ES2898683T3 - Direccionamiento del factor tisular a las plaquetas activadas - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno de este, que se une específicamente al transcri- to 1 similar al TREM (TLT-1), o un fragmento de este, y que tiene un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de la SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

Direccionamiento del factor tisular a las plaquetas activadas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos y proteínas de fusión procoagulantes que pueden unirse al transcrito 1 similar a TREM (TLT-1).

Antecedentes de la invención

El factor tisular (TF), una glicoproteína transmembrana, es el iniciador celular primario de la coagulación de la san­ gre. Se expresa predominantemente en la superficie de células subendoteliales, tales como células de músculo liso y fibroblastos, y se une tanto al cimógeno del Factor VII de la coagulación (FVII) como a la forma activada, el Factor VIIa (FVIIa) cuando se interrumpe la integridad del endotelio, tal como cuando se rompen los vasos sanguíneos. Cuando el TF se une a FVII, promueve la activación de FVII a FVIIa. El TF también mejora en gran medida la activi­ dad proteolítica del Factor VIIa hacia sus sustratos fisiológicos, los Factores IX y X. El FVIIa retiene un estado similar al de un cimógeno en solución, que actúa como una enzima relativamente deficiente. El TF proporciona un soporte para la interacción macromolecular óptima con exositos, induce cambios conformacionales en el dominio proteasa del FVIIa que conduce a la maduración de su sitio activo y orienta el FVIIa en una superficie celular para la interac­ ción óptima con el sustrato. En conjunto, estos efectos dan como resultado una capacidad catalítica mejorada de FVIIa de varios órdenes de magnitud. Por lo tanto, el TF es un cofactor para el FVIIa en el complejo de iniciación de lo que tradicionalmente se denomina como la vía extrínseca de la coagulación sanguínea. Las etapas posteriores de la cascada de coagulación finalmente dan como resultado la formación de un polímero de fibrina que se une median­ te las plaquetas activadas y forma reticulaciones con el FXIIIa.

Las plaquetas, también conocidas como trombocitos, derivan de su predecesor celular, los megacariocitos. Las plaquetas normales en reposo fluyen libremente a lo largo de la circulación sanguínea cuando el endotelio está intacto. Cuando la barrera endotelial de una sola capa se daña, las plaquetas en reposo se adhieren a las estructuras subendoteliales por medio de receptores de glicoproteína (GP). Por ejemplo, GPIaIIa y GPVI se unen al colágeno; GPIcIIa se une a la fibronectina; GPIc*IIa se une a la laminina y GPIb-V-IX se une a polímeros del Factor von Willebrand (vWF). La adhesión de plaquetas de esta manera hace que cambien de forma y liberen sus gránulos alfa y densos. A su vez, esto resulta en la exposición de una plétora de otros receptores de plaquetas con glicoproteínas, tales como GPIIbIIIa (que se une al fibrinógeno/fibrina) y el transcrito 1 similar a TREM (TLT-1); así como también la liberación de factores de coagulación I (fibrinógeno), V y XI; otros procoagulantes tales como ADP, Ca2+, serotonina y factores de plaquetas 3/4; anticoagulantes tales como el inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI); y compuestos tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) esencial para el reabastecimiento de plaquetas y la cicatrización. Las plaquetas activadas se unen entre sí y forman reticulaciones con la fibrina en una reacción rápida, por ejemplo, a través del complejo con el receptor GPIIbIIIa.

Por lo tanto, las plaquetas activadas y el producto de polímero de fibrina de la cascada de coagulación forman juntos el coágulo sanguíneo. La agregación plaquetaria de la coagulación se conoce como la respuesta hemostática primaria, mientras que la respuesta en cascada de la coagulación se conoce como la respuesta hemostática secundaria. Aunque la fibrina se produce durante la respuesta hemostática primaria, a través de la llamada iniciación de la coagulación (independiente del FIX/FVIIIa), la cantidad producida en este punto es insuficiente para un coagulo fuerte. La fibrina inicial sirve como agregador de plaquetas activadas en el lugar de la lesión, lo que nuevamente proporciona una superficie celular óptima para la función de los factores de coagulación activados.

En sujetos con una coagulopatía, tales como en seres humanos con hemofilia A y B, diversas etapas de la cascada de coagulación se tornan disfuncionales debido a, por ejemplo, la ausencia o presencia insuficiente de un factor de coagulación. Tal disfunción de una parte de la coagulación resulta en una coagulación insuficiente de la sangre y un sangrado potencialmente mortal.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto que sea adecuado para usar como un fármaco procoagulante en tales sujetos. Un segundo objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto que permita movilizar un punto físico de inicio de la coagulación sanguínea, de manera que la coagulación extrínseca no dependa únicamente del factor tisular subendotelial unido a las células. Un tercer objeto de la presente invención es proporcionar un compuesto que regule positivamente la coagulación sanguínea en un microambiente adecuado fisiológicamente. Un objeto adicional de la presente invención es dirigir un factor tisular soluble, o un fragmento o variante biológicamente funcional de este, a la superficie de las plaquetas activadas. Un objeto adicional de la invención es mejorar la actividad proteolítica del factor endógeno VIIa hacia sus sustratos fisiológicos, los factores IX y X. Por lo tanto, el objeto es permitir el inicio de la coagulación sanguínea en la superficie de las plaquetas activadas que se localizan intravascular o extravascularmente. Esto es adicional al inicio normal y exclusivamente subendotelial, típicamente extravascular, de la coagulación sanguínea.

El documento WO06/096828 describe proteínas quiméricas que comprenden el factor tisular soluble (sTF) y un dominio de unión a fosfatidil serina (PS), tal como Anexina V. La PS se expone en la superficie de células activadas, tales como monocitos, células endoteliales y células que experimentan apoptosis, así como también en plaquetas activadas y en reposo. Las proteínas quiméricas son tanto procoagulantes como anticoagulantes; esto último debido al hecho de que, en dosis más altas, las construcciones compiten con factores de coagulación en la unión a la PS en las plaquetas activadas. Por lo tanto, las proteínas quiméricas del documento WO06/096828 tienen un conjunto diferente de propiedades en comparación con las proteínas de fusión descritas en la presente descripción.

El documento US 2008/0131423 describe anticuerpos monocatenarios contra el transcrito 1 similar al TREM (TLT-1), identificados mediante el uso de exposición de fagos vírgenes que se cribó contra una fusión del dominio extracelular de TLT-1 con el fragmento Fc de IgG1 humana (TLT-1-Fc) (ver el Ejemplo 2). El documento US 2008/0131423 no describe un anticuerpo contra TLT-1, o fragmento de unión al antígeno de este, que se une específicamente a un epítopo particular dentro de la región del tallo del TLT-1.

El documento US 2004/0180409 describe moléculas de ácido nucleico, proteínas, proteínas de fusión, péptidos antigénicos y anticuerpos contra TLT-1. El documento US 2004/0180409 no describe realmente la identificación o generación y caracterización de un anticuerpo contra TLT-1, o fragmento de unión al antígeno de este. Específicamente, el documento US 2004/0180409 no describe un anticuerpo TLT-1, o fragmento de unión al antígeno de este, que se une específicamente a un epítopo particular dentro de la región del tallo del TLT-1.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos y proteínas de fusión procoagulantes que pueden unirse al transcrito 1 similar a TREM (TLT-1).

Además, la presente invención proporciona un método de direccionamiento al factor tisular como parte de una proteína de fusión a la superficie de las plaquetas activadas, dicho método comprende poner en contacto las plaquetas activadas con cualquier construcción que comprende (i) factor tisular, o una variante funcional de este, y (ii) un ligando con capacidad de unión a (iii) un receptor presente en una plaqueta activada, tal como TLT-1. De esta manera, la invención se refiere, además, a un método de regulación positiva de la activación del FX en la superficie de las plaquetas activadas, en donde dicho método comprende el contacto de las plaquetas activadas con dicha construcción en la presencia simultánea de FX.

Descripción de los dibujos

Figura 1: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos del TLT-1 humano. En la Figura 1, se muestran las secuen­ cias de aminoácidos y nucleótidos que representan el hTLT-1. Aquí, la secuencia de nucleótidos en la posición 1­ 45 codifica el péptido señal predicho, la secuencia de nucleótidos en la posición 46-486 codifica el dominio extra­ celular del hTLT-1, la secuencia de nucleótidos en la posición 487-555 codifica la región transmembrana y la se­ cuencia de nucleótidos en la posición 556-933 codifica el dominio intracelular del hTLT-1.

Figura 2: Secuencias de aminoácidos y nucleótidos que representan el dominio extracelular del TLT-1 humano que contiene una etiqueta His-6 en el extremo C. En la Figura 2, se muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos que representan el dominio extracelular del hTLT-1 con una etiqueta His en el extremo C. Aquí, la secuencia subrayada (7-15) indica las posiciones de una secuencia kozak, la secuencia de nucleótidos en la po­ sición 16-60 codifica el péptido señal predicho, la secuencia de nucleótidos en la posición 61-501 codifica el do­ minio extracelular del hTLT-1 y la secuencia de nucleótidos en la posición 502-519 codifica la etiqueta 6xHis (en negritas). Además, se muestran los sitios de la enzima de restricción HindIII (secuencia de nucleótidos en la po­ sición 1-6) y EcoRI (secuencia de nucleótidos en la posición 523-528) y el codón de parada se marca con un as­ terisco (520-522).

Figura 3: El dominio variable de 0012LC y 0012HC, que incluye la numeración de Kabat:

A) El dominio variable de 0012LC

B) El dominio variable de 0012LC, numeración de Kabat

C) El dominio variable de 0012HC

D) El dominio variable de 0012HC, numeración de Kabat.

En la Figura 3A, la secuencia de nucleótidos en la posición 1-57 codifica la secuencia del péptido señal LC; las secuencias de nucleótidos en la posición 58-396 codifican el dominio variable de 0012LC. En la Figura 3B, las secuencias en negritas y gris representan las posiciones de las CDR de 0012LC de acuerdo con la numeración de Kabat. En la Figura 3C, la secuencia de nucleótidos en la posición 1-54 codifica el péptido señal de 0012HC, la secuencia de nucleótidos en la posición 55-396 codifica el dominio variable de 0012HC. En la Figura 3D, las secuencias en negritas y gris representan las posiciones de las CDR de 0012HC de acuerdo con la numeración de Kabat.

Figura 4: El dominio variable de 0012LC junto con la región constante de la LC kappa humana, y una etiqueta HPC4 (codificada por pTT-0012LC.HPC4). En la Figura 4, las secuencias de nucleótidos en la posición 1-57 co­ difican el péptido señal de LC, la secuencia de nucleótidos 58-396 codifica el dominio variable de 0012LC, la se­ cuencia de nucleótidos 397-714 codifica la región constante de 0012LC kappa humana, y la secuencia de nu­ cleótidos 715-750 codifica una etiqueta HPC4.

Figura 5: El dominio variable de 0012HC junto con la región constante de la IgG4 humana (pTT-0012HC). En la Figura 5, la secuencia de nucleótidos 1-54 codifica el péptido señal de HC, la secuencia de nucleótidos 55-396 codifica el dominio variable de 0012HC y la secuencia de nucleótidos 397-1377 codifica la región constante de la IgG4 humana (en negritas).

Figura 6: Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de 0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219, según lo codificado por pTT-0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219. La construcción pTT-0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219 que codifica el enlazador Gly-Ser L4a y el dominio extracelular AA 1-219 del factor tisular humano. Aquí, la secuencia de nucleótidos en la posición 1-54 codifica el péptido señal predicho, la secuencia de nucleótidos en la posición 55-396 codifica el dominio variable de 0012HC, la secuencia de nucleótidos en la posición 397-699 (en negrita) codifica la región constante CH¹ de IgG4 humana, la secuencia de nucleótidos en la posición 700-750 (subrayada) codifica el enla­ zador Gly-Ser designado L4a y la secuencia de nucleótidos en la posición 701-1407 codifica el dominio extrace­ lular del factor tisular humano (aminoácido 1-219, secuencia de puntos). La secuencia de aminoácidos de 0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219 está compuesta de la SEQ ID NO. 51 (0012VH-VH1), SEQ ID NO. 61 (L4a) y la SEQ ID NO. 14 (hTF.1-219).

Figura 7: Estimulación de la actividad del factor VIIa. Los datos en la figura 7 demuestran que se obtuvo una estimulación similar dependiente de la concentración de la actividad amidolítica del FVIIa con las proteínas de fusión Fab-hTF.1-219 y mAb-hTF.1-219 como con las no fusionadas hTF.1-219. Esto indica que la unión de FVIIa al componente TF de las proteínas de fusión de TF no se afectó por la unión del TF a fragmentos Fab o mAb.

Figura 8: Unión de la proteína ID No. 0010 y 0011 a las plaquetas activadas mediante análisis por FACS. Detección mediante una etiqueta anti-HPC4 (Figura 8A) o un anticuerpo anti-LC (Figura 8B).

Figura 9: La Figura 9A muestra el efecto de i) 0,03 nM Innovin®, ii) 10 nM sTF, iii) 10 nM 0011 Fab-hTF.1-219, iv) 10 nM anticuerpo anti-TLT-1 Fab 0010 o v) 10 nM anticuerpo anti-TLT-1 mAb 0012 sobre la activación de fX mediada por FVIIa en ausencia o presencia de plaquetas. La Figura 9B muestra el efecto de reemplazar rFVIIa en el ensayo con el cimógeno, rFVII.

Figura 10: Los datos en la Figura 10A muestran que la unión de 10 nM 0011 Fab-hTF.1-219 al receptor de TLT-1 estimula específicamente la activación del FX mediada por FVIIa en plaquetas activadas y no en reposo. La es­ timulación aumenta con la cantidad de plaquetas activadas y se satura con una EC⁵⁰ ~ 12000 plts/pl. La Figura 10B compara los resultados en la Figura 10A con los resultados que se obtienen con la proteína de fusión 0,1 nM Anexina V - hTF.1-219 (AV- hTF.1-219). La Figura 10B muestra que la unión de AV-hTF.1-219 al fosfolípido de las plaquetas estimula la activación del FX en las plaquetas activadas y en reposo. Se observa una estimulación marcada de la activación del FX con plaquetas en reposo que en la cantidad máxima de plaquetas evaluada ex­ cede la generación de FXa en la superficie de una cantidad equivalente de plaquetas activadas. La Figura 10B muestra claramente que AV-TF no puede usarse para mejorar selectivamente la generación del FXa en plaque­ tas activadas.

Figura 11: Los datos en la Figura 11 muestran la dependencia de la estimulación de la activación del FX con la concentración de FVIIa/FVII en plaquetas activadas por 10 nM de las proteínas de fusión Fab-hTF.1-219. El efec­ to con las plaquetas activadas de 0020 Fab-hTF.1-219 se compara con el efecto de una proteína de fusión de isotipo 0094 Fab-hTF.1-219 que no se une al TLT-1 y al hTF.1-219 no fusionado. Además, para la comparación se muestra el efecto de 0020 Fab-hTF.1-219 con plaquetas en reposo. Se obtiene una estimulación similar en todas las concentraciones con FVIIa y FVII que muestra que las proteínas de fusión de TF median una activación de FVII con retroalimentación eficiente en plaquetas activadas y que la estimulación es óptima en concentracio­ nes fisiológicas de FVII/FVIIa. Una estimulación marcada se induce después del direccionamiento a TLT-1 y no con derivados de hTF.1-219 sin direccionamiento.

Figura 12: Los datos en la Figura 12 muestran la estimulación de la activación del FX mediada por FVIIa/FVII a 10 nM en plaquetas activadas a varias concentraciones de proteínas de fusión Fab-hTF.1-219. El efecto con las plaquetas activadas de 0070 Fab-hTF.1-219 se compara con el efecto de una proteína de fusión de isotipo 0094 Fab-hTF.1-219 que no se une al TLT-1 y al hTF.1-219 no fusionado. El 0070 Fab-hTF.1-219 estimula marcada­ mente la activación del FX en un amplio intervalo de concentración con un mecanismo que requiere el direccio­ namiento a TLT-1 como se indica mediante la comparación con los controles que no se unen.

Figura 13: Los datos en la Figura 13 muestran la estimulación de la activación del FX mediada por 0,1 nM FVIIa/FVII en fosfolípidos enriquecidos con TLT-1 a varias concentraciones de proteínas de fusión Fab-hTF.1 219. El efecto de 0070 Fab-hTF.1-219 se compara con el efecto de una proteína de fusión de isotipo 0094 FabhTF.1-219 que no se une a TLT-1 y al hTF.1-219 no fusionado. El 0070 Fab-hTF.1-219 estimula marcadamente la activación del FX en un amplio intervalo de concentración con un mecanismo que requiere el direccionamiento a TLT-1 como se indica mediante la comparación con los controles que no se unen.

Figura 14: La Figura 14 muestra la estimulación de la formación del coágulo de fibrina en sangre completa hu­ mana (HWB) "similar a la hemofilia” mediada por la proteína de fusión 0070 Fab-hTF.1-219. La Figura 14A mues­ tra los trazos de TEG de la formación de coágulos que se midieron a varias concentraciones (0, 0,1, 0,2, 1,0, y 10 nM) de la proteína de fusión 0070 Fab-hTF.1-219 añadida a HWB que se convierte en "similar a la hemofilia” mediante la adición de un anticuerpo contra el FVIII humano. El tiempo de coagulación se reduce notablemente por el anticuerpo contra FVIII y las concentraciones crecientes de 0070 Fab-hTF.1-219 revierten drásticamente el efecto del anticuerpo contra FVIII. La Figura 14B muestra los tiempos R para los trazos de TEG en la Figura 14A y compara el tiempo R para el 0070 Fab-hTF.1-219 con los tiempos R que se obtienen para la proteína de fusión de isotipo 0094 Fab-hTF.1-219 y hTF.1-219 corridos en paralelo con el mismo donante. El 0070 Fab-hTF.1-219 estimula notablemente la formación de coágulos en HWB "similar a la hemofilia” con un mecanismo que requiere el direccionamiento a TLT-1 como se indica mediante la comparación con los controles que no se unen.

La Figura 15: muestra que TLT1-FAb-TF reduce la pérdida de sangre en el sangrado de la cola en ratones hemofílicos transfundidos con plaquetas humanas 2 minutos antes de la inducción del sangrado, en comparación con una construcción de FAb-TF irrelevante.

Figura 16: Cobertura de secuencias de péptidos de TLT-1 analizados por HX en presencia y ausencia de 0023.La secuencia primaria (mediante el uso de la numeración madura) se muestra encima de los péptidos ana­ lizados por HX (se muestra como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio simi­ lares tanto en presencia como en ausencia de 0023 se muestran en blanco, mientras que los péptidos que mues­ tran una incorporación de deuterio reducida tras la unión de 0023 son de color negro.

Figura 17: Cobertura de secuencias de péptidos de TLT-1 analizados por HX en presencia y ausencia de 0051. La secuencia primaria (mediante el uso de la numeración madura) se muestra encima de los péptidos analizados por HX (se muestra como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tan­ to en presencia como en ausencia de 0051 se muestran en blanco, mientras que los péptidos que muestran una incorporación de deuterio reducida tras la unión de 0051 son de color negro.

Figura 18: Cobertura de secuencias de péptidos de TLT-1 analizados por HX en presencia y ausencia de 0062. La secuencia primaria (mediante el uso de la numeración madura) se muestra encima de los péptidos analizados por HX (se muestra como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tan­ to en presencia como en ausencia de 0062 se muestran en blanco, mientras que los péptidos que muestran una incorporación de deuterio reducida tras la unión de 0062 son de color negro.

Figura 19: Cobertura de secuencias de péptidos de TLT-1 analizados por HX en presencia y ausencia de 0061. La secuencia primaria (mediante el uso de la numeración madura) se muestra encima de los péptidos analizados por HX (se muestra como barras horizontales). Los péptidos que muestran patrones de intercambio similares tan­ to en presencia como en ausencia de 0061 se muestran en blanco, mientras que los péptidos que muestran una incorporación de deuterio reducida tras la unión de 0061 son de color negro.

Figura 20: Cobertura de secuencias de péptidos de la región 126-162 del TLT-1 analizados por HX. La secuen­ cia primaria (mediante el uso de la numeración madura) se muestra encima de los péptidos analizados por HX (se muestra como barras horizontales). Todos los péptidos mostraron una incorporación reducida de deuterio tras la unión de 0061.

Figura 21: Mapa del plásmido para el vector de expresión pTT. Los fragmentos de ADN pueden insertarse en los sitios de las enzimas de restricción HindIII y EcoRI.

Figura 22: Mapa del plásmido para el vector de expresión pTT-hIgG4. El vector de expresión contiene las se­ cuencias de a Dn de la IgG4 CH1-bisagra-CH2-CH3 humana. Las secuencias de ADN codificantes de V^h pueden insertarse en los sitios de las enzimas de restricción HinDIII y NheI, lo que resulta en un plásmido codificante de HC completa.

Figura 23: Mapa del plásmido para el vector de expresión pTT-hCL,kappa. El vector de expresión contiene las secuencias de ADN que codifican la región constante de la LC humana, kappa designada hCL, kappa. Las se­ cuencias de ADN codificantes de V^l pueden insertarse en los sitios de las enzimas de restricción HinDIII y BsiWI, lo que resulta en un plásmido codificante de LC completa.

Figura 24: Mapa del plásmido para el vector de expresión pTT-L4a-hTF.1-219.El vector de expresión contiene secuencias de ADN que codifican un enlazador Gly-Ser de 17 aminoácidos y TF.1-219 humano. Las secuencias de ADN que codifican HC, LC o V^h-CH1 pueden insertarse en los sitios de las enzimas de restricción HinDIII y BamHI, lo que resulta en los plásmidos codificantes de HC-L4a-hTF.1-219, LC-L4a-hTF.1-219 o Vh-CH1 -L4ahTF.1-219.

Figura 25: Mapa del plásmido para el vector de expresión pTT-hTF.1-219-L4b. El vector de expresión contiene secuencias de ADN codificantes de TF.1-219 humano y un enlazador Gly-Ser de 17 aminoácidos de longitud. Las secuencias de ADN codificantes de HC, LC o V^h-CH1 pueden insertarse en los sitios de las enzimas de res­ tricción BamHI y EcoRI, lo que resulta en un plásmido codificante de hTF.1-219-L4b-HC, hTF.1-219-L4b-LC o hTF.1-219-L4b-VH-CH1.

Figura 26: Esquema de las construcciones mAb-LC-hTF.1-219 y Fab-LC-hTF.1-219. Se muestran las denotacio­ nes estándar para los componentes de anticuerpo: VL, CL, VH, CH1, CH2, y CH3. Los dominios de fibronectina III del factor tisular se denotan como Fbn-III.

Figura 27: Cribado de la actividad procoagulante de la proteína de fusión de TF mediante la medición de la acti­ vación de FX mediada por FVII/FVIIa en i) plaquetas activadas y en ii) fosfolípidos enriquecidos con TLT-1. La estimulación de la activación del FX en plaquetas activadas se realizó como se describió en el Ejemplo 37 en plaquetas de donantes humanos individuales. La estimulación que se obtuvo con 0020 Fab-hTF.1-219 siempre se incluyó y se estableció como el 100 %. La estimulación de la activación de FX en fosfolípidos enriquecidos con TLT-1 se realizó como se describió en el Ejemplo 40 con la proteína de fusión FVII/FVIIa 0,1 nM y proteína de fusión Fab 10 nM o proteína de fusión mAB 1,0 nM. La estimulación que se obtuvo con 0020 Fab-hTF.1-219 siempre se incluyó y se estableció como el 100 %. La Figura 27A enumera los datos sobre las proteínas de fu­ sión mAb-TF y la Figura 27B enumera los datos sobre las proteínas de fusión Fab-TF. También se muestran da­ tos con 0020 Fab-hTF.1-219 en plaquetas en reposo y los resultados con anticuerpos de isotipo que no se unen.

Secuencias

Las secuencias son las siguientes:

La SEQ ID NO: 1 proporciona la secuencia de nucleótidos del (h)TLT-1 humano.

La SEQ ID NO: 2 proporciona la secuencia de aminoácidos del hTLT-1.

La SEQ ID NO: 3 proporciona la secuencia de nucleótidos del dominio extracelular del hTLT-1-His6.

La SEQ ID NO: 4 proporciona la secuencia de aminoácidos del dominio extracelular del hTLT-1-His6.

Las SEQ ID NO: 5 a 8 proporcionan las secuencias de aminoácidos de los fragmentos del hTLT-1: hTLT-1.20-125, hTLT-1.16-162, hTLT-1.126-162 y hTLT-1.129-142.

La SEQ ID NO: 9 proporciona la secuencia de nucleótidos del dominio variable de la LC del mAb 0012 (2F105), LC.

La SEQ ID NO: 10 proporciona la secuencia de aminoácidos del dominio variable del mAb 0012 (2F105), LC. La SEQ ID NO: 11 proporciona la secuencia de nucleótidos del dominio variable de 0012 (2F105) HC.

La SEQ ID NO: 12 proporciona la secuencia de aminoácidos del dominio variable de 0012 (2F105) HC.

La SEQ ID NO: 13 proporciona la secuencia de ácido nucleico de hTF.1-219.

La SEQ ID NO: 14 proporciona la secuencia de aminoácidos de hTF.1-219.

La SEQ ID NO: 15 proporciona la secuencia de ácido nucleico del factor tisular humano.

La SEQ ID NO: 16 proporciona la secuencia de aminoácidos del factor tisular humano.

La SEQ ID NO: 17 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb 0012.

La SEQ ID NO: 18 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb 0012 y Fab 0012.

La SEQ ID NO: 19 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb 0023.

La SEQ ID NO: 20 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb 0023 y Fab 0023.

La SEQ ID NO: 21 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb 0051.

La SEQ ID NO: 22 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb 0051 y Fab 0051.

La SEQ ID NO: 23 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb 0052.

La SEQ ID NO: 24 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb 0062.

La SEQ ID NO: 25 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb 0052, el Fab0052 y el mAb 0062.

La SEQ ID NO: 26 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb 0061.

La SEQ ID NO: 27 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena pesada del mAb 0082.

La SEQ ID NO: 28 proporciona la secuencia de nucleótidos de la cadena ligera del mAb 0061, el Fab0061, el mAb 0082 y el Fab0082.

La SEQ ID NO: 29 proporciona la secuencia de nucleótidos de VH-CH1 de Fab 0012.

La SEQ ID NO: 30 proporciona la secuencia de nucleótidos de VH-CH1 de Fab 0023.

La SEQ ID NO: 31 proporciona la secuencia de nucleótidos de VH-CH1 de Fab 0051.

La SEQ ID NO: 32 proporciona la secuencia de nucleótidos de VH-CH1 de Fab 0052.

La SEQ ID NO: 33 proporciona la secuencia de nucleótidos de VH-CH1 de Fab 0061.

La SEQ ID NO: 34 proporciona la secuencia de nucleótidos de VH-CH1 de Fab 0082.

La SEQ ID NO: 35 proporciona la secuencia de nucleótidos de VH-VH1 de Fab AP-3.

La SEQ ID NO: 36 proporciona la secuencia de nucleótidos del Fab AP-3 LC.

La SEQ ID NO: 37 proporciona la secuencia de nucleótidos del Fab-AP-3 LC.C34S.

La SEQ ID NO: 38 proporciona la secuencia de nucleótidos de la bisagra-CH2-CH3 de hlgG4.

La SEQ ID NO: 39 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0012, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).

La SEQ ID NO: 40 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0012, LC (VL de ratón - CL Kappa huma­ na) y Fab 0012, LC (VL de ratón - CL Kappa humana).

La S^eQ ID NO: 41 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0023, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).

La SEQ ID NO: 42 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0023, LC (VL de ratón - CL Kappa huma­ na) y Fab 0023, LC (VL de ratón - CL Kappa humana).

La S^eQ ID NO: 43 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0051, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).

La SEQ ID NO: 44 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0051, LC (VL de ratón - CL Kappa huma­ na) y Fab 0051, LC (VL de ratón - CL Kappa humana).

La SeQ ID NO: 45 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0052, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).

La SEQ ID NO: 46 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0052, LC (VL de ratón - CL Kappa huma­ na); Fab0052, LC (Vl de ratón - CL Kappa humana); mAb 0062, LC (VL de ratón - CL Kappa humana).

La SEQ ID NO: 47 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0061, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).

La SEQ ID NO: 48 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0061, LC (VL de ratón - CL Kappa huma­ na); Fab 0061, LC (v l de ratón - CL Kappa humana) y mAb 0082, LC (VL de ratón - CL Kappa humana); Fab 0082, LC (VL de ratón - CL Kappa humana).

La SEQ iD NO: 49 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0062, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).

La SEQ ID nO: 50 proporciona la secuencia de aminoácidos del mAb 0082, HC (VH de ratón-CH1-CH2-CH3 de IgG4 humana).

La SEQ ID NO: 51 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab 0012, VH de ratón - CH1 de IgG4 humana. La SEQ ID NO: 52 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab 0023, VH de ratón - CH1 de IgG4 humana. La SEQ ID NO: 53 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab 0051, VH de ratón - CH1 de IgG4 humana. La SEQ ID NO: 54 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab 0052, VH de ratón - CH1 de IgG4 humana. La SEQ ID NO: 55 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab 0082, VH de ratón - CH1 de IgG4 humana. La SEQ ID NO: 56 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab AP-3, VH de ratón - CH1 de IgG4 humana. La SEQ ID NO: 57 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab AP-3, LC (VL de ratón - CL Kappa huma­ na).

La SEQ ID NO: 58 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab AP-3.LC.C34S, LC (Ratón VL - CL Kappa humana).

Las SeQ ID NO: 59-68 proporcionan las secuencias de aminoácidos de los enlazadores opcionales L2-L10. Los enlazadores opcionales se enumeran y se listan en la Tabla 1.

La SEQ ID NO: 69 proporciona la secuencia de aminoácidos de la etiqueta de purificación HPC4.

Las SEQ ID NO: 70-155 proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos de los cebadores usados durante el desarrollo de las construcciones de expresión descritas en los ejemplos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 19, 20, 24, 25.

La SEQ ID NO: 156 proporciona la secuencia de aminoácidos de VH-CH1 del Fab 0061.

La SEQ ID NO: 157 proporciona la secuencia de aminoácidos de la bisagra-CH2-CH3 de hIgG4.

La SEQ ID NO: 158 proporciona la secuencia de aminoácidos de una etiqueta His6.

