ES2890776T3 - Métodos, composiciones y kits para la captura, la detección y la cuantificación del ARN pequeño - Google Patents

Abstract

Un método para detectar un ARN pequeño maduro en una muestra que comprende ARN pequeño maduro, comprendiendo el método: poliadenilar el extremo 3' del ARN pequeño maduro y ligar un adaptador monocatenario al extremo 5' del ARN pequeño maduro en presencia de una ligasa de ARN monocatenario, de modo que se forma un producto de ligadura de ARN, en donde el adaptador comprende una porción de cebador directo universal; transcribiendo de manera inversa el producto de ligadura de ARN usando un cebador de transcripción inversa (RT), formando de este modo un producto de ADNc del producto de ligadura del ARN, en donde el cebador de RT comprende una porción poli(T) y una porción de cola, en donde la porción de cola comprende una porción de cebador inverso universal; amplificar el producto de ADNc usando una primera pareja de cebador directo e inverso para formar un producto de amplificación, en donde el primer cebador directo puede hibridarse con la porción de cebador directo universal o su complemento, y el primer cebador inverso puede hibridarse con la porción de cebador inverso universal o su complemento; y detectar el producto de amplificación correspondiente al ARN pequeño maduro mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qPCR), en donde la amplificación del producto del ADNc es una etapa de amplificación previa, y en donde la poliadenilación, la ligadura y la transcripción inversa se llevan a cabo en el mismo recipiente de reacción, y en donde la poliadenilación, la ligadura, la transcripción inversa y la preamplificación se llevan a cabo sin que intervengan extracción, precipitación, purificación y/u otros procesos de limpieza.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos, composiciones y kits para la captura, la detección y la cuantificación del ARN pequeño

Campo

Las presentes enseñanzas se refieren al campo de la biología molecular y celular, específicamente al campo de la detección de polinucleótidos diana tales como especies de ARN pequeño.

Introducción

Las especies reguladoras no codificantes de ARN pequeño, tales como microARN (miARN), son una clase abundante de elementos reguladores que han mostrado alterar todos los aspectos de los procesos celulares normales en plantas y animales, incluyendo la muerte, diferenciación, y proliferación celular. Los miARN se han implicado también en numerosas enfermedades incluyendo cáncer, cardiopatías y enfermedades neurológicas, por consiguiente, los miARN se estudian como biomarcadores de diagnóstico y de pronóstico. Los ARN pequeños, incluyendo los miARN, se generan mediante complejos enzimáticos específicos a partir de precursores mucho más grandes. En general, un miARN está compuesto de una secuencia nuclear de 20-30 nucleótidos muy conservados y normalmente tiene un monofosfato en el extremo 5' y un grupo hidroxilo en el extremo 3'. Los miARN inducen generalmente el silenciamiento del gen mediante la unión a sitios diana dentro de la UTR en 3' de un ARNm diana. Esta interacción suprime la síntesis de proteínas y/o inicia la degradación del ARNm.

Los intentos de detectar, cuantificar y analizar los ARN pequeños maduros, tales como los miARN, han sido impedidos por diversos factores incluyendo sus tamaños pequeños y similitudes entre especies relacionadas aunque diferentes. Los miembros de la familia del miARN estrechamente relacionados pueden diferir en solo un nucleótido, por tanto, existe una necesidad de una alta especificidad y la capacidad de discriminar entre emparejamientos incorrectos de nucleótidos individuales.

Se han usado micromatrices de ácidos nucleicos para cuantificar ARN pequeños maduros, pero este método requiere una alta concentración de introducir la diana para una eficaz hibridación. El tamaño pequeño de los ARN pequeños maduros impide su amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa o con transcriptasa inversa (PCR), aunque se pueden amplificar precursores más grandes mediante la PCR. Se han desarrollado métodos para facilitar la amplificación de la PCR de los ARN pequeños maduros. Por ejemplo, se han alargado los ARN pequeños maduros mediante la adición de al menos un adaptador de oligonucleótidos. El documento WO 2011/146942 A1 divulga un método para detectar la presencia de miARN maduro en una muestra de ARN total. El documento WO 2012/112714 A1 divulga métodos para cuantificar el miARN en una muestra proporcionando secuencias de etiquetas específicas en los extremos 5' y 3'.

Existe todavía una necesidad de un método de captura, detección y análisis de ARN pequeño, que esté mejorado sobre la técnica anterior con respecto a al menos uno de los siguientes atributos: sensibilidad, velocidad, eficacia y economía.

Sumario

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se proporcionan métodos, composiciones y kits para la captura y detección de ARN pequeños maduros.

En determinadas realizaciones, se proporciona en el presente documento un método para detectar un ARN pequeño maduro en una muestra que comprende un ARN pequeños maduros, incluyendo el método: la poliadenilación del extremo 3' del ARN pequeño maduro y la ligadura de un adaptador monocatenario al extremo 5' del ARN pequeño maduro en presencia de ligasa de ARN monocatenario para formar un producto de ligadura del ARN, donde el adaptador comprende una porción de cebador directo universal; transcribir de manera inversa el producto de ligadura del ARN usando un cebador de transcripción inversa (RT)para formar un producto de ADNc del producto de ligadura del ARN, donde el cebador de RT comprende una porción poli(T) y una porción de cola, y la porción de cola comprende una porción de cebador inverso universal; preamplificar el producto de ADNc usando una primera pareja de cebador directo e inverso para formar un producto de amplificación, en donde el primer cebador directo puede hibridarse con la porción de cebador directo universal o su complemento, y el primer cebador inverso puede hibridarse con la porción de cebador inverso universal o su complemento; y detectar el producto de amplificación correspondiente al ARN pequeño maduro mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qPCR). La poliadenilación, ligadura, y transcripción inversa se llevan a cabo en el mismo recipiente de reacción, y la poliadenilación, ligadura, transcripción inversa y preamplificación se llevan a cabo sin que intervenga la extracción, precipitación, purificación y/u otros procesos de limpieza.

En determinadas realizaciones, se puede usar un agente bloqueante. En determinadas realizaciones, los métodos de amplificación comprende el uso de la activación mediante reacciones de polifosforolisis (APP) y agentes de polifosforolización.

En determinadas realizaciones, se proporcionan en el presente documento kits que comprenden un adaptador monocatenario que comprende un grupo -OH en el extremo 3' y una porción de cebador directo universal; un cebador de transcripción inversa (RT), donde el cebador de RT comprende una porción poli(T) y una porción de cola que comprende una porción de cebador inverso universal; una ligasa de ARN monocatenario, y una transcriptasa inversa. En determinadas realizaciones, la transcriptasa inversa es una transcriptasa inversa de inicio en caliente. El kit comprende además una ADN polimerasa y una pareja de cebadores directo e inverso universales, donde el cebador directo universal puede hibridarse con la porción de cebador directo universal o su complemento, y el cebador inverso universal puede hibridarse con la porción de cebador inverso universal o su complemento. El kit comprende además un oligonucleótido bloqueante seleccionado entre el grupo que consiste en un oligonucleótido bloqueante de MGB, un oligonucleótido bloqueante de 2'-O-metilo, un oligonucleótido bloqueante de acridina, un oligonucleótido bloqueante de fosfotioato, un oligonucleótido bloqueante de biotina, un oligonucleótido bloqueante de STAR, y un oligonucleótido bloqueante que comprende una secuencia de poli(A), en donde el oligonucleótido bloqueante suprime selectivamente la amplificación y/o la ligadura del subproducto adaptador-cebador.

En determinadas realizaciones, composiciones, tales como composiciones de reacción, se proporciona que comprendan un ADNc de un ARN pequeño maduro, comprendiendo el ADNc una secuencia adaptadora en el extremo 3' y un secuencia del cebador de transcripción inversa (RT) en el extremo 5', donde el cebador de RT comprende una porción poli(T) y una porción de cola que comprende una porción de cebador inverso universal, y en donde el adaptador comprende una porción de cebador directo universal; una polimerasa poli(A); una ARN ligasa 1; una transcriptasa inversa; y un oligonucleótido bloqueante seleccionado entre el grupo que consiste en un oligonucleótido bloqueante de MGB, un oligonucleótido bloqueante de 2'-O-metilo, un oligonucleótido bloqueante de acridina, un oligonucleótido bloqueante de fosfotioato, un oligonucleótido bloqueante de biotina, un oligonucleótido bloqueante de STAR, y un oligonucleótido bloqueante que comprende una secuencia de poli(A), en donde el oligonucleótido bloqueante suprime selectivamente la amplificación y/o la ligadura del subproducto adaptadorcebador.

Se divulga el uso de cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento para la identificación y/o la confirmación de los biomarcadores de ARN pequeño maduro que se pueden usar en detección y control de enfermedades, selección y seguimiento de tratamientos, así como los métodos de diagnóstico y/o pronóstico del paciente.

Breve descripción de los dibujos

El técnico experto entenderá que los dibujos descritos a continuación, son solo a fines ilustrativos. No se pretende que los dibujos limiten el alcance de las presentes enseñanzas en modo alguno.

La Fig. 1 representa esquemáticamente el flujo de trabajo de un ensayo de ARN pequeño maduro de cola universal de dos extremos de acuerdo con una de las realizaciones de las presentes enseñanzas.

Las Figs. 2A y 2B representan gráficamente el intervalo dinámico lineal (Fig. 2A) y la sensibilidad (FIG. 2B) de los métodos de acuerdo con las realizaciones de las presentes enseñanzas.

La Fig. 3 representa gráficamente una comparación de la sensibilidad promedio de 48 miARN con preamplificación (PA) y sin preamplificación (RT) a lo largo de un intervalo de cantidades de ARN de entrada. NTC es un control sin plantilla.

La Fig. 4 representa gráficamente una comparación de la sensibilidad de los métodos de ensayo en la detección del miARN en una preparación de ARN total del cerebro. Métodos de detección: TaqMan™ Individual MicroRNA Assays (Gold Std); ensayos de miARN de cola universal de dos extremos de acuerdo con las realizaciones de las presentes enseñanzas con una etapa de preamplificación con (+PA) y sin (-PA).

Las Figs. 5A-5D representan gráficamente el intervalo de la dinámica lineal y la sensibilidad de los métodos de acuerdo con las realizaciones de las presentes enseñanzas en la evaluación de 4 miARN en el ARN total de tejido cerebral (Figs. 5A y 5B) y de tejido de riñón (Figs. 5C y 5D).

Las Figs. 6A y 6B representan gráficamente 2 veces delta Ct (Fig. 6A) y la discriminación (Fig. 6B) de los miARN de 6 tejidos medidos de acuerdo con las realizaciones de las presentes enseñanzas.

Las Figs. 7A-7B representan gráficamente la cuantificación de 5 miARN en el ARN aislado de suero sanguíneo de dos donantes. Se midieron los niveles del miARN de acuerdo con las realizaciones de las presentes enseñanzas.

Las Figs. 8A-8B representan gráficamente la cuantificación de 5 miARN en el ARN aislado de plasma de sangre de dos donantes. Se midieron los niveles del miARN de acuerdo con las realizaciones de las presentes enseñanzas.

Las Figs. 9A-9B representan gráficamente la cuantificación de 5 miARN en el ARN aislado de la orina de dos donantes. Se midieron los niveles del miARN de acuerdo con las realizaciones de las presentes enseñanzas. Descripción de las realizaciones ilustrativas

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En el presente documento se proporcionan métodos, composiciones y kits para la captura y detección de los ARN diana utilizando un grupo fosfato en el extremo 5' y un grupo hidroxilo en el extremo 3' del ARN diana, tal como los ARN pequeños maduros. En determinadas realizaciones, las presentes enseñanzas proporcionan un método para detectar un ARN pequeño maduro, tal como un microARN (miARN), comprendiendo el método: proporcionar una muestra que comprende un ARN pequeño maduro, poliadenilar el extremo 3' del ARN pequeño maduro y ligar un adaptador monocatenario al extremo 5' del ARN pequeño maduro en presencia de una ligasa de ARN monocatenario para formar un producto de ligadura del ARN, en donde el adaptador comprende una porción de cebador directo universal, transcribir de manera inversa el producto de ligadura del ARN usando un cebador de transcripción inversa (RT)para formar un producto de ADNc del producto de ligadura del ARN, en donde el cebador de RT comprende una porción poli(T) y una porción de cola, y la porción de cola comprende una porción de cebador inverso universal; preamplificar el producto de ADNc usando una primera pareja de cebador directo e inverso para formar un producto de amplificación, en donde el primer cebador directo puede hibridarse con la porción de cebador directo universal o su complemento, y el primer cebador inverso puede hibridarse con la porción de cebador inverso universal o su complemento; y detectar el producto de amplificación correspondiente al ARN pequeño maduro mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qPCR). La poliadenilación, ligadura, y transcripción inversa se llevan a cabo en el mismo recipiente de reacción, y la poliadenilación, ligadura, transcripción inversa y preamplificación se llevan a cabo sin que intervenga la extracción, precipitación, purificación y/u otros procesos de limpieza. Se representa en la Fig. 1 un ejemplo no limitante de un flujo de trabajo que incluye la poliadenilación, la ligadura del adaptador, una cola universal y la transcripción inversa, una preamplificación universal y la detección del ARN pequeño maduro diana mediante la qPCR. En determinadas realizaciones, el ARN pequeño maduro diana es un miARN.

En determinadas realizaciones, se puede llevar a cabo la poliadenilación del ARN antes de la ligadura del adaptador en 5'. En otras realizaciones, se puede llevar a cabo la ligadura del adaptador en 5' al ARN antes de la poliadenilación. Las etapas de ligadura y la transcripción inversa se llevan a cabo juntas en un único recipiente de reacción (ligadura/RT en 1 etapa). En determinadas realizaciones, la transcripción inversa está catalizada por una enzima transcriptasa inversa de inicio en caliente. La digestión posterior a la ligadura del adaptador universal monocatenario es opcional pero no se requiere. La ligadura posterior del adaptador y/o y la extracción posterior a la transcripción inversa, la precipitación y/o la limpieza no se requieren. Las sucesivas reacciones del flujo de trabajo se llevan a cabo sin extracción, precipitación, purificación y/u otros medios de limpieza de los productos de reacción o componentes entre las etapas de reacción. Las etapas de poliadenilación, ligadura, transcripción inversa, y preamplificación se llevan a cabo sucesivamente sin que intervenga la extracción, precipitación, purificación y/u otros procesos de limpieza. La poliadenilación, ligadura, y transcripción inversa se pueden llevar a cabo en el mismo recipiente de reacción. En determinadas realizaciones, la poliadenilación, ligadura, transcripción inversa, y preamplificación se pueden llevar a cabo en el mismo recipiente de reacción. En determinadas realizaciones, las etapas de preamplificación y amplificación se llevan a cabo juntas en un único recipiente de reacción (preamplificación/amplificación en 1 etapa).

La ligadura de un único adaptador monocatenario al extremo 5' del ARN esta catalizada por una ligasa de ARN monocatenario (ligasa de ARNmc), tal como, por ejemplo, ARN Ligasa I. La ligadura del adaptador en 5' monocatenario se lleva a cabo en ausencia de ligadura a un oligonucleótido en forma de puente u otra secuencia que se hibrida al adaptador y al extremo 5' del ARN. En determinadas realizaciones, el adaptador monocatenario es una molécula de ARN. En determinadas realizaciones del método, un adaptador universal de ARN monocatenario se liga al grupo fosfato del extremo 5' del ARN pequeño maduro y el extremo 3' del producto de ligadura del ARN se poliadenila. En algunas realizaciones, los extremos 5' de la muestra de ARN (el ARN de entrada) no se modifica antes de la ligadura del adaptador en 5'. En determinadas realizaciones, el ARN de entrada no se trata para eliminar una estructura de tapa o el trifosfato que puede estar presente en el extremo 5'.

Para poliadenilar las moléculas de ARN pequeño maduro, se usa un único cebador que comprende una porción poli(T) como un cebador universal de la transcripción inversa (RT) y es compartido por todo el ADNc de los polinucleótidos diana en la muestra. Utilizando un adaptador universal de la ligadura en 5' y un cebador de RT universal, teniendo cada uno porciones de cebadores universales, se puede usar un par de cebadores universales para la preamplificación y/o la amplificación (por ejemplo, cebadores directo universal e inverso universal) para las moléculas de ARN pequeño maduro del ADNc que se han modificado con el adaptador y el cebador de RT.

La ligadura de la secuencia del adaptador de la ligadura en 5' al ARN pequeño maduro facilita la síntesis de un ADNc de longitud completa del ARN pequeño maduro ligado al adaptador. Con el adaptador ligado al extremo 5' del ARN, la reacción de transcripción inversa procede para copiar la secuencia completa en el extremo 5' del ARN pequeño maduro. Por consiguiente, en determinadas realizaciones, se proporcionan en el presente documento los métodos y el flujo de trabajo para detectar la base en el extremo 5' del ARN pequeño maduro diana. En algunas realizaciones, los métodos y el flujo de trabajo proporcionados en el presente documento pueden distinguir isómeros en el extremo 5' de los ARN pequeños maduros diana.

En determinadas realizaciones, el adaptador de la ligadura en 5' contiene secuencias que facilitan la entrada del ADNc o los productos de amplificación en un flujo de trabajo de secuenciación avanzada (NGS). En algunas realizaciones, el adaptador de la ligadura en 5' incluye al menos un código de barras, un código zip o una secuencia de direccionamiento que permita la captura, la clasificación, u otro procesamiento de otra forma adicional del ADNc o los productos de amplificación.

En determinadas realizaciones, el cebador de RT universal contiene secuencias que facilitan la entrada del ADNc o los productos de amplificación en el flujo de trabajo de secuenciación avanzada (NGS). En algunas realizaciones, el cebador de RT universal incluye al menos un código de barras, un código zip o una secuencia de direccionamiento que permita la captura, la clasificación, u otro procesamiento de otra forma adicional del ADNc o los productos de amplificación.

