ES2893120A1

ES2893120A1 - Uso de arn circular para el diagnostico de esclerosis multiple

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Publication number: ES2893120A1
Application number: ES202030782A
Authority: ES
Inventors: Gil Leire Iparraguirre; Culla Maider Munoz; Trivino Tamara Castillo; Bichot David Otaegui
Original assignee: Administracion General de la Comunidad Autonoma de Euskadi
Current assignee: Administracion General de la Comunidad Autonoma de Euskadi
Priority date: 2020-07-28
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2022-02-08
Also published as: WO2022023317A1; EP4189117A1

Abstract

Uso de ARN circular para el diagnóstico de esclerosis múltiple. La presente invención se refiere al uso de un ARN circular, solo o en combinación con otros ARNcircs, como biomarcador/es para diagnosticar de esclerosis múltiple de una forma eficaz, rápida y fiable.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de ARN circular para el diagnóstico de esclerosis múltiple

La presente invención se refiere al uso de un ARN circular, solo o en combinación con otros ARN circulares, como biomarcador/es para diagnosticar de esclerosis múltiple de una forma eficaz, rápida y fiable.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad desmielinizante y autoinmune que afecta a más de 2,5 millones de personas en el mundo. La EM supone la segunda causa de discapacidad en el segmento de población entre 20 y 40 años, particularmente es 3 veces más prevalente en mujeres que en hombres. La EM supone un alto coste para el sistema sanitario debido principalmente a los tratamientos, a la cronicidad de la enfermedad y a la discapacidad que produce.

Tiene una fisiopatología compleja con factores genéticos y ambientales que contribuyen al desarrollo de la enfermedad, y se distinguen diferentes formas clínicas. Para la mayoría de los pacientes (alrededor del 85%), la fase temprana de la enfermedad (EM recurrente-remitente o EM-RR) se caracteriza por exacerbaciones clínicas o recaídas, causadas por células inmunes autorreactivas que ingresan al sistema nervioso central (SNC), lo que resulta en inflamación focal y desmielinización que produce síntomas de discapacidad neurológica que duran al menos 24 h. Después de estas recaídas, la inflamación se resuelve y ocurre una remielinización parcial que ingresa a una fase de recuperación llamada remisión. Con el tiempo, para muchos pacientes la recuperación comienza a ser incompleta, lo que lleva a la acumulación de discapacidad con recaídas escasas, esta fase de la enfermedad se considera un segundo subtipo llamado EM progresiva secundaria (SP-EM). Para otro 10-15% de los pacientes, la enfermedad progresa desde el inicio, conocida como primaria progresiva o PP-EM (Compston A., et al, 2008. Múltiple sclerosis. Lancet 372, 1502-1517).

El diagnóstico de EM comúnmente implica encontrar evidencia clínica de lesiones desmielinizantes en el SNC, incluidos el cerebro, la médula espinal y los nervios ópticos. Además, las lesiones deben diseminarse en el tiempo y el espacio. Estas evidencias clínicas pueden basarse en los síntomas de los pacientes, signos revelados por examen físico o diferentes pruebas de diagnóstico. Las pruebas de diagnóstico más comunes son las imágenes por resonancia magnética (IRM) que permiten localizar las lesiones y la prueba del líquido cefalorraquídeo (LCR) para confirmar la presencia de bandas oligoclonales que sugieren la síntesis intratecal de IgG (Polman, C. H. et al. 2010, Diagnostic Crítería for Múltiple Sclerosis. Revisions to the McDonald Crítería, 2011, Ann. Neurol. 69, 292-302).

Teniendo en cuenta que la EM afecta al SNC, el LCR es la fuente más directa de biomarcadores, sin embargo, no es una fuente ideal para que los biomarcadores se usen de forma continua ya que no se recomiendan múltiples punciones lumbares debido a su invasividad y posibles efectos adversos. Por lo tanto, se ha hecho un gran esfuerzo para descubrir biomarcadores de diagnóstico mínimamente invasivos, como los biomarcadores sanguíneos.

Con este objetivo, y gracias a la llegada de técnicas ómicas, se han llevado a cabo diferentes enfoques, uno de ellos es el perfil de expresión génica que, además de descubrir nuevos biomarcadores, también permite dilucidar los mecanismos moleculares subyacentes a las respuestas inflamatorias en la enfermedad. Se ha demostrado una desregulación tanto en los ARN codificantes como no codificantes (como miARN) y un claro sesgo de género (Muñoz-Culla, M. et al. 2016, SncRNA (microRNA &snoRNA) opposite expression pattern found in múltiple sclerosis relapse and remission is sex dependent. Sci. Rep. 6). Algunas de estas transcripciones se han sugerido como biomarcadores para la EM, pero ninguna de ellas ha alcanzado la práctica clínica.

Los ARN no codificantes, como los miARN, se consideran participantes de la regulación de diversas respuestas inmunes y, como tales, se han propuesto no solo como objetivos de la enfermedad sino también como biomarcadores, aunque muy pocos han llegado a la clínica. Los ARN circulares (ARNcircs) han surgido recientemente como nuevos miembros en la familia de ARN no codificantes y han sido considerados como buenos biomarcadores no invasivos en varias enfermedades debido a su alta estabilidad en los fluidos corporales (Zhang, Z., et al, 2018, Circular RNAs: Promising Biomarkers for Human Diseases. EBioMedicine 34, 267-274).

En los últimos años, los ARNcircs han surgido como nuevos actores en el mundo ARN, con un papel importante en los procesos reguladores postranscripcionales. Se ha descubierto que participan en varios procesos, como tumores, metabolismo y vías inmunes. En consecuencia, también se han relacionado con diversas enfermedades, incluidos cánceres, enfermedades cardiovasculares, enfermedades neurológicas y enfermedades autoinmunes (Aufiero, S., et al, 2019, Circular RNAs open a new chapter in cardiovascular biology. Nat. Rev. Cardiol. 16, 503-514) (Xia, X., et al, 2019, Roles of CircRNAs in Autoimmune Diseases. Front. Immunol. 10, 1-8).

