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ES2967467T3 - Combinación de una terapia celular y un compuesto inmunomodulador - Google Patents

Combinación de una terapia celular y un compuesto inmunomodulador Download PDF

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ES2967467T3
ES2967467T3 ES18730161T ES18730161T ES2967467T3 ES 2967467 T3 ES2967467 T3 ES 2967467T3 ES 18730161 T ES18730161 T ES 18730161T ES 18730161 T ES18730161 T ES 18730161T ES 2967467 T3 ES2967467 T3 ES 2967467T3
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administration
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Michael Ports
Melissa Works
Oleksandr Baturevych
Ruth Salmon
Ronald Hause
Timothy Johnstone
David Kugler
Jon Jones
Neha Soni
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Juno Therapeutics Inc
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Abstract

La presente divulgación se refiere en algunos aspectos a métodos, composiciones y usos que implican inmunoterapias, tales como terapia celular adoptiva, por ejemplo, terapia de células T, y un compuesto inmunomodulador, tal como un análogo o derivado estructural o funcional de talidomida y/o un inhibidor de E3-ubiquitina ligasa. Los métodos, composiciones y usos proporcionados incluyen aquellos para terapias combinadas que implican la administración o el uso de uno o más compuestos inmunomoduladores junto con una terapia de células T, tal como una terapia de células T genéticamente modificada que involucra células diseñadas con un receptor recombinante, tal como quimérico. Células T que expresan el receptor de antígeno (CAR). También se proporcionan composiciones, métodos de administración a sujetos, artículos de fabricación y kits para usar en los métodos. En algunos aspectos, las características de los métodos y células proporcionan una actividad, eficacia, persistencia, expansión y/o proliferación aumentada o mejorada de células T para terapia celular adoptiva o células T endógenas reclutadas por agentes inmunoterapéuticos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Combinación de una terapia celular y un compuesto inmunomodulador
CAMPO
Campo
[0001] La presente divulgación se refiere en algunos aspectos a métodos, composiciones y usos que implican inmunoterapias, en particular terapia celular adoptiva, en particular terapia celular T, y un compuesto inmunomodulador, tal como un análogo o derivado estructural o funcional de talidomida y/o un inhibidor de E3-ubiquitina ligasa. Los métodos, composiciones y usos proporcionados incluyen los de terapias combinadas que implican la administración o el uso de uno o más compuestos inmunomoduladores junto con una terapia de células T, en particular una terapia de células T modificadas genéticamente que implica células modificadas genéticamente con un receptor recombinante, en particular células T que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR). En algunos aspectos, las características de los métodos y las células proporcionan una mayor o mejor actividad, eficacia, persistencia, expansión y/o proliferación de células T para terapia celular adoptiva o células T endógenas reclutadas por agentes inmunoterapéuticos.
Fondo
[0002] Existen varias estrategias para la inmunoterapia, por ejemplo la administración de células T modificadas para la terapia adoptiva. Por ejemplo, existen estrategias para diseñar células T que expresen receptores de antígenos modificados genéticamente, como CAR, y administrar composiciones que contengan dichas células a los sujetos. Se necesitan estrategias mejoradas para aumentar la eficacia de las células, por ejemplo, mejorando la persistencia, actividad y/o proliferación de las células tras su administración a los sujetos. Se proporcionan métodos, composiciones, kits y sistemas que satisfacen tales necesidades.
[0003] Otáhal et al. (2016) Oncoimmunology, 5(4):e1115940, describe cómo la lenalidomida potencia las funciones antitumorales de las células T modificadas con receptores de antígenos quiméricos.
[0004] Wang et al. (2016) Blood, 128(22):812, describe cómo la lenalidomida potencia la función de las células-t redirigidas por receptores de antígenos quiméricos CS1 contra el mieloma múltiple.
Resumen
[0005] La presente invención se expone en el juego de reivindicaciones adjunto.
[0006] Cualquier referencia en el presente documento a métodos de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia se refiere a compuestos, composiciones o medicamentos para su uso en dichos métodos.
[0007] En el presente documento se proporcionan terapias combinadas que implican la administración de una inmunoterapia que afecta a la función o actividad de las células T, en particular una terapia de células T, y un compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la E3-ubiquitina ligasa. En algunos aspectos, los métodos proporcionados mejoran o modulan la proliferación y/o actividad de la actividad de células T asociada con la administración de una inmunoterapia o agente inmunoterapéutico, en particular una composición que incluye células para terapia celular adoptiva, en particular una terapia de células T, en particular células T que expresan CAR. En la presente invención, la terapia combinada implica generalmente la administración de un compuesto inmunomodulador, como un análogo estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la E3-ubiquitina ligasa (por ej. lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona)), y la administración de la terapia celular T, en particular una composición que incluye células para terapia celular adoptiva, en particular una terapia celular T, en particular células T que expresan CAR.
[0008] En el presente documento se proporcionan métodos de tratamiento que implican: (a) administrar una terapia de células T a un sujeto que padece una enfermedad o afección; y (b) administrar al sujeto un compuesto inmunomodulador. En particular, la presente invención proporciona una terapia de células T y un compuesto inmunomodulador para su uso en un método de tratamiento del cáncer, en el que el método comprende:
(a) administrar una terapia de células T a un sujeto que padece una enfermedad o afección cancerosa, en la que la terapia de células T es o comprende células modificadas genéticamente que expresan un receptor recombinante que se une específicamente a un antígeno, en la que el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR), y en la que el CAR comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral, un espaciador y una región de señalización intracelular; y
(b) administrar al sujeto un compuesto inmunomodulador, en el que dicho compuesto inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste en: análogos de talidomida; derivados de talidomida; compuestos que interactúan con y/o se unen a cereblon (CRBN) y/o uno o más miembros del complejo ubiquitina-ligasa E3 de CRBN; inhibidores de Ikaros (IKZF1); inhibidores de Aiolos (IKZF3); y compuestos que potencian o promueven la ubiquitinación y/o degradación de Ikaros (IKZF1) y/o Aiolos (IKZF3),
donde el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador se lleva a cabo entre 7 y 21 días después del inicio de la administración de la terapia de células T, y
en el que el compuesto inmunomodulador se administra por vía oral.
[0009] En el presente documento se proporcionan métodos de tratamiento que implican administrar un compuesto inmunomodulador a un sujeto que padece una enfermedad o afección, en los que, en el momento de iniciar la administración del compuesto inmunomodulador, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia de células T para el tratamiento de la enfermedad o afección y, opcionalmente, una muestra de sangre o biopsia del sujeto contiene niveles detectables de células T de una terapia de células T de ingeniería. En particular, la presente invención proporciona además un compuesto inmunomodulador para su uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método administrar un compuesto inmunomodulador a un sujeto que tiene una enfermedad o afección que es cáncer, en el que, en el momento de iniciar la administración del compuesto inmunomodulador, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia de células T para el tratamiento de la enfermedad o afección, en la que la terapia de células T es o comprende células modificadas genéticamente que expresan un receptor recombinante que se une específicamente a un antígeno, en la que el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR), y en la que el CAR comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral, un espaciador y una región de señalización intracelular,
en el que dicho compuesto inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste en: análogos de talidomida; derivados de talidomida; compuestos que interactúan con y/o se unen a cereblon (CRBN) y/o a uno o más miembros del complejo ubiquitina-ligasa E3 de CRBN; inhibidores de Ikaros (IKZF1); inhibidores de Aiolos (IKZF3); y compuestos que potencian o promueven la ubiquitinación y/o degradación de Ikaros (IKZF1) y/o Aiolos (IKZF3); y
donde el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador se lleva a cabo entre 7 y 21 días después del inicio de la administración de la terapia de células T, y
en el que el compuesto inmunomodulador se administra por vía oral.
[0010] En algunas realizaciones, el método previene, reduce o mejora uno o más síntomas o resultados de la enfermedad o afección.
[0011] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, (a) la cantidad del compuesto inmunomodulador administrado es insuficiente, como agente único y/o en ausencia de administración de la terapia celular T, para mejorar, reducir o prevenir la enfermedad o afección o un síntoma o resultado de la misma; y/o (b) la cantidad del compuesto inmunomodulador administrado es insuficiente, como agente único y/o en ausencia de administración de la terapia celular T, para mejorar, reducir o prevenir la enfermedad o afección en el sujeto o un síntoma o resultado de la misma; y/o (c) el método reduce o mejora un síntoma o resultado o carga de la enfermedad o afección en un grado que es mayor que la combinación de (i) el grado de reducción o mejora efectuado por la administración del agente inmunomodulador solo, opcionalmente por término medio en una población de sujetos que padecen la enfermedad o afección, y (ii) el grado de reducción o mejora por la administración de la terapia celular T sola, opcionalmente por término medio en una población de sujetos que padecen la enfermedad o afección; y/o (d) la cantidad del compuesto inmunomodulador administrada en el método, o administrada en una o más dosis, es una dosis de nivel de mantenimiento del compuesto, o corresponde a una dosis del compuesto administrada a sujetos que han mostrado una respuesta, opcionalmente una respuesta completa, tras la administración del compuesto para el tratamiento.
[0012] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la enfermedad o afección es refractaria o resistente al compuesto inmunomodulador y/o se ha vuelto refractaria o resistente al mismo tras el tratamiento con el compuesto inmunomodulador; y/o se ha determinado que el sujeto o la enfermedad o afección tiene una mutación o factor que confiere resistencia de la enfermedad o afección al tratamiento con el compuesto inmunomodulador.
[0013] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el compuesto inmunomodulador se selecciona entre: análogos de talidomida, derivados de talidomida, compuestos que interaccionan con y/o se unen a cereblon (CRBN) y/o uno o más miembros del complejo ubiquitina-ligasa E3 de CRBN, inhibidores de ikaros (IKZF1), inhibidores de Aiolos (IKZF3), compuestos que potencian o promueven la ubiquitinación y/o degradación de Ikaros (IKZF1) y/o Aiolos (IKZF3).
[0014] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la administración del compuesto inmunomodulador incluye: (i) al menos un ciclo de más de 30 días que comienza al iniciar la administración del compuesto inmunomodulador, en el que el ciclo incluye la administración del compuesto, opcionalmente diariamente o al menos diariamente, durante hasta 21 días consecutivos y/o en el que la última administración del compuesto en el ciclo es a los 21 días o menos después de la primera administración del compuesto en el ciclo; y/o (ii) al menos dos ciclos, cada uno de los al menos dos ciclos incluye la administración del compuesto durante una pluralidad de días consecutivos seguida de un periodo de descanso durante el cual no se administra el compuesto inmunomodulador, en el que el periodo de descanso es superior a 14 días consecutivos; y/o (iii) la administración, opcionalmente diaria o al menos diaria, durante no más de 14 días consecutivos.
[0015] En la presente invención, el compuesto inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste en: análogos de talidomida; derivados de talidomida; compuestos que interaccionan con y/o se unen a cereblon (CRBN) y/o uno o más miembros del complejo ubiquitina-ligasa E3 de CRBN; inhibidores de Ikaros (IKZF1); inhibidores de Aiolos (IKZF3); y compuestos que potencian o promueven la ubiquitinación y/o degradación de Ikaros (IKZF1) y/o Aiolos (IKZF3).
[0016] En la presente invención, la terapia de células T incluye células diseñadas para expresar un receptor recombinante. En algunas realizaciones, la ingeniería incluye una o más etapas del proceso de fabricación ex vivo, opcionalmente seleccionadas entre: (1) aislar células de una muestra biológica mediante leucaféresis o aféresis; (2) seleccionar o enriquecer células mediante métodos basados en la inmunoafinidad; (3) introducir un ácido nucleico recombinante, opcionalmente un vector viral, en las células; (4) incubar células, opcionalmente células manipuladas, en presencia de una o más condiciones estimulantes; (5) formular células en presencia de un crioprotector; y/o (6) formular células para su administración a un sujeto, opcionalmente en presencia de un excipiente farmacéuticamente aceptable.
[0017] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el método incluye llevar a cabo el proceso de fabricación y/o además incluye la ingeniería de células T para expresar un receptor recombinante, generando así la terapia de células T. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el método incluye el contacto de las células con un compuesto inmunomodulador durante uno o más de los pasos del proceso de fabricación ex vivo.
[0018] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la terapia de células T incluye células T de ingeniería producidas por un proceso de fabricación que incluye la incubación de células, ex vivo, en presencia del compuesto inmunomodulador.
[0019] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el método implica incubar células en presencia de una o más condiciones estimulantes, que se lleva a cabo en presencia de un compuesto inmunomodulador.
[0020] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador en al menos un ciclo es posterior al inicio de la administración de la terapia de células T.
[0021] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, la terapia celular T es aquella en la que el número máximo de una población de células de la terapia, que opcionalmente son células CD3+ o CD8+ de la terapia celular T y son células CAR+ T en la sangre es ((a) de media en una pluralidad de sujetos tratados con la terapia de células T en ausencia de administración del compuesto inmunomodulador, o (b) en el sujeto tras la administración de la terapia de células T) inferior a 10 células por pL, inferior a 5 células por pL o inferior a por 1 células por pL.
[0022] En la presente invención, la terapia de células T incluye células que expresan un receptor recombinante, en particular un CAR. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el receptor recombinante incluye un dominio de unión a antígeno específico para un antígeno de maduración de células B (BCMA).
[0023] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador en al menos un ciclo se lleva a cabo después del inicio de la administración de la terapia de células T. En la invención, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador se lleva a cabo de 7 a 21 días después del inicio de la administración de, o después de la última dosis de, la terapia de células T.
[0024] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador se lleva a cabo en un momento que es mayor o superior a aproximadamente 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19, días o 20 días después del inicio de la administración de la terapia de células T.
[0025] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, antes de iniciar la administración del compuesto inmunomodulador, se selecciona un sujeto en el que: (i) el nivel pico o máximo de las células de la terapia celular T son detectables en la sangre del sujeto; (ii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre, después de haber sido detectables en la sangre, no es detectable o se reduce, opcionalmente reducido en comparación con un punto de tiempo precedente después de la administración de la terapia celular T; (iii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre se reduce en o más de 1,5 veces, 2,0 veces, 3,0 veces, 4,0 veces, 5.(iv) en un momento posterior al pico o nivel máximo de células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto, el número de células de o derivadas de las células T detectables en la sangre del sujeto es inferior a menos del 10%, menos del 5%, menos del 1% o menos del 0,5% del total de células monoclonales de sangre periférica detectables en la sangre del sujeto, el número de células de o derivadas de las células T detectables en la sangre del sujeto es inferior a menos del 10%, menos del 5%, menos del 1% o menos del 0,1% del total de células monoclonales de sangre periférica detectables en la sangre del sujeto.1% del total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la sangre del sujeto; (v) el sujeto presenta progresión de la enfermedad y/o ha recaído tras la remisión después del tratamiento con la terapia de células T; y/o (iv) el sujeto presenta aumento de la carga tumoral en comparación con la carga tumoral en un momento anterior o posterior a la administración de las células T y anterior al inicio de la administración del compuesto inmunomodulador.
[0026] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el compuesto inmunomodulador se administra durante más de 7 días consecutivos, más de 14 días consecutivos, más de 21 días consecutivos, más de 21 días consecutivos o más de 28 días consecutivos. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el compuesto inmunomodulador se administra en un ciclo que incluye la administración diaria durante una pluralidad de días consecutivos seguida de un periodo de descanso durante el cual no se administra el compuesto inmunomodulador. En algunas realizaciones, el periodo de descanso durante el cual no se administra el compuesto inmunomodulador es superior a 7 días consecutivos, superior a 14 días consecutivos, superior a 21 días o superior a 28 días.
[0027] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el ciclo de administración del compuesto inmunomodulador se repite al menos una vez. En algunas realizaciones, el compuesto inmunomodulador se administra durante al menos 2 ciclos, al menos 3 ciclos, al menos 4 ciclos, al menos 5 ciclos, al menos 6 ciclos, al menos 7 ciclos, al menos 8 ciclos, al menos 9 ciclos, al menos 10 ciclos, al menos 11 ciclos o al menos 12 ciclos.
[0028] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la administración del compuesto inmunomodulador se continúa, desde al menos después del inicio de la administración de las células T, hasta que: el número de células de o derivadas de la terapia de células T administrada detectables en la sangre del sujeto aumente en comparación con en el sujeto en un punto temporal precedente justo antes de la administración del compuesto inmunomodulador o en comparación con un punto temporal precedente después de la administración de la terapia de células T; el número de células de o derivadas de la terapia de células T detectables en la sangre esté dentro de 2 .0 veces (mayor o menor) el número máximo o pico observado en la sangre del sujeto tras el inicio de la administración de las células T; el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto es mayor o superior a aproximadamente el 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% o 60% del total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la sangre del sujeto; y/o el sujeto presenta una reducción de la carga tumoral en comparación con la carga tumoral en un momento inmediatamente anterior a la administración de la terapia celular T o en un momento inmediatamente anterior a la administración del compuesto inmunomodulador; y/o el sujeto presenta una remisión completa o clínica.
[0029] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el compuesto inmunomodulador se une a cereblon (CRBN) y/o al complejo ubiquitina-ligasa E3 de CRBN; y/o es un inhibidor del factor de transcripción Ikaros (IKZF1) o Aiolos (IKZF3); y/o aumenta la ubiquitinación o degradación de Ikaros (IKZF1) o Aiolos (IKZF3).
[0030] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el compuesto inmunomodulador es talidomida o es un derivado o análogo de la talidomida. En algunas realizaciones, el compuesto inmunomodulador es lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona) o pomalidomida (4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindol-1,3-diona), avadomida (3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona), un estereoisómero de lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona), pomalidomida (4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindol-1,3-diona), avadomida (3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona) o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo de los mismos farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el compuesto inmunomodulador es lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona), un estereoisómero de lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona) o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable de la misma.
[0031] En algunas de las realizaciones proporcionadas en el presente documento, el compuesto inmunomodulador es lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona) o pomalidomida (4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindol-1,3-diona),6-diona), pomalidomida (4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindol-1,3-diona), o avadomida (3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona), un estereoisómero de lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona), pomalidomida (4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindol-1.3- diona), o avadomida (3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona), o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable de los mismos.
[0032] En algunas realizaciones, el compuesto inmunomodulador es 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona, o un estereoisómero del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto inmunomodulador es 3-(4-amino-1-oxo-1.3- dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona. En algunas realizaciones, el compuesto inmunomodulador es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona, o un estereoisómero del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunas realizaciones, el compuesto inmunomodulador es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona.
[0033] En la presente invención, el compuesto inmunomodulador se administra por vía oral. En algunas realizaciones, el compuesto inmunomodulador se administra en una cápsula o un comprimido.
[0034] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, el compuesto inmunomodulador se administra en una cantidad desde o desde aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg, desde o desde aproximadamente 0,1 mg a 50 mg, desde o desde aproximadamente 0,1 mg a 25 mg, desde o desde aproximadamente 0,1 mg a 10 mg, desde o desde aproximadamente 0,1 mg a 5 mg, desde o desde aproximadamente 01 mg a 1 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 100 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 50 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 25 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 10 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 5 mg, desde o aproximadamente 5 mg a 100 mg, desde o aproximadamente 5 mg a 50 mg, desde o aproximadamente 5 mg a 25 mg, de o aproximadamente 5 mg a 10 mg, de o aproximadamente 10 mg a 100 mg, de o aproximadamente 10 mg a 50 mg, de o aproximadamente 10 mg a 25 mg, de o aproximadamente 25 mg a 100 mg, de o aproximadamente 25 mg a 50 mg o de o aproximadamente 50 mg a 100 mg, cada uno inclusive.
[0035] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el compuesto inmunomodulador se administra una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, cinco veces al día o seis veces al día. En algunas realizaciones, el compuesto inmunomodulador se administra en una cantidad de dosificación diaria total de al menos o aproximadamente 0,1 mg al día, 0,5 mg al día, 1,0 mg al día, 2,5 mg al día, 5 mg al día, 10 mg al día, 25 mg al día, 50 mg al día o 100 mg al día.
[0036] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el compuesto inmunomodulador se administra en una cantidad mayor o superior a aproximadamente 1 mg, 2,5 mg, 5 mg, 7,5 mg, 10 mg, 15 mg y menos de 25 mg; o el compuesto inmunomodulador se administra en una cantidad mayor o superior a aproximadamente 1 mg al día, 2,5 mg al día, 5 mg al día, 7,5 mg al día, 10 mg al día, 15 mg al día y menos de 25 mg al día.
[0037] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, la administración de la cantidad terapéuticamente eficaz de compuesto inmunomodulador estimula un aumento de la expansión de las células T asociadas con la terapia de células T en comparación con la expansión de tras la administración de la terapia de células T en ausencia del compuesto inmunomodulador.
[0038] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, la administración de la cantidad terapéuticamente eficaz de compuesto inmunomodulador estimula un aumento de la actividad citolítica mediada por células T de las células T asociadas con la terapia de células T en comparación con la actividad citolítica tras la administración de las células T en ausencia del compuesto inmunomodulador.
[0039] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, la administración de la cantidad terapéuticamente eficaz de compuesto inmunomodulador estimula un aumento en la producción de citocinas de las células T asociadas con la terapia de células T en comparación con la producción de citocinas tras la administración de las células T en ausencia del compuesto inmunomodulador. En algunas realizaciones, el aumento es superior o mayor que aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más.
[0040] En la presente invención, la terapia de células T es o incluye células modificadas genéticamente que expresan un receptor recombinante que se une específicamente a un antígeno. En la presente invención, el receptor de antígeno recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR).
[0041] En la presente invención, la terapia de células T incluye un receptor de antígeno recombinante, en particular un CAR, que incluye un dominio extracelular que contiene un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno. En la presente invención, el antígeno está asociado, es específico y/o se expresa en una célula o tejido de una enfermedad, trastorno o afección. En la presente invención, la enfermedad, trastorno o afección es un tumor o un cáncer. En la presente invención, el antígeno es un antígeno tumoral.
[0042] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el antígeno se selecciona entre ROR1, antígeno de maduración de células B (BCMA), anhidrasa carbónica 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (receptor tirosina quinasa erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, C<d>22, mesotelina, CEA y antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros erbB, EGFR vIII, proteína de unión al folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor del dominio de inserción de la quinasa (kdr), cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, (L1-CAM), antígeno asociado al melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno preferentemente expresado de melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor de folato-a, CD44v6, CD44v7/8, integrina avb6, 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligandos NKG2D, CD44v6, antígeno dual, antígeno cáncer-testículo, mesotelina, CMV murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, receptor 5D acoplado a proteína G (GPCR5D), antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), Her2/neu, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, efrínB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, Tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138, opcionalmente un antígeno humano de cualquiera de los anteriores; un antígeno patógeno específico; y un antígeno asociado a una marcación universal. En algunas realizaciones, el antígeno es o incluye CD19, opcionalmente CD19 humano. En algunas realizaciones, el antígeno es o incluye un antígeno asociado a mieloma múltiple, opcionalmente un BCMA, opcionalmente BCMA humano.
[0043] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el dominio de unión a antígeno es o incluye un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo del mismo, que opcionalmente es un fragmento de cadena simple. En algunas realizaciones, el fragmento incluye regiones variables de anticuerpos unidas por un enlazador flexible. En algunas realizaciones, el fragmento incluye un scFv.
[0044] En la presente invención, la terapia de células T incluye un receptor recombinante, en particular un CAR, que incluye además un espaciador, opcionalmente derivado de una inmunoglobulina, que contiene opcionalmente una región bisagra. En la presente invención, el receptor de antígeno recombinante, en particular el CAR, incluye una región de señalización intracelular. En algunas realizaciones, la región de señalización intracelular incluye un dominio de señalización intracelular. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular es o incluye un dominio de señalización primaria, un dominio de señalización que es capaz de inducir una señal de activación primaria en una célula T, un dominio de señalización de un componente del receptor de células T (TCR), y/o un dominio de señalización que contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM). En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el dominio de señalización intracelular es o incluye un dominio de señalización intracelular de una cadena CD3, opcionalmente una cadena CD3-zeta (CD3Z), o una porción de señalización de la misma.
[0045] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, el receptor recombinante, en particular el CAR, incluye además un dominio transmembrana dispuesto entre el dominio extracelular y la región de señalización intracelular, en el que el dominio transmembrana es opcionalmente dominio transmembrana de CD8 o CD28. En algunas realizaciones, la región de señalización intracelular incluye además una región de señalización costimulatoria. En algunas realizaciones, la región de señalización costimuladora incluye un dominio de señalización intracelular de una molécula costimuladora de células T o una porción de señalización de la misma. En algunas realizaciones, la región de señalización costimuladora incluye un dominio de señalización intracelular de un CD28, un 4-1BB o un ICOS o una porción de señalización del mismo. En algunas realizaciones, la región de señalización costimuladora que contiene un dominio de señalización intracelular de 4-1BB. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la región de señalización costimuladora se encuentra entre el dominio transmembrana y la región de señalización intracelular.
[0046] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la terapia de células T incluye: Células T seleccionadas entre células T de memoria central, células T de memoria efectoras, células T ingenuas, células T madre de memoria central, células T efectoras y células T reguladoras; y/o una pluralidad de células, conteniendo la pluralidad al menos el 50 % de una población de células seleccionadas entre células T CD4+, células T CD8+, células T de memoria central, células T efectoras de memoria, células T ingenuas, células T madre de memoria central, células T efectoras y células T reguladoras.
[0047] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la terapia de células T incluye células T que son CD4+ o CD8+. En algunas realizaciones, la terapia de células T incluye células primarias derivadas de un sujeto. En algunas realizaciones, la terapia celular T incluye células autólogas del sujeto. En algunas realizaciones, la terapia celular T incluye células T que son alogénicas al sujeto. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí descritos, el sujeto es un ser humano.
[0048] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la terapia celular T incluye la administración de desde o desde aproximadamente 1 * 105 a 1 * 108 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, desde o desde aproximadamente 5 * 105 a 1 * 107 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales o desde o desde aproximadamente 1 * 106 a 1 * 107 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, cada una inclusive.
[0049] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la terapia celular T incluye la administración de no más de 1 * 108 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales, o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, no más de 1 * 107 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales, o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, no más de 05 * 107 células totales que expresen receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (CMSP) totales, no más de 1 * 106 células totales que expresen receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (CMSP) totales, no más de 0,5 * 106 células totales que expresen receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (CMSP) totales.
[0050] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la cantidad de células administradas en la terapia de células T es menor que la cantidad en otro método en el que la terapia de células T se administra sin la administración del compuesto inmunomodulador, opcionalmente cuyo otro método da como resultado un grado similar o menor de mejora o reducción o prevención de la enfermedad o afección o síntoma o carga de la misma, en comparación con el resultante del método. En algunas realizaciones, la cantidad de células administradas es 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces menor que la administrada en el otro método.
[0051] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la terapia de células T se administra como una única composición farmacéutica que contiene las células. En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos proporcionados en el presente documento, la terapia celular T incluye una dosis de células que es una dosis dividida, en la que las células de la dosis se administran en una pluralidad de composiciones, que contienen colectivamente las células de la dosis, durante un período de no más de tres días.
[0052] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el método incluye además la administración de una quimioterapia linfodepletora antes de la administración de la terapia de células T.
[0053] En la presente invención, la enfermedad o condición es el cáncer. En algunas realizaciones, el cáncer es una neoplasia de células B y/o un mieloma, linfoma o leucemia. En algunas realizaciones, el cáncer es linfoma de células del manto (MCL), mieloma múltiple (MM), leucemia linfoblástica aguda (ALL), ALL en adultos, leucemia linfoblástica crónica (CLL), linfoma no Hodgkin (N<h l>) o linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). En algunas realizaciones, el cáncer es un cáncer no hematológico o es un tumor sólido.
[0054] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, la terapia de células T exhibe una expansión y/o persistencia aumentada o prolongada en el sujeto en comparación con un método en el que la terapia de células T se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador.
[0055] En algunas realizaciones de cualquiera de los métodos aquí proporcionados, el método reduce la carga tumoral en mayor grado y/o durante un mayor periodo de tiempo en comparación con la reducción que se observaría con un método comparable en el que la terapia de células T se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador y/o en el que el compuesto inmunomodulador se administra en ausencia de la terapia de células T, opcionalmente a la misma dosis o programa de dosificación.
Breve Descripción de los Dibujos
[0056]
La FIG.1A muestra la expresión superficial de BCMA en líneas celulares de mieloma múltiple (RPMI-8226, MM1.S y OPM-2). La línea de puntos indica el fondo y las líneas celulares BCMA negativas se tiñeron con anticuerpo anti-BCMA. IMF, intensidad de fluorescencia media.
La FIG.1B muestra el porcentaje de reducción de células diana que expresan BCMA (RPMI-8226) por células T anti-BCMA CAR+ en presencia y ausencia de lenalidomida (10<j>M) tras 6 días de co-cultivo. La FIG. 1C muestra el efecto de la lenalidomida sobre la actividad citolítica de las células T CAR+ anti-BCMA contra las células diana RPMI-8226.
Las FIGs. 2A-2C muestran la cantidad de IL-2 (FIG. 2A), IFNy (FIG. 2B), y TNF-a (FIG. 2C) observados en los sobrenadantes tras la incubación de células diana RPMI-8226 con células T CAR anti-BCMA en presencia y ausencia de lenalidomida.
La FIG. 3A muestra el efecto de concentraciones crecientes de lenalidomida sobre la actividad citolítica de las células T CAR+ anti-BCMA contra las células diana OPM2.
Las FIGs. 3B-D muestran la cantidad de IFNy (FIG. 3B), IL-2 (FIG. 3C), y TNF-a (FIG. 3D) observadas en sobrenadantes tras la incubación de células diana OPM2 con células T CAR anti-BCMA en presencia de concentraciones crecientes de lenalidomida, o en ausencia de lenalidomida.
La FIG. 3E muestra la actividad citolítica anti-BCMA CAR-T antígeno-específica y la producción de citocinas de células T anti-BCMA CAR+ derivadas de donantes sanos representativos y pacientes con mieloma múltiple contra células diana OPM-2 en presencia de concentraciones variables de lenalidomida (0,01<j>M, 0,1<j>M, 1,0<j>M o 10<j>M de lenalidomida) o en ausencia de lenalidomida.
La FIG. 3F muestra la actividad citolítica anti-BCMA CAR-T antígeno-específica de células T anti-BCMA CAR+ derivadas de tres donantes sanos y un paciente con mieloma múltiple contra células diana OPM-2 y RPMI-8226 en presencia de concentraciones variables de lenalidomida (0,01 j M, 0,1 j M, 1,0 j M o 10 j M de lenalidomida) o en ausencia de lenalidomida. La FIG. 3G muestra la producción de citocinas de células T CAR+ anti-BCMA derivadas de tres donantes sanos y un paciente con mieloma múltiple contra células diana OPM-2 en presencia de concentraciones variables de lenalidomida (0,01 j M, 0,1 j M, 1,0 j M o 10 j M de lenalidomida) o en ausencia de lenalidomida. La FIG. 3H muestra la producción de citocinas de células T CAR+ anti-BCMA derivadas de tres donantes sanos y un paciente con mieloma múltiple contra células diana RPMI-8226 en presencia de concentraciones variables de lenalidomida (0,01 j M, 0,1 j M, 1,0 j M o 10 j M de lenalidomida) o en ausencia de lenalidomida.
La FIG. 4A representa la expansión de células T CAR anti-BCMA tras la reestimulación en presencia de concentraciones variables de lenalidomida.
La FIG. 4B representa la expansión de las células T CAR anti-BCMA tras la reestimulación tanto en presencia como en ausencia de lenalidomida.
La FIG.5A muestra los recuentos celulares (duplicaciones poblacionales proyectadas) de las células T CAR+ anti-BCMA de tres donantes para cada punto temporal en el ensayo de reestimulación, en presencia de un vehículo o lenalidomida 0,1<j>M. La "x" indica insuficiencia de células para la repetición del ensayo. La FIG. 5B muestra la intensidad fluorescente media (IFM) de CD25 (en células<c>D3+ CAR+ vivas). La FIG. 5C muestra la producción de citoquinas normalizada para el número de células sembradas (paneles superior e inferior izquierdo) y la intensidad fluorescente media (MFI) de CD25 (en células CD3+ CAR+ vivas) (panel inferior derecho).
La FIG. 6A muestra el número total de células CD3+ en cultivo en los días 2 y 7 tras incubar células T CAR antiBCMA o células T que no expresaban un CAR (mock) en presencia o ausencia de lenalidomida. Las FIGs. 6B y 6C muestran la expresión de CD25+ en CD4+ (FIG. 6B) y CD8+ (FIG. 6C) Células T en cultivo en los días 2 y 7 tras incubar células T CAR anti-BCMA o células T que no expresaban un CAR (mock) en presencia o ausencia de lenalidomida.
La FIG. 7A muestra el volumen tumoral de los ratones a lo largo del tiempo tras la administración de una dosis baja de células T CAR+ anti-BCMA en presencia y ausencia de lenalidomida.
La FIG. 7B muestra el porcentaje de supervivencia de ratones a los que se administró una dosis baja de células T CAR+ anti-BCMA en presencia y ausencia de lenalidomida. Para los grupos de control, se administraron células T que no expresaban un CAR (simulacro) en presencia y ausencia de lenalidomida, y también se administró lenalidomida sin células T.
La FIG. 8A muestra los niveles de células T CD4+ CAR+ en la sangre de los ratones tratados con células T anti-BCMA CAR+ y lenalidomida en comparación con los otros grupos de tratamiento en los días 7 y 14. La FIG. 8B muestra los niveles de células T CD4+ CAR+ en la sangre de los ratones tratados con células T anti-BCMA CAR+ y lenalidomida en comparación con los otros grupos de tratamiento en los días 21 y 36. La FIG. 8C muestra los niveles de células T CD8+ CAR+ en la sangre de los ratones tratados con células T anti-BCMA CAR+ y lenalidomida en comparación con los otros grupos de tratamiento en los días 7 y 14. La FIG.8D muestra los niveles de células T CD8+ CAR+ en la sangre de ratones tratados con células T anti-BCMA CAR+ y lenalidomida en comparación con los otros grupos de tratamiento en los días 21 y 36.
La FIG. 8E muestra los niveles de células T CD4+ CAR+ en la sangre de ratones tratados con células T no CAR+ y lenalidomida en comparación con los otros grupos de tratamiento en los días 7, y 14. La FIG. 8F muestra los niveles de células T CD4+ CAR+ en la sangre de ratones tratados con células T no CAR+ y lenalidomida en comparación con los otros grupos de tratamiento en los días 21 y 36. La FIG. 8G muestra los niveles de células T CD8+ CAR+ en la sangre de ratones tratados con células T no CAR+ y lenalidomida en comparación con los otros grupos de tratamiento en los días 7 y 14. La FIG. 8H muestra los niveles de células T CD8+ CAR+ en la sangre de ratones tratados con células T no c Ar y lenalidomida en comparación con los otros grupos de tratamiento en los días 21 y 36.
Las FIGs. 9A y 9B muestran los resultados de carga tumoral de los ratones tratados con el Régimen A (LenA), en el que se administró lenalidomida a los ratones un día antes de recibir las células T CAR+.
La FIG. 9C muestra la carga tumoral de ratones individuales hasta el día 53.
La FIG. 9D muestra los resultados de las imágenes tumorales en el día 46 tras la administración de células CAR+ a ratones individuales que recibieron la dosis más alta de CAR+ (1 * 106), con lenalidomida en el día -1 (Len A). La FIG. 9E muestra los resultados de las imágenes tumorales en el día 46 tras la administración de células CAR+ a ratones individuales que recibieron la dosis más alta de CAR+ (1 * 106) sin lenalidomida en el día -1 (Len A). Las FIGs. 9F y 9G muestran los resultados de la carga tumoral de los ratones tratados con el Régimen B (LenB), en el que la administración de lenalidomida se inició el día 14 tras la administración de CAR+T.
La FIG. 9H muestra la carga tumoral de ratones individuales hasta el día 53.
La FIG. 9I muestra los resultados de las imágenes tumorales (día 46 post-administración de células CAR+) para ratones individuales que recibieron la dosis más alta de CAR+ (1 * 106), con lenalidomida en el día -1 (Len A). La FIG. 9J muestra los resultados de las imágenes tumorales (día 46 tras la administración de células CAR+) de ratones individuales que recibieron la dosis CAR+ más alta (1 * 106), sin lenalidomida en el día -1 (Len A). Las FIGs. 10A-10D muestran la supervivencia de los ratones en presencia o ausencia de lenalidomida. La lenalidomida se administró mediante el Régimen A (Len A; administración de lenalidomida iniciada en el día -1) o el Régimen B (Len B; administración de lenalidomida iniciada en el día 14) en combinación con dosis bajas (5 * 105 o 5e5) o altas (1 * 106 o 1e6) de células T CAR+. Para los grupos de control, se administraron células T que no expresaban un CAR (simulacro) en presencia y ausencia de lenalidomida tanto a través del Régimen A como del Régimen B, y también se administró lenalidomida sin células T tanto a través del Régimen A como del Régimen B. La FIG. 10E muestra los resultados de la evaluación de la carga tumoral de los ratones que recibieron la dosis CAR+ más alta (1 * 106) y a los que se administró una dosis intraperitoneal diaria de 10 mg/kg de lenalidomida o control con vehículo iniciada en el día -1 (un día antes de la administración de CAR-T) (lenalidomida concurrente [lenalidomida (C) o vehículo [vehículo (C)] o en el día 14 tras la administración de células CAR-T (o simulacro) [lenalidomida retardada (D)]. Los resultados se muestran hasta el día 60, analizados mediante la bioluminiscencia medida por citometría de flujo. La FIG. 10F muestra el porcentaje de supervivencia de los ratones en presencia o ausencia de lenalidomida. Las FIGs. 10G y 10H muestran el análisis de citometría de flujo de las células de control simuladas y las células CAR-T en la sangre de los ratones en los días 8, 14, 22 y 28 tras la inyección de las células CAR-T de dos donantes.
La FIG. 11 muestra el número de células T CD4+ y CD8+ en cultivos de células T CAR anti-CD19 estimuladas con una concentración subóptima de anti-CD3 en presencia y ausencia de lenalidomida.
La FIG. 12A muestra el número de células T CD3+/CAR+ en sangre periférica medido en determinados puntos temporales tras la infusión en sujetos agrupados por mejor respuesta global.
La FIG. 12B muestra las células T CD3+/CAR+ en sangre periférica medidas en determinados momentos tras la infusión en sujetos que lograron una respuesta, agrupados por respuesta continuada a los 3 meses.
Las FIGs. 12C-2D muestran los niveles de células T CD4+/CAR+ T y CD8+/CAR+ en sangre periférica medidos en determinados momentos tras la infusión en sujetos que lograron una respuesta, agrupados por respuesta continuada a los 3 meses.
La FIG. 13A muestra el número de células T CD3+/CAR+, CD4+/CAR+, CD8+/CAR+ en sangre periférica de un sujeto con LDCBD transformado quimiorrefractario medido en determinados puntos temporales. La FIG. 13B muestra una imagen axial de PET-TC previa al tratamiento que muestra una anomalía intracraneal en la fosa craneal media derecha y una anomalía extensa en los tejidos subcutáneos de la región auricular posterior derecha. La FIG. 13C es una imagen PET-CT posterior al tratamiento que muestra la resolución de la anomalía de la FIG. 13B tras el tratamiento con células T anti-CD19 CAR+. La FIG. 13D es una RM cerebral previa al tratamiento (imagen ponderada en Ti de alta resolución con uso de material de contraste; vista axial) que muestra una masa que realza homogéneamente en la fosa craneal media derecha. La FIG. 13E es una imagen de resonancia magnética posterior al tratamiento que muestra una resolución casi completa de la masa que realza. La FIG. 13F es una imagen axial de PET-TC en la recidiva que muestra la recidiva del tumor auricular posteroventricular derecho asociada a una intensa captación de 18F'flurodeoxiglicosa (flecha). La FIG. 13G es una imagen PET-CT que muestra la resolución del tumor auricular posterior tras la biopsia incisional y la reexpansión de las células T CAR+.
La FIG. 14 muestra el nivel de células diana viables durante un periodo de aproximadamente 120 horas cuando se incuban células T anti-CD19 CAR+ con células efectoras K562-CD19 a una proporción de células efectoras a células diana (E:T) de 5:1 en presencia o ausencia de 1 nM, 5 nM, 60 nM, 550 nM o 5000 nM de lenalidomida o en ausencia de lenalidomida (control).
La FIG. 15A muestra los niveles de expresión de CD25+ en células T CD4+ y CD8+ cuando se incuban células T CAR+ anti-CD19 con células efectoras K562-CD19 en presencia de lenalidomida o un compuesto alternativo de marcación de una quinasa.
La FIG. 15B muestra los niveles de expresión de CD25+ en células T CD4+ y CD8+ cuando se incuban células T CAR+ anti-CD19 con células efectoras PD-1 en presencia de lenalidomida o un compuesto alternativo de marcación de una quinasa.
La FIG. 16 muestra la cantidad de IL-10 en sobrenadantes de cultivo tras incubar células T CAR+ anti-CD19 con células efectoras K562-CD19 a una proporción de células efectoras a células diana (E:T) de 3:1 o 9:1, en presencia o ausencia de diversas concentraciones de lenalidomida.
La FIG. 17A muestra el cambio de pliegues del número de células tras la estimulación de células T CAR+ anti-CD19 de dos donantes (pt 1 y pt 2) con células efectoras K562-CD19 en presencia o ausencia de 1 pM de lenalidomida o 50 nM o 500 nM de un compuesto alternativo de marcación de una quinasa. La FIG. 17B muestra el número de duplicaciones celulares en comparación con el número inicial después de la 2' y 4' estimulación. La FIG. 18A muestra la actividad citolítica de las células T CAR+ anti-CD19 de dos células donantes (pt 1 y pt 2) reestimuladas con células K562-CD19 (marcadas con NucLight Red (NLR)) y en presencia de 1 pM de lenalidomida o 50 nM o 500 nM del compuesto alternativo de marcación de una quinasa.
La FIG. 18B muestra el porcentaje de eliminación de células diana de las células T CAR+ anti-CD19 de dos células donantes (1 o 2) reestimuladas con células K562-CD19 en comparación con el control solo vehículo (fijado en 100%).
La FIG. 19A muestra un histograma de tinción CTV de células totales en una composición de células T anti-BCMA CAR+ tras incubación con microesferas (composición de microesferas conjugadas con BCMA 200 pg/mL) en una proporción de 1:1 células T por microesfera y en presencia o ausencia de 5pM de lenalidomida.
La FIG. 19B y FIG. 19C muestran histogramas de citometría de flujo para CD25 en células T CD4+ (panel izquierdo) o células T CD8+ (panel derecho) presentes en una composición de células T CAR+ anti-BCMA tras la incubación con microesferas (composición de microesferas conjugadas con BCMA 200 pg/mL) en una proporción de 1:1 de células T a microesferas o anti-CD3 inmovilizado, respectivamente, en presencia o ausencia de lenalidomida.
FIGS. 20A-20I muestran gráficos que muestran los niveles de factores de transcripción y marcadores de activación en o sobre células T CD4+ (paneles izquierdos) o células T CD8+ (paneles derechos) presentes en una composición de células T CAR+ anti-BCMA tras incubación sin estimulación o con diferentes cantidades de microesferas conjugadas con BCMA o microesferas conjugadas anti-CD3 y anti-CD28 y en presencia de 0 pM, 0,5 pM, o 50 pM de lenalidomida. Niveles de Blimp1 (FIG. 20A), CD25 (FIG. 20B), CD31 (FIG. 20C), PD-1 (FIG. 20D), Tbet (FIG. 20E), EOMAS (FIG. 20F), GATA3 (FIG. 20G), Helios (FIG. 20H), e Ikaros (FIG. 20I) son presentados.
200 BCMA, 50 BCMA y 5 Bc MA indican microesferas conjugadas con BCMA generadas incubando BCMA con las microesferas en una cantidad de 200, 50 y 5 pg de BCMA por aproximadamente 4*108 microesferas, respectivamente.
La FIG. 21A-C muestra gráficos que muestran los niveles de IFN-gamma extracelular (FIG. 21A), IL-2 (FIG. 21B), y TNF alfa (FIG. 21C) de cultivos tras la incubación de una composición de células T CAR+ anti-BCMA con dos cantidades diferentes de microesferas conjugadas con BCMA en presencia o ausencia de 5pM de lenalidomida.
50pg BCMA y 5pg BCMA indican microesferas conjugadas con BCMA generadas incubando BCMA con las microesferas en una cantidad de 50 y 5 pg de BCMA por aproximadamente 4*108 microesferas, respectivamente. La FIG. 21D muestra un gráfico que muestra los niveles de IL-2 extracelular de los cultivos tras la incubación de una composición de células T CAR+ anti-BCMA de dos donantes diferentes con diferentes cantidades de microesferas conjugadas con BCMA en presencia de 0 pM, 1 pM o 5 pM de lenalidomida. 200 BCMA y 5 BCMA indican microesferas conjugadas con BCMA generadas incubando BCMA con las microesferas en una cantidad de 200 pg y 5 pg de BCMA por aproximadamente 4*108 microesferas, respectivamente.
La FIG. 21E y FIG. 21F muestra el recuento total de células tras el cultivo de una composición de células T CAR+ anti-BCMA después de incubación durante 4 días (FIG. 21E) o 7 días (FIG. 21F) con diferentes cantidades de microesferas conjugadas con BCMA en presencia de 5 pM de lenalidomida. 50 BCMA y 5 BCMA indican microesferas conjugadas con BCMA generadas incubando antígeno BCMA con las microesferas en una cantidad de 50 pg y 5 pg de BCMA por aproximadamente 4*108 microesferas, respectivamente.
La FIG. 21G muestra gráficos de histograma de tinción CTV de células T CD4+ o células T CD8+ en una composición de células T CAR+ anti-BCMA tras incubación durante 4 o 7 días con microesferas conjugadas con BCMA en presencia de lenalidomida 5|jM o ausencia de lenalidomida (vehículo).
La FIG. 21H y 21I muestran gráficos que muestran el porcentaje de células positivas para el marcador sustitutivo EGFRt determinado con un anticuerpo anti-EGFR tras la incubación de una composición de células T CAR+ anti-BCMA durante 4 días (FIG. 21H) o 7 días (FIG. 21I) con diferentes cantidades de microesferas conjugadas con BCMA en presencia de 5<j>M de lenalidomida o en ausencia de lenalidomida (vehículo). "50" y "5" indican microesferas generadas incubando BCMA con las microesferas en una cantidad de 50 jg y 5 jg de BCMA por aproximadamente 4*108 microesferas, respectivamente.
La FIG. 21J muestra el porcentaje de destrucción celular de células diana RPMI-8226 por células efectoras de células T anti-BCMA CAR+ que se habían incubado con diferentes cantidades de microesferas conjugadas con BCMA en presencia de 5 jM de lenalidomida o en ausencia de lenalidomida (vehículo). Actividad citolítica de composiciones que contienen una proporción de células efectoras a células diana de 3: 1 o 1: 1 y en presencia o ausencia de lenalidomida. "50" y "5" indican microesferas conjugadas con BCMA generadas incubando BCMA con las microesferas en una cantidad de 50 y 5 jg de BCMA por aproximadamente 4*108 microesferas, respectivamente.
La FIG. 22A muestra el análisis citométrico de flujo de STATS fosforiladas tras 2 horas de estimulación CAR (estim.) con 50 jg de esferas BCMA. El control sin estimulación se muestra con una línea de puntos. La FIG. 22B muestra el análisis de citometría de flujo de los niveles de citocinas intracelulares en un donante CAR T normal representativo tras 24 horas de estimulación con microesferas BCMA (en CD3+ vivos transducidos).
La FIG. 23A-23B representa los resultados de un ensayo de reestimulación en serie de composiciones de células T CAR anti-BCMA que se habían incubado durante siete días con microesferas conjugadas con BCMA (50 jg/mL). Se muestran los resultados de tres composiciones diferentes de donantes. La FlG. 23A y FIG. 23B muestran la actividad citolítica de las células T CAR+ anti-BCMA en cada uno de los puntos temporales para dos donantes diferentes.
La FIG. 24A muestra los resultados de la actividad citolítica específica del antígeno CAR y la FIG. 24B muestra los resultados de la producción de citocinas para las células CAR-T anti-BCMA que habían sido preestimuladas con esferas BCMA (en comparación con las células CAR-T anti-BCMA recién descongeladas (no preestimuladas)) en los cocultivos, comparando las células cultivadas en presencia frente a las cultivadas en ausencia de lenalidomida. La FIG. 24c muestra la viabilidad global y el recuento celular evaluados para tres donantes CAR T anti-BCMA. La FIG. 24D muestra los resultados del análisis de citometría de flujo de la expresión CD25 y PD-1 de superficie (intensidad fluorescente media [IFM]) para células T CAR anti-BCMA CD4+ o CD8+ tras la estimulación (pretratamiento) con microesferas BCMA durante 7 días, en presencia o ausencia de lenalidomida 1 jM . La FIG.
24E muestra el análisis de citometría de flujo en todos los donantes CAR T para la intensidad de fluorescencia media (MFI; CD25 y Tim3) o el porcentaje de PD-1 y Lag3 positivos en la superficie de los marcadores de células T en los subconjuntos CD4+ CAR+ y CD8+ CAR+ (en células CD3+ vivas). Los valores mostrados son porcentajes de MFI, viabilidad o recuento de referencia (Veh).
La FIG. 25A muestra el análisis de la producción de citoquinas efectoras tras la estimulación específica de CAR en microesferas de BCMA de 50 jg durante 24 horas en presencia de lenalidomida 1 jM en comparación con la respuesta basal (vehículo) para cada uno de los tres donantes.
La FIG. 25B muestra los efectos de las células T CAR anti-BCMA activadas en diferentes concentraciones de microesferas BCMA (es decir, 5 jg , 50 jg y 200 jg ) en presencia o ausencia de lenalidomida (0,1 jM o 1 jM ) sobre la producción de citocinas efectoras CAR T.
La FIG. 25C muestra la producción de citocinas de células T CAR anti-BCMA derivadas de donantes sanos representativos y de pacientes con mieloma múltiple estimuladas en esferas BCMA con o sin adición de PD-L1 en las esferas, en presencia de 1 jM de lenalidomida) o en ausencia de lenalidomida.
FIGS. 26A y 26B muestran los resultados del análisis de componentes principales (ACP) para la expresión génica (basados en los resultados de ARN-seq; FIG. 26A) y la accesibilidad de la cromatina (basada en los resultados de ATAC-seq; FIG. 26B), en células T que expresan CAR anti-BCMA generadas a partir de 4 donantes diferentes (donantes 1-4), estimuladas con microesferas conjugadas con BCMA, durante 24 horas (24 h estim.) o 7 días (d7 estim.), o cultivadas sin estimulación durante 24 horas (24 h), en presencia o ausencia de lenalidomida. FIGS. 27A y 27B muestran diagramas de volcán que representan la significación estadística de la expresión (lógica del valor p ajustado) con multiplicación log2 en la expresión génica, incluyendo genes o picos que muestran una expresión aumentada (lado derecho) o disminuida (lado izquierdo), en células T CAR+ estimuladas con microesferas conjugadas con BCMA, durante 24 horas (24 h estim., FiG.27A) o 7 días (d7 estim., FIG. 27B), en presencia o ausencia de lenalidomida. Las tablas indican el número de genes o picos que mostraron un aumento (up) o una disminución (down) estadísticamente significativos de la expresión.
FIGS. 27C y 27D muestran diagramas de volcán que representan la significación estadística de la expresión (lógica del valor p ajustado) con multiplicación log2 en la accesibilidad de la cromatina g, incluyendo genes o picos que muestran un aumento (lado derecho) o una disminución (lado izquierdo) de la accesibilidad, en células T CAR+ estimuladas con microesferas conjugadas con BCMA, durante 24 horas (24 h estim., FIG. 27C) o 7 días (d7 estim., FIG. 27D). Las tablas indican el número de genes o picos que mostraron un aumento (aumento) o una disminución (disminución) estadísticamente significativos de la accesibilidad.
FIGS. 28A y 28B muestran la direccionalidad y la importancia de la expresión de los genes en las vías de señalización biológica que se enriquecieron en los conjuntos de genes cuya expresión aumentó o disminuyó de forma estadísticamente significativa en las células T<c>A<r>+ estimuladas con microesferas conjugadas con BCMA durante 24 horas (24 h estimulación, FIG. 28A) o 7 días (d7 estim., FIG. 28B).
La FIG. 29 muestra un gráfico que compara los picos individuales de accesibilidad a la cromatina (rombo) y los cambios medios de accesibilidad a la cromatina para cada gen (círculo), con los cambios de expresión génica, para genes seleccionados implicados en la activación y señalización de células T.
La FIG. 30 muestra el análisis de enriquecimiento de motivos, el valor log p de enriquecimiento, la prevalencia y los factores de transcripción que se predice que se unen a los motivos para los picos con mayor accesibilidad en presencia de lenalidomida en cultivos de día 7.
La FIG. 31 muestra el análisis de citometría de flujo de la expresión intracelular de Ikaros tanto en células T CD4+ anti-CD19 que expresan CAR como en células T CD8+ anti-CD19 que expresan CAR. Las células T que expresan CAR se estimularon con el anticuerpo antiidiotípico CAR-T (5 pg/mL) tratado en un intervalo de concentración de lenalidomida o del Compuesto 1. Los valores de la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) de Ikaros se normalizaron y se calcularon como porcentaje en relación con el control con vehículo.
FIGS. 32A y 32B muestran análisis de la producción de citoquinas de células T anti-CD19 que expresan CAR en presencia del Compuesto 1(FIG. 32A) o lenalidomida (FIG. 32B) tras la incubación con las células diana. Ensayo multiplex de citoquinas de sobrenadantes tomados a las 24 horas de pocillos triplicados de células T anti-CDl9 que expresan c Ar co-cultivadas con células diana K562.CD19 en presencia de varias concentraciones del Compuesto 1 o lenalidomida. Se determinaron las concentraciones de IFN-<y>, IL-2 y TNF-a de las células T que expresaban CAR de tres donantes diferentes en dos proporciones E:T. Los datos representan la media /- S.D. de 3 experimentos.
La FIG. 33 muestra el análisis de la función citolítica de células T anti-CD19 que expresan CAR en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida tras la incubación con células diana. Las células T que expresan CAR anti-CD19 de tres donantes diferentes se co-cultivaron con células diana K562.CD19 por triplicado en dos proporciones E:T en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida durante 5 días. Los resultados se calcularon como un índice de mortalidad normalizado. Los datos representan la media /- S.D. de 3 experimentos.
FIGS. 34A y 34B muestran análisis de la producción de citocinas de células T anti-CD19 que expresan CAR en presencia del Compuesto 1(FIG. 34A) o lenalidomida (FIG. 34B) tras la estimulación con anticuerpos antiidiotípicos. Ensayo multiplex de citoquinas de sobrenadantes tomados a las 24 horas de pocillos triplicados de células T que expresan CAR anti-CD19 co-cultivados con anticuerpo agonista anti-idiotípico en presencia de 100 0 1000 nM de Compuesto 1(FIG. 34A), o 500 o 5000 nM de lenalidomida (FIG. 34B). Se determinaron las concentraciones de IFN-<y>, IL-2 y TNF-a de las células T que expresaban CAR procedentes de tres donantes diferentes. Los datos representan la media /- S.D. de 3 experimentos.
FIGS. 35A y 35B muestran análisis de expresiones de marcadores de superficie en células T CD4+ anti-CD19 que expresan CAR (FIG. 35A) y células T CD8+ anti-CD19 que expresan CAR (FIG. 35B) en presencia del Compuesto 1 tras la estimulación con anticuerpos antiidiotípicos. Células T anti-CD19 que expresan CAR de tres donantes diferentes fueron estimuladas con anticuerpo anti-idiotípico a 0, 0,3, 3, o 30 pg/mL en presencia de 100 o 1000 nM del Compuesto 1. Las células se analizaron mediante citometría de flujo el día 4. Se calculó el cambio absoluto en la mediana de la intensidad de fluorescencia en relación con el control con vehículo para cada concentración de anticuerpo antiidiotípico. Los datos son representativos de 3 experimentos.
FIGS. 36A y 36B muestran el análisis de las expresiones de marcadores de superficie en células T CD4+ anti-CD19 que expresan CAR (FIG. 36A) y células T CD8+ anti-CD19 que expresan Ca r (FIG. 36B) en presencia de lenalidomida tras la estimulación con anticuerpos antiidiotípicos. Se estimularon células T que expresaban CAR anti-CD19 de tres donantes diferentes con anticuerpo antiidiotípico a 0, 0,3, 3 o 30 pg/mL en presencia de 500 o 5000 nM de lenalidomida. Las células se analizaron mediante citometría de flujo el día 4. Se calculó el cambio absoluto en la mediana de la intensidad de fluorescencia en relación con el control con vehículo para cada concentración de anticuerpo antiidiotípico. Los datos son representativos de 3 experimentos.
FIGS.37A y 37B muestran el análisis de la expresión superficial de CD28 en células T CD4+ y CD8+ que expresan CAR anti-CD19 en presencia del Compuesto 1 (FIG. 37A) o lenalidomida (FIG. 37B) tras la estimulación en serie. Células T que expresan CAR anti-CD19 de tres donantes diferentes fueron estimuladas con K562.CD19 en una proporción E:T de 2,5:1 cada 3-4 días en presencia del Compuesto 1 (FIG. 37A) o lenalidomida (FIG. 37B). El porcentaje de células positivas para CD28 se midió mediante citometría de flujo en el día 28.
La FIG. 38 muestra el análisis de la función citolítica de células T anti-CD19 que expresan CAR en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida tras estimulación seriada. Células T expresantes de CAR anti-CD19 de tres donantes diferentes tras 24 días de estimulación seriada se co-cultivaron con células diana K562.CD19 irradiadas por triplicado en dos proporciones E:T en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida. Los resultados se calcularon como un índice de mortalidad normalizado.
FIGS. 39A y 39B muestran el análisis de las duplicaciones de población de células T anti-CD19 que expresan CAR durante un periodo de estimulación en serie de 28 días en presencia o ausencia del Compuesto 1. Células T anti-CD19 que expresan CAR de tres donantes diferentes fueron estimuladas con células diana K562.CD19 en una proporción E:T de 2,5:1 o 10:1 cada 3-4 días en presencia de 500 nM de Compuesto 1 durante 28 días (representado por el eje x). Se contaron las células después de cada estimulación y se calcularon los doblajes celulares. (FIG. 39A) El cambio porcentual en la duplicación celular en el día 24 de estimulación seriada en presencia de 10 nM, 100 nM o 500 nM del Compuesto 1 se mostró en la FIG. 39B. Los datos representan la media /- E.S.M. de tratamientos triplicados de 3 donantes. Cada flecha representa un punto temporal de reestimulación. FIGS. 40A y 40B muestran análisis de duplicación de poblaciones de células T anti-CD19 que expresan CAR durante un periodo de estimulación en serie de 28 días en presencia o ausencia de lenalidomida. Las células T que expresan CAR anti-CD19 de tres donantes diferentes fueron estimuladas con células diana K562.CD19 en una proporción E:T de 2,5:1 o 10:1 cada 3-4 días en presencia de lenalidomida 1000 nM durante 28 días (representado por el eje x). Se contaron las células después de cada estimulación y se calcularon los doblajes celulares. (FIG. 40A) El cambio porcentual en la duplicación celular en el día 24 de estimulación seriada en presencia de lenalidomida 100 nM o 1000 nM se muestra en la FIG. 40B. Los datos representan la media /-E.S.M. de tratamientos triplicados de tres donantes. Cada flecha representa un punto temporal de reestimulación.
Descripción Detallada
[0057] Las realizaciones de la invención se describen en algunos de los casos y aspectos divulgados a continuación.
[0058] En el presente documento se describen terapias combinadas que implican la administración de una inmunoterapia que afecta a la función o actividad de las células T, como una terapia de células T, y un compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la E3-ubiquitina ligasa. En algunos aspectos, los métodos divulgados mejoran o modulan la proliferación y/o actividad de la actividad de células T asociada con la administración de una inmunoterapia o agente inmunoterapéutico, tal como una composición que incluye células para terapia celular adoptiva, por ejemplo, tal como una terapia de células T (por ejemplo, células T que expresan CAR). En algunos casos, la terapia combinada implica la administración de un compuesto inmunomodulador, como un análogo estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la E3-ubiquitina ligasa, y la administración de la terapia celular T, como una composición que incluye células para terapia celular adoptiva, por ejemplo, como una terapia celular T (por ejemplo, células T que expresan c A r ).
[0059] Las terapias basadas en células T, como las terapias de células T adoptivas (incluidas las que implican la administración de células que expresan receptores quiméricos específicos para una enfermedad o trastorno de interés, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR) y/u otros receptores de antígenos recombinantes, así como otras terapias de células inmunitarias adoptivas y de células T adoptivas) pueden ser eficaces en el tratamiento del cáncer y otras enfermedades y trastornos. La expresión manipulada de receptores recombinantes, como los receptores de antígenos quiméricos (CAR), en la superficie de las células T permite redirigir la especificidad de estas células. En estudios clínicos, las células CAR-T, por ejemplo las células CAR-T anti-CD19, han producido respuestas duraderas y completas tanto en pacientes con leucemia como con linfoma (Porter et al. (2015) Sci Transl Med., 7:303ra139; Kochenderfer (2015) J. Clin. Oncol., 33: 540-9; Lee et al. (2015) Lancet, 385:517-28; Maude et al. (2014) N Engl J Med, 371: 1507-17).
[0060] En ciertos contextos, los enfoques disponibles para la terapia celular adoptiva pueden no ser siempre totalmente satisfactorios. En algunos contextos, la eficacia óptima puede depender de la capacidad de las células administradas para reconocer y unirse a una diana,por ej.,un antígeno diana, para traficar, localizarse y penetrar con éxito en los sitios apropiados dentro del sujeto, los tumores y sus entornos. En algunos contextos, la eficacia óptima puede depender de la capacidad de las células administradas para activarse, expandirse, ejercer diversas funciones efectoras, incluida la destrucción citotóxica y la secreción de diversos factores como las citocinas, persistir, incluso a largo plazo, diferenciarse, transicionar o participar en la reprogramación hacia determinados estados fenotípicos (como la memoria de larga duración, menos diferenciados y efectores), para evitar o reducir las condiciones inmunosupresoras en el microentorno local de una enfermedad, para proporcionar respuestas de recuerdo eficaces y sólidas tras la eliminación y reexposición al ligando o antígeno diana, y para evitar o reducir el agotamiento, la anergia, la tolerancia periférica, la diferenciación terminal y/o la diferenciación a un estado supresivo.