En determinadas realizaciones, se puede usar un oligonucleótido bloqueante. En determinadas realizaciones, se puede usar un oligonucleótido bloqueante en las etapas de ligadura y/o preamplificación.

En determinadas realizaciones, la muestra que contiene un ARN pequeño maduro puede ser una preparación del ARN total, un extracto celular o tisular, un fluido biológico (por ejemplo, suero sanguíneo), una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro, o una síntesis química. Las realizaciones del flujo de trabajo proporcionadas en el presente documento son particularmente útiles para la detección de especies de ARN pequeño maduro presentes en baja abundancia y/o se expresan a bajos niveles, así como para utilizar en el análisis tal como el ARN de muestras biológicas pequeñas, raras y/o limitadas. Por ejemplo, los métodos proporcionados son de uso en la detección y/o la cuantificación del ARN pequeño maduro en las preparaciones de ARN de biopsias tisulares, tejido incluido en parafina fijado en formalina o para formalina (FFPE), suero sanguíneo, plasma sanguíneo, y orina. Como se ha demostrado, los métodos proporcionados en el presente documento poseen una alta sensibilidad y especificidad para detectar y cuantificar el miARN en muestras de ARN con un número de copias relativamente bajo.

Los métodos, composiciones y kits proporcionados en el presente documento se pueden usar en la detección y/o la cuantificación de la expresión del ^a Rⁿ pequeño maduro en muestras biológicas. Los métodos, composiciones, y kits proporcionados en el presente documento se pueden usar en la identificación y/o la confirmación de los biomarcadores del ARN pequeño maduro para la detección y el seguimiento de la enfermedad. Los métodos proporcionados en el presente documento se pueden usar en el cribado de muestras de ARN de individuos o poblaciones de estados variables de salud, edad, u otras dolencias para los biomarcadores de miARN potenciales. Los métodos y composiciones proporcionados son muy adecuados para la preparación y el análisis de muestras de alto rendimiento. Por ejemplo, la cola universal de dos extremos del miARN en una muestra de ARN total permite la generación de un único ADNc o del producto de amplificación que refleja la población de miARN en la muestra de ARN y que se puede evaluar para identificar y/o cuantificar las especies de miARN en la muestra de ARN. En algunas realizaciones, los métodos proporcionados se llevan a cabo en un gran número de muestras de ARN al mismo tiempo, tal como en un proceso de alto rendimiento. En determinadas realizaciones, los recipientes de reacción usados en el flujo de trabajo son pocillos en una placa de 96 pocillos. En determinadas realizaciones, los recipientes de reacción usados en el flujo de trabajo son pocillos en una placa de 384 pocillos.

En determinadas realizaciones, los métodos proporcionados también son susceptibles de detectar y/o cuantificar la expresión del ARN pequeño maduro y otros tipos de ARN, tales como ARNm, de la misma muestra de ARN. Como se describe en el presente documento, el flujo de trabajo se puede llevar a cabo sin procesos de extracción o purificación entre las reacciones de poliadenilación, ligadura, transcripción inversa y/o reacciones de amplificación sucesivas. Por consiguiente, la mezcla de reacción que contiene el producto de ARN pequeño maduro del ADNc o el producto de amplificación contiene también ARN que está presente en la muestra al comienzo del flujo de trabajo. Por ejemplo, tras la etapa de transcripción inversa o la etapa de preamplificación, se puede eliminar una porción de la reacción y utilizarse para detectar y/o cuantificar la expresión de otro ARN diana, tal como un ARNm. Usar la mezcla de reacción del flujo de trabajo para la detección y/o la cuantificación de ambos tipos de ARN permite realizar una correlación entre la expresión del ARN pequeño maduro y el ARNm de la misma muestra original. Esto puede ser beneficioso para el análisis de muestra de ARN pequeñas y/o limitadas o materiales de la fuente.

Se han descrito métodos para extender la longitud del microARN poliadenilando el extremo 3', transcribiendo de manera inversa el miARN poliadenilado para formar ADNc, y ligando un adaptador de oligonucleótido usando un oligonucleótido en forma de puente complementario al extremo 3' del microARN del ADNc con una ligasa monocatenaria. Cuando comienza con una muestra que contiene un transcriptoma de ARN completo, el método de ligadura bicatenaria captura la mezcla completa de los ARN incluyendo el microARN, ARNnc, ARNr, ARNm y los ARNip y da como resultado una preparación ligada con alta complejidad para la posterior detección y cuantificación. En contraste, los métodos proporcionados en el presente documento utilizan una ligasa de ARN monocatenario que liga solo con moléculas de ARN que tienen extremos 5' monofosforilados, excluyendo el ARN con caperuza en 5' y el ARN trifosforilado en 5'. El uso de una ligasa de ARN monocatenario en el flujo de trabajo proporcionado en el presente documento mejoró la eficacia de ligadura global de la diana desde menos del 10% (con el método de ligadura bicatenario) a más del 50 % y reduce el fondo de los productos secundarios de la ligadura. Por consiguiente, el uso de los métodos y composiciones proporcionados reduce la complejidad del producto capturado para la detección y la cuantificación. Cuando se capturan ARN pequeños, usando adaptadores con oligonucleótidos en forma de puente para generar una ligadura bicatenaria se requieren miles de oligonucleótidos o secuencias en forma de puente diferentes para asegurar la complementariedad de la secuencia con los ARN pequeños diana. En contraste, no se requieren oligonucleótidos en forma de puente para la ligadura en los métodos proporcionados en el presente documento.

El uso de los cebadores universales y el flujo de trabajo de la amplificación proporcionados en el presente documento proporciona una o más de las siguientes ventajas: 1) permite una reacción de un solo plex; 2) reduce los sesgos específicos de diana en la ligadura y la amplificación; 3) elimina las combinaciones fijas o personalizadas de los cebadores específicos de diana, tales como los cebadores específicos de ARN pequeño; 4) elimina la restricción del número de dianas; 5) elimina la necesidad de diseñar actualizaciones basadas en especies de ARN pequeño maduro descubiertas recientemente; 6) elimina la necesidad del desarrollo y la validación de combinaciones de cebadores específicos de ARN pequeño; y 7) simplifica la fabricación debido a que solo se requiere un conjunto de cebadores universales para amplificar una población de los ARN diana, tal como los ARN pequeños. De manera adicional, este sistema permite una flexibilidad aumentada para el diseño de cebadores y diseño de sondas específicos de diana debido al ARN diana, tal como ARN pequeño maduro, se puede detectar directamente mediante métodos de ensayo tales como PCR en tiempo real. Además, la capacidad de llevar a cabo reacciones sucesivas sin intervenir en los procesos de limpieza proporciona las siguientes ventajas: 1) simplifica el flujo de trabajo; 2) disminuye el tiempo hasta los resultados; 3) disminuye las manipulaciones en el tiempo; y 4) reduce la variación entre ensayos.

En determinadas realizaciones, se proporcionan composiciones que comprenden un oligonucleótido bloqueante para bloquear el adaptador-cebador ligado a la formación y/o amplificación de subproductos. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido bloqueante es ADN. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido bloqueante es ARN. En determinadas realizaciones, el oligonucleótido bloqueante comprende una porción de poli(A). En determinadas realizaciones, el oligonucleótido bloqueante comprende un agente bloqueante, incluyendo, aunque no de forma limitativa, 2'-O-metilo, acridina, y un aglutinante del surco menor (MGB).

Para describir de forma más clara y concisa y señalar la materia objeto de la presente divulgación, se proporcionan las siguientes definiciones de términos específicos que se usan en la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas. A lo largo de la memoria descriptiva, las ilustraciones de los términos específicos deben considerarse como ejemplos no limitantes.

Como se usa en la presente memoria descriptiva, las palabras "un" o "uno/a" significan "al menos uno o una, a menos que se indique específicamente lo contrario. En la presente memoria descriptiva, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente otra cosa. Por ejemplo, pero no como limitación, "un ácido nucleico diana" significa que puede estar presente más de un ácido nucleico diana; por ejemplo, una o más copias de una especie concreta de ácido nucleico diana, así como dos o más especies diferentes del ácido nucleico diana. El término "y/o" significa que los términos antes y después del corte pueden tomarse juntos o por separado. A fines ilustrativos, pero no como limitación, "X y/o Y" puede significar "X" o "Y" o "X" e "Y".

Se apreciará que hay un "aproximadamente" implícito antes de las temperaturas, concentraciones, tiempos, etc., descritos en la presente divulgación, de forma que hay unas desviaciones leves e insustanciales dentro del alcance de las presentes enseñanzas del presente documento. Además, el uso de "comprende", "comprenden", "que comprenden", "contiene", "contienen", "que contienen", "incluye", "incluyen", y "que incluyen" no se pretende que sea limitante. Debe entenderse que tanto la anterior descripción general como la siguiente descripción detallada son únicamente ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de las enseñanzas.

A no ser que se indique específicamente en la anterior memoria descriptiva, las realizaciones en la anterior memoria descriptiva que enumera "que comprenden" diversos componentes se contemplan también como "que consisten en" o " que consisten esencialmente en" los componentes enumerados; las realizaciones en la anterior memoria descriptiva que enumeran "que consiste en" diversos componentes se contemplan también como "que consisten en" o " que consisten esencialmente en" los componentes enumerados; y realizaciones en la memoria descriptiva que enumeran "que consiste esencialmente en" diversos componentes que se contemplan también como "que consisten en" o "que comprenden" los componentes enumerados (esta intercambiabilidad no se aplica al uso de estos términos en las reivindicaciones).

La expresión "o combinaciones de los mismos" como se usa en el presente documento se refiere a todas las permutaciones y combinaciones de los términos relacionados que preceden al término. Por ejemplo, "A, B, C, o combinaciones de los mismos" se pretende que incluya al menos uno de: A, B, C, AB, AC, BC o ABC, y, si el orden es importante en un contexto concreto, también BA, CA, CB, ACB, CBA, BCA, BAC, o CAB. Continuando con este ejemplo, se incluyen expresamente combinaciones que contienen repeticiones de uno o más elementos o términos, tales como BB, AAA, Aa B, BBC, AAABCCCC, Cb BaAA, CABABB y así sucesivamente. El experto en la materia entenderá que normalmente no hay ningún límite para el número de elementos o términos en ninguna combinación, a menos que resulte evidente de otra forma a partir del contexto.

Los encabezamientos de las secciones usados en el presente documento tienen fines únicamente organizativos y no deben considerarse como limitantes en modo alguno de la materia objeto descrita. Aunque las presentes enseñanzas se describen junto con diversas realizaciones, no se pretende que las presentes enseñanzas estén limitadas a dichas realizaciones.

El término "hibridación", incluyendo, sin limitación, variaciones de las palabras raíces "hibridar", se usa de manera indistinta y significa y significa la interacción complementaria de emparejamiento de bases de nucleótidos de un ácido nucleico con otro ácido nucleico que da como resultado la formación de un duplete, triplete, u otra estructura de orden superior. La interacción primaria es normalmente específica de bases de nucleótidos, por ejemplo, A:T, A:U, y G:C, de Watson-Crick y enlace de hidrógeno de tipo Hoogsteen. En determinadas realizaciones, el apilamiento de bases y las interacciones hidrófobas pueden contribuir también a la estabilidad del duplete. Son bien conocidas en la técnica las condiciones bajo las cuales se hibridan las sondas y los cebadores a secuencias complementarias, por ejemplo, como se describe en Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, Hames y Higgins, eds., IRL Press, Washington, D.C. (1985) y Wetmur y Davidson, Mol. Biol. 31:349 (1968).

En general, si dicha hibridación tiene lugar está influenciada por, entre otras cosas, la longitud del polinucleótido y la complementariedad, el pH, la temperatura, la presencia de cationes monovalentes y divalentes, la proporción de nucleótidos G y C en la región de hibridación, la viscosidad del medio, y la presencia de desnaturalizantes. Dichas variables influencian el tiempo requerido para la hibridación. Por lo tanto, las condiciones de hibridación preferidas dependerán de la aplicación concreta. Dichas condiciones, sin embargo, pueden determinarse de forma rutinaria por personas normalmente expertas en la materia, sin excesiva experimentación. Se apreciará que la complementariedad necesaria no es perfecta; existe un número pequeño de emparejamientos incorrectos de pares de bases que interferirán mínimamente con la hibridación entre la secuencia diana y los ácidos nucleicos monocatenarios de las presentes enseñanzas. Sin embargo, si el número de emparejamientos incorrectos de pares de bases es tan grande que puede no producirse la hibridación en condiciones mínimamente restrictivas, entonces, generalmente, la secuencia no es generalmente una secuencia diana complementaria. Por lo tanto, por "complementariedad" en el presente documento se entiende que las sondas o cebadores son suficientemente complementarias para hibridarse a la secuencia diana bajo las condiciones de reacción seleccionadas para alcanzar los extremos de las presentes enseñanzas. Preferentemente, las condiciones de hibridación se seleccionan para permitir que los cebadores y/o las sondas se hibriden selectivamente con una secuencia complementaria en la secuencia o amplicón que flanquea la diana correspondiente, pero no se hibridan en cualquier grado significativo a los diferentes ácidos nucleicos diana o secuencias no diana en la composición de reacción a la segunda temperatura de reacción.

La expresión "aglutinante del surco menor" o "MGB" como se usa en el presente documento se refiere a una molécula pequeña que se ajusta en el surco menor de un ADN bicatenario, algunas veces, en una manera específica de secuencia. En general, los aglutinantes del surco menor son moléculas planas largas, que pueden adoptar una forma de tipo crescente y por tanto, encajar perfectamente en el surco menor de una doble hélice, desplazando a menudo el agua. Las moléculas de unión al surco menor comprenden normalmente algunos anillos aromáticos conectados por enlaces con libertad de torsión, por ejemplo, aunque no de forma limitativa, anillos de furano, benceno, o pirrol.

Como se usa en el presente documento, los términos "polinucleótido", "oligonucleótido", y "ácido nucleico" se usan indistintamente y se refieren a polímeros de monómeros de nucleótidos monocatenarios y bicatenarios, incluyendo, sin limitación, 2-desoxirribonucleótidos (ADN) y ribonucleótidos (ARN) unidos por enlaces de uniones fosfodiéster internucleótidos, o análogos de internucleótidos, y contraiones asociados, por ejemplo, H+, NH4+, trialquilamonio, Mg2+, Na+, y similares. Un polinucleótido puede estar compuesto completamente por desoxirribonucleótidos, completamente de ribonucleótidos, o mezclas quiméricas de los mismos y puede incluir análogos de nucleótidos. Las unidades de monómeros de nucleótidos pueden comprender cualquiera de los nucleótidos descritos en el presente documento, incluyendo, aunque no de forma limitativa, nucleótidos y/o análogos de nucleótidos. Los polinucleótidos varían normalmente de tamaño desde unas pocas unidades monoméricas, por ejemplo, 5-40 cuando se denominan algunas veces en la técnica como oligonucleótidos, a algunos miles de unidades de nucleótidos monoméricos. A menos que se denote otra cosa, siempre que se represente una secuencia de polinucleótidos, se entenderá que los nucleótidos están en el orden 5' a 3' desde la izquierda a la derecha y que "A" denota desoxiadenosina, "C" denota desoxicitosina, "G" denota desoxiguanosina, "T" denota desoxitimidina, y "U" denota desoxiuridina, a no ser que se indique otra cosa.

El término "nucleótido" se refiere, a un éster fosfato de un nucleósido, por ejemplo, ésteres trifosfato, en donde el sitio más común de esterificación es el grupo hidroxilo unido en la posición C-5 de la pentosa.

El término "nucleósido" se refiere a un compuesto que consiste en una purina, desazapurina, o base del nucleósido pirimidina, por ejemplo, adenina, guanina, citosina, uracilo, timina, desazaadenina, desazaguanosina, y similares, unida a una pentosa en la posición 1', incluyendo las formas 2'-desoxi y 2'-hidroxilo. Cuando la base de nucleósido es purina o 7-desazapurina, la pentosa se une a la nucleobase en la posición 9 de la purina o la desazapurina, y cuando la nucleobase es pirimidina, la pentosa se une a la nucleobase en la posición 1 de la pirimidina.