Sin embargo, tanto el curso de la enfermedad como el fenotipo clínico de la EM son muy variables tanto entre pacientes y como dentro del mismo individuo. Actualmente, no hay biomarcadores efectivos a corto plazo y la mayor parte de las veces la muestra debe ser de líquido cefalorraquídeo. Por esta razón, se hace necesario el desarrollo de biomarcadores alternativos a los que ya existen en el estado de la técnica que puedan ayudar en el diagnóstico precoz y viable de EM, preferiblemente de muestras de fácil obtención como la sangre.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han demostrado el potencial de un conjunto de ARN circulares (ARNcirc) como biomarcadores para el diagnóstico de EM. Mediante ARN-Seq, han analizado el perfil de ARNcircs en muestras de sangre de pacientes con EM y pacientes sanos (controles sanos o CS), detectando un patrón de expresión alterado de ARNcircs en pacientes con EM en comparación con los CS. Tras el análisis, seleccionaron los mejores candidatos basándose en su nivel de expresión, en el cambio que se produce en la expresión entre los dos grupos (Fold-Change) y en el valor p obtenido en el test estadístico corregido (FDR). Además en una segunda cohorte en 84 pacientes con EM y 51 controles sanos, validaron los mejores ARNcircs candidatos y obtuvieron 6 ARNcircs significativamente regulados al alza (upregulated), los ARNcircs: ARNcirc_PADI4 [1](hsa_circ_17715), ARNcirc _0001707 [2], ARNcirc_0001947 [3], ARNcirc_0058514 [4], ARNcirc_0141241 [5] y ARNcirc_1459 [6], y que por tanto, tenían un mejor resultado como biomarcadores de la EM, siendo el ARNcirc_PADI4 [1] el biomarcador con los mejores resultados, con un valor de área bajo la curva de 0.843 (ver Tabla 5 y Figura 8 del presente documento).

Finalmente, los inventores analizaron la posibilidad de combinar varios de los ARNcircs para mejorar la capacidad predictiva de los marcadores. Observaron que la combinación del ARNcirc_PADI4 (hsa_circ_17715) [1] con los ARNcirc [2] y [6] mejora el área bajo la curva hasta obtener un valor de 0.847, mientras que la combinación de los 6 ARNcirc validados es la que permite obtener el valor máximo de área bajo la curva, 0.853 tal y como se puede observar en la Figura 9 o la Tabla 5 del presente documento.

Por tanto, los inventores han demostrado la utilidad del ARNcirc_PADI4 [1] como biomarcador de diagnóstico de la EM de una forma eficaz, rápida y fiable, y que dicha eficacia y fiabilidad es mejorada cuando dicho ARNcirc se combina con otros ARNcircs, particularmente cuando se combinan los seis ARNcircs. El número de acceso a la Base de datos circRNADb de dicho ARNcirc PADI4 [1] es Circ ID: hsa_circ_17715, que pertenece al gen PADI4, y que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso in vitro de un ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 como biomarcador para el diagnóstico de esclerosis múltiple (EM).

En la presente invención se entiende por “diagnóstico” o “diagnosticar” al proceso o acto de reconocer, decidir o concluir sobre una enfermedad o afección en un sujeto, basándose en los síntomas, signos y/o resultados de diferentes variables, tales como, por ejemplo, conocer la presencia, ausencia, cantidad y/o niveles de expresión de uno o más biomarcadores característicos de la enfermedad o afección que se va a diagnosticar. En la presente invención, el “diagnóstico de esclerosis múltiple” o “diagnóstico de EM” en un sujeto significa, en particular, que el sujeto sufre o padece esclerosis múltiple.

En la presente invención el diagnóstico de EM se realiza mediante el uso de un ARNcirc como biomarcador. El término "biomarcador" se refiere a una molécula o al producto de expresión de un gen o fragmentos y variantes del mismo que muestran cambios sustanciales en una enfermedad dada y que puede usarse tanto para la detección como para el diagnóstico de una enfermedad al detectar la aparición de dichos cambios en el biomarcador y/o para seguir la eficacia de un tratamiento para esa enfermedad.

El biomarcador que permite diagnosticar EM es un ARNcirc. El término “ARN circular” o “ARNcirc” , utilizados indistintamente en el presente documento, se refiere a un tipo de ARN monocatenario que, a diferencia del ARN lineal, forma un bucle continúo cerrado covalentemente, es decir, en el ARNcirc, los extremos 3 'y 5' presentes en una molécula de ARN se han unido. Es práctica de rutina para un experto en la materia identificar los ARNcirc del estado de la técnica descritos en documentos o bases de datos.

Ejemplos de bases de datos de ARNcircs incluyen, sin limitar a, “circBase” (http://www.circbase.org/), “CircNet” (https://omictools.com/circnet-tool), “circRNABase” (http://starbase.sysu.edu.cn/starbase2/mirCircRNA.php), “circRNADb - A database for human circular RNAs” (http://reprod.njmu.edu.cn/cgi-bin/circrnadb/circRNADb.php) o “Circ2T raits” (http://gyanxet-beta.com/circdb/).

Los inventores observaron que el ARNcirc “hsa_circ_17715” (circRNADb) que comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, de aquí en adelante el “ARNcirc de la invención”, esta sobreexpresado diferencialmente en pacientes con EM en comparación con pacientes sanos, es decir, que no padecen EM, siendo este ARNcirc un biomarcador para el diagnóstico de EM.

Como entiende un experto en la materia, dentro del término ARNcirc de la invención o ARNcirc hsa_circ_17715 están contempladas todas aquellas variantes que, aun teniendo diferentes secuencias de nucleótidos debido a mutaciones neutras de los nucleótidos (sustituciones conservativas), desempeñan la misma función que dicho ARNcirc en el ser humano. Así, en una realización particular de la invención, el gen que codifica el ARNcirc de la invención comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 1. El grado de identidad se determina usando algoritmos y procedimientos informáticos que son ampliamente conocidos para el experto en la materia. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos/nucleótidos se determina preferentemente usando el algoritmo BLASTP/BLASTN [BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NLM NIH Bethesda, Md.20894, Altschul, S., y col., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]. En otra realización más particular, el ARNcirc de la invención comprende una secuencia de nucleótidos con un 100% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1. En otra realización aún más particular, el ARNcirc de la invención consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1.

El ARNcirc de la invención está sobreexpresado diferencialmente en pacientes con EM, por lo que los niveles de expresión de dicho ARNcirc se pueden usar como biomarcador para diagnosticar EM. Por tanto, otra realización particular de la presente invención se refiere al uso in vitro de los niveles de expresión de un ARN circular que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 como biomarcador para el diagnóstico de esclerosis múltiple (EM).

