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ES2956243A2 - Adn lineal con resistencia potenciada contra exonucleasas y metodos para la produccion de los mismos - Google Patents

Adn lineal con resistencia potenciada contra exonucleasas y metodos para la produccion de los mismos Download PDF

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ES2956243A2 ES202390123A ES202390123A ES2956243A2 ES 2956243 A2 ES2956243 A2 ES 2956243A2 ES 202390123 A ES202390123 A ES 202390123A ES 202390123 A ES202390123 A ES 202390123A ES 2956243 A2 ES2956243 A2 ES 2956243A2
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Abstract

ADN lineal con resistencia potenciada contra exonucleasas y métodos para la producción de los mismos. Se proporcionan métodos para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal con resistencia potenciada para digestión con nucleasa. Los métodos comprenden: (a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y (b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar un producto de ADN lineal. También se proporcionan productos de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal con resistencia potenciada para digestión con nucleasa y usos de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN
ADN LINEAL CON RESISTENCIA POTENCIADA CONTRA EXONUCLEASAS Y
MÉTODOS PARA LA PRODUCCIÓN DE LOS MISMOS
CAMPO TÉCNICO
La presente invención se refiere a métodos para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) con resistencia potenciada para digestión con nucleasa. La presente invención se refiere a métodos que comprenden las etapas: (a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y (b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado). La presente invención también se refiere a productos de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) con resistencia potenciada para digestión con nucleasa y usos de los mismos.
ANTECEDENTES
El ADN es susceptible a degradación por las nucleasas, que son enzimas de ocurrencia naturales dentro de los organismos y que tienen una función vital en la regulación de muchos procesos celulares, al mismo tiempo que protegen contra especies de ADN extrañas. La degradación enzimática del ADN puede hacer que las terapias génicas sean ineficaces y es una consideración importante cuando se desarrollan terapias génicas o vacunas de ADN.
Se han realizado esfuerzos considerables para ampliar la vida útil molecular eficaz de los ácidos nucleicos al aumentar la resistencia de las moléculas de ácido nucleico a las nucleasas tanto extracelulares como intracelulares.
Para moléculas lineales, una de las soluciones propuestas incluye el uso de nucleótidos fosforotioados (es decir, 2’-desoxinucleótidos-5’-(a-tio)-trifosfato).
Los nucleótidos fosforotioados comprenden un átomo de azufre en lugar de un átomo de oxígeno no puente. Estos nucleótidos modificados muestran características físicas y químicas comparables a los nucleótidos no modificados correspondientes, pero son resistentes a la digestión con exonucleasas. Como tal, la incorporación del grupo funcional fosforotioato puede prolongar la vida media de la molécula de ácido nucleico.
Las modificaciones de fosforotioato se utilizan en programas de desarrollo de fármacos de ácido nucleico. En los ácidos nucleicos terapéuticos, los nucleótidos fosforotioados se incorporan en cadenas de polinucleótidos cortas de hebra sencilla. Por ejemplo, un oligonucleótido antisentido fomivirsen es un oligodesoxinucleótido de fosforotioato de 21 meros que se utiliza para tratar la retinitis por citomegalovirus (Stein and Castanotto, "FDA-approved oligonucleotide therapies in 2017.” Molecular Therapy 25.5 (2017): 1069-1075). De manera similar, el pegaptanib (nombre comercial Macugen) es un aptámero corto (27 nucleótidos) con un casquete de fosforotioato 3’-3’ desoxitimidina que se utiliza para tratar la degeneración macular relacionada con la edad de la retina.
Las modificaciones de fosforotioato también se han utilizado en el contexto de una cadena de polinucleótidos de doble hebra lineal (por ejemplo, ADN de doble hebra) para tapar los extremos de la cadena de polinucleótidos para aumentar la resistencia a la digestión con exonucleasas (Putney et al. "A DNA fragment with an alpha-phosphorothioate nucleotide at one end is asymmetrically blocked from digestion by exonuclease III and can be replicated in vivo.” Proceedings of the National Academy of Sciences 78.12 (1981): 7350-7354). Para tapar los extremos de la cadena de polinucleótidos, los extremos se digieren con una enzima de restricción y se tratan con una polimerasa de ADN y una mezcla de trifosfatos de desoxirribonucleótido (dNTP), al menos un tipo de los cuales es un nucleótido fosforotioado complementario a un nucleótido en la hebra saliente. Dado que las polimerasas de ADN agregan nucleótidos en la dirección 5’ a 3’, el resultado de este tratamiento es un fragmento de polinucleótido de extremos romos con un nucleótido fosforotioado ubicado en el extremo 3’ de cada hebra (es decir, en "el casquete”).
La resistencia a la digestión con nucleasas también se puede lograr al utilizar moléculas de ADN cerradas, tales como plásmidos o minicírculos. Sin embargo, los plásmidos y los minicírculos tienen una utilidad limitada in vivo debido a su frecuente contaminación con agentes tóxicos derivados de componentes celulares, problemas de fidelidad que alteran la secuencia de interés y presencia de diferentes especies (superenrolladas, lineales y circulares abiertas).
Alternativamente, la resistencia a la digestión con nucleasas se puede lograr al producir moléculas de ADN lineales cerradas. Por ejemplo, el documento WO2010/086626 A1 describe un método para producir un ADN lineal cerrado al utilizar una protelomerasa. Sin embargo, este método tiene la limitación de que la acción de la protelomerasa produce la misma secuencia en ambos extremos de la molécula de ADN lineal cerrada.
Por lo tanto, subsiste la necesidad de un método más flexible para producir un producto de ADN lineal con una resistencia potenciada a la digestión con nucleasas (por ejemplo, exonucleasas).
DESCRIPCIÓN
La invención proporciona un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) con resistencia potenciada para digestión con nucleasa. La invención se basa en la adición de moléculas adaptadoras a una molécula de ADN de doble hebra. El método de la invención depende de la adición de las moléculas adaptadoras, una endonucleasa y una ligasa a la molécula de ADN de doble hebra en un único volumen de reacción (o único volumen acuoso contiguo). Por lo tanto, el método para producir un producto de ADN lineal comprende las etapas: (a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y (b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal. Preferiblemente, el producto de ADN lineal tiene resistencia potenciada a la exonucleasa (por ejemplo, digestión de exonucleasa I, exonucleasa III y/o exonucleasa VIII). El producto de ADN lineal puede ser un producto de ADN lineal cerrado. El producto de ADN lineal puede comprender nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos), tales como nucleótidos fosforotioados. El producto de ADN lineal puede ser un producto de ADN lineal parcialmente cerrado. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos), tales como nucleótidos fosforotioados. El producto de ADN lineal puede comprender un casete. El casete puede comprender una secuencia de codificación.
La invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La primera y segunda moléculas adaptadoras pueden ser moléculas idénticas o pueden ser moléculas diferentes. Por ejemplo, la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una horquilla. La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden ser moléculas de ácido nucleico lineales de doble hebra que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa. La primera molécula adaptadora puede comprender una horquilla y la segunda molécula adaptadora puede ser una molécula de ácido nucleico lineal de doble hebra que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa. Por lo tanto, el producto de ADN lineal producido por los métodos descritos en el presente documento es resistente a digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasa).
La etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se realiza preferiblemente en la presencia de una ligasa. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La anexión (o ligado o cierre) de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora se puede realizar mediante la hibridación o ligación de las moléculas adaptadoras a los extremos de la región de doble hebra lineal. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora se puede hibridar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede hibridar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La primera molécula adaptadora se puede ligar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede ligar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La anexión de la primera molécula adaptadora y la segunda molécula adaptadora se puede realizar mediante tanto hibridación como ligación de las moléculas adaptadoras a los extremos de la región de doble hebra lineal. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora se puede hibridar y ligar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede hibridar y ligar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La anexión se puede realizar a través de una molécula ligadora o separadora que facilita la unión de la molécula adaptadora al primer y/o segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
El método puede comprender adicionalmente, antes de la etapa (a) (es decir, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa, la ligasa y la primera y segunda moléculas adaptadoras), una etapa de amplificación de una molécula de molde de ADN para producir la molécula de ADN de doble hebra. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal, el método comprende:
(a) amplificación de una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La amplificación puede ser una amplificación in vitro o in vivo. Preferiblemente, la amplificación es una amplificación in vitro. Por ejemplo, la amplificación se puede realizar mediante amplificación por círculo rodante (RCA), método MALBAC, reacción de cadena de polimerasa tradicional (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) y amplificación de polimerasa recombinasa (RPA). Preferiblemente, la amplificación es amplificación por círculo rodante. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal, el método comprende:
(a) amplificación por círculo rodante de una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
El método puede comprender adicionalmente (después de la etapa de amplificación y antes de la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras) una etapa de desactivación por calor. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal, el método comprende:
(a) amplificación de una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) desactivación por calor de la reacción de la etapa (a);
(c) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
Preferiblemente, la amplificación es amplificación por círculo rodante.
La etapa de desactivación por calor se puede realizar bajo condiciones suficientes para inactivar los reactivos utilizados durante la reacción de amplificación. La etapa de desactivación por calor se puede realizar a una temperatura de al menos 50 °C, al menos 55 °C, al menos 60 °C, al menos 65 °C, al menos 70 °C, al menos 75 °C, al menos 80 °C, al menos 85 °C, al menos 90 °C, al menos 95 °C, o al menos 100 °C. La etapa de desactivación por calor se puede realizar durante al menos 1 min, al menos 3 mins, al menos 5 mins, al menos 10 mins, al menos 15 mins, o al menos 20 mins.
Los inventores de la presente solicitud han descubierto sorprendentemente que se pueden utilizar productos concateméricos grandes de la reacción de amplificación por círculo rodante para producir los productos de ADN descritos en el presente documento. Esto es sorprendente ya que el producto de amplificación por círculo rodante tiene una alta viscosidad y, normalmente, se debe someter a etapas de purificación antes de que se pueda utilizar para aplicaciones posteriores.
En el método descrito en el presente documento, después de la etapa de amplificación, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo se puede realizar sin purificar el producto de la reacción de amplificación. Es decir que la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se puede realizar directamente después de la etapa de amplificación. La etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se puede realizar directamente después de la etapa de desactivación por calor.
Los inventores de la presente solicitud han descubierto un método que requiere muy pocas etapas para producir el producto de ADN descrito en el presente documento. Los métodos descritos en el presente documento son muy eficientes en el tiempo. Esto se debe, en parte, al hecho de que no se requiere una etapa de purificación después de la reacción de amplificación. Opcionalmente, el producto de la reacción de amplificación se puede desactivar por calor. Sorprendentemente, el método descrito en el presente documento en el que la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y una primera y segunda moléculas adaptadoras se realiza directamente después de la etapa de amplificación (es decir, sin la etapa de purificación) produce mayores rendimientos del producto de ADN descrito en el presente documento en comparación con un método en el que los dos etapas se separan mediante la purificación del producto de amplificación.
El método puede comprender adicionalmente, después de la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo, una etapa de purificación del producto de ADN lineal.
El método puede comprender adicionalmente, después de la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo, una etapa de digestión con nucleasa. La digestión con nucleasa puede ser digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa I y/o exonucleasa III. La etapa de digestión con nucleasa puede tener lugar antes o después de la etapa de purificación. La etapa de digestión con nucleasa puede permitir la eliminación de cualesquier moléculas de ADN de doble hebra y/o moléculas adaptadoras que no se han utilizado para producir los productos de ADN lineal. Por lo tanto, el método para producir un producto de ADN lineal puede comprender las etapas:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, una exonucleasa).
El método para producir un producto de ADN lineal puede comprender las etapas:
(a) amplificación de una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal; y
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, una exonucleasa).
El método para producir un producto de ADN lineal puede comprender las etapas:
(a) amplificación de una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal;
(d) purificación del producto de ADN lineal; y
(e) incubar el producto de la etapa (d) con una nucleasa (por ejemplo, una exonucleasa).
El método para producir un producto de ADN lineal puede comprender las etapas:
(a) amplificación de una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal;
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, una exonucleasa); y
(e) purificación del producto de ADN lineal.
La endonucleasa puede ser una endonucleasa de enzima de restricción. La endonucleasa puede ser una enzima de restricción Tipo IIS. La endonucleasa puede ser cualquier enzima que reconoce una secuencia de ADN y se escinde fuera de la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, la endonucleasa puede ser una enzima de restricción BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
Las endonucleasas de restricción de Tipo IIS escinden la molécula de ADN de doble hebra fuera de la secuencia de reconocimiento (es decir, una secuencia diana de endonucleasa), que significa que la secuencia de reconocimiento (es decir, secuencia diana de endonucleasa) no se incluye en el producto de ADN lineal.
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente métodos para la producción de un producto de ADN lineal de la resistencia potenciada para digestión con nucleasa. Específicamente, el producto de ADN lineal producido por los métodos descritos en el presente documento tiene resistencia potenciada para la digestión con exonucleasa (por ejemplo, digestión con exonucleasa III). La resistencia potenciada a la digestión con exonucleasa extiende la vida del producto de ADN lineal en una célula (es decir, el producto de ADN lineal tiene resistencia potenciada a exonucleasas intracelulares) y en un sistema libre de células (es decir, el producto de ADN lineal tiene resistencia potenciada a exonucleasas extracelulares). Los presentes inventores han desarrollado un método que depende de la adición de moléculas adaptadoras (es decir, una primera molécula adaptadora y una segunda molécula adaptadora) a ambos extremos de una molécula de ADN de doble hebra. Las moléculas adaptadoras pueden comprender una horquilla o un bucle para formar un producto de ADN lineal cerrado con resistencia potenciada a la digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). Además, los presentes inventores han descubierto un método para la introducción eficiente de nucleótidos protegidos en la forma de una primera molécula adaptadora y una segunda molécula adaptadora en ambos extremos de una región de doble hebra lineal del producto de ADN lineal. Los métodos descritos en el presente documento pueden utilizar una horquilla o un adaptador de bucle sobre un extremo del producto de ADN y un adaptador lineal que comprende los nucleótidos protegidos sobre el otro extremo del producto de ADN. Es decir que cualquier tipo de adaptadores descritos en el presente documento se puede utilizar siempre que se proteja el producto de ADN final de la digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). Los métodos de la invención proporcionan protección de la digestión mediante exonucleasas que escinden los nucleótidos de extremo 3’ (por ejemplo, exonucleasa III) y exonucleasas que escinden los nucleótidos de extremo 5’ (por ejemplo, exonucleasa VIII). Por lo tanto, el producto de ADN lineal producido por los métodos de la invención tiene una expresión in vivo prolongada en comparación con un producto de ADN lineal que no comprende una molécula adaptadora descrita en el presente documento.
Como se utiliza en el presente documento, el término "nucleótido protegido” o "nucleótido resistente a nucleasa” pretende abarcar cualquier tipo de molécula que proporcione o potencie la resistencia a la digestión con nucleasa (especialmente la digestión con exonucleasa). Aunque las moléculas adaptadoras se describen en el presente documento como que comprenden nucleótidos fosforotioados, el experto en la técnica apreciaría que las moléculas adaptadoras pueden comprender en su lugar cualesquier moléculas que proporcionen resistencia a la digestión con nucleasa (por ejemplo, digestión con exonucleasa III). Por ejemplo, las moléculas adaptadoras pueden comprender nucleótidos resistentes a nucleasas, es decir, nucleótidos modificados que proporcionan o aumentan la resistencia a las nucleasas (por ejemplo, exonucleasas). Las moléculas adaptadoras pueden comprender un péptido, polipéptido o proteína que proporciona o aumenta la resistencia a la digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasas). Las moléculas adaptadoras pueden comprender nucleótidos de 2’-O-metilo o nucleótidos de 2’-O-metoxietilo (MOE).
Como se utiliza en el presente documento, el término "nucleótido fosforotioado” se refiere a un nucleótido que tiene una estructura principal de fosfato alterado, en el que las fracciones de azúcar se ligan por un enlace de fosforotioato. En la estructura principal de fosfato de una secuencia de oligonucleótidos, el enlace de fosforotioato contiene un átomo de azufre como un sustituto de un átomo de oxígeno no puente. Esta modificación hace que el ligamiento entrenucleótidos sea resistente a la degradación por nucleasa.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) producido por los métodos de la presente invención tiene propiedades ventajosas adicionales, tales como una falta sustancial de una estructura principal bacteriana y/o genes resistentes a los antibióticos. La falta de estas características es particularmente beneficiosa en la producción de un sistema de suministro de células, tal como un vector viral o una nanopartícula, por ejemplo, para la terapia celular. La falta de estas características hace que el producto de ADN lineal producido por los métodos de la presente invención sea particularmente adecuado para uso en una composición farmacéutica.
Inesperadamente, los presentes inventores han descubierto un método para la producción de un producto de ADN lineal de resistencia potenciada a la digestión con nucleasa que permite la producción eficaz de grandes cantidades del producto de ADN lineal con resistencia potenciada para la digestión con exonucleasas. La fabricación a gran escala del producto se puede realizar en un sistema libre de células, lo que da como resultado la producción de una muestra pura que comprende el producto de ADN lineal sustancialmente libre de contaminantes bacterianos (por ejemplo, los que quedan después de la lisis celular).
1. Métodos para producir el producto de ADN lineal cerrado
Los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para producir un producto de ADN lineal cerrado por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado covalentemente.
La invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal cerrado, el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
La etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se realiza preferiblemente en la presencia de una ligasa. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal cerrado, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
La región de doble hebra lineal puede ser la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra.
La invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal cerrado, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y se cierra en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
Un producto de ADN lineal cerrado tiene una utilidad particular como un agente terapéutico (es decir, ADN terapéutico) que se puede utilizar para expresar un producto génico in vivo. Esto se debe a que su estructura cerrada (por ejemplo, estructura cerrada covalentemente) evita el ataque de enzimas tales como las exonucleasas, lo que conduce a una mayor estabilidad y longevidad de la expresión génica en comparación con las moléculas de ADN "abiertas” con extremos de ADN expuestos. Se ha demostrado que los casetes abiertos de doble hebra lineales son ineficaces con respecto a la expresión génica cuando se introducen en el tejido huésped. Esto se ha atribuido a la inestabilidad del casete debido a la acción de las exonucleasas en el espacio extracelular.
El secuestro de extremos de ADN dentro de estructuras cerradas también tiene otras ventajas. Se evita que los extremos del ADN se integren con el ADN genómico y, por lo tanto, los productos de ADN lineal cerrado ofrecen mayor seguridad. Además, la estructura lineal cerrada reduce la concatemerización de los productos de ADN dentro de las células huésped y, por lo tanto, los niveles de expresión del producto génico se pueden regular de una manera más sensible.
El método de la invención se puede utilizar para la producción de ADN para la expresión in vitro en una célula huésped, por ejemplo, en vacunas de ADN. Las vacunas de ADN normalmente codifican una forma modificada del ADN de un organismo infeccioso. Las vacunas de ADN se administran a un sujeto donde luego expresan la proteína seleccionada del organismo infeccioso, iniciando una respuesta inmunitaria contra esa proteína que es normalmente protectora. Las vacunas de ADN también pueden codificar un antígeno tumoral en un enfoque de inmunoterapia contra el cáncer.
El método puede producir otros tipos de moléculas de ADN terapéuticas, por ejemplo, aquellos utilizados en terapia génica. Por ejemplo, se pueden utilizar dichas moléculas de ADN para expresar un gen funcional cuando un sujeto tiene un trastorno genético causado por una versión disfuncional de ese gen. Ejemplos de dichas enfermedades incluyen anemia de células falciformes, fibrosis quística, enfermedad de Huntington, Distrofia Muscular de Duchenne, hemofilia A, deficiencia de a1-antitripsina, discinesia ciliar primaria o síndrome de dificultad respiratoria del prematuro. Otras enfermedades en las que la terapia génica puede ser útil incluyen enfermedades metabólicas, enfermedades respiratorias, enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, crónicas e infecciosas, que incluyen dichos trastornos como SIDA, cáncer, enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, hipercolesterolemia, diversos trastornos sanguíneos, que incluyen diversas anemias, talasemia y hemofilia y enfisema. Para el tratamiento de tumores sólidos, se pueden expresar genes que codifican péptidos tóxicos (es decir, agentes quimioterapéuticos tales como ricina, toxina diftérica y factor de veneno de cobra), genes supresores de tumores tales como p53, genes que codifican secuencias de ARNm que son antisentido para transformar oncogenes, péptidos antineoplásicos tales como el factor de necrosis tumoral (TNF) y otras citocinas, o mutantes negativos transdominantes de oncogenes transformantes.
El cierre de la región de doble hebra lineal por la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora se puede realizar mediante la hibridación o ligación de las moléculas adaptadoras a los extremos de la región de doble hebra lineal. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora se puede hibridar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede hibridar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La primera molécula adaptadora se puede ligar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede ligar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. El cierre de la región de doble hebra lineal por la primera molécula adaptadora y la segunda molécula adaptadora se puede realizar mediante tanto hibridación como ligación de las moléculas adaptadoras a los extremos de la región de doble hebra lineal. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora se puede hibridar y ligar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede hibridar y ligar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado puede comprender generar la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra al digerir la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar bajo condiciones que promueven la anexión (o ligado) de la primera y segunda moléculas adaptadoras a la región de doble hebra lineal para producir el producto de ADN lineal cerrado. La anexión se puede realizar al crear un enlace covalente entre la primera y/o segunda molécula adaptadora y el primer y/o segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar bajo condiciones que promueven la digestión de la molécula de ADN de doble hebra para producir la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra. La digestión de la molécula de ADN de doble hebra para producir la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra se puede realizar a una primera temperatura de 1°C-100°C, 1 °C -80 °C, 5°C-70°C, 10°C-60°C, 15°C-55°C, 20 °C-50 °C, 25 °C -45 °C, 30 °C-40 °C, 35 °C-3°, 36 °C-38 °C, o en aproximadamente 37 °C. La digestión puede ser digestión con endonucleasa, preferiblemente digestión con endonucleasa Tipo IIS.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar bajo condiciones que promueven la ligación de la región de doble hebra lineal a la primera y segunda moléculas adaptadoras. La ligación puede ser al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60, al menos 65, al menos 70 %, al menos 75, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % eficiente. Por ejemplo, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60, al menos 65, al menos 70 %, al menos 75, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de las regiones de doble hebra lineal (o las porciones de las moléculas de ADN de doble hebra) se pueden incorporar en productos de ADN lineal cerrado. Preferiblemente, la ligación es al menos 15 % eficiente.
La eficacia de la ligación se puede establecer en base a los valores de cuantificación del ADN antes y después de la reacción de digestión/ligación. Por lo tanto, la eficiencia de la ligación se puede establecer con base en la ecuación: (cantidad de ADN amplificado inicial)/(cantidad de ADN lineal final) x 100 %.
La eficacia de la ligación también se puede establecer en base a los valores de cuantificación del ADN antes y después de la reacción de digestión/ligación y el posterior tratamiento con exonucleasa para eliminar las construcciones de ADN abiertas restantes y el exceso de moléculas adaptadoras.
Por ejemplo, la molécula de ADN de doble hebra generada por la amplificación por círculo rodante se cuantifica primero para que se conozca la cantidad de molécula de ADN de doble hebra utilizada como material de partida durante la reacción de digestión/ligación. Después de todas las reacciones enzimáticas, el producto de ADN lineal se cuantifica para calcular la eficiencia de ligación según la ecuación anterior.
Los métodos de cuantificación de ADN son conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, las cuantificaciones de ADN se pueden realizar con el ensayo Qubit dsDNA BR de ThermoFisher (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32850#/Q32850).
La etapa de ligación de la región de doble hebra lineal a la primera y segunda moléculas adaptadoras se puede realizar a una segunda temperatura de 1 °C -90 °C, 2 °C -70 °C, 5 °C-60 °C, 8°C-55°C, 9°C-50°C, 10°C-45°C, 11°C-40°C, 12°C-37°C, 13°C-30°C, 14 °C-25 °C, 15 °C-20 °C o en aproximadamente 16 °C.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender incubar a una primera temperatura y luego incubar a una segunda temperatura. La primera temperatura puede ser de 1 °C-100°C, 1 °C-80 °C, 5°C-70°C, 10°C-60°C, 15°C-55°C, 20 °C-50 °C, 25 °C-45 °C, 30 °C-40 °C, 35 °C-39 °C, 36 °C-38 °C, o aproximadamente 37 °C. La segunda temperatura puede ser de 1 °C -90 °C, 2 °C -70 °C, 5 °C-60 °C, 8 °C-55 °C, 9 °C-50 °C, 10 °C-45 °C, 11 °C-40 °C, 12 °C-37 °C, 13 °C-30 °C, 14 °C-25 °C, 15 °C-20 °C o en aproximadamente 16 °C. Preferiblemente, la primera temperatura es 35 °C-39 °C y la segunda temperatura es 14°C-18°C. Utilizando estas condiciones la endonucleasa puede ser una endonucleasa de restricción Tipo IIS (por ejemplo, Bsal) y la ligasa puede ser ligasa de ADN T4, ligasa de ADN T7, ligasa de ADN de mamífero I, III y IV; ligasa de ADN Taq, ligasa de ADN Tth, o ligasa de ADN de E. coli.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar de forma isotérmica. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender incubar a una temperatura constante. La temperatura constante promueve la digestión simultánea de la molécula de ADN de doble hebra para producir la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra y la ligación de la región de doble hebra lineal a la primera y segunda moléculas adaptadoras. Por ejemplo, la temperatura constante puede ser 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, o 40 °C. Preferiblemente, la temperatura constante es 30 °C. Se pretende que la temperatura constante signifique que la temperatura no cambia significativamente durante la reacción. La temperatura constante pretende significar que la variación de temperatura durante la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo es menor de 10 °C, menor de 9 °C, menor de 8 °C, menor de 7 °C, menor de 6 °C, menor de 5 °C, menor de 4 °C, menor de 3 °C, menor de 2 °C, o menor de 1 °C. En una realización preferida la temperatura durante la etapa de incubar el único acuoso contiguo no se desvía en más de 5 °C, preferiblemente en no más de 3°C, incluso más preferiblemente no más de 1 °C. Por lo tanto, la temperatura constante puede ser una temperatura en un rango de 20 °C-30 °C, 22 °C-32 °C, 24 °C-34 °C, 26 °C-36 °C, 28 °C-38 °C, 30 °C-40 °C, 22 °C-28 °C, 32 °C-38 °C, 25 °C-35 °C, 26 °C-34 °C, 27 °C- 33 °C, 27.5 °C-32.5 °C, 28 °C-32 °C, 28.5 °C-31.5 °C, 29 °C-31 °C, o 29.5 °C-30.5 °C. Preferiblemente, la temperatura constante es una temperatura en un rango de 27.5 °C-32.5 °C. Alternativamente, la temperatura constante puede ser una temperatura en un rango de 32 °C-42 °C, 33 °C-41 °C, 34 °C-40 °C, 35 °C-39 °C, 36 °C-38 °C. Preferiblemente, la temperatura constante es una temperatura en un rango de 34.5 °C-39.5 °C.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 80, al menos 90, o al menos 100 veces, preferiblemente al menos 20 veces. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura menor de 40, menor de 35, menor de 30 veces, menor de 29, menor de 25 veces. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura 2-100, 5-80, 10­ 70, 20-60, o 30-60 veces. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura 2-20, 5-29, 61­ 100, o 65-80 veces.
El método puede comprender adicionalmente, antes de la etapa (a) (es decir, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa, la ligasa y la primera y segunda moléculas adaptadoras), una etapa de amplificar una molécula de molde de ADN para producir la molécula de ADN de doble hebra. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal cerrado, el método comprende:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
La etapa de amplificar se puede realizar mediante amplificación in vitro o in vivo. Preferiblemente, la etapa de amplificar se realiza mediante amplificación in vitro. Por ejemplo, la etapa de amplificar se puede realizar mediante amplificación por círculo rodante (RCA), método MALBAC, reacción de cadena de polimerasa tradicional (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) y amplificación de polimerasa recombinasa (RPA). Preferiblemente, la etapa de amplificar se realiza mediante amplificación por círculo rodante. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal cerrado, el método comprende:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra, en la que la molécula de molde de ADN se amplifica mediante amplificación por círculo rodante;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
La amplificación por círculo rodante se puede realizar sin ningún cebador, o en la presencia de un cebador o múltiples cebadores. Por ejemplo, el cebador puede ser un cebador sintético. Los cebadores pueden ser cebadores aleatorios. La amplificación por círculo rodante se puede realizar en la presencia de una primasa. La primasa puede ser TthPrimPol. Preferiblemente, si la amplificación por círculo rodante se realiza sin ningún cebador, se realiza en la presencia de una primasa, tal como TthPrimPol. Del mismo modo, si se utiliza un cebador durante la reacción de amplificación, no se utiliza una primasa. El producto de ADN de doble hebra se puede generar por la amplificación por círculo rodante in vitro bajo condiciones isotérmicas utilizando una polimerasa de ácido nucleico adecuada, tal como polimerasa de ADN Phi29.
En los métodos descritos en el presente documento, la molécula de molde de ADN puede comprender al menos una secuencia diana escindible. La secuencia diana escindible puede ser una secuencia diana de endonucleasa. Por lo tanto, la molécula de molde de ADN puede comprender al menos una secuencia diana de endonucleasa. Preferiblemente, la molécula de molde de ADN comprende al menos dos secuencias diana de endonucleasa. Las secuencias diana de endonucleasa pueden ser la misma o diferente. Preferiblemente, la al menos una secuencia diana de endonucleasa es una secuencia diana de endonucleasa de restricción. Diferentes secuencias diana de endonucleasa de restricción serían conocidas por el experto en la técnica. La secuencia diana escindible puede ser una secuencia diana de endonucleasa de restricción Tipo IIS. Por ejemplo, la secuencia diana de endonucleasa de restricción puede ser una secuencia diana BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, Psrl, SchI, SfaNI, TaqlI, TspDTI y/o TspGWI. La al menos una secuencia escindible (por ejemplo, secuencia diana de endonucleasa) puede ser una secuencia escindible nativa (es decir, una secuencia escindible presente en la molécula de molde). Alternativamente, la al menos una secuencia escindible (por ejemplo, secuencia diana de endonucleasa) se puede introducir a la molécula de molde de ADN antes de la producción del producto de ADN lineal cerrado.
La endonucleasa puede ser una endonucleasa de enzima de restricción. La endonucleasa puede ser una enzima de restricción Tipo IIS. La endonucleasa puede ser cualquier enzima que reconoce una secuencia de ADN y se escinde fuera de la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, la endonucleasa puede ser una enzima de restricción BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
La ligasa puede ser una ligasa de ADN, tal como una ligasa de ADN T4, ligasa de ADN T7, ligasa de ADN de mamífero I, III y IV; ligasa de ADN Taq, ligasa de ADN Tth, o ligasa de ADN de E. coli.
La molécula de molde de ADN utilizada en los métodos descritos en el presente documento puede ser de hebra sencilla o de hebra doble. Preferiblemente, la molécula de molde de ADN es de hebra doble. La molécula de molde de ADN puede ser una molécula de ADN circular natural. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede ser (i) un plásmido, (ii) un minicírculo, (iii) un cósmido, (iv) un cromosoma artificial bacteriano (BAC), o (v) una sonda de inversión molecular (MIP). La molécula de molde de ADN puede ser una molécula de ADN circular producida enzimáticamente. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede ser (i) una molécula de ADN circular obtenida de la reacción de recombinasa, preferiblemente reacción de recombinasa Cre, o (ii) una molécula de ADN circular obtenida de la reacción de ligasa, preferiblemente utilizando el ensamblaje Golden Gate. La molécula de molde de ADN puede ser una molécula de ADN lineal cerrada covalentemente producida enzimáticamente.
Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede ser (i) una molécula de ADN procesada con protelomerasa TelN; o (ii) una molécula de ADN generada por ligación de los extremos del ADN con un adaptador. La molécula de molde de ADN puede comprender un elemento que es de hebra doble y un elemento que es de hebra sencilla. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede comprender un ADN de doble hebra y un bucle de horquilla de hebra sencilla.
La molécula de molde de ADN puede ser lineal. Si la molécula de molde de ADN es lineal, antes de la amplificación (por ejemplo, amplificación por círculo rodante), una molécula de molde de ADN se puede hacer circular para producir una molécula de molde de ADN adecuada para uso en los métodos descritos en el presente documento.
La molécula de molde de ADN puede comprender un casete. El casete puede ser un casete de expresión de mamífero. El casete puede comprender adicionalmente un promotor. El promotor puede ser un promotor de CMV. El casete puede comprender adicionalmente un potenciador. El casete puede comprender adicionalmente un gen indicador, tal como un gen indicador de eGFP o un gen indicador de luciferasa. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia homopolimérica. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia LoxP, preferiblemente dos secuencias LoxP. Si las dos secuencias LoxP se orientan en la misma dirección, la secuencia de ADN entre las dos secuencias LoxP se corta como un bucle circular de ADN. Si las dos secuencias LoxP se orientan en la dirección opuesta, se invierte la secuencia de ADN entre las dos secuencias LoxP. Por lo tanto, preferiblemente, las dos secuencias LoxP están en la misma orientación (es decir, la misma dirección) en la molécula de molde de ADN.