[0061] En algunos casos, la exposición y persistencia de las células de ingeniería se reduce o disminuye después de la administración al sujeto. Sin embargo, las observaciones indican que, en algunos casos, una mayor exposición del sujeto a las células administradas que expresan los receptores recombinantes (por ejemplo, mayor número de células o duración en el tiempo) puede mejorar la eficacia y los resultados terapéuticos en la terapia celular adoptiva. Los análisis preliminares llevados a cabo tras la administración de diferentes células T que expresan CAR de marcación de CD19 a sujetos con diversos cánceres que expresan CD19 en múltiples ensayos clínicos revelaron una correlación entre un grado mayor y/o más prolongado de exposición a las células que expresan CAR y los resultados del tratamiento. Dichos resultados incluían la supervivencia y la remisión de los pacientes, incluso en individuos con una carga tumoral grave o significativa.
[0062] En algunos aspectos, los métodos y usos divulgados proporcionan o logran respuestas o eficacia mejoradas o más duraderas en comparación con ciertos métodos alternativos, como en grupos particulares de sujetos tratados. En algunos casos, los métodos son ventajosos en virtud de la administración de terapia celular T, tal como una composición que incluye células para terapia celular adoptiva, por ejemplo, tal como una terapia celular T(por ej.células T que expresan CAR), y un compuesto inmunomodulador, como un análogo estructural o funcional o un derivado de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ejemplo lenalidomida.
[0063] Los métodos divulgados se basan en observaciones de que el compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ejemplo lenalidomida, mejora la función de las células T, incluidas las funciones relacionadas con la expansión, proliferación y persistencia de las células T. La lenalidomida es un fármaco inmunomodulador actualmente aprobado para el tratamiento del mieloma múltiple (MM) y el linfoma de células del manto (MCL), y clínicamente probado en la terapia del linfoma difuso de células B grandes de inmunofenotipo de células B activadas. En algunos casos, la lenalidomida aumenta las respuestas inmunitarias antitumorales, al menos parcialmente, modulando la actividad de la E3 ubiquitin ligasa Cereblon (CRBN), que conduce a un aumento de la ubiquitinilación de los factores de transcripción Ikaros y Aiolos, lo que a su vez provoca un cambio en la expresión de diversos receptores en la superficie de las células tumorales(véase,por ejemplo, Otáhal et al. (2016) Oncoimmunology., April; 5(4): e1115940).
[0064] Los hallazgos proporcionados indican que la terapia de combinación del compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ej. lenalidomida, en métodos que implican células T, como los que implican la administración de terapia de células T adoptiva, consigue mejorar la función de la terapia de células T. En algunos casos, la combinación de la terapia celular (por ej. la administración de células T modificadas) con el compuesto inmunomodulador, por ej. lenalidomida, mejora o potencia una o más funciones y/o efectos de la terapia celular T, como la persistencia, la expansión, la citotoxicidad y/o los resultados terapéuticos, por ej. la capacidad de eliminar o reducir la carga del tumor u otra enfermedad o célula diana.
[0065] En aspectos particulares, se encuentra en el presente documento que un compuesto inmunomodulador, tal como un análogo estructural o funcional o derivado de talidomida y/o un inhibidor de E3 ubiquitina ligasa, por ejemplo lenalidomida, promueve la función continua y/o supervivencia de células de una terapia de células T (por ejemplo células CAR-T) después de la activación, incluyendo después del encuentro con antígeno. En algunos aspectos, la lenalidomida aumenta la capacidad de dichas células T para persistir o funcionar a largo plazo, como por ejemplo previniendo el agotamiento o la muerte celular. En algunos casos, dichas mejoras pueden dar lugar a una terapia combinada que presente respuestas globales mejoradas, por ejemplo, reducción de la carga tumoral, y/o mayor supervivencia en comparación con sujetos tratados con una monoterapia que incluya la administración de la terapia celular T (por ejemplo, célula CAR-T) o compuesto inmunomodulador (por ejemplo, lenalidomida) solos. En algunos aspectos, los métodos divulgados aumentan la respuesta global y/o la supervivencia en o más de 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más en comparación con un tratamiento alternativo, como en comparación con una monoterapia que incluya la administración de la terapia de células T (por ejemplo, célula CAR-T) o compuesto inmunomodulador (por ejemplo, lenalidomida) solo.
[0066] En algunos casos, la combinación con el compuesto inmunomodulador, aunque mejora uno o más resultados o atributos funcionales, no afecta a uno o más efectos secundarios o cambios no deseados en las células T, como por ejemplo no reduce la capacidad de las células para activarse, secretar una o más citocinas deseadas, expandirse y/o persistir, por ejemplo, según se mide en un ensayo in vitro en comparación con dichas células cultivadas en condiciones por lo demás iguales pero en ausencia del compuesto inmunomodulador. Así, en algunos casos, se divulgan métodos y combinaciones que dan lugar a mejoras en la función o el fenotipo de las células T, por ejemplo, en la funcionalidad intrínseca de las células T y/o el fenotipo intrínseco de las células T, generalmente sin comprometer una o más de las otras propiedades deseadas de funcionalidad, por ejemplo, de la funcionalidad de las células CAR-T.
[0067] En algunos casos, los métodos divulgados pueden potenciar la terapia celular T, por ejemplo, la terapia celular CAR-T, que, en algunos aspectos, puede mejorar los resultados del tratamiento. En algunos casos, los métodos son particularmente ventajosos en sujetos en los que las células de la terapia celular T muestran una expansión débil, se han agotado, muestran una persistencia reducida o disminuida en el sujeto y/o en sujetos que tienen un cáncer que es resistente o refractario a otras terapias, es un cáncer agresivo o de alto riesgo, y/o que es o es probable que muestre una tasa de respuesta relativamente menor a una terapia celular CAR-T administrada sin el compuesto inmunomodulador en comparación con otro tipo de cáncer o en comparación con la administración con una terapia celular CAR-T diferente.
[0068] En algunos aspectos, los métodos divulgados pueden mejorar, aumentar o potenciar la terapia de células T, como para superar la falta de persistencia y/o el agotamiento de las células T, por ej. en sujetos en los que, en el día 12-15 o aproximadamente después del inicio de la administración de la terapia de células T, menos de 10 pl, como menos de 5 pl o menos de 1 pl de dichas células, o un subconjunto CD8+ o CD3+ de las mismas, son detectables en la sangre. En algunos casos, un sujeto que ha recibido la administración de una terapia de células T, por ejemplo, una célula CAR-T, se monitoriza para detectar la presencia, ausencia o nivel de células T de la terapia en el sujeto, como en una muestra biológica del sujeto, por ejemplo, en la sangre del sujeto. En algunos casos, se administra un compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ejemplo lenalidomida, a un sujeto que ha recibido la terapia de células T (por ejemplo, células CAR-T CAR-T) pero en el que dichas células se han expandido débilmente y/o están en o por debajo de un nivel umbral en una muestra del sujeto, por ejemplo, una muestra de sangre, en un momento en el que típicamente se observa una expansión fuerte o robusta de las células CAR-T en el sujeto en una pluralidad de sujetos a los que se administra una terapia de células T (por ejemplo, CAR-T), en algunos casos, esta misma terapia de células T (por ejemplo, las mismas células CAR-T). En algunos aspectos, se administra un compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ej. lenalidomida, si, en el día 12-15 o aproximadamente después del inicio de la administración de la terapia de células T, son detectables en la sangre menos de 10 pl, como menos de 5 pl o menos de 1 pl de dichas células, o un subconjunto CD8+ o CD3+ de las mismas.
[0069] En ciertos aspectos, los métodos divulgados pueden mejorar, aumentar o potenciar la terapia de células T en sujetos en los que se ha observado una respuesta máxima a la terapia de células T, pero en los que la respuesta, por ejemplo, la presencia de células T y/o la reducción de la carga tumoral, se ha reducido o ya no es detectable. En algunos aspectos, un compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ej. lenalidomida, se administra a un sujeto en el plazo de una semana, tal como en el plazo de 1,2 o 3 días después de que: (i) el nivel máximo o pico de las células de la terapia celular T sea detectable en la sangre del sujeto; (ii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre, después de haber sido detectables en la sangre, no sea detectable o se reduzca, opcionalmente reducido en comparación con un punto temporal precedente después de la administración de la terapia celular T; (iii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre se reduzca en o más de 1.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces.(iv) en un momento posterior al pico o nivel máximo de células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto, el número de células de o derivadas de las células T detectables en la sangre del sujeto es inferior a menos del 10%, menos del 5%, menos del 1% o menos del 0,5% del total de células monoclonales de sangre periférica detectables en la sangre del sujeto, el número de células de o derivadas de las células T detectables en la sangre del sujeto es inferior a menos del 10%, menos del 5%, menos del 1% o menos del 0,1% del total de células monoclonales de sangre periférica detectables en la sangre del sujeto.1% del total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la sangre del sujeto; (v) el sujeto presenta progresión de la enfermedad y/o ha recaído tras la remisión después del tratamiento con la terapia de células T; y/o (iv) el sujeto presenta aumento de la carga tumoral en comparación con la carga tumoral en un momento anterior o posterior a la administración de las células T y anterior al inicio de la administración del compuesto inmunomodulador.
[0070] En algunos casos, los métodos pueden usarse para tratar una enfermedad o afección, por ejemplo, una neoplasia maligna de células B o hematológica, y en particular tales enfermedades, afecciones o neoplasias malignas en las que las respuestas, por ejemplo, respuesta completa, al tratamiento con la terapia celular T sola, tal como una composición que incluye células para terapia celular adoptiva, por ejemplo, tal como una terapia celular T(porej.células T que expresan CAR), es relativamente baja en comparación con el tratamiento con otras terapias de células T o el tratamiento de otras enfermedades o neoplasias malignas (por ejemplo, una RC en menos de o menos de aproximadamente el 60%, menos de aproximadamente el 50% o menos de aproximadamente el 45% de los sujetos así tratados) y/o en los que el sujeto no responde al tratamiento con el compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ejemplo, lenalidomida, solo.
[0071] En algunos casos, la terapia combinada aquí divulgada es para uso en un sujeto que tiene un cáncer en el que después de la iniciación de la administración de la terapia de células T, tal como una composición que incluye células para terapia celular adoptiva, por ejemplo, células T que expresan CAR, el sujeto ha recaído después de la remisión después del tratamiento con la terapia de células T. En algunos casos, a los sujetos que han recaído tras dicha remisión se les administra un compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ejemplo, lenalidomida. En algunos casos, la terapia combinada aquí descrita se utiliza en un sujeto que padece una enfermedad o afección, por ejemplo cáncer, en la que la cantidad del compuesto inmunomodulador administrado es insuficiente, como agente único y/o en ausencia de la administración de la terapia celular T, para mejorar, reducir o prevenir la enfermedad o afección o un síntoma o resultado de la misma, como por ejemplo es insuficiente para mejorar, reducir o prevenir la enfermedad o afección en el sujeto o un síntoma o resultado de la misma. En algunos casos, el método reduce o mejora un síntoma o resultado o carga de la enfermedad o afección en un grado que es mayor que la combinación de (i) el grado de reducción o mejora efectuado por la administración del agente inmunomodulador solo, opcionalmente por término medio en una población de sujetos que padecen la enfermedad o afección, y (ii) el grado de reducción o mejora por la administración de la terapia de células T sola, opcionalmente por término medio en una población de sujetos que padecen la enfermedad o afección. En algunos casos, el método reduce o mejora dichos síntomas, resultados o cargas de la enfermedad, por ej. en comparación con la media de una población de sujetos que padecen la enfermedad o afección, en más o menos 1,5 veces.5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces o más.
[0072] En algunos casos, la terapia de combinación proporcionada se utiliza en relación con el tratamiento de ciertas enfermedades o afecciones, por ejemplo, cáncer, en las que la estimulación óptima de un receptor de antígeno recombinante, por ejemplo, célula c AR-T, es difícil de lograr y/o no se observa de manera consistente. En algunos casos, una estimulación inferior a la óptima puede ser el resultado de niveles bajos o inaccesibles del antígeno de la enfermedad in vivo, por ejemplo, en el tumor o sobre él. En algunos casos, ciertos tipos de cáncer, como el NHL, por ejemplo el NHL de alto riesgo o agresivo, como el DLBCL, y/o la leucemia linfocítica crónica (CLL), pueden asociarse a defectos o reducción de la funcionalidad intrínseca de las células T, que, en algunos casos, está influida por la propia enfermedad. Por ejemplo, la patogénesis de muchos cánceres, como la CLL y el NHL, por ejemplo el DLBCL, puede estar asociada a la inmunodeficiencia, lo que conduce a la promoción del crecimiento tumoral y la evasión inmunitaria, por ejemplo debido a la inmunosupresión de las células T, por ejemplo impulsada por uno o más factores en el microambiente tumoral. En algunos casos, el alivio de los defectos intrínsecos de las células T obtenidas de cánceres de dichos pacientes para su uso en relación con la terapia celular adoptiva podría proporcionar respuestas más potentes a la terapia celular T adoptiva, por ejemplo, la terapia celular CAR-T. En algunos casos, una estimulación inferior a la óptima puede deberse a diferencias en el nivel de expresión del CAR en las células T de ingeniería administradas al sujeto. En cualquiera de dichos casos, la administración del compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ejemplo, lenalidomida, puede potenciar la estimulación o actividad de dichas células T in vivo en el sujeto.
[0073] En algunos casos de los métodos divulgados, una o más propiedades de las células modificadas genéticamente administradas pueden mejorarse o aumentar o ser mayores en comparación con las células administradas de una composición de referencia, como una expansión y/o persistencia mayor o más prolongada de dichas células administradas en el sujeto o una respuesta de recuerdo mayor o aumentada tras la reestimulación con antígeno. En algunos casos, el aumento puede ser de al menos 1,2 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces en dicha propiedad o característica en comparación con la misma propiedad o característica tras la administración de una composición celular de referencia. En algunos casos, el aumento en una o más de dichas propiedades o características puede observarse o está presente en el plazo de 7 días, 14 días, 21 días, en el plazo de un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses, cinco meses, seis meses o 12 meses tras la administración de las células modificadas genéticamente y el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ejemplo, lenalidomida.
[0074] En algunos casos, una composición celular de referencia puede ser una composición de células T de la sangre de un sujeto que no tiene o no se sospecha que tiene el cáncer o es una población de células T obtenida, aislada, generada, producida, incubada y/o administrada en las mismas condiciones o sustancialmente en las mismas condiciones, excepto que no ha sido incubada o administrada en presencia del compuesto inmunomodulador. En algunos casos, la composición celular de referencia contiene células modificadas genéticamente que son sustancialmente iguales, incluida la expresión del mismo receptor recombinante, por ejemplo, CAR. En algunos aspectos, dichas células T se tratan de forma idéntica o sustancialmente idéntica, como fabricadas de forma similar, formuladas de forma similar, administradas en la misma o aproximadamente la misma cantidad de dosis y otros factores similares.
[0075] En algunos casos, los métodos divulgados dan como resultado una célula modificada genéticamente con mayor persistencia y/o mejor potencia en un sujeto al que se administra. En algunos casos, la persistencia de las células modificadas genéticamente, como las células T que expresan CAR, en el sujeto es mayor en comparación con la que se conseguiría con métodos alternativos, como los que implican la administración de una composición celular de referencia, por ejemplo, la administración de la terapia de células T pero en ausencia de la administración del compuesto inmunomodulador. En algunos casos, la persistencia aumenta al menos o aproximadamente 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces o más.
[0076] En algunos casos, el grado o extensión de la persistencia de las células administradas puede detectarse o cuantificarse después de la administración a un sujeto. Por ejemplo, en algunos aspectos, la PCR cuantitativa (qPCR) se utiliza para evaluar la cantidad de células que expresan el receptor recombinante (por ejemplo, células que expresan CAR) en la sangre o el suero o el órgano o tejido (por ejemplo, el lugar de la enfermedad) del sujeto. En algunos aspectos, la persistencia se cuantifica como copias de ADN o plásmido que codifica el receptor, por ejemplo, CAR, por microgramo de ADN, o como el número de células que expresan el receptor, por ejemplo, CAR, por microlitro de la muestra, por ejemplo, de sangre o suero, o por número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o glóbulos blancos o células T por microlitro de la muestra. En algunos casos, también pueden realizarse ensayos de citometría de flujo que detectan células que expresan el receptor generalmente utilizando anticuerpos específicos para los receptores. También pueden utilizarse ensayos celulares para detectar el número o porcentaje de células funcionales, como células capaces de unirse a y/o neutralizar y/o inducir respuestas, por ejemplo, citotóxicas, contra células de la enfermedad o afección o que expresan el antígeno reconocido por el receptor. En cualquiera de estos casos, el grado o nivel de expresión de otro marcador asociado con el receptor recombinante (por ejemplo, células que expresan CAR) puede utilizarse para distinguir las células administradas de las células endógenas en un sujeto.
[0077] También se divulgan métodos para la ingeniería, preparación y producción de las células, composiciones que contienen las células y/o el compuesto inmunomodulador, y kits y dispositivos que contienen y para usar, producir y administrar las células y/o el compuesto inmunomodulador, como de acuerdo con los métodos de terapia de combinación divulgados.
[0078] Los títulos de las secciones que se utilizan en el presente documento tienen únicamente fines organizativos y no deben interpretarse como una limitación de la materia descrita.
I. TERAPIA COMBINADA
[0079] En el presente documento se divulgan métodos de terapia combinada para tratar una enfermedad o trastorno, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad proliferativa, que incluye administrar a un sujeto una terapia combinada de 1) un compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ejemplo, lenalidomida, y 2) una terapia de células T, por ejemplo, células que expresan CAR, por ejemplo, células T. En algunos casos, la terapia celular T es una terapia celular inmunitaria adoptiva que comprende células T que reconocen y/o se dirigen específicamente a un antígeno asociado con una enfermedad o trastorno, por ejemplo, un cáncer o una enfermedad proliferativa. También se divulgan combinaciones y artículos de fabricación, tales como kits, que contienen una composición que comprende la terapia de células T y/o una composición que comprende el compuesto inmunomodulador, y usos de tales composiciones y combinaciones para tratar o prevenir enfermedades, afecciones y trastornos, incluyendo cánceres.
[0080] En algunos casos, dichos métodos pueden incluir la administración del compuesto inmunomodulador, como un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3, por ej. lenalidomida, antes de, simultáneamente con, durante, en el transcurso de (incluyendo una vez y/o periódicamente durante el transcurso de), y/o posteriormente a, la administración (por ej. inicio de la administración) de la terapia de células T (por ej. células T que expresan CAR). En algunos casos, las administraciones pueden incluir administraciones secuenciales o intermitentes del compuesto inmunomodulador y la terapia de células T.
[0081] En algunos casos, la terapia celular es una terapia celular adoptiva. En algunos casos, la terapia celular es o comprende una terapia linfocítica infiltrante de tumor (TIL), una terapia<t>C<r>transgénica o una terapia celular que expresa un receptor recombinante (opcionalmente terapia celular T), que opcionalmente es una terapia celular que expresa un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos casos, la terapia es una terapia dirigida a células B. En algunos casos, la terapia se dirige al antígeno de maduración de células B (BCMA). En algunos casos, la terapia se dirige a CD19. En algunos casos, las células y los regímenes de dosificación para administrar las células pueden incluir cualquiera de los descritos en la siguiente subsección A bajo "Administración de la terapia de células T".
[0082] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador potencia la funcionalidad de las células T. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador impulsa la actividad antimieloma. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador altera el microambiente supresor. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un análogo estructural o funcional o un derivado de la talidomida. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es lenalidomida o un compuesto con propiedades iguales o similares a las de la lenalidomida, incluidos análogos o derivados, un estereoisómero de lenalidomida o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, los regímenes de dosificación para administrar el compuesto inmunomodulador pueden incluir cualquiera de los descritos en la siguiente subsección B bajo "Administración del compuesto inmunomodulador".
[0083] En algunos casos, la terapia de células T (por ejemplo, células T que expresan CAR) y el compuesto inmunomodulador se proporcionan como composiciones farmacéuticas para su administración al sujeto. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas contienen cantidades terapéuticamente eficaces de uno o ambos agentes para la terapia combinada,por ej.,células T para la terapia celular adoptiva y un compuesto inmunomodulador como se ha descrito. En algunos casos, los agentes se formulan para su administración en composiciones farmacéuticas separadas. En algunos casos, cualquiera de las composiciones farmacéuticas aquí divulgadas puede formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
[0084] En algunos casos, la terapia combinada, que incluye la administración de la terapia de células T, incluidas las células de ingeniería, como la terapia de células CAR-T, y el compuesto inmunomodulador se administra a un sujeto o paciente que tiene una enfermedad o afección a tratar(por ej.,cáncer) o que está en riesgo de tener la enfermedad o afección(por ej.,cáncer). En algunos aspectos, los métodos tratan,por ej.,mejoran uno o más síntomas de la enfermedad o afección, por ejemplo, disminuyendo la carga tumoral en un cáncer que expresa un antígeno reconocido por la inmunoterapia o el agente inmunoterapéutico, por ejemplo, reconocido por una célula T modificada.
[0085] En algunos casos, la enfermedad o afección que se trata puede ser cualquiera en la que la expresión de un antígeno esté asociada y/o implicada en la etiología de una enfermedad, afección o trastorno, porejemplo,cause, exacerbe o esté implicada de otro modo en dicha enfermedad, afección o trastorno. Las enfermedades y afecciones ejemplares pueden incluir enfermedades o afecciones asociadas con malignidad o transformación de células(por ej.,cáncer), enfermedad autoinmune o inflamatoria, o una enfermedad infecciosa,por ej.,causada por patógenos bacterianos, víricos o de otro tipo. Los antígenos ejemplares, que incluyen antígenos asociados con diversas enfermedades y afecciones que pueden tratarse, incluyen cualquiera de los antígenos descritos en el presente documento. En casos particulares, el receptor recombinante expresado en células de ingeniería de una terapia combinada, incluido un receptor de antígeno quimérico o TCR transgénico, se une específicamente a un antígeno asociado con la enfermedad o afección.
[0086] En algunos casos, la enfermedad o afección es un tumor, como un tumor sólido, linfoma, leucemia, tumor sanguíneo, tumor metastásico u otro tipo de cáncer o tumor.
[0087] En algunos casos, el cáncer o enfermedad proliferativa es una neoplasia maligna de células B o hematológica. En algunos casos, el cáncer o la enfermedad proliferativa es leucemia linfoblástica (ALL), linfoma no Hodgkin (NHL) o leucemia linfocítica crónica (CLL). En algunos casos, el cáncer es CLL. En algunos casos, los métodos pueden utilizarse para tratar un mieloma, un linfoma o una leucemia. En algunos casos, los métodos pueden utilizarse para tratar un linfoma no Hodgkin (NHL), una leucemia linfoblástica aguda (ALL), una leucemia linfocítica crónica (CLL), un linfoma difuso de células B grandes (LDCGB), una leucemia mieloide aguda (LMA) o un mieloma,por ej.,un mieloma múltiple (MM). En algunos casos, los métodos pueden utilizarse para tratar un MM o un DBCBL.
[0088] En algunos casos, el antígeno asociado con la enfermedad o trastorno se selecciona del grupo que consiste en ROR1, antígeno de maduración de células B (BCMA), tEGFR, Her2, Ll-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA, y antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3, o 4, dímeros erbB, EGFR vIII, FBP, FCRL5, FCRH5, receptor fetal de aceticolina e, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, (L1-CAM), antígeno asociado al melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno expresado preferentemente del melanoma (PRAME), survivina, EGP2, EGP40, TAG72, B7-H6, receptor IL-13 a2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor de folato-a, CD44v6, CD44v7/8, integrina avb6, 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligandos NKG2D, CD44v6, antígeno dual, y un antígeno asociado a una etiqueta universal, un antígeno cáncer-testículo, mesotelina, MUC1, MUC16, PSCA, ligandos NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, Recetor 5D acoplado a proteína G (GPCR5D), antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno prostático específico, PSMA, Her2/neu, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, efrinB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, Tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138 y un antígeno patógeno específico. En algunos casos, el antígeno está asociado o es una etiqueta universal.
[0089] En algunos casos, el cáncer o la enfermedad proliferativa expresa BCMA. En algunos casos, los métodos divulgados emplean una célula T recombinante que expresa el receptor(por ej.CAR-T) dirigida contra BCMA.
[0090] En algunos casos, los métodos pueden utilizarse para tratar un cáncer no hematológico, como un tumor sólido. En algunos casos, los métodos pueden utilizarse para tratar un cáncer de vejiga, pulmón, cerebro, melanoma(porej.,pulmón de células pequeñas, melanoma), mama, cuello uterino, ovario, colorrectal, páncreas, endometrio, esófago, riñón, hígado, próstata, piel, tiroides o útero. En algunos casos, el cáncer o la enfermedad proliferativa es un cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer renal, cáncer hepatocelular, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer cervical, cáncer de páncreas, cáncer rectal, cáncer de tiroides, cáncer uterino, cáncer gástrico, cáncer esofágico, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cánceres neuroendocrinos, cánceres del SNC, tumores cerebrales, cáncer de hueso o sarcoma de tejidos blandos.
[0091] En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección infecciosa, como por ejemplo, entre otras, infecciones virales, retrovirales, bacterianas y protozoarias, inmunodeficiencia, citomegalovirus (CMV), virus de Epstein-Barr (EBV), adenovirus, poliomavirus BK. En algunos casos, la enfermedad o afección es una enfermedad o afección autoinmune o inflamatoria, como la artritis,por ej., laartritis reumatoide (AR), la diabetes de tipo I, el lupus eritematoso sistémico (LES), la enfermedad inflamatoria intestinal, la psoriasis, la esclerodermia, la enfermedad tiroidea autoinmune, la enfermedad de Graves, la enfermedad de Crohn, la esclerosis múltiple, el asma y/o una enfermedad o afección asociada a un trasplante.
[0092] Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada de compuesto inmunomodulador (por ej. lenalidomida) y/o inmunoterapia, como una terapia de células T(por ej.CAR), puede depender del tipo de enfermedad a tratar, el compuesto inmunomodulador concreto, las células y/o los receptores recombinantes expresados en las células, la gravedad y el curso de la enfermedad, la vía de administración, si el compuesto inmunomodulador y/o la terapia de células T se administran con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la frecuencia de administración, el historial clínico del sujeto y la respuesta a las células, y la discreción del médico tratante. En algunos casos, las composiciones y las células se administran adecuadamente al sujeto de una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Se describen regímenes y esquemas de dosificación ejemplares para la terapia combinada proporcionada.
[0093] En algunos casos, la terapia de células T y el compuesto inmunomodulador se administran como parte de otro tratamiento combinado, que puede administrarse simultánea o secuencialmente, en cualquier orden, a otra intervención terapéutica. En algunos contextos, la terapia de células T, por ej. células T modificadas, como las células T que expresan CAR, se coadministra con otra terapia lo suficientemente próxima en el tiempo como para que la terapia de células T potencie el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. En algunos casos, las células se administran antes de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, la terapia de células T, por ejemplo, células T modificadas, como las células T que expresan CAR, se administran después de uno o más agentes terapéuticos adicionales. En algunos casos, los métodos de terapia combinada incluyen además una terapia de linfodepleción, como la administración de un agente quimioterapéutico. En algunos casos, la terapia combinada comprende además la administración de otro agente terapéutico, como un agente anticanceroso, un inhibidor de puntos de control u otro agente inmunomodulador. Los usos incluyen los usos de las terapias combinadas en dichos métodos y tratamientos, y los usos de dichas composiciones en la preparación de un medicamento para llevar a cabo dichos métodos de terapia combinada. En algunos casos, los métodos y usos tratan la enfermedad o afección o trastorno, como un cáncer o enfermedad proliferativa, en el sujeto.
[0094] Antes, durante o después de la administración de la inmunoterapia(por ej.T, como la terapia celular CAR-T) y/o un compuesto inmunomodulador, la actividad biológica de la terapia celular T,por ej.,la actividad biológica de las poblaciones celulares modificadas, en algunos casos se mide,por ej.,mediante cualquiera de los métodos conocidos. Los parámetros a evaluar incluyen la capacidad de las células modificadas para destruir las células diana, la persistencia y otras medidas de la actividad de las células T, medidas mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, como los ensayos descritos más adelante en la Sección III. En algunos casos, la actividad biológica de las células,por ej.,las células T administradas para la terapia basada en células T, se mide analizando la destrucción de células citotóxicas, la expresión y/o secreción de una o más citocinas, la proliferación o la expansión, como en la reestimulación con antígeno. En algunos aspectos, la actividad biológica se mide evaluando la carga de la enfermedad y/o el resultado clínico, como la reducción de la carga tumoral. En algunos casos, la administración de uno o ambos agentes de la terapia combinada y/o cualquier administración repetida de la terapia, puede determinarse basándose en los resultados de los ensayos antes, durante, en el transcurso o después de la administración de uno o ambos agentes de la terapia combinada.
[0095] En algunos casos, el efecto combinado del compuesto inmunomodulador en combinación con la terapia celular puede ser sinérgico en comparación con los tratamientos que implican sólo el compuesto inmunomodulador o la monoterapia con la terapia celular. Por ejemplo, en algunos casos, los métodos aquí descritos producen un aumento o una mejora de un efecto terapéutico deseado, como un aumento o una mejora de la reducción o inhibición de uno o más síntomas asociados al cáncer.
[0096] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador aumenta la expansión o proliferación de las células T modificadas, como las células T CAR. En algunos casos, el aumento de la expansión o proliferación se observa in vivo tras la administración a un sujeto. En algunos casos, el aumento en el número de células T modificadas, por ejemplo, células CAR-T, se incrementa en más o menos 1,2 veces, 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces o más.
A. ADMINISTRACIÓN DE TERAPIA CELULAR T
[0097] En algunos casos de los métodos, composiciones, combinaciones, kits y usos aquí divulgados, la terapia combinada incluye administrar a un sujeto una terapia de células inmunitarias, como una terapia de células T(por ej.células T que expresan CAR). La administración de dichas terapias puede iniciarse antes, después o simultáneamente con la administración de uno o más compuestos inmunomoduladores como se ha descrito.
[0098] En algunos casos, la terapia basada en células es o comprende la administración de células, como células inmunitarias, por ejemplo células T o células NK, que se dirigen a una molécula expresada en la superficie de una lesión, como un tumor o un cáncer. En algunos casos, las células inmunitarias expresan un receptor de células T (TCR) u otro receptor de unión a antígenos. En algunos casos, las células inmunitarias expresan un receptor recombinante, como un TCR transgénico o un receptor de antígeno quimérico (CAR). En algunos casos, las células son autólogas del sujeto. En algunos casos, las células son alogénicas al sujeto.
[0099] En algunos aspectos, la terapia de células T es o comprende una terapia de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), una terapia de TCR transgénico o una terapia de células T que comprende células modificadas genéticamente, como una terapia de células que expresan receptores recombinantes. En algunos casos, el receptor recombinante se une específicamente a un ligando, como uno asociado a una enfermedad o afección, porejemplo,asociado o expresado en una célula de un tumor o cáncer. En algunos casos, la terapia de células T incluye la administración de células T diseñadas para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR).
[0100] En algunos casos, las células proporcionadas expresan y/o están diseñadas para expresar receptores, como receptores recombinantes, incluidos los que contienen dominios de unión a ligando o fragmentos de unión de los mismos, y receptores de células T (TCR) y componentes de los mismos, y/o receptores de antígenos no TCR funcionales, como receptores de antígenos quiméricos (CAR). En algunos casos, el receptor recombinante contiene un dominio extracelular de unión al ligando que se une específicamente a un antígeno. En algunos casos, el receptor recombinante es un CAR que contiene un dominio extracelular de reconocimiento de antígeno que se une específicamente a un antígeno. En algunos casos, el ligando, como un antígeno, es una proteína expresada en la superficie de las células. En algunos casos, el CAR es un CAR similar al TCR y el antígeno es un antígeno peptídico procesado, como un antígeno peptídico de una proteína intracelular, que, como un TCR, se reconoce en la superficie celular en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC).
[0101] Entre las células de ingeniería, incluidas las células de ingeniería que contienen receptores recombinantes, se describen en la Sección II a continuación. Entre los receptores recombinantes ejemplares, incluidos los CAR y los TCR recombinantes, así como los métodos de ingeniería e introducción de los receptores en las células, se incluyen los descritos, por ejemplo, en los números de publicación de solicitud de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, WO2016/0046724, WO2016/014789, WO2016/090320, WO2016/094304, WO2017/025038, WO2017/173256, números de publicación de solicitud de patente de EE.UU. US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de EE.UU. N°. 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353, 8,479,118, y 9,765,342, y la solicitud de patente europea número EP2537416, y/o las descritas por Sadelain et al, Cancer Discov., 3(4): 388-398 (2013); Davila et al., PLoS ONE 8(4): e61338 (2013); Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 24(5): 633-39 (2012); Wu et al., Cancer, 18(2): 160-75 (2012). En algunos aspectos, los receptores de antígenos modificados genéticamente incluyen un CAR como se describe en Patente de EEUU N.°: 7.446.190, y los descritos en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional N°: WO/2014055668 A1.
[0102] En algunos casos, el antígeno es o incluye avp6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocida como CAIX o G250), un antígeno cáncer-testis, antígeno cáncer/testículo 1B (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, ciclina A2, Ligando de Quimiocina de C-C Motif 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano de condroitín sulfato 4 (CSPG4), proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína truncada del factor de crecimiento epidérmico (tEGFR), mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógenos, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; también conocido como receptor Fc homólogo 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliósido GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), glypican-3 (GPC3), receptor 5D acoplado a proteína G (GPCR5D), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitario humano A2 (HLA-A2), receptor IL-22 alfa(II,-22Ra), receptor IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1-CAM), CE7 epítopo de L1-CAM, Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A (LRRC8A), Lewis Y, Antigénio associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina(MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1),<m>U<c>16, ligandos del grupo linfocito T asesino 2 miembro D (NKG2D), melanina A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferentemente expresado de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostético específico, antígeno de células madre de próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor tirosina quinasa similar al receptor huérfano 1 (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblasto (TPBG también conocida como 5T4), glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG72), proteína relacionada con la tirosinasa 1 (TRP1, también conocida como TYRP1 o gp75), proteína relacionada con la tirosinasa 2 (TRP2, también conocida como dopacromo tautomerasa, dopacromo delta-isomerasa o DCT), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno, o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por VIH, VHC, VHB u otros patógenos. En algunos casos, los antígenos a los que se dirigen los receptores incluyen antígenos asociados con una neoplasia de células B, como cualquiera de una serie de marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno es o incluye CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30.
[0103] En algunos casos, el antígeno es o incluye un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno. En algunos casos, el antígeno es un antígeno viral (como un antígeno viral del HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios.
[0104] En algunos casos, la terapia combinada incluye la administración a un sujeto de células, por ejemplo células T, que expresan un receptor recombinante que reconoce y/o se dirige específicamente a un antígeno asociado con el cáncer y/o presente en una etiqueta universal. En algunos casos, el antígeno reconocido o al que se dirigen las células T es ROR1, antígeno de maduración de células B (BCMA), anhidrasa carbónica 9 (CAIX), tEGFR, Her2/neu (receptor tirosina quinasa erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, Cd 22, mesotelina, CEA y antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros erbB, EGFR vlII, proteína de unión al folato (FBP), FCRL5, FCRH5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor del dominio de inserción de la quinasa (kdr), cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, (L1-CAM), antígeno asociado al melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno preferentemente expresado de melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al, HLA-A2, PSCA, receptor de folato-a, CD44v6, CD44v7/8, integrina avb6, 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligandos NKG2D, CD44v6, antígeno dual, antígeno a cáncer-testes, mesotelina, CMV murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, receptor 5D acoplado a proteína G (GPCR5D), antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), Her2/neu, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, efrínB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (Og D2), CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138, opcionalmente un antígeno humano de cualquiera de los anteriores; un antígeno patógeno específico.
[0105] Los métodos para la administración de células de ingeniería para la terapia celular adoptiva son conocidos y pueden utilizarse en relación con los métodos y composiciones divulgados. Por ejemplo, los métodos de terapia de células T adoptivas se describen, por ejemplo , en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2003/0170238 a Gruenberg et al ; patente estadounidense n.° 4.690.915 a Rosenberg ; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Véase,porej.,Themeli et al., (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al., (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al., (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.
[0106] En algunos casos, la terapia celular, por ejemplo, la terapia celular T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia autóloga, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir del sujeto que va a recibir la terapia celular, o a partir de una muestra derivada de dicho sujeto. Así, en algunos aspectos, las células se derivan de un sujeto, por ejemplo, un paciente, que necesita un tratamiento y las células, tras su aislamiento y procesamiento, se administran al mismo sujeto.
[0107] En algunos casos, la terapia celular,por ej.,la terapia celular T adoptiva, se lleva a cabo mediante transferencia alogénica, en la que las células se aíslan y/o se preparan de otro modo a partir de un sujeto distinto del sujeto que va a recibir o que finalmente recibe la terapia celular,por ej.,un primer sujeto. En tales casos, las células se administran entonces a un sujeto diferente, por ejemplo, un segundo sujeto, de la misma especie. En algunos casos, el primer y el segundo sujeto son genéticamente idénticos. En algunos casos, el primer y el segundo sujeto son genéticamente similares. En algunos casos, el segundo sujeto expresa la misma clase o supertipo HLA que el primer sujeto.
[0108] En ciertos casos, las células, o poblaciones individuales de subtipos de células, se administran al sujeto en un intervalo de aproximadamente un millón a aproximadamente 100 mil millones de células y/o esa cantidad de células por kilogramo de peso corporal, tal como, por ejemplo, de 1 millón a aproximadamente 50 mil millones de células (por ejemplo, aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1.000 millones de células, aproximadamente 5.000 millones de células, aproximadamente 20.000 millones de células, aproximadamente 30.000 millones de células, aproximadamente 40.000 millones de células, 0 un intervalo definido por dos de los valores anteriores), como por ejemplo, de aproximadamente 10 millones a aproximadamente 100.000 millones de células (por ejemplo, unos 20 millones de células, unos 30 millones de células, unos 40 millones de células, unos 60 millones de células, unos 70 millones de células, unos 80 millones de células, unos 90 millones de células, unos 10.000 millones de células, unos 25.000 millones de células, unos 50.000 millones de células, unos 75.000 millones de células, unos 90.000 millones de células, o un intervalo definido por dos de los valores anteriores), y en algunos casos entre unos 100 millones de células y unos 50.000 millones de células (por ejemplo, unos 120 millones de células, unos 250 millones de células, unos 350 millones de células, unos 450 millones de células, unos 650 millones de células, unos 800 millones de células, unos 900 millones de células, unos 3.000 millones de células, unos 30.000 millones de células, unos 45.000 millones de células) o cualquier valor entre estos intervalos y/o por kilogramo de peso corporal. Las dosis pueden variar en función de los atributos propios de la enfermedad o trastorno y/o del paciente y/o de otros tratamientos.
[0109] En algunos casos, por ejemplo, cuando el sujeto es un ser humano, la dosis incluye menos de aproximadamente 1 x 108 células totales que expresan receptores recombinantes (por ejemplo, CAR), células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 x 106 a 1 x 108 de dichas células, como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 o 1 x 108 o total de dichas células, o el intervalo entre dos de los valores anteriores.
[0110] Las células pueden administrarse por cualquier medio adecuado. Las células se administran en un régimen de dosificación para lograr un efecto terapéutico, como la reducción de la carga tumoral. La dosificación y la administración pueden depender en parte de la pauta de administración del compuesto inmunomodulador, que puede administrarse antes, después y/o simultáneamente con el inicio de la administración de la terapia de células T. Los distintos esquemas de dosificación de la terapia de células T incluyen, entre otros, la administración única o múltiple en distintos puntos temporales, la administración en bolo y la infusión en pulsos.
1. Composiciones y formulaciones
[0111] En algunos casos, la dosis de células de la terapia de células T, tal terapia de células T que comprende células modificadas por ingeniería con un receptor de antígeno recombinante,por ej.CAR o TCR, se proporciona como una composición o formulación, como una composición o formulación farmacéutica. Dichas composiciones pueden utilizarse de acuerdo con los métodos divulgados, como en la prevención o el tratamiento de enfermedades, afecciones y trastornos.
[0112] En algunos casos, la terapia de células T, como las células T modificadas por ingeniería(por ej.CAR), se formulan con un portador farmacéuticamente aceptable. En algunos aspectos, la elección del portador viene determinada en parte por la célula o agente concreto y/o por el método de administración. En consecuencia, existe una gran variedad de formulaciones adecuadas. Por ejemplo, la composición farmacéutica puede contener conservantes. Los conservantes adecuados pueden incluir, por ejemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato sódico y cloruro de benzalconio. En algunos aspectos, se utiliza una mezcla de dos o más conservantes. El conservante o sus mezclas suelen estar presentes en una cantidad comprendida entre el 0,0001% y el 2% en peso de la composición total. Los soportes se describen,por ej.,en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Los portadores farmacéuticamente aceptables no suelen ser tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, entre otros: tampones, como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10 residuos); proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como la polivinilpirrolidona; aminoácidos, como la glicina, la glutamina, la asparagina, la histidina, la arginina o la lisina monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, como glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, como EDTA; azúcares, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones formadores de sal, como sodio; complejos metálicosfp. ej.g.complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como el polietilenglicol (PEG).
[0113] En algunos aspectos se incluyen agentes tamponadores en las composiciones. Entre los agentes tamponadores adecuados se encuentran, por ejemplo, el ácido cítrico, el citrato sódico, el ácido fosfórico, el fosfato potásico y otros ácidos y sales diversos. En algunos aspectos, se utiliza una mezcla de dos o más agentes amortiguadores. El agente tampón o sus mezclas suelen estar presentes en una cantidad de entre el 0,001% y el 4% en peso de la composición total. Se conocen métodos para preparar composiciones farmacéuticas administrables. Los métodos ejemplares se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington: La ciencia y la práctica de la farmacia, Lippincott Williams & Wilkins; 21.a edición. (1 de mayo de 2005).
[0114] Las formulaciones pueden incluir soluciones acuosas. La formulación o composición también puede contener más de un ingrediente activo útil para la indicación, enfermedad o afección concreta que se esté previniendo o tratando con las células o agentes, cuando las actividades respectivas no se afecten negativamente entre sí. Dichos ingredientes activos están convenientemente presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto. Así, en algunos casos, la composición farmacéutica incluye además otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, como agentes quimioterapéuticos,por ej.,asparaginasa, busulfán, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.
[0115] En algunos casos, la composición farmacéutica contiene células en cantidades eficaces para tratar o prevenir la enfermedad o afección, como una cantidad terapéuticamente eficaz o profilácticamente eficaz. En algunos casos, la eficacia terapéutica o profiláctica se controla mediante evaluaciones periódicas de los sujetos tratados. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se repite hasta que se produce una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles y pueden determinarse. La dosis deseada puede administrarse mediante una única administración en bolo de la composición, mediante múltiples administraciones en bolo de la composición o mediante la administración en infusión continua de la composición.
[0116] Las células pueden administrarse utilizando técnicas, formulaciones y/o dispositivos de administración estándar. Se divulgan formulaciones y dispositivos, como jeringas y viales, para el almacenamiento y la administración de las composiciones. Con respecto a las células, la administración puede ser autóloga o heteróloga. Por ejemplo, las células o progenitores inmunorresponsables pueden obtenerse de un sujeto y administrarse al mismo sujeto o a un sujeto diferente y compatible. Las células inmunorreactivas derivadas de sangre periférica o su progenie (por ejemplo, derivadas in vivo, ex vivo o in vitro) pueden administrarse mediante inyección localizada, incluida la administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica (por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene una célula inmunorresponsable modificada genéticamente), generalmente se formulará en una forma inyectable de dosis unitaria (solución, suspensión, emulsión).
[0117] Las formulaciones incluyen aquellas para administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o en supositorios. En algunos casos, el agente o las poblaciones celulares se administran por vía parenteral. El término "parenteral", tal como se utiliza aquí, incluye la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, rectal, vaginal e intraperitoneal. En algunos casos, el agente o las poblaciones celulares se administran a un sujeto mediante administración sistémica periférica por inyección intravenosa, intraperitoneal o subcutánea.
[0118] En algunos casos, las composiciones se proporcionan como preparaciones líquidas estériles, por ejemplo, soluciones acuosas isotónicas, suspensiones, emulsiones, dispersiones o composiciones viscosas, que en algunos aspectos pueden tamponarse a un pH seleccionado. Las preparaciones líquidas suelen ser más fáciles de preparar que los geles, otras composiciones viscosas y las composiciones sólidas. Además, las composiciones líquidas son algo más cómodas de administrar, especialmente por inyección. Por otra parte, las composiciones viscosas pueden formularse dentro del intervalo de viscosidad adecuado para proporcionar periodos de contacto más prolongados con tejidos específicos. Las composiciones líquidas o viscosas pueden comprender portadores, que pueden ser un disolvente o medio dispersante que contenga, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos.
[0119] Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando las células en un disolvente, por ejemplo en mezcla con un portador, diluyente o excipiente adecuado, como agua estéril, solución salina fisiológica, glucosa, dextrosa o similares. Las composiciones también pueden liofilizarse. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ej., metilcelulosa), agentes amortiguadores del pH, aditivos gelificantes o mejoradores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada. En algunos aspectos, pueden consultarse textos estándar para preparar los preparados adecuados.
[0120] Pueden añadirse diversos aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluidos conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes retardadores de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
[0121] Las formulaciones que se utilizarán para la administración in vivo son generalmente estériles. La esterilidad puede lograrse fácilmente, por ej., por filtración a través de membranas de filtración estériles.
[0122] Para la prevención o el tratamiento de enfermedades, la dosificación adecuada puede depender del tipo de enfermedad a tratar, el tipo de agente o agentes, el tipo de células o receptores recombinantes, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el agente o las células se administran con fines preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del sujeto y la respuesta al agente o las células, y la discreción del médico tratante. En algunos casos, las composiciones se administran adecuadamente al sujeto de una sola vez o a lo largo de una serie de tratamientos.
[0123] En algunos casos, la terapia celular se administra como una única composición farmacéutica que comprende las células. En algunos casos, se administra una dosis determinada mediante una única administración en bolo de las células o el agente. En algunos casos, se administra mediante múltiples administraciones en bolo de las células o el agente, por ejemplo, durante un periodo no superior a 3 días, o mediante la administración en infusión continua de las células o el agente.
2. Posología Calendario y administración
[0124] En algunos casos, se administra una dosis de células a los sujetos de acuerdo con los métodos de terapia combinada divulgados. En algunos casos, el tamaño o el momento de las dosis se determina en función de la enfermedad o afección concreta del sujeto. A la vista de la descripción proporcionada, se puede determinar empíricamente el tamaño o el momento de las dosis para una enfermedad concreta.
[0125] En ciertos casos, las células, o poblaciones individuales de subtipos de células, se administran al sujeto en un intervalo de aproximadamente 0,1 millones a aproximadamente 100.000 millones de células y/o esa cantidad de células por kilogramo de peso corporal del sujeto, tal como,por ej.,0.1 millones a aproximadamente 50.000 millones de células(por ej.,aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1.000 millones de células, aproximadamente 5 .000 millones de células, aproximadamente 20.000 millones de células, aproximadamente 30.000 millones de células, aproximadamente 40.000 millones de células, o un intervalo definido por dos de los valores anteriores), 1 millón to aproximadamente 50.000 millones de células(por ej.,aproximadamente 5 millones de células, aproximadamente 25 millones de células, aproximadamente 500 millones de células, aproximadamente 1 .000 millones de células, aproximadamente 5 .000 millones de células, aproximadamente 20.000 millones de células, aproximadamente 30.000 millones de células, aproximadamente 40.000 millones de células, 0 un intervalo definido por dos de los valores anteriores), como aproximadamente 10 millones a aproximadamente 100.000 millones de células(por ej.,aproximadamente 20 millones de células, aproximadamente 30 millones de células, aproximadamente 40 millones de células, aproximadamente 60 millones de células, aproximadamente 70 millones de células, aproximadamente 80 millones de células, aproximadamente 90 millones de células, aproximadamente 10.000 millones de células, aproximadamente 25 .000 millones de células, aproximadamente 50.000 millones de células, aproximadamente 75 .000 millones de células, aproximadamente 90.000 millones de células, o un intervalo definido por dos de los valores anteriores), y en algunos casos entre aproximadamente 100 millones de células to aproximadamente 50.000 millones de células(por ej.,aproximadamente 120 millones de células, aproximadamente 250 millones de células, aproximadamente 350 millones de células, aproximadamente 450 millones de células, aproximadamente 650 millones de células, aproximadamente 800 millones de células, aproximadamente 900 millones de células, aproximadamente 3 .000 millones de células, aproximadamente 30.000 millones de células, aproximadamente 45 .000 millones de células) o cualquier valor entre estos intervalos y/o por kilogramo de peso corporal del sujeto. Las dosis pueden variar en función de los atributos propios de la enfermedad o trastorno y/o del paciente y/o de otros tratamientos. En algunos casos, dichos valores se refieren al número de células que expresan receptores recombinantes; en otros casos, se refieren al número de células T o PBMC o al total de células administradas.
[0126] En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células de o de aproximadamente 1 * 105 a 1 x 108 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, desde o desde aproximadamente 5 * 105 a 1 * 107 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales o desde o desde aproximadamente 1 * 106 a 1 * 107 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, cada una inclusive. En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis de células que comprende un número de células de al menos o aproximadamente al menos 1 * 105 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, tales como al menos o aproximadamente al menos 1 * 106, al menos o aproximadamente al menos 1 * 107, al menos o aproximadamente al menos 1 * 108 de tales células.
[0127] En algunos casos, por ejemplo, cuando el sujeto es un ser humano, la dosis incluye menos de aproximadamente 5 * 108 células totales que expresan receptores recombinantes (por ejemplo, CAR), células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC), por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 * 106 a 5 * 108 células de este tipo, como 2 * 106, 5 * 106, 1 * 107, 5 * 107, 1* 108 o 5 * 108 células totales de este tipo, o el intervalo entre dos de los valores anteriores.
[0128] En algunos casos, el número se refiere al número total de células CD3+ o CD8+, en algunos casos también células que expresan receptores recombinantes (por ejemplo, CAR+). En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células de o de aproximadamente 1 * 105 a 1 * 108 células T totales CD3+ o CD8+ o células CD3+ o CD8+ que expresan receptores recombinantes, de o de aproximadamente 5 * 105 a 1 * 107 células T totales CD3+ o CD8+ o células CD3+ o CD8+ que expresan receptores recombinantes, o de o de aproximadamente 1 * 106 a 1 * 107 células T totales CD3+ o CD8+ o células CD3+ o CD8+ que expresan receptores recombinantes, cada una inclusive. En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células de o de aproximadamente 1 * 105 a 1 * 108 células CD3+/CAR+ o CD8+/CAR+ totales, de o de aproximadamente 5 * 105 a 1 * 107 células CD3+/CAR+ o CD8+/CAR+ totales, o de o de aproximadamente 1 * 106 a 1 * 107 células CD3+/CAR+ o CD8+/CAR+ totales, cada una inclusive.
[0129] En algunos casos, la dosis de células modificadas genéticamente comprende desde o aproximadamente 1 * 105to 5 * 108 células T totales que expresan CAR, 1 * 105to 2,5 * 108 células T totales que expresan CAR, 1 * 105to 1 * 108 células T totales que expresan CAR, 1 * 105 to 5 * 107 células T totales que expresan CAR, 1 * 105 to 2,5 * 107 células T totales que expresan CAR, 1 * 105 to 1 * 107 células T totales que expresan CAR, 1 * 105 to 5 * 106 células T totales que expresan CAR, 1 * 105to 2,5 * 106 células T totales que expresan CAR, 1 * 105to 1 * 106 células T totales que expresan CAR, 1 * 106to 5 * 108 células T totales que expresan c A r , 1 * 106to 2,5 * 108 células T totales que expresan c A r , 1 * 106 to 1 * 108 células T totales que expresan CAR, 1 * 106 to 5 * 107 células T totales que expresan c Ar , 1 * 106to 2,5 * 107 células T totales que expresan C<a r>, 1 * 106to 1 * 107 células T totales que expresan C<a r>, 1 * 106to 5 * 106 células T totales que expresan CAR, 1 * 106to 2,5 * 106 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 106to 5 * 108 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 106to 2,5 * 108 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 106to 1 * 108 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 106to 5 * 107 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 106to 2,5 * 107 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 106to 1 * 107 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 106to 5 * 106 células T totales que expresan CAR, 5 * 106 to 5 * 108 células T totales que expresan CAR, 5 * 106 to 2,5 * 108 células T totales que expresan CAR, 5 * 106 to 1 * 108 células T totales que expresan CAR, 5 * 106 to 5 * 107 células T totales que expresan CAR, 5 * 106to 2,5 * 107 células T totales que expresan CAR, 5 * 106to 1 * 107 células T totales que expresan CAR, 1 * 107to 5 * 108 células T totales que expresan c A r , 1 * 107to 2,5 * 108 células T totales que expresan CAR, 1 * 107 to 1 * 108 células T totales que expresan CAR, 1 * 107 to 5 * 107 células T totales que expresan CAR, 1 * 107 to 2,5 * 107 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 107 to 5 * 108 células T totales que expresan C<a r>, 2,5 * 107 to 2,5 * 108 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 107 to 1 * 108 células T totales que expresan CAR, 2,5 * 107 to 5 * 107 células T totales que expresan CAR, 5 * 107 to 5 * 108 células T totales que expresan CAR, 5 * 107 to 2,5 * 108 células T totales que expresan CAR, 5 * 107 to 1 * 108 células T totales que expresan CAR, 1 * 108 to 5 * 108 células T totales que expresan c A r , 1 * 108to 2,5 * 108 células T totales que expresan CAR, or 2,5 * 108to 5 * 108 células T totales que expresan CAR.
[0130] En algunos casos, la dosis de células modificadas genéticamente comprende al menos o al menos aproximadamente 1 * 105 células que expresan CAR, al menos o al menos aproximadamente 2,5 * 105 células que expresan CAR, al menos o al menos aproximadamente 5 * 105 células que expresan CAR, al menos o al menos aproximadamente 1 * 106 células que expresan CAR, al menos o al menos aproximadamente 25 * 106 células con expresión de CAR, al menos o aproximadamente 5 * 106 células con expresión de CAR, al menos o aproximadamente 1 * 1o7 células con expresión de CAR, al menos o aproximadamente 2,5 * 107 células con expresión de CAR, al menos o aproximadamente 5 * 107 células con expresión de CAR, al menos o aproximadamente 1 * 1o8 células con expresión de CAR, al menos o aproximadamente 2,5 * 108 células con expresión de CAR, o al menos o aproximadamente 5 * 108 células con expresión de CAR.
[0131] En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células de o de aproximadamente 1 * 105 a 5 * 105 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, desde o desde aproximadamente 5 * 105 a 1 * 107 células totales expresantes de receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales o desde o desde aproximadamente 1 * 106 a 1 * 107 células totales expresantes de receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, cada una inclusive. En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis de células que comprende un número de células de al menos o aproximadamente 1 * 105 células totales que expresan receptores recombinantes, células T totales o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, tales como al menos o aproximadamente 1 * 106, al menos o aproximadamente 1 * 107, al menos o aproximadamente 1 * 108 de tales células. En algunos casos, el número se refiere al número total de células CD3+ o CD8+, en algunos casos también células que expresan receptores recombinantes (por ejemplo, CAR+). En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células de o de aproximadamente 1 * 105 a 5 * 108 células T totales CD3+ o CD8+ o células CD3+ o CD8+ que expresan receptores recombinantes, de o de aproximadamente 5 * 105 a 1 * 107 células T totales CD3+ o CD8+ o células CD3+ o CD8+ que expresan receptores recombinantes, o de o de aproximadamente 1 * 106 a 1 * 107 células T totales CD3+ o CD8+ o células CD3+ o CD8+ que expresan receptores recombinantes, cada una inclusive. En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células de 0 de aproximadamente 1 * 105 a 5 * 108 células CD3+/CAR+ o CD8+/CAR+ totales, de o de aproximadamente 5 * 105 a 1 * 107 células CD3+/CAR+ o CD8+/CAR+ totales, o de o de aproximadamente 1 * 106 a 1 * 107 células CD3+/CAR+ o CD8+/CAR+ totales, cada una inclusive.
[0132] En algunos casos, las células T de la dosis incluyen células T CD4+, células T CD8+ o células T CD4+ y CD8+.
[0133] En algunos casos, por ejemplo, cuando el sujeto es humano, las células T CD8+ de la dosis, incluyendo en una dosis que incluye células T CD4+ y CD8+, incluye entre aproximadamente 1 * 106 y 5 * 108 células totales de receptor recombinante (por ej. células CD8+ que expresan CAR, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 5 * 106 a 1 * 108 células, tales células 1 * 107, 2,5 * 107, 5 * 107, 7,5 * 107, 1 * 108 o 5 * 108 células totales, o el intervalo entre dos de los valores anteriores. En algunos casos, al paciente se le administran múltiples dosis, y cada una de las dosis o la dosis total puede estar dentro de cualquiera de los valores anteriores. En algunos casos, la dosis de células comprende la administración de 1 * 107 a 0,75 * 108 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes, de 1 * 107 a 2,5 * 107 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes, de 1 * 107 a 0,75 * 108 células T CD8+ que expresan receptores recombinantes, cada una inclusive. En algunos casos, la dosis de células comprende la administración de o aproximadamente 1 * 107, 2,5 * 107, 5 * 1077,5 * 107, 1 * 108 o 5 * 108 células T CD8+ totales que expresan receptores recombinantes.
[0134] En algunos casos, la dosis de células, por ejemplo, células T recombinantes que expresan receptores, se administra al sujeto como dosis única o se administra una sola vez en un periodo de dos semanas, un mes, tres meses, seis meses, 1 año o más.
[0135] En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células que es al menos o al menos es o es aproximadamente 0,1 * 106 células/kg de peso corporal del sujeto, 0,2 * 106 células/kg, 0,3 * 106 células/kg, 0,4 * 106 células/kg, 0,5 * 106 células/kg, 1 * 106 células/kg, 2,0 * 106 células/kg, 3 * 106 células/kg o 5 * 106 células/kg.
[0136] En algunos casos, la terapia celular comprende la administración de una dosis que comprende un número de células comprendido entre aproximadamente 0,1 * 106 células/kg de peso corporal del sujeto y 1,0 * 107 células/kg, entre o entre aproximadamente 0,5 * 106 células/kg y 5 * 106 células/kg, entre o entre aproximadamente 0,5 * 106 células/kg y 3 * 106 células/kg, entre o entre aproximadamente 0,5 * 106 células/kg y 2 * 106 células/kg, entre o entre aproximadamente 0,5 * 106 células/kg y 1 * 106 células/kg, entre o entre aproximadamente 1,0 * 106 células/kg de peso corporal del sujeto y 5 * 106 células/kg, entre o entre aproximadamente 1,0 * 106 células/kg y 3 * 106 células/kg, entre o entre aproximadamente 1,0 * 106 células/kg y 2 * 106 células/kg, entre o entre aproximadamente 2,0 * 106 células/kg de peso corporal del sujeto y 5 * 106 células/kg, entre o entre aproximadamente 2,0 * 106 células/kg y 3 * 106 células/kg, o entre o entre aproximadamente 3,0 * 106 células/kg de peso corporal del sujeto y 5 * 106 células/kg, ambos inclusive.
[0137] En algunos casos, la dosis de células comprende entre al menos aproximadamente 2 * 105 de las células/kg y al menos aproximadamente 2 * 106 de las células/kg, tal como entre al menos aproximadamente 4 * 105 de las células/kg y al menos aproximadamente 1 * 106 de las células/kg o entre al menos aproximadamente 6 * 105 de las células/kg y al menos aproximadamente 8 * 105 de las células/kg. En algunos casos, la dosis de células comprende no más de 2 *105 de las células(por ej.,expresantes de antígeno, como las células expresantes de CAR) por kilogramo de peso corporal del sujeto (células/kg), como no más de en o aproximadamente 3 * 105 células/kg, no más de en o aproximadamente 4 * 105 células/kg, no más de en o aproximadamente 5 * 105 células/kg, no más de 6 * 105 células/kg, no más de 7 * 105 células/kg, no más de 8 * 105 células/kg, no más de 9 * 105 células/kg, no más de 1 * 106 células/kg, o no más de 2 * 106 células/kg. En algunos casos, la dosis de células comprende al menos o al menos aproximadamente o en o aproximadamente 2 * 105 de las células(por ej.,expresantes de antígeno, como las células expresantes de CAR) por kilogramo de peso corporal del sujeto (células/kg), como al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 3 * 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 4 * 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 5 * 105 células/kg, al menos o al menos aproximadamente o aproximadamente 6 * 105 células/kg, al menos o al menos unas o unas 7 * 105 células/kg, al menos o al menos unas o unas o unas 8 * 105 células/kg, al menos o al menos unas o unas o unas 9 * 105 células/kg, al menos o al menos unas o unas o unas 1 * 106 células/kg, o al menos o al menos unas o unas o unas 2 * 106 células/kg.
[0138] En el contexto de la terapia celular adoptiva, la administración de una "dosis" dada de células abarca la administración de la cantidad o número dado de células como una composición única y/o administración única ininterrumpida,por ej.,como una inyección única o infusión continua, y también abarca la administración de la cantidad o número dado de células como una dosis dividida, proporcionada en múltiples composiciones o infusiones individuales, durante un período de tiempo especificado, que no es más de 3 días. Así, en algunos contextos, la dosis es una administración única o continua del número especificado de células, administrada o iniciada en un único momento. En algunos contextos, sin embargo, la dosis se administra en múltiples inyecciones o infusiones durante un periodo no superior a tres días, como una vez al día durante tres días o durante dos días o mediante múltiples infusiones durante un periodo de un solo día.
[0139] Así, en algunos aspectos, las células de la dosis se administran en una única composición farmacéutica. En algunos casos, las células de la dosis se administran en una pluralidad de composiciones, que contienen colectivamente las células de la dosis.
[0140] El término "dosis dividida" se refiere a una dosis que se divide para que se administre en más de un día. Este tipo de dosificación se incluye en los presentes métodos y se considera una dosis única. En algunos casos, las células de una dosis dividida se administran en una pluralidad de composiciones, que comprenden colectivamente las células de la dosis, durante un periodo no superior a tres días.
[0141] Así, la dosis de células puede administrarse como una dosis dividida. Por ejemplo, en algunos casos, la dosis puede administrarse al sujeto durante 2 días o durante 3 días. Los métodos ejemplares para la dosificación dividida incluyen la administración del 25% de la dosis el primer día y la administración del 75% restante de la dosis el segundo día. En otros casos, el 33% de la dosis puede administrarse el primer día y el 67% restante el segundo. En algunos aspectos, el 10% de la dosis se administra el primer día, el 30% de la dosis se administra el segundo día y el 60% de la dosis se administra el tercer día. En algunos casos, la dosis dividida no se reparte en más de 3 días.
