),
o V<h>A a V<h>X a través de un conector de 1 -8 aa, en particular de 1 -5 aa, o de aproximadamente 1 aa, alternativamente de 0 aa (L3),
o V<l>A a V<l>X a través de un conector de 3-12 aa, en particular de 5-10 aa, o de aproximadamente 7 aa, alternativamente de 10 aa (L1),
o V<h>B a V<h>Y a través de un conector de 1 -8 aa, en particular de 1 -5 aa, o de aproximadamente 1 aa, alternativamente de 0 aa (L3), y
o V<l>B a V<l>Y a través de un conector de 3-12 aa, en particular de 5-10 aa, o de aproximadamente 7 aa, alternativamente de 10 aa (L1); o
2. (ii)
o CH2<h>a V<h>A a través de un conector de 2-15 aa, en particular de 2-12 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente de 10 aa (L4),
o CH2<l>a V<l>A a través de un conector de 1 -4 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa (L2),
o DIM<h>a V<h>B a través de un conector de 2-15 aa, en particular de 2-12 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente de 10 aa (L4),
o DIM<l>a V<l>B a través de un conector de 1 -4 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa (L2),
o V<h>A a V<h>X a través de un conector 2-15 aa, en particular de 4-12 aa, o de aproximadamente 7 aa, alternativamente de 10 aa (L3),
o V<l>A a V<l>X a través de un conector de 1 -3 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 1 aa, alternativamente de 0 aa (L1),
o V<h>B a V<h>Y a través de un conector de 2-15 aa, en particular de 4-12 aa, o de aproximadamente 7 aa, alternativamente de 10 aa (L3), y
o V<l>B a V<l>Y a través de un conector de 1 -3 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 1 aa, alternativamente de 0 aa (L1). En el (i) anterior, los conectores de la cadena ligera son más largos que los conectores de la cadena pesada en ambos brazos, y en (ii), los conectores de la cadena pesada son más largos que los conectores de la cadena ligera en ambos brazos. En otras palabras, con respecto a los conectores, los brazos son simétricos. Sin embargo, también pueden ser asimétricos como se indica en la Fig. 1D, es decir, en un brazo, los conectores de la cadena ligera son más largos que los conectores de la cadena pesada, y en el otro brazo, los conectores de la cadena pesada son más largos que los conectores de la cadena ligera. Esto se traduce directamente en las siguientes facetas alternativas (iii) y (iv), respectivamente:
3. (iii)
o CH2<h>a V<h>A a través de un conector de 1 -3 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa (L4),
o CH2<l>a V<l>A a través de un conector de 3-14 aa, en particular de 5-8 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente de 10 aa (L2),
o DIM<h>a V<h>B a través de un conector de 3-14 aa, en particular de 5-8 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente de 10 aa (L4),
o DIM<l>a V<l>B a través de un conector de 1 -3 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa (L2),
o V<h>A a V<h>X a través de un conector de 1 -8 aa, en particular de 1 -5 aa, o de aproximadamente 1 aa, alternativamente de 0 aa (L3),
o V<l>A a V<l>X a través de un conector de 3-12 aa, en particular de 5-10 aa, o de aproximadamente 7 aa, alternativamente de 10 aa (L1),
o V<h>B a V<h>Y a través de un conector de 3-12 aa, en particular de 5-10 aa, o de aproximadamente 7 aa, alternativamente de 10 aa (L3), y
o V<l>B a V<l>Y a través de un conector de 1 -8 aa, en particular de 1 -5 aa, o de aproximadamente 1 aa, alternativamente de 0 aa (L1); o
4. (iv)
o CH2<h>a V<h>A a través de un conector de 2-15 aa, en particular de 2-12 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente de 10 aa (L4),
o CH2<l>a V<l>A a través de un conector de 1 -4 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa (L2),
o DIM<h>a V<h>B a través de un conector de 1 -4 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa (L4),
o DIM<l>a V<l>B a través de un conector de 2-15 aa, en particular de 2-12 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente de 10 aa (L2),
o V<h>A a V<h>X a través de un conector 2-15 aa, en particular de 4-12 aa, o de aproximadamente 7 aa, alternativamente de 10 aa (L3),
o V<l>A a V<l>X a través de un conector de 1 -3 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 1 aa, alternativamente de 0 aa (L1),
o V<h>B a V<h>Y a través de un conector de 1 -3 aa, en particular de 1 -2 aa, o de aproximadamente 1 aa, alternativamente de 0 aa (L3), y
o V<l>B a V<l>Y a través de un conector de 2-15 aa, en particular de 4-12 aa, o de aproximadamente 7 aa, alternativamente de 10 aa (L1).
[0044]En lo anterior, los intervalos más generales suelen combinarse entre sí, o los intervalos particulares entre sí, o los valores individuales mencionados en último lugar entre sí (primeras alternativas que entre sí y segunda alternativa que entre sí). Con respecto a (i), normalmente los conectores CH2<l>a V<l>A y DIML a V<l>B son más largos que los conectores CH2<h>a V<h>A y DIM<h>a V<h>B, respectivamente, y los conectores V<l>X a V<l>A y V<l>Y a V<l>B son más largos que los conectores V<h>A a V<h>X y V<h>B a V<h>Y, respectivamente. Con respecto a (ii), normalmente los conectores CH2<h>a V<h>A y DIM<h>a V<h>B son más largos que los conectores CH2<l>a V<l>A y DIM<l>a V<l>B, respectivamente, y los conectores V<h>A a V<h>X y V<h>B a V<h>Y son más largos que los conectores V<l>X a V<l>A y V<l>Y a V<l>B, respectivamente. Con respecto a iii), normalmente los conectores CH2<l>a V<l>A y DIM<h>a V<h>B son más largos que los conectores CH2<h>a V<h>A y DIM<l>a V<l>B, respectivamente, y los conectores V<l>X a V<l>A y V<h>Y a V<h>B son más largos que los conectores V<h>A a V<h>X y V<l>B a V<l>Y, respectivamente. Con respecto a (iv), normalmente los conectores CH2<h>a V<h>A y DIM<l>a V<l>B son más largos que los conectores CH2<l>a V<l>A y DIM<h>a V<h>B, respectivamente, y los conectores V<h>A a V<h>X y V<l>B a V<l>Y son más largos que los conectores V<l>X a V<l>A y V<h>Y a V<h>B, respectivamente. Más largo, en el presente documento, puede significar al menos 1,5 veces más largo, al menos 1,75 veces más largo o al menos 2 veces más largo (en la medida de lo posible dados los intervalos especificados).
[0045]Además, lo anterior también puede describirse con fórmulas de dominio de cadena pesada (I) y ligera (II) para cada brazo, que son
(I) CH2<h>/DIM<h>- L4 - V<h>- L3 - V<h>y (II) CH2<l>/DIM<l>- L2 - V<l>- L1 - V<l>,
en donde un brazo tiene CH2<h>y CH2<l>para (I) y (II), respectivamente, y el otro brazo tiene DIM<h>y DIM<l>para (I) y (II), respectivamente,
y en donde L4 es (a) un conector de 1-3 aa, en particular de 1-2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa, o (b) un conector 2-15 aa, en particular de 2-12 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente 10 aa, L3 es (a) un conector de 1 -8 aa, en particular de 1 -5 aa, o de aproximadamente 1 aa, alternativamente de 0 aa, o (b) un conector 2-15 aa, en particular de 4-12 aa, o de aproximadamente 7 aa, alternativamente 10 aa, L2 es (a) un conector 3-14 aa, en particular de 5-8 aa, o de aproximadamente 5 aa, alternativamente 10 aa, o (b) un conector de 1-4 aa, en particular de 1-2 aa, o de aproximadamente 2 aa, alternativamente de 0 aa. En ellos, las facetas (a) se combinan entre sí, y las facetas (b) se combinan entre sí. También, los intervalos más generales suelen combinarse entre sí, o los intervalos particulares entre sí, o los valores individuales mencionados en último lugar entre sí (primeras alternativas que entre sí y segunda alternativa que entre sí).
[0046]Una faceta específica de la "configuración CODV" es la "configuración CODV de Fab bivalente", que comprende el brazo izquierdo "A" de la "configuración CODV" mostrada en la Fig. 1D sin los dominios constantes C<h>2A ni C<h>3A, es decir, comprende los dominios V<h>A, V<l>A, V<h>X y V<l>X configurados como se describe para la "configuración CODV".
[0047]Otro ejemplo de anticuerpo asimétrico o derivado del mismo descrito anteriormente es la "configuración quimera CODV", siendo un ejemplo particular la "configuración trivalente" (véase la Figura 1 F). En la "configuración quimera CODV", el anticuerpo comprende un brazo A que no está en la "configuración CODV" y un brazo B en la "configuración CODV". Bien el brazo A comprende los dominios CH2 como se describe en el presente documento y el brazo B comprende los dominios DIM como se describe en el presente documento, o el brazo A comprende los dominios DIM y el brazo B los dominios CH2.
[0048]El brazo A que no está en la "configuración CODV" puede tener cualquier configuración de brazo de anticuerpo, incluido un brazo con las configuraciones descritas en el presente documento, en particular con las configuraciones asimétricas descritas en el presente documento, tales como la "configuración IgG" o la "configuración TBTI". En el brazo A en la "configuración IgG", la cadena pesada y la cadena ligera están configuradas como se ha descrito anteriormente para esa configuración (con dominios CH2 si el brazo B comprende dominios DIM o con dominios DIM en su lugar si el brazo B comprende dominios CH2). En el brazo A de la "configuración TBTI", la cadena pesada y la cadena ligera están configuradas como se ha descrito anteriormente para dicha configuración (con dominios CH2 si el brazo B comprende dominios DIM o con dominios DIM en su lugar si el brazo B comprende dominios DH2).