La molécula de molde de ADN puede comprender una secuencia homopolimérica en un extremo 5’ o un extremo 3’ o tanto un extremo 5’ como un extremo 3’. La secuencia homopolimérica se puede agregar a la molécula de molde de ADN antes de la circularización. La secuencia homopolimérica puede ser una secuencia poliA, poliC, poliG, o poliT. La secuencia homopolimérica puede tener entre 3-200 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para facilitar la purificación del producto de ADN lineal, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 4-12 nucleótidos en longitud, o entre 5-10 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para mejorar la expresión de ARNm, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 10-200 nucleótidos en longitud, preferiblemente entre 80-150 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, o al menos 200 nucleótidos en longitud. Preferiblemente, la secuencia homopolimérica tiene al menos 100 nucleótidos en longitud. Más preferiblemente aún, la secuencia homopolimérica tiene al menos 120 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, la secuencia homopolimérica puede comprender una secuencia poliA de al menos 120 nucleótidos.
El método puede comprender adicionalmente (después de la etapa de amplificación y antes de la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras) una etapa de desactivación por calor. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal cerrado, el método comprende:
(a) amplificación de una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) desactivación por calor de la reacción de la etapa (a);
(c) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
Preferiblemente, la amplificación es amplificación por círculo rodante.
La etapa de desactivación por calor se puede realizar bajo condiciones suficientes para inactivar los reactivos utilizados durante la reacción de amplificación. La etapa de desactivación por calor se puede realizar a una temperatura de al menos 50 °C, al menos 55 °C, al menos 60 °C, al menos 65 °C, al menos 70 °C, al menos 75 °C, al menos 80 °C, al menos 85 °C, al menos 90 °C, al menos 95 °C, o al menos 100 °C. La etapa de desactivación por calor se puede realizar durante al menos 1 min, al menos 3 mins, al menos 5 mins, al menos 10 mins, al menos 15 mins, o al menos 20 mins.
En el método descrito en el presente documento, después de la etapa de amplificación, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo se puede realizar sin purificar el producto de la reacción de amplificación. Es decir que la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se puede realizar directamente después de la etapa de amplificación. La etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se puede realizar directamente después de la etapa de desactivación por calor.
El método puede comprender adicionalmente, después de la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo, una etapa de purificación del producto de ADN lineal cerrado.
El método puede comprender adicionalmente, después de la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo, una etapa de digestión con nucleasa. La digestión con nucleasa puede ser digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa I y/o exonucleasa III. La etapa de digestión con nucleasa puede tener lugar antes o después de la etapa de purificación. Esta etapa permite la eliminación de cualesquier moléculas de ADN de doble hebra y/o moléculas adaptadoras que no se han utilizado en el curso de la realización del método. Por lo tanto, el método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora; y
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa).
En el método descrito en el presente documento, después de la etapa de amplificación, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo se puede realizar sin purificar el producto de la reacción de amplificación. Es decir que la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se puede realizar directamente después de la etapa de amplificación. La etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se puede realizar directamente después de la etapa de desactivación por calor.
El método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(d) purificar el producto de ADN lineal cerrado; y
(e) incubar el producto purificado de la etapa (d) con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa).
El método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) desactivación por calor de la reacción de la etapa (a);
(c) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(e) purificar el producto de ADN lineal cerrado; y
(f) incubar el producto purificado de la etapa (d) con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa).
El método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa); y
(e) purificar el producto de ADN lineal cerrado.
El método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) desactivación por calor de la reacción de la etapa (a);
(c) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(e) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa); y
(f) purificar el producto de ADN lineal cerrado.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) con una nucleasa se puede realizar a una temperatura de 5-90 °C, 10-80 °C, 15-70 °C, 20-60 °C, 25-50 °C, 30-45 °C o 35-40 °C. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) con una nucleasa se puede realizar durante al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 60 min. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) se puede realizar en dos diferentes temperaturas. Por ejemplo, la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) se puede realizar a 15­ 40 °C durante 10-60 minutos seguida por una temperatura de 60-90 °C durante 10-30 min. La mayor temperatura normalmente inactiva la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). Por lo tanto, el método proporciona adicionalmente una etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) se puede realizar a 37 °C durante 30 min y 80 °C durante 20 min. Preferiblemente, la etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa) se realiza a una temperatura de 70-80 °C. La etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa) se puede realizar durante al menos 1, al menos 5, al menos 10, al menos 20 o al menos 30 minutos. Preferiblemente, la etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa) se realiza durante al menos 5 minutos.
El método puede ser un método libre de células.
El producto de ADN lineal cerrado puede ser parcialmente de doble hebra y/o parcialmente de hebra sencilla. El producto de ADN lineal cerrado puede comprender una porción que es de hebra doble y una porción que es de hebra sencilla.
El producto de ADN lineal cerrado puede comprender un casete. El casete puede comprender una secuencia de codificación. La secuencia de codificación puede codificar un gen de interés, por ejemplo un gen que codifica una proteína. El casete puede comprender al menos una porción de un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor, una secuencia de codificación, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la traducción. El casete puede comprender adicionalmente secuencias que ayudan a la expresión de proteínas, tales como un elemento de traducción independiente del casquete. El casete puede comprender (o codificar) un molde de reparación (o molde de edición). La molde de reparación (o molde de edición) puede ser para uso en la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR-Cas (HDR). El casete puede codificar el ARN guía CRISPR. El casete puede ser un casete de expresión de mamífero. El promotor puede ser un promotor de CMV. El casete puede comprender adicionalmente un potenciador. El casete puede comprender adicionalmente un gen indicador, tal como un gen indicador de eGFP o un gen indicador de luciferasa. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia homopolimérica, tal como una secuencia poliA, poli C, poliT o poliG. La secuencia homopolimérica puede tener entre 3-200 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para facilitar la purificación del casete, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 4-12 nucleótidos en longitud, o entre 5-10 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para mejorar la expresión de ARNm, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 10-200 nucleótidos en longitud, preferiblemente entre 80-150 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, o al menos 200 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, la secuencia homopolimérica puede comprender una secuencia poliA de al menos 120 nucleótidos.
El producto de ADN lineal cerrado puede comprender un separador. El separador puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, o al menos 200 pares base de largo.
El producto de ADN lineal cerrado puede comprender una secuencia de repetición terminal invertida.
El producto de ADN lineal cerrado puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, el producto de ADN lineal cerrado tiene al menos 50 pares base de largo.
La molécula de ADN de doble hebra puede ser circular, o ramificada.
La molécula de ADN de doble hebra puede no comprender un adaptador. La molécula de ADN de doble hebra puede no comprender una horquilla, un bucle o una estructura de bucle de tallo.
La molécula de ADN de doble hebra puede comprender un casete. El casete puede comprender una secuencia de codificación. La secuencia de codificación puede codificar un gen de interés, por ejemplo un gen que codifica una proteína. El casete puede comprender al menos una porción de un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor, una secuencia de codificación, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la traducción. El casete puede comprender adicionalmente secuencias que ayudan a la expresión de proteínas, tales como un elemento de traducción independiente del casquete. El casete puede comprender (o codificar) un molde de reparación (o molde de edición). La molde de reparación (o molde de edición) puede ser para uso en la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR-Cas (HDR). El casete puede codificar el ARN guía CRISPR. El casete puede ser un casete de expresión de mamífero. El promotor puede ser un promotor de CMV. El casete puede comprender adicionalmente un potenciador. El casete puede comprender adicionalmente un gen indicador, tal como un gen indicador de eGFP o un gen indicador de luciferasa. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia homopolimérica, tal como una secuencia poliA, poli C, poliT o poliG. La secuencia homopolimérica puede tener entre 3-200 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para facilitar la purificación del casete, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 4-12 nucleótidos en longitud, o entre 5-10 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para mejorar la expresión de ARNm, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 10-200 nucleótidos en longitud, preferiblemente entre 80-150 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, o al menos 200 nucleótidos en longitud. Preferiblemente, la secuencia homopolimérica tiene al menos 100 nucleótidos en longitud. Más preferiblemente aún, la secuencia homopolimérica tiene al menos 120 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, la secuencia homopolimérica puede comprender una secuencia poliA de al menos 120 nucleótidos.
La molécula de ADN de doble hebra puede comprender un separador. El separador puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, o al menos 200 pares base de largo. El separador puede mejorar el rendimiento de la amplificación de la molécula de ADN de doble hebra.
La molécula de ADN de doble hebra puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, la molécula de ADN de doble hebra tiene al menos 50 pares base de largo.
La molécula de ADN de doble hebra puede comprender una o más secuencias diana escindibles (por ejemplo, endonucleasa). La molécula de ADN de doble hebra puede comprender dos secuencias diana escindibles (por ejemplo, endonucleasa). La una o más secuencias diana escindibles (por ejemplo, endonucleasa) pueden ser secuencias diana de endonucleasa Tipo IIS. La una o más secuencias diana escindibles (por ejemplo, endonucleasa) pueden ser secuencias diana BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, Mmel, MnlI, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, Psrl, SchI, SfaNI, TaqlI, TspDTI y/o TspGWI.
La molécula de ADN de doble hebra puede ser un producto de amplificación. Preferiblemente, la amplificación es amplificación por círculo rodante.
La región de doble hebra lineal (por ejemplo, la porción lineal de la molécula de hebra doble) puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, la molécula de ADN de doble hebra tiene al menos 50 pares base de largo.
La región de doble hebra lineal (por ejemplo, la porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender una secuencia que es al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, o 100 % idéntica a la secuencia de la molécula de ADN de doble hebra.
El primer extremo y el segundo extremo de la región de doble hebra lineal (por ejemplo, la porción lineal de la molécula de hebra doble) pueden ser resistentes a la digestión con nucleasa. Preferiblemente, el primer extremo y el segundo extremo de la región de doble hebra lineal son resistentes a la digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa III y/o digestión con exonucleasa I.
La región de doble hebra lineal puede comprender un grupo 3’-OH en el primer y/o segundo extremos. El grupo 3’-OH puede facilitar la ligación a la primera y/o segunda molécula(s) adaptadora(s) (que puede(n) comprender un fosfato 5’). La región de doble hebra lineal puede comprender un fosfato 5’ en el primer y/o segundo extremos. El fosfato 5’ puede facilitar la ligación a la primera y/o segunda molécula(s) adaptadora(s) (que puede(n) comprender un grupo 3’-OH).
La región de doble hebra lineal (por ejemplo, la porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender una saliente. Por ejemplo, la región de doble hebra lineal puede comprender una saliente 5’ o una saliente 3’. La región de doble hebra lineal puede comprender un extremo romo o extremos romos. La región de doble hebra lineal puede comprender: una saliente 5’ y un extremo romo, dos salientes 5’, una saliente 3’ y un extremo romo, dos salientes 3’, o una saliente 5’ y una saliente 3’. La saliente puede tener al menos 3 nucleótidos (preferiblemente desde 4 hasta 8 nucleótidos). La saliente puede estar en la hebra con sentido o la hebra antisentido de la región de doble hebra lineal.
La porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra (por ejemplo, la porción lineal de la molécula de hebra doble) puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, la molécula de ADN de doble hebra tiene al menos 50 pares base de largo.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora puede ser una molécula adaptadora sintética.
La primera molécula adaptadora puede ser una molécula adaptadora de ácido nucleico. La segunda molécula adaptadora puede ser una molécula adaptadora de ácido nucleico. La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender un elemento autocomplementario que crea un bucle, tal como un bucle de horquilla o un bucle de tallo. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora puede comprender una horquilla o un bucle de tallo. La segunda molécula adaptadora puede comprender una horquilla o un bucle de tallo. Tanto la primera como la segunda moléculas adaptadoras pueden comprender una horquilla o un bucle de tallo. Las moléculas adaptadoras pueden cada una comprender una porción de doble hebra que comprende una hebra con sentido y una hebra antisentido, en la que la hebra con sentido y la hebra antisentido se ligan juntas en una horquilla de tal manera que la hebra con sentido se hibrida a la hebra antisentido. La porción de doble hebra de un adaptador puede comprender una saliente 3’ o una saliente 5’ de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, o al menos 5 nucleótidos. Preferiblemente la saliente 3’ o la saliente 5’ tienen 4-8 nucleótidos. Cada extremo de la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra) puede comprender una saliente 3’ o 5’. Una porción de la primera molécula adaptadora (por ejemplo, la saliente) puede ser complementaria al primer extremo de la región de doble hebra lineal. Una porción de la segunda molécula adaptadora puede ser complementaria al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
El producto de ADN lineal cerrado puede ser un producto de ADN lineal cerrado covalentemente. Por lo tanto, en las realizaciones donde las moléculas adaptadoras comprenden un bucle (por ejemplo, una horquilla), las moléculas adaptadoras cierran los extremos de la región de doble hebra lineal formando un producto de ADN lineal cerrado covalentemente.
La invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal cerrado covalentemente, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo, en el que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas adaptadoras de ácido nucleico que cada una comprende una horquilla; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado covalentemente, en el que el producto de ADN lineal cerrado covalentemente comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora, en la que (i) la primera molécula adaptadora comprende una saliente que es complementaria a y se empareja a una saliente en el primer extremo de la región de doble hebra lineal por lo que se cierra el primer extremo de la región de doble hebra lineal y (ii) la segunda molécula adaptadora comprende una saliente que es complementaria a y se empareja a una saliente en el segundo extremo de la región de doble hebra lineal por lo que se cierra el segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal cerrado covalentemente, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo, en el que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas adaptadoras de ácido nucleico que cada una comprende una horquilla; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado covalentemente, en el que el producto de ADN lineal cerrado covalentemente comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora, en la que (i) la primera molécula adaptadora comprende una saliente que es complementaria a y se empareja a una saliente en el primer extremo de la región de doble hebra lineal por lo que se cierra el primer extremo de la región de doble hebra lineal y (ii) la segunda molécula adaptadora comprende una saliente que es complementaria a y se empareja a una saliente en el segundo extremo de la región de doble hebra lineal por lo que se cierra el segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora se liga al primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal cerrado covalentemente, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo, en el que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas adaptadoras de ácido nucleico que cada una comprende una horquilla; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado covalentemente, en el que el producto de ADN lineal cerrado covalentemente comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, en la que la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y se cierra en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora, en la que (i) la primera molécula adaptadora comprende una saliente que es complementaria a y se empareja a una saliente en el primer extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra por lo que se cierra el primer extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra y (ii) la segunda molécula adaptadora comprende una saliente que es complementaria a y se empareja a una saliente en el segundo extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra por lo que se cierra el segundo extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga al primer extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra y la segunda molécula adaptadora se liga al segundo extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden no ser un plásmido o un vector de ADN.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una porción de hebra sencilla. La porción de hebra sencilla puede formar una horquilla o un bucle de tallo. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una porción de bucle. La porción de hebra sencilla puede comprender menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 nucleótidos. Preferiblemente, la porción de hebra sencilla comprende 5 nucleótidos.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una porción de doble hebra. La porción de doble hebra puede comprender menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, menos de 30, menos de 25, menos de 20, menos de 15, o menos de 10 pares base. La porción de doble hebra puede comprender al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15 pares base.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender un fosfato 5’. El fosfato 5’ puede facilitar la ligación a la región de doble hebra lineal (que puede comprender un grupo 3’-OH en el primer y/o segundo extremos). La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender un 3’-OH. El 3’-OH puede facilitar la ligación a la región de doble hebra lineal (que puede comprender un fosfato 5’ en el primer y/o segundo extremos).
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o una porción de la misma. La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. La porción de doble hebra de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una porción de la misma. La porción de doble hebra de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 2. La porción de hebra sencilla de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una secuencia de ACTCA. La porción de hebra sencilla de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 nucleótidos contiguos de la secuencia ACTCA.
La primera y segunda moléculas adaptadoras pueden comprender una secuencia de ácidos nucleicos idéntica. La primera y segunda moléculas adaptadoras pueden comprender una secuencia de ácidos nucleicos diferente.
La primera molécula adaptadora puede comprender una porción que es complementaria al primer extremo de la región de doble hebra lineal (o la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra). La segunda molécula adaptadora puede comprender una porción que es complementaria al segundo extremo de la región de doble hebra lineal (o la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra). La primera molécula adaptadora puede comprender una porción que se empareja al primer extremo de la región de doble hebra lineal (o la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra). La segunda molécula adaptadora puede comprender una porción que se empareja al segundo extremo de la región de doble hebra lineal (o la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra). La primera molécula adaptadora puede comprender una porción que es complementaria y se empareja al primer extremo de la región de doble hebra lineal (o la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra). La segunda molécula adaptadora puede comprender una porción que es complementaria y se empareja al segundo extremo de la región de doble hebra lineal (o la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra).
La porción que es complementaria o se empareja al primer o segundo extremo de la región de doble hebra lineal (o la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra) puede ser una saliente 5’ o una saliente 3’ de la primera y/o segunda molécula adaptadora. La saliente de la primera molécula adaptadora puede ser complementaria al primer extremo de la región de doble hebra lineal y/o la saliente de la segunda molécula adaptadora puede ser complementaria al segundo extremo de la región de doble hebra. La saliente de la primera molécula adaptadora se puede emparejar con el primer extremo de la región de doble hebra lineal y/o la saliente de la segunda molécula adaptadora se puede emparejar con el segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La saliente de la primera molécula adaptadora puede ser complementaria a y emparejarse con el primer extremo de la región de doble hebra lineal y/o la saliente de la segunda molécula adaptadora puede ser complementaria a y emparejarse con el segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden no comprender una secuencia diana de endonucleasa Tipo IIS. La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden no comprender secuencias diana BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender uno o más ácidos bloqueados (LNA).
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender uno o más nucleótidos protegidos (es decir, nucleótidos resistentes a nucleasa), tales como nucleótidos fosforotioados. Los nucleótidos protegidos se pueden ubicar en la porción de hebra sencilla (por ejemplo, porción de horquilla) o la porción de doble hebra. Los nucleótidos protegidos se pueden ubicar en la porción de saliente de las moléculas adaptadoras.
El producto de ADN lineal cerrado puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra. Por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado puede comprender al menos 2, al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, o al menos 500 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Preferiblemente, el producto de ADN lineal cerrado comprende al menos 2 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra.
Las posiciones internas pueden no estar ubicadas entre el segundo y el penúltimo nucleótido del producto de ADN lineal cerrado.
La región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra. Por ejemplo, la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender al menos 2, al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, al menos o 500 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Preferiblemente, la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble) comprende al menos 2 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Las posiciones internas pueden no estar ubicadas entre el segundo y el penúltimo nucleótido de la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble).
Los nucleótidos resistentes a la digestión con exonucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) adecuados para uso en los métodos descritos en el presente documento pueden ser nucleótidos fosforotioados. Por ejemplo, los nucleótidos fosforotioados pueden ser a-S-dATP (es decir, 2’-desoxiadenosina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dCTP (es decir, 2’-desoxicitidina-5’-(atio)-trifosfato), a-S-dGTP (es decir, 2’-desoxiguanosina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dTTP (es decir, 2’-desoxitimidina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dUTP (es decir, 2’-desoxiuridina-5’-(a-tio)-trifosfato), y/o uridina 2’, 3’-ciclofosforotioato.
Los nucleótidos fosforotioados pueden ser Sp-isómeros, Rp-isómeros o una mezcla de ambos Sp- y Rp-isómeros.
Los nucleótidos resistentes a la digestión con exonucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) pueden ser 2'-O-metil nucleótidos o 2'-O-metoxietil (MOE) nucleótidos. Por ejemplo, los nucleótidos MOE pueden ser 2’-O-metoxi-etil guanosina, 2’-O-metoxi-etil citidina, 2’-O-metoxietil adenosina, y/o 2’-O-metoxi-etil timidina.
El primer extremo de la región de doble hebra lineal puede ser complementario a una porción de la primera molécula adaptadora. El segundo extremo de la región de doble hebra lineal puede ser complementario a una porción de la segunda molécula adaptadora. El primer extremo y/o el segundo extremo de la región de doble hebra lineal se puede generar por digestión con endonucleasa.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una porción funcional. La porción funcional puede ser una molécula de unión, una secuencia de direccionamiento, o una sonda.
La porción funcional puede ser una sonda. Como se utiliza en el presente documento, el término "sonda” se refiere a un fragmento de ADN, ARN o quimera de ADN/ARN de longitud variable (por ejemplo, de 3 a 1000 bases de largo), que se utiliza para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos diana que son complementarias a la secuencia en la sonda. Normalmente, la sonda se hibrida con un ácido nucleico de hebra sencilla cuya secuencia de bases permite el emparejamiento de bases de sonda-diana debido a la complementariedad entre la sonda y la diana. Por lo tanto, la porción funcional puede ser una secuencia de ADN, una secuencia de ARN o una secuencia quimera de ADN/ARN. Como se utiliza en el presente documento, el término "complementario” se refiere al emparejamiento de secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reglas de emparejamiento de Watson/Crick. Por ejemplo, una secuencia 5’-GCGGTCCCA-3’ tiene la secuencia complementaria de 5’-TGGGACCGC-3’. Una secuencia de complemento también puede ser una secuencia de ARN complementaria a la secuencia de ADN.
La porción funcional puede ser una molécula de unión. El término "molécula de unión” se refiere a cualquier molécula capaz de unirse al producto de ADN lineal descrito en el presente documento y/o que es capaz de unirse a otra molécula o diana. La molécula de unión puede ser una proteína, un polipéptido o un péptido. La molécula de unión puede ser un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. La molécula de unión puede ser un fragmento de anticuerpo.
La porción funcional puede facilitar la detección del producto de ADN al unirse a moléculas de captura (por ejemplo, anticuerpos de captura unidos por interacciones proteína-proteína). La porción funcional puede unirse a una diana celular, por ejemplo, un receptor celular.
La porción funcional puede ser un marcador. El "marcador” puede ser cualquier entidad química que permita la detección de la molécula de ácido nucleico de doble hebra por medios físicos, químicos y/o biológicos. El marcador puede ser un cromóforo, un fluoróforo y/o una molécula radiactiva.
La porción funcional puede ser una secuencia de direccionamiento. La secuencia de direccionamiento puede ser un fragmento de ADN o ARN de longitud variable, que se utiliza para dirigir el producto de ADN a una ubicación específica en una célula. La secuencia de direccionamiento se puede utilizar para aumentar la eficiencia de transfección del suministro de genes no virales en virtud de la importación nuclear potenciada del producto de ADN lineal cerrado. Por ejemplo, la secuencia de direccionamiento puede ser una secuencia de direccionamiento nuclear de ADN (es decir, una secuencia de reconocimiento para proteínas endógenas de unión a ADN), tal como Secuencia potenciadora SV40 (preferiblemente en dirección descendente del casete).
Para facilitar la detección y/o cuantificación del producto de ADN, la porción funcional puede comprender un fluoróforo, un compuesto radiactivo o un código de barras.
Una señal que corresponde a la presencia, ausencia y/o nivel del producto de ADN lineal cerrado se puede medir utilizando un código de barras. El código de barras puede comprender al menos una fracción de unión ligada a una porción con código de barras, en la que la porción con código de barras comprende al menos un nucleótido (es decir, en la que la porción con código de barras comprende una secuencia de nucleótidos de al menos un nucleótido en longitud), y en la que la fracción de unión es capaz de unirse a la saliente 3’, la saliente 5’ o el extremo romo del producto de ADN lineal cerrado. La fracción de unión es capaz de unirse al extremo 3’ y/o 5’ del producto de ADN lineal cerrado. La señal se puede medir al determinar la presencia, ausencia y/o nivel de la porción con código de barras del código de barras (por ejemplo, mediante secuenciación o PCR). La porción con código de barras puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos 10 nucleótidos. El código de barras puede comprender al menos 2 fracciones de unión (por ejemplo, una primera fracción de unión y una segunda fracción de unión). Por ejemplo, la primera fracción de unión ligada a la primera porción con código de barras se puede unir al extremo 3’ del producto de ADN lineal cerrado y la segunda fracción de unión ligada a la segunda porción con código de barras se puede unir al extremo 5’ del producto de ADN lineal cerrado. Los extremos 3’ y 5’ pueden comprender una saliente 3’, una saliente 5’ o un extremo romo.
Una señal que corresponde a la presencia, ausencia y/o nivel del producto de ADN lineal cerrado se puede medir utilizando un fluoróforo (es decir, una molécula marcada con fluorescencia), que se adhiere o une a la saliente 3’, la saliente 5’ o el extremo romo del producto de ADN lineal cerrado. La señal se puede medir mediante citometría de flujo y/o clasificación celular activada por fluorescencia.
La porción funcional también puede facilitar la secuenciación del ADN. Por ejemplo, la porción funcional puede ser un adaptador de secuenciación. El término "adaptador de secuenciación” pretende abarcar uno o más dominios de ácido nucleico que incluyen al menos una porción de una secuencia de ácidos nucleicos (o complemento de la misma) utilizada por una plataforma de secuenciación de interés, tal como una plataforma de secuenciación proporcionada por Illumina® (por ejemplo, los sistemas de secuenciación HiSeq™, MiSeq™ y/o Genome Analyzer™), Oxford Nanopore™ Technologies (por ejemplo, el sistema de secuenciación MinlON), Ion Torrent™ (por ejemplo, los sistemas de secuenciación Ion PGMTM y/o Ion Proton™), Pacific Biosciences (por ejemplo, el sistema de secuenciación PACBIO RS II); Life Technologies™ (por ejemplo, un sistema de secuenciación SOLiD), Roche (por ejemplo, los sistemas de secuenciación 454 GS FLX+ y/o GS Junior), o cualesquier otras plataformas de secuenciación de interés.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una secuencia de repetición terminal invertida. Las secuencias de repetición terminal invertidas de la primera molécula adaptadora y la segunda molécula adaptadora pueden ser simétricas (es decir, tener la misma organización tridimensional simétrica entre sí) o asimétricas (es decir, tener una organización tridimensional diferente entre sí) Las secuencias de repetición terminal invertidas de la primera molécula adaptadora y la segunda molécula adaptadora pueden ser del mismo serotipo o de serotipos diferentes. Una secuencia de repetición terminal invertida puede comprender un sitio de resolución terminal y un sitio de unión Rep.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender un aptámero.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden conferir resistencia a la digestión con nucleasa, tal como digestión con exonucleasa (por ejemplo, digestión con exonucleasa I y/o exonucleasa III).
El cierre de la región de doble hebra lineal (o la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra) en el primer extremo puede generar un primer extremo cerrado del producto de ADN lineal cerrado. El cierre de la región de doble hebra lineal (o la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra) en el segundo extremo puede generar un segundo extremo cerrado del producto de ADN lineal cerrado. El primer extremo cerrado y el segundo extremo cerrado del producto de ADN lineal cerrado pueden ser resistentes a la digestión con nucleasa. La digestión con nucleasa puede ser digestión con exonucleasa. Preferiblemente, la digestión con nucleasa es digestión con exonucleasa III y/o digestión con exonucleasa I.
2. Métodos para producir un producto de ADN lineal que comprenden nucleótidos resistentes a nucleasa
Los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para producir un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos).
La invención proporciona un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos).
La etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se realiza preferiblemente en la presencia de una ligasa. Por lo tanto, el método para producir un producto de ADN lineal puede comprender las etapas:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos).
El producto de ADN lineal producido por los métodos descritos en el presente documento tiene resistencia potenciada para la digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). Por ejemplo, el producto de ADN lineal tiene expresión in vivo prolongada cuando se compara con un producto de ADN lineal que no contiene nucleótidos protegidos.
La anexión de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora se puede realizar mediante la hibridación o ligación de las moléculas adaptadoras a los extremos de la región de doble hebra lineal. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora se puede hibridar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede hibridar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La primera molécula adaptadora se puede ligar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede ligar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La anexión de la primera molécula adaptadora y la segunda molécula adaptadora se puede realizar mediante tanto hibridación como ligación de las moléculas adaptadoras a los extremos de la región de doble hebra lineal. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora se puede hibridar y ligar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede hibridar y ligar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La hibridación se basa en la complementariedad de una porción de la primera y/o segunda moléculas adaptadoras al primer y/o segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
El método para producir un producto de ADN lineal puede comprender las etapas:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos).
El método para producir un producto de ADN lineal puede comprender las etapas:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos).
Como se utiliza en el presente documento, el término “complementario” se refiere al emparejamiento de secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reglas de emparejamiento Watson/Crick. Por ejemplo, una secuencia 5’-GCGGTCCCA-3’ tiene la secuencia complementaria de 5’-TGGGACCGC-3’. Una secuencia de complemento también puede ser una secuencia de ARN complementaria a la secuencia de ADN.
Preferiblemente, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa, la ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se realiza en un única reacción (es decir, una única etapa).
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal puede comprender generar la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra al digerir la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar bajo condiciones que promueven la anexión (o ligado) de la primera y segunda moléculas adaptadoras a la región de doble hebra lineal para producir el producto de ADN lineal. La anexión se puede realizar al crear un enlace covalente entre la primera y/o segunda molécula adaptadora y el(los extremo(s) de la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra).
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar bajo condiciones que promueven la digestión de la molécula de ADN de doble hebra para producir la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra. La digestión de la molécula de ADN de doble hebra para producir la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra se puede realizar a una primera temperatura de 1°C-100°C, 1 °C -80 °C, 5°C-70°C, 10°C-60°C, 15°C-55°C, 20 °C-50 °C, 25 °C -45 °C, 30 °C-40 °C, 35 °C-39 °C, 36 °C-38 °C, o en aproximadamente 37 °C. La digestión puede ser digestión con endonucleasa, preferiblemente digestión con endonucleasa Tipo IIS.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar bajo condiciones que promueven la ligación de la región de doble hebra lineal a la primera y segunda moléculas adaptadoras. La ligación puede ser al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60, al menos 65, al menos 70 %, al menos 75, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % eficiente. Por ejemplo, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60, al menos 65, al menos 70 %, al menos 75, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de las regiones de doble hebra lineal (o las porciones de las moléculas de ADN de doble hebra) se pueden incorporar en los productos de ADN lineal cerrado. Preferiblemente, la ligación es al menos 15 % eficiente.
La etapa de ligación de la región de doble hebra lineal a la primera y segunda moléculas adaptadoras se puede realizar a una segunda temperatura de 1 °C -90 °C, 2 °C -70 °C, 5 °C-60 °C, 8°C-55°C, 9°C-50°C, 10°C-45°C, 11°C-40°C, 12°C-37°C, 13°C-30°C, 14 °C-25 °C, 15 °C-20 °C o en aproximadamente 16 °C.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender incubar a una primera temperatura y luego incubar a una segunda temperatura. La primera temperatura puede ser de 1 °C-100°C, 1 °C-80 °C, 5°C-70°C, 10°C-60°C, 15°C-55°C, 20 °C-50 °C, 25 °C-45 °C, 30 °C-40 °C, 35 °C-39 °C, 36 °C-38 °C, o aproximadamente 37 °C. La segunda temperatura puede ser de 1 °C -90 °C, 2 °C -70 °C, 5 °C-60 °C, 8 °C-55 °C, 9 °C-50 °C, 10 °C-45 °C, 11 °C-40 °C, 12 °C-37 °C, 13 °C-30 °C, 14 °C-25 °C, 15 °C-20 °C o en aproximadamente 16 °C. Preferiblemente, la primera temperatura es 35°C-39°C. Preferiblemente, la segunda temperatura es 14 °C-18 °C.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 80, al menos 90, o al menos 100 veces, preferiblemente al menos 20 veces. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura menor de 40, menor de 35, menor de 30 veces, menor de 29, menor de 25 veces. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura 2-100, 5-80, 10­ 70, 20-60, o 30-60 veces. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura 2-20, 5-29, 61­ 100, o 65-80 veces.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar de forma isotérmica. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender incubar a una temperatura constante. La temperatura constante promueve la digestión simultánea de la molécula de ADN de doble hebra para producir la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra y la ligación de la región de doble hebra lineal a la primera y segunda moléculas adaptadoras. Por ejemplo, la temperatura constante puede ser 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, o 40 °C. Preferiblemente, la temperatura constante es 30 °C. Se pretende que la temperatura constante signifique que la temperatura no cambia significativamente durante la reacción. La temperatura constante pretende significar que la variación de temperatura durante la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo es menor de 10 °C, menor de 9 °C, menor de 8 °C, menor de 7 °C, menor de 6 °C, menor de 5 °C, menor de 4 °C, menor de 3 °C, menor de 2 °C, o menor de 1 °C. En una realización preferida la temperatura durante la etapa de incubar el único acuoso contiguo no se desvía en más de 5 °C, preferiblemente en no más de 3°C, incluso más preferiblemente no más de 1 °C. Por lo tanto, la temperatura constante puede ser una temperatura en un rango de 20 °C-30 °C, 22 °C-32 °C, 24 °C-34 °C, 26 °C-36 °C, 28 °C-38 °C, 30 °C-40 °C, 22 °C-28 °C, 32 °C-38 °C, 25 °C-35 °C, 26 °C-34 °C, 27 °C- 33 °C, 27.5 °C-32.5 °C, 28 °C-32 °C, 28.5 °C-31.5 °C, 29 °C-31 °C, o 29.5 °C-30.5 °C. Preferiblemente, la temperatura constante es una temperatura en un rango de 27.5 °C-32.5 °C. Alternativamente, la temperatura constante puede ser una temperatura en un rango de 32 °C-42 °C, 33 °C-41 °C, 34 °C-40 °C, 35 °C-39 °C, 36 °C-38 °C. Preferiblemente, la temperatura constante es una temperatura en un rango de 34.5 °C-39.5 °C.
