ES2827845T3 - Proceso de producción de alcohol - Google Patents

Abstract

Un método para optimizar el suministro de un sustrato que comprende CO a un biorreactor, en donde el sustrato se fermenta para producir productos que incluyen uno o más alcohol(es) y/o ácido(s) mediante un cultivo de uno o más microorganismos carboxidotróficos, incluyendo el método determinar los niveles de ácido en el biorreactor en un primer punto temporal y un segundo punto temporal, en donde un aumento en el nivel de ácido entre el primer y el segundo puntos temporales da como resultado un aumento del suministro de sustrato, en donde una disminución en el nivel de ácido entre el primer y segundo puntos temporales da como resultado una disminución en el suministro de sustrato y en donde el sustrato se proporciona de manera que los niveles de ácido se mantienen entre concentraciones umbral predeterminadas de 1 a 10 g/l de caldo de fermentación.

Description

DESCRIPCIÓN

Proceso de producción de alcohol

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a métodos para aumentar la eficacia del crecimiento microbiano y la producción de productos mediante fermentación microbiana de sustratos. Más particularmente, la invención se refiere a procesos para producir alcoholes, particularmente etanol, mediante fermentación microbiana de sustratos gaseosos que contienen monóxido de carbono. En realizaciones particulares, la invención se refiere a métodos para optimizar el suministro de sustrato de manera que aumente la eficiencia global de la fermentación microbiana.

Antecedentes de la invención

El etanol se está convirtiendo rápidamente en un importante combustible de transporte líquido rico en hidrógeno en todo el mundo. El consumo mundial de etanol en 2005 fue de aproximadamente 12,2 mil millones de galones. También se espera que el mercado global de la industria del combustible etanol siga creciendo considerablemente en el futuro, debido a un mayor interés en el etanol en Europa, Japón, Estados Unidos y diversas naciones en desarrollo.

Por ejemplo, en los Estados Unidos, el etanol se usa para producir E10, una mezcla al 10 % de etanol en gasolina. En las mezclas E10, el componente etanol actúa como un agente oxigenante, mejorando la eficiencia de la combustión y reduciendo la producción de contaminantes del aire. En Brasil, el etanol satisface aproximadamente el 30 % de la demanda de combustible para el transporte, tanto como agente oxigenante mezclado con gasolina como combustible puro por derecho propio. Asimismo, en Europa, la preocupación ambiental en torno a las consecuencias de las emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) han sido el estímulo para que la Unión Europea (UE) imponga a los países miembros un objetivo obligatorio para el consumo de combustibles de transporte sostenible, tales como etanol derivado de biomasa.

La gran mayoría del etanol combustible se produce mediante procesos de fermentación tradicionales basados en levaduras que utilizan carbohidratos derivados de cultivos, tales como sacarosa extraída de la caña de azúcar o almidón extraído de cultivos de cereales, como la principal fuente de carbono. Sin embargo, el coste de estas reservas de carbohidratos depende de su valor como alimento humano o animal y el cultivo de plantas productoras de almidón o sacarosa para la producción de etanol no es económicamente sostenible en todas las zonas geográficas. Por lo tanto, es interesante desarrollar tecnologías para convertir recursos de carbono de bajo coste y/o más abundantes en combustible etanol.

El monóxido de carbono (CO) es un subproducto importante y muy energético de la combustión incompleta de materiales orgánicos tales como el carbón o el petróleo y productos derivados del petróleo. Otros procesos industriales también dan como resultado la producción de monóxido de carbono. Según informes, la industria del acero en Australia produce y libera a la atmósfera más de 500.000 toneladas de CO anualmente.

Se pueden usar procesos catalíticos para convertir gases que consisten fundamentalmente en CO y/o CO e hidrógeno (H²) en una variedad de combustibles y sustancias químicas. Los microorganismos también pueden usarse para convertir estos gases en combustibles y productos químicos. Estos procesos biológicos, aunque generalmente más lentos que las reacciones químicas, tienen varias ventajas sobre los procesos catalíticos, incluyendo mayor especificidad, mayores rendimientos, menores costes de energía y mayor resistencia al envenenamiento.

La capacidad de los microorganismos para crecer en CO como única fuente de carbono se descubrió por primera vez en 1903. Más tarde se determinó que esto era una propiedad de los organismos que utilizan la vía bioquímica de la acetil coenzima A (acetil CoA) de crecimiento autótrofo (también conocida como la vía de Woods-Ljungdahl y la vía de la monóxido de carbono deshidrogenasa/acetil CoA sintasa (CODH/ACS)). Se ha demostrado que una gran cantidad de organismos anaerobios, incluidos los organismos carboxidotróficos, fotosintéticos, metanogénicos y acetogénicos, metabolizan el CO a varios productos finales, concretamente CO² , H² , metano, n-butanol, acetato y etanol. Si bien utilizan CO como la única fuente de carbono, todos estos organismos producen al menos dos de estos productos finales.

Se ha demostrado que las bacterias anaerobias, tales como las del género Clostridium, producen etanol a partir de CO, CO² y H² a través de la vía bioquímica de Acetil-CoA. Por ejemplo, en el documento WO 00/68407 se describen varias cepas de Clostridium Ijungdahlii que producen etanol a partir de gases, EP 117309, las patentes de Estados Unidos n.° 5.173.429, 5.593.886 y 6.368.819, WO 98/00558 y WO 02/08438. También se sabe que la bacteria Clostridium autoethanogenum sp produce etanol a partir de gases (Abrini et al., Archives of Microbiology 161, páginas 345-351 (1994)).

Sin embargo, la producción de etanol por microorganismos por fermentación de gases se asocia normalmente con la coproducción de acetato y/o ácido acético. Como parte del carbono disponible se convierte en acetato/ácido acético en lugar de etanol, la eficiencia de producción de etanol usando tales procesos de fermentación puede ser menor que la deseable. Asimismo, a menos que el subproducto acetato/ácido acético pueda usarse para algún otro propósito, puede plantear un problema de eliminación de desechos. El acetato/ácido acético es convertido en metano por microorganismos y, por lo tanto, tiene el potencial de contribuir a las emisiones de GEI.

Los documentos WO2007/117157, WO2008/115080 y WO2009/022925 describen procesos que producen alcoholes, particularmente etanol, mediante fermentación anaerobia de gases que contienen monóxido de carbono. El documento WO2007/117157, describe un proceso para producir alcoholes, particularmente etanol, mediante fermentación anaerobia de gases que contienen monóxido de carbono. El acetato producido como subproducto del proceso de fermentación se convierte en gas hidrógeno y gas dióxido de carbono, uno o ambos de los cuales pueden usarse en el proceso de fermentación anaerobio. El documento WO2008/115080, describe un proceso para la producción de alcohol(es) en múltiples etapas de fermentación. Los subproductos producidos como resultado de la fermentación anaerobia del gas(es) en un primer biorreactor se pueden usar para producir productos en un segundo biorreactor. Adicionalmente, los subproductos de la segunda etapa de fermentación se pueden reciclar al primer biorreactor para producir productos. El documento WO2009/022925 describe el efecto del pH y ORP en la conversión de sustratos que comprenden CO en productos tales como ácidos y alcoholes por fermentación. El documento WO2009/058028 describe métodos de absorción de carbono por fermentación microbiana de un sustrato gaseoso que comprende CO.

Se sabe que los microbios capaces de crecer en gases que contienen CO lo hacen a un ritmo más lento que el que se asocia tradicionalmente con los microbios que crecen en azúcares. Desde una perspectiva comercial, en un proceso de fermentación, el tiempo requerido para que una población microbiana crezca hasta una densidad celular suficientemente alta para permitir que se sintetice un nivel económicamente viable de producto, es un costo operativo clave que afecta a la rentabilidad del proceso. Las tecnologías que actúan para mejorar las tasas de crecimiento y/o la productividad de los cultivos y, por tanto, reducen el tiempo necesario para alcanzar las densidades celulares deseadas y/o los niveles de producto deseados pueden servir para mejorar la viabilidad comercial del proceso general.

En los procesos de fermentación dedicados a la producción de alcoholes a partir de materias primas de gas, garantizar que las condiciones adecuadas para el crecimiento microbiano y/o la producción de alcohol, pueden ser fundamentales para mantener un crecimiento microbiano óptimo y/o productividades alcohólicas. Por ejemplo, se reconoce que proporcionar un sustrato a un cultivo microbiano en o próximo a un nivel o intervalo óptimo puede dar como resultado un crecimiento microbiano óptimo y/o la producción de metabolitos deseada como se describe en el documento WO/2010/093262. Por ejemplo, si se proporciona demasiado poco sustrato, el crecimiento microbiano se ralentiza y el o los productos de fermentación son predominantemente ácidos tales como el acetato, mientras que demasiado sustrato puede conducir a un crecimiento microbiano deficiente y/o muerte celular.

Debido a la baja solubilidad del CO y la falta de medios precisos para medir la disolución, es difícil determinar cuánto CO está disponible para un cultivo microbiano en un momento dado y en condiciones particulares. Por tanto, puede ser difícil determinar un nivel óptimo de CO para proporcionar a un cultivo microbiano para su conversión en productos en un momento determinado.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso que sirva al menos de alguna manera para superar las desventajas anteriores, o al menos proporcionar al público una opción útil.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un método para optimizar el suministro de un sustrato que comprende CO a un biorreactor, en donde el sustrato se fermenta para producir productos que incluyen uno o más alcohol(es) y/o ácido(s) mediante un cultivo de uno o más microorganismos carboxidotróficos, incluyendo el método determinar los niveles de ácido en el biorreactor en un primer punto temporal y un segundo punto temporal, en donde un aumento en el nivel de ácido entre el primer y el segundo puntos temporales da como resultado un aumento del suministro de sustrato, en donde una disminución en el nivel de ácido entre el primer y segundo puntos temporales da como resultado una disminución en el suministro de sustrato y en donde el sustrato se proporciona de manera que los niveles de ácido se mantienen entre concentraciones umbral predeterminadas de 1 a 10 g/l de caldo de fermentación.

En una realización, los niveles de ácido se determinan mediante la medición del pH del cultivo.

En una realización, el suministro de sustrato se ajusta en respuesta a un cambio detectado en el pH del caldo de fermentación.

En una realización, el pH se mantiene en un intervalo de 5 a 6.

En una realización, el suministro de sustrato se controla manteniendo el pH del caldo de fermentación a una tasa de cambio constante.

En una realización, el microorganismo es Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei o Clostridium carboxydivorans.

En una realización, los niveles de ácido se mantienen entre 2 y 8 g/l de caldo de fermentación.

En una realización, los productos se producen en una proporción de al menos 2:1 de alcohol(es) a ácido(s).

También se describe un método para aumentar la eficiencia de la fermentación de un sustrato que comprende CO en un biorreactor, mediante un cultivo de uno o más microorganismos carboxidotróficos, para producir productos que incluyen ácido(s) y/o alcohol(es), en donde se proporciona el sustrato. de manera que los niveles de ácido se mantengan entre concentraciones umbral predeterminadas en el biorreactor.

El suministro de sustrato puede controlarse automáticamente en respuesta a cambios en los niveles de ácido.

Los niveles de ácido se pueden mantener entre concentraciones umbral predeterminadas de 1-10 g/l de caldo de fermentación. Los niveles de ácido se pueden mantener entre concentraciones umbral predeterminadas de 2-8 g/l de caldo de fermentación. Normalmente, los niveles de ácido se determinan mediante la medición del pH del cultivo. Normalmente, la fermentación es continua.

También se describe un método para determinar un nivel y/o intervalo de suministro de sustrato óptimo, incluyendo el método proporcionar un sustrato a un cultivo de uno o más microorganismos carboxidotróficos en un biorreactor, a un nivel o sustancialmente próximo a un nivel tal que la proporción deseada de alcohol: productos ácidos se produce por fermentación de un sustrato que comprende CO.

En realizaciones particulares de la invención, el ácido es acetato. En realizaciones particulares, el alcohol es etanol. También se describe un método para mejorar la eficiencia global de la fermentación microbiana de un sustrato para producir productos, comprendiendo el método proporcionar el sustrato a un cultivo microbiano sustancialmente a un nivel próximo a un nivel óptimo, a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo.

Normalmente, el sustrato comprende CO.

Los productos pueden ser ácido(s) y/o alcohol(es). Normalmente, el alcohol (particularmente el etanol) se produce sin la producción concomitante de ácido (particularmente acetato).

El método puede incluir proporcionar el sustrato de manera que el pH de un medio de fermentación permanezca sustancialmente constante o dentro de un intervalo predeterminado. En realizaciones particulares, el sustrato se proporciona de manera que sustancialmente no haya un cambio neto en la concentración de ácido(s) durante la fermentación.

Por ejemplo, el sustrato puede proporcionarse de manera que el pH se mantenga dentro de un intervalo deseable. El intervalo deseable puede ser ± 0,5 unidades del pH operativo óptimo. Normalmente, el sustrato se proporciona de manera que el pH se mantenga entre 5-6; o entre 5,1-5,9; o entre 5,2-5,8; o entre 5,3-5,7; o entre 5,4-5,6; o sustancialmente a 5,5.

También se describe un método para mejorar la eficiencia global de la fermentación microbiana de un sustrato para producir productos, incluyendo el método monitorizar el pH y controlar el suministro de sustrato en función de los cambios de pH. El sustrato puede comprender CO.

Normalmente, la provisión del sustrato se controla de manera que el pH permanezca sustancialmente constante o dentro de un intervalo predeterminado o cambie con una tasa de cambio predeterminada.

Normalmente, el método incluye aumentar el suministro de sustrato en respuesta a una disminución del pH. Adicionalmente o como alternativa, el método incluye disminuir el suministro de sustrato en respuesta a una disminución del pH.

El método puede incluir monitorizar la concentración de metabolito en un caldo de fermentación mediante métodos analíticos conocidos.

También se describe un método para mejorar la eficiencia global de la fermentación microbiana de un sustrato para producir productos, comprendiendo el método proporcionar el sustrato a un cultivo microbiano sustancialmente a un nivel próximo a un nivel óptimo, a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo.

El sustrato puede comprender CO.

Normalmente, los productos son ácido(s) y/o alcohol(es). Por ejemplo, los productos se producen de tal manera que el cultivo produce una proporción de producto deseable de al menos 1:1; o al menos 1:2; o al menos 1:3; o al menos 1:4; o al menos 1:5; o al menos 1:10; o al menos 1:20; ácido: alcohol. Normalmente, el alcohol (particularmente el etanol) se produce sin la producción concomitante de ácido (particularmente acetato).