[0049]El brazo B en la "configuración CODV" está configurado como se define como se ha descrito anteriormente para esa configuración (con dominios DIM si el brazo A comprende dominios CH2 o con dominios CH2 en su lugar si el brazo A comprende dominios DIM). La unión de los dominios puede ser bien como en (i) o como en (ii) definidos anteriormente.
[0050]La faceta con brazo A que tiene la "configuración IgG" es una configuración particular, denominada también en el presente documento "configuración trivalente" (véase la Fig. 1 F), ya que forma tres parátopos. Esta configuración puede ser monoespecífica (todos los parátopos son iguales), pero suele ser biespecífica (dos de los tres parátopos son iguales) o triespecífica (todos los parátopos son diferentes). La configuración es particularmente útil en la forma triespecífica.
[0051]En otras facetas del anticuerpo multiespecífico, en particular biespecífico, o derivado del mismo del segundo aspecto, el anticuerpo o derivado del mismo comprende una o más modificaciones que facilitan el aislamiento del anticuerpo, especialmente modificaciones que facilitan el emparejamiento de la cadena pesada A con la cadena pesada B o que permiten la selección de este emparejamiento. Esto se aplica en particular a un anticuerpo asimétrico o derivado del segundo aspecto.
[0052]Por ejemplo, las modificaciones que facilitan el aislamiento del anticuerpo pueden ser una o varias de las siguientes: una modificación de la tecnología de botones en ojales, una modificación de la tecnología DuoBody, una modificación de la tecnología Azymmetric, una modificación de la tecnología Charge Pair, una modificación de la tecnología HA-TF, una modificación de la tecnología SEEDbody o una modificación de la afinidad de la proteína A diferencial. Específicamente, pueden ser una o más de las siguientes:
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): mutación T366Y y opcionalmente mutación adicional S354 (S354C) y/o T166W, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): mutación Y407T y, opcionalmente, mutación adicional Y349C, T366S, L368A y/o Y407V (tecnología de botones en ojales),
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): mutación T366W, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): mutación T366S, L368A y/o Y407V (tecnología de botones en ojales),
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): mutación F405L, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): mutación K409R (tecnología DuoBody),
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): mutación T350V, L351Y, F405A e Y407V, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): mutación T350V, T366L, K392L y T394W (tecnología Azymmetric),
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): mutación K409D y K392D, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): mutación D399K y E356K (tecnología Charge Pair),
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): mutación D221E, P228E y L368E, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): mutación D221R, P228R y K409R (tecnología Charge Pair),
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): mutación S364H y F405A, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): mutación Y349T y T394F (tecnología HA-TF),
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): quimera IgG/A, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): quimera IgA/G (tecnología SEEDbody),
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): La región Fc o parte de la misma (por ejemplo, el dominio C<h>3) es de la IgG3, la región Fc de la segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B) o parte de la misma (por ejemplo, el dominio C<h>3) es de la IgG1, 2 o 4, en particular la IgG1 (afinidad diferencial por la proteína A),
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): mutación H435R y Y436F, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): mutación T407T (afinidad diferencial por la proteína A), y/o
- primera cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada A): mutación H435R, segunda cadena pesada (por ejemplo, la cadena pesada B): sin mutación (afinidad diferencial por la proteína A).
[0053]En este caso, la primera cadena pesada puede ser alternativamente la cadena pesada B, y la segunda cadena pesada puede ser la cadena pesada A.
[0054]En una faceta particular, el anticuerpo tiene una forma de tipo IgG en forma de Y (incluida la "configuración IgG", la "configuración TBTI" y la "configuración CODV"), los dominios constantes C<h>2A, C<h>2B, C<h>3A y/o C<h>3B, preferentemente C<h>3A y/o C<h>3B, facilitan la heterodimerización de la cadena pesada o una selección de heterodímeros de la cadena pesada. Por heterodimerización de la cadena pesada se entiende una unión de la cadena pesada A con la cadena pesada B, por lo que se impide o se selecciona contra una unión de la cadena pesada A con otra cadena pesada A y/o una unión de la cadena B con otra cadena pesada B.
[0055]Por ejemplo, las regiones Fc de la cadena pesada A y de la cadena pesada B (por ejemplo, los dominios constantes C<h>2A y C<h>2B, y/o C<h>3A y C<h>3B), en particular C<h>3A y C<h>3B comprenden mutaciones de "botón en ojal". Dichas mutaciones de "botón en ojal" son en particular T366Y en una de C<h>3A o C<h>3B e Y407T en la otra, en donde C<h>3A y C<h>3B son dominios constantes de IgG 1, y opcionalmente en donde la región Fc que comprende la mutación T366Y (cadena "botón") comprende además las mutaciones S354 y T166W, y la región Fc que comprende la mutación Y407T (cadena "ojal") comprende además las mutaciones Y349C, T366S, L368A e Y407V.
[0056]Alternativa o adicionalmente, (i) bien la región Fc de la cadena pesada A o una parte de la misma (es decir, C<h>2A o C<h>3A), en particular C<h>3A, o la región Fc de la cadena pesada B o una parte de la misma (es decir, C<h>2B o C<h>3B), en particular C<h>3B, deriva de la IgG3, o (ii) bien la región Fc de la cadena pesada A (es decir, C<h>2A y C<h>3A), en particular C<h>3A, o la región Fc de la cadena pesada B (es decir, C<h>2B y C<h>3B), en particular C<h>3B, comprende una o más mutaciones que disminuyen, y en particular, suprimen la unión a la proteína A. Dichas mutaciones pueden ser H435R e Y436F en C<h>3A o C<h>3B, en donde C<h>3A y C<h>3B son dominios constantes de la IgG1.
[0057]Particularmente se contempla que las regiones Fc de la cadena pesada A y de la cadena pesada B (por ejemplo, los dominios constantes C<h>2A y C<h>2B, y/o C<h>3A y C<h>3B), en particular C<h>3A y C<h>3B comprendan mutaciones de botón en ojal, y que la región Fc de la cadena pesada A (es decir, C<h>2A y C<h>3A), en particular C<h>3A, o la región Fc de la cadena pesada B (es decir, C<h>2B y C<h>3B), en particular C<h>3B, comprendan una o más mutaciones que supriman la unión a la proteína A. Aún más particularmente, se contempla que la cadena pesada que comprende la mutación o mutaciones de ojal de las mutaciones de botón en ojal comprenda la una o más mutaciones que disminuyen, o en particular, suprimen la unión a la proteína A. Esto tiene la ventaja de que el aislamiento de este anticuerpo puede realizarse sin una cromatografía Kappa Select como se describe más adelante, ya que el enfoque de botón en ojal permite la dimerización también de dos cadenas pesadas de "ojal", pero no la dimerización de dos cadenas pesadas de "botón". Por lo tanto, si la cadena pesada "ojal" tiene la una o más mutaciones que disminuyen, y en particular, suprimen la unión a la proteína A y se selecciona con cromatografía de proteína A, se seleccionará contra los dímeros "ojal" y se aislará únicamente el anticuerpo multiespecífico, en particular biespecífico, sin ninguna etapa adicional.
[0058]Además, el anticuerpo o derivado del mismo del segundo aspecto puede tener una funciones Fc efectoras reducidas o nulas. Una función Fc efectora es la interacción con la proteína del complemento C1q y/o la unión a los receptores Fc. Una reducción o ausencia de funciones efectoras puede conseguirse, por ejemplo, mediante una doble mutación L234A y L235A (la denominada "mutación LALA") en el dominio C<h>2A y/o el dominio C<h>2B.
[0059]Todos los términos utilizados con respecto al segundo aspecto tienen los significados definidos con respecto al primer aspecto de la enseñanza, salvo que se definan específicamente de otro modo. Además, todas las facetas especificadas para el primer aspecto que son aplicables al segundo aspecto también se contemplan para el segundo aspecto.
[0060]En un tercer aspecto, la presente enseñanza se refiere a uno o más polinucleótidos que codifican la cadena pesada A y/o la cadena ligera A del primer aspecto. En una faceta, el uno o más polinucleótidos también codifican la cadena pesada B y/o la cadena ligera B del anticuerpo o derivado del segundo aspecto. En particular, el uno o más polinucleótidos codifican el anticuerpo o derivado del segundo aspecto. Esto se refiere a todas las facetas descritas anteriormente, en particular a cualquiera de las configuraciones de anticuerpos descritas en el presente documento. En una faceta, el uno o más polinucleótidos están aislados.
[0061]Todos los términos utilizados con respecto al tercer aspecto tienen los significados definidos con respecto al primer y segundo aspecto de la enseñanza, salvo que se definan específicamente de otro modo. Además, todas las facetas especificadas para el primer y el segundo aspecto que son aplicables al tercer aspecto también se contemplan para el tercer aspecto.
[0062]En un cuarto aspecto, la presente enseñanza se refiere a uno o más vectores de expresión que comprenden el uno o más polinucleótidos del tercer aspecto.
[0063]El término "vector", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) que se utiliza para transferir información de codificación a una célula hospedadora. El término "vector" incluye una molécula de ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha fusionado.
[0064]Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a una molécula de ADN bicatenario circular en el que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde pueden insertarse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de una replicación autónoma en una célula hospedadora en donde son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano, y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora, y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes que comprenden. Dichos vectores se citan en el presente documento "vectores de expresión".
[0065]Además, todas las facetas especificadas para el primer, el segundo y el tercer aspecto que son aplicables al cuarto aspecto también se contemplan para el cuarto aspecto.