[0142] En algunos casos, la dosis de células es generalmente lo suficientemente grande como para ser eficaz en la reducción de la carga de la enfermedad.
[0143] En algunos casos, las células se administran a una dosis deseada, que en algunos aspectos incluye una dosis o número deseado de células o tipo(s) celular(es) y/o una proporción deseada de tipos celulares. Así, la dosificación de células en algunos casos se basa en un número total de células (o número por kg de peso corporal) y una proporción deseada de las poblaciones individuales o subtipos, como la proporción de CD4+ a CD8+. En algunos casos, la dosis de células se basa en un número total deseado (o número por kg de peso corporal) de células en las poblaciones individuales o de tipos celulares individuales. En algunos casos, la dosificación se basa en una combinación de tales características, como el número deseado de células totales, la proporción deseada y el número total deseado de células en las poblaciones individuales.
[0144] En algunos casos, las poblaciones o subtipos de células, como las células T CD8+ y CD4+, se administran a una diferencia tolerada de una dosis deseada de células totales, como una dosis deseada de células T, o dentro de ella. En algunos aspectos, la dosis deseada es un número deseado de células o un número deseado de células por unidad de peso corporal del sujeto al que se administran las células, por ejemplo, células/kg. En algunos aspectos, la dosis deseada es igual o superior a un número mínimo de células o a un número mínimo de células por unidad de peso corporal. En algunos aspectos, entre las células totales, administradas a la dosis deseada, las poblaciones o subtipos individuales están presentes en o cerca de una proporción de salida deseada (como la proporción de CD4+ aCD8+),por ej.,dentro de una cierta diferencia o error tolerado de dicha proporción.
[0145] En algunos casos, las células se administran en o dentro de una diferencia tolerada de una dosis deseada de una o más de las poblaciones individuales o subtipos de células, como una dosis deseada de células CD4+ y/o una dosis deseada de células CD8+. En algunos aspectos, la dosis deseada es un número deseado de células del subtipo o población, o un número deseado de dichas células por unidad de peso corporal del sujeto al que se administran las células, por ejemplo, células/kg. En algunos aspectos, la dosis deseada es igual o superior a un número mínimo de células de la población o subtipo, o número mínimo de células de la población o subtipo por unidad de peso corporal.
[0146] Así, en algunos casos, la dosificación se basa en una dosis fija deseada de células totales y una proporción deseada, y/o se basa en una dosis fija deseada de uno o más,por ej.,cada uno, de los subtipos o subpoblaciones individuales. Así, en algunos casos, la dosificación se basa en una dosis fija o mínima deseada de células T y una proporción deseada de células CD4+ a CD8+, y/o se basa en una dosis fija o mínima deseada de células CD4+ y/o CD8+.
[0147] En algunos casos, las células se administran en o dentro de un intervalo tolerado de una proporción de salida deseada de múltiples poblaciones o subtipos celulares, tales como células o subtipos CD4+ y CD8+. En algunos aspectos, la proporción deseada puede ser una proporción específica o puede ser un intervalo de proporciones. por ejemplo, en algunos casos, la proporción deseada(por ej.,proporción de células CD4+ a CD8+) está comprendida entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 5:1 (o mayor que aproximadamente 1:5 y menor que aproximadamente 5:1), o entre aproximadamente 1:3 y aproximadamente 3:1 (o mayor que aproximadamente 13 y menos de aproximadamente 3:1), tales como entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 1:5 (o mayor que aproximadamente 1:5 y menor que aproximadamente 2:1, tales como aproximadamente 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, o 1:5. En algunos aspectos, la diferencia tolerada está dentro de aproximadamente el 1%, aproximadamente el 2%, aproximadamente el 3%, aproximadamente el 4%, aproximadamente el 5%, aproximadamente el 10%, aproximadamente el 15%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 25%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 35%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 45%, aproximadamente el 50% de la relación deseada, incluyendo cualquier valor entre estos intervalos.
[0148] En casos particulares, los números y/o concentraciones de células se refieren al número de células que expresan receptores recombinantes(por ej.,CAR). En otros casos, los números y/o concentraciones de células se refieren al número o concentración de todas las células, células T o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) administradas.
[0149] En algunos aspectos, el tamaño de la dosis se determina basándose en uno o más criterios tales como la respuesta del sujeto a un tratamiento previo,por ej.,quimioterapia, carga de la enfermedad en el sujeto, tal como carga tumoral, volumen, tamaño, o grado, extensión o tipo de metástasis, estadio, y/o probabilidad o incidencia de que el sujeto desarrolle resultados tóxicos,por ej.,SRC, síndrome de activación de macrófagos, síndrome de lisis tumoral, neurotoxicidad, y/o una respuesta inmunitaria del huésped contra las células y/o receptores recombinantes que se administran.
[0150] En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador en combinación con las células es capaz de aumentar significativamente la expansión o proliferación de las células, por lo que puede administrarse una dosis menor de células al sujeto. En algunos casos, los métodos divulgados permiten administrar una dosis menor de dichas células, para lograr la misma o mejor eficacia del tratamiento que la dosis en un método en el que la terapia celular se administra sin administrar el compuesto inmunomodulador, como al menos 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces o 10 veces menos que la dosis en un método en el que la terapia celular se administra sin administrar el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida.
[0151] En algunos casos, por ejemplo, la dosis contiene entre o aproximadamente 5,0 * 106 y 2,25 * 107, 5,0 * 106 y 2,0 x 107, 5,0 * 106 y 1,5 * 107, 5,0 * 106y 1,0 * 107, 5,0 * 106 y 7,5 * 106, 7,5 * 106y 2,25 * 107, 7,5 * 106 y 2,0 * 107, 7,5 * 106 y 1,5 * 107, 7,5 * 106 y 1,0 * 107, 1,0 * 107y 2,25 * 107, 1,0 * 107y 2,0 * 107, 1,0 * 107y 1,5 * 107, 1,5 * 107y 2,25 x 107, 1,5 x 107 y 2,0 * 107, 2,0 * 107 y 2,25 * 107. En algunos casos, la dosis de células contiene un número de células, que está entre al menos o aproximadamente 5 *106, 6 * 106, 7 * 106, 8 * 106, 9 * 106, 10 * 106y aproximadamente 15 * 106 células que expresan receptores recombinantes, tales como células que expresan receptores recombinantes que son CD8+. En algunos casos, dicha dosis, como dicho número objetivo de células se refiere al total de células que expresan receptores recombinantes en la composición administrada.
[0152] En algunos casos, por ejemplo, la dosis más baja contiene menos de aproximadamente 5 * 106 células, células que expresan receptores recombinantes (por ejemplo, CAR), células T y/o PBMC por kilogramo de peso corporal del sujeto, como menos de aproximadamente 4,5 * 106, 4 * 106, 3,5 * 106, 3 * 106, 2,5 * 106, 2 * 106, 1,5 * 106, 1 * 106, 5 * 105, 2,5 * 105 o 1 * 105 de dichas células por kilogramo de peso corporal del sujeto. En algunos casos, la dosis inferior contiene menos de aproximadamente 1 * 105, 2 * 105, 5 * 105 o 1 * 106 de dichas células por kilogramo de peso corporal del sujeto, o un valor comprendido entre dos de los valores anteriores. En algunos casos, dichos valores se refieren al número de células que expresan receptores recombinantes; en otros casos, se refieren al número de células T o PBMC o al total de células administradas.
[0153] En algunos casos, el sujeto recibe múltiples dosis, por ejemplo, dos o más dosis o múltiples dosis consecutivas, de las células. En algunos casos, se administran dos dosis a un sujeto. En algunos casos, el sujeto recibe la dosis consecutiva, por ejemplo, la segunda dosis, se administra aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 días después de la primera dosis. En algunos casos, se administran múltiples dosis consecutivas tras la primera dosis, de forma que se administra una dosis o dosis adicionales tras la administración de la dosis consecutiva. En algunos aspectos, el número de células administradas al sujeto en la dosis adicional es igual o similar al de la primera dosis y/o dosis consecutiva. En algunos casos, la dosis o dosis adicionales son mayores que las dosis anteriores. En algunos casos, pueden administrarse al sujeto una o más dosis posteriores de células. En algunos casos, la dosis posterior de células se administra más o menos 7 días, 14 días, 21 días, 28 días o 35 días después del inicio de la administración de la primera dosis de células. La dosis posterior de células puede ser superior, aproximadamente igual o inferior a la primera dosis. En algunos casos, la administración de la terapia de células T, como la administración de la primera y/o segunda dosis de células, puede repetirse.
[0154] En algunos casos, el inicio de la administración de la terapia celular, por ejemplo, la dosis de células o una primera dosis de una dosis dividida de células, se administra antes (antes de), concurrentemente con o después (posteriormente o subsecuentemente a) la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida.
[0155] En algunos casos, la dosis de células, o la dosis subsiguiente de células, se administra simultáneamente con el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador de acuerdo con los métodos de terapia combinada. En algunos casos, la dosis de células, o la dosis subsiguiente de células, se administra el mismo día que se inicia la administración del compuesto inmunomodulador de acuerdo con los métodos de terapia combinada. En algunos casos, la dosis de células, o la dosis subsiguiente de células, se administra en el plazo de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días tras iniciar la administración del compuesto inmunomodulador de acuerdo con los métodos de terapia combinada.
[0156] En algunos casos, la dosis de células, o la dosis subsiguiente de células, se administra antes de comenzar o iniciar la administración del compuesto inmunomodulador de acuerdo con la terapia combinada proporcionada. En algunos casos, la dosis de células se administra al menos o aproximadamente en 1 hora, al menos o aproximadamente en 2 horas, al menos o aproximadamente en 3 horas, al menos o aproximadamente en 6 horas, al menos o aproximadamente en 12 horas, al menos o aproximadamente en 1 día, al menos o aproximadamente en 2 días, al menos o aproximadamente en 3 días, al menos o aproximadamente en 4 días, al menos o aproximadamente en 5 días, al menos o aproximadamente en 6 días, al menos o aproximadamente en 7 días, al menos o aproximadamente al menos 12 días, al menos o aproximadamente al menos 14 días, al menos o aproximadamente al menos 15 días, al menos o aproximadamente al menos 21 días, al menos o aproximadamente al menos 28 días, al menos o aproximadamente al menos 30 días, al menos o aproximadamente al menos 35 días, al menos o aproximadamente al menos 42 días, al menos o aproximadamente al menos 60 días o al menos o aproximadamente al menos 90 días antes de administrar el compuesto inmunomodulador de acuerdo con la terapia combinada proporcionada.
[0157] En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador (por ejemplo, lenalidomida) compuesto inmunomodulador de acuerdo con la terapia combinada proporcionada es en un momento en el que la administración previa de la inmunoterapia(por ej.,terapia celular T, como la terapia celular CAR-T) está asociada con, o es probable que esté asociada con, una funcionalidad disminuida de las células T en comparación con la funcionalidad de las células T en un momento justo antes del inicio de la inmunoterapia(por ej.,terapia celular T, como la terapia celular CAR-T) o en un momento precedente después del inicio de la terapia celular T. En algunos casos, el método implica, después de administrar la dosis de células de la terapia celular T, porejemplo,terapia celular T adoptiva, pero antes de administrar el compuesto inmunomodulador, evaluar una muestra del sujeto para una o más funciones de las células T, como la expansión o persistencia de las células, por ejemplo, según lo determinado por el nivel o la cantidad en la sangre, u otros fenotipos o resultados deseados como se describe en el presente documento,por ej.,como los descritos en la Sección III. En la Sección III se describen diversos parámetros para determinar o evaluar el régimen de la terapia combinada.
B. ADMINISTRACIÓN DEL COMPUESTO INMUNOMODULADOR
[0158] Los métodos, composiciones, combinaciones, kits y usos de terapia combinada divulgados implican la administración de un compuesto inmunomodulador, como un análogo estructural o funcional o un derivado de talidomida y/o un inhibidor de E3 ubiquitina ligasa, por ejemplo lenalidomida, que puede administrarse antes de, posteriormente a, durante, simultáneamente o casi simultáneamente, secuencialmente y/o intermitentemente con la administración de la terapia de células T,por ej.,la administración de células T que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR).
[0159] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador pertenece a una clase de compuestos inmunomoduladores que es un análogo o derivado estructural o funcional de la talidomida y/o un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3.
[0160] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador se une al cereblon (CRBN). En algunos casos, el compuesto inmunomodulador se une al complejo ubiquitina-ligasa E3 CRBN. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador se une a CRBN y al complejo ubiquitina-ligasa E3 de CRBN. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador regula al alza la expresión proteica o génica de CRBN. En algunos aspectos, CRBN es el adaptador de sustrato para la ubiquitina ligasa E3 CRL4crbn, y modula la especificidad de la enzima. En algunos casos, la unión a CRB o al complejo de ubiquitina ligasa E3 CRBN inhibe la actividad de ubiquitina ligasa E3. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador induce la ubiquitinación de KZF1
[0161] (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos) y/o induce la degradación de IKZF 1 (Ikaros) e IKZF3 (Aiolos). En algunos casos, el compuesto inmunomodulador induce la ubiquitinación de la caseína quinasa 1A1 (CK1a) por la ubiquitina ligasa E3 CRL4crbn En algunos casos, la ubiquitinación de CK1a provoca la degradación de CK1a.
[0162] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un inhibidor del factor de transcripción Ikaros (IKZF1). En algunos casos, el compuesto inmunomodulador potencia la ubiquitinación de Ikaros. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador aumenta la degradación de Ikaros. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador regula a la baja la expresión proteica o génica de Ikaros. En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador provoca una disminución de los niveles de proteína Ikaros.
[0163] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un inhibidor del factor de transcripción Aiolos (IKZF3). En algunos casos, el compuesto inmunomodulador potencia la ubiquitinación de Aiolos. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador aumenta la degradación de Aiolos. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador regula a la baja la expresión proteica o génica de Aiolos. En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador provoca una disminución de los niveles de proteína Aiolos.
[0164] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un inhibidor de los factores de transcripción Ikaros (IKZF1) y Aiolos (IKZF3). En algunos casos, el compuesto inmunomodulador aumenta la ubiquitinación tanto de Ikaros como de Aiolos. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador aumenta la degradación tanto de Ikaros como de Aiolos. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador aumenta la ubiquitinación y degradación tanto de Ikaros como de Aiolos. En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador hace que disminuyan tanto los niveles de proteína Aiolos como los de proteína Ikaros.
[0165] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un fármaco inhibidor selectivo de citoquinas (SelCID). En algunos casos, el compuesto inmunomodulador inhibe la actividad de la fosfodiesterasa-4 (PDE4). En algunos casos, el compuesto inmunomodulador suprime la actividad enzimática de las fosfatasas CDC25. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador altera el tráfico intracelular de las fosfatasas CDC25.
[0166] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador en la terapia de combinación es talidomida (2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1H-isoindol-1,3(2H)-diona) o un análogo o derivado de la talidomida. En ciertos casos, un derivado de la talidomida incluye variantes estructurales de la talidomida que tienen una actividad biológica similar. Los derivados ejemplares de la talidomida incluyen, entre otros, la lenalidomida (REVLIMMUNOMODULATORY COMPOUND™; Celgene Corporation), la pomalidomida (también conocida como ACTIMMUNOMODULATORY COMPOUND™ o POMALYST™ (Celgene Corporation)), CC-1088, CDC-501 y CDC-801, y los compuestos divulgados en Patente de EE. UU. N.° 5.712.291 ; 7.320.991 ; y 8.716.315 ; y Pub. N° 2016/0313300 ; y Pub. PCT N.° WO 2002/068414 y WO 2008/154252.
[0167] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es 1-oxo- y 1,3 dioxo-2-(2,6-dioxopiperldin-3-il) isoindolinas sustituidas con amino en el anillo benzo como se describe en Patente de EE. UU. N.° 5,635,517.
[0168] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un compuesto de la siguiente fórmula:
donde uno de X e Y es -C(O)- y el otro de X e Y es -C(O)- o -CH2-, y R5 es hidrógeno o alquilo inferior, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, X es - C(O)- e Y es -CH2-. En algunos casos, tanto X como Y son -C(O)-. En algunos casos, R5 es hidrógeno. En otros casos, R5 es metilo.
[0169] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un compuesto que pertenece a una clase de compuestos 2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)ftalimmunomoduladores sustituidos y 2-(2,6-dioxopiperldin-3-il)-1-oxoisoindoles sustituidos, tales como los descritos en Patente de EE. UU. N.° 6.281.23o ; 6.316.471 ; 6.335.349 ; y 6.476.052, y la Solicitud Internacional de Patente n° PCT/US97/13375 (Publicación Internacional n° WO 98/03502).
[0170] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un compuesto de la siguiente fórmula:
donde
uno de X e Y es -C(O)- y el otro de X e Y es -C(O)- o -CH2-;
(1) cada uno de R1, R2, R3, y R4 son independientemente halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi o de 1 a 4 átomos de carbono, o
(2) uno de R1, R3, R4 , y R5 is -NHRa y el restante de R1, R2, R3, y R4 es hidrógeno, donde Ra es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono;
R5 es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, bencilo o halo;
siempre que R5 sea distinto de hidrógeno si X e Y son -C(O)- y (i) cada uno de R1, R2, R3, y R4 es fluoro; o (ii) uno de R1, R2, R3, y R4 es amino;
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0171] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un compuesto que pertenece a una clase de compuestos inmunomoduladores de isoindol divulgados en Patente de EE. UU. N.° 7.091.353; Publicación de Patente de EE.UU. n° 2003/0045552, y Solicitud Internacional n° PCT/USOI/50401 (Publicación Internacional n° WO02/059106). Por ejemplo, en algunos casos, el compuesto inmunomodulador es [2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1H-isoindol-4-ilmetil]-amida; éster terc-butílico del ácido (2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1H-isoindol-4-ilmetil)-carbámico; 4-(aminometil)-2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-isoindolina-1,3-diona; N-(2-(2,6-dioxo-piperidin-3-il)-1,3-dioxo-2,3-dihidro-1H-isoindol-4-ilmetil)-acetamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil)-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}ciclopropilcarboxamida; 2-cloro-N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}acetamida; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)-3-piridilcarboxamida; 3-{ 1-oxo-4-(bencilamino)isoindolin-2-il}piperidina-2,6-diona; 2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-4-(bencilamino)isoindolina-l,3-diona;N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}propanamida; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}-3-piridilcarboxamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}heptanamida; N-{(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)metil}-2-furilcarboxamida; fN-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)carbamoil}acetato de metilo; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)pentanamida; N-(2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il)-2-tienilcarboxamida; N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}(butilamino)carboxamida; N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}(octilamino)carboxamida; o N-{[2-(2,6-dioxo(3-piperidil))-1,3-dioxoisoindolin-4-il]metil}(bencilamino)carboxamida.
[0172] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un compuesto que pertenece a una clase de compuestos inmunomoduladores de isoindol divulgados en Publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. N°. 2002/0045643, Publicación Internacional n° WO 98/54170, y Patente de EE. UU. N.° 6,395,754. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un 2-(2,6-dioxopiperdin-3-yl)-1-oxoisoindolines tetra sustituido descrito en Patente de EE. UU. N.° 5,798,368. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es 1-oxo y 1,3-dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl) isoindolines divulgados en Patente de EE. UU. N.° 6,403,613. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es una 1-oxo o 1,3-dioxoisoindolina sustituida en la posición 4 o 5 del anillo de indolina, tal como se describe en Patente de EE. UU. N.° 6.380.239 y Patente de EE. UU. N.° 7,244,75.
[0173] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es el ácido 2-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-4-carbamoil-butírico o el ácido 4-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-4-carbamoil-butírico. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es el ácido 4-carbamoil-4-{4-[(furano-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-butírico, el ácido 4-carbamoil-2-{4-[(furano-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-13-dihidro-isoindol-2-il}-butírico, 2-{4-[(furano-2-ilmetil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il}-4-fenilcarbamoil-butírico o 2-{4-[(furano-2-il-metil)-amino]-1,3-dioxo-1,3-dihidroisoindol-2-il}-pentanodioico.
[0174] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es una isoindolina-1-ona o isoindolina-1,3-diona sustituida en la posición 2 con 2,6-dioxo-3-hidroxipiperidin-5-il como se describe en Patente de EE. UU. N.° 6,458,810. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona, o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetilbenciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
[0175] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es como se describe en Oshima, K. et al., Nihon Rinsho., 72(6):1130-5 (2014); Millrine, D. et al., Trends Mol Med., 23(4):348-364 (2017); y Collins, et al., Biochem J., 474(7):1127-1147 (2017).
[0176] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un inhibidor de la ubiquitina ligasa E3. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un derivado de la talidomida. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un análogo estructural y/o funcional de la talidomida. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es lenalidomida, pomalidomida, avadomida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0177] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es lenalidomida, pomalidomida, avadomida, un estereoisómero de lenalidomida, pomalidomida, avadomida o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es lenalidomida, un estereoisómero de lenalidomida o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0178] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es avadomida, que también se conoce como 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona con la siguiente estructura
o es un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo (en lo sucesivo, Compuesto 1).
[0179] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un solvato de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un hidrato de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2.6- diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es una sal farmacéuticamente aceptable de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un polimorfo de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador tiene la estructura de la Fórmula I.
[0180] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es lenalidomida, que también se conoce como 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona, o es un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, la lenalidomida es 2,6-piperidinediona, 3-(4-amino-1,3-dihidro-1-oxo-2H-isoindol-2-il)-, 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)-2,6-piperidinedione, 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihydro-2H-isoindol-2-yl)-2,6-piperidinedione, 3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidin-2,6-diona, 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona, 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona, todos los cuales pueden utilizarse indistintamente, o es un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.
[0181] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es (A)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2.6- diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es(S)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es una mezcla de(R)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona y(S)-3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona.
[0182] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es
(Fórmula II), o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es
o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En otros casos, el compuesto inmunomodulador es
o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En ciertos casos, el compuesto inmunomodulador comprende una mezcla de
o sales, solvatos, hidratos, cocristales, clatratos o polimorfos de los mismos farmacéuticamente aceptables.
[0183] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2.,6-diona, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un solvato de (R)-3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona y/o(S)-3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un hidrato de (RS)-3-(4-Amino-1-oxo-11,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona y/o(S)-3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es una sal farmacéuticamente aceptable de (R)-3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona y/o (S)-3-(4-Amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es lenalidomida, o 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador tiene la estructura de la Fórmula II. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador tiene la estructura de la Fórmula IIA o la Fórmula IIB o una mezcla de las mismas.
[0184] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es pomalidomida, que también se conoce como 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona, o es un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es
o un enantiómero o una mezcla de enantiómeros del mismo; o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es
o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En otros casos, el compuesto inmunomodulador es
(Fórmula IIIB), o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo. En ciertos casos, el compuesto inmunomodulador comprende una mezcla de
o sales, solvatos, hidratos, cocristales, clatratos o polimorfos de los mismos farmacéuticamente aceptables.
[0185] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un enantiómero o una mezcla de enantiómeros de 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable de 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es (R)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona y/o(S)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona, o una sal farmacéuticamente aceptable, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo de (R)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona y/o (S)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un solvato de (R)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona y/o (S)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es un hidrato de (R)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona y/o (S)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es una sal farmacéuticamente aceptable de (R) -4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona y/o (S)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es (R)-4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona, (S) -4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindolina-1,3-diona, o una mezcla de los mismos en cualquier proporción. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador tiene la estructura de la Fórmula III. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador tiene la estructura de Fórmula IIIA o Fórmula IIIB o una mezcla de las mismas.
[0186] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador es o comprende lenalidomida. La lenalidomida está aprobada por la FDA para el tratamiento del mieloma múltiple, el síndrome mielodisplásico asociado a la deleción 5q y, más recientemente, en el linfoma de células del manto (MCL) recidivante/refractario. La lenalidomida es un derivado sintético de la talidomida, y actualmente se entiende que tiene múltiples efectos inmunomoduladores, incluido el refuerzo de la formación de sinapsis inmunitarias entre las células T y las células presentadoras de antígenos (APC). Por ejemplo, en algunos casos, la lenalidomida modula las respuestas de las células T y da lugar a un aumento de la producción de interleucina (IL)-2 en las células T CD4+ y CD8+, induce el desplazamiento de las respuestas T auxiliares (Th) de Th2 a Th1, inhibe la expansión del subconjunto de células T reguladoras (Tregs) y mejora el funcionamiento de las sinapsis inmunológicas en el linfoma folicular (FL) y la leucemia linfocítica crónica (<l>L<c>) (Otahal et al., Oncoinmunología (2016) 5(4):e1115940). La lenalidomida también tiene actividad tumoricida directa en pacientes con mieloma múltiple (MM) y modula directa e indirectamente la supervivencia de las células tumorales de CLL al afectar a las células de apoyo, como las células tipo enfermera que se encuentran en el microentorno de los tejidos linfoides.
1. Composiciones y formulaciones
[0187] En algunos casos de los métodos, composiciones, combinaciones, kits y usos de la terapia de combinación aquí divulgados, la terapia de combinación puede administrarse en una o más composiciones, por ejemplo, una composición farmacéutica que contiene un compuesto inmunomodulador, por ejemplo, lenalidomida.
[0188] En algunos casos, la composición,por ej.,una composición farmacéutica que contiene el compuesto inmunomodulador, porejemplo,lenalidomida, puede incluir portadores tales como un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el que se administra el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, y/o las células. En "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E. W., se describen ejemplos de soportes farmacéuticos adecuados. Martin. Dichas composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto inmunomodulador, porejemplolenalidomida, generalmente en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma de administración adecuada al paciente. Dichos portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluidos los de origen petrolífero, animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral y aceite de sésamo. Las soluciones salinas y las soluciones acuosas de dextrosa y glicerol también pueden emplearse como soportes líquidos, especialmente para soluciones inyectables. Las composiciones farmacéuticas pueden contener uno o varios diluyentes, adyuvantes, antiadherentes, aglutinantes, recubrimientos, cargas, aromas, colorantes, lubricantes, glidificante(s), conservante(s), detergente(s), sorbente(s), agente(s) emulsionante(s), excipiente(s) farmacéutico(s), agente(s) amortiguador(es) del pH, o edulcorante(s) y una combinación de los mismos. En algunos casos, la composición farmacéutica puede ser líquida, sólida, un polvo liofilizado, en forma de gel, y/o una combinación de los mismos. En algunos aspectos, la elección del portador viene determinada en parte por el inhibidor concreto y/o por el método de administración.
[0189] Los portadores farmacéuticamente aceptables son generalmente no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen, pero no se limitan a: tampones como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como ácido ascórbico y metionina; conservantes (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos como metil o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 0189-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 3 residuos); proteínas, como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, como polivinilpirrolidona; aminoácidos, como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, como glucosa, manosa o dextranos; agentes quelantes, como EDTA; azúcares, como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal, como sodio; complejos metálicos(por ej.,complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos como el polietilenglicol (PEG), estabilizantes y/o conservantes. Las composiciones que contienen el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, también pueden liofilizarse.
[0190] En algunos casos, las composiciones farmacéuticas pueden formularse para su administración por cualquier vía conocida, incluida la intramuscular, intravenosa, intradérmica, intralesional, inyección intraperitoneal, subcutánea, intratumoral, epidural, nasal, oral, vaginal, rectal, tópica, local, ótica, inhalatoria, bucal(por ej.sublingual) y transdérmica o cualquier vía. En algunos casos, también se contemplan otros modos de administración. En algunos casos, la administración se realiza mediante infusión en bolo, mediante inyección,por ej.,inyecciones intravenosas o subcutáneas, inyección intraocular, inyección periocular, inyección subretiniana, inyección intravítrea, inyección transeptal, inyección subescleral, inyección intracoroidea, inyección intracameral, inyección subconjuntival, inyección subconjuntival, inyección sub-Tenon, inyección retrobulbar, inyección peribulbar o administración yuxtaescleral posterior. En algunos casos, la administración es parenteral, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento local, intralesional. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. En algunos casos, una dosis determinada se administra mediante un único bolo. En algunos casos, se administra mediante múltiples administraciones en bolo, por ejemplo, durante un periodo no superior a 3 días, o mediante administración en infusión continua.
[0191] En algunos casos, la administración puede ser local, tópica o sistémica dependiendo del lugar de tratamiento. En algunos casos, la administración local a una zona que necesita tratamiento puede lograrse, por ejemplo, mediante infusión local durante una intervención quirúrgica, aplicación tópica,por ej.,junto con un apósito para heridas después de una intervención quirúrgica, mediante inyección, mediante un catéter, mediante un supositorio o mediante un implante. En algunos casos, las composiciones también pueden administrarse con otros agentes biológicamente activos, ya sea de forma secuencial, intermitente o en la misma composición. En algunos casos, la administración también puede incluir sistemas de liberación controlada, incluyendo formulaciones de liberación controlada y liberación controlada por dispositivo, como por medio de una bomba. En algunos casos, la administración es oral.
[0192] En algunos casos, los compuestos farmacéutica y terapéuticamente activos y sus derivados se formulan y administran típicamente en formas de dosificación unitarias o múltiples. Cada dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de compuesto terapéuticamente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con el soporte farmacéutico, vehículo o diluyente requerido. En algunos casos, las formas de dosificación unitarias incluyen, entre otras, comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, soluciones o suspensiones parenterales estériles y soluciones o suspensiones orales, así como emulsiones de agua y aceite que contengan cantidades adecuadas de los compuestos o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos. Las formas de dosis unitarias pueden ser ampollas y jeringas o comprimidos o cápsulas envasados individualmente. Las formas de dosis unitarias pueden administrarse en fracciones o múltiplos de las mismas. En algunos casos, una forma de dosificación múltiple es una pluralidad de formas de dosificación unitarias idénticas envasadas en un único recipiente para ser administradas en forma de dosis unitarias segregadas. Ejemplos de formas de dosis múltiples son los viales, los frascos de comprimidos o cápsulas o los frascos de pintas o galones.
[0193] Los principios activos pueden quedar atrapados en microcápsulas, en sistemas coloidales de administración de fármacos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. En ciertos casos, la composición farmacéutica que contiene el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se formula como un complejo de inclusión, como un complejo de inclusión de ciclodextrina, o como un liposoma. Los liposomas pueden servir para dirigir las células huésped (por ejemplo, células T o células NK) a un tejido concreto. Existen muchos métodos para preparar liposomas, como los descritos, por ejemplo, en Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9: 467; y Patentes de EE.UU. 4.235.871,4.501.728, 4.837.028 y 5.019.369.
[0194] La composición farmacéutica que contiene el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, en algunos aspectos puede emplear sistemas de administración de liberación prolongada, liberación retardada y liberación sostenida, de manera que la administración de la composición se produzca antes de, y con tiempo suficiente para causar, la sensibilización del sitio a tratar. Existen y se conocen muchos tipos de sistemas de liberación. Tales sistemas pueden evitar la administración repetida de la composición, aumentando así la comodidad para el sujeto y el médico.
[0195] Las composiciones que contienen el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, también pueden liofilizarse. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes, dispersantes o emulsionantes (por ej., metilcelulosa), agentes amortiguadores del pH, aditivos gelificantes o mejoradores de la viscosidad, conservantes, agentes aromatizantes, colorantes y similares, dependiendo de la vía de administración y de la preparación deseada. En algunos aspectos, pueden consultarse textos estándar para preparar los preparados adecuados.
[0196] Pueden añadirse diversos aditivos que mejoran la estabilidad y esterilidad de las composiciones, incluidos conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos puede garantizarse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede conseguirse mediante el uso de agentes retardadores de la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
[0197] Pueden prepararse preparados de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, cuyas matrices se presentan en forma de artículos moldeados,por ej.,películas, o microcápsulas.
[0198] En algunos casos, la composición que contiene el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra en forma de sal, por ej. una sal farmacéuticamente aceptable. Las sales de adición de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen las derivadas de ácidos minerales, como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, fosfórico, metafosfórico, nítrico y sulfúrico, y ácidos orgánicos, como los ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzoico, glicólico, glucónico, succínico y arilsulfónico, por ejemplo, el ácido p-toluenosulfónico.
2. Posología del Compuesto inmunomodulador
[0199] En algunos casos, el método de terapia combinada proporcionado implica administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco inmunomodulador (compuesto inmunomodulador),por ej.lenalidomida, y la terapia celular, tal como una terapia de células T(por ej.células T que expresan CAR).
[0200] En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se inicia antes de, después de, durante, en el transcurso de, simultáneamente, casi simultáneamente, secuencialmente y/o intermitentemente con la administración de la terapia celular, tal como una terapia de células T(por ej.,lenalidomida). células T que expresan CAR). En algunos casos, el método implica iniciar la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, antes de la administración de la terapia de células T. En otros casos, el método implica iniciar la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, después de la administración de la terapia de células T. En algunos casos, el esquema de dosificación comprende iniciar la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, de forma concurrente o simultánea con la administración de la terapia de células T.
[0201] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra en un ciclo. En algunos casos, el ciclo comprende un periodo de administración en el que se administra el compuesto inmunomodulador, por ejemplo , lenalidomida, seguido de un periodo de descanso durante el cual no se administra el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida. En algunos casos, el número total de días del ciclo, porejemplo,desde el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador, es superior o mayor que aproximadamente 21 días, 28 días, 30 días, 40 días, 50 días, 60 días o más.
[0202] En algunos casos, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se lleva a cabo en al menos un ciclo y el inicio de la administración de la terapia de células T se llevan a cabo el mismo día, opcionalmente de forma concurrente. En algunos casos, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, en al menos un ciclo es anterior al inicio de la administración de la terapia de células T. En algunos casos, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, en al menos un ciclo es concurrente con o en el mismo día que el inicio de la administración de la terapia de células T. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador, por ej, lenalidomida, se administra de o desde aproximadamente 0 a 30 días, como de 0 a 15 días, de 0 a 6 días, de 0 a 96 horas, de 0 a 24 horas, de 0 a 12 horas, de 0 a 6 horas, o de 0 a 2 horas, de 2 horas a 15 días, de 2 horas a 6 días, de 2 horas a 96 horas, de 2 horas a 24 horas, de 2 horas a 12 horas, de 2 horas a 6 horas, de 6 horas a 30 días, de 6 horas a 15 días, de 6 horas a 6 días, de 6 horas a 96 horas, de 6 horas a 24 horas, 6 horas a 12 horas, 12 horas a 30 días, 12 horas a 15 días, 12 horas a 6 días, 12 horas a 96 horas, 12 horas a 24 horas, 24 horas a 30 días, 24 horas a 15 días, 24 horas a 6 días, 24 horas a 96 horas, 96 horas a 30 días, 96 horas a 15 días, 96 horas a 6 días, 6 días a 30 días, 6 días a 15 días o 15 días a 30 días antes del inicio de la terapia con células T. En algunos aspectos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra no más de unas 96 horas, 72 horas, 48 horas, 24 horas, 12 horas, 6 horas, 2 horas o 1 hora antes del inicio de la terapia de células T.
[0203] En algunos de estos casos en los que el compuesto inmunomodulador, por ejemplo , lenalidomida, se administra antes de la terapia celular(por ej.,lenalidomida), el compuesto inmunomodulador, por ejemplo , lenalidomida, se administra antes de la terapia celular(por ej.,lenalidomida). T, como la terapia celular CAR-T), la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, continúa a intervalos regulares hasta el inicio de la terapia celular y/o durante un tiempo después del inicio de la terapia celular.
[0204] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador, por ejemplo , lenalidomida, se administra, o se administra además, después de la administración de la terapia celular (porej.,lenalidomida). terapia celular T, como la terapia celular CAR-T). En algunos casos, el compuesto inmunomodulador, por ej ., lenalidomida, se administra en el plazo de 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 96 horas, 4 días, 5 días, 6 días o 7 días, 14 días, 15 días, 21 días, 24 días, 28 días, 30 días, 36 días, 42 días, 60 días, 72 días o 90 días después del inicio de la administración de la terapia celular(por ej.,lenalidomida). terapia de células T). En algunos casos, los métodos divulgados implican la administración continuada, como a intervalos regulares, del compuesto inmunomodulador tras el inicio de la administración de la terapia celular.
[0205] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra hasta o hasta aproximadamente 1 día, hasta o hasta aproximadamente 2 días, hasta o hasta aproximadamente 3 días, hasta o hasta aproximadamente 4 días, hasta o hasta aproximadamente 5 días, hasta o hasta aproximadamente 6 días, hasta o hasta aproximadamente 7 días, hasta o hasta aproximadamente 12 días, hasta o hasta aproximadamente 14 días, hasta o hasta aproximadamente 21 días, hasta o hasta aproximadamente 24 días, hasta o hasta aproximadamente 28 días, hasta aproximadamente 30 días, hasta aproximadamente 35 días, hasta aproximadamente 42 días, hasta aproximadamente 60 días, hasta aproximadamente 90 días, hasta aproximadamente 120 días, hasta aproximadamente 180 días, hasta aproximadamente 240 días, hasta aproximadamente 360 días o hasta aproximadamente 720 días o más después del inicio de la administración de la terapia celular(por ej.terapia celular T, como la terapia celular CAR-T).
[0206] En algunos de los casos anteriores, el compuesto inmunomodulador, por ejemplo , lenalidomida, se administra antes y después del inicio de la administración de la terapia celular(porej.,lenalidomida). terapia celular T, como la terapia celular C<a>R-T).
[0207] En algunos casos, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador, porej,lenalidomida, se lleva a cabo en o después de, opcionalmente inmediatamente después o en el plazo de 1 a 3 días después de: (i) el nivel máximo o pico de las células de la terapia celular T es detectable en la sangre del sujeto; (ii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre, después de haber sido detectables en la sangre, no es detectable o se reduce, opcionalmente reducido en comparación con un punto de tiempo precedente después de la administración de la terapia celular T; (iii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre se reduce en o más de 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más el pico o número máximo de células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto tras el inicio de la administración de la terapia celular T; (iv) en un momento posterior al pico o nivel máximo de células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto, el número de células de o derivadas de las células T detectables en la sangre del sujeto es inferior a menos del 10%, menos del 5%, menos del 1% o menos del 0,5% del total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la sangre del sujeto; (v) el sujeto presenta progresión de la enfermedad y/o ha recaído tras la remisión después del tratamiento con la terapia de células T; y/o (iv) el sujeto presenta aumento de la carga tumoral en comparación con la carga tumoral en un momento anterior o posterior a la administración de las células T y anterior al inicio de la administración del compuesto inmunomodulador.
[0208] En algunos casos, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, en al menos un ciclo es posterior al inicio de la administración de la terapia de células T. En algunos casos, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, es de al menos o aproximadamente al menos 1 día, al menos o aproximadamente al menos 2 días, al menos o aproximadamente al menos 3 días, al menos o aproximadamente al menos 4 días, al menos o aproximadamente al menos 5 días, al menos o aproximadamente al menos 6 días, al menos o aproximadamente al menos 7 días, al menos o aproximadamente al menos 8 días, al menos o aproximadamente al menos 9 días, al menos o aproximadamente al menos 10 días, al menos o aproximadamente 12 días, al menos o aproximadamente al menos 14 días, al menos o aproximadamente al menos 15 días, al menos o aproximadamente al menos 21 días, al menos o aproximadamente al menos 24 días, al menos o aproximadamente al menos 28 días, al menos o aproximadamente al menos 30 días, al menos o aproximadamente al menos 35 días o al menos o aproximadamente al menos 42 días, al menos o aproximadamente al menos 60 días, o al menos o aproximadamente al menos 90 días tras el inicio de la administración de la terapia celular T. En algunos casos, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se lleva a cabo al menos 2 días después, al menos 1 semana después, al menos 2 semanas después, al menos 3 semanas después o al menos 4 semanas después del inicio de la administración de la terapia de células T. En algunos casos, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se lleva a cabo de 2 a 28 días o de 7 a 21 días después del inicio de la administración de la terapia de células T. En algunos casos, el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se lleva a cabo en un momento que es mayor o superior a unos 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19, días, 20 días, 21 días, 24 días o 28 días después del inicio de la administración de la terapia de células T. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra varias veces al día, dos veces al día, diariamente, en días alternos, tres veces a la semana, dos veces a la semana o una vez a la semana tras el inicio de la terapia celular. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra diariamente. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra dos veces al día. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra tres veces al día. En otros casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra en días alternos. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra diariamente. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra durante el periodo de administración durante una pluralidad de días consecutivos, como por ejemplo hasta aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o más de 30 días consecutivos. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra durante más de o más de unos 7 días consecutivos, más de o más de unos 14 días consecutivos, más de o más de unos 21 días consecutivos, más de o más de unos 21 días consecutivos, o más de o más de unos 28 días consecutivos. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra durante el periodo de administración hasta 21 días consecutivos. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra durante el periodo de administración hasta 21 días consecutivos, en los que el ciclo comprende más de 30 días a partir del inicio de la administración del compuesto inmunomodulador.
[0209] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra durante el período de administración durante no más de aproximadamente 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, o no más de 30 días consecutivos. En ciertos casos, la lenalidomida se administra una vez al día durante 14 días en un ciclo de tratamiento de 21 días. En ciertos casos, la lenalidomida se administra una vez al día durante 21 días en un ciclo de tratamiento de 28 días. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra durante el periodo de administración durante no más de 14 días consecutivos.
[0210] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra en un ciclo, en el que el ciclo comprende la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, durante una pluralidad de días consecutivos, seguido de un período de descanso durante el cual no se administra el compuesto inmunomodulador. En algunos casos, el período de descanso es superior a aproximadamente 1 día, superior a aproximadamente 3 días consecutivos, superior a aproximadamente 5 días consecutivos, superior a aproximadamente 7 días consecutivos, superior a aproximadamente 8 días consecutivos, superior a aproximadamente 9 días consecutivos, superior a aproximadamente 10 días consecutivos, superior a aproximadamente 11 días consecutivos, superior a aproximadamente 12 días consecutivos, superior a unos 13 días consecutivos, superior a unos 14 días consecutivos, superior a unos 15 días consecutivos, superior a unos 16 días consecutivos, superior a unos 17 días consecutivos, superior a unos 18 días consecutivos, superior a unos 19 días consecutivos, superior a unos 20 días consecutivos, o superior a unos 21 o más días consecutivos. En algunos casos, el período de descanso es superior a 7 días consecutivos, superior a 14 días consecutivos, superior a 21 días o superior a 28 días. En algunos casos, el período de descanso es superior a unos 14 días consecutivos. En algunos casos, el ciclo de administración del compuesto inmunomodulador no contiene un periodo de descanso.
[0211] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra en un ciclo, en el que el ciclo se repite al menos una vez. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra durante al menos 2 ciclos, al menos 3 ciclos, al menos 4 ciclos, al menos 5 ciclos, al menos 6 ciclos, al menos 7 ciclos, al menos 8 ciclos, al menos 9 ciclos, al menos 10 ciclos, al menos 11 ciclos o al menos 12 ciclos. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23 o 24 ciclos.
[0212] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra seis veces al día, cinco veces al día, cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, dos veces a la semana, una vez a la semana o sólo una vez antes o después del inicio de la administración de la terapia con células T. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra en dosis múltiples en intervalos regulares antes, durante, en el transcurso y/o después del periodo de administración de la terapia de células T. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra en una o más dosis en intervalos regulares antes de la administración de la terapia de células T. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra en una o más dosis a intervalos regulares tras la administración de la terapia de células T. En algunos casos, una o más de las dosis del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, pueden producirse simultáneamente con la administración de una dosis de la terapia de células T.
[0213] En algunos casos, la dosis, frecuencia, duración, momento y/u orden de administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se determina, basándose en umbrales o criterios particulares de los resultados del paso de cribado y/o evaluación de los resultados del tratamiento descritos en el presente documento, por ej. los descritos en la Sección III del presente documento.
[0214] En algunos casos, el método implica administrar la terapia celular a un sujeto al que se le ha administrado previamente una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto inmunomodulador. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador se administra a un sujeto antes de administrarle una dosis de células que expresan un receptor recombinante. En algunos casos, el tratamiento con el compuesto inmunomodulador se produce al mismo tiempo que la administración de la dosis de células. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador se administra tras la administración de la dosis de células.
[0215] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra diariamente durante 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más de 21 días. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra dos veces al día durante 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más de 21 días. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.lenalidomida, se administra tres veces al día durante 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más de 21 días. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra en días alternos durante 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o más de 21 días.
[0216] En algunos casos de los métodos aquí divulgados, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, y la terapia de células T se administran simultáneamente o casi simultáneamente.
[0217] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador, por ejemplo lenalidomida, se administra a una dosis de o desde aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 100 mg, de o desde aproximadamente 0,1 mg a 50 mg, de o desde aproximadamente 0,1 mg a 25 mg, de o desde aproximadamente 0,1 mg a 10 mg, de o desde aproximadamente 0,1 mg a 5 mg, de o desde aproximadamente 0.1 mg a 1 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 100 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 50 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 25 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 10 mg, desde o aproximadamente 1 mg a 5 mg, desde o aproximadamente 5 mg a 100 mg, desde o aproximadamente 5 mg a 50 mg, desde o aproximadamente 5 mg a 25 mg, de o aproximadamente 5 mg a 10 mg, de o aproximadamente 10 mg a 100 mg, de o aproximadamente 10 mg a 50 mg, de o aproximadamente 10 mg a 25 mg, de o aproximadamente 25 mg a 100 mg, de o aproximadamente 25 mg a 50 mg o de o aproximadamente 50 mg a 100 mg, cada uno inclusive. En algunos casos, la cantidad es una cantidad diaria del compuesto inmunomodulador, por ejemplo lenalidomida.
[0218] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador, por ejemplo lenalidomida, se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 20 mg, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 10 mg, de aproximadamente 2,5 mg a aproximadamente 7,5 mg, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 15 mg, como aproximadamente 5 mg, 10 mg, 15 mg o 20 mg. En algunos casos, la lenalidomida se administra a una dosis de aproximadamente 10 pg/kg a 5 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 200 pg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 400 pg/kg a aproximadamente 600 pg/kg, como aproximadamente 500 pg/kg. En algunos casos, la cantidad es una cantidad diaria del compuesto inmunomodulador, por ejemplo lenalidomida.
[0219] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador, por ejemplo, lenalidomida, se administra en una cantidad de dosificación diaria total de al menos o aproximadamente 0,1 mg al día, 0,5 mg al día, 1,0 mg al día, 2,5 mg al día, 5 mg al día, 10 mg al día, 25 mg al día, 50 mg al día o 100 mg al día. En algunos casos, la dosis de lenalidomida es o es de aproximadamente 25 mg al día. En casos particulares, la dosis de lenalidomida es o es de unos 10 mg al día.
[0220] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador, por ejemplo lenalidomida, se administra en una cantidad mayor o superior a aproximadamente 1 mg, 2,5 mg, 5 mg, 7,5 mg, 10 mg, 15 mg y menos de 25 mg. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador, por ejemplo lenalidomida, se administra en una cantidad mayor o superior a aproximadamente 1 mg al día, 2,5 mg al día, 5 mg al día, 7,5 mg al día, 10 mg al día, 15 mg al día y menos de 25 mg al día.
[0221] En cualquiera de los casos mencionados, el compuesto inmunomodulador, por ejemplo lenalidomida, puede administrarse por vía oral. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador, por ejemplo lenalidomida, se administra en forma de comprimido o cápsula.
[0222] En algunos casos, las dosis, como las dosis diarias, se administran en una o más dosis divididas, como 2, 3 o 4 dosis, o en una única formulación. El compuesto inmunomodulador, porejemplola lenalidomida, puede administrarse solo, en presencia de un portador farmacéuticamente aceptable o en presencia de otros agentes terapéuticos.
[0223] Se entiende que podrían utilizarse dosis mayores o menores del compuesto inmunomodulador, por ejemplo, en función del agente concreto y de la vía de administración. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador puede administrarse solo o en forma de una composición farmacéutica en la que el compuesto está mezclado con uno o más portadores, excipientes o diluyentes farmacéuticamente aceptables. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador puede administrarse por vía sistémica o local en el órgano o tejido a tratar. Las vías de administración ejemplares incluyen, entre otras, las vías tópica, inyectable (como subcutánea, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intratumoral e intravenosa), oral, sublingual, rectal, transdérmica, intranasal, vaginal e inhalatoria. En algunos casos, la vía de administración es oral, parenteral, rectal, nasal, tópica u ocular, o por inhalación. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador se administra por vía oral. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador se administra por vía oral en formas de dosificación sólidas, como cápsulas, comprimidos y polvos, o en formas de dosificación líquidas, como elixires, jarabes y suspensiones.
[0224] Una vez que se ha producido la mejoría de la enfermedad del paciente, la dosis puede ajustarse para el tratamiento preventivo o de mantenimiento. Por ejemplo, la dosis o la frecuencia de administración, o ambas, pueden reducirse en función de los síntomas, hasta un nivel en el que se mantenga el efecto terapéutico o profiláctico deseado. Si los síntomas se han aliviado hasta un nivel adecuado, se puede interrumpir el tratamiento. No obstante, los pacientes pueden necesitar tratamiento intermitente a largo plazo en caso de reaparición de los síntomas. Los pacientes también pueden requerir tratamiento crónico a largo plazo.
C. TRATAMIENTO LINFODEPLETOR
[0225] En algunos aspectos, los métodos divulgados pueden incluir además la administración de una o más terapias linfodepletoras, como antes o simultáneamente con el inicio de la administración de la terapia de células T. En algunos casos, la terapia de linfodepleción comprende la administración de una fosfamida, como la ciclofosfamida. En algunos casos, la terapia de linfodepleción puede incluir la administración de fludarabina.
[0226] En algunos aspectos, el preacondicionamiento de sujetos con terapias inmunodepletoras (por ejemplo, linfodepletoras) puede mejorar los efectos de la terapia celular adoptiva (ACT). El preacondicionamiento con agentes linfodepletores, incluidas las combinaciones de ciclosporina y fludarabina, ha sido eficaz para mejorar la eficacia de las células de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) transferidas en terapia celular, incluso para mejorar la respuesta y/o la persistencia de las células transferidas.Véase,por ejemplo, Dudley et al., Science, 298, 850-54 (2002); Rosenberg et al., Clin Cancer Res, 17(13):4550-4557 (2011). Del mismo modo, en el contexto de las células T CAR+, varios estudios han incorporado agentes linfodepletores, más comúnmente ciclofosfamida, fludarabina, bendamustina o combinaciones de los mismos, a veces acompañados de dosis bajas de irradiación.VéaseHan et al. Journal of Hematology & Oncology, 6:47 (2013); Kochenderfer et al., Blood, 119: 2709-2720 (2012); Kalos et al., Sci Transl Med, 3(95):95ra73 (2011); N.° de registro de estudios de ensayos clínicos: NCT02315612;<n>C<t>01822652.
[0227] Tal preacondicionamiento puede llevarse a cabo con el objetivo de reducir el riesgo de uno o más de varios resultados que podrían disminuir la eficacia de la terapia. Estos incluyen el fenómeno conocido como "disipador de citocinas", por el cual las células T, las células B y las células NK compiten con los TIL por las citocinas homeostáticas y activadoras, como la IL-2, la IL-7 y/o la IL-15; la supresión de los TIL por células T reguladoras, células NK u otras células del sistema inmunitario; el impacto de los reguladores negativos en el microambiente tumoral. Muranski et al., Nat Clin Pract Oncol. Diciembre; 3(12): 668-681 (2006).
[0228] Así, en algunos casos, el método divulgado comprende además la administración de una terapia de linfodepleción al sujeto. En algunos casos, el método incluye la administración de la terapia linfodepletora al sujeto antes de la administración de la dosis de células. En algunos casos, la terapia de linfodepleción contiene un agente quimioterapéutico como fludarabina y/o ciclofosfamida. En algunos casos, la administración de las células y/o la terapia linfodepletora se lleva a cabo de forma ambulatoria.
[0229] En algunos casos, los métodos incluyen la administración de un agente preacondicionador, como un agente linfodepletor o quimioterapéutico, como ciclofosfamida, fludarabina o combinaciones de los mismos, a un sujeto antes de la administración de la dosis de células. Por ejemplo, al sujeto se le puede administrar un agente preacondicionador al menos 2 días antes, como al menos 3, 4, 5, 6 o 7 días antes, de la primera dosis o de la siguiente. En algunos casos, al sujeto se le administra un agente preacondicionador no más de 7 días antes, por ejemplo no más de 6, 5, 4, 3 o 2 días antes, de la administración de la dosis de células.
[0230] En algunos casos, el sujeto es preacondicionado con ciclofosfamida a una dosis entre o aproximadamente 20 mg/kg y 100 mg/kg, tal como entre o aproximadamente 40 mg/kg y 80 mg/kg. En algunos aspectos, el sujeto es preacondicionado con o con aproximadamente 60 mg/kg de ciclofosfamida. En algunos casos, la fludarabina puede administrarse en una dosis única o en varias dosis, por ejemplo, diariamente, cada dos días o cada tres días. En algunos casos, la ciclofosfamida se administra una vez al día durante uno o dos días.
[0231] En algunos casos, cuando el agente linfodepletor comprende fludarabina, el sujeto se administra fludarabina a una dosis entre o entre aproximadamente 1 mg/m2 y 100 mg/m2, tal como entre o entre aproximadamente 10 mg/m2y 75 mg/m2, 15 mg/m2 y 50 mg/m2, 20 mg/m2 y 30 mg/m2, o 24 mg/m2 y 26 mg/m2. En algunos casos, al sujeto se le administran 25 mg/m2 de fludarabina. En algunos casos, la fludarabina puede administrarse en una dosis única o en varias dosis, por ejemplo, diariamente, cada dos días o cada tres días. En algunos casos, la fludarabina se administra diariamente, por ejemplo, durante 1-5 días, por ejemplo, de 3 a 5 días.
[0232] En algunos casos, el agente linfodepletor comprende una combinación de agentes, como una combinación de ciclofosfamida y fludarabina. Así, la combinación de agentes puede incluir ciclofosfamida a cualquier dosis o pauta de administración, como las descritas anteriormente, y fludarabina a cualquier dosis o pauta de administración, como las descritas anteriormente. Por ejemplo, en algunos aspectos, al sujeto se le administran 60 mg/kg (~2 g/m2) de ciclofosfamida y de 3 a 5 dosis de 25 mg/m2 de fludarabina antes de la dosis de células.
[0233] En un régimen de dosificación ejemplar, antes de recibir la primera dosis, los sujetos reciben un compuesto inmunomodulador 1 día antes de la administración de las células y una quimioterapia precondicionadora linfodepletora de ciclofosfamida y fludarabina (CY/FLU), que se administra al menos dos días antes de la primera dosis de células que expresan CAR y generalmente no más de 7 días antes de la administración de las células. En otro régimen de dosificación ejemplar, los sujetos reciben el compuesto inmunomodulador simultáneamente con la administración de células, por ejemplo el mismo día. En otro régimen de dosificación ejemplar, los sujetos reciben el compuesto inmunomodulador varios días después de la administración de las células, como 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o más de 14 días después. En algunos casos, por ejemplo, la ciclofosfadmida se administra entre 24 y 27 días después de la administración del compuesto inmunomodulador, por ejemplo, lenalidomida. Tras el tratamiento de preacondicionamiento, se administra a los sujetos la dosis de células T que expresan CAR descrita anteriormente.
[0234] En algunos casos, la administración del agente preacondicionador antes de la infusión de la dosis de células mejora un resultado del tratamiento. Por ejemplo, en algunos aspectos, el preacondicionamiento mejora la eficacia del tratamiento con la dosis o aumenta la persistencia de las células que expresan receptores recombinantes (por ejemplo, células que expresan CAR, como células T que expresan CAR) en el sujeto. En algunos casos, el tratamiento de preacondicionamiento aumenta la supervivencia libre de enfermedad, como el porcentaje de sujetos que están vivos y no presentan enfermedad mínima residual o molecularmente detectable tras un periodo de tiempo determinado después de la dosis de células. En algunos casos, aumenta el tiempo hasta la mediana de supervivencia libre de enfermedad.
[0235] Una vez que las células se administran al sujeto (por ejemplo, un ser humano), la actividad biológica de las poblaciones celulares modificadas en algunos aspectos se mide mediante cualquiera de los métodos conocidos. Los parámetros a evaluar incluyen la unión específica de una célula T natural o modificada o de otra célula inmunitaria al antígeno,in vivo,por ejemplo, mediante imágenes, oex vivo,por ejemplo, mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertos casos, la capacidad de las células modificadas para destruir las células diana puede medirse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, como los ensayos de citotoxicidad descritos en, por ejemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), and Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). En algunos casos, la actividad biológica de las células también puede medirse analizando la expresión y/o secreción de determinadas citocinas, como CD107a, IFNy, IL-2 y TNF. En algunos aspectos, la actividad biológica se mide evaluando el resultado clínico, como la reducción de la carga tumoral. En algunos aspectos, se evalúan los resultados tóxicos, la persistencia y/o expansión de las células, y/o la presencia o ausencia de una respuesta inmunitaria del huésped.
[0236] En algunos casos, la administración del agente preacondicionador antes de la infusión de la dosis de células mejora un resultado del tratamiento, como por ejemplo mejorando la eficacia del tratamiento con la dosis o aumenta la persistencia de las células que expresan receptores recombinantes (por ejemplo, células que expresan CAR, como células T que expresan CAR) en el sujeto. Por lo tanto, en algunos casos, la dosis de agente preacondicionador administrada en el método que es una terapia combinada con el compuesto inmunomodulador y la terapia celular es mayor que la dosis administrada en el método sin el compuesto inmunomodulador.
II. T TERAPIA CELULAR E INGENIERÍA CELULAR
[0237] En algunos casos, la terapia de células T para su uso de acuerdo con los métodos de terapia combinada divulgados incluye la administración de células de ingeniería que expresan receptores recombinantes diseñados para reconocer y/o unirse específicamente a moléculas asociadas con la enfermedad o afección y dar lugar a una respuesta, como una respuesta inmunitaria contra dichas moléculas al unirse a dichas moléculas. Los receptores pueden incluir receptores quiméricos,por ej.,receptores antigénicos quiméricos (CAR), y otros receptores antigénicos transgénicos, incluidos los receptores transgénicos de células T (TCR).
[0238] En algunos casos, las células contienen o están diseñadas para contener un receptor diseñado,por ej.,un receptor de antígeno diseñado, como un receptor de antígeno quimérico (CAR) o un receptor de células T (TCR). También se dan a conocer poblaciones de dichas células, composiciones que contienen dichas células y/o enriquecidas para dichas células, por ejemplo, en las que se enriquecen o seleccionan células de un determinado tipo, como células T o células CD8+ o CD4+. Entre las composiciones se encuentran las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración, como por ejemplo para la terapia celular adoptiva. También se divulgan métodos terapéuticos para administrar las células y composiciones a sujetos,por ej.,pacientes.
[0239] Así, en algunos casos, las células incluyen uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante ingeniería genética, y por lo tanto expresan productos recombinantes o de ingeniería genética de dichos ácidos nucleicos. En algunos casos, la transferencia de genes se consigue estimulando primero las células, por ejemplo combinándolas con un estímulo que induzca una respuesta como la proliferación, la supervivencia y/o la activación,por ej.,medida por la expresión de una citocina o un marcador de activación, seguida de la transducción de las células activadas y la expansión en cultivo hasta alcanzar un número suficiente para aplicaciones clínicas.
A. RECEPTORES RECOMBINANTES
[0240] Las células generalmente expresan receptores recombinantes, tales como receptores de antígenos incluyendo receptores de antígenos funcionales no TCR,por ej.,receptores de antígenos quiméricos (CARs), y otros receptores de unión a antígenos tales como receptores de células T transgénicas (TCRs). También hay otros receptores quiméricos.
1. Receptores quiméricos de antígenos (CAR)
[0241] En algunos casos, las células de ingeniería, como las células T, empleadas en los casos divulgados expresan un CAR con especificidad para un antígeno particular (o marcador o ligando), como un antígeno expresado en la superficie de un tipo de célula particular. En algunos casos, el antígeno es un polipéptido. En algunos casos, se trata de un hidrato de carbono u otra molécula. En algunos casos, el antígeno se expresa selectivamente o se sobreexpresa en las células de la enfermedad o afección, por ejemplo, el tumor o las células patógenas, en comparación con las células o tejidos normales o no diana. En otros casos, el antígeno se expresa en las células normales y/o se expresa en las células manipuladas.
[0242] En casos particulares, el receptor recombinante, tal como el receptor quimérico, contiene una región de señalización intracelular, que comprende un dominio o región de señalización citoplasmática (también denominado indistintamente dominio o región de señalización intracelular), tal como una región citoplasmática (intracelular) capaz de inducir una señal de activación primaria en una célula T, por ejemplo, un dominio o región de señalización citoplasmática de un componente del receptor de células T (TCR)(por ej.,un dominio o región de señalización citoplasmática de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z) o una variante funcional o porción de señalización de la misma) y/o que comprende un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM).
[0243] En algunos casos, el receptor quimérico contiene además un dominio extracelular de unión a ligando que se une específicamente a un antígeno ligando (por ejemplo, antígeno). En algunos casos, el receptor quimérico es un CAR que contiene un dominio extracelular de reconocimiento de antígeno que se une específicamente a un antígeno. En algunos casos, el ligando, como un antígeno, es una proteína expresada en la superficie de las células.
[0244] En algunos casos, el CAR es un CAR de tipo TCR y el antígeno es un antígeno peptídico procesado, como un antígeno peptídico de una proteína intracelular, que, como un TCR, se reconoce en la superficie celular en el contexto de una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). En general, un CAR que contiene un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que muestra una especificidad similar al TCR dirigida contra complejos péptido-MHC también puede denominarse CAR similar al TCR. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno extracelular específico para un complejo CMH-péptido de un CAR similar a TCR está unido a uno o más componentes de señalización intracelular, en algunos aspectos mediante enlazadores y/o dominio(s) transmembrana(s). En algunos casos, dichas moléculas pueden imitar o aproximar típicamente una señal a través de un receptor de antígeno natural, como un TCR, y, opcionalmente, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor coestimulador.
[0245] Entre los receptores de antígenos ejemplares, incluidos los CAR, y los métodos de ingeniería e introducción de dichos receptores en las células, se incluyen los descritos, por ejemplo, en los números de publicación de solicitud de patente internacional WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, WO2016/0046724, WO2016/014789, WO2016/090320, WO2016/094304, WO2017/025038, WO2017/173256, números de publicación de solicitud de patente de EE.UU. US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes de EE.UU. N°. 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645, 8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209, 7.354.762, 7.446.191, 8.324.353, 8.479.118, y 9.765.342, y la solicitud de patente europea número EP2537416, y/o las descritas por Sadelain et al, Cancer Discov., 3(4): 388-398 (2013); Davila et al., PLoS ONE 8(4): e61338 (2013); Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 24(5): 633-39 (2012); Wu et al., Cancer, 18(2): 160-75 (2012). En algunos aspectos, los receptores de antígeno incluyen un CAR como se describe en Patente n° 7.446.190, y las descritas en la Publicación de Solicitud de Patente Internacional n° WO/2014055668 A1. Entre los ejemplos de CAR se incluyen los CAR divulgados en cualquiera de las publicaciones mencionadas, como WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, Patente de EE.UU. n.° 7.446.190, Patente de EE.UU. n.° 8.389.282, Kochenderfer et al., Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al., J. Immunother.