El método puede incluir proporcionar el sustrato de manera que el cultivo microbiano produzca hidrógeno. El sustrato puede proporcionarse de manera que se produzca hidrógeno a un nivel de al menos 0,5 % en moles; o al menos 1,0 % en moles; o al menos 1,5 % en moles; o al menos 2,0 % en moles del sustrato consumido por el cultivo microbiano. Adicionalmente o como alternativa, el sustrato se proporciona de manera que la absorción específica de CO por el cultivo microbiano se mantenga entre 0,6-1,5 mmol de CO consumido por gramo de biomasa por minuto (mmol/g/min). Por ejemplo, cuando el sustrato comprende CO, a medida que la disponibilidad del sustrato aumenta por encima de una cantidad óptima (o por encima de un intervalo óptimo), el exceso de CO inhibe la(s) enzima(s) hidrogenasa, evitando así sustancialmente la producción de H2. A medida que se inhiben la(s) enzima(s) hidrogenasa(s), el microbio no puede liberarse del exceso de poder reductor, lo que conduce a problemas de cultivo tales como inhibición del crecimiento y/o muerte microbiana.

También se describe un método para mejorar la eficiencia global de la fermentación microbiana de un sustrato para producir productos, incluyendo el método monitorizar el hidrógeno producido por un cultivo microbiano y controlar el suministro de sustrato basado en la producción de hidrógeno.

Normalmente, la provisión del sustrato se controla de tal manera que el hidrógeno producido por el cultivo microbiano a un nivel de al menos 0,5 % en moles; o al menos 1,0 % en moles; o al menos 1,5 % en moles; o al menos 2,0% en moles del sustrato consumido por el cultivo.

Normalmente, el suministro de sustrato aumenta de manera que la producción de hidrógeno se mantiene a un nivel de al menos 0,5 % en moles; o al menos 1,0 % en moles; o al menos 1,5 % en moles; o al menos 2,0 % en moles del sustrato consumido por el cultivo microbiano. Adicionalmente o como alternativa, el suministro de sustrato puede reducirse o mantenerse sustancialmente constante, de modo que la producción de hidrógeno se mantenga a un nivel de al menos 0,5 % en moles; o al menos 1,0 % en moles; o al menos 1,5 % en moles; o al menos 2,0 % en moles del sustrato consumido por el cultivo microbiano.

También se describe un método para mejorar la eficiencia global de la fermentación microbiana de un sustrato para producir productos, comprendiendo el método proporcionar el sustrato que comprende CO, a un cultivo microbiano de manera que la absorción específica del cultivo microbiano se mantenga sustancialmente entre 0,6-1,5 mmol de CO consumido por gramo de biomasa por minuto (mmol/g/min). El sustrato que comprende CO puede proporcionarse de manera que la absorción específica se mantenga sustancialmente entre 0,8-1,2 mmol/g/min.

En realizaciones particulares de la invención, el sustrato que comprende CO es gaseoso. En realizaciones particulares, el sustrato gaseoso comprende un gas obtenido como subproducto de un proceso industrial. En determinadas realizaciones, el proceso industrial se selecciona del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinación de petróleo, gasificación de biomasa, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. Los sustratos que tienen concentraciones más bajas de CO, tal como el 6 %, también pueden ser apropiados, particularmente cuando también haya H² y CO².

En ciertas realizaciones de la invención, el sustrato que contiene CO normalmente contendrá una proporción importante de CO, tal como al menos de aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 % de CO en volumen, de 40 % a 95 % de CO en volumen, de 40 % a 60 % de CO en volumen y de 45 % a 55 % de CO en volumen. En realizaciones particulares, el sustrato comprende aproximadamente 25 % o aproximadamente 30 %, o aproximadamente 35 %, o aproximadamente 40 %, o aproximadamente 45 %, o aproximadamente 50 % de CO, o aproximadamente 55 % de CO, o aproximadamente 60 % de CO en volumen.

En realizaciones particulares de la invención, el alcohol producido por el proceso de fermentación es etanol. La reacción de fermentación también puede producir acetato.

En realizaciones particulares de la invención, la reacción de fermentación se lleva a cabo por una o más cepas de bacterias acetogénicas. Preferentemente, la bacteria acetogénica se selecciona de Clostridium, Moorella y Carboxydothermus, tales como Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii y Morella thermoacetica. En una realización, la bacteria acetogénica es Clostridium autoethanogenum.

También se describe un sistema para la fermentación microbiana de un sustrato para producir productos, que incluye un biorreactor configurado para realizar una fermentación deseada, medios de determinación configurados para determinar el pH de un caldo de fermentación durante la fermentación deseada y medios de control adaptados para controlar el suministro de sustrato.

El sistema puede configurarse para proporcionar un sustrato que comprende CO.

Los medios de control pueden configurarse para realizar uno o más ajustes al suministro de sustrato si el pH se ha desviado de un valor o intervalo predeterminado.

El sistema puede incluir medios de procesamiento. Los medios de procesamiento pueden estar vinculados a los medios de control, de manera que el suministro de sustrato se pueda regular automáticamente en respuesta a cambios de pH. El suministro de sustrato puede controlarse de manera que se suministren cantidades crecientes de sustrato cuando el pH disminuya y/o se proporcionen cantidades menores de sustrato cuando el pH aumenta.

También se describe un sistema para la fermentación microbiana de un sustrato para producir productos, que incluye un biorreactor configurado para realizar una fermentación deseada, medios de determinación configurados para determinar una cantidad de hidrógeno producido durante la fermentación deseada y medios de control adaptados para controlar el suministro de sustrato.

El sistema puede configurarse para proporcionar un sustrato que comprende CO. Los medios de determinación también pueden determinar la cantidad de sustrato consumido durante la fermentación. Los medios de determinación se pueden vincular opcionalmente a un medio de procesamiento de manera que se pueda determinar una proporción H2-^producido/CO^consumido.

Los medios de control pueden configurarse para realizar uno o más ajustes al suministro de sustrato si la proporción de H2^producido/CO^consumido se ha desviado de una valor o intervalo predeterminado.

Los medios de procesamiento pueden estar vinculados a los medios de control, de modo que el suministro de sustrato se pueda regular automáticamente en respuesta a los cambios en la producción de H2 y/o a la proporción de H2^producido/CO^consumido.

También se describe un sistema para la fermentación microbiana de un sustrato para producir productos que incluye:

i. un biorreactor configurado para realizar la fermentación de un sustrato que comprende CO

ii. medios de determinación; y

iii. medios de control;

en donde, los medios de control están configurados para controlar el suministro de un sustrato que comprende CO en respuesta a la determinación hecha mediante los medios de determinación.

Los medios de determinación se pueden configurar para determinar la cantidad de uno o más ácidos producidos en una fermentación.

Los medios de determinación se pueden configurar para determinar el pH de la fermentación.

Los medios de determinación se pueden configurar para determinar la cantidad de H2 producido en la fermentación.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describirá ahora en más detalle con referencia a las figuras adjuntas en las cuales:

Figura 1: es una representación esquemática de un sistema para realizar una reacción de fermentación para producir productos.

Figura 2: es una representación esquemática de un sistema para realizar una reacción de fermentación para producir productos.

Figura 3: muestra el crecimiento microbiano y la producción de metabolitos como se describe en el ejemplo 1. Figura 4: muestra el consumo de CO y la producción de H2 como se describe en el ejemplo 1.

Figura 5: muestra el crecimiento microbiano y la producción de metabolitos como se describe en el ejemplo 2. Figura 6: muestra el consumo de CO y la producción de H2 como se describe en el ejemplo 2.

Figura 7: muestra el crecimiento microbiano y la producción de metabolitos como se describe en el ejemplo 3. Figura 8: muestra el consumo de CO y la producción de H2 como se describe en el ejemplo 3.

Figura 9: muestra el crecimiento microbiano y la producción de metabolitos como se describe en el ejemplo 4. Figura 10 muestra los cambios de pH durante la fermentación como se describe en el ejemplo 4.

Figura 11 muestra el consumo/producción de gas como se describe en el ejemplo 5A.

Figura 12 muestra el crecimiento microbiano y la producción de metabolitos como se describe en el ejemplo 5A. Figura 13 muestra el consumo/producción de gas como se describe en el ejemplo 5B.

Figura 14 muestra el crecimiento microbiano y la producción de metabolitos como se describe en el ejemplo 5B. Figura 15 muestra el consumo/producción de gas como se describe en el ejemplo 6.

Figura 16 muestra el crecimiento microbiano y la producción de metabolitos como se describe en el ejemplo 6.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un método para optimizar el suministro de un sustrato que comprende CO a un biorreactor, en donde el sustrato se fermenta para producir productos que incluyen uno o más alcohol(es) y/o ácido(s) mediante un cultivo de uno o más microorganismos carboxidotróficos, incluyendo el método determinar los niveles de ácido en el biorreactor en un primer punto temporal y un segundo punto temporal, en donde un aumento en el nivel de ácido entre el primer y el segundo puntos temporales da como resultado un aumento del suministro de sustrato, en donde una disminución en el nivel de ácido entre el primer y segundo puntos temporales da como resultado una disminución en el suministro de sustrato y en donde el sustrato se proporciona de manera que los niveles de ácido se mantienen entre concentraciones umbral predeterminadas de 1 a 10 g/l de caldo de fermentación. En realizaciones particulares de la invención, el sustrato se proporciona a una o más bacterias carboxidotróficas, tales como bacterias acetogénicas. En condiciones anaerobias adecuadas, bacterias acetogénicas, tales como Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei y Clostridium carboxydivorans convierten un sustrato que comprende CO en productos que incluyen ácidos y alcoholes.

Se ha reconocido que el suministro de un sustrato, tal como un sustrato que comprende CO, a un cultivo microbiano en o próximo a un nivel o intervalo óptimo puede dar como resultado un crecimiento microbiano óptimo y/o la producción de metabolitos deseada, como se describe en el documento WO2010/093262. Por ejemplo, se reconoce que suministrar un sustrato que comprende CO a un nivel óptimo o próximo a un nivel óptimo, a un cultivo microbiano que comprende uno o más microorganismos carboxidotróficos da como resultado un buen crecimiento microbiano y la producción de productos deseados, tales como uno o más alcoholes.

Para mantener el crecimiento microbiano óptimo y la producción de los productos deseados, el sustrato debe proporcionarse al cultivo microbiano en o próximo a un nivel óptimo de forma sustancialmente continua durante el transcurso de la fermentación. La desviación del suministro óptimo puede provocar una desaceleración del crecimiento, la producción de productos menos deseables o, en casos extremos, puede provocar la inhibición del crecimiento microbiano o la muerte microbiana.

Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se considera que al menos una parte de un sustrato, particularmente un sustrato que comprende CO, se oxida mediante un cultivo microbiano para producir energía (equivalentes reductores) que se puede utilizar en la producción de metabolitos y/o en el crecimiento celular. El aumento del suministro de sustrato conduce a un aumento en la reducción de equivalentes disponibles para la producción de metabolitos y/o crecimiento. Normalmente, en un cultivo con sustrato limitado, se utilizan equivalentes reductores para que el cultivo microbiano crezca y produzca productos tales como ácido(s). Sin embargo, a medida que aumenta el suministro de sustrato, un microbio puede usar el sustrato adicional para producir equivalentes reductores adicionales, que se puede usar para reducir el producto(s) tales como ácido(s) a los productos deseables tales alcohol(es). A medida que aumenta el suministro de sustrato próximo a un nivel óptimo, la cantidad de alcohol(es) aumenta con respecto al ácido(s), ya que el microbio usa las cantidades crecientes de equivalentes reductores. Normalmente, en dichas realizaciones, el cultivo microbiano crecerá y producirá alcohol(es), tales como etanol.

El suministro de sustrato o el nivel al que se proporciona un sustrato a uno o más microorganismos está sustancialmente relacionado con la velocidad de transferencia de masa del sustrato a un caldo de fermentación acuoso. La transferencia de masa de un gas a un líquido es función de tres variables principales:

1. Fuerza impulsora de la concentración: La presión parcial de un componente gaseoso particular es sustancialmente proporcional a la velocidad a la que ese componente puede convertirse en una solución.

2. Área superficial interfacial: Cuanto mayor sea el área de superficie interfacial entre las fases gaseosa y líquida, mayor será la oportunidad de transferencia de masa. En particular, el área superficial interfacial es normalmente una función de la retención de gas y el tamaño de la burbuja.

3. Coeficiente de transferencia: El coeficiente de transferencia de un sistema está influenciado por una variedad de factores. Sin embargo, desde una perspectiva práctica, normalmente la mayor influencia es la velocidad relativa entre las fases líquida y gaseosa. Las velocidades relativas (y por lo tanto la transferencia de masa) se incrementan normalmente aumentando la turbulencia mediante agitación u otra mezcla.

Los expertos en la materia conocerán métodos para incrementar la transferencia de masa de un sustrato a la solución. Sin embargo, a modo de ejemplo, el suministro o nivel de sustrato se puede aumentar en uno o más de: aumentar la velocidad a la que se proporciona un sustrato a un biorreactor, aumentar la presión parcial del sustrato o por medios mecánicos, tal como aumentar la agitación de un biorreactor de tanque agitado, o aumentar las características de transferencia de masa de un biorreactor en particular. Se conocen muchos dispositivos y equipos para promover la transferencia de masa a microorganismos en la fermentación de sustratos gaseosos.

Se ha reconocido que el aumento de la cantidad de sustrato disponible para el cultivo microbiano, para la conversión en productos, próximo a un nivel óptimo conduce a un aumento en la cantidad de alcohol(es) producidos, en relación con el ácido(s). En realizaciones particulares de la invención, los productos se producen de tal manera que el cultivo produce una proporción de producto deseable de al menos 1:1; o al menos 1:2; o al menos 1:3; o al menos 1:4; o al menos 1:5; o al menos 1:10; o al menos 1:20; ácido: alcohol. En realizaciones particulares, la fermentación continua en estado estacionario de un sustrato que comprende CO producirá productos que incluyen acetato y/o alcoholes. En realizaciones particulares, en estado estacionario, cuando el sustrato se proporciona en o próximo a un nivel óptimo, el acetato se mantiene a una concentración de menos de 10 g/l, o menos de 9 g/l, o menos de 8 g/l, o menos de 7 g/l, o menos de 6 g/l, o menos de 5 g/l en el caldo de fermentación.

En otras realizaciones de la invención, el alcohol (particularmente el etanol) se produce sin la producción concomitante de ácido (particularmente acetato). Sin embargo, la disponibilidad excesiva (por exceso de suministro) de sustrato puede provocar problemas de cultivo, tal como inhibición del crecimiento y/o muerte microbiana.