[0066]En un quinto aspecto, la presente enseñanza se refiere a una célula que comprende el uno o más polinucleótidos del tercer aspecto o el uno o más vectores de expresión del cuarto aspecto. En una faceta, la célula está aislada.
[0067]Puede utilizarse una amplia variedad de sistemas de expresión celular para expresar dichos polinucleótidos, incluido el uso de células procariotas y eucariotas, tales como células bacterianas (por ejemplo,E. coli),células de levadura, células de insecto o células de mamífero (por ejemplo, células de ratón, células de rata, células humanas, etc.). Para ello, se transforma o se transfecta una célula con dicho o dichos polinucleótidos o vectores de expresión, de modo que el o los polinucleótidos se expresen en la célula y, en una faceta, se secreten al medio en el que se cultivan las células, de donde puede recuperarse el producto de expresión.
[0068]Además, todas las facetas especificadas para el primer, el segundo, el tercer y el cuarto aspecto que son aplicables al quinto aspecto también se contemplan para el quinto aspecto.
[0069]En un sexto aspecto, la presente enseñanza se refiere a una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y un dímero de la cadena pesada A y la cadena ligera A del primer aspecto o el anticuerpo o derivado del segundo aspecto, en donde en una faceta particular, el dímero o el anticuerpo o derivado se une específicamente a un patógeno, una célula enferma, un receptor celular o una molécula de señalización celular.
[0070]Las composiciones farmacéuticas pueden seleccionarse para administración parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para administración a través del tubo digestivo, tal como por vía oral. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la pericia de la técnica.
[0071]El término "portador farmacéuticamente aceptable" o "portador fisiológicamente aceptable", como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para llevar a cabo o potenciar la administración de una proteína de unión de tipo anticuerpo. El portador primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado para inyección puede ser agua, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales habituales en las composiciones para administración parenteral. Algunos vehículos adicionales ilustrativos son solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con seroalbúmina. Otras composiciones farmacéuticas ilustrativas comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0 5,5, que pueden incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado. En una faceta, las composiciones de proteína de unión de tipo anticuerpo se pueden preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, la proteína de unión de tipo anticuerpo se puede formular como un liofilizado utilizando excipientes apropiados, tales como sacarosa.
[0072]La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la limpidez, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolución o de liberación, la adsorción o la penetración de la composición. Algunos materiales de formulación adecuados incluyen, pero sin limitación, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tales como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio), tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes de carga (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA)), agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas), proteínas (tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas), colorantes, aromatizantes y agentes de dilución, emulsionantes, polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sales (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, tiomersal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol), alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics; PEG; ésteres de sorbitano; polisorbatos, tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; Tritón; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferentemente sodio o cloruro de potasio, o manitol sorbitol), vehículos de administración, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18.a Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) y ediciones posteriores del mismo).
[0073]El término "se une específicamente", como se utiliza en el presente documento, se refiere a una reacción de unión que es determinante de la presencia de la molécula objetivoin vitrooin vivo,en particular en un organismo tal como el cuerpo humano. Como tal, el ligando especificado se une a su molécula objetivo particular y no se une en una cantidad sustancial a otras moléculas presentes. Generalmente, un anticuerpo o derivado del mismo que se "une específicamente" a una molécula objetivo tiene una constante de afinidad en equilibrio superior a aproximadamente 105 (por ejemplo, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 y 1012 o más) mol/l para esa molécula objetivo.
[0074]El término "patógeno" se refiere a cualquier organismo que pueda causar una enfermedad en un sujeto. Incluye, pero sin limitación, bacterias, protozoos, hongos, nematodos, viroides y virus, o cualquier combinación de los mismos, en donde cada patógeno es capaz, ya sea por sí mismo o en concierto con otro patógeno, de provocar la enfermedad en vertebrados, incluyendo, pero sin limitación, mamíferos, e incluyendo, pero sin limitación, seres humanos. Como se utiliza en el presente documento, el término "patógeno" también engloba microorganismos que pueden no ser patógenos normalmente en un hospedador no inmunodeprimido, pero que sí lo son en un hospedador inmunodeprimido.
[0075]La célula enferma puede ser una célula tumoral, una célula infectada crónicamente, una célula senescente, una célula que presenta un fenotipo inflamatorio, una célula que acumula proteínas amiloides o una célula que acumula proteínas mal plegadas.
[0076]En el caso de una célula tumoral, la enfermedad subyacente es un tumor, en particular seleccionado del grupo que consiste en cáncer suprarrenal, cáncer anal, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, cáncer óseo, cerebro/SNC, tumores, cáncer de mama, cáncer de tumor primario desconocido, enfermedad de Castleman, cáncer cervicouterino, cáncer de colon/recto, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, tumores de la familia de Ewing, cáncer ocular, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal (Kaposi), enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, linfoma, linfoma cutáneo, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de cavidad nasal y senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no hodgkiniano, cáncer de cavidad oral y orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores hipofisarios, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, sarcoma, cáncer de tejidos blandos en adultos, cáncer cutáneo, cáncer de intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldnstrom y tumor de Wilms. En particular, el antígeno es un antígeno asociado al cáncer, tal como HER2, EGFR, EGFRvlll, EGFR3 (ERBB3), MET, FAP, PSMA, CXCR4, ITGB3, CEA, CAIX, mucinas, proteína de unión a folato,<g>D2, VEGFR1, VEGFR2,<c>D20, CD30, CD33, CD52, CTLA4, CD55, integrina aVp3, integrina a5p1, IGF1R, EPHA3, RANKL, TRAILR1, TRAILR2, IL13Ralfa, UPAR, tenascina, p D-1 , PD-L1, glicoproteína 72 asociada a tumores, gangliósido GM2, A33, antígeno Y de Lewis o MUC1.
[0077]En el caso de una célula infectada crónicamente, la enfermedad subyacente es una enfermedad infecciosa crónica, tal como tuberculosis, malaria, hepatitis vírica crónica (VHB, virus de la hepatitis D y VHC), síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA, causado por el VIH, virus de la inmunodeficiencia humana) o trastornos relacionados con el VEB: enfermedades autoinmunitarias sistémicas (lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide y síndrome de Sjogren) y esclerosis múltiple (EM). En particular, la célula infectada crónicamente comprende un agente patógeno o parte del mismo de las enfermedades infecciosas citadas anteriormente.
[0078]En el caso de una célula senescente, la enfermedad subyacente es una enfermedad asociada a la senescencia, tal como (i) enfermedades genéticas raras denominadas síndromes progeroides, caracterizadas por un envejecimiento prematuro: síndrome de Werner (WS), síndrome de Bloom (BS), síndrome de Rothmund-Thomson (RTS), síndrome de Cockayne (CS), xeroderma pigmentoso (XP), tricotiodistrofia o síndrome de progeria de Hutchinson-Gilford (HGPS) o (ii) trastornos comunes relacionados con la edad: obesidad, diabetes de tipo 2, sarcopenia, artrosis, fibrosis pulmonar idiopática y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cataratas, enfermedades neurodegenerativas o trastornos relacionados con el tratamiento del cáncer. En concreto, la célula senescente expresa, en particular en una forma mal plegada y/o presentada en la superficie celular, una o más proteínas tales como proteína priónica (PrP), FasR, ligando Fas, C<d>44, receptor del EGF, CD38, Notch-1, CD44, CD59 o receptor del TNF. No obstante, la célula también puede ser una célula no enferma que exprese una o más de estas proteínas.
[0079]En caso de que una célula presente un fenotipo inflamatorio, la enfermedad subyacente es una enfermedad inflamatoria, tal como alergia, asma, arteriosclerosis, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades autoinflamatorias, enfermedad celíaca, prostatitis crónica, glomerulonefritis, hipersensibilidad, enfermedad inflamatoria intestinal, miopatías inflamatorias, obesidad, enfermedad inflamatoria pélvica, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, sarcoidosis, rechazo de trasplante, vasculitis o cistitis intersticial. En particular, una célula que muestra un fenotipo inflamatorio es una célula que sobreexpresa uno o más factores proinflamatorios tales como bradicinina, C3, C5a, factor XII, complejo de ataque de membrana, plasmina, trombina, gránulos de lisosoma, histamina, IFN-gamma, IL-8, IL-6, IL-8, iL-18, leucotrieno B4, óxido nítrico, prostaglandinas, TNF-alfa o proteína C reactiva.
[0080]En caso de que una célula acumule proteínas amiloides, la enfermedad subyacente es una enfermedad asociada a la acumulación anormal de fibrillas amiloides tal como enfermedad de Alzheimer, diabetes sacarina tipo 2, enfermedad de Parkinson, encefalopatía espongiforme transmisible, insomnio familiar letal, enfermedad de Huntington, carcinoma medular de tiroides, arritmias cardiacas, aterosclerosis, artritis reumatoide, amiloide medial aórtico, prolactinomas, polineuropatía amiloide familiar, amiloidosis sistémica hereditaria no neuropática, amiloidosis relacionada con la diálisis, distrofia corneal reticular, angiopatía amiloide cerebral, angiopatía amiloide cerebral, amiloidosis sistémica AL o miositis esporádica por cuerpos de inclusión. En particular, una célula que acumula proteínas amiloides es una célula que sobreexpresa uno o más amiloides tales como beta amiloide, IAPP, alfasinucleína, PrPSc, huntingtina, calcitonina, factor natriurético auricular, apolipoproteína A1, aminoide sérico A, medina, prolactina, transtiretina, lisozima, beta-2 microglobulina, gelsolina, queratoepitelina, cistatina, cadena ligera AL de inmunoglobulina o S-IBM.