35(9): 689-701 (2012); and Brentjens et al., Sci Transl Med. 5(177) (2013). Véase también WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente de EE.UU. n° 7.446.190 y Patente de EE.UU. n° 8.389.282. Los receptores quiméricos, como los CAR, generalmente incluyen un dominio extracelular de unión a antígeno, como una porción de una molécula de anticuerpo, generalmente una región de cadena pesada variable (Vh) y/o una región de cadena ligera variable (Vl) del anticuerpo, porejemplo,un fragmento de anticuerpo scFv.
[0246] En algunos casos, el CAR se construye con una especificidad para un antígeno (o marcador o ligando) en particular, tal como un antígeno expresado en un tipo de célula en particular al que se dirigirá la terapia adoptiva,por ej.,un marcador de cáncer, y/o un antígeno destinado a inducir una respuesta amortiguadora, tal como un antígeno expresado en un tipo de célula normal o no enferma. Así, el CAR incluye típicamente en su porción extracelular una o más moléculas de unión a antígeno, como uno o más fragmentos, dominios o porciones de unión a antígeno, o uno o más dominios variables de anticuerpo, y/o moléculas de anticuerpo. En algunos casos, el CAR incluye una porción o porciones de unión a antígeno de una molécula de anticuerpo, como un fragmento de anticuerpo de cadena única (scFv) derivado de las cadenas pesada variable (Vh) y ligera variable (Vl) de un anticuerpo monoclonal (mAb), o un anticuerpo de dominio único (sdAb), como sdFv, nanobody, VhH y Vnar. En algunos casos, un fragmento de unión a antígeno comprende regiones variables de anticuerpo unidas por un enlazador flexible.
[0247] Entre los dominios de unión a antígeno incluidos en los CAR se encuentran fragmentos de anticuerpos. Un "fragmento de anticuerpo" o "fragmento de unión a antígeno" se refiere a una molécula distinta de un anticuerpo intacto que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al que se une el anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacuerpos; anticuerpos lineales; regiones variables de cadena pesada (V<h>), moléculas de anticuerpo de cadena única como scFvs y anticuerpos de dominio único que comprenden sólo la región V<h>; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. En casos particulares, los anticuerpos son fragmentos de anticuerpos de cadena simple que comprenden una región variable de cadena pesada (Vh) y/o una región variable de cadena ligera (Vl), como los scFvs.
[0248] En ciertos casos, las moléculas de unión multiespecíficas, por ejemplo, los receptores quiméricos multiespecíficos, como los CAR multiespecíficos, pueden contener cualquiera de los anticuerpos multiespecíficos, incluyendo,por ej.,anticuerpos biespecíficos, anticuerpos de cadena única multiespecíficos,por ej.,diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos, di-scFvs en tándem y tri-scFvs en tándem.
[0249] Los anticuerpos de dominio único (sdAbs) son fragmentos de anticuerpos que comprenden toda o una parte de la región variable de la cadena pesada o toda o una parte de la región variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertos casos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo humano de dominio único.
[0250] Los fragmentos de anticuerpo pueden fabricarse mediante diversas técnicas, incluyendo pero sin limitarse a la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción mediante células huésped recombinantes. En algunos casos, los anticuerpos son fragmentos producidos recombinantemente, como fragmentos que comprenden disposiciones que no se producen de forma natural, como aquellos con dos o más regiones o cadenas de anticuerpos unidas por enlazadores sintéticos,por ej.,enlazadores peptídicos, y/o que no pueden producirse por digestión enzimática de un anticuerpo intacto que se produce de forma natural. En algunos aspectos, los fragmentos de anticuerpo son scFvs.
[0251] En algunos casos, el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo es un fragmento de anticuerpo de cadena simple, como un fragmento variable de cadena simple (scFv) o un diacuerpo o un anticuerpo de dominio simple (sdAb). En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo de dominio único que comprende únicamente la región Vh. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un scFv que comprende una región variable de cadena pesada (V<h>) y una región variable de cadena ligera (V<l>).
[0252] En algunos casos, el antígeno al que se dirige el receptor es un polipéptido. En algunos casos, se trata de un hidrato de carbono u otra molécula. En algunos casos, el antígeno se expresa selectivamente o se sobreexpresa en las células de la enfermedad o afección,por ej.,el tumor o las células patógenas, en comparación con las células o tejidos normales o no diana. En otros casos, el antígeno se expresa en las células normales y/o se expresa en las células manipuladas.
[0253] En algunos casos, el antígeno es o incluye avp6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maduración de células B (BCMA), B7-H3, B7-H6, anhidrasa carbónica 9 (CA9, también conocida como CAIX o G250), un antígeno cáncer-testis, antígeno cáncer/testículo 1B (CTAG, también conocido como NY-ESO-1 y LAGE-2), antígeno carcinoembrionario (CEA), una ciclina, ciclina A2, Ligando de Quimiocina de C-C Motif 1 (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano de condroitín sulfato 4 (CSPG4), proteína del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), proteína truncada del factor de crecimiento epidérmico (tEGFR), mutación del receptor del factor de crecimiento epidérmico tipo III (EGFR vIII), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), receptor de estrógenos, receptor Fc tipo 5 (FCRL5; también conocido como receptor Fc homólogo 5 o FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), proteína de unión a folato (FBP), receptor de folato alfa, gangliósido GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliósido GD3, glicoproteína 100 (gp100), glypican-3 (GPC3), receptor 5D acoplado a proteína G (GPCR5D), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano de alto peso molecular asociado a melanoma (HMW-MAA), antígeno de superficie de la hepatitis B, antígeno leucocitario humano A1 (HLA-A1), antígeno leucocitario humano A2 (HlA-A2), receptor IL-22 alfa(II,-22Ra), receptor IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, molécula de adhesión celular L1 (L1-CAM), CE7 epítopo de L1-CAM, Miembro A de la familia 8 de repeticiones ricas en leucina (LRRC8A), Lewis Y, Antigénio associado ao melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina(MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (M<u>C1), MUC16, ligandos del grupo linfocito T asesino 2 miembro D (NKG2D), melanina A (MART-1), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno preferentemente expresado de melanoma (PRAME), receptor de progesterona, antígeno prostético específico, antígeno de células madre de próstata (PSCA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor tirosina quinasa similar al receptor huérfano 1 (ROR1), survivina, glicoproteína de trofoblasto (TPBG también conocida como 5T4), glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG72), proteína relacionada con la tirosinasa 1 (TRP1, también conocida como TYRP1 o gp75), proteína relacionada con la tirosinasa 2 (TRP2, también conocida como dopacromo tautomerasa, dopacromo delta-isomerasa o DCT), receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), tumor de Wilms 1 (WT-1), un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno, o un antígeno asociado con una etiqueta universal, y/o moléculas biotiniladas, y/o moléculas expresadas por HIV, HCV, HBV u otros patógenos. En algunos casos, los antígenos a los que se dirigen los receptores incluyen antígenos asociados con una neoplasia de células B, como cualquiera de una serie de marcadores de células B conocidos. En algunos casos, el antígeno es o incluye CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b o CD30.
[0254] En algunos casos, el antígeno es o incluye un antígeno específico de patógeno o expresado por patógeno. En algunos casos, el antígeno es un antígeno viral (como un antígeno viral del HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos y/o antígenos parasitarios.
[0255] En algunos casos, el CAR es un CAR anti-BCMA que es específico para BCMA, por ejemplo BCMA humano. Se han descrito previamente receptores de antígenos quiméricos que contienen anticuerpos anti-BCMA, incluidos anticuerpos BCMA antihumanos de ratón y anticuerpos BCMA antihumanos humanos, y células que expresan dichos receptores quiméricos. Véase Carpenter et al., Clin Cancer Res., 2013, 19(8):2048-2060, US 9,765,342, WO 2016/090320, WO2016090327, WO2010104949A2, WO2016/0046724, WO2016/014789, WO2016/094304, WO2017/025038, y WO2017173256. En algunos casos, el CAR anti-BCMA contiene un dominio de unión a antígeno, tal como un scFv, que contiene una región variable pesada (V<h>) y/o una región variable ligera (V<l>) derivada de un anticuerpo descrito en WO 2016/090320 o WO2016090327. En algunos casos, el dominio de unión al antígeno es un fragmento de anticuerpo que contiene una cadena pesada variable (Vh) y una región de cadena ligera variable (Vl). En algunos aspectos, la región Vh es o incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la región Vh establecida en cualquiera de las SEQ ID N°: 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 181, 183, 185 y 188; y/o la región Vl es o incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la región Vl establecida en cualquiera de las SEQ ID N°: 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 182, 184, 186, y 189.
[0256] En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 30 y una Vl establecida en SEQ ID N°:31. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 32 y una Vl establecida en SEQ ID N°:33. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 34 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 35. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 36 y una Vl establecida en SEQ ID N°:37. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 38 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 39. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 40 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 41. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 42 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 43. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 77 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 78. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 79 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 80. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 81 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 82. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 83 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 84. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 85 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 86. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 87 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 88. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 89 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 90. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 91 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 92. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 93 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 94. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 95 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 96. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 97 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 98. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 99 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 100. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 101 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 102. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 103 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 104. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 105 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 106. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 107 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 106. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 30 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 108. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 109 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 110. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 111 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 112. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 181 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 182. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 183 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una Vh establecida en SEQ ID N°: 185 y una Vl establecida en SEQ ID N°: 186. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno, como un scFv, contiene una V<h>establecida en SEQ ID N°: 187 y una V<l>establecida en SEQ ID N°: 188. En algunos casos, la V<h>o VLtiene una secuencia de aminoácidos que presenta al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias V<h>o<vl>anteriores, y conserva la unión a BCMA. En algunos casos, la región Vh es aminoterminal a la región Vl. En algunos casos, la región Vh es carboxi-terminal a la región Vl. En algunos casos, las cadenas pesada y ligera variables están conectadas por un enlazador. En algunos casos, el enlazador se establece en SEQ ID N°: 70, 72, 73, 74, o 189.
[0257] En algunos casos, el CAR es un CAR anti-CD19 que es específico para CD19, por ejemplo, CD19 humano. En algunos casos, el dominio de unión a antígeno incluye una Vh y/o Vl derivada de FMC63, que, en algunos aspectos, puede ser un scFv. En algunos casos, el scFv y/o los dominios Vh se derivan de FMC63. FMC63 se refiere generalmente a un anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón criado contra células Nalm-1 y -16 que expresan CD19 de origen humano (Ling, N. R.,et al.(1987).Tipificación leucocitaria III.302). El anticuerpo FMC63 comprende CDRH1 y H2 establecidos en SEQ ID N°: 44, 45 respectivamente, y CDRH3 establecidos en SEQ ID N°: 46 ó 47 y CDRL1 que figura en SEQ ID N°: 48 y CDR L2 establecidos en SEQ ID N°: 49 ó 50 y las secuencias CDR L3 establecidas en SEQ ID N°: 51, o 52. El anticuerpo FMC63 comprende la región variable de la cadena pesada (Vh) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 53 y la región variable de la cadena ligera (V<l>) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 54. En algunos casos, el svFv comprende una cadena ligera variable que contiene la secuencia CDRL1 de SEQ ID N°:48, una secuencia CDRL2 de SEQ ID N°:49, y una secuencia CDRL3 de SEQ ID N°:51 y/o una cadena pesada variable que contiene una secuencia CDRH1 de SEQ ID N°:44, una secuencia CDRH2 de SEQ ID N°:45, y una secuencia CDRH3 de SEQ ID N°:46. En algunos casos, el scFv comprende una región variable de cadena pesada de FMC63 establecida en SEQ ID N°:53 y una región variable de cadena ligera de FMC63 establecida en SEQ ID N°:54. En algunos casos, las cadenas pesada y ligera variables están conectadas por un enlazador. En algunos casos, el enlazador se establece en SEQ ID N°: 70, 72, 73, 74, o 189. En algunos casos, el scFv comprende, en orden, un Vh, un enlazador y un Vl. En algunos casos, el scFv comprende, en orden, un V<l>, un enlazador y un V<h>. En algunos casos, el svFv está codificado por una secuencia de nucleótidos establecida en SEQ ID N°:69 o una secuencia que presenta al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N°:69. En algunos casos, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N°:55 o una secuencia que presenta al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N°:55.
[0258] En algunos casos, el dominio de unión a antígeno incluye un Vh y/o Vl derivado de SJ25C1, que, en algunos aspectos, puede ser un scFv. SJ25C1 es un anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón criado contra células Nalm-1 y -16 que expresan CD19 de origen humano (Ling, N. R.,et al.(1987).Tipificación leucocitaria III.302). El anticuerpo SJ25C1 comprende CDRH1, H2 y H3 establecidos en SEQ ID N°: 59-61, respectivamente, y las secuencias CDRL1, L2 y L3 establecidas en SEQ ID N°: 56-58, respectivamente. El anticuerpo SJ25C1 comprende la región variable de la cadena pesada (Vh) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 62 y la región variable de la cadena ligera (Vl) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID N°: 63. En algunos casos, el svFv comprende una cadena ligera variable que contiene la secuencia CDRL1 de SEQ ID N°:56, una secuencia CDRL2 de SEQ ID N°: 57, y una secuencia CDRL3 de SEQ ID N°:58 y/o una cadena pesada variable que contenga una secuencia CDRH1 de SEQ ID N°:59, una secuencia CDRH2 de S<e>Q ID N°:60, y una secuencia CDRH3 de SEQ ID N°:61. En algunos casos, el scFv comprende una región de cadena pesada variable de SJ25C1 establecida en SEQ ID N°:62 y una región de cadena ligera variable de SJ25C1 establecida en SEQ ID N°:63. En algunos casos, la cadena pesada variable y la cadena ligera variable están conectadas por un enlazador. En algunos casos, el enlazador se establece en SEQ ID N°:64. En algunos casos, el scFv comprende, en orden, un Vh, un enlazador y un Vl. En algunos casos, el scFv comprende, en orden, un Vl, un enlazador y un Vh. En algunos casos, el scFv comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N°:65 o una secuencia que presenta al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con SEQ ID N°:65.
[0259] En algunos casos, el anticuerpo es un fragmento de unión a antígeno, como un scFv, que incluye uno o más enlazadores que unen dos dominios o regiones de anticuerpo, como una región variable de cadena pesada (Vh) y una región variable de cadena ligera (V<l>). En consecuencia, los anticuerpos incluyen fragmentos de anticuerpos de cadena simple, como scFvs y diacuerpos, en particular fragmentos de anticuerpos humanos de cadena simple, que típicamente comprenden enlazador(es) que unen dos dominios o regiones de anticuerpos, como las regiones V<h>y V<l>. El enlazador suele ser un enlazador peptídico,por ej.,un enlazador peptídico flexible y/o soluble, como uno rico en glicina y serina. Entre los enlazadores se encuentran los ricos en glicina y serina y/o, en algunos casos, en treonina. En algunos casos, los enlazadores incluyen además residuos cargados, como lisina y/o glutamato, que pueden mejorar la solubilidad. En algunos casos, los enlazadores incluyen además una o más prolinas.
[0260] En algunos aspectos, los enlazadores ricos en glicina y serina (y/o treonina) incluyen al menos 80%, 85%, 90%, 9l% , 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de dicho(s) aminoácido(s). En algunos casos, incluyen al menos un 50%, 55%, 60%, 70% o 75% de glicina, serina y/o treonina. En algunos casos, el enlazador está compuesto sustancialmente en su totalidad por glicina, serina y/o treonina. Los enlazadores generalmente tienen entre 5 y 50 aminoácidos de longitud, típicamente entre 10 y 30, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, y en algunos ejemplos entre 10 y 25 aminoácidos de longitud. Los enlazadores ejemplares incluyen enlazadores que tienen varios números de repeticiones de la secuencia GGGGS (4GS; SEQ ID N°:19) o GGGS (3GS; SEQ ID N°:71), como entre 2, 3, 4 y 5 repeticiones de dicha secuencia. Los enlazadores ejemplares incluyen los que tienen o consisten en una secuencia establecida en SEQ ID N°:72 (GGGGSGGGGSGGGGGS), SEQ ID N°:189 (ASGGGGSGGRASGGGGS), SEQ ID N°:73 (GSTSGSGKPGSGEGSTKG) o SEQ ID N°: 74 (SRGGGGSGGGGSGGGGSLEMA).
[0261] En algunos casos, el receptor recombinante tal como el CAR, tal como la porción de anticuerpo del receptor recombinante,porej.,CAR, incluye además un espaciador, que puede ser o incluir al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina o variante o versión modificada de la misma, tal como una región bisagra,por ej.,una región bisagra IgG4, una región bisagra IgG1, una región Ch1/Cl, y/o región Fc. En algunos casos, el receptor recombinante comprende además un espaciador y/o una región bisagra. En algunos casos, la región o porción constante es de una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunos aspectos, la porción de la región constante sirve como región espaciadora entre el componente de reconocimiento de antígeno,por ej.,scFv, y el dominio transmembrana. El espaciador puede ser de una longitud que proporcione una mayor capacidad de respuesta de la célula tras la unión al antígeno, en comparación con la ausencia del espaciador.
[0262] Entre los espaciadores ejemplares,por ej.,regiones de bisagra, se incluyen los descritos en la publicación de solicitud de patente internacional número WO2014031687. En algunos ejemplos, el espaciador es o tiene aproximadamente 12 aminoácidos de longitud o no tiene más de 12 aminoácidos de longitud. Los espaciadores ejemplares incluyen los que tienen al menos entre 10 y 229 aminoácidos, entre 10 y 200 aminoácidos, entre 10 y 175 aminoácidos, entre 10 y 150 aminoácidos, entre 10 y 125 aminoácidos, entre 10 y 100 aminoácidos, entre 10 y 75 aminoácidos, entre 10 y 50 aminoácidos, entre 10 y 40 aminoácidos, entre 10 y 30 aminoácidos, entre 10 y 20 aminoácidos o entre 10 y 15 aminoácidos, e incluyen cualquier número entero entre los extremos de cualquiera de los intervalos enumerados. En algunos casos, una región espaciadora tiene unos 12 aminoácidos o menos, unos 119 aminoácidos o menos, o unos 229 aminoácidos o menos. En algunos casos, el espaciador es un espaciador que tiene al menos una longitud particular, tal como tener una longitud de al menos 100 aminoácidos, tal como al menos 110, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, o 250 aminoácidos de longitud. Los espaciadores ejemplares incluyen la bisagra IgG4 sola, la bisagra IgG4 unida a los dominios Ch2 y Ch3, o la bisagra IgG4 unida al dominio Ch3. Los espaciadores ejemplares incluyen la bisagra IgG4 sola, la bisagra IgG4 unida a los dominios CH2 y CH3, o la bisagra IgG4 unida al dominio C<h>3. Los espaciadores ejemplares incluyen, entre otros, los descritos en Hudecek et al., Clin. Cancer Res., 19:3153 (2013), Hudecek et al. (2015) Cancer Immunol Res. 3(2): 125-135, solicitud internacional de patente número de publicación WO2014031687, EE.UU. Patente n° 8.822.647 o aplicación publicada. N° US2014/0271635. En algunos casos, el espaciador incluye una secuencia de una región bisagra de inmunoglobulina, una región CH2 y CH3. En algunos casos, una o más de las bisagras, C<h>2 y C<h>3 se derivan total o parcialmente de IgG4 o IgG2. En algunos casos, la bisagra, Ch2 y Ch3 se derivan de IgG4. En algunos aspectos, una o más de las bisagras, Ch2 y Ch3 son quiméricas y contienen secuencias derivadas de IgG4 e IgG2. En algunos ejemplos, el espaciador contiene una bisagra quimérica IgG4/2, una región IgG2/4CH2 y una región IgG4 C<h>3.
[0263] En algunos casos, el espaciador, que puede ser una región constante o una porción de la misma de una inmunoglobulina, es de una IgG humana, como IgG4 o IgG1. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia ESKYGPPCPPCP (establecida en SEQ ID N°: 1). En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 3. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 4. En algunos casos, el espaciador codificado es o contiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 29. En algunos casos, la región o porción constante es de IgD. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 5. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 125.
[0264] En algunos casos, el espaciador puede derivarse total o parcialmente de IgG4 y/o IgG2 y puede contener mutaciones, como una o más mutaciones de aminoácido único en uno o más dominios. En algunos ejemplos, la modificación de aminoácidos es una sustitución de una prolina (P) por una serina (S) en la región bisagra de una IgG4. En algunos casos, la modificación de aminoácidos es una sustitución de una glutamina (Q) por una asparagina (N) para reducir la heterogeneidad de la glicosilación, como una mutación N177Q en la posición 177, en la región Ch2, de la secuencia Fc de IgG4 de longitud completa o una N176Q. en la posición 176, en la región CH2, de la secuencia Fc de IgG4 de longitud completa.
[0265] Otras regiones espaciadoras ejemplares incluyen regiones bisagra derivadas de CD8a, CD28, CTLA4, PD-1 o FcyRIIIa. En algunos casos, el espaciador contiene un dominio extracelular truncado o una región bisagra de un CD8a, CD28, CTLA4, PD-1 o FcyRIIIa. En algunos casos, el espaciador es una región bisagra truncada de CD28. En algunos casos, un enlazador oligo o polipeptídico corto, por ejemplo, un enlazador de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contenga alaninas o alanina y arginina, por ejemplo, triplete de alanina (AAA) o RAAA (SEQ ID N°: 180), está presente y forma un enlace entre el scFv y la región espadadora del CAR. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 114. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 116. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en cualquiera de las SEQ ID N°: 117-119, En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 120. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 122. En algunos casos, el espaciador tiene la secuencia establecida en SEQ ID N°: 124.
[0266] En algunos casos, el espaciador tiene una secuencia de aminoácidos que exhibe al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia con cualquiera de los SEQ ID N°: 1, 3, 4, 5 ó 29, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 122, 124 ó 125.
[0267] Este dominio de reconocimiento de antígeno generalmente está unido a uno o más componentes de señalización intracelular, tales como componentes de señalización que imitan la estimulación y/o activación a través de un complejo receptor de antígeno, tal como un complejo TCR, en el caso de un CAR, y/o señal a través de otro receptor de superficie celular. Así, en algunos casos, el componente de unión al antígeno(por ej.,el anticuerpo) está unido a uno o más dominios transmembrana y de señalización intracelular. En algunos casos, el dominio transmembrana está fusionado al dominio extracelular. En un caso, se utiliza un dominio transmembrana que se asocia de forma natural con uno de los dominios del receptor,por ej.,CAR. En algunos casos, el dominio transmembrana se selecciona o modifica mediante sustitución de aminoácidos para evitar la unión de dichos dominios a los dominios transmembrana de las mismas o diferentes proteínas de membrana de superficie para minimizar las interacciones con otros miembros del complejo receptor.
[0268] En algunos casos, el dominio transmembrana se deriva de una fuente natural o sintética. Cuando la fuente es natural, el dominio en algunos aspectos se deriva de cualquier proteína de membrana o transmembrana. Las regiones transmembrana incluyen aquellas derivadas de( es decir, que comprenden al menos la(s) región(es) transmembrana de) la cadena alfa, beta o zeta del receptor de células T, Cd 28, CD3 épsilon, CD45, Cd 4, CD5, CD8, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137 (4-1BB), CD154, CTLA-4 o PD-1. Alternativamente, el dominio transmembrana en algunos casos es sintético. En algunos aspectos, el dominio transmembrana sintético comprende residuos predominantemente hidrofóbicos como leucina y valina. En algunos aspectos, se encontrará un triplete de fenilalanina, triptófano y valina en cada extremo de un dominio transmembrana sintético. En algunos casos, la unión se realiza mediante enlazadores, espaciadores y/o dominio(s) transmembrana. Secuencias ejemplares de dominios transmembrana son o comprenden las secuencias establecidas en SEQ ID N°: 8, 115, 121, 123, 178, o 179.
[0269] Entre los dominios de señalización intracelular se encuentran aquellos que imitan o aproximan una señal a través de un receptor de antígeno natural, una señal a través de dicho receptor en combinación con un receptor costimulador, y/o una señal a través de un receptor costimulador solo. En algunos casos, está presente un enlazador oligopéptido corto, por ejemplo, un enlazador de entre 2 y 10 aminoácidos de longitud, como uno que contenga glicinas y serinas,por ej.,un doblete glicina-serina, y forma un enlace entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización citoplasmática del CAR.
[0270] El receptor,por ej.,el CAR, generalmente incluye al menos un componente o componentes de señalización intracelular. En algunos casos, el receptor incluye un componente intracelular de un complejo TCR, como una cadena TCR CD3 que media la estimulación y/o activación de células T y la citotoxicidad,por ej.,la cadena CD3 zeta. Así, en algunos aspectos, la porción de unión a antígeno está unida a uno o más módulos de señalización celular. En algunos casos, los módulos de señalización celular incluyen el dominio transmembrana CD3, dominios de señalización intracelular CD3 y/u otros dominios transmembrana CD. En algunos casos, el receptor,por ej.,CAR, incluye además una porción de una o más moléculas adicionales como el receptor Fc<y>, CD8, CD4,<c>D25 o CD16. Por ejemplo, en algunos aspectos, el CAR u otro receptor quimérico incluye una molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-Z) o receptor Fc y y CD8, CD4, CD25 o CD16.
[0271] En algunos casos, tras la ligadura del CAR u otro receptor quimérico, el dominio citoplasmático o el dominio de señalización intracelular del receptor estimula y/o activa al menos una de las funciones efectoras o respuestas normales de la célula inmunitaria,por ej.,la célula T diseñada para expresar el CAR. Por ejemplo, en algunos contextos, el CAR induce una función de una célula T, como la actividad citolítica o la actividad T-auxiliar, como la secreción de citocinas u otros factores. En algunos casos, se utiliza una porción truncada de un dominio de señalización intracelular de un componente receptor de antígeno o molécula coestimuladora en lugar de una cadena inmunoestimuladora intacta, por ejemplo, si transduce la señal de función efectora. En algunos casos, el dominio o dominios de señalización intracelular incluyen las secuencias citoplasmáticas del receptor de células T (TCR), y en algunos aspectos también las de los correceptores que en el contexto natural actúan en concierto con dichos receptores para iniciar la transducción de señales tras el enganche del receptor de antígeno, y/o cualquier derivado o variante de dichas moléculas, y/o cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional.
[0272] En el contexto de un TCR natural, la activación completa generalmente requiere no sólo la señalización a través del TCR, sino también una señal coestimuladora. Así, en algunos casos, para promover la activación completa, también se incluye en el CAR un componente para generar una señal secundaria o coestimuladora. En otros casos, el CAR no incluye un componente para generar una señal costimulatoria. En algunos aspectos, un CAR adicional se expresa en la misma célula y proporciona el componente para generar la señal secundaria o costimuladora.
[0273] La estimulación y/o activación de células T se describe en algunos aspectos como mediada por dos clases de secuencias de señalización citoplasmática: las que inician la estimulación y/o activación primaria dependiente de antígeno a través del TCR (regiones, dominios o secuencias de señalización citoplasmática primaria), y las que actúan de manera independiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora (regiones, dominios o secuencias de señalización citoplasmática secundaria). En algunos aspectos, el CAR incluye uno o ambos componentes de señalización.
[0274] En algunos aspectos, el CAR incluye regiones, dominios o secuencia de señalización citoplasmática primaria que regula la activación primaria del complejo TCR. Las regiones, dominios o secuencias de señalización citoplasmática primaria que actúan de forma estimuladora pueden contener motivos de señalización que se conocen como motivos de activación basados en tirosinas inmunorreceptoras o ITAM. Ejemplos de ITAM que contienen secuencias de señalización citoplasmáticas primarias incluyen las derivadas de TCR zeta, FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 epsilon, CD8,<c>D22, CD79a, CD79b y CD66d. En algunos casos, la molécula o moléculas de señalización citoplasmática de la CAR contienen un dominio de señalización citoplasmática, una parte del mismo o una secuencia derivada de CD3 zeta. En algunos casos, el CAR incluye una región de señalización y/o una porción transmembrana de un receptor costimulador, como CD28, 4-1BB, OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, ICOS y/u otros receptores costimuladores. En algunos aspectos, el mismo CAR incluye tanto la región de señalización citoplasmática primaria como componentes de señalización costimulatoria.
[0275] En algunos casos, uno o más receptores recombinantes diferentes pueden contener una o más región(es) o dominio(s) de señalización intracelular diferente(s). En algunos casos, la región de señalización citoplasmática primaria está incluida en un CAR, mientras que el componente coestimulador lo proporciona otro receptor, por ejemplo, otro CAR que reconoce otro antígeno. En algunos casos, los CAR incluyen CAR activadores o estimuladores y CAR costimuladores, ambos expresados en la misma célula(Véase WO2014/055668).
[0276] En algunos aspectos, las células incluyen uno o más CAR estimuladores o activadores y/o un CAR coestimulador. En algunos casos, las células incluyen además CAR inhibitorias (iCAR, véase Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013), como un CAR que reconoce un antígeno distinto del asociado y/o específico de la enfermedad o afección, mediante el cual una señal activadora emitida a través del CAR de marcación de la enfermedad se ve disminuida o inhibida por la unión del CAR inhibidor a su ligando,por ej.,para reducir los efectos fuera de diana.
[0277] En ciertos casos, el dominio de señalización intracelular comprende un dominio transmembrana y de señalización CD28 unido a un dominio intracelular CD3(por ej.,CD3-zeta). En algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende unos dominios coestimuladores quiméricos CD28 y CD137 (4-1BB, TNFRSF9), unidos a un dominio intracelular CD3 zeta.
[0278] En algunos casos, el CAR abarca uno o más, por ejemplo, dos o más, dominios costimulatorios y región de señalización citoplasmática primaria, en la porción citoplasmática. Los CAR ejemplares incluyen componentes intracelulares, como región(es) o dominio(s) de señalización intracelular, de CD3-zeta, CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, dAp 12, NKG2D y/o ICOS. En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico contiene una región o dominio de señalización intracelular de una molécula costimuladora de células T, por ejemplo, de CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D y/o ICOS, en algunos casos, entre el dominio transmembrana y la región o dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es una o más de CD28, CD137 (4-1BB), OX40 (CD134), CD27, DAP10, DAP12, NKG2D y/o ICOS.
[0279] En algunos casos, los CARs se denominan CARs de primera, segunda y/o tercera generación. En algunos aspectos, un CAR de primera generación es aquel que únicamente proporciona una señal inducida por la cadena CD3 tras la unión al antígeno; en algunos aspectos, un<c>A<r>de segunda generación es aquel que proporciona dicha señal y una señal costimulatoria, como la que incluye un dominio de señalización intracelular de un receptor costimulatorio como CD28 o CD137; en algunos aspectos, un CAR de tercera generación es aquel que incluye múltiples dominios costimulatorios de diferentes receptores costimulatorios.
[0280] En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En algunos aspectos, el receptor de antígeno quimérico incluye una porción extracelular que contiene el anticuerpo o fragmento y un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el anticuerpo o fragmento incluye un scFv y el dominio intracelular contiene un ITAM. En algunos aspectos, el dominio de señalización intracelular incluye un dominio de señalización de una cadena zeta de una cadena cD3-zeta (CD3Z). En algunos casos, el receptor de antígeno quimérico incluye un dominio transmembrana que une el dominio extracelular y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, el dominio transmembrana contiene una porción transmembrana de CD28. En algunos casos, el receptor antigénico quimérico contiene un dominio intracelular de una molécula coestimuladora de células T. El dominio extracelular y el dominio transmembrana pueden estar unidos directa o indirectamente. En algunos casos, el dominio extracelular y el transmembrana están unidos por un espaciador, como cualquiera de los descritos en el presente documento. En algunos casos, el receptor contiene la porción extracelular de la molécula de la que deriva el dominio transmembrana, como la porción extracelular CD28. En algunos casos, el receptor antigénico quimérico contiene un dominio intracelular derivado de una molécula coestimuladora de células T o una variante funcional de la misma, como entre el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular. En algunos aspectos, la molécula coestimuladora de células T es CD28 o 4-1BB.
[0281] Por ejemplo, en algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo, porejemplo,un fragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de CD28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de CD28 o una variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o una variante funcional del mismo. En algunos casos, el CAR contiene un anticuerpo,por ej., unfragmento de anticuerpo, un dominio transmembrana que es o contiene una porción transmembrana de c D28 o una variante funcional del mismo, y un dominio de señalización intracelular que contiene una porción de señalización de un 4-1BB o una variante funcional del mismo y una porción de señalización de CD3 zeta o una variante funcional del mismo. En algunos de estos casos, el receptor incluye además un espaciador que contiene una porción de una molécula Ig, como una molécula Ig humana, como una bisagra Ig,por ejemplouna bisagra IgG4, como un espaciador sólo de bisagra.
[0282] En algunos casos, el dominio transmembrana del receptor recombinante,p o re j,el CAR, es o incluye un dominio transmembrana de CD28 humano(por ej.Accession No. P10747.1) o CD8a (Accession No. P01732.1) o una variante de los mismos, como un dominio transmembrana que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N°: 8, 115, 178 ó 179 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID N°: 8, 115, 178 o 179; en algunos casos, la porción del receptor recombinante que contiene el dominio transmembrana comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N°: 9 o una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con la misma.
[0283] En algunos casos, el componente o componentes de señalización intracelular del receptor recombinante, porejemploel CAR, contiene un dominio de señalización costimuladora intracelular de CD28 humano o una variante funcional o porción del mismo, tal como un dominio con una sustitución LL a GG en las posiciones 186-187 de una proteína CD28 nativa. Por ejemplo, el dominio de señalización intracelular puede comprender la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N°: 10 u 11 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID N°: 10, o 11. En algunos casos, el dominio intracelular comprende un dominio de señalización costimuladora intracelular de 4-1BB(por ej.Q07011.1) o una variante funcional o parte de la misma, como la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N°: 12 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID N°: 12.
[0284] En algunos casos, el dominio de señalización intracelular del receptor recombinante, porejemploel CAR, comprende un dominio de señalización estimulador CD3 zeta humano o una variante funcional del mismo, tal como un dominio citoplasmático 112 AA de la isoforma 3 de CD3Z humano (N° de acceso P20963.2) o un dominio de señalización CD3 zeta como se describe en Patente de EE.UU. n° 7.446.190 o Patente de EEUU N.° 8.911.993. Por ejemplo, en algunos casos, el dominio de señalización intracelular comprende la secuencia de aminoácidos tal como se establece en SEQ ID N°: 13, 14 ó 15 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID N°: 13, 14, o 15.
[0285] En algunos aspectos, el espaciador contiene sólo una región bisagra de una IgG, tal como sólo una bisagra de IgG4 o IgG1, tal como el espaciador sólo bisagra establecido en SEQ ID N°: 1 o SEQ ID N°: 125. En otros casos, el espaciador es o contiene una bisagra Ig,por ej.,una bisagra derivada de IgG4, opcionalmente unida a un dominio CH2 y/o CH3. En algunos casos, el espaciador es una bisagra Ig,por ej.,una bisagra IgG4, unida a los dominios CH2 y CH3, tal como se establece en SEQ ID N°: 4. En algunos casos, el espaciador es una bisagra Ig,por ej.,una bisagra IgG4, unida únicamente a un dominio CH3, tal como se establece en SEQ ID N°: 3. En algunos casos, el espaciador es o comprende una secuencia rica en glicina-serina u otro enlazador flexible como los enlazadores flexibles conocidos. En algunos casos, el espaciador es una bisagra CD8a, tal como se establece en cualquiera de las SEQ ID N°: 117-119, una bisagra FcyRIIIa, tal como se establece en SEQ ID N°: 124, una bisagra CTLA4, tal como se establece en SEQ ID N°: 120, o una bisagra PD-1, tal como se establece en SEQ ID N°: 122.
[0286] Por ejemplo, en algunos casos, el CAR incluye un anticuerpo tal como un fragmento de anticuerpo, incluyendo scFvs, un espaciador, tal como un espaciador que contiene una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como una región bisagra y/o una o más regiones constantes de una molécula de cadena pesada, como un espaciador que contenga una bisagra Ig, un dominio transmembrana que contenga todo o parte de un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de CD28 y un dominio de señalización CD3 zeta. En algunos casos, el CAR incluye un anticuerpo o fragmento, como scFv, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagra Ig, un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de 4-1BB y un dominio de señalización derivado de CD3 zeta.
[0287] Los receptores recombinantes, como los CAR, expresados por las células administradas al sujeto generalmente reconocen o se unen específicamente a una molécula que se expresa en, está asociada con y/o es específica para la enfermedad o afección o las células de la misma que se están tratando. Tras la unión específica a la molécula,por ej., elantígeno, el receptor generalmente envía una señal inmunoestimuladora, como una señal inducida por ITAM, a la célula, promoviendo así una respuesta inmunitaria dirigida a la enfermedad o afección. Por ejemplo, en algunos casos, las células expresan un CAR que se une específicamente a un antígeno expresado por una célula o tejido de la enfermedad o afección o asociado a la enfermedad o afección. Las secuencias CAR ejemplares no limitantes se exponen en SEQ ID N°: 126-177.
[0288] En algunos casos, la secuencia de CAR codificada puede incluir además una secuencia señal o péptido señal que dirige o entrega el CAR a la superficie de la célula en la que se expresa el CAR. En algunos casos, el péptido señal se deriva de una proteína transmembrana. En algunos ejemplos, el péptido señal se deriva de CD8a, CD33 o una IgG. Los péptidos señal ejemplares incluyen las secuencias establecidas en SEQ ID N°: 21, 75 y 76 o sus variantes.
[0289] En algunos casos, la CAR incluye un anticuerpo anti-CD19 tal como un fragmento de anticuerpo, incluyendo scFvs, un espaciador, tal como un espaciador que contiene una porción de una molécula de inmunoglobulina, tal como una región bisagra y/o una o más regiones constantes de una molécula de cadena pesada, como cualquiera de los espaciadores que contienen Ig-bisagra u otros espaciadores descritos en el presente documento, un dominio transmembrana que contiene la totalidad o una parte de un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de CD28 y un dominio de señalización CD3 zeta. En algunos casos, el CAR incluye un anticuerpo o fragmento anti-CD19, como scFv, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagra Ig u otros espaciadores descritos en el presente documento, un dominio transmembrana derivado de CD28, un dominio de señalización intracelular derivado de 4-1BB y un dominio de señalización derivado de CD3 zeta. En algunos casos, dichas construcciones CAR incluyen además un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia tEGFR,por ej.,corriente abajo del CAR.
[0290] En algunos casos, la CAR incluye un anticuerpo o fragmento anti-BCMA, como cualquiera de los anticuerpos anti-BCMA humanos, incluidos sdAbs y scFvs, descritos en el presente documento, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagra Ig u otros espaciadores descritos en el presente documento, un dominio transmembrana CD28, un dominio de señalización intracelular CD28 y un dominio de señalización zeta CD3. En algunos casos, la CAR incluye un anticuerpo o fragmento anti-BCMA, como cualquiera de los anticuerpos anti-BCMA humanos, incluidos sdAbs y scFvs, descritos en el presente documento, un espaciador como cualquiera de los espaciadores que contienen bisagra Ig u otros espaciadores descritos en el presente documento, un dominio transmembrana CD28, un dominio de señalización intracelular 4-1BB y un dominio de señalización zeta CD3. En algunos casos, dichas construcciones CAR incluyen además un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia tEGFR,por ej.,corriente abajo del CAR.
2. Receptor de Autoanticuerpo Quimérico (CAAR)
[0291] En algunos casos, el receptor recombinante es un receptor de autoanticuerpo quimérico (CAAR). En algunos casos, el CAAR se une, por ejemplo, se une específicamente o reconoce un autoanticuerpo. En algunos casos, una célula que expresa el CAAR, como una célula T diseñada para expresar un CAAR, puede utilizarse para unirse a células que expresan autoanticuerpos y destruirlas, pero no a células normales que expresan anticuerpos. En algunos casos, las células que expresan CAAR pueden utilizarse para tratar una enfermedad autoinmune asociada a la expresión de autoantígenos, como las enfermedades autoinmunes. En algunos casos, las células que expresan CAAR pueden dirigirse a las células B que finalmente producen los autoanticuerpos y muestran los autoanticuerpos en sus superficies celulares, marcando estas células B como dianas específicas de la enfermedad para la intervención terapéutica. En algunos casos, las células que expresan CAAR pueden utilizarse para marcar y destruir eficazmente los linfocitos B patógenos en enfermedades autoinmunes, marcando los linfocitos B causantes de la enfermedad mediante un receptor quimérico de autoanticuerpos específico de antígeno. En algunos casos, el receptor recombinante es un CAAR, como cualquiera de los descritos en Publ. de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° US 2017/0051035.
[0292] En algunos casos, el CAAR comprende un dominio de unión a autoanticuerpos, un dominio transmembrana y una o más regiones o dominios de señalización intracelular (también llamados indistintamente dominios o regiones de señalización citoplasmática). En algunos casos, la región de señalización intracelular comprende un dominio de señalización intracelular. En algunos casos, el dominio de señalización intracelular es o comprende una región de señalización primaria, un dominio de señalización que es capaz de estimular y/o inducir una señal de activación primaria en una célula T, un dominio de señalización de un componente del receptor de células T (TCR) (por ejemplo, un dominio o región de señalización intracelular de una cadena zeta de una cadena CD3-zeta (CD3Z) o una variante funcional o porción de señalización de la misma), y/o un dominio de señalización que comprende un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM).
[0293] En algunos casos, el dominio de unión a autoanticuerpos comprende un autoantígeno o un fragmento del mismo. La elección del autoantígeno puede depender del tipo de autoanticuerpo objetivo. Por ejemplo, el autoantígeno puede elegirse porque reconoce un autoanticuerpo en una célula diana, como una célula B, asociado con un estado de enfermedad particular, por ejemplo, una enfermedad autoinmune, como una enfermedad autoinmune mediada por autoanticuerpos. En algunos casos, la enfermedad autoinmune incluye el pénfigo vulgar (PV). Algunos autoantígenos ejemplares son la desmogleína 1 (Dsg1) y la Dsg3.
3. TCR
[0294] En algunos casos, se proporcionan células de ingeniería, como células T, que expresan un receptor de células T (TCR) o una porción de unión a antígeno del mismo que reconoce un epítopo peptídico o epítopo de células T de un polipéptido diana, como un antígeno de una proteína tumoral, viral o autoinmune. En algunos aspectos, el TCR es o incluye un TCR recombinante.
[0295] En algunos casos, un "receptor de células T" o "TCR" es una molécula que contiene cadenas a y p variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente) o cadenas<y>y 6 variables (también conocidas como TCRa y TCRp, respectivamente), o porciones de unión a antígeno de las mismas, y que es capaz de unirse específicamente a un péptido unido a una molécula MHC. En algunos casos, el TCR se encuentra en la forma ap. Normalmente, los TCR que existen en las formas ap y<y>6 suelen ser estructuralmente similares, pero las células T que los expresan pueden tener ubicaciones anatómicas o funciones distintas. Un TCR puede encontrarse en la superficie de una célula o en forma soluble. Por lo general, un TCR se encuentra en la superficie de las células T (o células T), donde suele encargarse de reconocer antígenos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH).
[0296] A menos que se indique lo contrario, debe entenderse que el término "TCR" abarca los TCR completos, así como porciones de unión a antígeno o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. En algunos casos, el TCR es un TCR intacto o de longitud completa, incluidos los TCR en forma ap o y6. En algunos casos, el TCR es una porción de unión a antígeno que es menor que un TCR de longitud completa pero que se une a un péptido específico unido en una molécula MHC, como se une a un complejo MHC-péptido. En algunos casos, una porción o fragmento de unión a antígeno de un TCR puede contener sólo una parte de los dominios estructurales de un TCR completo o intacto, pero aun así es capaz de unirse al epítopo peptídico, como el complejo MHC-péptido, al que se une el TCR completo. En algunos casos, una porción de unión a antígeno contiene los dominios variables de un TCR, como la cadena a variable y la cadena p variable de un TCR, suficientes para formar un sitio de unión para unirse a un complejo MHC-péptido específico. Generalmente, las cadenas variables de un TCR contienen regiones determinantes de la complementariedad que intervienen en el reconocimiento del péptido, MHC y/o complejo MHC-péptido.
[0297] En algunos casos, los dominios variables del TCR contienen bucles hipervariables, o regiones determinantes de la complementariedad (CDR), que generalmente son los principales contribuyentes al reconocimiento del antígeno y a las capacidades y especificidad de unión. En algunos casos, una CDR de un t Cr o una combinación de las mismas formas todo o sustancialmente todo el sitio de unión al antígeno de una molécula de TCR dada. Las distintas CDRs dentro de una región variable de una cadena TCR generalmente están separadas por regiones marco (FRs), que generalmente muestran menos variabilidad entre las moléculas TCR en comparación con las CDRs (véase,por ej.,Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; véase también Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). En algunos casos, la CDR3 es la principal CDR responsable de la unión al antígeno o de la especificidad, o es la más importante entre las tres CDR de una región variable del TCR dada para el reconocimiento del antígeno, y/o para la interacción con la porción peptídica procesada del complejo péptido-MHC. En algunos contextos, la CDR1 de la cadena alfa puede interactuar con la parte N-terminal de ciertos péptidos antigénicos. En algunos contextos, la CDR1 de la cadena beta puede interactuar con la parte C-terminal del péptido. En algunos contextos, la CDR2 contribuye en mayor medida o es la CDR principal responsable de la interacción o el reconocimiento de la porción MHC del complejo MHC-péptido. En algunos casos, la región variable de la cadena p puede contener otra región hipervariable (CDR4 o HVR4), que generalmente participa en la unión del superantígeno y no en el reconocimiento del antígeno (Kotb (l995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
[0298] En algunos casos, un TCR también puede contener un dominio constante, un dominio transmembrana y/o una cola citoplasmática corta (véase,por ej.,Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3a edición, Current Biology Publications, p. 4:33, 1997). En algunos aspectos, cada cadena del TCR puede poseer un dominio variable de inmunoglobulina N-terminal, un dominio constante de inmunoglobulina, una región transmembrana y una cola citoplasmática corta en el extremo C-terminal. En algunos casos, un TCR se asocia con proteínas invariantes del complejo CD3 implicadas en la mediación de la transducción de señales.
[0299] En algunos casos, una cadena TCR contiene uno o más dominios constantes. Por ejemplo, la porción extracelular de una cadena TCR dada(por ej.,cadena a o cadena p) puede contener dos dominios similares a inmunoglobulinas, como un dominio variable(porej.,Va o Vp; normalmente aminoácidos 1 a 116 basados en la numeración de Kabat Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5a ed.) y un dominio constante(por ej.,dominio constante de cadena a o Ca, típicamente posiciones 117 a 259 de la cadena según la numeración de Kabat o dominio constante de cadena p o Cp, típicamente posiciones 117 a 295 de la cadena según Kabat) adyacente a la membrana celular. Por ejemplo, en algunos casos, la porción extracelular del TCR formada por las dos cadenas contiene dos dominios constantes proximales de membrana y dos dominios variables distales de membrana, cada uno de los cuales contiene CDR. El dominio constante del TCR puede contener secuencias de conexión cortas en las que un residuo de cisteína forma un enlace disulfuro, uniendo así las dos cadenas del TCR. En algunos casos, un TCR puede tener un residuo de cisteína adicional en cada una de las cadenas a y p, de modo que el TCR contiene dos enlaces disulfuro en los dominios constantes.
[0300] En algunos casos, las cadenas TCR contienen un dominio transmembrana. En algunos casos, el dominio transmembrana está cargado positivamente. En algunos casos, la cadena del TCR contiene una cola citoplasmática. En algunos casos, la estructura permite que el TCR se asocie con otras moléculas como CD3 y sus subunidades. Por ejemplo, un TCR que contenga dominios constantes con una región transmembrana puede anclar la proteína en la membrana celular y asociarse con subunidades invariantes del aparato o complejo de señalización CD3. Las colas intracelulares de las subunidades de señalización CD3(por ej.cadenas CD3<y>,<c>D36, CD3<e>y CD3Z) contienen uno o más motivos de activación basados en tirosinas inmunorreceptoras o ITAM que intervienen en la capacidad de señalización del complejo TCR.
[0301] En algunos casos, el TCR puede ser un heterodímero de dos cadenas a y p (u opcionalmente<y>y 6) o puede ser una construcción de TCR de cadena única. En algunos casos, el TCR es un heterodímero que contiene dos cadenas separadas (cadenas a y p o cadenas y y 6) que están unidas, por ejemplo, por un enlace disulfuro o enlaces disulfuro.
[0302] En algunos casos, el TCR puede generarse a partir de una(s) secuencia(s) de TCR conocida(s), como secuencias de cadenas Va,p, para las que se dispone fácilmente de una secuencia de codificación de longitud sustancialmente completa. Los métodos para obtener secuencias de TCR de longitud completa, incluidas las secuencias de la cadena V, a partir de fuentes celulares son bien conocidos. En algunos casos, los ácidos nucleicos que codifican el TCR pueden obtenerse de diversas fuentes, como por amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de ácidos nucleicos que codifican el TCR dentro de una célula o células determinadas o aislados de ellas, o síntesis de secuencias de ADN del TCR disponibles públicamente.
[0303] En algunos casos, los receptores recombinantes incluyen TCR recombinantes y/o TCR clonados a partir de células T naturales. En algunos casos, se identifica un clon de células T de alta afinidad para un antígeno diana (por ejemplo, un antígeno canceroso), se aísla de un paciente y se introduce en las células. En algunos casos, el clon de TCR para un antígeno diana se ha generado en ratones transgénicos modificados genéticamente con genes del sistema inmunitario humano (por ejemplo, el sistema de antígenos leucocitarios humanos, o HLA). Véanse, por ejemplo, los antígenos tumorales (véase, por ejemplo, Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180 y Cohen et al. (2005) J Immunol.
175:5799-5808. En algunos casos, se utiliza la visualización de fagos para aislar los TCR contra un antígeno diana (véase, por ejemplo, Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395 y Li (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354.
[0304] En algunos casos, el TCR se obtiene de una fuente biológica, como por ejemplo de células como de una célulaT(por ejemplo,célula T citotóxica), hibridomas de células T u otra fuente disponible públicamente. En algunos casos, las células T pueden obtenerse a partir de células aisladasin vivo.En algunos casos, el TCR es un TCR seleccionado tímicamente. En algunos casos, el TCR es un TCR restringido a neoepítopos. En algunos casos, las células T pueden ser un hibridoma o clon de células T cultivadas. En algunos casos, el TCR o la porción de unión a antígeno del mismo puede generarse sintéticamente a partir del conocimiento de la secuencia del TCR.
[0305] En algunos casos, el TCR se genera a partir de un TCR identificado o seleccionado a partir del cribado de una biblioteca de TCR candidatos contra un antígeno polipéptido diana, o un epítopo de células T diana del mismo. Las bibliotecas de TCR pueden generarse por amplificación del repertorio de Va y Vp de células T aisladas de un sujeto, incluidas las células presentes en PBMC, bazo u otro órgano linfoide. En algunos casos, las células T pueden amplificarse a partir de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). En algunos casos, las bibliotecas de TCR pueden generarse a partir de células CD4+ o CD8+. En algunos casos, los TCR pueden amplificarse a partir de una fuente de células T de un sujeto normal o sano, esdecir,bibliotecas de TCR normales. En algunos casos, los TCR pueden amplificarse a partir de una fuente de células T de un sujeto enfermo,es decir,bibliotecas de TCR enfermos. En algunos casos, se utilizan cebadores degenerados para amplificar el repertorio génico de Va y Vp, por ejemplo, mediante RT-PCR en muestras, como células T, obtenidas de seres humanos. En algunos casos, las bibliotecas scTv pueden ensamblarse a partir de bibliotecas Va y Vp ingenuas en las que los productos amplificados se clonan o ensamblan para ser separados por un enlazador. Dependiendo del origen del sujeto y de las células, las bibliotecas pueden ser específicas para cada alelo HLA. Alternativamente, en algunos casos, las bibliotecas de TCR pueden generarse por mutagénesis o diversificación de una molécula de TCR madre o andamiaje. En algunos aspectos, los TCR se someten a evolución dirigida, como por mutagénesis,por ej.,de la cadena a o p. En algunos aspectos, se alteran residuos particulares dentro de las CDR del TCR. En algunos casos, los TCR seleccionados pueden modificarse mediante maduración por afinidad. En algunos casos, pueden seleccionarse células T antígeno-específicas, por ejemplo, mediante cribado para evaluar la actividad CTL contra el péptido. En algunos aspectos, los TCR,por ej.,presentes en las células T específicas de antígeno, pueden seleccionarse, como por actividad de unión,por ej.,afinidad o avidez particular por el antígeno.
[0306] En algunos casos, el TCR o la porción de unión a antígeno del mismo es uno que ha sido modificado o manipulado. En algunos casos, se utilizan métodos de evolución dirigida para generar TCR con propiedades alteradas, por ejemplo, con mayor afinidad por un complejo específico MHC-péptido. En algunos casos, la evolución dirigida se consigue mediante métodos de visualización que incluyen, entre otros, la visualización en levaduras (Holler et al., (2003) Nat Immunol, 4, 55 62; Holler et al., (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92), visualización en fagos (Li et al., (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), o visualización en células T (Chervin et al., (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84). En algunos casos, los enfoques de visualización implican la ingeniería, o modificación, de un TCR conocido, parental o de referencia. Por ejemplo, en algunos casos, se puede utilizar un TCR de tipo salvaje como plantilla para producir TCR mutagenizados en los que se mutan uno o más residuos de las CDR, y se seleccionan mutantes con una propiedad alterada deseada, como una mayor afinidad por un antígeno diana deseado.
[0307] En algunos casos, los péptidos de un polipéptido diana para su uso en la producción o generación de un TCR de interés son conocidos o pueden ser fácilmente identificados como una cuestión de rutina. En algunos casos, los péptidos adecuados para su uso en la generación de TCR o porciones de unión a antígeno pueden determinarse basándose en la presencia de un motivo restringido por HLA en un polipéptido diana de interés, como un polipéptido diana descrito a continuación. En algunos casos, los péptidos se identifican mediante modelos informáticos de predicción de forma rutinaria. En algunos casos, para predecir los sitios de unión del CMH de clase I, dichos modelos incluyen, entre otros, ProPred1 (Singh y Raghava (2001) Bioinformatics 17(12): 1236-1237, y SYFPEITHI (véase Schuler et al., (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-932007). En algunos casos, el epítopo restringido al CMH es HLA-A0201, que se expresa en aproximadamente el 39-46% de todos los caucásicos y, por lo tanto, representa una elección adecuada de antígeno CMH para su uso en la preparación de un TCR u otra molécula de unión a péptidos CMH.
[0308] Se conocen los motivos de unión de HLA-A0201 y los sitios de escisión de proteasomas e inmunoproteasomas mediante modelos informáticos de predicción. Para predecir los sitios de unión del MHC de clase I, dichos modelos incluyen, entre otros, ProPred1 (descrito con más detalle en Singh y Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMÁTICA 17(12): 1236-1237 2001), y SYFPEITHI (véase Schuler et al., SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-932007)
[0309] En algunos casos, el TCR o la porción de unión a antígeno del mismo puede ser una proteína natural producida recombinantemente o una forma mutada de la misma en la que se ha alterado una o más propiedades, como la característica de unión. En algunos casos, un TCR puede derivarse de una de varias especies animales, como el ser humano, el ratón, la rata u otro mamífero. Un TCR puede estar unido a la célula o en forma soluble. En algunos casos, para los fines de los métodos divulgados, el TCR está en forma unida a la célula expresada en la superficie de una célula.
[0310] En algunos casos, el TCR es un TCR de longitud completa. En algunos casos, el TCR es una porción de unión a antígeno. En algunos casos, el TCR es un TCR dimérico (dTCR). En algunos casos, el TCR es un TCR de cadena única (sc-TCR). En algunos casos, un dTCR o un scTCR tienen las estructuras descritas en WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186.
[0311] En algunos casos, el TCR contiene una secuencia correspondiente a la secuencia transmembrana. En algunos casos, el TCR contiene una secuencia correspondiente a secuencias citoplasmáticas. En algunos casos, el TCR es capaz de formar un complejo TCR con CD3. En algunos casos, cualquiera de los TCR, incluido un dTCR o un scTCR, puede unirse a dominios de señalización que producen un TCR activo en la superficie de una célula T. En algunos casos, el TCR se expresa en la superficie de las células.
[0312] En algunos casos, un dTCR contiene un primer polipéptido en el que una secuencia correspondiente a una secuencia de región variable de cadena a del TCR se fusiona con el extremo N de una secuencia correspondiente a una secuencia extracelular de región constante de cadena a del TCR, y un segundo polipéptido en el que una secuencia correspondiente a una secuencia de región variable de cadena p del TCR se fusiona con el extremo N de una secuencia correspondiente a una secuencia extracelular de región constante de cadena p del TCR, estando el primer y segundo polipéptidos unidos por un enlace disulfuro. En algunos casos, el enlace puede corresponder al enlace disulfuro nativo entre cadenas presente en los TCR ap diméricos nativos. En algunos casos, los enlaces disulfuro entre cadenas no están presentes en un TCR nativo. Por ejemplo, en algunos casos, pueden incorporarse una o más cisteínas en las secuencias extracelulares de región constante del par de polipéptidos dTCR. En algunos casos, puede ser deseable tanto un enlace disulfuro nativo como uno no nativo. En algunos casos, el TCR contiene una secuencia transmembrana para anclarse a la membrana.
[0313] En algunos casos, un dTCR contiene una cadena TCR a que comprende un dominio a variable, un dominio a constante y un primer motivo de dimerización unido al C-terminal del dominio a constante, y una cadena TCR p que comprende un dominio p variable, un dominio p constante y un primer motivo de dimerización unido al C-terminal del dominio p constante, en el que el primer y segundo motivos de dimerización interactúan fácilmente para formar un enlace covalente entre un aminoácido en el primer motivo de dimerización y un aminoácido en el segundo motivo de dimerización que une la cadena TCR a y la cadena TCR p.
[0314] En algunos casos, el TCR es un scTCR. Típicamente, un scTCR puede generarse utilizando métodos adecuados conocidos, Véasepor ej.,Soo Hoo, W. F. et al., PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wülfing, C. y Plückthun, A., J. Mol. Biol.
242, 655 (1994); Kurucz, I. et al., PNAS (USA) 90 3830 (1993); PCT internacional publicado N°. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186 ; y Schlueter, C. J. et al., J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). En algunos casos, un scTCR contiene un enlace disulfuro entre cadenas no nativo introducido para facilitar la asociación de las cadenas del TCR (véase, por ejemplo, el PCT internacional publicado n° WO 03/020763). En algunos casos, un scTCR es un TCR truncado no unido a disulfuro en el que cremalleras de leucina heterólogas fusionadas a los terminales C del mismo facilitan la asociación de cadenas (véase,por ej.PCT internacional publicado n° WO99/60120). En algunos casos, un scTCR contiene un dominio variable TCRa unido covalentemente a un dominio variable TCRp mediante un enlazador peptídico (véase,por ej.,el PCT internacional publicado N° WO99/18129).
[0315] En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una región variable de cadena a del TCR, un segundo segmento constituido por una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia de región variable de cadena p del TCR fusionada al extremo N de una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia extracelular de dominio constante de cadena p del TCR, y una secuencia enlazadora que une el extremo C del primer segmento al extremo N del segundo segmento.
[0316] En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena a fusionada al extremo N de una secuencia de dominio constante extracelular de cadena a, y un segundo segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena p fusionada al extremo N de una secuencia constante extracelular de cadena p y secuencia transmembrana, y, opcionalmente, una secuencia enlazadora que une el extremo C del primer segmento al extremo N del segundo segmento.
[0317] En algunos casos, un scTCR contiene un primer segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena p de TCR fusionada al extremo N de una secuencia de dominio constante extracelular de cadena p, y un segundo segmento constituido por una secuencia de región variable de cadena a fusionada al extremo N de una secuencia constante extracelular de cadena a y secuencia transmembrana, y, opcionalmente, una secuencia enlazadora que une el extremo C del primer segmento al extremo N del segundo segmento.
[0318] En algunos casos, el enlazador de un scTCRs que une los segmentos primero y segundo del TCR puede ser cualquier enlazador capaz de formar una sola cadena polipeptídica, conservando la especificidad de unión al TCR. En algunos casos, la secuencia enlazadora puede, por ejemplo, tener la fórmula - P-AA-P- en la que P es prolina y AA representa una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos son glicina y serina. En algunos casos, los segmentos primero y segundo están emparejados de modo que las secuencias de región variable de los mismos están orientadas para dicha unión. Por lo tanto, en algunos casos, el enlazador tiene una longitud suficiente para abarcar la distancia entre el extremo C del primer segmento y el extremo N del segundo segmento, o viceversa, pero no es demasiado largo para bloquear o reducir la unión del scTCR al ligando diana. En algunos casos, el enlazador puede contener de o aproximadamente de 10 a 45 aminoácidos, como de 10 a 30 aminoácidos o de 26 a 41 residuos de aminoácidos, por ejemplo 29, 30, 31 o 32 aminoácidos. En algunos casos, el enlazador tiene la fórmula -PGGG-(SGGGG)5-P- donde P es prolina, G es glicina y S es serina (SEQ ID N°: 16). En algunos casos, el enlazador tiene la secuencia GSADDAKKKDAAKKDGKS (SEQ ID N°: 17)
[0319] En algunos casos, el scTCR contiene un enlace disulfuro covalente que une un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena a a un residuo de la región de inmunoglobulina del dominio constante de la cadena p. En algunos casos, el enlace disulfuro entre cadenas en un TCR nativo no está presente. Por ejemplo, en algunos casos, pueden incorporarse una o más cisteínas en las secuencias extracelulares de región constante de los segmentos primero y segundo del polipéptido scTCR. En algunos casos, puede ser deseable tanto un enlace disulfuro nativo como uno no nativo.
[0320] En algunos casos de un dTCR o scTCR que contiene enlaces disulfuro entre cadenas introducidos, los enlaces disulfuro nativos no están presentes. En algunos casos, una o más de las cisteínas nativas que forman un enlace disulfuro nativo entre cadenas se sustituyen por otro residuo, como una serina o una alanina. En algunos casos, puede formarse un enlace disulfuro introducido mutando residuos no cisteína en los segmentos primero y segundo a cisteína. Los enlaces disulfuro no nativos ejemplares de un TCR se describen en el PCT internacional publicado n° W02006/000830.
