ES2888904T3 - Un método de cuantificación de C5a sin unir en una muestra - Google Patents

Abstract

Un método de cuantificación de la proteína del complemento C5a humana (C5a) libre (sin unirse) de una muestra, que comprende: a. retirar C5 humana de la muestra; en el que la muestra se incuba con anticuerpos biotinilado específico de C5 acoplado a microesferas magnéticas y en el que las microesferas magnéticas acopladas a anticuerpo biotinilado específico de C5 unido a C5 humana se capturan con un imán; b. unir anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a se añade mediante acción capilar a un Gyros Bioaffy 200 CD que comprende columnas con las partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro de un Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; c. capturar la C5a libre (sin unir) en la muestra en el anticuerpo de captura; en el que la muestra después de la etapa a. se añade al CD mediante acción capilar; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, la muestra después de la etapa a. al anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; d. detectar la C5a libre capturada; en el que un anticuerpo de detección marcado con AlexaFluor anti-C5a se añade al CD mediante acción capilar, en el que dicho anticuerpo de detección anti-C5a se une a C5a en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo de captura; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de detección a la C5a libre unida al anticuerpo de captura unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; y e. cuantificar la C5a libre capturada usando detección de fluorescencia inducida por láser.

Description

DESCRIPCIÓN

Un método de cuantificación de C5a sin unir en una muestra

Campo técnico

Esta invención se refiere al campo de enfermedades relacionadas inmunológicamente y ensayos para cuantificar la diana farmacéutica libre (sin unir).

Antecedentes

La proteína del complemento C5a es un componente importante de la reacción en cadena alternativa del complemento, y una diana del fármaco de Alexion ALXN1007. La cuantificación apropiada de esta diana es esencial por varias razones, tales como supervisión de la patología, modelado, selección de la dosificación y especificaciones del producto. ALXN1007 tiene afinidad 60 pM por C5a humana, pero también tiene afinidad 5 nM por C5 humana. La afinidad por C5 se basa en la disponibilidad del neoepítopo cuando la C5 convertasa escinde C5 en C5a y C5b, y es una función del tiempo. Esta afinidad de bajo nivel por C5 puede tener un efecto aditivo sobre la cuantificación de C5a en bioensayos porque, al igual que ALXN1007, no hay anticuerpos secundarios que sean específicos solamente para C5a; se unen a C5 a una menor afinidad también. Si C5 se une por ALXN1007 cuando el fármaco se usa como anticuerpo de captura en un formato de ensayo de unión a ligando, una proporción de la proteína se reconocerá y unirá por un anticuerpo anti-C5a, dando lugar, por tanto, a sobreestimación de lo que es verdaderamente C5a. El documento EP0097440 A1 describe un método para retirar y ensayar fragmentos del sistema del complemento incluyendo C5a usando acrinol.

Sumario

Esta divulgación proporciona un método de cuantificación de la proteína del complemento C5a humana (C5a) libre (sin unirse) de una muestra, que comprende:

a. retirar C5 humana de la muestra; en el que la muestra se incuba con anticuerpo biotinilado específico de C5 acoplado a microesferas magnéticas y en el que las microesferas magnéticas acopladas a anticuerpo biotinilado específico de C5 unido a C5 humana se capturan con un imán;

b. unir anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a se añade mediante acción capilar a un Gyros Bioaffy 200 CD que comprende columnas con las partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro de un Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

c. capturar la C5a libre (sin unir) en la muestra en el anticuerpo de captura; en el que la muestra, después de la etapa a. se añade al CD mediante acción capilar; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, la muestra después de la etapa a. al anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

d. detectar la C5a libre capturada; en el que un anticuerpo de detección marcado con AlexaFluor anti-C5a se añade al CD mediante acción capilar, en el que dicho anticuerpo de detección anti-C5a se une a C5a en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo de captura; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de detección a la C5a libre unida al anticuerpo de captura unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; y

e. cuantificar la C5a libre capturada usando detección de fluorescencia inducida por láser.

Sin limitar la divulgación, a continuación, se describen varias realizaciones de la divulgación con fines de ilustración.