[0081]En caso de que una célula acumule proteínas mal plegadas, la enfermedad subyacente es una proteopatía tal como enfermedad de Alzheimer, angiopatía p-amiloide cerebral, degeneración de las células ganglionares de la retina en el glaucoma, enfermedades priónicas, enfermedad de Parkinson, taupatías, degeneración lobular frontotemporal, FTLD-FUS, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Huntington, demencia familiar británica, demencia familiar danesa, hemorragia cerebral hereditaria con amiloidosis, CADASIL, enfermedad de Alexander, seipinopatías, neuropatía amiloidótica familiar, amiloidosis sistémica senil, amiloidosis al (cadena ligera), amiloidosis AH (cadena pesada), amiloidosis AA (secundaria), diabetes de tipo II, amiloidosis aórtica medial, amiloidosis ApoAl, amiloidosis ApoAll, amiloidosis ApoAlV, amiloidosis familiar de tipo finlandés, amiloidosis por lisozima, amiloidosis por fibrinógeno, amiloidosis por diálisis, miositis/miopatía por cuerpos de inclusión, cataratas, retinosis pigmentaria con mutaciones de la rodopsina, carcinoma medular de tiroides, amiloidosis auricular cardiaca, prolactinoma hipofisario, distrofia corneal reticular hereditaria, amiloidosis liquenoide cutánea, cuerpos de Mallory, amiloidosis corneal por lactoferrina, proteinosis alveolar pulmonar, amiloide tumoral odontógeno (Pindborg), amiloide de la vesícula seminal, fibrosis quística, anemia falciforme o miopatía por enfermedad crítica. Preferentemente, una célula que acumula proteínas mal plegadas es una célula que pliega mal una o más proteínas tales como péptido p amiloide (Ap), proteína Tau, péptido p amiloide (Ap), péptido p amiloide (Ap), proteína priónica, a-sinucleína, proteína tau asociada a microtúbulos (proteína Tau), TDP-43, proteína fusionada en sarcoma (FUS), superóxido dismutasa, TDP-43, FUS, proteínas con expansiones de glutamina en tándem, ABri, ADan, cistatina C, Notch3, proteína fibrilar glial ácida (GFAP), seipina, transtiretina, serpinas, cadenas ligeras de inmunoglobulinas monoclonales, cadenas pesadas de inmunoglobulinas, proteína amiloide A, polipéptido amiloide de los islotes (IAPP; amilina), medina (lactadherina), apolipoproteína Al, apolipoproteína All, apolipoproteína AIV, gelsolina, lisozima, fibrinógeno, beta-2 microglobulina, péptido p amiloide (Ap), cristalinas, rodopsina, calcitonina, factor natriurético atrial, prolactina, queratoepitelina, queratinas, proteínas del filamento intermedio de la queratina, lactoferrina, proteína C tensioactiva (SP-C), proteína odontógena asociada al ameloblasto, semenogelina I, proteína reguladora de la conductancia transmembranaria de la fibrosis quística (CFTR), hemoglobina o estado hiperproteolítico de ubiquitinación de la miosina.
[0082]El término "receptor celular" no se limita a ningún receptor en particular. Por ejemplo, puede ser un receptor acoplado a proteínas G, un canal iónico o un transportador transmembranario. Algunos ejemplos específicos son CD3, CD4, CD8, CD28, CD16 y NKp46.
[0083]La molécula de señalización celular puede ser una citocina, tal como una quimiocina, un interferón, una interleucina, una linfocina o un factor de necrosis tumoral, o una hormona o un factor de crecimiento.
[0084]En una faceta particular del sexto aspecto, el anticuerpo o derivado del mismo es multiespecífico, en particular biespecífico, y se une además a una molécula efectora, por ejemplo, una sustancia citotóxica o un ligando receptor.
[0085]Otros objetivos a los que puede unirse el dímero o el anticuerpo o derivado del sexto aspecto son los antígenos descritos anteriormente con respecto al segundo aspecto.
[0086]En otra faceta particular del sexto aspecto, el anticuerpo o derivado del mismo es multiespecífico, en particular biespecífico, y se une a dicho patógeno, célula enferma o molécula de señalización celular con una región variable adicional.
[0087]Todos los términos utilizados con respecto al sexto aspecto tienen los significados definidos con respecto al primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto de la enseñanza, salvo que se definan específicamente de otro modo. Además, todas las facetas especificadas para el primer, segundo, tercer, cuarto y quinto aspecto que son aplicables al sexto aspecto también se contemplan para el sexto aspecto.
[0088]En un séptimo aspecto, la presente enseñanza se refiere a un método de aislamiento del anticuerpo o derivado del mismo del segundo aspecto, que comprende las etapas de
(i) proporcionar una solución que comprenda una cadena pesada A y una cadena ligera A de acuerdo con el primer aspecto, y una cadena pesada B y una cadena ligera B de acuerdo con el segundo aspecto, (ii)
(ii) purificar el anticuerpo o el derivado sin un medio para seleccionar el emparejamiento de la cadena pesada A con la cadena ligera A y/o el emparejamiento de la cadena pesada B con la cadena ligera B.
[0089]En particular, la solución puede comprender
- el anticuerpo o derivado del segundo aspecto,
- un anticuerpo o derivado que comprenda dos cadenas pesadas A de acuerdo con el primer aspecto, y - un anticuerpo o derivado que comprenda dos cadenas pesadas B como se define en el segundo aspecto.
[0090]En particular, la solución no comprende un anticuerpo o derivado en donde la cadena ligera A esté emparejada con la cadena pesada B ni/o en donde la cadena ligera B esté emparejada con la cadena pesada A.
[0091]En una faceta, la etapa (i) comprende expresar el uno o más polinucleótidos del tercer aspecto en una célula y, opcionalmente, lisar la célula. La purificación del anticuerpo o derivado puede incluir un medio conocido en la técnica, por ejemplo, fraccionamiento fisicoquímico (por ejemplo, precipitación diferencial, exclusión por tamaño o unión en fase sólida de inmunoglobulinas basada en el tamaño, la carga u otras características químicas compartidas de los anticuerpos), afinidad específica de clase o la afinidad específica de antígeno.
[0092]En una faceta particular, el anticuerpo o derivado del mismo es el anticuerpo o derivado del segundo aspecto de acuerdo con la "configuración Fab bivalente" o un anticuerpo simétrico o derivado del mismo del segundo aspecto (por ejemplo, en la "configuración de araña tetravalente"), y el anticuerpo o derivado se purifica sin un medio para seleccionar el emparejamiento de las cadenas pesadas, por ejemplo, un emparejamiento de la cadena pesada A con la cadena pesada B.
[0093]En otra faceta particular, en el que las cadenas pesadas del anticuerpo o derivado del mismo pueden comprender mutaciones de botón en ojal, el anticuerpo o derivado del mismo es el anticuerpo o derivado del segundo aspecto, tiene una forma de tipo IgG en forma de Y (incluyendo la "configuración IgG", la "configuración TBTI" y la "configuración CODV"), y el anticuerpo o derivado se purifica incluyendo un medio para seleccionar un emparejamiento de la cadena pesada A con la cadena pesada B. En particular, el medio para seleccionar un emparejamiento de la cadena pesada A con la cadena pesada B incluyen
- seleccionando la unión a la proteína A (por ejemplo, mediante cromatografía de proteína A),
- seleccionando la presencia de un dominio C<h>1 o un dominio C<l>(o C<k>) (por ejemplo, mediante cromatografía Kappa Select), o la ausencia de un dominio CH2, o
- seleccionando la unión a la proteína A (por ejemplo, mediante cromatografía de proteína A), seguido de la selección de la presencia de un dominio C<h>1 o un dominio C<l>(o C<k>) (por ejemplo, mediante cromatografía Kappa Select), o de la ausencia de un dominio CH2.
[0094]En una faceta particularmente ventajosa, en donde las regiones Fc de la cadena pesada A y la cadena pesada B comprenden mutaciones de botón en ojal y la región Fc de la cadena pesada A o la región Fc de la cadena pesada B comprenden una o más mutaciones que suprimen la unión a la Proteína A, y en donde la cadena pesada que comprende la mutación de ojal de las mutaciones de botón en ojal comprende la una o más mutaciones que suprimen la unión a la Proteína A, el método del séptimo aspecto no comprende la selección de la presencia de un dominio C<h>1 o un dominio C<l>(o C<k>) (por ejemplo, mediante cromatografía Kappa Select), o de la ausencia de un dominio CH2. La omisión de esta selección es posible ya que el enfoque de "botón en ojal" permite la dimerización también de dos cadenas pesadas "ojal", pero no la dimerización de dos cadenas pesadas "botón". Por lo tanto, si la cadena pesada "ojal" tiene la una o más mutaciones que disminuyen, y en particular, suprimen la unión a la proteína A y se selecciona con cromatografía de proteína A, se seleccionará contra los dímeros "ojal" y se aislará únicamente el anticuerpo biespecífico, sin ninguna etapa adicional.
[0095]Todos los términos utilizados con respecto al séptimo aspecto tienen los significados definidos con respecto al primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto aspecto de la enseñanza, salvo que se definan específicamente de otro modo. Además, todas las facetas especificadas para el primer, segundo, tercer, cuarto, quinto y sexto aspecto que son aplicables al séptimo aspecto también se contemplan para el séptimo aspecto.
[0096]Algunos anticuerpos ilustrativos están representados por las siguientes secuencias de aminoácidos:
Un anticuerpo de araña tetravalente (véase la Fig. 1E) que tiene
- cadenas ligeras A de acuerdo con la SEQ ID NO: 3, en donde los restos 1-113 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, - cadenas pesadas de acuerdo con la SEQ ID NO: 4, en donde los restos 1 -120 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente, y los restos 239-358 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, y
- cadenas ligeras B de acuerdo con la SEQ ID NO: 5, en donde los restos 1-107 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada.