El término "análogo" incluye análogos sintéticos que tienen restos de bases modificadas, restos de azúcares modificados, y/o restos de ésteres fosfato modificados. Los análogos de fosfato comprenden generalmente análogos de fosfato en donde el átomo de fósforo está en el estado de oxidación 5 y uno o más de los átomos de oxígeno está sustituido con un resto no de oxígeno, por ejemplo, azufre. Los análogos de fosfato ilustrativos incluyen: fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoanilidato, fosforamidato, boronofosfatos, incluyendo los contraiones asociados, por ejemplo, H+, NH⁴+, Na+. Los análogos de bases ilustrativos incluyen: 2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudouridina, C-5-propino, isocitosina, isoguanina, 2-tiopirimidina. Los análogos de azúcares ilustrativos incluyen: modificaciones en 2' o 3' donde la posición 2' o 3' es hidrógeno, hidroxi, alcoxi, por ejemplo, metoxi, etoxi, aliloxi, isopropoxi, butoxi, isobutoxi y fenoxi, azido, amino o alquilamino, flúor, cloro, y bromo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "polinucleótido diana" se refiere a una secuencia de polinucleótido que se procura detectar. Se puede obtener el polinucleótido diana a partir de cualquier fuente, y puede comprender cualquier número de diferentes componentes de la composición. Por ejemplo, la diana puede ser un ácido nucleico (p. ej. ADN, ARN), ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN de interferencia pequeño (ARNip), microARN (miARN), u otro ARN pequeño maduro, y puede comprender análogos de ácidos nucleicos u otros mimetizadores de ácidos nucleicos. La diana puede estar metilada, no metilada, o ambas. La diana pueden ser citosinas tratadas con bisulfito y citosinas no metiladas convertidas en uracilo. Además, se apreciara que el "polinucleótido diana" puede referirse a propio polinucleótido diana, así como sus sustitutos, por ejemplo, los productos de la amplificación y las secuencias nativas. En determinadas realizaciones, el polinucleótido diana es una molécula de miARN. En determinadas realizaciones, el polinucleótido diana carece de una cola poli-A. En determinadas realizaciones, el polinucleótido diana es una molécula de ARN pequeño maduro. Los polinucleótidos diana de las presentes enseñanzas pueden derivarse de cualquier número de fuentes, incluyendo, sin limitación, virus, arqueas, protistas, procariotas y eucariotas, por ejemplo, aunque no de forma limitativa, plantas, hongos y animales. Estas fuentes pueden incluir, aunque no de forma limitativa, sangre completa, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, una biopsia de tejido, tejido fijado con formalina incluido en parafina, linfa, médula ósea, líquido amniótico, cabello, piel, semen, orina, agentes de guerra biológica, secreciones anales, secreciones vaginales, sudoración, saliva, frotis bucales, diversas muestras ambientales (por ejemplo, agrícolas, de agua y suelo), muestras de investigación en general, muestras purificadas en general, células cultivadas y células lisadas. Se apreciará que los polinucleótidos diana pueden aislarse de muestras que utilizan cualquiera de varios procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, el kit de aislamiento de miARN Ambion™ mirVana™ (Thermo Fisher Scientific, Inc.), el kit de purificación de A^r N Ambion™ mirVana™ PARIS™ (Thermo Fisher Scientific, Inc.), el kit de aislamiento de ARN total Ambion™ MagMAX™ mirVana™ (Thermo Fisher Scientific, Inc.), Applied Biosystems™ TaqMan™ MicroRNA Cellsto-CT™ Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.), Kits de purificación ^a B^c del miARN Applied Biosystems™ TaqMan™ (Thermo Fisher Scientific, Inc.), y similares. Se apreciará que los polinucleótidos diana pueden cortarse o cizallarse antes del análisis, incluyendo el uso de dichos procedimientos como fuerza mecánica, tratamiento por ultrasonidos, escisión mediante la endonucleasa de restricción, o cualquier método conocido en la técnica. En general, los polinucleótidos diana de las presentes enseñanzas serán monocatenarios, aunque en algunas realizaciones, el polinucleótido diana puede ser bicatenario, y un polinucleótido monocatenario puede ser resultado de la desnaturalización.

Como se usa en el presente documento, la expresión "ARN pequeño maduro" se refiere a una molécula de ARN pequeña que comprende generalmente aproximadamente 20-30 nucleótidos que se procesó a partir de un precursor de ARN más grande. Normalmente, un ARN pequeño maduro tiene un grupo fosfato en el extremo 5' y un grupo hidroxilo en el extremo 3'. Se pueden detectar algunos tipos diferentes de moléculas de ARN pequeñas mediante los métodos proporcionados en el presente documento. Los ejemplos de ARN pequeños maduros que pueden detectarse incluyen, aunque no de forma limitativa, microARN (miARN), ARN de interferencia pequeño (ARNip), ARN en horquilla pequeño (o pequeño) (ARNhp), ARNip asociado a repeticiones (ARNipar), ARNip transactuante (ARNipta), ARN interactuante con Piwi (ARNpi) y ARN de 21U. El a Rn pequeño puede estar codificado en el genoma o puede originarse a partir de una molécula de ARN bicatenario exógeno. La longitud del ARN pequeño que puede detectarse mediante los métodos descritos en el presente documento puede variar. En determinadas realizaciones, el ARN pequeño maduro puede variar desde aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, el ARN pequeño maduro puede variar desde aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 35 nucleótidos de longitud. En otras realizaciones, el ARN pequeño maduro puede ser de aproximadamente 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32 nucleótidos de longitud.

La cantidad de ARN pequeño maduro en la muestra añadida a la reacción de ligadura o a la reacción de poliadenilación puede variar dependiendo de la fuente de la muestra que contiene el ARN. En general, cualquier cantidad del ARN pequeño maduro que se puede ligar a un adaptador en 5' se puede usar en una etapa de ligadura y cualquier cantidad de ARN pequeño maduro que se puede poliadenilar puede usarse en la etapa de poliadenilación. Normalmente, la cantidad de ARN pequeño maduro purificado usado por volumen de reacción será menor que la cantidad de ARN total usada por volumen de reacción. En determinadas realizaciones, la cantidad de ARN total varía desde aproximadamente 100 ng a aproximadamente 20 pg. En determinadas realizaciones, la cantidad de ARN total varía desde aproximadamente 100 ng a aproximadamente 2,5 ng.

Como se usa en el presente documento, los términos "adaptador" y "adaptador de la ligadura" son equivalentes y se usan de manera indistinta y se refieren a un oligonucleótido que está ligado en el extremo 5' del ARN pequeño maduro (es decir, un adaptador de la ligadura en 5'). Los nucleótidos del adaptador de la ligadura en 5' pueden ser convencionales o naturales (es decir, adenosina, guanosina, citidina, timidina, y uridina) así como nucleótidos no convencionales. Los ejemplos no limitantes de nucleótidos no convencionales incluyen inosina, xantosina, isoguanosina, isocitidina, diaminopirimidina y desoxiuridina. Los adaptadores de la ligadura pueden comprender nucleótidos modificados o derivatizados. Los ejemplos no limitantes de modificaciones en la ribosa o los restos de bases incluyen la adición, o la eliminación, de grupos acetilo, grupos amino, grupos carboxilo, grupos carboximetilo, grupos hidroxilo, grupos metilo, grupos fosforilo y grupos tiol. En particular, se incluyen 2'-O-metilo y los nucleótidos de ácidos nucleicos bloqueados (^lN^a ). Los ejemplos adecuados de nucleótidos derivatizados incluyen aquellos con colorantes unidos covalentemente, tales como colorantes fluorescentes o colorantes de inactivación, u otras moléculas tales como biotina, digoxigenina, o partículas magnéticas o microesferas. Los adaptadores de la ligadura pueden comprender también análogos de nucleótidos sintéticos tales como morfolinos o ácidos nucleicos peptídicos (PNA). Enlaces de fosfodiésteres o enlaces de fosfotioato pueden unir los nucleótidos o los análogos de nucleótidos de los enlazadores.

En determinadas realizaciones, el adaptador de la ligadura en 5' es un oligonucleótido lineal. En determinadas realizaciones, el adaptador de la ligadura en 5' comprende una porción de cebador directo universal localizada en la dirección 5' del extremo 3' del adaptador (denominado también en el presente documento como "adaptador universal" o un "adaptador universal en 5'" o un "adaptador de la ligadura universal" o "adaptador de la ligadura universal en 5'"). En determinadas realizaciones, el adaptador de la ligadura en 5' es un oligonucleótido de ARN. En determinadas realizaciones, el adaptador de la ligadura en 5' comprende una porción de cebador directo universal en la región del extremo 5' del adaptador. El adaptador de la ligadura en 5' puede tener cualquier base en el extremo 3' siempre que sea compatible para la ligadura con el extremo 5' del ARN pequeño maduro. En determinadas realizaciones, la base en el extremo 3' del adaptador de la ligadura en 5' es A. En determinadas realizaciones, la base en el extremo 3' del adaptador de la ligadura en 5' es C. En determinadas realizaciones, la base en el extremo 3' del adaptador de la ligadura en 5' es G. En determinadas realizaciones, la base en el extremo 3' del adaptador de la ligadura en 5' es T.

La longitud del adaptador de la ligadura en 5' variará dependiendo de, por ejemplo, la longitud deseada del producto de la ligadura y las características deseadas del adaptador. En general, el adaptador de la ligadura en 5' puede variar desde aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos de longitud, más preferentemente desde aproximadamente 19 nucleótidos a aproximadamente 26 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, el adaptador de la ligadura en 5' puede tener aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, la Tf del adaptador de la ligadura varía desde aproximadamente 30 °C a aproximadamente 60 °C.

En determinadas realizaciones, el adaptador de la ligadura en 5' contiene una estructura de tallo-bucle (denominada en el presente documento "adaptador de la ligadura de tallo-bucle en 5'"), en donde el adaptador de la ligadura de tallo-bucle en 5' comprende un tallo y un bucle, en donde el extremo 3' del adaptador es monocatenario en el momento de la ligadura hasta el extremo 5' del ARN pequeño maduro. En determinadas realizaciones, el adaptador de la ligadura de tallo-bucle en 5' es un oligonucleótido híbrido de ADN-ARN. En determinadas realizaciones, la porción de cebador directo universal se localiza en la porción del tallo del adaptador de la ligadura de tallo-bucle en 5'. En determinadas realizaciones, la porción de cebador directo universal se localiza en la porción del bucle del adaptador de la ligadura de tallo-bucle en 5'. En determinadas realizaciones, la porción del cebador directo universal se localiza en las porciones del tallo y el bucle del adaptador de la ligadura de tallo-bucle en 5'.

Como se usa en el presente documento, el término "tallo" se refiere a la región bicatenaria del adaptador de la ligadura de tallo-bucle que está localizado entre el extremo 3' y el bucle. En general, el tallo tiene entre aproximadamente 10 nucleótidos y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, más preferentemente, el tallo tiene entre 12 y aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, el tallo tiene aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de longitud. Como un asunto general, en aquellas realizaciones en las que una porción del cebador universal está codificada en el tallo, el tallo puede ser más largo. En aquellas realizaciones en las que una porción del cebador universal no está codificada en el tallo, el tallo puede ser más corto. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los tallos más cortos de aproximadamente 10 nucleótidos y más largos de aproximadamente 20 nucleótidos pueden identificarse en el curso de la metodología rutinaria y sin experimentación excesiva de tal manera que las presentes enseñanzas contemplan tallos más cortos y más largos.

Como se usa en el presente documento, el término "bucle" se refiere a la región monocatenaria del adaptador de la ligadura de tallo-bucles que se localiza entre las dos hebras complementarias del tallo, y normalmente, el bucle comprende nucleótidos monocatenarios, aunque son también posibles otros restos tales como ADN o ARN modificado, separadores de carbono tales como C18 y/o polietilenglicol (PEG). En general, el bucle tiene entre aproximadamente 10 y aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, más preferentemente, el bucle tiene entre 17 nucleótidos y 19 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, el bucle tiene aproximadamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de longitud. Como un asunto general, en aquellas realizaciones en las que una porción del cebador universal está codificada en el bucle, el bucle puede ser generalmente más largo. En aquellas realizaciones en las que no está codificada una porción del cebador universal en el bucle, el bucle puede ser generalmente más corto. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que los bucles más cortos de aproximadamente 10 nucleótidos y más largos de aproximadamente 20 nucleótidos pueden identificarse en el curso de la metodología rutinaria sin experimentación excesiva y que se contemplan bucles más cortos y más largos por las presentes enseñanzas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "producto de la ligadura" se refiere a una molécula híbrida que comprende al menos el adaptador de la ligadura en 5' y un ARN pequeño maduro. El producto de la ligadura se genera sin el uso de un oligonucleótido complementario en forma de puente para el adaptador de la ligadura y el ARN pequeño maduro.

La secuencia universal del adaptador de la ligadura en 5' facilita la síntesis del ADNc de longitud completa del ARN pequeño maduro ligado al adaptador. Con el adaptador ligado al extremo 5' del ARN, la reacción de transcripción inversa procede para copiar la secuencia completa en el extremo 5' del ARN pequeño maduro. La secuencia universal del adaptador de la ligadura en 5' facilita la preamplificación y/o la amplificación de la PCR del producto de ADNc usando cebadores universales. Para impulsar la ligadura del adaptador de la ligadura en 5' al ^a Rⁿ pequeño maduro, se usa una cantidad en exceso del adaptador de la ligadura; por lo tanto, la ligadura entre los dos adaptadores de la ligadura puede producirse subproductos de fondo no específicos. El uso de un adaptador de la ligadura en 5' que tiene grupos hidroxilo en los extremos 5' y 3' evita la ligadura adaptador-adaptador y por tanto limita el fondo no específico debido a la ligadura entre dos adaptadores. La ligadura entre los cebadores de la transcripción inversa universales libres (sin hibridar) y los adaptadores de la ligadura en 5' puede producirse como un subproductos durante la etapa de ligadura en los métodos proporcionados, dicho subproducto conduce a un fondo no específico durante la detección. En determinadas realizaciones, el uso de una enzima transcriptasa inversa de inicio en caliente para la etapa de transcripción inversa suprime el subproducto adaptador-cebador. En determinadas realizaciones, se usan oligonucleótidos bloqueantes para suprimir selectivamente la amplificación y/o la ligadura del subproducto adaptador-cebador para reducir el fondo. Se pueden usar en las etapas de ligadura, extensión y/o amplificación oligonucleótidos de ADN marcados en el extremo 5' o 3' con grupos bloqueantes, tales como acridina, MGB, 2'-O-metilo, bloqueantes restrictivos de la amplificación dirigidos a secuencia (STAR), y oligonucleótidos bloqueantes que comprenden una secuencia poli(A). Se encontró que la adición de dicho oligonucleótido bloqueante reduce drásticamente la amplificación del fondo y aumenta la sensibilidad de detección del miARN mediante la qPCR con los ensayos TaqMan™ de la qPCR.

Un oligonucleótido bloqueante de STAR comprende una secuencia de la etiqueta STAR en el extremo 5' del oligonucleótido, siendo la secuencia de la etiqueta STAR complementaria a toda o a una porción de otra secuencia de cebador que se usa en la reacción de amplificación. Cuando se extiende el cebador bloqueante de STAR, el producto de la extensión comprende la secuencia de la etiqueta STAR en el extremo 5' y el complemento de la secuencia de la etiqueta STAR en la región 3' del producto de la extensión. Por lo tanto, el producto de la extensión del cebador STAR puede replegarse para autohibridarse formando una estructura de tallo-bucle. La estructura de tallo-bucle del cebador STAR extendido excluye la unión del otro cebador usado para amplificar la molécula diana, inhibiendo por tanto la amplificación de diana no deseada (por ejemplo, un producto de la ligadura adaptadoradaptador). En determinadas realizaciones, la secuencia de la etiqueta STAR puede comprender una porción de la secuencia interna del amplicón para bloquear la hibridación de otro cebador o la extensión de la ADN polimerasa. Se pueden usar cebadores STAR para la supresión de la amplificación selectiva de los adaptadores de la ligadura ligados en la preamplificación del ARN pequeño maduro o el ADNc ligados a adaptador en los métodos proporcionados. Se describen cebadores STAR en el documento de Estados Unidos con n.° de serie 14/071444, presentado el 4 de noviembre de 2013, y publicado como la publicación de patente de Estados Unidos. n.° 2014/0134614.

En determinadas realizaciones, el oligonucleótido bloqueante comprende una porción poli(A) y está presente durante la reacción de ligadura. En los métodos en los que un ARN pequeño maduro poliadenilado tiene un adaptador ligado en el extremo 5' y se transcribe de manera inversa usando un cebador de la transcripción inversa universal para generar un ADNc, la inclusión de un oligonucleótido bloqueante durante la reacción de ligadura puede suprimir selectivamente la formación de un subproducto del cebador de RT universal del adaptador. En determinadas realizaciones, un oligonucleótido bloqueante tiene una estructura de tallo-bucle y un poli(A) que contiene una porción saliente bicatenaria en su extremo 3'. En otras realizaciones, el oligonucleótido bloqueante es un oligonucleótido lineal y tiene una porción poli(A) en su extremo 5' y secuencias complementarias al cebador de la transcripción inversa universal en su extremo 3'. En determinadas realizaciones, la porción no de poli(A) del oligonucleótido bloqueante comprende desoxiuridina. En determinadas realizaciones, la Tf del cebador de RT y los bloqueantes comprende una porción poli(A) varía desde aproximadamente 30 °C a aproximadamente 60 °C, desde aproximadamente 35 °C a aproximadamente 50 °C, o aproximadamente 38 °C a aproximadamente 42 °C.

Un "grupo bloqueante" es un resto químico que se puede añadir a un nucleótido o un ácido nucleico para evitar o minimizar la adición de nucleótidos por una ADN polimerasa. Añadiendo un grupo bloqueante al extremo 3'-OH, el nucleótido ya no puede participar en la formación del enlace fosfodiéster catalizada por la ADN polimerasa. Algunos ejemplos no limitantes incluyen, un grupo alquilo, enlazadores no nucleótidos, fosforotioato, restos de alcano-diol, APN, ANB, análogos de nucleótidos que comprenden un grupo 3'-amino en lugar del grupo 3'-OH, análogos de nucleótidos que comprenden un grupo 5'-OH en lugar de un grupo 5'-fosfato, derivados de nucleótidos que carecen de un grupo 3'-OH, biotina, intercaladores de ácidos nucleicos, acridina, y un aglutinante del surco menor. Un grupo bloqueante de alquilo es un hidrocarburo saturado que puede ser de cadena lineal, ramificada, cíclica, o combinaciones de los mismos. Algunos ejemplos no limitantes de nucleótidos no extendibles incluyen nucleótidos que tienen un grupo 3'-hidroxilo que se ha modificado tal como mediante sustitución con hidrógeno o flúor o mediante la formación de un éster, amida, sulfato o glicósido. Estos nucleótidos no tienen generalmente cadena extendible. Otros ejemplos de nucleótidos no extendibles que se pueden usar incluyen nucleótidos que tienen restos de ribosa modificados. En determinadas realizaciones, los ribonucleótidos pueden servir como nucleótidos no extendibles debido a que los oligonucleótidos que terminan en ribonucleótidos no se pueden extender por determinadas ADN polimerasas. La ribosa puede estar modificada para incluir derivados 3'-desoxi que incluyen aquellos en los que el 3'-hidroxi está sustituido por un grupo funcional diferente que el hidrógeno, por ejemplo, como un grupo azida. En determinadas realizaciones, un nucleótido no extendible comprende un didesoxinucleótido (ddN), por ejemplo, aunque no de forma limitativa, una didesoxiadenosina (ddA), una didesoxicitosina (ddC), una didesoxiguanosina (ddG), una didesoxitimidina (ddT), o una didesoxiuridina (ddU). En una realización preferida, el grupo bloqueante se selecciona entre el grupo que consiste en un aglutinante del surco menor, un grupo 2'-O-metilo, una biotina, una acridina, y un grupo fosfotioato.