La primera y segunda moléculas adaptadoras pueden comprender uno o más nucleótidos fosforotioados, de tal manera que, una vez se anexan las moléculas adaptadoras (por ejemplo, se ligan) a la región de doble hebra lineal, el producto de ADN lineal es resistente a la digestión con nucleasa o tiene resistencia mejorada o potenciada a la digestión con nucleasa. El producto de ADN lineal puede ser resistente a la digestión con exonucleasa de extremo 3’ (por ejemplo, por la exonucleasa III) y/o digestión con exonucleasa de extremo 5’ (por ejemplo, por la exonucleasa VIII).
La molécula adaptadora puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados. Por ejemplo, las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleótidos fosforotioados en cada hebra.
La molécula adaptadora puede ser una molécula adaptadora de ácido nucleico. La molécula adaptadora puede ser de doble hebra. La molécula adaptadora puede comprender una porción que es de hebra doble.
La primera y/o segunda moléculas adaptadoras pueden comprender al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 pares base.
La molécula adaptadora puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados en cada hebra. Por ejemplo, las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleótidos fosforotioados en cada hebra.
La molécula adaptadora puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra. Por ejemplo, las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra. Preferiblemente, la molécula adaptadora comprende al menos 2 nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra.
Las posiciones internas pueden no estar ubicadas entre el segundo y el penúltimo nucleótido de la molécula adaptadora. Las posiciones internas pueden ser cualesquier posiciones en las moléculas adaptadoras diferentes del último nucleótido en el extremo de cada hebra.
La molécula adaptadora puede comprender al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 100 % de nucleótidos protegidos.
Una vez se anexan las moléculas adaptadoras a la región de doble hebra lineal, el producto de ADN lineal puede comprender un nucleótido protegido (por ejemplo, nucleótido fosforotioado) en el extremo 5’ (o en la región de extremo 5’) de una o ambas hebras. Preferiblemente, el producto de ADN lineal comprende un nucleótido fosforotioado en el extremo 5’ (o en la región de extremo 5’) de una o ambas hebras. El producto de ADN lineal puede comprender un nucleótido fosforotioado en el extremo 5’ (o en la región de extremo 5’) de una o ambas hebras. Como la mayoría de las exonucleasas, por ejemplo, la exonucleasa III, eliminan los nucleótidos desde el extremo 3’ de la cadena de polinucleótidos, el producto de ADN lineal puede comprender un nucleótido protegido en el extremo 3’ (o en la región de extremo 3’) de una o ambas hebras. Preferiblemente, el producto de ADN lineal comprende un nucleótido fosforotioado en el extremo 3’ (o la región de extremo 3’) de una o ambas hebras. El producto de ADN lineal puede comprender al menos un nucleótido fosforotioado en el extremo 3’ (o la región de extremo 3’) y al menos un nucleótido fosforotioado en el extremo 5’ (o la región de extremo 5’) de una o ambas hebras. El producto de ADN lineal puede comprender un nucleótido fosforotioado en el extremo 3’ (o la región de extremo 3’) y el extremo 5’ (o la región de extremo 5’) de una o ambas hebras.
El producto de ADN lineal puede comprender adicionalmente una pluralidad de nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Por ejemplo, el producto de ADN lineal puede comprender al menos 2, al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, o al menos 500 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Preferiblemente, el producto de ADN lineal comprende al menos 2 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra.
Las posiciones internas pueden no estar ubicadas entre el segundo y el penúltimo nucleótido del producto de ADN lineal. Las posiciones internas pueden ser cualesquier posiciones en las moléculas adaptadoras diferentes del último nucleótido en el extremo de cada hebra.
La región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra. Por ejemplo, la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender al menos 2, al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, o al menos 500 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Preferiblemente, la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble) comprende al menos 2 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Las posiciones internas pueden no estar ubicadas entre el segundo y el penúltimo nucleótido de la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble).
Los nucleótidos resistentes a la digestión con exonucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) pueden ser nucleótidos fosforotioados de al menos un tipo. Por ejemplo, el al menos un tipo de nucleótidos fosforotioados es a-S-dATP (es decir, 2’-desoxiadenosina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dCTP (es decir, 2’-desoxicitidina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dGTP (es decir, 2’-desoxiguanosina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dTTP (es decir, 2’-desoxitimidina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dUTP (es decir, 2’-desoxiuridina-5’-(a-tio)-trifosfato), y/o uridina 2’, 3’-ciclofosforotioato.
Las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos dos tipos de nucleótidos fosforotioados. Por ejemplo, los al menos dos tipos de nucleótidos fosforotioados son: a-S-dATP y a-S-dCTP, a-S-dATP y a-S-dGTP, a-S-dATP y a-S-dTTP, a-S-dCTP y a-S-dGTP, a-S-dCTP y a-S-dTTP, o a-S-dGTP y a-S-dTTP.
Las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos tres tipos de nucleótidos fosforotioados. Por ejemplo, los al menos tres tipos de nucleótidos fosforotioados son:
(a) a-S-dATP, a-S-dCTP y a-S-dGTP;
(b) a-S-dATP, a-S-dCTP y a-S-dTTP;
(c) a-S-dATP, a-S-dGTP y a-S-dTTP; o
(d) a-S-dCTP, a-S-dGTP y a-S-dTTP.
Las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos cuatro tipos de nucleótidos fosforotioados. Por ejemplo, los al menos cuatro tipos de nucleótidos protegidos son a-S-dATP, a-S-dCTP, a-S-dGTP y a-S-dTTP.
Los nucleótidos fosforotioados pueden ser Sp-isómeros, Rp-isómeros o una mezcla de ambos Sp- y Rp-isómeros.
Los nucleótidos resistentes a la digestión con exonucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) pueden ser nucleótidos MOE de al menos un tipo, o al menos dos, tres o cuatro tipos. Por ejemplo, los nucleótidos MOE pueden ser 2’-O-metoxi-etil guanosina, 2’-O-metoxi-etil citidina, 2’-O-metoxi-etil adenosina, y/o 2’-O-metoxi-etil timidina.
El método puede comprender adicionalmente, antes de la etapa (a) (es decir, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa, la ligasa y la primera y segunda moléculas adaptadoras), una etapa de amplificar una molécula de molde de ADN para producir la molécula de ADN de doble hebra. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal, el método comprende:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos).
La etapa de amplificar se puede realizar mediante amplificación in vitro o in vivo. Preferiblemente, la etapa de amplificar se realiza mediante amplificación in vitro. Por ejemplo, la etapa de amplificar se puede realizar mediante amplificación por círculo rodante (RCA), método MALBAC, reacción de cadena de polimerasa tradicional (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) y amplificación de polimerasa recombinasa (RPA). Preferiblemente, la etapa de amplificar se realiza mediante amplificación por círculo rodante. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal, el método comprende:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra, en la que la molécula de molde de ADN se amplifica mediante amplificación por círculo rodante;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos).
La amplificación por círculo rodante se puede realizar sin ningún cebador, o en la presencia de un cebador o múltiples cebadores. Por ejemplo, el cebador puede ser un cebador sintético. Los cebadores pueden ser cebadores aleatorios. Amplificación por círculo rodante se puede realizar en la presencia de una primasa. La primasa puede ser TthPrimPol. Preferiblemente, si la amplificación por círculo rodante se realiza sin ningún cebador, se realiza en la presencia de una primasa, tal como TthPrimPol. Del mismo modo, si se utiliza un cebador durante la reacción de amplificación, no se utiliza una primasa. El producto de ADN de doble hebra se puede generar por la amplificación por círculo rodante in vitro bajo condiciones isotérmicas utilizando una polimerasa de ácido nucleico adecuada, tal como polimerasa de ADN Phi29.
En los métodos descritos en el presente documento, la molécula de molde de ADN puede comprender al menos una secuencia diana escindible. La secuencia diana escindible puede ser una secuencia diana de endonucleasa. Por lo tanto, la molécula de molde de ADN puede comprender al menos una secuencia diana de endonucleasa. Preferiblemente, la molécula de molde de ADN comprende al menos dos secuencias diana de endonucleasa. Las secuencias diana de endonucleasa pueden ser la misma o diferente. Preferiblemente, la al menos una secuencia diana de endonucleasa es una secuencia diana de endonucleasa de restricción. Diferentes secuencias diana de endonucleasa de restricción serían conocidas por el experto en la técnica. La secuencia diana escindible puede ser una secuencia diana de endonucleasa de restricción Tipo IIS. Por ejemplo, la secuencia diana de endonucleasa de restricción puede ser una secuencia diana BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI. La al menos una secuencia escindible (por ejemplo, secuencia diana de endonucleasa) puede ser una secuencia escindible nativa (es decir, una secuencia escindible presente en la molécula de molde). Alternativamente, la al menos una secuencia escindible (por ejemplo, secuencia diana de endonucleasa) se puede introducir a la molécula de molde de ADN antes de la producción del producto de ADN lineal.
La endonucleasa puede ser una endonucleasa de enzima de restricción. La endonucleasa puede ser una enzima de restricción Tipo IIS. La endonucleasa puede ser cualquier enzima que reconoce una secuencia de ADN y se escinde fuera de la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, la endonucleasa puede ser una enzima de restricción BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
La ligasa puede ser una ligasa de ADN, tal como una ligasa de ADN T4, ligasa de ADN T7, ligasa de ADN de mamífero I, III y IV; ligasa de ADN Taq, ligasa de ADN Tth, o ligasa de ADN de E. coli.
La molécula de molde de ADN utilizada en los métodos descritos en el presente documento puede ser de hebra sencilla o de hebra doble. Preferiblemente, la molécula de molde de ADN es de hebra doble. La molécula de molde de ADN puede ser una molécula de ADN circular natural. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede ser (i) un plásmido, (ii) un minicírculo, (iii) un cósmido, (iv) un cromosoma artificial bacteriano (BAC), o (v) una sonda de inversión molecular (MIP). La molécula de molde de ADN puede ser una molécula de ADN circular producida enzimáticamente. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede ser (i) una molécula de ADN circular obtenida de la reacción de recombinasa, preferiblemente reacción de recombinasa Cre, o (ii) una molécula de ADN circular obtenida de la reacción de ligasa, preferiblemente utilizando el ensamblaje Golden Gate. La molécula de molde de ADN puede ser una molécula de ADN lineal cerrada covalentemente producida enzimáticamente. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede ser (i) una molécula de ADN procesada con protelomerasa TelN; o (ii) una molécula de ADN generada por ligación de los extremos del ADN con un adaptador. La molécula de molde de ADN puede comprender un elemento que es de hebra doble y un elemento que es de hebra sencilla. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede comprender un ADN de doble hebra y un bucle de horquilla de hebra sencilla.
La molécula de molde de ADN puede ser lineal. Si la molécula de molde de ADN es lineal, antes de la amplificación (por ejemplo, amplificación por círculo rodante), una molécula de molde de ADN se puede hacer circular para producir una molécula de molde de ADN adecuada para uso en los métodos descritos en el presente documento.
La molécula de molde de ADN puede comprender un casete. El casete puede ser un casete de expresión de mamífero. El casete puede comprender adicionalmente un promotor. El promotor puede ser un promotor de CMV. El casete puede comprender adicionalmente un potenciador. El casete puede comprender adicionalmente un gen indicador, tal como un gen indicador de eGFP o un gen indicador de luciferasa. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia homopolimérica. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia LoxP, preferiblemente dos secuencias LoxP. Si las dos secuencias LoxP se orientan en la misma dirección, la secuencia de ADN entre las dos secuencias LoxP se corta como un bucle circular de ADN. Si las dos secuencias LoxP se orientan en la dirección opuesta, se invierte la secuencia de ADN entre las dos secuencias LoxP. Por lo tanto, preferiblemente, las dos secuencias LoxP están en la misma orientación en la molécula de molde de ADN.
La molécula de molde de ADN puede comprender una secuencia homopolimérica en un extremo 5’ o un extremo 3’ o tanto un extremo 5’ como un extremo 3’. La secuencia homopolimérica se puede agregar a la molécula de molde de ADN antes de la circularización. La secuencia homopolimérica puede ser una secuencia poliA, poliC, poliG, o poliT. La secuencia homopolimérica puede tener entre 3-200 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para facilitar la purificación del producto de ADN lineal, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 4-12 nucleótidos en longitud, o entre 5-10 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para mejorar la expresión de ARNm, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 10-200 nucleótidos en longitud, preferiblemente entre 80-150 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, o al menos 200 nucleótidos en longitud. Preferiblemente, la secuencia homopolimérica tiene al menos 100 nucleótidos en longitud. Más preferiblemente aún, la secuencia homopolimérica tiene al menos 120 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, la secuencia homopolimérica puede comprender una secuencia poliA de al menos 120 nucleótidos.
El método puede comprender adicionalmente, después de la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo, una etapa de purificación del producto de ADN lineal.
El método puede comprender adicionalmente, después de la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo, una etapa de digestión con nucleasa. La digestión con nucleasa puede ser digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa I y/o exonucleasa 111. La etapa de digestión con nucleasa puede tener lugar antes o después de la etapa de purificación. Esta etapa permite la eliminación de cualesquier moléculas de ADN de doble hebra y/o moléculas adaptadoras que no se han utilizado en el curso de la realización del método. Por lo tanto, el método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos); y
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa).
El método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos);
(d) purificar el producto de ADN lineal cerrado; y
(e) incubar el producto purificado de la etapa (d) con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa).
El método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos);
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa); y
(e) purificar el producto de ADN lineal cerrado.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) con una nucleasa se puede realizar a una temperatura de 5-90 °C, 10-80 °C, 15-70 °C, 20-60 °C, 25-50 °C, 30-45 °C o 35-40 °C. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) con una nucleasa se puede realizar durante al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 60 min. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) se puede realizar en dos diferentes temperaturas. Por ejemplo, la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) se puede realizar a 15­ 40 °C durante 10-60 minutos seguida por una temperatura de 60-90 °C durante 10-30 min. La mayor temperatura normalmente inactiva la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). Por lo tanto, el método proporciona adicionalmente una etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) se puede realizar a 37 °C durante 30 min y 80 °C durante 20 min. Preferiblemente, la etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa) se realiza a una temperatura de 70-80 °C. La etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa) se puede realizar durante al menos 1, al menos 5, al menos 10, al menos 20 o al menos 30 minutos. Preferiblemente, la etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa) se realiza durante al menos 5 minutos.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una saliente. El extremo de la región de doble hebra lineal puede comprender una saliente 3’ o 5’. Una porción de la primera molécula adaptadora (por ejemplo, la saliente) puede ser complementaria al primer extremo de la región de doble hebra lineal. Una porción de la segunda molécula adaptadora puede ser complementaria al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
El primer extremo y el segundo extremo de la región de doble hebra lineal pueden ser resistentes a la digestión con nucleasa. Preferiblemente, el primer extremo y el segundo extremo de la región de doble hebra lineal son resistentes a la digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa III y/o digestión con exonucleasa I.
El producto de ADN lineal puede ser parcialmente de doble hebra y/o parcialmente de hebra sencilla. El producto de ADN lineal puede comprender una porción que es de hebra doble y una porción que es de hebra sencilla.
El producto de ADN lineal puede comprender un casete. El casete puede comprender una secuencia de codificación. La secuencia de codificación puede codificar un gen de interés, por ejemplo un gen que codifica una proteína. El casete puede comprender al menos una porción de un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor, una secuencia de codificación, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la traducción. El casete puede comprender adicionalmente secuencias que ayudan a la expresión de proteínas, tales como un elemento de traducción independiente del casquete. El casete puede comprender (o codificar) un molde de reparación (o molde de edición). La molde de reparación (o molde de edición) puede ser para uso en la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR-Cas (HDR). El casete puede codificar el ARN guía CRISPR. El casete puede ser un casete de expresión de mamífero. El promotor puede ser un promotor de CMV. El casete puede comprender adicionalmente un potenciador. El casete puede comprender adicionalmente un gen indicador, tal como un gen indicador de eGFP o un gen indicador de luciferasa. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia homopolimérica, tal como una secuencia poliA, poli C, poliT o poliG. La secuencia homopolimérica puede tener entre 3-200 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para facilitar la purificación del casete, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 4-12 nucleótidos en longitud, o entre 5-10 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para mejorar la expresión de ARNm, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 10-200 nucleótidos en longitud, preferiblemente entre 80-150 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, o al menos 200 nucleótidos en longitud. Preferiblemente, la secuencia homopolimérica tiene al menos 100 nucleótidos en longitud. Más preferiblemente aún, la secuencia homopolimérica tiene al menos 120 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, la secuencia homopolimérica puede comprender una secuencia poliA de al menos 120 nucleótidos.
El producto de ADN lineal puede comprender un separador. El separador puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, o al menos 200 pares base de largo. El separador puede mejorar la eficiencia de ligación de la primera y segunda moléculas adaptadoras a la región de doble hebra lineal. El separador puede mejorar los rendimientos de transfección de célula.
El producto de ADN lineal puede comprender una secuencia de repetición terminal invertida.
El producto de ADN lineal puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, el producto de ADN lineal tiene al menos 50 pares base de largo.
La molécula de ADN de doble hebra puede ser circular, o ramificada.
La molécula de ADN de doble hebra puede no comprender una molécula adaptadora. La molécula de ADN de doble hebra puede no comprender una horquilla, un bucle o una estructura de bucle de tallo.
La molécula de ADN de doble hebra puede comprender un casete. El casete puede comprender una secuencia de codificación. La secuencia de codificación puede codificar un gen de interés, por ejemplo un gen que codifica una proteína. El casete puede comprender al menos una porción de un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor, una secuencia de codificación, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la traducción. El casete puede comprender adicionalmente secuencias que ayudan a la expresión de proteínas, tales como un elemento de traducción independiente del casquete. El casete puede comprender (o codificar) un molde de reparación (o molde de edición). La molde de reparación (o molde de edición) puede ser para uso en la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR-Cas (HDR). El casete puede codificar el ARN guía CRISPR. El casete puede ser un casete de expresión de mamífero. El promotor puede ser un promotor de CMV. El casete puede comprender adicionalmente un potenciador. El casete puede comprender adicionalmente un gen indicador, tal como un gen indicador de eGFP o un gen indicador de luciferasa. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia homopolimérica, tal como una secuencia poliA, poli C, poliT o poliG. La secuencia homopolimérica puede tener entre 3-200 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para facilitar la purificación del casete, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 4-12 nucleótidos en longitud, o entre 5-10 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para mejorar la expresión de ARNm, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 10-200 nucleótidos en longitud, preferiblemente entre 80-150 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, o al menos 200 nucleótidos en longitud. Preferiblemente, la secuencia homopolimérica tiene al menos 100 nucleótidos en longitud. Más preferiblemente aún, la secuencia homopolimérica tiene al menos 120 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, la secuencia homopolimérica puede comprender una secuencia poliA de al menos 120 nucleótidos.
La molécula de ADN de doble hebra puede comprender un separador. El separador puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, o al menos 200 pares base de largo. El separador puede mejorar el rendimiento de la amplificación de la molécula de ADN de doble hebra. El separador puede mejorar la eficiencia de ligación de la primera y segunda moléculas adaptadoras a la región de doble hebra lineal. El separador puede mejorar los rendimientos de transfección de célula.
La molécula de ADN de doble hebra puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, la molécula de ADN de doble hebra tiene al menos 50 pares base de largo.
La molécula de ADN de doble hebra puede comprender una o más secuencias diana escindibles (por ejemplo, endonucleasa). La molécula de ADN de doble hebra puede comprender dos secuencias diana escindibles (por ejemplo, endonucleasa). La una o más secuencias diana de endonucleasa pueden ser secuencias diana de endonucleasa Tipo IIS. La una o más secuencias diana de endonucleasa pueden ser secuencias diana BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, Faql, Faul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, HpyAV, LguI, Lmnl, Lsp1109l, Lwel, Mboll, Mlyl, Mmel, Mnll, Mva1269l, NmeAIII, PaqCI, PciSI, Pctl, Piel, Ppsl, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
La molécula de ADN de doble hebra puede ser un producto de amplificación. Preferiblemente, la amplificación es amplificación por círculo rodante.
La región de doble hebra lineal puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, la molécula de ADN de doble hebra tiene al menos 50 pares base de largo.
La región de doble hebra lineal puede comprender un grupo 3’-OH en el primer y/o segundo extremos. El grupo 3’-OH puede facilitar la ligación a la primera y/o segunda molécula(s) adaptadora(s) (que puede(n) comprender un fosfato 5’). La región de doble hebra lineal puede comprender un fosfato 5’ en el primer y/o segundo extremos. El fosfato 5’ puede facilitar la ligación a la primera y/o segunda molécula(s) adaptadora(s) (que puede(n) comprender un grupo 3’-OH).
La región de doble hebra lineal (por ejemplo, la porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender una saliente. Por ejemplo, la región de doble hebra lineal puede comprender una saliente 5’ o una saliente 3’. La región de doble hebra lineal puede comprender un extremo romo o extremos romos. La región de doble hebra lineal puede comprender: una saliente 5’ y un extremo romo, dos salientes 5’, una saliente 3’ y un extremo romo, dos salientes 3’, o una saliente 5’ y una saliente 3’. La saliente puede tener al menos 3 nucleótidos (preferiblemente desde 4 hasta 8 nucleótidos). La saliente puede estar en la hebra con sentido o la hebra antisentido de la región de doble hebra lineal.
La porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra (por ejemplo, la porción lineal de la molécula de hebra doble) puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, la molécula de ADN de doble hebra tiene al menos 50 pares base de largo.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora puede ser una molécula adaptadora sintética.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden no ser un plásmido o un vector de ADN.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una porción de hebra sencilla. La porción de hebra sencilla puede comprender menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 nucleótidos. Preferiblemente, la porción de hebra sencilla comprende 5 nucleótidos.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una porción de doble hebra. La porción de doble hebra puede comprender menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, menos de 30, menos de 25, menos de 20, menos de 15, o menos de 10 pares base. La porción de doble hebra puede comprender al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15 pares base.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender un fosfato 5’. El fosfato 5’ puede facilitar la ligación a la región de doble hebra lineal.
La primera molécula adaptadora puede comprender una porción que es complementaria al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora puede comprender una porción que es complementaria al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La primera molécula adaptadora puede comprender una porción que se empareja al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora puede comprender una porción que se empareja al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una saliente. Por ejemplo, la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una saliente 5’ o una saliente 3’. La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender un extremo romo. La saliente puede tener al menos 3 nucleótidos (preferiblemente desde 4 hasta 6 nucleótidos). La saliente de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora puede ser complementaria al primer y/o segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La saliente de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora se puede emparejar con el primer y/o segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora puede no comprender una secuencia diana de endonucleasa Tipo IIS. La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora puede no comprender secuencias diana BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI SapI.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una porción funcional. La porción funcional puede ser una molécula de unión, una secuencia de direccionamiento, o una sonda.
La porción funcional puede ser una sonda. Como se utiliza en el presente documento, el término "sonda” se refiere a un fragmento de ADN, ARN o quimera ADN/ARN de longitud variable (por ejemplo, 3-1000 bases de largo), que se utiliza para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos diana que son complementarias a la secuencia en la sonda. Normalmente, la sonda se hibrida con un ácido nucleico de hebra sencilla cuya secuencia de bases permite el emparejamiento de bases de sonda-diana debido a la complementariedad entre la sonda y la diana. Por lo tanto, la porción funcional puede ser una secuencia de ADN, una secuencia de ARN o una secuencia de quimera ADN/ARN. Como se utiliza en el presente documento, el término "complementario” se refiere al emparejamiento de secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reglas de emparejamiento Watson/Crick. Por ejemplo, una secuencia 5'-GCGGTCCCA-3' tiene la secuencia complementaria de 5'-TGGGACCGC-3'.
Una secuencia de complemento también puede ser una secuencia de ARN complementaria a la secuencia de ADN.
La porción funcional puede ser una molécula de unión. El término "molécula de unión” se refiere a cualquier molécula capaz de unirse al producto de ADN lineal descrito en el presente documento y/o que es capaz de unirse a una molécula adicional o diana. La molécula de unión puede ser una proteína, un polipéptido, o un péptido. La molécula de unión puede ser un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. La molécula de unión puede ser un fragmento de anticuerpo.
La porción funcional puede facilitar la detección del producto de ADN al unirse para capturar moléculas (por ejemplo, anticuerpos de captura unidos por interacciones de proteínaproteína). La porción funcional se puede unir a una diana de célula, por ejemplo, un receptor celular.
La porción funcional puede ser un marcador. El ‘marcador’ puede ser cualquier entidad química que permita la detección de la molécula de ácido nucleico de doble hebra por medios físicos, químicos y/o biológicos. El marcador puede ser un cromóforo, un fluoróforo y/o una molécula radioactiva.
La porción funcional puede ser una secuencia de direccionamiento. La secuencia de direccionamiento puede ser un fragmento de ADN o ARN de longitud variable, que se utiliza para dirigir el producto de ADN a una ubicación específica en una célula. La secuencia de direccionamiento se puede utilizar para aumentar la eficiencia de transfección del suministro de genes no virales en virtud de la importación nuclear mejorada del producto de ADN lineal. Por ejemplo, la secuencia de direccionamiento puede ser una secuencia de direccionamiento nuclear de ADN (es decir, una secuencia de reconocimiento para proteínas endógenas de unión a ADN), tales como secuencia potenciadora de SV40 (preferiblemente en dirección descendente del casete).
Para facilitar la detección y/o cuantificación del producto de ADN, la porción funcional puede comprender un fluoróforo, un compuesto radioactivo o un código de barras.
Una señal que corresponde a la presencia, ausencia y/o nivel del producto de ADN lineal se puede medir utilizando un código de barras. El código de barras puede comprender al menos una fracción de unión ligada a una porción con código de barras, en la que la porción con código de barras comprende al menos un nucleótido (es decir, en la que la porción con código de barras comprende una secuencia de nucleótidos de al menos un nucleótido en longitud), y en la que la fracción de unión es capaz de unirse a la saliente 3’, la saliente 5’ o el extremo romo del producto de ADN lineal. La fracción de unión es capaz de unirse al extremo 3’ y/o 5’ del producto de ADN lineal. La señal se puede medir al determinar la presencia, ausencia y/o nivel de la porción con código de barras del código de barras (por ejemplo, mediante secuenciación o PCR). La porción con código de barras puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos 10 nucleótidos. El código de barras puede comprender al menos 2 fracciones de unión (por ejemplo, una primera fracción de unión y una segunda fracción de unión). Por ejemplo, la primera fracción de unión ligada a la primera porción con código de barras se puede unir al extremo 3’ del producto de ADN lineal y la segunda fracción de unión ligada a la segunda porción con código de barras se puede unir al extremo 5’ del producto de ADN lineal. Los extremos 3’ y 5’ pueden comprender una saliente 3’, una saliente 5’ o un extremo romo.
Una señal que corresponde a la presencia, ausencia y/o nivel del producto de ADN lineal se puede medir utilizando un fluoróforo (es decir, una molécula marcada con fluorescencia), que se adhiere o une a la saliente 3’, la saliente 5’ o el extremo romo del producto de ADN lineal. La señal se puede medir mediante citometría de flujo y/o clasificación celular activada por fluorescencia.
La porción funcional también puede facilitar la secuenciación del ADN. Por ejemplo, la porción funcional puede ser un adaptador de secuenciación. El término "adaptador de secuenciación” pretende abarcar uno o más dominios de ácido nucleico que incluyen al menos una porción de una secuencia de ácidos nucleicos (o complemento de la misma) utilizada por una plataforma de secuenciación de interés, tal como una plataforma de secuenciación proporcionada por Illumina® (por ejemplo, los sistemas de secuenciación HiSeq™, MiSeq™ y/o Genome Analyzer™), Oxford Nanopore™ Technologies (por ejemplo, el sistema de secuenciación MinlON), Ion Torrent™ (por ejemplo, los sistemas de secuenciación Ion PGMTM y/o Ion Proton™), Pacific Biosciences (por ejemplo, el sistema de secuenciación PACBIO RS II); Life Technologies™ (por ejemplo, un sistema de secuenciación SOLiD), Roche (por ejemplo, los sistemas de secuenciación 454 GS FLX+ y/o GS Junior), o cualesquier otras plataformas de secuenciación de interés.
Un ejemplo del método se proporciona con referencia a la Figura 3, que ilustra el flujo de trabajo para obtener el producto de ADN lineal mediante digestión y ligación de moléculas adaptadoras en una única etapa, partiendo del ADN amplificado obtenido a través de la amplificación por círculo rodante de un molde de ADN circular a través de la acción de recombinasa Cre sobre sustratos que contienen dos secuencias LoxP que flanquean el ADN de interés en la misma dirección.
El método se describe adicionalmente con referencia a la Figura 4, que ilustra las secuencias que impulsan la ligación de la molécula adaptadora después de la digestión con BsaI de la molécula de ADN de doble hebra amplificada en cada ciclo del proceso. La digestión con BsaI produce extremos sobresalientes de 4 nucleótidos en 5’ (TCCC 5’) en ambos lados del casete de expresión. Las moléculas adaptadoras se ligan a ambos lados del casete de expresión, lo que da como resultado un producto de ADN lineal protegido debido a la presencia de nucleótidos protegidos (marcados con un asterisco) en ambos lados y en ambas hebras del casete de expresión, lo que evita la degradación por exonucleasa del producto de ADN.
3. Métodos para producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado que comprenden nucleótidos resistentes a nucleasa
Los métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado que comprende nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos).
La invención proporciona un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) parcialmente cerrado, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
La etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se realiza preferiblemente en la presencia de una ligasa. Por lo tanto, el método para producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender las etapas:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado producido por los métodos descritos en el presente documento tiene resistencia potenciada para la digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasa).
La anexión de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora se puede realizar mediante la hibridación o ligación de las moléculas adaptadoras a los extremos de la región de doble hebra lineal. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora se puede hibridar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede hibridar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La primera molécula adaptadora se puede ligar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede ligar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La anexión de la primera molécula adaptadora y la segunda molécula adaptadora se puede realizar mediante tanto hibridación como ligación de las moléculas adaptadoras a los extremos de la región de doble hebra lineal. Por lo tanto, la primera molécula adaptadora se puede hibridar y ligar al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora se puede hibridar y ligar al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La hibridación se basa en la complementariedad de una porción de la primera y/o segunda moléculas adaptadoras al primer y/o segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
El método para producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender las etapas:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos), y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
El método para producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender las etapas:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos), y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
Como se utiliza en el presente documento, el término “complementario” se refiere al emparejamiento de secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reglas de emparejamiento Watson/Crick. Por ejemplo, una secuencia 5’-GCGGTCCCA-3’ tiene la secuencia complementaria de 5’-TGGGACCGC-3’. Una secuencia de complemento también puede ser una secuencia de ARN complementaria a la secuencia de ADN.
Preferiblemente, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa, la ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras se realiza en un única reacción (es decir, una única etapa).
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender generar la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra al digerir la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar bajo condiciones que promueven la anexión (o ligado) de la primera y segunda moléculas adaptadoras a la región de doble hebra lineal para producir el producto de ADN lineal parcialmente cerrado. La anexión se puede realizar al crear un enlace covalente entre la primera y/o segunda molécula adaptadora y el (los extremo(s) de la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra).
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar bajo condiciones que promueven la digestión de la molécula de ADN de doble hebra para producir la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra. La digestión de la molécula de ADN de doble hebra para producir la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra se puede realizar a una primera temperatura de 1°C-100°C, 1 °C -80 °C, 5°C-70°C, 10°C-60°C, 15°C-55°C, 20 °C-50 °C, 25 °C -45 °C, 30 °C-40 °C, 35 °C-39 °C, 36 °C-38 °C, o en aproximadamente 37 °C. La digestión puede ser digestión con endonucleasa, preferiblemente digestión con endonucleasa Tipo IIS.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar bajo condiciones que promueven la ligación de la región de doble hebra lineal a la primera y segunda moléculas adaptadoras. La ligación puede ser al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60, al menos 65, al menos 70 %, al menos 75, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % eficiente. Por ejemplo, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60, al menos 65, al menos 70 %, al menos 75, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de las regiones de doble hebra lineal (o las porciones de las moléculas de ADN de doble hebra) se pueden incorporar en los productos de ADN lineal cerrado. Preferiblemente, la ligación es al menos 15 % eficiente.