[0097]Un anticuerpo IgG1 biespecífico (véase la Fig. 1A) con dominios MCH2, que tiene:
- una cadena ligera A de acuerdo con la SEQ ID NO: 6, en donde los restos 1-112 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, - una cadena pesada A de acuerdo con la SEQ ID NO: 7, en donde los restos 1-113 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, - una cadena ligera B de acuerdo con la SEQ ID NO: 8, en donde los restos 1-107 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, y - una cadena pesada B de acuerdo con la SEQ ID NO: 9, en donde los restos 1-118 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada.
[0098]Un anticuerpo IgG1 biespecífico (véase la Fig. 1A) con dominios MCH2, que tiene:
- una cadena ligera A de acuerdo con la SEQ ID NO: 10, en donde los restos 1-111 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, - una cadena pesada A de acuerdo con la SEQ ID NO: 11, en donde los restos 1-118 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, - una cadena ligera B de acuerdo con la SEQ ID NO: 12, en donde los restos 1-107 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, y - una cadena pesada B de acuerdo con la SEQ ID NO: 13, en donde los restos 1-123 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada.
[0099]Un Fab bivalente (Fig. 1B) en donde CH2<h>está unido a V<h>B en lugar de a DIM<h>, que tiene
- una cadena ligera A de acuerdo con la SEQ ID NO: 14, en donde los restos 1-112 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, - una cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO: 15, en donde los restos 1-121 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente, y en donde los restos 240-359 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, y
- una cadena ligera B de acuerdo con la SEQ ID NO: 16, en donde los restos 1-113 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada.
[0100]Un anticuerpo bivalente biespecífico, en donde dos dominios variables B forman parte, cada uno, de una cadena pesada, y estas cadenas pesadas HC1 y HC2 están emparejadas entre sí (emparejando de este modo los dominios variables B), y en donde la cadena pesada HC1 está unida a un dominio MCH2 unido a un dominio variable A, y el dominio MCH2 está emparejado con otro dominio MCH2 que está unido a un dominio variable A para formar una cadena ligera LC1 (emparejando de este modo los dominios variables A), que tiene
- una cadena ligera LC1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 17, en donde los restos 1-112 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, una cadena pesada HC1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 18, en donde los restos 1 -121 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente, y en donde los restos 240-359 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, y
- una cadena ligera LC2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 19, en donde los restos 1-113 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada. Un anticuerpo CH2E-pseudo-CODV (véase la Fig. 7A) que tiene
una cadena 1 de acuerdo con la SEQ ID NO: 20, en donde los restos 1-118 son el dominio variable 1 y los restos 120-242 son el dominio variable 2 (ambos pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada), y
una cadena 2 de acuerdo con la SEQ ID NO: 21, en donde los restos 1-107 son el dominio variable 2 y los restos 115-225 son el dominio variable 1 (ambos pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada).
[0101]Un pseudo bisagra-CH2E-híbrido-Fab2 (véase la Fig. 8A) que tiene
una cadena pesada A de acuerdo con la SEQ ID NO: 22, en donde los restos 1 -123 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, una cadena ligera A de acuerdo con la SEQ ID NO: 23, en donde los restos 1-106 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, una cadena pesada B de acuerdo con la SEQ ID NO: 24, en donde los restos 1-118 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, una cadena ligera B de acuerdo con la SEQ ID NO: 25, en donde los restos 1-111 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada,
[0102]Un anticuerpo IgG1 biespecífico (véase la Fig. 1A) con dominios ECH2, que tiene:
una cadena ligera A de acuerdo con la SEQ ID NO: 26, en donde los restos 1-110 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, una cadena pesada A de acuerdo con la SEQ ID NO: 27, en donde los restos 1-123 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, una cadena ligera B de acuerdo con la SEQ ID NO: 28, en donde los restos 1-111 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada, y una cadena pesada B de acuerdo con la SEQ ID NO: 29, en donde los restos 1-118 son el dominio variable B y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada.
[0103]Un anticuerpo trivalente (véase la Fig. 1F) con dominios MCH2, que tiene:
una cadena ligera A de acuerdo con la SEQ ID NO: 30, en donde los restos 1-111 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada (anti-IL13-(huzdBB13)-VL-huMCH2),
una cadena pesada A de acuerdo con la SEQ ID NO: 31, en donde los restos 1-118 son el dominio variable A y pueden sustituirse por un dominio variable que tenga una especificidad diferente a la ejemplificada (anti-IL13-(huzdBB13)-VH-huMCH2-hulgG1-Fc (ojal-RF)),
una cadena ligera B de acuerdo con la SEQ ID NO: 32, en donde los restos 118-224 son el dominio variable B y los restos 1-107 son el dominio variable Y, y ambos pueden sustituirse por dominios variables que tengan una especificidad diferente a las ejemplificadas (CODV-anti-IL4-(huzd8D4-8)-VL--anti-TNFalfa-(adalimumab)-VL--hulGLC2), y
una cadena pesada B de acuerdo con la SEQ ID NO: 33, en donde los restos 1-121 son el dominio variable B y los restos 122-244 son el dominio variable Y, y ambos pueden sustituirse por dominios variables que tengan una especificidad diferente a las ejemplificadas (CODV-anti-TNFalfa-(adalimumab)-VH-anti-IL4-(huzd8D4-8)-VH-hulGHG1(botón)). Este anticuerpo es triespecífico, pero los dominios variables pueden sustituirse también de forma que el anticuerpo sea biespecífico o monoespecífico.
[0104]En lugar de las cadenas anteriores, pueden utilizarse variantes de las mismas. Una variante tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de la que deriva, por ejemplo, la SEQ ID NO: 3 a 33. La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se realiza como se ha descrito anteriormente. Además, en todos los ejemplos anteriores, los dominios MCH2/ECH2 pueden intercambiarse por los dominios DIM/CH1Ck, según corresponda.
[0105]En las siguientes figuras y ejemplos se describen con más detalle algunas facetas particulares. Sin embargo, los detalles de las facetas particulares no pretenden limitar la enseñanza.
[0106] Descripción de las figuras:
Figura 1: ejemplos de configuraciones de anticuerpos o derivados facilitadas por la enseñanza. Diferentes dominios de dimerización aseguran el correcto emparejamiento de los dominios variables. A: configuración de IgG (no se muestran los conectores, excepto la unión Fc-Fab mediante la región de bisagra), B: configuración Fab bivalente (no se muestran los conectores, excepto la unión Fab-Fab; este conector puede unir alternativamente CH2<h>con DIM<l>, CH2<l>con DIM<h>o CH2i_con DIM<l>), C: configuración TBTI (no se muestran los conectores, excepto la unión Fc-Fab mediante la región de bisagra), D: configuración CODV, que muestra dos posibles configuraciones del conector en el brazo izquierdo y en el derecho (ambos brazos también pueden tener la misma configuración del conector, es decir, la del brazo izquierdo o la del derecho, mostrada), E: configuración de araña tetravalente (no se muestran los conectores excepto la unión Fc-Fab mediante la región de bisagra y los conectores Fab-Fab), F: configuración trivalente (ejemplo de la configuración quimera CODV) que contiene tres sitios de unión que permiten la mono-, bi- y tri-especificidad. El brazo derecho mostrado es un brazo CODV que tiene la configuración del conector del brazo derecho de la configuración CODV de la Fig. 1 D, pero también puede tener la configuración del conector de esta configuración CODV. El brazo izquierdo es un brazo de IgG convencional. Los brazos izquierdo y derecho son intercambiables, es decir, el brazo izquierdo puede ser el brazo CODV y el derecho el brazo de IgG. Además, se muestra que los dominios MCH2 están en el brazo de IgG, pero en su lugar pueden estar en el brazo CODV (independientemente de la configuración de su conector), estando entonces los dominios DIM en el brazo de IgG.
Figura 2: representación esquemática de la arquitectura del anticuerpo asimétrico. A: en una mitad de la estructura de tipo anticuerpo, la región CH1/kappa está reemplazada por los dominios MCH2. El Fc de la mitad que contiene el Fab es quimérico, portando el CH3 de IgG3, mientras que todos los demás dominios Fc son de origen IgG1. Una purificación en dos etapas, que incluyen la proteína A y la cromatografía kappa select, permite aislar la molécula heterodímera correctamente ensamblada. B: SDS-PAGE que muestra la composición de la cadena en condiciones reductoras. C: perfil de SEC del anticuerpo heterodímero purificado. Figura 3: representación esquemática de la arquitectura del anticuerpo asimétrico. A: en una mitad de la estructura de tipo anticuerpo, la región CH1/kappa está reemplazada por los dominios MCH2. La heterodimerización está guiada por mutaciones de "botones en ojales" dentro de las partes Fc. La parte Fc con las mutaciones de los ojales contiene además la mutación RF. Una purificación en dos etapas, que incluyen la proteína A y la cromatografía kappa select, permite aislar la molécula heterodímera correctamente ensamblada. B: SDS-PAGE que muestra la composición de la cadena en condiciones reductoras. C: perfil de SEC del anticuerpo heterodímero purificado.
Figura 4: configuración de araña tetravalente. A: representación esquemática de la estructura simétrica de tipo IgG. Una cromatografía de proteína A de una única etapa permite aislar la molécula homodímera correctamente ensamblada. B: SDS-PAGE que muestra la composición de la cadena en condiciones reductoras. C: perfil de SEC del anticuerpo heterodímero purificado. D y E: sensogramas Biacore que presentan la unión a los correspondientes antígenos.