El término "expresión”, como se usa en el presente documento, se refiere al proceso mediante el cual se produce una molécula de ARN a partir de una secuencia del genoma de ADN en el proceso denominado transcripción. En el contexto de la invención "niveles de expresión” se refiere a cualquier cambio cuantificable en la expresión o producción de ARN, que produce niveles relativos alterados de ARN en una muestra con respecto a otras moléculas en la misma muestra. Se apreciará que los niveles de expresión de un biomarcador pueden determinarse determinando los niveles de ARN.

Como entiende un experto en la materia, la evaluación y determinación de los niveles de expresión del ARNcirc de la invención para el diagnóstico de EM, requiere de un resultado estadísticamente significativo de los sujetos para que pueda identificarse como portador de la enfermedad. Un experto en la materia es capaz de determinar si los niveles de expresión del ARNcirc en un sujeto con EM es estadísticamente significativo con respecto a un sujeto sano, mediante herramientas de evaluación estadística. Ejemplos de herramientas estadísticas son, sin limitar a, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student o prueba de Mann-Whitney. En una realización particular los valores de p son preferiblemente inferiores a 0,1, más preferiblemente un valor de p inferior a 0,05.

Como entiende un experto en la materia y como se ha descrito anteriormente en el presente documento, dentro del término ARNcirc de la invención están contempladas todas aquellas variantes que, aun teniendo diferentes secuencias de nucleótidos, desempeñan la misma función que el ARNcirc de la invención. Igualmente, la sobreexpresión de dichas variantes puede ser indicativo de que el sujeto padece EM y, por tanto, usarse sus niveles de expresión como biomarcadores para el diagnóstico de EM.

Así, otra realización particular de la invención, se refiere al uso in vitro de los niveles de expresión de un ARNcirc que comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 1 como biomarcador para el diagnóstico de esclerosis múltiple (EM). El grado de identidad se determina usando algoritmos y procedimientos informáticos que son ampliamente conocidos para el experto en la materia y descritos anteriormente en el presente documento. Otra realización más particular, se refiere al uso in vitro de los niveles de expresión de un ARNcirc que comprende una secuencia de nucleótidos con un 100% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1.

Otra realización aún más particular, se refiere al uso in vitro de los niveles de expresión de un ARNcirc que consiste en la secuencia SEQ ID NO: 1.

Los inventores también observaron otros ARNcircs diferencialmente sobreexpresados en pacientes con EM. Los números de acceso o identificadores (circ RNA ID) de la base de datos circBase de dichos ARNcircs son los siguientes: hsa_circ_0001707 (SEQ ID NO: 2), hsa_circ_0001947 (SEQ ID NO: 3), hsa_circ_0058514 (SEQ ID NO: 4), hsa_circ_0141241 (SEQ ID NO: 5) y hsa_circ_0001459 (SEQ ID NO: 6). Los inventores analizaron la combinación de estos ARNcircs con el ARNcirc de la invención y obtuvieron una mejora en la capacidad predictiva del diagnóstico de EM.

Por tanto, otra realización particular de la invención se refiere al uso in vitro del ARNcirc de la invención en combinación con al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs seleccionados de la lista que consiste en: el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6, como biomarcador para el diagnóstico de esclerosis múltiple (EM).

Loa términos “diagnóstico de EM” , “biomarcador” y "ARN circular” ya han sido definidos anteriormente en el presente documento, y aplican de igual modo a esta realización de la invención.

Como entiende un experto en la materia, dentro de este conjunto de ARNcircs para su combinación con el ARNcirc de la invención, están contempladas todas aquellas variantes que, aun teniendo diferentes secuencias de nucleótidos, desempeñan la misma función que hsa_circ_0001707 (SEQ ID NO: 2), hsa_circ_0001947 (SEQ ID NO: 3), hsa_circ_0058514 (SEQ ID NO: 4), hsa_circ_0141241 (SEQ ID NO: 5) y hsa_circ_0001459 (SEQ ID NO: 6). Así, otra realización particular de la invención, se refiere al uso in vitro del ARNcirc de la invención en combinación con al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs arriba mencionados, en donde el gen que codifica cada uno de estos ARNcirc comprende, o consiste en, una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

Otra realización más particular de la invención se refiere al uso in vitro del ARNcirc de la invención en combinación con al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs arriba mencionados, en donde el gen que codifica para cada uno de estos ARNcirc comprende una secuencia de nucleótidos con un 100% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

Otra realización aún más particular de la invención se refiere al uso in vitro del ARNcirc de la invención en combinación con al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs arriba mencionados en donde el gen que codifica para cada uno de estos ARNcirc consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6. Estos ARNcirc están sobreexpresados en pacientes con EM, por tanto, dicho niveles de expresión se pueden usar como biomarcadores para diagnosticar EM en combinación con los niveles de expresión del ARNcirc de la invención.

Por tanto, otra realización particular de la presente invención se refiere al uso in vitro de los niveles de expresión del ARNcirc de la invención en combinación con los niveles de expresión de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs seleccionados de la lista que consiste en: el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6, como biomarcador para el diagnóstico de esclerosis múltiple (EM).

El término "niveles de expresión” ya ha sido definido anteriormente en el presente documento, y aplica de igual modo a esta realización particular de la invención.

Como entiende un experto en la materia, y como se ha descrito anteriormente en el presente documento, dentro de este conjunto de ARNcircs para su combinación con el ARNcirc de la invención, están contempladas todas aquellas variantes que, aun teniendo diferentes secuencias de nucleótidos, desempeñan la misma función que hsa_ci rc_0001707 (SEQ ID NO: 2), hsa_circ_0001947 (SEQ ID NO: 3), hsa_circ_0058514 (SEQ ID NO: 4), hsa_circ_0141241 (SEQ ID NO: 5) y hsa_circ_0001459 (SEQ ID NO: 6), y de igual forma, un nivel de expresión alto de dichas variantes con respecto a un valor de referencia puede ser indicativo de que el sujeto padece EM y por tanto, usarse junto a los niveles de expresión del ARNcirc de la invención como biomarcadores para el diagnóstico de EM.

Así, otra realización particular de la invención se refiere al uso in vitro de los niveles de expresión del ARNcirc de la invención en combinación con los niveles de expresión de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs en donde el gen que codifica para cada uno de estos ARNcirc comprende una secuencia de nucleótidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60, 65, 70, 75, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % con la secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

Otra realización más particular de la invención se refiere al uso in vitro de los niveles de expresión del ARNcirc de la invención en combinación con los niveles de expresión de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs en donde el gen que codifica para cada uno de estos ARNcirc comprende una secuencia de nucleótidos con un 100% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

Otra realización aún más particular de la invención se refiere al uso in vitro de los niveles de expresión del ARNcirc de la invención en combinación con los niveles de expresión de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco o seis de los ARNcircs en donde el gen que codifica para cada uno de estos ARNcirc consiste en la secuencia SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6.