La etapa de ligación de la región de doble hebra lineal a la primera y segunda moléculas adaptadoras se puede realizar a una segunda temperatura de 1 °C -90 °C, 2 °C -70 °C, 5 °C-60 °C, 8°C-55°C, 9°C-50°C, 10°C-45°C, 11°C-40°C, 12°C-37°C, 13°C-30°C, 14 °C-25 °C, 15 °C-20 °C o en aproximadamente 16 °C.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender incubar a una primera temperatura y luego incubar a una segunda temperatura. La primera temperatura puede ser de 1 °C-100°C, 1 °C-80 °C, 5°C-70°C, 10°C-60°C, 15°C-55°C, 20 °C-50 °C, 25 °C-45 °C, 30 °C-40 °C, 35 °C-39 °C, 36 °C-38 °C, o aproximadamente 37 °C. La segunda temperatura puede ser de 1 °C -90 °C, 2 °C -70 °C, 5 °C-60 °C, 8 °C-55 °C, 9 °C-50 °C, 10 °C-45 °C, 11 °C-40 °C, 12 °C-37 °C, 13 °C-30 °C, 14 °C-25 °C, 15 °C-20 °C o en aproximadamente 16 °C. Preferiblemente, la primera temperatura es 35 °C-39 °C. Preferiblemente, la segunda temperatura es 14 °C-18 °C.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 80, al menos 90, o al menos 100 veces, preferiblemente al menos 20 veces. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura menor de 40, menor de 35, menor de 30 veces, menor de 29, menor de 25 veces. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura 2-100, 5-80, 10­ 70, 20-60, o 30-60 veces. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura 2-20, 5-29, 61­ 100, o 65-80 veces.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo se puede realizar de forma isotérmica. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo puede comprender incubar a una temperatura constante. La temperatura constante promueve la digestión simultánea de la molécula de ADN de doble hebra para producir la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra y la ligación de la región de doble hebra lineal a la primera y segunda moléculas adaptadoras. Por ejemplo, la temperatura constante puede ser 20 °C, 21 °C, 22 °C, 23 °C, 24 °C, 25 °C, 26 °C, 27 °C, 28 °C, 29 °C, 30 °C, 31 °C, 32 °C, 33 °C, 34 °C, 35 °C, 36 °C, 37 °C, 38 °C, 39 °C, o 40 °C. Preferiblemente, la temperatura constante es 30 °C. Se pretende que la temperatura constante signifique que la temperatura no cambia significativamente durante la reacción. La temperatura constante pretende significar que la variación de temperatura durante la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo es menor de 10 °C, menor de 9 °C, menor de 8 °C, menor de 7 °C, menor de 6 °C, menor de 5 °C, menor de 4 °C, menor de 3 °C, menor de 2 °C, o menor de 1 °C. En una realización preferida la temperatura durante la etapa de incubar el único acuoso contiguo no se desvía en más de 5 °C, preferiblemente en no más de 3°C, incluso más preferiblemente no más de 1 °C. Por lo tanto, la temperatura constante puede ser una temperatura en un rango de 20 °C-30 °C, 22 °C-32 °C, 24 °C-34 °C, 26 °C-36 °C, 28 °C-38 °C, 30 °C-40 °C, 22 °C-28 °C, 32 °C-38 °C, 25 °C-35 °C, 26 °C-34 °C, 27 °C- 33 °C, 27.5 °C-32.5 °C, 28 °C-32 °C, 28.5 °C-31.5 °C, 29 °C-31 °C, o 29.5 °C-30.5 °C. Preferiblemente, la temperatura constante es una temperatura en un rango de 27.5 °C-32.5 °C. Alternativamente, la temperatura constante puede ser una temperatura en un rango de 32 °C-42 °C, 33 °C-41 °C, 34 °C-40 °C, 35 °C-39 °C, 36 °C-38 °C. Preferiblemente, la temperatura constante es una temperatura en un rango de 34.5 °C-39.5 °C.
La primera y segunda moléculas adaptadoras pueden comprender uno o más nucleótidos fosforotioados, de tal manera que, una vez se anexan las moléculas adaptadoras (por ejemplo, se ligan) a la región de doble hebra lineal, el producto de ADN lineal parcialmente cerrado es resistente a la digestión con nucleasa o tiene resistencia mejorada o potenciada a la digestión con nucleasa. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede ser resistente a la digestión con exonucleasa de extremo 3’ (por ejemplo, por la exonucleasa III) y/o digestión con exonucleasa de extremo 5’ (por ejemplo, por la exonucleasa VIII).
La molécula adaptadora puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados. Por ejemplo, las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleótidos fosforotioados en cada hebra.
La molécula adaptadora puede ser una molécula adaptadora de ácido nucleico. La molécula adaptadora puede ser de doble hebra. La molécula adaptadora puede comprender una porción que es de hebra doble.
La primera y/o segunda moléculas adaptadoras pueden comprender al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, o al menos 16 pares base.
La molécula adaptadora puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados en cada hebra. Por ejemplo, las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleótidos fosforotioados en cada hebra.
La molécula adaptadora puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra. Por ejemplo, las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15 o al menos 16 nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra.
Preferiblemente, la molécula adaptadora comprende al menos 2 nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra.
Las posiciones internas pueden no estar ubicadas entre el segundo y el penúltimo nucleótido de la molécula adaptadora. Las posiciones internas pueden ser cualesquier posiciones en las moléculas adaptadoras diferentes del último nucleótido en el extremo de cada hebra.
La molécula adaptadora puede comprender al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 %, o al menos 100 % de nucleótidos protegidos.
Una vez se anexan las moléculas adaptadoras a la región de doble hebra lineal, el producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender un nucleótido protegido (por ejemplo, nucleótido fosforotioado) en el extremo 5’ (o en la región de extremo 5’) de una o ambas hebras. Preferiblemente, el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende un nucleótido fosforotioado en el extremo 5’ (o en la región de extremo 5’) de una hebra. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender un nucleótido fosforotioado en el extremo 5’ (o en la región de extremo 5’) de una hebra. Como la mayoría de las exonucleasas, por ejemplo, la exonucleasa III, eliminan los nucleótidos desde el extremo 3’ de la cadena de polinucleótidos, el producto de ADN lineal puede comprender un nucleótido protegido en el extremo 3’ (o en la región de extremo 3’) de una hebra. Preferiblemente, el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende un nucleótido fosforotioado en el extremo 3’ (o la región de extremo 3’) de una hebra. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender al menos un nucleótido fosforotioado en el extremo 3’ (o la región de extremo 3’) y al menos un nucleótido fosforotioado en el extremo 5’ (o la región de extremo 5’) de una hebra. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender al menos un nucleótido fosforotioado en el extremo 3’ (o la región de extremo 3’) de la hebra con sentido y el extremo 5’ (o la región de extremo 5’) si la hebra antisentido. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender al menos un nucleótido fosforotioado en el extremo 5’ (o la región de extremo 5’) de la hebra con sentido y el extremo 3’ (o la región de extremo 3’) si la hebra antisentido. Por lo tanto, ambas hebras sentido y antisentido en el producto de ADN lineal parcialmente cerrado de hebra doble se puede proteger de la digestión con nucleasa al utilizar nucleótidos resistentes a nucleasa en un extremo del producto de ADN lineal parcialmente cerrado.
Una de las moléculas adaptadoras se utiliza en los métodos descritos en el presente documento puede comprender un elemento autocomplementario que crea un bucle, tal como un bucle de horquilla o un bucle de tallo. Por lo tanto, la una de las moléculas adaptadoras puede comprender una horquilla o un bucle de tallo. La molécula adaptadora puede comprender una porción de doble hebra que comprende una hebra con sentido y una hebra antisentido, en la que la hebra con sentido y la hebra antisentido se ligan juntas en una horquilla de tal manera que la hebra con sentido se hibrida a la hebra antisentido. La porción de doble hebra de un adaptador puede comprender una saliente 3’ o una saliente 5’ de al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, o al menos 5 nucleótidos. Preferiblemente la saliente 3’ o la saliente 5’ tienen 4-8 nucleótidos. Cada extremo de la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra) puede comprender una saliente 3’ o 5’. Una porción de la molécula adaptadora (por ejemplo, la saliente) puede ser complementaria al primer extremo o el segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
El método descrito en el presente documento puede utilizar una primera molécula adaptadora que es una molécula de ácido nucleico lineal que comprende nucleótidos resistentes a nucleasa y una segunda molécula adaptadora que comprende bucle de horquilla o bucle de tallo, o cualquier otra estructura que sea capaz de cerrar un extremo de la molécula de ADN lineal para producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede ser un producto de ADN parcialmente cerrado covalentemente. Por lo tanto, en las realizaciones donde las moléculas adaptadoras comprenden un bucle (por ejemplo, una horquilla), la molécula adaptadora cierra un extremo de la región de doble hebra lineal que forma un producto de ADN parcialmente cerrado covalentemente.
La molécula adaptadora puede comprender una porción de hebra sencilla. La porción de hebra sencilla puede formar una horquilla o un bucle de tallo. La porción de hebra sencilla puede comprender menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 nucleótidos. Preferiblemente, la porción de hebra sencilla comprende 5 nucleótidos.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender adicionalmente una pluralidad de nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Por ejemplo, el producto de ADN lineal puede comprender al menos 2, al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, o al menos 500 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Preferiblemente, el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende al menos 2 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra.
Las posiciones internas pueden no estar ubicadas entre el segundo y el penúltimo nucleótido del producto de ADN lineal parcialmente cerrado. Las posiciones internas pueden ser cualesquier posiciones en las moléculas adaptadoras diferentes del último nucleótido en el extremo de cada hebra.
La región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender una pluralidad de nucleótidos fosforotioados en posiciones internas en cada hebra. Por ejemplo, la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender al menos 2, al menos 4, al menos 6, al menos 8, al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400, al menos 450, o al menos 500 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Preferiblemente, la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble) comprende al menos 2 nucleótidos protegidos (por ejemplo, nucleótidos fosforotioados) en posiciones internas en cada hebra. Las posiciones internas pueden no estar ubicadas entre el segundo y el penúltimo nucleótido de la región de doble hebra lineal (o porción lineal de la molécula de hebra doble).
Los nucleótidos resistentes a la digestión con exonucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) pueden ser nucleótidos fosforotioados de al menos un tipo. Por ejemplo, el al menos un tipo de nucleótidos fosforotioados es a-S-dATP (es decir, 2’-desoxiadenosina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dCTP (es decir, 2’-desoxicitidina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dGTP (es decir, 2’-desoxiguanosina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dTTP (es decir, 2’-desoxitimidina-5’-(a-tio)-trifosfato), a-S-dUTP (es decir, 2’-desoxiuridina-5’-(a-tio)-trifosfato), y/o uridina 2’, 3’-ciclofosforotioato.
Las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos dos tipos de nucleótidos fosforotioados. Por ejemplo, los al menos dos tipos de nucleótidos fosforotioados son: a-S-dATP y a-S-dCTP, a-S-dATP y a-S-dGTP, a-S-dATP y a-S-dTTP, a-S-dCTP y a-S-dGTP, a-S-dCTP y a-S-dTTP, o a-S-dGTP y a-S-dTTP.
Las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos tres tipos de nucleótidos fosforotioados. Por ejemplo, los al menos tres tipos de nucleótidos fosforotioados son:
(e) a-S-dATP, a-S-dCTP y a-S-dGTP;
(f) a-S-dATP, a-S-dCTP y a-S-dTTP;
(g) a-S-dATP, a-S-dGTP y a-S-dTTP; o
(h) a-S-dCTP, a-S-dGTP y a-S-dTTP.
Las moléculas adaptadoras pueden comprender al menos cuatro tipos de nucleótidos fosforotioados. Por ejemplo, los al menos cuatro tipos de nucleótidos protegidos son a-S-dATP, a-S-dCTP, a-S-dGTP y a-S-dTTP.
Los nucleótidos fosforotioados pueden ser Sp-isómeros, Rp-isómeros o una mezcla de ambos Sp- y Rp-isómeros.
Los nucleótidos resistentes a la digestión con exonucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) pueden ser nucleótidos MOE de al menos un tipo, o al menos dos, tres o cuatro tipos. Por ejemplo, los nucleótidos MOE pueden ser2’-O-metoxi-etil guanosina, 2’-O-metoxi-etil citidina, 2’-O-metoxi-etil adenosina, y/o 2’-O-metoxi-etil timidina.
El método puede comprender adicionalmente, antes de la etapa (a) (es decir, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa, la ligasa y la primera y segunda moléculas adaptadoras), una etapa de amplificar una molécula de molde de ADN para producir la molécula de ADN de doble hebra. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado, el método comprende:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
La etapa de amplificar se puede realizar mediante amplificación in vitro o in vivo. Preferiblemente, la etapa de amplificar se realiza mediante amplificación in vitro. Por ejemplo, la etapa de amplificar se puede realizar mediante amplificación por círculo rodante (RCA), método MALBAC, reacción de cadena de polimerasa tradicional (PCR), amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos (NASBA), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), amplificación dependiente de helicasa (HDA), amplificación de desplazamiento múltiple (MDA) y amplificación de polimerasa recombinasa (RPA). Preferiblemente, la etapa de amplificar se realiza mediante amplificación por círculo rodante. Por lo tanto, la invención proporciona un método para producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado, el método comprende:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra, en la que la molécula de molde de ADN se amplifica mediante amplificación por círculo rodante;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
La amplificación por círculo rodante se puede realizar sin ningún cebador, o en la presencia de un cebador o múltiples cebadores. Por ejemplo, el cebador puede ser un cebador sintético. Los cebadores pueden ser cebadores aleatorios. Amplificación por círculo rodante se puede realizar en la presencia de una primasa. La primasa puede ser TthPrimPol. Preferiblemente, si la amplificación por círculo rodante se realiza sin ningún cebador, se realiza en la presencia de una primasa, tal como TthPrimPol. Del mismo modo, si se utiliza un cebador durante la reacción de amplificación, no se utiliza una primasa. El producto de ADN de doble hebra se puede generar por la amplificación por círculo rodante in vitro bajo condiciones isotérmicas utilizando una polimerasa de ácido nucleico adecuada, tal como polimerasa de ADN Phi29.
En los métodos descritos en el presente documento, la molécula de molde de ADN puede comprender al menos una secuencia diana escindible. La secuencia diana escindible puede ser una secuencia diana de endonucleasa. Por lo tanto, la molécula de molde de ADN puede comprender al menos una secuencia diana de endonucleasa. Preferiblemente, la molécula de molde de ADN comprende al menos dos secuencias diana de endonucleasa. Las secuencias diana de endonucleasa pueden ser la misma o diferente. Preferiblemente, la al menos una secuencia diana de endonucleasa es una secuencia diana de endonucleasa de restricción. Diferentes secuencias diana de endonucleasa de restricción serían conocidas por el experto en la técnica. La secuencia diana escindible puede ser una secuencia diana de endonucleasa de restricción Tipo IIS. Por ejemplo, la secuencia diana de endonucleasa de restricción puede ser una secuencia diana BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, Bsrl, Bst6I, BstF5I, BstMAl, BstV1I, BstV2I, Bsul, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, Bvel, Csel, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, Faql, Faul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, HpyAV, Lgul, Lmnl, Lsp1109l, Lwel, Mboll, Mlyl, Mmel, Mnll, Mva1269l, NmeAIII, PaqCI, PciSI, Pctl, Plel, Ppsl, Psrl, Schl, SfaNI, Taqll, TspDTI y/o TspGWI. La al menos una secuencia escindible (por ejemplo, secuencia diana de endonucleasa) puede ser una secuencia escindible nativa (es decir, una secuencia escindible presente en la molécula de molde). Alternativamente, la al menos una secuencia escindible (por ejemplo, secuencia diana de endonucleasa) se puede introducir a la molécula de molde de ADN antes de la producción del producto de ADN lineal parcialmente cerrado.
La endonucleasa puede ser una endonucleasa de enzima de restricción. La endonucleasa puede ser una enzima de restricción Tipo IIS. La endonucleasa puede ser cualquier enzima que reconoce una secuencia de ADN y se escinde fuera de la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, la endonucleasa puede ser una enzima de restricción BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
La ligasa puede ser una ligasa de ADN, tal como una ligasa de ADN T4, ligasa de ADN T7, ligasa de ADN de mamífero I, III y IV; ligasa de ADN Taq, ligasa de ADN Tth, o ligasa de ADN de E. coli.
La molécula de molde de ADN utilizada en los métodos descritos en el presente documento puede ser de hebra sencilla o de hebra doble. Preferiblemente, la molécula de molde de ADN es de hebra doble. La molécula de molde de ADN puede ser una molécula de ADN circular natural. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede ser (i) un plásmido, (ii) un minicírculo, (iii) un cósmido, (iv) un cromosoma artificial bacteriano (BAC), o (v) una sonda de inversión molecular (MIP). La molécula de molde de ADN puede ser una molécula de ADN circular producida enzimáticamente. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede ser (i) una molécula de ADN circular obtenida de la reacción de recombinasa, preferiblemente reacción de recombinasa Cre, o (ii) una molécula de ADN circular obtenida de la reacción de ligasa, preferiblemente utilizando el ensamblaje Golden Gate. La molécula de molde de ADN puede ser una molécula de ADN lineal cerrada covalentemente producida enzimáticamente. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede ser (i) una molécula de ADN procesada con protelomerasa TelN; o (ii) una molécula de ADN generada por ligación de los extremos del ADN con un adaptador. La molécula de molde de ADN puede comprender un elemento que es de hebra doble y un elemento que es de hebra sencilla. Por ejemplo, la molécula de molde de ADN puede comprender un ADN de doble hebra y un bucle de horquilla de hebra sencilla.
La molécula de molde de ADN puede ser lineal. Si la molécula de molde de ADN es lineal, antes de la amplificación (por ejemplo, amplificación por círculo rodante), una molécula de molde de ADN se puede hacer circular para producir una molécula de molde de ADN adecuada para uso en los métodos descritos en el presente documento.
La molécula de molde de ADN puede comprender un casete. El casete puede ser un casete de expresión de mamífero. El casete puede comprender adicionalmente un promotor. El promotor puede ser un promotor de CMV. El casete puede comprender adicionalmente un potenciador. El casete puede comprender adicionalmente un gen indicador, tal como un gen indicador de eGFP o un gen indicador de luciferasa. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia homopolimérica. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia LoxP, preferiblemente dos secuencias LoxP. Si las dos secuencias LoxP se orientan en la misma dirección, la secuencia de ADN entre las dos secuencias LoxP se corta como un bucle circular de ADN. Si las dos secuencias LoxP se orientan en la dirección opuesta, se invierte la secuencia de ADN entre las dos secuencias LoxP. Por lo tanto, preferiblemente, las dos secuencias LoxP están en la misma orientación en la molécula de molde de ADN.
La molécula de molde de ADN puede comprender una secuencia homopolimérica en un extremo 5’ o un extremo 3’ o tanto un extremo 5’ como un extremo 3’. La secuencia homopolimérica se puede agregar a la molécula de molde de ADN antes de la circularización. La secuencia homopolimérica puede ser una secuencia poliA, poliC, poliG, o poliT. La secuencia homopolimérica puede tener entre 3-200 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para facilitar la purificación del producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 4-12 nucleótidos en longitud, o entre 5-10 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para mejorar la expresión de ARNm, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 10-200 nucleótidos en longitud, preferiblemente entre 80­ 150 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, o al menos 200 nucleótidos en longitud. Preferiblemente, la secuencia homopolimérica tiene al menos 100 nucleótidos en longitud. Más preferiblemente aún, la secuencia homopolimérica tiene al menos 120 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, la secuencia homopolimérica puede comprender una secuencia poliA de al menos 120 nucleótidos.
El método puede comprender adicionalmente, después de la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo, una etapa de purificación del producto de ADN lineal parcialmente cerrado.
El método puede comprender adicionalmente, después de la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo, una etapa de digestión con nucleasa. La digestión con nucleasa puede ser digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa I y/o exonucleasa III. La etapa de digestión con nucleasa puede tener lugar antes o después de la etapa de purificación. Esta etapa permite la eliminación de cualesquier moléculas de ADN de doble hebra y/o moléculas adaptadoras que no se han utilizado en el curso de la realización del método. Por lo tanto, el método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora; y
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa).
El método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(d) purificar el producto de ADN lineal cerrado; y
(e) incubar el producto purificado de la etapa (d) con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa).
El método puede comprender las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana escindible (por ejemplo, endonucleasa) para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(d) incubar el único volumen acuoso contiguo con una nucleasa (por ejemplo, exonucleasa); y
(e) purificar el producto de ADN lineal cerrado.
La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) con una nucleasa se puede realizar a una temperatura de 5-90 °C, 10-80 °C, 15-70 °C, 20-60 °C, 25-50 °C, 30-45 °C o 35-40 °C. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) con una nucleasa se puede realizar durante al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, o al menos 60 min. La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) se puede realizar en dos diferentes temperaturas. Por ejemplo, la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) se puede realizar a 15­ 40 °C durante 10-60 minutos seguida por una temperatura de 60-90 °C durante 10-30 min. La mayor temperatura normalmente inactiva la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). Por lo tanto, el método proporciona adicionalmente una etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). La etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo (o el producto purificado de la etapa (d)) se puede realizar a 37 °C durante 30 min y 80 °C durante 20 min. Preferiblemente, la etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa) se realiza a una temperatura de 70-80 °C. La etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa) se puede realizar durante al menos 1, al menos 5, al menos 10, al menos 20 o al menos 30 minutos. Preferiblemente, la etapa de inactivar la nucleasa (por ejemplo, exonucleasa) se realiza durante al menos 5 minutos.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una saliente. El extremo de la región de doble hebra lineal puede comprender una saliente 3’ o 5’. Una porción de la primera molécula adaptadora (por ejemplo, la saliente) puede ser complementaria al primer extremo de la región de doble hebra lineal. Una porción de la segunda molécula adaptadora puede ser complementaria al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
El primer extremo y el segundo extremo de la región de doble hebra lineal pueden ser resistentes a la digestión con nucleasa. Preferiblemente, el primer extremo y el segundo extremo de la región de doble hebra lineal son resistentes a la digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa III y/o digestión con exonucleasa I.
El producto de ADN lineal puede ser parcialmente de doble hebra y/o parcialmente de hebra sencilla. El producto de ADN lineal puede comprender una porción que es de hebra doble y una porción que es de hebra sencilla.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender un casete. El casete puede comprender una secuencia de codificación. La secuencia de codificación puede codificar un gen de interés, por ejemplo un gen que codifica una proteína. El casete puede comprender al menos una porción de un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor, una secuencia de codificación, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la traducción. El casete puede comprender adicionalmente secuencias que ayudan a la expresión de proteínas, tales como un elemento de traducción independiente del casquete. El casete puede comprender (o codificar) un molde de reparación (o molde de edición). La molde de reparación (o molde de edición) puede ser para uso en la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR-Cas (HDR). El casete puede codificar el ARN guía CRISPR. El casete puede ser un casete de expresión de mamífero. El promotor puede ser un promotor de CMV. El casete puede comprender adicionalmente un potenciador. El casete puede comprender adicionalmente un gen indicador, tal como un gen indicador de eGFP o un gen indicador de luciferasa. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia homopolimérica, tal como una secuencia poliA, poli C, poliT o poliG. La secuencia homopolimérica puede tener entre 3-200 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para facilitar la purificación del casete, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 4-12 nucleótidos en longitud, o entre 5-10 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para mejorar la expresión de ARNm, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 10-200 nucleótidos en longitud, preferiblemente entre 80-150 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, o al menos 200 nucleótidos en longitud. Preferiblemente, la secuencia homopolimérica tiene al menos 100 nucleótidos en longitud. Más preferiblemente aún, la secuencia homopolimérica tiene al menos 120 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, la secuencia homopolimérica puede comprender una secuencia poliA de al menos 120 nucleótidos.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender un separador. El separador puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, o al menos 200 pares base de largo. El separador puede mejorar la eficiencia de ligación de la primera y segunda moléculas adaptadoras a la región de doble hebra lineal. El separador puede mejorar los rendimientos de transfección de célula.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender una secuencia de repetición terminal invertida.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, el producto de ADN lineal parcialmente cerrado tiene al menos 50 pares base de largo.
La molécula de ADN de doble hebra puede ser circular o ramificada.
La molécula de ADN de doble hebra puede no comprender una molécula adaptadora. La molécula de ADN de doble hebra puede no comprender una horquilla, un bucle o una estructura de bucle de tallo.
La molécula de ADN de doble hebra puede comprender un casete. El casete puede comprender una secuencia de codificación. La secuencia de codificación puede codificar un gen de interés, por ejemplo un gen que codifica una proteína. El casete puede comprender al menos una porción de un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor y una secuencia de codificación. El casete puede comprender un promotor, una secuencia de codificación, un sitio de unión ribosomal y una secuencia de terminación de la traducción. El casete puede comprender adicionalmente secuencias que ayudan a la expresión de proteínas, tales como un elemento de traducción independiente del casquete. El casete puede comprender (o codificar) un molde de reparación (o molde de edición). La molde de reparación (o molde de edición) puede ser para uso en la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR-Cas (HDR). El casete puede codificar el ARN guía CRISPR. El casete puede ser un casete de expresión de mamífero. El promotor puede ser un promotor de CMV. El casete puede comprender adicionalmente un potenciador. El casete puede comprender adicionalmente un gen indicador, tal como un gen indicador de eGFP o un gen indicador de luciferasa. El casete puede comprender adicionalmente una secuencia homopolimérica, tal como una secuencia poliA, poli C, poliT o poliG. La secuencia homopolimérica puede tener entre 3-200 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para facilitar la purificación del casete, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 4-12 nucleótidos en longitud, o entre 5-10 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica se puede utilizar para mejorar la expresión de ARNm, en cuyo caso, la secuencia homopolimérica puede tener entre 10-200 nucleótidos en longitud, preferiblemente entre 80-150 nucleótidos en longitud. La secuencia homopolimérica puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 110, al menos 120, al menos 130, al menos 140, al menos 150, al menos 160, al menos 170, al menos 180, al menos 190, o al menos 200 nucleótidos en longitud. Preferiblemente, la secuencia homopolimérica tiene al menos 100 nucleótidos en longitud. Más preferiblemente aún, la secuencia homopolimérica tiene al menos 120 nucleótidos en longitud. Por ejemplo, la secuencia homopolimérica puede comprender una secuencia poliA de al menos 120 nucleótidos.
La molécula de ADN de doble hebra puede comprender un separador. El separador puede tener al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, o al menos 200 pares base de largo. El separador puede mejorar el rendimiento de la amplificación de la molécula de ADN de doble hebra. El separador puede mejorar la eficiencia de ligación de la primera y segunda moléculas adaptadoras a la región de doble hebra lineal. El separador puede mejorar los rendimientos de transfección de célula.
La molécula de ADN de doble hebra puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, la molécula de ADN de doble hebra tiene al menos 50 pares base de largo.
La molécula de ADN de doble hebra puede comprender una o más secuencias diana escindibles (por ejemplo, endonucleasa). La molécula de ADN de doble hebra puede comprender dos secuencias diana escindibles (por ejemplo, endonucleasa). La una o más secuencias diana de endonucleasa pueden ser secuencias diana de endonucleasa Tipo IIS. La una o más secuencias diana de endonucleasa pueden ser secuencias diana BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
La molécula de ADN de doble hebra puede ser un producto de amplificación. Preferiblemente, la amplificación es amplificación por círculo rodante.
La región de doble hebra lineal puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, la molécula de ADN de doble hebra tiene al menos 50 pares base de largo.
La región de doble hebra lineal puede comprender un grupo 3’-OH en el primer y/o segundo extremos. El grupo 3’-OH puede facilitar la ligación a la primera y/o segunda molécula(s) adaptadora(s) (que puede(n) comprender un fosfato 5’). La región de doble hebra lineal puede comprender un fosfato 5’ en el primer y/o segundo extremos. El fosfato 5’ puede facilitar la ligación a la primera y/o segunda molécula(s) adaptadora(s) (que puede(n) comprender un grupo 3’-OH).
La región de doble hebra lineal (por ejemplo, la porción lineal de la molécula de hebra doble) puede comprender una saliente. Por ejemplo, la región de doble hebra lineal puede comprender una saliente 5’ o una saliente 3’. La región de doble hebra lineal puede comprender un extremo romo o extremos romos. La región de doble hebra lineal puede comprender: una saliente 5’ y un extremo romo, dos salientes 5’, una saliente 3’ y un extremo romo, dos salientes 3’, o una saliente 5’ y una saliente 3’. La saliente puede tener al menos 3 nucleótidos (preferiblemente desde 4 hasta 8 nucleótidos). La saliente puede estar en la hebra con sentido o la hebra antisentido de la región de doble hebra lineal.
La porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra (por ejemplo, la porción lineal de la molécula de hebra doble) puede tener al menos 50, al menos 100, al menos 250, al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 pares base de largo. Preferiblemente, la molécula de ADN de doble hebra tiene al menos 50 pares base de largo.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora puede ser una molécula adaptadora sintética.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden no ser un plásmido o un vector de ADN.
La molécula adaptadora puede comprender una porción de doble hebra. La porción de doble hebra puede comprender menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, menos de 30, menos de 25, menos de 20, menos de 15, o menos de 10 pares base. La porción de doble hebra puede comprender al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, o al menos 15 pares base.
La molécula adaptadora puede comprender un fosfato 5’. El fosfato 5’ puede facilitar la ligación a la región de doble hebra lineal.
La primera molécula adaptadora puede comprender una porción que es complementaria al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora puede comprender una porción que es complementaria al segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La primera molécula adaptadora puede comprender una porción que se empareja al primer extremo de la región de doble hebra lineal. La segunda molécula adaptadora puede comprender una porción que se empareja al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una saliente. Por ejemplo, la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una saliente 5’ o una saliente 3’. La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender un extremo romo. La saliente puede tener al menos 3 nucleótidos (preferiblemente desde 4 hasta 6 nucleótidos). La saliente de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora puede ser complementaria al primer y/o segundo extremo de la región de doble hebra lineal. La saliente de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora se puede emparejar con el primer y/o segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora puede no comprender una secuencia diana de endonucleasa Tipo IIS. La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora puede no comprender secuencias diana Bbsl, Bsal, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, Acul, AjuI, Alol, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, Bael, BarI, BbvI, BccI, BceAl, Bcgl, BciVI, BcoDI, BfuAl, BfuI, Bmrl, BmsI, BmuI, Bpil, Bμml, BpuEl, BsaXI, BselI, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, Bsgl, BsIFI, BsmAl, BsmFI, Bsml, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, Bsrl, Bst6I, BstF5I, BstMAl, BstV1I, BstV2I, Bsul, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, Bvel, Csel, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, Faql, Faul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, HpyAV, LguI, Lmnl, Lsp1109l, Lwel, Mboll, Mlyl, Mmel, Mnll, Mva1269l, NmeAIII, PaqCI, PciSI, Pctl, Piel, Ppsl, Psrl, Schl, SfaNI, Taqll, TspDTI y/o TspGWI Saμl.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una porción funcional. La porción funcional puede ser una molécula de unión, una secuencia de direccionamiento, o una sonda.
La porción funcional puede ser una sonda. Como se utiliza en el presente documento, el término "sonda” se refiere a un fragmento de ADN, ARN o quimera ADN/ARN de longitud variable (por ejemplo, 3-1000 bases de largo), que se utiliza para detectar la presencia de secuencias de nucleótidos diana que son complementarias a la secuencia en la sonda. Normalmente, la sonda se hibrida con un ácido nucleico de hebra sencilla cuya secuencia de bases permite el emparejamiento de bases de sonda-diana debido a la complementariedad entre la sonda y la diana. Por lo tanto, la porción funcional puede ser una secuencia de ADN, una secuencia de ARN o una secuencia de quimera ADN/ARN. Como se utiliza en el presente documento, el término "complementario” se refiere al emparejamiento de secuencias de nucleótidos de acuerdo con las reglas de emparejamiento Watson/Crick. Por ejemplo, una secuencia 5'-GCGGTCCCA-3' tiene la secuencia complementaria de 5'-TGGGACCGC-3'. Una secuencia de complemento también puede ser una secuencia de ARN complementaria a la secuencia de ADN.
La porción funcional puede ser una molécula de unión. El término "molécula de unión” se refiere a cualquier molécula capaz de unirse al producto de ADN lineal descrito en el presente documento y/o que es capaz de unirse a una molécula adicional o diana. La molécula de unión puede ser una proteína, un polipéptido, o un péptido. La molécula de unión puede ser un anticuerpo, tal como un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. La molécula de unión puede ser un fragmento de anticuerpo.
La porción funcional puede facilitar la detección del producto de ADN al unirse para capturar moléculas (por ejemplo, anticuerpos de captura unidos por interacciones de proteínaproteína). La porción funcional se puede unir a una diana de célula, por ejemplo, un receptor celular.
La porción funcional puede ser un marcador. El ‘marcador’ puede ser cualquier entidad química que permita la detección de la molécula de ácido nucleico de doble hebra por medios físicos, químicos y/o biológicos. El marcador puede ser un cromóforo, un fluoróforo y/o una molécula radioactiva.
La porción funcional puede ser una secuencia de direccionamiento. La secuencia de direccionamiento puede ser un fragmento de ADN o ARN de longitud variable, que se utiliza para dirigir el producto de ADN a una ubicación específica en una célula. La secuencia de direccionamiento se puede utilizar para aumentar la eficiencia de transfección del suministro de genes no virales en virtud de la importación nuclear mejorada del producto de ADN lineal parcialmente cerrado. Por ejemplo, la secuencia de direccionamiento puede ser una secuencia de direccionamiento nuclear de ADN (es decir, una secuencia de reconocimiento para proteínas endógenas de unión a ADN), tales como secuencia potenciadora de SV40 (preferiblemente en dirección descendente del casete).
Para facilitar la detección y/o cuantificación del producto de ADN, la porción funcional puede comprender un fluoróforo, un compuesto radioactivo o un código de barras.