Punto 1. Un método de cuantificación de la proteína del complemento C5a humana (C5a) libre (sin unirse) de una muestra, que comprende:

a. retirar C5 humana de la muestra; en el que la muestra se incuba con anticuerpos biotinilado específico de C5 acoplado a microesferas magnéticas y en el que las microesferas magnéticas acopladas a anticuerpo biotinilado específico de C5 unido a C5 humana se capturan con un imán;

b. unir anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a se añade mediante acción capilar a un Gyros Bioaffy 200 CD que comprende columnas con las partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro de un Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

c. capturar la C5a libre (sin unir) en la muestra en el anticuerpo de captura; en el que la muestra, después de la etapa a. se añade al CD mediante acción capilar; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, la muestra después de la etapa a. al anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; d. detectar la C5a libre capturada; en el que un anticuerpo de detección marcado con AlexaFluor anti-C5a se añade al CD mediante acción capilar, en el que dicho anticuerpo de detección anti-C5a se une a C5a en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo de captura; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de detección a la C5a libre unida al anticuerpo de captura unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; y

e. cuantificar la C5a libre capturada usando detección de fluorescencia inducida por láser.

Punto 2. El método del punto 1, en el que la etapa (a) usa un tampón de aproximadamente 1 M de NaCl/aproximadamente un 0,5 % de Tween 20.

Punto 3. El método del punto 1 o punto 2, que comprende además calcular la concentración o cantidad de anticuerpo contra C5a libre comparando el valor obtenido de la etapa e. con una curva patrón preparada a partir de cantidades conocidas de C5a añadidas a una muestra reducida de C5a usando el método del punto 1 o punto 2 (al menos las etapas b.-e.; y opcionalmente la etapa a.).

Punto 4. El método de uno cualquiera de los puntos precedentes, en el que la muestra se obtiene de un paciente humano.

Punto 5. El método del punto 4, en el que dicha muestra es una muestra de suero.

Punto 6. El método de uno cualquiera de los puntos precedentes, en el que el paciente se ha tratado con un anticuerpo anti-C5a.

Punto 7. El método del punto 6, en el que el paciente se ha tratado con un anticuerpo que comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que tienen las secuencias de SEQ ID No: 13, 14 y 15 y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID No: 5, 6 y 7. Punto 8. El método del punto 7, en el que el paciente se ha tratado con un anticuerpo que comprende las cadenas pesada y ligera que tienen las secuencias de SEQ ID No: 10 y 2.

Punto 9. El método de uno cualquiera de los puntos precedentes, en el que las microesferas magnéticas son microesferas magnéticas Dynabead.

Punto 10. El método de uno cualquiera de los puntos precedentes, en el que el anticuerpo de captura biotinilado comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que tienen las secuencias de SEQ ID No: 13, 14 y 15 y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID No: 5, 6 y 7.

Punto 11. El método del punto 10, en el que el anticuerpo de captura biotinilado comprende las cadenas pesada y ligera que tienen las secuencias de SEQ ID No: 10 y 2.

Punto 12. El método de uno cualquiera de los puntos precedentes, que comprende además cebar el instrumento Gyros dos veces distintas con PBS con un 0,1 % de Tween 20, un 0,02 % de azida sódica y tampón de pH 11.

Se proporciona otros numerosos aspectos de acuerdo con estos y otros aspectos de la invención. Llegarán a ser más completamente evidentes otros rasgos característicos y aspectos de la presente invención a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es un gráfico que muestra el paralelismo de tratamiento con microesferas de C5a libre.

La FIG. 2 es un ejemplo de una curva patrón realizada por triplicado.

La FIG. 3 muestra el efecto de las microesferas sobre C5a y C5.

La FIG. 4 muestra el efecto de las microesferas - Rexxip AN frente a 1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20.

La FIG. 5 muestra la selectividad del tratamiento con microesferas temprano de C5a libre.

Descripción detallada

Como se usa en este documento, la palabra "un/o" o "pluralidad" antes de un sustantivo representa uno o más del sustantivo particular. Por ejemplo, la expresión "una célula de mamífero" representa "una o más células de mamífero".

La expresión "célula de mamífero" es conocida en la técnica y puede referirse a cualquier célula de o derivada de cualquier mamífero incluyendo, por ejemplo, un ser humano, un hámster, un ratón, un mono verde, una rata, un cerdo, una vaca, un hámster o un conejo. En algunas realizaciones, la célula de mamífero puede ser una célula inmortalizada, una célula diferenciada, una célula indiferenciada, una célula madre, etc.