Los inventores observaron que mediante la combinación del ARNcirc de la invención, hsa_circ_17715 (SEQ ID NO:1), junto con los otros 5 ARNcircs validados, se obtenían los mejores resultados predictivos para el diagnóstico de la EM, mostrados en la Figura 9 del presente documento.

Por tanto, otra realización más particular de la presente invención se refiere al uso in vitro del ARNcirc de la invención (SEQ ID NO:1), en combinación con los 5 ARNcircs validados que comprenden las secuencias (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), (SEQ ID NO:4), (SEQ ID NO:5), (SEQ ID NO:6).

Estos ARNcirc están sobreexpresados en pacientes con EM, por tanto, la combinación de los niveles de expresión de dichos ARNcirc también se pueden usar para diagnosticar EM. Por ello, otra realización particular de la presente invención se refiere al uso in vitro del nivel de expresión del ARNcirc de la invención en combinación con los 5 ARNcircs validados que comprenden las secuencias (SEQ ID NO:2), (SEQ ID NO:3), (SEQ ID NO:4), (SEQ ID NO:5), (SEQ ID NO:6).

Como se ha descrito anteriormente en el presente documento, los inventores demostraron que el ARNcirc de la invención, así como sus niveles de expresión, tanto individualmente como en combinación con otros ARNcircs, permiten diagnosticar in vitro EM en un sujeto.

Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de esclerosis múltiple, de aquí en adelante el "método de la invención”, que comprende:

(a) determinar la expresión del ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 en una muestra aislada de un sujeto, y

(b) compararla con un valor de referencia, en donde un aumento en la expresión de dicho ARNcirc con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto padece EM.

Los términos "diagnóstico de EM” , "ARN circular” o "nivel de expresión” ya han sido descritos anteriormente en el presente documento, y se aplican de igual modo en este aspecto inventivo, así como a todas sus realizaciones particulares.

La etapa (a) del método de la invención requiere determinar la expresión del ARNcirc de la invención en una muestra aislada del sujeto.

El término "muestra aislada” , como se usa en la presente invención, se refiere a toda muestra obtenida o procedente de un individuo que comprende el ácido nucleico, es decir, el material genético de los organismos vivos que controla la herencia y se localiza en el núcleo de las células. Ejemplos de muestras biológicas incluyen, sin limitar, a biopsia, tejido, heces sólidas y biofluidos, tales como orina, heces, suero, saliva, semen, esputo, líquido cefalorraquídeo (LCR), lágrimas, moco, sudor, leche, extractos de cerebro y similares. En una realización particular del método de la invención, la muestra biológica es sangre.

La muestra biológica se aísla de un sujeto. Tal como se usa en la presente invención, el término "sujeto” o "individuo” se refiere a cualquier animal que tenga sistema nervioso, en concreto, sistema nervioso central. Preferiblemente, el sujeto es un mamífero, más preferiblemente es un humano. El término no indica una edad o sexo particular. En una realización particular, el sujeto del método de la invención es un mamífero, preferiblemente un primate, más preferiblemente, un ser humano de cualquier sexo o edad.

Una vez obtenida la muestra biológica aislada del sujeto, hay que determinar el nivel de expresión del ARNcirc, etapa (a) del método de la invención. Es práctica de rutina para un experto en la materia determinar el nivel de expresión de un gen, particularmente el nivel de expresión de un ARNcirc, mediante técnicas ampliamente conocidas en el estado de la técnica. Ejemplos de técnicas y métodos para determinar los niveles de expresión incluyen, sin limitar a, métodos basados en hibridación, como análisis por Northern-blot e hibridación in situ, métodos que combinan la hibridación con la citometría de flujo, ensayos de hibridación en matrices como microarrays o NanoString; métodos de PCR como PCR cuantitativa (qPCR) o PCR digital en gota (ddPCR) ya sea mediante ensayos basados en sondas Taqman o en la detección de SYBRgreen; y métodos de secuenciación a gran escala como ARN-Seq.

Así en una realización particular del método de la invención, la determinación de la expresión del ARNcirc se determina mediante ARN-Seq, PCR cuantitativa (qPCR) o PCR digital (ddPCR).

Posteriormente, una vez obtenido el nivel de expresión del ARNcirc de la invención en el sujeto, hay que compararlo estadísticamente con un valor de referencia, en donde un aumento en la expresión de dicho ARNcirc con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto padece EM.

El término "nivel de referencia" o “valor de referencia” usado indistintamente en la presente invención, se refiere a un criterio predeterminado utilizado como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos de las muestras recopiladas de un sujeto. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior o inferior, un rango de valores, un valor promedio, un valor de mediana, un valor medio o un valor en comparación con un control particular. El valor de referencia puede basarse en un valor de muestra individual, como, por ejemplo, un valor obtenido de una muestra del sujeto que se está evaluando, pero en un momento anterior. También, el valor de referencia se puede basar en un gran número de muestras, como la población de sujetos del grupo de edad cronológica, o en un grupo de muestras que incluyen o excluyen la muestra a analizar.

En otra realización particular de la presente invención, el nivel de referencia es el nivel de expresión del ARNcirc de la invención en un sujeto sano, es decir, un individuo que no padece EM.

Un experto en la materia es capaz de determinar si el nivel de expresión del ARNcirc en un sujeto con EM es estadísticamente significativo con respecto al valor de referencia (nivel de expresión del ARNcirc en un sujeto sano), mediante herramientas de evaluación estadística. Ejemplos de herramientas estadísticas son, sin limitar a, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba t de Student o prueba de Mann-Whitney. En una realización particular los valores de p son preferiblemente inferiores a 0,1, más preferiblemente un valor de p inferior a 0,05.

Además, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento, los inventores también observaron que la determinación de los niveles de expresión del ARNcirc de la invención en combinación con la determinación de los niveles de expresión de otros ARNcircs permitían diagnosticar EM en un sujeto con mayor capacidad predictiva. Estos ARNcirc, igual que en el aspecto anterior de la presente invención, tienen los siguientes Circ ID de la base de datos circBase: hsa_circ_0001707 (SEQ ID NO: 2), hsa_circ_0001947 (SEQ ID NO: 3), hsa_circ_0058514 (SEQ ID NO: 4), hsa_circ_0141241 (SEQ ID NO: 5) y hsa_circ_0001459 (SEQ ID NO: 6).