También se describen métodos para optimizar la fermentación microbiana de un sustrato, particularmente un sustrato que comprende CO, mediante el control del suministro del sustrato, de manera que se proporcione en un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo para promover la viabilidad y crecimiento del cultivo y la producción de metabolitos deseables, tales como etanol. Se reconoce que el nivel (o intervalo) óptimo puede cambiar con el tiempo debido al tamaño de la población microbiana. Por ejemplo, un sustrato se proporciona en o próximo a un nivel óptimo, cuando el cultivo produce ácido(s), tal como acetato, a una tasa específica de menos de 2 g/g de biomasa/día, o menos de 1,5 g/g/día, o menos de 1,2 g/g/día, o menos de 1 g/g/día.

Por tanto, en la presente memoria se describen medios para optimizar el suministro de sustrato independientemente del tamaño del cultivo microbiano. Por ejemplo, en la fermentación por lotes o por lotes alimentados, un cultivo microbiano crecerá exponencialmente durante la fase de crecimiento. Como tal, el sustrato debe suministrarse en cantidades crecientes, de modo que se proporcione continuamente una cantidad sustancialmente óptima de sustrato. Adicionalmente o como alternativa, en un cultivo continuo, el sustrato debe proporcionarse en o próximo a un nivel o intervalo óptimo durante un período prolongado para mantener el crecimiento microbiano sostenible y la producción de metabolitos deseada. Se reconoce que los pequeños cambios en las condiciones operativas, tales como la tasa de suministro de medios frescos, la temperatura, el pH, ORP, y la viabilidad del cultivo, pueden provocar cambios en los niveles de biomasa y, por lo tanto, en los requisitos del sustrato. De acuerdo con los métodos de la invención, se puede proporcionar un sustrato en o próximo a un nivel óptimo, independientemente de los cambios en la biomasa.

T ambién se describe un método de optimización que incluye controlar el pH de un medio de fermentación y monitorizar el suministro de un sustrato basado en determinaciones de pH o cambios de pH a lo largo del tiempo. Puede proporcionarse un sustrato a un cultivo microbiano en un medio de fermentación de manera que el pH del medio cambie sustancialmente en o próximo a una tasa de cambio predeterminada o dentro de un intervalo de tasa de cambio predeterminada. Normalmente, la tasa de cambio se acerca a cero, de modo que en algunas realizaciones el pH del medio se mantiene sustancialmente constante o dentro de un intervalo predeterminado. Normalmente, durante períodos de suministro limitado de sustrato, las bacterias acetogénicas producen productos que incluyen ácido acético. Como tal, el pH de un medio de fermentación que contiene un cultivo acetogénico limitado por sustrato disminuirá a menos que pueda controlarse mediante la adición de una base. De acuerdo con la invención descrita en el documento WO2009/113878 cuando se sobreabastece un sustrato que comprende CO, el acetato se convertirá en alcohol y el pH aumentará a menos que pueda controlarse mediante la adición de un ácido. Por tanto, en condiciones óptimas de crecimiento y/o producción de alcohol, un cultivo microbiano puede producir o consumir metabolitos ácidos. Normalmente, la productividad óptima del alcohol se asocia con la coproducción de ácido(s) tales como el acetato. Por tanto, la producción de metabolitos ácidos, tales como el acetato, dará como resultado una disminución del pH del caldo de fermentación con el tiempo. Normalmente, los productos se producen de tal manera que el cultivo produce una proporción de producto deseable de al menos 1:1; o al menos 1:2; o al menos 1:3; o al menos 1:4; o al menos 1:5; o al menos 1:10; o al menos 1:20; ácido: alcohol y el pH cambiará como resultado de la producción de ácido por el cultivo microbiano.

Se reconoce que el pH de un caldo de fermentación puede cambiar debido a diversas influencias, tales como el consumo o la producción de uno o más ácidos o bases, o una combinación de los mismos. Por ejemplo, la fijación de nitrógeno por un cultivo microbiano durante el crecimiento microbiano puede dar como resultado una disminución del pH. Los microorganismos carboxidotróficos tales como Clostridium autoethanogenum pueden absorber nitrógeno en forma de NH3, lo que puede dar como resultado una disminución del pH de un caldo de fermentación con el tiempo. El cultivo microbiano también puede producir y/o consumir otros metabolitos, tales como fosfato y/o lactato, afectando por tanto el pH de un caldo de fermentación. Se reconoce que el acetato es normalmente un producto importante en la fermentación por bacterias acetogénicas y normalmente tiene la mayor influencia en el pH.

En el presente documento se describe un método para proporcionar un sustrato en o próximo a un nivel o intervalo óptimo, incluyendo el método mantener el cambio de pH sustancialmente en o próximo a una tasa de cambio predeterminada. Normalmente, se puede determinar experimentalmente una tasa deseada de cambio de pH para un cultivo microbiano dado. Por ejemplo, se puede suministrar a un cultivo microbiano una cantidad óptima de sustrato para un crecimiento óptimo y/o producción deseada de metabolitos y controlar los cambios de pH. Durante la fermentación, el cultivo microbiano puede producir y/o consumir componentes ácidos y/o básicos, dando como resultado un cambio en el pH con el tiempo. Esta tasa (pre)determinada) de cambio de pH se puede utilizar para controlar el suministro de sustrato a un cultivo microbiano en fermentaciones posteriores.

Normalmente, un cultivo de microorganismos con suministro óptimo crece y produce metabolitos que incluyen alcoholes (tales como etanol) y ácidos (tales como acetato). Durante la producción de metabolitos en estado estacionario, la producción de ácido(s) permanecerá sustancialmente constante de manera que haya una tasa sustancialmente constante de cambio de pH. Si el pH disminuye más rápidamente que la tasa de cambio predeterminada, se puede determinar que el cultivo está produciendo más ácido(s) y el suministro de sustrato se puede aumentar hasta la tasa óptima. Si el pH disminuye más despacio que la tasa de cambio predeterminada, se puede inferir que el cultivo produce ácido(s) a una tasa más lenta y el suministro de sustrato se puede reducir hasta una tasa óptima. Si el pH aumenta, se puede inferir que el cultivo consume ácido(s) y el suministro de sustrato se puede reducir hasta una tasa óptima.

El cambio de pH se puede contrarrestar mediante la adición de un ácido o una base para mantener un pH sustancialmente constante. En este caso, la tasa de ácido/base añadida a la fermentación se puede utilizar para determinar el suministro óptimo de sustrato.

Se ha reconocido sorprendentemente que el crecimiento microbiano y la producción de alcohol se pueden optimizar manteniendo el pH a un nivel predeterminado, o dentro de un intervalo predeterminado, suministrando un sustrato que comprende CO, a un nivel deseable. El pH se puede mantener a un nivel predeterminado, o dentro de un intervalo predeterminado, asegurándose de que no haya producción o consumo neto de metabolitos ácidos, tal como acetato. En este caso, la tasa de cambio de pH es aproximadamente cero. Si, durante la fermentación, el pH comienza a disminuir, se puede inferir que el cultivo produce ácido(s), tal como acetato, y que el cultivo está limitado por el sustrato. Por tanto, de acuerdo con el método de la invención, se aumenta el suministro de sustrato. En cambio, si durante la fermentación, el pH empieza a aumentar, se puede inferir que existe una conversión neta de ácido(s), tal como acetato, en alcohol(es), tal como etanol, y que el cultivo está sobreabastecido de sustrato. Por tanto, de acuerdo con el método de la invención, se reduce el suministro de sustrato.

Este método de control es de particular importancia en un cultivo microbiano en crecimiento, ya que el requisito de sustrato del cultivo cambiará con el tiempo. Por ejemplo, un nivel óptimo de sustrato en un punto temporal determinado puede ser una cantidad limitante de sustrato en un momento posterior, si el cultivo ha crecido en la operación por lotes. Se considera que durante el crecimiento exponencial, la cantidad óptima de sustrato requerida también aumentará sustancialmente de manera exponencial. En funcionamiento continuo, incluso en estado estacionario, el estado dinámico del cultivo significa que se puede suministrar continuamente un suministro de sustrato en o próximo a un nivel o intervalo óptimo en respuesta a pequeños cambios en el cultivo microbiano.

Se reconoce que el suministro óptimo de un sustrato también puede depender de los requisitos operativos de fermentación. Por ejemplo, en la fermentación discontinua (o el inicio de la fase discontinua de un cultivo continuo) puede ser deseable proporcionar un sustrato de manera que no haya producción o consumo neto de acetato y no haya cambios en el pH. En funcionamiento continuo, puede ser deseable producir continuamente pequeñas cantidades de acetato, de manera que se pueda mantener un cultivo estable.

Adicionalmente o como alternativa, la acumulación y/o consumo de metabolitos, tales como acetato y otros ácidos tales como lactato o bases tales como NH3, se pueden monitorizar mediante cualquier medio conocido en la técnica y controlar el suministro de sustrato en respuesta a los niveles de metabolitos. Por ejemplo, la concentración de acetato y/o lactato en un fermentador se puede monitorizar de forma periódica o sustancialmente continua mediante una variedad de técnicas analíticas, tales como GC, HPLC, GCIR, GCMS, LCMS, NIR mediante una o más sonda(s) selectivas, tales como sondas amperométricas u otros ensayos adecuados, conocidos por los expertos en la materia. Las concentraciones de metabolitos se pueden monitorizar en los medios de fermentación en el biorreactor y/o en los medios que salen del biorreactor (tal como la corriente de producto de una fermentación continua) y los niveles de sustrato se optimizan en función de los metabolitos medidos en los medios. Por ejemplo, si el acetato comienza a acumularse en el medio por encima de un umbral predeterminado, el suministro de sustrato puede aumentar de acuerdo con el método de la invención. De manera similar, si la concentración de acetato disminuye por debajo de un umbral predeterminado o preestablecido, se puede disminuir el suministro de sustrato. En realizaciones particulares, en estado estacionario, cuando el sustrato se proporciona en o próximo a un nivel óptimo, el acetato se mantiene dentro de una concentración predeterminada de aproximadamente 1-10 g/l, o aproximadamente 2-8 g/l, o aproximadamente 3-7 g/l, o aproximadamente 4-6 g/l.

En realizaciones particulares, en estado estacionario, cuando el sustrato se proporciona en o próximo a un nivel óptimo, el acetato se mantiene a una concentración de aproximadamente 10 g/l, o aproximadamente 9 g/l, o aproximadamente 8 g/l, o aproximadamente 7 g/l, o aproximadamente 6 g/l, o aproximadamente 5 g/l en el caldo de fermentación. En realizaciones particulares, un sustrato se proporciona en o próximo a un nivel óptimo, cuando el cultivo produce ácido(s), tal como acetato, a una tasa específica de menos de 2 g/g de biomasa/día, o menos de 1,5 g/g/día, o menos de 1,2 g/g/día, o menos de 1 g/g/día.

Por tanto, de acuerdo con los métodos de la invención, el pH del medio puede usarse como una indicación de que el cultivo se suministra con una cantidad sustancialmente óptima de sustrato, o al menos dentro de un intervalo óptimo. Adicionalmente, manteniendo el medio a un pH deseado o dentro de un intervalo de pH predeterminado, se puede optimizar el suministro de sustrato, particularmente el suministro de un sustrato que comprende CO.

También se describe un método para mejorar la fermentación microbiana que incluye monitorizar la producción de hidrógeno (H2) mediante un cultivo microbiano y controlar el suministro de un sustrato basado en la producción de H2. El H2 puede ser producido por uno o más microorganismos carboxidotróficos cuando se proporciona un sustrato que comprende CO y un mínimo o nada de H2 en o próximo a un nivel o intervalo óptimo. Durante períodos de suministro limitado de sustrato, las bacterias carboxidotróficas, tales como Clostridium autoethanogenum, pueden convertir una parte del sustrato en productos, tales como ácido(s) y pequeñas cantidades de alcohol(es) y una parte adicional se dirige a la producción anabólica de material celular (crecimiento). Durante tales períodos de suministro limitado de sustrato, sustancialmente no se produce H2. Se ha reconocido sorprendentemente que cuando el suministro de sustrato aumenta próximo a un nivel óptimo, las bacterias carboxidotróficas, tales como C. autoethanogenum, convierten una parte del sustrato en productos tales como ácido(s) y alcohol(es), una parte en material celular y otra parte en H2. Normalmente, cuando se proporciona un sustrato, particularmente un sustrato que comprende CO, a un nivel o próximo a un nivel óptimo, o dentro de un intervalo óptimo, se produce H2 además de los metabolitos deseados tales como etanol. También se reconoce que el exceso de suministro de un sustrato que comprende CO puede conducir a la inhibición de la(s) enzima(s) hidrogenasa(s), reduciendo así la cantidad de H2 producida por el cultivo. Por tanto, el sustrato se puede proporcionar a un nivel o próximo a un nivel óptimo, o dentro de un intervalo óptimo mediante la monitorización del H2 producido por el cultivo.

Cuando el sustrato comprende CO, a medida que la disponibilidad del sustrato aumenta por encima de una cantidad óptima (o por encima de un intervalo óptimo), el exceso de CO inhibe la(s) enzima(s) hidrogenasa, evitando así sustancialmente la producción de H2. A medida que se inhiben la(s) enzima(s) hidrogenasa(s), el microbio no puede liberarse del exceso de poder reductor, lo que conduce a problemas de cultivo tales como inhibición del crecimiento y/o muerte microbiana.

Por tanto, el hidrógeno producido por un cultivo microbiano puede usarse como una indicación de que el cultivo se suministra con una cantidad sustancialmente óptima de sustrato, o al menos dentro de un intervalo óptimo. Adicionalmente, la producción de hidrógeno mediante un cultivo microbiano puede usarse para controlar el suministro de sustrato al cultivo microbiano. Por ejemplo, el suministro de sustrato a un cultivo limitado por sustrato se puede incrementar hasta que se observe la producción de hidrógeno. Una vez iniciada la producción de hidrógeno, el suministro de sustrato se puede ajustar para mantener la producción de hidrógeno a lo largo del tiempo. A medida que crece un cultivo microbiano, se puede incrementar el suministro de sustrato para mantener la producción de hidrógeno.

Este método de control es de particular importancia en un cultivo microbiano en crecimiento, ya que el requisito de sustrato del cultivo cambiará con el tiempo. Por ejemplo, un nivel óptimo de sustrato en un punto temporal determinado puede ser una cantidad limitante de sustrato en un momento posterior, si el cultivo ha crecido. Se considera que durante el crecimiento exponencial, la cantidad óptima de sustrato requerida también aumentará sustancialmente de manera exponencial.

Se reconoce que las enzimas hidrogenasa son reversibles, por lo que un cultivo microbiano puede usar un componente de hidrógeno de una corriente de sustrato que comprende hidrógeno como fuente de energía. Por tanto, los métodos de optimización emplean un sustrato que comprende CO que contiene cantidades mínimas de hidrógeno o está sustancialmente exento de hidrógeno.