La SEQ ID NO: 159 proporciona la secuencia de aminoácidos del hTLT-1.18-188.

La SEQ ID NO: 160 proporciona la secuencia de ácido nucleico del cebador núm.1004.

La SEQ ID NO: 161 proporciona la secuencia de ácido nucleico del cebador núm.1005.

La SEQ ID NO: 162 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab 0100 HC.

La SEQ ID NO: 163 proporciona la secuencia de aminoácidos del Fab 0100 LC.

Descripción de la invención

La invención se refiere a anticuerpos y proteínas de fusión procoagulantes que pueden unirse al transcrito 1 similar a TREM (TLT-1). Proteínas expresadas a partir de dos o más genes que se han unido artificialmente, por ejemplo a través de tecnología recombinante o acoplamiento químico, y que originalmente codificaron proteínas separadas.

Las proteínas de fusión de la invención pueden unirse a un receptor que solo está (en el sentido no ubicuo) presente en una plaqueta que experimenta cambios conformacionales y funcionales asociados con la activación y en particular al transcrito 1 similar a TREM (TLT-1).

La activación de receptores expresados en células mieloides (TREM) tiene un papel bien establecido en la biología de diversos linajes mieloides, y juegan papeles importantes en la regulación de la inmunidad innata y adaptativa. El TLT-1 pertenece a la misma familia de proteínas, aunque el gen TLT-1 se expresa solo en un linaje único, específicamente en megacariocitos y trombocitos (plaquetas) y se encuentra exclusivamente en los gránulos alfa de los megacariocitos y las plaquetas. El TLT-1 es una proteína transmembrana que se expone en la superficie de plaquetas activadas tras la liberación de gránulos alfa. Hasta la fecha, el TLT-1 no se ha encontrado en la superficie de plaquetas en reposo o en la superficie de cualesquiera otros tipos de células.

Es conocido que la porción extracelular del TLT-1 consiste de un único dominio similar a inmunoglobulina (similar a Ig) conectado a la membrana celular de las plaquetas mediante una región enlazadora llamada el tallo (Gattis y otros, Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, núm. 19, pp. 13396-13403). El dominio similar a Ig del TLT-1 humano (hTLT-1) consiste en 105 residuos y se une a la membrana mediante un tallo de 37 aminoácidos. Por lo tanto, se espera que el dominio similar a Ig del TLT-1 tenga una libertad de movimiento considerable.

El segmento transmembrana putativo del hTLT-1 es de 20 aminoácidos de longitud. El TLT-1 tiene, además, un mo­ tivo de inhibición basado en tirosina del inmunorreceptor citoplasmático, que puede funcionar como un dominio de transducción de la señal intracelular.

El papel del TLT-1 en la biología de las plaquetas todavía no se ha dilucidado completamente; se cree que el TLT-1 juega un papel en la regulación de la coagulación e inflamación en el sitio de una lesión. Se ha informado una forma soluble del TLT-1 que contiene el dominio similar a Ig (Gattis y otros, Jour Biol Chem, 2006, Vol. 281, núm. 19, pp.

13396-13403). Las funciones específicas del TLT-1 soluble frente al que se une a las plaquetas aún están por establecerse.

Un receptor tal como TLT-1 comprende epítopos que son dianas útiles para las proteínas/construcciones de fusión de la presente invención. Las proteínas de fusión pueden unirse a cualquier parte del TLT-1 que pudiera estar disponible para la unión in vivo, tal como residuos accesibles de la superficie del dominio similar a Ig, o parte del tallo. Por lo tanto, las proteínas de fusión pueden unirse a uno o más residuos dentro de TLT-1 (20-125), t Lt -1 (16­ 162), TLT-1 (126-162) y/o TLT-1 (129-142).

En una modalidad preferida, las proteínas de fusión se unen al tallo del TLT-1, tal como uno o más residuos del TLT-1 (126-162) o TLT-1 (129-142). Es poco probable que las proteínas de fusión que se unen al tallo de TLT-1 interfieran con la función del dominio similar a Ig y probablemente no se separarán de la superficie de la plaqueta si se elimina el dominio similar a Ig. Además, las proteínas de fusión que se unen al tallo de TLT-1 ubican su porción de TF en una posición y orientación favorables en la superficie celular de las plaquetas activadas, con relación a las del FVII y FVIIa. En otra modalidad preferida, la fusión del TF al extremo C de un anticuerpo, o fragmento de este, ubicará al TF aún más favorablemente en la superficie celular de las plaquetas activadas, con relación a la del FVII y FVIIa.

En términos de la presente invención, el TLT-1 puede ser de cualquier vertebrado, tal como cualquier mamífero, tal como un roedor (tal como un ratón, rata o cobayo), un lagomorfo (tal como un conejo), un artiodáctilo (tal como un cerdo, vaca, oveja o camello) o un primate (tal como un mono o un ser humano). El TLT-1 es, preferentemente, TLT-1 humano. El ^t L^t -1 puede traducirse a partir de cualquier genotipo o alelo de origen natural que da lugar a una proteína TLT-1 funcional. Un ejemplo no limitante de un TLT-1 humano es la secuencia polipeptídica de la SEQ ID NO. 2.

Las proteínas de fusión de la invención comprenden un componente similar al factor tisular. El factor tisular es un receptor de glicoproteína de membrana integral de 263 aminoácidos de longitud. Consiste en una parte extracelular plegada en dos dominios compactos similar a fibronectina tipo III (1-209) que se estabilizan cada uno por un único enlace disulfuro, un enlazador corto (210-219), un segmento transmembrana (220-242) y una cola citoplasmática corta (243-263). Forma un complejo ajustado dependiente de Ca2+con el Factor VII/FVIIa.

En términos de la presente invención, "factor tisular, o cualquier variante o fragmento biológicamente funcional de este”, puede ser cualquier polipéptido similar al factor tisular que pueda unirse al Factor VII/VIIa, de manera que se estimula la coagulación sanguínea. El "factor tisular” puede derivarse de cualquier animal vertebrado, tal como cual­ quier mamífero, tal como un roedor (tal como un ratón, rata o cobayo), un lagomorfo (tal como un conejo), un artio­ dáctilo (tal como un cerdo, vaca, oveja o camello) o un primate (tal como un mono o un ser humano). El "factor tisu­ lar, o cualquier variante o fragmento biológicamente funcional de este” puede ser el dominio extracelular del factor tisular humano. El "factor tisular, o cualquier variante o fragmento biológicamente funcional de este” puede ser cual­ quier polipéptido que sea al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % idéntico a la secuencia polipeptídica del factor tisular. El "factor tisular, o cual­ quier variante o fragmento biológicamente funcional de este” puede ser cualquier polipéptido que sea al menos 90 %, tal como al menos 91 %, tal como al menos 92 %, tal como al menos 93 %, tal como al menos 94 %, tal como al menos 95 %, tal como al menos 96 %, tal como al menos 97 %, tal como al menos 98 %, tal como al menos 99 % idéntico a la secuencia polipeptídica del dominio extracelular del factor tisular o una variante de este. El "factor tisular, o cualquier variante o fragmento biológicamente funcional de este” puede ser cualquier polipéptido que sea ca­ paz de funcionar como cofactor para el FVII y FVIIa. Por lo tanto, el "factor tisular o cualquier variante o fragmento biológicamente funcional de este” puede ser cualquier polipéptido que sea capaz de estimular la actividad amidolítica del FVIIa.Dicho "factor tisular, o cualquier variante o fragmento biológicamente funcional de este” puede ser el domi­ nio extracelular de TF (1-219). El "polipéptido del factor tisular” puede ser un polipéptido que comprende el dominio extracelular soluble del factor tisular, es decir, los aminoácidos 1-219 (en lo siguiente denominado sTF o sTF(1219)), o una variante funcional o forma truncada de este. Preferentemente, el polipéptido del factor tisular comprende al menos un fragmento correspondiente a la secuencia de aminoácidos 6-209 del factor tisular. Ejemplos de estos son sTF(6-209), sTF(1-209), sTF (1-210), sTF (1-211), sTF (1-212), sTF (1-213), sTF (1-214), sTF (1-215), sTF (1­ 216), sTF (1-217), sTF (1-218), sTF(1-219), sTF(2-219), sTF(3-219), sTF(4-219), sTF(5-219).

De acuerdo con la presente invención, "factor tisular, o cualquier variante o fragmento biológicamente funcional de este” puede tener una o más de las características mencionadas anteriormente.

Las proteínas de fusión de la invención comprenden, además, un "ligando”. El término "ligando” se refiere a cualquier sustancia que pueda unirse y formar un complejo con una biomolécula, con el fin de servir a un propósito biológico. En un sentido del término, es una señal que activa la unión de la molécula a un sitio en una proteína diana por medio de fuerzas intermoleculares tales como enlaces iónicos, puentes de hidrógeno y fuerzas de Van der Waals. La asociación de un ligando con dicha biomolécula generalmente es reversible. La unión de un ligando de origen natural a su receptor equivalente puede o no alterar la conformación de la proteína receptora. En términos de la presente invención, un objeto de dicho ligando es dirigir el componente similar al TF a la superficie de una plaqueta que está activada o en el proceso de activarse.

El ligando puede ser cualquier ligando sintético o de origen natural que se une a un receptor que está, preferentemente, presente solamente en las plaquetas que experimentan activación. El ligando de la presente invención puede ser cualquier ligando de origen natural o sintético que se une al TLT-1, o el ligando puede ser un anticuerpo, o un fragmento de este, que se ha generado contra el ^t L^t -1. El ligando de la presente invención puede o no dar como resultado un cambio en la estructura conformacional de TLT-1. Además, el ligando de la presente invención puede o no resultar en señalización intracelular, como un resultado de la unión al TLT-1. En una modalidad preferida, el ligando de la invención puede unirse al tallo de TLT-1. Por lo tanto, el ligando de la presente invención utiliza un receptor de origen natural, o porción de este, para lograr el efecto que es único y proporcionado por la presente invención.

Como se mencionó anteriormente, el componente del ligando de las proteínas de fusión de la invención puede ser un anticuerpo o un fragmento de este. El término "anticuerpo", como se menciona en la presente descripción, incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas únicas de estos. Un anticuerpo se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) que están interconectadas mediante enlaces disulfuro; o una porción de unión a antígeno de este. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente descripción como VH) y una región constante de la cadena pesada. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente descripción como VL) y una región constante de la cadena ligera. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos o factores del huésped, que incluyen diversas células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (CIq) del sistema de complemento clásico. Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal. En una modalidad, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal. Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humano o humanizado, o una porción de unión a antígeno de cualquiera de estos. Para la producción de anticuerpos monoclonales y policlonales, el animal experimental es un mamífero adecuado, tal como una cabra, conejo, rata o ratón.

En términos estructurales, un anticuerpo monoclonal se representa por una especie molecular única que tiene una especificidad de unión y afinidad únicas por un epítopo en particular. Los anticuerpos monoclonales (mAb) de la pre­ sente invención pueden producirse mediante una variedad de técnicas bien conocidas, que incluyen la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica estándar de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495, o la transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para la preparación de hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de los esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. Además, se conocen los componentes de fusión (por ejem­ plo, células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión.

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales de la invención, los esplenocitos y/o células de ganglios linfáticos de ratones inmunizados pueden aislarse y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden cribarse para la producción de anticuerpos específicos de antígenos. Los hibridomas secretores de anticuerpos pueden volver a sembrarse en placas, cribarse de nuevo, y si aún son positivos para la IgG adecuada, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse al menos dos veces mediante dilución limitante. Después, los subclones estables pueden cultivarse in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para la caracterización.

Un anticuerpo de la invención puede prepararse, expresarse, crearse o aislarse por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulinas de interés o un hibridoma preparado a partir de este, (b) anticuerpos aislados a partir de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo de interés, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca recombinante y combinatoria de anticuerpos, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulinas a otras secuencias de ADN.

Los anticuerpos monoclonales adecuados, mostrados en la Tabla 1, se identifican en la presente descripción por medio del prefijo “mAb” junto con un número de 4 dígitos. Por lo tanto, el anticuerpo monoclonal puede ser mAb 0012 o una variante de este. (Tenga en cuenta que el dominio variable del mAb denominado “2F105” es idéntico al del mAb 0012.) El anticuerpo monoclonal puede ser mAb 0023 o una variante de este. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb 0051 o una variante de este. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb 0061 o una variante de este. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb 0062 o una variante de este. El anticuerpo monoclonal puede ser mAb 0082 o una variante de este.

Tabla 1: Ejemplos no limitantes de anticuerpos monoclonales adecuados

El término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno, tal como TLT-1 u otro receptor diana, como se describe en la presente descripción. Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa pueden realizar la función de unión al antígeno de un anticuerpo. Los ejemplos de fragmentos de unión que se abarcan dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab')², un fragmento Fab', un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento ScFv, un fragmento dAb y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Los anticuerpos monocatenarios tales como scFv y anticuerpos de cadena pesada tales como VHH y anticuerpos de camello también pretenden abarcarse dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos pueden obtenerse mediante el uso de técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos pueden cribarse para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Los fragmentos Fab adecuados, mostrados en la Tabla 2, se identifican en la presente descripción por medio del prefijo “Fab” junto con un número de 4 dígitos. Dicho fragmento Fab puede ser Fab 0012 o una variante de este. Dicho fragmento Fab puede ser Fab 0023 o una variante de este. Dicho fragmento Fab puede ser Fab 0051 o una variante de este. Dicho fragmento Fab puede ser 0052 o una variante de este. Dicho fragmento Fab puede ser Fab 0061 o una variante de este. Dicho fragmento Fab puede ser Fab 0062 o una variante de este. Dicho fragmento Fab puede ser Fab 0082 o una variante de este.

Tabla 2: Ejemplos no limitantes de fragmentos Fab adecuados

Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. Se pretende que el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que tanto las regiones marco como las regiones CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones in vitro, introducidas por mutagénesis aleatoria o específica de sitio, o por mutación somática in vivo). Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente descripción, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias c Dr derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

Tal anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Tal anticuerpo monoclonal humano puede producirse mediante un hibridoma que incluye una célula B que se obtiene a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionados en una célula inmortalizada.

Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido de transformación de los linfocitos con el virus Epstein-Barr.

El término "derivados de anticuerpos humanos” se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

El término “anticuerpo humanizado” pretende referirse a anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas. Pueden hacerse modificaciones de las regiones marco adicionales dentro de las secuencias marco humanas.

Los anticuerpos de la invención pueden analizarse para determinar la unión a la proteína diana mediante, por ejemplo, ELISA o transferencia Western estándar. Un ensayo ELISA puede usarse, además, para el cribado de hibridomas que muestran reactividad positiva con la proteína diana. La especificidad de unión de un anticuerpo puede determinarse, además, mediante el monitoreo de la unión del anticuerpo a células que expresan la proteína diana, por ejemplo, mediante citometría de flujo.

La especificidad de un anticuerpo de la invención para la proteína diana puede estudiarse adicionalmente al determinar si el anticuerpo se une o no a otras proteínas. Por ejemplo, cuando se desea producir un anticuerpo que se une específicamente al TLT-1 o a una parte en particular, por ejemplo, un epítopo, del TLT-1, la especificidad del anticuerpo puede evaluarse al determinar si el anticuerpo se une o no, además, a otras moléculas o formas modificadas del TLT-1 que carecen de la parte de interés.

Los “fragmentos” de anticuerpos o polipéptidos de acuerdo con la invención pueden obtenerse mediante truncamien­ to, por ejemplo, mediante la eliminación de uno o más aminoácidos de los extremos N y/o C de un polipéptido. Hasta 10, hasta 20, hasta 30, hasta 40 o más aminoácidos pueden eliminarse del extremo N y/o C de esta manera. Los fragmentos pueden generarse, además, mediante una o más deleciones internas.

Un anticuerpo de la invención puede ser, o puede comprender, un fragmento del anticuerpo anti-TLT-1 o una varian­ te de este. El anticuerpo de la invención puede ser, o puede comprender, una porción de unión al antígeno de este anticuerpo o una variante de este, como se analizó anteriormente. Por ejemplo, el anticuerpo de la invención puede ser un fragmento Fab de este anticuerpo, o una variante de este, o puede ser un anticuerpo monocatenario derivado de este anticuerpo, o una variante de este.

Los anticuerpos, así como también las proteínas de fusión que comprenden un anticuerpo, o fragmento de este, pueden definirse en términos de sus epítopos y/o parátopos. El término “epítopo” incluye cualquier determinante proteico que puede unirse específicamente a una inmunoglobulina (o receptor de células T). Los determinantes epitópicos generalmente consisten en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como ami­ noácidos o cadenas laterales de azúcar y generalmente tienen características estructurales tridimensionales especí­ ficas, así como también características de carga específicas. Un epítopo que tiene actividad antigénica es una por­ ción de un polipéptido al cual un anticuerpo se une con especificidad inmunológica, como se determina mediante cualquier método bien conocido en la técnica, por ejemplo, por inmunoensayos. Los epítopos antigénicos no necesi­ tan ser necesariamente inmunogénicos.

“Epítopo”, en términos de la presente invención, se refiere al área o región en un antígeno (Ag), que es un receptor en una plaqueta activada, a la que la porción del anticuerpo (Ac) de la proteína de fusión puede unirse específica­ mente, es decir, el área o región que está en contacto físico con el Ac. Un epítopo de un antígeno puede compren­ der residuos de aminoácidos en el Ag que se involucran directamente en la unión al Ac (componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácidos, que no se involucran directamente en la unión, tales como los residuos de aminoácidos del Ag bloqueados eficazmente por el Ac (en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro de la “superficie excluida al solvente” y/o la "huella" del Ac). El término epítopo en la presente descripción incluye ambos tipos de sitios de unión en cualquier región particular de un receptor tal como TLT-1 que se une espe­ cíficamente a un anticuerpo anti-TLT-1, u otro agente específico del TLT-1 de acuerdo con la invención, a menos que se indique de cualquier otra manera (por ejemplo, en algunos contextos, la invención se refiere a anticuerpos que se unen directamente a residuos de aminoácidos particulares). Los receptores tales como TLT-1 puede com­ prender un número de epítopos diferentes, que pueden incluir, sin limitación, (1) determinantes antigénicos peptídicos lineales, (2) determinantes antigénicos conformacionales que consisten en uno o más aminoácidos no contiguos ubicados cerca uno del otro en la conformación del receptor madura; y (3) determinantes antigénicos postraduccionales que consisten, en su totalidad o en parte, en estructuras moleculares unidas covalentemente al TLT-1, tal co­ mo los grupos de carbohidratos.

El epítopo para un par anticuerpo (Ac)/antígeno (Ag) dado puede definirse y caracterizarse a niveles diferentes de detalle mediante el uso de una variedad de métodos experimentales y computacionales de mapeo de epítopos. Los métodos experimentales incluyen mutagénesis, cristalografía de rayos X, espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR), espectrometría de masa de intercambio hidrógeno-deuterio (HX-MS) y diversos métodos de unión por competencia. Como cada método depende de un principio único, la descripción de un epítopo se relaciona ínti­ mamente con el método mediante el cual se ha determinado. Por lo tanto, el epítopo para un par Ac/Ag dado se de­ finirá de manera diferente en dependencia del método de mapeo de epítopos empleado.

A su nivel más detallado, el epítopo para la interacción entre el Ag y el Ac puede definirse mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos presentes en la interacción Ag-Ac, así como también la información acerca de sus contribuciones relativas a las termodinámicas de unión. A un nivel menos detallado, el epítopo puede caracterizarse mediante las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos entre el Ag y el Ac. A un nivel aún menos detallado, el epítopo puede caracterizarse mediante los residuos de aminoácidos que comprende según se define por un criterio específico, por ejemplo, la distancia entre átomos en el Ac y el Ag. A un nivel aún me­ nos detallado, el epítopo puede caracterizarse a través de la función, por ejemplo, mediante la unión por competen­ cia con otros Ac. Además, el epítopo puede definirse más genéricamente como que comprende residuos de aminoá­ cidos cuya sustitución por otro aminoácido alterará las características de la interacción entre el Ac y el Ag.

En el contexto de una estructura cristalina derivada por rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ac, por ejemplo, un fragmento Fab, y su Ag, el término epítopo en la presente descripción, a menos que se especifique de cualquier otra manera o se contradiga por el contexto, se define específicamente, como residuos del receptor de plaquetas caracterizado por tener un átomo pesado (es decir, un átomo que no es hidrógeno) dentro de una distancia de 4 A a partir de un átomo pesado en el Ac.

A partir del hecho de que las descripciones y definiciones de epítopos, en dependencia del método de mapeo de epítopos usado, se obtienen a niveles diferentes de detalle, se deduce que la comparación de epítopos para Ac dife­ rentes en el mismo Ag puede conducirse de manera similar en niveles diferentes de detalle.

Se dice que los epítopos descritos al nivel de aminoácido, por ejemplo, determinados a partir de una estructura por rayos X, son idénticos si contienen el mismo conjunto de residuos de aminoácidos. Se dice que los epítopos se sola­ pan si los epítopos comparten al menos un aminoácido. Se dice que los epítopos están separados (son únicos) si los epítopos no comparten ningún residuo de aminoácido.

Se dice que los epítopos caracterizados por unión de competencia se solapan si la unión de los Ac correspondientes es mutuamente excluyente, es decir, si la unión de un Ac excluye la unión simultánea del otro Ac. Se dice que los epítopos son separados (únicos) si el Ag puede acomodar la unión de ambos Ac correspondientes simultáneamente. Por lo tanto, las proteínas de fusión de la invención pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb 0012. Las proteínas de fusión pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb 0023. Las proteínas de fusión pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb 0051. Las proteínas de fusión pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb 0061. Las proteínas de fusión pueden ser capaces de unirse al mismo epítopo que el mAb 0062.

El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de la SEQ ID NO: 4.

El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, L63, G64, G65, G66, L67, L68, G89, A90, R91, G92, P93, Q94, I95 y L96 de la SEQ ID NO: 5.

El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en L36, P37, E38, G39, C40, Q41, P42, L43, V44, S45, S46, A47, V73, T74, L75, Q76, E77, E78, D79, A80, G81, E82, Y83, G84, C85, M86, R91, G92, P93, Q94, I95, L96, H97, R98, V99, S110 y L111 de la SEQ ID NO: 5.

El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en V17, Q18, C19, H20, Y21, R22, L23, Q24, D25, V26, K27, A28, R91, G92, P93, Q94, I95, L96, H97, R98, V99, S100 y L101 de la SEQ ID NO: 5.

El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en E5, T6, H7, K8, I9, G10, S11, L12, A13, E14, N15, A16, F17, S18, D19, P20 y A21 de la SEQ ID NO: 7.

El epítopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de la SEQ ID NO: 7.

La definición del término “parátopo” deriva de la definición anterior de “epítopo” al invertir la perspectiva. Por lo tanto, el término “parátopo” se refiere al área o región en el Ac al que se une específicamente un Ag, es decir, a la que ha­ ce contacto físico con el Ag.

El parátopo puede comprender uno o más residuos seleccionados del grupo que consiste en H50, N52, Y56, H58, Y73, F79, S115, T116, V118 e Y120 de la cadena ligera (L) del anti-TLT-1 (SEQ ID NO: 40), y los residuos V20, F45, R49, Y50, W51, E68, T75, N77, S116, G117, V118 y T120 de la cadena pesada (H) del anti-TLT-1 (SEQ ID NO: 39) En el contexto de una estructura cristalina derivada por rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ac, por ejemplo, un fragmento Fab, y su antígeno, el término parátopo en la presente descripción, a menos que se especifique de cualquier otra manera o se contradiga por el contexto, se define específicamente, como los residuos del Ag caracterizados por tener un átomo pesado (es decir, un átomo que no es hidrógeno) dentro de una distancia de 4 A a partir de un átomo pesado en el receptor de plaquetas.

El epítopo y el parátopo para un par anticuerpo (Ac)/antígeno (Ag) dado pueden identificarse mediante métodos de rutina. Por ejemplo, la ubicación general de un epítopo puede determinarse mediante la evaluación de la capacidad de un anticuerpo para unirse a fragmentos o variantes diferentes del TLT-1. Los aminoácidos específicos dentro del TLT-1 que hacen contacto con un anticuerpo (epítopo) y los aminoácidos específicos en un anticuerpo que hacen contacto con el TLT-1 (parátopo) también pueden determinarse mediante el uso de métodos de rutina, tales como los descritos en los ejemplos. Por ejemplo, el anticuerpo y la molécula diana pueden combinarse y el complejo Ac/Ag puede cristalizarse. La estructura cristalina del complejo puede determinarse y usarse para identificar sitios específi­ cos de interacción entre el anticuerpo y su diana.

Las proteínas de fusión que comprenden un ligando que es un anticuerpo o fragmento de este también pueden defi­ nirse en términos de sus regiones determinantes de la complementariedad (CDR). El término “región determinante de la complementariedad” o “región hipervariable”, cuando se usa en la presente descripción, se refiere a los resi­ duos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. Las regiones determinantes de la complementariedad o “CDR” se componen generalmente de residuos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89­ 97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; (Kabat y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. De­ partment of Health and Human Services, NIH Publicación Núm. 91-3242) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96­ 101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987;196:901-917). Típicamente, la numeración de residuos de aminoácidos en esta región se realiza mediante el método descrito en Kabat y otros, supra. Las frases tales como “posición Kabat”, “residuo de Kabat”, y “de acuerdo con Kabat” en la presente descrip­ ción se refieren a este sistema de numeración para dominios variables de cadena pesada o dominios variables de cadena ligera. Mediante el uso del sistema de numeración de Kabat, la secuencia de aminoácidos lineal real de un péptido puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento de, o inserción en, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir inserciones de aminoácidos (residuo 52a, 52b y 52c de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de CDR H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b, y 82c, etcétera de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" nume­ rada según Kabat.

Los términos “región marco” o residuos “FR” se refieren a los residuos de aminoácidos VH o VL que no están dentro de las CDR, como se define en la presente descripción.

En una modalidad, la cadena pesada comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (DYFMY) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno de estos ami­ noácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (YISNGGDSSSYPDTVKG) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (NKNWDDYYDMDY) de la SEQ ID NO: 41, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

En otra modalidad, la cadena ligera comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 60 (kssqsllnsrtrknyla) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 76 a 82 (wastres) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 115 a 122 (kqsynllt) de la SEQ ID NO: 42, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

En otra modalidad, la cadena pesada comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (dysmh) de la SEQ ID NO: 43, en donde uno de estos aminoá­ cidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (vistyygdvrynqkfkg) de la SEQ ID NO: 43, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 129 (apmittgawfay) de la SEQ ID NO: 43, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

En otra modalidad, la cadena ligera comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (kasqsvsndva) de la SEQ ID NO: 44, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (yassryt) de la SEQ ID NO: 44, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (qqdysspyt) de la SEQ ID NO: 44, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

En otra modalidad, la cadena pesada comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (shwie) de la SEQ ID NO: 49, en donde uno de estos aminoá­ cidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (eilpgsgntnynekfkg) de la SEQ ID NO: 49, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 130 (gyyglnydwyfdv) de la SEQ ID NO: 49, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

En otra modalidad, la cadena ligera comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 54 (rasqdisnyln) de la SEQ ID NO: 46, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 70 a 76 (ytsrlhs) de la SEQ ID NO: 46, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 109 a 117 (qqdtklpyt) de la SEQ ID NO: 46, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

En otra modalidad, la cadena pesada comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (rywmt) de la SEQ ID NO: 47, en donde uno de estos aminoá­ cidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (einpdsstinyNpslkd) de la SEQ ID NO: 47, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (gvfts) de la SEQ ID NO: 47, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

En otra modalidad, la cadena ligera comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (rssqslvhrngntyfh) de la SEQ ID NO: 48, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (kvsnrfs) de la SEQ ID NO: 48, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (sqsthvpyt) de la SEQ ID NO: 48, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

En otra modalidad, la cadena pesada comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (rywmt) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno de estos aminoá­ cidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (einpdsstinyTpslkd) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (Gvfts) de la SEQ ID NO: 39, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

En otra modalidad, la cadena ligera comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (rssqslvhrngntyfh) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (kvsnrfs) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (sqsthvpyt) de la SEQ ID NO: 40, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

Aun en otra modalidad, la cadena pesada de (ii) comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 50 a 54 (NYWLG) de la SEQ ID NO: 56 , en donde uno de estos ami­ noácidos puede sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 69 a 85 (DIYPGGGYNKYNENFKG) de la SEQ ID NO: 56, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 118 a 128 (EYGNYDYAMDS) de la SEQ ID NO: 56, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos pueden sustituirse por un aminoácido diferente.

En una modalidad adicional, la cadena ligera de (ii) comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 44 a 59 (RSSRSLLHSNGNTYLC) de la SEQ ID NO: 57, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 75 a 81 (RMSNLAS) de la SEQ ID NO: 57, en donde uno o dos de es­ tos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente; y/o

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 114 a 122 (MQHLEYPFT) de la SEQ ID NO: 57, en donde uno o dos de estos aminoácidos pueden sustituirse con un aminoácido diferente.

Por lo tanto, la construcción de la presente invención es cualquier proteína de fusión o quimera que comprende (i) al menos un TF, o variante(s) biológicamente funcional(es) o fragmento(s) de este, y (ii) un ligando que puede unirse (iii) a un receptor, y/o un fragmento de este, en donde el receptor está presente solamente (en el sentido de no ubicuo) en la superficie de las plaquetas activadas. En una modalidad preferida, (iii) es TLT-1. La proteína de fusión (construcción) de la presente invención se diseña preferentemente de manera que sus partes constituyentes pueden funcionar independientemente entre sí. Por ejemplo, dicho componente del "factor tisular...” de la presente invención puede unirse al FVII y FVIIa, en lugar de verse obstaculizado estéricamente de hacerlo debido a la presencia de dicho componente de "ligando” de la invención. Igualmente, dicho componente de "ligando”, preferentemente, puede unirse a un receptor tal como TLT-1, sin impedimento por la presencia de dicho componente del "factor tisular...”. El extremo carboxi del componente del "polipéptido TF” puede unirse covalentemente al extremo amino del componente de ligando de la construcción, o viceversa. Dicho componente de ligando de la construcción, preferentemente, no se unirá a ningún otro TREM. La construcción de la presente invención puede comprender o no un enlazador entre dichos constituyentes de TF y de ligando. Dicho enlazador opcional puede ser uno cualquiera de los enlazadores descritos en la Tabla 3, o puede ser cualquier otro enlazador que se une tanto a las partes constituyentes de TF como del ligando de la construcción, de manera que ambos sean funcionales.