Por ello, otra realización particular del método de la invención se refiere a un método in vitro que además comprende determinar la expresión de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs seleccionados de la lista que consiste en: el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6, en donde un aumento en la expresión de dicho ARNcirc con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto padece EM.

Los términos “diagnóstico de EM”, “ARN circular” , "nivel de expresión” o “valor de referencia" ya han sido descritos anteriormente en el presente documento, y se aplican de igual modo a esta realización particular, así como a realizaciones particulares sucesivas del presente documento.

Tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento, los inventores observaron que mediante la determinación de los niveles de expresión de la combinación del ARNcirc de la invención, hsa_circ_17715 (SEQ ID NO:1), junto con los ARNcircs hsa_circ_0001707 (SEQ ID NO: 2), hsa_circ_0001947 (SEQ ID NO: 3), hsa_circ_0058514 (SEQ ID NO: 4), hsa_circ_0141241 (SEQ ID NO: 5) y hsa_circ_0001459 (SEQ ID NO:6), se obtenían los mejores resultados predictivos para el diagnóstico de la EM.

Por tanto, otra realización más particular del método de la invención se refiere a un método in vitro que comprende determinar la expresión de los ARNcircs que comprenden las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5 y 6, en donde un aumento en la expresión de dichos ARNcircs con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto padece EM.

La puesta en práctica del método de la invención comprende el uso de un conjunto de reactivos que pueden estar comprendidos dentro de un kit.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un kit que comprende los reactivos necesarios para cuantificar la expresión del ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1, de aquí en adelante "kit de la invención” , en donde dichos reactivos comprenden:

- una pareja de cebadores que hibrida de forma específica con la secuencia de nucleótidos del ARNcirc, y/o

- una sonda que hibrida de forma específica con la secuencia de nucleótidos del ARNcirc.

En la presente invención se entiende por "kit” como un producto que comprende los diferentes reactivos necesarios para llevar a cabo los métodos de la invención adaptado para permitir el transporte y almacenamiento de dichos reactivos. Los materiales adecuados para el embalaje de los componentes del kit pueden ser de plástico (tales como polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), de cristal, y pueden comprender botellas, frascos, sobres, etc. Además, el kit de la invención puede contener instrucciones para el uso simultáneo, secuencial o separado de los diferentes componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden ser en forma de material impreso, o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones, tales como los discos de almacenamiento (discos magnéticos), métodos ópticos (CD-ROM, DVD, etc.) y similares.

La expresión "reactivos necesarios para cuantificar los niveles de expresión del ARN circular” significa un compuesto o grupo de compuestos que permiten determinar el nivel de expresión de una secuencia de ARN. Ejemplos de reactivos necesarios para cuantificar los niveles de expresión del ARNcirc incluyen, sin limitar a, buffer, mezclas de desoxirribonucleótidos trifosfatos (dNTP), transcriptasa inversa, inhibidores de ARNasa, termociclador convencional o a tiempo real y sondas fluoróforas (como por ejemplo SYBR Green).

Además, el kit de la invención puede comprender los reactivos necesarios para cuantificar el nivel de expresión de una combinación de ARNcircs, donde dichos ARNcircs ya se han descrito anteriormente en el presente documento y son los mismos para este aspecto inventivo. Por tanto, el kit de la invención además puede comprender parejas de cebadores de dichos ARNcircs que se combinan con el ARNcirc de la invención, cuyas secuencias están descritas en la Tabla 2 del presente documento.

Por tanto, en otra realización particular, el kit de la invención además comprende los reactivos para cuantificar la expresión de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs seleccionados de la lista que consiste en: el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.

Una vez que los reactivos están comprendidos dentro del kit, éste puede emplearse para poner en práctica el método de la invención.

Así, otro aspecto de la presente invención se refiere al uso in vitro del kit de la invención para el diagnóstico de la EM.

Los términos "kit” y “diagnóstico de EM” ya han sido descritos anteriormente en el presente documento y es aplicable a este aspecto inventivo.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Diagrama que muestra el flujo de trabajo del RNA-Seq desde la preparación de las muestras hasta la expresión diferencial.

Figura 2. Características generales del perfil ARNcirc. A) Correlación de la cuantificación realizada por find_circ y Ciri2. B) Histograma que muestra el número de lecturas por ARNcirc. C) Expresión global de ARNcirc para cada muestra. D) distribución de ARNcirc en cromosomas. E) Número de ARNcirc producidos a partir de cada gen.

Figura 3. Se han encontrado 464 ARNcirc expresados diferencialmente (ARNcirc-DE) (valor p <0,05, FC > 1,5) con una clara tendencia a la regulación positiva en pacientes (446 arriba y 18 abajo) y un sesgo sexual. Gráficos de volcanes que muestran ARNcirc-DE entre A) todos los pacientes con EM y CS (30 frente a 20) B) Pacientes femeninos con EM y CS (23 frente a 14) C) pacientes masculinos con EM y CS (7 frente a 6). La relación entre el número de ARNcirc significativamente regulados hacia arriba (upregulated) y hacia abajo (downregulated) para cada una de las comparaciones se muestra en la esquina superior izquierda de cada diagrama de volcán. D) Diagrama de Venn que compara los ARNcirc-DE entre sexos que muestran que hay una firma específica de sexo. Se indican 7 ARNcirc seleccionados para la validación de qPCR. Abreviaturas: ARNcirc-DE, ARNcirc expresados diferencialmente; EM, esclerosis múltiple; CS, controles saludables.

Figura 4. Detección de los amplicones de cada uno de los ARNcircs en el gel de agarosa y electroferogramas que muestran la secuencia correspondiente al BSJ de cada ARNcirc.

Figura 5. Muestra los 6 candidatos de ARNcircque se encuentran regulados al alza (upregulated) en una segunda cohorte independiente (70 EM y 46 CS). T-test se realizó para el análisis estadístico. Abreviaciones y símbolos: ns, no significativo; ****, pvalor<0.0001

Figura 6. La sobreexpresión de los ARNcircs se mantiene cuando el análisis se limita a las mujeres. En los hombres, sólo tres de los ARNcircs se mantienen sobreexpresados. Se empleó el test T-student para la estadística. Abreviaciones y símbolos; CSM, Control sano Mujer; EMM, Esclerosis múltiple Mujer; CSH, Control sano Hombre; EMH, Esclerosis múltiple Hombre; ns, no significativo; ****, p-valor<0.0001; ***, p-valor<0.001; **, p-valor<0.01; *, p-valor<0.05;

Figura 7. Volcano plot de los ARNcircs diferencialmente expresados entre patientes EM-SP(n=10) y pacientes EM-RR (n=20). El porcentaje de los ARNcircs upregulados se muestra en el cuadrante superior derecho del volcano plot. Abreviaciones: EM-SP, esclerosis múltiple secundaria progresiva; EM-RR, esclerosis múltiple recurrente remitente; UP, upregulated; FC, fold change.