Una señal que corresponde a la presencia, ausencia y/o nivel del producto de ADN lineal parcialmente cerrado se puede medir utilizando un código de barras. El código de barras puede comprender al menos una fracción de unión ligada a una porción con código de barras, en la que la porción con código de barras comprende al menos un nucleótido (es decir, en la que la porción con código de barras comprende una secuencia de nucleótidos de al menos un nucleótido en longitud), y en la que la fracción de unión es capaz de unirse a la saliente 3’, la saliente 5’ o el extremo romo del producto de ADN lineal parcialmente cerrado. La fracción de unión es capaz de unirse al extremo 3’ y/o 5’ del producto de ADN lineal parcialmente cerrado. La señal se puede medir al determinar la presencia, ausencia y/o nivel de la porción con código de barras del código de barras (por ejemplo, mediante secuenciación o PCR). La porción con código de barras puede comprender al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, o al menos 10 nucleótidos. El código de barras puede comprender al menos 2 fracciones de unión (por ejemplo, una primera fracción de unión y una segunda fracción de unión). Por ejemplo, la primera fracción de unión ligada a la primera porción con código de barras se puede unir al extremo 3’ del producto de ADN lineal parcialmente cerrado y/o la segunda fracción de unión ligada a la segunda porción con código de barras se puede unir al extremo 5’ del producto de ADN lineal parcialmente cerrado.
Una señal que corresponde a la presencia, ausencia y/o nivel del producto de ADN lineal parcialmente cerrado se puede medir utilizando un fluoróforo (es decir, una molécula marcada con fluorescencia), que se adhiere o une a la saliente 3’, la saliente 5’ o el extremo romo del producto de ADN lineal parcialmente cerrado. La señal se puede medir mediante citometría de flujo y/o clasificación celular activada por fluorescencia.
La porción funcional también puede facilitar la secuenciación del ADN. Por ejemplo, la porción funcional puede ser un adaptador de secuenciación. El término "adaptador de secuenciación” pretende abarcar uno o más dominios de ácido nucleico que incluyen al menos una porción de una secuencia de ácidos nucleicos (o complemento de la misma) utilizada por una plataforma de secuenciación de interés, tal como una plataforma de secuenciación proporcionada por Illumina® (por ejemplo, los sistemas de secuenciación HiSeq™, MiSeq™ y/o Genome Analyzer™), Oxford Nanopore™ Technologies (por ejemplo, el sistema de secuenciación MinlON), Ion Torrent™ (por ejemplo, los sistemas de secuenciación Ion PGMTM y/o Ion Proton™), Pacific Biosciences (por ejemplo, el sistema de secuenciación PACBIO RS II); Life Technologies™ (por ejemplo, un sistema de secuenciación SOLiD), Roche (por ejemplo, los sistemas de secuenciación 454 GS FLX+ y/o GS Junior), o cualesquier otras plataformas de secuenciación de interés.
Un ejemplo del método se proporciona con referencia a la Figura 17, que ilustra el flujo de trabajo para obtener el producto de ADN lineal parcialmente cerrado mediante digestión y ligación de moléculas adaptadoras en una única etapa, partiendo del ADN amplificado obtenido a través de la amplificación por círculo rodante de un molde de ADN circular a través de la acción de recombinasa Cre sobre sustratos que contienen dos secuencias LoxP que flanquean el ADN de interés en la misma dirección.
El método se describe adicionalmente con referencia a la Figura 18, que ilustra las secuencias que impulsan la ligación de moléculas adaptadoras después de digestión con BsaI de una molécula de ADN de doble hebra amplificada en cada ciclo del proceso. La digestión con BsaI produce extremos sobresalientes de 4-nucleótidos en 5’ (TCCC 5’ en dirección ascendente y TTTT 5’ en dirección descendente) en cada uno de los lados del casete de expresión. Las moléculas adaptadoras autocomplementarias (SEQ ID NO: 4 que contienen el extremo sobresaliente de 4-nucleótidos en 5’ (GGGA 5’) luego se liga al lado en dirección ascendente del casete de expresión. Los adaptadores en dirección descendente se forman mediante la hibridación de los oligonucleótidos complementarios (SEQ ID NOs: 13 y 14) que contienen enlaces internucleotídicos de fosforotioato (marcados como asteriscos) y que forman un extremo sobresaliente de 4 nucleótidos en 5’ (AAAA 5’). Las moléculas adaptadoras complementarias se ligan a cada lado del casete de expresión, lo que da como resultado un producto de ADN lineal parcialmente cerrado que tiene resistencia potenciada a la exonucleasa, dado que los enlaces internucleotídicos de fosforotioato en uno de los lados del casete de expresión evitan la degradación exonucleolítica del producto de ADN lineal parcialmente cerrado.
4. Métodos de transcripción y expresión de proteínas
La invención proporciona un método para transcripción in vitro de un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado), en el que el método comprende poner en contacto el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado), producido por los métodos descritos en el presente documento, con una polimerasa y producir un producto de transcripción codificado por el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado).
La invención proporciona un método para transcripción in vitro de un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado), en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado) mediante cualquiera de métodos descritos en el presente documento;
(b) poner en contacto el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado), con una polimerasa; y
(c) producir un producto de transcripción codificado por el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado).
La invención proporciona un método para transcripción in vitro de un producto de ADN lineal, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal; y
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal con una polimerasa; y
(d) producir un producto de transcripción codificado por el producto de ADN lineal.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que generan un producto de ADN lineal cerrado, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para transcripción in vitro de un producto de ADN lineal cerrado puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal cerrado con una polimerasa; y
(d) producir un producto de transcripción codificado por el producto de ADN lineal cerrado.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que comprenden nucleótidos protegidos, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para transcripción in vitro de un producto de ADN lineal puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos);
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal con una polimerasa; y
(d) producir un producto de transcripción codificado por el producto de ADN lineal.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que comprenden nucleótidos protegidos y moléculas adaptadoras que comprenden una horquilla o un bucle de tallo, tal como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para transcripción in vitro de un producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal parcialmente cerrado con una polimerasa; y
(d) producir un producto de transcripción codificado por el producto de ADN lineal parcialmente cerrado.
La invención proporciona un método para producir una proteína, en el que el método comprende introducir el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado o el producto de ADN lineal parcialmente cerrado), producido por los métodos descritos en el presente documento, en una célula (por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota) o un sistema de expresión libre de célula para generar una proteína codificada por el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado o el producto de ADN lineal parcialmente cerrado).
La invención proporciona un método para producir una proteína, en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado o producto de ADN lineal parcialmente cerrado) mediante cualquiera de métodos descritos en el presente documento; y
(b) introducir el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado o producto de ADN lineal parcialmente cerrado) en una célula (por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota) o un sistema de expresión libre de célula para generar una proteína codificada por el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado o producto de ADN lineal parcialmente cerrado).
La invención proporciona un método para producir una proteína que comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal; y
(c) introducir el producto de ADN lineal en una célula (por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota) o un sistema de expresión libre de célula para generar una proteína codificada por el producto de ADN lineal.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que generan un producto de ADN lineal cerrado, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para producir una proteína puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora; y
(c) introducir el producto de ADN lineal cerrado en una célula (por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota) o un sistema de expresión libre de célula para generar una proteína codificada por el producto de ADN lineal cerrado.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que comprenden nucleótidos protegidos, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para producir una proteína puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos); y
(c) introducir el producto de ADN lineal en una célula (por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota) o un sistema de expresión libre de célula para generar una proteína codificada por el producto de ADN lineal.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que generan un producto de ADN lineal parcialmente cerrado, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para producir una proteína puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora; y
(c) introducir el producto de ADN lineal parcialmente cerrado en una célula (por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota) o un sistema de expresión libre de célula para generar una proteína codificada por el producto de ADN lineal parcialmente cerrado.
El sistema de expresión libre de células puede originar a partir de (o se puede derivar de) una célula procariota o célula eucariota. Por ejemplo, el sistema de expresión libre de células se puede originar a partir de (o se puede derivar de) reticulocitos de conejo, germen de trigo o Eschenchia coli.
La célula puede ser una célula procariota o una célula eucariota. La célula puede ser una célula animal, tal como célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana), una célula fúngica, una célula de un microorganismo (por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota), o una célula vegetal. Preferiblemente, la célula es una célula humana.
El producto de ADN lineal o el producto de ADN lineal cerrado pueden comprender un casete. La proteína deseada se podría codificar por el casete.
La etapa de introducir el producto de ADN lineal en una célula se puede realizar in vivo o in vitro.
Los nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos) pueden ser cualesquier nucleótidos protegidos descritos en el presente documento.
5. Métodos para transfección celular y composiciones de transfección celular
La invención proporciona un método para transfección celular de un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado), producido mediante cualquiera de métodos descritos en el presente documento, en una célula.
La invención proporciona un método para transfección celular de un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado) en una célula, en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado) mediante cualquiera de métodos descritos en el presente documento;
(b) poner en contacto una célula con el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado); y
(c) transfectar el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado) en el citosol de la célula.
La invención proporciona un método para transfección celular de a ADN lineal en una célula, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal;
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal con la célula; y
(d) transfectar el producto de ADN lineal en el citosol de la célula.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que generan un producto de ADN lineal cerrado, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para transfección celular de un producto de ADN lineal cerrado en una célula puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; (b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal cerrado con la célula; y
(d) transfectar el producto de ADN lineal cerrado en el citosol de la célula.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que comprenden nucleótidos protegidos, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para transfección celular de un producto de ADN lineal en una célula puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos);
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal con la célula; y
(d) transfectar el producto de ADN lineal en el citosol de la célula.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que comprenden nucleótidos protegidos, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para transfección celular de un producto de ADN lineal parcialmente cerrado en una célula puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal parcialmente cerrado con la célula; y
(d) transfectar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado en el citosol de la célula.
La invención proporciona una composición de transfección celular que comprende un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) producido por (o que se puede obtener por) los métodos descritos en el presente documento.
La composición de transfección celular puede o puede no comprender un portador por ejemplo, un agente o una formulación. Preferiblemente, el portador promueve la acumulación del producto de ADN lineal en un sitio diana y/o protege el producto de ADN lineal de interacciones indeseables con componentes del medio biológico y/o protege el producto de ADN lineal del metabolismo y/o degradación.
La invención proporciona adicionalmente un método de transfección celular que comprende poner en contacto (in vitro) una célula que se va a transfectar con un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) producido por los métodos de la invención, y en los que el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se transfecta en el citosol de la célula.
La célula o células que se van a transfectar se pueden proporcionar en un medio de cultivo celular (por ejemplo, en una placa de Petri, un recipiente o pocillo de cultivo, etc.). El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede agregar directamente al medio de cultivo celular o las células se pueden agregar a una solución, tal como una solución salina, una solución tamponada o un medio de cultivo celular, que comprenda el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado).
El portador puede ser un portador viral o un portador no viral. Los portadores virales incluyen un vector lentiviral, un vector adenoviral, un vector retroviral o un vector viral adenoasociado para el suministro del producto de ADN lineal. Los portadores (o vectores) no virales incluyen la formación de complejos del producto de ADN lineal con un agente catiónico tal como un péptido catiónico de penetración celular (CPP); un componente catiónico de unión a ADN, tal como una cadena de polilisina; un polímero catiónico o dendrímero, por ejemplo, polietilenimina (PEI), poli-D,L-lactida-co-glicólido (PLGA) y un copolímero en bloque de PEG y polilisina, y/o un lípido catiónico (por ejemplo, lipofectamina).
El portador puede ser una molécula pequeña (por ejemplo, colesterol, ácido biliar y/o lípido), polímero, proteína (por ejemplo, un anticuerpo) y/o aptámero (por ejemplo, ARN) que se conjuga con el producto de ADN lineal. El portador puede ser una formulación de nanopartículas utilizada para encapsular el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado).
El portador puede ser una modificación del producto de ADN lineal con un ligando de direccionamiento (por ejemplo, un anticuerpo), un péptido, una molécula pequeña (por ejemplo, ácido fólico y/o biotina) o un polímero presente en la matriz extracelular (por ejemplo, ácido hialurónico y/o o sulfato de condroitina), o una modificación hidrófoba de la molécula de ácido nucleico de doble hebra (por ejemplo, utilizando colesterol y/o a-tocoferol).
La composición de transfección celular puede comprender o no un agente seleccionado de un agente fotosensibilizante y/o un iniciador de radicales, por ejemplo, un fotoiniciador. Preferiblemente, este agente mejora la función del producto de ADN lineal en un sitio diana y/o protege el producto de ADN lineal del metabolismo y/o degradación.
La invención proporciona adicionalmente una célula que se puede obtener por los métodos de la invención. Por lo tanto, la célula puede comprender un producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) producido por los métodos de la invención.
La invención proporciona adicionalmente una célula transfectada con un producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) producida por los métodos de la invención.
La célula puede ser una célula animal, tal como célula de mamífero (por ejemplo, una célula humana), una célula fúngica, una célula de un microorganismo (por ejemplo, una célula procariota o una célula eucariota), o una célula vegetal. Preferiblemente, la célula es una célula humana.
La etapa de poner en contacto la célula con un producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede realizar in vivo. Por ejemplo el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede administrar a un organismo (por ejemplo, un sujeto) en necesidad del mismo. El organismo (por ejemplo, el sujeto) puede ser un animal, tal como mamífero (por ejemplo, un humano), un hongo, un microorganismo, o una planta.
Todos o cualquiera de los productos de ADN lineal (por ejemplo, los productos de ADN lineal cerrado) descritos en el presente documento se pueden suministrar a una célula a través de partículas de suministro tales como liposomas, nanopartículas, exosomas, macrovesículas, vectores virales o no virales. Todos o cualquiera de los productos de ADN lineal (por ejemplo, los productos de ADN lineal cerrado) descritos en el presente documento se pueden suministrar a una célula utilizando una pistola de genes. Todos o cualquiera de los productos de ADN lineal (por ejemplo, los productos de ADN lineal cerrado) descritos en el presente documento se pueden suministrar a una célula mediante electroporación. Todos o cualquiera de los productos de ADN lineal (por ejemplo, los productos de ADN lineal cerrado) descritos en el presente documento se pueden suministrar a una célula por aguja hidrodinámica. Los productos de ADN lineal (por ejemplo, los productos de ADN lineal cerrado) descritos en el presente documento se pueden suministrar a una célula sin un portador.
La nanopartícula es preferiblemente una nanopartícula autoensamblada. La nanopartícula puede ser una nanopartícula que se produce mediante un proceso en el que los componentes preexistentes (por ejemplo, un componente lipídico, un producto de ADN descrito en el presente documento) forman una estructura organizada como consecuencia de interacciones locales específicas entre los propios componentes, sin dirección externa.
El producto de ADN y el componente lipídico pueden interactuar de forma reversible para formar una nanopartícula autoensamblada. El producto de ADN y el componente lipídico pueden interactuar de forma reversible en la nanopartícula autoensamblada a través de fuerzas intermoleculares. El producto de ADN y el componente lipídico pueden interactuar de forma reversible en la nanopartícula autoensamblada a través de interacciones no covalentes. El producto de ADN y el componente lipídico pueden interactuar de forma reversible en la nanopartícula autoensamblada a través de enlaces de hidrógeno, interacciones de van der Waals, hidrófobas y/o electrostáticas. El producto de ADN y el componente lipídico no se pueden conjugar ni ligar por fuerzas distintas de las fuerzas intermoleculares en la nanopartícula autoensamblada.
6. Composiciones farmacéuticas y métodos para producir composiciones farmacéuticas.
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) producido por (o que se puede obtener por) los métodos descritos en el presente documento, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona un método para producir una composición farmacéutica que comprende el producto de ADN lineal, en el que el método comprende realizar el método descrito en el presente documento y formular el producto de ADN lineal resultante con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona un método para producir una composición farmacéutica, en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) mediante cualquiera de métodos descritos en el presente documento;
(b) formular el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona un método para producir una composición farmacéutica, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar un producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal; y
(c) formular el producto de ADN lineal con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que generan un producto de ADN lineal cerrado, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para producir una composición farmacéutica puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar un producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora; y
(c) formular el producto de ADN lineal cerrado con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que comprenden nucleótidos protegidos, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para producir una composición farmacéutica puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa (es decir, nucleótidos protegidos);
(c) formular el producto de ADN lineal con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
El método puede utilizar moléculas adaptadoras que generan un producto de ADN lineal parcialmente cerrado, tales como las moléculas adaptadoras descritas en el presente documento. Un método para producir una composición farmacéutica puede comprender:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora; y
(c) formular el producto de ADN lineal parcialmente cerrado con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
La composición farmacéutica se puede formular como píldoras, comprimidos o cápsulas combinadas con uno o más portadores sólidos farmacéuticamente aceptables o como una solución en uno o más solventes farmacéuticamente aceptables, o como una emulsión, suspensión o dispersión en uno o más solventes o portadores farmacéuticamente aceptables. La formulación también puede incluir otros excipientes farmacéuticamente aceptables tales como estabilizantes, antioxidantes, aglutinantes, agentes colorantes o agentes emulsionantes o modificadores del sabor y formulaciones de liberación prolongada.
La composición farmacéutica se puede administrar por vía oral, tópica, parenteral o transdérmica o por inhalación. La composición farmacéutica se puede administrar por inyección o infusión intravenosa utilizando soluciones estériles adecuadas. Las formas de dosificación tópicas pueden ser cremas, ungüentos, parches o vehículos similares adecuados para formas de dosificación transdérmicas y tópicas.
La composición farmacéutica se puede disolver o suspender en un vehículo líquido o formular como un gránulo (una pequeña partícula o grano), una miniesfera (una pequeña masa sólida estéril que consiste en una composición altamente purificada, con o sin excipientes, hecha por la formación de gránulos, o por compresión y moldeo), o una miniesfera de liberación prolongada recubierta (una forma de dosificación sólida en la que la composición en sí está en forma de gránulos a los que se han aplicado cantidades variables de recubrimiento, y que libera la composición de tal manera para permitir una reducción en la frecuencia de dosificación en comparación con la composición presentada como una forma de dosificación convencional).
Otras formas de composiciones farmacéuticas incluyen píldoras (una forma de dosificación sólida pequeña y redonda que contiene la composición destinada a la administración oral), polvo (una mezcla íntima de una composición seca finamente dividida con uno o más aditivos farmacéuticamente aceptables que pueden estar destinados a uso interno o externo), elixir (líquido hidroalcohólico transparente, de sabor agradable, edulcorado que contiene una composición disuelta; que está destinado para uso oral), chicle (una materia plástica insoluble edulcorada y aromatizada de diversas formas que, al masticarla, libera la composición en la cavidad bucal), jarabe (una solución oral que contiene la composición y altas concentraciones de sacarosa u otros azúcares; el término también se ha utilizado para incluir cualquier otra forma de dosificación líquida preparada en un vehículo dulce y viscoso, que incluye las suspensiones orales), comprimido (una forma de dosificación sólida que contiene la composición con o sin diluyentes adecuados), comprimido masticable (una forma de dosificación sólida que contiene la composición con o sin diluyentes adecuados que está destinada a ser masticada, que produce un residuo de sabor agradable en la cavidad oral que se traga fácilmente y no deja gusto amargo o desagradable), comprimido recubierto o comprimido de liberación retardada, comprimido dispersable, comprimido efervescente, comprimido de liberación prolongada, comprimido recubierto con película o comprimido recubierto con película de liberación prolongada donde el comprimido está formulado de tal manera que la composición contenida disponible durante un período prolongado de tiempo después de la ingestión.
En otras formas de composiciones farmacéuticas, se puede proporcionar un comprimido para solución, comprimido para suspensión, comprimido multicapa, comprimido multicapa de liberación prolongada, donde el comprimido se formula de tal manera que permita al menos una reducción en la frecuencia de dosificación en comparación con esa composición presentada como una forma de dosificación convencional. También son adecuados un comprimido que se desintegra por vía oral, un comprimido que se desintegra por vía oral de liberación retardada, un comprimido soluble, un comprimido recubierto de azúcar, osmótico y similares.
La composición farmacéutica en forma de dosificación oral puede contener, además de la composición, uno o más ingredientes farmacéuticos inactivos tales como diluyentes, solubilizantes, alcoholes, aglutinantes, polímeros de liberación controlada, polímeros entéricos, desintegrantes, excipientes, colorantes, saborizantes, edulcorantes, antioxidantes, conservantes, pigmentos, aditivos, cargas, agentes de suspensión, tensioactivos (por ejemplo, aniónicos, catiónicos, anfóteros y no iónicos) y similares. Varios ingredientes tópicos inactivos aprobados por la FDA se encuentran en la "Base de datos de ingredientes inactivos” de la FDA que contiene ingredientes inactivos específicamente destinados como tales por el fabricante.
Como se utiliza en el presente documento, las formas de dosificación inyectables y de infusión incluyen, pero no se limitan a, un inyectable liposomal, que consiste o forma liposomas (una vesícula de bicapa lipídica usualmente compuesta de fosfolípidos que se utiliza para encapsular la composición); una inyección, que incluye una preparación estéril destinada para uso parenteral; una inyección de emulsión, que incluye una emulsión que consiste en una preparación estéril libre de pirógenos destinada a ser administrada por vía parenteral; o una inyección de complejo lipídico.
Por ejemplo, el producto de ADN lineal (por ejemplo, producto de ADN lineal cerrado) se puede administrar mediante inyección intratimpánica (por ejemplo, en el αdo medio) y/o inyecciones en el oído externo, medio y/o interno. Dichos métodos se utilizan rutinariamente en la técnica, por ejemplo, para la administración de esteroides y antibióticos en los αdos humanos. La inyección puede ser, por ejemplo, a través de la ventana redonda del oído o a través de la cápsula coquial.
Otras formas de composición farmacéutica incluyen un polvo para inyección de solución, que es una preparación estéril destinada a la reconstitución para formar una solución para uso parenteral; un polvo para suspensión inyectable que es una preparación estéril destinada a la reconstitución para formar una suspensión para uso parenteral; un polvo liofilizado para inyección de suspensión liposomal, que es una preparación liofilizada estéril destinada a la reconstitución para uso parenteral que se ha formulado de una manera que permitiría que los liposomas (una vesícula de bicapa lipídica generalmente compuesta de fosfolípidos que se utiliza para encapsular la composición, ya sea dentro de una bicapa lipídica o en un espacio acuoso) que se formará tras la reconstitución; o un polvo liofilizado para inyección de solución, en el que la liofilización ("secado por congelación”) es un proceso que implica la eliminación del agua de los productos en estado congelado a presiones extremadamente bajas.
Una inyección en suspensión comprende una preparación líquida, adecuada para inyección, que consiste en partículas sólidas dispersas a través de una fase líquida en la que las partículas no son solubles que también puede consistir en una fase oleosa dispersa a través de una fase acuosa, o viceversa. Una inyección de liposomas en suspensión comprende una preparación líquida, adecuada para inyección, que consiste en una fase oleosa dispersa a través de una fase acuosa de tal manera que se forman liposomas (una vesícula de bicapa lipídica usualmente compuesta por fosfolípidos que se utiliza para encapsular la composición, ya sea dentro de una bicapa lipídica o en un espacio acuoso). Una inyección sonicada en suspensión comprende una preparación líquida, adecuada para inyección, que consiste en partículas sólidas dispersas a través de una fase líquida en la que las partículas no son solubles. Además, el producto se somete a sonicación mientras se burbujea un gas a través de la suspensión, y esto da como resultado la formación de microesferas por las partículas sólidas.
En otro modo de administración, la composición farmacéutica se puede administrar in situ, a través de un catéter o una bomba. Un catéter o bomba puede, por ejemplo, dirigir la composición a la ubicación diana.
El sistema de portador parenteral puede incluir uno o más excipientes farmacéuticamente adecuados, tales como solventes y cosolventes, agentes solubilizantes, agentes humectantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, agentes emulsionantes, agentes quelantes, tampones, ajustadores de pH, antioxidantes, agentes reductores, conservantes antimicrobianos, agentes de carga, protectores, ajustadores de tonicidad y aditivos especiales. Las formulaciones adecuadas para administración parenteral comprenden convenientemente una preparación oleosa o acuosa estéril de la composición que es preferiblemente isotónica con la sangre del receptor pero esto no es esencial.
Como se utiliza en el presente documento, las formas de dosificación de inhalación incluyen, pero no se limitan a, un aerosol (un producto que se empaca bajo presión y contiene la composición que se libera tras la activación de un sistema de válvula adecuado destinado a la aplicación tópica en la piel, así como a la aplicación en la nariz (aerosoles nasales), boca (aerosoles linguales y sublinguales) o pulmones (aerosoles de inhalación)). Un aerosol de espuma es una forma de dosificación que contiene la composición, tensioactivos, líquidos acuosos o no acuosos y propulsores, por lo que si el propulsor está en la fase interna (discontinua) (es decir, del tipo de aceite en agua), se descarga una espuma estable, y si el propulsor está en la fase externa (continua) (es decir, del tipo agua en aceite), se descarga un pulverizador o una espuma de ruptura rápida. Un aerosol medido es una forma de dosificación presurizada que consiste en válvulas dosificadoras que permiten el suministro de una cantidad uniforme de pulverizador en cada activación. Un aerosol en polvo es un producto que se empaca a presión y contiene la composición, en forma de polvo que se libera tras la activación de un sistema de válvula adecuado. Un pulverizador de aerosol es un producto en aerosol que utiliza un gas comprimido como propulsor para proporcionar la fuerza necesaria para expulsar el producto como un pulverizador húmedo y que es aplicable a soluciones de la composición en solvente(s) acuoso(s).
Una forma de dosificación transdérmica puede incluir, pero no se limita a, un parche (un sistema de suministro de fármacos que a menudo contiene un respaldo adhesivo que generalmente se aplica en un sitio externo del cuerpo, en el que los ingredientes (que incluye la composición) se difunden pasivamente desde, o se transportan activamente desde, alguna porción del parche y, por lo cual dependiendo del parche, los ingredientes (que incluyen la composición) se suministran a la superficie exterior del cuerpo o al interior del cuerpo. En la técnica se conocen varios tipos de parches transdérmicos tales como matriz, reservorio y otros.
Una forma de dosificación tópica puede incluir varias formas de dosificación conocidas en la técnica, tales como lociones (en emulsión, una forma de dosificación líquida, por lo cual esta forma de dosificación es generalmente para aplicación externa a la piel), loción aumentada (una forma de dosificación de loción que potencia el suministro de la composición, por lo cual el aumento no se refiere a la fuerza de la composición en la forma de dosificación), geles (una forma de dosificación semisólida que contiene una composición gelificante para proporcionar rigidez a una solución o una dispersión coloidal, por lo cual el gel puede contener partículas suspendidas) y ungüentos ( una forma de dosificación semisólida, que usualmente contiene menos del 20 % de agua y volátiles y más del 50 % de hidrocarburos, ceras o polioles como vehículo, siendo esta forma de dosificación generalmente para aplicación externa en la piel o las membranas mucosas). Otras realizaciones incluyen ungüento potenciado (una forma de dosificación de ungüento que mejora la administración de la composición, por lo que el aumento no se refiere a la concentración de la composición en la forma de dosificación), cremas (una emulsión, forma de dosificación semisólida, que normalmente contiene más del 20 % de agua y compuestos volátiles y/o menos del 50 % de hidrocarburos, ceras o polioles también se pueden utilizar como vehículo, por lo cual esta forma de dosificación es generalmente para aplicación externa a la piel o las membranas mucosas) y crema aumentada (una forma de dosificación en crema que potencia el suministro de la composición, por lo cual el aumento no se refiere a la fuerza de la composición en la forma de dosificación). Como se utiliza en el presente documento, una "emulsión” se refiere a una forma de dosificación que consiste en un sistema de dos fases compuesto por al menos dos líquidos inmiscibles, uno de los cuales está disperso en forma de gotitas, fase interna o dispersa, dentro del otro líquido, fase externa o continua, generalmente estabilizado con uno o más agentes emulsionantes, por lo que la emulsión se utiliza como un término de forma de dosificación a menos que se aplique un término más específico (por ejemplo, crema, loción, ungüento). Realizaciones adicionales incluyen suspensiones (una forma de dosificación líquida que contiene partículas sólidas dispersadas en un vehículo líquido), suspensión de liberación prolongada, pastas (una forma de dosificación semisólida que contiene una gran proporción, 20-50 %, de sólidos finamente dispersos en un vehículo graso, por lo cual de esta forma de dosificación es generalmente para aplicación externa a la piel o membranas mucosas), soluciones (una forma de dosificación líquida transparente y homogénea que contiene una o más sustancias químicas disueltas en un solvente o mezcla de solventes mutuamente miscibles) y polvos.
La composición en forma de dosificación tópica contiene la composición y uno o más ingredientes farmacéuticos inactivos, tales como excipientes, colorantes, pigmentos, aditivos, rellenos, emolientes, tensioactivos (por ejemplo, aniónicos, catiónicos, anfóteros y no iónicos), potenciadores de la penetración (por ejemplo, alcoholes, grasas alcoholes, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos y polioles), y similares. Varios ingredientes tópicos inactivos aprobados por la FDA se encuentran en la "Base de Datos de Ingredientes Inactivos” de la FDA que contiene ingredientes inactivos específicamente destinados como tales por el fabricante.
7. Productos de ADN lineal
La invención proporciona un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) como se describe en el presente documento.
La invención proporciona un producto de ADN lineal cerrado que comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de una molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por una primera molécula adaptadora y se cierra en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
La invención proporciona un producto de ADN lineal cerrado que comprende una porción lineal de una molécula de ADN de doble hebra, en la que la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra se cierra en un primer extremo por una primera molécula adaptadora y se cierra en un segundo extremo por una segunda molécula adaptadora.
La invención proporciona un producto de ADN lineal que comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de una molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa.
La invención proporciona un producto de ADN lineal que comprende una porción lineal de una molécula de ADN de doble hebra, en la que una primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa.
La invención proporciona un producto de ADN lineal parcialmente cerrado que comprende una porción lineal de una molécula de ADN de doble hebra, en la que una primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora. Por lo tanto, la invención proporciona un producto de ADN lineal parcialmente cerrado que se cierra (o se cierra covalentemente) en un segundo extremo y se abre en un primer extremo. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en la región de extremo abierto y/o en el primer extremo. La región de extremo abierto puede estar en el extremo 3’ o extremo 5’ de la molécula.
La región de extremo abierto se refiere a al menos 5, al menos 10, al menos 15, o al menos 20 pares base ubicados más cerca al extremo abierto del producto de ADN. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una hebra con sentido y/o antisentido. Por lo tanto, por ejemplo, uno o más nucleótidos de los 20 pares base ubicados más cerca al extremo abierto del producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede ser un nucleótido resistente a nucleasa. Preferiblemente, el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende al menos 5 nucleótidos resistentes a nucleasa en la región de extremo abierto.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender una porción de ADN de doble hebra que se cierra en un primer extremo y se abre en un segundo extremo. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender una porción de ADN de doble hebra que se cierra en un primer extremo por una porción de hebra sencilla (es decir, puede comprender una primera horquilla en el primer extremo) y se abre en un segundo extremo. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una región de extremo abierto adyacente al segundo extremo. La región de extremo abierto adyacente al segundo extremo puede estar en el extremo 3’ o extremo 5’ de la molécula. La región de extremo abierto adyacente al segundo extremo puede comprender al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, al menos 19, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, o al menos 50 nucleótidos ubicados en el segundo extremo del producto de ADN lineal parcialmente cerrado. Es decir que la región de extremo abierto adyacente al segundo extremo puede comprender cualquier nucleótido entre y que incluye el nucleótido de extremo del segundo extremo y un nucleótido en la ubicación 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 recuentos desde el nucleótido de extremo del segundo extremo.
La región de extremo abierto adyacente al segundo extremo puede comprender una hebra con sentido y una hebra antisentido. La región de extremo abierto adyacente al segundo extremo puede comprender uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en la hebra con sentido o la hebra antisentido. La región de extremo abierto adyacente al segundo extremo puede comprender uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en tanto la hebra con sentido como antisentido. La región de extremo abierto adyacente al segundo extremo puede comprender dos o más, tres o más, cuatro o más, o cinco o más nucleótidos resistentes a nucleasa en tanto la hebra con sentido como antisentido. Preferiblemente, la región de extremo abierto adyacente al segundo extremo comprende cinco nucleótidos resistentes a nucleasa en tanto la hebra con sentido como antisentido.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender un bucle de horquilla en el extremo 5’ o el extremo 3’. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender una primera molécula adaptadora en un primer extremo y una segunda molécula adaptadora en un segundo extremo. La primera molécula adaptadora puede comprender una horquilla y un segundo adaptador puede comprender uno o más nucleótidos protegidos (es decir, nucleótidos resistentes a la digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasa)). La horquilla puede conferir resistencia a la digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). La presencia de nucleótidos protegidos puede conferir resistencia a la digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasa). El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede ser una molécula de ADN que tiene una porción de doble hebra cerrada en un primer extremo mediante ligación de un primer adaptador (por ejemplo, adaptador de horquilla) al primer extremo y comprende en un segundo extremo un adaptador lineal de doble hebra que comprende nucleótidos protegidos (es decir, nucleótidos resistentes a la digestión con nucleasa (por ejemplo, exonucleasa)).
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender (i) un casete, en el que el casete comprende una hebra con sentido y una hebra antisentido; y (ii) uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una región de extremo abierto del producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que la región de extremo abierto es 5’ de la hebra con sentido del casete. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender (i) un casete, en el que el casete comprende una hebra con sentido y una hebra antisentido; y (ii) uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una región de extremo abierto del producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que la región de extremo abierto es 5’ de la hebra antisentido del casete. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender (i) un casete, en el que el casete comprende una hebra con sentido y una hebra antisentido; y (ii) uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una región de extremo abierto del producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que la región de extremo abierto es 3’ de la hebra con sentido del casete. El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender (i) un casete, en el que el casete comprende una hebra con sentido y una hebra antisentido; y (ii) uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una región de extremo abierto del producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que la región de extremo abierto es 3’ de la hebra antisentido del casete.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender (i) un casete, en el que el casete comprende una hebra con sentido y una hebra antisentido; (ii) uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una región de extremo abierto del producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que la región de extremo abierto es 5’ de la hebra con sentido del casete; y (iii) uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una región de extremo abierto del producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que la región de extremo abierto es 3’ de la hebra antisentido del casete.
El producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender (i) un casete, en el que el casete comprende una hebra con sentido y una hebra antisentido; (ii) uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una región de extremo abierto del ADN lineal parcialmente cerrado, en el que la región de extremo abierto es 3’ de la hebra con sentido del casete; y (iii) uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa en una región de extremo abierto del producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que la región de extremo abierto es 5’ de la hebra antisentido del casete.
El producto de ADN lineal cerrado, producto de ADN lineal o producto de ADN lineal parcialmente cerrado puede comprender un casete, opcionalmente un único casete. La porción lineal de una molécula de ADN de doble hebra (de un producto de ADN lineal cerrado, producto de ADN lineal o producto de ADN lineal parcialmente cerrado) puede comprender un casete, opcionalmente un único casete. De acuerdo con lo anterior, el casete (o único casete) se ubica entre la primera y segunda moléculas adaptadoras.
El término "único casete” como se utiliza en el presente documento está destinado a abarcar una molécula que no comprende o consiste en una pluralidad de casetes. Es decir que el producto de ADN lineal cerrado, producto de ADN lineal, o producto de ADN lineal parcialmente cerrado, comprende solo un único casete, que puede comprender una única secuencia de codificación de un gen de interés. El único casete puede no comprender o consistir en una pluralidad de secuencias de repetición en tándem, y/o ADN concatemérico. El término "único casete” como se utiliza en el presente documento está destinado a abarcar una única copia de la secuencia de ADN de interés, por ejemplo, una única copia de la secuencia de codificación. Por lo tanto, el "único casete” puede no abarcar un casete que comprende o consiste en múltiples copias de la misma secuencia de ADN ligada en serie. El único casete puede comprender una colección de genes de interés. Por ejemplo, el único casete puede comprender la secuencia para al menos dos, tres, cuatro, o cinco genes de interés. Los genes de interés pueden no ser los mismos en un único casete.
La invención proporciona un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado) que se puede obtener mediante cualquiera de métodos descritos en el presente documento.
8. Usos y aplicaciones
La invención proporciona un uso de un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) como se describe en el presente documento en la producción de un sistema de suministro viral o no viral.
La invención proporciona un uso de un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) en la producción de un sistema de suministro viral o no viral, en el que el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se produce al realizar el método descrito en el presente documento.
La invención proporciona un sistema de suministro viral o no viral que comprende un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) como se describe en el presente documento. La invención proporciona un sistema de suministro viral o no viral que comprende un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado), en el que el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se produce al realizar el método descrito en el presente documento.
Vectores virales
Los métodos para producir vectores virales, tales como vectores AAV, son conocidos en la técnica. El método más utilizado implica la cotransfección de HEK293 por tres plásmidos bacterianos. El primer plásmido codifica los elementos Reps y Cap, el segundo plásmido es un plásmido auxiliar, mientras que el tercer plásmido codifica la carga útil genética de interés con repeticiones terminales invertidas (ITR). Existen varios problemas relacionados con el uso de plásmidos para la preparación viral (por ejemplo, AAV), a saber: 1) la producción de plásmidos requiere mucho tiempo y es costosa, 2) existe una dificultad en la propagación de secuencias ITR en E. coli; 3) la incorporación de la estructura principal del plásmido en la cápside viral (por ejemplo, la cápside de AAV) podría ser un desafío (por ejemplo, problemas con los marcadores de resistencia a los antibióticos). Los métodos para producir vectores virales pueden estar utilizando otras estirpes celulares. Por ejemplo, una estirpe celular adecuada para la producción de vectores virales puede ser una célula Vero o cualquier otra estirpe celular estable. Juntos, estos representan el principal cuello de botella en la producción de vectores virales (por ejemplo, producción de AAV). Por lo tanto, los métodos descritos en el presente documento proporcionan un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) adecuado para uso en la producción de vectores virales. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) supera los problemas anteriores con los vectores de plásmidos.
La invención proporciona un método de producir un vector viral, el método comprende introducir el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) producido por los métodos descritos en el presente documento en una célula bajo condiciones de tal manera que el vector viral se produce. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar al menos un elemento requerido para la producción del vector viral. Por ejemplo, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar los elementos Rep y/o Cap e. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar los elementos del plásmido auxiliar. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar los elementos Rep, Cap y del plásmido auxiliar. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar un transgén. El método puede ser un método in vivo o in vitro. La célula puede ser una célula animal, preferiblemente célula de mamífero, tal como célula humana (por ejemplo, HEK293T, HEK293, CAP, CAP-T, o CHO). La célula puede ser una célula cultivada in vitro en una estirpe celular de cultivo de tejidos.
Preferiblemente, el vector es un vector AAV o vector lentivirus.
La invención también proporciona un método para suministrar el vector viral (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) a una célula, que comprende poner en contacto el vector viral producido por los métodos descritos en el presente documento con la célula. La célula puede ser una célula animal, preferiblemente célula de mamífero, tal como célula humana.
La invención también proporciona una célula que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento.
Vectores no virales
Los métodos para producir vectores no virales son conocidos en la técnica. El uso de vectores no virales sobre los vectores virales tiene varias ventajas, que incluyen la oportunidad de repetir la dosificación debido a su falta de inmunogenicidad, una capacidad de empaquetamiento ilimitada y una baja toxicidad asociada. La mayoría de los métodos para producir vectores no virales utilizan ADN plasmídico. Por lo tanto, el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) producido por los métodos descritos en el presente documento es adecuado para uso en la producción de vectores no virales. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) producido por los métodos de la invención supera los problemas del uso de vectores plasmídicos en la preparación de vectores no virales. Por ejemplo, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado), a diferencia del ADN plasmídico, no comprende una estructura principal bacteriana, lo que permite más copias transgénicas por mg de ADN. Además, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) no comprende genes resistentes a antibióticos ni contaminantes bacterianos. Además, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) proporciona una expresión transgénica prolongada (debido a la presencia de nucleótidos resistentes a exonucleasa) y un proceso más rentable de producción de vectores no virales.
La invención proporciona un método para suministrar el vector no viral a una célula, que comprende poner en contacto el vector no viral que comprende el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) con la célula. La célula puede ser una célula animal, preferiblemente célula de mamífero, tal como célula humana.
La invención también proporciona una célula que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento.
Usos terapéuticos y diagnósticos generales.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) producido por los métodos descritos en el presente documento es particularmente adecuado para uso en terapia. La invención proporciona un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) como se describe en el presente documento para uso en terapia. La invención proporciona un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) se puede obtener mediante el método descrito en el presente documento para uso en terapia. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar una secuencia de una proteína terapéutica, una parte de una vacuna o un elemento de un mecanismo de ingeniería genética, que se utiliza para tratar una enfermedad o infección en un sujeto.
La invención proporciona adicionalmente el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) como se describe en el presente documento para uso como un medicamento. La invención proporciona adicionalmente el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento para uso como un medicamento. La invención también proporciona el uso de un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) como se describe en el presente documento para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad. La invención también proporciona el uso de un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar una secuencia de una proteína terapéutica, una parte de una vacuna, o un elemento de un mecanismo de ingeniería genética, que se utiliza para tratar una enfermedad o infección en un sujeto.
La invención proporciona adicionalmente el producto de ADN lineal producido por los métodos descritos en el presente documento para uso en tratar una enfermedad.
La invención también proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto que comprende administrar al sujeto un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento. La invención también proporciona un método para tratar una enfermedad en un sujeto que comprende administrar al sujeto el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento. Preferiblemente, la cantidad del producto de ADN lineal administrada al sujeto es una cantidad activa terapéutica.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento se puede utilizar para tratar cualquier enfermedad o trastorno. Por ejemplo, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede utilizar para tratar una o más enfermedades y/o trastornos seleccionados entre trastornos genéticos (por ejemplo, trastornos monogénicos), cáncer, VIH, otras infecciones virales (por ejemplo, infección causadas por coronavirus (por ejemplo, COVID-19), hepatitis A, hepatitis B, virus del herpes simple tipo 2, gripe, sarampión y/o virus respiratorio sincitial), enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Parkinson y/o enfermedades poliglutamínicas tales como enfermedad de Huntington), enfermedades oculares (por ejemplo, degeneración macular) e insuficiencia hepática. Preferiblemente, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se utiliza para tratar un trastorno genético. Aún más preferiblemente, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se utiliza para tratar un trastorno monogénico. Por ejemplo, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede utilizar para tratar la anemia de células falciformes, fibrosis quística, enfermedad de Huntington y Distrofia Muscular de Duchenne, hemofilia A, deficiencia de a1-antitripsina, la discinesia ciliar primaria o síndrome de dificultad respiratoria del prematuro.
Un sujeto tratado con el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) puede recibir el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) en forma de cualquiera de las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento.
Un sujeto tratado con el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) puede recibir el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) en combinación con otras formas de tratamiento para el trastorno en cuestión, que incluye el tratamiento con fármacos utilizados generalmente para el tratamiento del trastorno. Los fármacos se pueden administrar en una o varias unidades de dosificación. El experto en la técnica (por ejemplo, un médico) puede determinar un régimen de dosificación apropiado para el sujeto de acuerdo con las circunstancias específicas del sujeto.
Como se utiliza en el presente documento, “administrar” significa introducir el producto de ADN lineal en el cuerpo del sujeto como se describió con más detalle anteriormente (véase “Métodos para producir una composición farmacéutica”). Los ejemplos incluyen, entre otros, inyección oral, tópica, bucal, sublingual, pulmonar, transdérmica, transmucosa, así como inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa e intramuscular o en forma de dosis líquidas o sólidas a través del canal alimentario.
Como se utiliza en el presente documento, la frase "una cantidad terapéuticamente activa” significa una cantidad del producto de ADN lineal que, cuando se administra a un sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para efectuar dicho tratamiento de la enfermedad. Una "cantidad terapéuticamente activa” variará dependiendo, por ejemplo, de factores tales como el producto específico utilizado, la gravedad de la enfermedad del sujeto, la edad y la salud relativa del sujeto y la ruta y forma de administración. La determinación de la cantidad terapéuticamente activa relevante para un sujeto específico que se basa en dichos factores es una rutina para el experto en la técnica (por ejemplo, un médico tratante). Se debe entender que el tratamiento de una enfermedad como se describe en el presente documento significa una mejora en uno o más de los síntomas de una enfermedad.
La invención también proporciona el uso del producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) como se describe en el presente documento en un método para diagnosticar una enfermedad y/o un trastorno. La invención también proporciona el uso del producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento en un método para diagnosticar una enfermedad y/o un trastorno.
La invención proporciona el uso del producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) en el diagnóstico "in vitro” de una enfermedad. La invención proporciona el uso del producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento en el diagnóstico "in vitro” de una enfermedad.
La invención también proporciona el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) para uso en un método de diagnóstico "in vivo” de una enfermedad.
El método se puede utilizar para diagnosticar cualquier enfermedad y/o trastorno. Por ejemplo, las enfermedades y/o trastornos se pueden seleccionar de trastornos genéticos (por ejemplo, trastornos monogénicos), cáncer, VIH, otras infecciones virales (por ejemplo, infección causada por coronavirus (por ejemplo, COVID-19), hepatitis A, hepatitis B, virus del herpes simple tipo 2, gripe, sarampión y/o virus respiratorio sincitial), enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Parkinson y/o enfermedades poliglutamínicas tales como la enfermedad de Huntington), enfermedades oculares (por ejemplo, degeneración macular) e insuficiencia hepática. Preferiblemente, el producto de ADN lineal se utiliza para diagnosticar un trastorno genético. Aún más preferiblemente, el producto de ADN lineal se utiliza para diagnosticar un trastorno monogénico. Por ejemplo, el producto de ADN lineal se puede utilizar para diagnosticar anemia de células falciformes, fibrosis quística, enfermedad de Huntington y Distrofia Muscular de Duchenne, hemofilia A, deficiencia de a1-antitripsina, discinesia ciliar primaria o síndrome de dificultad respiratoria del prematuro.
Los métodos de diagnóstico y tratamiento descritos en el presente documento pueden ser métodos in vitro o métodos in vivo.
El método de diagnóstico se puede basar en la detección y/o cuantificación del producto de ADN lineal (por ejemplo, producto de ADN lineal cerrado).
Para facilitar la detección y/o cuantificación del producto de ADN lineal, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede adherir o unir a una porción funcional. La porción funcional puede ser cualquier porción funcional descrita en el presente documento. Por ejemplo la porción funcional puede ser una sonda. La porción funcional puede comprender un fluoróforo, un compuesto radioactivo o un código de barras. La porción funcional puede ser una proteína, por ejemplo, un anticuerpo.
El diagnóstico se puede basar en la detección de una señal que corresponde a la presencia, ausencia y/o nivel del producto de ADN lineal. Por ejemplo, la señal se puede medir mediante citometría de flujo y/o clasificación celular activada por fluorescencia de un producto de ADN lineal adherido a una sonda fluorescente.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede detectar al estar unido a una fracción de captura, por ejemplo, en un ensayo de flujo lateral. En este ejemplo, la porción funcional es una proteína, por ejemplo, un anticuerpo específico para la fracción de captura. La captura del anticuerpo adherido al producto de ADN lineal puede producir una señal visual (por ejemplo, una banda de un color diferente).
La invención también proporciona un método que combina el diagnóstico de una enfermedad con un tratamiento de la enfermedad.
Terapia celular
Los productos producidos por los métodos de la invención pueden estar sustancialmente menos contaminados que el ADN plasmídico. Además, los productos producidos por los métodos de la invención son de naturaleza muy simple (por ejemplo, sin estructura principal bacteriana), lo que significa que normalmente es fácil trabajar con ellos. La naturaleza pura y simple de los productos descritos en el presente documento los hace particularmente adecuados para uso en terapia celular. Por ejemplo, una célula que comprende el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede inyectar o trasplantar de otro modo a un paciente para provocar el efecto deseado. La célula (o células) pueden ser capaces de luchar contra las células cancerosas, por ejemplo, a través de la inmunidad mediada por células en el curso de la inmunoterapia. La célula (o células) se pueden injertar para regenerar tejidos enfermos.
La invención proporciona el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento para uso en la terapia celular. La invención proporciona el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento para uso en la terapia celular.
La invención proporciona el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento para uso en la terapia celular. La invención proporciona el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento para uso en la terapia celular.
Preferiblemente, la terapia celular es terapia celular ex-vivo. La célula puede ser una célula animal, preferiblemente célula de mamífero, tal como célula humana.
La invención también proporciona una célula que se puede obtener por cualesquier métodos descritos en el presente documento. Por ejemplo, la célula puede ser adecuada para uso en la terapia celular.
Vacunas
Los productos de ADN lineal (por ejemplo, los productos de ADN lineal cerrado) producidos por los métodos descritos en el presente documento son particularmente adecuados para uso en la producción de vacunas. Una vacuna puede comprender un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento. Una vacuna puede comprender un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento. Alternativamente, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede utilizar para producir una vacuna, preferiblemente una vacuna basada en ARNm. Por ejemplo, vacunas tales como las vacunas de ARNm BioNTech y Moderna contra COVID-19.
Por lo tanto, la invención proporciona el uso del producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento en la producción de una vacuna. La invención también proporciona el uso del producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento en la producción de una vacuna.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar un antígeno, que puede causar una respuesta inmunitaria en un sujeto. El sujeto puede ser humano. Preferiblemente, el antígeno se codifica sobre el casete.
Células CAR-T
La invención proporciona el uso de un producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento en la producción de una célula CAR-T. La invención proporciona el uso del producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento en la producción de una célula CAR-T.
La invención proporciona un método para producir una célula CAR-T diseñada genéticamente que comprende: (a) introducir el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento en una célula T; y (b) que expresa un gen de interés que es codificado por el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado). Preferiblemente, el gen de interés es un CAR específico del tumor.
La invención proporciona un método para producir una célula CAR-T diseñada genéticamente que comprende: (a) introducir el producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento en una célula T; y (b) que expresa un gen de interés que es codificado por el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado). Preferiblemente, el gen de interés es un CAR específico del tumor.
El método puede comprender además, antes de la etapa (a), una etapa de eliminar las células mononucleares de un paciente. Preferiblemente, la etapa de eliminación se realiza utilizando leucoféresis. Preferiblemente, las células mononucleares son células T. El método puede comprender adicionalmente, después de la etapa (b), una etapa de devolver las células manipuladas genéticamente al paciente.
La invención también proporciona una célula T diseñada por ingeniería que se puede obtener mediante cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. La célula T diseñada por ingeniería puede ser adecuada para uso en la terapia de células T con CAR.
Suministro CRISPR
Los productos producidos por los métodos descritos en el presente documento son particularmente adecuados para uso en el suministro de maquinaria CRISPR a las células, por ejemplo, en terapia celular o terapia in vivo.
Varias cargas diferentes y vehículos de suministro se utilizan comúnmente para el suministro de maquinaria CRISPR, que incluyen métodos de suministro físico (por ejemplo, microinyección, electroporación), métodos de suministro viral (por ejemplo, virus adenoasociados (AAV); adenovirus y lentivirus de tamaño completo) y métodos de no suministro viral (por ejemplo, liposomas, pólipos, partículas de oro).
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede comprender una secuencia génica que codifica cualquier componente de la maquinaria CRIPSR. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar todos los componentes de la maquinaria CRIPSR.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede comprender (o codificar) un molde de reparación (o molde de edición). La molde de reparación (o molde de edición) puede ser para editar genomas, por ejemplo, utilizar el sistema CRISPR-Cas. La molde de reparación (o molde de edición) puede comprender o consistir en una región de homología (por ejemplo, brazo de homología) que es homóloga a la región de ADN deseada (es decir, molécula diana). La molde de reparación (o molde de edición) puede ser para uso en la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR-Cas (HDR). La molde de reparación (o molde de edición) se puede utilizar para reparar la molécula diana que tiene una ruptura de hebra (por ejemplo, una ruptura de hebra sencilla o una ruptura de hebra doble). La ruptura de hebra se puede crear por una nucleasa del sistema CRISPR (por ejemplo, Cas9, Cpf1, o MAD7). La molde de reparación (o molde de edición) puede introducir al menos una mutación (por ejemplo, una inserción, supresión, y/o sustitución) en la región de ADN deseada (es decir, molécula diana). La molde de reparación (o molde de edición) puede tener al menos 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, o 10000 pares base de largo. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica el molde de reparación se puede suministrar a una célula por una nanopartícula, un vector no viral o un vector viral, o sin la ayuda de ningún portador. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica el molde de reparación se puede suministrar a una célula mediante electroporación. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica el molde de reparación se puede suministrar a una célula por aguja hidrodinámica.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede comprender (o comprender adicionalmente) una secuencia génica que codifica una proteína de nucleasa de un sistema CRISPR (por ejemplo, Cas9, Cpf1, o MAD7), y/o un ARN guía. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede comprender (o comprender adicionalmente) una secuencia génica que codifica una proteína de nucleasa de un sistema CRISPR (por ejemplo, Cas9, Cpf1, o MAD7). El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede comprender (o comprender adicionalmente) una secuencia génica que codifica un ARN guía. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede comprender (o comprender adicionalmente) una secuencia génica que codifica una proteína de nucleasa de un sistema CRISPR (por ejemplo, Cas9, Cpf1, o MAD7) y un ARN guía. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede comprender (o comprender adicionalmente) una secuencia génica que codifica una diana genómica que se va a modificar (por ejemplo, un separador). El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede ligar a un vector. El vector puede comprender una secuencia de algunos de los componentes del sistema CRIPSR. El vector puede comprender una secuencia de ARN guía o una secuencia de una parte del ARN guía. Si el vector comprende una secuencia de una parte del ARN guía, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede comprender la parte de la secuencia faltante del ARN guía, de tal manera que luego de la ligación, el vector ligado comprende una secuencia de un ARN guía completa. La nucleasa del sistema CRISPR y el ARN guía se puede codificar sobre un único vector o sobre dos vectores diferentes. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) puede codificar la nucleasa del sistema CRISPR y ARN guía. Un producto de ADN lineal (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado) puede codificar la nucleasa del sistema CRISPR, y el otro producto de ADN lineal (por ejemplo, el otro producto de ADN lineal cerrado) puede codificar ARN guía.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) se puede utilizar en la reparación mediada por CRISPR-Cas mediante recombinación, reparación dirigida por homología o unión de extremos no homólogos.
Si la nucleasa del sistema CRISPR y el ARN guía se codifican por un producto de ADN lineal diferente (por ejemplo, un producto de ADN lineal cerrado diferente), pueden ser parte de un mecanismo de suministro diferente o similar. Por ejemplo, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica la nucleasa del sistema CRISPR se puede suministrar a una célula en una primera nanopartícula, vector no viral o vector viral, mientras que el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica el ARN guía se puede suministrar a una célula por una segunda nanopartícula, un vector no viral, o vector viral. Por ejemplo, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica la nucleasa del sistema CRISPR y el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica el ARN guía se puede suministrar a una célula por la misma nanopartícula, vector no viral o vector viral.
Si la nucleasa del sistema CRISPR y el ARN guía se codifican por el mismo producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) (o por un vector que comprende el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado)) pueden ser parte del mismo mecanismo de suministro. Por ejemplo, el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado), o el vector, que codifica la nucleasa del sistema CRISPR y el ARN guía se puede suministrar a una célula por una nanopartícula, un vector no viral o un vector viral.
El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica la nucleasa del sistema CRISPR y el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica el ARN guía se puede suministrar a una célula mediante electroporación. El producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica la nucleasa del sistema CRISPR y el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que codifica el ARN guía se puede suministrar a una célula por aguja hidrodinámica.
Por lo tanto, la invención proporciona el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento para uso en sistema de suministro de CRISPR a una célula. La invención proporciona un método para suministrar el sistema CRISPR a una célula, que comprende poner en contacto el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) descrito en el presente documento con una célula. La invención también proporciona el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento para uso en el sistema de suministro de CRISPR a una célula. La invención proporciona un método para suministrar el sistema CRISPR a una célula, que comprende poner en contacto el producto de ADN lineal (por ejemplo, el producto de ADN lineal cerrado) que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento con una célula.
La célula puede ser una célula animal, preferiblemente célula de mamífero, tal como célula humana.
La invención también proporciona una célula que se puede obtener por los métodos descritos en el presente documento. La célula es particularmente adecuada para uso en la terapia celular y/o terapia in vivo.
El producto de ADN lineal producido por los métodos descritos en el presente documento se puede utilizar en la transcripción, para generar ARN, preferiblemente ARNm, in vitro o in vivo.
9. Kits
La invención proporciona un kit que comprende los componentes requeridos para llevar a cabo el método descrito en el presente documento. El kit comprende al menos:
(a) primera y segunda moléculas adaptadoras;
(b) una endonucleasa; y
(c) a ligasa.
El kit puede comprender adicionalmente a ADN polimerasa, al menos un tampón y/o una nucleasa.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender una secuencia de la SEQ ID NO: 1 o una porción de la misma. La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1. La primera y segunda moléculas adaptadoras pueden comprender una secuencia de ácidos nucleicos idéntica. La primera y segunda moléculas adaptadoras pueden comprender una secuencia de ácidos nucleicos diferente. La primera molécula adaptadora puede comprender uno o más nucleótidos protegidos y la segunda molécula adaptadora pueden comprender una horquilla o una región de bucle de tallo.
La primera y segunda molécula adaptadora se puede proporcionar en un kit juntas o por separado.
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender uno o más ácidos bloqueados (LNA).
La primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender uno o más nucleótidos protegidos (es decir, nucleótidos resistentes a nucleasa), tal como nucleótidos fosforotioados.
La endonucleasa puede ser una endonucleasa de enzima de restricción. La endonucleasa puede ser una enzima de restricción Tipo IIS. La endonucleasa puede ser cualquier enzima que reconoce una secuencia de ADN y se escinde fuera de la secuencia de reconocimiento. Por ejemplo, la endonucleasa puede ser una enzima de restricción Bbsl, Bsal, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, Acul, AjuI, Alol, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, Bael, BarI, Bbvl, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, BselI, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, Bsgl, BsIFI, BsmAl, BsmFI, Bsml, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, Bsrl, Bst6I, BstF5I, BstMAl, BstV1I, BstV2I, Bsul, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, Bvel, Csel, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, Faql, Faul, Fokl, Gsul, Hgal, Hphl, HpyAV, LguI, Lmnl, Lsp1109I, Lwel, MboII, Mlyl, Mmel, Mnll, Mva1269l, NmeAIII, PaqCI, PciSI, Pctl, Piel, Ppsl, Psrl, Schl, SfaNI, Taqll, TspDTI y/o TspGWI.
La ligasa puede ser una ligasa de ADN, tal como una ligasa de ADN T4, ligasa de ADN T7, ligasa de ADN de mamífero I, III y IV; ligasa de ADN Taq, ligasa de ADN Tth, o ligasa de ADN de E. coli.
La nucleasa puede ser una exonucleasa por ejemplo, exonucleasa I, exonucleasa III y/o exonucleasa VIII.
Cada aspecto o realización como se define en el presente documento se puede combinar con cualesquier otro(s) aspecto(s) o realización(es) a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa se puede combinar con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.
La descripción detallada anterior se ha proporcionado a modo de explicación e ilustración, y no pretende limitar el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Muchas variaciones en las realizaciones actualmente preferidas ilustradas en el presente documento serán evidentes para un experto con conocimientos básicos en la técnica, y permanecerán dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La FIG. 1 ilustra el flujo de trabajo para obtener el producto de ADN lineal cerrado mediante digestión y ligación de moléculas adaptadoras en una única etapa, partiendo del ADN amplificado obtenido a través de la amplificación por círculo rodante (RCA) de un molde de ADN circular a través de la acción de recombinasa Cre sobre sustratos que contienen dos secuencias LoxP (SEQ ID NO: 3) que flanquean el ADN de interés en la misma dirección.
La FIG. 2 ilustra las secuencias que impulsan la ligación de moléculas adaptadoras después de digestión con Bsal de una molécula de ADN de doble hebra amplificada en cada ciclo del proceso. La digestión con BsaI produce extremos sobresalientes de 4-nucleótidos en 5’ (TCCC 5’) en ambos extremos del casete de expresión. Las moléculas adaptadoras autocomplementarias (SEQ ID NO: 4 que contienen el extremo sobresaliente de 4-nucleótidos en 5’ (GGGA 5’) luego se liga a ambos extremos del casete de expresión, lo que da como resultado un producto de ADN lineal cerrado covalentemente.
La FIG. 3 ilustra el flujo de trabajo para obtener un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos mediante digestión y ligación de moléculas adaptadoras en una única etapa, partiendo de la molécula de ADN de doble hebra amplificada obtenida a través de la amplificación por círculo rodante (RCA) de un molde de ADN circular a través de la acción de recombinasa Cre sobre sustratos que contienen dos secuencias LoxP (SEQ ID NO: 3) que flanquean el ADN de interés en la misma dirección.
La FIG.4 ilustra las secuencias que impulsan la ligación de moléculas adaptadoras después de digestión con BsaI de una molécula de ADN de doble hebra amplificada en cada ciclo del proceso. La digestión con BsaI produce extremos sobresalientes de 4-nucleótidos en 5’ (TCCC 5’) en ambos extremos del casete de expresión. Se forman adaptadores mediante la hibridación de los oligonucleótidos complementarios (SEQ ID NO: 5 y 6) que contienen enlaces internucleotídicos de fosforotioato (marcados como asteriscos) y que forman un extremo sobresaliente de 4 nucleótidos en 5’ (GGGA 5’). Las moléculas adaptadoras se ligan en ambos extremos del casete de expresión, lo que da como resultado un producto de ADN lineal que tiene resistencia potenciada a la exonucleasa, dado que los enlaces internucleotídicos de fosforotioato en ambos lados y en ambas hembras del casete de expresión evitan la degradación exonucleolítica del producto de ADN lineal.
La FIG.5 ilustra los elementos de secuencia de tres construcciones (A, B y C). Los casetes de expresión de mamíferos se forman por el promotor CMV (SEQ ID NO: 7) y potenciador (SEQ ID NO: 8), gen informador eGFP (SEQ ID NO: 9) y señal poliA SV40 (SEQ ID NO: 10). Los casetes se flanquean por dos secuencias LoxP (SEQ ID NO: 3) que tienen la misma orientación y dos repeticiones terminales invertidas (ITR, SEQ ID NO: 11), requeridas para la replicación del virus adenoasociado (AAV) y la encapsidación del ADN en partículas virales. La diferencia entre los tres casetes es la ausencia (A) o presencia de secuencias de ADN (B: 20 pb; C: 100 pb) entre los sitios de restricción ITR y BsaI en ambos extremos del casete.
La FIG.6 ilustra la cuantificación de Picogreen de los rendimientos de amplificación de la Construcción A, la Construcción B y la Construcción C (véase FIG. 5), obtenidos a partir de moléculas de ADN circular derivadas de Cre.
La FIG.7 representa el análisis de los ADN amplificados (Construcción A y Construcción B, véase FIG. 5) durante el proceso de digestión y ligación de moléculas adaptadoras por electroforesis en gel de agarosa (0.8 %).
La FIG.8 resume los rendimientos de ligación obtenidos a partir de dos ensayos independientes para cada molécula de ADN (es decir, Construcción A, Construcción B y Construcción C, véase FIG. 5).
La FIG.9 muestra células HEK293 transfectadas con moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el gen informador eGFP (es decir, Construcción A y Construcción B, véase FIG. 5). Las células se transfectaron utilizando JetOptimus y la expresión de GFP se analizó 48 h después de transfección.
La FIG.10 muestra el análisis de citometría de flujo de células HEK293 transfectadas con moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el gen informador eGFP. Las células se transfectaron utilizando Lipofectamine 2000 y la expresión de GFP se analizó 48 h después de la transfección. La Figura 10a muestra un histograma y un gráfico de puntos de una muestra no transfectada representativa sin expresión de GFP. La Figura 10b muestra la expresión de GFP que surge de células transfectadas con moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el gen informador de eGFP con ITR (Construcción A). La Figura 10c muestra la expresión de GFP que surge de células transfectadas con moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el gen informador de eGFP con ITR separador de 20 pb (Construcción B).
La FIG.11 muestra la eficiencia de transfección de GFP y la mediana de la intensidad de fluorescencia de células en suspensión HEK293 transfectadas con moléculas de ADN cerradas covalentemente lineales (Construcción B) frente a construcciones de ADNp que codifican GFP, utilizando PeiPro. La expresión de GFP se midió por citometría de flujo 72 h después de la transfección.
La FIG.12 muestra el título del genoma viral de rAAV5 (VG/ml) de partículas de AAV producidas utilizando construcciones transgénicas de ADN cerradas covalentemente (Construcciones A-C), según lo medido por qPCR. Las células en suspensión HEK293 se transfectaron con construcciones transgénicas de ADN cerradas covalentemente lineales, junto con RepCap y ADNp auxiliar utilizando el reactivo de transfección PeiPro, y se recolectaron 72 h después de la transfección.
La FIG.13 muestra la relación Lleno:Vacío de partículas de AAV producidas con construcciones transgénicas de ADN cerradas covalentemente lineales (Construcciones A y B), en comparación con un control de ADNp (eje principal). La TCID50/ml (Dosis Infecciosa Media en Cultivo de Tejido) en células HeLaRC32 codosificadas con Ad5 se expresa en el eje secundario.
La FIG.14 resume la producción de moléculas de ADN lineal cerradas covalentemente que codifican el gen indicador de luciferasa (SEQ ID NO: 12).
La FIG.15 muestra la expresión de luciferasa en ratones hembra suizos de 6 semanas de edad. Los ratones recibieron una inyección intramuscular del producto de ADN lineal cerrado covalentemente (ADNlc) que codifica el transgén de Luciferasa, seguido de electroporación. En los días 1-15 posteriores a la inyección intramuscular, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de D-luciferina (150mg/kg en 100 ul de PBS) 10 minutos antes de la observación. Se observó bioluminiscencia óptica mediante el sistema IVIS Spectrum bajo anestesia con isoflurano.
La FIG. 16 ilustra las secuencias que impulsan la ligación de moléculas adaptadoras después de digestión con BsaI de una molécula de ADN de doble hebra amplificada en cada ciclo del proceso. La digestión con BsaI produce extremos sobresalientes de 4-nucleótidos en 5’ (TCCC 5’ en dirección ascendente y TTTT 5’ en dirección descendente) en cada lado del casete de expresión. Se forman los adaptadores en dirección ascendente mediante la hibridación de los oligonucleótidos complementarios (SEQ ID NOs: 22 y 23) que contienen enlaces internucleotídicos de fosforotioato (marcados como asteriscos) y que forman un extremo sobresaliente de 4 nucleótidos en 5’ (GGGA 5’). Los adaptadores en dirección descendente se forman mediante la hibridación de los oligonucleótidos complementarios (SEQ ID NOs: 13 y 14) que contienen enlaces internucleotídicos de fosforotioato (marcados como asteriscos) y que forman un extremo sobresaliente de 4 nucleótidos en 5’ (AAAA 5’).