La proteína de fusión/construcción de la presente invención puede comprender (i) factor tisular y (ii) un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno de este que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha proteína de fusión/construcción puede comprender además un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores L1-L10 proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) factor tisular y (ii) un fragmento Fab que puede unir­ se a (iii) TLT-1. La construcción puede comprender además un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlaza­ dores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) factor tisular y (ii) un fragmento F(ab^')2 que puede unirse a (iii) TLT-1. La construcción puede comprender además un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) factor tisular y (ii) un fragmento Fab' que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) factor tisular y (ii) un fragmento Fd que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) factor tisular y (ii) un fragmento Fv que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) factor tisular y (ii) un fragmento dAc que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) factor tisular y (ii) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) cualquier variante o fragmento biológicamente funcional del factor tisular y (ii) un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno de este que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) cualquier variante o fragmento biológicamente funcional del factor tisular y (ii) un fragmento Fab que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) cualquier variante o fragmento biológicamente funcional del factor tisular y (ii) un fragmento F(ab^')2 que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) cualquier variante o fragmento biológicamente funcional del factor tisular y (ii) un fragmento Fab' que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) cualquier variante o fragmento biológicamente funcional del factor tisular y (ii) un fragmento Fd que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) cualquier variante o fragmento biológicamente funcional del factor tisular y (ii) un fragmento Fv que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) cualquier variante o fragmento biológicamente funcional del factor tisular y (ii) un fragmento dAc que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) cualquier variante o fragmento biológicamente funcional del factor tisular y (ii) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador, que puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) el dominio extracelular del factor tisular y (ii) un anticuerpo monoclonal, o un fragmento de unión al antígeno de este que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador. Dicho enlazador puede ser cualquiera de los enlazadores L1-L10 proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) el dominio extracelular del factor tisular y (ii) un fragmento Fab que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador. Dicho enlazador puede ser cualquiera de los enlazadores L1-L10 proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) el dominio extracelular del factor tisular y (ii) un fragmento F(ab^')2 que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador. Dicho enlazador puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) el dominio extracelular del factor tisular y (ii) un fragmento Fab' que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador. Dicho enlazador puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) el dominio extracelular del factor tisular y (ii) un fragmento Fd que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador. Dicho enlazador puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) el dominio extracelular del factor tisular y (ii) un fragmento Fv que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador. Dicho enlazador puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) el dominio extracelular del factor tisular y (ii) un fragmento dAc que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador. Dicho enlazador puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede comprender (i) el dominio extracelular del factor tisular y (ii) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada que puede unirse a (iii) TLT-1. Dicha construcción puede comprender, además, un enlazador. Dicho enlazador puede ser cualquiera de los enlazadores (L1-L10) proporcionados en la Tabla 3.

La construcción de la presente invención puede ser una proteína de fusión que comprende el dominio variable del mAb 0012 (2F105) HC, la región constante CH1 de IgG4 humana, el enlazador de glicina-serina y el dominio extracelular del factor tisular humano (2F105HC-V-CH1-enlazador-hTF ECD).

La construcción de la presente invención puede ser una proteína de fusión que consiste en el dominio variable del mAb 0012 (2F105) HC, la región constante CH1 de IgG4 humana, el enlazador de glicina-serina y el dominio extracelular del factor tisular humano (2F105HC-V-CH1-enlazador-hTF ECD).

Como se mencionó anteriormente, la proteína de fusión de la presente invención puede comprender un enlazador. Los ejemplos no limitantes de secuencias de aminoácidos de enlazadores se muestran en la Tabla 3. Por lo tanto, dicho enlazador puede ser L1. El enlazador puede ser L2. El enlazador puede ser L3. El enlazador puede ser L4. El enlazador puede ser L5. El enlazador puede ser L6. El enlazador puede ser L7. El enlazador puede ser L8. El enlazador puede ser L9. El enlazador puede ser L10.

Tabla 3: Ejemplos no limitantes de enlazadores opcionales

Como se mencionó anteriormente, la parte extracelular del TLT-1 consiste en un dominio similar a inmunoglobulina y un tallo. Las proteínas de fusión de la invención pueden unirse a cualquiera de estos. Cuando la parte (ii) de la proteína de fusión puede unirse al dominio similar a inmunoglobulina, un enlazador más largo puede permitir a la parte (i) de dicha proteína de fusión adoptar una posición y orientación relevante funcionalmente en la superficie de la plaqueta activada, de esta manera se facilita su función. Esto es porque la parte (i), es decir, el polipéptido TF, debe estar en la cercanía especial de y correctamente orientada con relación a FVII/FVIIa: El TF actúa como cofactor para FVII/FVIIa, que se une a Ca2+ y fosfolípido en la superficie de las plaquetas activadas.

Una proteína de fusión que puede unirse al tallo del TLT-1 está adyacente a la membrana de las plaquetas. Una proteína de fusión que puede unirse al tallo puede comprender un enlazador, sin embargo, la inclusión de un enlazador no afecta necesariamente la función de la parte del TF de la proteína de fusión.

Los ejemplos de proteínas de fusión adecuadas, en donde (ii) es un anticuerpo monoclonal, se proporcionan en la tabla 4. Como cada mAb tiene dos cadenas pesadas (HC) idénticas y dos cadenas ligeras (LC) idénticas, las proteínas de fusión en donde la parte (ii) es un mAb pueden comprender dos polipéptidos de TF (parte (i)). El TF puede fusionarse a una HC del mAb; el TF puede fusionarse a una LC del mAb. El TF puede fusionarse a un ligando que, a su vez, se fusiona a una HC del mAb o una LC del mAb. Lo siguiente son ejemplos de cómo interpretar los nombres de las proteínas de fusión proporcionadas en la tabla 4:

En la proteína de fusión "mAb 0012-(HC-L0-hTF.1-219)2;LC2”:

• "mAb 0012”: anticuerpo monoclonal 0012.

• “(HC-L0-hTF.1-219)2”: un hTF.1-219 se fusiona a cada HC; el extremo N de hTF.1-219 se fusiona al extremo C de la cadena pesada.

• “L0”: no hay ningún enlazador presente.

• LC²: hay dos cadenas ligeras, a las que no se fusiona nada.

En la proteína de fusión “mAb 0023-(HC-L4a-hTF.1-219)2;(LC-HPC4)2”:

• “mAb 0023” es el anticuerpo monoclonal 0023.

• “(HC-L4a-hTF.1-219)2” indica que un hTF.1-219 se fusiona a cada HC a través de un enlazador; el extremo N de hTF.1-219 se fusiona al extremo C del enlazador L4a, cuyo extremo N se fusiona al extremo C de la cadena pesada del mAb.

• “(LC-HPC4)2” indica que una etiqueta HPC4 se fusiona con el terminal C de cada LC.

En la proteína de fusión “mAb 0012-(LC-L5-hTF.1-219)2;HC2”:

• (LC-L5-hTF.1-219)2 indica que el extremo N de hTF.1-219 se fusiona al extremo C del enlazador L5 cuyo extremo N se fusiona al extremo C de la cadena ligera.

• HC² indica que hay dos cadenas pesadas, a las que no se fusiona nada.

En la proteína de fusión “mAb 0012-(hTF.1-219-L4b-LC)2;HC2”:

• (hTF.1-219-L4b-LC)2 indica que el extremo C de hTF.1-219 se fusiona con el conector L4b que se fusiona con el extremo N de la cadena ligera.

Tabla 4: Ejemplos no limitantes de proteínas de fusión mAb-TF

Los ejemplos de proteínas de fusión adecuadas en donde (ii) es un fragmento Fab se proporcionan en la tabla 5. El TF puede fusionarse a una HC del mAb; el TF puede fusionarse a una LC del mAb. El TF puede fusionarse a un ligando que, a su vez, se fusiona a una HC del mAb o una LC del mAb. Lo siguiente son ejemplos de cómo interpretar los nombres de las proteínas de fusión proporcionadas en la tabla 5:

En la proteína de fusión "Fab 0012-VH-CH1-L0-hTF.1-219;LC-HPC4”:

• "Fab 0012”: Fragmento Fab del mAb 0012.

• “VH-CH1-L0-hTF.1-219”: el extremo N de hTF.1-219 se fusiona directamente al extremo C del dominio V^h-CH1 del fragmento Fab.

• “HPC4”: una etiqueta de purificación se encuentra en el extremo N de la cadena ligera.

En la proteína de fusión “Fab 0012-hTF.1-219-L4b-VH-CH1;LC-HPC4”:

• “hTF.1-219-L4b- Vh-CH1”: indica que el extremo C del factor tisular se fusiona con el extremo N del enlazador 4b que se fusiona con el dominio V^h-CH1 del fragmento Fab.

Tabla 5: Ejemplos no limitantes de proteínas de fusión Fab-TF

Como se describió anteriormente, las proteínas de fusión de la invención pueden unirse a un receptor que está presente en las plaquetas que experimentan activación, tal como TLT-1. El término "afinidad de unión" pretende referirse a la propiedad de las proteínas de fusión, o el componente de anticuerpo de las proteínas de fusión, de unirse o no a sus dianas. La afinidad de unión puede cuantificarse mediante la determinación de la constante de unión (KD) para un componente de anticuerpo y su diana. De manera similar, la especificidad de unión de un componente de anticuerpo a su diana puede definirse en términos de las constantes de unión comparativas (KD) del anticuerpo con su diana en comparación con la constante de unión con respecto al anticuerpo y otra molécula no diana.

Típicamente, la K^d para el anticuerpo con respecto a la diana será de 2 veces, preferentemente, 5 veces, con mayor preferencia, 10 veces menor que la KD con respecto a la otra molécula no diana, tal como un material no relacionado o material acompañante en el ambiente. Con mayor preferencia, la Kd será 50 veces menor, aún con mayor preferencia, 100 veces menor, y aún con mayor preferencia, 200 veces menor.

El valor de esta constante de unión puede determinarse directamente mediante métodos bien conocidos, y puede calcularse incluso para mezclas complejas mediante métodos tales como aquellos, por ejemplo, expuestos en Caceci y otros, (Byte 9:340-362, 1984). Por ejemplo, la K^d puede establecerse mediante el uso de un ensayo de unión a filtro de nitrocelulosa de doble filtro tal como el descrito por Wong y Lohman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5428-5432, 1993). Otros ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de ligandos tal como anticuerpos con las dianas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, RIA y análisis de citometría de flujo. La cinética de unión (por ejemplo, la afinidad de unión) del anticuerpo puede evaluarse, además, mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR).

Puede realizarse un ensayo de unión competitiva en el que la unión del anticuerpo a la diana se compara con la unión de la diana por otro ligando conocido de esa diana, tal como otro anticuerpo.

Los valores de KD para el ligando, tal como un anticuerpo o fragmento de este, de la invención pueden ser al menos 1 x 10^-15 M, tal como al menos 1 x 10^-14 M, tal como al menos 1 x 10^-13 M, tal como al menos 1 x 10^-12 M, tal como al menos 1 x 10^-11 M, tal como al menos 1 x 10^-10 M, tal como aproximadamente 3 x 10^-9 M, tal como al menos 1 x 10^-9 M, o al menos 1 x 10^-8 M. Un anticuerpo de la invención puede tener una Kd (o Ki) por su diana de 1 x 10^-7 M o menos, 1 x 10^-8 M o menos o 1 x 10^-9 M o menos.

Los valores de Kd preferidos para el ligando de la invención, tal como un anticuerpo o fragmento de este, pueden ser 1 x 10^-15 M a 1 x 10^-14 M, tal como 1 x 10^-14 M a 1 x 10^-13 M 1 x 10^-13 M a 1 x 10^-12 M, tal como 1 x 10^-12 M a 1 x 10^-11 M, tal como 1 x 10^-11 M a 1 x 10^-10 M, tal como 1 x 10^-10 M a 1 x 10^-9 M tal como aproximadamente 3 x 10^-9 M, tal como 1 x 10^-9 M a 2 x 10^-8 M.

Un anticuerpo que se une específicamente a su diana puede unirse a su diana con una alta afinidad, tal como una Kd como se analizó anteriormente, y puede unirse a otras moléculas no diana con una menor afinidad. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a moléculas no diana con una Kd de 1 x 10^-6M o más, con mayor preferencia 1 x 10^-5 M o más, con mayor preferencia 1 x 10^-4 M o más, con mayor preferencia 1 x 10^-3 M o más, aún con mayor preferencia 1 x 10^-2 M o más. Un anticuerpo de la invención, preferentemente, puede unirse a su diana con una afinidad que es al menos dos veces, 10 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces, 1000 veces o 10000 veces o mayor que su afinidad para unirse a otra molécula no diana, tal como otros TREM diferentes de TLT-1.

Como se mencionó anteriormente, las proteínas de fusión pueden comprender un componente similar al factor tisular que es al menos 90 % idéntico al dominio extracelular del factor tisular o una variante de este. El término "identidad” como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos, según se determina mediante la comparación de las secuencias. En la técnica, "identidad" significa, además, el grado de relación de las secuencias entre los polipéptidos, según se determina por la cantidad de coincidencias entre las cadenas de dos o más residuos de aminoácidos. La "identidad” mide el por ciento de coincidencias idénticas entre la/s más pequeña/s de dos o más secuencias con alineaciones de espacios (si corresponde) al que se llega mediante un modelo matemático o programa de computadora en particular (es decir, "algoritmos”). La identidad de polipéptidos relacionados puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo y otros, SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para obtener la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas de computadora disponibles públicamente. Los métodos de programas de computadora preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programas GCG, que incluye GAP (Devereux y otros, Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul y otros, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul y otros, NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul y otros, más arriba). También puede usarse el bien conocido algoritmo de Smith Waterman para determinar la identidad.

Por ejemplo, mediante el uso del algoritmo informático GAP (Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), dos polipéptidos, para los cuales se va a determinar el por ciento de identidad de secuencia, se alinean para una coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (el "rango coincidente", según se determina por el algoritmo). Una penalización por abertura de hueco (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada coincidencia perfecta de aminoácidos por la matriz de comparación en particular) y una penalización por extensión del hueco (que es usualmente {la fracción (¹ /^{1 0} )} veces la penalización por abertura de hueco), así como también se usa una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 junto con el algoritmo. El algoritmo también usa una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff y otros, Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62).

Los parámetros preferidos para una comparación de secuencias de péptidos incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y otros, J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); Comparison matrix: BLOSUM ^{6 2} de Henikoff y otros, PNAS USA 89, 10915-10919 (1992); Penalización por hueco: 12, Penalización por longitud del hueco: 4, Umbral de similitud: 0.

El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros mencionados anteriormente son los parámetros predeterminados para las comparaciones de los péptidos (junto con la ausencia de penalización por huecos en los extremos) mediante el uso del algoritmo GAP.

Los efectos funcionales de las proteínas de fusión de la invención pueden evaluarse por medio de diversos experi­ mentos in vitro e in vivo. Los experimentos in vitro pueden diseñarse para evaluar la función de las proteínas de fu­ sión como un todo, así como también sus partes componentes (i) TF y (ii) ligando. Tales experimentos se describen en detalle en los ejemplos. Estos incluyen métodos para evaluar la capacidad de:

• las proteínas de fusión para unirse a FVII/FVIIa;

• el componente TF de las proteínas de fusión para mejorar selectivamente la activación de FX mediada por FVIIa en las plaquetas activadas;

• el componente TF de las proteínas de fusión para mejorar la activación de FX mediada por FVIIa en vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1;

• las proteínas de fusión para promover la formación de coágulos de fibrina en plasma rico en plaquetas similar a la hemofilia

• las proteínas de fusión para promover la formación de coágulos de fibrina en sangre completa similar a la hemofílica;

In vivo, las proteínas de fusión pueden analizarse en un modelo de sangrado de la cola en ratones hemofílicos que se transfunden con plaquetas humanas. Además, in vivo, las proteínas de fusión pueden evaluarse en un modelo de sangrado de la cola en ratones hemofílicos con el gen TLT-1 humano insertado ("humanizado” con respecto al TLT-1).

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones y formulaciones que comprenden moléculas de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas de fusión de la invención, formuladas junto con un portador aceptable farmacéuticamente.

En consecuencia, un objeto de la invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende tal anticuerpo que está presente en una concentración de 0,25 mg/ml a 250 mg/ml, y en donde dicha formulación tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulación puede comprender, además, un sistema tampón, conservante(s), agente(s) de tonicidad, agente(s) quelante(s), estabilizantes y surfactantes. El uso de conservantes, agentes isotónicos, agentes quelantes, estabilizantes y surfactantes en las composiciones farmacéuticas se conoce bien por el experto. Puede hacerse referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.

En una modalidad, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa. Tal formulación es, típicamente, una solución o una suspensión. El término "formulación acuosa” se define como una formulación que comprende al menos 50 % p/p de agua. Igualmente, el término "solución acuosa” se define como una solución que comprende al menos 50 % p/p de agua y el término "suspensión acuosa” se define como una suspensión que comprende al menos 50 % p/p de agua.

En otra modalidad, la composición farmacéutica es una formulación liofilizada, a la que el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes de usar.

En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de tal anticuerpo y un tampón, en donde el anticuerpo se presenta en una concentración de 1 mg/ml o más, y en donde dicha formulación tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.

El término "tratamiento”, como se usa en la presente descripción, se refiere a la terapia médica de cualquier sujeto humano u otro animal que necesita de esto. Se espera que dicho sujeto se haya sometido a un examen físico por parte de un médico [o veterinario], quien ha dado un diagnóstico presuntivo o definitivo que indicaría que el uso de dicho tratamiento específico es beneficioso para la salud de dicho sujeto humano u otro animal. El momento y el propósito de dicho tratamiento pueden variar de una persona a otra, de acuerdo con el statu quo de la salud del sujeto. Por lo tanto, dicho tratamiento puede ser profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo.

En términos de la presente invención, los tratamientos profilácticos, paliativos, sintomáticos y/o curativos pueden representar aspectos separados de la invención.

Una coagulopatía que da como resultado una tendencia hemorrágica aumentada puede tener como causa cualquier deficiencia cualitativa o cuantitativa de cualquier componente procoagulativo de la cascada de coagulación normal, o por cualquier regulación positiva de la fibrinólisis. Tales coagulopatías pueden ser congénitas y/o adquiridas y/o iatrogénicas y se identifican por un experto en la técnica.

Los ejemplos no limitantes de hipocoagulopatías congénitas son la hemofilia A, la hemofilia B, la deficiencia del Factor VII, la deficiencia del Factor X, la deficiencia del Factor XI, la enfermedad de von Willebrand y las trombocitopenias tales como la trombobastenia de Glanzmann y el síndrome de Bernard-Soulier.

Un ejemplo no limitante de una coagulopatía adquirida es la deficiencia de serina proteasa causada por la deficiencia de la vitamina K; tal deficiencia de la vitamina K puede provocarse por la administración de un antagonista de vitamina K, tal como la warfarina. La coagulopatía adquirida puede producirse, además, después de un trauma extenso. En este caso, conocido de cualquier otra manera como el "ciclo vicioso de sangramiento”, se caracteriza por hemodilución (trombocitopenia por dilución y dilución de factores de coagulación), hipotermia, consumo de factores de coagulación y trastornos metabólicos (acidosis). La terapia con líquidos y el aumento de la fibrinólisis pueden exacerbar esta situación. Dicha hemorragia puede ser de cualquier parte del cuerpo.

La hemofilia A con "inhibidores" (es decir, los aloanticuerpos contra el factor VIII) y la hemofilia B con "inhibidores" (es decir, los aloanticuerpos contra el factor IX) son ejemplos no limitantes de coagulopatías que son parcialmente congénitas y parcialmente adquiridas.

Un ejemplo no limitante de una coagulopatía iatrogénica es una sobredosificación de medicamentos anticoagulantes, tales como heparina, aspirina, warfarina y otros inhibidores de la agregación plaquetaria, que pueden prescribirse para tratar una enfermedad tromboembólica. Un segundo ejemplo no limitante de coagulopatía iatrogénica es la que se induce por una terapia de líquidos excesiva y/o inapropiada, tal como la que puede inducirse mediante una transfusión de sangre.

En una modalidad de la presente invención, la hemorragia se asocia con la hemofilia A o B. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con la hemofilia A o B con inhibidores adquiridos. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con la enfermedad de von Willebrand. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con graves daños tisulares. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con trauma grave. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con cirugía. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con gastritis y/o enteritis hemorrágica. En otra modalidad, la hemorragia es un sangrado uterino profuso, tal como en el desprendimiento de la placenta. En otra modalidad, la hemorragia se produce en órganos con una posibilidad limitada de hemostasia mecánica, tal como intracraneal, intraauricular o intraocular. En otra modalidad, la hemorragia se asocia con terapia anticoagulante.

En una modalidad adicional, la hemorragia puede asociarse con trombocitopenia. En individuos con trombocitopenia, las construcciones descritas en la presente descripción pueden administrarse conjuntamente con plaquetas.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes adicionales.

Ejemplos

Ejemplo 1

Clonación y expresión del antígeno hTLT-1 ECD-His. Las secuencias de nucleótidos que codifican el dominio extra­ celular del TLT-1 humano (hTLT-1) (figura 1) junto con una etiqueta His-6 en el extremo C se amplificaron por PCR con un cebador directo que contiene un sitio de reconocimiento de HindIII junto con una secuencia kozak, y un ce­ bador inverso que contiene un codón de parada y un sitio de reconocimiento EcoRI (figura 2). El fragmento de PCR digerido con HindIII y EcoRI se insertó en los sitios de HindIII y EcoRI de un vector de expresión basado en pTT. El vector pTT se describe esencialmente en Durocher, Y. y otros, (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9. El plásmido de ex­ presión resultante se designó pTT-hTLT-1 ECD-His. pTT-hTLT-1 ECD-His se transfectó en células en suspensión HEK293-6E para expresar transitoriamente hTLT-1 ECD-His. Las células HEK293-6E se cultivaron en medio Freestyle para HEK293 (GIBCO, núm. de cat. 12338-018) suplementado con P/S al 1 % (GIBCO, núm. de cat.

15140-122), plurónico al 0,1 % (GIBCO, núm. de cat. 24040-032) y geneticina 25 ug/ml (GIBCO, núm. de cat. 10131­ 019) y las células se transfectaron a una densidad celular de 1 mill/ml mediante el uso de 293fectin (Invitrogen, núm. de cat. 12347-019). Para cada litro de células HEK293-6E, la transfección se realizó mediante la dilución de 1 mg de ADN de pTT-hTLT-1 ECD-His en 30 ml de Optimen (dilución A) y mediante la dilución de 1 ml de 293fectin en 30 ml de Optimem (GIBCO, núm. de cat. 51985-026, dilución B). Las diluciones A y B se mezclaron y se incubaron a tem­ peratura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de transfección se añadió posteriormente a las células HEK293-6E y las células se incubaron a 370C en una incubadora humidificada con rotación orbital (125 rpm). Siete días des­ pués de la transfección, las células se eliminaron mediante centrifugación y los sobrenadantes resultantes que con­ tenían hTLT-1 ECD-His se esterilizaron por filtración antes de la purificación.

Ejemplo 2

Purificación y caracterización de la proteína hTLT1 ECD-His. La purificación de la proteína hTLT1 ECD-His se realizó como un proceso en 2 etapas compuesto de 1) cromatografía de afinidad a His mediante el uso de la resina cargada con cobalto TALON (Clontech, núm. de cat. 635506) y 2) cromatografía de intercambio aniónico mediante el uso de la resina de partículas finas Source 15Q (GE Healthcare, núm. de cat. 17-0947). Las purificaciones se realizaron mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los siste­ mas tampón usados para la primera etapa de purificación fueron un tampón de equilibrado compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM, un tampón de lavado compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,0, NaCl 0,5 M y un tampón de elución compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,0, imidazol 150 mM. El sobrenadante celular se aplicó directamente sin ningún ajuste en una columna TALON equilibrada previamente. La columna se lavó con 20 volúmenes de columna de tampón de equilibrio, 20 volúmenes de columna de tampón de lavado y por último con 20 volúmenes de columna de tampón de equilibrio. La proteína se eluyó de manera isocrática en aproximadamente 5 volúmenes de columna de tampón de elución. La masa molecular de la proteína eluida se analizó mediante el uso de geles Bis-Tris SDS-PAGE/Coomassie NuPage 4-12 % (Invitrogen, núm. de cat. NP0321BOX) y la configuración de espectrometría de masas por desorción ionización láser asistida por matriz con tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS) en un sistema Microflex (Bruker Daltonics). Aquí, se observaron dos masas de proteínas distintas de aproximadamente 16,7 y 33,4 kDa de cantidades casi iguales. Las masas observadas correspondieron a formas de monómero y dímero de hTLT1 ECD-His. La reducción de la proteína dio como resultado la eliminación completa de la proteína de 33,4 kDa, a la vez que se intensificó la proteína de 16,7 kDa según se analizó a partir de un análisis de SDS-PAGE/Coomassie. Por lo tanto, la proteína hTLT-1 ECD-His contenía un dímero de C-C interenlazado. Para separar el monómero del dímero, se empleó una segunda etapa de purificación. Los sistemas de tampones usados para esta etapa de purifi­ cación fueron un tampón de equilibrio compuesto de Hepes 50 mM, pH 8,0 y un tampón de elución compuesto de Hepes 50 mM, pH 8,0, NaCl 1 M. La muestra se ajustó a un pH de 8,0 mediante el uso de NaOH 1M y después se diluyó hasta una conductividad de aproximadamente 10 mS/cm. La proteína se aplicó a una columna Source 15Q equilibrada previamente, se lavó con 5 volúmenes de columna de equilibrado y se eluyó mediante el uso de 0 - 100 % de tampón de elución en 20 volúmenes de columna. En base al monitoreo de UV280, se evidenciaron dos picos con casi separación de la línea base. El análisis de las fracciones de los dos picos mediante el uso de análisis de SDS-PAGE/Coomassie, MS MALDI-TOF y Dispersión Dinámica de la Luz (DLS) mediante el uso de un instrumento Dynapro (Wyatt Technology) mostró la presencia del monómero de la proteína hTLT-1 ECD-His en el pico que eluyó primero y el dímero Cys-Cys en el pico que eluyó segundo. Se preparó una mezcla que contenía el monómero de la proteína hTLT-1 ECD-His solamente. La integridad de la proteína final se analizó basado en una configuración del método de cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) en un sistema Agilent LC 1100/1200 y mediante el uso de una columna BIOSep-SEC-S3000 de 300x7,8 mm (Phenomenex, núm. de cat. 00H-2146-K0) y un tampón de corrida compuesto de fosfato de Na 200 mM pH 6,9, NaCl 300 mM e isopropanol al 10 %. La proteína eluyó como un pico simétrico único a un tiempo de retención de aproximadamente 9,9 min a un régimen de flujo de 1 ml/min.

Se preparó un lote de hTLT-1 ECD-His para un estudio de inmunización para la producción de anticuerpos monoclonales anti-TLT1. De esta forma, la proteína se dializó en un tampón de PBS isotónico mediante el uso de un casete de diálisis Slide-A-Lyzer de 10 kDa de MWCO (Pierce, núm. de cat. 66453). Para medir la concentración de proteína final, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con un coeficiente de extinción de 0,55.

Ejemplo 3

Preparación de anticuerpos monoclonales contra TLT-1. Los ratones RBF se inmunizaron mediante la inyección de 50 pg de hTLT-1 ECD-His. FCA por vía subcutánea seguido de dos inyecciones con 20pg de hTLT-1 ECD-His en FIA. Los ratones con respuesta alta se reforzaron por vía intravenosa con 25pg de hTLT-1 ECD-His y los bazos se extrajeron después de 3 días. Las células del bazo se fusionaron con la línea celular Fox de mieloma. Los sobrenadantes se cribaron para la producción de anticuerpos específicos contra hTLT-1 en un ELISA específico y en un ensayo FACS mediante el uso de células CHO transfectadas con hTLT-1 o falsamente transfectadas como células diana positivas y negativas, respectivamente. Se realizó un cribado secundario en plaquetas en reposo frente a plaquetas activadas con agonistas dobles de origen humano, de monos cynomolgus, de perros, de conejos o de ratón.

Ejemplo 4

Clonación y secuenciación de ADNc de LC y HC del mAb antiTLT-1 a partir de hibridoma. El ARN total se extrajo a partir de cuatro hibridomas diferentes que expresaron mAb anti-TLT-1 denominados: 0012Hyb (también conocido como 2F105/2F105A3), 0023Hyb, 0051Hyb y 0052Hyb. El ARN se extrajo a partir de células de hibridoma mediante el uso del mini kit RNeasy (Qiagen, núm. de cat. 74106) y una alícuota del ARN resultante se usó como molde para la síntesis de la primera cadena de ADNc mediante el uso del kit de amplificación SMART RACE cDNA (Clontech, núm. de cat. 634914) según las instrucciones del fabricante para 5' RACE y mediante el uso del cebador A para 5' RACE CDS junto con un oligonucleótido de ARN SMART II A. La región codificante de los ADNc de la cadena ligera (LC) y la cadena pesada (HC) de cada uno de los cuatro hibridomas anti-TLT-1 se amplificaron posteriormente por PCR mediante el uso de una mezcla de cebador directo de UPM junto con o bien un cebador inverso específico de LC,kappa de ratón (cebador inverso número 339, 348 o 610) o junto con un cebador inverso que reconoce las se­ cuencias de IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3 de ratón (cebador inverso número 341, 347, 613, 614, 615 o 616, las se­ cuencias de los cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155). Las reacciones de PCR se realizaron me­ diante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, cat núm.: F-531L). Los fragmentos de PCR resultantes se clonaron mediante el uso del kit de clonación Zero Blunt TOPO PCR para secuenciación (Invitrogen, núm. K287540) y se secuenciaron. Las secuencias de los dominios variables para 0012LC y HC se muestran en la figura 3.