Figura 8. Curvas ROC para cada uno de los 6 ARNcirc seleccionadosque muestra su potencial de ser biomarcadores en la esclerosis múltiple.

Figura 9. Curvas ROC que muestran el valor predictivo de la combinación del ARNcirc hsa_circ_17715 con dos o más de los ARNcircs seleccionados.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad de la invención.

MATERIALES Y METODOS

Obtención de muestras de sangre y extracción de ARN

Los inventores recolectaron la sangre completa de un total de 66 controles sanos (CS) y de 100 pacientes con esclerosis múltiple (EM) emparejados por edad y sexo en el Departamento de Neurología del Hospital Universitario de Donostia. Lisaron los eritrocitos con tampón EL (Qiagen) y el ARN total se aisló de los leucocitos con el miRNeasy Mini Kit (Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los inventores midieron la concentración de ARN usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific).

Los inventores dividieron las muestras en dos cohortes. La cohorte de descubrimiento estaba formada por 20 CS y 30 pacientes con EM (20 RR-EM y 10 SP-EM) y fueron analizados por ARN-Seq. Por otro lado, 46 muestras de CS y 70 EM (62 RR-EM y 8 SP-EM) se incluyeron en la cohorte de validación y se sometieron a PCR en tiempo real (RT-qPCR). Las principales características clínicas y demográficas de los pacientes y los controles sanos se resumen en la Tabla 1. Los inventores recogieron muestras de todos los individuos después de recibir el consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el comité de ética del hospital y las muestras se procesaron y almacenaron en el Biobanco Vasco (http://www.biobancovasco.org).

Tabla 1. Principales características clínicas y demográficas de los individuos incluidos en el estudio (100 pacientes con esclerosis múltiple y 66 controles sanos en dos cohortes diferentes). Abreviaciones: EM, Esclerosis múltiple. CS, control sano. EM-RR, Esclerosis múltiple remitente recurrente. EM-SP, Esclerosis múltiple secundaria progresiva. EDSS, Expanded Disability Status Scale. Tiempo evo., Tiempo de evolución. AOO, Age of onset. Edad, Tiempo evo. y AOO se presentan como ‘promedio (desviación estándar) ’, EDSS se presenta como ‘mediana (rango) ’.

Sexo Edad Tipo de EM EDSS Tiempo evo. AOO

Mujer (n=23) 44,3 (±10,0) ^16EM- _RR/7EM-SP3,7 (0-7) 14,7 (±10,4) 29,6 (±7,4) EM (n=30)

Hombre (n=7) 44,7 (±8,5) ^4EM-4,6 (2-8) 15,7 (±7,6) 29,0 (±10,1) Cohorte de _RR/3EM-SP

descubrimiento

Mujer (n=14) 49,6 (±7,9) - - - -CS (n=20)

Hombre (n=6) 38,5 (±4,5) - - _{- “}

Mujer (n=58) 41,3 (±9,5) ^50EM- _RR/8EM-SP2,3 (0-8) 10,2 (±7,6) 31,1 (±8,9) EM (n=70)

Hombre (n=12) 40,0 (±8,2) 12EM-RR 2,4(0-4) 5,9 (±3,7) 28,9 (±9,8) Cohorte de

validación

Mujer (n=14) 33,2 (±8,7) - - - -CS (n=46)

Hombre (n=18) 34,9 (±10,2) _{- - - “}

ARN-Seq

Los inventores realizaron la preparación de la biblioteca y la secuenciación de próxima generación (Next Generation Sequencing en inglés) en CD Genomics (EE.UU.). Midieron la concentración y la calidad de las muestras de ARN nuevamente utilizando el instrumento Bioanalyzer 2100 (Agilent) antes de la preparación de la librería. Después de la normalización, eliminaron el ARNr de la muestra de ARN total utilizando el kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero seguido de los pasos de purificación y fragmentación.

Para construir las librerías de secuenciación, los inventores realizaron una síntesis de ADNc específica de cadena, adenilaron los extremos 3 'y se ligaron los adaptadores. Las librerías resultantes fueron sometidas a control de calidad y proceso de normalización. Realizaron la secuenciación mediante lecturas pareadas con Illumina HiSeq PE150 y obtuvieron un promedio de 10 Gb de datos por muestra.

Detección de ARNcirc y cuantificación en datos de ARN-Seq

Los inventores verificaron las lecturas de secuenciación por calidad y las mapearon contra la versión GRCh37/hg19 del genoma usando los alineadores BWA o Bowtie. Posteriormente, realizaron la detección de ARNcirc mediante los algoritmos find_circ, versión 1.0 y Ciri2 siguiendo la recomendación de los autores. Para find_circ, usaron un umbral de rigurosidad mayor que requiere que ambas secuencias del adaptador se mapeen con la calidad de mapeo más alta posible (mapq = 40). Además, solo los ARNcirc detectados con al menos dos lecturas en una muestra dada y encontrados por ambos algoritmos se usaron en análisis posteriores.

El nivel de expresión de ARNcircs se basó en la cuantificación del número de lecturas que abarcan BSJ según la del algoritmo Ciri2. El análisis de expresión diferencial lo realizaron utilizando DESeq2 en R-studio.

Los ARNcirc con un valor de cambio absoluto (FC o Fold-change en inglés) superior a 1,5 (FC > 1,5) y un valor p-valor inferior a 0,05 (p <0,05) se consideraron como ARNcirc diferencialmente expresados (de ahora en adelante, ARNcirc-DE). Los inventores aplicaron criterios de filtrado adicionales a estos ARNcirc-DE para la selección de candidatos de ARNcirc para su validación por RT-qPCR. Los inventores seleccionaron estos candidatos de ARNcirc entre los ARNcirc-DE de alta confianza definidos como aquellos detectados en al menos el 50% de las muestras en cada grupo y con un valor de expresión media, definida como la media de los recuentos normalizados de todas las muestras, por encima de 10. Todas estas etapas explicadas anteriormente se muestran esquemáticamente en la Figura 1, desde la preparación de la muestra hasta la expresión diferencial.