Las moléculas adaptadoras complementarias se ligan a cada lado del casete de expresión, lo que da como resultado un producto de ADN lineal que tiene resistencia potenciada a la exonucleasa, dado que los enlaces internucleotídicos de fosforotioato en ambos lados y ambas hebras del casete de expresión evitan la degradación exonucleolítica del producto de ADN lineal.
La FIG. 17 ilustra el flujo de trabajo para obtener un producto de ADN parcialmente abierto lineal que comprende nucleótidos protegidos en un extremo mediante digestión y ligación de moléculas adaptadoras en una única etapa, partiendo de la molécula de ADN de doble hebra amplificada obtenida a través de la amplificación por círculo rodante (RCA) de un molde de ADN circular a través de la acción de recombinasa Cre sobre sustratos que contienen dos secuencias LoxP (SEQ ID NO: 3) que flanquean el ADN de interés en la misma dirección.
La FIG.18 ilustran las secuencias que impulsan la ligación de moléculas adaptadoras después de digestión con BsaI de una molécula de ADN de doble hebra amplificada en cada ciclo del proceso. La digestión con BsaI produce extremos sobresalientes de 4-nucleótidos en 5’ (TCCC 5’ en dirección ascendente y TTTT 5’ en dirección descendente) en cada lado del casete de expresión. Las moléculas adaptadoras autocomplementarias (SEQ ID NO: 4 que contienen el extremo sobresaliente de 4-nucleótidos en 5’ (GGGA 5’) luego se liga al lado en dirección ascendente del casete de expresión. Los adaptadores en dirección descendente se forman mediante la hibridación de los oligonucleótidos complementarios (SEQ ID NO: 13 y 14) que contienen enlaces internucleotídicos de fosforotioato (marcados como asteriscos) y que forman un extremo sobresaliente de 4 nucleótidos en 5’ (AAAA 5’). Las moléculas adaptadoras complementarias se ligan a cada lado del casete de expresión, lo que da como resultado un producto de ADN parcialmente abierto lineal que tiene resistencia potenciada a la exonucleasa, dado que los enlaces internucleotídicos de fosforotioato en uno de los lados del casete de expresión evitan la degradación exonucleolítica del producto de ADN lineal.
La FIG. 19 resume la producción de un producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) que codifican el gen indicador de luciferasa para IVT (SEQ ID NO: 24).
La FIG. 20 resume la producción de un producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) que codifican el gen GFP indicador para IVT (SEQ ID NO: 25).
La FIG. 21 resume la producción del producto de ADN lineal cerrado (ADNhp) y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) que codifican el gen indicador de luciferasa para la expresión de mamíferos (SEQ ID NO:12).
La FIG. 22 ilustra los rendimientos generados a partir del ARNm transcrito in vitro utilizando polimerasa de ARN T7 y diferentes productos de ADN descritos en el presente documento. ADNop- producto de ADN lineal parcialmente cerrado, ADNoe- producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos.
La FIG.23 ilustra muestras de ARNm transcritas in vitro de la FIG. 22 obtenidas mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % nativo.
La FIG.24 ilustra muestras de ARNm transcritas in vitro de la FIG. 21 obtenidas mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % desnaturalizante.
La FIG.25 ilustra los rendimientos generados a partir de ARNm transcrito in vitro utilizando polimerasa de ARN T7 y diferentes moldes de ADN como en la FIG. 22
La FIG.26 ilustra muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % nativo. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de moldes de ADN con diferentes extremos adaptados.
La FIG.27 ilustra muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % desnaturalizante. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de moldes de ADN con diferentes extremos adaptados.
La FIG.28 muestra la expresión de luciferasa en células HEK293 transfectadas con reactivo de transfección disponible comercialmente, Lipofectamine2000 que encapsula ARNm derivado del producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe).
La FIG.29 muestra la expresión de GFP en células HEK293 transfectadas con reactivo de transfección comercialmente disponible, Lipofectamine2000 que encapsula ARNm derivado del producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe).
La FIG.30 muestra la expresión de Luciferasa en células HEK293 transfectadas con reactivo de transfección comercialmente disponible, Lipofectamine2000 que encapsula ADN lineal cerrado (ADNhp) o producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) que codifican el gen informador de Luciferasa
Las secuencias discutidas en la solicitud se proporcionan en la tabla a continuación:
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Tabla 1. Secuencias discutidas en la solicitud.
CLÁUSULAS
1. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonudeico (ADN) lineal, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
2. El método de la cláusula 1, en el que la anexión se realiza mediante ligación y/o hibridación.
3. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
4. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y se cierra en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
5. El método de la cláusula 3 o cláusula 4, en el que la porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra se cierra en el primer extremo y el segundo extremo mediante ligación de la primera y segunda moléculas adaptadoras.
6. El método de una cualquiera de las cláusulas 3-5, en el que el primer extremo cerrado y el segundo extremo cerrado son resistentes a la digestión con nucleasa.
7. El método de la cláusula 6, en el que la digestión con nucleasa es digestión con exonucleasa, opcionalmente digestión con exonucleasa III y/o digestión con exonucleasa I.
8. El método de una cualquiera de las cláusulas 3-7, en el que el producto de ADN lineal cerrado es un producto de ADN lineal cerrado covalentemente.
9. El método de una cualquiera de las cláusulas 3-8, en el que el producto de ADN lineal cerrado es parcialmente de doble hebra y/o parcialmente de hebra sencilla.
10. El método de una cualquiera de las cláusulas 3-9, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende al menos 500, al menos 1000, al menos 2000, al menos 3000, al menos 4000, al menos 5000, al menos 6000, al menos 7000, al menos 8000, al menos 9000, al menos 10,000, al menos 11,000, al menos 12,000, al menos 13,000, al menos 14,000, o al menos 15,000 nucleótidos en longitud.
11. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-10, en el que la molécula de ADN de doble hebra es circular o ramificada.
12. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-11, en el que la molécula de ADN de doble hebra comprende un casete, opcionalmente en el que el casete comprende una secuencia de codificación.
13. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-12, en el que la molécula de ADN de doble hebra comprende un separador, opcionalmente en el que el separador tiene al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, o al menos 200 pares base de largo.
14. El método de una cualquiera de las cláusulas 3-13, en el que el producto de ADN cerrado comprende una secuencia homopolimérica, tal como una secuencia poliA, poli C, poliT o poliG.
15. El método de una cualquiera de las cláusulas 3-14, en el que el producto de ADN cerrado comprende una secuencia de repetición terminal invertida.
16. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-15, en el que la molécula de ADN de doble hebra comprende una o más secuencias diana de endonucleasa, opcionalmente en la que la una o más secuencias diana de endonucleasa son secuencias diana de endonucleasa Tipo IIS, tales como secuencias diana BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I, y/o SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
17. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-16, en el que la molécula de ADN de doble hebra es un producto de amplificación, opcionalmente amplificación por círculo rodante.
18. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-17, en el que la endonucleasa es una endonucleasa de enzima de restricción, opcionalmente en la que la endonucleasa es endonucleasa de enzima de restricción Tipo IIS, tal como endonucleasa de enzima de restricción BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
19. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-18, en el que la ligasa es una ligasa de ADN, opcionalmente en la que la ligasa de ADN es una ligasa de ADN T4, ligasa de ADN T7, ligasa de ADN de mamífero I, III y IV; ligasa de ADN Taq, ligasa de ADN Tth, o ligasa de ADN de E. coli.
20. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-19, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora es una molécula adaptadora sintética.
21. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-20, en el que la primera molécula adaptadora comprende una horquilla y/o la segunda molécula adaptadora comprende una horquilla.
22. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-21, en el que la primera molécula adaptadora es una molécula adaptadora de ácido nucleico.
23. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-22, en el que la segunda molécula adaptadora es una molécula adaptadora de ácido nucleico.
24. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-23, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una porción de hebra sencilla, opcionalmente en la que:
(a) la porción de hebra sencilla forma una horquilla;
(b) la porción de hebra sencilla comprende menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 nucleótidos; y/o
(c) la porción de hebra sencilla comprende 5 nucleótidos.
25. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-24, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una porción de doble hebra, opcionalmente en la que:
(a) la porción de doble hebra comprende menos de 50, 45, 40, 35, 30 pares base; y/o
(b) la porción de doble hebra comprende al menos 10, 11, 12, 13, 14, 15 pares base.
26. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-25, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden un fosfato 5’.
27. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-26, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una secuencia de la SEQ ID NO: 1.
28. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-26, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden al menos 13, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 17, al menos 18, o al menos 19 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 1.
29. El método de la cláusula 25, en el que la porción de doble hebra de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una secuencia de la SEQ ID NO: 2.
30. El método de la cláusula 25, en el que la porción de doble hebra de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 11, al menos 12, al menos 13, al menos 14 o al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 2.
31. El método de la cláusula 24, en el que la porción de hebra sencilla de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una secuencia de ACTCA.
32. El método de la cláusula 24, en el que la porción de hebra sencilla de la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora pueden comprender al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4 o al menos 5 nucleótidos contiguos de ACTCA.
33. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-32, en el que la primera y segunda moléculas adaptadoras son diferentes.
34. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-33, en el que la primera molécula adaptadora comprende una porción que es complementaria al primer extremo de la región de doble hebra lineal.
35. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-34, en el que la segunda molécula adaptadora comprende una porción que es complementaria al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
36. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-35, en el que la primera molécula adaptadora comprende una porción que se empareja al primer extremo de la región de doble hebra lineal.
37. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-37, en el que la segunda molécula adaptadora comprende una porción que se empareja al segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
38. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-37, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una saliente.
39. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-38, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una porción funcional, opcionalmente en la que la porción funcional es una molécula de unión, una secuencia de direccionamiento, o una sonda.
40. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-39, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una secuencia de localización nuclear.
41. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-40, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden un código de barras.
42. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-41, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden un fluoróforo.
43. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-42, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden un compuesto radioactivo.
44. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-43, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una porción que facilita la secuenciación, detección o cuantificación.
45. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-44, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una secuencia de repetición terminal invertida.
46. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-45, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden un aptámero.
47. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-46, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora confieren resistencia a la digestión con nucleasa, opcionalmente digestión con exonucleasa (por ejemplo, digestión con exonucleasa I y/o exonucleasa III).
48. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-47, en el que la primera y segunda moléculas adaptadoras se ligan a la región de doble hebra lineal.
49. El método de la cláusula 48, en el que la ligación es al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 15, al menos 20 %, al menos 25 %, al menos 30 %, al menos 35 %, al menos 40, al menos 45 %, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60, al menos 65, al menos 70 %, al menos 75, al menos 80 %, al menos 82 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % eficiente.
50. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-49, en el que la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo comprende incubar a una primera temperatura y luego incubar a una segunda temperatura; opcionalmente en la que:
(a) la primera temperatura es 1 °C-100 °C, 4 °C-70 °C, 10 °C-60 °C, 16 °C-55 °C, 20 °C-50 °C, 25 °C-45 °C, 30 °C-40 °C, o 35 °C-39 °C; y/o
(b) la segunda temperatura es 1 °C-100 °C, 4 °C-70 °C, 8 °C-60 °C, 10 °C-55 °C, 23 °C-50 °C, 14 °C-40 °C, 14 °C-30 °C, o 15 °C-18 °C.
51. El método de la cláusula 50, en el que la primera temperatura es 35°C-39°C y la segunda temperatura es 15 °C-18 °C.
52. El método de la cláusula 50 o 51, en el que la primera temperatura es 37 °C y la segunda temperatura es 16 °C.
53. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-52, en el que la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo comprende alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura, opcionalmente en la que la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo comprende alternar entre la primera temperatura y la segunda temperatura al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 45, al menos 50, al menos 55, al menos 60, al menos 65, al menos 70, al menos 80, al menos 90, o al menos 100 veces, preferiblemente al menos 20 veces.
54. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-52, en el que la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo comprende incubar a una temperatura constante.
55. El método de reivindicaciones 54, en el que la temperatura constante es aproximadamente 30 °C o aproximadamente 37 °C.
56. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-55, en el que el método comprende adicionalmente, antes de la etapa (a) (es decir, la etapa de poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con la endonucleasa, la ligasa y la primera y segunda moléculas adaptadoras), una etapa de amplificación de una molécula de molde de ADN para producir la molécula de ADN de doble hebra, opcionalmente en la que la amplificación es amplificación por círculo rodante.
57. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-56, en el que el método comprende adicionalmente, después de la etapa (b) (es decir, la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo), una etapa de purificación del producto de ADN lineal o producto de ADN lineal cerrado.
58. El método de una cualquiera de las cláusulas 1-57, en el que el método comprende adicionalmente, después de la etapa (b) (es decir, la etapa de incubar el único volumen acuoso contiguo), una etapa de digestión con nucleasa, opcionalmente en la que la digestión con nucleasa es digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa I y/o exonucleasa III.
59. El método de la cláusula 58, en el que la etapa de digestión con nucleasa tiene lugar antes de o después de la etapa de purificación
60. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa.
61. El método de la cláusula 60, en el que la etapa (a) comprende poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo.
62. El método de cláusulas 60 o 61, en el que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
63. El método de una cualquiera de las cláusulas 60-62, en el que el producto de ADN lineal es resistente a la digestión con nucleasa, opcionalmente en la que la digestión con nucleasa es digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa III y/o digestión con exonucleasa I.
64. El método de una cualquiera de las cláusulas 60-63, en el que los nucleótidos resistentes a nucleasa son nucleótidos fosforotioados.
65. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, el método comprende:
(a) amplificación por círculo rodante de una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana de endonucleasa para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
66. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) parcialmente cerrado, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se anexa a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se anexa a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
67. El método de la cláusula 66, en el que la etapa (a) comprende poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo.
68. El método de cláusulas 66 o 67, en el que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal.
69. El método de una cualquiera de las cláusulas 66-68, en el que el producto de ADN lineal es resistente a la digestión con nucleasa, opcionalmente en la que la digestión con nucleasa es digestión con exonucleasa, tal como digestión con exonucleasa III y/o digestión con exonucleasa I.
70. El método de una cualquiera de las cláusulas 66-69, en el que los nucleótidos resistentes a nucleasa son nucleótidos fosforotioados.
71. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) parcialmente cerrado, el método comprende:
(a) amplificación por círculo rodante de una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana de endonucleasa para generar una molécula de ADN de doble hebra;
(b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
71. Un método para transcripción in vitro de un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal cerrado con una polimerasa; y
(d) producir un producto de transcripción.
72. Un método para la expresión de proteína, el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar un producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora; y
(c) introducir el producto de ADN lineal cerrado en una célula procariota o una célula eucariota o un sistema de expresión de proteína libre de células para generar un ARN o proteína deseada.
73. Un método para transfección celular de un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado en una célula, el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo;
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora;
(c) poner en contacto el producto de ADN lineal cerrado con la célula; y
(d) transfectar el producto de ADN lineal cerrado en el citosol de la célula.
73. Un método para producir una composición farmacéutica que comprende el producto de ADN lineal cerrado, el método comprende realizar el método de una cualquiera de las cláusulas 3-59 y formular el producto de ADN lineal resultante cerrado con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
74. Un método para producir una composición farmacéutica que comprende el producto de ADN lineal, el método comprende realizar el método de una cualquiera de las cláusulas 60-64 y formular el producto de ADN lineal resultante con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
75. Un método para producir una composición farmacéutica que comprende el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, el método comprende realizar el método de una cualquiera de las cláusulas 66-71 y formular el producto de ADN lineal resultante con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
76. Uso de un producto de ADN lineal cerrado en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia, en el que la fabricación comprende realizar el método de una cualquiera de las cláusulas 3-59.
77. Uso de un producto de ADN lineal en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia, en el que la fabricación comprende realizar el método de una cualquiera de las cláusulas 60-64.
78. Uso de un producto de ADN lineal parcialmente cerrado en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia, en el que la fabricación comprende realizar el método de una cualquiera de las cláusulas 66-71.
79. Uso de un producto de ADN lineal cerrado en la producción de un sistema de suministro viral o no viral, en el que el producto de ADN lineal cerrado se produce al realizar el método de una cualquiera de las cláusulas 3-59.
80. Uso de un producto de ADN lineal en la producción de un sistema de suministro viral o no viral, en el que el producto de ADN lineal se produce al realizar el método de una cualquiera de las cláusulas 60-64.
81. Uso de un producto de ADN lineal parcialmente cerrado en la producción de un sistema de suministro viral o no viral, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado se produce al realizar el método de una cualquiera de las cláusulas 66-71.
82. Un producto de ADN lineal cerrado que se puede obtener mediante el método de una cualquiera de las cláusulas 3-59.
83. Un producto de ADN lineal que se puede obtener mediante el método de una cualquiera de las cláusulas 60-64.
84. Un producto de ADN lineal parcialmente cerrado que se puede obtener mediante el método de una cualquiera de las cláusulas 66-71.
85. Un producto de ADN lineal cerrado que se puede obtener mediante el método de una cualquiera de las cláusulas 3-59 para uso en terapia.
86. Un producto de ADN lineal que se puede obtener mediante el método de una cualquiera de las cláusulas 60-64 para uso en terapia.
87. Un producto de ADN lineal parcialmente cerrado que se puede obtener mediante el método de una cualquiera de las cláusulas 66-71 para uso en terapia.
88. Un kit que comprende:
(a) primera y segunda moléculas adaptadoras;
(b) una endonucleasa; y
(c) a ligasa.
89. Un kit que comprende:
(a) a primera molécula adaptadora;
(b) a segunda molécula adaptadora;
(c) una endonucleasa; y
(d) a ligasa.
90. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
91. El método de la reivindicación 90, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende un separador, opcionalmente en el que el separador tiene al menos una longitud de 20 pares base.
92. El método de la reivindicación 90 o 91, en el que la endonucleasa es una endonucleasa de restricción Tipo IIS, opcionalmente en la que la endonucleasa es endonucleasa de restricción BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
93. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 90-92, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora son moléculas adaptadoras de ácido nucleico.
94. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 90-93, en el que la primera molécula adaptadora comprende una horquilla y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una horquilla.
95. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 90-94, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una región de doble hebra con una saliente.
96. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 90-95, en el que el método comprende las etapas:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana de endonucleasa para generar la molécula de ADN de doble hebra, en la que la molécula de molde de ADN se amplifica mediante amplificación por círculo rodante; (b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora.
97. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal, en el que el método comprende:
(a) poner en contacto una molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(b) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa.
98. El método de la reivindicación 97, en el que el uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa son uno o más nucleótidos fosforotioados.
99. Un método para transcripción in vitro de un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, o un producto de ADN lineal, en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal cerrado de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 90-96, o producir un producto de ADN lineal de acuerdo con el método de la reivindicación 97 o reivindicación 98;
(b) poner en contacto el producto de ADN lineal cerrado, o el producto de ADN lineal, con una polimerasa; y
(c) producir un producto de transcripción codificado por el producto de ADN lineal cerrado, o el producto de ADN lineal.
100. Un método para producir una proteína, en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal cerrado de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 90-96, o producir un producto de ADN lineal de acuerdo con el método de la reivindicación 97 o reivindicación 98;
(b) introducir el producto de ADN lineal cerrado, o el producto de ADN lineal, en una célula o un sistema de expresión libre de célula para generar una proteína codificada por el producto de ADN lineal cerrado o el producto de ADN lineal.
101. Un método para transfección celular de un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, o un producto de ADN lineal, en una célula, en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal cerrado de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 90-96, o producir un producto de ADN lineal de acuerdo con el método de la reivindicación 97 o reivindicación 98;
(b) poner en contacto una célula con el producto de ADN lineal cerrado o el producto de ADN lineal; y
(c) transfectar el producto de ADN lineal cerrado, o el producto de ADN lineal, en el citosol de la célula.
102. El método de la reivindicación 101, en el que la transfección del producto de ADN lineal cerrado, o el producto de ADN lineal, en el citosol de la célula se realiza mediante electroporación.
103. Uso de un producto de ADN lineal cerrado, o un producto de ADN lineal, en la producción de un sistema de suministro viral o no viral, en el que el producto de ADN lineal cerrado se produce al realizar el método de una cualquiera de las reivindicaciones 90-96 y el producto de ADN lineal se produce mediante el método de la reivindicación 97 o reivindicación 98.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Amplificación de círculo rodante de ADN circular derivado de Cre
La recombinasa Cre del bacteriófago P1 es una topoisomerasa de Tipo I. La enzima cataliza la recombinación específica de sitio de ADN entre sitios loxP (SEQ ID NO: 3). El sitio de reconocimiento de LoxP (34 pb) consiste en dos repeticiones invertidas de 13 pb que flanquean una región separadora de 8 pb, que confiere direccionalidad. Los productos de la recombinación mediada por Cre dependen de la ubicación y la orientación relativa de los sitios loxP. Se fusionaron dos especies de ADN que contenían sitios loxP únicos. El ADN encontrado entre dos sitios loxP orientados en la misma dirección se cortó como un bucle circular de ADN, mientras que el ADN entre sitios loxP opuestos se invirtió con respecto a las secuencias externas. La recombinasa Cre no requiere cofactores adicionales o proteínas accesorias para su función.
Condiciones de reacción Cre: volumen de reacción 50 ^l, ADN de interés purificado a partir de electroforesis en gel de agarosa tras digestión con enzimas de restricción (100 ng), recombinasa Cre (NEB, 4 unidades), tiempo y temperatura de incubación: 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. A continuación, para eliminar las moléculas de ADN no circulares restantes antes de la etapa de amplificación, se agregaron exonucleasa I (NEB, 20 unidades) y III (NEB, 100 unidades) de E. coli y la reacción se incubó 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C.
La amplificación de círculo rodante (RCA) es un método de amplificación de ADN fiel e isotérmico basado en la polimerasa de ADN Phi29 (Phi29DNApol). Phi29DNApol es la enzima monomérica responsable de la replicación del ADN lineal de doble hebra del bacteriófago phi29 de Bacillus subtilis (Blanco and Salas, 1984). Es una polimerasa extremadamente procesiva (hasta más de 70 kb por evento de unión) con una fuerte capacidad de desplazamiento de hebra (Blanco et al, 1989). La enzima muestra actividad de exonucleasa correctora 3’->5’ (Garmendia et al, 1992), lo que da como resultado una altísima fidelidad de síntesis (Esteban et al, 1993). Estas características especiales hacen de esta enzima la elección perfecta para la amplificación de ADN isotérmica.
La RCA se puede iniciar mediante cebadores sintéticos aleatorios (Dean et al, 2001) o una primasa de ADN como TtfiPrimPol (Picher) et al, 2016) que sintetiza los cebadores para Phi29DNApol durante la reacción de amplificación.
Se muestran en la FIG. 6 los rendimientos de amplificación de la Construcción A, la Construcción B y la Construcción C (véase FIG. 5), obtenidos a partir de moléculas de ADN circular derivadas de Cre obtenidas siguiendo el procedimiento esquematizado en la FIG. 2.
Antes de la amplificación, las muestras de ADN circularizado se desnaturalizaron primero al agregar 1 volumen de tampón D (KOH 400 mM, EDTA 10 mM) e incubar 3 min a temperatura ambiente. A continuación, las muestras se neutralizaron añadiendo 1 volumen de tampón N (HCl 400 mM, Tris-HCl 600 mM, pH 7.5). Condiciones de amplificación de círculo rodante: 10 ml de volumen de reacción, 1 ml de tampón de reacción TruePrime WGA 10x (4basebio), 500 ^l de muestra de ADN desnaturalizado, 1 ml TtfiPrimPol (1 ^M), 160 ^l de QualiPhi Phi29DNApol (12.5 ^M), 2.5 unidades de PPase (Thermo) y 1 ml de dNTPs (10 mM). Tiempo y temperatura de incubación: 20 horas a 30 °C y 10 min a 65 °C.
Los ADN amplificados se incubaron con la enzima de restricción de tipo II Bsal, la ligasa de ADN T4 y los adaptadores complementarios a los extremos salientes 5’ generados por BsaI sobre el ADN amplificado. Condiciones de reacción de digestión y ligación: volumen de reacción 100 ^l, 10 ^l de tampón de reacción ligasa de ADN T4 10x (NEB), 3 ^g de ADN, 60 unidades BsaI-HFv2 (NEB), 2000 unidades de ligasa de ADN T4 (NEB), 480 ng de adaptador de ADN (exceso molar 1:20), tiempo y temperatura de incubación: 5 minutos a los 37 °C y 5 minutos a las 16 °C (60 ciclos). Condiciones de reacción de limpieza de exonucleasa: Luego se agrega 15 unidades de exonucleasa I de E. coli (NEB) y 75 unidades de exonucleasa III de E. coli (NEB) para eliminar los adaptadores restantes y abrir las moléculas de ADN. Tiempo y temperatura de incubación: 30 minutos a las 37 °C y 20 minutos a 80 °C.
Se muestra en la FIG. 7 el análisis de electroforesis en gel de agarosa de los ADN amplificados (carriles 1 y 7) digeridos con la enzima de restricción BsaI (carriles 2 y 8), liberando el tamaño unitario del casete de expresión (véase FIG. 5). Los ADN amplificados y los adaptadores son degradados por las exonucleasas I y III (carriles 3 y 9), así como los ADN amplificados digeridos con BsaI (carriles 4 y 10), ya que ninguno de ellos está cerrado covalentemente en ambos extremos para evitar la degradación por exonucleasas. La adición de ligasa de ADN T4 a la reacción (carriles 5 y 11) permitió la ligación de los adaptadores a ambos extremos de cada casete de expresión generado por digestión con BsaI. Finalmente, las exonucleasas I y III degradaron los ADN y adaptadores abiertos restantes, dando como resultado moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente (carriles 6 y 12) resistentes a la degradación exonucleolítica.
Los rendimientos de ligación obtenidos a partir de dos ensayos independientes para cada molécula de ADN se resumen en la Fig. 8.
Ejemplo 2
El producto de ADN lineal cerrado que codifica el gen informador eGFP con ITR, con y sin un separador de 20 pb, se transfectó en células HEK293. Las células se transfectaron utilizando JetOptimus y la expresión de GFP se analizó 48 h después de la transfección. La Figura 9 muestra imágenes de microscopía fluorescente y de campo claro de células que expresan la proteína GFP expresada a partir de las construcciones A y B de ADN lineal cerrado (véase FIG. 5).
La FIG.10 muestra el análisis de citometría de flujo de células HEK293 transfectadas con moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el gen informador eGFP. Las células se transfectaron utilizando Lipofectamine 2000 y la expresión de GFP se analizó 48 h después de la transfección. La Figura 10a muestra un histograma y un gráfico de puntos de una muestra no transfectada representativa sin expresión de GFP. La Figura 10b muestra la expresión de GFP que surge de células transfectadas con moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el gen indicador de eGFP con ITR (Construcción A, FIG. 5). La eficiencia de transfección fue del 54.43 %. La Figura 10c muestra la expresión de GFP que surge de células transfectadas con moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el gen indicador de eGFP con ITR y un separador de 20 pb (Construcción B, FIG. 5). La eficiencia de transfección fue del 44.45 %.
La FIG.11 muestra la eficiencia de transfección de GFP y la mediana de la intensidad de fluorescencia de las células en suspensión HEK293 transfectadas con moléculas de ADN cerradas covalentemente lineales (Construcción B dosis 1 y Construcción B dosis 2) frente a construcciones de ADNp (ADNp dosis 1 y ADNp dosis 2) que codifican GFP, utilizando PeiPro, a una dosis de 1 ^g o 1.5 ^g por ml. La expresión de GFP se midió por citometría de flujo 72 h después de la transfección. Las moléculas de ADN cerradas covalentemente, lineales dieron una eficiencia de transfección del 64 % a una dosis de 1 ^g/ml, en comparación con el ADNp al 47%. La intensidad de fluorescencia mediana (MFI) fue 155,556, en comparación con 51,345 para ADNp. A una dosis de 1.5^g/ml, las moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente dieron una eficacia de transfección del 53.7 %, en comparación con el ADNp del 60.6 %. MFI fue 143,353.8, en comparación con 83,856 para ADNp.
La FIG.12 muestra el título del genoma viral de rAAV5 (VG/ml) de partículas de AAV producidas utilizando construcciones transgénicas de ADN cerradas covalentemente lineales (Construcciones A, B y C, véase FIG. 5), medido por qPCR. Las células en suspensión HEK293 se transfectaron con construcciones transgénicas de ADN cerradas covalentemente lineales, junto con RepCap y ADNp Auxiliar utilizando el reactivo de transfección PeiPro, y se recolectaron 72 h después de la transfección. Los títulos virales variaron de 1.78E+11 a 2.38E+11 a través de las construcciones transgénicas de ADN cerradas covalentemente lineales.
La FIG.13 muestra la relación Lleno:Vacío de partículas de AAV producidas con construcciones transgénicas de ADN cerradas covalentemente lineales (Construcción A y Construcción B, véase FIG. 5), en comparación con un control ADNp (eje primario). La TCID50/ml (Dosis Infecciosa Media en Cultivo de Tejido) en células HeLaRC32 codosificadas con Ad5 se expresa en el eje secundario. Las relaciones Lleno:Vacío de las construcciones A y B del transgén de ADN lineal cerrado covalentemente fueron del 57.1 % y el 68.38% respectivamente, en comparación con el control de ADNp, del 46.3 %. Esto sugiere que las partículas de AAV producidas con construcciones de transgenes de ADN cerrados covalentemente lineales tienen un mayor porcentaje de cápsides que contienen el transgén deseado de longitud completa, mientras que una relación más baja Lleno:Vacío sugiere que hay más cápsides vacías, lo que puede inhibir la transducción de las partículas virales y por lo tanto la eficacia de la AAV. Estas impurezas también pueden aumentar la inmunogenicidad del producto AAV. Los valores de TCID50/ml para las construcciones transgénicas A y B de ADN cerrado covalentemente lineales fueron 5.01E+07 y 5.2E+08 respectivamente, en comparación con el control ADNp, en 3.16E+09. Esto sugiere que las partículas de AAV producidas con construcciones transgénicas de ADN cerradas covalentemente lineales son más potentes y requieren una concentración más baja para mostrar un efecto citopático (CPE) en las células HeLaRC32.
La FIG.14 resume la producción de moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el gen indicador de luciferasa. Un plásmido que contiene el casete de expresión mostrado en la FIG. 14 se sometió al procedimiento representado en la FIG. 1. Condiciones de reacción Cre: volumen de reacción 50 ^l, ADN de interés purificado a partir de electroforesis en gel de agarosa después de digestión con enzimas de restricción (100 ng), recombinasa Cre (NEB, 4 unidades), tiempo y temperatura de incubación: 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. A continuación, para eliminar las moléculas de ADN no circulares restantes antes de la etapa de amplificación, se agregaron exonucleasa I (NEB, 20 unidades) y III (NEB, 100 unidades) de E. coli y la reacción se incubó 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. Antes de la amplificación, primero se desnaturalizó el ADN circularizado al agregar 1 volumen de tampón D (KOH 400 mM, EDTA 10 mM) e incubar 3 min a temperatura ambiente. A continuación, la muestra se neutralizó al agregar 1 volumen de tampón N (HCl 400 mM, Tris-HCl 600 mM, pH 7.5). Condiciones de amplificación de círculo rodante: 10 ml de volumen de reacción, 1 ml de tampón de reacción TruePrime WGA 10x (4basebio), 500 ^l de muestra de ADN desnaturalizado, 1 ml de TthPrimPol (1 ^M), 160 ^l de QualiPhi Phi29DNApol (12.5 ^M), 2.5 unidades de PPase (Thermo) y 1 ml de dNTPs (10 mM). Tiempo y temperatura de incubación: 20 horas a 30 °C y 10 min a 65 °C. Luego, el ADN amplificado se incubó con la enzima de restricción de Tipo II BsaI, la ligasa de ADN T4 y los adaptadores complementarios (SEQ ID NO: 4) a los extremos salientes 5’ generados por BsaI en el ADN amplificado. Condiciones de reacción de digestión y ligación: volumen de reacción 100 ^l, 10 ^l de tampón de reacción ligasa de ADN T410x (NEB), 3 ^g de ADN, 60 unidades de BsaI-HFv2 (NEB), 2000 unidades de ligasa de ADN T4 (NEB), 480 ng de adaptador de ADN (exceso molar 1:20), tiempo y temperatura de incubación: 5 minutos a los 37 °C y 5 minutos a las 16 °C (60 ciclos). Condiciones de reacción de limpieza de exonucleasa: luego se agregaron 15 unidades de exonucleasa I de E. coli (NEB) y 75 unidades de exonucleasa III de E. coli (NEB) para eliminar los adaptadores restantes y abrir las moléculas de ADN. Tiempo y temperatura de incubación: 30 minutos a las 37 °C y 20 minutos a 80 °C. Se muestra en la FIG. 14 es el análisis de electroforesis en gel de agarosa del ADN cerrado lineal producido. La tabla de la FIG. 14 muestra la eficiencia del proceso de generación de ADN cerrado lineal.
La FIG.15 muestra la expresión de luciferasa en ratones hembra suizos de 6 semanas de edad. Los ratones recibieron una inyección intramuscular de moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el transgén de Luciferasa, seguido de electroporación. En los días 1-15 posteriores a la inyección intramuscular, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de D-luciferina (150mg/kg en 100 ul de PBS) 10 minutos antes de la observación. Se observó bioluminiscencia óptica mediante el sistema IVIS Spectrum bajo anestesia con isoflurano. La expresión de la proteína luciferasa de las moléculas de ADN lineales cerradas covalentemente que codifican el transgén de luciferasa alcanzó su punto máximo en el día 2 y disminuyó gradualmente en el transcurso de 15 días.