La ligadura de los adaptadores de la ligadura al ARN pequeño maduro está catalizada por una ligasa de ARN monocatenario, por ejemplo, la ARN ligasa I. En determinadas realizaciones, los métodos, kits y composiciones proporcionados en el presente documento incluyen una ligasa de ARN monocatenario, tal como una ARN ligasa I. En determinadas realizaciones, los métodos, kits y composiciones proporcionados en el presente documento incluyen la ARN ligasa I.

Las condiciones de la reacción de ligadura se ajustan normalmente para que la ligasa funcione cerca de su nivel de actividad óptimo. Se puede utilizar un agente tamponante para ajustar y mantener el pH al nivel deseado. Los ejemplos representativos de tampones adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, MOPS, HEPES, TAPS, Bicina, Tricina, TES, PIPES, MES, acetato de sodio y tampón Tris. La mezcla de ligadura puede comprender además un catión divalente. Los cationes divalentes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa calcio, magnesio y manganeso. La mezcla de reacción puede comprender además un agente reductor. Los ejemplos no limitantes incluyen ditiotreitol y p-mercaptoetanol. Se puede añadir también un inhibidor de la ribonucleasa (ARNasa) a la mezcla de la ligadura. La mezcla de la ligadura puede comprender además ATP.

Como se usa en el presente documento, la expresión "reacción de extensión" se refiere a una reacción de alargamiento en la que el extremo 3' de una secuencia de cebador se hibrida a una secuencia diana que se extiende para formar un "producto de la reacción de extensión" que comprende una hebra complementaria al polinucleótido diana. Como se usa en el presente documento, "transcripción inversa" se denomina también a una reacción de extensión. En determinadas realizaciones, la reacción de extensión es una reacción de transcripción inversa que comprende una polimerasa, tal como una transcriptasa inversa. En algunas realizaciones, el polinucleótido diana es una molécula de miARN poliadenilado que tiene un adaptador de ARN ligado al extremo 5' y la reacción de extensión es una reacción de transcripción inversa que comprende una transcriptasa inversa, por lo cual se realiza una copia de ADN del producto de ligadura del miARN.

Las transcriptasas inversas incluyen cualquier enzima que tiene actividad transcriptasa inversa. Dichas enzimas incluyen, aunque no de forma limitativa, la transcriptasa inversa retrovírica (por ejemplo, las transcriptasas inversas del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (VLM-M), Virus de la Mieloblastosis Aviar (VMA) o el Virus del Sarcoma de Rous (VSR)), Superscript I™, Superscript II™, Superscript III™, transcriptasa inversa del retrotransposón, transcriptasa inversa de la hepatitis B, transcriptasa inversa del virus del mosaico de la coliflor, transcriptasa inversa bacteriana, ADN polimerasa Tth, ADN polimerasa Taq, ADN polimerasa Tne, ADN polimerasa Tma, y sus mutantes, variantes o derivados. En determinadas realizaciones, la transcriptasa inversa es una enzima transcriptasa inversa de inicio en caliente.

En una realización, las transcriptasas inversas incluyen aquellas que se han reducido, reducido sustancialmente o actividad H de la ARNasa eliminada. Por una enzima con "actividad H sustancialmente reducida en la ARNasa " se entiende que la enzima tiene menos de aproximadamente un 20%, un 15%, un 10%, un 5% o un 2%, de la actividad H de la ARNasa de la enzima natural o la enzima ARNasa H+ correspondiente tal como las transcriptasas inversas del Virus de la Leucemia Murina de Moloney (VLM-M), Virus de la Mieloblastosis Aviar (VMA) o el Virus del Sarcoma de Rous (VSR). Se puede determinar la actividad H de la ARNasa de cualquier enzima mediante varios ensayos, tales como los descritos, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 5.244.797, in Kotewicz, M. L., et al, Nucl. Acids Res. 16:265 (1988) y en Gerard, G. F., et al., FOCUS 14:91 (1992). Los polipéptidos adecuados para su uso en las composiciones y métodos descritos en el presente documento incluyen, aunque no de forma limitativa, transcriptasa inversa H del VLM-M, transcriptasa inversa H del VSR, transcriptasa inversa H del VMA, transcriptasa inversa H del VAR (virus asociado a Rous), transcriptasa inversa H del VAM (virus asociado a mieloblastosis), transcriptasa inversa H del VIH, y Superscript III®, y sus mutantes, variantes o derivados. Se entenderá por una persona normalmente experta, sin embargo, que cualquier enzima capaz de producir una molécula de ADN a partir de una molécula de ácido ribonucleico (es decir, que tiene una actividad transcriptasa inversa) puede usarse de forma equivalente en las composiciones, métodos y kits descritos en el presente documento.

Se pueden obtener comercialmente las enzimas que tienen actividad transcriptasa inversa y/o polimerasa, por ejemplo, a partir de Thermo Fisher Scientific's Invitrogen™ o Applied Biosystems™, Perkin-Elmer (Branchburg, NJ), New England BioLabs (Beverly, MA) o Boehringer Mannheim Biochemicals (Indianápolis, IN). Como alternativa, se pueden aislar las polimerasas o transcriptasas inversas que tienen actividad polimerasa de sus fuentes víricas o bacterianas naturales de acuerdo con los procedimientos convencionales para aislar y purificar proteínas naturales que son bien conocidos por una persona normalmente experta en la materia (véase, por ejemplo, Houts, G. E., et al., J. Virol. 29:517 (1979)). De manera adicional, dichas polimerasas y/o transcriptasas inversas pueden prepararse mediante técnicas de ADN recombinante rutinarias bien conocidas por los expertos en la materia (véanse, por ejemplo, Kotewicz, M. L., et al., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988); Patente de Estados Unidos n.° 5.244.797; publicación de solicitud PCT. n.° WO 98/47912; Soltis, D. A., y Skalka, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3372­ 3376 (1988)).

De acuerdo con algunas realizaciones, con tampones, sales, pH, temperatura, y nucleótidos trifosfatos adecuados, incluyendo sus análogos, es decir, en condiciones adecuadas, una polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a la hebra de la plantilla comenzando en el extremo 3' de un producto de ligadura hibridado, para generar una hebra complementaria. En algunas realizaciones, la polimerasa usada para la extensión carece o carece prácticamente de actividad exonucleasa en 5'. En algunas realizaciones de las presentes enseñanzas, se pueden introducir bases de nucleótidos no convencionales en los productos de la reacción de amplificación y los productos tratados mediante medios enzimáticos (por ejemplo, glicosilasas) y/o fisicoquímicos a fin de volver el producto incapaz de actuar como una plantilla para las amplificaciones posteriores. En algunas realizaciones, se puede incluir el uracilo como una nucleobase en la mezcla de reacción, permitiendo por tanto que posteriores reacciones descontaminar el arrastre de los productos anteriores que contienen uracilo mediante el uso de uracil-N-glicosilasa (véase por ejemplo la publicación de solicitud PCT. n.° W^o 92/ 01814A2). En algunas realizaciones de las presentes enseñanzas, se puede emplear cualquiera de varias técnicas antes de la amplificación a fin de facilitar el éxito de la amplificación, como se describe por ejemplo en Radstrom et al., Mol Biotechnol. 26:133-46 (2004). En algunas realizaciones, se puede conseguir la amplificación en una estrategia integrada autocontenida que comprende la preparación y la detección de la muestra, como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos números 6.153.425 y 6.649.378. Las enzimas modificadas de forma reversible, por ejemplo, pero sin limitarse a las descritas en la patente de Estados Unidos n.° 5.773.258, están también comprendidas en el alcance de las enseñanzas divulgadas. Las presentes enseñanzas contemplan también diversas estrategias de descontaminación basadas en uracilo, en donde, por ejemplo, se puede incorporar uracilo en una reacción de amplificación, y los productos de arrastre posteriores eliminarse con diversos tratamientos de la glicosilasa (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.536.649). Los expertos en la materia entenderán que se puede usar cualquier proteína con la actividad enzimática deseada en los métodos, composiciones y kits divulgados.

El polinucleótido diana es un miARN u otra molécula de ARN pequeño maduro y como tal se apreciará que el uso de polimerasas que también comprende propiedades de transcripción inversa puede permitir que algunas realizaciones de las presentes enseñanzas comprendan una primera reacción de transcripción inversa seguida posteriormente por una reacción de amplificación, permitiendo por tanto la consolidación de dos reacciones en esencialmente una única reacción. En determinadas realizaciones, la consolidación de la reacción de extensión y la posterior reacción de amplificación se contempla adicionalmente por las presentes enseñanzas.

Como se usa en el presente documento, la expresión "porción de cebador universal" se refiere a una región de un adaptador de la ligadura o un cebador universal de la transcripción inversa (RT) que puede servir directamente, o en virtud de su complemento, como la plantilla tras la cual un cebador universal puede hibridarse por cualquiera de varias reacciones de extensión del nucleótido cebador conocidas en la técnica (por ejemplo, PCR o RT-PCR). Los expertos en la materia apreciarán que cuando dos porciones de cebadores están presentes en un único polinucleótido, la orientación de las dos porciones de cebadores es generalmente diferente. Por ejemplo, un cebador de la PCR puede hibridarse directamente a una primera porción de cebador, mientras que el otro cebador de la PCR puede hibridarse al complemento de la segundo porción de cebador. De manera adicional, los cebadores "universales" y las porciones de cebadores que se usan en el presente documento se seleccionan generalmente para ser tan únicos como sea posible dados los ensayos concretos y los genomas hospedadores para asegurar la especificidad del ensayo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cebador universal" se refiere a un cebador que se puede usar en una pluralidad de diferentes reacciones consultado diferentes polinucleótidos diana y se hibrida a la porción de cebador universal del adaptador de la ligadura o al cebador de RT universal. En general, la región del cebador universal que se híbrida al adaptador de la ligadura o al cebador de RT universal tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, más preferentemente entre aproximadamente 18 nucleótidos y aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, la región que se hibrida al adaptador de la ligadura o al cebador de RT universal tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 nucleótidos de longitud. Los expertos en la materia apreciarán que las longitudes del adaptador de la ligadura o la porción de cebador de RT universal puede ser más corta de aproximadamente 15 nucleótidos y más larga de aproximadamente 25 nucleótidos de longitud y puede identificarse en el curso de la metodología rutinaria y sin experimentación excesiva y que dicho adaptador de la ligadura más largo o más corto o las porciones de cebadores de RT universales son contempladas por las presentes enseñanzas. El cebador universal puede comprender nucleótidos convencionales, no convencionales, derivatizados y modificados como se describe en el presente documento.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cebador universal de la transcripción inversa (RT) se refiere a un cebador que se puede usar en una pluralidad de diferentes reacciones consultando diferentes polinucleótidos diana. El cebador de RT universal comprende una porción poli(T) y una porción de cola, en donde la porción de cola comprende una porción de cebador universal. Normalmente, la porción poli(T) está en el extremo 3' del cebador de RT universal. En determinadas realizaciones, la secuencia poli(T) en el extremo 3' del cebador está seguida por una base de nucleótido adicional que no es una T. Generalmente, el cebador de RT universal tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, más preferentemente entre aproximadamente 18 nucleótidos y aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, el cebador de RT universal tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud. El cebador de RT universal puede comprender nucleótidos convencionales, no convencionales, derivatizados y modificados como se ha descrito en el presente documento anteriormente.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cebador directo universal" se refiere a un cebador que se puede usar en una pluralidad de reacciones diferentes consultando diferentes polinucleótidos diana. Como se usa en el presente documento, la expresión "cebador inverso universal" se refiere a un cebador que se puede usar en una pluralidad de diferentes reacciones consultando diferentes polinucleótidos diana. En una reacción de amplificación típica, se usan cebadores directo e inverso para dirigirse de forma preferente y amplificar una secuencia de ADN de interés. Como se usa en los métodos proporcionados, una única pareja de cebadores directo e inverso universales permiten la amplificación de diferentes polinucleótidos diana debido a que los polinucleótidos diana se modifican para incluir porciones de cebadores universales que sirven directamente, o en virtud de su complemento, como una plantilla tras la cual se puede hibridar un cebador directo o inverso universal.

En determinadas realizaciones, el cebador directo universal se hibrida a una porción del adaptador de la ligadura en 5' que comprende la porción del cebador universal o el complemento de la porción del cebador universal. En general, la región del cebador directo universal que se hibrida al adaptador de la ligadura en 5' tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, más preferentemente entre aproximadamente 18 nucleótidos y aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, la región que se hibrida al adaptador de la ligadura en 5' tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 nucleótidos de longitud. Los expertos en la materia apreciarán que las longitudes de la porción del adaptador de la ligadura en 5' del cebador directo universal puede ser más corta de aproximadamente 15 nucleótidos y más larga de aproximadamente 25 nucleótidos de longitud y puede identificarse en el curso de la metodología rutinaria y sin experimentación excesiva y que dichas porciones del adaptador de la ligadura en 5' más largas o más cortas de cebadores directos universales son contempladas por las presentes enseñanzas. El cebador directo universal puede comprender nucleótidos convencionales, no convencionales, derivatizados y modificados como se ha descrito en el presente documento anteriormente.

En determinadas realizaciones, el cebador inverso universal se hibrida a una porción del cebador de RT universal que comprende la porción del cebador universal o sus complemento. Tras la reacción de la transcripción inversa, el cebador directo universal puede extenderse para formar un segundo producto de hebra. El cebador inverso universal puede hibridarse con su segunda hebra y puede extenderse para continuar la reacción de amplificación. En general, el cebador inverso universal tiene entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, más preferentemente entre aproximadamente 18 nucleótidos y aproximadamente 22 nucleótidos de longitud. En determinadas realizaciones, el cebador inverso universal tiene aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud. El cebador inverso universal puede comprender nucleótidos convencionales, no convencionales, derivatizados y modificados como se ha descrito en el presente documento anteriormente.

La expresión "en la dirección 5'" como se usa en el presente documento asume su significado habitual en la biología molecular, y se refiere a la localización de una región de un polinucleótido que está en el lado 5' de una región "en la dirección 3'". De forma correspondiente, la expresión "en la dirección 3'" se refiere a la localización de un polinucleótido que está en el lado 3' de una región "en la dirección".

Los términos "amplicón" y "producto de amplificación" como se usa en el presente documento se refiere generalmente al producto de una reacción de amplificación. Un amplicón puede ser bicatenario o monocatenario, y puede incluir hebras de componentes separados obtenidas desnaturalizando un producto de amplificación bicatenario. En determinadas realizaciones, el amplicón de un ciclo de amplificación puede servir como una plantilla en un ciclo de amplificación posterior.

Como se usa en el presente documento, el término "amplificar" se refiere a cualquier medio por el cual, al menos una parte de un polinucleótido diana, un sustituto de un polinucleótido diana, o sus combinaciones, se reproduce, normalmente de una manera dependiente de la plantilla, incluyendo, sin limitación, un amplio intervalo de técnicas para amplificar secuencias de ácidos nucleicos, tanto lineal como exponencialmente. Se pueden usar cualquiera de diversos métodos para amplificar el polinucleótido diana. Se puede utilizar cualquier medio in vitro para multiplicar las copias de una secuencia diana de ácido nucleico. Estos incluyen métodos de amplificación lineales, logarítmicos. o cualquier otro método de amplificación. Los métodos ilustrativos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos números 4.683.202; 4.683.195; 4.965.188; y 5.035.996), procedimientos isotérmicos (usando una o más ARN polimerasas (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud PCT n.° WO 2006/081222), desplazamiento de la hebra (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° RE39,007), destrucción parcial de moléculas de cebadores (véase, por ejemplo, publicación de solicitud PCT n.°WO 2006/087574)), reacción en cadena de ligasa (LCR) (véanse, por ejemplo, Wu, et al. Genomics 4:560-569 (1990) y Barany, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193 (1991)), sistemas de la replicasa del ARN Qp (véase, por ejemplo, documento WO 1994/016108), sistemas basados en la transcripción del ARN (por ejemplo, TAS, 3SR), amplificación de círculo rodante (RCA) (véanse, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 5.854.033; publicación de solicitud de patente de Estados Unidos. n.° 2004/265897; Lizardi, et al. Nat. Genet. 19:225-232 (1998); y Banér, et al. Nucleic Acid Res. 26: 5073-5078 (1998)), y amplificación del desplazamiento de hebra (SDA) (Little, et al. Clin. Chem. 45:777-784 (1999)), entre otros. Son adecuados muchos sistemas para usar en la amplificación de los ácidos nucleicos diana y se contemplan en el presente documento como lo entendería un experto en la materia.

Como se describe en el presente documento, las presentes enseñanzas proporcionan un método para detectar un ARN pequeño maduro que incluye una etapa de preamplificación en el flujo de trabajo. Durante la etapa de preamplificación, se produce un número limitado de ciclos de amplificación (por ejemplo, pero sin limitarse a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15 ciclos de amplificación). En general, el amplicón resultante se diluye a continuación y las porciones del amplicón diluido se someten a ciclos adicionales de amplificación en una etapa de amplificación posterior (véanse, por ejemplo, patentes de Estados Unidos números 6.606.451 y 8.815.546), o analizarse de otra manera para la diana preamplificada. En determinadas realizaciones, se lleva a cabo una etapa de preamplificación con un par de cebadores directo e inverso universales durante 2-18 ciclos. En determinadas realizaciones, se lleva a cabo una etapa de preamplificación con un par de cebadores directo e inverso universales durante 2-14 ciclos. En algunas realizaciones, se llevan a cabo 5-12 ciclos de preamplificación. En algunas realizaciones, se llevan a cabo 10-14 ciclos de preamplificación.