Figura 5: representación esquemática de la arquitectura del anticuerpo asimétrico. A: en una mitad de la estructura de tipo anticuerpo, la región CH1/kappa está reemplazada por los dominios ECH2. La heterodimerización está guiada por mutaciones de "botones en ojales" dentro de las partes Fc. La parte Fc con las mutaciones de botón contiene además la mutación RF. B: SDS-PAGE que muestra la composición de la cadena en condiciones reductoras. C: perfil de SEC de la proteína purificada. D: sensogramas Biacore que presentan la unión a la L4 y la IL13.
Figura 6: configuración Fab bivalente. A: representación esquemática del fragmento Fab bivalente biespecífico. B: perfil de SEC de la proteína purificada. C y D: sensogramas Biacore que presentan la unión a<c>D3 y CD123, respectivamente.
Figura 7: configuración CODV de Fab bivalente (EC<h>2). A: representación esquemática de la arquitectura de la proteína. B: perfil de SEC de la proteína purificada. C: sensogramas Biacore que presentan la unión tanto a la IL4 como a la IL13.
Figura 8: configuración de tipo F(ab’)2. A: representación esquemática del fragmento bivalente biespecífico de tipo F(ab')2. B: perfil de SEC del anticuerpo heterodímero purificado. C: SDS-PAGE que presenta la composición de la cadena en condiciones reductoras. D: sensogramas Biacore que presentan la unión a la L4 y la IL13.
Descripción de los ejemplos:
Material y métodos
Generación de plásmidos de expresión
[0107]Todas las construcciones descritas se construyeron a partir de fragmentos de síntesis génica (GeneArt), se escindieron con enzimas de restricción y se ligaron en el vector de expresión de mamífero pXL. El vector se utilizó para transformarE. coli,y los clones se seleccionaron y se amplificaron para aislar el ADN para una transfección temporal utilizando kits de Qiagen. La secuencia de ADN se verificó mediante la secuenciación del ORF pertinente y el contexto de la secuencia. Los ORF codificantes resultantes se ajustan a las secuencias antes enumeradas y descritas.
Expresión de las proteínas recombinantes
[0108]Todos los ciclos de producción de proteínas se realizaron mediante expresión temporal. Se transfectaron con el plásmido de expresión células HEK293 (Life) que crecían en un cultivo en suspensión sin suero F17 (Life). Las transfecciones se realizaron utilizando el reactivo de transfección Cellfectin (Life). Las células se cultivaron a 37 °C durante 7 días con un 8 % de CO<2>en frascos agitadores. El sobrenadante del cultivo que contenía la proteína recombinante se recogió por centrifugación y se clarificó por filtración (0,22 gm). Las construcciones de IgG1 recombinante se purificaron mediante cromatografía de afinidad en proteína A (columnas HiTrap Protein A HP, GE Life Sciences). Tras la elución de la columna con tampón de acetato 100 mM y NaCl 100 mM, pH 3,5, las construcciones CODV-lgG1 se desalaron utilizando las columnas de desalación HiPrep 26/10, formuladas en PBS a una concentración de 1 mg/ml, y se filtraron con una membrana de 0,22 gm. Las construcciones de tipo Fab se purificaron mediante una IMAC en columnas HiTrap IMAC HP (GE Life Sciences). Tras la elución de la columna con un gradiente lineal (tampón de elución: fosfato sódico 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 50-500 mM, pH 7,4), se agruparon las fracciones que contenían proteínas y se desalaron utilizando las columnas de desalación HiPrep 26/10, formuladas en PBS a una concentración de 1 mg/ml, y se filtraron utilizando una membrana de 0,22 gm. Para la purificación de las construcciones heterodímeras asimétricas, las muestras de proteínas se aplicaron adicionalmente en la columna HisTrap (GE) y/o se capturaron mediante Kappa select (GE) tras la captura en la proteína A y la etapa de desalación. La proteína se refinó mediante una SEC utilizando una Superdex 200 (GE). Tras una última etapa de concentración por ultrafiltración, la proteína se utilizó para diferentes ensayos. Esta estrategia se utilizó para aislar los heterodímeros de los homodímeros. La concentración de proteínas se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm. Cada lote se analizó mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras para determinar la pureza y el peso molecular de cada subunidad y del monómero.
Caracterización de las variantes MCH2 y ECH2
[0109]Para determinar si las cadenas pesadas y ligeras de las proteínas de tipo anticuerpo MCH2 y ECH2 se emparejaban y plegaban correctamente, se midió el nivel de agregación mediante una cromatografía analítica de exclusión por tamaño (SEC). La SEC analítica se realizó con pares ensamblados utilizando un ÁKTA explorer 10 (GE Healthcare) equipado con una columna TSKgel G3000SWXL (7,8 mm x 30 cm) y una columna de guarda TSKgel SWXL (Tosoh Bioscience). El análisis se realizó a 1 ml/min utilizando NaCl 250 mM, fosfato sódico 100 mM, pH 6,7, con detección a 280 nm. Se aplicaron 30 gl de muestra de proteína (a 0,5-1 mg/ml) en la columna. Para la estimación del tamaño molecular, la columna se calibró utilizando una mezcla patrón para filtración en gel (MWGF-1000, SIGMA Aldrich). La evaluación de los datos se realizó con el programa informático UNICORN v5.11.
Análisis de la unión mediante SPR
[0110]Se seleccionaron dos pares de cadenas pesadas y ligeras para el análisis cinético completo. La IL13 y la IL4 humanas recombinantes se adquirieron en Chemicon (EE.UU.). La caracterización cinética de anticuerpos purificados se realizó utilizando tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) con un BIACORE 3000 (GE Healthcare). Se utilizó un ensayo de captura con un anticuerpo específico de la especie (por ejemplo, MAB 1302 específico para el Fc humano, Chemicon) para la captura y orientación de los anticuerpos investigados. El anticuerpo de captura se inmovilizó a través de los grupos amino primarios (11000 UR) en un chip CM5 de calidad para investigación (GE Life Sciences) utilizando procedimientos convencionales. El anticuerpo analizado se capturó a un caudal de 10 pl/min con un valor ajustado de UR que daría como resultado la máxima unión al analito de 30 UR. Se midió la cinética de unión frente a la IL4 y la IL13 humanas recombinantes a lo largo de un intervalo de concentración de entre 0 y 25 nM en HBS EP (HE<p>E<s>10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y un 0,005 % de tensioactivo P20) a un caudal de 30 pl/min. Las superficies de los chips se regeneraron con glicina 10 mM, pH 2,5. Se analizaron los parámetros cinéticos y se calcularon en el paquete de programas BIAevaluation v4.1 utilizando una celda de flujo sin anticuerpo capturado como referencia.
Eliminación celular "redirigida"
[0111]Se aislaron leucocitos monomorfonucleares en la sangre periférica (PBMC) a partir de 200 ml de sangre periférica de donantes sanos tratada con EDTA mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll. Se precargaron 15 ml de Histopaque (Sigma-Aldrich) en un Leucosep-Tube de 50 ml (Greiner bio-one). La sangre se diluyó con tampón de aclarado autoMACS 1 % de BSA (Miltenyi Biotec) y se cargó en la membrana de un total de diez tubos preparados. Los tubos se centrifugaron sin freno durante 10 min a 1000 xg. Se recogieron los PBMC y se lavaron tres veces con tampón de aclarado autoMACS 1 % de BSA. Por último, los PBMC se resuspendieron en tampón de electroforesis autoMACS (Miltenyi Biotec) para el aislamiento de los linfocitos T mediante la tecnología autoMACSpro utilizando el kit de aislamiento de células Pan T (Miltenyi Biotec) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La pureza de los linfocitos T separados se analizó mediante citometría de flujo MACSQuant utilizando el kit de inmunofenotipado humano 7-Color (Miltenyi Biotec). El efecto de captación de linfocitos T de los anticuerpos biespecíficos se analizó mediante un ensayo citotóxico basado en citometría de flujo. Las células objetivo (es decir, la estirpe celular THP-1) se tiñeron durante 15 min a 37 °C con CFSE 1 pM en 1 ml de RPMI GlutaMAX I (Gibco) por 1E7 células. Después, las células se lavaron dos veces y se resuspendieron en RPMI GlutaMAX I 10 % de FCS (Invitrogen). Se sembraron 2,5E4 células objetivo en placas de cultivo en suspensión con fondo en U de 96 pocillos (Greiner bio-one) en 50 pl de medio por pocillo. Los linfocitos T humanos primarios aislados se resuspendieron en RPMI GlutaMAX I 10 % de FCS y se añadieron en la proporción efector-objetivo indicada en 50 pl por pocillo a las células objetivo (en general E:T=10:1). Los anticuerpos biespecíficos se diluyeron a 1:3 en serie en PBS (Invitrogen) y se añadieron 5 pl de cada uno a las células a una concentración final máxima de 3000 ng/ml. El ensayo se incubó durante 20 h a 37 °C en un 5 % de CO2. Para detectar las células objetivo muertas, se tiñeron todas las células con 7-AAD. Por lo tanto, se añadieron 5 pg/ml de 7-AAD diluido en tampón de tinción con FBS (BD Pharmingen) a cada pocillo y se incubaron durante 15 min a 4 °C en la oscuridad. Las células se midieron con el citómetro de flujo MACSQuant (Miltenyi Biotec) o LSRII (BD), respectivamente. Los análisis posteriores de los datos se realizaron con el programa informático FlowJo (Tree Star, Inc.). El resultado fue el porcentaje de células doblemente positivas para CFSE y 7-AAD. Los resultados de estas investigaciones demuestran la capacidad de los Fab CD123xCD3 para mediar en la eliminación redirigida de células tumorales.