Ejemplo 3
Las FIG. 3, 16, 17 y 18 resumen la producción de un producto de ADN lineal parcialmente cerrado y un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos. Los dos productos de ADN codifican el gen informador GFP para IVT (SEQ ID NO: 25). Un plásmido que contiene el casete de expresión mostrado en la FIG. 20 se sometió al procedimiento representado en las FIG. 3, 16, 17 y 18 para generar un producto de ADN lineal parcialmente cerrado y un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos, respectivamente. Condiciones de reacción Cre: volumen de reacción 1 ml, ADN de interés purificado tras digestión con enzimas de restricción (2 ng/^l), recombinasa Cre (NEB, 0.08 unidades/^l), tiempo y temperatura de incubación: 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. A continuación, para eliminar las moléculas de ADN no circulares restantes antes de la etapa de amplificación, se agregaron exonucleasa I (NEB, 0.4 unidades/^l) y III (NEB, 2 unidades/^l) de E. coli y la reacción se incubó 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. Antes de la amplificación, primero se desnaturalizó el ADN circularizado al agregar 1 volumen de tampón D (KOH 400 mM, EDTA 10 mM) e incubar 3 min a temperatura ambiente. A continuación, la muestra se neutralizó al agregar 1 volumen de tampón N (HCl 400 mM, Tris-HCl 600 mM, pH 7.5). Condiciones de amplificación de círculo rodante: 20 ml de volumen de reacción, 2 ml de tampón de reacción TruePrime WGA 10x (4basebio), 3 ml de muestra de ADN desnaturalizado, 2 ml de TthPrimPol (1 ^M), 320 ^l de QualiPhi Phi29DNApol (12.5 ^M), 5 unidades de PPasa (Thermo) y 2 ml de dNTP (10 mM). Tiempo y temperatura de incubación: 20 horas a 30 °C y 10 min a 65 °C. Luego, el ADN amplificado se incubó con la enzima de restricción de tipo II BsaI, la ligasa de ADN T4 y los adaptadores complementarios (ya sea SEQ ID NO: 4, 13 y 14 o SEQ ID NO: 1, 2, 13 y 14) a los extremos salientes 5’ generados por BsaI sobre el ADN amplificado. Condiciones de reacción de digestión y ligación: volumen de reacción 20 ml, 2 ml tampón de reacción ligasa de ADN T4 10x (NEB), 120 ng/^l de ADN amplificado, 0.6 unidades/^l de BsaI-HFv2 (NEB), 20 unidades/^l de ligasa de ADN T4 (NEB), adaptador de ADN (exceso molar 1:10), tiempo y temperatura de incubación: 23 horas a 30 °C. Condiciones de reacción de limpieza de exonucleasa: A continuación, se agregan 0.15 unidades/^l de exonucleasa I de E. coli (NEB) y 0.75 unidades/^l de exonucleasa III de E. coli (NEB) para eliminar los adaptadores restantes y abrir las moléculas de ADN. Tiempo y temperatura de incubación: 2 horas a 37 °C. Se muestra en la FIG. 19 el análisis de electroforesis en gel de agarosa del producto de ADN lineal parcialmente cerrado y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos producidos. La tabla de la FIG. 20 muestra la eficiencia del producto de ADN lineal parcialmente cerrado y el producto de ADN lineal que comprende el proceso de generación de nucleótidos protegidos.
Las FIG. 3, 16, 17 y 18 resumen la producción de un producto de ADN lineal parcialmente cerrado y un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos que codifican el gen indicador de luciferasa para IVT (SEQ ID NO: 24). Un plásmido que contiene el casete de expresión mostrado en la FIG. 19 se sometió al procedimiento representado en las FIG. 3, 16, 17 y 18 para generar un producto de ADN lineal parcialmente cerrado y un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos. Condiciones de reacción Cre: volumen de reacción 1 ml, ADN de interés purificado después de digestión con enzimas de restricción (2 ng/^l), recombinasa Cre (NEB, 0.08 unidades/^l), tiempo y temperatura de incubación: 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. A continuación, para eliminar las moléculas de ADN no circulares restantes antes de la etapa de amplificación, se agregaron exonucleasa I (NEB, 0.4 unidades/^l) y III (NEB, 2 unidades/^l) de E. coli y la reacción se incubó 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. Antes de la amplificación, primero se desnaturalizó el ADN circularizado al agregar 1 volumen de tampón D (KOH 400 mM, EDTA 10 mM) e incubar 3 min a temperatura ambiente. A continuación, la muestra se neutralizó al agregar 1 volumen de tampón N (HCl 400 mM, Tris-HCl 600 mM, pH 7.5). Condiciones de amplificación de círculo rodante: 20 ml de volumen de reacción, 2 ml de tampón de reacción TruePrime WGA 10x (4basebio), 3 ml de muestra de ADN desnaturalizado, 2 ml de TthPrimPol (1 ^M), 320 ^l de QualiPhi Phi29DNApol (12.5 ^M), 5 unidades de PPasa (Thermo) y 2 ml de dNTP (10 mM). Tiempo y temperatura de incubación: 20 horas a 30 °C y 10 min a 65 °C. Luego, el ADN amplificado se incubó con la enzima de restricción de Tipo II BsaI, la ligasa de ADN T4 y los adaptadores complementarios (ya sea SEQ ID NO: 4, 13 y 14 o SEQ ID NO: 1, 2, 13 y 14) a los extremos salientes 5’ generados por BsaI sobre el ADN amplificado. Condiciones de reacción de digestión y ligación: volumen de reacción 20 ml, 2 ml tampón de reacción ligasa de ADN T4 10x (NEB), 120 ng/^l de ADN amplificado, 0.6 unidades/^l de BsaI-HFv2 (NEB), 20 unidades/^l de ligasa de ADN T4 (NEB), adaptador de ADN (exceso molar 1:10), tiempo y temperatura de incubación: 23 horas a 30 °C. Condiciones de reacción de limpieza de exonucleasa: A continuación, se agregan 0.15 unidades/^l de exonucleasa I de E. coli (NEB) y 0.75 unidades/^l de exonucleasa III de E. coli (NEB) para eliminar los adaptadores restantes y abrir las moléculas de ADN. Tiempo y temperatura de incubación: 2 horas a 37 °C. Se muestra en la FIG. 19 el análisis de electroforesis en gel de agarosa del producto de ADN lineal parcialmente cerrado y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos producidos. La tabla de la FIG. 19 muestra la eficiencia del producto de ADN lineal parcialmente cerrado y el producto de ADN lineal que comprende el proceso de generación de nucleótidos protegidos.
La FIG.21 resume la producción de un producto de ADN lineal cerrado y un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos que codifican el gen informador de luciferasa para la expresión en células de mamíferos (SEQ ID NO: 12). Un plásmido que contiene el casete de expresión mostrada en la FIG. 21 se sometió al procedimiento representado en las FIG. 1-4 para generar un producto de ADN lineal cerrado (ADNhp) y un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe). Condiciones de reacción Cre: volumen de reacción 1 ml, ADN de interés purificado tras digestión con enzimas de restricción (2 ng/^l), recombinasa Cre (NEB, 0.08 unidades/^l), tiempo y temperatura de incubación: 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. A continuación, para eliminar las moléculas de ADN no circulares restantes antes de la etapa de amplificación, se agregaron exonucleasa I (NEB, 0.4 unidades/^l) y III (NEB, 2 unidades/^l) de E. coli y la reacción se incubó 30 min a 37 °C y 20 min a 80 °C. Antes de la amplificación, primero se desnaturalizó el ADN circularizado al agregar 1 volumen de tampón D (KOH 400 mM, EDTA 10 mM) e incubar 3 min a temperatura ambiente. A continuación, la muestra se neutralizó al agregar 1 volumen de tampón N (HCl 400 mM, Tris-HCl 600 mM, pH 7.5). Condiciones de amplificación de círculo rodante: 20 ml de volumen de reacción, 2 ml de tampón de reacción TruePrime WGA 10x (4basebio), 3 ml de muestra de ADN desnaturalizado, 2 ml de TthPrimPol (1 ^M), 320 ^l de QualiPhi Phi29DNApol (12.5 ^M), 5 unidades de PPasa (Thermo) y 2 ml de dNTP (10 mM). Tiempo y temperatura de incubación: 20 horas a 30 °C y 10 min a 65 °C. Luego, el ADN amplificado se incubó con la enzima de restricción de Tipo II BsaI, la ligasa de ADN T4 y los adaptadores complementarios (ya sea SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 1 y 2) a los extremos salientes 5’ generados por BsaI en el ADN amplificado. Condiciones de reacción de digestión y ligación: volumen de reacción 20 ml, 2 ml tampón de reacción ligasa de ADN T4 10x (NEB), 120 ng/^l de ADN amplificado, 0.6 unidades/^l de BsaI-HFv2 (NEB), 20 unidades/^l de ligasa de ADN T4 (NEB), adaptador de ADN (exceso molar 1:10), tiempo y temperatura de incubación: 23 horas a 30 °C. Condiciones de reacción de limpieza de exonucleasa: A continuación, se agregan 0.15 unidades/^l de exonucleasa I de E. coli (NEB) y 0.75 unidades/^l de exonucleasa III de E. coli (NEB) para eliminar los adaptadores restantes y abrir las moléculas de ADN. Tiempo y temperatura de incubación: 2 horas a 37 °C. Se muestra en la FIG. 21 el análisis de electroforesis en gel de agarosa del producto de ADN lineal cerrado y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos producidos. La tabla de la FIG. 21 muestra la eficacia del proceso de generación de ADN lineal parcialmente abierto y abierto protegido.
Ejemplo 4 - Transcripción in vitro
Se utilizó 1 ^g de molde de ADN de entrada por muestra, luego 2 ^l de tampón de transcripción 10X T7-FlashScribeTM (CellScript), ATP 9mM, CTP 9mM (CellScript), N1-metilpseudo-UTP 9 mM (TriLink), análogo de estructura de boquete ARCA 8 mM (NEB), GTP 9 mM, DTT 10 mM (CellScript), pirofosfatasa inorgánica 0.2 U (Thermo Scientific), inhibidor de RNasa ScriptGuardTM 20 U, solución Enzimática T7-FlashScribeTM 2 ^l (CellScript). Tiempo y temperatura de incubación: 1.5 horas a 37 °C. Se aplicó el siguiente tratamiento con ADNasa I a 1 U (CellScript), tiempo y temperatura de incubación: 15 min a 37 °C.
Ejemplo 5 - Electroforesis en gel de agarosa con desnaturalización de formaldehído Se preparó gel de agarosa al 0.8 % con formaldehído al 0.7 %. Las muestras se prepararon utilizando colorante de carga de formaldehído (Invitrogen) y se desnaturalizaron con calor a 65 °C durante 5 min antes de agregarlas al pocillo. Las muestras se procesaron durante 70 min a 80 V antes de la formación de imágenes.
Ejemplo 6 - Transfección de células HEK - ARNm de luciferasa
Las células HEK293 se cultivaron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco No. de Cat: 11965084) con suero fetal bovino al 10 % (FBS) (Gibco, No. de Cat: 16140-071) y 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco cat. No: 15070-063).
Las transfecciones en células HEK293 se realizaron con el reactivo de transfección disponible comercialmente Lipofectamine2000 (ThermoFisher cat. No: 11668019).
Las transfecciones se realizaron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 25 x 103 células por pocillo sembrado un día antes de la transfección.
300 ng de ARNm por pocillo diluido en 50 ul de OptiMEM mientras que 0.5 ul de Lipofectamine2000 se diluyeron en 50 ul de OptiMEM. Los componentes se incubaron durante 5 minutos por separado, luego se mezclaron completamente y se incubaron durante 25 minutos más antes de agregar 100 ul de OptiMEM a los pocillos.
Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Las células se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2. 4 horas después de la transfección, las células se enjuagaron en PBS, antes de la resuspensión en tampón Reporter Lysis (Promega). Las placas se incubaron a 4 °C durante 20 minutos, antes de -80 °C durante 40 minutos. Después de la descongelación, se midió la actividad de la luciferasa tras la inyección del sustrato del ensayo de luciferasa en el lector de placas ClarioSTAR plus (BMG Labtech, Aylesbury, Reino Unido). La expresión de luciferasa se normalizó al contenido de proteína utilizando el Ensayo de Proteína Pierce BCA, con absorbancia medida a 562 nm. La actividad de luciferasa se expresó como Unidades de Luz Relativas por mg de proteína (RLU/mg).
La Figura 25 ilustra los rendimientos generados a partir de ARNm transcrito in vitro utilizando polimerasa de ARN T7 y diferentes moldes de ADN. Específicamente, esta Figura ilustra el impacto de utilizar un producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop), un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) y un plásmido linealizado como moldes de transcripción in vitro en los rendimientos de ARNm. Se han utilizado moldes de plásmidos linealizados de ADN tradicionales para la comparación. Condiciones de reacción: Se utilizó 1 ^g de molde de ADN de entrada por muestra en un volumen de reacción final de 20 ^l, 2 ^l de Tampón de transcripción 10X T7-FlashScribeTM (CellScript), NTP 10 mM (CellScript), CleanCap AG 8 mM (TriLink), DTT 10 mM (CellScript), pirofosfatasa inorgánica 0.2 U (Thermo Scientific), 20 U de Inhibidor de ARNasa ScriptGuard™, 2 ^l de Solución enzimática T7-FlashScribeTM (CellScript). Tiempo y temperatura de incubación: 2 horas a 37 °C. Se aplicó el siguiente tratamiento con ADNasa I a 1 U (CellScript), tiempo y temperatura de incubación: 15 minutos a 37 °C. Rendimientos de ARNm medidos utilizando cuantificación Qubit (n=1) a través del kit Qubit RNA Broad Range (Invitrogen).
Se muestran en la Fig. 25 rendimientos de ARNm de transcripción in vitro obtenidos utilizando diferentes moldes de ADN, lo que demuestra el impacto de utilizar producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop), producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) y plásmido linealizado como moldes de transcripción in vitro sobre los rendimientos de ARNm. Se logró un rendimiento mínimo de 180 ^g a partir de moldes de ADNoe y un rendimiento mínimo de 190 ^g a partir de moldes de ADNop. Tanto el producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) como el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) produjeron rendimientos de ARNm comparables a los del plásmido linealizado tradicional. Condiciones de reacción: Se utilizó 1 ^g de molde de ADN de entrada por muestra en un volumen de reacción final de 20 ^l, 2 ^l de Tampón de Transcripción 10X T7-FlashScribeTM (CellScript), NTP 10 mM (CellScript), CleanCap AG 8 mM (TriLink), DTT 10 mM (CellScript), 0.2 U de pirofosfatasa inorgánica (Thermo Scientific), 20 Ude Inhibidor de ARNasa ScriptGuard™, 2 ^l de Solución Enzimática T7-FlashScribeTM (CellScript). Tiempo y temperatura de incubación: 2 horas a 37 °C. Se aplicó el siguiente tratamiento con ADNasa I a 1 U (CellScript), tiempo y temperatura de incubación: 15 minutos a 37 °C.
La Figura 26 ilustra muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % nativo. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de moldes de ADN con diferentes extremos adaptados. Las muestras se han cargado a una masa igual de 1000 ng. El ARNm derivado de un plásmido linealizado tradicional se ha cargado como comparación.
En la Fig. 26 se muestran muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % nativo. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de productos de ADN con diferentes extremos adaptados. La banda diana de ~0.75 kb se puede observar en todas las muestras. Independientemente del extremo del molde de ADN adaptada, todas las muestras produjeron una intensidad de banda y una pureza similares. También se puede observar una segunda banda de mayor peso molecular que corresponde al plegamiento de la estructura secundaria natural del ARNm bajo condiciones nativas.
La Figura 27 ilustra muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % desnaturalizante. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de productos de ADN con diferentes extremos adaptados. Las muestras se han cargado a una masa igual de 1000 ng. El ARNm derivado de plásmidos linealizados tradicionales se ha cargado como comparación. Todas las muestras se desnaturalizaron con calor a 70 °C durante 5 min y se trataron con formamida antes de agregarlas al gel.
En la Fig. 27 se muestran muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % desnaturalizante. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de productos de ADN con diferentes extremos adaptados. Se puede observar una banda principal de ~0.75 kb en todas las muestras, lo que demuestra que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos son adecuados para los procesos de transcripción.
La Figura 28 muestra la expresión de luciferasa en células HEK293 transfectadas con reactivo de transfección comercialmente disponible, Lipofectamine2000 que encapsula el ARNm derivado de producto de ADN lineal parcialmente cerrado y producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos. La expresión de luciferasa se midió 4 horas después de la transfección. n =3 en todos los experimentos, barras de error = DE. El molde de ADN de plásmido linealizado y el ARNm de Trilink se utilizaron como controles positivos.
Se muestra en la Figura 28 la expresión de luciferasa en células HEK293 transfectadas con el reactivo de transfección comercialmente disponible Lipofectamine2000, que encapsula el ARNm derivado del producto de ADN lineal parcialmente cerrado y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos. Se utilizaron ARNm derivado de plásmido linealizado y ARNm de Trilink como controles positivos. La expresión de luciferasa varió entre 2.25 x 10A8 y 6.05x10A8 RLU/mg de proteína, con una equivalencia entre el producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y el producto de ADN lineal que comprende ARNm derivado de nucleótidos protegidos (ADNoe), en comparación con el plásmido linealizado.
Ejemplo 7 - Transfección de células HEK293 - ARNm de GFP
Las células HEK293 se cultivaron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco No. de Cat: 11965084) con 10 % de suero fetal bovino (FBS) (Gibco, No. de Cat: 16140-071) y 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco No. de Cat: 15070-063).
Las transfecciones en células HEK293 se realizaron con reactivos de transfección disponibles comercialmente como Lipofectamine2000 (ThermoFisher No. de Cat: 11668019).
Las transfecciones se realizaron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 25 x 103 células por pocillo sembrado un día antes de la transfección.
Se diluyeron 300 ng de ARNm de GFP por pocillo en 50 ul de OptiMEM mientras que 0.5 ul de Lipofectamine2000 se diluyeron en 50 ul de OptiMEM. Los componentes se incubaron durante 5 minutos por separado, luego se mezclaron completamente y se incubaron durante 25 minutos adicionales antes de agregar 100 ul de OptiMEM a los pocillos.
Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Las células se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2. 4 h después de la transfección, las células se enjuagaron en PBS, antes de la incubación en tripsina al 0.05 %, EDTA 0.53 mM (Corning, No. de Cat: 25-052-CV) para despegar las células. Las células se resuspendieron en PBS para su análisis mediante citometría de flujo utilizando el citómetro de flujo Aligent Novocyte.
La FIG.22 ilustra los rendimientos generados a partir de ARNm transcrito in vitro utilizando polimerasa de ARN T7 y diferentes moldes de ADN. Específicamente, esta figura ilustra el impacto de utilizar un producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) y plásmido linealizado como moldes de transcripción in vitro en los rendimientos de ARNm. Se han utilizado moldes de plásmidos linealizados de ADN tradicionales para la comparación. Condiciones de reacción: Se utilizó 1 ^g de molde de ADN de entrada por muestra en un volumen de reacción final de 40 ^l, 4 ^l de Tampón de Transcripción 10X T7-FlashScribeTM (CellScript), NTP 10 mM (CellScript), CleanCap AG 8 mM (TriLink), DTT 10 mM (CellScript), 0.4 U de pirofosfatasa inorgánica (Thermo Scientific), 40 U de Inhibidor de ARNasa ScriptGuard™, 4 ^l de Solución enzimática T7-FlashScribeTM (CellScript). Tiempo y temperatura de incubación: 2 horas a 37 °C. Se aplicó el siguiente tratamiento con ADNasa I a 1 U (CellScript), tiempo y temperatura de incubación: 15 minutos a 37 °C. Rendimientos de ARNm medidos mediante cuantificación Qubit (n=3) a través del kit Qubit RNA Broad Range (Invitrogen).
La FIG.22 muestra los rendimientos de ARNm de transcripción in vitro obtenidos utilizando diferentes moldes de ADN, lo que demuestra el impacto de utilizar un producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) y plásmido linealizado como moldes de transcripción in vitro sobre los rendimientos de ARNm. Se logró un rendimiento mínimo de 280 ^g a partir del producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe), y se logró un rendimiento mínimo de 340 a partir del producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop). Ambas formas de productos de ADN produjeron rendimientos de ARNm comparables a los del plásmido linealizado tradicional. Condiciones de reacción: Se utilizó 1 ^g de molde de ADN de entrada por muestra en un volumen de reacción final de 40 ^l, 4 ^l de Tampón de Transcripción 10X T7-FlashScribe™ (CellScript), NTP 10 mM (CellScript), CleanCap AG 8 mM (TriLink), DTT 10 mM (CellScript), 0.4 U de pirofosfatasa inorgánica (Thermo Scientific), 40 U+de Inhibidor de ARNasa ScriptGuard™, 4 ^l de Solución enzimática T7-FlashScribeTM (CellScript). Tiempo y temperatura de incubación: 2 horas a 37 °C. Se aplicó el siguiente tratamiento con ADNasa I a 1 U (CellScript), tiempo y temperatura de incubación: 15 min a 37 °C.
La Figura 23 ilustra muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % nativo. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de moldes de ADN con diferentes extremos adaptados. Las muestras se han cargado a una masa igual de 1000 ng. El ARNm derivado de un plásmido linealizado tradicional se ha cargado como comparación.
En la Fig. 23 se muestran muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % nativo. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de moldes de ADN con diferentes extremos adaptados. La banda diana de ~2 kb se puede observar en todas las muestras. Independientemente del extremo del molde de ADN adaptado, todas las muestras produjeron una intensidad de banda y una pureza similares. También se puede observar una segunda banda de mayor peso molecular que corresponde al plegamiento de la estructura secundaria natural del ARNm bajo condiciones nativas.
La Figura 24 ilustra muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % desnaturalizante. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de moldes de ADN con diferentes extremos adaptados. Las muestras se han cargado a una masa igual de 1000 ng. El ARNm derivado de plásmidos linealizados tradicionales se ha cargado como comparación. Todas las muestras se desnaturalizaron con calor a 70 °C durante 5 min y se trataron con formamida antes de agregarlas al gel.
Se muestran en la Fig. 24 las muestras de ARNm transcritas in vitro obtenidas a través de electroforesis en gel de agarosa al 0.8 % desnaturalizante. Las muestras de ARNm se transcribieron a partir de moldes de ADN con diferentes extremos adaptados. Se puede observar una banda principal de ~2 kb en todas las muestras, lo que demuestra que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) son adecuados para los procesos de transcripción.
La Figura 29 muestra la expresión de GFP en células HEK293 transfectadas con reactivo de transfección disponible comercialmente, Lipofectamine2000 que encapsula el ARNm derivado de producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe). La expresión de GFP se midió 4 horas después de la transfección. n =3 en todos los experimentos, barras de error = DE. El molde de ADN de plásmido linealizado y el ARNm de Trilink se utilizaron como controles positivos.
Se muestra en la Figura 29 es la expresión de GFP en células HEK293 transfectadas con un reactivo de transfección comercialmente disponible, Lipofectamine2000 que encapsula el ARNm derivado del producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y el producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe). El molde de ADN de plásmido linealizado y el ARNm de Trilink se utilizaron como controles positivos. La expresión de GFP fue superior al 70 % en todo el ARNm, con una equivalencia entre el producto de ADN lineal parcialmente cerrado (ADNop) y el producto de ADN lineal que comprende el ARNm derivado de nucleótidos protegidos (ADNoe), en comparación con el plásmido linealizado.
Ejemplo 8- Transfección de células HEK: ADN lineal cerrado de luciferasa (ADNhp) frente a producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe)
Las células HEK293 se cultivaron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (Gibco No. de Cat: 11965084) con 10 % de suero fetal bovino (FBS) (Gibco, No. de Cat: 16140-071) y 1 % de penicilina/estreptomicina (Gibco No. de Cat: 15070-063).
Las transfecciones en células HEK293 se realizaron con el reactivo de transfección disponible comercialmente Lipofectamine2000 (ThermoFisher No. de Cat: 11668019).
Las transfecciones se realizaron en una placa de 96 pocillos a una densidad de 25 x 103 células por pocillo sembrado un día antes de la transfección.
300 ng de producto de ADN lineal cerrado que comprende nucleótidos protegidos por pocillo diluidos en 50 ul de OptiMEM mientras que 0.5 ul de Lipofectamine2000 se diluyeron en 50 ul de OptiMEM. Los componentes se incubaron durante 5 minutos por separado, luego se mezclaron completamente y se incubaron durante 25 minutos más antes de agregar 100 ul de OptiMEM a los pocillos.
Todas las condiciones se realizaron por triplicado. Las células se incubaron a 37 °C con 5 % de CO2. 48 horas después de la transfección, las células se enjuagaron en PBS, antes de la resuspensión en tampón de Lisis Indicadora (Promega). Las placas se incubaron a 4 °C durante 20 minutos, antes de -80 °C durante 40 minutos. Después de la descongelación, se midió la actividad de la luciferasa tras la inyección del sustrato del ensayo de luciferasa en el lector de placas ClarioSTAR plus (BMG Labtech, Aylesbury, Reino Unido). La expresión de luciferasa se normalizó al contenido de proteína utilizando el Ensayo de Proteína Pierce BCA, con absorbancia medida a 562 nm. La actividad de luciferasa se expresó como Unidades de Luz Relativas por mg de proteína (RLU/mg).
La Figura 30 muestra la expresión de Luciferasa en células HEK293 transfectadas con reactivo de transfección comercialmente disponible, Lipofectamine2000 que encapsula un producto de ADN lineal cerrado (ADNhp) o un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) que codifican el gen indicador de luciferasa. La expresión de GFP se midió 48 horas después de la transfección. n=3 en todos los experimentos, barras de error = DE.
Se muestra en la Figura 30 la expresión de luciferasa en células HEK293 transfectadas con un reactivo de transfección comercialmente disponible, Lipofectamine2000, que encapsula un producto de ADN lineal cerrado (ADNhp) o un producto de ADN lineal que comprende nucleótidos protegidos (ADNoe) que codifican el gen indicador de luciferasa. La expresión de luciferasa fue de 3.85E+10 para ADNoe frente a 1.20E+11 para ADNhp, lo que muestra una alta expresión de luciferasa independientemente del producto de ADN lineal.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, en el que el método comprende:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana de endonucleasa para generar una molécula de ADN de doble hebra, en la que la molécula de molde de ADN se amplifica mediante amplificación por círculo rodante; (b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal cerrado, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en un primer extremo por la primera molécula adaptadora y cerrada en un segundo extremo por la segunda molécula adaptadora, y en donde la molécula de ADN de doble hebra generada en la etapa a) no se purifica antes de la etapa b).
2. El método de la reivindicación 1, en el que el producto de ADN lineal cerrado comprende un separador, opcionalmente en el que el separador tiene al menos una longitud de 20 pares base.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la endonucleasa es una endonucleasa de restricción Tipo IIS, opcionalmente en el que la endonucleasa es endonucleasa de restricción BbsI, BsaI, BsmBI, BspQI, BtgZI, Esp3I,SapI, AarI, Acc36I, AclWI, AcuI, AjuI, AloI, Alw26I, AlwI, ArsI, AsuHPI, BaeI, BarI, BbvI, BccI, BceAI, BcgI, BciVI, BcoDI, BfuAI, BfuI, BmrI, BmsI, BmuI, Bpil, BμmI, BpuEI, BsaXI, Bse1I, Bse3DI, BseGI, BseMI, BseMII, BseNI, BseRI, BseXI, BsgI, BslFI, BsmAI, BsmFI, BsmI, Bso31I, BspCNI, BspMI, BspPI, BspQI, BspTNI, BsrDI, BsrI, Bst6I, BstF5I, BstMAI, BstV1I, BstV2I, BsuI, BtgZI, BtsCI, BtsI-v2, BtsMutI, BveI, CseI, CspCI, Eam1104I, EarI, Ecil, Eco31I, Eco57I, Esp3I, FaqI, FauI, FokI, GsuI, HgaI, HphI, HpyAV, LguI, LmnI, Lsp1109I, LweI, MboII, MlyI, MmeI, MnII, Mva1269I, NmeAIII, PaqCI, PciSI, PctI, PleI, PpsI, PsrI, SchI, SfaNI, TaqII, TspDTI y/o TspGWI.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora son moléculas adaptadoras de ácido nucleico.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la primera molécula adaptadora comprende una horquilla y/o la segunda molécula adaptadora comprende una horquilla.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la primera molécula adaptadora y/o la segunda molécula adaptadora comprenden una región de doble hebra con una saliente.
7. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal, en el que el método comprende:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana de endonucleasa para generar una molécula de ADN de doble hebra, en la que la molécula de molde de ADN se amplifica mediante amplificación por círculo rodante; (b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal, en el que el producto de ADN lineal comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera y segunda moléculas adaptadoras son moléculas de ácido nucleico que comprenden uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en donde la molécula de ADN de doble hebra generada en la etapa a) no se purifica antes de la etapa b).
8. Un método para producir un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) parcialmente cerrado, en el que el método comprende:
(a) amplificar una molécula de molde de ADN que comprende al menos una secuencia diana de endonucleasa para generar una molécula de ADN de doble hebra, en la que la molécula de molde de ADN se amplifica mediante amplificación por círculo rodante; (b) poner en contacto la molécula de ADN de doble hebra con una endonucleasa, una ligasa y primera y segunda moléculas adaptadoras para formar un único volumen acuoso contiguo; y
(c) incubar el único volumen acuoso contiguo para generar el producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en el que el producto de ADN lineal parcialmente cerrado comprende una región de doble hebra lineal, en la que la región de doble hebra lineal comprende una porción lineal de la molécula de ADN de doble hebra, y en la que la primera molécula adaptadora se liga a un primer extremo de la región de doble hebra lineal y la segunda molécula adaptadora se liga a un segundo extremo de la región de doble hebra lineal, y en la que la primera molécula adaptadora es una molécula de ácido nucleico que comprende uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa, y en la que la región de doble hebra lineal se cierra en el segundo extremo por la segunda molécula adaptadora, y en donde la molécula de ADN de doble hebra generada en la etapa a) no se purifica antes de la etapa b).
9. El método de la reivindicación 7 o reivindicación 8, en el que el uno o más nucleótidos resistentes a nucleasa son uno o más nucleótidos fosforotioados.
10. Un método para transcripción in vitro de un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, o un producto de ADN lineal, en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal cerrado de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, producir un producto de ADN lineal de acuerdo con el método de la reivindicación 7 o reivindicación 9, o producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado de acuerdo con el método de la reivindicación 8 o reivindicación 9;
(b) poner en contacto el producto de ADN lineal cerrado, el producto de ADN lineal, o el producto de ADN lineal parcialmente cerrado con una polimerasa; y
(c) producir un producto de transcripción codificado por el producto de ADN lineal cerrado, el producto de ADN lineal o el producto de ADN lineal parcialmente cerrado.
11. Un método para producir una proteína, en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal cerrado de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, producir un producto de ADN lineal de acuerdo con el método de la reivindicación 7 o reivindicación 9, o producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado de acuerdo con el método de la reivindicación 8 o reivindicación 9; e
(b) introducir el producto de ADN lineal cerrado, el producto de ADN lineal, o el producto de ADN lineal parcialmente cerrado en una célula o un sistema de expresión libre de célula para generar una proteína codificada por el producto de ADN lineal cerrado, el producto de ADN lineal o el producto de ADN lineal parcialmente cerrado; y
en el que la etapa (b) se realiza in vitro.
12. Un método para transfección celular de un producto de ácido desoxirribonucleico (ADN) lineal cerrado, un producto de ADN lineal, o un producto de ADN lineal parcialmente cerrado, en una célula, en el que el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal cerrado de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, producir un producto de ADN lineal de acuerdo con el método de la reivindicación 7 o reivindicación 9, o producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado de acuerdo con el método de la reivindicación 8 o reivindicación 9;
(b) poner en contacto una célula con el producto de ADN lineal cerrado, el producto de ADN lineal, o el producto de ADN lineal parcialmente cerrado; y
(c) transfectar el producto de ADN lineal cerrado, el producto de ADN lineal, o el producto de ADN lineal parcialmente cerrado en el citosol de la célula; y
en el que las etapas (b) y (c) se realizan in vitro.
13. El método de la reivindicación 12, en el que la transfección del producto de ADN lineal cerrado, o el producto de ADN lineal, en el citosol de la célula se realiza mediante electroporación.
14. Un método para producer un sistema de suministro no-viral, en donde el método comprende:
(a) producir un producto de ADN lineal cerrado de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, producir un producto de ADN lineal de acuerdo con el método de la reivindicación 7 o reivindicación 9, o producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado de acuerdo con el método de la reivindicación 8 o reivindicación 9; y
(b) usar el producto de ADN lineal cerrado, el producto de ADN lineal o el producto de ADN lineal parcialmetne cerrado para producir un sistema de suministro no-viral.
15. Un método para producer un sistema de suministro viral, en donde el método comprende: (a) producir un producto de ADN lineal cerrado de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, producir un producto de ADN lineal de acuerdo con el método de la reivindicación 7 o reivindicación 9, o producir un producto de ADN lineal parcialmente cerrado de acuerdo con el método de la reivindicación 8 o reivindicación 9; y
(b) usar el producto de ADN lineal cerrado, el producto de ADN lineal o el producto de ADN lineal parcialmetne cerrado para producir un sistema de suministro viral.
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