Como se demuestra en el presente documento, la inclusión de una etapa de preamplificación en los métodos proporcionados para detectar y/o cuantificar un ARN pequeño maduro puede proporcionar una mejora significativa en la sensibilidad de la detección en comparación con los métodos llevados a cabo sin la etapa de preamplificación. En algunas realizaciones, la inclusión de una etapa de preamplificación en el flujo de trabajo antes de la detección de la PCR en tiempo real mejora la sensibilidad del ensayo aproximadamente 3 a 10 Ct en comparación con el compartimento del flujo de trabajo y del ensayo sin preamplificación. En algunas realizaciones, la inclusión de una etapa de preamplificación en el flujo de trabajo antes de la detección de la PCR en tiempo real mejora la sensibilidad del ensayo aproximadamente 6 a 10 Ct en comparación con el comportamiento del flujo de trabajo y del ensayo sin preamplificación. En algunas realizaciones, la inclusión de una etapa de preamplificación en el flujo de trabajo antes de la detección de la PCR en tiempo real mejora la sensibilidad del ensayo hasta aproximadamente 1000 veces en comparación con el comportamiento del flujo de trabajo y del ensayo sin preamplificación. En algunas realizaciones, la inclusión de una etapa de preamplificación en el flujo de trabajo antes de la detección de la PCR en tiempo real mejora la sensibilidad del ensayo hasta aproximadamente 10 veces, aproximadamente 50 veces, aproximadamente 100 veces, aproximadamente 500 veces, aproximadamente 1000 veces en comparación con el comportamiento del flujo de trabajo y del ensayo sin preamplificación.

Los métodos proporcionados en el presente documento incluyen además evaluar el producto del ADNc que comprende el ADNc del ARN pequeño maduro y del adaptador de la ligadura en 5', o el producto de la preamplificación que comprende amplicones del producto de ADNc, de tal manera que se detectan los ARN pequeños maduros del ADNc o los amplicones del ADNc.

Se usa la PCR cuantitativa en tiempo real para evaluar el ADNc o el producto preamplificado. Para evaluar el ADNc o el producto preamplificado en determinadas realizaciones, el método de amplificación puede usar un cebador directo que tenga una porción específica del ARN pequeño y un cebador directo universal, y la detección del ADNc amplificado puede ser mediante el uso de una sonda que tenga una porción específica de ARN pequeño. En determinadas realizaciones, el método de amplificación del ensayo puede usar un cebador directo y un cebador inverso universales que tienen una porción específica de ARN pequeño, y la detección del ADNc amplificado puede ser mediante el uso de una sonda específica de ARN pequeño. En determinadas realizaciones, el método de amplificación del ensayo puede usar cebadores directos e inversos universales, y la detección del ADNc amplificado puede ser mediante el uso de una sonda específica del ARN pequeño. En determinadas realizaciones, el método de amplificación del ensayo puede usar un cebador directo que tenga una porción específica del ARN pequeño y un cebador inverso universal, y la detección del ADNc amplificado puede ser mediante el uso de una sonda universal. En determinadas realizaciones, el método de amplificación del ensayo puede usar un cebador directo que tenga una porción específica del ARN pequeño y un cebador inverso que tenga una porción específica del ARN pequeño, y la detección del ADNc amplificado puede ser mediante el uso de una sonda específica de ARN pequeño.

En determinadas realizaciones, el conjunto de cebadores y la sonda utilizada para evaluar el ADNc de los productos preamplificados se configuran para detectar los extremos 5' y/o 3' del ARN pequeño maduro diana. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, el cebador directo o sonda se hibrida con la porción del ADNc que comprende la unión entre el adaptador ligado y el extremo 5' del ARN pequeño maduro. En determinadas realizaciones, el cebador inverso o la sonda se hibrida a la porción del ADNc que comprende la unión entre la adición de poli(A) y el extremo 3' del ARN pequeño maduro. En dichas realizaciones, pueden consultarse las secuencias en los extremos 5' y/o 3' del ARN pequeño maduro y detectarse los isómeros terminales. La extensión de los extremos 5' y 3' del ARN pequeño maduro en el flujo de trabajo y los ensayos de detección proporcionados en el presente documento permiten la discriminación de los isómeros de ARN pequeño maduro, incluyendo isómeros que difieren en sus extremos.

Los cebadores directo en inverso universales y las sondas y los cebadores directo e inverso específicos y las sondas del ARN pequeño pueden comprender nucleótidos convencionales, no convencionales, derivatizados y modificados como se ha detallado anteriormente. Los cebadores directo e inverso pueden cada uno variar entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, y en determinadas realizaciones, entre aproximadamente 18 nucleótidos y aproximadamente 22 nucleótidos de longitud.

Se puede usar la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para evaluar el producto de la ligadura. En este método, la cantidad de producto de la PCR se seguida ciclo a ciclo en tiempo real. Para medir la cantidad de producto de la PCR, se puede llevar a cabo la reacción en presencia de un colorante fluorescente cuya fluorescencia aumenta mucho cuando se une a un ADN bicatenario. Los ejemplos no limitantes de colorantes fluorescentes adecuados incluyen SYBR™ Green I, PicoGreen™ I, EvaGreen™, bromuro de etidio y naranja de acridina. La reacción se puede llevar a cabo también con una sonda indicadora fluorógena que es específica del ADN que se está amplificando. Los ejemplos no limitantes de sondas indicadoras incluyen sondas TaqMan™, balizas moleculares, y cebadores Scorpion™. Las sondas anteriormente mencionadas dependen de la Transferencia de energía de resonancia de Forster (FRET) para inactivar la señal de fluorescencia mediante el acoplamiento de una molécula de colorante fluorógeno y un resto inactivador sobre el mismo o diferentes sustratos de oligonucleótidos. Se genera la señal de fluorescencia cuando la molécula de colorante fluorógeno y el inactivador se desacoplan mediante medios enzimáticos o físicos. Se registran generalmente durante cada ciclo los valores de fluorescencia y representan la cantidad de producto amplificado hasta el momento en la reacción de amplificación. El ciclo durante el cual la fluorescencia excede un valor umbral definido se define como el ciclo umbral (Ct). En general, se puede calcular la cantidad de material de partida determinando el valor Ct de la muestra y comparando este con el valor Ct de las muestras del control.

En una realización, la reacción de amplificación es un ensayo de la 5'-nucleasa (también comercialmente conocidos como ensayos TaqMan™) llevado a cabo usando una ácido nucleico polimerasa, tal como una ADN polimerasa, ARN polimerasa, y transcriptasa inversa, al menos un cebador de oligonucleótidos capaz de hibridarse específicamente con un polinucleótido diana (a partir del cual se amplifica el ácido nucleico diana amplificado), al menos una sonda detectable que se hibrida al ácido nucleico diana amplificado, y que puede incorporarse en al menos un cebador), y al menos un agente de unión al ácido nucleico detectable (por ejemplo, un colorante intercalante o no intercalante) que se puede introducir antes, durante o después de la amplificación. La sonda contiene normalmente un marcador detectable que emite una señal que se puede monitorizar para discernir si se ha amplificado el ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, la sonda es un oligonucleótido que se hibrida al ácido nucleico diana en 3' con respecto al de al menos un cebador. En algunas realizaciones, la polimerasa tiene una actividad nucleasa (es decir, una actividad nucleasa 5' a 3') para liberar la sonda del ácido nucleico amplificado. En algunas realizaciones, la liberación del ácido nucleico amplificado vuelve la sonda detectable. En algunas realizaciones, la sonda comprende un marcador detectable y una molécula inactivadora que inactiva el marcador detectable cuando está libre, pero no lo inactiva cuando la sonda se hibrida al ácido nucleico amplificado. En algunas realizaciones, se pueden usar dos o más sondas cuando al menos una sonda tiene un marcador detectable y al menos otra sonda tiene una molécula inactivadora. Cuando está en una proximidad suficientemente cercana a la otra, la molécula inactivadora suprime normalmente la señal del marcador detectable sobre la otra sonda. En algunas realizaciones, dos o más sondas, teniendo cada una un marcador detectable diferente, se pueden usar sin moléculas activadoras. En dichas realizaciones, las sondas se vuelven detectables, tanto de novo como presentando una señal diferente que cualquier sonda sola, cuando están en proximidad suficientemente cercana entre sí. Normalmente, el marcador detectable y la molécula inactivadora son parte de una única sonda. Según procede la amplificación, la polimerasa digiere la sonda para separar el marcador detectable de la molécula inactivadora. El marcador detectable (por ejemplo, la fluorescencia) se monitoriza durante la reacción, cuando la detección del marcador corresponde a la incidencia de la amplificación del ácido nucleico (es decir, cuanto mayor es la señal, mayor es la cantidad de la amplificación). Se conocen en la técnica variaciones de los ensayos TaqMan™, tal como el ensayo TaqMan™ enriquecido con LNA™, y serían adecuadas para usar en los métodos descritos en el presente documento.

Cualquiera de los diversos métodos se pueden usar para detectar ácidos nucleicos amplificados usando cebadores o sondas. Se pueden usar muchos reactivos, sistemas, o marcadores detectables diferentes en los métodos descritos en el presente documento. Estos incluyen, por ejemplo, sistemas TaqMan™, sistemas de marcadoresinactivadores detectables (por ejemplo, FRET, sistemas de ligandos de salicilato / DTPA (véase, por ejemplo, Oser, et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29:1167-1169 (1990), hibridación por desplazamiento, sondas homólogas, ensayos descritos en el documento EP 070685), balizas moleculares (por ejemplo, NASBA™), bases de ácidos nucleicos bloqueadas (LNA) (Singh, et al. Chem. Commun. 4:455-456 (1998)), sondas de ácidos nucleicos peptídicos (^p N^a ) (Pellestor, et al. Eur. J. Hum. Gen. 12:694-700 (2004)), sondas Eclipse (Afonina, et al. Biotechniques 32:940-949 (2002)), sondas luminosas (Svanvik, et al. Anal. Biochem. 281:26-35 (2000)), balizas moleculares (Tyagi, et al. Nat. Biotechnol. 14:303-308 (1996)), balizas moleculares tripartitas (Nutiu, et al. Nucleic Acids Res. 30:E94 (2002)), QuantiProbes (www.qiagen.com), HyBeacons (French, et al. Mol. Cell. Probes 15:363-374 (2001)), sondas de desplazamiento (Li, et al. Nucleic Acids Res. 30:E5 (2002)), HybProbes (Cardullo, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8790-8794 (1988)), MGB Alert (www.nanogen.com), Q-PNA (Fiandaca, et al. Genome Res.

11:609-613 (2001)), Plexor (Promega), cebadores LUX™ (Nazarenko, et al. Nucleic Acids Res. 30:E37 (2002)), cebadores Scorpion™ (Whitcombe, et al. Nat. Biotechnol. 17:804-807 (1999)), cebadores AmpliFluor™ (Sunrise) (Nazarenko, et al. Nucleic Acids Res. 25:2516-2521 (1997)), cebadores DzyNA (Todd, et al. Clin. Chem. 46:625-630 (2000)), y similares. En cada uno de estos ensayos, se puede monitorizar la generación de los productos de amplificación aunque la reacción esté progresando. Se puede usar un aparato para detectar la señal generada por el marcador detectable para detectar, medir, y cuantificar la señal antes, durante o después de la amplificación. El tipo particular de señal puede dictar la elección del método de detección. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se usan marcadores fluorescentes para marcar sondas o productos amplificados. Las sondas se unen a los productos amplificados monocatenario o bicatenario, o los colorantes se intercalan en los productos amplificados bicatenario, y por consiguiente, la fluorescencia resultante aumenta a medida que aumenta la cantidad de producto amplificado. Se contempla también en el presente documento el uso de otros métodos o reactivos como entendería un experto en la materia.

Otro sistema ilustrativo utiliza sondas bicatenarias en los métodos de hibridación por desplazamiento (véanse, por ejemplo, Morrison, et al. Anal. Biochem. 183:231-244 (1989); y Li, et al. (más arriba)). En dichos métodos, la sonda incluye normalmente dos oligonucleótidos complementarios de diferentes longitudes donde uno incluye un marcador detectable y el otro incluye una molécula inactivadora. Cuando no se une a un ácido nucleico diana, el inactivador suprime la señal del marcador detectable. La sonda se vuelve detectable tras la hibridación por desplazamiento con un ácido nucleico diana. Se pueden usar múltiples sondas, conteniendo cada una diferentes marcadores detectables, de tal manera que se pueden consultar los múltiples ácidos nucleicos diana en una única reacción.

Los métodos ilustrativos adicionales para amplificar y detectar ácidos nucleicos diana implican "balizas moleculares", que son sondas de oligonucleótidos con forma de horquilla monocatenarias. En presencia de la secuencia diana, la sonda se despliega, se une y emite una señal (por ejemplo, fluorescencias). Una baliza molecular incluye normalmente al menos cuatro componentes: 1) el "bucle", una región de 18-30 nucleótidos que es complementaria con la secuencia diana; 2) dos "tallos" de 5-7 nucleótidos que se encuentran en cualquier extremo del bucle y que son complementarios entre sí; 3) en el extremo 5', un marcador detectable; y 4) en el extremo 3', una molécula inactivadora que evita que el marcador detectable emita un singlete cuando la sonda está en la forma de un bucle cerrado (es decir, no se une a un ácido nucleico diana). Por lo tanto, en presencia de una diana complementaria, la porción del "tallo" de la baliza se separa haciendo que la sonda se hibride a la diana. Se conocen también otros tipos de balizas moleculares y pueden ser adecuados para usar en los métodos descritos en el presente documento. Se pueden utilizar balizas moleculares en varios sistemas de ensayo. Uno de dichos sistemas es una amplificación basada en una secuencia de ácido nucleico (NASBA™), un proceso isotérmico de una única etapa para amplificar el ARN a ADN bicatenario sin ciclado de la temperatura. Una reacción NASBA™ requiere normalmente el virus de la mieloblastosis aviar (VMA), una transcriptasa inversa (RT), ARN polimerasa de T7, ARNasa H, y dos cebadores de oligonucleótidos. Tras la amplificación, el ácido nucleico diana amplificado se puede detectar usando una baliza molecular. Se conocen en la técnica otros usos de balizas moleculares y serían adecuados para usar en los métodos descritos en el presente documento.

El sistema Scorpion™ es otro formato de ensayo ilustrativo que se puede usar en los métodos descritos en el presente documento. Los cebadores Scorpion™ son moléculas bifuncionales en las que un cebador se une covalentemente a la sonda, junto con un marcador detectable (por ejemplo, un fluoróforo) y un inactivador. En presencia de un ácido nucleico diana, el marcador y el inactivador detectables se separan, lo cual conduce a un aumento en la señal emitida desde el marcador detectable. Normalmente, un cebador usado en la reacción de amplificación incluye un elemento de sonda en el extremo 5' junto con un elemento "bloqueante de la PCR" (tal como un monómero de HEG) al inicio del bucle de la horquilla. La sonda incluye normalmente una secuencia de tallo autocomplementaria con un marcador detectable en un extremo y un inactivador en el otro. En los ciclos de amplificación iniciales, el cebador se hibrida a la diana y se produce la extensión debido a la acción de la polimerasa. El sistema Scorpion™ se puede usar para examinar e identificar las mutaciones puntuales usando múltiples sondas con diferentes etiquetas para distinguir entre las sondas. Usando la PCR como ejemplo, después que se ha completado un ciclo de extensión, la región diana sintetizada recientemente se une a la misma hebra que la sonda. Tras el segundo ciclo de desnaturalización e hibridación, la sonda y la diana se hibridan. La secuencia horquilla se híbrida a continuación a una parte del producto de la PCR producido recientemente. Esto da como resultado la separación del marcador detectable del inactivador y produce la emisión de la señal. Se conocen en la técnica otros usos para los cebadores Scorpion™ y serían adecuados para usar en los métodos descritos en el presente documento.

Uno o más marcadores o agentes de inactivación detectable se unen normalmente a un cebador o sonda. El marcador detectable puede emitir una señal cuando está libre o cuando se une a un ácido nucleico diana. El marcador detectable puede emitir también una señal cuando está en proximidad de otro marcador detectable. Los marcadores detectables se pueden usar también con moléculas inactivadoras de tal manera que la señal es solo detectable cuando no está en proximidad suficientemente cercana de la molécula inactivadora. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el sistema de ensayo puede hacer que el marcador detectable se libere de la molécula de inactivación. Se puede usar cualquiera de los diversos marcadores detectables para marcar los cebadores y sondas usados en los métodos descritos en el presente documento. Como se ha mencionado anteriormente, en algunas realizaciones, el marcador detectable puede unirse a una sonda que puede incorporarse en un cebador o unirse de otra forma a un ácido nucleico diana amplificado (por ejemplo, un agente de unión a un ácido nucleico detectable tal como un colorante intercalante o no intercalante). Cuando se usa más de un marcador detectable, cada marcador debe diferir en sus propiedades espectrales de tal manera que los marcadores pueden distinguirse entre sí, o de tal manera que conjuntamente, los marcadores detectables emiten una señal que no es emitida por cualquier marcador detectable solo. Los marcadores detectables ilustrativos incluyen, aunque no de forma limitativa, un colorante o fluoróforo fluorescente (es decir, un grupo químico que puede ser excitado por la luz para emitir fluorescencia o fosforescencia), "los colorantes aceptores" son capaces de inactivar una señal fluorescente desde un colorante donante fluorescente, y similares.