Ejemplo 5

Desarrollo de las construcciones de expresión pTT-0012HC, pTT-0023HC, pTT-0051HC y pTT-0052HC. Las se­ cuencias de ADN codificantes del dominio variable de HC (V^h) aisladas a partir de cada uno de los cuatro hibridomas anti-TLT-1 diferentes se amplificaron por PCR con cebadores directos que contienen un sitio de la enzima de restric­ ción HindIII y cebadores inversos que contienen un sitio de la enzima de restricción NheI para propósitos de clona­ ción. Las secuencias de ADN de 0012V^h, 0023V^h, 0051V^h y 0052V^h se amplificaron por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, cat núm. F-531L) con los siguientes pares de números de cebadores: 490 (di­ recto) 491 (inverso), 546 (directo) 547 (inverso), 627 (directo) 628 (inverso) y 617 (directo) 618 (inverso, las secuencias de cebadores se muestran en las SEQ NO. 70-155), respectivamente, y se insertaron en los sitios de las enzimas de restricción HindIII y Nhel de un vector basado en pTT (figura 22+23) denominado pTT-hIgG4, que con­ tiene las secuencias codificantes de la región constante para HC de IgG4 humana (es decir, CH1-bisagra-CH2-CH3). El vector pTT se describe esencialmente en Durocher, Y. y otros, (2002) Nucleic Acid Res, 30: E9 (figura 22). Los vectores resultantes se denominaron pTT-0012HC (figura 5), pTT-0023HC, pTT-0051HC, y pTT-0052HC. Las se­ cuencias de aminoácidos de la HC del anti-TLT-1 codificadas por los vectores de expresión se muestran (SEQ. ID NO.: 0012HC: 39, 0023HC: 41, 0051HC: 43, 0052HC: 45).

Ejemplo 6

Desarrollo de las construcciones de expresión pTT-0012LC, pTT-0023LC, pTT-0051LC y pTT-0052LC. Las secuen­ cias de ADN codificantes del dominio variable de LC (V^l) aisladas a partir de cada uno de los cuatro hibridomas anti-TLT-1 diferentes se amplificaron por PCR con cebadores directos que contienen un sitio de la enzima de restricción HindIII y cebadores inversos que contienen un sitio de la enzima de restricción BsiWI para propósitos de clonación. Las secuencias de ADN de 0012V^l, 0023V^l, 0051V^l y 0052V^l se amplificaron por PCR con los siguientes pares de números de cebadores: 493 (directo) 495 (inverso), 548 (directo) 549 (inverso), 492 (directo) 494 (inverso) y 619 (directo) 620 (inverso, las secuencias de cebadores se muestran en las SEQ NO. 70-155), respectivamente, y se insertaron en los sitios de las enzimas de restricción HindIII y BsiWI de un vector basado en pTT denominado pTT-hLC,Kappa, que contiene las secuencias codificantes de la región constante para LC humana, kappa (figura 24). Los vectores resultantes se denominaron pTT-0012LC, pTT-0023LC, pTT-0051LC y pTT-0052LC. La secuencia de aminoácidos de la LC del anti-TLT-1 codificada por los vectores de expresión se muestra en (Seq. ID no.: 0012LC: 40, 0023LC: 42, 0051LC: 44, 0052LC: 46).

Ejemplo 7

Desarrollo de pTT-0012HC.T60N, pTT-0012HC.T60A, pTT-0012LC.C36A y pTT-0052HC.C91Y. La secuencia de aminoácidos de 0012V^h contiene un sitio potencial de glicosilación ligado a N (T60, numeración de kabat) y las se­ cuencias de aminoácidos de 0012VL y del 0052VH contienen cada una, una Cys no pareada (C36 y C91, respecti­ vamente, numeración de kabat). Los vectores de expresión que codifican 0012HC.T60N o 0012HC.T60A o 0012LC.C36A o 0052HC.C91Y se desarrollaron mediante el uso de mutagénesis dirigida al sitio (Quickchange II, Stratagene, número de catálogo 20523-5) según las instrucciones del fabricante. Las reacciones de mutagénesis dirigida al sitio se realizaron mediante el uso de a) ADN de pTT-0012HC como molde y los números de cebadores 682 (directo) 683 (inverso) para pTT-0012HC.T60N, b) ADN de pTT-0012HC como molde y los números de ceba­ dores 688 (directo) 689 (inverso) para pTT-0012HC.T60A, c) a Dn de pTT-0012LC como molde y los números de cebadores 598 (directo) 599 (inverso) para pTT-0012LC.C36A, d) ADN de pTT-0052HC como molde y los siguien­ tes números de cebadores 684 (directo) 685 (inverso, las secuencias de los cebadores se muestran en las SEQ NO 70-155) para pTT-0052HC.C91Y . Los vectores de expresión resultantes se secuenciaron para verificar las se­ cuencias de ADN. La secuencia de aminoácidos de HC y LC anti-TLT-1 codificadas por los vectores de expresión pTT-0012HC.T60N, pTT-0012HC.T60A y pTT-0012LC.C36A se muestran en (Seq. ID no.: 0012HC.T60N: 47, 0012HC.T60A: 50, 0012LC.C36A: 48).

Ejemplo 8

Desarrollo de construcciones de expresión pTT-0012LC-HPC4, pTT-0012LC.C36A-HPC4, pTT-0023LC-HPC4, pTT-0051LC-HPC4 y pTT-0052LC-HPC4. Las secuencias de ADN codificantes de V^l aisladas a partir de cada uno de los cuatro hibridomas anti-TLT-1 diferentes se amplificaron por PCR con cebadores directos que contienen un sitio de la enzima de restricción HindIII y cebadores inversos que contienen un sitio de la enzima de restricción BsiWI para pro­ pósitos de clonación. Las secuencias de ADN de 0012V^l, 0012V^l.C36A, 0023V^l, 0051V^l y 0052V^l se amplificaron por PCR con los números de cebadores siguientes: 493 (directo) 495 (inverso), 548 (directo) 549 (inverso), 492 (directo) 494 (inverso), y 619 (directo) 620 (inverso, las secuencias de los cebadores se muestran en las SEQ. ID NO. 70-155)respectivamente, mediante el uso de la mezcla de PCR phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L). La secuencia codificante de la Q_,kappa humana se amplificó por PCR con el cebador directo número 486 y el cebador inverso número 485. El cebador directo número 486 contiene un sitio de la enzima de restricción BsiWI y el cebador inverso 485 codifica una etiqueta HPC4 (SEQ. ID NO.: 69) seguida de un codón de parada y contiene un sitio de EcoRI flanqueante 3' para propósitos de clonación. La reacción PCR se realizó mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, cat núm. F-531L). El fragmento de PCR de 0012V^l digerido por HindIII+BsiWI se mezcló con el fragmento de PCR de Q_,kappa-HPC4 humana digerido por BsiWI+EcoRI y se insertó en los sitios de HindIII EcoRI de un vector de expresión basado en pTT que resultó en pTT-0012LC-HPC4 (figura 4). Para desarrollar los vectores de expresión correspondientes codificantes de la versión LC-HPC4 de las cuatro secuencias LC anti-TLT-1 restantes, la secuencia 0012Vl en pTT-0012LC-HPC4 se escindió con HindIII+ BsiWI y se sustituyó con fragmentos de PCR 0023Vl, 0051Vl, 0052Vl y 0012Vl.C36A digeridos con HindIII+BsiWI. Los cuatro vectores de expresión re­ sultantes se denominaron: pTT-0023LC-HPC4, pTT-0051LC-HPC4, pTT-0052LC-HPC4 y pTT-0012LC.C36A.HPC4.

Ejemplo 9

Desarrollo de las construcciones de expresión ^pTT-0012V^h-CH1, ^pTT-0012V^h-CH1-HPC4, ^pTT-0023V^h-CH1, pTT-0023V^h-CH1-HPC4, ^pTT-0051V^h-CH1 , ^pTT-0051V^h-CH1-HPC4, ^pTT-0052V^h-CH1 y ^pTT-0052V^h-CH1-HPC4. Las secuencias de 0012Vh, 0023Vh, 0051Vh, y 0052Vh aisladas a partir de 0012Hyb, 0023Hyb, 0051Hyb, 0052Hyb se amplificaron por PCR con los números de cebadores: 490 (directo) 491 (inverso), 546 (directo) 547 (inverso), 627 (directo) 628 (inverso), 617 (directo) 618 (inverso, las secuencias de cebadores se muestran en las SEQ NO 70­ 155), respectivamente, mediante el uso de la mezcla de PCR phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L). Todos los cebadores directos (490, 546, 627 y 617) contenían un sitio de HindIII y todos los cebadores inversos (491, 547, 628 y 618) contenían un sitio de NheI para propósitos de clonación. La región CH1 de IgG⁴ humana se amplificó por PCR con los cebadores número: 489 (directo) 488 (inverso), o los cebadores número 489 (directo) 487 (inverso). El cebador directo número 489 contenía un sitio de NheI, el cebador inverso número 488 contenía un codón de parada y un sitio de EcoRI, y el cebador inverso número 487 contenía una secuencia codificante de la etiqueta HPC4, un codón de parada seguido por un sitio de EcoRI para propósitos de clonación. El fragmento de PCR 0012V^h digerido por HindIII+NheI, se combinó con el fragmento de P^c R CH1 de IgG⁴ humana digerido por NheI+EcoRI o con el fragmento de PCR CH1-HPC4 de IgG⁴ humana digerido por NheI+EcoRI y se clonó en los sitios de HindIII+EcoRI para un vector basado en pTT. Los vectores resultantes se denominaron pTT-0012Vh-CH1 y pTT-0012Vh-CH1-HPC4, respectivamente. Subsecuentemente, los dominios Vh de pTT-0012Vh-CH1 y de pTT-0012Vh-CH1-HPC4 se escindieron mediante digestión con HindIII+NheI y se insertaron los fragmentos de PCR 0197-0000-0023V^h, 0197-0000-0051V^h y 0197-0000-0052V^h digeridos con HinDIII+NheI. Los vectores de expresión resultantes se denomina­ ron: pTT-0023Vh-CH1, pTT-0023Vh-CH1-HPC4, pTT-0051Vh-CH1 , pTT-0051Vh-CH1-HPC4, pTT-0052Vh-CH1, y pTT-0052VH-CH1-HPC4.

Ejemplo 10

Desarrollo de las construcciones de expresión ^pTT-0012V^h.T60N-CH1 y ^pTT-0012V^h.T60N-CH1-HPC4. La secuen­ cia 0012VH.T60N-CH1 (que incluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR a partir de pTT-0012HC.T60N mediante el uso de una mezcla de PCR phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y el uso de un cebador directo número 572 que contiene un sitio de la enzima de restricción HinDIII y un cebador inverso número 488 que contiene un sitio de EcoRI para propósitos de clonación o el cebador inverso 487 que contiene una secuen­ cia codificante de la etiqueta HPC4 junto con un sitio de EcoRI para propósitos de clonación (las secuencias de los cebadores se muestran en las SEQ NO 70-155). Los fragmentos de P^c R resultantes se digirieron con HindIII+ Eco­ RI y se insertaron en los sitios de HindIII EcoRI de un vector basado en pTT. Los vectores de expresión resultantes se denominaron ^pTT-0012V^h.T60N-CH1 y ^pTT-0012V^h.T60N-CH1-HPC4.

Ejemplo 11

Desarrollo de las construcciones de expresión pTT-L4a-hTF.1-219 y pTT-hTF.1-219-L4b. Se realizó una construc­ ción de expresión que codifica un enlazador Gly-Ser de 17 aminoácidos en el extremo N (L4a: GSGGGGSGGGGS GGGGS, SEQ. ID NO. 61) y el dominio extracelular del factor tisular humano que excluye la secuencia codificante del péptido señal (hTF.1-219, SEQ. ID NO. 14). Al principio, la secuencia de ADNc de hTF.1-219 se amplificó por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador número 466 (directo) que contiene la secuencia de ADN codificante de L4a y el cebador inverso 449 (las secuencias de los cebadores se muestran en las SEQ NO 70-155) que dan como resultado el fragmento de PCR L4a-hTF.1-219. Se realizó una segunda etapa de amplificación de PCR con el cebador número 483 (directo) y 449 (inverso) mediante el uso del primer fragmento de ^pC^r como molde. La segunda etapa de PCR se realizó con el fin de incor­ porar los sitios de HinDIII y EcoRI en el fragmento de PCR para propósitos de clonación. El fragmento de PCR resul­ tante codifica L4a-hTF.1-219 y contenía un sitio de BamHI como parte del enlazador Gly-Ser (secuencia subrayada en L4a) para futuros propósitos de clonación. El fragmento de ADN se insertó en los sitios de HinDIII y EcoRI de un vector basado en pTT y el vector resultante se denominó pTT-L4a-hTF.1-219 (figura 25).

Se produjo una construcción de expresión que codifica el dominio extracelular del factor tisular humano que incluye la secuencia codificante del péptido señal y un enlazador Gly-Ser de 17 aminoácidos en el extremo C (L4b: GGGGSGGGGSGGGGS GS, ^s E^q . ID NO. 62). Al principio, hTF.1-219 se amplificó por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador número 448 (directo) y 467 (inverso, las secuencias de los cebadores se muestran en las SEQ. ID NO 70-155) que resultan en un fragmen­ to de ADN que codifica hTF.1-219-L4b (SEQ. ID NO. 16(AA1-251) 62). Se realizó una segunda etapa de amplifica­ ción de PCR con el cebador número 448 (directo) y 484 (inverso) mediante el uso del primer fragmento de p Cr co­ mo molde. La segunda etapa de PCR se realizó con el fin de incorporar los sitios de HinDIII y EcoRI en el fragmento de PCR para propósitos de clonación. El fragmento de PCR que codifica hTF.1-219-L4b resultante contenía un sitio de BamHI como parte del enlazador Gly-Ser (secuencia subrayada en L4b) para futuros propósitos de clonación. El fragmento de ADN se insertó en los sitios de HinDIII y EcoRI de un vector basado en pTT y el vector resultante se denominó pTT-hTF.1-219-L4b (figura 26).

Ejemplo 12

Desarrollo de las construcciones de expresión pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219, pTT-hTF.1-219-L4b-0012LC y pTT-0012LC.C36A-L4a-hTF.1-219. El ADNc de 0012LC (que incluye la secuencia codificante del péptido señal) se ampli­ ficó por PCR a partir de pTT-0012LC mediante el uso de la mezcla de PCR phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador directo número 493 y el cebador inverso número 552. El cebador directo 493 insertó un sitio de la enzima de restricción HinDIII en el extremo 5' y el cebador inverso 552 insertó un sitio de la en­ zima de restricción BamHI en el extremo 3' para propósitos de clonación (las secuencias de los cebadores se mues­ tran en las SEQ NO 70-155). El fragmento de ^p C^r de 0012LC resultante se insertó en los sitios de HinDIII BamHI de pTT-L4a-hTF.1-219 que resultó en el vector de expresión que codifica 0012LC-L4a-hTF.1-219 denominado pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219.

El ADNc de 0012LC (que excluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR a partir de pTT-0012LC mediante el uso de la mezcla de PCR phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del ce­ bador directo número 551 y el cebador inverso número 98. El cebador directo 551 insertó un sitio de la enzima de restricción BamHI en el extremo 5' y el cebador inverso 98 insertó un sitio de la enzima de restricción EcoRI en el extremo 3' para propósitos de clonación (las secuencias de los cebadores se muestran en las SEQ NO 70-155). El fragmento de PCR de 0012LC resultante se insertó en los sitios de BamHI EcoRI de pTT-hTF.1-219-L4b que resul­ tó en el hTF.1-219-L4b-0012LC que codifica el vector de expresión denominado pTT-hTF.1-219-L4b-0012LC.

La secuencia de ADNc de 0012V^l.C36A se escindió de pTT-0012LC.C36A mediante el uso de las enzimas de res­ tricción HinDIII y BsiWI y el fragmento de ADN resultante se insertó en los sitios de las enzimas de restricción Hin-DIII+BsiWI del plásmido pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219 es decir, se reemplazó la secuencia 0012V^l. El plásmido de expresión resultante se denominó pTT-0012LC.C36A-L4a-hTF.1-219 (también se denominó 0061LC-L4a-hTF.1-219).

Ejemplo 13

Desarrollo de las construcciones de expresión pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219 y pTT-hTF.1-219-L4b-0012HC. La se­ cuencia de 0012HC (que incluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR a partir del pTT-0012HC mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y el uso del cebador direc­ to número 490 y el cebador inverso número 513. El cebador directo 490 insertó un sitio de la enzima de restricción HinDIII en el extremo 5' y el cebador inverso 513 insertó un sitio de la enzima de restricción BamHI en el extremo 3'para propósitos de clonación. El fragmento de PCR de 0012HC se insertó en los sitios de HinDIII BamHI de pTT-L4a-hTF.1-219 y dio como resultado la construcción de expresión 0012HC-L4a-hTF.1-219 denominada pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219.

La secuencia de 0012HC (que excluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR a partir de pTT-0012HC mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y el uso del cebador directo número 512 y el cebador inverso número 100. El cebador directo 512 insertó un sitio de la enzima de restric­ ción BamHI en el extremo 5' y el cebador inverso 100 insertó un sitio de la enzima de restricción EcoRI en el extremo 3' para propósitos de clonación (las secuencias de los cebadores se muestran en las SEQ NO. 70-155). El fragmen­ to de pCr de 0012HC se insertó en los sitios de BamHI EcoRI de pTT-hTF.1-219-L4b lo que dio como resultado la construcción de expresión hTF.1-219-L4b-0012HC denominada pTT-hTF.1-219-L4b-0012HC.

Ejemplo 14

Desarrollo de las construcciones pTT-0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219 y pTT-hTF.1-219-L4b-0012VH-CH1. La secuencia de ADN codificante de 0012V^h-CH1 (que incluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR a partir de pTT-0012HC mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador directo número 490 y el cebador inverso número 514 (las secuencias de los cebadores se mues­ tran en las SEQ ID NO 70-155). El cebador directo 490 insertó un sitio de la enzima de restricción HinDIII en el ex­ tremo 5' y el cebador inverso 514 insertó un sitio de la enzima de restricción BamHI en el extremo 3' para propósitos de clonación. El fragmento de PCR 0012VH-CH1se insertó en los sitios de HinDIII BamHI de pTT-L4a-hTF.1-219 lo que dio como resultado la construcción de expresión 0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219 denominada pTT-0012Vh-CH1-L4a-hTF.1-219 (figura 6).

La secuencia de ADN codificante de 0012V^h-CH1 (que excluye la secuencia codificante del péptido señal) se ampli­ ficó por PCR a partir de pTT-0012HC mediante el uso del cebador directo número 512 y el cebador inverso número 488. El cebador directo 512 insertó un sitio de la enzima de restricción BamHI en el extremo 5' y el cebador inverso 488 insertó un codón de parada y un sitio de la enzima de restricción EcoRI en el extremo 3' para propósitos de clo­ nación (las secuencias de los cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155). El fragmento de PCR de 0012V^h-CH1 se insertó en los sitios de BamHI EcoRI de pTT-hTF.1-219-L4b y dio como resultado la construcción de expresión hTF.1-219-L4b-0012VH-CH1 denominada pTT-hTF.1-219-L4b-0012VH-CH1.

Ejemplo 15

Desarrollo de pTT-0012LC-TF con diferentes longitudes del enlazador: L0 (sin enlazador), L1 (2GS), L2 (7GS), L3 (12GS), L5 (22GS), L6 (27GS), L7 (32GS), L8 (37GS), L9 (42GS). La secuencia de ADNc de 0012LC (que incluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y el uso del cebador directo número 574 que contiene un sitio de HinDIII en el extremo 5' y los cebadores inversos que contienen secuencias en el extremo 3' que codifican longitudes del enlaza­ dor GS de 5 GS un sitio de BamHI (cebador inverso número 590), 10GS+ un sitio de BamHI (cebador inverso nú­ mero 585), 15GS (cebador inverso número 583) un sitio de BamHI, 20GS un sitio de BamHI (cebador inverso número 584), 25GS un sitio de BamHI (cebador inverso número 591, las secuencias de los cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155). Los fragmentos de PCR 0012LC resultantes se digirieron con HinDIII+BamHI y se insertaron en pTT-L4a-hTF.1-219, lo que dio como resultado vectores de expresión designados pTT-0012LC-L5-hTF.1-219 (enlazador 22GS), pTT-0012LC-L6-hTF.1-219 (enlazador 27GS), pTT-0012LC-L7-hTF.1-219 (enlazador 32GS), pTT-0012LC-L8-hTF.1-219 (enlazador 37GS) y pTT-0012LC-L9-hTF.1-219 (enlazador 42GS).

La secuencia de ADNc de hTF.1-219 (que excluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y el uso del cebador directo núme­ ro 586, que contiene un sitio de BamHI (enlazador 2GS) seguido de una secuencia codificante del enlazador 10GS, o el cebador directo número 699 que contiene un sitio de BamHI (enlazador 2GS) seguido de una secuencia codifi­ cante de un enlazador de 5GS o el cebador directo número 700 que contiene un sitio de BamHI (enlazador 2GS) junto con el cebador inverso número 449 que contiene un sitio de la enzima de restricción EcoRI para propósitos de clonación (las secuencias de cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155). Los fragmentos de PCR resul­ tantes se digirieron con BamHI+EcoRI y se insertaron en los sitios de BamHI+EcoRI de pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219, es decir, se sustituye la secuencia L4a-hTF.1-219. Los vectores de expresión resultantes se denominaron: pTT-0012LC-L3-hTF.1-219 (enlazador 12GS), pTT-0012LC-L2-hTF.1-219 (enlazador 7GS) o pTT-0012LC-L1-hTF.1-219 (enlazador 2GS).

La secuencia de ADNc de 0012LC (que incluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador di­ recto número 574 que contiene un sitio de HinDIII del extremo 5' y el cebador inverso número 704 que contiene se­ cuencias del extremo 5' de hTF.1-219. La secuencia de ADNc de hTF.1-219 (que excluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador directo número 703 que contiene secuencias del extremo 3' de 0012LC y el cebador inverso número 449 que contiene un sitio de EcoRI en el extremo 3'. Los fragmentos de PCR de 0012LC y hTF.1-219 se combinaron y se realizó una segunda etapa de PCR (PCR de solapamiento) mediante el uso del ce­ bador directo número 574 y del cebador inverso número 449 (las secuencias de cebadores se muestran en las se­ cuencias núm. 70-155). El fragmento de PCR resultante se insertó en los sitios de HinDIII+EcoRI de un vector de expresión basado en pTT, que dio como resultado pTT-0012LC-L0-hTF.1-219 que codifica una proteína de fusión 0012LC-hTF.1-219 sin ninguna secuencia enlazadora.

Ejemplo 16

Desarrollo de pTT-0023LC-TF con diferentes longitudes del enlazador: L3 (12GS), L4a (17GS), L5 (22GS), L6 (27GS), L7 (32GS), L8 (37GS), L9 (42GS). La secuencia de ADNc de 0023VL (que incluye la secuencia codificante del péptido señal) se escindió de pTT-0023LC mediante el uso de las enzimas de restricción HinDIII+BsiWI y se in­ sertó en los sitios de las enzimas de restricción HinDIII+BsiWI de: pTT-0012LC-L3-hTF.1-219 (enlazador 12GS), pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219 (enlazador 17GS), pTT-0012LC-L5-hTF.1-219 (enlazador 22GS), pTT-0012LC-L6-hTF.1-219 (enlazador 27GS), pTT-0012LC-L7-hTF.1-219 (enlazador 32GS), pTT-0012LC-L8-hTF.1-219 (enlazador 37GS) y pTT-0012LC-L9-hTF.1-219 (enlazador 42GS) es decir, se reemplaza la secuencia de ADNc de 0012V^l con 0023V^l. Los vectores de expresión resultantes se denominaron: pTT-0023LC-L3-hTF.1-219 (enlazador 12GS), pTT-0023LC-L4a-hTF.1-219 (enlazador 17GS), pTT-0023LC-L5-hTF.1-219 (enlazador 22GS), pTT-0023LC-L6-hTF.1-219 (enlazador 27GS), pTT-0023LC-L7-hTF.1-219 (enlazador 32GS), pTT-0023LC-L8-hTF.1-219 (enlazador 37GS) y pTT-0023LC-L9-hTF.1-219 (enlazador 42GS).

Ejemplo 17

Desarrollo de pTT-0023HC-TF con diferentes longitudes de enlazador: L1 (2GS), L2 (7GS), L3 (12GS), L4a (17GS), L5 (22GS), L6 (27GS), L7 (32GS), L8 (37GS), L9 (42GS). La secuencia de ADNc de 0023HC (que incluye la se­ cuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZy­ mes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador directo número 546 que contiene un sitio de la enzima de restricción HindIII en el extremo 5' y 1) cebador inverso número 592 que contiene una secuencia codificante de 5GS junto con un sitio de BamHI o 2) cebador inverso número 589 que contiene una secuencia codificante de 10GS junto con un sitio de BamHI o 3) cebador inverso número 587 que contiene una secuencia codificante de 15GS junto con un sitio de BamHI o 4) cebador inverso número 588 que contiene una secuencia codificante de 20GS junto con un sitio de BamHI o 5) cebador inverso número 593 que contiene una secuencia codificante de 25GS junto con un sitio de BamHI (las secuencias de los cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155). Los fragmentos de PCR resultantes se digirieron con HinDIII+BamHI y se insertaron en los sitios de la enzima de restricción HinDIII+BamHI de pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219 es decir, se reemplaza la secuencia codificante de 0012LC. Los vectores de expre­ sión resultantes se denominaron: pTT-0023HC-L5-hTF.1-219 (enlazador 22GS), pTT-0023HC-L6-hTF.1-219 (enla zador 27GS), pTT-0023HC-L7-hTF.1-219 (enlazador 32GS), pTT-0023HC-L8-hTF.1-219 (enlazador 37GS), pTT-0023HC-L9-hTF.1-219 (enlazador 42GS).

La secuencia de ADNc de hTF.1-219 (que excluye la secuencia del péptido señal de hTF) se amplificó por PCR me­ diante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso de a) el cebador directo número 586 que contiene un sitio de la enzima de restricción BamHI y una secuencia codificante de 10GS o b) el cebador directo número 699 que contiene un sitio de la enzima de restricción BamHI y una secuencia codifican­ te de 5GS o el cebador directo número 700 que contiene un sitio de la enzima de restricción BamHI junto con el ce­ bador inverso número 449 que contiene un sitio de la enzima de restricción de EcoRI para propósitos de clonación (las secuencias de los cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155). Los fragmentos de PCR resultantes se digirieron con BamHI+EcoRI y se insertaron en los sitios de BamHI+EcoRI de pTT-0023HC-L4a-hTF.1-219, es decir, se sustituye la secuencia de L4a-hTF.1-219 por la secuencia de ADNc de L3-hTF.1-219 o L2-hTF.1-219 o L1-hTF.1-219. Los vectores de expresión resultantes se denominaron pTT-0023HC-L3-hTF.1-219 (enlazador 12GS), pTT-0023HC-L2-hTF.1-219 (enlazador 7GS) y pTT-0023HC-L1-hTF.1-219 (enlazador 2GS), respectivamente.

La secuencia de ADN 0023Vh se escindió de pTT-0023HC mediante el uso de HinDIII NheI y se insertó en los si­ tios de HinDIII NheI de pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219, es decir, se reemplaza la secuencia de ADN de 0012Vh. El vector de expresión resultante se denominó pTT-0023HC-L4a-hTF.1-219.

Ejemplo 18

Desarrollo de pTT-0012HC-TF con diferentes longitudes de enlazador: L0 (sin enlazador), L1 (2GS), L2 (7GS), L3 (12GS), L5 (22GS), L6 (27GS), L7 (32GS), L8 (37GS), L9 (42GS). La secuencia de ADNc codificante de 0012Vh se escindió de pTT-0012HC mediante el uso de HinDIII+NheI y el fragmento de ADNc resultante se insertó en pTT-0023HC-L1-hTF.1-219, pTT-0023HC-L2-hTF.1-219, pTT-0023HC-L3-hTF.1-219, pTT-0023HC-L5-hTF.1-219, pTT-0023HC-L6-hTF.1-219, pTT-0023HC-L7-hTF.1-219, pTT-0023HC-L8-hTF.1-219 o pTT-0023HC-L9-hTF.1-219, es decir, se reemplaza 0023V^h. Los vectores de expresión resultantes se denominaron: 1) pTT-0012HC-L1-hTF.1-219, pTT-0012HC-L2-hTF.1-219, pTT-0012HC-L3-hTF.1-219, pTT-0012HC-L5-hTF.1-219, pTT-0012HC-L6-hTF.1-219, pTT-0012HC-L7-hTF.1-219, pTT-0012HC-L8-hTF.1-219 o pTT-0012HC-L9-hTF.1-219.

El ADNc que codifica 0012HC (que incluye la secuencia de péptido señal) se amplificó por PCR mediante el uso de una mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador directo número 490 que contiene un sitio de enzima de restricción HinDIII en el extremo 5' y el cebador inverso número 801 que contiene una parte de la secuencia de ADNc en el extremo 5' que codifica hTF.1-219. La secuencia de ADNc de hTF.1-219 (que excluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR mediante el uso del cebador directo número 800 que contiene una secuencia en el extremo 5' que codifica la parte del extremo 3' del ADNc de 0012HC y el cebador inverso número 449 que contiene un sitio de EcoRI para propósitos de clonación (las secuencias de ce­ badores se muestran en las secuencias núm. 70-155). Los dos fragmentos de PCR resultantes se combinaron y se usaron como molde en una segunda etapa de PCR (PCR de solapamiento) mediante el uso del cebador directo nú­ mero 490 y el cebador inverso número 449. El fragmento de PCR que se obtuvo se digirió con HinDIII+EcoRI y se insertó en un vector de expresión basado en pTT. El vector de expresión resultante se denominó pTT-0012-L0-hTF.1-219 y codificó una proteína de fusión 0012HC-TF sin secuencia enlazadora.