[0321] En algunos casos, el TCR o fragmento de unión a antígeno del mismo exhibe una afinidad con una constante de unión de equilibrio para un antígeno diana de entre o entre aproximadamente 10'5 y 10'12 M y todos los valores individuales y intervalos de los mismos. En algunos casos, el antígeno diana es un complejo MHC-péptido o ligando.
[0322] En algunos casos, el ácido nucleico o los ácidos nucleicos que codifican un TCR, como las cadenas a y p, pueden amplificarse por PCR, clonación u otros medios adecuados y clonarse en un vector o vectores de expresión adecuados. El vector de expresión puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede utilizarse para transformar o transfectar cualquier huésped adecuado. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión o ambas, como los plásmidos y los virus.
[0323] En algunos casos, el vector puede ser un vector de la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, La Jolla, Calif.), la serie pET (Novagen, Madison, Wis.), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia), o la serie pEX (Clontech, Palo Alto, Calif.). En algunos casos, también pueden utilizarse vectores bacteriófagos, como AG10, AGT11, AZaplI (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. En algunos casos, pueden utilizarse vectores de expresión vegetal, como pBl01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). En algunos casos, los vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). En algunos casos, se utiliza un vector viral, como un vector retroviral.
[0324] En algunos casos, los vectores de expresión recombinantes pueden prepararse utilizando técnicas estándar de ADN recombinante. En algunos casos, los vectores pueden contener secuencias reguladoras, como codones de iniciación y terminación de la transcripción y la traducción, que son específicas del tipo de huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, según proceda y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN. En algunos casos, el vector puede contener un promotor no nativo operativamente unido a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR o la porción de unión a antígeno (u otra molécula de unión a péptido MHC). En algunos casos, el promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, como un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor que se encuentra en la repetición largo-terminal del virus de células madre murino. También se contemplan otros promotores conocidos.
[0325] En algunos casos, para generar un vector que codifica un TCR, las cadenas a y p se amplifican por PCR a partir de ADNc total aislado de un clon de células T que expresa el TCR de interés y se clonan en un vector de expresión. En algunos casos, las cadenas a y p se clonan en el mismo vector. En algunos casos, las cadenas a y p se clonan en vectores diferentes. En algunos casos, las cadenas a y p generadas se incorporan a un vector retroviral,por ej.,lentiviral.
4. Multi-marcación
[0326] En algunos casos, las células y los métodos incluyen estrategias multi-marcación, como la expresión de dos o más receptores modificados genéticamente en la célula, cada uno de los cuales reconoce el mismo antígeno o un antígeno diferente y, por lo general, cada uno de ellos incluye un componente de señalización intracelular diferente. Estas estrategias multi-marcación se describen, por ejemplo, en la Pub. PCT No. WO 2014055668 A1 (describe combinaciones de CARs activadoras y costimuladoras,por ej.,marcación de dos antígenos diferentes presentes individualmente en células no diana,por ej.,normales, pero presentes conjuntamente sólo en células de la enfermedad o afección a tratar) y Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013) (describe células que expresan un CAR activador y otro inhibidor, como aquellas en las que el CAR activador se une a un antígeno expresado tanto en células normales o no enfermas como en células de la enfermedad o afección que se desea tratar, y el CAR inhibidor se une a otro antígeno expresado solo en las células normales o en las células que no se desea tratar).
[0327] Por ejemplo, en algunos casos, las células incluyen un receptor que expresa un primer receptor de antígeno modificado genéticamente(por ej.,CAR o TCR) que es capaz de inducir una señal activadora a la célula, generalmente tras la unión específica al antígeno reconocido por el primer receptor,por ej.,el primer antígeno. En algunos casos, la célula incluye además un segundo receptor de antígeno modificado genéticamente(por ej.,CAR o TCR),por ej.,un receptor costimulador quimérico, que es capaz de inducir una señal costimuladora a la célula inmunitaria, generalmente tras la unión específica a un segundo antígeno reconocido por el segundo receptor. En algunos casos, el primer antígeno y el segundo antígeno son el mismo. En algunos casos, el primer antígeno y el segundo antígeno son diferentes.
[0328] En algunos casos, el primer y/o segundo receptor de antígeno modificado genéticamente(por ej.CAR o TCR) es capaz de inducir una señal activadora a la célula. En algunos casos, el receptor incluye un componente de señalización intracelular que contiene ITAM o motivos similares a ITAM. En algunos casos, la activación inducida por el primer receptor implica una transducción de señales o un cambio en la expresión de proteínas en la célula que da lugar a la iniciación de una respuesta inmunitaria, como la fosforilación de ITAM y/o la iniciación de la cascada de transducción de señales mediada por ITAM, la formación de una sinapsis inmunológica y/o la agrupación de moléculas cerca del receptor unido(porejemplo.CD4 o CD8, etc.), activación de uno o más factores de transcripción, como NF-kB y/o AP-1, y/o inducción de la expresión génica de factores como citoquinas, proliferación y/o supervivencia.
[0329] En algunos casos, el primer y/o segundo receptor incluye dominios de señalización intracelular de receptores costimuladores tales como c D28, CD137 (4-1 BB), OX40, y/o ICOS. En algunos casos, el primer y el segundo receptor incluyen un dominio de señalización intracelular de un receptor costimulador que son diferentes. En un caso, el primer receptor contiene una región de señalización coestimuladora CD28 y el segundo receptor contiene una región de señalización coestimuladora 4-1BB o viceversa.
[0330] En algunos casos, el primer y/o segundo receptor incluye tanto un dominio de señalización intracelular que contiene motivos ITAM o similares a ITAM como un dominio de señalización intracelular de un receptor coestimulador.
[0331] En algunos casos, el primer receptor contiene un dominio de señalización intracelular que contiene motivos ITAM o similares a ITAM y el segundo receptor contiene un dominio de señalización intracelular de un receptor costimulador. La señal costimuladora en combinación con la señal activadora inducida en la misma célula es la que da lugar a una respuesta inmunitaria, como una respuesta inmunitaria robusta y sostenida, como el aumento de la expresión génica, la secreción de citoquinas y otros factores, y funciones efectoras mediadas por células T, como la destrucción celular.
[0332] En algunos casos, ni la ligadura del primer receptor solo ni la ligadura del segundo receptor solo inducen una respuesta inmune robusta. En algunos aspectos, si sólo se liga un receptor, la célula se tolera o no responde al antígeno, o se inhibe, y/o no es inducida a proliferar o secretar factores o llevar a cabo funciones efectoras. En algunos de estos casos, sin embargo, cuando la pluralidad de receptores se ligan, por ejemplo al encontrarse con una célula que expresa el primer y segundo antígenos, se consigue una respuesta deseada, como la activación o estimulación inmunitaria completa, por ejemplo, como indica la secreción de una o más citocinas, la proliferación, la persistencia y/o la realización de una función efectora inmunitaria como la destrucción citotóxica de una célula diana.
[0333] En algunos casos, las células que expresan el receptor recombinante incluyen además CARs inhibitorios (iCAR, ver Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013), como un CAR que reconoce un antígeno distinto del asociado y/o específico de la enfermedad o afección, mediante el cual una señal activadora emitida a través del CAR de marcación de la enfermedad se ve disminuida o inhibida por la unión del CAR inhibidor a su ligando,por ej.,para reducir los efectos fuera de diana.
[0334] En algunos casos, los dos receptores inducen, respectivamente, una señal activadora y una señal inhibidora a la célula, de tal manera que la unión de uno de los receptores a su antígeno activa la célula o induce una respuesta, pero la unión del segundo receptor inhibidor a su antígeno induce una señal que suprime o amortigua esa respuesta. Algunos ejemplos son las combinaciones de CAR activadoras y CAR inhibidoras o iCAR. Dicha estrategia puede utilizarse, por ejemplo, en la que el CAR activador se une a un antígeno expresado en una enfermedad o afección pero que también se expresa en células normales, y el receptor inhibidor se une a un antígeno distinto que se expresa en las células normales pero no en las células de la enfermedad o afección.
[0335] En algunos aspectos, el receptor quimérico es o incluye un CAR inhibitorio (por ej. iCAR) e incluye componentes intracelulares que amortiguan o suprimen una respuesta inmunitaria, como una respuesta promovida por ITAM y/o coestimulador en la célula. Ejemplos de tales componentes de señalización intracelular son los que se encuentran en las moléculas de punto de control inmunitario, incluyendo PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, receptores de PGE2, receptores de adenosina EP2/4 incluyendo A2AR. En algunos aspectos, la célula manipulada incluye un CAR inhibidor que incluye un dominio de señalización de o derivado de dicha molécula inhibidora, de tal manera que sirve para amortiguar la respuesta de la célula, por ejemplo, la inducida por un CAR activador y/o coestimulador.
[0336] En algunos casos, la estrategia multi-marcación se emplea cuando un antígeno asociado con una enfermedad o condición particular se expresa en una célula no enferma y/o se expresa en la propia célula manipulada, ya sea transitoriamente(porej.,al ser estimulada en asociación con la ingeniería genética) o permanentemente. En tales casos, al requerir la ligadura de dos receptores de antígenos separados e individualmente específicos, puede mejorarse la especificidad, selectividad y/o eficacia.
[0337] En algunos casos, la pluralidad de antígenos,por ej.,el primer y segundo antígenos, se expresan en la célula, tejido, o enfermedad o condición a la que se apunta, tal como en la célula cancerosa. En algunos aspectos, la célula, tejido, enfermedad o afección es mieloma múltiple o una célula de mieloma múltiple. En algunos casos, uno o más de la pluralidad de antígenos generalmente también se expresa en una célula a la que no se desea dirigir la terapia celular, como una célula o tejido normal o no enfermo, y/o las propias células manipuladas. En tales casos, al requerir la ligadura de múltiples receptores para lograr una respuesta de la célula, se consigue especificidad y/o eficacia.
B. CÉLULAS Y PREPARACIÓN DE CÉLULAS PARA INGENIERÍA GENÉTICA
[0338] Entre las células que expresan los receptores y que se administran mediante los métodos divulgados se encuentran las células de ingeniería. La ingeniería genética generalmente implica la introducción de un ácido nucleico que codifica el componente recombinante o modificado en una composición que contiene las células, como por transducción retroviral, transfección o transformación.
[0339] En algunos casos, los ácidos nucleicos son heterólogos,es decir,normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como una obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo, no se encuentra ordinariamente en la célula que está siendo manipulada y/o un organismo del que deriva dicha célula. En algunos casos, los ácidos nucleicos no son de origen natural, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.
[0340] Las células generalmente son células eucariotas, tales como células de mamíferos, y típicamente son células humanas. En algunos casos, las células se derivan de la sangre, médula ósea, linfa u órganos linfoides, son células del sistema inmunitario, como células de la inmunidad innata o adaptativa,por ej.,células mieloides o linfoides, incluidos linfocitos, típicamente células T y/o células NK. Otras células ejemplares son las células madre, como las células madre multipotentes y pluripotentes, incluidas las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Las células suelen ser células primarias, como las aisladas directamente de un sujeto y/o aisladas de un sujeto y congeladas. En algunos casos, las células incluyen uno o más subconjuntos de células T u otros tipos de células, como poblaciones de células T completas, células CD4+, células CD8+ y subpoblaciones de las mismas, como las definidas por función, estado de activación, madurez, potencial de diferenciación, expansión, recirculación, localización y/o capacidades de persistencia, especificidad de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presencia en un órgano o compartimento particular, perfil de secreción de marcadores o citocinas y/o grado de diferenciación. Con referencia al sujeto a tratar, las células pueden ser alogénicas y/o autólogas. Entre los métodos se encuentran los disponibles en el mercado. En algunos aspectos, como en el caso de las tecnologías disponibles, las células son pluripotentes y/o multipotentes, como las células madre, por ejemplo las células madre pluripotentes inducidas (iPSC). En algunos casos, los métodos incluyen aislar células del sujeto, prepararlas, procesarlas, cultivarlas y/o diseñarlas, y reintroducirlas en el mismo sujeto, antes o después de la crioconservación.
[0341] Entre los subtipos y subpoblaciones de células T y/o de células T CD4+ y/o CD8+ se encuentran los células T ingenuos (Tn), los células T efectores (Teff), los células T de memoria y sus subtipos, como los células T de memoria de células madre (T<scm>), los células T de memoria central (T<cm>), los células T efectores de memoria (T<em>) o los células T efectores de memoria diferenciados terminalmente, los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células T inmaduros, células T maduros, células T auxiliares, células T citotóxicos, células T invariantes asociados a mucosas (MAIT), células T reguladores (Treg) naturales y adaptativos, células T auxiliares, como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T alfa/beta y células T delta/gamma.
[0342] En algunos casos, las células son células asesinas naturales (NK). En algunos casos, las células son monocitos o granulocitos,por ej.,células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos y/o basófilos.
[0343] En algunos casos, las células incluyen uno o más ácidos nucleicos introducidos mediante ingeniería genética, y por lo tanto expresan productos recombinantes o de ingeniería genética de dichos ácidos nucleicos. En algunos casos, los ácidos nucleicos son heterólogos,es decir,normalmente no están presentes en una célula o muestra obtenida de la célula, como una obtenida de otro organismo o célula, que por ejemplo, no se encuentra normalmente en la célula que se está modificando y/o en un organismo del que deriva dicha célula. En algunos casos, los ácidos nucleicos no son de origen natural, como un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, incluyendo uno que comprende combinaciones quiméricas de ácidos nucleicos que codifican varios dominios de múltiples tipos de células diferentes.
[0344] En algunos casos, la preparación de las células de ingeniería incluye uno o más pasos de cultivo y/o preparación. Las células para la introducción del ácido nucleico que codifica el receptor transgénico, como el CAR, pueden aislarse de una muestra, como una muestra biológica,por ej.,una obtenida de o derivada de un sujeto. En algunos casos, el sujeto del que se aísla la célula es uno que padece la enfermedad o afección o que necesita una terapia celular o al que se le administrará la terapia celular. En algunos casos, el sujeto es un ser humano que necesita una intervención terapéutica concreta, como la terapia celular adoptiva para la que se aíslan, procesan y/o manipulan las células.
[0345] En consecuencia, las células en algunos casos son células primarias,por ej.,células humanas primarias. Las muestras incluyen tejidos, fluidos y otras muestras tomadas directamente del sujeto, así como muestras resultantes de uno o más pasos de procesamiento, como separación, centrifugación, ingeniería genética(porej.,transducción con vector viral), lavado y/o incubación. La muestra biológica puede ser una muestra obtenida directamente de una fuente biológica o una muestra procesada. Las muestras biológicas incluyen, entre otras, fluidos corporales como sangre, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina y sudor, muestras de tejidos y órganos, incluidas las muestras procesadas derivadas de los mismos.
[0346] En algunos aspectos, la muestra de la que se derivan o aíslan las células es sangre o una muestra derivada de sangre, o es o se deriva de un producto de aféresis o leucaféresis. Entre las muestras ejemplares se incluyen sangre total, células mononucleares de sangre periférica (PBMC), leucocitos, médula ósea, timo, biopsia de tejido, tumor, leucemia, linfoma, ganglio linfático, tejido linfoide asociado a intestino, tejido linfoide asociado a mucosa, bazo, otros tejidos linfoides, hígado, pulmón, estómago, intestino, colon, riñón, páncreas, mama, hueso, próstata, cuello uterino, testículos, ovarios, amígdala u otro órgano, y/o células derivadas de los mismos. Las muestras incluyen, en el contexto de la terapia celular,por ej.,la terapia celular adoptiva, muestras de fuentes autólogas y alogénicas.
[0347] En algunos casos, las células se derivan de líneas celulares,por ej.,líneas de células T. En algunos casos, las células se obtienen de una fuente xenogénica, por ejemplo, de ratón, rata, primate no humano y cerdo.
[0348] En algunos casos, el aislamiento de las células incluye uno o más pasos de preparación y/o separación celular no basada en afinidad. En algunos ejemplos, las células se lavan, centrifugan y/o incuban en presencia de uno o más reactivos, por ejemplo, para eliminar componentes no deseados, enriquecer para componentes deseados, lisar o eliminar células sensibles a determinados reactivos. En algunos ejemplos, las células se separan en función de una o más propiedades, como la densidad, las propiedades adherentes, el tamaño, la sensibilidad y/o la resistencia a determinados componentes.
[0349] En algunos ejemplos, se obtienen células de la sangre circulante de un sujeto,por ej.,por aféresis o leucaféresis. Las muestras, en algunos aspectos, contienen linfocitos, incluyendo células T, monocitos, granulocitos, células B, otros glóbulos blancos nucleados, glóbulos rojos y/o plaquetas, y en algunos aspectos contienen células distintas de los glóbulos rojos y las plaquetas.
[0350] En algunos casos, las células sanguíneas recogidas del sujeto se lavan,por ej.,para eliminar la fracción de plasma y colocar las células en un tampón o medio apropiado para los pasos de procesamiento posteriores. En algunos casos, las células se lavan con solución salina tamponada con fosfato (PBS). En algunos casos, la solución de lavado carece de calcio y/o magnesio y/o muchos o todos los cationes divalentes. En algunos aspectos, el paso de lavado se realiza en una centrifugadora semiautomática de "flujo continuo" (por ejemplo, el procesador celular Cobe 2991, Baxter) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos aspectos, la etapa de lavado se realiza mediante filtración de flujo tangencial (TFF) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En algunos casos, las células se resuspenden en una variedad de tampones biocompatibles después del lavado, como, por ejemplo, PBS sin Ca++/Mg++. En algunos casos, los componentes de una muestra de células sanguíneas se eliminan y las células se resuspenden directamente en medios de cultivo.
[0351] En algunos casos, los métodos incluyen métodos de separación celular basados en la densidad, como la preparación de glóbulos blancos a partir de sangre periférica lisando los glóbulos rojos y centrifugando a través de un gradiente Percoll o Ficoll.
[0352] En algunos casos, los métodos de aislamiento incluyen la separación de diferentes tipos celulares basados en la expresión o presencia en la célula de una o más moléculas específicas, tales como marcadores de superficie,por ej.,proteínas de superficie, marcadores intracelulares, o ácido nucleico. En algunos casos, puede utilizarse cualquier método conocido de separación basado en dichos marcadores. En algunos casos, la separación se basa en la afinidad o inmunoafinidad. Por ejemplo, el aislamiento en algunos aspectos incluye la separación de células y poblaciones celulares basada en la expresión de las células o el nivel de expresión de uno o más marcadores, típicamente marcadores de superficie celular, por ejemplo, por incubación con un anticuerpo o compañero de unión que se une específicamente a tales marcadores, seguido generalmente por pasos de lavado y separación de las células que se han unido al anticuerpo o compañero de unión, de aquellas células que no se han unido al anticuerpo o compañero de unión.
[0353] Tales pasos de separación pueden basarse en la selección positiva, en la que las células que se han unido a los reactivos se retienen para su uso posterior, y/o en la selección negativa, en la que se retienen las células que no se han unido al anticuerpo o al compañero de unión. En algunos ejemplos, ambas fracciones se conservan para su uso posterior. En algunos aspectos, la selección negativa puede ser particularmente útil cuando no se dispone de ningún anticuerpo que identifique específicamente un tipo de célula en una población heterogénea, de manera que la separación se realiza mejor basándose en marcadores expresados por células distintas de la población deseada.
[0354] No es necesario que la separación resulte en un enriquecimiento o eliminación del 100% de una población celular particular o de células que expresen un marcador particular. Por ejemplo, la selección positiva o el enriquecimiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere al aumento del número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar lugar a una ausencia total de células que no expresen el marcador. Del mismo modo, la selección negativa, eliminación o agotamiento de células de un tipo particular, como las que expresan un marcador, se refiere a la disminución del número o porcentaje de dichas células, pero no tiene por qué dar lugar a una eliminación completa de todas ellas.
[0355] En algunos ejemplos, se llevan a cabo múltiples rondas de pasos de separación, donde la fracción seleccionada positiva o negativamente de un paso se somete a otro paso de separación, tal como una selección positiva o negativa posterior. En algunos ejemplos, un único paso de separación puede agotar las células que expresan múltiples marcadores simultáneamente, por ejemplo incubando las células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión, cada uno de ellos específico para un marcador objeto de selección negativa. Del mismo modo, se pueden seleccionar positivamente múltiples tipos celulares de forma simultánea incubando las células con una pluralidad de anticuerpos o compañeros de unión expresados en los distintos tipos celulares.
[0356] Por ejemplo, en algunos aspectos, subpoblaciones específicas de células T, tales como células positivas o que expresan altos niveles de uno o más marcadores de superficie,por ej.,células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, c D4+, CD8+, CD45RA+, y/o CD45RO+, se aíslan mediante técnicas de selección positiva o negativa.
[0357] Por ejemplo, las células T CD3+, CD28+ pueden seleccionarse positivamente utilizando esferas magnéticas conjugadas anti-CD3/anti-CD28(porej.,DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).
[0358] En algunos casos, el aislamiento se lleva a cabo por enriquecimiento para una población celular particular por selección positiva, o agotamiento de una población celular particular, por selección negativa. En algunos casos, la selección positiva o negativa se logra incubando las células con uno o más anticuerpos u otro agente de unión que se unen específicamente a uno o más marcadores de superficie expresados o expresados (marcador+) a un nivel relativamente más alto (marcadorhigh) en las células seleccionadas positiva o negativamente, respectivamente.
[0359] En algunos casos, las células T se separan de una muestra de PBMC por selección negativa de marcadores expresados en células no T, como células B, monocitos u otros glóbulos blancos, como CD14. En algunos aspectos, se utiliza un paso de selección CD4+ o CD8+ para separar las células T auxiliares CD4+ de las citotóxicas CD8+. Dichas poblaciones de CD4+ y CD8+ pueden clasificarse en subpoblaciones mediante selección positiva o negativa para marcadores expresados o expresados en un grado relativamente mayor en una o más subpoblaciones de células T ingenuas, de memoria y/o efectoras.
[0360] En algunos casos, las células CD8+ se enriquecen aún más para o se agotan de células madre ingenuas, de memoria central, de memoria efectoras y/o de memoria central, como por selección positiva o negativa basada en antígenos de superficie asociados con la subpoblación respectiva. En algunos casos, el enriquecimiento para células T de memoria central (mtc) se lleva a cabo para aumentar la eficacia, como para mejorar la supervivencia a largo plazo, la expansión y/o el injerto tras la administración, que en algunos aspectos es particularmente robusta en dichas subpoblaciones. See Terakura et al., Blood.1:72-82 (2012); Wang et al., J Immunother. 35(9):689-701 (2012). En algunos casos, la combinación de células T CD8+ enriquecidas con MTC y células T CD4+ mejora aún más la eficacia.
[0361] En algunos casos, las células T de memoria están presentes en los subconjuntos CD62L+ y CD62L- de los linfocitos CD8+ de la sangre periférica. Las PBMC pueden enriquecerse o eliminarse de las fracciones CD62L-CD8+ y/o CD62L+CD8+, por ejemplo utilizando anticuerpos anti-CD8 y anti-CD62L.
[0362] En algunos casos, el enriquecimiento para células T de memoria central (T<cm>) se basa en la expresión superficial positiva o alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, y/o CD 127; en algunos aspectos, se basa en la selección negativa para células que expresan o expresan altamente CD45RA y/o granzima B. En algunos aspectos, el aislamiento de una población CD8+ enriquecida para células T<cm>se lleva a cabo por agotamiento de células que expresan CD4, CD14, CD45RA, y selección positiva o enriquecimiento para células que expresan CD62L. En un aspecto, el enriquecimiento para células T de memoria central (Tcm) se lleva a cabo comenzando con una fracción negativa de células seleccionadas en base a la expresión de CD4, que se somete a una selección negativa en base a la expresión de CD14 y CD45RA, y a una selección positiva en base a CD62L. Tales selecciones en algunos aspectos se llevan a cabo simultáneamente y en otros aspectos se llevan a cabo secuencialmente, en cualquier orden. En algunos aspectos, el mismo paso de selección basado en la expresión de CD4 utilizado en la preparación de la población o subpoblación de células CD8+ también se utiliza para generar la población o subpoblación de células CD4+, de forma que tanto las fracciones positivas como las negativas de la separación basada en CD4 se conservan y utilizan en pasos posteriores de los métodos, opcionalmente tras uno o más pasos de selección positiva o negativa adicionales.
[0363] En un ejemplo particular, una muestra de PBMCs u otra muestra de glóbulos blancos se somete a selección de células CD4+, donde se retienen tanto las fracciones negativas como las positivas. A continuación, la fracción negativa se somete a una selección negativa basada en la expresión de CD14 y CD45RA o CD19, y a una selección positiva basada en un marcador característico de las células T de memoria central, como CD62L o CCR7, donde las selecciones positiva y negativa se llevan a cabo en cualquier orden.
[0364] Las células T auxiliares CD4+ se clasifican en ingenuas, de memoria central y efectoras mediante la identificación de poblaciones celulares que tienen antígenos de superficie celular. Los linfocitos CD4+ pueden obtenerse por métodos estándar. En algunos casos, los células T CD4+ ingenuos son células T CD4+ CD45RO-, CD45RA+, CD62L+. En algunos casos, las células CD4+ de memoria central son CD62L+ y CD45RO+. En algunos casos, las células efectoras CD4+ son CD62L- y CD45RO-.
[0365] En un ejemplo, para enriquecer para células CD4+ por selección negativa, un cóctel de anticuerpos monoclonales típicamente incluye anticuerpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, y CD8. En algunos casos, el anticuerpo o compañero de unión está unido a un soporte sólido o matriz, como una esfera magnética o paramagnética, para permitir la separación de las células para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, en algunos casos, las células y las poblaciones celulares se separan o aíslan utilizando técnicas de separación inmunomagnéticas (o afinimagnéticas) (revisadas en Methods in Molecular Medicine, vol. 58): Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In vitro and In vivo, p 17-25 Editado por: S. A. Brooks and U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).
[0366] En algunos aspectos, la muestra o composición de células a separar se incuba con material pequeño, magnetizable o que responde magnéticamente, como partículas o micropartículas que responden magnéticamente, como esferas paramagnéticas(por ej.,como esferas Dynalbeads o MACS). El material con respuesta magnética,por ej.,la partícula, generalmente está unido directa o indirectamente a un compañero de unión,por ej.,un anticuerpo, que se une específicamente a una molécula,por ej.,un marcador de superficie, presente en la célula, células o población de células que se desea separar,por ej.,que se desea seleccionar negativa o positivamente.
[0367] En algunos casos, la partícula o esfera magnética comprende un material magnéticamente sensible unido a un miembro de unión específico, tal como un anticuerpo u otro compañero de unión. Hay muchos materiales magnéticamente sensibles bien conocidos que se utilizan en los métodos de separación magnética. Las partículas magnéticas adecuadas incluyen las descritas en Molday, Patente de EE. UU. No. 4.452.773, y en la Especificación de Patente Europea EP 452342 B. Partículas de tamaño coloidal, como las descritas en Owen U.S. Patente de EE. UU. No. 4,795,698 , and Liberti et al., Patente de EE. UU. N° 5.200.084 son otros ejemplos.
[0368] La incubación generalmente se lleva a cabo bajo condiciones en las que los anticuerpos o compañeros de unión, o moléculas, tales como anticuerpos secundarios u otros reactivos, que se unen específicamente a dichos anticuerpos o compañeros de unión, que están unidos a la partícula magnética o esfera, se unen específicamente a moléculas de la superficie celular si están presentes en las células dentro de la muestra.
[0369] En algunos aspectos, la muestra es colocada en un campo magnético, y aquellas células que tienen partículas magnéticamente responsivas o magnetizables adheridas serán atraídas al imán y separadas de las células no etiquetadas. Para la selección positiva, se retienen las células que son atraídas por el imán; para la selección negativa, se retienen las células que no son atraídas (células no etiquetadas). En algunos aspectos, se realiza una combinación de selección positiva y negativa durante la misma etapa de selección, en la que las fracciones positivas y negativas se retienen y se siguen procesando o se someten a otras etapas de separación.
[0370] En ciertos casos, las partículas magnéticamente sensibles están recubiertas de anticuerpos primarios u otros compañeros de unión, anticuerpos secundarios, lectinas, enzimas o estreptavidina. En ciertos casos, las partículas magnéticas se adhieren a las células mediante un recubrimiento de anticuerpos primarios específicos para uno o más marcadores. En algunos casos, las células, en lugar de las microesferas, se marcan con un anticuerpo primario o un compañero de unión y, a continuación, se añaden partículas magnéticas recubiertas de anticuerpos secundarios específicos del tipo celular u otro compañero de unión(por ej.,estreptavidina). En algunos casos, las partículas magnéticas recubiertas de estreptavidina se utilizan junto con anticuerpos primarios o secundarios biotinilados.
[0371] En algunos casos, las partículas magnéticamente sensibles se dejan adheridas a las células que van a ser posteriormente incubadas, cultivadas y/o manipuladas; en algunos aspectos, las partículas se dejan adheridas a las células para su administración a un paciente. En algunos casos, las partículas magnetizables o que responden magnéticamente se retiran de las células. Los métodos para eliminar partículas magnetizables de las células son conocidos e incluyen,por ej.,el uso de anticuerpos no marcados competidores, y partículas magnetizables o anticuerpos conjugados con enlazadores escindibles. En algunos casos, las partículas magnetizables son biodegradables.
[0372] En algunos casos, la selección basada en la afinidad se realiza mediante clasificación celular activada magnéticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Los sistemas MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) son capaces de seleccionar células de gran pureza con partículas magnetizadas adheridas a ellas. En algunos casos, el MACS funciona en un modo en el que las especies objetivo y no objetivo se eluyen secuencialmente tras la aplicación del campo magnético externo. Es decir, las células adheridas a las partículas magnetizadas se mantienen en su lugar mientras se eluyen las especies no adheridas. A continuación, una vez completado este primer paso de elución, las especies que quedaron atrapadas en el campo magnético y no pudieron ser eluidas se liberan de alguna manera para que puedan ser eluidas y recuperadas. En algunos casos, las células no diana se marcan y se eliminan de la población heterogénea de células.
[0373] En ciertos casos, el aislamiento o separación se lleva a cabo usando un sistema, dispositivo o aparato que lleva a cabo uno o más de los pasos de aislamiento, preparación celular, separación, procesamiento, incubación, cultivo y/o formulación de los métodos. En algunos aspectos, el sistema se utiliza para llevar a cabo cada uno de estos pasos en un entorno cerrado o estéril, por ejemplo, para minimizar los errores, la manipulación por parte del usuario y/o la contaminación. En un ejemplo, el sistema es un sistema como el descrito en la Pub. PCT Número WO2009/072003, o US 20110003380A1.
[0374] En algunos casos, el sistema o aparato lleva a cabo uno o más,por ej.,todos los pasos de aislamiento, procesamiento, ingeniería y formulación en un sistema integrado o autónomo, y/o de forma automatizada o programable. En algunos aspectos, el sistema o aparato incluye un ordenador y/o un programa informático en comunicación con el sistema o aparato, que permite a un usuario programar, controlar, evaluar el resultado de y/o ajustar diversos aspectos de los pasos de procesamiento, aislamiento, ingeniería y formulación.
[0375] En algunos aspectos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo utilizando el sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec), por ejemplo, para la separación automatizada de células a escala clínica en un sistema cerrado y estéril. Los componentes pueden incluir un microordenador integrado, una unidad de separación magnética, una bomba peristáltica y varias válvulas de pellizco. En algunos aspectos, el ordenador integrado controla todos los componentes del instrumento y dirige el sistema para realizar procedimientos repetidos en una secuencia estandarizada. En algunos aspectos, la unidad de separación magnética incluye un imán permanente móvil y un soporte para la columna de selección. La bomba peristáltica controla el caudal en todo el conjunto de tubos y, junto con las válvulas de pinzamiento, garantiza el flujo controlado de tampón a través del sistema y la suspensión continua de las células.
[0376] En algunos aspectos, el sistema CliniMACS utiliza partículas magnetizables acopladas a anticuerpos que se suministran en una solución estéril no pirogénica. En algunos casos, después de etiquetar las células con partículas magnéticas, las células se lavan para eliminar el exceso de partículas. A continuación, se conecta una bolsa de preparación celular al conjunto de tubos, que a su vez está conectado a una bolsa que contiene tampón y a una bolsa de recogida de células. El juego de tubos consta de tubos estériles premontados, que incluyen una precolumna y una columna de separación, y son de un solo uso. Una vez iniciado el programa de separación, el sistema aplica automáticamente la muestra celular en la columna de separación. Las células marcadas quedan retenidas en la columna, mientras que las no marcadas se eliminan mediante una serie de lavados. En algunos casos, las poblaciones celulares para su uso con los métodos aquí descritos no están etiquetadas y no se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones celulares para su uso con los métodos aquí descritos están etiquetadas y se retienen en la columna. En algunos casos, las poblaciones celulares para su uso con los métodos descritos en el presente documento se eluyen de la columna después de la eliminación del campo magnético, y se recogen dentro de la bolsa de recogida de células.
[0377] En ciertos casos, la separación y/u otros pasos se llevan a cabo utilizando el sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). En algunos aspectos, el sistema CliniMACS Prodigy está equipado con una unidad de procesamiento celular que permite el lavado y fraccionamiento automatizado de las células mediante centrifugación. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara integrada y un software de reconocimiento de imágenes que determina el punto final óptimo de fraccionamiento celular discerniendo las capas macroscópicas del producto celular de origen. Por ejemplo, la sangre periférica se separa automáticamente en capas de eritrocitos, glóbulos blancos y plasma. El sistema CliniMACS Prodigy también puede incluir una cámara de cultivo celular integrada que realiza protocolos de cultivo celular como,por ej.,diferenciación y expansión celular, carga de antígenos y cultivo celular a largo plazo. Los puertos de entrada permiten la extracción y reposición estéril de los medios, y las células pueden controlarse mediante un microscopio integrado. Véase,por ej.,Klebanoff et al., J Immunother. 35(9): 651-660 (2012), Terakura et al., Blood. 1:72-82 (2012), y Wang et al., J Immunother. 35(9):689-701 (2012).
[0378] En algunos casos, una población celular descrita en el presente documento se recoge y enriquece (o agota) mediante citometría de flujo, en la que las células teñidas para múltiples marcadores de superficie celular se transportan en una corriente fluídica. En algunos casos, una población celular descrita en el presente documento se recoge y enriquece (o agota) mediante clasificación a escala preparativa (FACS). En ciertos casos, una población celular descrita en el presente documento se recoge y enriquece (o agota) mediante el uso de chips de sistemas microelectromecánicos (MEMS) en combinación con un sistema de detección basado en FACS (véase,por ej.,WO 2010/033140, Cho et al., Lab Chip 10, 1567-1573 (2010); y Godin et al., J Biophoton. 1(5):355-376 (2008). En ambos casos, las células pueden marcarse con múltiples marcadores, lo que permite aislar subconjuntos de células T bien definidos y de gran pureza.
[0379] En algunos casos, los anticuerpos o socios de unión se etiquetan con uno o más marcadores detectables, para facilitar la separación para la selección positiva y/o negativa. Por ejemplo, la separación puede basarse en la unión a anticuerpos marcados con fluorescencia. En algunos ejemplos, la separación de células basada en la unión de anticuerpos u otros socios de unión específicos para uno o más marcadores de la superficie celular se lleva a cabo en una corriente fluídica, como por ejemplo mediante la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS), incluyendo chips a escala preparativa (FACS) y/o sistemas microelectromecánicos (MEMS),por ej.,en combinación con un sistema de detección citométrica de flujo. Estos métodos permiten la selección positiva y negativa basada en múltiples marcadores simultáneamente.
[0380] En algunos casos, los métodos de preparación incluyen pasos para congelar,por ej.,criopreservar, las células, ya sea antes o después del aislamiento, incubación y/o ingeniería. En algunos casos, el paso de congelación y posterior descongelación elimina los granulocitos y, en cierta medida, los monocitos de la población celular. En algunos casos, las células se suspenden en una solución de congelación,por ej.,tras una etapa de lavado para eliminar el plasma y las plaquetas. En algunos aspectos puede utilizarse cualquiera de las diversas soluciones y parámetros de congelación conocidos. Un ejemplo consiste en utilizar PBS que contenga un 20% de DMSO y un 8% de albúmina sérica humana (HSA), u otros medios de congelación celular adecuados. A continuación, se diluye 1:1 con medio de modo que la concentración final de DMSO y HSA sea del 10% y el 4%, respectivamente. A continuación, las células se congelan generalmente a -80° C. a un ritmo de 1° por minuto y se almacenan en la fase de vapor de un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido.
[0381] En algunos casos, las células son incubadas y/o cultivadas antes o en conexión con la ingeniería genética. Los pasos de incubación pueden incluir el cultivo, la estimulación, la activación y/o la propagación. La incubación y/o ingeniería puede llevarse a cabo en un recipiente de cultivo, como una unidad, cámara, pocillo, columna, tubo, conjunto de tubos, válvula, vial, placa de cultivo, bolsa u otro recipiente para el cultivo o cultivo de células. En algunos casos, las composiciones o las células se incuban en presencia de condiciones estimulantes o de un agente estimulante. Dichas condiciones incluyen aquellas diseñadas para inducir la proliferación, expansión, activación y/o supervivencia de las células de la población, para imitar la exposición al antígeno y/o para preparar las células para la ingeniería genética, como por ejemplo para la introducción de un receptor de antígeno recombinante.
[0382] Las condiciones pueden incluir uno o más de los medios particulares, temperatura, contenido de oxígeno, contenido de dióxido de carbono, tiempo, agentes,por ej.,nutrientes, aminoácidos, antibióticos, iones, y/o factores estimulantes, tales como citoquinas, quimioquinas, antígenos, socios de unión, proteínas de fusión, receptores solubles recombinantes, y cualquier otro agente diseñado para activar las células.
[0383] En algunos casos, las condiciones o agentes estimulantes incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligando, que es capaz de activar un dominio de señalización intracelular de un complejo TCR. En algunos aspectos, el agente activa o inicia la cascada de señalización intracelular TCR/CD3 en una célula T. Dichos agentes pueden incluir anticuerpos, como los específicos para un TCR, por ejemplo, anti-CD3. En algunos casos, las condiciones estimulantes incluyen uno o más agentes, por ejemplo, ligandos, que son capaces de estimular un receptor costimulador, por ejemplo, anti-CD28. En algunos casos, dichos agentes y/o ligandos pueden estar unidos a un soporte sólido, como una esfera, y/o a una o más citocinas. Opcionalmente, el método de expansión puede comprender además el paso de añadir anticuerpos anti-CD3 y/o anti CD28 al medio de cultivo (por ejemplo, a una concentración de al menos aproximadamente 0,5 ng/ml). En algunos casos, los agentes estimulantes incluyen IL-2, IL-15 y/o IL-7. En algunos aspectos, la concentración de IL-2 es de al menos unas 10 unidades/mL.
[0384] En algunos aspectos, la incubación se lleva a cabo de acuerdo con técnicas como las descritas en la Patente de EE.UU. N° 6.040.177 a Riddell et al. , Klebanoff et al., J Immunother. 35(9): 651-660 (2012), Terakura et al., Blood.1:72-82 (2012), and/or Wang et al., J Immunother. 35(9):689-701 (2012).
[0385] En algunos casos, las células T se expanden añadiendo a una composición iniciadora de cultivo células alimentadoras, tales como células mononucleares de sangre periférica no divididas (PBMC),(porej.,de tal manera que la población resultante de células contenga al menos aproximadamente 5, 10, 20, o 40 o más células alimentadoras PBMC por cada linfócito T en la población inicial a expandir); e incubando el cultivo(por ej.,durante un tiempo suficiente para expandir el número de células T). En algunos aspectos, las células alimentadoras que no se dividen pueden comprender células alimentadoras PBMC irradiadas con rayos gamma. En algunos casos, las PBMC se irradian con rayos gamma entre 3000 y 3600 rads para evitar la división celular. En algunos aspectos, las células alimentadoras se añaden al medio de cultivo antes de la adición de las poblaciones de células T.
[0386] En algunos casos, las condiciones de estimulación incluyen una temperatura adecuada para el crecimiento de linfocitos T humanos, por ejemplo, al menos unos 25 grados Celsius, generalmente al menos unos 30 grados, y generalmente en o aproximadamente 37 grados Celsius. Opcionalmente, la incubación puede comprender además la adición de células linfoblastoides (LCL) no divididas transformadas por el VEB como células alimentadoras. El LCL puede irradiarse con rayos gamma en el intervalo de unos 6.000 a 10.000 rads. Las células alimentadoras LCL en algunos aspectos se proporcionan en cualquier cantidad adecuada, como una proporción de células alimentadoras LCL a linfocitos T iniciales de al menos aproximadamente 10:1.
[0387] En algunos casos, las células T específicas de antígeno, como las células T CD4+ y/o CD8+ específicas de antígeno, se obtienen estimulando células T ingenuos o específicos de antígeno con antígeno. Por ejemplo, se pueden generar líneas o clones de células T específicas para antígenos del citomegalovirus aislando células T de sujetos infectados y estimulando las célulasin vitrocon el mismo antígeno.
C. ÁCIDOS NUCLEICOS, VECTORES Y MÉTODOS DE INGENIERÍA GENÉTICA
[0388] En algunos casos, las células, por ejemplo, células T, se modifican genéticamente para expresar un receptor recombinante. En algunos casos, la ingeniería se lleva a cabo mediante la introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor recombinante. También se divulgan moléculas de ácido nucleico que codifican un receptor recombinante, y vectores o construcciones que contienen dichos ácidos nucleicos y/o moléculas de ácido nucleico.
[0389] En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante, por ejemplo, el receptor de antígeno quimérico (CAR), contiene una secuencia señal que codifica un péptido señal. En algunos aspectos, la secuencia señal puede codificar un péptido señal derivado de un polipéptido nativo. En otros aspectos, la secuencia señal puede codificar un péptido señal heterólogo o no nativo. En algunos casos, el péptido señal se deriva de una proteína transmembrana. En algunos ejemplos, el péptido señal se deriva de CD8a,<c>D33 o una IgG. Ejemplos ejemplares no limitantes de péptidos señal incluyen, por ejemplo, el péptido señal CD33 establecido en SEQ ID N°:2l, el péptido señal CD8a establecido en SEQ ID N°:75, o el péptido señal establecido en SEQ ID N°:76 o una variante modificada del mismo.
[0390] En algunos casos, la molécula de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante contiene al menos un promotor que está unido operativamente para controlar la expresión del receptor recombinante. En algunos ejemplos, la molécula de ácido nucleico contiene dos, tres o más promotores unidos operativamente para controlar la expresión del receptor recombinante. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico puede contener secuencias reguladoras, como codones de iniciación y terminación de la transcripción y la traducción, que son específicas del tipo de huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir la molécula de ácido nucleico, según proceda y teniendo en cuenta si la molécula de ácido nucleico está basada en ADN o ARN. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico puede contener elementos reguladores/controladores, como un promotor, un potenciador, un intrón, una señal de poliadenilación, una secuencia consenso de Kozak y un aceptor o donante de empalme. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico puede contener un promotor no nativo operativamente unido a la secuencia de nucleótidos que codifica el receptor recombinante y/o uno o más polipéptido(s) adicional(es). En algunos casos, el promotor se selecciona entre un promotor de ARN pol I, pol II o pol III. En algunos casos, el promotor es reconocido por la ARN polimerasa II (por ejemplo, una región temprana de<c>M<v>, SV40 o un promotor tardío principal de adenovirus). En otro caso, el promotor es reconocido por la ARN polimerasa III (por ejemplo, un promotor U6 o h 1). En algunos casos, el promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, como un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor que se encuentra en la repetición largo-terminal del virus de células madre murino. También se contemplan otros promotores conocidos.
[0391] En algunos casos, el promotor es o comprende un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos ejemplares incluyen, por ejemplo, el promotor temprano del virus simio 40 (SV40), el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), el promotor humano de la ubiquitina C (UBC), el promotor humano del factor de elongación 1a (EF1a), el promotor de la fosfoglicerato quinasa 1 de ratón (PGK) y el promotor de la p-actina de pollo acoplado con el potenciador temprano del CMV (CAGG). En algunos casos, el promotor constitutivo es un promotor sintético o modificado. En algunos casos, el promotor es o comprende un promotor MND, un promotor sintético que contiene la región U3 de un LTR MoMuLV modificado con un potenciador del virus del sarcoma mieloproliferativo (véase Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755). En algunos casos, el promotor es un promotor específico de tejido. En otro caso, el promotor es un promotor viral. En otro caso, el promotor es un promotor no viral.
[0392] En otro caso, el promotor es un promotor regulado (por ejemplo, un promotor inducible). En algunos casos, el promotor es un promotor inducible o un promotor reprimible. En algunos casos, el promotor comprende una secuencia operadora Lac, una secuencia operadora de tetraciclina, una secuencia operadora de galactosa o una secuencia operadora de doxiciclina, o es un análogo de las mismas o es capaz de ser unido o reconocido por un represor Lac o un represor de tetraciclina, o un análogo de los mismos. En algunos casos, la molécula de ácido nucleico no incluye un elemento regulador, por ejemplo, un promotor.
[0393] En algunos casos, la molécula de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante, por ejemplo, CAR u otro receptor de antígeno, incluye además secuencias de ácido nucleico que codifican un marcador y/o las células que expresan el CAR u otro receptor de antígeno incluyen además un marcador, por ejemplo, un marcador sustitutivo, como un marcador de superficie celular, que puede utilizarse para confirmar la transducción o ingeniería de la célula para expresar el receptor, como una versión truncada de un receptor de superficie celular, como EGFR truncado (tEGFR). En algunos casos, el marcador o marcadores son marcadores de transducción, marcadores sustitutos y/o marcadores de selección.
[0394] En algunos casos, el marcador es un marcador de transducción o un marcador sustituto. Se puede utilizar un marcador de transducción o un marcador sustitutivo para detectar las células que se han introducido con la molécula de ácido nucleico, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica un receptor recombinante. En algunos casos, el marcador de transducción puede indicar o confirmar la modificación de una célula. En algunos casos, el marcador sustitutivo es una proteína que se hace coexpresar en la superficie celular con el receptor recombinante, por ejemplo CAR. En casos particulares, dicho marcador sustituto es una proteína de superficie que ha sido modificada para tener poca o ninguna actividad. En ciertos casos, el marcador sustitutivo está codificado en la misma molécula de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante está unida de forma operable a una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador, opcionalmente separado por un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES), o un ácido nucleico que codifica un péptido autodestructor o un péptido que provoca la omisión de ribosomas, como una secuencia 2A, como una T2A, una P2A, una E2A o una F2A. En algunos casos, pueden utilizarse genes marcadores extrínsecos en relación con la célula manipulada para permitir la detección o selección de células y, en algunos casos, también para promover el suicidio celular.
[0395] Los marcadores sustitutos ejemplares pueden incluir formas truncadas de polipéptidos de superficie celular, tales como formas truncadas que no son funcionales y no transducen o no son capaces de transducir una señal o una señal ordinariamente transducida por la forma de longitud completa del polipéptido de superficie celular, y/o no se internalizan o no son capaces de internalizarse. Polipéptidos de superficie celular truncados ejemplares que incluyen formas truncadas de factores de crecimiento u otros receptores como un receptor 2 truncado del factor de crecimiento epidérmico humano (tHER2), un receptor truncado del factor de crecimiento epidérmico (tEGFR, secuencia tEGFR ejemplar expuesta en SEQ ID N°: 11 o 76) o un antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA) o una forma modificada del mismo. El tEGFR puede contener un epítopo reconocido por el anticuerpo cetuximab (Erbitux®) u otro anticuerpo terapéutico anti-EGFR o molécula de unión, que puede utilizarse para identificar o seleccionar células que han sido diseñadas con el constructo tEGFR y una proteína exógena codificada, y/o para eliminar o separar células que expresan la proteína exógena codificada. Véase Patente de EE.UU. n° 8.802.374 y Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434). En algunos aspectos, el marcador,por ej.,marcador sustitutivo, incluye todo o parte(por ej.,forma truncada) de CD34, un NGFR, un c D19 o un CD19 truncado, por ejemplo, un CD19 no humano truncado, o receptor del factor de crecimiento epidérmico(por ej.,tEGFR). En algunos casos, el marcador es o comprende una proteína fluorescente, como la proteína verde fluorescente (GFP), la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP), como la GFP superdoblada (sfGFP), la proteína roja fluorescente (RFP), como tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed o DsRed2, la proteína fluorescente cian (CFP), la proteína fluorescente verde azulada (BFP), la proteína fluorescente azulada mejorada (EBFP) y la proteína fluorescente amarilla (YFP), y sus variantes, incluidas las variantes de especie, las variantes monoméricas y las variantes optimizadas en codones y/o mejoradas de las proteínas fluorescentes. En algunos casos, el marcador es o comprende una enzima, como una luciferasa, el gen lacZ deE. coli,fosfatasa alcalina, fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP), cloranfenicol acetil transferasa (CAT). Algunos genes informadores emisores de luz ejemplares son la luciferasa (luc), la p-galactosidasa, la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), la p-glucuronidasa (GUS) o sus variantes.
[0396] En algunos casos, el marcador es un marcador de selección. En algunos casos, el marcador de selección es o comprende un polipéptido que confiere resistencia a agentes o fármacos exógenos. En algunos casos, el marcador de selección es un gen de resistencia a los antibióticos. En algunos casos, el marcador de selección es un gen de resistencia a antibióticos que confiere resistencia a antibióticos a una célula de mamífero. En algunos casos, el marcador de selección es o comprende un gen de resistencia a la Puromicina, un gen de resistencia a la Higromicina, un gen de resistencia a la Blasticidina, un gen de resistencia a la Neomicina, un gen de resistencia a la Geneticina o un gen de resistencia a la Zeocina o una forma modificada de los mismos.
[0397] En algunos aspectos, el marcador,por ej.,marcador sustituto, incluye todo o parte(por ej.,forma truncada) de CD34, un NGFR, o receptor del factor de crecimiento epidérmico(por ej.,tEGFR). En algunos casos, el ácido nucleico que codifica el marcador está unido de forma operable a un polinucleótido que codifica para una secuencia enlazadora, como una secuencia enlazadora escindible,por ej.,T2A. Por ejemplo, un marcador, y opcionalmente una secuencia enlazadora, puede ser cualquiera de los descritos en la Pub. PCT N.° WO2014031687. Por ejemplo, el marcador puede ser un EGFR truncado (tEGFR) que está, opcionalmente, unido a una secuencia enlazadora, tal como una secuencia enlazadora T2A escindible. Un polipéptido ejemplar para un EGFR truncado(por ej.,tEGFR) comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N°: 7 ó 28, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID N°: 7, o 28. Una secuencia enlazadora T2A ejemplar comprende la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID N°: 6 o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID N°: 6.
[0398] En algunos casos, las moléculas de ácido nucleico que codifican tales construcciones CAR incluyen además una secuencia que codifica un elemento de salto ribosómico T2A y/o una secuencia tEGFR,por ej.,corriente abajo de la secuencia que codifica el CAR. En algunos casos, la secuencia codifica un elemento de salto ribosómico T2A establecido en SEQ ID N°: 6, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID N°: 6. En algunos casos, las células T que expresan un receptor de antígeno(p. ej. CAR) también puede generarse para expresar un EGFR truncado (EGFRt) como epítopo de selección no inmunogénico(por ej.,mediante la introducción de una construcción que codifica el CAR y el EGFRt separados por un conmutador ribosómico T2A para expresar dos proteínas de la misma construcción), que luego puede utilizarse como marcador para detectar dichas células (véase, porejemplo.La Patente de EEUU N.° 8.802.374. En algunos casos, la secuencia codifica una secuencia tEGFR establecida en SEQ ID N°: 7 ó 28, o una secuencia de aminoácidos que presente al menos un 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de secuencia con SEQ ID N°: 7, o 28.
[0399] En algunos casos, un único promotor puede dirigir la expresión de un ARN que contenga, en un único marco de lectura abierto (ORF), dos o tres genes(por ej.,que codifiquen la molécula implicada en la modulación de una vía metabólica y que codifiquen el receptor recombinante) separados entre sí por secuencias que codifiquen un péptido de autolimpieza(por ej.,secuencias 2A) o un sitio de reconocimiento de proteasas(por ej.,furina). Así pues, el o Rf codifica un único polipéptido que, ya sea durante (en el caso de 2A) o después de la traducción, se procesa en las proteínas individuales. En algunos casos, el péptido, como el T2A, puede hacer que el ribosoma se salte (ribosome skipping) la síntesis de un enlace peptídico en el C-terminal de un elemento 2A, lo que lleva a la separación entre el final de la secuencia 2A y el siguiente péptido aguas abajo(véase,por ejemplo, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) y de Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)). Muchos elementos 2A son conocidos en la técnica. Ejemplos de secuencias 2A que pueden utilizarse en los métodos y ácidos nucleicos aquí divulgados, sin limitación, secuencias 2A del virus de la fiebre aftosa (F2A,por ej.,SEQ ID N°: 27), virus de la rinitis equina A (E2A,por ej.,SEQ ID N°: 26), virus Thosea asigna (T2A,por ej.,SEQ ID N°: 6 o 23), y teschovirus-1 porcino (p2a ,por ej.,s Eq ID N°: 24 o 25), tal como se describe en Publicación de patente de EE.UU. n° 20070116690.
[0400] En algunos casos, el marcador es una molécula,por ej.,una proteína de la superficie celular, que no se encuentra naturalmente en las células T o que no se encuentra naturalmente en la superficie de las células T, o una porción de la misma. En algunos casos, la molécula es una molécula no propia,por ej., unaproteína no propia,es decir,una que no es reconocida como "propia" por el sistema inmunitario del huésped al que se transferirán adoptivamente las células.
[0401] En algunos casos, el marcador no cumple ninguna función terapéutica y/o no produce ningún efecto aparte de ser utilizado como marcador para la ingeniería genética,por ej.,para seleccionar células manipuladas con éxito. En otros casos, el marcador puede ser una molécula terapéutica o una molécula que ejerza algún efecto deseado, como un ligando para una célula que se va a encontrarin vivo,como una molécula coestimuladora o de punto de control inmunitario para mejorar y/o amortiguar las respuestas de las células tras la transferencia adoptiva y el encuentro con el ligando.
[0402] La introducción de las moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor recombinante en la célula puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de una serie de vectores conocidos. Dichos vectores incluyen sistemas virales y no virales, incluidos los sistemas lentivirales y gammaretrovirales, así como sistemas basados en transposones, como PiggyBac o los sistemas de transferencia de genes basados en la Bella Durmiente. Los métodos ejemplares incluyen aquellos para la transferencia de ácidos nucleicos que codifican los receptores, incluyendo vía viral,por ej.,retroviral o lentiviral, transducción, transposones y electroporación.
[0403] En algunos casos, la transferencia de genes se logra estimulando primero la célula, por ejemplo, combinándola con un estímulo que induce una respuesta como la proliferación, la supervivencia y/o la activación, por ejemplo, medida por la expresión de una citocina o marcador de activación, seguida de la transducción de las células activadas y la expansión en cultivo hasta un número suficiente para aplicaciones clínicas.
[0404] En algunos casos, antes o durante la transferencia génica, las células se incuban o cultivan en presencia de un compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, incluyendo cualquiera de los descritos en el presente documento. En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida se añade durante el proceso de fabricación de células, por ejemplo, durante el proceso de ingeniería de células CAR-T. En algunos aspectos, la presencia del compuesto inmunomodulador puede mejorar la calidad de la población de células producidas. En algunos aspectos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, puede aumentar la proliferación o expansión de las células o puede alterar una o más vías de señalización, lo que da lugar a células con un fenotipo de superficie menos diferenciado o menos activado, a pesar de presentar una expansión sustancial y/o una función efectora.
[0405] En algunos contextos, la sobreexpresión de un factor estimulante (por ejemplo, una linfoquina o una citoquina) puede ser tóxica para un sujeto. Así, en algunos contextos, las células modificadas incluyen segmentos génicos que hacen que las células sean susceptibles a la selección negativa in vivo, como por ejemplo tras su administración en inmunoterapia adoptiva. Por ejemplo, en algunos aspectos, las células están diseñadas para que puedan eliminarse como resultado de un cambio en el estado in vivo del paciente al que se administran. El fenotipo seleccionable negativo puede resultar de la inserción de un gen que confiere sensibilidad a un agente administrado, por ejemplo, un compuesto. Los genes selectivos negativos incluyen el gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple tipo I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell 2:223, 1977) que confiere sensibilidad al ganciclovir; el gen de la hipoxantina fosfribosiltransferasa celular (HPRT), el gen de la adenina fosforibosiltransferasa celular (APRT), la citosina deaminasa bacteriana, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
[0406] En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células utilizando partículas de virus infecciosos recombinantes, como, por ejemplo, vectores derivados del virus simio 40 (SV40), adenovirus, virus adenoasociados (AAV). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T utilizando vectores lentivirales recombinantes o vectores retrovirales, como los vectores gamma-retrovirales (véase, por ejemplo, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 noviembre 29(11): 550-557.
[0407] En algunos casos, el vector retroviral tiene una secuencia de repetición terminal larga (LTR), por ejemplo, un vector retroviral derivado del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV), el virus del sarcoma mieloproliferativo (MPSV), el virus de células madre embrionarias murinas (MESV), el virus de células madre murinas (MSCV), el virus formador de focos en el bazo (SFFV) o el virus adenoasociado (AAV). La mayoría de los vectores retrovirales derivan de retrovirus murinos. En algunos casos, los retrovirus incluyen los derivados de cualquier fuente celular aviar o mamífera. Los retrovirus suelen ser anfotrópicos, lo que significa que son capaces de infectar células huésped de varias especies, incluida la humana. En un caso, el gen a expresar sustituye a las secuencias retrovirales gag, pol y/o env. Se han descrito varios sistemas retrovirales ilustrativos (por ejemplo, Patente de EE. UU. N.° 5.219.740 ; 6.207.453 ; 5.219.740 ; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109.
[0408] Se conocen métodos de transducción lentiviral. Se describen métodos ejemplares en, por ejemplo, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; y Cavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505.
[0409] En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante electroporación(Véase, por ejemplo, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 y Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). En algunos casos, los ácidos nucleicos recombinantes se transfieren a las células T mediante transposición (véase, por ejemplo, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; y Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Otros métodos para introducir y expresar material genético en células inmunitarias incluyen la transfección con fosfato cálcico (por ejemplo, como se describe en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York. N.Y.), fusión de protoplastos, transfección mediada por liposomas catiónicos; bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno (Johnston, Nature, 346: 776 777 (1990)); y coprecipitación de ADN con fosfato de estroncio (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7. 2031-2034 (1987)).
[0410] Otros enfoques y vectores para la transferencia de los ácidos nucleicos que codifican los productos recombinantes son los descritos, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional, Publicación N°: WO2014055668, y Patente de EEUU N.° 7.446.190.
[0411] En algunos casos, las células, por ejemplo, células T, pueden ser transfectadas durante o después de la expansión, por ejemplo, con un receptor de células T (TCR) o un receptor de antígeno quimérico (CAR). Esta transfección para la introducción del gen del receptor deseado puede llevarse a cabo con cualquier vector retroviral adecuado, por ejemplo. A continuación, la población celular modificada genéticamente puede ser liberada del estímulo inicial (el estímulo CD3/CD28, por ejemplo) y posteriormente ser estimulada con un segundo tipo de estímulo (por ejemplo, a través de un receptor introducido de novo). Este segundo tipo de estímulo puede incluir un estímulo antigénico en forma de molécula de péptido/MHC, el ligando cognado (reticulado) del receptor introducido genéticamente (por ejemplo, el ligando natural de un CAR) o cualquier ligando (como un anticuerpo) que se una directamente dentro del marco del nuevo receptor (por ejemplo, reconociendo regiones constantes dentro del receptor). Véase, por ejemplo, Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 o Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014).
[0412] En algunos casos, se puede utilizar un vector que no requiera que las células,por ej.,las células T, estén activadas. En algunos casos, las células pueden seleccionarse y/o transducirse antes de la activación. Por lo tanto, las células pueden ser manipuladas antes o después del cultivo y, en algunos casos, al mismo tiempo o durante al menos una parte del cultivo.
[0413] En algunos aspectos, las células están diseñadas además para promover la expresión de citoquinas u otros factores. Entre los ácidos nucleicos adicionales, por ejemplo, los genes para introducción son aquellos para mejorar la eficacia de la terapia, como por ejemplo promoviendo la viabilidad y/o función de las células transferidas; genes para proporcionar un marcador genético para la selección y/o evaluación de las células, como por ejemplo para evaluar la supervivencia o localizaciónin vivo;genes para mejorar la seguridad, por ejemplo, haciendo que la célula sea susceptible a la selección negativa in vivo como se describe por Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); y Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); véanse también las publicaciones PCT/US91/08442 y PCT/US94/05601 de Lupton et al. en las que se describe el uso de genes de fusión seleccionables bifuncionales derivados de la fusión de un marcador seleccionable positivo dominante con un marcador seleccionable negativo.Véase, por ej.,Riddell et al., US Patent No. 6,040,177, en las columnas 14-17.
III. RESULTADOS EJEMPLARES DEL TRATAMIENTO Y MÉTODOS PARA EVALUARLOS
[0414] En algunos casos de los métodos, composiciones, combinaciones, kits y usos divulgados aquí, la terapia de combinación proporcionada resulta en uno o más resultados de tratamiento, como una característica asociada con cualquiera de los parámetros asociados con la terapia o tratamiento, como se describe a continuación. En algunos casos, el método incluye la evaluación de la exposición, persistencia y proliferación de las células T,por ej.,células T administradas para la terapia basada en células T. En algunos casos, la exposición, o la expansión y/o persistencia prolongada de las células, y/o los cambios en los fenotipos celulares o la actividad funcional de las células, por ej. , células administradas para inmunoterapia,por ej.La terapia con células T, en los métodos aquí divulgados, puede medirse evaluando las características de las células Tin vitrooex vivo.En algunos casos, dichos ensayos pueden utilizarse para determinar o confirmar la función de las células T,por ej.terapia de células T, antes o después de administrar la terapia combinada aquí descrita.
[0415] En algunos casos, la terapia de combinación puede incluir además uno o más pasos de cribado para identificar sujetos para el tratamiento con la terapia de combinación y/o la continuación de la terapia de combinación, y/o un paso para la evaluación de los resultados del tratamiento y/o la monitorización de los resultados del tratamiento. En algunos casos, el paso para la evaluación de los resultados del tratamiento puede incluir pasos para evaluar y/o monitorizar el tratamiento y/o identificar sujetos para la administración de pasos adicionales o restantes de la terapia y/o para repetir la terapia. En algunos casos, el paso de cribado y/o la evaluación de los resultados del tratamiento pueden utilizarse para determinar la dosis, la frecuencia, la duración, el momento y/o el orden de la terapia combinada aquí descrita.