Los marcadores detectables adecuados incluyen, por ejemplo, fluoresceínas (por ejemplo, 5-carboxi-2,7-diclorofluoresceína; 5-Carboxifluoresceína (5-FAM); 5-HAT (Hidroxi Triptamina); 6-HAT; 6-JOE; 6-carboxifluoresceína (6-FAM); FITC); Alexafluores (por ejemplo, 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 635, 647, 660, 680, 700, 750); fluoróforos BODIPY™ (por ejemplo, 492/515, 493/503, 500/510, 505/515, 530/550, 542/563, 558/568, 564/570, 576/589, 581/591, 630/650-X, 650/665-X, 665/676, FL, FL ATP, Fl-Ceramida, R6G SE, TMR, conjugado de TMR-X, TMR-X, SE, TR, TR ATP, TR-X SE), cumarinas (por ejemplo, 7-amino-4-metilcoumarina, AMC, AMCA, AMCA-S, AMCA-X, ABQ, metilcumarina CPM, cumarina faloidina, hidroxicumarina, CMFDA, metoxicumarina), calceína, calceína AM, calceína azul, colorantes de calcio (por ejemplo, calcio crimson, calcio verde, calcio naranja, calcoflúor blanco), Cascade Blue, Cascade Yellow; colorante CyTM (por ejemplo, 3, 3.18, 3.5, 5, 5.18, 5.5, 7), cian GFP, fluorosensor de AMP cíclico (FiCRhR), proteínas fluorescentes (por ejemplo, proteína fluorescente verde (por ejemplo, GFP. EGFP), proteína fluorescente azul (por ejemplo, BFP, EBFP, EBFP2, Azurita, mKalama1), proteína fluorescente cian (por ejemplo, ECFP, Cerúleo, CyPet), proteína fluorescente amarilla (por ejemplo, YFP, Citrina, Venus, YPet), pares de donantes/aceptores de FRET (por ejemplo, fluoresceína/tetrametilrodamina, lAEDANS/fluoresceína, EDANS/dabcilo, fluoresceína/fluoresceína, BODIPY™ FL/BODIPY™ FL, Fluoresceína/QSY7 y QSY9), LysoTracker™ y LysoSensor™ (por ejemplo, LysoTracker™ Blue DND-22, LysoTracker™ Blue-White DPX, LysoTracker™ Yellow HCK-123, LysoTracker™ Green DND-26, LysoTracker™ Red DND-99, LysoSensor™ Blue DND-167, LysoSensor™ Green Dⁿ D-189, LysoSensor™ Green DND-153, LysoSensor™ Yellow/Blue DND-160, LysoSensor Yellow/Blue dextrano 10.000 MW ), Oregon Green (e.g., 488, 488-X, 500, 514); rodaminas (por ejemplo, 110, 123, B, B 200, BB, BG, B extra, 5-carboxitetrametilrodamina (5-TAMRA), 5 GLD, 6-Carboxirodamina 6G, Lisamina, Lissamina Rodamina B, Falicidina, Faloidina, Rojo, Rhod-2, 5-ROX (carboxi-X-rodamina), Sulforrodamina B can C, Sulforrodamina G Extra, Tetrametilrrodamina (TRITC), WT), Texas Red, Texas Red-X, VIC y otros marcadores descritos en, por ejemplo, la publicación US n.° 2009/0197254), entre otras como conocerían los expertos en la materia. Se pueden usar también otros marcadores detectables (véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2009/0197254), como conocerían los expertos en la materia.

Como se usa en el presente documento "polimerasa" se refiere a cualquier enzima que tenga una actividad polimerizante del nucleótido. Las polimerasas (incluyendo ADN polimerasas y ARN polimerasas) útiles de acuerdo con las presentes enseñanzas incluyen, aunque no de forma limitativa, ADN polimerasas comercialmente disponibles o dirigidas a ADN natural, ARN polimerasas dirigidas a ADN, ADN polimerasas dirigidas a ARN, y ARN polimerasas dirigidas a ARN. Las polimerasas usadas de acuerdo con la invención pueden ser cualquier enzima que pueda sintetizar una molécula de ácido nucleico procedente de una plantilla de ácido nucleico, normalmente en la dirección 5' a 3'.

Las ADN polimerasas ilustrativas que se pueden usar en los métodos, kits y composiciones proporcionados en el presente documento incluyen, aunque no de forma limitativa: ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa de Thermotoga neopolitana (Tne), ADN polimerasa de Thermotoga maritima (Tma), ADN polimerasa de Thermococcus litoralis (Tli o VENT™), ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus (Pfu), ADN polimerasa DEEPVENT™, ADN polimerasa de Pyrococcus woosii (Pwo), ADN polimerasa de Bacillus stearothermophilus (Bst), ADN polimerasa de Bacillus caldophilus (Bca), ADN polimerasa de Sulfolobus acidocaldarius (Sac), ADN polimerasa de Thermoplasma acidophilum (Tac), ADN polimerasa de Thermus flavus (Tfl/Tub), ADN polimerasa de Thermus ruber (Tru), ^a Dⁿ polimerasa de Thermus brockianus (DYNAZYME™), ADN polimerasa de Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth), ADN polimerasa de mycobacterium (Mtb, Mlep), y sus mutantes, y variantes y derivados. ARN polimerasas tales como T3, T5 y SP6 y sus mutantes, variantes y derivados también se pueden usar de acuerdo con las presentes enseñanzas. En general, se puede usar cualquier tipo I de ADN polimerasa de acuerdo con las presentes enseñanzas aunque se pueden usar otras ADN polimerasas incluyendo, aunque no de forma limitativa, tipo III o familia A, B, C, etc., de ADN polimerasas.

Las polimerasas de ácidos nucleicos usadas en los métodos, kits y composiciones proporcionados en el presente documento pueden ser mesófilos o termófilos. Las ADN polimerasas mesófilas ilustrativas incluyen la ADN polimerasa T7, ADN polimerasa de T5, Fragmento Klenow de la ADN polimerasa, ADN polimerasa III y similares. Las ADN polimerasas termoestables ilustrativas incluyen Taq, Tne, Tma, Pfu, Tfl, Tth, fragmento Stoffel, ADN polimerasas VENT™ y DEEPVENT™, y sus mutantes, variantes y derivados (patentes de Estados Unidos números 5.436.149; 4.889.818; 4.965.188; 5.079.352; 5.614.365; 5.374.553; 5.270.179; 5.047.342; y 5.512.462; publicaciones de solicitudes PCT números WO 92/06188, WO 92/06200, y WO 96/10640; Barnes, Gene 112:29-35 (1992); Lawyer, et al., PCR Meth. Appl. 2:275-287 (1993); Flaman, et al., Nucl. Acids Res. 22:3259-3260 (1994)). Los ejemplos de ADN polimerasas que carecen sustancialmente de actividad exonucleasa en 3' incluyen, aunque no de forma limitativa, las ADN polimerasas Taq, Tne (exo-), Tma (exo-), Pfu (exo-), Pwo (exo-) y Tth, y sus mutantes, variantes y derivados.

Las ADN polimerasas para usar en las presentes enseñanzas pueden obtenerse comercialmente, por ejemplo, de Invitrogen™ (Thermo Fisher Scientific, Inc., Carlsbad, CA), Pharmacia (Piscataway, N.J.), Sigma (St. Louis, Mo.) y Boehringer Mannheim. Las ADN polimerasas comercialmente disponibles ilustrativas para usar en la presente divulgación incluyen, aunque no de forma limitativa, La ADN polimerasa Tsp de Invitrogen™ (Thermo Fisher Scientific, Inc., Carlsbad, CA).

Los métodos proporcionados se pueden usar para detectar un ARN pequeño maduro raro en una muestra y/o distinguir un ARN pequeño de otro similar o los ARN pequeños muy homólogos en la muestra. Los métodos para amplificar los ácidos nucleicos diana pueden usar la activación mediante reacciones de polifosforolisis (APP) para proporcionar una amplificación muy específica del ARN pequeño maduro diana o su ADNc. La polifosforolisis se refiere a la eliminación de un nucleótido no extendible procedente de un ácido nucleico (por ejemplo, un oligonucleótido) en presencia de uno o más agentes polifosforolizantes y una enzima que presenta actividad polifosforolizante. El oligonucleótido activable mediante polifosforolisis (oligonucleótido APP) puede ser un oligonucleótido específico diana con un didesoxinucleótido en el extremo 3'. El didesoxinucleótido en el extremo 3' inhibe la extensión directa por la polimerasa pero puede eliminarse mediante polifosforolisis en presencia de un agente polifosforolizante y la hebra complementaria de la diana. En general, el didesoxinucleótido no se elimina si existe un emparejamiento incorrecto entre el oligonucleótido APP y su molécula de hibridación asociada. Normalmente, el oligonucleótido APP se diseña para tener un nucleótido próximo al extremo 3' que distingue una diana de otra, por ejemplo, un miARN de otro miARN. Se puede usar un APP para polimerizar y/o amplificar moléculas de ácidos nucleicos, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ácido ribonucleico (por ejemplo, ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (por ejemplo, ADN) o híbridos de los mismos. Las reacciones de APP y sus mencionados usos se describen en la patente de Estados Unidos n.° 8.932.813.

APP proporciona la extensión de oligonucleótidos convirtiendo un oligonucleótido no extensible en un oligonucleótido extensible, extendiendo el oligonucleótido para producir una hebra de ácido nucleico deseada (por ejemplo, una copia complementaria de un ácido nucleico diana) y, opcionalmente, amplificar y detectar la hebra de ácido nucleico deseada. Un nucleótido no extensible se refiere a un nucleótido que, tras su incorporación a un ácido nucleico, impide la extensión adicional del ácido nucleico, por ejemplo, mediante al menos un biocatalizador (por ejemplo, una enzima). Un nucleótido se puede extender mediante una enzima, pero no se puede extender mediante otra enzima. Un nucleótido que no es extensible por una enzima se puede volver extensible o parcialmente extensible en condiciones diferentes. Un nucleótido extensible se puede referir a un nucleótido al cual otro nucleótido se puede agregar o unirse covalentemente en una posición 3' del resto de azúcar del nucleótido extensible mediante un biocatalizador (por ejemplo, una enzima) presente en la reacción. La extensión también se puede iniciar en el -OH en 2' de un nucleótido que puede tener o no un 3'-OH extensible. Extender un nucleótido se refiere a la adición o incorporación de uno o más nucleótidos a o dentro de un ácido nucleico dado. Un oligonucleótido extendido es normalmente un oligonucleótido (por ejemplo, un ácido nucleico cebador) al cual se han agregado uno o más nucleótidos adicionales o bien se han incorporado de otra manera (por ejemplo, se han unido covalentemente al mismo). La APP se lleva a cabo normalmente usando las etapas de: (a) hibridar a un ácido nucleico un primer oligonucleótido que tiene un resto no extensible en 3' ("P*") que se puede eliminar mediante polifosforolisis (es decir, activable); (b) eliminar el extremo 3' no extensible usando un agente de polifosforolización y un biocatalizador (es decir, una ADN polimerasa) que tiene actividad de polifosforolisis para producir un oligonucleótido no bloqueado; y, (c) extender el oligonucleótido no bloqueado para producir una hebra de ácido nucleico deseada. Etapas adicionales para detectar la hebra de ácido nucleico deseada también se pueden incluir como se describe a continuación.

El método APP se puede usar para la amplificación específica de miARN. La plantilla de la hebra de ácido nucleico es, normalmente, una hebra de ADNc de sentido directo o de sentido contrario de una especie de miRNA y está presente en la mezcla con la correspondiente hebra de ADNc (sentido directo o sentido contrario) de otra especie de miRNA. El oligonucleótido P* activable (por ejemplo, no extensible) no tiene emparejamientos incorrectos cerca del extremo 3' de la secuencia de ADNc del miRNA diana y tiene al menos un nucleótido en o cerca de su extremo 3' que es un emparejamiento incorrecto del correspondiente nucleótido del ADNc del miRNA de la especie no diana. Debido al emparejamiento incorrecto, en la etapa (a) del método APP, en nucleótido no extensible del extremo del oligonucleótido P* no está hibridado con el ADNc del miRNA no diana. En la etapa (b), la polifosforolisis sustancialmente no elimina el nucleótido no hibridado del extremo o casi del extremo del oligonucleótido P* activable hibridado con el miRNA no diana. En la etapa (c), por lo tanto, el oligonucleótido P* o se extiende sustancialmente mediante polimerización del ADNc del miRNA no diana. Como resultado, la hebra de ácido nucleico deseada del ADNc del miRNA diana sintetizado sobre la hebra de plantilla se amplifica preferentemente respecto de cualquier hebra de ácido nucleico sintetizada sobre el ADNc del miRNA no diana. El método APP se puede usar para la amplificación exponencial de una especie de miRNA específica (diana) en una mezcla que contiene una o más especies de miRNA diferentes (no diana). Tras la generación de un producto de ligadura del miARN poliadenilado y la posterior transcripción inversa para crear un ADNc como se describe en el presente documento, las hebras de los ADNc se pueden separar para proporcionar ADN monocatenario, seguido por las etapas en serie (a) - (e):

(a) Hibridar con las hebras de sentido directo o de sentido contrario del ADNc diana y no diana, un 2'-desoxioligonucleótido P* que tiene un 2',3'-didesoxinucleótido no extensible en su extremo 3'. P* no tiene nucleótidos en o cerca de su extremo 3' que sea un emparejamiento incorrecto de los correspondientes 2'-desoxioligonucleótidos del ADNc diana, pero tiene al menos un nucleótido en o cerca de su extremo 3' que es un emparejamiento incorrecto del correspondiente 2'-desoxioligonucleótido en el correspondiente ADNc no diana. Por consiguiente, el 2',3'-didesoxinucleótido se hibrida con la hebra diana, pero no lo hace a la hebra no diana cuando el oligonucleótido P* está hibridado. Simultáneamente, un segundo 2'-desoxioligonucleótido que es complementario de las hebras antiparalelas de cada ADNc se hibrida con las hebras antiparalelas. El 2'-desoxioligonucleótido P* activable y el segundo 2'-desoxioligonucleótido flanquean la región del ADNc que se va a amplificar.

(b) Polifosforolizar el P* activable que está hibridado con una hebra de ADNc diana con al menos un agente de polifosforolización y una enzima que tiene actividad de polifosforolisis. Esto activa el P* que está hibridado con la hebra diana mediante la eliminación del 2',3'-didesoxinucleótido del extremo. Esto no activa sustancialmente el P* que está hibridado con la hebra de ADNc no diana puesto que el 2',3'-didesoxinucleótido del extremo no hibridado no se elimina sustancialmente mediante la polifosforolisis.

(c) Polimerizar mediante extensión el oligonucleótido P* activado sobre la hebra diana en presencia de cuatro trifosfatos de nucleósido y una ADN polimerasa y, simultáneamente, extender el segundo 2'-desoxioligonucleótido sobre las hebras antiparalelas del ADNc tanto diana como no diana.

(d) Separar los productos de extensión de la etapa (c);

(e) Repetir las etapas (a)-(d) hasta que se haya conseguido el nivel deseado de amplificación exponencial del ADNc diana.

Cuando se utiliza para amplificar el ADN, el oligonucleótido P* activable no extensible es, normalmente, un 2'-desoxioligonucleótido, el desoxioligonucleótido del extremo puede ser un 2',3'-didesoxinucleótido, los cuatro trifosfatos de nucleósido son trifosfatos de 2'-desoxinucleósido, y la polimerasa de ácido nucleico es una ADN polimerasa. La ADN polimerasa utilizada en la etapa (c) también puede ser la enzima que tiene actividad de polifosforolisis utilizada en la etapa (b). La amplificación mediante APP puede ser lineal o exponencial. La amplificación lineal se obtiene cuando el oligonucleótido P* activable es el único oligonucleótido complementario utilizado. Se obtiene amplificación exponencial cuando está presente un segundo oligonucleótido que es complementario de la hebra de ácido nucleico deseada (por ejemplo, como en la PCR). El segundo oligonucleótido puede ser tanto un oligonucleótido extensible como un oligonucleótido activable no extensible. El oligonucleótido P* activable y el segundo oligonucleótido flanquean la región diana para amplificación. En la etapa (a), el segundo oligonucleótido se hibrida con la hebra de ácido nucleico deseada independiente producto de la etapa (d). En la etapa (c), la polimerización extiende el segundo oligonucleótido sobre la hebra de ácido nucleico deseada para sintetizar una copia de la hebra de ácido nucleico plantilla. En la etapa (d), la hebra de ácido nucleico plantilla sintetizada se separa de la hebra de ácido nucleico deseada. A continuación se pueden repetir las etapas (a)-(d) hasta que se haya conseguido el nivel de amplificación exponencial deseado.

Los métodos APP, las reacciones y las composiciones para usar en dicho documento descritas en la patente de Estados unidos n.° 8.932.813 se han incorporado por referencia en el presente documento. El uno o más agentes de polifosforolización pueden incluir los representados mediante la Fórmula I o la Fórmula II de la patente de Estados unidos n.° 8.932.813 que incluyen, aunque no de forma limitativa, un difosfato, un trifosfato, un tetrafosfato, un pentafosfato o un hexafosfato. Por ejemplo, el imidodifosfatato une los restos de fosfato usando nitrógeno; compuestos de difosfato similares pueden sustituir el azufre para el nitrógeno. Un polifosfato puede ser cualquier éster de fosfato que tenga dos o más restos de fosfato. Un polifosfato puede ser cualesquiera ésteres de fosfato que tengan tres o más restos de fosfato.

Cualquiera de los agentes de polifosforolización descritos en el presente documento se puede combinar con otros cualesquiera agentes de polifosforolización. El uno o más agentes de polifosforolización pueden ser pirofosfato (PPI) junto con al menos uno o más agentes de polifosforolización diferentes. Cualquiera del uno o más agentes de polifosforolización se puede usar en forma de una sal (por ejemplo, de sodio).