Definiciones

A menos que se definan de otra manera, los siguientes términos como se utilizan en esta memoria descriptiva se definen de la siguiente manera: Las expresiones "que aumenta la eficacia", "eficacia aumentada" y similares, cuando se utilizan en relación a un proceso de fermentación, incluyen, pero sin limitación, el aumento de uno o más de: la tasa de crecimiento de los microorganismos que catalizan la fermentación, el volumen del producto deseado (tal como alcoholes) producido por volumen de sustrato (tal como monóxido de carbono) consumido, la velocidad de producción o el nivel de producción del producto deseado, y la proporción relativa del producto deseado producido en comparación con otros subproductos de la fermentación. De manera similar, "optimización" o similar incluye incrementar la eficiencia hacia una eficiencia máxima dado un conjunto particular de condiciones de fermentación.

La expresión "sustrato que comprende monóxido de carbono" y expresiones similares, incluyen cualquier sustrato en el que una o más cepas de bacterias disponen de monóxido de carbono para su crecimiento y/o fermentación, por ejemplo.

Los "sustratos gaseosos que comprenden monóxido de carbono" incluyen cualquier gas que contenga monóxido de carbono. El sustrato gaseoso contendrá normalmente una proporción significativa de CO, preferentemente al menos de aproximadamente 5 % a aproximadamente 100 % de CO en volumen.

En el contexto de los productos de fermentación, el término "ácido" como se usa en el presente documento, incluye tanto ácidos carboxílicos como el anión carboxilato asociado, tal como la mezcla de ácido acético libre y acetato presente en un caldo de fermentación como se describe en el presente documento. La relación de ácido molecular a carboxilato en el caldo de fermentación depende del pH del sistema. El término "acetato" incluye tanto la sal de acetato sola como una mezcla de ácido acético molecular o libre y sal de acetato, tal como la mezcla de sal de acetato y ácido acético libre presente en un caldo de fermentación como puede describirse en el presente documento. La relación de ácido acético molecular a acetato en el caldo de fermentación depende del pH del sistema.

El término "biorreactor" incluye un dispositivo de fermentación que consiste en uno o más recipientes y/o torres o tuberías, que incluye el reactor de tanque agitado de flujo continuo (CSTR), el reactor de células inmovilizadas (ICR), el reactor de lecho percolador (TBR), el reactor de película biológica de lecho en movimiento (MBBR), columna de burbujeo, fermentador de elevación de gases, reactor de membrana, tal como el biorreactor de membrana de fibra hueca (HFMBR), mezclador estático u otro recipiente u otro dispositivo adecuado para el contacto de gas-líquido.

La expresión "transferencia de masa", como se usa en el presente documento, se refiere a la transferencia de átomos o moléculas, particularmente átomos o moléculas de sustrato desde una fase gaseosa a una solución acuosa.

A menos que el contexto requiera lo contrario, las frases "fermentación", "proceso de fermentación" o "reacción de fermentación" y similares, como se usa en el presente documento, pretenden abarcar tanto la fase de crecimiento como la fase de biosíntesis de producto del proceso. Como se describirá además en el presente documento, en algunas realizaciones el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento y un segundo reactor de fermentación. Como tal, debe entenderse que la adición de metales o composiciones a una reacción de fermentación incluye la adición a uno o ambos de estos reactores.

Si bien la siguiente descripción se centra en realizaciones particulares de la invención, concretamente la producción de etanol y/o acetato utilizando CO como sustrato primario, debe apreciarse que la invención puede ser aplicable a la producción de alcoholes y/o ácidos alternativos como será conocido por los expertos con conocimientos ordinarios en la materia a la que se refiere la invención. Adicionalmente, la invención puede aplicarse a la fermentación para producir butirato, propionato, caproato, etanol, propanol y butanol. Los métodos también pueden utilizarse para producir hidrógeno. A modo de ejemplo, estos productos se pueden producir mediante fermentación usando microbios del género Moorella, Clostridia, Ruminococcus, Acetobacterium, Eubacterium, Butyribacterium, Oxobacter, Methanosarcina, Methanosarcina, y Desulfotomaculum.

Ciertas realizaciones de la invención están adaptadas para usar corrientes de gas producidas por uno o más procesos industriales. Tales procesos incluyen procesos de fabricación de acero, en particular procesos que producen una corriente de gas que tiene un alto contenido de CO o un contenido de CO por encima de un nivel predeterminado (es decir, 5 %). De acuerdo con dichas realizaciones, se usan preferentemente bacterias acetogénicas para producir ácidos y/o alcoholes, particularmente etanol o butanol, dentro de uno o más biorreactorres. Los expertos en la materia sabrán, al considerar la presente divulgación, que la invención puede aplicarse a diversas industrias o corrientes de gas residual, incluidas las de vehículos con motor de combustión interna. Asimismo, los expertos en la materia sabrán, al considerar la presente divulgación, que la invención puede aplicarse a otras reacciones de fermentación, incluidas aquellas que utilizan el mismo o diferentes microorganismos. Por tanto, se pretende que el alcance de la invención no se limite a las realizaciones y/o aplicaciones particulares descritas, sino que debe entenderse en un sentido más amplio; por ejemplo, la fuente de la corriente de gas no es limitante, salvo que al menos un componente de la misma se pueda utilizar para alimentar una reacción de fermentación. La invención tiene una aplicabilidad particular para mejorar la absorción total de carbono y/o la producción de etanol y otros alcoholes a partir de sustratos gaseosos tales como gases de escape de automóviles y gases de combustión industriales que contienen CO en un alto volumen.

Fermentación

Se conocen procesos para la producción de etanol y otros alcoholes a partir de sustratos gaseosos. Los ejemplos de procesos incluyen los descritos, por ejemplo, en los documentos WO2007/117157, WO2008/115080, US 6.340.581, US 6.136.577, US 5.593.886, US 5.807.722 y US 5.821.111.

Se sabe que varias bacterias anaerobias carboxidotróficas son capaces de llevar a cabo la fermentación de CO a alcoholes, incluyendo n-butanol, etanol y ácido acético, y son adecuadas para usar en los procesos de la presente invención. Ejemplos de tales bacterias que son adecuadas para usar en la invención incluyen las del género Clostridium, tales como cepas de Clostridium ljungdahlii, incluyendo las descritas en los documentos WO 00/68407, EP 117309, en las patentes de Estados Unidos N.° 5.173.429, 5.593.886 y 6.368.819, WO 98/00558 y WO 02/08438, Clostridium carboxydivorans (Liou et al., International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 33: pág.

2085-2091), Clostridium ragsdalei (WO/2008/028055) y Clostridium autoethanogenum (Abrini et al, Archives of Microbiology 161: pág 345-351). Otras bacterias adecuadas incluyen las del género Moorella, incluyendo Moorella sp HUC22-1, (Sakai et al, Biotechnology Letters 29: págs. 1607-1612), y las del género Carboxydothermus (Svetlichny, V.A., Sokolova, T.G. et al (1991), Systematic and Applied Microbiology 14: 254-260). Otros ejemplos incluyen Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica, Ruminococcus productus, Acetobacterium woodii, Eubacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Oxobacter pfennigii, Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Desulfotomaculum kuznetsovii (Simpa et. al. Critical Reviews in Biotechnology, 2006 Vol. 26. pág. 41-65). Además, debe entenderse que otras bacterias anaerobias carboxidotróficas y/o acetogénicas pueden ser aplicables a la presente invención, como entendería un experto en la materia. También se entenderá que la invención se puede aplicar a un cultivo mixto de dos o más bacterias.

Un ejemplo de microorganismo adecuado para su uso en la presente invención es Clostridium autoethanogenum. En una realización, el Clostridium autoethanogenum es un Clostridium autoethanogenum que tiene las características de identificación de la cepa depositada en el German Resource Centre for Biological Material (DSMZ y que tiene el número de depósito 19630. En otra realización, el Clostridium autoethanogenum es un Clostridium autoethanogenum que tiene las características identificativas del número de depósito DSMZ 10061.

El cultivo de las bacterias que se utilizan en los métodos de la invención, puede realizarse utilizando cualquiera de los diversos procesos conocidos en la técnica para cultivar y fermentar sustratos utilizando bacterias anaerobias. En la sección de "Ejemplos" se proporcionan ejemplos de técnicas. A modo de ejemplo adicional, pueden utilizarse los procesos descritos, en líneas generales, en los siguientes artículos, en los que se utilizan sustratos gaseosos para la fermentación: (i) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactors for synthesis gas fermentations resources. Conservation and Recycling, 5; 145-165; (ii) K. T. Klasson, et al. (1991). Bioreactor design for synthesis gas fermentations. Fuel. 70. 605­ 614; (iii) K. T. Klasson, et al. (1992). Bioconversion of synthesis gas into liquid or gaseous fuels. Enzyme and Microbial Technology. 14; 602-608; (iv) J. L. Vega, et al. (1989). Study of Gaseous Substrate Fermentation: Carbon Monoxide Conversion to Acetate. 2. Continuous Culture. Biotech. Bioeng. 34. 6. 785-793; (v) J. L. Vega, et al. (1989). Study of gaseous substrate fermentations: Carbon monoxide conversion to acetate. 1. Cultivo discontinuo. Biotechnology and Bioengineering. 34. 6. 774-784; (vi) J. L. Vega, et al. (1990). Design of Bioreactors for Coal Synthesis Gas Fermentations. Resources, Conservation and Recycling. 3. 149-160.

La fermentación puede llevarse a cabo en cualquier biorreactor adecuado, tal como un reactor de tanque agitado continuo (CSTR), un reactor de células inmovilizadas, un reactor de elevación de gases, un reactor de columna de burbujas (BCR), un reactor de membrana, tal como un biorreactor de membrana de fibra hueca (HFMBR) o un reactor de lecho percolador (TBR). Asimismo, en algunas realizaciones de la invención, el biorreactor puede comprender un primer reactor de crecimiento en el cual se cultivan los microorganismos, y un segundo reactor de fermentación, al que puede suministrarse caldo de fermentación desde el reactor de crecimiento y en el que se produce la mayor parte del producto de fermentación (por ejemplo, etanol y acetato).

De acuerdo con diversas realizaciones de la invención, la fuente de carbono para la reacción de fermentación es un sustrato gaseoso que contiene CO. El sustrato gaseoso puede ser un gas residual que contiene CO obtenido como un subproducto de un proceso industrial, o de alguna otra fuente tal como gases de escape de automóviles. En determinadas realizaciones, el proceso industrial se selecciona del grupo que consiste en la fabricación de productos de metales ferrosos, tales como un molino de acero, fabricación de productos no ferrosos, procesos de refinación de petróleo, gasificación de carbón, producción de energía eléctrica, producción de negro de carbón, producción de amoniaco, producción de metanol y fabricación de coque. En estas realizaciones, el sustrato que contiene CO se puede capturar del proceso industrial antes de que se emita a la atmósfera, usando cualquier método conveniente. Dependiendo de la composición del sustrato que contiene CO, también puede ser deseable tratarlo para retirar cualquier impureza no deseada, tal como partículas de polvo antes de introducirlo en la fermentación. Por ejemplo, el sustrato gaseoso puede filtrarse o lavarse utilizando métodos conocidos.

Como alternativa, el sustrato que contiene CO puede proceder de la gasificación de biomasa. El proceso de gasificación implica la combustión parcial de biomasa en una alimentación restringida de aire u oxígeno. El gas resultante comprende principalmente CO y H² , con volúmenes mínimos de CO² , metano, etileno y etano. Por ejemplo, los subproductos de la biomasa obtenidos durante la extracción y el procesamiento de alimentos tales como el azúcar de la caña de azúcar o el almidón de maíz o cereales, o los residuos de biomasa no alimentaria generados por la industria forestal pueden gasificarse para producir un gas que contenga CO adecuado para usar en la presente invención.

El sustrato que contiene CO normalmente contendrá una proporción importante de CO, tal como al menos de aproximadamente 20 % a aproximadamente 100 % de CO en volumen, de 40 % a 95 % de CO en volumen, de 40 % a 70 % de CO en volumen y de 40 % a 65 % de CO en volumen. En realizaciones particulares, el sustrato comprende 25 % o 30 % o 35 % o 40 % o 45 % o 50 % de CO en volumen. Los sustratos que tienen concentraciones más bajas de CO, tal como el 6 %, también pueden ser apropiados, particularmente cuando también haya H² y CO².

Si bien no es necesario que el sustrato contenga hidrógeno, la presencia de H² no debe ser perjudicial para la formación del producto de acuerdo con los métodos de la invención. En realizaciones particulares, la corriente de sustrato comprende bajas concentraciones de H2, por ejemplo, menos de 5 %, o menos de 4 %, o menos de 3 %, o menos de 2 %, o menos de 1 %, o está sustancialmente exenta de hidrógeno. El sustrato también puede contener algo de CO² por ejemplo, tal como de aproximadamente 1 % a aproximadamente 80 % de CO² en volumen, o de 1 % a aproximadamente 30 % de CO² en volumen.

En realizaciones particulares, en donde el pH se utiliza para controlar el suministro de sustrato, el sustrato puede comprender cantidades sustanciales de H2. En realizaciones particulares, la presencia de hidrógeno da como resultado una eficiencia de la producción de alcohol global mejorada. Por ejemplo, en realizaciones particulares, el sustrato puede comprender una proporción aproximada de 2:1 o 1:1 o 1:2 de H2:CO.

Normalmente, el dióxido de carbono se añadirá a la reacción de fermentación en estado gaseoso. Sin embargo, los métodos de la invención no se limitan a la adición de dióxido de carbono en este estado. Por ejemplo, el monóxido de carbono puede proporcionarse en un líquido.

Por ejemplo, un líquido puede saturarse con un gas que contenga monóxido de carbono y ese líquido puede añadirse al biorreactor. Esto puede realizarse utilizando metodología estándar. A modo de ejemplo, para este fin se podría utilizar un generador de dispersión de microburbujas (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersión generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology Volume 101, Número 3 / Octubre, 2002).

Normalmente, se suministrará un sustrato gaseoso a un caldo de fermentación acuoso que comprende uno o más microorganismos de manera que se produzca una transferencia de masa eficaz a través de la interfaz gas/líquido. Se conocen muchos métodos para aumentar la eficiencia de la transferencia de masa de un sustrato que comprende CO a un caldo de fermentación acuoso, todos los cuales se incorporan en el presente documento como si especificasen individualmente. En realizaciones particulares, la tasa de transferencia de masa del sustrato que comprende CO se controla de manera que el sustrato se proporcione en o próximo a una tasa óptima de acuerdo con los métodos de la invención.