Síntesis de ADNc y PCR cuantitativa

Los inventores transcribieron inversamente 600 ng de ARN total en ADNc con cebadores aleatorios usando el kit de transcripción inversa de ADNc ”High capacity (Applied Biosystems, Inc., EE. UU.). La RT-qPCR se realizó en un termociclador Verity (Applied Biosystems, Inc., EE. UU.) con el siguiente programa: 25°C durante 10 minutos, 37°C durante 120 minutos y 85°C durante 5 minutos. La PCR cuantitativa se realizó utilizando Power SYBRGreen Master Mix (Applied Biosystems) en un sistema de detección de PCR en tiempo real táctil (CFX384 Touch Real-Time PCR Detection System) (Bio-Rad laboratories, Inc.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Los inventores usaron cebadores divergentes para la amplificación de los ARNcirc de modo que el amplicón se extiende por la unión empalmada hacia atrás del término en inglés “backspliced junctiorí’ y usaron EEF1A1 como el gen de referencia para la normalización (Tabla 2).

Tabla 2. Secuencia de los cebadores empleados para la amplificación de los ARNcirc mediante RT-qPCR

Los cebadores divergentes, han sido diseñados de manera que se sitúan en los exones comprometidos en el empalme de los extremos del ARNcirc y orientados hacia lados opuestos para que amplifiquen únicamente en el supuesto de que la molécula sea circular.

Los inventores procesaron cada muestra por triplicado (a partir de 10 ng de ADNc en 10 pl de volumen de reacción total). Las condiciones de la q-PCR fueron: 50°C durante 2 minutos, 95°C durante 10 minutos, 40 ciclos de 95°C durante 15 segundos y 60°C 1 minuto seguido de un análisis de curva de disociación. Los valores de Cq sin procesar y las curvas de disociación se analizaron en CFX Maestro 1.0 (BioRad), donde un pico único en la curva de disociación indica la especificidad de la amplificación. El cambio en el nivel de expresión de los ARNcircs, representada como FC, se calculó en Microsoft Excel 2010 utilizando el método 2_DDCq. Graphpad Prism 6.01 se utilizó para la prueba T de Student y SPSS para las curvas ROC.

RESULTADOS

identificación y caracterización del perfil de ARNcirc en EM

Con el objetivo de describir el perfil de expresión de las moléculas de ARNcirc en la EM sin sesgos, y cubriendo todo el genoma, los inventores realizaron un ARN-seq del ARN total depleccionado de ARN ribosómico de muestras de sangre de pacientes diagnosticados con EM (n = 30) y controles sanos (n = 20). Mediante Find_circ y CIRI2 detectaron un total de 65.726 y 31.314 ARNcirc admitidos por al menos dos lecturas de expansión de unión de empalme posterior (BSJ o back-spliced junction en inglés) respectivamente. Observaron una buena superposición entre ambos algoritmos con 22.835 ARNcirc detectados en común y con una buena correlación de recuento de lectura (Figura 2A).

Los niveles de expresión de la mayoría de los ARNcircs son bajos, el 96,5% de los ARNcirc se han detectado con menos de 10 lecturas, sin embargo, también hay un pequeño grupo de 92 ARNcircs (0,4%) que son altamente abundantes detectados con más de 50 lecturas (Figura 2B). La distribución de los recuentos de lectura de BSJ de todas las muestras después de la normalización mostró que no hay ninguna muestra atípica en el conjunto de datos (Figura 2C).

Para analizar si había algún sesgo en la distribución de los ARNcirc a lo largo de los cromosomas, se mostró el número de ARNcirc en cada cromosoma. El número de ARNcirc detectados fue en general consistente con el tamaño del cromosoma para todos los autosomas, mientras que se producen menos ARNcirc de los cromosomas sexuales, y particularmente del cromosoma Y, del cual solo se detectaron 19 ARNcirc. La proporción de ARNcirc regulados a la baja (de aquí en adelante “downregulated” del término en inglés) y al alza (de aquí en adelante “upregulated” del término en inglés) también se mantiene para cada uno de los cromosomas que representan aproximadamente el 26-33% y el 66-73% del número total de ARNcirc, respectivamente (Figura 2D).

De los 22.835 ARNcirc detectados, 22.197 se encuentran dentro de un locus genético conocido, mientras que 638 ARNcirc son intergénicos. Curiosamente, solo se han identificado 5.599 genes diferentes dentro de las regiones genéticas que producen ARNcirc, lo que revela que cada uno de los genes da lugar a varios ARNcircs. De hecho, el 63,3% de los genes están produciendo varios ARNcirc con una media de 5,6 ARNcirc producidos por cada gen. Sin embargo, vale la pena señalar que 2.053 genes dan lugar a un solo ARNcirc y que, en el otro extremo, también hay 533 genes que producen más de diez ARNcircs (Figura 2E).

Los ARNs circulares son más abundantes en pacientes con EM en relación con los controles sanos, además se encuentra una diferente expresión en función del sexo

Entre los 22.835 ARNcirc detectados en total, solo el 60% se detectó tanto en los grupos con EM como en los controles sanos (CS), mientras que algunos de ellos eran exclusivos de uno de los grupos. Vale la pena señalar que se detectaron más ARNcirc en pacientes con EM (19.781 ARNcirc) en comparación con los controles sanos (16.772 ARNcirc). Además, con respecto a la expresión general del grueso de los ARNcirc, se puede observar diferencia entre los grupos, lo que indica que los ARNcirc son más abundantes en pacientes con EM que en controles sanos (Expresión media del recuento de lecturas normalizado EM = 1.973 ± 10.811; CS = 1.854 ± 7.526; p <0,0001) (Figura 2C).

En línea con esto, se observó que 464 ARNcirc se expresaban diferencialmente (ARNcirc-DE) con un valor p <0,05 y un FC > 1,5 y una clara tendencia a la regulación positiva con más del 96,1% de ARNcirc upregulated en pacientes (446 ARNcirc upregulated frente a 18 ARNcirc downregulated) (Figura 3A).

Para averiguar si esta regulación positiva está influenciada por el sexo, los inventores subdividieron la cohorte en mujeres, 20 con EM frente 14 sanos, y en hombres, 10 con EM frente a 6 sanos, y realizaron un segundo análisis de expresión diferencial. Usando los mismos criterios, se observó la misma tendencia de regulación positiva con 498 ARNcirc significativamente upregulated y solo 14 downregulated entre pacientes y controles sanos, es decir, un 97,3% upregulated cuando la comparación se limitó a las mujeres (Figura 3B).