Normalmente, las reacciones de APP que se describen en el presente documento incluyen además uno o más biocatalizador (por ejemplo, enzima(s)) que tienen actividad de polifosforolisis para generar uno o más trifosfatos de nucleósido. Uno o más ejemplos de biocatalizador que se pueden usar en APP es una ADN polimerasa que cataliza la polimerización de los trifosfatos de nucleósido y la polifosforolisis de los dupletes de ADN en presencia de uno o más agentes de polifosforolización como se describe en el presente documento. Los ejemplos de ADN polimerasas que tienen actividad de polifosforolisis incluyen, pero sin limitación, Tfl termoestable, Taq, y/o ADN polimerasas diseñadas mediante ingeniería genética (por ejemplo, AMPLITAQFS, THERMOSEQUENASE), aquellos que tengan el sitio activo de la mutación F667Y o el equivalente de F667Y (por ejemplo, en Tth) que muestra afinidad mejorada por el didesoxinucleótido como nucleótido entrante (por ejemplo, Km más pequeño para ddNTP)), RQ1 como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7.422.872 y mutantes de la misma (por ejemplo, RQY en la que 669 está sustituido por tirosina, que se puede proporcionar para la transcripción inversa y/o la secuenciación directa del ARN), THERMINATOR I (NEB), THERMINATOR II, THERMINATOR III y/o THERMINATOR GAMMA (todos disponibles de NEB), entre otros. Estas y otras ADN polimerasas potencialmente adecuadas se pueden describir en, por ejemplo, la publicación de EE.UU. 2008/0254525A1, la publicación de EE.UU. 2007/0020622A1, la publicación de EE.UU.

2007/0009924A1, patente de Estados Unidos n.° 4.889.818, patente de Estados Unidos n.° 4.965.188, patente de Estados Unidos n.° 5.047.342, patente de Estados Unidos n.° 5.079.352, patente de Estados Unidos n.° 5.270.179, patente de Estados Unidos n.° 5.374.553, patente de Estados Unidos n.° 5.436.149, patente de Estados Unidos n.° 5.512.462, patente de Estados Unidos n.° 5.614.365 y patente de Estados Unidos n.° 6.228.628B1. Se ha descubierto que el uso de estas ADN polimerasas diseñadas mediante ingeniería genética puede mejorar la eficacia de la APP.

Los agentes de polifosforolización se pueden usar en condiciones, en concentraciones y con biocatalizador y otros componentes de reacción descritos en la patente de Estados Unidos n.° 8.932.813.

Los métodos proporcionados para detectar y/o cuantificar el miARN pueden comprender la etapa de dirigir la amplificación del ADNc de usando la activación por polifosforolisis (APP) en presencia de al menos un agente de polifosforolización. El al menos un agente de polifosforolización puede ser un difosfato, un trifosfato, un tetrafosfato, un pentafosfato o un hexafosfato. El agente de polifosforolización puede ser trifosfato. El agente de polifosforolización puede ser hexafosfato. El uno o más agentes de polifosforolización pueden ser pirofosfato (PPj) junto con al menos uno o más agentes de polifosforolización diferentes.

Los métodos para amplificación de ácidos nucleicos diana pueden usar la activación mediante reacciones de polimerización activadas por pirofosforolisis (PAP). Se puede usar PAP para polimerizar y/o amplificar moléculas de ácido nucleico, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ácido ribonucleico (por ejemplo, ARN) y/o ácido desoxirribonucleico (por ejemplo, ADN) o híbridos de los mismos. Las reacciones PAP y el uso de las mismas en reacciones de polimerización y amplificación se describe, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 7.033.763. En PAP, el oligonucleótido P* activable hibridado se pirofosforoliza con pirofosfato y una enzima que presenta actividad de polifosforolización. Esto activa el oligonucleótido P* mediante eliminación del extremo 3' hibridado no extensible. Por consiguiente, la amplificación del miARN del ADNc puede usar PAP y pirofosfato como agente de polifosforolización.

Para las reacciones de amplificación de ADNc diana que utilizan APP o PAP, un cebador directo o un cebador inverso pueden comprender un nucleótido no extensible en el extremo 3'. Para las reacciones de amplificación de ADNc diana que utilizan APP o PAP, tanto el cebador directo como el cebador inverso pueden comprender un nucleótido no extensible en el extremo 3'.

Un método de hibridación también se puede usar para estudiar el producto de ligadura. Los ejemplos no limitantes de métodos de hibridación adecuados incluyen las micromatrices de ácidos nucleicos. Los análisis mediante micromatriz se pueden llevar a cabo usando equipos comercialmente disponibles y siguiendo los protocolos del fabricante. Normalmente, los ácidos nucleicos monocatenarios se unen (combinan con la matriz) a la superficie de un microchip. Las secuencias combinadas con la matriz se hibridan a continuación (sondean) con ácidos nucleicos, que están marcados de forma fluorescente. Tras el lavado riguroso para eliminar los ácidos nucleicos unidos de forma no específica, la superficie del chip se explora generalmente mediante microscopio de láser confocal u otro método de detección, tal como una cámara CCD. Los métodos para analizar los datos de fluorescencia en bruto son conocidos en la técnica. Se puede usar varios ácidos nucleicos combinados con la matriz y sondas para detectar el producto de ligadura de las presentes enseñanzas.

El adaptador de ligadura en 5' puede estar libre en solución, de manera que el ARN pequeño maduro o el ADNc del mismo se detecta en solución. Como alternativa, cuando el adaptador de ligadura en 5' puede estar unido a un soporte sólido, de modo que el extremo 3' del adaptador de la ligadura en 5' esté libre. Por lo tanto, en esta realización, el ARN pequeño maduro se une al adaptador de ligadura que está unido al soporte sólido. En otras realizaciones, el cebador de RT universal que comprende una porción poli(T) puede estar unido a un soporte sólido, de modo que el extremo 3' del cebador de RT universal esté libre. Por lo tanto, en esta realización, el ADNc del ARN pequeño extendido a partir del cebador universal está unido al soporte sólido. Los ejemplos no limitantes de un soporte sólido adecuado incluyen una superficie de vidrio, una superficie de sílice, una superficie de plástico, una superficie de polímero, una superficie de copolímero o una superficie metálica.

Como se usa en el presente documento, la expresión "secuenciación avanzada" o "NGS" se refiere generalmente a las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, incluyendo, aunque no de forma limitativa, secuenciación masiva paralela mediante firma, secuenciación de alto rendimiento, secuenciación por ligadura (por ejemplo, secuenciación SOLiD), secuenciación de semiconductores iónicos de protón, secuenciación de nanoesferas de ADN, secuenciación de una única molécula y secuenciación en nanoporos. En determinadas realizaciones, el adaptador de ligadura y/o el cebador de RT universal contiene secuencias de nucleótidos que son compatibles con una determinada química o flujo de trabajo NGS. En determinadas realizaciones, el uso de un adaptador de ligadura y/o cebador de RT universal que tiene secuencias que son complementarias de las secuencias utilizadas en reacciones de NGS concretas permite que el ADNc del ADNc pequeño maduro poliadenilado ligado al adaptador o el producto amplificado del mismo experimente un perfilado y secuenciación mediante NGS.

Como se usa en el presente documento, la expresión "recipiente de reacción" se refiere en general a cualquier contenedor en el que puede producirse una reacción de acuerdo con las presentes enseñanzas. En algunas realizaciones, un recipiente de reacción puede ser un tubo de microcentrífuga y contenedores del tipo habitual utilizados en los modernos laboratorios de biología molecular. En algunas realizaciones, un recipiente de reacción puede ser un pocillo de una placa de microtitulación (por ejemplo, una placa de 96 pocillos, placa de 384 pocillos), una mancha en un portaobjetos de vidrio, así como en una tarjeta matriz de Applied Biosystems™ TaqMan™ (Thermo Fisher Scientific, Inc.) o un orificio pasante de una placa Applied Biosystems™ TaqMan™ OpenArray™ (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Por ejemplo, una pluralidad de recipientes de reacción puede encontrarse en el mismo soporte. En algunas realizaciones, los dispositivos de laboratorio en un chip, disponibles por ejemplo, de Caliper y Fluidigm, pueden proporcionar recipientes de reacción. En algunas realizaciones, se pueden utilizar diversos enfoques de microfluidos. Se reconocerá que diversos recipientes de reacción están disponibles en la técnica y están comprendidos en el alcance de las presentes enseñanzas.

Como se describe, se proporciona en el presente documento un adaptador de ligadura universal en el extremo 5' que comprende una porción de cebador directo universal situado en la región del extremo 5'. También se proporciona un cebador de RT universal comprende una porción poli(T) y una porción de cola, comprendiendo la porción de cola una porción de cebador universal inverso. Se proporcionan composiciones que comprenden el adaptador de ligadura universal en 5'. Se proporcionan composiciones que comprenden tanto el adaptador de ligadura universal en 5' como el cebador de Rt universal. Se proporcionan composiciones que comprenden además un par de cebadores universales directo e inverso, siendo el par de cebadores específico de la porción del cebador directo del adaptador en 5' y de la porción del cebador inverso del cebador de ^rT. Se proporcionan composiciones que comprenden además un oligonucleótido bloqueante. Dichas composiciones pueden ser composiciones de reacción.

Las presentes enseñanzas también proporcionan kits diseñados para acelerar la realización de ciertos métodos. Los kits pueden servir para acelerar el rendimiento de los métodos de interés ensamblando dos o más componentes usados para llevar a cabo los métodos. Los kits pueden contener componentes en cantidades previamente medidas para minimizar la necesidad de mediciones a realizar por los usuarios finales. Los kits pueden incluir instrucciones para llevar a cabo uno o más de los métodos de las presentes enseñanzas. Los componentes del kit se pueden optimizar para funcionar conjuntamente entre sí.

Las presentes enseñanzas proporcionan un kit que comprende un adaptador de ligadura en 5' y un cebador de RT universal que comprende una porción de poli(T). Los kits pueden comprender además uno o más de una ligasa, una transcriptasa inversa y una ^a Dⁿ polimerasa. Los kits pueden comprender un par de cebadores universales, siendo el par de cebadores específico de la porción del cebador directo del adaptador en 5' y de la porción del cebador inverso del cebador de Rt . Los kits pueden también comprender pares de cebadores específicos de uno o más ARN pequeños maduros. Los kits pueden comprender una pluralidad de pares de cebadores, en donde cada par de cebadores está en un recipiente de reacción de una pluralidad de recipientes de reacción. Los kits pueden comprender una sonda de detección. La sonda de detección puede comprender un nucleótido del adaptador en 5' o del cebador de RT universal en el producto de amplificación o un complemento del nucleótido del adaptador en 5' o del cebador de RT universal en el producto de amplificación, y la sonda del detector puede también comprender un nucleótido de la región del extremo 3' del ARN pequeño maduro o un nucleótido de la región del extremo 5' del ARN pequeño maduro en el producto de amplificación o un nucleótido de la región del extremo 3' del ARN pequeño maduro o un nucleótido de la región del extremo 5' del complemento del ARN pequeño maduro en el producto de amplificación. El kit puede también comprender un oligonucleótido bloqueante.

Los métodos proporcionados en el presente documento se utilizan para detectar o cuantificar ARN pequeño maduro en una muestra. Los métodos proporcionados se pueden usar para detectar y/o diferenciar una especie específica de ARN pequeño maduro entre otras especies de ARN pequeño maduro en la muestra. Los métodos proporcionados se pueden usar para distinguir varios miARN entre sí en una muestra esencialmente simultáneamente en un único ensayo. Los métodos proporcionados pueden detectar cantidades muy bajas de ARN maduro en una muestra. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 1500 copias de un miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 1000 copias, menos de aproximadamente 800 copias, menos de aproximadamente 600 copias, menos de aproximadamente 400 copias, menos de aproximadamente 300 copias, menos de aproximadamente 200 copias, menos de aproximadamente 100 copias, menos de aproximadamente 60 copias, menos de aproximadamente 30 copias de un miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar incluso cantidades tan bajas como de 20 copias a aproximadamente 1500 copias de un miARN en una muestra. Los intervalos de sensibilidad adicionales de algunas realizaciones de los métodos proporcionados incluyen, aunque no de forma limitativa, la detección de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 1000 copias, de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 600 copias, de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 300 copias, de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 100 copias, y de aproximadamente 20 copias a aproximadamente 60 copias de un miARN en una muestra. En determinadas realizaciones, los métodos proporcionados pueden detectar incluso cantidades tan bajas como: de aproximadamente 1000 copias a aproximadamente 1500 copias, de aproximadamente 500 copias a aproximadamente 1000 copias, de aproximadamente 50 copias a aproximadamente 500 copias, de aproximadamente 50 copias a aproximadamente 200 copias, o de aproximadamente 50 copias a aproximadamente 100 copias de un miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar incluso cantidades tan bajas como aproximadamente 600 copias de un miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar incluso cantidades tan bajas como aproximadamente 60 copias de un miARN en una muestra.

Los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 0,01 pM de miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 0,001 pM de miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar menos de aproximadamente 0,0001 pM de miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar en el intervalo de aproximadamente 0,0001 pM a aproximadamente 0,01 pM de miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar en el intervalo de aproximadamente 0,0001 pM a aproximadamente 0,001 pM de miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar en el intervalo de aproximadamente 0,001 pM a aproximadamente 0,01 pM de miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar aproximadamente 0,01 pM de miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar aproximadamente 0,001 pM de miARN en una muestra. Los métodos proporcionados pueden detectar aproximadamente 0,0001 pM de miARN en una muestra.

Los métodos proporcionados en el presente documento se pueden utilizar para identificar y/o confirmar biomarcadores de ARN pequeño maduro que se pueden usar en la detección y seguimiento de enfermedades, selección y seguimiento de tratamientos, así como los métodos de diagnóstico y/o pronóstico del paciente. En los métodos para identificar y/o confirmar biomarcadores de ARN pequeño maduro, se pueden preparar muestras de ARN a partir de células, tejido (congelado o fresco), tejido incluido en parafina fijado en formalina o para formalina (FFPE), orina, sangre completa, plasma sanguíneo, suero sanguíneo, linfa, médula ósea, sudoración, saliva y/u otras secreciones biológicas. La identificación de biomarcadores en muestras biológicas fácilmente accesibles, por ejemplo, sangre, componentes de la sangre y orina, es muy deseable, y se sabe que los ARN pequeños maduros, como los miARN, circulan por la sangre y están presentes en otros fluidos corporales. Como se ha demostrado, los métodos proporcionados en el presente documento poseen una alta sensibilidad y especificidad para detectar y cuantificar el miARN en muestras de ARN con un número de copias relativamente bajo. Los métodos proporcionados son también adecuados para el muestreo de alto rendimiento. Los métodos proporcionados en el presente documento son de utilidad en el cribado de muestras de ARN de individuos o poblaciones de estados variables de salud, edad, u otras dolencias para los biomarcadores de miARN potenciales.

La elevada sensibilidad y especificidad de los métodos proporcionados también son adecuadas para detectar y/o cuantificar la expresión de a Rn pequeño maduro y otros ARN, tales como ARNm o ARNr, en la misma muestra de ARN. Por ejemplo, una porción de la muestra de ARN se puede usar para detectar y/o cuantificar la expresión de ARN pequeño maduro en la muestra y otra porción de la muestra de ARN se utiliza para detectar y/o cuantificar la expresión de ARNm, lo que permite realizar una correlación entre la expresión del ARN pequeño maduro y el ARNm. Esto puede ser beneficioso para muestras de ARN pequeñas y/o limitadas.

Los métodos divulgados en el presente documento también se utilizan en métodos de diagnóstico y/o pronóstico para identificar enfermedades y/o para determinar la respuesta del paciente al tratamiento con ciertos fármacos, medicamentos o métodos terapéuticos. Una dolencia ilustrativa que se puede asociar con los ARN pequeños maduros tales como el miARN es el cáncer. Por lo tanto, las presentes enseñanzas proporcionan un método para diagnosticar la susceptibilidad a un cáncer, pronosticar el resultado del tratamiento de un cáncer, o la estadificación y/o identidad del cáncer basándose en el perfil de miARN de la muestra.

Se divulga el uso de cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento para el diagnóstico y/o pronóstico de enfermedades, por ejemplo, cáncer, incluidos, aunque no de forma limitativa, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de piel, cánceres del tracto reproductor, cáncer de cerebro, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de estómago, cánceres de la sangre (por ejemplo, leucemia y linfoma), sarcomas, melanomas y similares; enfermedades cardiovasculares; enfermedades y trastornos autoinmunitarios; y enfermedades y trastornos metabólicos. Se divulga el uso de cualquiera de los métodos divulgados en el presente documento para el diagnóstico y/o determinación de la sensibilidad a los fármacos y el tratamiento médico.

Aunque las presentes enseñanzas se han descrito en términos de estos ejemplos de realización, el experto en la materia entenderá rápidamente que son posibles numerosas variaciones y modificaciones de estos ejemplos de realización sin excesiva experimentación. Dichas variaciones y modificaciones están comprendidas en el ámbito de las enseñanzas actuales. Algunos aspectos de las presentes enseñanzas se pueden entender mejor a la luz de los siguientes ejemplos, que no deben tomarse en forma alguna como limitantes del alcance de las enseñanzas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Análisis de miARN usando RT-qPCR de cola universal de dos extremos

Se obtuvieron ARN totales de cerebro humano de Ambion™(Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los oligonucleótidos de miARN sintético se adquirieron de Integrated DNA Technologies (IDT, Coralville, Iowa). El adaptador de ligadura, cebadores de transcripción inversa y de preamplificación, y los ensayos TaqMan™ se obtuvieron de Applied Biosystems™ (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

Etapa 1: Cola poli(A)

La cola poli A de los miARN sintéticos o del ARN total se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:

La reacción de poli(A) se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un ciclador térmico a 37 °C durante 45 minutos, 65 °C durante 10 minutos, 4 °C de mantenimiento.