Se apreciará que para que se produzca el crecimiento de las bacterias y la fermentación de CO a alcohol, además del gas sustrato que contiene CO, será necesario alimentar al biorreactor con un medio nutriente líquido adecuado. Un medio nutriente contendrá vitaminas y minerales suficientes para permitir el crecimiento del microorganismo utilizado. Se conocen en la técnica medios anaerobios adecuados para la fermentación de etanol usando CO como única fuente de carbono. Por ejemplo, se describen medios adecuados en las patentes de los Estados Unidos n.° 5.173.429 y 5.593.886 y en los documentos WO 02/08438, WO2007/115157, WO2008/115080 y WO2009/022925 citados anteriormente.

De manera deseable, la fermentación debe realizarse en condiciones apropiadas para que se produzca la fermentación deseada (por ejemplo, CO a etanol). Las condiciones de reacción que deben considerarse incluyen presión, temperatura, caudal de gas, caudal de líquido, pH del medio, potencial redox de los medios, velocidad de agitación (en caso de utilizar un reactor de tanque agitado de flujo continuo), nivel de inóculo, concentraciones máximas de sustrato gaseoso para garantizar que el CO en la fase líquida no se vuelve limitante, y concentraciones máximas del producto para evitar la inhibición del producto. Las condiciones adecuadas se describen en los documentos WO02/08438, WO07/117157, WO2008/115080 y WO2009/022925.

Las condiciones óptimas de reacción dependerán en parte del microorganismo particular utilizado. Sin embargo, en realizaciones particulares, la fermentación se realiza a una presión superior a la presión ambiental. El funcionamiento a presiones aumentadas permite un aumento significativo en la tasa de transferencia de CO desde la fase gaseosa a la fase líquida, donde el microorganismo puede absorberlo como fuente de carbono para la producción de etanol. Esto a su vez significa que el tiempo de retención (definido como el volumen de líquido en el biorreactor dividido entre el caudal de gas de entrada) puede reducirse cuando los biorreactores se mantienen a presión elevada en lugar de a presión atmosférica.

Se reconoce que la tasa de transferencia de masa de CO a un medio acuoso es proporcional a la presión parcial de un sustrato gaseoso que comprende CO. Como tal, la tasa de transferencia de masa se puede aumentar aumentando la proporción de CO en una corriente de gas por enriquecimiento o eliminación. de componentes no deseados, tales como componentes inertes. Además, la presión parcial de CO puede aumentar la presión de una corriente de sustrato gaseoso.

Los beneficios de llevar a cabo una fermentación de gas a etanol a presiones elevadas también se han descrito en otra parte. Por ejemplo, El documento WO 02/08438 describe fermentaciones de gas a etanol realizadas a presiones de 0,20 MPa (30 psig) y 0,51 MPa (75 psig), dando productividades de etanol de 150 g/l/día y ³⁶⁹ g/l/día, respectivamente. Sin embargo, se descubrió que las fermentaciones de ejemplo realizadas utilizando medios similares y composiciones de gases de entrada a presión atmosférica producían entre 10 y 20 veces menos etanol por litro al día.

También es deseable que la tasa de introducción del sustrato gaseoso que contiene CO sea tal que asegure que la concentración de CO en la fase líquida no se vuelva limitante. Esto se debe a que una consecuencia de las condiciones limitadas de CO puede ser que el cultivo consuma el producto de etanol.

Recuperación de los productos

Los productos de la reacción de fermentación pueden recuperarse utilizando métodos conocidos. Los ejemplos de métodos incluyen los descritos en los documentos WO07/117157, WO08/115080, US 6.340.581, US 6.136.577, US 5.593.886, US 5.807.722 y US 5.821.111. Sin embargo, brevemente y solo como ejemplo, el etanol puede recuperarse del caldo de fermentación mediante métodos tales como destilación fraccionada o evaporación, y fermentación extractiva.

La destilación de etanol de un caldo de fermentación produce una mezcla azeotrópica de etanol y agua (es decir, 95 % de etanol y 5 % de agua). Posteriormente se puede obtener etanol anhidro mediante el uso de tecnología de deshidratación de etanol por tamiz molecular, que también es bien conocida en la técnica.

Los procedimientos de fermentación extractiva implican el uso de un disolvente miscible en agua que presenta un bajo riesgo de toxicidad para el organismo de fermentación, para recuperar el etanol del caldo de fermentación diluido. Por ejemplo, el alcohol oleílico es un disolvente que puede utilizarse en este tipo de proceso de extracción. El alcohol oleílico se introduce continuamente en un fermentados después de lo cual, este disolvente se eleva formando una capa en la parte superior del fermentador que se extrae continuamente y se suministra a través de una centrifugadora. Después, el agua y las células se separan fácilmente del alcohol oleílico y se devuelven al fermentador mientras que el disolvente cargado de etanol se suministra a una unidad de vaporización instantánea. La mayor parte del etanol se evapora y condensa, mientras que el alcohol oleílico no es volátil y se recupera para su reutilización en la fermentación.

El acetato, que se produce como un subproducto en la reacción de fermentación, también se puede recuperar del caldo de fermentación usando métodos conocidos en la técnica.

Por ejemplo, se puede utilizar un sistema de adsorción que incluya un filtro de carbón activado. En este caso, se prefiere que las células microbianas se eliminen primero del caldo de fermentación utilizando una unidad de separación adecuada. Se conocen en la técnica numerosos métodos basados en la filtración para generar un caldo de fermentación exento de células para la recuperación del producto. El permeado que contiene etanol y acetato exento de células se pasa a continuación a través de una columna que contiene carbón activado para adsorber el acetato. El acetato en forma ácida (ácido acético) en lugar de la forma de sal (acetato) se adsorbe más fácilmente por el carbón activado. Por tanto, se prefiere que el pH del caldo de fermentación se reduzca a menos de aproximadamente 3 antes de pasar a través de la columna de carbón activado, para convertir la mayor parte del acetato en la forma de ácido acético.

El ácido acético adsorbido en el carbón activado puede recuperarse mediante elución usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar etanol para eluir el acetato unido. En determinadas realizaciones, el etanol producido por el propio proceso de fermentación puede usarse para eluir el acetato. Debido a que el punto de ebullición del etanol es 78,8 °C y el del ácido acético es 107 °C, el etanol y el acetato pueden separarse fácilmente entre sí utilizando un método basado en la volatilidad, tal como la destilación.

También se conocen en la técnica otros métodos para recuperar acetato de un caldo de fermentación y pueden usarse en los procesos de la presente invención. Por ejemplo, las patentes de Estados Unidos n.° 6.368.819 y 6.753.170 describen un sistema de disolvente y codisolvente que se puede usar para la extracción de ácido acético de los caldos de fermentación. Como en el ejemplo del sistema a base de alcohol oleílico descrito para la fermentación extractiva de etanol, los sistemas descritos en las patentes de Estados Unidos n.° 6.368.819 y 6.753.170 describen un solvente/codisolvente inmiscible en agua que puede mezclarse con el caldo de fermentación en presencia o ausencia de los microorganismos fermentados para extraer el producto de ácido acético. A continuación, el disolvente/codisolvente que contiene el producto de ácido acético se separa del caldo por destilación. A continuación, se puede utilizar una segunda etapa de destilación para purificar el ácido acético del sistema disolvente/codisolvente.

Los productos de la reacción de fermentación (por ejemplo, etanol y acetato) pueden recuperarse del caldo de fermentación eliminando continuamente una parte del caldo del biorreactor de fermentación, separando las células microbianas del caldo (convenientemente por filtración) y recuperando uno o más productos del caldo de forma simultánea o secuencial. En el caso del etanol, puede recuperarse convenientemente por destilación, y el acetato puede recuperarse por adsorción sobre carbón activado, usando los métodos descritos anteriormente. Las células microbianas separadas se pueden devolver al biorreactor de fermentación. El permeado exento de células que queda después de que se han eliminado el etanol y el acetato también se devuelve preferiblemente al biorreactor de fermentación. Se pueden agregar nutrientes adicionales (tales como vitaminas B) al permeado exento de células para reponer el medio nutritivo antes de que se devuelva al biorreactor. Asimismo, si el pH del caldo se ajustó como se describe anteriormente para mejorar la adsorción de ácido acético al carbón activado, el pH debe reajustarse a un pH similar al del caldo en el biorreactor de fermentación, antes de devolverlo al biorreactor.

Control del suministro de sustrato

Se describen métodos para mejorar la eficiencia global de la fermentación microbiana de un sustrato, comprendiendo el método proporcionar el sustrato sustancialmente a un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo. El sustrato puede comprender CO y se proporciona a una o más bacterias carboxidotróficas, tales como bacterias acetogénicas. En condiciones anaerobias adecuadas, bacterias acetogénicas, tales como Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei y Clostridium carboxydivorans convierten un sustrato que comprende CO en productos que incluyen ácidos y alcoholes. Se describen métodos para optimizar la fermentación microbiana de un sustrato, particularmente un sustrato que comprende CO, mediante el control del suministro del sustrato, de manera que se proporcione en un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo, para promover la viabilidad del cultivo y la producción de metabolitos deseables tales como el etanol.

Se ha reconocido que el aumento de la cantidad de sustrato disponible para el cultivo microbiano, para la conversión en productos, próximo a un nivel o intervalo óptimo conduce a aumentos en la tasa de crecimiento microbiano, tasa de producción de metabolitos y/o la cantidad de alcohol(es) producidos, en relación con el ácido(s). Los productos pueden producirse de tal manera que el cultivo produce una proporción de producto deseable de al menos 1:1; o al menos 1:2; o al menos 1:3; o al menos 1:4; o al menos 1:5; o al menos 1:10; o al menos 1:20; ácido: alcohol. Normalmente, el alcohol (particularmente el etanol) se produce sin la producción concomitante de ácido (particularmente acetato).

Normalmente, el cultivo microbiano no puede regular la absorción del sustrato. Por tanto, un exceso de suministro de sustrato conduce a problemas de cultivo, tal como inhibición del crecimiento y/o muerte microbiana.

Un sustrato que comprende CO se proporciona normalmente en forma gaseosa y la disponibilidad de CO para un cultivo microbiano dependerá de las propiedades de transferencia de masa del sistema de fermentación. Por ejemplo, la disponibilidad de Co para un cultivo microbiano suspendido en un caldo de fermentación depende de factores conocidos por los expertos en la materia que incluyen temperatura, composición del caldo, tasa de suministro de gas, composición del gas, presión de vapor de CO, mezcla. Por tanto, aumentar la disponibilidad de CO para una fermentación microbiana requiere mejorar las propiedades de transferencia de masa del sistema, tal como aumentar la tasa de suministro de sustrato y/o aumentar la agitación de un biorreactor agitado mecánicamente.

Con el fin de mantener la viabilidad del cultivo, el crecimiento microbiano y/o la producción de productos deseables, tales como alcoholes, el sustrato debe estar disponible para el cultivo en un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo. Un cultivo microbiano con un suministro inadecuado (subóptimo) de CO puede crecer mal, ser menos viable y/o producir productos predominantemente menos deseables, tales como ácido(s), en particular acetato. Adicionalmente, la tasa de crecimiento y la tasa de producción de metabolitos también pueden ser sustancialmente más bajas que un cultivo microbiano provisto de una cantidad adecuada u optimizada de sustrato. Normalmente, el cultivo microbiano no puede regular la absorción del sustrato. Por tanto, un exceso de suministro de sustrato conduce a problemas de cultivo, tal como inhibición del crecimiento y/o muerte microbiana.

Se ha reconocido que el aumento de la cantidad de sustrato disponible para el cultivo microbiano, para la conversión en productos, próximo a un nivel óptimo conduce a un aumento en la cantidad de alcohol(es) producidos, en relación con el ácido(s). Normalmente, el alcohol (particularmente el etanol) se produce sin la producción concomitante de ácido (particularmente acetato).

Se describe un método para controlar el suministro de un sustrato, particularmente un sustrato que comprende CO, de manera que el sustrato se proporcione sustancialmente de forma continua en un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo. El sustrato se puede proporcionar a un nivel óptimo, o dentro de un intervalo óptimo, manteniendo el pH del medio de fermentación a un nivel constante o dentro de un intervalo constante o dentro de una tasa de cambio predeterminada.

Se ha reconocido que el aumento de la cantidad de sustrato disponible para el cultivo microbiano, para la conversión en productos, próximo a un nivel óptimo conduce a un aumento en la cantidad de alcohol(es) producidos, en relación con el ácido(s).

En realizaciones de la invención, un cultivo microbiano puede producir o consumir uno o más componentes ácidos y/o básicos de manera que el pH cambie durante el funcionamiento óptimo. Por tanto, de acuerdo con la invención, el sustrato se puede suministrar de manera que el pH cambie sustancialmente en o próximo a una tasa de cambio predeterminada. En dichas realizaciones, el crecimiento microbiano sostenible y la producción de metabolitos deseada se asociarán con la producción y/o el consumo de uno o más ácidos y/o bases, de modo que haya un cambio neto en el pH con el tiempo. En realizaciones particulares, microorganismos carboxidotróficos, tales como Clostridium autoethanogenum, producen alcohol (tal como etanol) y ácidos (tales como acetato) al mismo tiempo. En realizaciones particulares de la invención, los productos se producen de tal manera que el cultivo produce una proporción de producto deseable de al menos 1:1; o al menos 1:2; o al menos 1:3; o al menos 1:4; o al menos 1:5; o al menos 1:10; o al menos 1:20; ácido: alcohol. Adicionalmente, también puede haber un cambio de pH asociado con el consumo de componentes básicos tales como el NH3. Por tanto, en realizaciones particulares, durante la fermentación continua en estado estacionario, habrá una disminución neta del pH a menos que el pH se controle mediante la adición de una base o la adición continua de medio fresco con un pH adecuado para mantener un pH constante.

El pH de un sistema de fermentación normalmente se ve afectado por la producción de compuestos ácidos tales como acetato y/o lactato y, en menor medida, por el consumo de compuestos básicos o ácidos tales como NH3, fosfato, etc. La tasa de cambio de pH dependerá de la velocidad a la que tiene lugar dicha producción y/o consumo de compuestos ácidos/básicos. En realizaciones particulares, los microbios acetogénicos producen acetato como metabolito y esto explica el mayor cambio de pH a lo largo del tiempo.

Para un sistema de fermentación dado, se puede determinar experimentalmente una tasa de cambio de pH cuando se suministra un sustrato a una tasa óptima. Por ejemplo, cuando se proporciona a un sustrato un cultivo de uno o más microorganismos carboxidotróficos en o próximo a un nivel óptimo, se pueden producir etanol y acetato a tasas particulares. El pH del caldo de fermentación cambiará de acuerdo con la cantidad de acetato presente y, en menor grado, la cantidad de otros componentes ácidos o básicos tales como el NH3 presente. Se reconoce que la tasa de cambio de pH dependerá de la capacidad amortiguadora del caldo de fermentación y del punto de partida del pH. Por ejemplo, la acumulación de acetato en un caldo de fermentación bien tamponado conducirá a cambios lentos o pequeños en el pH. En cambio, la acumulación de acetato en un caldo de fermentación sustancialmente tamponado conducirá a cambios grandes y/o rápidos en el pH. Por tanto, la tasa de cambio de pH con un suministro de sustrato óptimo debe predeterminarse para cualquier sistema de fermentación dado.