Ejemplo 19

Desarrollo de pTT-0012VH-CH1-L10-hTF.1-219, pTT-0012Vn.T60N-CH1-L10-hTF.1-219 y ^pTT-0012V^h.T60A-CH1-L10-hTF.1-219. La secuencia de ADNc 0012VH-CH1-bisagra (que incluye la secuencia codificante del péptido señal) se amplificó por PCR a partir del plásmido pTT-0012HC mediante el uso de una mezcla de PCR Phusion (FinnZy­ mes, no de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador directo número 572 que contiene un sitio de la enzima de restricción HindIII en el extremo 5' y un cebador inverso número 686, que contiene parte de las secuencias del ex­ tremo 5' de hTF.1-219. El cebador inverso 686 hibridó con la región de bisagra de hIgG4 del plásmido pTT-0012HC y se incorporaron dos mutaciones puntuales, C239S y C242S (numeración de Kabat) para eliminar dos cisteínas libres. La secuencia de ADNc de TF.1-219 humano se amplificó por PCR mediante el uso del cebador directo núme­ ro 687 que contiene la secuencia del extremo 3' del ADNc de 0012VH-CH1-bisagra y el cebador inverso número 449 que contiene un sitio de la enzima de restricción EcoRI para propósitos de clonación (las secuencias de los cebado­ res se muestran en las secuencias núm. 70-155). El ADNc de 0012VH-CH1-bisagra y los fragmentos de PCR de hTF.1-219 se combinaron y usaron como molde en una segunda reacción de PCR (PCR de solapamiento) mediante el uso del cebador directo número 572 y el cebador inverso número 449. El fragmento de PCR resultante que codifi­ ca 0012VH-CH1-bisagra-hTF.1-219 se digirió con HindIII+EcoRI y se insertó en un vector de expresión basado en pTT que dio como resultado el vector de expresión denominado pTT-0012VH-CH1-L10-hTF.1-219.

Los ADNc de 0012V^h.T60N y 0012V^h.T60A (que incluyen la secuencia codificante del péptido señal) se escindieron de pTT-0012HC.T60N o de pTT-0012HC.T60A, respectivamente, mediante el uso de las enzimas de restricción HinDIII y NheI. Los dominios variables resultantes se insertaron en los sitios de HinDIII NheI de ^pTT-0012V^h-CH1-L10-hTF.1-219, es decir, se reemplaza la secuencia 0012Vh. Los vectores de expresión resultantes se denominaron: pTT-0012VH.T60N-CH1-L10-hTF.1-219 (también conocido como pTT-0061VH-CH1-L10-hTF.1-219) y pTT-0012VH.T60A-CH1-L10-hTF.1-219 (también conocido como pTT-0082VH-CH1-L10-hTF.1-219), respectivamente.

Ejemplo 20

Desarrollo de pTT-0012VH-CH1-L0-hTF.1-219. La secuencia de ADN que codifica 0012Vh-CH1 se amplificó por PCR a partir del plásmido pTT-0012HC mediante el uso de la mezcla de ^p C^r Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso de HinDIII que contiene el cebador directo número 572 y un cebador inverso número 702 que con­ tiene secuencias de ADN que se sobrelapan con el extremo 5' de la secuencia de ADNc de hTF.1-219. La secuencia de ADNc de hTF.1-219 se amplificó por PCR mediante el uso del cebador directo número 701 que contiene secuen­ cias de ADNc que se sobrelapan con la secuencia de ADNc del extremo 3' para 0012V^h-CH1 y el cebador inverso número 449 que contiene un sitio de la enzima de restricción EcoRI para propósitos de clonación. Los fragmentos de PCR resultantes se combinaron y se usaron en una segunda reacción de PCR (PCR de solapamiento) mediante el uso del cebador directo número 572 y el cebador inverso número 449. El fragmento de PCR resultante se digirió con HinDIII+EcoRI y se insertó en los sitios de restricción de HinDIII+EcoRI de un vector de expresión basado en pTT que resultó en un vector de expresión denominado pTT-0012 VH-CH1-sin enlazador-hTF.1-219.

Ejemplo 21

Desarrollo de pTT-023VH-CH1-L4a-hTF.1-219, pTT-0051HC-L4a-hTF.1-219, pTT-0051VH-CH1-L4a-hTF.1-219, pTT-0052HC-L4a-hTF.1-219 y pTT-0052VH-CH1-L4a-hTF.1-219. Las secuencias de ADNc de 0023Vh, 0051VH y 0052Vh se escindieron de pTT-023HC, pTT-0051HC o de pTT-0052HC mediante el uso de enzimas de restricción Hin-DIII+NheI. Los fragmentos de ADN resultantes se insertaron en los sitios de las enzimas de restricción HinDIII+NheI de pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219 o de pTT-0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219, es decir, se reemplaza la secuencia de ADN 0012V^h. Los vectores de expresión resultantes se denominaron pTT-0023VH-CH1-L4a-hTF.1-219, pTT-0051HC-L4ahTF.1-219, pTT-0051VH-CH1-L4a-hTF.1-219, pTT-0052HC-L4a-hTF.1-219 y pTT-0052VH-CH1-L4a-hTF.1-219. Ejemplo 22

Desarrollo de pTT-0051LC-L4a-hTF.1-219 y pTT-0052LC-L4a-hTF.1-219. Las secuencias de ADNc de 0051Vl y 0052Vl se escindieron de pTT-0051LC o de pTT-0052LC mediante el uso de las enzimas de restricción HinDIII BsiWI. Los fragmentos de ADN resultantes se insertaron en los sitios de las enzimas de restricción HinDIII+BsiWI de pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219, es decir, se reemplaza la secuencia de ADN de 0012V^l. Los vectores de expresión resultantes se denominaron pTT-0051LC-L4a-hTF.1-219 o pTT-0052LC-L4a-hTF.1-219.

Ejemplo 23

Desarrollo de pTT-control de isotipo LC-L4a-hTF.1-219, pTT-control de isotipo LC-HPC4, pTT-control de isotipo HC-L4a-hTF.1-219, pTT-control de isotipo HC, pTT-control de isotipo V^h-CH1-HPC4 y pTT-control de isotipo V^h-CH1-L4a-TF. Con el fin de expresar una proteína de fusión hTF.1-219 en base a una secuencia de control de isotipo de Fab o mAb, las secuencias de ADNc de V^h y V^l se recuperaron en base a las secuencias de CDR antitriNitroFenilo (ATNP). La secuencia de ATNP V^l se insertó en los sitios de las enzimas de restricción HinDIII+BsiWI de los siguien­ tes plásmidos: pTT-0012LC, pTT-0012LC-HPC4 y pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219, es decir, se reemplaza la secuencia de 0012Vl y da como resultado los siguientes plásmidos de expresión: pTT-control de isotipo-LC, pTT-control de isotipo-LC-HPC4 y pTT-control de isotipo-LC-L4a-hTF.1-219.

La secuencia de ATNP Vh se insertó en los sitios de las enzimas de restricción HinDIII+NheI de los siguientes plás­ midos: pTT-0012HC, ^pTT-0012V^h-CH1-HPC4, pTT-0012VH-CH1-L4a-hTF.1-219 y pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219, es decir, se reemplaza la secuencia 0012V^h y da como resultado los siguientes plásmidos de expresión: pTT-control de isotipo-HC, pTT-control de isotipo-VH-CH1-HPC4, pTT-control de isotipo-VH-CH1-L4a-hTF.1-219 y pTT-control de isotipo-HC-L4a-hTF.1-219.

Ejemplo 24

Desarrollo de pTT-AP-3LC-17GS-TF.1-219, pTT-AP-3LC.C34S-17GS-TF.1-219 y ^pTT-AP-3V^h-CH1-HPC4. El hibridoma AP-3 que expresa un mAb antiGPIIbIIIa se compró de ATCC (número de ATCC: HB-242) y se determinaron las secuencias de codificación del dominio variable de AP3 LC y HC. El ARN total se aisló de las células del hibridoma AP-3 mediante el uso del minikit de RNeasy (Qiagen, núm. de cat. 74106) y se fabricó una primera cadena de ADNc mediante el uso de SMART RACE (clontech, núm. de cat. PT3269-1), polimerasa inversa Primescript (Takara Bio Inc, núm. de código 2680A) y se empleó el cebador de 5-CDS y el oligonucleótido de SMART IIA (ambos inclui­ dos en el kit SMART RACE). Las secuencias de los dominios variables de LC y HC se amplificaron por PCR median­ te el uso de la mezcla de cebadores UPM (incluida en el kit SMART RACE) junto con el cebador número 69 para LC y la mezcla de cebadores UPM junto con el cebador número 312 (las secuencias de los cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155) para HC. Los fragmentos de PCR se clonaron en un vector de secuenciación mediante el uso del kit de clonación de PCR Zeroblunt Topo para Secuenciación (Invitrogen, núm. de cat. K287520) y se si­ guieron las instrucciones del fabricante.

Una Cys libre potencial en la posición 34 (de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat) se identificó en la secuencia de ADNc de Vl. El residuo de Cys se mutó a una Ser con el empleo de mutagénesis dirigida al sitio me­ diante el uso del kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (núm. de cat. 200518, Stratagene) y los cebadores números 50 y 51 (las secuencias de cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155). La secuencia de ADNc de Vl resultante se secuenció con el fin de verificar la secuencia de ADNc mutado.

El ADNc de AP-3V^h, AP-3V^l y AP-3V^l.C34S se secuenció y se amplificó por PCR con el fin de generar vectores de expresión que codifican AP-3V^h-CH1-HPC4, AP-3LC-L4a-hTF.1-219 y AP-3LC.C34S-L4a-hTF.1-219. AP-3V^h se amplificó por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR Phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador directo número 842 que contiene un sitio de la enzima de restricción HinDIII y el cebador inverso número 843 que contiene un sitio de la enzima de restricción NheI para propósitos de clonación. El ADNc de AP-3V^l y AP-3V^l.C34S secuenciado se amplificó por PCR mediante el uso de la mezcla de PCR phusion (FinnZymes, núm. de cat. F-531L) y mediante el uso del cebador directo número 844 que contiene un sitio de la enzima de restricción HinDIII y el cebador inverso número 845 (las secuencias de los cebadores se muestran en las secuencias núm. 70­ 155) que contiene un sitio de la enzima de restricción BsiWI para propósitos de clonación. El fragmento de PCR de AP-3V^h digerido con HinDIII NheI se insertó en los sitios de la enzima de restricción HinDIII y NheI de ^pTT-0012V^h-CH1-HPC4, es decir, se reemplaza la secuencia de ADN de 0012V^h que da como resultado un vector de expresión denominado pTT-AP3V^h-CH1-HPC4. Los fragmentos de PCR de AP-3V^l y AP-3V^l.C34S digeridos por HinDIII BsiWI se insertaron en los sitios de las enzimas de restricción HinDIII y BsiWI de pTT-0012LC-L4a-hTF.1-219, es decir, se reemplaza la secuencia de ADN de 0012V^l y da como resultado un vector de expresión denominado pTT-AP-3LC-L4a-hTF.1-219 y pTT-AP-3LC.C34S-L4a-hTF.1-219.

Ejemplo 25

Desarrollo de pTT-0012HC.T60N-His6, pTT-hIgG4-bisagra-CH2-CH3-His6 y pTT-hIgG4- bisagra-CH2-CH3-L4ahTF.1-219. Para desarrollar un vector de expresión que codifica 0012HC.T60N con una etiqueta His-6 en el extremo C, se realizó mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso del kit rápido Quickchange (GenStar Biosolutions, núm. de cat. T113-01). Brevemente, la reacción de mutagénesis dirigida al sitio se realizó mediante el uso de pTT-0012HC.T60N como molde, cebador directo e inverso número 1000 y 1001 (las secuencias de los cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155). El cebador número 1000 1001 hibridó con el extremo 3' de la secuencia de ADNc de 0012HC.T60N y contenía secuencias de codificación de la etiqueta His-6 seguido de un codón de para­ da. El plásmido resultante se denominó pTT-0012HC.T60N-His6.

Con el fin de desarrollar un vector de expresión que codifica hIgG4-bisagra-CH2-CH3-L4a-hTF.1-219 se realizó mu­ tagénesis dirigida al sitio mediante el uso del kit rápido Quickchange (GenStar Biosolutions, cat. núm. T113-01) y mediante el uso de pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219 como molde y los cebadores directo e inverso números 1002 y 1003 (las secuencias de los cebadores se muestran en las secuencias núm. 70-155). Los cebadores números 1002+1003 hibridaron con parte del péptido señal de 0012HC y parte de la región bisagra de hIgG4 y eliminaron las secuencias de ADN de 0012V^h-CH1 del plásmido pTT-0012HC-L4a-hTF.1-219. El vector de expresión resultante se denominó pTT-hIgG4-bisagra-CH2-CH3-L4a-hTF.1-219. Con el fin de desarrollar un vector de expresión que codifica hIgG4-bisagra-CH2-CH3-His6, se realizó mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso del kit rápido Quichange (Stratagene, núm. de cat. 200518) y mediante el uso de pTT-hIgG4-bisagra-CH2-CH3-L4a-hTF.1-219 como molde y los cebadores directo e inverso números 1000 y 1001. El cebador número 1000+1001 contenía secuencias de ADN que codifican His-6 seguido de un codón de parada y ellos hibridaron con el extremo 3' de la secuencia de ADN de CH3 de hIgG4. El vector de expresión resultante se denominó pTT-hIgG4-bisagra-CH2-CH3-His6.

Ejemplo 26

Transfección transitoria de células HEK293-6E. Todos los mAb, Fab y proteínas de fusión hTF.1-219 se expresaron en células en suspensión HEK293-6E mediante la transfección transitoria de plásmidos de expresión en las células. Las combinaciones de plásmidos individuales subyacentes a los compuestos proteicos específicos resultantes se muestran en la Tabla 6. Las células HEK293-6E se cultivaron en medio Freestyle HEK293 (GIBCO, núm. de cat.

12338-018) suplementado con P/S al 1 % (GIBCO núm. de cat. 15140-122), plurónico al 0,1 % (GIBCO, núm. de cat.

24040-032) y 25 ug/mL de geneticina (GiBc O, núm. de cat. 10131-019) y las células se transfectaron a una densi­ dad celular de aproximadamente 1 mill/mL mediante el uso de 293fectin (Invitrogen, núm. de cat. 12347-019) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, para cada litro de células HEK293-6E, la transfección se realizó mediante la dilución de un total de 1 mg de ADN en 30 ml de Optimem (dilución A) y mediante la dilución de 1 ml de 293fectin en 30 ml de Optimem (GIBCO, núm. de cat. 51985-026, dilución B). Las diluciones A y B se mezcla­ ron y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. La mezcla de transfección se añadió posteriormente a las células HEK293-6E y las células se incubaron a 370C en una incubadora humidificada con rotación orbital (125 rpm). Cinco a siete días después de la transfección, las células se eliminaron por centrifugación y los sobrenadantes resultantes del cultivo celular se esterilizaron por filtración antes de la purificación. Para todos los experimentos de transfección transitoria mediante el uso de cotransfección de 2 plásmidos de expresión, los plásmidos se cotransfectaron en una relación de plásmido 1:1 (ug:ug) mediante el uso de una cantidad de ADN total de 1 mg por cada litro de células HEK293-6E a transfectar. Para la expresión de la proteína 0120 y 0121 (Tabla 6), se cotransfectaron 3plásmidos de expresión en células HEK293-6E en una relación de plásmidos 1:1:1 (ug:ug:ug).

Tabla 6

Continuación

Continuación

Ejemplo 27

Plásmidos mutantes pcDNA3.1(+)-hTLT-1 ECD-HPC4 ala._De acuerdo con la tabla 7, se diseñaron cuarenta cons­ trucciones de expresión mutantes de hTLT-1 ECD-HPC4 Ala. El contratista externo GENEART AG (Im Gewerbepark B35, 93059 Regensburg, Alemania) desarrolló las construcciones de expresión y todas las 40 construcciones de expresión se fabricaron en base al vector de expresión denominado pcDNA3.1(+). Las alícuotas de ADN para cada una de las 40 construcciones de expresión de hTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+) se transfectaron en células HEK293-6E en suspensión con el fin de expresar transitoriamente cada proteína mutante de hTLT-1 ECD-HPC4 Ala (Tabla 7). La transfección transitoria y el cultivo de las células HEK293-6E se realizaron como se describió en el ejemplo Z.

Tabla 7

wt Tipo silvestre

1 L22A

2 V25A

3 Q27A

4 V30A

5 L35A

6 H39A

7 R41A

8 L42A

9 Q43A

10 K46A

11 Q48A

12 F54A

13 L55A

14 P56A

15 E57A

16 Q60A

17 D68A

18 R69A

19 R70A

20 R75A

21 L82A

22 L86A

23 E90A

24 M91A

25 T93A

26 Q95A

27 E96A

28 E97A

29 D107A

30 R110A

31 H116A

32 R117A

33 S119A

34 P125A

35 E126A

36 E128A

37 E130A

38 S136A

39 N140A

40 K159A

Ejemplo 28

Purificación y caracterización de anticuerpos monoclonales anti-TLT-1. La purificación de los siete anticuerpos monoclonales anti-TLT-1 expresados de manera recombinante descritos en la tabla 1 se realizó mediante un proceso en 2 etapas compuesto por cromatografía de afinidad mediante el uso de una resina MabSelect SuRe de Proteína A (GE Healthcare, núm. de cat. 17-5438-01) y cromatografía de filtración en gel mediante el uso de una columna Superdex 200 PrepGrade 26/60 (GE Healthcare, núm. de cat. 17-1071-01). Las purificaciones se realizaron mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas de tampones que se usaron para la etapa de purificación por afinidad fueron un tampón de equilibrio compuesto de fosfato de Na 20 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, un tampón de elución compuesto por ácido fórmico 10 mM pH 3,5 y un tampón de ajuste de pH compuesto de fosfato de Na 0,5 M pH 9,0. Los sobrenadantes celulares se aplicaron directamente sin ningún ajuste sobre una columna MabSelect SuRe equilibrada previamente. La columna se lavó con 15 volúme­ nes de columna del tampón de equilibrio y los anticuerpos monoclonales se eluyeron isocráticamente en aproxima­ damente 2-5 volúmenes de columna de tampón de elución. Las fracciones agrupadas se ajustaron a pH neutro me­ diante el uso del tampón de ajuste del pH descrito inmediatamente después de la elución. La proteína se purificó posteriormente y el tampón se intercambió mediante el uso de dicha columna de filtración en gel. El tampón de corri­ da usado para la cromatografía de exclusión por tamaño fue His 25 mM pH 6,5, NaCl 135 mM. El régimen de flujo usado fue 2,5 ml/min y los anticuerpos monoclonales anti-TLT1 eluyeron como picos individuales aproximadamente a 0,4 volúmenes de columna. Basado en el análisis de las fracciones en todo el pico mediante el uso del método de SEC-HPLC descrito anteriormente (como se describió en el ejemplo 2), se prepararon mezclas que contenían una proteína pura del anticuerpo, que eluye como picos simétricos aproximadamente a 8,5 min y con un contenido míni­ mo de proteína de alto peso molecular de elución temprana.

Los anticuerpos purificados se caracterizaron mediante el uso de los métodos de SDS-PAGE/Coomassie descritos anteriormente (como se describió en el ejemplo 2) y los métodos de SEC-HPLC, lo que muestra que todas las prepa­ raciones de proteínas de anticuerpo producidas fueron altamente homogéneas. Todos los anticuerpos mostraron los componentes esperados de cadena pesada de aproximadamente 50 kDa y componentes de cadena ligera de apro­ ximadamente 25 kDa, cuando se usaron condiciones de reducción antes de los análisis de la corrida de SDS-PAGE/Coomassie. Las determinaciones de masa molecular intacta se realizaron mediante el uso del método de espectrometría de masa con Ionización por electrospray con tiempo de vuelo y cromatografía líquida que se configu­ ró en un instrumento Agilent 6210 y una columna de desalinización MassPREP (Waters, núm. de cat. USRM10008656). El sistema de tampones que se usó fue un tampón de equilibrio compuesto por ácido fórmico al 0,1 % en H²O de calidad para LC-MS y un tampón de elución compuesto por ácido fórmico al 0,1 % en ACN de cali­ dad para LC-MS. Todos los anticuerpos mostraron masas moleculares intactas de 147,2 - 148,6 kDa, que es apro­ ximadamente 2,7 - 3,1 kDa por encima de las masas teóricas de las secuencias de aminoácidos para cada uno de los anticuerpos. Así, todos los anticuerpos anti-TLT-1 expresados de manera recombinante mostraron modificacio­ nes postraduccionales correspondientes a las N-glicosilaciones esperadas de HC. Se obtuvieron purezas finales del 95 - 99 % para los seis anticuerpos. Para verificar la secuencia del extremo N de los anticuerpos anti-TLT-1 clona­ dos y purificados, se realizaron degradaciones EDMAN mediante el uso de un sistema secuenciador automatizado (Applied Biosystems 494 Protein Sequencer). Se realizaron 10-20 ciclos de degradación para cada anticuerpo. Aquí, las secuencias esperadas de las cadenas ligera y pesada se confirmaron para los seis anticuerpos anti-TLT-1 clona­ dos. Para medir las concentraciones finales de proteína, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con coeficientes de extinción específicos para cada uno de los seis anticuerpos, que variaron de 1,34-1,51.

Ejemplo 29

Purificación y caracterización de las proteínas expresadas de manera recombinante Fab-hTF.1-219. La purificación de las proteínas de fusión Fab-hTF.1-219 descritas en la tabla 6 se realizó mediante el uso de un proceso de 2 eta­ pas compuesto por cromatografía de afinidad mediante el uso de una resina anti-HPC4 (Roche, núm. de cat.

11815024001) y un cambio final de tampón. La purificación se realizó mediante el uso de un sistema de cromatogra­ fía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas de tampones que se usaron para la etapa de purificación fueron un tampón de equilibrio compuesto por Hepes 20 mM, pH 7,5, CaCl21,0 mM, NaCl 100 mM y Tween-80 al 0,005 % (v/v), un tampón de lavado compuesto de Hepes 20 mM, pH 7,5, CaCl21,0 mM, NaCl 1,0 M y Tween-80 al 0,005 % (v/v) y un tampón de elución compuesto por Hepes 20 mM, pH 7,5, EDTA 5,0 mM y NaCl 100 mM. Los sobrenadantes celulares se ajustaron con CaCl21 mM de concentración final y un pH de 7,5 y se aplicaron sobre una columna anti-HPC4 equilibrada previamente. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio, 5 volúmenes de columna de tampón de lavado y por último con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio. Las proteínas Fab-hTF1-219 se eluyeron isocráticamente en aproximadamente 4 volúmenes de columna de tampón de elución. Las proteínas Fab-hTF1-219 se analizaron mediante el uso de análisis de SDS-PAGE/Coomassie, SEC-HPLC y espectrometría de masa MALDI-TOF, como se describió previamente (como se describió en los ejemplos 1 y 28), lo que muestra que se obtuvieron proteínas puras y homogéneas con masas mo­ leculares de 78-86 kDa. Debido a que la masa teórica de la secuencia de aminoácidos para las construcciones FabhTF1-219 fue de 73-77 kDa, todas las proteínas expresadas contenían modificaciones postraduccionales. Las pro­ teínas se prepararon para los análisis del ensayo mediante diálisis en tampón PBS o en un tampón compuesto por His a 25 mM, NaCl a 135 mM, pH 6,5 mediante el uso de un casete de diálisis Slide-A-Lyzer MWCO a 10kDa (Pierce, núm. de cat. 66453) o mediante el uso de la resina desalinizadora Sephadex G-25 (GE, núm. de cat. 17-0033) empacado en una columna adecuada. Para medir las concentraciones finales de proteína, se usó un espectrofotó­ metro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con coeficientes de extinción de 1,31-1,47.

Ejemplo 30

Purificación y caracterización de proteínas expresadas de manera recombinante de mAb-hTF.1-219. La purificación de las proteínas de fusión mAb-hTF.1-219 descritas en la tabla 6 se llevó a cabo mediante un proceso de 2 etapas compuesto por cromatografía de afinidad basada en una resina MabSelect SuRe de Proteína A (GE Healthcare, núm. de cat. 17-5438-01) o una resina anti-HPC4 (Roche, núm. de cat. 11815024001). La resina anti-HPC4 se usó para la purificación de construcciones de mAb-hTF.1-219, en las cuales hTF.1-219 se fusionó de manera extremo C a la cadena pesada. Estos incluyeron los compuestos 0197-0000-0013, 0197-0000-0018, 0197-0000-0086, 0197­ 0000-0087, 0197-0000-0088, 0197-0000-0089, 0197-0000-0090, 0197-0000-0091, 0197-0000-0092, 0197-0000­ 0093, 0197-0000-0034, 0197-0000-0056, 0197-0000-0060, 0197-0000-0096 y 0197-0000-0116. Las restantes pro­ teínas de fusión mAb-hTF.1-219 descritas en la tabla 6 se purificaron mediante el uso de la resina SuRe MabSelect de Proteína A. Se usó un método de cromatografía de filtración en gel como purificación final de pulido. Aquí se usó una columna 26/60 Superdex 200 PrepGrade (GE Healthcare, núm. de cat. 17-1071-01). Todas las purificaciones se llevaron a cabo mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112­ 41) y se basaron esencialmente en el uso de los procedimientos cromatográficos descritos previamente. Las proteí­ nas mAb-hTF.1-219 eluyeron como picos individuales aproximadamente a 0,4 volúmenes de columna. Basado en el análisis de las fracciones en todo el pico mediante el uso del método de SEC-HPLC analítico descrito previamente, se prepararon mezclas que contenían la proteína pura que eluyó como picos simétricos a aproximadamente 9 min con un contenido mínimo de proteína de alto peso molecular de elución temprana.

Las proteínas mAb-hTF.1-219 purificadas se caracterizaron mediante el uso de los métodos SDS-PAGE/Coomassie y SEC-HPLC descritos anteriormente (como se describió en el ejemplo 2), lo que demuestra que todas las proteínas mAb-hTF.1-219 eran altamente puras, es decir, por encima del 90 % de impurezas no relacionadas con el producto. Las determinaciones de masa molecular intacta se realizaron mediante el uso del método de espectrometría de ma­ sa MALDI-TOF descrito anteriormente (como se describió en el ejemplo 28). Todas las proteínas mAb-hTF.1-219 mostraron pesos moleculares intactos de 200-206 kDa, que es aproximadamente 8-12 kDa por encima de las ma­ sas teóricas de las secuencias de aminoácidos para cada uno de los anticuerpos. Así, todas las proteínas mAbhTF.1-219 mostraron modificaciones postraduccionales. Para medir las concentraciones finales de proteína, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con coeficientes de extinción específicos para cada uno de los seis anticuerpos que variaron de 1,34 - 1,51.

Ejemplo 31

Purificación y caracterización de la proteína heterodimérica denominada 0120. La purificación de la proteína heterodimérica denominada con el número 0120 en la tabla 6 se llevó a cabo como un proceso de 4 etapas compuesto por 1) cromatografía de afinidad a His mediante el uso de la resina Ni-NTA (QIAGEN, núm. de cat. 30430), 2) Cambio de tampón mediante el uso de la columna de desalinización HiPrep 26/10 (GE Healthcare, núm. de cat. 17-5087-01), 3) cromatografía de intercambio aniónico mediante el uso de Q Sepharose_HP (GE Healthcare, núm. de cat. 17-1014­ 03), y 4) cromatografía de exclusión por tamaño mediante el uso de HiLoad 16/60 Superdex 200 (GE Healthcare, núm. de cat. 17-1069-01). Las purificaciones se realizaron mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaEx­ plorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas de tampón usados para la primera etapa de purifica­ ción fueron un tampón de equilibrio compuesto por Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM, Imidazol 10 mM, y un tampón de elución compuesto por Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM, Imidazol 500 mM. El sobrenadante celular se ajustó con Imidazol 10 mM de concentración final y un pH de 7,5 y se aplicó sobre una columna Ni-NTA equilibrada pre­ viamente. La columna se lavó con 4 volúmenes de columna de tampón de elución al 2 %. La proteína se eluyó isocráticamente en aproximadamente 4 volúmenes de columna de tampón de elución al 60 %. El pico principal basado en el monitoreo de UV280 se recogió y se mezcló. En la segunda etapa, la proteína se preparó para el cromatógrafo de intercambio aniónico al cambiar a tampón Tris 50 mM, de pH 7,5 mediante el uso de una columna de desaliniza­ ción. El sistema de tampones que se usó para la tercera etapa de purificación fue un tampón de equilibrio compuesto por Tris 50 mM, pH 7,5 y un tampón de elución compuesto por Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 1 M. La mezcla de la se­ gunda etapa se aplicó directamente a la columna Q Sepharose HP preequilibrada, se lavó con 2 volúmenes de co­ lumna de tampón de equilibrio y se eluyó en un gradiente de tampón de elución de 0-100 % en 10 volúmenes de columna seguido de 3 volúmenes de columna de tampón de elución al 100 %. El pico principal se recogió y se mez­ cló. El tampón usado en la cuarta etapa fue PBS. La mezcla de proteína de la etapa 3 se aplicó directamente a la columna HiLoad 16/60 Superdex 200. El pico principal se recogió y se almacenó a -80 °C. El análisis de SDS-PAGE/Coomassie al 8-15 %, SEC-HPLC y LC-M^s mostró que se obtuvo una proteína pura. Se observó una banda densa de proteína a partir del análisis SDS-PAGE/Coomassie que correspondió a dicho complejo de proteína hete­ rodimérica. La reducción de la proteína dio como resultado la abolición completa de la banda del complejo proteico, mientras que aparecieron tres bandas que indican tres subunidades del complejo proteico. La integridad de la pro­ teína final se analizó en base a un método SEC-HPLC configurado en un sistema Waters LC 2795/2996 y mediante el uso de una columna BIOSep-SEC-S3000 de 300x7,8 mm (Phenomenex, núm. de cat. 00H-2146-K0) y un tampón de corrida compuesto por PBS. La proteína eluyó como un único pico simétrico a un tiempo de retención de aproxi­ madamente 8,2 min a un régimen de flujo de 1 ml/min. Para medir la concentración final de proteína, se usó un es­ pectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con un coeficiente de extinción de 1,34. Los pesos moleculares de cada subunidad se determinaron mediante LC-MS. La deconvolución de masa de la subunidad LC indicó una masa igual al valor esperado. La deconvolución de masa de la subunidad HC-His indicó una masa igual al valor es­ perado con los N-glicanos G0F, G1F y G2F. La señal del espectro de masas de Fc-sTF era demasiado baja para deconvolucionar debido a la glicosilación pesada del factor tisular.

Ejemplo 32

Purificación y caracterización de la proteína heterodimérica denominada 0121. La purificación de la proteína hetero­ dimérica denominada con número 121 fue esencialmente la misma que se describió para el heterodímero con núme­ ro 120. Aquí, la proteína se lavó en 3 volúmenes de columna de tampón de equilibrio y se eluyó en tampón de elu­ ción al 0-40 % en 8 volúmenes de columna seguido de 3 volúmenes de columna de tampón de elución al 100 %. Esta elución en gradiente garantizó la separación completa del heterodímero con el homodímero Fc-His. Mediante SDS-PAGE/Coomassie 8-15 %, SEC-HPLC y LC-MS se demostró que se obtuvo una proteína pura. Se observó una banda densa de proteína en SDS-PAGE/Coomassie que correspondió a dicho complejo de proteína heterodimérica.