Para los hombres, en general, se desregulan menos ARNcirc, con un total de 266 ARNcirc regulados diferencialmente entre pacientes y controles sanos. De hecho, hay menos ARNcirc (193 upregulated frente a 73 downregulated, es decir, un 72,5% upregulated), y la regulación al alza también es menos significativa (Figura 3C). También, se puede observar en el diagrama del volcán que la relación de regulación ascendente (upregulated) a regulación descendente (downregulated) no cambia tanto en hombres como en las mujeres (mujeres = 35,6 frente a machos = 2,6). Por otro lado, sólo 34 ARNcirc se expresan diferencialmente tanto en mujeres como en hombres, mientras que 93,4% y 87,21% de los ARNcirc desregulados respectivamente, comprenden una firma específica de sexo (Figura 3D).

Entre los 464 ARNcirc-DE entre todos los pacientes con EM y los controles, 68 eran ARNcirc de alta confianza y, en función de su abundancia, cambios en la expresión y significación estadística, siete de esos ARNcirc se seleccionaron como candidatos para su posterior validación (Tabla 3).

Tabla 3. Valores de FC y p-valor para los siete ARNcirc candidatos tanto en las cohortes de descubrimiento (ARN-Seq) como de validación (qPCR). Las coordenadas genómicas y los genes parentales también se muestran para cada uno de los ARNcirc. Los valores significativos se resaltan en negrita. Abreviaciones: CS, control sano; EM, esclerosis multiple; FC, Fold change.

Para la validación, se llevaron a cabo RT-qPCRs utilizando cebadores divergentes (Tabla 2) que abarcan las uniones con empalme posterior respectivo para cada uno de los 7 candidatos de ARNcirc. La amplificación correcta de los BSJ se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa y secuenciación de Sanger (Figura 4). Seis de los 7 ARNcirc estaban significativamente regulados al alza (upregulated) en una segunda cohorte independiente de 70 pacientes y 46 controles, debido a que, aunque hsa_circ_0001400 también mostró una tendencia de regulación al alza, esta no fue significativa (Figura 5).

Basado en el sesgo de sexo observado para los resultados de ARN-Seq, y sabiendo que, aunque todos ellos están significativamente desregulados en toda la cohorte, algunos de ellos parecen ser específicos del sexo (Figura 3D). Por lo tanto, la expresión de ARNcirc también se evaluó para mujeres y hombres por separado en la cohorte de validación (Figura 6).

Los 6 ARNcirc que fueron upregulated fueron validados para el total de las muestras, también fueron significativamente upregulated para las mujeres. Para los hombres, solo 3 ARNcirc permanecen significativamente al alza, pero vale la pena señalar que el FC para circPADI4 y hsa_circ_0001707 se incrementa en comparación con los resultados obtenidos tanto para las mujeres como para toda la cohorte (Tabla 3).

Expresión de ARNcirc en diferentes tipos de EM y correlación con características clínicas.

Entre los 30 pacientes con EM incluidos en el experimento de ARN-Seq, 20 fueron diagnosticados de RR-EM y 10 de SP-EM en el momento del muestreo en sangre. Los 19.871 ARNcirc detectados en pacientes con EM fueron sometidos a un análisis de expresión diferencial entre ambos tipos, dando como resultado 121 ARNcirc-DE (Tabla 4). Estos ARNcirc-DE representan solo el 0,61% de los ARNcirc detectados en pacientes, lo que indica que la firma general de ARNcirc no cambia con la progresión de la enfermedad (Figura 7). Además, solo 7 de esos ARNcirc eran de alta confianza.

Tabla 4. ARNcircs diferencialmente expresados (FC>\1.5\ and p-valor<0.05) entre pacientes con diagnóstico EM-SP (n=10) y EM-RR (n=20).

ARNcirc como biomarcadores para el diagnóstico de EM

Para explorar el potencial de diagnóstico de los 6 ARNcirc candidatos cuya sobreexpresión había sido validada por RT-qPCR, los inventores realizaron el análisis de la curva de Características operativas del receptor (Curva ROC). Como se muestra en la Figura 8 y la tabla 5, los 6 ARNcirc mostraron un buen rendimiento con un área bajo la curva (AUC) capaz de discriminar a los pacientes de controles sanos, donde el ARNcirc PADI4 destaca como el ARNcirc con el mayor potencial de diagnóstico.

Finalmente, los inventores analizaron la posibilidad de combinar varios de los ARNcirc para obtener una mejoría en la capacidad predictiva la combinación. Observaron que la combinación de ARNcirc_PADI4 con los otros 5 ARNcirc mejora los valores obtenidos, lo que implica que toda la firma de los 6 ARNcirc regulados al alza (upregulation) podría tener el potencial de diagnosticar el 85,2% de los casos de EM.

Tabla 5. Resultados de área debajo de la curva (AUC) de los 6 ARNcirc candidatos y las dos combinaciones propuestas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso in vitro de un ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 como biomarcador para el diagnóstico de esclerosis múltiple (EM).

2. Uso según la reivindicación 1, en donde el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 se usa en combinación con al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs seleccionados de la lista que consiste en: el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.

3. Uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 se usa en combinación con los ARNcircs seleccionados de la lista que consiste en: el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.

4. Un método in vitro para el diagnóstico de esclerosis múltiple que comprende:

(a) determinar la expresión del ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1 en una muestra aislada de un sujeto y

5. El método in vitro según la reivindicación 4, que además comprende determinar la expresión de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs seleccionados de la lista que consiste en: el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6, en donde un aumento en la expresión de dicho ARNcirc con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto padece EM.

6. El método in vitro según la reivindicación 4 o 5, que comprende además determinar la expresión de los ARNcircs seleccionados de la lista que consiste en: el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.

7. El método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la muestra aislada es sangre.

8. El método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde la determinación de la expresión del ARNcirc se determina mediante ARN-Seq o PCR en tiempo real (qPCR).

9. El método in vitro según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde el sujeto es un ser humano.

10. Un kit que comprende los reactivos para cuantificar la expresión del ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1.

11. El kit según la reivindicación 10, que además comprende los reactivos para cuantificar la expresión de al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco de los ARNcircs seleccionados de la lista que consiste en: el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 2, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4, el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y el ARNcirc que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.

12. Uso del kit según la reivindicación 10 o 11 para el diagnóstico de la EM.