También se reconoce que pequeños cambios en el pH pueden tener un efecto perjudicial sobre la fermentación. Por consiguiente, el cambio de pH a través de la producción de ácido se puede contrarrestar mediante la adición de una base, tal como NH4OH. Como tal, el pH de un sistema de fermentación de funcionamiento continuo se puede mantener dentro de los parámetros de funcionamiento de pH óptimos. Por ejemplo, el pH operativo óptimo de Clostridium autoethanogenum se ha determinado experimentalmente que es aproximadamente 5-5,5. En realizaciones particulares, el intervalo deseable es ± 0,5 unidades del pH operativo óptimo. El pH operativo óptimo para varias bacterias carboxidotróficas se describe en Henstra et al. Current Opinion in Biotechnology, 2007, 18:200-206.

Como tal, el control sobre la provisión de sustrato se puede mantener usando varios mecanismos alternativos. Por ejemplo, determinando la tasa de cambio de pH, determinando la cantidad de ácido/base necesaria para contrarrestar el cambio de pH o determinando la cantidad de acetato producida por el cultivo.

Por tanto, en condiciones de estado estacionario, el ácido se produce a una velocidad sustancialmente constante, lo que da como resultado una concentración sustancialmente constante en el caldo de fermentación. La invención proporciona un método para optimizar el suministro de un sustrato que comprende CO a un biorreactor, en donde el sustrato se fermenta para producir productos que incluyen uno o más alcohol(es) y/o ácido(s) mediante un cultivo de uno o más microorganismos carboxidotróficos, incluyendo el método determinar los niveles de ácido en el biorreactor en un primer punto temporal y un segundo punto temporal, en donde un aumento del nivel de ácido entre el primero y el segundo puntos temporales da como resultado un aumento del suministro de sustrato, y en donde una disminución en el nivel de ácido entre el primer y segundo puntos temporales da como resultado una disminución en el suministro de sustrato y en donde el sustrato se proporciona de manera que los niveles de ácido se mantienen entre concentraciones umbral predeterminadas de 1 a 10 g/l de caldo de fermentación. Por tanto, si el nivel de ácido (acetato) aumenta con el tiempo, el suministro de sustrato se puede incrementar de manera que la producción de ácido se ralentice, llevando el ácido a un nivel o intervalo deseado con el tiempo. En cambio, si el nivel de ácido disminuye, se puede disminuir el suministro de sustrato, promoviendo así la producción de ácido. En realizaciones particulares, el acetato se mantiene dentro de una concentración sustancialmente constante de aproximadamente 10 g/l, o aproximadamente 9 g/l, o aproximadamente 8 g/l, o aproximadamente 7 g/l, aproximadamente 6 g/l, o aproximadamente 5 g/l de caldo de fermentación. En realizaciones particulares, el acetato se mantiene dentro de un intervalo de concentración predeterminado, tal como aproximadamente 2-8 g/l, o aproximadamente 3-7 g/l, o aproximadamente 4-6 g/l de caldo de fermentación.

También se reconoce, en realizaciones particulares, que la tasa de producción de uno o más ácidos tales como acetato depende de la densidad microbiana en un caldo de fermentación. En realizaciones particulares, la productividad específica de acetato se mantiene a menos de 2 g/g de biomasa/día, o menos de 1,5 g/g/día, o menos de 1,2 g/g/día, o menos de 1 g/g/día.

En otra realización particular de la invención, el alcohol (particularmente el etanol) se produce sin la producción concomitante de ácido (particularmente acetato). Por consiguiente, cuando se proporciona un sustrato, particularmente un sustrato que comprende CO, a un nivel óptimo, o dentro de un intervalo óptimo, no hay cambio neto en la concentración o concentraciones de ácido en el medio y el pH del medio permanece sustancialmente constante. En dichas realizaciones, la tasa de cambio de pH será aproximadamente 0.

Se reconoce que la proporción del producto también puede estar relacionada en parte con la composición del medio como se describe en Gaddy US 7.285.402. Como tal, se reconoce que la proporción de producto deseada puede cambiar de un sistema de fermentación a otro. Por consiguiente, también cambiará la tasa de cambio de pH asociada con el suministro del nivel óptimo de sustrato.

Si el cultivo se vuelve limitado por sustrato en cualquier etapa de la fermentación, el cultivo produce ácido(s), tal como acetato, lo que hace que el pH del caldo de fermentación disminuya. Por tanto, de acuerdo con los métodos de la invención, el suministro de sustrato puede aumentarse de manera que cese la acumulación neta de acetato y se estabilice el pH.

Adicionalmente o como alternativa, si existe un exceso de suministro de sustrato, existe un consumo neto de ácido(s), ya que el acetato se convierte en etanol y el pH aumenta. Por tanto, el suministro de sustrato debe reducirse de manera que cese la acumulación neta de ácido y se estabilice el pH. Se observa que el exceso de suministro de sustrato durante un período prolongado puede conducir a problemas de cultivo tales como inhibición del crecimiento y/o muerte microbiana.

En realizaciones particulares, el sustrato se proporciona de manera que el pH se mantenga dentro de un intervalo deseable. Los expertos en la materia apreciarán un pH o un intervalo de pH adecuados para realizar una fermentación particular. En realizaciones particulares, por ejemplo realizaciones en donde se usa Clostridium autoethanogenum para producir productos, el sustrato se proporciona de manera que el pH se mantenga entre 5-6; o entre 5,1-5,9; o entre 5,2-5,8; o entre 5,3-5,7; o entre 5,4-5,6; o sustancialmente a 5,5.

el pH se puede determinar mediante cualquier método conocido. Sin embargo, a modo de ejemplo, las sondas de electrodo se utilizan normalmente para medir el pH durante la fermentación y los expertos en la materia conocerán ejemplos de tales sondas.

A modo de ejemplo no limitante, considerar un cultivo microbiano en las siguientes condiciones:

1. Sustrato limitado:

El cultivo tiene suficiente sustrato para crecer y producir productos (predominantemente ácido(s)) pero no producirá cantidades significativas de productos deseables (tales como alcohol(es)). El pH disminuye más rápido que una tasa de cambio predeterminada. Por lo tanto, aumentar el suministro de sustrato hasta un nivel óptimo

2. Suministro de sustrato óptimo

El cultivo tiene suficiente sustrato para crecer y producir productos, particularmente productos deseables tales como alcohol(es) a altas tasas (en o al menos próximas a las tasas de productividad óptimas). El pH cambia a una tasa de cambio predeterminada. Por lo tanto, mantener el suministro de sustrato a un nivel óptimo

3. Exceso de suministro de sustrato

Ácido(s), tales como acetato convertido en alcoholes, tales como etanol. Puede ocurrir inhibición del crecimiento y muerte microbiana. El pH disminuye más lentamente que una tasa de cambio predeterminada, o aumenta. Por consiguiente, disminuir hasta el nivel óptimo

Por tanto, al cultivo microbiano en el escenario 1 (anterior) debe suministrarse cantidades crecientes de sustrato hasta que el pH se estabilice o vuelva a un nivel predeterminado. Se considera que un cultivo de este tipo recibe una cantidad óptima de sustrato como en el escenario 2. En condiciones por lotes, se considera que dicho cultivo crecerá hasta que se vuelva limitado nuevamente, por lo que el cultivo en crecimiento debe recibir cantidades crecientes de sustrato con el tiempo, de manera que el pH se mantenga sustancialmente constante o dentro de un intervalo predeterminado. Si, en cualquier momento, existe un exceso de suministro (escenario 3), el pH aumenta y el suministro de sustrato debe reducirse hasta el nivel óptimo para que se reanude el crecimiento eficiente y la producción de metabolitos.

Se reconoce que otros metabolitos, tales como lactato pueden ser producidos por un cultivo microbiano, particularmente durante períodos de exceso de suministro de sustrato. Por tanto, en realizaciones particulares, el método incluye monitorizar las concentraciones de metabolitos en un medio de fermentación, además de monitorizar el pH. Los expertos en la materia apreciarán los métodos para monitorizar las concentraciones de metabolitos en un medio de fermentación. Sin embargo, a modo de ejemplo, se pueden usar los métodos analíticos, tales como GC, GCIR, GCMS, LCMS, HPLC, NIR.

También se describen métodos para mejorar la eficiencia global de la fermentación microbiana de un sustrato, comprendiendo el método proporcionar el sustrato sustancialmente a un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo. Normalmente, el sustrato comprende CO y se proporciona a una o más bacterias carboxidotróficas, tales como bacterias acetogénicas. En condiciones anaerobias adecuadas, bacterias acetogénicas, tales como Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei y Clostridium carboxydivorans convierten un sustrato que comprende CO en productos que incluyen ácidos y alcoholes. También se describen métodos para optimizar la fermentación microbiana de un sustrato, particularmente un sustrato que comprende CO, mediante el control del suministro del sustrato, de manera que se proporcione en un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo, para promover la viabilidad del cultivo y la producción de metabolitos deseables tales como etanol. Normalmente, el contenido de CO del gas comprende poco o nada de H2, tal como menos del 5 %, o menos del 4 %, o menos del 3 %, o menos del 2 %, o menos del 1 % o 0 % de H2.

Un sustrato que comprende CO se proporciona normalmente en forma gaseosa y la disponibilidad de CO para un cultivo microbiano dependerá de las propiedades de transferencia de masa del sistema de fermentación. Por ejemplo, la disponibilidad de Co para un cultivo microbiano suspendido en un caldo de fermentación depende de factores conocidos por los expertos en la materia que incluyen temperatura, composición del caldo, tasa de suministro de gas, composición del gas, presión de vapor de CO, mezcla. Por tanto, aumentar la disponibilidad de CO para una fermentación microbiana requiere mejorar las propiedades de transferencia de masa del sistema, tal como aumentar la tasa de suministro de sustrato y/o aumentar la agitación de un biorreactor agitado mecánicamente.

Con el fin de mantener la viabilidad del cultivo, el crecimiento microbiano y/o la producción de productos deseables, tales como alcoholes, el sustrato debe estar disponible para el cultivo en un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo. Un cultivo microbiano con un suministro inadecuado (subóptimo) de CO puede crecer mal, ser menos viable y/o producir productos predominantemente menos deseables, tales como ácido(s), en particular acetato. Adicionalmente, la tasa de crecimiento y la tasa de producción de metabolitos también pueden ser sustancialmente más bajas que un cultivo microbiano provisto de una cantidad adecuada u optimizada de sustrato.

Se describe un método para controlar el suministro de un sustrato, particularmente un sustrato que comprende CO, de manera que el sustrato se proporcione sustancialmente de forma continua en un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo. Normalmente, el método para mejorar la fermentación microbiana incluye monitorizar la producción de hidrógeno mediante un cultivo microbiano y controlar el suministro de un sustrato basado en la producción de hidrógeno.

Normalmente, un cultivo microbiano al que se le suministra una cantidad óptima de sustrato (o sustrato dentro de un intervalo óptimo) crecerá y producirá productos deseables, tales como alcoholes, a una tasa óptima. Además de las proporciones deseables de producción de metabolitos, el cultivo microbiano también producirá hidrógeno. Normalmente se producirán pequeñas cantidades de hidrógeno, tal como aproximadamente 0,5-5 % en moles del sustrato consumido por el cultivo microbiano. Se puede proporcionar un cultivo microbiano con una cantidad óptima de sustrato cuando la cantidad de hidrógeno producido se mantiene en aproximadamente el 1-3 % del sustrato consumido por el cultivo.

A modo de ejemplo no limitante, considerar un cultivo microbiano en las siguientes condiciones:

1. Sustrato limitado:

El cultivo tiene suficiente sustrato para crecer y producir productos (predominantemente ácido(s)) pero no producirá cantidades significativas de productos deseables (tales como alcohol(es)). Se producen cantidades insignificantes o NO SE PRODUCE HIDRÓGENO.

2. Suministro de sustrato óptimo

El cultivo tiene suficiente sustrato para crecer y producir productos, particularmente productos deseables tales como alcohol(es) a altas tasas (en o al menos próximas a las tasas de productividad óptimas). SE PRODUCE HIDRÓGENO.

3. Exceso de suministro de sustrato

Puede ocurrir inhibición del crecimiento y muerte microbiana. NO SE PRODUCE HIDRÓGENO.

El hidrógeno producido por un cultivo microbiano puede usarse como una indicación de que el cultivo se suministra con una cantidad sustancialmente óptima de sustrato, o al menos dentro de un intervalo óptimo. Adicionalmente, la producción de hidrógeno mediante un cultivo microbiano puede usarse para controlar el suministro de sustrato al cultivo microbiano. Por ejemplo, el suministro de sustrato a un cultivo limitado por sustrato se puede incrementar hasta que se observe la producción de hidrógeno. Una vez iniciada la producción de hidrógeno, el suministro de sustrato se puede ajustar para mantener la producción de hidrógeno a lo largo del tiempo.

Por tanto, al cultivo microbiano en el escenario 1 (anterior) debe suministrarse cantidades crecientes de sustrato hasta que el cultivo produce hidrógeno. Se considera que un cultivo de este tipo recibe una cantidad óptima de sustrato como en el escenario 2. En condiciones por lotes, se considera que dicho cultivo crecerá hasta que se vuelva limitado nuevamente, por lo que el cultivo en crecimiento debe recibir cantidades crecientes de sustrato con el tiempo, de tal modo que se mantenga la producción de H2. Si, en cualquier momento, existe un exceso de suministro de sustrato (escenario 3), la producción de H2 se detiene y el suministro de sustrato debe reducirse hasta el nivel óptimo para que se reanude el crecimiento eficiente y la producción de metabolitos.

Se reconoce que durante el escenario 1 y 3 se pueden producir pequeñas cantidades de hidrógeno. Sin embargo, la cantidad de hidrógeno producido por el cultivo aumenta a medida que el sustrato disponible para el cultivo aumenta o disminuye a un nivel próximo al óptimo (o en un intervalo óptimo).