La reducción de la proteína dio como resultado la abolición completa de la banda del complejo proteico, mientras que aparecieron tres bandas que indican tres subunidades del complejo proteico. La integridad de la proteína final se analizó en base a un método SEC-HPLC configurado en un sistema Waters LC 2795/2996 y mediante el uso de una columna BIOSep-SEC-S3000 de 300x7,8 mm (Phenomenex, núm. de cat. 00H-2146-K0) y un tampón de corrida compuesto por PBS. La proteína eluyó como un único pico simétrico a un tiempo de retención de aproximadamente 8,2 min a un régimen de flujo de 1 ml/min. Para medir la concentración final de proteína, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con un coeficiente de extinción de 1,34. El peso molecular de cada subunidad se determinó mediante LC-MS. La deconvolución de masa de la subunidad FC-His indicó una masa igual al valor esperado con los N-glicanos G0F, G1F y G2F. La deconvolución de masa de la subunidad HC indicó que la masa observada se correlacionó con los N-glicanos G0F, G1F y G2F, pero con un truncamiento de Lys en el extremo C. La señal del espectro de masas de LC-sTF era demasiado baja para deconvolucionarse debido a la glicosilación pesada del factor tisular.

Ejemplo 33

Unión de proteínas de fusión de TF a FVIIa. La unión de las proteínas de fusión de TFa FVIIa se probó por su capa­ cidad para estimular la actividad de FVIIa mediante el uso de un ensayo amidolítico. El efecto se comparó con la estimulación inducida por TF soluble (sTF), idéntica a hTF.1-219. La unión de TF a FVIIa da como resultado un au­ mento marcado de la actividad catalítica de FVIIa; y la unión de sTF y la construcción de TF se midió conveniente­ mente mediante el uso de la actividad amidolítica de FVIIa con el sustrato cromogénico S2288 (Ile-Pro-Arg-pNA). La unión de hTF.1-219 a FVIIa aumenta la actividad catalítica de FVIIa. Las proteínas de fusión de TF se diseñaron para localizar FVII/FVIIa en la superficie de las plaquetas activadas. La fusión de una proteína a TF no debe, por lo tanto, afectar significativamente su unión a FVIIa, y se espera que la estimulación dependiente de la concentración de la actividad de FVIIa inducida por proteínas de fusión de TF en condiciones óptimas sea idéntica a la obtenida con el TF no fusionado (hTF.1-219). En la figura 7 se analizaron las proteínas de fusión de TF en un ensayo con FVIIa 50 nM, Hepes 50 mM, NaCl 0,1 M, CaCl²5 mM, BSA 1 mg/ml pH 7,4 y varias concentraciones (0 - 100 nM) de proteínas sTF (cuadrado abierto) o proteínas de fusión Fab-TF (símbolos abiertos) o proteínas de fusión mAb-TF (símbolos cerrados). La actividad amidolítica de FVIIa se midió con 1 mM del sustrato cromogénico S2288. La activi­ dad de FVIIa se midió mediante el aumento de la absorbancia a 405 nm a temperatura ambiente y la reacción se inició mediante la adición de S2288 1 mM. Las proteínas de fusión Fab- hTF.1-219 estimulan la actividad amidolítica de FVIIa de una manera dependiente de la concentración indistinguible de la inducida por hTF.1-219 que muestra que esta construcción se une a FVIIa con una estequiometría 1:1 y con una afinidad similar a hTF.1-219. Las proteí­ nas de fusión de mAb- hTF.1-219 estimulan de manera similar la actividad de FVIIa de una manera dependiente de la concentración idéntica a la de hTF.1-219. Sin embargo, en este caso, la estequiometría indica que esta construc­ ción se une a dos FVIIa por mAb como se espera con acceso libre a ambos restos de TF en las proteínas de fusión de mAb-TF.

Ejemplo 34

Unión de mAb y competencia de diferentes mAb para la unión al TLT-1.

Materiales:

Tabla 8: Reactivos

Método:

Los mAb de interés se inmovilizaron directamente a un chip CM5 o por captura a través de un mAb de captura de Fc humano inmovilizado a un chip CM5. Los reactivos que se usaron se muestran en la tabla 8.

Captura directa: Los mAb contra TLT-1 se inmovilizaron a un nivel de aproximadamente 500-1000 RU en un chip CM5 (50 pg/ml diluido en acetato de Na, pH 4,0) mediante el uso del procedimiento estándar recomendado por el proveedor. Se analizaron diluciones de dos veces del TLT1 desde 200 nM hasta 0,2 nM para su unión a los mAb. Tampón de corrida y de dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo me­ diante glicina 10 mM, pH 1,7.

Captura a través del mAb Fc humano: El mAb Fc humano se inmovilizó aproximadamente a 10000 RU. Se añadió el mAb de interés (aproximadamente 100 nM). Se probaron diluciones de dos veces del TLT1 desde 200 nM hasta 0,2 Nm. Tampón de corrida y de dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo en MgCl²3 M

La determinación de las constantes cinéticas y de unión (kon, koff, K^d) se obtuvo al asumir una interacción 1:1 del TLT1 y el fibrinógeno mediante el uso del programa informático de evaluación Biacore T100.

Competencia: El análisis de interacción de unión por competencia se obtuvo por resonancia de plasmones superfi­ ciales en un Biacore T-100 que analizó la unión de diversos mAb contra TLT1 al TLT1 cuando se une al mAb0012 inmovilizado (o un mAb alternativo). Se logró la inmovilización directa a un chip CM5 de los mAb a un nivel de 5000­ 10000 RU en acetato de sodio 10 mM pH 4,5-5,0. Esto fue seguido por la unión de TLT1 50 nM y después de 2 min de disociación, seguido por la unión de otros tres mAb para evaluar la competencia. Tampón de corrida y de dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo mediante glicina 10 mM, pH 1,7.

Resultados:

Tabla 9

Tabla 10: Análisis de SPR. Constante de unión para la unión a TLT1. Competencia con mAb0012

Conclusión:

Las constantes de unión para mAb 0061, 0023, 0051 y 0062 se estimaron mediante el análisis de Biacore (ver tabla 9).

El mAb 0061 y el mAB 0051 no compiten con ninguno de los otros mAb para la unión (ver tabla 10). El mAb 0023 y el mAb 0062 sí compiten entre sí (ver tabla 10).

Ejemplo 35

Unión a las plaquetas activadas mediante análisis FACS._La unión a las plaquetas activadas mediante el análisis de FACS demostró que se unen tanto a las células transfectadas con t Lt-1 como a las plaquetas activadas específicamente como se describe más abajo.

La tinción con la proteína de fusión 2F105FabHC-TF en plaquetas mediante el uso de citometría de flujo se realizó mediante adición de preparaciones de plaquetas (plaquetas en reposo frente a activadas) en placas de 96 pocillos junto con 50 pl de proteína de fusión diluida 2F105FabHC-TF (0011 Fab hTF.1-219) o control de isotipo 2F105Fab (0010 Fab) en la titulación, lo que da concentraciones finales de 5 pl /ml hasta 0,001 pl /ml. Las preparaciones celulares se incubaron después a 4 grados Celsius durante 1 hora. Después de la incubación y el lavado (tampón PBS con suero fetal bovino al 5 %, centrifugar durante 5 minutos a 200 g), se añadió el anticuerpo secundario anti-L+H humana específico de cadena marcado con RPE (diluido en tampón PBS 1:100) o un anticuerpo específico para HPC4 (específico para la etiqueta en 2F105Fab HC-TF) y se incubó durante 1 hora adicional a 4 grados Celsius. Finalmente, las células se lavaron y fijaron con paraformaldehído al 1 % p/v y se analizaron en el citómetro de flujo dentro de 36 horas.

Las preparaciones de plaquetas se produjeron al producir un plasma rico en plaquetas (PRP) estándar. En resumen, la sangre total anticoagulada se centrifugó (a 200 g durante 15 minutos) sin freno. La capa superior que contiene plaquetas (Plasma rico en plaquetas) se recogió y se añadió prostaglandina (Conc. final 5 pl/ml) para la inhibición de la activación plaquetaria. Las plaquetas se lavaron y se usaron para la tinción como se describió anteriormente. Para la producción de plaquetas activadas se realizó una activación agonista doble, durante 10 minutos mediante el uso de (62,5 pg/ml Par 1 y Convulxin 100 ng/ml). Se usaron 50-100000 células por pocillo.

La Figura 8 muestra, con dos procedimientos de tinción, que tanto el isotipo Fab como la proteína de fusión 2F105FabHC-TF (0011 Fab hTF.1-219) se unen específicamente y con alta afinidad a las plaquetas activadas y no a las plaquetas en reposo.

Ejemplo 36

Mejora de la activación de FX mediada por FVIIa mediante la localización del complejo FVIIa/TF en la superficie de las plaquetas preactivadas mediante la unión de las proteínas de fusión de TF al receptor TLT-1. La capacidad de las proteínas de fusión de TF para estimular específicamente la activación mediada por FVIIa en las plaquetas activadas se analizó en un ensayo de dos etapas en la figura 9A. La capacidad de las proteínas de fusión de TF para mediar, además, la activación de FVII a FVIIa se probó en la figura 9B. Para este fin usamos plaquetas liofilizadas (activadas) de Biopal (REF 50710, lote R088001). La activación de FX se midió en un ensayo de dos etapas en ausencia o presencia de plaquetas a una concentración final de 67000 plt/pl. Se mezcló rFVIIa a 100 pM (LASa 15860-008) con FX 175 nM (Enzyme Research, factor X humano, HFX 3170 PAL) en Hepes a 50 mM, NaCl a 0,1 M, CaCl²5 mM, 1 mg/ml de BSA pH 7,4 a temperatura ambiente. La activación de FX se detuvo después de 10 minutos cuando se retiró una alícuota de cada pocillo y se añadió a un volumen igual de tampón de parada frío (Hepes 50 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM, BSA a 1 mg/ml pH 7,5). La cantidad de FXa generada en las muestras se determinó luego en un ensayo cromogénico mediante la transferencia de 50 pl de la mezcla a un pocillo de placa de microtitulación y mediante la adición de 25 pl de Cromozima X (0,42 mg/ml final) al pocillo. La absorbancia se midió continuamente a 405 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices). La Figura 9A muestra el efecto de i) Innovin® 0,03 nM, ii) hTF.1-219 10 nM, iii) 0011 Fab-hTF.1-21910 nM,iv) anticuerpo Fab 001010 nM o v) anticuerpo mAB 0012 sobre la activación de FX mediada por FVIIa en ausencia o presencia de plaquetas. La Figura 9B muestra el efecto de reemplazar rFVIIa en el ensayo con el cimógeno, rFVII.

El bloqueo de la activación de FX (> 95 %) se obtuvo en experimentos de control mediante preincubación con el anticuerpo policlonal caprino anti-TF humano (0,5 mg/ml) durante 15 minutos antes de la adición de FVIIa.

Los datos en la figura 9A muestran que la fusión de TF con el fragmento Fab de un anticuerpo contra TLT-1 proporciona una construcción que estimula la activación de FX catalizada por FVIIa solo en presencia de plaquetas activadas. La estimulación de la activación de FX por la proteína de fusión TF 0011 en presencia de plaquetas fue notablemente más fuerte que la estimulación por hTF.1-219. La especificidad hacia las plaquetas activadas es una propiedad preferida de la proteína de fusión de TF, que no se obtiene con TF lipídico (Innovin®) que estimula la activación de FX mediada por FVIIa también en ausencia de plaquetas activadas.

La Figura 9B muestra el efecto de reemplazar rFVIIa en el ensayo con el cimógeno, rFVII. Es bien sabido que Innovin® estimula la activación de FX mediada por FVIIa (figura 9A); y además, como se indica en los datos en la figura 9B, que Innovin® puede estimular la activación de la retroalimentación eficiente de FVII. Esta reacción es esencialmente independiente de la presencia de plaquetas. La construcción de TF, 0011 Fab-hTF.1-219, igualmente estimula la activación de FX mediada por FVIIa y puede mediar una activación de la retroalimentación dependiente de plaquetas de FVII (figura 9B), sin embargo, de una manera notoria dependiente de las plaquetas, y notablemente más fuerte que hTF.1-219. No se observó estimulación significativa de la activación de FX con el anticuerpo Fab 0010 o el anticuerpo mAb 0012 per se.

Ejemplo 37

Mejora de la activación de FX mediada por FVIIa mediante la localización del complejo FVIIa/TF en la superficie de las plaquetas activadas mediante la unión al receptor TLT-1.

En la Figura 10A, la proteína de fusión 0011 hTF.1-219 y hTF.1-219 se analizaron en un ensayo de dos etapas (ver Ejemplo 36) en presencia de plaquetas en reposo o activadas a varias concentraciones. Las plaquetas activadas (pero no en reposo) expusieron el receptor TLT-1 en sus superficies. Se cree que el direccionamiento de una proteína de fusión TF al receptor TLT-1 da como resultado el ensamblaje del complejo TF/FVIIa en una posición favorable para la estimulación de la activación de FX en la superficie fosfolipídica de las plaquetas activadas. La Figura 10B muestra los resultados cuando la proteína de fusión 0011 hTF.1-219 se reemplaza por 0,1 nM de una proteína de fusión AV-hTF.1-219 en la que el anticuerpo contra TLT-1 se reemplaza por la Anexina V (AV).

Las plaquetas en reposo recién purificadas y lavadas se prepararon a partir de sangre total estabilizada con citrato que se centrifugó a 200 X g durante 10 min. El plasma rico en plaquetas se transfirió a tubos de 15 ml y se suplementó con 1/10 de volumen de citrato trisódico al 2,5 %, ácido cítrico al 1,5 %, 2 %. D-glucosa . Centrifugación a 500 x g/15 min, freno 5. El sobrenadante se desechó y el sedimento de plaquetas se disolvió en 10 ml de tampón Hepes/Tyrodes (Hepes 100 mM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, MgCl² 1,7 mM, D-glucosa 5,0 mM, NaH²PÜ⁴ 0,4 mM pH= 6,5) más 5 pl de prostaglandina E1 a 10 mg/ml. Las plaquetas se suspendieron cuidadosamente con una pipeta de plástico y se centrifugaron a 500 x g durante 15 min, con freno 5. El sobrenadante se desechó y el sedimento se volvió a disolver en 10 ml de tampón Hepes/Tyrodes más 5 pl de prostaglandina E1 a 10 mg/ml. El número de plaquetas se determinó por Medonic. Las plaquetas reposaron 30 minutos o más a temperatura ambiente antes del uso. La activación de las plaquetas se obtuvo mediante un tratamiento con trombina 5 nM y con Convulxin 100 ng/ml.

Se mezcló rFVIIa 100 pM con una proteína de fusión hTF.1-219 10 nM o 0011 Fab-hTF.1-21910 nM o una proteína de fusión AV-hTF.1-2190,1 nM y con FX 175 nM (Enzyme Research, factor X humano, HFX 3170 PAL) en Hepes 50 mM, NaCl 0,1 M, CaCl²5 mM, BSA 1 mg/ml a pH 7,4 a temperatura ambiente, en presencia de plaquetas en reposo o activadas a varias concentraciones (0-100 000 plt/gl). La activación de FX se detuvo después de 10 minutos cuando se retiró una alícuota de cada pocillo y se añadió a un volumen igual de tampón de parada frío (Hepes 50 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM, BSA a 1 mg/ml pH 7,5). La cantidad de FXa generada en las muestras se determinó luego en un ensayo cromogénico mediante la transferencia de 50 gl de la mezcla a un pocillo de placa de microtitulación y mediante la adición de 25 gl de Cromozima X (0,42 mg/ml final) al pocillo. La absorbancia se midió continuamente a 405 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices).

Los datos en la figura 10A ilustran que la unión de la proteína de fusión 0011 Fab-hTF.1-219 al receptor TLT-1 estimula específicamente la activación de FX mediada por FVIIa en las plaquetas activadas y no en las plaquetas en reposo. La estimulación aumentó con el número de plaquetas y es saturable con una EC⁵⁰ de aproximadamente 12 000 plts activadas/gl. El direccionamiento a la superficie plaquetaria, que se obtuvo por ejemplo, mediante la fusión de hTF.1-219 al fragmento Fab de unión a TLT-1 da como resultado una estimulación marcada de la activación de FX mientras que solo se obtiene una estimulación menor con hTF.1-219 no fusionado.

La Figura 10B muestra los resultados obtenidos cuando la proteína de fusión 0011 Fab-hTF.1-219 10 nM se reemplaza por la proteína de fusión AV-hTF.1-219 0,1 nM. La proteína de fusión AV-hTF.1-219 es un estimulador más eficiente que 0011 Fab-hTF.1-219 de la activación de FX mediada por FVIIa en las plaquetas. Sin embargo, la proteína de fusión AV-hTF.1-219 se demostró que es menos específica hacia las plaquetas activadas que 0011 FabhTF.1-219 y la proteína de fusión AV-hTF.1-219 induce una estimulación considerable con las plaquetas en reposo. Con mayores cantidades de plaquetas, la estimulación con las plaquetas en reposo incluso excede la obtenida con las plaquetas activadas en cantidades equivalentes.

Ejemplo 38

Efecto de FVII/FVIIa y las concentraciones de las construcciones de direccionamiento-TF sobre la estimulación de la activación de FX en plaquetas activadas. Una proteína de fusión de TF dirigida a TLT-1 con un supuesto efecto pro­ coagulante en pacientes con hemofilia debe ser capaz de funcionar en las condiciones que prevalecen en condicio­ nes fisiológicas y basarse en la composición FVII/FVIIa en la sangre. Con el ensayo descrito en el Ejemplo 36 fue posible examinar el efecto estimulador de las proteínas de fusión de TF sobre la activación de FX mediada por FVIIa en plaquetas activadas a varias concentraciones de FVII/FVIIa (Figura 11) y a varias concentraciones de la proteína de fusión TF (Figura 12). La estimulación se obtuvo en presencia de rFVIIa o rFVII añadidos como se indica en las figuras.

Los resultados de la Figura 11 muestran que la activación de FX a una concentración fija de la proteína de fusión TF depende de FVII/FVIIa y se estimula de una manera dependiente de la concentración con estimulación máxima en el intervalo fisiológico relevante (FVII ~ 10 nM). Los resultados también confirman que la estimulación marcada obteni­ da con una proteína de fusión TF requiere activación plaquetaria y que el FVII así como también el FVIIa inducen estimulación. Además, los resultados demuestran el requisito para el direccionamiento al mostrar que se obtuvo una estimulación marcada con la fusión de hTF.1-219 a un fragmento Fab anti TLT-1 pero no cuando se fusionó TF a un fragmento Fab equivalente sin direccionamiento.

A una concentración fija de FVII/FVIIa (10 nM) la figura 12 examina la estimulación obtenida con la proteína de fu­ sión 0070 Fab-hTF, 1-219 en función de su concentración. Además, la Figura 12 compara este efecto con la estimu­ lación inducida por varias concentraciones de hTF.1-219 o una proteína de fusión control 0094 isotipo Fab-hTF.1-219. Los datos demuestran que se obtuvo una estimulación marcada en un amplio intervalo de concentración de la proteína de fusión 0070 Fab hTF.1-219, y nuevamente demuestran la superioridad de una proteína de fusión TF de direccionamiento con relación a las proteínas de fusión sin direccionamiento hTF.1-219 y control 0094 isotipo FabhTF.1-219. La proteína de fusión 0070 Fab hTF.1-219 indujo una estimulación procoagulante a lo largo de un inter­ valo de concentración grande y no fue anticoagulante a altas concentraciones. Esto estuvo en contraste con las pro­ teínas de fusión AV-TF que se observó que eran anticoagulantes a altas concentraciones (Huang X y otros 2006. Blood 107, 980-986).

Ejemplo 39

Preparación de vesículas PS:PC 20:80 y clonación, expresión, replegamiento y relipidación de TLT-1. El TLT-1 relipidado en vesículas PS:PC 20:80 se preparó mediante el uso de Triton X-100 como detergente como se describió en Smith y Morrissey (2005) J. Thromb. Haemost., 2, 1155-1162 excepto que se usó TLT-1 en lugar de TF.

Materiales

Medio LB de Sub. Lab. Ba. Kanamicina (50 mg/ml). Kanamicina Sigma K-0254 IPTG 1000 mM (IPTG Sigma I-6758)

Tampón de lisis: Bugbuster 1x (Novagen) en Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0. Añadir lisozima 0,5 mg/ml DNAseI. Añadir coctel inhibidor completo 1x (Roche)

Tampón de lavado IB 1: 1:10 bugbuster en tampón IB. Añadir lisozima 50 pg/ml coctel inhibidor completo 0,5x (Roche)

Tampón de lavado IB 2: 1:10 Bugbuster en tampón IB

Tampón IB: Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 2 mM, pH 8,0

Tampón GndHCl: Guanidinio HCl 6 M, Tris-HCl 50 mM, NaCl 50 mM, Triton X-100 red. al 0,1 %, pH 8,0 Tampón de replegado: Tris-HCl 50 mM, Arginina 800 mM, Triton X-100 red. al 0,1 %, glutatión reducido 5 mM, glutatión oxidado 0,5 mM pH 8,5

Tampón de diálisis: Tris-HCl 20 mM, Triton X-100 Red. al 0,1 %, pH 8,0

DTT:glutatión reducido (Sigma G4251) glutatión oxidado Sigma G4376

PC:10 mg/ml de L-a-fosfatidilcolina (huevo, pollo) en cloroformo (Avanti Polar Lipids Inc.) Núm. de catálogo 840051C. Mw 760,09

PS: 10 mg/ml de sal sódica de L-a-fosfatidilserina (cerebro, porcino) en cloroformo. (Avanti Polar Lipids Inc.) Núm. de catálogo 840032C. Mw 812,05

Triton X-100: Triton X-100 al 10 %, hidrogenado, detergente de grado proteico, filtrado esterilizado. Calbiochem. Núm. de catálogo 648464 Concentración 159 mM (Mw 628)

Tampón HBS: HEPES 50 mM, NaCl 100 mM, pH 7,4

Bioperlas: Bio-Beads SM2 Adsorbent, malla 20-50 BioRad Laboratories, Núm. de catálogo 152-3920.

Método

Expresión: El TLT-1 (TLT-1 18-188; SEQ ID NO 182), que incluye dominio extracelular, enlazador y dominio transmembrana, se clonó en pET24a mediante el uso de los cebadores 1004 (SEQ ID NO 183) y 1005 (SEQ ID NO 184) y pTT-hTLT-1 como molde. Se emplearon técnicas estándar para la preparación del ^a DN.

La transformación se realizó en BL21 (DE3). Cultivo durante toda la noche: se mezclaron 1 x 50 ml de medio LB en matraces de 250 ml (plásticos) y 50 pl de Kanamicina 50 mg/ml 1 colonia (transformación) a partir de la pla­ ca de BL21. El cultivo se incubó ON a 37 oC, 220 rpm. Cultivo iniciador: se añadieron 2 x 500 ml de medio LB en matraces de 2 l (plásticos) con 300 pl de Kanamicina a 50 mg/ml. Se añadieron 10 ml del cultivo ON del reborde de TLT-1/pET24a en BL21 (DE3) y se dio seguimiento a la OD600. Se incubó a 37 oC, 220 rpm

Inducción: 2 x 500 ml con reborde de TLT-1/pET24a ~ BL21 (DE3) en LB. Al cultivo celular se le añadió IPTG ~ 0,2 mM (100 pl de 1 M) a 25 °C cuando la OD⁶⁰⁰ alcanzó entre 0,6 - 0,8. Esto se incubó durante 3 h a 25 °C, a 220 rpm. El cultivo se cosechó después de 3 h y se centrifugó durante 30 min a 4600 rpm. El sobrenadante se desechó. El sedimento se almacenó a -20 °C.

Lisis de los cuerpos de inclusión: El sedimento de E. coli se resuspendió en 5 ml de tampón de lisis/g de sedi­ mento. Se añadió MgSO4 hasta 5 mM para respaldar la actividad ADNseI. La suspensión celular se incubó en plataforma de agitación durante 20 min a temperatura ambiente. El lisado se aclaró mediante centrifugación a 20 000 g (8500 rpm) durante 20 min a 4 °C. El sedimento se resuspendió en 100 ml de tampón de lavado IB. La suspensión se mezcló mediante agitación suave en vórtex y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. La suspensión se centrifugó a 20000 g durante 20 min a 4 °C para recoger los cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión se resuspendieron en 100 ml de tampón de lavado IB 2. La muestra se centrifugó a 20000 g durante 20 min a 4 °C para recoger los cuerpos de inclusión. El sedimento se resuspendió en 100 ml de agua y se centrifugó a 20000 g durante 20 min a 4 °C para recoger los cuerpos de inclusión.

Replegado:_El sedimento se solubilizó nuevamente en x ml de tampón GdnHCl (20 ml). La concentración final del TLT-1 (se midió la A280) fue de 1-2 mg/ml. Se añadió DTT (400 pl) hasta una concentración final de 20 mM. La solubilización completa se aseguró mediante agitación magnética durante ~ 1-2,5 horas (1,5 h) a temperatura ambiente. El material insoluble se eliminó mediante centrifugación a 20000 g durante 20 min. Se usó una bomba peristáltica lenta (durante toda la noche) para transferir la solución de GdnHCl/proteína (20 ml) al tampón de re­ plegado >20x (400 ml) a 4 °C. El tampón de replegado se agitó rápidamente para asegurar la dilución rápida. La corrida de la bomba se obtuvo a un régimen de flujo 1x, velocidad 2,5, 4 °C y se dejó durante toda la noche a 4 °C. La proteína precipitada se eliminó por centrifugación a 20 000 g (8500 rpm) en tubos de 50 ml durante 30 min. El reborde de TLT1 se concentró de 400 ml a 120 ml en el filtro Amico de 76 mm de diámetro, 10 000 MWCO a 4,5 bar. La proteína se revisó en un SDS-Page mediante precipitación con EtOH debido al GdnHCl en la muestra. Se concentraron 2x 500 pl y 2x 25 pl en tubos de 0,5 ml con 10000 MWCO. Se mezclaron 50 pl de la muestra 9 vol. de EtOH frío al 99 % (450 pl) y se colocó a -20 °C durante 10 min. La muestra se centrifugó a una velocidad máxima de 13000 rpm durante 5 min. Se descartó el sobrenadante. El sedimento se lavó con 450 pl de EtOH frío al 96 % 50 pl de MQ. Centrifugar nuevamente. Dejar secar (el EtOH debe eliminarse comple­ tamente antes del SDS-PAGE). Se resuspendieron 100 pl con tampón de muestra 1x

Preparación de PS:PC y relipidación:Se siguió el protocolo exacto descrito en Smith SA y Morrissey JH (2004) “Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes”. J. Thromb. Haemost. 2:1155-1162 para la relipidación de TLT-1.

Ejemplo 40

Establecimiento de un ensayo de detección de activación de FX basado en vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1. El uso de plaquetas recién purificadas como se describió en el Ejemplo 37 es muy adecuado para demostrar la prueba de principio. Sin embargo, no es óptimo con plaquetas activadas de donantes individuales para cribar y clasificar series más grandes de proteínas de fusión de T^f con direccionamiento a TLT-1. Cada preparación de pla­ quetas permite que se realice un número limitado de pruebas y también está sujeta a variaciones entre donantes. Se establece un ensayo alternativo de detección de activación de FX mediante el uso de vesículas fosfolipídicas enri­ quecidas con TLT-1 en lugar de plaquetas purificadas activadas. La superficie de las vesículas se compone para imitar la composición fosfolipídica de las plaquetas activadas.

La viabilidad del ensayo de activación de FX para medir la estimulación por las proteínas de fusión de TF con direc­ cionamiento a TLT-1 se probó como se muestra en la Figura 13 y proporcionó la base para las condiciones usadas para el cribado de las construcciones. Se mezclaron rFVIIa/rFVII 100 pM con varias concentraciones (0 - 200 nM) de hTF.1-219 o la proteína de fusión 0070 Fab-hTF,1-219 o una proteína de fusión control 0094 isotipo Fab-hTF y con FX 175 nM (Enzyme Research, factor X humano, HFX 3170 PAL) en Hepes 50 mM, NaCl 0,1 M, CaCh 5 mM, BSA a 1 mg/ml pH 7,4 a temperatura ambiente en presencia de la preparación de vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1 a una dilución de 1:2000. La activación de FX se detuvo después de 10 minutos cuando se retiró una alícuota de cada pocillo y se añadió a un volumen igual de tampón de parada frío (Hepes 50 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 20 mM, BSA 1 mg/ml pH 7,5). La cantidad de FXa generada en las muestras se determinó luego en un ensayo cromogénico mediante la transferencia de 50 pl de la mezcla a un pocillo de placa de microtitulación y mediante la adición de 25 pl de Cromozima X (0,42 mg/ml final) al pocillo. La absorbancia se midió continuamente a 405 nm en un lector de microplacas (Molecular Devices).

Los datos en la Figura 13 muestran una copia esencial del patrón obtenido con plaquetas activadas, nosotros solo observamos una activación de FX inespecífica por TLT-1 con las proteínas de fusión mAb hTF.1-219 a altas concen­ traciones de FVII/FVIIa (datos no mostrados). Por lo tanto, en el ensayo de detección se aplicó FVII/FVIIa 0,1 nM con proteína de fusión Fab TF.1-21910 nM y FVII/FVIIa 0,1 nM con proteína de fusión mAb TF.1-2191,0 nM.

Ejemplo 41

El cribado de las proteínas de fusión de TF para determinar las condiciones óptimas para la fusión con mAb anti-TLT-1 o sus fracciones es útil para la selección de candidatos a fármacos. El ensayo con vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1 permitió un cribado integral de una serie grande de proteínas de fusión de TF. La confiabili­ dad de los datos obtenidos por este cribado también se probó en comparación con los datos obtenidos con el méto­ do de activación de FX aplicado en el ejemplo 41. Con cada preparación de plaquetas activadas, se comparó la es­ timulación obtenida con la estimulación obtenida con la proteína de fusión 0020 Fab-hTF.1-219 establecida como el 100 %. La misma escala relativa se usó para el ensayo con vesículas fosfolipídicas enriquecidas con TLT-1. Los resultados de dicho cribado se comparan en la Figura 27A (proteínas de fusión con mAb) y 27B (proteínas de fusión con Fab).