Etapa 2: Reacción de ligadura

La reacción de ligadura se llevó a cabo para ligar un adaptador de ARN en 5' con el ARN con cola de poliA que tiene un monofosfato en el extremo 5' (que incluye miARN con cola de poliA). La reacción de ligadura se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:

Los componentes anteriores se mezclaron y a continuación se añadieron a la reacción de 5 j l de poli (A) procedente de la Etapa 1 anterior para un volumen de reacción de ligadura total de 15 jl. La reacción de ligadura se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un ciclador térmico a 16 °C durante 60 minutos, 4 °C de mantenimiento. Etapa 3: Reacción de transcripción inversa

La etapa de transcripción inversa (RT) sintetiza la primera hebra de ADNc procedente del producto de ligadura de la etapa 2 e incorpora el cebador de RT universal en el producto. La reacción de RT se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:

Los componentes anteriores se mezclaron y a continuación se añadieron a 15 ul de reacción de ligadura procedente de la Etapa 2 para un volumen de reacción de RT total de 30 ul. La reacción de RT se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un ciclador térmico a 42 °C durante 15 minutos, 85 °C durante 5 minutos, 4 °C de mantenimiento.

Etapa 4: Reacción de preamplificación (opcional)

La preamplificación (preamp) es una etapa opcional para aumentar la sensibilidad de la detección. La reacción de preamp se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:

La reacción de preamp se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un ciclador térmico a 95 °C durante 10 minutos, seguido de 12 ciclos de (95 °C durante 15 segundos, 60 °C durante 2 minutos), a continuación 99 °C durante 10 minutos y 4 °C de mantenimiento.

Etapa 5: Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR)

La PCR en tiempo real se llevó a cabo para la detección del miARN. La reacción de RT o de preamp se diluyó a 1:10 en tampón TE 0.1X. La qPCR se preparó combinando los siguientes componentes:

La PCR se mezcló y centrifugó brevemente. Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real tal como el sistema ViiA™7 RealTime PCR o el sistema de detección de secuencias ABI PRISM™ 7900HT. Los datos se analizaron de acuerdo con las especificaciones del instrumento y las directrices.

Usando el flujo de trabajo detallado anteriormente, se diseñaron ensayos RT-qPCR de cola universal de dos extremos y se llevaron a cabo para detectar 48 especies de miARN. El flujo de trabajo se realizó con y sin una etapa de preamplificación. Se obtuvo una respuesta lineal muy buena con la titulación de la plantilla sintética con un intervalo dinámico lineal de 6 unidades logarítmicas con copias de entrada de 60 a 60 millones y un límite de detección de 60 copias con preamplificación (Figs. 2A y 2B). La Fig. 3 representa gráficamente una comparación del umbral del ciclo promedio ("Ct") para introducir la cantidad de ("AT conc.") para los 48 ensayos de miARN sin preamplificación ("RT") y con preamplificación ("PA"). Como se muestra en la Fig. 3, se obtuvo una distribución de Ct estrecha a través de los 48 ensayos con resultados uniformes en todo el flujo de trabajo y el pequeño sesgo de ligadura.

Ejemplo 2: Comparación de ensayos de detección de miRNA

Los datos de detección de miARN usando los ensayos y métodos descritos en el presente documento se compararon con el patrón comercial habitual, los ensayos de microARN individuales TaqMan™. El ensayo de cola universal de dos extremos descrito en el presente documento se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1, tanto con una etapa de preamplificación de 12 ciclos, como sin ella. Los ensayos de microARN individuales TaqMan™ se llevaron a cabo de acuerdo con las especificaciones del producto y las directrices.

Se usó ARN total obtenido de cerebro humano normal para detectar el nivel de expresión de 4 miARN de expresión alta, 4 de expresión media y 3 de expresión baja. Se tuvo en cuenta el factor de dilución de manera que la cantidad de entrada y el número de copias de la PCR fueran los mismos entre el ensayo de cola universal descrito en el presente documento y los ensayos de microARN individuales TaqMan™. Los ensayos se realizaron con una cantidad de entrada de 25 ng de ARN total y con 2,5 ng de ARN total, junto con un control sin plantilla (NTC).

Como puede observarse en la Fig. 4, sin una etapa de amplificación previa ("-PA"), el ensayo proporcionado en el presente documento es al menos tan sensible como el ensayo realizado con el patrón comercial habitual en la detección de miARN ("Patrón"). La inclusión de la etapa de amplificación previa en el ensayo proporcionado dio como resultado un aumento significativo en la sensibilidad de detección (Fig. 4 "+PA").

Ejemplo 3: Análisis de miARN de ARN total procedente de muestras de tejido

Los ARN totales procedentes de tejido humano (cerebro, riñón, colon, corazón, hígado y pulmón) se obtuvieron de Ambion™ (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Los componentes de la reacción proceden del kit TaqMan™ Advanced miRNA cDNA Synthesis y los ensayos de miARN avanzados TaqMan™ obtenidos de Applied Biosystems™ (Thermo Fisher Scientific, Inc.).

Etapa 1: Cola poli(A)

La cola poli A del ARN total se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:

La reacción de poli(A) se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un ciclador térmico a 37 °C durante 45 minutos, 65 °C durante 10 minutos, 4 °C de mantenimiento.

Etapa 2: Reacción de ligadura

La reacción de ligadura se llevó a cabo para ligar un adaptador de ARN en 5' con el ARN con cola de poliA que tiene un monofosfato en el extremo 5' (que incluye miARN con cola de poliA). La reacción de ligadura se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:

Los componentes anteriores se mezclaron y a continuación se añadieron a la reacción de 5 j l de poli (A) procedente de la Etapa 1 anterior para un volumen de reacción de ligadura total de 15 jl. La reacción de ligadura se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un ciclador térmico a 16 °C durante 60 minutos, 4 °C de mantenimiento. Etapa 3: Reacción de transcripción inversa

La etapa de transcripción inversa (RT) sintetiza la primera hebra de ADNc procedente del producto de ligadura de la etapa 2 e incorpora el cebador de RT universal en el producto. La reacción de RT se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:

Los componentes anteriores se mezclaron y a continuación se añadieron a 15 ul de reacción de ligadura procedente de la Etapa 2 para un volumen de reacción de RT total de 30 ul. La reacción de RT se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un ciclador térmico a 42 °C durante 15 minutos, 85 °C durante 5 minutos, 4 °C de mantenimiento.

Etapa 4: Reacción de preamplificación

La reacción de preamplificación (preamp) se llevó a cabo combinando los siguientes componentes:

La reacción de preamp se mezcló, se centrifugó brevemente y se incubó en un ciclador térmico a 95 °C durante 10 minutos, seguido de 14 ciclos de (95 °C durante 3 segundos, 60 °C durante 30 segundos), a continuación 99 °C durante 10 minutos y 4 °C de mantenimiento.

Etapa 5: Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR)

La PCR en tiempo real ciclado rápido se llevó a cabo para la detección del miARN. La reacción de RT o de preamp se diluyó a 1:10 en tampón TE 0.1X. La qPCR se preparó combinando los siguientes componentes:

La PCR se mezcló y centrifugó brevemente. Las reacciones se realizaron en un sistema de PCR en tiempo real tal como el sistema ViiA™7 RealTime PCR o el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio. Las reacciones se incubaron en el instrumento de la PCR en tiempo real a 95 °C durante 20 segundos, seguido de 40 ciclos de (95 °C durante 1 segundo, 60 °C durante 20 segundos), después mantenimiento a 4 °C. Los datos se analizaron de acuerdo con las especificaciones del instrumento y las directrices.

Los ensayos se diseñaron y se realizaron para detectar varias especies de miRNA procedente de diversos tejidos. Se usó un intervalo de 5 unidades logarítmicas de ARN total (de 1 pg a 1 ug) de los tejidos de cerebro y riñón en el flujo de trabajo, y cada ensayo analizó 4 miARN. Los resultados representados en las Figs. 5A-5D muestran buenas respuestas lineales a la entrada de ADN en todo el intervalo de 5 unidades logarítmicas para los 4 miARN. Los miARN let-7a-5p, miR16-5p, miR23a-3p y miR361-5p se midieron en ARN total de cerebro (Figs. 5A-5B) y los miARN miR16-5p, miR199ab-3p, miR21a-5p y miR23-3p se midieron en ARN total de riñón (Figs. 5C-5D). Los ensayos de detección de miARN se realizaron para preparaciones de ADNc sin amplificación previa (Figs. 5A y 5C) y para preparación que se habían sometido a amplificación previa (Figs. 5B y 5D). La inclusión de la etapa de amplificación previa dio como resultado un aumento significativo en la sensibilidad de detección.

El ARN total procedente de seis tejidos humanos (cerebro, riñón, colon, corazón, hígado y el pulmón) se sometieron al flujo de trabajo de cola de ARN y a los ensayos de detección de miARN anteriormente descritos. El ADNc y los productos de reacción preamplificados se sometieron a ACt de 2 veces y a ensayos de discriminación con dilución de 2 veces (Figs. 6A y 6B; rombo = sin amplificación previa (RT); cuadrado = con amplificación previa). Los resultados que se muestran en la Fig. 6B muestran que el flujo de trabajo cumple la detección con discriminación de 2 veces para los estudios de expresión génica.

El ensayo sin amplificación previa (designado como "RT" en la Fig. 6) no está de acuerdo con la invención citada en las presentes reivindicaciones.

Ejemplo 4: Análisis de miARN de ARN total procedente de muestras de sangre y orina

El ARN total (incluido el miRNA) se preparó a partir de muestras de suero sanguíneo humano (100 microlitros), plasma sanguíneo (100 microlitros) y orina (250 microlitros) procedentes de donantes sanos usando dos procedimientos diferentes. En un procedimiento de alto rendimiento, el ARN total se aisló de las muestras (por duplicado) usando el kit MagMAX™ mirVana™ Total RNA Isolation (Ambion™, Thermo Fisher Scientific, Inc.) y un protocolo específico de suero con el instrumento Thermo Scientific™ KingFisher™ FLEX (cabezal con 96 pocillos profundos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En el otro procedimiento, el ARN total se aisló de la muestra usando el kit de purificación de ARN mirVana™ PARIS™ (Ambion™, Thermo Fisher Scientific, Inc.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se usó un kit TaqMan™ Advanced cDNA Synthesis para producir el ADNc de miARN con cola universal a partir de dos microlitros de ARN total aislado y se amplificó el ADNc mediante amplificación previa con miR-Amp según el procedimiento realizado como se describe en el Ejemplo 3. Después de la preamplificación, se usaron los ensayos de miARN avanzados TaqMan™ y la mezcla maestra avanzada rápida TaqMan™ en reacciones de amplificación por qPCR para la detección y cuantificación de miARN, como se describe en el Ejemplo 3. El ADNc preamplificado se sometió a ensayos de miARN para detectar 5 especies de miARN: let7c, miR16, miR221, miR21 y miR26a. Las Figs. 7A y 7B muestran la detección de los 5 miARN en el ARN aislado del suero de dos donantes. Las Figs. 8A y 8B muestran la detección de los 5 miARN en el ARN aislado del plasma de dos donantes. Las Figs. 9A y 9B muestran la detección de los 5 miARN en el ARN aislado de la orina de dos donantes.

Las Figs. 7A, 7B, 8A, 8B, 9A y 9B muestran los resultados de ARN aislado con el procedimiento de alto rendimiento (rombo, kit MagMAX™ mirVana™) y el ARN aislado con un procedimiento de aislamiento de ARN habitual (pero no de alto rendimiento) (cuadrado, kit mirVana™ PARIS™).

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un método para detectar un ARN pequeño maduro en una muestra que comprende ARN pequeño maduro, comprendiendo el método:

poliadenilar el extremo 3' del ARN pequeño maduro y ligar un adaptador monocatenario al extremo 5' del ARN pequeño maduro en presencia de una ligasa de ARN monocatenario, de modo que se forma un producto de ligadura de ARN, en donde el adaptador comprende una porción de cebador directo universal; transcribiendo de manera inversa el producto de ligadura de ARN usando un cebador de transcripción inversa (RT), formando de este modo un producto de ADNc del producto de ligadura del ARN, en donde el cebador de RT comprende una porción poli(T) y una porción de cola, en donde la porción de cola comprende una porción de cebador inverso universal;

amplificar el producto de ADNc usando una primera pareja de cebador directo e inverso para formar un producto de amplificación, en donde el primer cebador directo puede hibridarse con la porción de cebador directo universal o su complemento, y el primer cebador inverso puede hibridarse con la porción de cebador inverso universal o su complemento; y

detectar el producto de amplificación correspondiente al ARN pequeño maduro mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real cuantitativa (qPCR),

en donde la amplificación del producto del ADNc es una etapa de amplificación previa, y

en donde la poliadenilación, la ligadura y la transcripción inversa se llevan a cabo en el mismo recipiente de reacción, y

en donde la poliadenilación, la ligadura, la transcripción inversa y la preamplificación se llevan a cabo sin que intervengan extracción, precipitación, purificación y/u otros procesos de limpieza.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la detección comprende una qPCR usando un segundo par de cebadores directo e inverso, en donde al menos uno del segundo cebador directo y el segundo cebador inverso comprende una porción específica del ARN pequeño maduro.

3. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la etapa de amplificación previa comprende de 2 a 14 ciclos de amplificación.

4. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la detección comprende una qPCR usando una sonda de detección marcada, en donde la sonda de detección comprende una porción específica del ARN pequeño maduro.

5. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde las etapas de poliadenilación, ligadura, transcripción inversa y amplificación se llevan a cabo sin intervenir la purificación de los productos de reacción.

6. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la etapa de poliadenilación se lleva a cabo antes de la etapa de ligadura o en donde la etapa de ligadura se lleva a cabo antes de la etapa de poliadenilación.

7. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la etapa de transcripción inversa y la etapa de amplificación previa se realizan esencialmente de manera simultánea o

en donde la etapa de ligadura y la etapa de transcripción inversa se realizan esencialmente de manera simultánea o en donde la etapa de ligadura, la etapa de transcripción inversa y la etapa de amplificación se realizan esencialmente de manera simultánea.

8. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el ARN pequeño maduro se selecciona del grupo que consiste en un microARN (miARN), un ARN de interferencia pequeño (ARNip), un ARNip asociado a repeticiones (ARNipar), un ARNip transactuante (ARNipta), un ARN que interactúa con Piwi (ARNpi), un ARN de horquilla corta (ARNhc) y un ARN de 21-U.

9. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la muestra que comprende un ARN pequeño maduro se selecciona del grupo que consiste de una preparación aislada de ARN total, un extracto celular, una célula intacta, una reacción de transcripción in vitro, y una síntesis química.

10. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la muestra que comprende ARN pequeño maduro se ha preparado del grupo que consiste en un tejido biológico, sangre completa, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, y orina.

11. El método de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el adaptador es una molécula de ARN.

12. El método de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende además añadir un oligonucleótido bloqueante en la etapa de ligadura y/o amplificación, en donde el oligonucleótido bloqueante se selecciona del grupo que consiste en un oligonucleótido bloqueante de 3'-MGB, un oligonucleótido bloqueante de 5'-MGB, un oligonucleótido bloqueante de 2'-O-metilo, un oligonucleótido bloqueante de 3'-acridina, un oligonucleótido bloqueante de 5'-acridina, un oligonucleótido bloqueante de STAR y un oligonucleótido bloqueante que comprende una secuencia de poli(A).

13. Un kit para sintetizar y amplificar un ADNc de ARN pequeño maduro, comprendiendo el kit:

un adaptador monocatenario que comprende un grupo -OH en el extremo 3' y una porción de cebador directo universal;

un cebador de transcripción inversa (RT), en donde el cebador de RT comprende una porción poli(T) y una porción de cola y en donde la porción de cola comprende una porción de cebador inverso universal;

una ARN ligasa monocatenaria;

una transcriptasa inversa;

una ADN polimerasa;

un par de cebadores universales directo e inverso, en donde el cebador directo universal puede hibridarse con la porción de cebador directo universal o su complemento, y el cebador inverso universal puede hibridarse con la porción de cebador inverso universal o su complemento;

y un oligonucleótido bloqueante seleccionado entre el grupo que consiste en un oligonucleótido bloqueante de MGB, un oligonucleótido bloqueante de 2'-O-metilo, un oligonucleótido bloqueante de acridina, un oligonucleótido bloqueante de fosfotioato, un oligonucleótido bloqueante de biotina, un oligonucleótido bloqueante de STAR, y un oligonucleótido bloqueante que comprende una secuencia de poli(A), en donde el oligonucleótido bloqueante suprime selectivamente la amplificación y/o la ligadura del subproducto adaptador-cebador.

14. El kit de la reivindicación 13, que comprende además uno o más dNTP, ATP, un tampón y una sal de un catión divalente.

15. Una composición para detectar un ARN pequeño maduro que comprende:

un ADNc de un ARN pequeño maduro, comprendiendo el ADNc una secuencia de un cebador de transcripción inversa (RT) en el extremo 5' y una secuencia de adaptador en el extremo 3', en donde el cebador de RT comprende una porción poli(T) y una porción de cola y en donde la porción de cola comprende una porción de cebador inverso universal, y en donde el adaptador comprende una porción de cebador directo universal; polimerasa poli(A),

ARN ligasa 1,

y una transcriptasa inversa,

en donde la composición comprende además un oligonucleótido bloqueante seleccionado entre el grupo que consiste en un oligonucleótido bloqueante de MGB, un oligonucleótido bloqueante de 2'-O-metilo, un oligonucleótido bloqueante de acridina, un oligonucleótido bloqueante de fosfotioato, un oligonucleótido bloqueante de biotina, un oligonucleótido bloqueante de STAR, y un oligonucleótido bloqueante que comprende una secuencia de poli(A), en donde el oligonucleótido bloqueante suprime selectivamente la amplificación y/o la ligadura del subproducto adaptador-cebador.

16. La composición de la reivindicación 15, que además comprende un par de cebadores universales directo e inverso, en donde el cebador directo universal puede hibridarse con la porción de cebador directo universal o su complemento, y el cebador inverso universal puede hibridarse con la porción de cebador inverso universal o su complemento.