Ejemplo 1: configuración IgG (MCh2), mutaciones RF
[0112]Como se describe en la sección Material y métodos, se generó un anticuerpo en la configuración IgG que comprende un dominio IgG3-CH3 en una cadena Fc y un dominio IgG1-CH3 en la otra, y los dominios variables son de la IL13 y la IL4, en donde los dominios CH2<h>y CH2<l>son un dominio constante MC<h>2 de IgM (véase la Fig. 2A). Se purificó con las siguientes etapas:
1. Cromatografía de la proteína A
2. Cromatografía Kappa Select
3. Desalación en HiPrep 26/10
[0113]El rendimiento fue de 4 mg/l. La SDS-PAGE en NuPAGE® Novex® con un 4-12 % de Bis-Tris (Fig. 2B) mostró el número y tamaño esperados de fragmentos en condiciones reductoras. El análisis mediante SEC de la proteína purificada mostró un nivel de monómeros del 96 % (Fig. 2C). El análisis mediante Biacore mostró una unión a los correspondientes antígenos y una cinética de unión como la esperada a partir de los anticuerpos parentales (Tabla 2).
Tabla 2:Cinética de unión del anticuerpo biespecífico purificado contra la IL4 la IL13
Ejemplo 2: Configuración de la IgG (MCh2), RF y mutaciones de botón en ojal
[0114]Como se describe en la sección Material y métodos, se generó un anticuerpo en la configuración IgG que comprende las mutaciones H435R e Y436F (mutaciones RF) en un dominio CH3, así como las mutaciones de botón en ojal y los dominios variables de unión a IL13 e IL4 (véase la Fig. 3A). Se purificó con las siguientes etapas:
1. Cromatografía de la proteína A
2. Cromatografía Kappa Select
3. Desalación en HiPrep 26/10
[0115]El rendimiento fue, con 10 mg/l, más del doble que para la variante descrita en el ejemplo 1, lo que indica una mayor eficacia de la asociación correcta de cadenas guiada por la modificación de botón en ojal de los fragmentos Fc. La SDS-PAGE en NuPAGE® Novex® con un 4-12 % de Bis-Tris (Fig. 3B) mostró, en condiciones reductoras, el número y tamaño esperados de fragmentos. El análisis mediante SEC de la proteína purificada mostró un nivel de monómeros del 96 % (Fig. 3C). El análisis mediante Biacore mostró una unión a los correspondientes antígenos y una cinética de unión como la esperada a partir de los anticuerpos parentales.
Ejemplo 3: configuración de araña tetravalente
[0116]Como se describe en la sección Material y métodos, se generó un anticuerpo en la configuración de araña tetravalente (véase la Fig. 4A). Se purificó con las siguientes etapas:
1. Cromatografía de la proteína A
2. Desalación en HiPrep 26/10
[0117]El rendimiento fue de 5 mg/l. La SDS-PAGE en NuPAGE® Novex® con un 4-12 % de Bis-Tris (Fig. 4B) mostró todos los fragmentos esperados con el tamaño esperado en condiciones no reductoras. El análisis mediante SEC mostró un nivel de monómeros del 98 % (Fig. 4C). El análisis mediante Biacore (Fig. 4D y E) mostró la unión contra los correspondientes antígenos.
Ejemplo 4: configuración IgG (ECh2), RF y mutaciones de botón en ojal
[0118]Este anticuerpo bivalente biespecífico (véase la Fig. 5A) contiene un dominio CH2 de la IgE humana (Uniprot P01854) desde la posición de aminoácido 104 a la 210. El dominio contiene la mutación de la cisteína 105 a alanina para evitar la reactividad indeseada de la cys, y la mutación de la asparagina 146 a glutamina para evitar la glicosilación. En los siguientes ejemplos, se denomina "CH2E". Para fusionar la parte CH2E con la HC de la construcción, se introdujo un conector flexible (GSGSGS).
[0119]En el ejemplo se utilizan los dominios variables"huBB13'y"hu8D4-8"que reconocen antígenos: las IL4 e IL13 descritas anteriormente (documento US 20100226923 A1) compuestas en una estructura de tipo IgG que consiste en dos Fab diferentes, cada uno de los cuales representa un VD objetivo diferente fusionado a un dominio IgG1-Fc modificado. Para mejorar la expresión y la formación de heterodímeros KIH (botón en ojal), se introdujeron mutaciones en los dominios CH3. Las mutaciones L234A, L235A (Hezareh et al. 2001, J. Virol., 75: 12161) se incorporaron para evitar la función efectora de la cadena principal de Fc. El dominio ECH2 reemplaza a CH1/kappa.
[0120]El anticuerpo comprende las cadenas
anti-IL4(hu8D4-8-VL1 )-CL1gk
anti-IL4(hu8D4-8-VH1)-CH1g-Fc(IgG1 LALA botón RF)
anti-IL13-VL(huBB13-VL3)-CH2e
anti-IL13-(huBB13-VH2)-CH2e-Fc(IgG1 LALA ojal)
[0121]Se realizó una cromatografía de afinidad en dos etapas para garantizar el enriquecimiento de los pares de cadenas heterodímeras. La proteína se capturó conHiTrap Protein A de 5 ml (GE Healthcare)y se eluyó por cambio de pH. Se recogieron las fracciones de proteínas y se intercambió instantáneamente el tampón a PBS mediante unacolumna de desalación HiPrep 26/10de 53 ml (GE Healthcare).La solución de proteína se aplicó a laHiTrap KappaSelect de 5 ml (GE Healthcare)y se eluyó mediante cambio de pH. Se recogieron las fracciones que contenían proteínas y se intercambió instantáneamente el tampón a PBS mediante unacolumna de desalación HiPrep 26/10de 53 ml (GE Healthcare).Las fracciones se agruparon y el volumen de la muestra se redujo a través de una ultrafiltración. La proteína se refinó mediante una SEC utilizando una columnaSuperdex200(GE Healthcare).Tras una última etapa de ultrafiltración y filtración a 0,22 pm, la solución de proteína se utilizó para ensayos adicionales.
[0122]El rendimiento tras la purificación fue de 18 mg/l. La SDS-PAGE en NuPAGE® Novex® con un 4-12 % de Bis-Tris (Fig. 5B) mostró el número y tamaño esperados de fragmentos en condiciones reductoras. El análisis mediante SEC de la proteína purificada mostró un nivel de monómeros del -99 % (Fig. 5C). El análisis mediante Biacore mostró la unión a los correspondientes antígenos IL4 e IL13 (Fig. 5D).
Ejemplo 5: configuración Fab bivalente
[0123]Como se describe en la sección Material y métodos, se generó un anticuerpo en la configuración de Fab bivalente, en donde los dos Fab están unidos a través de un enlace de un dominio MCH2 de un fragmento de tipo Fab (CD3) a un dominio variable del otro Fab (CD123), véase la Figura 6A. El rendimiento fue de 7 mg/l. El análisis mediante SEC mostró un nivel de monómeros del 97 % (Fig. 6B). El análisis mediante Biacore mostró la unión a los correspondientes antígenos (Fig. 6C y D) y las cinéticas de unión como se esperaban a partir de los anticuerpos parentales (Tabla 3)
Tabla 3: in i ni n l F iv l n i ífi rifi n r D D12
Ejemplo 6: configuración CODV de Fab bivalente (ECh2)
[0124]El fragmento biespecífico de tipo F (véase la Fig. 7A) contiene un dominio CH2 de IgE humana (Uniprot P01854) desde la posición de aminoácido 104 a la 210. El dominio contiene la mutación de la cisteína 105 a alanina para evitar la reactividad indeseada de la cys, y la mutación de la asparagina 146 a glutamina para evitar la glicosilación. En el ejemplo se utilizan los dominios variables”huBB13' y"hu8D4-8'que reconocen los antígenos IL4 e IL13 descritos anteriormente (documento US 20100226923 A1). La molécula está compuesta en el formato CODV. En este ejemplo, el dominio ECH2 reemplaza a los dominios CH1 y CL situados normalmente en el extremo carboxiterminal de ambas cadenas para conectar HC y LC a través de puentes de disulfuro. Se añadió una etiqueta de histidina 8x para la purificación.
[0125]El anticuerpo comprende 2 cadenas únicas:
Cadena 1: anti-IL13(huBB13-VH2)-anti-IL4(hu8D4-8-VH1)-ECH2-His
Cadena 2: anti-IL4(hu8D4-8-VL1)-anti-IL13(huBB13-VL2)-ECH2
[0126]La proteína marcada con His se capturó enHisTrap High Performance de 5 ml(GE Healthcare)y se eluyó mediante un gradiente de imidazol. La proteína se refinó mediante una SEC conSuperdex 200(GE Healthcare)Mediante un etapa final de concentración por ultrafiltración, la proteína se concentró y se utilizó para ensayos adicionales. La Fig. 7B muestra el perfil de la SEC del fragmento de tipo Fab tras la purificación. El análisis mediante Biacore mostró la unión tanto de la IL4 como de la IL13 (Fig. 7C).