Los datos muestran que la estimulación de la activación mediada por FVII/FVIIa dirigida a proteínas expuestas en plaquetas activadas se obtuvo con una variedad de proteínas de fusión hTF.1-219.

La eficacia relativa de cuatro epítopos diferentes en TLT-1 para mediar el direccionamiento de TF se analizó con proteínas de fusión de TF en las cuales se fusionaron diferentes fragmentos de mAb o Fab con restos idénticos de enlazador-hTF.1-219. La comparación de las proteínas de fusión mAb/Fab 0012, 0023, 0051 y 0052 muestra la si­ guiente clasificación de potencia procoagulante: 0012 > 0051 > 0052 = 0023.

Adicionalmente, la Figura 27A/B permite una clasificación de la potencia procoagulante de TF fusionado a un mAb completo o a varias partes o composiciones de este mAb mientras todavía conserva su afinidad por el epítopo de TLT-1 intacto. La comparación de construcciones idénticas del enlazador-hTF, 1-219 fusionadas con un mAb o un fragmento Fab muestra que las proteínas de fusión Fab-enlazador-hTF.1-219 son superiores a las proteínas de fu­ sión mAb-enlazador-hTF.1-219. Igualmente, las proteínas de fusión Fab-hTF.1-219 también son superiores a los heterodímeros en los cuales las proteínas de fusión hTF.1-219 se obtienen por fusión de hTF.1-219 al extremo C de una de las dos HC o una de las dos LC del mAb.

La fusión de hTF.1-219 al extremo N o al extremo C de las cadenas pesadas o ligeras de anticuerpos también se prueba mediante la comparación de proteínas de fusión de TF equivalentes de cualquier otra manera. Los datos sugieren que la fusión al extremo C es superior a la fusión al extremo N.

La comparación de proteínas de fusión de TF equivalentes en las cuales solo varía el enlazador entre TF y se varía el fragmento de mAb/Fab, también proporciona una clasificación de los enlazadores útil para la selección de candi­ datos a fármacos.

Los receptores de plaquetas distintos de TLT-1 también pueden alcanzarse con proteínas de fusión de TF para ob­ tener la activación de FX mediada por FVII/FVIIa en plaquetas activadas. Esto se demostró con las proteínas de fusión de TF 0128 y 0129 producidas por la fusión de TF con el fragmento de AP3 Fab. El AP3-Fab se dirigió hacia el receptor GPlIblIIa que está presente en la superficie de las plaquetas activadas y en reposo (Phillips, D. R., y Agin, P. P. (1977) J. Biol. Chem. 252, 2121-226). Las proteínas de fusión de TF 0128 Fab-hTF.1-219 y 0129 FabhTF.1-219 estimularon fuertemente la respuesta en las plaquetas activadas. Sin embargo, la respuesta con plaque­ tas en reposo es aproximadamente el 20 % de la respuesta con plaquetas activadas en condiciones donde, en com­ paración, la respuesta inducida por la proteína de fusión de TF dirigida a TLT-1, 0020 Fab-hTF.1-219, con plaquetas en reposo es el 8 % de la respuesta con plaquetas activadas. Es concebible que el patrón de estimulación obtenido con las proteínas de fusión de TF es un resultado de tres factores principales: i) densidad del receptor en las plaque­ tas y exposición superficial relativa en las plaquetas en reposo y activadas, ii) exposición superficial de fosfolípidos ácidos y iii) un mínimo de activación espontánea de plaquetas durante la preparación de plaquetas lavadas, en repo­ so. La presencia del receptor de GPlIblIIa en la superficie de las plaquetas en reposo podría ser responsable de una actividad relativamente alta de las proteínas de fusión de TF y AP3 en las plaquetas en reposo. Las proteínas de fusión basadas en anticuerpos contra los receptores de plaquetas de importancia crucial para la hemostasia, como GPIIbIIIa, también tienen probabilidades de poseer propiedades antagonistas y servir como anticoagulantes a altas concentraciones.

Ejemplo 42

Las proteínas de fusión de TF promueven la formación de coágulos de fibrina en sangre total similar a la hemofílica. Las condiciones similares a hemofilia A se obtuvieron mediante incubación de sangre total humana normal estabili­ zada con citrato (HWB) con 10 gg/ml de anticuerpo anti-FVIII (anti-Factor VIII humano generado en oveja; Hematologic Technologies Inc) durante 30 min a temperatura ambiente. La coagulación espontánea tras la recalcificación de HWB con citrato se inhibió fuertemente por la presencia del anticuerpo anti-FVIII. La proteína de fusión TF se añadió a HWB para demostrar la capacidad de estas proteínas para revertir las condiciones similares a la hemofilia induci­ das por la adición de anticuerpo anti-FVIII a HWB.

La formación de coágulos se midió mediante tromboelastografía (analizador TEG serie 5000, Haemoscope Corpora­ tion, Niles, IL, EE.UU.). Se añadieron varias concentraciones (0; 0,02; 0,1; 0,2; 1,0; 10 nM) de proteína de fusión de TF 0070, proteína de fusión de TF 0094 o hTF.1-219 a HWB con citrato similar a la hemofilia. La coagulación se inició cuando se transfirieron 340 pl de HWB normal o premezclada a una copa del tromboelastógrafo que contiene 20 pl de CaCl² 0,2 M. El trazo de TEG se siguió continuamente por hasta 120 min. Se registraron las variables de TEG siguientes: Tiempo R (tiempo de coagulación, es decir, el tiempo desde el inicio de la coagulación hasta que se obtuvo una amplitud de 2 mm), ángulo a (desarrollo del coágulo medido como el ángulo entre el valor de R y el pun­ to de inflexión del trazo de TEG), K (velocidad de la cinética del coágulo para alcanzar un cierto nivel de resistencia del coágulo, amplitud = 20 mm), y MA (amplitud máxima del trazo de TEG que refleja la resistencia mecánica máxi­ ma del coágulo). Los trazos de ^t E^g obtenidos con sangre normal HWB (NWB), sangre "hemofílica” y sangre “hemo­ fílica” suplementada con (0; 0,02; 0,1; 0,2; 1,0; 10 nM) de la proteína de fusión 0070 Fab-hTF.1-219 se muestran en la Figura 14A. En la Figura 14B se muestran los valores de tiempo R obtenidos para los trazos de TEG representa­ dos. La Figura 14B, además de los valores de tiempo R para la proteína de fusión 0070 Fab-hTF.1-219, también incluye los valores de tiempo R para concentraciones equivalentes de hTF.1-219 y la proteína de control de fusión 0094 isotipo de Fab hTF.1-219 sin direccionamiento. Todos los datos se obtuvieron a partir de un donante represen­ tativo.

Se observó que la proteína de fusión 0070 Fab-hTF.1-219 normalizaba eficientemente la coagulación de HWB simi­ lar a la hemofilia. El efecto procoagulante en HWB similar a la hemofilia, del direccionamiento de TF a TLT-1, se de­ muestra con la proteína de fusión 0070 Fab-hTF.1-219 en comparación con el efecto obtenido con la proteína de fusión 0094 isotipo de Fab hTF.1-219 en la que TF se fusiona con un Fab control que no se une.

Ejemplo 43

TLT1-Fab0043-TF redujo el sangrado de la cola en ratones con inactivación de FVIII transfundidos con plaquetas humanas. El efecto de una construcción TLT-1-Fab0043-TF se probó en un modelo de sangrado por la cola en rato­ nes hemofílicos (ratones con inactivación de FVIII) transfundidos con plaquetas humanas.

La sangre humana venosa se extrajo en dextrosa de citrato ácido (ACD; 1,7 ml/10 ml). La sangre se incubó con 50 ng/ml de PGE¹ durante 10 min a temperatura ambiente (RT), seguido de centrifugación (200 g; 10 min). Se recogió el plasma rico en plaquetas (PRP) y se incubó con 50 ng/ml de PGE¹ durante 10 min a RT, seguido de centrifuga­ ción a 450 g durante 10 min a RT. El plasma se eliminó y el sedimento de plaquetas se resuspendió en plasma hasta una concentración de 1,1-2,8109 plts/ml.

Los ratones se anestesiaron con pentobarbital y se cateterizaron. Los ratones se trataron previamente con 1 nmol/kg de TLT1-Fab0043-TF (5 ml/kg; n=7) o ATNP-FAb-TF (control; FAb-TF0095-construcción irrelevante; n=8) a través del catéter. Después de 3 minutos se transfundieron las plaquetas humanas (como PRP) a los ratones (1,1 -2,8 x 108 plaquetas/ratón; 5 ml/kg), y después de otros 2 minutos se indujo la hemorragia de la cola seguida de un período de observación de 30 minutos. La pérdida de sangre se midió como la cantidad de hemoglobina perdida. Un minuto después de la transfusión de plaquetas, 6,5 y 7,5 % de la población total de plaquetas fue humana en el grupo con­ trol y en el grupo tratado con TLT1-FAb-TF, respectivamente.

El TLT1-FAb-TF redujo significativamente la pérdida de sangre de 3956±447 a 1180±489 nmol de hemoglobina (p<0,01).

Ejemplo 44

Análisis de la unión de fibrinógeno a TLT1 y competencia de unión entre los mAb contra TLT1 y el fibrinógeno. TLT-1 se une al fibrinógeno, como se probó mediante análisis de SPR. Además, se analizó la unión simultánea del fibrinó­ geno y cada uno de los cuatro mAb: mAb0012, mAb0023, mAb0051 y mAb0062 mediante análisis de SPR en un instrumento Biacore T100.

Los materiales usados se muestran en la Tabla 11.

Tabla 11

Método:

El TLT1 humano se inmovilizó a un nivel de aproximadamente 1000 RU en un chip CM5 (50 pg/ml diluido en acetato de Na, pH 4,0) mediante el uso del procedimiento estándar recomendado por el proveedor. Se analizaron diluciones de cuatro veces del fibrinógeno humano desde 200 nM a 0,2 nM para la unión a TLT1 inmovilizado. Tampón de co­ rrida y de dilución: HEPES 10 mM, 150 mM, p20 al 0,005 %, pH 7,4. La regeneración se obtuvo mediante glicina 10 mM, pH 1,7. La determinación de las constantes cinéticas y de unión (kon, koff, Kd) se obtuvo al asumir una interac­ ción 1:1 del TLT1 y el fibrinógeno mediante el uso del programa informático de evaluación Biacore T100.

La competencia de los diferentes mAb por la unión a TLT1 y al fibrinógeno simultáneamente se analizó mediante la inmovilización de cada uno de los mAb a aproximadamente 10000-15000 RU en un chip CM5 seguido de la unión de TLT1 50 nM seguido después de disociación de 2-3 min mediante la variación de las concentraciones de los mAb a analizar para la competencia. La regeneración del chip se obtuvo mediante Glicina 10 mM, pH 1,7.

Resultados:

Tabla 12. Unión de TLT1 al fibrinógeno

Tabla 13. Competencia con fibrinógeno. El mAb de interés se inmovilizó en un chip. La adición del TLT1 se siguió por el fibrinógeno (un sándwich).

Conclusión:

El fibrinógeno (HCI-0150R) se une al fibrinógeno. mAb0023 y mAb0062 compiten con este sitio de unión. mAb0012 y mAb0051 no compiten.

Ejemplo 45

Mapeo de epítopos por espectrometría de masa de intercambio de hidrógeno (HX-MS). La técnica HX-MS se ha empleado para identificar los epítopos de unión a TLT-1 cubiertos por los cuatro anticuerpos monoclonales mAb0023, mAb0051, mAb0062 y mAb0061.

Para los experimentos de mapeo se usaron hTLT-1.20-125, hTLT-1.16-162 y hTLT-1.126-162 correspondientes a las SEQ ID NO 5, 6 y 7, respectivamente. Todas las proteínas se sometieron a intercambio en tampón a PBS pH 7,4 antes de los experimentos.

Método: Experimentos de HX-MS.

Instrumentación y registro de datos

Los experimentos de HX se automatizaron mediante un robot Leap (H/D-x PAL; Leap Technologies Inc.) operado mediante el programa informático LeapShell (Leap Technologies Inc.), que realizó el inicio de la reacción de inter­ cambio de deuterio, el control del tiempo de reacción, la reacción de inactivación, la inyección en el sistema UPLC y control del tiempo de digestión. El robot Leap se equipó con dos estantes con temperatura controlada mantenidos a 20 °C para el almacenamiento del tampón y reacciones de HX y mantenidos a 2 °C para el almacenamiento de la proteína y la solución de inactivación, respectivamente. El robot Leap contenía además una unidad Trio VS enfriada (Leap Technologies Inc.) que contenía las columnas de pepsina-, pre- y analíticas, y la tubería de LC y las válvulas de conmutación a 1 °C. Las válvulas de conmutación se han mejorado de HPLC a válvulas de conmutación UHPLC Microbore (Cheminert, VICI AG). Para la digestión con pepsina en línea, se cargaron 100 pl de la muestra inactivada que contiene 200 pmol del TLT-1 y se pasaron sobre un cartucho de pepsina inmovilizada Poroszyme® (2,1 x 30 mm (Applied Biosystems)) mediante el uso de un régimen de flujo isocrático de 200 pl/min (ácido fórmico 0,1 %:CH³Cⁿ 95:5). Los péptidos resultantes se atraparon y se desalinizaron en una precolumna VanGuard BEH C18 1,7 pm (2,1 x 5 mm (Waters Inc.)). Subsecuentemente, las válvulas se conmutaron para colocar la precolumna en línea con la columna analítica, UPLC-BEH C18 1,7 pm (2,1 x 100 mm (Waters Inc.)), y los péptidos se separaron mediante el uso de un gradiente de 9 min de B 15-40 % suministrado a 150 pl/min desde un sistema AQUITY UPLC (Waters Inc.). Las fases móviles consistieron en A: ácido fórmico al 0,1 % y B: ácido fórmico al 0,1 % en CH³CN. Los datos de ESI MS, y las adquisiciones de MS/MS dependientes de datos separados (CID) y los experimentos de energía elevada (MSE) se adquirieron en modo ion positivo mediante el uso de Q-Tof Premier MS (Waters Inc.). La leucina-encefalina se usó como la masa de bloqueo (ion ([M+H]+con m/z 556,2771) y los datos se recogieron en modo continuo.

Análisis de datos

Los péptidos pépticos se identificaron en experimentos separados mediante el uso de los métodos estándar CID MS/MS o MSE (Waters Inc.). Los datos de MSE se procesaron mediante el uso de BiopharmaLynx 1.2 (versión 017). La adquisición de MS/MS dependiente de datos de CID se analizó mediante el uso del programa informático MassLynx y la base de datos MASCOT producida internamente.

Los archivos de datos primarios de HX-MS se sometieron a corrección continua con masa de bloqueo. El análisis de datos, es decir, la determinación centroide de los péptidos deuterados y la graficación de las curvas de intercambio, se realizó mediante el uso de HX-Express ((versión Beta); Weis y otros, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 17, 1700 (2006)).

Mapeo de epítopos de mAb 0023:

El intercambio de hidrógeno/deuterio (HX) de amida se inició mediante una dilución de 30 veces del hTLT-1.20-125 en presencia o ausencia del mAb 0023 en el tampón deuterado correspondiente (es decir PBS preparado en D²O, 96 % de D²O final, pH 7,4 (valor no corregido)). Todas las reacciones de HX se llevaron a cabo a 20 °C y contenían hTLT-1.20-1254 pM en ausencia o presencia de mAb 00232,4 pM lo que proporcionó un exceso molar de 1,2 veces de sitios de unión a mAb. En intervalos de tiempo adecuados que varían de 10 segundos a 8 horas, las alícuotas de la reacción de HX se inactivaron con un volumen igual de tampón de inactivación frío (TCEP 1,35 M) que dio como resultado un pH final de 2,6 (valor no corregido).

Mapeo de epítopos de los mAb 0051 y 0062:

El mapeo de epítopos de mAb0051 y mAb0062 se realizó en un experimento separado mediante el uso del hTLT-1.20-125 y se llevó a cabo de manera similar al mapeo de mAb 0023 como se describió anteriormente.

Mapeo de epítopos de mAb 0061:

El mapeo de epítopos de mAb 0061 se realizó en dos experimentos separados mediante el uso de la proteína hTLT-1.16-162 o del péptido hTLT-1.126-162.

Los experimentos se realizaron de manera similar a como se describió anteriormente para mAb 0023. No obstante, la columna de pepsina se colocó a temperatura ambiente para los experimentos que usaron el hTLT-1.126-162. Esto da como resultado un aumento de la eficacia de digestión de pepsina con una pérdida mínima de intercambio adi­ cional.

Resultados

Mapeo de epítopos de mAb 0023

El curso de tiempo de HX de 20 péptidos, que cubre el 100 % de la secuencia primaria del TLT-1, se monitoreó en presencia y ausencia de mAb 0023 por 10 segundos hasta 8 horas.

El patrón de intercambio observado en presencia o ausencia de mAb 0023 puede dividirse en dos grupos diferentes: Un grupo de péptidos de TLT-1 muestran un patrón de intercambio que no se afecta por la unión de mAb 0023 y otro grupo de péptidos TLT-1 que muestran protección a partir del intercambio tras la unión a mAb 0023. Las regiones que muestran protección tras la unión a mAb 0023 abarcan péptidos que cubren los residuos del TLT-1 36-51, 79-91 y 105-120. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido, el epítopo para mAb 0023 puede estrecharse para los residuos 36-47, VQCHYRLQDVKA (50 %), 82-87, LGGGLL (30 %), 108-115, GARGPQIL (20 %) con la protección de intercambio relativo para cada segmento señalado entre paréntesis. Una visión general del mapa del péptido para el epítopo 0023 se muestra en la figura 16.

Mapeo de epítopos de mAb 0051

El curso de tiempo de HX de 22 péptidos, que cubre el 100 % de la secuencia primaria de TLT-1, se monitoreó en presencia y ausencia de mAb 0051 durante 10 segundos hasta 1000 segundos.

El patrón de intercambio observado en presencia o ausencia de mAb 0051 puede dividirse en dos grupos diferentes: Un grupo de péptidos TLT-1 muestran un patrón de intercambio que no se afecta por la unión de mAb 0051 y un grupo que se afecta. Las regiones que muestran protección tras la unión a mAb 0051 abarcan péptidos que cubren los residuos 52-66, 92-120. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada pépti­ do, el epítopo para mAb 0051 puede estrecharse para los residuos 55-66, LPEGCQPLVSSA (75 %) y 110-120, RGPQILHRVSL (25 %), así como también, una interacción débil en el tramo 92-105. Una visión general del mapa del péptido para el epítopo 0051 se muestra en la figura 17.

Mapeo de epítopos de mAb 0062

El curso de tiempo de HX de 22 péptidos, que cubre el 100 % de la secuencia primaria de TLT-1, se monitoreó en presencia y ausencia de mAb 0062 durante 10 segundos hasta 1000 segundos.

El patrón de intercambio observado en presencia o ausencia de mAb 0062 puede dividirse en dos grupos diferentes: Un grupo de péptidos de TLT-1 muestra un patrón de intercambio que no se afecta por la unión de mAb 0062 y otro grupo de péptidos TLT-1 que muestran protección. Las regiones que muestran protección tras la unión a mAb 0062 abarcan péptidos que cubren los residuos 36-51 y 105-120. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido, el epítopo para mAb 0062 puede estrecharse para 36-47, VQCHYRLQDVKA (60 %) y 110-120, RGPQILHRVSL (40 %). Una visión general del mapa del péptido para el epítopo 0062 se muestra en la figura 18.

Mapeo de epítopos de mAb 0061

El epítopo para mAb 0061 se mapeó en dos experimentos separados mediante el uso de la proteína hTLT-1.16-162 o hTLT-1.126-162.

Para hTLT-1.16-162 los cursos del tiempo de HX de 19 péptidos, que cubren el 85 % de la secuencia primaria del TLT-1, se monitorearon en presencia y ausencia de mAb 0061 durante 10 segundos hasta 8 horas. Debido a una O-glicosilación en el residuo S148, no pudo registrarse la información más allá del residuo 141.

El patrón de intercambio observado en presencia o ausencia de mAb 0061 puede dividirse en dos grupos diferentes: Un grupo de péptidos de TLT-1 muestran un patrón de intercambio que no se afecta por la unión de mAb 0061 y otro grupo de péptidos TLT-1 que muestran protección a partir del intercambio tras la unión a mAb 0061. Las regiones que muestran protección tras la unión a mAb 0061 abarcan los péptidos que cubren los residuos 121-141. Sin em­ bargo, es importante notar que en este experimento no se proporciona información para el residuo 142 y más allá. Al comparar las cantidades relativas de protección de intercambio dentro de cada péptido, el epítopo para mAb 0061 puede estrecharse para comenzar en el residuo 130.

Para obtener información completa sobre el epítopo mAb 0061, el experimento de mapeo se repitió mediante el uso del péptido hTLT-1.126-162. Este péptido se une al mAb 0061 con alta afinidad y no se modifica por glicosilación. Así, debería ser capaz de proporcionar información de HX-MS para toda la región.

El curso de tiempo de HX de 12 péptidos, que cubren toda la región 126-162 del TLT-1 se monitorearon en presen­ cia y ausencia de mAb 0061 durante 10 s hasta 3000 s.

Todos los péptidos en esta región 126-162 desarrollaron protección derivada del intercambio a partir de la unión a mAb 0061. Al comparar las cantidades relativas de protección por intercambio dentro de cada péptido el epítopo para mAb 0061 puede estrecharse para estar dentro de los residuos 130-145, ETHKIGSLAENA. Una visión general del mapa del péptido para el epítopo 0061 se muestra en la figura 19.

Ejemplo 46

Producción, caracterización y análisis de unión de los mutantes de hTLT1 ECD-HPC4 Ala. Las construcciones de mutantes de hTLT-1 ECD-HPC4 alanina se diseñaron de acuerdo con la tabla 7. Las construcciones de expresión se desarrollaron por el contratista externo GENEART AG (Im Gewerbepark B35, 93059 Regensburg, Alemania) y todas las construcciones de expresión se basaron en el vector de expresión denominado pcDNA3.1(+). Las alícuotas de ADN para cada una de las 40 construcciones de expresión de hTLT-1 ECD-HPC4 pcDNA3.1(+) se transfectaron en células en suspensión HEK293-6E con el fin de expresar de manera transitoria cada proteína mutante de hTLT-1 ECD-HPC4 Ala (Tabla 7). La transfección transitoria y el cultivo de las células HEK2936e se realizaron como se describió en el ejemplo A.

Siete días después de la transfección, las células se eliminaron mediante centrifugación y los sobrenadantes que contenían la proteína mutante de hTLT-1 ECD-HPC4 Ala resultante se esterilizaron mediante filtración antes de los análisis. La concentración de la proteína mutante de hTLT-1 ECD-HPC4 Ala expresada en el sobrenadante celular clarificado se determinó mediante el uso de una combinación de RP-HPLC y análisis de SDS-PAGE/Coomassie. Estas variaron de 4 - 40 pg/ml y contenían un grado variable de formación de dímeros. Como se describió anterior­ mente para la producción de la proteína hTLT usada para los experimentos de inmunización, se observaron formas de monómero/dímero de la proteína expresada para todas las construcciones de mutantes hTLT ECD-HPC4 Ala. La concentración relativa de la proteína monomérica/dimérica hTLT1 ECD-HPC4 se estimó mediante SDS-PAGE/Coomassie y se calculó un Mw promedio para cada preparación de mutantes.

Todos los estudios de unión se corrieron a 25 °C, y las muestras se almacenaron a 15 °C en el compartimiento de muestras en un analizador ProteOn (Biorad) que mide las interacciones moleculares en tiempo real mediante reso­ nancia de plasmones superficiales. La señal (RU, unidades de respuesta) informada por el analizador ProteOn se correlaciona directamente con la masa en los puntos de la superficie del chip del sensor individual.

El anticuerpo policlonal anti-hFc se inmovilizó en celdas de flujo separadas de un chip sensor GLM mediante el uso de una mezcla 1:1 de EDAC 0,4 M [hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida] y sulfo-NHS [N-hidroxisulfosuccinimida] 0,1 M. Cada anticuerpo se diluyó en acetato de sodio 10 mM pH 5,0 a una concentración de 50 pg/ml y se inmovilizó en una celda de flujo individual a 30 pl/min durante 240 s. Los anticuerpos se inmovilizaron en celdas de flujo A1-A6 (dirección horizontal). Después de la inmovilización, los sitios activos en la celda de flujo se bloquearon con etanolamina 1 M. El nivel de inmovilización final del anticuerpo de captura varió típicamente de apro­ ximadamente 9000 a 10000 RU en un experimento. La captura de los anticuerpos anti-TLT1 0197-0000-0023, 0197­ 0000-0051, 0197-0000-0061 y 0197-0000-0062 se realizó mediante la dilución a 0,5 pg/ml en tampón HBS-EP (HE-PES 10 mM, NaCl 150 mM, EdTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 %, pH 7,4) y se inyectó a 30 pl/min durante 60 s en dirección vertical, lo que crea puntos de referencia interbandas con anticuerpos anti-Fc humano solamente. El nivel de captura final de los anticuerpos de prueba varió típicamente de aproximadamente 200 a 300 RU en un expe­ rimento. La unión de la proteína hTLT-1 ECD-HPC4 wt o mutante de Ala se llevó a cabo mediante la inyección en celdas de flujo paralelas en dirección horizontal para permitir los análisis comparativos de la unión a diferentes anti­ cuerpos anti-TLT1 capturados con relación a la unión a las referencias de interbanda. Cada proteína hTLT-1 ECD-HPC4 se diluyó hasta 100 nM, basado en el Mw promedio calculado, en tampón HBS-EP y se inyectó a 30 pl/min durante 240 s. El chip GLM se regeneró después de cada ciclo de inyección de analito a través de una inyección de 18 s de ácido fórmico 1 M seguido por una inyección de 18 s de NaOH 50 mM a 100 pl/min. Esta etapa de regenera­ ción eliminó el anticuerpo anti-TLT1 y cualquier TLT1 unido derivado de la superficie del anticuerpo de captura inmo­ vilizado, y permitió la unión posterior del siguiente par de muestras de prueba. El procedimiento de regeneración no eliminó el anticuerpo de captura anti-Fc humano, inmovilizado directamente, de la superficie del chip.

El análisis de datos se realizó mediante el uso del programa informático ProteOn ManagerTM. No se observó unión no específica significativa a las superficies de control interbandas. Las curvas de unión se procesaron mediante referenciación doble (sustracción de las señales de superficie de control interbandas, así como también, inyecciones de tampón blanco sobre los anticuerpos anti-TLT1 capturados). Esto permitió corregir el ruido del instrumento, el cam­ bio de volumen y la deriva durante las inyecciones de muestra. La señal de unión a los 10 s después de detener la inyección del analito se normalizó con respecto al nivel del anticuerpo anti-TLT1 capturado y se presentó como unión con relación a la proteína hTLT-1 ECD-HPC4 wt.

Las mutaciones de Ala siguientes mostraron una disminución significativa de la unión a los respectivos anti-TLT1 en comparación con la proteína hTLT-1 ECD-HPC4 wt. 0197-0000-0051: F54A < 0,4 wt; M91A < 0,2 wt; R117A < 0,2 wt; S119A < 0,6 wt. 0197-0000-0062: R41A < 0,2 wt; L42A < 0,6 wt; Q43A < 0,4 wt; F54A < 0,6 wt; M91A < 0,4 wt; R110A < 0,2 wt; H116A < 0,6 wt. 0197-0000-0023: L42A < 0,2 wt; Q43A < 0,2 wt; K46A < 0,2 wt; M91A < 0,4 wt; R110A < 0,2 wt. Dado que se pudo observar una disminución de la unión para el mutante M91A de hTLT1 ECD-HPC4 para los 4 anticuerpos anti-TLT1, el residuo probablemente tiene una influencia importante sobre la estabilidad de las proteínas en lugar de ser parte de un epítopo real. 0197-0000-0061 no mostró una disminución de la unión a cualquiera de las variantes de TLT-1 mutadas analizadas, lo que indica que el epítopo no está cubierto por los mu­ lantes introducidos en el estudio de unión.

Ejemplo 47

Complejos de estructuras cristalinas entre los péptidos del tallo de TLT-1 y Fab anti-TLT-1.

Expresión de Fab 100 anti-TLT-1 para la cristalización: El fragmento Fab anti-TLT-1, Fab0100, que comprende la cadena pesada que corresponde a la SEQ ID NO: 162 y la cadena ligera que corresponde a la SEQ ID NO: 163, se expresó de manera transitoria en células HEK293 de acuerdo con el procedimiento generalizado.

Purificación del Fab 0100 anti-TLT-1, para la cristalización: La purificación de dicho Fab se realizó mediante un pro­ ceso en dos etapas compuesto por cromatografía de afinidad mediante el uso de la resina kappaSelect (GE Healthcare, núm. de cat. 17-5458-01) y cromatografía de exclusión por tamaño. La purificación se realizó mediante el uso de un sistema de cromatografía ÁktaExplorer (GE Healthcare, núm. de cat. 18-1112-41). Los sistemas tampón usados para la etapa de purificación fueron un tampón de equilibrio compuesto de fosfato de Na 10 mM, pH 7,5 y NaCl 150 mM y un tampón de elución compuesto de ácido fórmico 20 mM, pH 3,0. El sobrenadante se ajustó con NaOH 1 M a un pH de 7,5 y se aplicó sobre una columna kappaSelect equilibrada previamente. La columna se lavó con 5 volúmenes de columna de tampón de equilibrio y la proteína Fab se eluyó isocráticamente mediante el uso de aproximadamente 5 volúmenes de columna de tampón de elución. La proteína Fab se analizó mediante el uso de análisis de SDS-PAGE/Coomassie y LC-MS, que mostraron la obtención de una proteína pura y homogénea con un peso molecular esperado de 46,9 kDa. Para medir la concentración de proteína, se usó un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific) junto con un coeficiente de extinción de 1,31. El acabado final de la proteína Fab se llevó a cabo mediante el uso de una columna de exclusión por tamaño (Superdex200).