[0416] En algunos casos, cualquiera de los pasos de cribado y/o evaluación del tratamiento de los resultados descritos en el presente documento se puede utilizar antes, durante, en el transcurso o después de la administración de uno o más pasos de la terapia combinada proporcionada,por ej.,la administración de la terapia de células T(por ej.células T que expresan CAR), y/o un compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida. En algunos casos, la evaluación se realiza antes, durante, en el transcurso o después de realizar cualquiera de los métodos aquí descritos. En algunos casos, la evaluación se realiza antes de llevar a cabo los métodos aquí descritos. En algunos casos, la evaluación se realiza después de llevar a cabo uno o más pasos de los métodos aquí descritos. En algunos casos, la evaluación se realiza antes de la administración de uno o más pasos de la terapia combinada proporcionada, por ejemplo, para examinar e identificar a los pacientes adecuados y/o susceptibles de recibir la terapia combinada. En algunos casos, la evaluación se realiza durante, en el transcurso o después de la administración de uno o más pasos de la terapia combinada proporcionada, por ejemplo, para evaluar el resultado intermedio o final del tratamiento, porejemplo,para determinar la eficacia del tratamiento y/o para determinar si continuar o repetir los tratamientos y/o para determinar si administrar los pasos restantes de la terapia combinada.
[0417] En algunos casos, el tratamiento de los resultados incluye la mejora de la función inmunitaria,por ej.,la función inmunitaria de las células T administradas para la terapia basada en células y/o de las células T endógenas del cuerpo. En algunos casos, los resultados de tratamiento ejemplares incluyen, entre otros, una mayor proliferación de células T, una mayor actividad funcional de células T, cambios en la expresión de marcadores fenotípicos de células inmunitarias, como características asociadas con las células T modificadas, por ejemplo, células CAR-T, administradas al sujeto. En algunos casos, los resultados ejemplares del tratamiento incluyen la disminución de la carga de la enfermedad,por ej.,la carga tumoral, la mejora de los resultados clínicos y/o la mejora de la eficacia de la terapia.
[0418] En algunos casos, el paso de cribado y/o evaluación del tratamiento de los resultados incluye la evaluación de la supervivencia y/o función de las células T administradas para la terapia basada en células. En algunos casos, el paso de cribado y/o evaluación del tratamiento de los resultados incluye la evaluación de los niveles de citoquinas o factores de crecimiento. En algunos casos, el paso de cribado y/o la evaluación del tratamiento de los resultados incluye la evaluación de la carga de la enfermedad y/o las mejoras,por ej.,la evaluación de la carga tumoral y/o los resultados clínicos. En algunos casos, cualquiera de los pasos de cribado y/o evaluación del tratamiento de los resultados puede incluir cualquiera de los métodos y/o ensayos de evaluación descritos en el presente documento y/o conocidos en la técnica, y puede realizarse una o más veces,por ej.,antes, durante, en el transcurso o posteriormente a la administración de uno o más pasos de la terapia combinada. Los conjuntos ejemplares de parámetros asociados con un resultado del tratamiento, que pueden evaluarse en algunos casos de los métodos aquí divulgados, incluyen el perfil de la población de células inmunitarias de sangre periférica y/o la carga tumoral.
[0419] En algunos casos, los métodos afectan a la eficacia de la terapia celular en el sujeto. En algunos casos, la persistencia, expansión y/o presencia de células que expresan receptores recombinantes,por ej.,células que expresan CAR, en el sujeto tras la administración de la dosis de células en el método con el compuesto inmunomodulador es mayor en comparación con la conseguida mediante un método sin la administración del compuesto inmunomodulador. En algunos casos de los métodos de inmunoterapia divulgados en el presente documento, como una terapia de células T(por ej.células T que expresan CAR), la evaluación del parámetro incluye evaluar la expansión y/o persistencia en el sujeto de las células T administradas para la inmunoterapia,por ej.,terapia de células T, en comparación con un método en el que la inmunoterapia se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador. En algunos casos, los métodos dan lugar a que las células T administradas presenten una expansión y/o persistencia aumentada o prolongada en el sujeto en comparación con un método en el que la terapia de células T se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador.
[0420] En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida disminuye la carga de la enfermedad,por ej.,la carga tumoral, en el sujeto en comparación con un método en el que la dosis de células que expresan el receptor recombinante se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador. En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida disminuye la médula blástica en el sujeto en comparación con un método en el que la dosis de células que expresan el receptor recombinante se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador. En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, produce mejores resultados clínicos, por ej., tasa de respuesta objetiva (ORR), supervivencia sin progresión (PFS) y supervivencia global (OS), en comparación con un método en el que la dosis de células que expresan el receptor recombinante se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador.
[0421] En algunos casos, el sujeto puede ser examinado antes de la administración de uno o más pasos de la terapia combinada. Por ejemplo, antes de la administración de la terapia combinada, se puede examinar al sujeto para determinar las características de la enfermedad y/o la carga de la enfermedad,por ej.,la carga tumoral, para determinar la idoneidad, la capacidad de respuesta y/o la susceptibilidad a la administración de la terapia combinada. En algunos casos, el paso de cribado y/o la evaluación de los resultados del tratamiento pueden utilizarse para determinar la dosis, la frecuencia, la duración, el momento y/o el orden de la terapia combinada aquí descrita.
[0422] En algunos casos, el sujeto puede ser examinado después de la administración de uno de los pasos de la terapia combinada, para determinar e identificar sujetos para recibir los pasos restantes de la terapia combinada y/o para monitorear la eficacia de la terapia. En algunos casos, el número, nivel o cantidad de células T administradas y/o la proliferación y/o actividad de las células T administradas se evalúa antes de la administración y/o después de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida.
[0423] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, se administra hasta que la concentración o el número de células modificadas en la sangre del sujeto es (i) al menos o aproximadamente 10 células modificadas por microlitro, (ii) al menos 20%, 30%, 40% o 50% del número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), (iii) al menos o aproximadamente 1 x 105 células modificadas; o (iv) al menos 5.000 copias de ADN recombinante codificante de receptor por microgramos de ADN; y/o en el día 90 tras el inicio de la administración en (a), las células que expresan CAR son detectables en la sangre o el suero del sujeto; y/o en el día 90 tras el inicio de la administración en (a), la sangre del sujeto contiene al menos un 20% de células que expresan CAR, al menos 10 células que expresan CAR por microlitro o al menos 1 x104 células que expresan CAR.
[0424] En algunos casos, el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida se administra hasta que haya un beneficio clínico del tratamiento, tal como al menos o mayor que una disminución del 50% en el volumen total del tumor o una respuesta completa (RC) en la cual el tumor detectable ha desaparecido, supervivencia libre de progresión o supervivencia libre de enfermedad por más de 6 meses o más de 1 año o más.
[0425] En algunos casos, se determina o evalúa un cambio y/o una alteración,por ej.,un aumento, una elevación, una disminución o una reducción, en los niveles, valores o mediciones de un parámetro o resultado en comparación con los niveles, valores o mediciones del mismo parámetro o resultado en un punto de tiempo de evaluación diferente, una condición diferente, un punto de referencia y/o un sujeto diferente. Por ejemplo, en algunos casos, se puede determinar un cambio de pliegue,por ej.,un aumento o disminución, en parámetros particulares, por ejemplo, el número de células T modificadas en una muestra, en comparación con el mismo parámetro en una condición diferente, por ejemplo, antes o después de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida. En algunos casos, se determinan los niveles, valores o mediciones de dos o más parámetros y se comparan los niveles relativos. En algunos casos, los niveles, valores o mediciones determinados de los parámetros se comparan con los niveles, valores o mediciones de una muestra de control o una muestra no tratada. En algunos casos, los niveles, valores o mediciones determinados de los parámetros se comparan con los niveles de una muestra del mismo sujeto pero en un momento diferente. Los valores obtenidos en la cuantificación de un parámetro individual pueden combinarse a efectos de evaluación de la enfermedad,por ej.,formando una operación aritmética o lógica sobre los niveles, valores o mediciones de los parámetros mediante el uso del análisis multiparamétrico. En algunos casos, puede calcularse una relación de dos o más parámetros específicos.
A. EXPOSICIÓN, PERSISTENCIA Y PROLIFERACIÓN DE CÉLULAS T
[0426] En algunos casos, el parámetro asociado con la terapia o un resultado del tratamiento, que incluyen parámetros que pueden ser evaluados para los pasos de detección y/o evaluación del tratamiento de los resultados y/o monitoreo de los resultados del tratamiento, es o incluye la evaluación de la exposición, persistencia y proliferación de las células T,por ej.,células T administradas para la terapia basada en células T. En algunos casos, el aumento de la exposición, o la expansión y/o persistencia prolongada de las células, y/o los cambios en los fenotipos celulares o la actividad funcional de las células,por ej.,células administradas para inmunoterapia,por ej.La terapia con células T, en los métodos aquí divulgados, puede medirse evaluando las características de las células Tin vitrooex vivo.En algunos casos, dichos ensayos pueden utilizarse para determinar o confirmar la función de las células T utilizadas para la inmunoterapia,por ej.terapia de células T, antes o después de administrar uno o más pasos de la terapia combinada aquí divulgada.
[0427] En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador, por ejemplo, lenalidomida, está diseñada para promover la exposición del sujeto a las células, porejemplo,células T administradas para la terapia basada en células T, como promoviendo su expansión y/o persistencia en el tiempo. En algunos casos, la terapia celular T muestra una expansión y/o persistencia aumentada o prolongada en el sujeto en comparación con un método en el que la terapia celular T se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida.
[0428] En algunos casos, los métodos divulgados aumentan la exposición del sujeto a las células administradas(por ej.,mayor número de células o duración en el tiempo) y/o mejoran la eficacia y los resultados terapéuticos de la inmunoterapia,por ej.terapia de células T. En algunos aspectos, los métodos son ventajosos en el sentido de que un grado mayor y/o más prolongado de exposición a las células que expresan los receptores recombinantes,por ej.,células que expresan CAR, mejora los resultados del tratamiento en comparación con otros métodos. Estos resultados pueden incluir la supervivencia y la remisión del paciente, incluso en individuos con una carga tumoral grave.
[0429] En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida puede aumentar el máximo, total y/o la duración de la exposición a las células,por ej.células T administradas para la terapia basada en células T, en el sujeto en comparación con la administración de las células T solas en ausencia del compuesto inmunomodulador. En algunos aspectos, la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, en el contexto de una carga elevada de la enfermedad (y, por tanto, mayores cantidades de antígeno) y/o un cáncer más agresivo o resistente mejora la eficacia en comparación con la administración de las células T solas en ausencia del compuesto inmunomodulador en el mismo contexto, lo que puede dar lugar a inmunosupresión, anergia y/o agotamiento que pueden impedir la expansión y/o persistencia de las células.
[0430] En algunos casos, se detecta la presencia y/o cantidad de células que expresan el receptor recombinante(porej.,células que expresan CAR administradas para terapia basada en células T) en el sujeto después de la administración de las células T y antes, durante y/o después de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida. En algunos aspectos, la PCR cuantitativa (qPCR) se utiliza para evaluar la cantidad de células que expresan el receptor recombinante(por ej.,células que expresan CAR administradas para una terapia basada en células T) en la sangre o suero o muestra de órgano o tejido(por ej.,sitio de la enfermedad,por ej.,muestra de tumor) del sujeto. En algunos aspectos, la persistencia se cuantifica como copias de ADN o plásmido que codifica el receptor,porejemplo, CAR, por microgramo de ADN, o como el número de células que expresan el receptor, por ejemplo, CAR, por microlitro de la muestra, porejemplo,de sangre o suero, o por número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o glóbulos blancos o células T por microlitro de la muestra.
[0431] En algunos casos, las células se detectan en el sujeto en o al menos a los 4, 14, 15, 27 o 28 días después de la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR. En algunos aspectos, las células se detectan en o al menos a las 2, 4, o 6 semanas siguientes, o 3, 6, o 12, 18, o 24, o 30 o 36 meses, o 1,2, 3, 4, 5, o más años, tras la administración de las células T, porejemplo, células T que expresan CAR y/o el compuesto inmunomodulador,por ejemplo,lenalidomida.
[0432] En algunos casos, la persistencia de células que expresan receptores (por ej.CAR) en el sujeto mediante los métodos, tras la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR y/o el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, es mayor en comparación con el que se conseguiría mediante métodos alternativos como los que implican la administración de la inmunoterapia sola,por ej.,la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR, en ausencia del compuesto inmunomodulador.
[0433] La exposición,por ej., elnúmero de células,por ej.Las células T administradas para la terapia celular T, indicativas de expansión y/o persistencia, pueden expresarse en términos de números máximos de las células a las que se expone el sujeto, duración de las células detectables o células por encima de un cierto número o porcentaje, área bajo la curva para el número de células a lo largo del tiempo, y/o combinaciones de las mismas e indicadores de las mismas. Dichos resultados pueden evaluarse mediante métodos conocidos, como la qPCR para detectar el número de copias del ácido nucleico que codifica el receptor recombinante en comparación con la cantidad total de ácido nucleico o ADN en la muestra concreta,por ej.,sangre, suero, plasma o tejido, como una muestra tumoral, y/o ensayos de citometría de flujo que detectan células que expresan el receptor utilizando generalmente anticuerpos específicos para los receptores. También pueden utilizarse ensayos celulares para detectar el número o porcentaje de células funcionales, como células capaces de unirse a y/o neutralizar y/o inducir respuestas,por ej.,citotóxicas, contra células de la enfermedad o afección o que expresan el antígeno reconocido por el receptor.
[0434] En algunos aspectos, el aumento de la exposición del sujeto a las células incluye el aumento de la expansión de las células. En algunos casos, las células que expresan el receptor,por ej.células que expresan CAR, se expanden en el sujeto tras la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR, y/o tras la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida. En algunos aspectos, los métodos dan lugar a una mayor expansión de las células en comparación con otros métodos, como los que implican la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR, en ausencia de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida.
[0435] En algunos aspectos, el método da como resultado una alta proliferaciónin vivode las células administradas, por ejemplo, medida por citometría de flujo. En algunos aspectos, se detectan proporciones de pico elevadas de las células. Por ejemplo, en algunos casos, en un nivel pico o máximo tras la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR y/o el compuesto inmunomodulador,porejemplo,lenalidomida, en la sangre o en el sitio de la enfermedad del sujeto o fracción de leucocitos de la misma,por ej.,fracción de PBMC o fracción de células T, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% de las células expresan el receptor recombinante, por ejemplo , el CAR.
[0436] En algunos casos, el método resulta en una concentración máxima, en la sangre o suero u otro fluido corporal u órgano o tejido del sujeto, de al menos 100, 500, 1000, 1500, 2000, 5000, 10,000 o 15,000 copias de o ácido nucleico que codifica el receptor,por ej.,el CAR, por microgramo de ADN, o al menos 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 o 0,9 células que expresan el receptor, por ejemplo, CAR, por número total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), número total de células mononucleares, número total de células T o número total de microlitros. En algunos casos, las células que expresan el receptor se detectan como al menos el 10, 20, 30, 40, 50, o 60 % del total de PBMC en la sangre del sujeto, y/o a tal nivel durante al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 24, 36, 48, o 52 semanas después de la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR y/o el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, o durante 1, 2, 3, 4, o 5, o más años tras dicha administración.
[0437] En algunos aspectos, el método resulta en un aumento de al menos 2 veces, al menos 4 veces, al menos 10 veces o al menos 20 veces en copias de ácido nucleico que codifica el receptor recombinante,por ej.,CAR, por microgramo de ADN, porejemplo,en el suero, plasma, sangre o tejido,por ej.,muestra de tumor, del sujeto.
[0438] En algunos casos, las células que expresan el receptor son detectables en el suero, plasma, sangre o tejido,por ej.,muestra de tumor, del sujeto,por ej.,mediante un método especificado, tal como qPCR o método de detección basado en citometría de flujo, al menos 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, o 60 o más días después de la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR, o tras la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, durante al menos o aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, o 24 o más semanas tras la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR, y/o el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida.
[0439] En algunos aspectos, al menos aproximadamente 1 * 102, al menos aproximadamente 1 * 103, al menos aproximadamente 1 * 104, al menos aproximadamente 1 * 105, o al menos aproximadamente 1 * 106 o al menos aproximadamente 5 * 106 o al menos aproximadamente 1 * 107 o al menos aproximadamente 5 * 107 o al menos aproximadamente 1 * 108 células recombinantes que expresan receptores, por ejemplo , células que expresan CAR, y/o al menos 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, o 500, o 1000 células que expresan receptores por microlitro,por ej.,al menos 10 por microlitro, son detectables o están presentes en el sujeto o fluido, plasma, suero, tejido, o compartimento del mismo, como en la sangre,por ej.,sangre periférica, o lugar de la enfermedad,por ej.,tumor, del mismo. En algunos casos, dicho número o concentración de células es detectable en el sujeto durante al menos unos 20 días, al menos unos 40 días, o al menos unos 60 días, o al menos unos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses, o al menos 2 o 3 años, tras la administración de las células T, por ej., células T que expresan CAR, y/o tras la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida. Este número de células puede detectarse mediante citometría de flujo o métodos cuantitativos basados en la PCR y extrapolarse al número total de células mediante métodos conocidos.Véase, por ej.,Brentjens et al., Sci Transl Med. 20135(177), Park et al, Molecular Therapy 15(4):825-833 (2007), Savoldo et al, JCI 121(5):1822-1826 (2011), Davila et al, (2013) PLoS ONE 8(4):e61338, Davila et al, Oncoimmunology 1(9):1577-1583 (2012), Lamers, Blood 2011 117:72-82, Jensen et al, Biol Blood Marrow Transplant 2010 September; 16(9): 1245-1256, Brentjens et al., Blood 2011 118(18):4817-4828.
[0440] En algunos aspectos, el número de copias del ácido nucleico que codifica el receptor recombinante, por ejemplo,número de copias del vector, por 100 células, por ejemplo en la sangre periférica o médula ósea u otro compartimento, medido por inmunohistoquímica, PCR, y/o citometría de flujo, es al menos 0,01, al menos 0,1, al menos 1, o al menos 10, en aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 5 semanas, o al menos aproximadamente 6 semanas, o al menos aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, o 12 meses o al menos 2 o 3 años tras la administración de las células, por ejemplo , células T que expresan CAR, y/o el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida. En algunos casos, el número de copias del vector que expresa el receptor,por ej.CAR, por microgramo de ADN genómico es de al menos 100, al menos 1.000, al menos 5.000, o al menos 10.000, o al menos 15.000 o al menos 20.000 en un momento de aproximadamente 1 semana, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, o al menos aproximadamente 4 semanas tras la administración de las células T, por ej., células T que expresan CAR, o compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, o al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 meses o al menos 2 o 3 años tras dicha administración.
[0441] En algunos aspectos, el receptor,por ej.CAR, expresado por las células, es detectable por PCR cuantitativa (qPCR) o por citometría de flujo en el sujeto, plasma, suero, sangre, tejido y/o sitio de la enfermedad del mismo,por ej.,tumor, en un momento que es de al menos unos 3 meses, al menos unos 6 meses, al menos unos 12 meses, al menos un año, al menos unos 2 años, al menos unos 3 años, o más de 3 años, tras la administración de las células,por ej.,tras el inicio de la administración de las células T,por ej.,células T que expresan CAR, y/o el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida.
[0442] En algunos casos, el área bajo la curva (AUC) para la concentración de células que expresan receptores(por ej.,CAR) en un fluido, plasma, suero, sangre, tejido, órgano y/o sitio de la enfermedad,por ej.,sitio del tumor, del sujeto con el tiempo después de la administración de las células T,por ej.,Las células T que expresan CAR y/o el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, son mayores en comparación con las conseguidas mediante un régimen de dosificación alternativo en el que se administran al sujeto las células T,por ej.,células T que expresan CAR, en ausencia de administración del compuesto inmunomodulador.
[0443] En algunos aspectos, el método da como resultado una alta proliferaciónin vivode las células administradas, por ejemplo, medida por citometría de flujo. En algunos aspectos, se detectan proporciones de pico elevadas de las células. Por ejemplo, en algunos casos, en un nivel pico o máximo después de las células T, porejemplo,células T que expresan CAR y/o compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, en la sangre, plasma, suero, tejido o sitio de la enfermedad del sujeto o fracción de glóbulos blancos del mismo, porejemplo,fracción de PBMC o fracción de células T, al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90% de las células expresan el receptor recombinante, por ejemplo , el CAR.
[0444] En algunos aspectos, la expansión y/o persistencia aumentada o prolongada de la dosis de células en el sujeto administrado con el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida se asocia con un beneficio en los resultados relacionados con el tumor en el sujeto. En algunos casos, el resultado relacionado con el tumor incluye una disminución de la carga tumoral o una disminución de la médula blástica en el sujeto. En algunos casos, la carga tumoral disminuye en o al menos en o aproximadamente un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 por ciento tras la administración del método. En algunos casos, la carga de la enfermedad, el tamaño del tumor, el volumen tumoral, la masa tumoral y/o la carga o volumen tumoral se reducen tras la dosis de células en al menos o aproximadamente un 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más en comparación con un sujeto que ha sido tratado con un método que no implica la administración de un compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida.
B. ACTIVIDAD FUNCIONAL DE LAS CÉLULAS T
[0445] En algunos casos, los parámetros asociados con la terapia o un resultado del tratamiento, que incluyen parámetros que pueden ser evaluados para los pasos de detección y/o evaluación del tratamiento de los resultados y/o monitoreo de los resultados del tratamiento, incluye uno o más de la actividad, fenotipo, proliferación o función de las células T. En algunos casos, se puede utilizar cualquiera de los ensayos conocidos en la técnica para evaluar la actividad, los fenotipos, la proliferación y/o la función de las células T,por ej.,las células T administradas para la terapia celular T. Antes y/o después de la administración de las células y/o del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, en algunos casos se mide la actividad biológica de las poblaciones celulares manipuladas ,por ej.,mediante cualquiera de los métodos conocidos. Los parámetros a evaluar incluyen la unión específica de una célula T natural o modificada o de otra célula inmunitaria al antígeno,in vivo,por ejemplo, mediante imágenes, oex vivo,por ejemplo, mediante ELISA o citometría de flujo. En ciertos casos, la capacidad de las células modificadas para destruir las células diana puede medirse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, como los ensayos de citotoxicidad descritos en, por ejemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), y Herman et al., J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004). En ciertos casos, la actividad biológica de las células se mide evaluando la expresión y/o secreción de una o más citocinas, como CD107a, IFN<y>, IL-2, GM-CSF y TNFa, y/o evaluando la actividad citolítica.
[0446] En algunos casos, los ensayos para la actividad, fenotipos, proliferación y/o función de las células T,por ej.,Las células T administradas para la terapia celular T incluyen, pero no se limitan a, ELISPOT, ELISA, proliferación celular, ensayo de linfocitos citotóxicos (CTL), unión al epítopo de células T, antígeno o ligando, o tinción de citocinas intracelulares, ensayos de proliferación, ensayos de secreción de linfoquinas, ensayos de citotoxicidad directa y ensayos de dilución limitante. En algunos casos, las respuestas proliferativas de las células T pueden medirse,por ej.,mediante la incorporación de 3H-timidina, BrdU (5-Bromo-2'-Deoxiuridina) o 2'-desoxi-5-etiniluridina (EdU) en su ADN o ensayos de dilución de colorantes, utilizando colorantes como el éster de carboxifluoresceína diacetato succininininmunomodulador (CFSE), CellTrace Violet o el colorante de membrana PKH26.
[0447] En algunos casos, evaluar la actividad, fenotipos, proliferación y/o función de las células T, por ej., células T administradas para terapia de células T, incluye medir la producción de citoquinas de las células T, y/o medir la producción de citoquinas en una muestra biológica del sujeto, por ej., plasma, suero, sangre, y/o muestras de tejido, por ej., muestras de tumor. En algunos casos, dichas citocinas medidas pueden incluir, sin limitación, interleucina-2 (IL-2), interferóngamma (IFNy), interleucina-4 (IL-4), TNF-alfa (TNFa), interleucina-6 (IL-6), interleucina-10 (IL-10), interleucina-12 (IL-12), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), CD107a, y/o TGF-beta (TGFp). Los ensayos para medir las citocinas son bien conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, ELISA, tinción intracelular de citocinas, matriz de microesferas citométricas, RT-PCR, ELISPOT, citometría de flujo y bioensayos en los que se comprueba la capacidad de respuesta de las células a la citocina en cuestión(porej.,proliferación) en presencia de una muestra de ensayo.
[0448] En algunos casos, la evaluación de la actividad, fenotipos, proliferación y/o función de las células T,por ej.,células T administradas para terapia celular T, incluye la evaluación de fenotipos celulares,por ej.,expresión de marcadores de superficie celular particulares. En algunos casos, se evalúa la expresión de marcadores de activación de células T, de marcadores de agotamiento de células T y/o de marcadores de diferenciación de células T en las células T, por ejemplo , células T administradas para terapia celular. En algunos casos, el fenotipo celular se evalúa antes de la administración. En algunos casos, el fenotipo celular se evalúa tras la administración. Los marcadores de activación de células T, los marcadores de agotamiento de células T y/o los marcadores de diferenciación de células T para evaluación incluyen cualquier marcador conocido en la técnica para subconjuntos particulares de células T,por ej.,CD25, CD38, antígeno leucocitario humano-DR (HLA-DR), CD69, CD44, CD137, KLRG1, CD62Llow, CCR7low, CD71, CD2, CD54, CD58, CD244, CD160, proteína 1 de muerte celular programada (PD-1), proteína 3 del gen de activación linfocitaria (LAG-3), dominio de inmunoglobulina de células T y proteína de dominio de mucina 3 (TIM-3), antígeno de células T citotóxicos-4 (CTLA-4), atenuador de células T en banda (BTLA) y/o inmunoglobulina de células T y dominio de motivo inhibidor basado en tirosina inmunorreceptora (TIGIT) (véase,por ej.,Liu et al., Cell Death and Disease (2015) 6, e1792). En algunos casos, el marcador de superficie celular evaluado es CD25, PD-1 y/o TIM-3. En algunos casos, el marcador de superficie celular evaluado es CD25.
[0449] En algunos aspectos, la detección de los niveles de expresión incluye la realización de un ensayoin vitro.En algunos casos, el ensayoin vitroes un inmunoensayo, un ensayo basado en aptámeros, un ensayo histológico o citológico, o un ensayo de nivel de expresión de ARNm. En algunos casos, el parámetro o parámetros para uno o más de cada uno de los factores, efectores, enzimas y/o marcadores de superficie se detectan mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), inmunotransferencia, inmunoprecipitación, radioinmunoensayo (RIA), inmunotinción, ensayo de citometría de flujo, resonancia de plasmón superficial (SPR), ensayo de quimioluminiscencia, inmunoensayo de flujo lateral, ensayo de inhibición o ensayo de avidez. En algunos casos, la detección de citocinas y/o marcadores de superficie se determina utilizando un reactivo de unión que se une específicamente al menos a un biomarcador. En algunos casos, el reactivo de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, un aptámero o una sonda de ácido nucleico.
[0450] En algunos casos, la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida aumenta el nivel de células T CAR circulantes.
C. CARGA DE LA ENFERMEDAD
[0451] En algunos casos, los parámetros asociados con la terapia o un resultado del tratamiento, que incluyen parámetros que pueden ser evaluados para los pasos de detección y/o evaluación del tratamiento de los resultados y/o monitoreo de los resultados del tratamiento, incluyen la carga tumoral o de la enfermedad. La administración de la inmunoterapia, como una terapia de células T(por ej.células T que expresan CAR) y/o el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, pueden reducir o prevenir la expansión o la carga de la enfermedad o afección en el sujeto. Por ejemplo, cuando la enfermedad o afección es un tumor, los métodos generalmente reducen el tamaño del tumor, el volumen, la metástasis, el porcentaje de blastos en la médula ósea o el cáncer detectable molecularmente y/o mejoran el pronóstico o la supervivencia u otro síntoma asociado con la carga tumoral.
[0452] En algunos casos, los métodos divulgados dan lugar a una disminución de la carga tumoral en los sujetos tratados en comparación con métodos alternativos en los que la inmunoterapia, tal como una terapia de células T(por ej.células T que expresan CAR) se administra sin la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida. No es necesario que la carga tumoral se reduzca realmente en todos los sujetos que reciben la terapia combinada, sino que la carga tumoral se reduzca de media en los sujetos tratados, como por ejemplo, basándose en datos clínicos, en los que una mayoría de los sujetos tratados con dicha terapia combinada presenten una carga tumoral reducida, como por ejemplo, al menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de los sujetos tratados con la terapia combinada, presenten una carga tumoral reducida.
[0453] La carga de la enfermedad puede abarcar un número total de células de la enfermedad en el sujeto o en un órgano, tejido o fluido corporal del sujeto, como el órgano o tejido del tumor u otra localización,por ej.,que indicaría metástasis. Por ejemplo, las células tumorales pueden detectarse y/o cuantificarse en la sangre, la linfa o la médula ósea en el contexto de determinadas neoplasias hematológicas. La carga de enfermedad puede incluir, en algunos casos, la masa de un tumor, el número o la extensión de las metástasis y/o el porcentaje de blastos presentes en la médula ósea.
[0454] En algunos casos, el sujeto tiene un mieloma, un linfoma o una leucemia. En algunos casos, el sujeto tiene un linfoma no Hodgkin (NHL), una leucemia linfoblástica aguda (ALL), una leucemia linfocítica crónica (CLL), un linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) o un mieloma,por ej.,un mieloma múltiple (MM). En algunos casos, el sujeto tiene un MM o un DBCBL. En algunos casos, el sujeto tiene un linfoma folicular (FL).
[0455] En algunos casos, el sujeto tiene un tumor sólido.
[0456] En el caso del MM, los parámetros ejemplares para evaluar el alcance de la carga de la enfermedad incluyen parámetros tales como el número de células plasmáticas clonales(por ej.,>10% en la biopsia de médula ósea o en cualquier cantidad en una biopsia de otros tejidos; plasmocitoma), presencia de proteína monoclonal (paraproteína) en suero u orina, evidencia de daño en los órganos terminales que se siente relacionado con el trastorno de células plasmáticas(por ej.,hipercalcemia (calcio corregido >2,75 mmol/l); insuficiencia renal atribuible al mieloma; anemia (hemoglobina <10 g/dl); y/o lesiones óseas (lesiones líticas u osteoporosis con fracturas por compresión)).
[0457] En el caso de DLBCL, los parámetros ejemplares para evaluar la extensión de la carga de la enfermedad incluyen parámetros tales como morfología celular(por ej.,células centroblásticas, inmunoblásticas y anaplásicas), expresión génica, expresión de miARN y expresión proteica,(por ej.,expresión de BCL2, BCL6, MUM1, LMO2, MYC y p21).
[0458] En el caso de la leucemia, la extensión de la carga de la enfermedad puede determinarse mediante la evaluación de la leucemia residual en sangre o médula ósea. En algunos casos, un sujeto presenta enfermedad morfológica si hay más o igual al 5% de blastos en la médula ósea, por ejemplo, detectados mediante microscopía óptica. En algunos casos, un sujeto presenta una remisión completa o clínica si hay menos de un 5% de blastos en la médula ósea.
[0459] En algunos casos, para la leucemia, un sujeto puede exhibir una remisión completa, pero una pequeña proporción de células leucémicas residuales morfológicamente indetectables (por técnicas de microscopía de luz) están presentes. Se dice que un sujeto presenta enfermedad residual mínima (ERM) si el sujeto presenta menos del 5% de blastos en la médula ósea y presenta cáncer detectable molecularmente. En algunos casos, el cáncer detectable molecularmente puede evaluarse utilizando cualquiera de las diversas técnicas moleculares que permiten la detección sensible de un pequeño número de células. En algunos aspectos, dichas técnicas incluyen ensayos de PCR, que pueden determinar reordenamientos únicos de genes receptores de células Ig/T o transcritos de fusión producidos por translocaciones cromosómicas. En algunos casos, la citometría de flujo puede utilizarse para identificar células cancerosas basándose en inmunofenotipos específicos de la leucemia. En algunos casos, la detección molecular del cáncer puede detectar tan sólo 1 célula leucémica en 100.000 células normales. En algunos casos, un sujeto presenta ERM detectable molecularmente si se detecta al menos o más de 1 célula leucémica en 100.000 células, como por PCR o citometría de flujo. En algunos casos, la carga de enfermedad de un sujeto es molecularmente indetectable o MRD-, de forma que, en algunos casos, no se pueden detectar células leucémicas en el sujeto mediante técnicas de PCR o citometría de flujo.
[0460] En algunos casos, los métodos y/o la administración de una inmunoterapia, como una terapia de células T(por ej.CAR) y/o compuesto inmunomodulador, por ejemplo, lenalidomida, disminuye(n) la carga de la enfermedad en comparación con la carga de la enfermedad en un momento inmediatamente anterior a la administración de la inmunoterapia,por ej.,terapia de células T y/o compuesto inmunomodulador.
[0461] En algunos aspectos, la administración de la inmunoterapia,por ej.La terapia de células T y/o el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, pueden prevenir un aumento de la carga de la enfermedad, y esto puede evidenciarse por la ausencia de cambios en la carga de la enfermedad.
[0462] En algunos casos, el método reduce la carga de la enfermedad o afección,por ej.,el número de células tumorales, el tamaño del tumor, la duración de la supervivencia del paciente o la supervivencia libre de eventos, en mayor grado y/o durante un mayor período de tiempo en comparación con la reducción que se observaría con un método comparable que utilizara una terapia alternativa, como aquella en la que el sujeto recibe inmunoterapia,por ej.En algunos casos, la carga de la enfermedad se reduce en mayor medida o durante más tiempo tras la terapia combinada de la administración de la inmunoterapia,por ej.,terapia de células T, y el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, terapia de células T y el compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, en comparación con la reducción que se produciría administrando cada uno de los agentes por separado,por ej.,administrando el compuesto inmunomodulador a un sujeto que no ha recibido la inmunoterapia,por ej.,lenalidomida. terapia de células T; o administrar la inmunoterapia,por ej.terapia de células T, a un sujeto que no ha recibido el compuesto inmunomodulador.
[0463] En algunos casos, la carga de una enfermedad o condición en el sujeto es detectada, evaluada o medida. La carga de enfermedad puede detectarse en algunos aspectos detectando el número total de células enfermas o asociadas a la enfermedad,por ej.,células tumorales, en el sujeto, o en un órgano, tejido o fluido corporal del sujeto, como sangre o suero. En algunos casos, la carga de la enfermedad,por ej.la carga tumoral, se evalúa midiendo la masa de un tumor sólido y/o el número o extensión de las metástasis. En algunos aspectos, se evalúa la supervivencia del sujeto, la supervivencia dentro de un periodo de tiempo determinado, el alcance de la supervivencia, la presencia o duración de la supervivencia libre de eventos o libre de síntomas, o la supervivencia libre de recaídas. En algunos casos, se evalúa cualquier síntoma de la enfermedad o afección. En algunos casos, se especifica la medida de la carga de la enfermedad o afección. En algunos casos, los parámetros ejemplares para la determinación incluyen resultados clínicos particulares indicativos del mejoramiento o mejora de la enfermedad o afección,por ej.,un tumor. Dichos parámetros incluyen: la duración del control de la enfermedad, incluida la respuesta completa (RC), la respuesta parcial (RP) o la enfermedad estable (EV) (véanse,por ej.,las directrices de los Criterios de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos (RECIST)), la tasa de respuesta objetiva (TRO), la supervivencia sin progresión (SLP) y la supervivencia global (SG). Pueden establecerse umbrales específicos para los parámetros a fin de determinar la eficacia del método de terapia combinada aquí descrito.
[0464] En algunos casos, los sujetos tratados según el método logran una respuesta más duradera. En algunos casos, una medida de la duración de la respuesta (DOR) incluye el tiempo transcurrido desde la documentación de la respuesta tumoral hasta la progresión de la enfermedad. En algunos casos, el parámetro para evaluar la respuesta puede incluir la respuesta duradera, por ejemplo, la respuesta que persiste después de un periodo de tiempo desde el inicio de la terapia. En algunos casos, la respuesta duradera se indica por la tasa de respuesta aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18 o 24 meses después del inicio de la terapia. En algunos casos, la respuesta es duradera durante más de 3 meses, más de 6 meses o más de 12 meses. En algunos casos particulares, los sujetos tratados según el método logran una respuesta más duradera después de que el sujeto haya recaído previamente tras la remisión en respuesta a la administración de las células modificadas genéticamente.
[0465] En algunos aspectos, la carga de la enfermedad se mide o detecta antes de la administración de la inmunoterapia,por ej.terapia de células T, tras la administración de la inmunoterapia, porejemploterapia celular T pero antes de la administración del compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida, después de la administración del compuesto inmunomodulador pero antes de la administración de la inmunoterapia,por ej.,terapia celular T, y/o después de la administración tanto de la inmunoterapia,por ej.terapia de células T y el compuesto inmunomodulador. En el contexto de la administración múltiple de uno o más pasos de la terapia combinada, la carga de la enfermedad en algunos casos puede medirse antes o después de la administración de cualquiera de los pasos, dosis y/o ciclos de administración, o en un momento entre la administración de cualquiera de los pasos, dosis y/o ciclos de administración.
[0466] En algunos casos, la carga se disminuye en o por lo menos en o aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, o 100 por ciento por los métodos divulgados en comparación con inmediatamente antes de la administración del compuesto inmunomodulador, porejemplo,lenalidomida y la inmunoterapia,por ej.terapia de células T. En algunos casos, la carga de la enfermedad, el tamaño del tumor, el volumen tumoral, la masa tumoral y/o la carga o volumen tumoral se reducen tras la administración de la inmunoterapia, porejemplo.terapia de células T y el compuesto inmunomodulador, en al menos un 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 % o más en comparación con la inmediatamente anterior a la administración de la inmunoterapia,por ej.terapia de células T y/o el compuesto inmunomodulador.
[0467] En algunos casos, la reducción de la carga de la enfermedad por el método comprende una inducción en la remisión morfológica completa, por ejemplo, evaluada en 1 mes, 2 meses, 3 meses, o más de 3 meses, después de la administración de, porejemplo,la iniciación de, la terapia de combinación.
[0468] En algunos aspectos, un ensayo de enfermedad residual mínima, por ejemplo, medida por citometría de flujo multiparamétrica, es negativo, o el nivel de enfermedad residual mínima es inferior a aproximadamente 0,3%, inferior a aproximadamente 0,2%, inferior a aproximadamente 0,1%, o inferior a aproximadamente 0,05%.
[0469] En algunos casos, la tasa de supervivencia libre de eventos o la tasa de supervivencia global del sujeto mejora con los métodos, en comparación con otros métodos. Por ejemplo, en algunos casos, la tasa o probabilidad de supervivencia libre de eventos para los sujetos tratados con los métodos a los 6 meses después del método de terapia combinada aquí descrito, es superior a aproximadamente el 40%, superior a aproximadamente el 50%, superior a aproximadamente el 60%, superior a aproximadamente el 70%, superior a aproximadamente el 80%, superior a aproximadamente el 90% o superior a aproximadamente el 95%. En algunos aspectos, la tasa de supervivencia global es superior a aproximadamente el 40%, superior a aproximadamente el 50%, superior a aproximadamente el 60%, superior a aproximadamente el 70%, superior a aproximadamente el 80%, superior a aproximadamente el 90% o superior a aproximadamente el 95%. En algunos casos, el sujeto tratado con los métodos presenta una supervivencia libre de eventos, una supervivencia libre de recaídas o una supervivencia de al menos 6 meses, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años. En algunos casos, se mejora el tiempo hasta la progresión, como un tiempo hasta la progresión de más de 6 meses, o al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 años.
[0470] En algunos casos, tras el tratamiento por el método, la probabilidad de recaída se reduce en comparación con otros métodos. Por ejemplo, en algunos casos, la probabilidad de recaída a los 6 meses tras el método de terapia combinada, es inferior a aproximadamente el 80%, inferior a aproximadamente el 70%, inferior a aproximadamente el 60%, inferior a aproximadamente el 50%, inferior a aproximadamente el 40%, inferior a aproximadamente el 30%, inferior a aproximadamente el 20% o inferior a aproximadamente el 10%.
IV. ARTÍCULOS DE FABRICACIÓN Y KITS
[0471] También se divulgan artículos de fabricación que contienen un fármaco inmunomodulador (compuesto inmunomodulador), como lenalidomida, y componentes para la inmunoterapia,por ej.,anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o terapia de células T,por ej.,células diseñadas, y/o composiciones de los mismos. Los artículos de fabricación pueden incluir un envase y una etiqueta o prospecto en el envase o asociado a él. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de solución intravenosa, etc. Los recipientes pueden estar hechos de diversos materiales, como vidrio o plástico. En algunos casos, el recipiente contiene una composición que es por sí misma o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la enfermedad. En algunos casos, el contenedor tiene un puerto de acceso estéril. Los recipientes ejemplares incluyen bolsas de solución intravenosa, viales, incluidos aquellos con tapones perforables por una aguja para inyección, o botellas o viales para agentes administrados por vía oral. La etiqueta o el prospecto pueden indicar que la composición se utiliza para tratar una enfermedad o afección.
[0472] El artículo de fabricación puede incluir (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición incluye el anticuerpo o las células de ingeniería utilizadas para la inmunoterapia, porejemplo.T; y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en el que la composición incluye el segundo agente, como un compuesto inmunomodulador,por ej.,lenalidomida. El artículo de fabricación puede incluir además un prospecto en el que se indique que las composiciones pueden utilizarse para tratar una afección concreta. Alternativa o adicionalmente, el artículo de fabricación puede incluir además otro o el mismo recipiente que comprenda un tampón farmacéuticamente aceptable. Además, puede incluir otros materiales como otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y/o jeringas.
V. DEFINICIONES
[0473] A menos que se defina de otro modo, todos los términos de la técnica, notaciones y otros términos o terminología técnica y científica utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con conocimientos ordinarios en la técnica a la que pertenece la materia reivindicada. En algunos casos, los términos con significados comúnmente entendidos se definen aquí para mayor claridad y/o para facilitar la referencia, y la inclusión de tales definiciones aquí no debe interpretarse necesariamente como una diferencia sustancial sobre lo que generalmente se entiende en la técnica.
[0474] Como se usa aquí, un "sujeto" es un mamífero, tal como un humano u otro animal, y típicamente es humano. En algunos casos, el sujeto, por ejemplo, el paciente, al que se administran los polipéptidos inmunomoduladores, las células artificiales o las composiciones, es un mamífero, típicamente un primate, como un ser humano. En algunos casos, el primate es un mono o un simio. El sujeto puede ser hombre o mujer y de cualquier edad, incluidos lactantes, jóvenes, adolescentes, adultos y ancianos. En algunos casos, el sujeto es un mamífero no primate, como un roedor.
[0475] Como se usa aquí, "tratamiento" (y variaciones gramaticales del mismo como "tratar" o "tratando") se refiere a la mejoría o reducción completa o parcial de una enfermedad o condición o desorden, o un síntoma, efecto adverso o resultado, o fenotipo asociado con el mismo. Los efectos deseables del tratamiento incluyen, entre otros, la prevención de la aparición o recurrencia de la enfermedad, el alivio de los síntomas, la disminución de cualquier consecuencia patológica directa o indirecta de la enfermedad, la prevención de la metástasis, la disminución de la tasa de progresión de la enfermedad, la mejora o paliación del estado de la enfermedad y la remisión o mejora del pronóstico. Los términos no implican la curación completa de una enfermedad ni la eliminación total de ningún síntoma o efecto(s) sobre todos los síntomas o resultados.
[0476] Tal como se utiliza en el presente documento, "retrasar el desarrollo de una enfermedad" significa diferir, obstaculizar, ralentizar, retardar, estabilizar, suprimir y/o posponer el desarrollo de la enfermedad (como el cáncer). Este retraso puede ser de duración variable, en función de los antecedentes de la enfermedad y/o del individuo tratado. Como es evidente, un retraso suficiente o significativo puede, en efecto, abarcar la prevención, en el sentido de que el individuo no desarrolle la enfermedad. Por ejemplo, un cáncer en fase avanzada, como el desarrollo de metástasis, puede retrasarse.
[0477] "Prevenir," como se usa aquí, incluye proveer profilaxis con respecto a la ocurrencia o recurrencia de una enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero que aún no ha sido diagnosticado con la enfermedad. En algunos casos, las células y composiciones proporcionadas se utilizan para retrasar el desarrollo de una enfermedad o ralentizar su progresión.
[0478] Como se usa aquí, "suprimir" una función o actividad es reducir la función o actividad cuando se compara con las mismas condiciones excepto por una condición o parámetro de interés, o alternativamente, cuando se compara con otra condición. Por ejemplo, las células que suprimen el crecimiento tumoral reducen la tasa de crecimiento del tumor en comparación con la tasa de crecimiento del tumor en ausencia de las células.
[0479] Una "cantidad efectiva" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica, células, o composición, en el contexto de administración, se refiere a una cantidad efectiva, en dosis/cantidades y por períodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado deseado, tal como un resultado terapéutico o profiláctico.
[0480] Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente, por ejemplo, una formulación farmacéutica o células de ingeniería, se refiere a una cantidad eficaz, a las dosis y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado, como para el tratamiento de una enfermedad, afección o trastorno, y/o el efecto farmacocinético o farmacodinámico del tratamiento. La cantidad terapéuticamente eficaz puede variar en función de factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del sujeto, y los polipéptidos inmunomoduladores o las células de ingeniería administradas. En algunos casos, los métodos divulgados implican administrar los polipéptidos inmunomoduladores, las células manipuladas o las composiciones en cantidades eficaces, por ejemplo, cantidades terapéuticamente eficaces.
[0481] Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, en las dosis y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, dado que una dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes o en un estadio más temprano de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
[0482] El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que tiene una forma tal que permite que la actividad biológica de un ingrediente activo contenido en ella sea eficaz, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se administraría la formulación.
[0483] Un "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente en una formulación farmacéutica, distinto de un ingrediente activo, que no es tóxico para un sujeto. Un portador farmacéuticamente aceptable incluye, entre otros, un tampón, un excipiente, un estabilizador o un conservante.
[0484] Tal como se utiliza en el presente documento, la mención de que nucleótidos o posiciones de aminoácidos "corresponden a" nucleótidos o posiciones de aminoácidos en una secuencia divulgada, tal como se expone en el listado de secuencias, se refiere a nucleótidos o posiciones de aminoácidos identificados tras la alineación con la secuencia divulgada para maximizar la identidad utilizando un algoritmo de alineación estándar, tal como el algoritmo GAP. Al alinear las secuencias, se pueden identificar los residuos correspondientes, por ejemplo, utilizando como guías residuos de aminoácidos conservados e idénticos. En general, para identificar las posiciones correspondientes, las secuencias de aminoácidos se alinean de forma que se obtenga la coincidencia de mayor orden (véase, por ejemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva. Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073).
[0485] El término "vector", como se usa aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de propagar otro ácido nucleico al cual está ligado. El término incluye el vector como estructura de ácido nucleico autorreplicante, así como el vector incorporado en el genoma de una célula huésped en la que se ha introducido. Ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los ácidos nucleicos a los que están operativamente unidos. Tales vectores se denominan aquí "vectores de expresión". Entre los vectores se encuentran los vectores virales, como los retrovirales, por ejemplo, los vectores gammaretrovirales y lentivirales.
[0486] Los términos "célula huésped", "línea celular huésped" y "cultivo celular huésped" se utilizan indistintamente y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluida la progenie de dichas células. Las células huésped incluyen los "transformantes" y las "células transformadas", que incluyen la célula transformada primaria y la progenie derivada de ella sin tener en cuenta el número de pasajes. La progenie puede no ser completamente idéntica en contenido de ácido nucleico a una célula progenitora, sino que puede contener mutaciones. Se incluye aquí la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que la célula transformada originalmente.
[0487] Como se usa aquí, una declaración de que una célula o población de células es "positiva" para un marcador particular se refiere a la presencia detectable en o sobre la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la presencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y la detección de dicho anticuerpo, en el que la tinción es detectable por citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior a la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas y/o a un nivel sustancialmente similar al de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente superior al de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.
[0488] Como se usa aquí, una declaración de que una célula o población de células es "negativa" para un marcador particular se refiere a la ausencia de presencia sustancial detectable en o sobre la célula de un marcador particular, típicamente un marcador de superficie. Cuando se hace referencia a un marcador de superficie, el término se refiere a la ausencia de expresión de superficie detectada por citometría de flujo, por ejemplo, mediante tinción con un anticuerpo que se une específicamente al marcador y detección de dicho anticuerpo, en la que la tinción no se detecta por citometría de flujo a un nivel sustancialmente superior a la tinción detectada llevando a cabo el mismo procedimiento con un control de isotipo coincidente en condiciones por lo demás idénticas, y/o a un nivel sustancialmente inferior al de la célula que se sabe que es positiva para el marcador, y/o a un nivel sustancialmente similar en comparación con el de una célula que se sabe que es negativa para el marcador.
[0489] Una sustitución de aminoácidos puede incluir el reemplazo de un aminoácido en un polipéptido por otro aminoácido. La sustitución puede ser una sustitución conservadora de aminoácidos o una sustitución no conservadora de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden introducirse en una molécula de unión de interés, por ejemplo, un anticuerpo, y los productos pueden analizarse para determinar la actividad deseada,por ej.,la retención/mejora de la unión al antígeno, la disminución de la inmunogenicidad o la mejora de la ADCC o la CDC.
[0490] Los aminoácidos generalmente pueden agruparse según las siguientes propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobo: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) hidrófilo neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) ácido: Asp, Glu;
(4) básico: His, Lys, Arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro;
(6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
[0491] En algunos casos, las sustituciones conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase. En algunos casos, las sustituciones no conservadoras de aminoácidos pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por otro de otra clase.
[0492] Tal como se utiliza en el presente documento, "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" y "porcentaje de identidad" cuando se utilizan con respecto a una secuencia de aminoácidos (secuencia polipeptídica de referencia) se definen como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata (por ej. el anticuerpo o fragmento en cuestión) que son idénticos a los residuos de aminoácidos de la secuencia polipeptídica de referencia, tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad de secuencia, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación para determinar el porcentaje de identidad entre secuencias de aminoácidos puede realizarse de varias maneras, por ejemplo, utilizando programas informáticos de acceso público como BLAST, BLAST-2, ALIGN o Megalign (DNASTAr ). Pueden determinarse los parámetros adecuados para alinear las secuencias, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la máxima alineación en toda la longitud de las secuencias comparadas.
[0493] Tal como se utilizan aquí, las formas singulares "un/una", y "el/la" incluyen una referencia plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, "un" o "una" significa "al menos uno" o "uno o más". Se entiende que los aspectos y variaciones aquí descritos incluyen aspectos y variaciones "consistentes" y/o "consistentes esencialmente en".
[0494] A lo largo de esta divulgación, varios aspectos de la materia reivindicada se presentan en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es meramente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible sobre el alcance de la materia reivindicada. En consecuencia, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha revelado específicamente todos los posibles subintervalos, así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor declarado o intermedio en ese intervalo declarado está comprendido dentro de la materia reivindicada. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños, y también están comprendidos dentro del objeto reivindicado, sujeto a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo declarado. Cuando el intervalo declarado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos límites incluidos también se incluyen en el objeto reivindicado. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
[0495] El término "aproximadamente", tal como se utiliza aquí, se refiere al intervalo de error habitual para el valor respectivo fácilmente conocido en este campo técnico. La referencia a "sobre" un valor o parámetro incluye (y describe) instancias dirigidas a ese valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción referida a "sobre X" incluye la descripción de "X".
[0496] Como se usa aquí, una composición se refiere a cualquier mezcla de dos o más productos, sustancias o compuestos, incluyendo células. Puede ser una solución, una suspensión, un líquido, un polvo, una pasta, acuosa, no acuosa o cualquier combinación de los mismos.
VII. EJEMPLOS
[0497] Los siguientes ejemplos se incluyen únicamente con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Actividad citolítica de células CAR-T anti-BCMA y producción de citocinas tras la incubación con líneas celulares diana que expresan BCMA en presencia o ausencia de lenalidomida.
[0498] Las células T se aislaron por enriquecimiento basado en inmunoafinidad a partir de muestras de leucaféresis de donantes sanos. Las células aisladas se transdujeron con un vector vírico que codificaba uno de varios CAR anti-BCMA ejemplares. Cada CAR anti-BCMA contenía un scFv anti-BCMA humano, una región espaciadora, un dominio transmembrana CD28, una secuencia de coseñalización intracelular derivada de 4-1BB y un dominio de señalización intracelular derivado de CD3-zeta. La construcción del vector viral codificaba además un EGFR truncado (EGFRt), que servía como marcador sustitutivo de la expresión de CAR; la región codificante de EGFRt estaba separada de la secuencia CAR por una secuencia de salto T2A. Tras la transducción, las células se expandieron y las composiciones resultantes se congelaron mediante criopreservación.
[0499] Las células T CAR anti-BCMA criocongeladas se descongelaron y se evaluaron para varias respuestas después del co-cultivo con células diana que expresan BCMA en presencia o ausencia de lenalidomida. Se realizaron ensayos in vitro para evaluar la destrucción de células diana y la producción de citocinas utilizando dos líneas celulares de mieloma múltiple diana RPMI-8226 u OPM-2 que expresan Bc Ma . La FIG. 1A muestra la expresión superficial de BCMA, evaluada por citometría de flujo tras la tinción con un anticuerpo anti-BCMA, de líneas celulares de mieloma múltiple ejemplares, incluidas RPMI-8226 y OPM-2. La línea de puntos indica el fondo de una línea celular BCMA negativa teñida con anticuerpo anti-BCMA. IMF, intensidad de fluorescencia media. La expresión de BCMA fue relativamente baja en ambas líneas celulares (véase Lee et al. (2016) Br J Haematol. 174:911-922). Se ha demostrado que RPMI-8226 es más sensible a la lenalidomida que OPM-2 (6,43 y 37,4 j M, respectivamente) (Wellcome Sanger Institute. Genómica de la sensibilidad a los fármacos en el cáncer. www.cancerrxgene.org/translation/Drug/1020. Consultado el 7 de febrero de 2018).
A. RPMI-8226
1. Actividad Citolítica
[0500] Las células de la línea celular diana que expresan BCMA (RPMI-8226) se incubaron con células T CAR anti-BCMA ejemplares que expresaban un CAR con un scFv anti-BCMA humano en una proporción de células efectoras a células diana (E:T) de 0,3:1 en presencia de lenalidomida 1<j>M o 10<j>M o en ausencia de lenalidomida (vehículo). Como controles se utilizaron co-cultivos con células T que no expresaban el CAR (simulacro) o cultivos sólo con células diana (sin CAR T), cada uno en presencia o ausencia (vehículo) de 10 j M o 1 j M de lenalidomida. Las células de cada condición se sembraron por triplicado.
[0501] Las células RPMI-8226 diana se marcaron con NucLight Red (NLR) para permitir su seguimiento por microscopía. La actividad citolítica se evaluó midiendo la pérdida de células diana viables durante un periodo de seis días, determinada por la señal fluorescente roja (utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte®, Essen Bioscience). El número normalizado de células diana se generó dividiendo el recuento de células diana por el recuento de células al inicio de cada cultivo. El porcentaje de destrucción de la diana se evaluó midiendo el área bajo la curva (AUC) para el recuento normalizado de células diana a lo largo del tiempo y normalizando los valores AUC inversos (1/AUC) definiendo un valor 0% (células diana solas) y un valor 100% (células T CAR+ co-cultivadas con células diana en control con vehículo).
[0502] Como se muestra, el co-cultivo en presencia de 1 j M (FIG. 1C) o 10 j M (FIG. 1B, 1C) la lenalidomida produjo un mayor grado de destrucción de las células diana por las células T CAR+ anti-BCMA en el día 6 del co-cultivo, en comparación con la incubación de las células diana con las células T CAR+ anti-BCMA en ausencia de lenalidomida (fijado en el 100% en la FIG. 1B). Como se muestra en la FIG. 1C, el efecto observado de la lenalidomida sobre la actividad citolítica fue sensible a la dosis y tardío, no emergiendo hasta después de aproximadamente 50 horas en cultivo. Los resultados fueron coherentes con el papel de la lenalidomida en la promoción de la función continuada y/o la supervivencia (por ejemplo, previniendo el agotamiento o la muerte celular) de las células CAR-T tras la activación inicial. Se observaron resultados similares en células diseñadas para expresar otros CARs anti-BCMA, cada uno con diferentes dominios de unión scFv.
2. Producción de Citoquinas/Acumulación
[0503] Se evaluaron los niveles de varias citocinas en sobrenadantes de cultivo después de incubar células T CAR anti-BCMA con células de la línea celular diana RPMI-8226 que expresan BCMA en una proporción de 0,3:1 de células efectoras a células diana (E:T) en presencia o ausencia de 10 j M de lenalidomida. Como control se utilizó el cultivo de células T que no expresaban el CAR anti-BCMA (mock). Cantidades de IL-2 (FIG. 2A), IFNy (FIG. 2B), y TNF-a (FIG. 2C) en los sobrenadantes de cultivo se evaluó a las 48 horas del inicio del cultivo. Como se muestra en las FIGs. 2A-2C, la presencia de lenalidomida se asoció con un aumento de la producción y/o acumulación de citoquinas dependientes de CAR tras el co-cultivo de células diana CAR T anti-BCMA con células diana específicas de antígeno. Estos resultados fueron coherentes con el papel de la lenalidomida en la promoción de las funciones efectoras mediadas por CAR. Se observaron resultados similares con células que expresaban otros CARs anti-BCMA, cada uno con diferentes dominios de unión scFv.
B. OPM-2
3. Actividad Citolítica
[0504] Las células diana de mieloma múltiple OPM-2 se incubaron con células T humanas (aisladas de cuatro donantes independientes diferentes) que expresaban un CAR anti-BCMA ejemplar) a una proporción de células efectoras a células diana (E:T) de 1:1 en presencia de lenalidomida 0,01 j M, 0,1 j M, 1,0 j M o 10 j M o en ausencia de lenalidomida durante un periodo de 7 días. Las células OPM-2 se marcaron con NucLight Red (NLR) para permitir el seguimiento de las células diana mediante microscopía, tal como se ha descrito anteriormente. La actividad citolítica se evaluó midiendo la pérdida de células diana viables al final de la incubación. El grado de actividad citolítica observado en los cultivos incubados en ausencia de lenalidomida se fijó como valor de referencia, el 100 %. Los resultados se muestran en la FIG. 3A.Se observó que la adición de lenalidomida potenciaba la actividad citolítica de las células T CAR+ anti-BCMA contra las células diana OPM-2, de forma dosis-dependiente. Se observaron resultados similares en otras células T que expresaban CAR anti-BCMA, incluidas las que expresaban diferentes CAR anti-BCMA, cada una con diferentes dominios de unión scFv y/o creadas utilizando células de diferentes donantes.
4. Citoquina
[0505] Las células T CAR anti-BCMA, producidas a partir de cuatro donantes independientes, se incubaron con la línea celular diana OPM-2 que expresa BCMA a una proporción de células efectoras a diana (E:T) de 1:1 en presencia de 0,01 |jM, 0,1|jM, 1,0|jM o 10|jM de lenalidomida o en ausencia de lenalidomida (línea de base, fijada en 100%). Tras 24 horas de cultivo, la presencia de IFNy (FIG. 3B), IL-2 (FIG. 3C), y TNF-a (FIG. 3D) en sobrenadantes de cultivo. Como se muestra en las FIGS. 3B-3D, se observó que la lenalidomida aumentaba la producción y/o acumulación de citocinas por parte de las células T CAR+ anti-BCMA estimuladas con antígeno de forma dependiente de la dosis.
C. COMPARACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS CÉLULAS T ANTI-BCMA CAR+ DERIVADAS DE MÚLTIPLES DONANTES
[0506] En otro estudio, se incubaron células T CAR anti-BCMA de un donante sano representativo y un paciente con mieloma múltiple (el paciente era refractario a la pomalidomida) con células diana OPM-2 marcadas fluorescentemente a una proporción de células efectoras a células diana (E:T) de 0.3:1 en presencia de concentraciones variables de lenalidomida (0,01 jiM, 0,1 jiM, 1,0 jiM o 10 jiM de lenalidomida) o en ausencia de lenalidomida durante 6 a 7 días. La actividad citolítica se midió por la pérdida de células rojas fluorescentes. Para evaluar la producción de citocinas, se cocultivaron células CAR-T anti-BCMA derivadas de donantes sanos y de pacientes con mieloma múltiple con células diana OPM-2 marcadas con fluorescencia en una proporción de células efectoras a células diana (E:T) de 1:1 en presencia de concentraciones variables de lenalidomida (0,01 jiM, 0,1 jiM, 1,0 jiM o 10 jiM de lenalidomida) o en ausencia de lenalidomida. Transcurridas 24 horas, se tomaron muestras de los medios para evaluar la presencia de IFNy e IL-2. Los resultados mostrados en la FIG. 3E, que son una media de dos experimentos; se observó que la actividad citolítica anti-BCMA CAR-T específica de antígeno y la producción de citocinas aumentaban con lenalidomida de forma dependiente de la concentración.
[0507] Los estudios anteriores se ampliaron con células T CAR+ anti-BCMA generadas a partir de células de otros dos donantes sanos. Se comparó la actividad de las células T CAR+ anti-BCMA de tres donantes sanos y un paciente refractario a IMiD (el donante del paciente era refractario a la pomalidomida) frente a las líneas celulares de mieloma múltiple OPM-2 y Rp MI-8226 que expresan BCMA. La actividad citolítica y la producción de citocinas (IFNy, IL-2 y TNF-a) se ensayaron sustancialmente como se ha descrito anteriormente. Se calcularon los cambios absolutos en los niveles de citoquinas en relación con el control con vehículo. Los experimentos se realizaron de 2 a 3 veces en cada donante.
[0508] Se observó una mayor actividad citolítica anti-BCMA CAR T contra las células diana OPM-2 tituladas con concentraciones crecientes de lenalidomida en todos los donantes(P= 6,2 * 10'5) (FIG. 3F). Como se muestra en la FIG.
3F, el efecto del tratamiento con lenalidomida sobre la actividad citolítica de los CAR T parecía depender del donante en el cultivo conjunto con RPMI-8226, mostrando el donante paciente un aumento significativo de la actividad citolítica (P = 1,9 * 10'8). Además, todos los donantes de CAR T presentaron un aumento significativo de la producción de IFN-<y>, IL-2 y TNF-a de forma dependiente de la concentración de lenalidomida en el co-cultivo con células OPM-2(P< 0,002, FIG.
3G). La producción de citocinas por las células T que expresan CAR en cocultivo RPMI-8226 también aumentó significativamente en todos los donantes y citocinas tras el tratamiento con lenalidomida(P< 0,003, FIG. 3H).