Ejemplo 7: configuración de tipo F(ab')2 (ECh2 reemplaza a la región de bisagra)
[0127]Este anticuerpo de tipo F(ab')2 (véase la Fig. 8A) contiene un dominio CH2 de la IgE humana (Uniprot P01854) desde la posición de aminoácido 104 a la 210. El dominio contiene la mutación de la cisteína 105 a alanina para evitar la reactividad indeseada de la cys, y la mutación de la asparagina 146 a glutamina para evitar la glicosilación. También en este ejemplo se introdujo la inclusión de un conector flexible que conecta el dominio CH2E en la cadena pesada. En el ejemplo se utilizan los dominios variables”huBB13' y"hu8D4-8'que reconocen los antígenos IL4 e IL13 descritos anteriormente (documento US 20100226923 A1) compuestos en un formato de tipo Fab<2>. En este ejemplo, el dominio ECH2 reemplaza a la región de bisagra para conectar dos módulos Fab a través de partes HC. La generación de una molécula biespecífica se realiza a través de la heterodimerización de dos Fab diferentes que representan dos especificidades objetivo distintas. Un brazo Fab contiene un dominio MCH2, y el otro corresponde a una estructura Fab natural. En este ejemplo, el VD anti-IL4 está unido a un dominio CH1/kappa, y el VD anti-IL13 está fusionado a un dominio MCH2 modificado. Se añadió una etiqueta de histidina 8x en el Cter de un dominio ECH2 para su purificación.
[0128]El anticuerpo comprende 4 cadenas únicas:
anti-IL4 (hu8D4-8-VH1)-CH1g-CH2e
anti-IL4 (hu8D4-8-VL1)-Ck
anti-IL13 (huBB13-VH2)-MCH2-ECH2-8xHis
anti-IL13 (huBB13-VL3)-MCH2
[0129]Se realizó una cromatografía de afinidad en dos etapas para garantizar el enriquecimiento de los pares de cadenas heterodímeras. La proteína se capturó medianteHiTrap KappaSelect de 5 ml (GE Healthcare)y se eluyó siguiendo las instrucciones del fabricante por cambio de pH. Mediante una columna de desalación, el tampón se cambió inmediatamente a PBS. Después, la solución de proteínas se aplicó aHisTrap High Performancede 5 ml (GE Healthcare) y se eluyó mediante un gradiente de imidazol. Posteriormente, las fracciones que contenían proteínas se agruparon y se refinaron más mediante una SEC utilizando un Superdex 200 (GEHealthcare).Tras una última etapa de concentración por ultrafiltración, la proteína se utilizó para ensayos adicionales. El perfil de la SEC tras la purificación reveló una fracción monómera del -99 % (Fig. 8B). Una SDS PAGE reductora (Novex, 4-12 % de Bis-Tris) mostró los 4 tamaños de fragmento esperados (Fig. 8C). La construcción es capaz de unirse tanto a la IL4 como a la IL13, como demuestra el análisis mediante Biacore (Fig. 8D).

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo o derivado del mismo, que comprende
A) un dímero de una cadena pesada A y una cadena ligera A, en donde la cadena pesada comprende un dominio variable V<h>A unido a un dominio de dimerización CH2<h>, y la cadena ligera comprende un dominio variable V<l>A unido a un dominio de dimerización CH2<l>, y en donde tanto CH2<h>como CH2<l>son un dominio constante MC<h>2 de IgM o un dominio constante EC<h>2 de IgE, y
B) un dímero de una cadena pesada B y una cadena ligera B, en donde la cadena pesada B comprende un dominio variable V<h>B y la cadena ligera comprende un dominio variable V<l>B, en donde V<h>B y V<l>B están unidos a dominios de dimerización diferentes de CH2<h>y CH2<l>,
en donde el anticuerpo o derivado es multiespecífico.
2. El anticuerpo o derivado de la reivindicación 1, en donde V<h>A está unido a CH2<h>directamente o a través de un conector que tiene una longitud de hasta 30 aminoácidos, y en donde V<l>A está unido a CH2<l>directamente o a través de un conector que tiene una longitud de hasta 30 aminoácidos.
3. El anticuerpo o derivado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que comprende una primera y una segunda cadena pesada A y una primera y una segunda cadena ligera A, cada una como se define en la reivindicación 1, en donde
(i) el dominio CH2<l>de la primera cadena ligera A está unido al dominio V<h>1 o V<l>1 de un anticuerpo IgG o derivado del mismo, y el dominio CH2<l>de la segunda cadena ligera A está unido al otro dominio V<h>1 o V<l>1 del anticuerpo IgG o derivado del mismo, o
(ii) el dominio CH2<h>de la primera cadena ligera A está unido al dominio V<h>1 o V<l>1 de un anticuerpo IgG o derivado del mismo, y el dominio CH2<h>de la segunda cadena ligera A está unido al otro dominio V<h>1 o V<l>1 del anticuerpo IgG o derivado del mismo.
4. El anticuerpo o derivado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde el anticuerpo o derivado es asimétrico, y en donde preferentemente V<h>B está unido a un dominio de dimerización DIM<h>y V<l>B está unido a un dominio de dimerización DIM<l>, en donde DIM<h>y DIM<l>son dominios de dimerización diferentes de CH2<h>y CH2<l>, respectivamente, y forman un dímero.
5. El anticuerpo o derivado de la reivindicación 4, en donde V<h>B está unido a un dominio de dimerización DIM<h>y V<l>B está unido a un dominio de dimerización DIM<l>, en donde DIM<h>y DIM<l>son dominios de dimerización diferentes de CH2<h>y CH2<l>, respectivamente, y en donde
(i) DIM<h>está unido al CH2<h>o al CH2<l>, o DIM<l>está unido al CH2<h>o al CH2<l>,
(ii) CH2<h>está unido a través de una región de bisagra a un dominio constante C<h>2A, DIM<h>está unido a través de una región de bisagra a un dominio constante C<h>2B, y opcionalmente C<h>2A está unido a un dominio constante CH3A, y CH2B está unido a un dominio constante CH3B, o
(iii) además de ii), la cadena pesada A comprende además otro dominio variable de cadena pesada V<h>X unido a V<h>A, y la cadena ligera A comprende además otro dominio variable de cadena ligera V<l>X unido a V<l>A; y/o la cadena pesada B comprende además otro dominio variable de cadena pesada VHY unido a VHB, y la cadena ligera B comprende además otro dominio variable de cadena ligera V<l>Y unido a V<l>B.
6. El anticuerpo o derivado de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en donde el anticuerpo o derivado del mismo comprende una o más modificaciones que facilitan el aislamiento del anticuerpo, en donde la una o más modificaciones facilitan preferentemente el emparejamiento de la cadena pesada A con la cadena pesada B o permiten seleccionar este emparejamiento, y en donde las modificaciones son preferentemente una o más de:
- una mutación T366Y y opcionalmente además una mutación S354C y T166W en una cadena pesada, y una mutación Y407T y opcionalmente además una mutación Y349C, T366S, L368A e Y407V en la otra cadena pesada,
- una mutación T366W en una cadena pesada, y una mutación T366S, L368A e Y407V en la otra cadena pesada,
- una mutación F405L en una cadena pesada, y una mutación K409R en la otra cadena pesada,
- una mutación T350V, L351Y, F405A e Y407V en una cadena pesada, y una mutación<t>350V, T366L, K392L y T394W en la otra cadena pesada,
- una mutación K409D y K392D en una cadena pesada, y una mutación D399K y E356K en la otra cadena pesada,
- una mutación D221E, P228E y L368E en una cadena pesada, y una mutación D221R, P228R y K409R en la otra cadena pesada,
- una mutación S364H y F405A en una cadena pesada, y una mutación Y349T y T394F en la otra cadena pesada,
- una quimera IgG/A para una cadena pesada y una quimera IgA/G para la otra cadena pesada,
- una región Fc o parte de la misma de una cadena pesada de IgG3, y una región Fc o parte de la misma de la otra cadena pesada de IgG1, IgG2 o IgG4,
- una mutación H435R e Y436F en una cadena pesada, y una mutación T407T en la otra cadena pesada, y/o - una mutación H435R en una cadena pesada, y ninguna mutación en la otra cadena pesada.
7. El anticuerpo o derivado de la reivindicación 6, en donde las cadenas pesadas comprenden mutaciones de botón en ojal y una o más mutaciones que disminuyen la unión a la Proteína A, y en donde preferentemente la cadena pesada que comprende la mutación o mutaciones de ojal de las mutaciones de botón en ojal comprende la una o más mutaciones que disminuyen la unión a la Proteína A.
8. Uno o más polinucleótidos que codifican el anticuerpo o derivado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Uno o más vectores de expresión que comprenden el uno o más polinucleótidos de la reivindicación 8.
10. Una célula que comprende el uno o más polinucleótidos de la reivindicación 8 o el uno o más vectores de expresión de la reivindicación 9.
11. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y el anticuerpo o derivado de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
12. Un método de aislamiento del anticuerpo o derivado del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende las etapas de
(i) proporcionar una solución que comprenda una cadena pesada A y una cadena ligera A y una cadena pesada B y una cadena ligera B, como se define en la reivindicación 1,
(ii) purificar el anticuerpo o el derivado sin un medio para seleccionar el emparejamiento de la cadena pesada A con la cadena ligera A y/o el emparejamiento de la cadena pesada B con la cadena ligera B.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo o derivado se purifica con un medio para seleccionar un emparejamiento de la cadena pesada A con la cadena pesada B, y en donde el medio es
a) selección de la unión a la proteína A,
b) selección de la presencia de un dominio C<h>1 o un dominio C<k>, o la ausencia de un dominio CH2, o c) una combinación de a) y b), preferentemente en ese orden.
14. El método de la reivindicación 12, en donde el anticuerpo o derivado del mismo es el de la reivindicación 6, en donde la cadena pesada que comprende la mutación o mutaciones de ojal de las mutaciones de botón en ojal comprende la una o más mutaciones que disminuyen la unión a la proteína A, y en donde el anticuerpo o derivado se purifica seleccionando la unión a la proteína A,caracterizado por queel método no comprende seleccionar la presencia de un dominio C<h>1 o un dominio C<k>, o la ausencia de un dominio CH2.
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