Preparación de péptidos para la cristalización: El péptido del tallo de TLT-1 hTLT-1.126-162 (SEQ ID NO 7) se pre­ paró mediante síntesis de péptidos en fase sólida. Igualmente, se preparó una versión más corta hTLT-1.129-142 del péptido del tallo que corresponde a la SEQ ID NO ⁸.

Preparación, cristalización y determinación de la estructura de los complejos Fab0100:TLT-1. Preparación de Fab0100:hTLT-1.126-162: El complejo entre Fab0100 y hTLT-1.126-162 se preparó mediante la adición de un exce­ so molar de dos veces de hTLT-1.126-162 a una solución de Fab anti-TLT-1 seguido por aislamiento del complejo mediante la separación del exceso del hTLT-1.126-162 mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño preparativa. Por lo tanto, el complejo Fab0100: hTLT-1.126-162 se preparó mediante la mezcla de Fab (1100 gl, 98 gM) y hTLT-1.126-162 (155 gl, 1391 gM), ambos en tampón PBS (pH 7,4). El complejo se sometió a filtración en gel mediante el uso de una columna Superdex 200 HighLoad 26/60 (G^e Healthcare) eluida con tampón PBS (pH 7,4) a un régimen de flujo de 1 ml/min. Se recogieron las fracciones correspondientes a un volumen de 3 ml. Las fracciones que contenían el complejo Fab0100: hTLT-1.126-162 deseado se agruparon y después se concentraron mediante el uso de un dispositivo de filtro centrífugo (Amicon, valor límite de 10 kDa) a una concentración de proteína de ^{8 , 6} mg/ml. Esta preparación se usó para la cristalización del complejo Fab0100:hTLT-1.126-162.

Preparación de Fab0100:hTLT-1.129-142: El complejo entre el Fab anti-TLT-1 y el péptido del tallo más corto (hTLT-1.129-142) se preparó de manera similar con las excepciones de que la relación molar entre hTLT-1.129-142 y Fab fue 1,5:1 y que la detención de la filtración en gel se omitió debido a la unión más débil del hTLT-1.129-142 en com­ paración con la del péptido de tallo más largo (hTLT-1.126-162).

Cristalización y recogida de datos de los complejos Fab0100:hTLT-1.129-142 y Fab0100:hTLT-1.126-162: Los com­ plejos Fab0100:hTLT-1.129-142 y Fab0100:hTLT-1.126-162 se cristalizaron a temperatura ambiente por el método de gota posada. El Fab0100:hTLT-1.129-142 se cristalizó mediante la adición a la solución de proteína, en una rela­ ción de volumen de ^{1 : 2} (precipitante:proteína), una solución de precipitación que contenía dihidrógeno fosfato de potasio 0,04 M, PEG 8000 al ¹⁶ % p/v y glicerol al 20 %, mientras que el complejo Fab0100:hTLT-1.126-162 se cris­ talizó mediante la adición a la solución de proteína, en una relación de volumen de ^{1 :1} (precipitante:proteína), una solución de precipitación que contenía PEG 10 000 al 20 % p/v y Hepes 0,10 M pH 7,5. Un cristal del complejo Fab0100:hTLT-1.129-142 se congeló inmediatamente en N² líquido y durante la recogida de datos se mantuvo a 100 K mediante una corriente de gas de N² criogénica. Los datos cristalográficos se recogieron subsecuentemente a una resolución de 2,14 A mediante el uso de un ánodo giratorio Rigaku MicroMax-007 HF y un detector de rayos X marCCD 165. La determinación del grupo separador, la integración y el escalado de los datos se realizaron mediante el paquete de programa informático XDS (Kabsch,W. (1993) J. Appl. Crystallogr.26, 795-800). Se determinó que los parámetros de celda del cristal eran 82,10, 64,99, 107,73 A, 90°, 95.12° y 90°, para a, b, c, a, p y ^y respectivamente, y se determinó que el grupo separador era C2. Se calculó que el Rsym para las intensidades del conjunto de datos era 6,5 %. Las coordenadas de un modelo de Fab de la estructura de 1NGZ depositada en la PDB (Berman, H.M. y otros, (2000) Nucleic Acids Res.28, 235-242) (Yin, J. y otros, PNAS us100, 856-861) se usaron para la determina­ ción de la estructura de la molécula Fab anti-TLT-1. El modelo de Fab de 1NGZ se dividió en dos dominios, los do­ minios variable y constante, que después se usaron como modelos de búsqueda independientes en un reemplazo molecular ejecutado por el programa informático PHASER (Mccoy, A.J. y otros, Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography 61, 458-464; Mccoy, A.J. y otros, J. Appl. Crystallogr. 40, 658-674) del paquete CCP4 (Bailey,S. (1994) Acta Crystallogr. Sect. D-Biol. Crystallogr. 50, 760-763). El paquete de programas informáticos ARP-wARP (Evrard,G.X. y otros, Acta Crystallographica Sección D63, 108-117) se usó subsecuentemente para la construcción y sincronización de modelos automatizados. Se aplicaron refinamientos cristalográficos adicionales, mediante el uso del programa informático REFMAC5 (Murshudov,G.N. y otros, Acta Crystallogr. Secc. D-Biol. Crystallogr.53, 240-255), seguido por inspección gráfica computarizada de los mapas de densidad electrónica, corrección y construcción de modelos, mediante el uso del programa informático C^{o o t} (Emsley,P. y otros, Acta Crystallogr. Secc. D-Biol. Crystallogr.60, 2126-2132). El procedimiento se sometió a ciclos hasta que no se pudieron hacer mejo­ ras significativas adicionales al modelo. Los valores finales calculados de R y R libre después de 3 ciclos de inter­ vención manual y después de los refinamientos fueron 0,185 y 0,245, respectivamente, y el modelo mostró una des­ viación cuadrática media (RMSD) de las longitudes de unión ideales de 0,022 A.

Un cristal del complejo Fab0100:hTLT-1.126-162 se transfirió a una criosolución que contenía 75 % de la solución precipitante y 25 % de glicerol. El cristal se dejó en remojo durante aproximadamente 15 segundos, después se con­ geló inmediatamente en N² líquido y durante la recogida de datos se mantuvo a 100 K mediante una corriente de gas N² criogénica. Los datos cristalográficos se recogieron subsecuentemente a una resolución de 1,85 A en la línea de haz BL911-3 (Ursby, T. y otros (2004) AIP Conference Proceedings 705, 1241-1246) en MAX-lab, Lund, Suecia. La determinación del grupo separador, la integración y el escalado de los datos se realizaron en el paquete de progra­ ma informático ^{x d s} . Se determinó que los parámetros de celda para los datos del sincotrón eran 82,54, 65,32, 108,05 A, 90°, 95,15° y 90°, para a, b, c, a, p y ^y respectivamente, y se determinó que el grupo separador era C2. Se calculó que el Rsym para las intensidades del conjunto de datos era 6,7 %. El cristal fue isomórfico con los cristales de Fab0100:hTLT-1.129-142 y, por lo tanto, el refinamiento del cuerpo rígido del complejo Fab0100:hTLT-1.129-142 se usó para la sincronización original del Fab0100:hTLT-1.126-162 seguido por la construcción y sincronización de modelos automatizados mediante el uso del paquete de programa informático ARP-wARP. Se aplicaron refinamien­ tos cristalográficos adicionales, mediante el uso del programa informático REFMAC5, seguido por inspección de los gráficos computarizados de los mapas de densidad electrónica, corrección y construcción de modelos, mediante el uso del programa informático C^{o o t} . El procedimiento se sometió a ciclos hasta que no se pudieron hacer mejoras significativas adicionales al modelo. Los valores finales calculados de R y R libre después de 13 ciclos de interven­ ción manual y los refinamientos siguientes fueron 0,171 y 0,223, respectivamente, y el modelo mostró una RMSD de longitudes de unión ideales de 0,027 A (Tabla 13).

Resultados

Como se muestra en las Tablas 14 y 15, el anti-TLT-1 se une eficazmente al tallo de TLT-1. Mediante el uso del pro­ grama informático AREAIMOL, del paquete de programas CCP4, se calculó que las áreas promedio excluidas en una interacción por pares entre anti-TLT-1 y TLT-1 fueron de 764 A2. Las áreas promedio excluidas en las interac­ ciones por pares para el complejo Fab0100:hTLT-1.126-162, dieron 656 y 871 A2, para anti-TLT-1 y TLT-1, respecti­ vamente.

Los residuos en el péptido TLT-1 (hTLT-1.126-162) que hacen contactos directos con el Fab anti-TLT-1 en el com­ plejo Fab0100: hTLT-1.126-162 se definen como el epítopo y los residuos en Fab anti-TLT-1 que hacen contactos directos con hTLT-1.126-162 en el complejo Fab0100: hTLT-1.126-162 se definen como parátopo. Los residuos de los epítopos y parátopos se identificaron al ejecutar el programa informático ^CONTACTS del paquete de programas CCP4 mediante el uso de una distancia límite de 4,0 A entre el Fab anti-TLT-1 y la molécula TLT-1. Los resultados de los cálculos del contacto para el complejo Fab0100:hTLT-1.126-162 de las estructuras cristalinas se muestran en las Tablas 14 y 15. Se encontró que el epítopo de TLT-1 resultante para anti-TLT-1 comprende los siguientes resi­ duos de la SEQ ID NO 7): Lys 8 (133), Ile 9 (134), Gly 10 (135), Ser 11 (136), Leu 12 (137), Ala 13 (138), Asn 15 (140), Ala 16 (141), Phe 17 (142), Ser 18 (143), Asp 19 (144), Pro 20 (145), Ala 21 (142) donde los números entre paréntesis se refieren a los residuos correspondientes en la s Eq ID NO: 2 (Tab. 14 y 15).

El parátopo resultante incluyó los residuos His 31, Asn 33, Tyr 37, His 39, Tyr 54, Phe 60, Ser 96, Thr 97, Val 99 y Tyr 101 de la cadena ligera de Fab0100 correspondiente a la SEQ ID NO 163 (Tabla 14), y los residuos Val 2, Phe 27, Arg 31, Tyr 32, Trp 33, Glu 50, Thr 57, Asn 59, Ser 98, Gly 99, Val 100 y Thr 102 de la cadena pesada de Fab0100 correspondiente a la SEQ ID NO 162 (Tabla 15). Los residuos del epítopo de TLT-1 implicados en la unión al hidrógeno también se indican en las Tablas 14 y 15.

Tabla 13: Resultados del refinamiento del modelo con rayos X con respecto a los datos observados del complejo Fab0100:hTLT-1.126-162 mediante el programa informático refmac5.

OBSERVACIÓN 3 REFINAMIENTO.

OBSERVACIÓN 3 PROGRAMA : REFMAC 5.5.0109

OBSERVACIÓN 3 AUTORES : MURSHUDOV,VAGIN,DODSON

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 OBJETIVO DEL REFINAMIENTO : PROBABILIDAD MÁXIMA

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 DATOS USADOS EN EL REFINAMIENTO.

OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN ALTO (ANGSTROMS) : 1,85

OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN BAJO (ANGSTROMS) : 34,18

OBSERVACIÓN 3 VALOR LÍMITE DE DATOS (SIGMA(F)): NINGUNO

OBSERVACIÓN 3 COMPLETAMIENTO PARA EL INTERVALO (%) : 99,89

OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DE REFLEXIONES : 46512

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 AJUSTE A LOS DATOS USADOS EN EL REFINAMIENTO.

OBSERVACIÓN 3 MÉTODO DE VALIDACIÓN CRUZADA : A TODO LO LARGO

OBSERVACIÓN 3 SELECCIÓN DEL CONJUNTO DE PRUEBA DEL VALOR DE R LIBRE : ALEATORIO OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R (CONJUNTO DE TRABAJO DE PRUEBA) : 0,17330 OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R (CONJUNTO DE TRABAJO) : 0,17070

OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R LIBRE : 0,22260

OBSERVACIÓN 3 TAMAÑO DEL CONJUNTO DE PRUEBA DEL VALOR DE R LIBRE (%) : 5,0 OBSERVACIÓN 3 CONTEO DEL CONJUNTO DE PRUEBA DEL VALOR DE R LIBRE : 2463 OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 AJUSTE EN EL RANGO DE NÚMEROS DE MAYOR RESOLUCIÓN.

OBSERVACIÓN 3 NÚMERO TOTAL DE RANGOS DE NÚMEROS USADOS: 20

OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN DE RANGOS DE NÚMEROS ALTO : 1,850 OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESOLUCIÓN DE RANGOS DE NÚMEROS BAJO : 1,898 OBSERVACIÓN 3 REFLECCIÓN EN RANGO DE NÚMEROS (CONJUNTO DE TRABAJO) : 3409 OBSERVACIÓN 3 COMPLETAMIENTO DE RANGOS DE NÚMEROS (TRABAJO+PRUEBA) (%) : 99,81 OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R DE RANGOS DE NÚMEROS (CONJUNTO DE TRABAJO) : 0,266 OBSERVACIÓN 3 CONTEO DEL CONJUNTO DE VALORES DE R LIBRE DEL RANGO DE NÚMEROS 195

OBSERVACIÓN 3 VALOR DE R LIBRE DE RANGOS DE NÚMEROS : 0,309

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DE ÁTOMOS DISTINTOS DE HIDRÓGENO USADOS EN EL REFINAMIENTO. OBSERVACIÓN 3 TODOS LOS ÁTOMOS : 3993

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 VALORES DE B.

OBSERVACIÓN 3 DEL GRÁFICO DE WILSON (A**2) : NULO

OBSERVACIÓN 3 VALOR DE B MEDIO (TOTAL, A**2) : 14,967

OBSERVACIÓN 3 VALOR DE B ANISOTRÓPICO TOTAL.

OBSERVACIÓN 3 B11 (A**2) : -0,06

OBSERVACIÓN 3 B22 (A**2) : 0,23

OBSERVACIÓN 3 B33 (A**2) : -0,24

OBSERVACIÓN 3 B12 (A**2) : 0,00

OBSERVACIÓN 3 B13 (A**2) : -0,36

OBSERVACIÓN 3 B23 (A**2) : 0,00

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 ERROR DE COORDENADA TOTAL ESTIMADO.

OBSERVACIÓN 3 ESU BASADO EN VALOR DE R (A): 0,116

OBSERVACIÓN 3 ESU BASADO EN VALOR DE R LIBRE (A): 0,123

OBSERVACIÓN 3 ESU BASADO EN LA PROBABILIDAD MÁXIMA (A): 0,084

OBSERVACIÓN 3 ESU PARA VALORES DE B BASADO EN LA PROBABILIDAD MÁXIMA (A**2): 6,165 OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 COEFICIENTES DE CORRELACIÓN.

OBSERVACIÓN 3 COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC : 0,963

OBSERVACIÓN 3 COEFICIENTE DE CORRELACIÓN FO-FC LIBRE : 0,939

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 DESVIACIONES DE RMS A PARTIR DE VALORES IDEALES CONTEO DEL PESO RMS OBSERVACIÓN 3 LONGITUDES DE UNIÓN DE ÁTOMOS REFINADOS (A): 3538 ; 0,027 ; 0,022 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE UNIÓN DE ÁTOMOS REFINADOS (GRADOS): 4833 ; 2,132 1,958 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERÍODO 1 (GRADOS) 473 ; 6,972 ; 5,000 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERÍODO 2 (GRADOS) 137 ;35,607 ;24,453 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERÍODO 3 (GRADOS) 583 ;14,216 ;15,000 OBSERVACIÓN 3 ÁNGULOS DE TORSIÓN, PERÍODO 4 (GRADOS) 14 ; 23,096 ;15,000 OBSERVACIÓN 3 RESTRICCIONES DE CENTROS QUIRALES (A 3): 552 ; 0,180 ; 0,200 OBSERVACIÓN 3 PLANOS GENERALES ÁTOMOS REFINADOS (A): 2664 ; 0,013 ; 0,021 OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 RESTRICCIONES DEL FACTOR TÉRMICO ISOTRÓPICO. CONTEO RMS PESO OBSERVACIÓN 3 ÁTOMOS REFINADOS UNIDOS A LA CADENA PRINCIPAL (A**2): 2262 ; 1,399 ; 1,500 OBSERVACIÓN 3 ÁTOMOS REFINADOS DEL ÁNGULO DE CADENA PRINCIPAL (A**2): 3679 ; 2,333 ; 2,000 OBSERVACIÓN 3 ÁTOMOS REFINADOS UNIDOS A LA CADENA LATERAL (A**2): 1276 ; 3,462 ; 3,000 OBSERVACIÓN 3 ÁTOMOS REFINADOS DEL ÁNGULO DE CADENA LATERAL (A**2): 1139 ; 5,231 ; 4,500 OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 ESTADÍSTICAS DE RESTRICCIÓN DE NCS

OBSERVACION 3 NÚMERO DE GRUPOS NCS : NULO

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACION 3 DETALLES DE GEMELOS

OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DE DOMINIOS GEMELOS : NULO

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 DETALLES DE TLS

OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DE GRUPOS TLS : 2

OBSERVACIÓN 3 REGISTRO DE ATOMOS QUE CONTIENE SOLO LOS FACTORES B RESIDUALES OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 GRUPO TLS : 1

OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DEL GRUPO DE COMPONENTES : 3

OBSERVACIÓN 3 COMPONENTES C SSSEQI A C SSSEQI

OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUOS : L 1 L 109

OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUOS : H 1 H 113

OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUOS : P 7 P 21

OBSERVACIÓN 3 ORIGEN PARA EL GRUPO (A): -4,1790 48,4400 34,3450

OBSERVACIÓN 3 TENSOR T

OBSERVACIÓN 3 T11: 0,1731 T22: 0,1937

OBSERVACIÓN 3 T33: 0,1093 T12: -0,0155

OBSERVACIÓN 3 T13: -0,0164 T23: -0,0192

OBSERVACIÓN 3 TENSOR L

OBSERVACIÓN 3 L11 1,9367 L22 0,4840

OBSERVACIÓN 3 L33 3,8383 L12 -0,1522

OBSERVACIÓN 3 L13: -1,2215 L23 -0,1172

OBSERVACIÓN 3 TENSOR S

OBSERVACIÓN 3 S11: 0,0447 S12: -0,2657 S13: 0,0758

OBSERVACIÓN 3 S21: 0,0958 S22: -0,0414 S23: -0,0674

OBSERVACIÓN 3 S31: 0,0036 S32: 0,0098 S33: -0,0032

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 GRUPO TLS : 2

OBSERVACIÓN 3 NÚMERO DEL GRUPO DE COMPONENTES : 2

OBSERVACIÓN 3 COMPONENTES CSSSEQI A CSSSEQI

OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUOS : L 114 L 219

OBSERVACIÓN 3 INTERVALO DE RESIDUOS : H 116 H 215

OBSERVACIÓN 3 ORIGEN PARA EL GRUPO (A): -24,4360 51,7710 5,9920

OBSERVACIÓN 3 TENSOR T

OBSERVACIÓN 3 T11: 0,0252 T22: 0,0170

OBSERVACIÓN 3 T33 0,0735 T12: 0,0161

OBSERVACIÓN 3 T13 0,0018 T23: 0,0048

OBSERVACIÓN 3 TENSOR L

OBSERVACIÓN 3 L11 2,0324 L22: 1,6905

OBSERVACIÓN 3 L33: 0,8461 L12: 0,7328

OBSERVACIÓN 3 L13 0,0695 L23: 0,3337

OBSERVACIÓN 3 TENSOR S

OBSERVACIÓN 3 S11 -0,0068 S12 0,0156 S13: 0,0515

OBSERVACIÓN 3 S21 -0,0127 S22 -0,0101 S23: 0,1316

OBSERVACIÓN 3 S31 -0,0077 S32 -0,0763 S33: 0,0168

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 MODELADO DE SOLVENTE VOLUMÉTRICO.

OBSERVACIÓN 3 MÉTODO USADO : MÁSCARA

OBSERVACIÓN 3 PARÁMETROS PARA EL CÁLCULO DE LA MÁSCARA

OBSERVACIÓN 3 RADIO DE SONDA VDW : 1,40

OBSERVACIÓN 3 RADIO DE SONDA DE ION : 0,80

OBSERVACIÓN 3 RADIO DE CONTRACCIÓN : 0,80

OBSERVACIÓN 3

OBSERVACIÓN 3 OTRAS OBSERVACIONES DEL REFINAMIENTO:

OBSERVACIÓN 3 HIDRÓGENOS QUE SE HAN AÑADIDO EN LAS POSICIONES DE MONTAJE OBSERVACIÓN 3 VALORES DE U : SOLO RESIDUAL

OBSERVACIÓN 3

LINKR SG CYS L 139 SG ACYS L 199 SS

LINKR SG CYS H 22 SG ACYS H 96 SS

LINKR SG ACYS H 141 SG ACYS H 197 SS

CISPEP 1 THR L 7 PRO L 8 0,00

CISPEP 2 VAL L 99 PRO L 100 0,00

CISPEP 3 TYR L 145 PRO L 146 0,00 CISPEP 4 PHE H 147 PRO H 148 0,00 CISPEP 5 GLU H 149 PRO H 150 0,00

Tabla 14

Continuación

Tabla 15

Continuación

Ejemplo 48

Mapeo de epítopos mediante recorrido del péptido. El ELISA de recorrido del péptido definió la región de unión mí­ nima del péptido. Esto se estableció mediante el recubrimiento de péptidos biotinilados con el desplazamiento en marco de un residuo en la región del tallo del TLT-1 en placas de estreptavidina seguido por la unión del anticuerpo de interés (mAb 0061). Se añadió un anticuerpo secundario para la detección y se midió la unión a 450 nm. Control positivo: unión a TLT-1 biotinilado.

Materiales

PBS 10X: GPBS 10X Gibco 14200

Tween20: Aldrich núm. de cat. 27,434-8, núm. lote S30950-315

Placa: Placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina Nunc núm. 466014

BSA: A7030-100 g núm. lote 057K0737

Tampón de bloqueo/dilución: PBS 1X pH=7,4

BSA al 2 %

Tween20 al 0,5 %

Tampón de lavado: PBS 1x Tween20 al 0,5 %

Estándar: TLT-1 biotinilado 04/09-081 mg/ml

mAb: 0197-0000-0061-4A -0,55 mg/ml

Ac de detección: Anticuerpo caprino anti-IgG humana marcado con HRP 1 mg/ml Prod. núm. NEF802001EA

Sustrato de TMB: Listo para usar núm. de cat. 4390L núm. lote 70904

Solución de parada: H³PO⁴2 M

Dilución del TLT-1 biotinilado:

1 mg/ml -> 6,3 ng/ml (Dilución 158500x)

Concentración en pocillo: 0,63 ng

Dilución de péptidos biotinilados:

Conc aprox. 2-5 mg/ml (2,5 mg/ml)

2,5 mg/ml -> Dilución 10000x (25 ng/pocillo): 100 pl de cada péptido en cada pocillo.

Dilución de mAb 0061

0,55 mg/ml ->100 ng/ml (Dilución 5500x)

Concentración en pocillo: 10 ng

Dilución de mAb caprino anti-IgG humana HRP:

1 mg/ml -> 0,2 pg/ml (Dilución 5000x)

Síntesis de péptidos biotinilados en formato de 96 pocillos.

Los péptidos biotinilados se sintetizaron mediante el uso de síntesis estándar de péptidos en fase sólida. Las solu­ ciones de aminoácidos protegidos con Fmoc 0,3 M en 1-hidroxibenzotriazol (HOBt) 0,3 M en N-metilpirrolidinona (NMP) se acoplaron mediante el uso de diisopropilcarbodiimida (DIC) durante 1-4 horas. Como soporte sólido se usó la resina Rink amida LL (Merck) en una placa de filtro de microtitulación de 96 pocillos (Nunc) y se usaron aproxima­ damente 20 mg de resina por pocillo. La síntesis se realizó mediante el uso del sintetizador de péptidos Multipep RS de Intavis, Alemania, y se usó el protocolo de fabricación. La eliminación de Fmoc se realizó mediante el uso de piperidina al 25 % en NMP. Todos los péptidos se acoplaron con biotina en el extremo N y el ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico se usó como un separador entre la biotina y los péptidos. Este separador también se acopló como un bloque estructural protegido por Fmoc de acuerdo con el protocolo de síntesis (IRIS biotech, Alemania) Desprotección y tratamiento final

La desprotección final se realizó mediante el uso de 90 % de ácido trifluoracético (TFA), 5 % de triisopropilsilano y 5 % de H2O durante 3 horas. Se usó un total de 1 ml de TFA por pocillo. El TFA se filtró a 96 pocillos profundos (Nunc) y el TFA se redujo en volumen mediante evaporación hasta aproximadamente 100- 200 ul por pocillo y se añadió éter dietílico a todos los pocillos para precipitar los péptidos. La suspensión del péptido en éter dietílico se transfirió a una placa con filtro de 96 pocillos Solvinert (0,47 um, Millipore) y los péptidos se lavaron dos veces con éter dietílico y se secaron. Los péptidos se volvieron a disolver en 80 % de DMSO y 20 % de agua para dar una so­ lución madre de aproximadamente 1-3 mg/ml.

Péptidos biotinilados de 20 mer de la región del tallo de TLT-1 (SEQ ID NO 6)

2-5 mg/ml en DMSO/H2O al 75 % (biotinilado en el extremo N):

El número del péptido se muestra a la izquierda:

2 A 2 2619.8 bio-Oeg-L-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E

3 A 3 2620.7 bio-Oeg-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N

4 A 4 2577.7 bio-Oeg-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A

5 A 5 2611.7 bio-Oeg-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F

6 A 6 2585.6 bio-Oeg-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S

7 A 7 2603.6 bio-Oeg-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D

8 A 8 2603.6 bio-Oeg-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P

9 A 9 2545.6 bio-Oeg-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A

10 A10 2473.6 bio-Oeg-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G

11 A11 2431.6 bio-Oeg-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S

12 A12 2373.6 bio-Oeg-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A

13 B 1 2358.6 bio-Oeg-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N

14 B 2 2354.6 bio-Oeg-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P

15 B 3 2330.7 bio-Oeg-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L

16 B 4 2331.6 bio-Oeg-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E

17 B 5 2315.5 bio-Oeg-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P

18 B 6 2345.5 bio-Oeg-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S

19 B 7 2386.5 bio-Oeg-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q

20 B 8 2388.4 bio-Oeg-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D

21 B 9 2446.4 bio-Oeg-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E

22 B10 2445.5 bio-Oeg-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K

23 B11 2418.5 bio-Oeg-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S

24 B12 2460.6 bio-Oeg-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I

25 C 1 2410.5 bio-Oeg-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P

26 C 2 2436.6 bio-Oeg-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L

27 C 3 2434.7 bio-Oeg-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L-I

Péptidos biotinilados de 16 mer de la región del tallo de hTLT-1 (SEQ ID NO 6) 2-5 mg/ml en DMSO/H2O al 75 %:

29 C 5 2219.3 bio-Oeg-L-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G

30 C 6 2193.2 bio-Oeg-N-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S

31 C 7 2192.3 bio-Oeg-I-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L

32 C 8 2150.2 bio-Oeg-L-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A

33 C 9 2166.1 bio-Oeg-P-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E

34 C10 2183.1 bio-Oeg-P-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N

35 C11 2157.1 bio-Oeg-E-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A

36 C12 2175.2 bio-Oeg-E-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F

37 D 1 2133.2 bio-Oeg-E-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S

38 D 2 2119.2 bio-Oeg-E-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D

39 D 3 2087.2 bio-Oeg-E-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P

40 D 4 2029.2 bio-Oeg-T-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A

41 D 5 1985.2 bio-Oeg-H-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G

42 D 6 1935.2 bio-Oeg-K-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S

43 D 7 1878.1 bio-Oeg-I-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A

44 D 8 1879 bio-Oeg-G-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N

45 D 9 1919 bio-Oeg-S-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P

46 D10 1945.1 bio-Oeg-L-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L

47 D11 1961 bio-Oeg-A-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E

48 D12 1987 bio-Oeg-E-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P

49 E 1 1945 bio-Oeg-N-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S

50 E 2 1959 bio-Oeg-A-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q

51 E 3 2003 bio-Oeg-F-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D

52 E 4 1984.9 bio-Oeg-S-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E

53 E 5 2026 bio-Oeg-D-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K

54 E 6 1998 bio-Oeg-P-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S

55 E 7 2014.1 bio-Oeg-A-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I

56 E 8 2040.1 bio-Oeg-G-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P

57 E 9 2096.2 bio-Oeg-S-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L

58 E10 2122.3 bio-Oeg-A-N-P-L-E-P-S-Q-D-E-K-S-I-P-L-I

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno de este, que se une específicamente al transcri­ to 1 similar al TREM (TLT-1), o un fragmento de este, y que tiene un epítopo que comprende los residuos de aminoácidos K133, I134, G135, S136, L137, A138, N140, A141, F142, S143, D144, P145 y A146 de la SEQ ID NO: 2.

2. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de este, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cadena pesa­ da de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno, comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 39;

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYTPSLKD) de la SEQ ID NO: 39; y • una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 39;

y en donde la cadena ligera de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno, comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de la SEQ ID NO: 40; • una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 40; y

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 40.

3. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de este, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cadena pesa­ da de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno, comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 49 a 53 (RYWMT) de la SEQ ID NO: 50;

• una secuencia CDR2 de los aminoácidos 68 a 84 (EINPDSSTINYAPSLKD) de la SEQ ID NO: 50; y • una secuencia CDR3 de los aminoácidos 117 a 121 (GVFTS) de la SEQ ID NO: 50;

y en donde la cadena ligera de dicho anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno, comprende:

• una secuencia CDR1 de los aminoácidos 43 a 58 (RSSQSLVHRNGNTYFH) de la SEQ ID NO: 48; • una secuencia CDR2 de los aminoácidos 74 a 80 (KVSNRFS) de la SEQ ID NO: 48; y

• una secuencia CDR3 de los aminoácidos 113 a 121 (SQSTHVPYT) de la SEQ ID NO: 48.

4. El anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno de este, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es un anticuerpo monoclonal humanizado, o fragmento de unión al antígeno de este.

5. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, seleccionado del grupo que consiste en un Fab, un F(ab')2, un Fab', un Fd, un Fv, un ScFv, un dAb y una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada.

6. El fragmento de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, que es un fragmento Fab.

7. Una construcción o proteína de fusión procoagulante que comprende el anticuerpo monoclonal, o fragmento de unión al antígeno de este, de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6.