Ejemplo 2 Efecto de la lenalidomida sobre la expansión de células CAR-T y la función antígeno-específica con reestimulación seriada
A. Expansión de células CAR-T
[0509] La capacidad de las células T CAR para expandirse y mostrar una función específica de antígeno ex vivo tras rondas repetidas de estimulación con antígeno puede correlacionarse con la función in vivo y/o la capacidad de las células para persistir in vivo (por ej. tras la administración y activación inicial en respuesta al encuentro con el antígeno) (Zhao et al. (2015) Cancer Cell, 28:415-28). Las células T CAR+ anti-BCMA generadas como se ha descrito anteriormente se sembraron por triplicado a 1 * 105 células/pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadieron células diana irradiadas que expresaban BCMA (células MM1.S) en una proporción efector-diana (E:T) de 1:2 en presencia o ausencia de diversas concentraciones (0,01 jiM, 0,1 jiM, 1,0 jiM o 10 jiM) de lenalidomida.
[0510] Cada 3-4 días (inicio de cada nueva ronda), se contaron las células T CAR. A continuación, se cosecharon las células y se volvieron a implantar a la densidad de siembra inicial con medio fresco, lenalidomida recién añadida a la misma concentración, en su caso, y células diana recién descongeladas y recién irradiadas. Se realizaron 8 rondas de estimulación durante un periodo de cultivo de 31 días. En algunas rondas, se evaluó la presencia de marcadores fenotípicos en las células mediante citometría de flujo.
[0511] En la FIG. 4A. Como se muestra, se observó una mayor expansión de células T CAR anti-BCMA en el día 14 para todas las concentraciones de lenalidomida, en comparación con los pocillos sin lenalidomida. El ensayo se realizó con varias composiciones de células T CAR+ anti-BCMA, cada una generada mediante la introducción del CAR en células T derivadas de uno de seis donantes diferentes. El ensayo se realizó con células de seis donantes independientes diferentes modificadas para expresar el CAR. Para cada donante, se observó un aumento o ningún cambio en la expansión de CAR-T a la concentración de 0,1 jiM de lenalidomida. La FIG. 4B muestra los resultados de un ensayo similar, en el que células diseñadas para expresar dos CARs anti-BCMA humanos diferentes fueron sometidas a múltiples rondas de estimulación de células diana en presencia o ausencia de lenalidomida. Como se muestra, se observó que la presencia de lenalidomida en los cultivos incrementaba la expansión en ambas poblaciones celulares, comenzando entre el día 21 y el día 28. Los resultados fueron consistentes con la conclusión de que la lenalidomida puede promover la expansión y/o supervivencia continuada de las células T CAR+ tras el encuentro repetido con el antígeno cognado.
B. Recuento de células CAR-T, producción de citocinas y activación
[0512] Las células T anti-BCMA CAR+ de 3 donantes generadas como se describió anteriormente se sembraron por triplicado en placas de 96 pocillos con células diana irradiadas que expresaban BCMA (células MM1S) en una proporción efector-diana (E:T) de 1:2, en presencia de lenalidomida 0,1 pM o control con vehículo. Las condiciones de cultivo se reajustaban cada 3-4 días. La reposición se mantuvo durante 28 días o hasta que el recuento celular fue < 50.000 células. Los experimentos se realizaron por triplicado en 3 donantes. Los niveles de citocinas (IFN<y>, IL-2 y TNF-a) se evaluaron 24 horas después de la reimplantación en los días 5, 8 y 15. La activación de las células CAR-T se midió en las células recogidas en los días 4, 7 y 14 mediante citometría de flujo para CD25.
[0513] La FIG. 5A muestra los recuentos celulares (duplicaciones poblacionales proyectadas) de las células T CAR+ anti-BCMA para cada punto temporal de reestimulación. La "x" indica insuficiencia de células para la repetición del ensayo. Los resultados mostraron que después de la estimulación repetida con células diana, los 3 donantes CAR T tratados con lenalidomida habían aumentado los recuentos de células proyectadas durante 28 días en relación con los controles (P < 0,003). La FIG. 5B muestra la intensidad mediana de fluorescencia (IMF) de CD25 (en células CD3+ CAR+ vivas) y la FlG.
5C muestra la producción de citoquinas normalizada para el número de células sembradas. El aumento de los recuentos celulares se asoció a un aumento significativo de la expresión de CD25 en CAR T(P< 3,4 * 10'4; FIG. 5B) y la producción de IL-2, IFN-y y TNF-a en los medios (P < 0,5; FIG. 5C). Los resultados mostraron que el recuento de células CAR-T anti-BCMA, la producción de citocinas y la activación aumentaban con la lenalidomida tras repetidas estimulacionesin vitro.
Ejemplo 3 Efectos de la lenalidomida en la proliferación y activación de BCMA CAR-T en un modelo de mieloma 3D
[0514] Para evaluar la función celular en el contexto de un microambiente tisular tridimensional (3-D) humano que expresa BCMA, se incrustó una médula ósea reconstruida (rBone™) (zPREDICTA, San Jose, CA) con RPMI-8226 que expresa BCMA. Se incubaron 20.000 células T que expresaban otro CAR anti-BCMA humano ejemplar (o células T simuladas que no expresaban el CAR) en el modelo tridimensional en presencia o ausencia de 1,0 pM de lenalidomida.
[0515] Después de 2 o 7 días, las células fueron aisladas y evaluadas por citometría de flujo para la expresión superficial de c D3, c D25, CD4 y CD8. Como se muestra en la FIG. 6A, se observó que la presencia de lenalidomida producía un aumento del número total de células CD3+ en cultivos con células T CAR+ anti-BCMA en el día 7. Un aumento de la expresión de CD25+ en CD4+ (FIG. 6B) y CD8+ (FIG. 6C) poblaciones de células T también se observó en presencia de lenalidomida. Los resultados fueron coherentes con la conclusión de que la lenalidomida puede promover una mayor expansión, supervivencia y/o función de las células T CAR+ anti-BCMA en un microambiente tumoral con expresión de antígenos.
Ejemplo 4 Efecto de la lenalidomida sobre la función de las células T CARin vivo
[0516] Se evaluaron los efectos antitumorales de las células T CAR anti-BCMA, solas y en combinación con lenalidomida, en dos modelos tumorales de ratón diferentes que expresan BCMA: un modelo de ratón de xenoinjerto de mieloma múltiple humano RPMI 8226 (modelo de implante subcutáneo) y un modelo de ratón de xenoinjerto de mieloma múltiple humano OPM-2 (modelo ortotópico de médula ósea).
A. MODELO RPMI-8226
[0517] Se inyectaron ratones por vía subcutánea (s.c.) con 5 * 106 células RPMI-8226, y se dejó crecer el volumen tumoral hasta aproximadamente 150 mm3. En el día 0, se administró por vía intravenosa a los ratones una composición que contenía una dosis subóptima (baja) de células T CAR+ anti-BCMA (generadas mediante la transducción de células derivadas de muestras de sujetos donantes humanos, esencialmente como se ha descrito anteriormente) (utilizándose como control una composición similar de células T que no expresaban un CAR (simulacro)). En concreto, la composición contenía aproximadamente 5 * 105 células T CD4+ CAR+ (o simuladas) y 5 * 105 células T CD8+ CAR+ (o simuladas). Las células T se transfirieron adoptivamente a ratones, solas o en combinación con lenalidomida, administrada diariamente, a 25 mg/kg, por vía intraperitoneal (i.p.), comenzando en d=0 (con la administración de células T), continuando hasta el día 21. En otro grupo de control, se administró lenalidomida sola a los ratones, sin administración de células T. Durante todo el estudio se controló el volumen tumoral y la supervivencia de los animales. Se tomó una hemorragia retroorbitaria (RO) semanal para determinar los niveles plasmáticos de BCMA e IFN-gamma y para la evaluación farmacocinética (PK) de las células T CAR+.
[0518] Las mediciones del volumen tumoral se muestran para animales individuales en la FIG. 7A, se observó que la administración de lenalidomida y la dosis baja de células T anti-BCMA CAR+ en combinación producía un crecimiento tumoral más lento en comparación con los ratones tratados con lenalidomida o células T anti-BCMA CAR+ por separado. El efecto observado fue más evidente en los puntos temporales posteriores, incluidos los posteriores a la última administración diaria de lenalidomida (es decir, después del día 21). Los resultados son coherentes con la capacidad de la lenalidomida para aumentar la capacidad de las células T para persistir y/o funcionar a largo plazo.
[0519] Como se muestra en la FIG. 7B, los ratones que recibieron lenalidomida y células T CAR+ anti-BCMA mostraron una mayor supervivencia en comparación con los otros grupos de tratamiento. La supervivencia media (ms) de los ratones a los que se administraron células T CAR+ anti-BCMA y lenalidomida fue de 85 días (el doble, en comparación con los otros grupos de tratamiento, que presentaron una supervivencia media de 38-43,5 días).
[0520] Además, se determinó el número de células T CD4+ y CD8+ CAR+ y células T no CAR en la sangre periférica de cada animal en los días 7, 14, 21 y 34. El número de células T CD4+ CAR y de células T no CAR se muestra en las FIGs.
8A y 8E (días 7 y 14), respectivamente, y FIG. 8B y 8F (días 21 y 34), respectivamente. Los números de células T CD8+ Ca R no CAR se muestran en las FIGs. 8C y 8G (días 7 y 14), respectivamente, y Fig. 8D y 8H (días 21 y 34), respectivamente. Como se muestra, se observó un aumento del número de células T CAR+ CD4+ y CD8+ (pero no de células T no CAR+) en sangre en el día 36 en los ratones que habían recibido la combinación de células T CAR+ anti-BCMA y lenalidomida, en comparación con los otros grupos de tratamiento.
B. MODELO OPM-2
i. Estudio 1
[0521] El efecto de la lenalidomida en combinación con CAR T anti-BCMA también se evaluó en un modelo tumoral ortotópico murino utilizando células OPM-2. A los ratones (ratones NOD.Cg-PrkdcscidIL-2rgtm1Wj1/SzJ (NSG; Jackson Labs)) se les inyectaron por vía intravenosa (i.v.) 2 * 106 células OPM2 (mieloma múltiple) transfectadas con luciferasa de luciérnaga (OPM2-ffluc). Se permitió el injerto tumoral durante 13 días antes de la estadificación (14 días antes de la administración de células CAR-T) y se verificó mediante imágenes de bioluminiscencia. Se administró a ratones una o más composiciones en varios grupos de tratamiento, como se indica a continuación y se resume en la Tabla E1.
[0522] Algunos grupos recibieron 10 mg/kg de lenalidomida en solución salina tamponada con fosfato mediante inyección intraperitoneal, ya sea (A) comenzando en el día -1 (un día antes de la administración de células T CAR+) (lenalidomida (A)); o (B) en el día 14 (día 14 después del inicio de la administración de células T CAR+) (lenalidomida (B)), en cada caso, diariamente, durante la duración del estudio. En los grupos que recibieron células T CAR+, se administraron CAR anti-BCMA (generadas mediante la transducción de células derivadas de muestras de sujetos donantes humanos esencialmente como se ha descrito anteriormente) en el día 0 (día 14 después de la inyección de células tumorales), a una dosis de 5 * 105 (baja) o 1 * 106 (alta) células T que expresaban CAR. La Tabla E1 resume los regímenes de dosificación.
[0523] La carga tumoral en los animales de los distintos grupos se monitorizó mediante imágenes de bioluminiscencia hasta el día 39 tras la dosificación de células T CAR+. Para la obtención de imágenes de bioluminiscencia, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales (i.p.) de sustrato de luciferina (CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA) resuspendido en PBS (15 pg/g de peso corporal). Se determinó el flujo total (fotón/s) en cada punto temporal.
[0524] La FIG. 9A y FIG. 9B representan los resultados de la carga tumoral hasta el día 46, en ratones tratados con lenalidomida diariamente a partir del día -1 (lenalidomida A) en presencia o ausencia de la carga tumoral alta (1 * 10A6; FIG. 9A) o bajo (5 * 10A5; FIG. 9B) Dosis de células T CAR+. La FlG. 9C muestra gráficos de la carga tumoral de animales individuales hasta el día 53. La FIG. 9D muestra gráficas y resultados de imágenes tumorales (día 46 post-administración de células CAR+) para animales individuales que han recibido la dosis más alta de CAR+, con lenalidomida en el día -1 (lenalidomida A). La FIG. 9E muestra gráficos y resultados de imágenes tumorales (día 46 post-administración de células CAR+) para animales individuales que recibieron la dosis CAR+ más alta, sin lenalidomida en el día -1 (lenalidomida A). Los asteriscos indican la muerte o el sacrificio de un animal en el momento indicado en el gráfico. Como se muestra, se observó que la adición de lenalidomida producía un crecimiento tumoral más lento y una carga tumoral reducida en los ratones a los que se administraron células T CAR+ en ambas dosis de células T CAR+.
[0525] La FIG. 9F y FIG. 9G representan los resultados de la carga tumoral en un punto temporal de un estudio con ratones a los que se administró lenalidomida a partir del día 14 tras la administración de CAR+T (lenalidomida B) (líneas verticales en las FIGs. 9F y 9G) en presencia o ausencia de la alta (1 * 10A6, FIG. 9F) o bajo (5 * 10A5, FIG. 9G) Dosis de células T CAR+. La FIG. 9H muestra gráficos de la carga tumoral de animales individuales hasta el día 53. La FIG. 9I muestra gráficas y resultados de imágenes tumorales (día 46 post-administración de células CAR+) para animales individuales que recibieron la dosis más alta de CAR+, con lenalidomida en el día -1 (lenalidomida A). La FIG. 9J muestra gráficas y resultados de imágenes tumorales (día 46 post-administración de células CAR+) para animales individuales que recibieron la dosis CAR+ más alta, sin lenalidomida en el día -1 (lenalidomida A). Como se muestra, mientras que no se observó que la lenalidomida por sí sola redujera el crecimiento tumoral o la carga tumoral, se observó que la adición de lenalidomida producía una tendencia hacia un crecimiento tumoral más lento y una carga tumoral reducida en ratones administrados con ambas dosis de células CAR-T, observándose claras diferencias a partir del día 30-40 tras la inyección de células CAR-T para la dosis más alta (1 * 10A6) de células CAR+. Con esta dosis, se observó que la combinación con lenalidomida ralentizaba el crecimiento tumoral, tanto si se administraba en el día -1 como si se hacía mediante dosificación diferida.
[0526] Los resultados de supervivencia en un punto temporal del estudio se muestran en las FIGs. 10A y 10B (para los grupos que recibieron lenalidomida mediante los regímenes (d-1) y B (d.14 post-CAR (retardado), respectivamente), y las FIGs. 10c y 10D (para los grupos que recibieron dosis altas y bajas de CAR, respectivamente). Como se muestra, la adición de lenalidomida mejoró los efectos de supervivencia observados en ratones tratados con las células T CAR+ anti-BCMA (tanto a la dosis alta como a la baja evaluadas), cuando se administró en el día -1 (A) o en diferido (d. 14) dosificación (B).
[0527] La Tabla E2 enumera la mediana de supervivencia (ms) (evaluada en el día 56 posterior a la administración de células T CAR+) y el número de ratones en el grupo que sobreviven hasta el día 56 posterior a la administración de células T CAR+, para cada grupo de animales evaluado en este estudio.
(ii.) Estudio 2
[0528] En otro estudio, ratones NOD/Scid/gc7' (NSG) fueron inyectados (i.v.) con células OPM-2-luciferasa como se describe en el Estudio 1 anterior y se les permitió injertarse durante 14 días antes de la infusión (i.v.) de células CAR-T (o simulacro). En algunos grupos, se inició la administración intraperitoneal diaria de 10 mg/kg de lenalidomida o control con vehículo bien en el día -1 (un día antes de la administración de CAR-T) (lenalidomida concurrente [lenalidomida (C) o vehículo [vehículo (C)] o bien en el día 14 tras la administración de células CAR-T (o simulacro) [lenalidomida retardada (D)].
[0529] A los 14 días después de la inyección de células tumorales (día 0), se inyectó por vía intravenosa una dosis subterapéutica de células T CAR+ (1 * 1oA6 células CAR-T (generadas a partir de dos donantes diferentes)) o células de control simuladas. Los resultados se muestran en la FIG. 10E, 10F, 10G y 10H. Los datos se presentan como media ± SEM. En cuanto a la supervivencia in vivo, se utilizó la prueba de Gehan-Breslow-Wilcoxon para comparar los grupos.
[0530] La FIG. 10E representa los resultados de la evaluación de la carga tumoral hasta el día 60, analizados mediante la bioluminiscencia medida por citometría de flujo. Se observó que la adición de lenalidomida provocaba un crecimiento tumoral más lento y una menor carga tumoral en los ratones a los que se administraban células T CAR+ generadas a partir de ambas células donantes. Como se muestra en la FIG. 10F, se observó que la adición de lenalidomida mejoraba los efectos de supervivencia en ratones tratados con las células T CAR+ anti-BCMA, especialmente tras la administración simultánea de lenalidomida. Se utilizaron modelos lineales de efectos fijos o mixtos para evaluar la significación de los tratamientos con lenalidomida sobre la actividad citolítica, con el tratamiento, el donante y el tiempo tratados como efectos fijos y el animal tratado como efecto aleatorio, anidado con el tiempo cuando las mediciones repetidas procedían del mismo animal. Los valoresPse obtuvieron mediante pruebas de cociente de verosimilitudes comparando el modelo completo con el efecto de interés frente al modelo sin el efecto de interés. La adición de lenalidomida concomitante produjo una disminución significativa de la carga tumoral en el donante 1 (P = 0,02) y un aumento de la supervivencia en el donante 1 (P = 0,057) y el donante 2 (P = 0,04) en comparación con los animales tratados con vehículo e inyectados únicamente con CAR T anti-BCMA. Los animales en el régimen de dosificación concurrente de lenalidomida también mostraron un aumento de los recuentos de CAR T en la sangre periférica después de 7 días (P = 7,3 * 10'6), pero no en momentos posteriores. La lenalidomida tuvo un efecto CAR T de imitación pequeño, pero significativo, sobre la carga tumoral en el donante 1 solo(P= 0,003). En este estudio, la adición de una dosis retardada de lenalidomida no mejoró la eliminación del tumor ni la supervivencia de ambos donantes de CAR T. Los resultados mostraron que la supervivencia y el aclaramiento tumoral mediante una dosis subterapéutica de CAR-T anti-BCMA se vieron potenciados por la lenalidomida en el modelo tumoral OPM-2 in vivo.
[0531] Se recogió sangre de los ratones tratados para el análisis farmacocinético de CAR-T, y las células se tiñeron con anticuerpos para excluir células específicas de ratón (H2-kd, TER119 y muCD45) y se analizaron por citometría de flujo. Las células se agruparon en CD45+CD3+CAR+ y se determinó el número de células por microlitro de sangre. Para las mediciones farmacocinéticas, cada punto temporal se analizó mediante ANOVA unidireccional y prueba post hoc de Tukey. Las FIGs. 10G y 10H muestran el análisis de citometría de flujo de las células de control simuladas y las células CAR-T en la sangre de los ratones en los días 8, 14, 22 y 28 tras la inyección de las células CAR-T de dos donantes. Los resultados mostraron que se observó un aumento de los recuentos de células CAR-T en sangre periférica en los primeros momentos, especialmente tras la administración simultánea de lenalidomida (** P < 0,01).
Ejemplo 5 Efectos de la lenalidomida en la proliferación de CAR anti-CD19 en estimulación subóptima
[0532] Las células T que expresan CAR anti-CD19 fueron generadas por ingeniería de células T CD4+ y CD8+ (que habían sido aisladas por enriquecimiento basado en inmunoafinidad de sujetos donantes humanos sanos) con vector viral que codifica el CAR anti-CD19. El CAR contenía un scFv anti-CD19, un espaciador derivado de Ig, un dominio transmembrana derivado de CD28 humano, un dominio de señalización intracelular derivado de 4-1BB humano y un dominio de señalización derivado de CD3 zeta humano. La construcción de ácido nucleico que codifica el CAR también incluía una secuencia EGFR truncada (tEGFR) para su uso como marcador de transducción, separada de la secuencia CAR por una secuencia T2A de autocicatrización.
[0533] Las células T CAR anti-CD19 se sometieron a estimulación subóptima mediante incubación con anti-CD3 (sin un segundo reactivo como anti-CD28, diseñado para proporcionar una señal costimulatoria), en presencia de 5 pM de lenalidomida o control con vehículo. Las células T anti-CD19 que expresaban CAR se marcaron con el colorante CELLTRACE VIOLET (CTV; ThermoFisher Scientific, Waltham MA) antes de la incubación; la proliferación se evaluó valorando la dilución del colorante mediante citometría de flujo. Como se muestra en la FIG. 11, en el contexto de las condiciones subóptimas de estimulación durante un periodo de 72 horas, se observó que la lenalidomida había potenciado la proliferación de las células T CAR+.
Ejemplo 6 Relación observada entre los resultados del tratam iento y los niveles de sangre periférica CAR+ T en una cohorte de sujetos humanos a los que se administraron células CAR anti-CD19
[0534] Los resultados del tratamiento y el número de células T CAR+ en la sangre fueron evaluados en veintiocho sujetos adultos con linfoma no Hodgkin (NHL) en recaída o refractario (R/R) a quienes se les había administrado células T autólogas que expresaban un receptor antigénico quimérico (CAR) de marcación de CD19 que incluía un anticuerpo scFv anti-CD19 y un dominio de señalización intracelular 4-1BB (administrado en una proporción aproximada de 1:1 de células T CAR+ CD4+ a CD8+).
[0535] Antes de la administración de las células T que expresan CAR, los sujetos habían sido tratados con 30 mg/m2 diarios de fludarabina durante 3 días y 300 mg/m2 diarios de ciclofosfamida durante 3 días. En el d=0, los sujetos habían sido tratados con 5 * 107 (DL-1) o 1 * 108 (DL-2) células T que expresaban CAR mediante infusión intravenosa.
[0536] Las tasas de respuesta observadas en un punto de tiempo particular en un estudio en curso, se muestran en la Tabla E3 para una cohorte de 20 sujetos con Linfoma Difuso de Células B Grandes (DLBCL) tratados con una dosis única de DL-1. Como se muestra, se observó una tasa de respuesta global (ORR) del 80% (16/20) y se observó que el 60% (12/20) de los sujetos habían alcanzado la remisión completa (RC). El 20% (4/20) de los sujetos presentaron respuesta parcial (RP) y el 20% (4/20) presentaron enfermedad progresiva (EP). De los sujetos quimiorrefractarios (con enfermedad estable o progresiva tras el último régimen con quimioterapia o recaída menos de 12 meses después de un TCM autólogo) antes de la administración de células T CAR+, la tasa de respuesta global fue del 83% (10 ORR, 7 CR, 3 PR, 2 PD, n=12). Entre los sujetos que habían sido refractarios (que habían mostrado una remisión inferior a la completa tras el último tratamiento, pero que no se consideraron quimiorrefractarios), la tasa de respuesta global fue del 77% (13 ORR, 9 CR, 4 PR, 4PD, n=17).
*<CR para la última terapia
TSD o PD para el último régimen que contiene quimioterapia o recaída <12 meses después del SCT autólogo
[0537] De tres sujetos con LDCB que en el momento de la evaluación habían sido tratados con dos dosis de DL-1, dos exhibieron respuesta parcial (RP) y 1 exhibió enfermedad progresiva (EP). Entre 2 sujetos que en el momento de la evaluación habían sido tratados con una dosis única de DL-2, se observó que ambos alcanzaron la RC. Entre una cohorte de MCL con un total de dos sujetos tratados en el momento de la evaluación con una dosis única de DL-1 se observaron 1 PR y 1 PD. Se observó que dos sujetos con LDCBG de doble impacto, tres sujetos con triple impacto y cuatro sujetos con LDCBG de doble impacto lograron respuestas (7 RC, 2 RP).
[0538] El número de células T CAR+ en sangre periférica se determinó en ciertos puntos temporales post-tratamiento utilizando un reactivo específico para el transgén. El número de células T CD3+/CAR+ en sangre periférica medido en determinados puntos temporales tras la infusión se muestra para los sujetos agrupados por mejor respuesta global en la FIG. 12A. Se observó un pico más alto de células T CD3+/CAR+ en los pacientes que respondieron (RC/RP) que en los sujetos con enfermedad progresiva (EP). Las FIGs. 12B-D muestran los niveles de células T CD3+/CAR+, células T CD4+/CAR+ y células T CD8+/CAR+ (células/pl de sangre; media ± SEM) en sujetos que lograron una respuesta al tratamiento, agrupados por durabilidad de la respuesta (respuesta continuada [RC/RP] o EP a los 3 meses). La Cmax (células CAR+/pLde sangre) y el área bajo la curva (AUC) para respondedores (RC/RP) y PD se muestran en la Tabla E4. Los resultados fueron coherentes con la conclusión de que las respuestas duraderas se correlacionaban con niveles más elevados de células T CD3+/CAR+ en la sangre, a lo largo del tiempo y en el momento de máxima expansión.
[0539] Para un sujeto con LDCBG transformado quimiorrefractario (subtipo de centro germinal con reordenamiento de BCL2 y múltiples copias deMYCyBCL6)al que se le habían administrado las células T CAR+ en DL-1, los números de células T CD3+/CAR+, CD4+/c A r , CD8+/CAR+ en sangre periférica, medidos en ciertos puntos temporales, se muestran en la FIG. 13A. El sujeto había sido tratado previamente con cinco líneas terapéuticas previas, y era refractario a ellas, incluyendo etopósido, doxorrubicina y ciclofosfamida con dosis ajustadas, vincristina y prednisona más rituximab (DA-EPOCH-R) y trasplante alogénico de células madre de intensidad intermedia de un donante no emparentado con HLA 8/8 compatible. Tras el trasplante alogénico de células madre y antes de recibir las células T c A r , el sujeto presentaba un quimerismo donante del 100% en todos los linajes sanguíneos, había dejado de tomar tratamiento inmunosupresor y no padecía enfermedad injerto contra huésped (EICH). Antes de la administración de las células T CAR+, el sujeto presentaba una masa periauricular y una lesión en el lóbulo temporal observadas mediante tomografía por emisión de positrones y tomografía computarizada (PET-CT) (FIG. 13B) y confirmada por resonancia magnética (RM) (FIG. 13D).
[0540] Después de recibir el tratamiento con células CAR-T anti-CD 19, el sujeto alcanzó RC 28 días después de la infusión, como se muestra en la PET-TC (FIG. 13C) y resonancia magnética cerebral (FIG. 13E), sin que se observaran signos de neurotoxicidad o RSC. Tres meses después de la infusión de las células CAR-T, se observó una recidiva de la masa periauricular en este sujeto (FIG. 13F), y se realizó una biopsia incisional. Como se muestra en la FIG. 13A, tras la biopsia, el tumor visible remitió sin necesidad de tratamiento adicional. El análisis farmacocinético mostró una marcada reexpansión de las células T CAR+ en sangre periférica (a un nivel superior a la expansión inicial observada, con niveles máximos observados a unos 113 días post-infusión) i, que coincidió con la regresión tumoral. A continuación, el sujeto logró una segunda RC, confirmada por un PET-TC de reestadificación un mes después de la biopsia (FIG. 13G), y permaneció en RC 6 meses después de la infusión de células CAR-T. La evaluación posterior del sujeto mostró que la respuesta del SNC era duradera y el sujeto seguía en RC a los 12 meses.
[0541] Los resultados son coherentes con la conclusión de que la reexpansión y activación de las células CAR+T puede iniciarsein vivotras la reducción o pérdida de células CAR+ T funcionales o activas y/o la recaída tras la respuesta antitumoral a la terapia con células CAR-T. Además, tras una reexpansiónin vivotardía después de la infusión inicial de células T CAR+, las células T CAR+ son capaces de volver a ejercer actividad antitumoral. Este resultado respalda que la reexpansión y activación de las células T CAR+ puede desencadenarsein vivoy que los métodos de reactivación de las células T<c>A<r>+ pueden aumentar aún más su eficacia.
Ejemplo 7 Efectos de la lenalidomida en la actividad de las células T CAR anti-CD19 tras la reestimulación seriada
[0542] Las células T CAR+ anti-CD19, generadas sustancialmente como se describe en el Ejemplo 5, se descongelaron y se incubaron con células que expresan CD19 (células K562 transducidas para expresar CD 19) en una proporción de células efectoras a células diana (E:T) de 2,5:1 en presencia o ausencia de lenalidomida 1 nM, 5 nM, 60 nM, 550 nM o 5000 nM o en ausencia de lenalidomida (control). Las células diana K562-CD 19 se marcaron con NucLight Red (NLR) como se describe en el Ejemplo 1 para permitir el seguimiento de las células diana mediante microscopía. La actividad citolítica se evaluó midiendo la pérdida de células diana viables durante un periodo de unas 120 horas, determinada por la señal fluorescente roja (utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte®, Essen Bioscience). Las células de cada condición se sembraron por triplicado. Como se muestra en la FIG. 14, los resultados eran coherentes con la conclusión de que la presencia de lenalidomida reducía la actividad citolítica mediada por CAR en este ensayo. En ensayos similares, los resultados variaron en función de las proporciones E:T y con diferentes composiciones de células T CAR+ anti-CD19 (por ejemplo, generadas en diferentes momentos y/o a partir de células de diferentes donantes).
[0543] En otro estudio, se incubaron células T CAR+ anti-CD19 con células efectoras K562-CD19 en una proporción E:T de 2,5:1 en presencia de lenalidomida 100 nM o 1600 nM, 2 nM o 166 nM de un compuesto alternativo de marcación de una quinasa, control con vehículo o en ausencia de compuesto añadido (control CAR-T). Tras 120 horas de cultivo, se aislaron las células y se evaluó mediante citometría de flujo la expresión superficial de CD25 o PD-1 en los subconjuntos de células T CD4+ o CD8+. Como se muestra en la FIG. 15A, la incubación de células T CAR+ anti-CD19 con células efectoras K562-CD19 en presencia de la concentración más alta de lenalidomida (por ejemplo, 1600 nM) dio lugar a niveles más altos de expresión de CD25 tanto en células T CD4+ como CD8+ en comparación con otras condiciones. No se observaron diferencias en la expresión superficial de PD-1 en células T CD4+ o CD8+ en presencia de lenalidomida, incluso a la concentración más alta de 1600 nM (FIG. 15B).
[0544] En otro estudio, se evaluó la cantidad de IL-10 en los sobrenadantes de cultivo después de incubar, durante 24 horas, células T anti-CD19 CAR+ con células efectoras K562-CD19 a una proporción de células efectoras a células diana (E:T) de 3:1 o 9:1, en presencia o ausencia de varias concentraciones de lenalidomida. Como se muestra en la FIG. 16, la lenalidomida aumentó de forma dependiente de la dosis la secreción y/o acumulación de IL-10 en sobrenadantes de cultivos de células T.
Ejemplo 8 Efectos de la lenalidomida en la expansión de células T CAR anti-CD19 tras la reestimulación seriada
[0545] La capacidad de las células T CAR+ anti-CD19 de expandirse ex vivo tras estimulaciones repetidas se evaluó utilizando métodos sustancialmente como los descritos en el Ejemplo 2. Las células T CAR+ anti-CD19, generadas a partir de dos donantes (pt1 y pt2) sustancialmente como se describe en el Ejemplo 5, se cultivaron con células K562 irradiadas transducidas para expresar CD19 (células K562-CD19) en una proporción de diana efectora de 2,5:1 en presencia o ausencia de 1 pM de lenalidomida o 50 nM o 500 nM de un compuesto alternativo de marcacíon de una quinasa. Para cada donante, se cosecharon células cada 3-5 días de cada condición experimental en los pocillos y se contaron, y se volvieron a estimular con nuevas células diana utilizando las mismas condiciones de cultivo después de restablecer el número de células a la densidad de siembra inicial para cada ronda. Se realizaron un total de 4 rondas de estimulación durante un periodo de cultivo de 12 días. Para cada ronda de estimulación, se determinó el número total de células, y los resultados se representaron como el cambio de pliegues del número de células tras la estimulación (FIG.
17A) o el número de duplicaciones en comparación con el número inicial (FIG. 17B). Como se muestra en la FIG. 17A y 17B, no se observó ningún cambio o sólo un efecto menor en la expansión celular de las células T CAR+ anti-CD19 en este ensayo de reestimulación cuando las células se cultivaron en presencia de lenalidomida frente a en ausencia de lenalidomida.
[0546] En cada reajuste después del pretratamiento, se evaluó la actividad citolítica incubando las células reestimuladas con las células K562-CD19 (marcadas con NucLight Red (NLR)) a una proporción de células efectoras a células diana (E:T) de 1 pM de lenalidomida o 50 nM o 500 nM del compuesto alternativo. La actividad citolítica se evaluó midiendo la pérdida de células diana viables durante un periodo de hasta 40-60 horas, determinada por la señal fluorescente roja (utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte®, Essen Bioscience). Las células de cada condición se sembraron por triplicado. La muerte celular representativa observada en la 2a y 4a reestimulación para ambos donantes se muestra en las FIGS. 18A (normalizado con respecto a las células marcadas con K562-CD19-Nuc en t=0) o en la FIG.
18B (% de destrucción celular comparado con el control de vehículo solo (fijado en el 100%)). Como se muestra en la FIG. 18A y 18B, se observó que la incubación con lenalidomida producía una disminución de la actividad citolítica de las células T CAR+ anti-CD19 en este ensayo, en las condiciones de estimulación probadas.
Ejemplo 9 Generación de microesferas conjugadas con BCMA
[0547] El antígeno de maduración de células B (BCMA) se conjugó con microesferas mediante el acoplamiento covalente de un polipéptido de fusión BCMA-Fc, que contiene BCMA humano soluble fusionado en su extremo C a una región Fc de IgG, a la superficie de microesferas magnéticas activadas con tosilo disponibles en el mercado (ThermoFisher, Waltham MA). Se trata de microesferas superparamagnéticas, no porosas, monodispersas, tosilactivadas, que unen covalentemente grupos amino y sulfhidrilo primarios... La conjugación se realizó utilizando microesferas con un diámetro aproximado de 2,8 pm (designadas M-280) o 4,5 pm (designadas M-450).
[0548] El BCMA-Fc (SEQ ID N°: 22) contenía el dominio extracelular de BCMA humana (GenBank No. NP_001183.2) y una IgG1 Fc humana conectada con un enlazador de la siguiente manera:
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNA (dominio extracelular de BCMA; SEQ ID N°: 18)
GGGGS (enlazador; SEQ ID N°: 19)
PKSSDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK
FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNST YRVV S VLT VLHQDWLNGKEYKCK V SNKAL
PSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQP
ENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPGK(Hum IgGl Fe; SEQ ID NO: 20.
[0549] El clon que codifica la construcción de fusión BCMA-Fc humana con la secuencia líder N-terminal CD33 (SEQ ID N°: 21) se insertó en un vector de expresión y se expresó en células HEK 293. Se determinó que la proteína de fusión BCMA-Fc resultante tenía una pureza superior al 95%, evaluada mediante cromatografía de permeación en gel. Para comprobar la unión, la proteína de fusión BCMA-Fc se incubó con células T que expresaban CARs anti-BCMA y células T que expresaban CARs que no se unen a BCMA. Los resultados de la citometría de flujo indicaron que la proteína de fusión BCMA-Fc se unía específicamente a las células T que expresaban CAR anti-BCMA.
[0550] Se añadieron varias concentraciones de la proteína de fusión BCMA-Fc que oscilaban entre 5 pg y 200 pg a aproximadamente 1 mL de microesferas tocilactivadas (por ejemplo, conteniendo aproximadamente 4x109 microesferas tocilactivadas con un diámetro de 2,8 pm o aproximadamente 4x108 microesferas tocilactivadas con un diámetro de 4,5 pm). El acoplamiento covalente se realizó mediante incubación nocturna a 37 °C en solución amortiguadora de fosfatos (PBS) con 0,1% de albúmina sérica humana (HSA). Se lavaron las esferas y se resuspendieron en 1 mL de PBS con 0,1% de HSA. Tras la conjugación, se determinó la concentración de microesferas utilizando un Cellometer. En los ejemplos que figuran a continuación, las microesferas conjugadas con BCMA utilizadas en diversos estudios se mencionan con referencia a la cantidad de antígeno BCMA-Fc añadida por mL o a la concentración de antígeno (pg/mL) durante la conjugación, por ejemplo, 5 pg o 5 pg/mL; 50 pg o 50 pg/mL; 200 pg o 200 pg/mL, etcétera.
Ejemplo 10 Evaluación de marcadores de células T en células T anti-BCMA CAR+ estimuladas con microesferas conjugadas con BCMA en presencia o ausencia de lenalidomida
[0551] Esferas conjugadas con BCMA (diámetro de 4,5 pm) conjugadas con diversas cantidades de antígeno BCMA como se describe en el Ejemplo 9 se incubaron con células T anti-BCMA CAR+ en presencia o ausencia de lenalidomida, y se evaluó la expresión de marcadores de células T.
[0552] Se añadieron aproximadamente 1,5 x 106 células T CAR+ a pocillos de una placa de 12 pocillos y se incubaron con microesferas de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 200 pg/ml a una proporción de célula T CAR+ a microesfera conjugada con BCMA de 1:0,3, 1:1 o 1:3 (aproximadamente 0,5x106, 1,5x106y 4,5 x106 microesferas por pocillo, respectivamente). Como controles, se recubrieron los pocillos con 5 pg/mL de anticuerpo anti-CD3 (concentración subóptima para la estimulación) o se sembraron células en ausencia de cualquier agente (control sin estimulación). Cada condición se incubó en presencia o ausencia de 5 pM de lenalidomida. Las células se incubaron durante cuatro días y luego se analizaron por citometría de flujo para determinar la expresión superficial de CD4, CD8, Tim3, PD-1, CD25 y CD69.
[0553] Como se muestra en la FIG. 19A, la presencia de 5 pM de lenalidomida aumentó la capacidad proliferativa de las células T (observada por la disminución de la intensidad del colorante CTV) tras la incubación durante tres días con microesferas conjugadas con 200 pg de antígeno BCMA en una proporción de 1:1 de células T por microesfera, en comparación con la incubación con las microesferas en ausencia de lenalidomida (control con vehículo). Como se muestra en las FIGS. 19B y 19C, la presencia de lenalidomida durante la incubación aumentó aún más la extensión de la expresión superficial de CD25 en células T CD4+ y CD8+ inducida tras la incubación de células T CAR+ anti-BCMA con microesferas conjugadas con BCMA (FIG. 19B) o estimulación anti-CD3 (FIG. 19C).
[0554] En otro experimento, composiciones de células CAR-T anti-BCMA producidas sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1 se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 5 x 105 células por pocillo. Las composiciones de células CAR-T ensayadas contenían, por término medio, aproximadamente un 45% de células CAR+ anti-BCMA en el momento de la siembra. Las células de cada composición se incubaron durante 18 horas en presencia de microesferas de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 5 pg/ml, 50 pg/ml o 200 pg/ml en una proporción de 1:1 células T por microesfera. Como control, las células se incubaron con microesferas conjugadas con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28 (control positivo) o sin agente añadido (control negativo). Las incubaciones se realizaron en ausencia de lenalidomida o en presencia de 0,5 pM o 5 pM de lenalidomida. Tras la incubación, las células se trataron con reactivos que permitieron la tinción de anticuerpos extracelulares e intracelulares por citometría de flujo para los factores de transcripción Blimp1, EOMES, GATA-3, ikaros, helios y Tbet y los marcadores CD25, CD31 y PD-1
[0555] Los niveles de marcadores tras la incubación de una composición de células T CAR+ de un donante ejemplar se muestran para BLIMP-1 (FIG. 20A), CD25 (FIG. 20B), CD31 (FIG. 20C), PD-1 (FIG. 20D), Tbet (FIG. 20E), y EOMES (FIG. 20F), GATA-3 (FIG. 20G) Helios (FIG. 20H), y Ikaros (FIG. 20I). Como se muestra, la expresión de varios de los factores de transcripción y marcadores de activación asociados a células efectoras T evaluados aumentó tras la estimulación con las microesferas conjugadas con BCMA. Para muchos de los marcadores evaluados, el grado de aumento de la expresión fue similar al inducido por la estimulación con microesferas anti-CD3/anti-CD28. En algunos casos, el grado de estimulación con microesferas conjugadas con BCMA fue mayor en presencia de 5 |jg de microesferas. Como se muestra en la FIG. 20I, el nivel de expresión de Ikaros disminuyó en presencia de lenalidomida en todas las condiciones. Se observaron resultados similares en una composición de células T CAR+ generada a partir de un segundo donante, excepto que no se observó ningún cambio en la expresión de Helios en las células de este donante cuando se estimularon en las condiciones probadas.
Ejemplo 11 Evaluación de la actividad de células T CAR anti-BCMA estimuladas con microesferas conjugadas con BCMA en presencia o ausencia de lenalidomida
A. Respuestas Efectoras
[0556] Células T CAR anti-BCMA criocongeladas, producidas sustancialmente como se describe en el Ejemplo 2 y formuladas en una proporción 1:1 de células T CD4+ y CD8+, fueron descongeladas. A menos que se indique lo contrario, se añadieron a los pocillos microesferas (con un diámetro de aproximadamente 4,5 jm de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 5 jg/m l o 50 jg/ml, generadas como se describe en el Ejemplo 9, en una proporción de células T a microesferas de 1:1 en presencia o ausencia de 5 jM de lenalidomida. Las células se incubaron hasta 14 días y se analizaron en varios puntos temporales para determinar la secreción de citocinas, la expansión celular mediante citometría de flujo para el marcador sustitutivo EGFRt y la actividad citolítica.
a. Expresión de Citoquinas
(i) Presencia de citoquinas en el sobrenadante
[0557] Veinticuatro horas después de la adición de microesferas conjugadas con BCMA, se evaluó la presencia de TNF-a, IFN<y>e IL-2 en los sobrenadantes de cultivo. Como se muestra en las FIGS. 21A-21C, la incubación con microesferas conjugadas con BCMA indujo la secreción de IFN<y>(FIG. 21A), IL-2 (FIG. 21B), y TNF-a (FIG. 21C) en sobrenadantes de cultivo. El grado de producción de citocinas fue mayor cuando las células se incubaron con microesferas de la composición de microesferas conjugadas con BCMA de 50 jg/m L en comparación con la composición de microesferas conjugadas con BCMA de 5 jg/mL, lo que demuestra que la estimulación de CAR a través de microesferas de BCMA dependía de la dosis. Como se ha demostrado, la lenalidomida aumentó la producción de citocinas de células T CAR+ inducida por BCMA tras la estimulación con las microesferas conjugadas con BCMA.
[0558] En otro estudio ejemplar, se generaron dos composiciones diferentes de células T CAR anti-BCMA a partir de diferentes donantes, cada una de las cuales contenía células T que expresaban el mismo CAR anti-BCMA. Las células se descongelaron y se incubaron con microesferas (de un diámetro aproximado de 4,5 jm ) de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 5 jg/m L o 200 jg/m L generada como se describe en el Ejemplo 1. La incubación se llevó a cabo a una proporción de células T por microesferas de 1:1 en presencia o ausencia de 1 jM o 5 jM de lenalidomida. Veinticuatro horas después de la adición de microesferas conjugadas con BCMA, se evaluó la producción de IL-2 por las células T CAR+ anti-BCMA en los sobrenadantes de cultivo. Como se muestra en la FIG. 21D, se observó una mayor producción de IL-2 en presencia de una estimulación antigénica alta (esferas conjugadas con BCMA 200 jg/mL) en comparación con una estimulación antigénica baja (esferas conjugadas con BCMA 5 jg/mL). La lenalidomida, tanto a 1 jM como a 5 jM , aumentó la producción de citoquinas en presencia de la estimulación alta y baja de antígenos.
(ii) Niveles intracelulares de citoquinas
[0559] Las células T anti-BCMA CAR+ se incubaron en presencia de 1 jM de lenalidomida o un vehículo y 50 jg/m L de microesferas conjugadas BCMA-Fc durante 2 horas, y las células se evaluaron por citometría de flujo para STAT 5 fosforilada. Para evaluar los niveles de citocinas IFNy y TNFa, se incubaron células T CAR+ anti-BCMA en presencia de lenalidomida 0,1 jM o 1 jM o un vehículo y esferas conjugadas BCMA-Fc 5 jg/mL, 50 jg /m L o 200 jg/mL durante 24 horas. Las células se separaron en células CD3+ transducidas y vivas, y se evaluaron mediante citometría de flujo para determinar la acumulación intracelular de citocinas IFN<y>y TNFa en células CD4+ y CD8+.
[0560] Como se muestra en la FIG. 22A, una estimulación de 2 horas con antígeno aumentó el porcentaje de células positivas para STATS fosforilados en comparación con el control sin estimulación (mostrado con la línea de puntos). Los resultados de los niveles de citocinas intracelulares de IFN<y>y TNFa de células T CAR anti-BCMA generadas a partir de un donante de células CAR-T normal representativo se muestran en la FIG. 22B. En este estudio, la producción de citocinas de células CAR-T anti-BCMA aumentó con la lenalidomida en una amplia gama de niveles y concentraciones de antígeno.
b. Proliferación celular
[0561] Recuento celular total, monitorizado en el día 4 (FIG. 21E) y el día 7 (FIG. 21F), aumentó tras la estimulación de células T anti-BCMA CAR+ con microesferas de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 50 pg/mL, pero no de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 5 pg/mL, en comparación con las células presentes en el momento de iniciarse la incubación (línea discontinua). Se observó un pequeño aumento de la proliferación en las células incubadas con esferas de 50ug en presencia de lenalidomida en el día 7.
[0562] Para evaluar aún más la proliferación, las células que contenían células T que expresaban CAR anti-BCMA se marcaron con el tinte marcador de proliferación CELL TRACE VIOLET (CTV; ThermoFisher Scientific, Waltham MA) de acuerdo con el protocolo del fabricante antes de la incubación con las microesferas conjugadas con BCMA. La proliferación se evaluó por dilución del colorante mediante citometría de flujo en células estimuladas con microesferas de la composición de microesferas conjugadas con BCMA de 50 pg/mL. En comparación con la proliferación en ausencia de lenalidomida, se produjo un ligero retraso en la proliferación evaluada por dilución del CTV en presencia de lenalidomida en el día 4, pero no en el día 7 (FIG. 21G).
c. Expansión
[0563] Cuatro y siete días después de la adición de microesferas conjugadas con BCMA, las células incubadas se tiñeron con CD4 o c D8 y con un anticuerpo anti-EGFR para determinar el porcentaje de células positivas para EGFRt como sustituto de células T CAR+. En el momento de la siembra, el 26% de las células CD4+ expresaban anti-BCMA CAR y el 39% de las células CD8+ expresaban anti-BCMA CAR, según se determinó mediante tinción con BCMA-Fc. El porcentaje de células T EGFRt+CD4+ aumentó de aproximadamente un 26% al inicio de la incubación a más de un 40% al cuarto día (FIG. 21H) y superior al 60% al séptimo día (FIG. 21I) cuando las células se incubaron en presencia de microesferas de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 50 pg/mL. Como se muestra en la FIG. 21I, el porcentaje de células T EGFRt+CD8+ aumentó en el día 7 de aproximadamente el 38% al inicio de la incubación a más del 60% cuando las células se incubaron en presencia de microesferas de la composición de microesferas conjugadas con BCMA de 50 pg/mL. El grado de expansión celular fue mayor cuando las células se incubaron en presencia de microesferas de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 50 pg/mL, en comparación con las microesferas de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 5 pg/mL. La presencia de lenalidomida no afectó sustancialmente al grado de expansión de las células T CAR+ en este estudio.
d. Actividad Citolítica
[0564] La actividad citolítica de las células T CAR+ tras la incubación con microesferas conjugadas con BCMA se evaluó mediante incubación con la línea celular diana RPMI-8226 que expresa BCMA, que es una línea celular de mieloma múltiple BCMA+. Tras siete días de incubación de células T CAR+ anti-BCMA con microesferas conjugadas con BCMA (5 pg/ml o 50 pg/ml) en presencia o ausencia de lenalidomida, se retiraron las microesferas de los cultivos y se sembraron las células con las células diana RPMI-8226 en una proporción de células efectoras a células diana de 3:1 o 1:1 en presencia o ausencia adicional de 5 pM de lenalidomida. Para realizar el ensayo citolítico, las células RPMI-8226 diana se marcaron con NucLight Red (NLR) para permitir el seguimiento de las células diana mediante microscopía. La actividad citolítica se evaluó midiendo la pérdida de células diana viables durante un periodo de cuatro días, determinada por la señal fluorescente roja (utilizando el sistema de análisis de células vivas INCUCYTE®, Essen Bioscience). El número de células viables se normalizó con respecto a las células del día 0 antes de la incubación con las células diana RPMI-8226.
[0565] Resultados ejemplares en la proporción 1:1 de efector a célula diana se muestran en la FIG. 21J. Como se muestra, las células T CAR+ anti-BCMA demostraron una destrucción eficaz en el ensayo. Las células T anti-BCMA CAR+ estimuladas con microesferas de la composición de microesferas conjugadas con BCMA 5 pg/ml fueron ligeramente menos eficaces en la destrucción celular que las células T anti-BCMA CAR+ estimuladas con microesferas de la composición de microesferas conjugadas con BCMA 5 pg/ml. En todas las condiciones, la preincubación con lenalidomida durante los siete días de incubación previos al ensayo de destrucción aumentó la actividad citolítica de las células T CAR+. La presencia de lenalidomida durante el ensayo de destrucción celular no afectó sustancialmente a la actividad de destrucción. No se observó destrucción celular cuando las células RPMI 8226 se cultivaron solas o en presencia de lenalidomida, lo que demuestra que la lenalidomida no influyó directamente en la viabilidad de las células diana en este ensayo.
B. Reestimulación en Serie
[0566] Se generaron composiciones de células T anti-BCMA CAR a partir de tres donantes diferentes, cada una de las cuales contenía células T que expresaban el mismo anti-BCMA CAR, se descongelaron y se incubaron durante siete días con microesferas (diámetro de aproximadamente 4,5 pm) en una proporción de 1:1 de microesferas a células de una composición de microesferas conjugadas con BCMA de 50 pg/mL generada como se describe en el Ejemplo 9. La incubación se llevó a cabo en presencia de 5 pM de lenalidomida o en ausencia de lenalidomida (control con vehículo). Las células se cosecharon al cabo de 7 días y se repitieron en otras tres rondas de hasta 28 días, en cada una de las cuales se restableció la densidad de siembra inicial y se incubaron durante otros 7 días en presencia de la misma concentración de lenalidomida.
[0567] En cada reinicio tras el pretratamiento, se evaluó la actividad citolítica incubando con la línea celular diana RPMI-8226 que expresa BCMA (marcada con NucLight Red (NLR)) en una proporción de efector a célula diana (E:T) de 1:1 en presencia o ausencia adicional de lenalidomida. La actividad citolítica se evaluó midiendo la pérdida de células diana viables durante un periodo de hasta 80-150 horas, determinada por la señal fluorescente roja (utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte®, Essen Bioscience). Las células de cada condición se sembraron por triplicado. Se determinó el % de destrucción celular en comparación con el control sólo vehículo (fijado en el 100%).
[0568] La FIG. 23A muestra los resultados de la actividad citolítica de las células T CAR+ anti-BCMA de un donante ejemplar tras un pretratamiento de 7 días, 14 días o 21 días. Como se muestra, las células T CAR+ anti-BCMA que fueron preincubadas con lenalidomida durante 7 días o 14 días mostraron una mayor actividad citolítica en comparación con las células que no fueron preincubadas en presencia de lenalidomida. En este donante, se observó una disminución general de la eficacia de destrucción de las células T CAR+ anti-BCMA que fueron preincubadas con lenalidomida durante 14 o 21 días en comparación con el día 7. En el donante se observaron efectos similares en la actividad citolítica de las células T CAR+ anti-BCMA tras el pretratamiento con lenalidomida durante 7 o 14 días; en este donante no se evaluó la actividad citolítica tras 21 días de pretratamiento con lenalidomida. Como se muestra en la FIG. 23B, en este donante se observó una mayor eficacia de destrucción de las células T CAR+ anti-BCMA en las células que se preincubaron con lenalidomida en todos los puntos temporales.
Ejemplo 12 Efectos de la lenalidomida sobre la expresión de PD-1 y la señalización de PD-L1
[0569] Células CAR-T anti-BCMA, generadas a partir de muestras de donantes sanos representativos o material derivado de pacientes con mieloma múltiple, y cultivadas con microesferas conjugadas BCMA-Fc de 50 pg/mL (generadas como se describe en el Ejemplo 9) en una proporción de 1:1 microesfera:célula T CAR+ durante 7 días, en presencia de 1 de lenalidomida 1 pM o un control con vehículo. La expresión de CD25, PD-1, Tim3 y Lag3 en las células T CAR (utilizando un anticuerpo para el marcador CAR sustituto) cultivadas en las diferentes condiciones se evaluó mediante citometría de flujo.
[0570] Dichas células CAR-T anti-BCMA preestimuladas con microesferas en presencia o ausencia de lenalidomida, o células CAR-T anti-BCMA recién descongeladas generadas a partir de muestras de donantes comparables, se descascarillaron, lavaron y cultivaron con células diana RPMI-8226 (etiquetadas con NucLight Red (NLR) para permitir su seguimiento por microscopía), en presencia de 1 pM de lenalidomida o un control con vehículo. Específicamente, para las células pretratadas en las que el pretratamiento se había realizado en presencia de lenalidomida, las células se cultivaron con las células diana en presencia de lenalidomida; asimismo, para las células pretratadas en las que el pretratamiento se había realizado en presencia de vehículo, las células se cultivaron con las células diana en presencia de vehículo. Tras el co-cultivo, se evaluó la actividad citolítica midiendo la pérdida de células diana viables durante un periodo de siete días, determinada por la señal roja fluorescente. El porcentaje de destrucción se normalizó con respecto a las células T CAR anti-BCMA preestimuladas con microesferas en presencia de vehículo. La producción de citoquinas se evaluó mediante ELISA a partir del sobrenadante tras el cultivo con células diana durante 24 horas. Los experimentos se realizaron dos veces en 3 donantes. Se utilizaron modelos lineales de efectos fijos o mixtos para evaluar la importancia de los tratamientos con lenalidomida sobre la actividad citolítica y la producción de citocinas, con el tratamiento, el donante y el tiempo tratados como efectos fijos y el animal tratado como efecto aleatorio, anidado con el tiempo cuando las mediciones repetidas procedían del mismo animal. Los valoresPse obtuvieron mediante pruebas de cociente de verosimilitudes comparando el modelo completo con el efecto de interés frente al modelo sin el efecto de interés.
[0571] La FIG. 24A muestra los resultados de la actividad citolítica específica del antígeno CAR y la FIG. 24B muestra los resultados de la producción de citocinas para las células CAR-T anti-BCMA que habían sido preestimuladas con esferas BCMA (en comparación con las células CAR-T anti-BCMA recién descongeladas (no preestimuladas)) en los cocultivos, comparando las células cultivadas en presencia frente a las cultivadas en ausencia de lenalidomida. Las células CAR T preestimuladas mostraron una menor actividad citolítica^ P = 2,1 * 10'4) y producción de citoquinas(P=,03 para IFN-y) en comparación con las células CAR T anti-BCMA recién descongeladas. En ausencia de lenalidomida en el pretratamiento y posterior co-cultivo, las células CAR-T preestimuladas mostraron una reducción de la destrucción celular y de la producción de citoquinas en comparación con las células CAR-T frescas, lo que indica que la preestimulación crónica conduce a un deterioro funcional. Estos resultados son coherentes con un fenotipo de agotamiento inducido por la estimulación previa en las microesferas conjugadas con BCMA. La presencia de lenalidomida durante el periodo de preestimulación preservó la función citolítica(P = 0,04), y se observó una tendencia al aumento de la producción de citocinas en comparación con las células expuestas al vehículo durante el periodo de preestimulación (FIG. 24B). La presencia de lenalidomida en este ensayo fue coherente con la observación de que la lenalidomida puede reducir los efectos indicativos del fenotipo de agotamiento funcional en las células CAR-T preestimuladas.
[0572] Como se muestra en la FIG. 24C, se evaluó el fenotipo de las células T CAR anti-BCMA estimuladas durante 7 días en esferas BCMA, y la adición de lenalidomida aumentó significativamente la viabilidad CAR+ del material T CAR anti-BCMA en 3 donantes sanos (P = 0,04). La adición de lenalidomida no alteró el recuento total de células en todos los donantes en este periodo de 7 días, y no se observaron diferencias significativas en el porcentaje de CAR+ entre las células CAR T tratadas con vehículo y con lenalidomida. La FIG. 24D muestra resultados representativos del análisis de citometría de flujo de la expresión de CD25 y PD-1 en superficie (intensidad fluorescente media [IFM]) para células T CAR anti-BCMA CD4+ o CD8+ tras estimulación (pretratamiento) con microesferas BCMA durante 7 días, en presencia o ausencia de lenalidomida 1 pM. Como se muestra, los resultados indicaron que la lenalidomida redujo la expresión de PD-1 de las células BCMA-CAR-T, al tiempo que aumentó la expresión de CD25 tras una estimulación prolongada. Como se muestra en la FIG. 24E, el análisis de citometría de flujo en los tres donantes CAR T indicó que la adición de lenalidomida aumentó la expresión superficial deTim3 en la población CD8+ (P = 4,0 * 10-4), con efectos mixtos en la población CD4+ CAR+. En todos los donantes y en las poblaciones CAR+ CD4+ y CD8+, la lenalidomida aumentó la CD25 (CD4+ y CD8+; P = 2,2 * 10-16) y el porcentaje positivo para la expresión de Lag3 (CD8+ P < 0,03; CD4+ P = 0,002). En particular, también se observó una disminución del porcentaje de células PD-1+ en la población CD4+ (P = 0,04), y 2 de los 3 donantes también mostraron una disminución en la población CD8+.
[0573] En otro estudio, se utilizaron microesferas recombinantes humanas conjugadas con BCMA para estimular células T CAR a varias concentraciones para titular la magnitud de la estimulación, ya sea estimulación baja (5 |jg/ mL), media (50 jg / mL) y alta (200 jg / mL). En una condición de estimulación media, se midió la producción de citoquinas secretadas 24 horas después de la estimulación, y se observó un aumento del 200% en las concentraciones de IL-2 y TNF-a en comparación con el control con vehículo, con aumentos dependientes del donante en IFN-<y>(FIG. 25A). Las células se estimularon con microesferas conjugadas con BCMA durante 24 horas en presencia de 0,1 jM o 1,0 jM de lenalidomida, o con un control con vehículo. Se añadió un inhibidor del transporte de proteínas en las últimas horas de incubación y se tiñeron las células para detectar IL-2, IFN-y y TNF-a intracelulares.
[0574] Las células T CAR anti-BCMA activadas en microesferas BCMA mostraron efectos dependientes del nivel de estimulación sobre la producción de citocinas, con microesferas BCMA de 5-jg causando una producción limitada de citocinas efectoras c Ar T en comparación con microesferas BCMA de 50-jg y 200-jg (FIG. 25B). La lenalidomida aumentó el porcentaje de tinción intracelular IFN-Y+ y TNF-a+ en todos los niveles de estimulación para las células T CAR CD4+ y CD8+. La magnitud de la estimulación aumentó o disminuyó la IL-2 en respuesta a la lenalidomida, con lo que la lenalidomida disminuyó el porcentaje de células T IL-2+ CAR+ en la estimulación de 50-jg y 200-jg, pero aumentó el porcentaje de células T IL-2+ CAR+ en la condición de estimulación de 5-jg. En ausencia de estimulación, la lenalidomida no tuvo ningún efecto sobre la producción de citocinas CAR T, lo que indica que el aumento de citocinas proporcionado por la lenalidomida requiere estimulación.
[0575] En otro estudio, para explorar si la potenciación inducida por lenalidomida de la activación CAR T y la producción de citoquinas podría anular la inhibición mediada por PD-L1, se cultivaron células en presencia de microesferas BCMA generadas como se describe en el Ejemplo 9, con o sin conjugación adicional de PD-L1-Fc recombinante humana. Se estimularon células CAR T sanas derivadas de donantes o pacientes en presencia de microesferas conjugadas con BCMA o microesferas conjugadas con BCMA/PD-L1 durante 24 horas en presencia de 1 jM de lenalidomida. La producción de citoquinas se midió en el sobrenadante. Los resultados se muestran en la FIG. 25C. Como se muestra en la FIG. 25C, la evaluación de células T CAR tanto de donantes sanos como de pacientes demostró que la adición de PD-L1 recombinante a microesferas BCMA recombinantes reducía el IFN-<y>, la IL-2 y el TNF-a. Se demostró que el tratamiento con lenalidomida potenciaba los niveles de citoquinas secretadas por encima de los de las células T CAR tratadas con vehículo en presencia de PD-L1. Los resultados fueron coherentes con la conclusión de que la producción de citocinas anti-BCMA CAR-T tras la incubación con microesferas conjugadas con BCMA aumentaba con la lenalidomida en presencia de la inhibición mediada por PD-L1.
Ejemplo 13 Análisis de Expresión Génica y Accesibilidad a la Cromatina en Células T CAR en Presencia o Ausencia de Lenalidomida
[0576] Se evaluó la expresión génica y la accesibilidad de la cromatina en células T CAR tras la estimulación, en presencia o ausencia de lenalidomida. Las células T que expresan CAR anti-BCMA, generadas a partir de cuatro (4) donantes independientes diferentes, se estimularon con microesferas conjugadas con BCMA de 50 jg/m L durante 24 horas (24 h estim.) o 7 días (d7 estim.), o se cultivaron sin estimulación durante 24 horas (24 h), en presencia o ausencia de lenalidomida (1 jM ). Los experimentos se realizaron dos veces en 3 o 4 donantes. Se evaluó la expresión génica de las células que expresaban c A r mediante secuenciación de ARN (ARN-seq) y se analizó la cromatina accesible a la transposasa mediante secuenciación (ATAC-seq) para analizar la accesibilidad de la cromatina. Los ensayos se realizaron con 50.000 células en cada punto temporal.