Cuando el cultivo microbiano comprende Clostridium autoethanogenum, la absorción específica de CO durante la limitación del sustrato es normalmente de 0,3-0,6 mmol de CO consumido por gramo de biomasa por minuto (mmol/g/min). En estas condiciones limitadas de sustrato, un cultivo microbiano que comprende C. autoethanogenum no produce o produce cantidades mínimas de H2 (menos del 0,5 % en moles del sustrato consumido). A medida que aumenta la disponibilidad de sustrato, el H2 producido por el cultivo aumenta hasta al menos 0,5 % en moles; o al menos 1,0 % en moles; o al menos 1,5 % en moles; o al menos 2,0 % en moles del CO consumido por el cultivo. Normalmente, la absorción específica del cultivo aumenta por encima de aproximadamente 0,6 mmol/g/min. En las condiciones descritas en el presente documento, un cultivo microbiano que comprende C. autoethanogenum tiene un suministro de sustrato óptimo cuando la absorción específica se puede mantener al menos a 0,6 mmol/g/min pero menos de 1,2 mmol/g/min. Cuando la absorción específica aumenta por encima de 1,2 mmol/g/min, existe un exceso de suministro de sustrato y la producción de H2 disminuye y el suministro de sustrato debe reducirse. Si el suministro de sustrato no se reduce, puede ocurrir inhibición del crecimiento y muerte celular.

La figura 1 es una representación esquemática de un sistema 100. La corriente de sustrato 1 entra en el biorreactor 2 a través de un conducto 3 adecuado. La corriente de sustrato 1 comprende CO y en ciertas realizaciones, la corriente de sustrato es una corriente de gas residual de un proceso industrial, tal como la descarburación del acero. La corriente de sustrato 1 puede ser una corriente constante en el sentido de que se suministra constantemente, pero el contenido del flujo puede variar con el tiempo.

El biorreactor 2 está configurado para realizar la reacción de fermentación deseada para producir productos. El biorreactor 2 puede configurarse para convertir CO en productos que incluyen uno o más ácidos y/o alcoholes. El biorreactor 2 puede comprender más de un tanque, estando cada tanque configurado para realizar la misma reacción y/o diferentes etapas dentro de un proceso de fermentación particular y/o diferentes reacciones, incluyendo diferentes reacciones para diferentes fermentaciones que pueden incluir una o más etapas comunes.

Los productos producidos en el biorreactor 2, tales como ácidos y/o alcoholes, pueden recuperarse mediante cualquier proceso de recuperación conocido en la técnica.

El pH del medio de fermentación se puede monitorizar mediante el medio de medición del pH 4. Por tanto, un operador puede opcionalmente hacer ajustes al cultivo microbiano en el biorreactor 2 y/o la corriente de sustrato 1 usando el medio de ajuste 5 para mantener el cultivo microbiano en, o hacer la transición de manera que el sustrato se suministre a un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo, en respuesta a los cambios de pH. Los ajustes en el nivel de CO proporcionado al cultivo incluyen uno o más de: cambiar la concentración de CO del caldo de fermentación; cambiar la composición de la corriente de sustrato; cambiar la presión de la corriente de sustrato; la velocidad de agitación del caldo de fermentación. Adicionalmente o como alternativa, el sistema 100 incluye un medio de procesamiento opcional 6 adaptado para determinar el pH del caldo de fermentación y un medio de ajuste de control 5, de manera que el sustrato se proporciona a un nivel óptimo, o dentro de un intervalo óptimo. Adicionalmente, los medios de ajuste 5 pueden configurarse para realizar ajustes continuos o ajustes en puntos temporales discretos si es necesario.

En otra realización, 4 es un medio de determinación configurado para determinar la concentración de ácido, tal como acetato, en el biorreactor 2. Si se determina que la concentración de ácido está por encima de un umbral predeterminado, el medio de ajuste 5 puede aumentar el sustrato suministrado al biorreactor 2. Se puede usar cualquier medio de determinación conocido para medir la concentración de ácido en el biorreactor 2. Sin embargo, se puede usar a modo de ejemplo, HPLC, GCMS, LCMS y/o NIR.

La figura 2 es una representación esquemática de un sistema 101. La corriente de sustrato 1 entra en el biorreactor 2 a través de un conducto 3 adecuado. La corriente de sustrato 1 comprende CO y en ciertas realizaciones, la corriente de sustrato es una corriente de gas residual de un proceso industrial, tal como la descarburación del acero. La corriente de sustrato 1 puede ser una corriente constante en el sentido de que se suministra constantemente, pero el contenido del flujo puede variar con el tiempo. La corriente de sustrato puede comprender poco o nada de H2 tal como menos del 5 %, o menos del 4 %, o menos del 3 %, o menos del 2 %, o menos del 1 % o 0 % de H2.

El biorreactor 2 está configurado para realizar la reacción de fermentación deseada para producir productos. El biorreactor 2 puede configurarse para convertir CO en productos que incluyen uno o más ácidos y/o alcoholes. El biorreactor 2 puede comprender más de un tanque, estando cada tanque configurado para realizar la misma reacción y/o diferentes etapas dentro de un proceso de fermentación particular y/o diferentes reacciones, incluyendo diferentes reacciones para diferentes fermentaciones que pueden incluir una o más etapas comunes.

Los productos producidos en el biorreactor 2, tales como ácidos y/o alcoholes, pueden recuperarse mediante cualquier proceso de recuperación conocido en la técnica.

Los componentes de la corriente de sustrato que no se consumen en la reacción de fermentación y cualquier subproducto de la reacción de fermentación, tales como CO2 y H2, salen del biorreactor 2 a través de la salida de escape 7. Los medios de medición 8 pueden adaptarse para determinar el H2 y opcionalmente la concentración de CO y CO2 en la corriente agotada que sale del biorreactor 2 a través de la salida de escape 4. Se puede determinar la cantidad de hidrógeno producido por el cultivo microbiano. Por consiguiente, un operador puede opcionalmente hacer ajustes al cultivo microbiano en el biorreactor 2 y/o la corriente de sustrato 1 usando el medio de ajuste 9 para mantener el cultivo microbiano en, o hacer la transición de manera que el sustrato se suministre a un nivel óptimo, próximo a un nivel óptimo o dentro de un intervalo óptimo. Los ajustes para mantener o hacer la transición del cultivo incluyen uno o más de: cambiar la concentración de CO del caldo de fermentación; cambiar la composición de la corriente de sustrato; cambiar la presión de la corriente de sustrato; la velocidad de agitación del caldo de fermentación. Adicionalmente o como alternativa, el sistema 101 incluye un medio de procesamiento opcional 6 adaptado para determinar la concentración de hidrógeno de la corriente de salida y el medio de ajuste de control 9, de manera que el sustrato se proporciona a un nivel óptimo, o dentro de un intervalo óptimo.

El hidrógeno que sale del biorreactor 2 se puede monitorizar de forma continua o en un punto de tiempo discreto. Adicionalmente, los medios de ajuste 9 pueden configurarse para realizar ajustes continuos o ajustes en puntos temporales discretos si es necesario.

Se puede usar cualquier medio para determinar el hidrógeno producido por el cultivo, aunque normalmente, se utilizan uno o más cromatógrafos de gases para determinar las concentraciones de H2 de la corriente que sale del biorreactor 2 y, opcionalmente, la corriente de sustrato 1. El medio para determinar las concentraciones de H2 en la corriente que sale del biorreactor 2 puede ser un micro GC Varian c P-4900.

Ejemplos

Cualquier ejemplo que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se incluye solo con fines de referencia.

Materiales y métodos:

continuación

Preparación de Na2Sx

Se cargó un matraz de 500 ml con Na²S (93,7 g, 0,39 mol) y 200 ml de H²O. La solución se agitó hasta que la sal se disolvió y se añadió azufre (25 g, 0,1 mol) bajo flujo constante de N². Después de 2 horas de agitación a temperatura ambiente, la solución de "Na²Sx" (aprox. 4 M con respecto a [Na] y aprox. 5 M con respecto al azufre), ahora un líquido transparente de color marrón rojizo, se transfirió a frascos se suero purgados con N², envueltos en papel de aluminio.

Preparación de la solución de Cr(II)

Se equipó un matraz de tres bocas de 1 l con una entrada y salida estancas al gas para permitir el trabajo bajo gas inerte y la posterior transferencia del producto deseado a un matraz de almacenamiento adecuado. El matraz se cargó con CrCl3.6H20 (40 g, 0,15 mol), gránulos de zinc [malla 20] (18,3 g, 0,28 mol), mercurio (13,55 g, 1 ml, 0,0676 mol) y 500 ml de agua destilada. Después de enjuagar con N² durante una hora, la mezcla se calentó a aproximadamente 80 °C para iniciar la reacción. Después de dos horas de agitación bajo un flujo constante de N², la mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se agitó continuamente durante otras 48 horas, momento en el que la mezcla de reacción se había convertido en una solución de color azul intenso. La solución se transfirió a frascos de suero purgados con N² y se almacenaron en el refrigerador para uso futuro.

Bacterias:

El Clostridium autoethanogenum utilizado es el depositado en el German Resource Centre for Biological Material (DSMZ) y al que se le asignó el número de registro 19630.

Recogida de muestras y procedimientos analíticos

Se tomaron muestras de medio del reactor CSTR a intervalos durante el transcurso de cada fermentación. Cada vez que se tomaron muestras del medio, se tuvo cuidado de asegurarse de que no se permitiera que ningún gas entrara o escapara del reactor.

HPLC:

Sistema HPLC Agilent Serie 1100. Fase móvil: Ácido sulfúrico 0,0025N. Flujo y presión: 0,800 ml/min. Columna: Alltech IOA; N.° Catálogo 9648, 150 x 6,5 mm, Tamaño de partícula 5 |jm. Temperatura de columna: Detector 60 °C: Índice de refracción. Temperatura del detector: 45 °C.

Método para la preparación de la muestra:

Se cargan 400 j l de muestra y 50 j l de ZnSO⁴0,15 M y 50 j l de Ba(OH)²0,15 M en un tubo de Eppendorf.

Los tubos se centrifugan durante l0 min. a 12.000rpm, 4 °C. Se transfieren 200 j l del sobrenadante a un vial de HPLC y se inyectan 5 j l en el instrumento de HPLC.

Análisis del espacio de cabeza:

Las mediciones se realizaron en un micro GC Varian CP-4900 con dos canales instalados. El canal 1 era un columna de tamiz molecular de 10 m que funcionaba a 70 °C, 200 kPa de argón y un tiempo de retroenjuagado de 4,2 s, mientras que el canal 2 era un columna PPQ de 10 m que funcionaba a 90 °C, 150 kPa de helio y sin retroenjuagado. La temperatura del inyector para ambos canales fue de 70 °C. Los tiempos de análisis se establecieron en 120 s, pero todos los picos de interés normalmente eluían antes de los 100 s.

Densidad celular:

La densidad celular se determinó contando las células bacterianas en una alícuota definida de caldo de fermentación. Como alternativa, se midió la absorbancia de las muestras a 600 nm (espectrofotómetro) y se determinó la masa seca mediante cálculo de acuerdo con los procedimientos publicados.

Ejemplo 1 Fermentación por lotes

Aproximadamente 1400 ml de solución A se transfirieron a un fermentador de 1,5 l y se roció con nitrógeno. Se añadió resazurina (1,5 ml de una solución de 2 g/l) y H³PO⁴ (solución al 85 %, 2 ml) y el pH se ajustó a 5,3 usando NH⁴OH (ac) concentrado. Se añadió cloruro de cromo(II) hasta que el ORP de la solución disminuyó a aproximadamente -150 mV. Se añadió polisulfuro de sodio (4,2 ml de una solución 4,3 M), la solución se roció con N2, a continuación se añadieron la solución D (1,5 ml), la solución B (15 ml) y Na²WO³ (1,5 ml de una solución 0,01 M). Se añadió la solución F (15 ml), el pH se ajustó a 5,5 y la solución se roció con N2 antes de cambiar a gas que contenía CO (50 % de CO; 50 % de N2) a 40 ml/min. A continuación, el reactor se inoculó con 150 ml de un cultivo de Clostridium autoethanogenum. El biorreactor se mantuvo a 37 °C y se agitó a 300 rpm. Durante la fase de crecimiento, la agitación se incrementó gradualmente hasta 800 rpm.

El crecimiento de metabolitos y microbios se puede ver en la Figura 3. Durante la fase de crecimiento (iniciada aproximadamente el día 0,5), el suministro de sustrato se incrementó al aumentar la agitación y/o el flujo de gas. En la Figura 3, se puede ver que el crecimiento exponencial ocurre entre el día 0,5 y 1,2. El suministro de sustrato se incrementó de acuerdo con el crecimiento microbiano para mantener la producción de hidrógeno por el cultivo a un nivel entre aproximadamente 1-2,5 % en moles. Después del día 1,2, se aumentó el suministro de CO, sin embargo, la producción de H2 disminuyó sustancialmente, lo que indica un ligero exceso de suministro de sustrato. La producción de H2 y el consumo de CO se pueden ver en la Figura 4. Si bien el cultivo continúa creciendo y produciendo metabolitos después del día 1,2, la tasa de crecimiento se ralentiza sustancialmente y ya no es exponencial. Controlando el suministro de sustrato, de modo que se produzca H2, se produce etanol sin la producción de ácido concomitante.

La Tabla 1 muestra que manteniendo el suministro de sustrato de manera que el cultivo produzca hidrógeno, la absorción específica de CO se puede mantener a un nivel alto de al menos 0,6 mmol/g/min y hasta aproximadamente 1,2 mmol/g/min.

Tabla 1: Producción de H2, como una función del CO consumido y absorción específica de CO durante el periodo de r imi n x n n i l l Ei m 1.

continuación

Ejemplo 2

Los medios se prepararon a pH 5,5 como se indica a continuación. Todos los ingredientes de la solución E, a excepción de la cisteína-HCl, se mezclaron en 400 ml de agua destilada. Esta solución se hizo anaerobia calentando a ebullición y dejándola enfriar a temperatura ambiente bajo un flujo constante de 95 % de CO, 5 % de gas CO2. Una vez enfriado, se añadió cisteína-HCl y el pH de la solución se ajustó a 5,5 antes de completar el volumen hasta 1000 ml; la anaerobicidad se mantuvo a lo largo de los experimentos.

Se cargó un biorreactor de 1 l con 400 ml de medio de solución E, preparado como se describe anteriormente bajo un flujo constante de N2. El gas se cambió a gas que contenía CO (50 % de CO; 50 % de N2) a presión atmosférica antes de la inoculación con 400 ml de un cultivo de Clostridium autoethanogenum. El biorreactor se mantuvo a 37 °C y se agitó a 400 rpm en el momento de iniciarse el cultivo. Durante la fase de crecimiento, se aumentó la agitación a 400 rpm. El pH se mantuvo a 5,5 antes de dejarlo caer a pH 5,3. Después de la fase de crecimiento inicial, el cultivo se cambió a operación continua agregando medio fresco a una tasa de dilución de aproximadamente 1 volumen de reactor por día. El medio fresco se preparó de acuerdo con lo anterior, aunque contenía níquel adicional (aprox 0,5 ml/l de una solución 0,1 M).