[0577] Se realizó ARN-seq en las muestras de ADN complementario (ADNc) preparadas a partir del ARN aislado de las células cultivadas anti-BCMA que expresan CAR. ATAC-seq se realizó en general como se describe en Buenrostro et al., Nat Methods. (2013) 10(12): 1213-1218. Las lecturas ATAC de fin pareado se recortaron, alinearon con Bowtie2 y filtraron por calidad, longitud de fragmento, duplicación y contribución mitocondrial. Los picos de accesibilidad de ATAC-seq se llamaron utilizando MACS2 (q<0,01) y se generó un conjunto de consenso a partir de picos solapados presentes en 2 o más muestras, utilizando DiffBind. Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para los conjuntos de datos ARN-seq y ATAC-seq, generados a partir de recuentos normalizados DESeq2. Se calculó la expresión diferencial (DE, para ARN-seq) o la accesibilidad al pico consenso (DA, para ATAC-seq), modelando los efectos del donante (Donantes 1-4) y los efectos del tratamiento (lenalidomida frente a vehículo) a las 24 horas y el día 7. El corte de selección de locus diferenciales fue q<0,05 y log2 fold change > 0,5 para ARN-seq o q<0,1 para ATAC-seq. Se realizó un análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) y se determinó la puntuación z de activación en el subconjunto de genes expresados diferencialmente en q<0,1 utilizando el software Ingenuity Pathway Analysis (Qiagen, Inc.), teniendo en cuenta los efectos de los donantes dentro de cada condición de tratamiento. Se realizó un análisis de enriquecimiento de motivos para los picos que mostraron ser más accesibles en presencia de lenalidomida, con el software HOMER, utilizando el conjunto de picos de consenso como fondo, para los datos de ATAC-seq del día 7 de estimulación (d7 estim.).
[0578] Los mapas térmicos de ARN-seq se generaron a partir de datos de expresión normalizados (transcritos por millón), promediados en todos los donantes por condición, y normalizados por filas utilizando puntuaciones z. El enriquecimiento de motivos en los picos DA en el día 7 se realizó con HOMER, utilizando el conjunto de picos de consenso como fondo.
[0579] Los resultados del PCA, que representan la diversidad global a través de la expresión génica o la accesibilidad de la cromatina en el genoma, se muestran en la FIG. 26A (expresión génica; basada en los resultados de ARN-seq) y FIG.
26B (accesibilidad de la cromatina; basado en los resultados de ATAC-seq). Se trazaron elipses para indicar los grupos, ya que se observó que los principales factores que contribuían a la variación de la expresión génica o de la accesibilidad de la cromatina eran el tiempo de cultivo y la presencia de estimulación. Las células cultivadas en presencia de lenalidomida (círculos) mostraron una expresión génica global y una accesibilidad a la cromatina diferentes en comparación con las células cultivadas en ausencia de lenalidomida (triángulos, vehículo), lo que muestra un efecto del tratamiento con lenalidomida en cada donante y condición de cultivo. Para el tratamiento con lenalidomida, la dirección general del cambio (mostrada por la línea de puntos entre el triángulo y el círculo) fue similar en cada donante, y el grado de cambio fue generalmente mayor en las células cultivadas durante 7 días con estimulación, en comparación con el cambio en las células cultivadas durante 24 horas, con o sin estimulación. Así, el PCA demostró la agrupación basada en la estimulación (estimulación o no estimulación) y el tiempo (24 horas o 7 días) tanto para los conjuntos de datos ARN-seq (Figura 26A) como ATAC-seq (Figura 26B).
[0580] A continuación, se examinó el papel de la lenalidomida tras 24 horas o 7 días de estimulación, teniendo en cuenta la variabilidad entre donantes. FIGS. 27A-27D muestran cambios en la expresión génica(FIGS. 27A y 27B, tras cultivos de 24 horas y 7 días con estimulación, respectivamente) o la accesibilidad de la cromatina(FIGS. 27C y 27D, tras cultivos de 24 horas y 7 días con estimulación, respectivamente) en presencia de lenalidomida. El análisis ARN-seq mostró la regulación al alza de un pequeño conjunto de genes (214) a las 24 horas, y un mayor número de genes (583) modificados tras 7 días de estimulación en presencia de lenalidomida (Figuras 27A y 27B). El análisis ATAC-seq reveló un conjunto limitado de cambios en la accesibilidad de la cromatina asociados al tratamiento con lenalidomida tras 24 horas de estimulación, con un cambio drástico en el perfil y un aumento en el número de sitios con cambios en la accesibilidad de la cromatina (cambio en la accesibilidad de la cromatina en 2804 picos) tras 7 días de estimulación en presencia de lenalidomida (Figuras 27C y 27D). Estos resultados indicaron que el tratamiento con lenalidomida alteró tanto el perfil transcripcional como el epigenético de las células CAR-T.
[0581] Para identificar aún más los cambios transcripcionales específicos asociados con el tratamiento con lenalidomida, se aplicó un análisis de ontología génica al conjunto de datos de ARN-seq, y las vías de señalización biológica que estaban enriquecidas en genes expresados diferencialmente (FIGS. 28A y 28B). La direccionalidad y la importancia de los efectos sobre las vías biológicas se muestran a las 24 horas (FIG. 28A) o 7 días (FIG. 28B). Los resultados mostraron que la presencia de lenalidomida provocaba un aumento de la expresión de genes implicados en la activación y señalización de las células T. Los resultados mostraron que las vías reguladas diferencialmente en presencia y ausencia de lenalidomida mostraban un enriquecimiento de genes asociados a la sinapsis inmunitaria, genes implicados en la señalización de citocinas y genes implicados en las vías de activación de células T. En concreto, las vías asociadas a la quimiotaxis de células T (extravasación de leucocitos, integrina, ILK y conjuntos de genes asociados a CXCR4), la señalización intracelular y el citoesqueleto (Rac/Rho/Cdc42) se incrementaron en presencia de lenalidomida en las 24 horas posteriores a la estimulación en comparación con los controles con vehículo. Además, estos datos apoyan un aumento de las vías de señalización relacionadas con ICOS, un hallazgo que coincide con publicaciones anteriores que demuestran un aumento de ICOS e ICOSL en la población CD3+ de células mononucleares de sangre periférica tratadas con lenalidomida ex vivo (Gorgun et al. (2010) Blood, 116:3227-3237). Tras 7 días de estimulación, la lenalidomida aumentó las vías asociadas con la respuesta de las células T Th1 y la coestimulación, al tiempo que redujo las firmas génicas asociadas a Th2.
[0582] Para un subconjunto seleccionado de genes, incluyendo genes implicados en la activación y señalización de células T, se compararon los cambios de expresión génica y accesibilidad a la cromatina en presencia de lenalidomida para las células cultivadas durante 7 días con estimulación para determinar si la accesibilidad a la cromatina se correlacionaba con la transcripción. La FIG. 29 muestra los picos individuales de accesibilidad de la cromatina (rombo) y el cambio medio de accesibilidad de la cromatina para cada gen (círculo) trazados frente a los correspondientes cambios de expresión génica medidos por ARN-seq mostrando concordancia de señal entre los dos métodos. En todos los donantes, se observó un aumento significativo de la accesibilidad de la cromatina en múltiples loci asociados con IFN-y e IL-2RA (CD25), y estos cambios se correlacionaron con un aumento significativo de la transcripción. Es importante destacar que el aumento de IFN-<y>y CD25 corroboró los resultados anteriores de los experimentos de estimulación crónica. Además, también se observó una disminución de la accesibilidad a la cromatina de CD69 y CCR7 y de la transcripción génica en el tratamiento con lenalidomida.
[0583] Se analizó el conjunto de datos ATAC-seq para el enriquecimiento de motivos, y los resultados del análisis de enriquecimiento de motivos para picos con accesibilidad aumentada en presencia de lenalidomida en cultivos de día 7 se muestran en la FIG. 30. Los motivos predichos para unirse a varios factores de transcripción, entendidos como implicados en la activación y señalización de células T, incluyendo AP-1/Jun y el factor nuclear<k>B, se enriquecieron en picos con mayor accesibilidad en presencia de lenalidomida. Los resultados fueron coherentes con un aumento de la actividad funcional en las células T que expresaban CAR en presencia de lenalidomida.
[0584] Sin querer estar limitado por la teoría, los estudios de ARN y ATAC-seq resultaron en una serie de conocimientos sobre los posibles mecanismos para los aumentos inducidos por lenalidomida en la función CAR T. En primer lugar, el número de cambios transcripcionales y de accesibilidad a la cromatina asociados con la estimulación y el tiempo fueron predominantes en comparación con los efectos de la lenalidomida, lo que indica un efecto relativamente sutil de la lenalidomida en las redes transcripcionales. En segundo lugar, los cambios asociados a la lenalidomida fueron amplios, incluyendo cambios tempranos en los transcritos asociados a la remodelación del citoesqueleto y la quimiotaxis. Tras la estimulación crónica, apareció una firma transcripcional distinta que incluía una disminución de los transcritos asociados con la respuesta Th2, el punto de control G2/M y ATM, junto con un aumento de los genes Th1, del receptor y activado por el proliferador de peroxisomas y de los genes asociados al citoesqueleto de actina. Estos efectos pueden apoyar un papel para el tratamiento con lenalidomida y el control del ciclo celular y la activación de las células T. Estudios anteriores también han demostrado los efectos de las IMiD en las firmas asociadas a Th1- y Th2, así como cambios en elementos asociados a la remodelación del citoesqueleto y la migración de células T. Las alteraciones tempranas demostradas en la producción de citoquinas por la lenalidomida pueden contribuir a un estado alterado de las células T capaz de mejorar simultáneamente aspectos de la memoria y de la función efectora. En conjunto, estos resultados sugieren que en la prolongación de la función CAR T inducida por lenalidomida intervienen factores adicionales a los descritos anteriormente, incluidos posibles cambios en el control del ciclo celular.
[0585] La aplicación de ATAC-seq proporcionó más información sobre los posibles mecanismos de acción de la lenalidomida. Aunque tanto la estimulación como el tiempo fueron los impulsores predominantes de los cambios en la accesibilidad de la cromatina, el tratamiento con lenalidomida se asoció con aumentos en la accesibilidad de la cromatina en loci enriquecidos en motivos asociados con la activación y la función de las células T tras la estimulación crónica. Estos cambios epigenéticos coincidieron con los marcados cambios funcionales en las células T CAR incubadas con lenalidomida. Las alteraciones en las firmas de accesibilidad de la cromatina se han asociado con el agotamiento de las células T y pueden ser un indicador más sólido del agotamiento en comparación con la expresión del ligando de superficie de las células T. Estos datos demostraron que la estimulación crónica con lenalidomida produjo un aumento de la accesibilidad a la cromatina y de la expresión génica de IL-2 y CD25 y una disminución de la expresión génica y de la accesibilidad a la cromatina de CCR7 y CD69. Estudios anteriores sugerían que las células que expresaban CCR7 producían niveles más elevados de IL-2; sin embargo, los estudios actuales indicaban que la vía de la IL-2 podía verse alterada de forma independiente por la lenalidomida, dando lugar a un estado alternativo de las células T. CD69, un marcador de activación de células T, tiene un elemento de respuesta al factor nuclear kB que es necesario para la respuesta de CD69 al TNF-a. El cierre de la cromatina asociada a CD69 y la disminución de los transcritos pueden ser una reacción al aumento sostenido de la producción de TNF-a por las células T CAR cultivadas con lenalidomida, o puede ser una respuesta de las células T al aumento de la activación en presencia de lenalidomida. Las células tratadas con lenalidomida demostraron un mayor enriquecimiento de motivos de factores de transcripción de factores asociados a la activación de células T, lo que apoya la idea de que estas células están expuestas a una señalización de activación sostenida. En general, el estado de las células T<c>A<r>inducido por lenalidomida presenta elementos tanto de la función de las células T efectoras, incluido el aumento de la producción de IFN-<y>y TNF-a, como de la función de las células T de memoria, incluido el aumento de IL-2 y la proliferación a largo plazo.
Ejemplo 14 Evaluación de la respuesta farmacodinámica del factor de transcripción Ikaros en células T que expresan CAR en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida.
[0586] Se generaron composiciones de células T que contenían células T que expresaban CAR anti-CD19 a partir de muestras de leucaféresis de tres donantes adultos humanos sanos mediante un proceso que incluía la selección basada en inmunoafinidad de células T (incluidas células CD4+ y CD8+) a partir de las muestras, lo que dio como resultado dos composiciones, enriquecidas para células CD8+ y CD4+, respectivamente. Las células se incubaron en presencia de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (Compuesto 1) o lenalidomida, y se evaluó la expresión del factor de transcripción Ikaros.
[0587] Las células de las composiciones CD4+ y CD8+ enriquecidas se activaron por separado con microesferas anti-CD3/anti-CD28 y se sometieron a transducción lentiviral con un vector que codifica un CAR anti-CD 19. El CAR anti-CD 19 contenía un scFv anti-CD 19 derivado de un anticuerpo murino (región variable derivada de FMC63), un espaciador derivado de inmunoglobulina, un dominio transmembrana derivado de CD28, una región costimuladora derivada de 4-1BB y un dominio de señalización intracelular CD3-zeta. La construcción de expresión en el vector viral contenía además secuencias que codificaban un receptor truncado, que servía como marcador sustitutivo de la expresión de CAR, que estaba separado de la secuencia CAR por una secuencia de omisión del ribosoma T2A. A continuación, las poblaciones transducidas se incubaron por separado en presencia de reactivos estimulantes para la expansión celular. Las células CD8+ y CD4+ expandidas se formularon y crioconservaron por separado y se almacenaron. Las células CD4+ y CD8+ anti-CD 19 CAR de cada donante se descongelaron y combinaron en una proporción aproximada de 1:1 CAR+ CD4+:CD8+ antes de su uso.
[0588] Aproximadamente 2,5* 105 células (células T CD4+ y CD8+ combinadas en una proporción de 1:1) de la composición de células T CAR+ generada se estimularon durante la noche con un reactivo específico para la CAR, y luego las células se incubaron con lenalidomida (100 nM - 10.000 nM), el Compuesto 1 (10 nM - 3000 nM) o un control con vehículo durante la noche a 37°C, 5% CO2. Las concentraciones evaluadas del compuesto 1 y la lenalidomida abarcaron las Cmax y Cmin clínicas comunicadas. Tras la incubación, las células T que expresaban CAR anti-CD19 se tiñeron con anticuerpos y se analizaron mediante citometría de flujo para evaluar la expresión en superficie de CD4, CD8 y el marcador sustitutivo de la expresión de CAR, así como los niveles intracelulares de Ikaros en células CD4+CAR+ o CD8+CAR+. Los valores de la mediana de la intensidad de fluorescencia (MFI) de Ikaros se normalizaron y se calcularon como porcentaje en relación con el control con vehículo.
[0589] Como se muestra en la FIG. 31, se observó una disminución dependiente de la concentración en la expresión intracelular de Ikaros tanto en células T CD4+ anti-CD19 que expresaban CAR como en células T CD8+ anti-CD19 que expresaban CAR tras la incubación con el Compuesto 1 o lenalidomida. Se observó una mayor reducción de la expresión de Ikaros en las células en presencia del Compuesto 1 en comparación con la lenalidomida. La EC50 para reducir la expresión de Ikaros se calculó a partir de la concentración del inhibidor que redujo la MFI de Ikaros al 50% de su MFI máxima en ausencia del inhibidor. Los valores EC50 para el Compuesto 1 y la lenalidomida se muestran en la Tabla E5.
Tabla E5. EC50 (nM) de Ikaros en células T CD4+CAR+ y células T CD8+CAR+.
ND = no determinado
Ejemplo 15 Evaluación de los efectos funcionales en células T que expresan CAR tras la incubación con células diana en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida
5% CO2.Las composiciones de células T que expresan CAR anti-CD19 (que contienen células CD4+ y CD8+ combinadas en una proporción 1:1) se generaron sustancialmente como se describe en el Ejemplo 14, y se incubaron con células diana k 562 transducidas con CD19 humano (K562.CD19) en presencia de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (Compuesto 1) (a concentraciones de 10 nM, 100 nM, 500 nM, y 1000 nM), lenalidomida (a concentraciones de 100 nM, 1000 nM, y 10.000 nM), o un control con vehículo a 37°C, 5% CO2. Se evaluaron la expresión de citocinas, la citólisis de la célula diana y la expresión de marcadores de superficie de las células T anti-CD 19 que expresaban CAR.
A. Producción de citoquinas
[0591] Para evaluar la producción de citoquinas, 1x105 células CAR+ anti-CD19 (células T CD4+ y CD8+ combinadas en una proporción 1:1) se incubaron con células diana K562.CD19 en una proporción E:T de 5:1 o 2,5:1 en presencia o ausencia de lenalidomida o del Compuesto 1 como se describió anteriormente. Tras 24 horas, se recogieron los sobrenadantes y se analizó la producción de citocinas IFN-y, IL-2 y TNF-a.
[0592] Como se muestra en las FIGS. 32A (Compuesto 1) y 32B (lenalidomida), la producción de citoquinas aumentó en presencia del Compuesto 1 o la lenalidomida, respectivamente, de forma dependiente de la concentración en comparación con el control con vehículo, en ambas relaciones E:T de 5:1 y 2,5:1. Se observaron diferencias en los niveles de citocinas entre los distintos donantes. El tratamiento con el compuesto 1 dio lugar a una mayor producción de citoquinas en múltiples condiciones en comparación con el tratamiento con lenalidomida a concentraciones equivalentes. El aumento fue estadísticamente significativo según se determinó a partir del aumento de la producción de citocinas en presencia de 100 nM y 1000 nM del Compuesto 1 en comparación con la concentración equivalente de lenalidomida en la proporción 2,5:1 y 5:1 E:T según se determinó utilizando una prueba t paramétrica no apareada con la ejecución de la corrección de Welch, véase la Tabla E6 (Valores P en 2,5:1 E:T/Valores P en 5:1 E:T).
Tabla E6. Producción de citoquinas de células T anti-CD19 que expresan CAR tratadas con el Compuesto 1 o lenalidomida.
p<0.05: *; p <0.01:p<0.001: ***; ns: no significativo
B. Función citolítica
[0593] Para evaluar la función citolítica, se incubaron 1*105o 5*104 células CAR+ anti-CD19 (células T CD4+ y CD8+ combinadas en una proporción 1:1) con 2*104 células diana K562.CD19 en una proporción E:T de 5:1 o 2,5:1 en presencia 0 ausencia de lenalidomida o el Compuesto 1 o el control con vehículo como se describió anteriormente. Las células diana K562.CD19 se transdujeron con NucLight Red para permitir su seguimiento mediante microscopía. La actividad citolítica se evaluó midiendo la pérdida de células diana viables durante un periodo de cinco días, determinada por la señal fluorescente roja (utilizando el sistema de análisis de células vivas IncuCyte®, Essen Bioscience). Se determinó un índice de mortalidad mediante la fórmula 1/AUC, y el índice de destrucción se normalizó con respecto a las células CAR+ co cultivadas con células diana que habían sido incubadas con un control con vehículo (fijado en un 100% de destrucción).
[0594] Como se muestra en la FIG. 33, El compuesto 1 y la lenalidomida tuvieron en general un efecto limitado sobre la función citolítica de las células T anti-CD19 que expresan CAR. Cuando se estimuló el CAR en presencia de un antígeno mayor, como el presente en los cocultivos con una proporción E:T de 2,5:1, el compuesto 1 y la lenalidomida redujeron ligeramente la actividad citolítica de las células anti-CD19 que expresaban el CAR en algunos donantes. Cuando se estimuló el CAR en presencia de un antígeno menor, como el presente en los co-cultivos que contenían una proporción E:T de 5:1, se observó un aumento leve pero consistente de la actividad citolítica de las células T que expresaban CAR anti-CD19 contra las células diana a partir de células que se habían incubado en presencia de concentraciones elevadas del Compuesto 1 o lenalidomida para el Donante 2, mientras que no se observaron efectos con los Donantes 1 y 3.
C. Expresión de marcadores de superficie de células T
[0595] Para evaluar la expresión de superficie de varios marcadores de células T, 1x105 células diana K562.CD19 se incubaron con células anti-CD19 CAR+ (células T CD4+ y CD8+ combinadas en una proporción 1:1) en una proporción E:T de 5:1 o 2,5:1 en presencia o ausencia de lenalidomida o Compuesto 1 o control con vehículo como se describió anteriormente. Después de 24 horas, las células T que expresaban CAR se tiñeron para CD3, CD4, CD8 y el marcador sustituto de la expresión de CAR, y también para los siguientes marcadores de superficie: CD69, CD107a, PD-1, CD25, CD62L, CCR7, CD45RO, CD27, y LAG3.
[0596] Los niveles de expresión de marcadores selectos en células T CD4+ que expresan CAR y células T CD8+ que expresan CAR se alteraron, generalmente menos de dos veces, en relación con los cocultivos de control con vehículo. Los cambios en la expresión de marcadores en presencia de lenalidomida o del Compuesto 1 dependieron del donante, aunque para los marcadores de memoria evaluados la expresión de CD45RO aumentó y la de CD27 disminuyó en todos los donantes y proporciones E:T. La expresión de CD27 se redujo de forma dependiente de la concentración en respuesta al compuesto 1 o a la lenalidomida. La expresión de CD69 y LAG3 aumentó de forma dependiente de la concentración en las células derivadas del donante 3 tras la incubación con el Compuesto 1, pero no tras la incubación de las mismas células CAR+ derivadas del donante con lenalidomida. La expresión de los demás marcadores de activación evaluados permaneció inalterada en los donantes tratados con lenalidomida o con el compuesto 1. Los resultados son coherentes con la observación de que el compuesto 1 y la lenalidomida tienen el potencial de modular intrínsecamente los fenotipos de activación temprana de las células T que expresan CAR.
Ejemplo 16 Evaluación de la producción de citocinas y la expresión de marcadores de superficie de células T que expresan CAR tras la estimulación con anticuerpos antiidiotípicos en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida.
[0597] Se llevaron a cabo estudios similares a los descritos en el Ejemplo 15 para evaluar la producción de citocinas y la expresión de marcadores de superficie tras la estimulación dependiente de CAR de células T que expresan CAR en presencia o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (Compuesto 1) o lenalidomida, excepto que las células que expresan CAR se estimularon con un anticuerpo antiidiotípico. El anticuerpo anti-idiotípico se utilizó para simular niveles de estimulación variables en los co-cultivos, lo que generalmente no es posible con las células diana K562.CD19 porque la expresión del antígeno es uniformemente alta en las células K562.CD19.
[0598] Las composiciones de células T que expresan CAR anti-CD19 (que contienen células T CD4+ y CD8+ combinadas en una proporción 1:1) se generaron sustancialmente como se describe en el Ejemplo 14. Se añadieron aproximadamente 1x105 células que expresaban CAR a pocillos de una placa de 96 pocillos que se habían recubierto previamente con un anticuerpo antiidiotípico específico del scFv de las células T que expresaban CAR anti-CD19 a concentraciones de 0, 0,3, 3 y 30 |jg/ml. Las células se cultivaron en presencia del Compuesto 1 (a concentraciones de 100 nM y 1000 nM), lenalidomida (a concentraciones de 500 nM y 5000 nM), o un control con vehículo a 37°C, 5% CO2. Se evaluó la expresión de citoquinas y de marcadores de superficie de las células T anti-CD19 que expresaban CAR.
A. Producción de citoquinas
[0599] Los sobrenadantes de los cultivos estimulados se cosecharon después de 24 horas y se analizaron para la producción de citoquinas. En las FIGS. 34A y 34B, el nivel de producción de citoquinas en ausencia del Compuesto 1 o lenalidomida (control con vehículo) se indica con una línea discontinua. Como se muestra en las FIGS. 34A y 34B, la producción de IFN-y, IL-2 y TNF-a aumentó en relación con el control con vehículo tras el tratamiento con el Compuesto 1 o lenalidomida, respectivamente. El aumento fue particularmente evidente a un nivel intermedio de estimulación con 3jg/m L de anticuerpo antiidiotípico.
B. Expresión de marcadores de superficie de células T
[0600] La expresión de marcadores de superficie en células T que expresan CAR anti-CD19 se evaluó después de 4 días en cultivo con varias concentraciones del anticuerpo anti-idiotípico en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida. Las células T que expresan CAR se tiñeron para CD3, CD4, CD8 y el marcador sustituto de la expresión CAR, y también para los siguientes marcadores: CD25, PD-1 y CD69.
[0601] Las FIGS. 35A y 35B muestran la expresión de marcadores de superficie celular en células CD4+ y CD8+ que expresan CAR, respectivamente, en células estimuladas en presencia del Compuesto 1, y las FIGs. 36A y 36b muestran la expresión de marcadores de superficie celular en células CD4+ y CD8+ que expresan CAR, respectivamente, en células estimuladas en presencia de lenalidomida. En las figuras, el nivel de expresión del marcador de superficie en ausencia del Compuesto 1 o lenalidomida (control con vehículo) se indica con la línea discontinua. Como se muestra, se observó un aumento de los marcadores de superficie CD25 y CD69 en las células T CD4+ y CD8+ que expresaban CAR en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida en algunas células que expresaban CAR derivadas de donantes y en función de la cantidad de estimulación a través del CAR. La expresión de PD-1 también aumentó en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida en las células generadas a partir de al menos un donante, aunque los niveles de PD-1 no variaron o disminuyeron en las células generadas a partir de los otros donantes. Se observó un aumento de la expresión del marcador sustitutivo de la expresión CAR tras la adición del Compuesto 1 o lenalidomida a una dosis subóptima del anticuerpo antiidiotípico de 0,3 |jg/ml, pero a concentraciones más altas del anticuerpo antiidiotípico la expresión del marcador sustitutivo no cambió o disminuyó.
Ejemplo 17 Evaluación de la expresión de marcadores de superficie y potencial de expansión de células T que expresan CAR tras estimulación seriada en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida.
[0602] Se llevó a cabo la estimulación en serie de células T anti-CD19 que expresan CAR para evaluar los efectos a corto y largo plazo de 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (Compuesto 1) y lenalidomida. Las composiciones de células T que expresan CAR anti-CD19 (que contienen células T CD4+ y CD8+ combinadas en una proporción 1:1) se generaron sustancialmente como se describe en el Ejemplo 14. Las combinaciones de células T CAR+ generadas se añadieron a 1x105 células por pocillo a una placa de 96 pocillos y se incubaron con células diana K562.CD19 positivas fluorescentes rojas irradiadas en presencia del Compuesto 1, lenalidomida o un control con vehículo a 37°C, 5% CO2 a dos proporciones diferentes de efector a diana (E:T) de 10: 1 de 2,5:1. La incubación se llevó a cabo en presencia del Compuesto 1 (10, 100 o 500 nM), lenalidomida (100 o 1000 nM) o control con vehículo. Cada 3-4 días (inicio de cada nueva ronda), se contaron las células. A continuación, se cosecharon las células y se volvieron a implantar a 1x105 células que expresaban CAR anti-CD19 con medio fresco, Compuesto 1 recién añadido o lenalidomida a la misma concentración, y células diana K562.CD19 recién irradiadas. Esto se repitió durante 7 rondas de estimulación en serie, y las células se evaluaron en varios momentos para determinar la expresión de marcadores de superficie, la actividad citolítica y el potencial de expansión.
A. Expresión de marcadores de superficie
[0603] Se evaluó la expresión de marcadores de superficie seleccionados en las células en el día 4 (es decir, 4 días después de la primera estimulación) y en el día 28 (es decir, 4 días después de la séptima estimulación). Específicamente, las células cosechadas se analizaron por citometría de flujo para CD3, CD4, CD8 y el marcador sustituto para la expresión de CAR, y también para los siguientes marcadores de superficie: CD69, CD107a, PD-1, CD25, CD62L, CCR7,<c>D45RO, CD27, y LAG3.
[0604] Los cambios en los marcadores de superficie evaluados en las células CD4+ y CD8+ que expresan CAR tras la incubación con el Compuesto 1 y lenalidomida se observaron de forma variada en todos los donantes y proporciones E:T, aunque los cambios de expresión fueron más pronunciados en el día 28 en comparación con el día 4. En el día 4, CD25 y LAG3 fueron regulados al alza en los tres donantes en respuesta al tratamiento con el Compuesto 1 o lenalidomida, observándose una mayor disminución en las células del día 28 en comparación con el día 4. En general, el CCR7 disminuyó en el día 28 en todos los grupos tratados, lo que concuerda con la posibilidad de que la incubación con células diana en presencia del Compuesto 1 o lenalidomida haya impulsado el producto de células T hacia un fenotipo asociado con una estatus efector terminalmente diferenciada. La PD-1 se reguló a la baja hasta cierto punto en todos los donantes y en ambas proporciones E:T en las células el día 4 y el día 28 tras el tratamiento con el Compuesto 1 o lenalidomida, con una mayor regulación a la baja en las células el día 28. Como se muestra en las FIGS. 37A y 37B, la expresión de CD28 disminuyó de forma dosis-dependiente en presencia de concentraciones crecientes de Compuesto 1 y lenalidomida, respectivamente, tanto en células T CD4+ como CD8+ que expresaban CAR de los tres donantes. En conjunto, los cambios en los marcadores de superficie en el día 28 en comparación con el día 4 son consistentes con la capacidad del Compuesto 1 y la lenalidomida para impactar en las células T CAR+ tras un tratamiento a largo plazo.
B. Función citolítica
[0605] En el día 24 después de la estimulación en serie, la actividad citolítica de las células T que expresan CAR anti-CD19 se evaluó en general como se describe en el Ejemplo 15B. Como se muestra en la FIG. 38, tanto el tratamiento a largo plazo con el Compuesto 1 como con lenalidomida fueron capaces de aumentar la actividad citolítica de las células T anti-CD19 que expresan CAR.
C. Expansión
[0606] Para evaluar el efecto del Compuesto 1 y la lenalidomida sobre el potencial de expansión de las células T CAR+, se contaron los números celulares de las células T anti-CD19 que expresaban CAR después de cada ronda de estimulación y se calcularon los doblajes celulares.
[0607] Como se muestra en la FIG. 39A, en la proporción E:T de 2,5:1, las células T que expresan CAR anti-CD19 tratadas con el Compuesto 1 a concentraciones de 500nM tuvieron un recuento celular comparable al del grupo de control tratado hasta 3-4 rondas de estimulación para todos los donantes. Se observaron resultados similares en la proporción E:T de 10:1 para dos donantes. A la concentración superior de 500 nM del Compuesto 1, el número de duplicaciones de células CAR+ en rondas posteriores fue inferior al de los grupos de control no tratados. Por el contrario, tras 24 días de tratamiento con el Compuesto 1 a concentraciones inferiores de 10nM y 100nM, los recuentos celulares de células T que expresaban CAR anti-CD19 fueron superiores a los controles no tratados en dos de cada tres donantes (FIG. 39B).
[0608] Como se muestra en la FIG. 40A, en la proporción 2,5:1 E:T en células tratadas con lenalidomida 1000 nM sólo se observaron duplicaciones celulares inferiores en dos de los donantes y no hasta rondas posteriores de estimulación. Este resultado indica algunas diferencias en la actividad del Compuesto 1 y la lenalidomida, ya que 500 nM de Compuesto 1 disminuyeron los recuentos celulares en todos los donantes con esta proporción E:T. En la proporción 10:1 E:T, se observó una disminución de la duplicación celular tras 3-4 rondas de estimulación en presencia de1000 nM de lenalidomida por parte de células generadas a partir de todos los donantes (FIG.
[0609] 40A). Como se muestra en la FIG. 40B, el tratamiento con lenalidomida a una concentración inferior de 100 nM aumentó los recuentos de células T CAR+ en dos de cada tres donantes.
[0610] El resultado es coherente con la observación de que el tratamiento prolongado de células T que expresan CAR con el Compuesto 1 o lenalidomida a concentraciones fisiológicamente relevantes puede aumentar el potencial de proliferación a largo plazo de células T que expresan CAR, mientras que concentraciones más altas pueden ser perjudiciales para el rendimiento a largo plazo.
Ejemplo 18 Evaluación de la eficacia antitumoral de células T que expresan CAR en combinación con el Compuesto 1in vivo
[0611] La eficacia antitumoral de las células T que expresan CAR en combinación con el Compuesto 1 se evaluó monitorizando los tumores en un modelo de xenoinjerto tumoral. Las composiciones de células T que expresan CAR anti-CD19 (que contienen células T CD4+ y CD8+ combinadas en una proporción 1:1) se generaron sustancialmente como se describe en el Ejemplo 1. Las composiciones de células T se generaron a partir de tres donantes diferentes.
[0612] Se inyectaron por vía intravenosa (i.v.) ratones NOD.Cg.PrkdcscidIL2rgtmíW;7SzJ (NSG) con 0,5 * 106 células tumorales de linfoma Raji (una línea celular tumoral inmortalizada de linfocitos B humanos que expresa CD19) transfectadas con luciferasa de luciérnaga (Raji-ffluc). Se dejó que el tumor se injertara durante 6 días y se verificó mediante imágenes de bioluminiscencia. El día 7, los ratones no recibieron ningún tratamiento o recibieron una única inyección intravenosa (i.v.) de células CAR anti-CD19 a una dosis baja (0,5*106 células) o alta (1,0*106 células). En un grupo de estudio (designado "Concurrente"), se administró a los ratones 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (Compuesto 1)a una dosis de 0,3 mg/kg o control con vehículo mediante inyección intraperitoneal un día antes de la administración de las células que expresaban CAR (día 6), que se continuó una vez al día durante la duración del estudio. En un segundo grupo (designado "Retrasado"), se administró a los ratones un control con vehículo o 3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona (Compuesto 1) a una dosis de 0,3 mg/kg mediante inyección intraperitoneal a partir del día 14, que fue después del pico de expansión de las células T que expresan CAR, y la administración se continuó una vez al día durante todo el estudio. La carga tumoral se evaluó mediante bioluminiscencia cada 10 días. Para la obtención de imágenes de bioluminiscencia, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales (i.p.) de sustrato de luciferina (CaliperLife Sciences, Hopkinton, MA) resuspendido en PBS (15 pg/g de peso corporal). Se determinó la radiancia media (p/s/cm2/sr) .
[0613] En este estudio, se observó que la combinación con el Compuesto 1 reducía la carga tumoral y mejoraba los datos de supervivencia tanto en el grupo "Concurrente" como en el grupo "Retrasado", en comparación con la administración de las células que expresan CAR solas.
[0614] La presente invención no pretende limitarse en su alcance a las realizaciones particulares divulgadas, que se proporcionan, por ejemplo, para ilustrar diversos aspectos de la invención. Varias modificaciones de las composiciones y métodos descritos resultarán evidentes a partir de la descripción y las enseñanzas del presente documento.
SECUENCIAS
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Claims (25)

  1. REIVINDICACIONES 1. Una terapia de células T y un compuesto inmunomodulador para su uso en un método de tratamiento del cáncer, en el que el método comprende: (a) administrar una terapia de células T a un sujeto que padece una enfermedad o afección cancerosa, en la que la terapia de células T es o comprende células modificadas genéticamente que expresan un receptor recombinante que se une específicamente a un antígeno, en la que el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR), y en la que el CAR comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral, un espaciador y una región de señalización intracelular; y (b) administrar al sujeto un compuesto inmunomodulador, en el que dicho compuesto inmunomodulador es talidomida (2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1H-isoindol-1,3(2H)-diona) o un análogo o derivado de la talidomida, y en el que el compuesto inmunomodulador: (i) se une al cereblon (CRBN) y/o al complejo ubiquitina-ligasa E3 CRBN, y (ii) aumenta la degradación tanto de Ikaros (IKZF1) como de Aiolos (IKZF3); donde el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador se lleva a cabo entre 7 y 21 días después del inicio de la administración de la terapia de células T, y en el que el compuesto inmunomodulador se administra por vía oral.
  2. 2. Un compuesto inmunomodulador para su uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método la administración de un compuesto inmunomodulador a un sujeto que tiene una enfermedad o afección que es cáncer, en el que, en el momento de iniciar la administración del compuesto inmunomodulador, al sujeto se le ha administrado previamente una terapia de células T para el tratamiento de la enfermedad o afección, en la que la terapia de células T es o comprende células modificadas genéticamente que expresan un receptor recombinante que se une específicamente a un antígeno, en la que el receptor recombinante es un receptor de antígeno quimérico (CAR), y en la que el CAR comprende un dominio extracelular que comprende un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno tumoral, un espaciador y una región de señalización intracelular, en el que dicho compuesto inmunomodulador es talidomida (2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)-1H-isoindol- 1,3(2H)-diona) o un análogo o derivado de la talidomida, y en el que el compuesto inmunomodulador: (i) se une al cereblon (CRBN) y/o al complejo ubiquitina-ligasa E3 CRBN, y (ii) aumenta la degradación tanto de Ikaros (IKZF1) como de Aiolos (IKZF3); y donde el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador se lleva a cabo entre 7 y 21 días después del inicio de la administración de la terapia de células T, y en el que el compuesto inmunomodulador se administra por vía oral.
  3. 3. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 1 o el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 2, donde el inicio de la administración del compuesto inmunomodulador se lleva a cabo en un momento que es mayor de 14 días, 15 días, 16 días, 17 días, 18 días, 19, días o 20 días después del inicio de la administración de la terapia de células T.
  4. 4. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 3 o el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en el que el compuesto inmunomodulador se administra a un sujeto dentro de una semana, tal como dentro de 1, 2 o 3 días después: (i) el nivel máximo o pico de las células de la terapia celular T es detectable en la sangre del sujeto; (ii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre, tras haber sido detectables en la sangre, no es detectable o es reducido, opcionalmente reducido en comparación con un punto temporal precedente tras la administración de la terapia celular T; (iii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre disminuye en o más de 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 1o veces o más el pico o número máximo de células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto tras el inicio de la administración de la terapia celular T; (iv) en un momento posterior a un pico o nivel máximo de las células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto, el número de células de o derivadas de las células T detectables en la sangre del sujeto es inferior a menos del 10%, menos del 5%, menos del 1% o menos del 0,1% del total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la sangre del sujeto; (v) el sujeto presenta progresión de la enfermedad y/o ha recaído tras la remisión después del tratamiento con la terapia celular T; y/o (vi) el sujeto presenta un aumento de la carga tumoral en comparación con la carga tumoral en un momento anterior o posterior a la administración de las células T y anterior al inicio de la administración del compuesto inmunomodulador.
  5. 5. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-4 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, comprendiendo el método, antes de iniciar la administración del compuesto inmunomodulador, seleccionar un sujeto en el que: (i) el nivel máximo o pico de las células de la terapia celular T es detectable en la sangre del sujeto; (ii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre, tras haber sido detectables en la sangre, no es detectable o es reducido, opcionalmente reducido en comparación con un punto temporal precedente tras la administración de la terapia celular T; (iii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre disminuye en o más de 1,5 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más el pico o número máximo de células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto tras el inicio de la administración de la terapia celular T; (iv) en un momento posterior a un pico o nivel máximo de las células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto, el número de células de o derivadas de las células T detectables en la sangre del sujeto es inferior a menos del 10%, menos del 5%, menos del 1% o menos del 0,1% del total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la sangre del sujeto; (v) el sujeto presenta progresión de la enfermedad y/o ha recaído tras la remisión después del tratamiento con la terapia celular T; y/o (vi) el sujeto presenta un aumento de la carga tumoral en comparación con la carga tumoral en un momento anterior o posterior a la administración de las células T y anterior al inicio de la administración del compuesto inmunomodulador.
  6. 6. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-5 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en el que: (i) el compuesto inmunomodulador se administra durante más de o más de unos 7 días consecutivos, más de o más de unos 14 días consecutivos, más de o más de unos 21 días consecutivos, más de o más de unos 21 días consecutivos, o más de o más de unos 28 días consecutivos; y/o (ii) el compuesto inmunomodulador se administra en un ciclo que comprende la administración diaria durante una pluralidad de días consecutivos seguida de un periodo de descanso durante el cual no se administra el compuesto inmunomodulador, opcionalmente en el que el periodo de descanso durante el cual no se administra el compuesto inmunomodulador es superior a 7 días consecutivos, superior a 14 días consecutivos, superior a 21 días o superior a 28 días; y/o (iii) en el que el compuesto inmunomodulador se administra durante al menos 2 ciclos, al menos 3 ciclos, al menos 4 ciclos, al menos 5 ciclos, al menos 6 ciclos, al menos 7 ciclos, al menos 8 ciclos, al menos 9 ciclos, al menos 10 ciclos, al menos 11 ciclos o al menos 12 ciclos.
  7. 7. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-6 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-6, en el que la administración del compuesto inmunomodulador se continúa, desde al menos después del inicio de la administración de las células T, hasta: (i) el número de células de o derivadas de la terapia de células T administrada detectables en la sangre del sujeto aumenta en comparación con en el sujeto en un punto temporal precedente justo antes de la administración del compuesto inmunomodulador o en comparación con un punto temporal precedente después de la administración de la terapia de células T; (ii) el número de células de la terapia celular T detectables en la sangre del sujeto es superior o mayor que aproximadamente el 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50% o 60% del total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en la sangre del sujeto; (iii) el sujeto presenta una reducción de la carga tumoral en comparación con la carga tumoral en un momento inmediatamente anterior a la administración de la terapia celular T o en un momento inmediatamente anterior a la administración del compuesto inmunomodulador; y/o (iv) el sujeto muestra una remisión completa o clínica.
  8. 8. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en el que el compuesto inmunomodulador es un compuesto de la siguiente fórmula:
    donde uno de X e Y es -C(O)- y el otro de X e Y es -C(O)- o -CH2-; (1) cada uno de R1, R2, R3, y R4 son independientemente halo, alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, o alcoxi o de 1 a 4 átomos de carbono, o (2) uno restante R4 son hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono; R5 es hidrógeno o alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, bencilo o halo; siempre que R5 sea distinto de hidrógeno si X e Y son -C(O)- y (i) cada uno de R1, R2, R3, y R4 es fluoro; o (ii) uno de R1, R2, R3, y R4 es amino; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  9. 9. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-8 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-8, en el que el compuesto inmunomodulador es un compuesto de la siguiente fórmula: donde uno de X e Y es -C(O)- y el otro hidrógeno o alquilo inferior, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  10. 10. La terapia celular T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-9 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en el que el compuesto inmunomodulador es lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona), pomalidomida (4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindol-1,3-diona), o avadomida (3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2.,6-diona), un estereoisómero de lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona), pomalidomida (4-amino-2-(2,6-dioxopiperidin-3-il)isoindol-1,3-diona), avadomida (3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona), o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable de los mismos.
  11. 11. El compuesto inmunomodulador y de terapia celular T para uso de la reivindicación 10 o el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 10, en el que el compuesto inmunomodulador es lenalidomida (3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona), o un estereoisómero del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.
  12. 12. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 10 o el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 10, en el que el compuesto inmunomodulador es lenalidomida (3-(4-amino-1- oxo-1,3-dihidro-2H-isoindol-2-il)piperidina-2,6-diona).
  13. 13. El compuesto inmunomodulador y de terapia celular T para uso de la reivindicación 10 o el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 10, en el que el compuesto inmunomodulador es avadomida (3-(5-amino-2- metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona), o un estereoisómero del mismo, o una sal, solvato, hidrato, cocristal, clatrato o polimorfo farmacéuticamente aceptable del mismo.
  14. 14. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 10 o el compuesto inmunomodulador para uso de la reivindicación 10, en el que el compuesto inmunomodulador es avadomida (3-(5-amino-2-metil-4-oxo-4H-quinazolin-3-il)-piperidina-2,6-diona).
  15. 15. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-7 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-7, en el que el compuesto inmunomodulador es 3-[4-(4-morfolin-4-ilmetil-benciloxi)-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il]-piperidina-2,6-diona.
  16. 16. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-15 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-15, en el que el compuesto inmunomodulador se administra en una cápsula o un comprimido.
  17. 17. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-16 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-16, en el que el compuesto inmunomodulador se administra en una cantidad de 0,1 mg a 100 mg, de 0,1 mg a 50 mg, de 0,1 mg a 25 mg, de 0,1 mg a 10 mg, de 0,1 mg a 5 mg, de 0 .de 1 mg a 1 mg, de 1 mg a 100 mg, de 1 mg a 50 mg, de 1 mg a 25 mg, de 1 mg a 10 mg, de 1 mg a 5 mg, de 5 mg a 100 mg, de 5 mg a 50 mg, de 5 mg a 25 mg, de 5 mg a 10 mg, de 10 mg a 100 mg, de 10 mg a 50 mg, de 10 mg a 25 mg, de 25 mg a 100 mg, de 25 mg a 50 mg o de 50 mg a 100 mg, cada uno inclusive, en los que la cantidad es una cantidad diaria del compuesto inmunomodulador.
  18. 18. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-17 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-17, en el que: (i) el compuesto inmunomodulador se administra una vez al día, dos veces al día, tres veces al día, cuatro veces al día, cinco veces al día o seis veces al día; y/o (ii) el compuesto inmunomodulador se administra en una cantidad de dosificación diaria total de al menos o aproximadamente 0,1 mg al día, 0,5 mg al día, 1,0 mg al día, 2,5 mg al día, 5 mg al día, 10 mg al día, 25 mg al día, 50 mg al día o 100 mg al día; y/o (iii) el compuesto inmunomodulador se administra en una cantidad mayor o superior a aproximadamente 1 mg al día, 2,5 mg al día, 5 mg al día, 7,5 mg al día, 10 mg al día, 15 mg al día y menos de 25 mg al día.
  19. 19. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-18 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-18, en el que: (a) el antígeno se selecciona entre ROR1, antígeno de maduración de células B (BCMA), anhidrasa carbónica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor tirosina quinasa erbB2), L1-CAM, CD19, CD20, CD22, mesotelina, CEA y antígeno de superficie de la hepatitis B, receptor antifolato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), EPHa2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros erbB,<e>G<f>R vIII, proteína de unión a folatos (FBP), FCRL5,<f>C<r>H5, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de dominio de inserción de quinasa (kdr), cadena ligera kappa, Lewis Y, molécula de adhesión celular L1, (L1-CAM), antígeno asociado a melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno preferentemente expresado de melanoma (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor de IL-13 alfa 2 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250/CAIX, HLA-AI MAGE Al HLA-A2 NY-ESO-1, PSCA, receptor de folato-a, CD44v6, CD44v7/8, integrina avb6, 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligandos NKG2D, CD44v6, antígeno dual, antígeno a cáncer-testículos, mesotelina, CMV murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, PSCA, NKG2D, NY-ESO-1, MART-1, gp100, receptor 5D acoplado a proteína G (GPCR5D), antígeno oncofetal, ROR1, TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionario (CEA), Her2/neu, receptor de estrógenos, receptor de progesterona, efrínB2, CD123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (OGD2), CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), una ciclina, ciclina A2, CCL-1, CD138, opcionalmente un antígeno humano de cualquiera de los anteriores; un antígeno específico de patógeno; y un antígeno asociado a una etiqueta universal; o (b) el antígeno es o comprende un antígeno asociado a mieloma múltiple.
  20. 20. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-18 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-18, en el que el antígeno es o comprende CD19, opcionalmente CD19 humano.
  21. 21. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-18 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-18, en el que el antígeno es un BCMA, opcionalmente BCMA humano.
  22. 22. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-21 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-21, en el que: la terapia celular T comprende células T que son CD4+ o CD8+; y/o la terapia celular T comprende células primarias derivadas de un sujeto; y/o la terapia celular T comprende células que son autólogas del sujeto o la terapia celular T comprende células T que son alogénicas del sujeto; y/o el sujeto es un ser humano; y/o la terapia celular T comprende la administración de entre 1 * 105 y 1 * 108 células totales expresantes de receptores recombinantes, células T totales, o células mononucleares de sangre periférica (PBMC) totales, o de entre 5 * 105 y 1 * 107 células totales expresantes de receptores recombinantes total de células T o total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), o entre 1 * 106 y 1 * 107 células totales que expresan receptores recombinantes, total de células T o total de células mononucleares de sangre periférica (PBMC), cada una inclusive.
  23. 23. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-22 o el compuesto inmunomodulador para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-22, en el que el método comprende además administrar una quimioterapia linfodepletora antes de la administración de la terapia de células T.
  24. 24. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-23 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-23, en el que: (i) el cáncer es una neoplasia de células B y/o un mieloma, linterna o leucemia; y/o el cáncer es un linterna de células del manto (MCL), un mieloma múltiple (MM), una leucemia linfoblástica aguda (ALL), una ALL en adultos, una leucemia linfoblástica crónica (CLL), un linterna no hodgkiniano (NHL), un linterna difuso de células B grandes (DLBCL) o un linterna folicular (FL); o (ii) el cáncer es un cáncer no hematológico o es un tumor sólido.
  25. 25. La terapia de células T y el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-24 o el compuesto inmunomodulador para uso de cualquiera de las reivindicaciones 2-24, en el que; (i) la terapia celular T muestra una expansión y/o persistencia aumentada o prolongada en el sujeto en comparación con un método en el que la terapia celular T se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador; y/o (ii) el método reduce la carga tumoral en mayor grado y/o durante un mayor periodo de tiempo en comparación con la reducción que se observaría con un método comparable en el que la terapia celular T se administra al sujeto en ausencia del compuesto inmunomodulador y/o en el que el compuesto inmunomodulador se administra en ausencia de la terapia celular T, opcionalmente a la misma dosis o programa de dosificación.
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WO (1) WO2018204427A1 (es)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107206076B (zh) 2014-12-05 2021-07-09 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向b-细胞成熟抗原的抗体及其用途
CN110691792A (zh) 2017-01-10 2020-01-14 朱诺治疗学股份有限公司 细胞疗法的表观遗传学分析及相关方法
MX2019009552A (es) 2017-02-17 2019-10-02 Hutchinson Fred Cancer Res Terapias de combinacion para el tratamiento de canceres relacionados con el antigeno de maduracion de celulas b (bcma) y trastornos autoinmunitarios.
CA3064205A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Abvitro Llc High-throughput polynucleotide library sequencing and transcriptome analysis
CA3075716A1 (en) * 2017-09-14 2019-03-21 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatment for cancer
WO2019089982A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors
MX2020004243A (es) 2017-11-01 2020-09-25 Juno Therapeutics Inc Receptores de anticuerpos y de antigenos quimericos especificos para el antigeno de maduracion de celulas b.
JP7447006B2 (ja) * 2017-11-01 2024-03-11 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｂ細胞成熟抗原（ｂｃｍａ）に特異的なキメラ抗原受容体
KR20200099137A (ko) 2017-11-06 2020-08-21 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 세포 요법 및 감마 세크레타제 억제제의 조합
AU2019372331A1 (en) * 2018-11-01 2021-05-27 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using chimeric antigen receptors specific for B-cell maturation antigen
SG11202104411VA (en) * 2018-11-08 2021-05-28 Juno Therapeutics Inc Methods and combinations for treatment and t cell modulation
US11197852B2 (en) 2019-04-22 2021-12-14 Starton Therapeutics, Inc. Continuous delivery of lenalidomide and other immunomodulatory agents
EP3958875A4 (en) * 2019-04-25 2023-05-10 Purdue Research Foundation Engineered natural killer cells redirected toward purinergic signaling, constructs thereof, and methods for using the same
JP7615134B2 (ja) * 2019-09-27 2025-01-16 ビーム セラピューティクス インク． 液体がんの治療のための組成物および方法
WO2021092097A1 (en) 2019-11-05 2021-05-14 Juno Therapeutics, Inc. Methods of determining attributes of therapeutic t cell compositions
JP2022554353A (ja) * 2019-11-07 2022-12-28 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞療法と（ｓ）－３－［４－（４－モルホリン－４－イルメチル－ベンジルオキシ）－１－オキソ－１，３－ジヒドロ－イソインドール－２－イル］－ピペリジン－２，６－ジオンとの併用
CA3160423A1 (en) * 2019-12-06 2021-06-10 Fate Therapeutics, Inc. Enhancement of ipsc-derived effector immune cell using small compounds
WO2021148019A1 (zh) * 2020-01-22 2021-07-29 科济生物医药（上海）有限公司 病毒载体转导细胞的方法
MX2022009830A (es) * 2020-02-12 2022-10-28 Juno Therapeutics Inc Composiciones de celulas t que expresan receptores de antigenos quimericos dirigidos a bcma y metodos y usos de las mismas.
US20230178239A1 (en) 2020-05-13 2023-06-08 Juno Therapeutics, Inc. Methods of identifying features associated with clinical response and uses thereof
WO2022137181A1 (en) * 2020-12-23 2022-06-30 Crispr Therapeutics Ag Co-use of lenalidomide with car-t cells
CN113024671B (zh) * 2020-12-31 2022-05-24 北京艺妙神州医药科技有限公司 一种抗bcma的抗体及其应用
CA3227745A1 (en) * 2021-07-29 2023-02-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited Car-expressing immune cells that specifically target mesothelin and uses thereof
WO2023230548A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4452773A (en) 1982-04-05 1984-06-05 Canadian Patents And Development Limited Magnetic iron-dextran microspheres
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US4795698A (en) 1985-10-04 1989-01-03 Immunicon Corporation Magnetic-polymer particles
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
WO1990007380A2 (en) 1988-12-28 1990-07-12 Stefan Miltenyi Methods and materials for high gradient magnetic separation of biological materials
US5200084A (en) 1990-09-26 1993-04-06 Immunicon Corporation Apparatus and methods for magnetic separation
US5629327A (en) 1993-03-01 1997-05-13 Childrens Hospital Medical Center Corp. Methods and compositions for inhibition of angiogenesis
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
WO1996013593A2 (en) 1994-10-26 1996-05-09 Procept, Inc. Soluble single chain t cell receptors
WO1996018105A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 The President And Fellows Of Harvard College Single chain t-cell receptor
DE19608753C1 (de) 1996-03-06 1997-06-26 Medigene Gmbh Transduktionssystem und seine Verwendung
US6451995B1 (en) 1996-03-20 2002-09-17 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain FV polynucleotide or peptide constructs of anti-ganglioside GD2 antibodies, cells expressing same and related methods
CZ304569B6 (cs) 1996-07-24 2014-07-09 Celgene Corporation 1,3-Dioxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-aminoisoindolin pro použití pro snížení nežádoucí hladiny TNFα u savce
HU228769B1 (en) 1996-07-24 2013-05-28 Celgene Corp Substituted 2(2,6-dioxopiperidin-3-yl)phthalimides and -1-oxoisoindolines and their use for production of pharmaceutical compositions for mammals to reduce the level of tnf-alpha
US5635517B1 (en) 1996-07-24 1999-06-29 Celgene Corp Method of reducing TNFalpha levels with amino substituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-YL)-1-oxo-and 1,3-dioxoisoindolines
US5798368A (en) 1996-08-22 1998-08-25 Celgene Corporation Tetrasubstituted 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1-oxoisoindolines and method of reducing TNFα levels
US6281230B1 (en) 1996-07-24 2001-08-28 Celgene Corporation Isoindolines, method of use, and pharmaceutical compositions
EP1019439B1 (en) 1997-10-02 2011-11-16 Altor BioScience Corporation Soluble single-chain t-cell receptor proteins
EP1357120A1 (en) 1998-03-16 2003-10-29 Celgene Corporation 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindoline derivatives, their preparation and their use as inhibitors of inflammatory cytokines
SK17332000A3 (sk) 1998-05-19 2001-06-11 Avidex Limited Preskladaný rekombinantný t bunkový receptor-tcr, sekvencie nukleových kyselín, ktoré kódujú rekombinantné tcr reťazce rekombinantného tcr, a spôsob jeho výroby
WO2000014257A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Fusion receptors specific for prostate-specific membrane antigen and uses thereof
AU2472400A (en) 1998-10-20 2000-05-08 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
EP1163219B1 (en) 1999-03-18 2005-10-12 Celgene Corporation Substituted 1-oxo- and 1,3-dioxoisoindolines and their use in pharmaceutical compositions for reducing inflammatory cytokine levels
EP1287357A2 (en) 2000-06-02 2003-03-05 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
US7446179B2 (en) 2000-11-07 2008-11-04 City Of Hope CD19-specific chimeric T cell receptor
US6458810B1 (en) 2000-11-14 2002-10-01 George Muller Pharmaceutically active isoindoline derivatives
US20030045552A1 (en) 2000-12-27 2003-03-06 Robarge Michael J. Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
US7091353B2 (en) 2000-12-27 2006-08-15 Celgene Corporation Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
JP4361273B2 (ja) 2001-02-27 2009-11-11 アメリカ合衆国 潜在的な血管形成阻害剤としてのサリドマイド類似体
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
PT1421115E (pt) 2001-08-31 2005-07-29 Avidex Ltd Receptor de celulas t soluvel
US7939059B2 (en) 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
EP1549748B1 (en) 2002-10-09 2014-10-01 Immunocore Ltd. Single chain recombinant t cell receptors
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
DE602005022595D1 (de) 2004-06-29 2010-09-09 Immunocore Ltd Einen modifizierten t-zellen-rezeptor exprimierende zellen
US7244759B2 (en) 2004-07-28 2007-07-17 Celgene Corporation Isoindoline compounds and methods of making and using the same
PT2856876T (pt) 2007-03-30 2018-03-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Expressão constitutiva de ligantes co-estimulatórios em linfócitos t adotivamente transferidos
US7615883B2 (en) 2007-06-06 2009-11-10 Meheen H Joe Wind driven venturi turbine
EP2433713B1 (en) 2007-12-07 2017-07-26 Miltenyi Biotec GmbH Cell processing systems and methods
US8479118B2 (en) 2007-12-10 2013-07-02 Microsoft Corporation Switching search providers within a browser search box
US20120164718A1 (en) 2008-05-06 2012-06-28 Innovative Micro Technology Removable/disposable apparatus for MEMS particle sorting device
JP5173594B2 (ja) 2008-05-27 2013-04-03 キヤノン株式会社 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法
JP2012501180A (ja) 2008-08-26 2012-01-19 シティ・オブ・ホープ Ｔ細胞の抗腫瘍エフェクター機能増進のための方法および組成物
DK2406284T5 (en) 2009-03-10 2017-06-12 Biogen Ma Inc ANTI-BCMA ANTIBODIES
EP2486049A1 (en) 2009-10-06 2012-08-15 The Board Of Trustees Of The UniversityOf Illinois Human single-chain t cell receptors
EP2496698B1 (en) 2009-11-03 2019-01-09 City of Hope TRUNCATED EPIDERIMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR (EGFRt) FOR TRANSDUCED T CELL SELECTION
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
CN103502438A (zh) 2011-03-23 2014-01-08 弗雷德哈钦森癌症研究中心 用于细胞免疫治疗的方法和组合物
US8398282B2 (en) 2011-05-12 2013-03-19 Delphi Technologies, Inc. Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element
CN107880101B (zh) 2011-11-11 2021-12-21 弗雷德哈钦森癌症研究中心 针对癌症的靶向细胞周期蛋白a1的t细胞免疫疗法
EP3594245A1 (en) 2012-02-13 2020-01-15 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
BR112014024893B8 (pt) 2012-04-11 2022-09-06 Us Health Sequência de ácido nucleico isolada ou purificada que codifica um receptor de antígeno quimérico (car) e seu uso, cars isolados ou purificados, vetores, métodos para destruir células cancerígenas e polinucleotídeo
US9751928B2 (en) 2012-05-03 2017-09-05 Fred Hutchinson Cancer Research Center Enhanced affinity T cell receptors and methods for making the same
HUE053439T2 (hu) 2012-08-20 2021-06-28 Hutchinson Fred Cancer Res Sejtes immunterápiára szolgáló eljárás és készítmények
EP2903637B1 (en) 2012-10-02 2019-06-12 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Compositions and methods for immunotherapy
CN104781789B (zh) 2012-12-20 2018-06-05 三菱电机株式会社 车载装置
UY35468A (es) * 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
BR112016012795A2 (pt) 2013-12-06 2017-08-08 Celgene Corp Métodos para a determinação da eficácia do fármaco para o tratamento de linfoma difuso de grandes células b, mieloma múltiplo e cânceres mieloides
AU2014376328A1 (en) 2014-01-13 2016-07-21 Christine E. BROWN Chimeric antigen receptors (CARs) having mutations in the Fc spacer region and methods for their use
CA2940671A1 (en) * 2014-04-07 2015-10-15 Novartis Ag Treatment of cancer using anti-cd19 chimeric antigen receptor
DK3166968T3 (da) 2014-05-02 2021-12-06 Univ Pennsylvania Sammensætninger og fremgangsmåder til kimæriske autoantistofreceptor-T-celler
WO2016014530A1 (en) * 2014-07-21 2016-01-28 Novartis Ag Combinations of low, immune enhancing. doses of mtor inhibitors and cars
AU2015292590B2 (en) 2014-07-24 2020-01-16 2Seventy Bio, Inc. BCMA chimeric antigen receptors
CN107111299B (zh) 2014-09-22 2021-02-05 伊莫拉Sacmi机械合作公司 用于在连续循环中依次生产单个产品的生产线
CN107206076B (zh) 2014-12-05 2021-07-09 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 靶向b-细胞成熟抗原的抗体及其用途
PT3227432T (pt) 2014-12-05 2023-12-06 Eureka Therapeutics Inc Recetores de antigénios quiméricos que visam o antigénio de maturação das células b e sua utilização
SI3230321T1 (sl) 2014-12-12 2019-12-31 Bluebird Bio, Inc. BCMA himerni antigenski receptorji
US9713375B1 (en) 2015-02-26 2017-07-25 Brett Einar Rahm Collapsible portable table
ES2876974T3 (es) * 2015-04-07 2021-11-15 Novartis Ag Combinación de terapia con receptor de antígeno quimérico y derivados de amino pirimidina
HUE051661T2 (hu) 2015-05-18 2021-03-29 Tcr2 Therapeutics Inc Készítmények és gyógyászati felhasználások a TCR újraprogramozására fúziós fehérjék felhasználásával
EP3313818B1 (en) * 2015-06-26 2023-11-08 Celgene Corporation Methods for the treatment of kaposi's sarcoma or kshv-induced lymphoma using immunomodulatory compounds, and uses of biomarkers
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
WO2017058754A1 (en) * 2015-09-28 2017-04-06 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of hematological cancers and solid tumors
IL261941B2 (en) 2016-04-01 2023-11-01 Kite Pharma Inc Chimeric antigen and T cell receptors and methods of use
EP3525803B1 (en) * 2016-10-13 2022-12-07 Juno Therapeutics, Inc. Immunotherapy methods and compositions involving tryptophan metabolic pathway modulators
CN109983027A (zh) * 2016-10-20 2019-07-05 细胞基因公司 基于cereblon的可异二聚化嵌合抗原受体
WO2018093591A1 (en) * 2016-11-03 2018-05-24 Juno Therapeutics, Inc. Combination therapy of a cell based therapy and a microglia inhibitor
MA46783A (fr) * 2016-11-03 2019-09-11 Juno Therapeutics Inc Polythérapie de type thérapie cellulaire t et inhibiteur de btk
MA46995A (fr) * 2016-12-03 2019-10-09 Acerta Pharma Bv Méthodes et compositions pour l'utilisation de lymphocytes t thérapeutiques en association avec des inhibiteurs de kinase
MA46963A (fr) * 2016-12-03 2019-10-09 Juno Therapeutics Inc Méthodes pour déterminer le dosage de céllules car-t
BR112019011025A2 (pt) * 2016-12-03 2019-10-08 Juno Therapeutics Inc métodos para modulação de células t car
CN109752300A (zh) 2019-01-02 2019-05-14 五邑大学 一种涂料生产安全智能巡检机器人、系统及方法

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