Después de la fase de crecimiento inicial, la biomasa se mantuvo a un nivel constante mediante el suministro de sustrato de modo que se produjera H2 de forma continua (ver Figuras 5 y 6). Durante este tiempo, el suministro de sustrato se incrementó de manera que la absorción específica aumentó a aproximadamente 0,8-0,9 mmol/g/min (ver Tabla 2). La productividad del etanol aumentó a aproximadamente 9-10 g/l/día, mientras que la productividad del acetato se mantuvo en 6-8 g/l/día.

Tabla 2: Producción de H2, en función del CO consumido y la absorción de CO específica durante el periodo de r imi n x n n i l l E m l 2.

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Ejemplo 3

Se cargó un biorreactor de 1 l con 200 ml de medio de solución E preparado como se ha descrito anteriormente, bajo un flujo constante de N2. El gas se cambió a gas que contenía c O (50 % de CO; 20 % de CO2; 3 % de H2; 27 % de N2) a presión atmosférica antes de la inoculación con 800 ml de un cultivo de Clostridium autoethanogenum. El biorreactor se mantuvo a 37 °C y se agitó a 200 rpm en el momento de iniciarse el cultivo. Durante la fase de crecimiento, se aumentó la agitación a 400 rpm. El pH se ajustó a 5,5 y se mantuvo mediante la adición automática de NaOH 5 M. Después de un período de crecimiento inicial, el cultivo se cambió a operación continua agregando medio fresco a una tasa de dilución de aproximadamente 1 volumen de reactor por día.

Los datos de crecimiento microbiano, producción de metabolitos y consumo/producción de gas se pueden ver en las Figuras 7 y 8. El suministro de sustrato se incrementó con el tiempo aumentando la agitación y el flujo de gas. En el día 1,9, la agitación se incrementó a 100 rpm cada dos horas durante 8 horas. Durante ese tiempo, el consumo de CO aumentó y la producción de H2 aumentó ligeramente, lo que indica que el CO se está suministrando a próximo a un nivel óptimo. Durante este tiempo, la absorción específica de CO aumenta desde 0,6 mmol/g/min hasta 0,9 mmol/g/min.

El día 2,9, el flujo de gas se incrementó gradualmente (incrementos de 10 ml/min cada 2 horas). Tras el aumento del suministro de gas, el consumo de CO aumentó, pero la producción de H2 disminuyó. La Figura 6 muestra que el crecimiento se ralentiza durante este período, lo que lleva a una rápida caída de la biomasa.

Ejemplo 4

Aproximadamente 1400 ml de solución A se transfirieron a un fermentador de 1,5 l y se roció con nitrógeno. Se añadió resazurina (1,5 ml de una solución de 2 g/l) y H³PO⁴ (solución al 85 %, 2 ml) y el pH se ajustó a 5,3 usando NH⁴OH (ac) concentrado. Se añadió cloruro de cromo(II) hasta que el ORP de la solución disminuyó a aproximadamente -150 mV. Se añadió polisulfuro de sodio (4,2 ml de una solución 4,3 M), la solución se roció con N2, a continuación se añadieron la solución B (15 ml), la solución G (1,5 ml) y Na²WO³ (1,5 ml de una solución 0,01 M). Se añadió la solución F (15 ml), el pH se ajustó a 5,5 y la solución se roció con N2 antes de cambiar a gas que contenía CO (50 % de CO; 50 % de N2) a 40 ml/min. A continuación, el reactor se inoculó con 150 ml de un cultivo de Clostridium autoethanogenum. El biorreactor se mantuvo a 37 °C y se agitó a 300 rpm. Durante la fase de crecimiento, la agitación se incrementó gradualmente hasta 800 rpm.

El crecimiento de metabolitos y microbios se puede ver en la Figura 9. Durante la fase de crecimiento (iniciada aproximadamente el día 0,5), el suministro de sustrato se incrementó al aumentar la agitación y/o el flujo de gas. En la Figura 9, se puede ver que el crecimiento exponencial ocurre entre el día 0,5 y 1,2. El suministro de sustrato se incrementó de acuerdo con el crecimiento microbiano para mantener el pH del medio entre aproximadamente pH 5 y 5,6 como se muestra en la Figura 10. A partir del día 0,5, la disponibilidad de sustrato se incrementó lentamente aumentando la agitación y/o el flujo de gas. A partir de los días 0,5 y 1,0, se proporcionó el sustrato de manera que hubo una conversión neta de acetato en etanol además del crecimiento microbiano y la biosíntesis de alcohol. Durante este tiempo, el pH aumentó lentamente hasta aproximadamente 5,6. Desde el día 1,0 hasta el día 1,2, la disponibilidad de sustrato se mantuvo sustancialmente constante. Durante este tiempo, el cultivo microbiano continuó creciendo de manera sustancial y exponencial. Hubo una producción neta de acetato y el pH descendió a aproximadamente 4,9. Después del día 1,2, se aumentó el suministro de CO, sin embargo, el pH aumentó rápidamente de 4,9 a aproximadamente 5,6, lo que indica un consumo neto de acetato asociado con un exceso de suministro de sustrato.

51 bien el cultivo continúa creciendo y produciendo metabolitos después del día 1,2, la tasa de crecimiento se ralentiza sustancialmente y ya no es exponencial.

La Tabla 1 muestra que manteniendo el suministro de sustrato de manera que el pH se mantiene dentro de un intervalo deseable, la absorción específica de CO se puede mantener a un nivel alto de al menos 0,6 mmol/g/min y hasta aproximadamente 1,2 mmol/g/min.

Tab o 1

Ejemplo 5A: Fermentación continua en el CSTR

Los medios se prepararon como se indica a continuación: Se añadieron 100 ml de Solución A a 1,7 l de agua. Se añadió H³PO⁴85 % (30 mM) y la solución de medio se esterilizó en autoclave durante 30 minutos a 121 °C o mediante esterilización por filtración antes de su uso. La solución del medio se transfirió aséptica y anaerobiamente a un recipiente CSTr de 3 l y se roció continuamente con N².

El pH se incrementó con la adición de hidróxido de amonio. Se añadieron 20 ml de solución H de metales traza, a continuación 2 ml de ácido acético glacial y 20 ml de Solución B. Se añadió Cr(ll) hasta que la solución se volvió transparente. Antes de la inoculación, el gas se cambió a 2 % de H2, 33 % de n 2, 45 % de CO y 22 % de CO2. Se inoculó un cultivo de Clostridium autoethanogenum en crecimiento activo en el CSTR a un nivel de aproximadamente 12 % (v/v). Durante este experimento, se añadió una solución de Na2S (0,2 M) a una velocidad de aproximadamente 0,4 ml/hora.

Se dejó que el cultivo microbiano creciera en modo discontinuo durante aproximadamente 1 día. En el día 1, la fermentación se cambió a operación continua en donde se proporcionó medio fresco a una velocidad de dilución de aproximadamente 1,5 a 1,8 volúmenes de reactor por día. El suministro de sustrato se incrementó automáticamente en respuesta a los requisitos del cultivo microbiano de acuerdo con la invención (que se describe a continuación).

Los resultados de la fermentación se muestran en las Figuras 11-12. La tasa de suministro de sustrato y la tasa de agitación aumentaron o disminuyeron automáticamente durante el transcurso del tiempo de la fermentación en respuesta a cambios en el pH. Inicialmente, en la fase de crecimiento, el pH se mantuvo automáticamente a un pH de aproximadamente 5,5 aumentando el suministro de sustrato. Al convertir la fermentación en operación continua, se proporcionó el sustrato de manera que se logró una tasa sustancialmente constante de cambio de pH. Si la tasa de cambio aumentaba, el suministro de sustrato se incrementaba automáticamente para devolver la tasa de cambio de pH a un valor predeterminado. En cambio, si la tasa de cambio disminuía (o el pH comenzaba a aumentar), se reducía el suministro de sustrato. La tasa de cambio de pH fue de aproximadamente tres unidades de pH por día. El funcionamiento continuo sostenible dio como resultado una biomasa estable de aproximadamente 3 g/l, una concentración de acetato sustancialmente estable de aproximadamente 5 g/l y una concentración de etanol sustancialmente estable de al menos 10 g/l. Esto equivale a una productividad específica de acetato de aproximadamente 2 g/g de biomasa/día y aproximadamente 4 g/g de biomasa/día de etanol.

Ejemplo 5B: Fermentación continua en el CSTR

Todo el caldo de fermentación líquido del ejemplo 5A se dirigió a un CSTR de 3 l equipado con una membrana de reciclaje de células Xampler hidrófila de g E Healthcare, tamaño de poro: 0,1 NMWC, diámetro interno de la fibra: 1 mm, área de membrana: 0,011 m2. El fermentador se hizo funcionar de manera que se mantuvo un volumen constante y se le proporcionó continuamente una corriente de sustrato que comprendía 2 % de H2, 33 % de N2, 45 % de CO y 22 % de CO2. El circuito de reciclaje de células se hizo funcionar de manera que aproximadamente el 70 % de la biomasa microbiana se retuviera en el fermentador en cada pasada.

Se proporcionó automáticamente gas de sustrato de modo que el pH se mantuvo sustancialmente en aproximadamente 5,3. Durante la fermentación, si el pH empezaba a aumentar, se reducía el suministro de sustrato. En cambio, si el pH empezaba a disminuir, se aumentaba el suministro de sustrato. Los resultados de la fermentación se muestran en las Figuras 13-14. A medida que aumenta la densidad microbiana como resultado de la retención celular y/o el crecimiento microbiano, se aumentaba automáticamente el suministro de sustrato para mantener un pH sustancialmente constante. Mantener un pH constante ligeramente por debajo del pH del caldo de fermentación entrante da como resultado una conversión neta de acetato en etanol. Durante la fermentación, no se produjo acetato, por lo que el nivel neto en el fermentador disminuyó a menos de 5 g/l, mientras que el etanol se acumuló a al menos 40 g/l. El funcionamiento del fermentador de esta manera dio como resultado una producción constante de H2. Entre los días 6 y 7, la cantidad de H2 producida por el cultivo fue de aproximadamente 1 % en moles.

Ejemplo 6: Fermentación continua en el CSTR

Se configuró un CSTR de 2 l en las siguientes condiciones: Los medios se prepararon como se indica a continuación: Se añadió H³PO⁴85 % (30 mM) a 1,5 l de solución A. El pH del medio se ajustó a 5,3 mediante la adición de NH4OH. La solución de medio se esterilizó en autoclave durante 30 minutos a 121 °C o mediante esterilización por filtración antes de su uso. Se añadió resazurina como indicador redox. La solución del medio se transfirió aséptica y anaerobiamente a un recipiente CSTR de 1,5 l y se roció continuamente con N². Una vez transferidos al recipiente de fermentación, el estado de reducción y el pH del medio transferido se podían medir directamente mediante sondas. El medio se calentó a 37 °C y se agitó a 300 rpm, a continuación, se añadieron la solución de metales traza J (1,5 ml) y ácido nitriloacético (solución 0,15 M, 0,3 ml), y a continuación Na2WO3 (1,5 ml de una solución 0,01 M) y a continuación la solución K (15 ml). Antes de la inoculación, el gas se cambió a gas que contenía 50 % de N2 y 50 % de CO. Se inoculó un cultivo de Clostridium autoethanogenum en crecimiento activo en el CSTR a un nivel de aproximadamente 12 % (v/v). Durante este experimento, se añadió una solución de Na2S (0,2 M) a una velocidad de aproximadamente 0,3 ml/hora.

Se dejó que el cultivo microbiano creciera en modo discontinuo durante aproximadamente 1 día. En el día 1, la fermentación se cambió a operación continua en donde se proporcionó medio fresco. El suministro de sustrato se incrementó en respuesta a los requisitos del cultivo microbiano. Los resultados de la fermentación se muestran en las Figuras 15-16. Después de un período inicial de estabilización, la fermentación se realizó de manera que la biomasa se estabilizó en aproximadamente 3 g/l, mientras que el acetato se mantuvo a una concentración de aproximadamente 5 g/l y el etanol se mantuvo a una concentración de 15-20 g/l. A una tasa de dilución de aproximadamente 1,5, la productividad específica del acetato es de aproximadamente 1,2 g/g de biomasa/día, mientras que la productividad del etanol varía de aproximadamente 4-6 g/g de biomasa/día.

También se produjo H2 durante la fermentación a niveles superiores al 1 % en moles.

En el presente documento se ha descrito la invención con referencia a determinadas realizaciones preferidas, para permitir al lector llevar a la practica la invención sin excesiva experimentación. Los expertos en la materia apreciarán que la invención es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención incluye todas estas variaciones y modificaciones. Adicionalmente, se proporcionan títulos, encabezados o similares para mejorar la comprensión del lector de este documento, y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la presente invención.

La referencia a cualquier técnica anterior en esta especificación no es, y no debería tomarse como, un reconocimiento o cualquier forma de indicación de que esa técnica anterior forma parte del conocimiento general común en el campo de la empresa en cualquier país del mundo.

A lo largo de esta memoria descriptiva y de cualquiera de las siguientes reivindicaciones, a menos que el contexto requiera lo contrario, las palabras "comprende", "que comprende" y similares, deben interpretarse en un sentido inclusivo en lugar de exclusivo, es decir, en el sentido de "incluyendo, pero sin limitación".

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método para optimizar el suministro de un sustrato que comprende CO a un biorreactor, en donde el sustrato se fermenta para producir productos que incluyen uno o más alcohol(es) y/o ácido(s) mediante un cultivo de uno o más microorganismos carboxidotróficos, incluyendo el método determinar los niveles de ácido en el biorreactor en un primer punto temporal y un segundo punto temporal, en donde un aumento en el nivel de ácido entre el primer y el segundo puntos temporales da como resultado un aumento del suministro de sustrato, en donde una disminución en el nivel de ácido entre el primer y segundo puntos temporales da como resultado una disminución en el suministro de sustrato y en donde el sustrato se proporciona de manera que los niveles de ácido se mantienen entre concentraciones umbral predeterminadas de 1 a 10 g/l de caldo de fermentación.

2. El método de la reivindicación 1, en donde los niveles de ácido se determinan mediante la medición del pH del cultivo.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el suministro de sustrato se ajusta en respuesta a un cambio detectado en el pH del caldo de fermentación.

4. El método de la reivindicación 2 o 3, en donde el pH se mantiene en un intervalo de 5 a 6.

5. El método de la reivindicación 3, en donde el suministro de sustrato se controla manteniendo el pH del caldo de fermentación a una tasa de cambio constante.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el microorganismo es Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei o Clostridium carboxydivorans.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los niveles de ácido se mantienen entre 2 y 8 g/l de caldo de fermentación.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los productos se producen en una proporción de al menos 2:1 de alcohol(es) a ácido(s).