Como se usa en este documento, los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente. Un paciente o un sujeto puede ser un paciente humano o un sujeto humano.

La expresión "proteína recombinante" es conocida en la técnica. En resumen, la expresión "proteína recombinante" puede referirse a una proteína que puede fabricarse usando un sistema de cultivo celular. Las células en el sistema de cultivo celular pueden derivar de, por ejemplo, una célula de mamífero, incluyendo una célula humana, una célula de insecto, una célula de levadura o una célula bacteriana. En general, las células en el cultivo celular contienen un ácido nucleico introducido que codifica la proteína recombinante de interés (cuyo ácido nucleico puede estar portado en un vector, tal como un vector plasmídico). El ácido nucleico que codifica la proteína recombinante también puede contener un promotor heterólogo unido de forma funcional a un ácido nucleico que codifica la proteína.

El término "inmunoglobulina" es conocido en la técnica. En resumen, el término "inmunoglobulina" puede referirse a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de al menos 15 aminoácidos (por ejemplo, al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos, o más de 100 aminoácidos) de una proteína de inmunoglobulina (por ejemplo, una secuencia de dominio variable, una secuencia flanqueante o una secuencia de dominio constante). La inmunoglobulina puede incluir, por ejemplo, al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena ligera, por ejemplo, al menos 15 aminoácidos de una inmunoglobulina de cadena pesada, tal como una CDRH3. La inmunoglobulina puede ser un anticuerpo aislado (por ejemplo, una IgG, IgE, IgD, IgA o IgM). La inmunoglobulina puede ser una subclase de IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). La inmunoglobulina puede ser un fragmento de anticuerpo, por ejemplo, un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2 o un scFv. La inmunoglobulina también puede ser una proteína manipulada que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, una proteína de fusión). La proteína manipulada o proteína similar a inmunoglobulina también puede ser un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo dimérico, trimérico o multimérico, o un diacuerpo, un DVD-Ig, un CODV-Ig, un Affibody® o un Nanobody®. En este documento se describen ejemplos no limitantes de inmunoglobulinas y ejemplos adicionales de inmunoglobulinas son conocidos en la técnica.

La expresión "proteína manipulada" es conocida en la técnica. En resumen, la expresión "proteína manipulada" puede referirse a un polipéptido que no está codificado de forma natural por un ácido nucleico endógeno presente dentro de un organismo (por ejemplo, un mamífero). Ejemplos de proteínas manipuladas incluyen enzimas modificadas con una o más sustituciones, eliminaciones, inserciones o adiciones aminoacídicas que provocan un aumento en la estabilidad y/o actividad catalítica de la enzima manipulada, proteínas de fusión, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos divalentes, anticuerpos trivalentes, anticuerpos de cuatro dominios de unión, un diacuerpo y proteínas de unión a antígeno que contienen al menos una secuencia estructural recombinante.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente y son conocidos en la técnica y pueden significar cualquier cadena de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, independientemente de la longitud o modificación postraduccional.

El término "anticuerpo" es conocido en la técnica. El término "anticuerpo" puede usarse indistintamente con el término "inmunoglobulina". En resumen, puede referirse a un anticuerpo completo que comprende dos polipéptidos de la cadena ligera y dos polipéptidos de la cadena pesada. Los anticuerpos completos incluyen diferentes isotipos de anticuerpo incluyendo anticuerpos IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. El término "anticuerpo" incluye, por ejemplo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerizado o quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo primatizado, un anticuerpo desinmunizado y un anticuerpo completamente humano. El anticuerpo puede prepararse en o derivar de cualquiera de una diversidad de especies, por ejemplo, mamíferos tales como seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, orangutanes, babuinos o chimpancés), caballos, ganado bovino, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos, conejos, cobayas, jerbos, hámsteres, ratas y ratones. El anticuerpo puede ser un anticuerpo purificado o uno recombinante.

El anticuerpo también puede ser una proteína manipulada o proteína similar a anticuerpo que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina (por ejemplo, una proteína de fusión). La proteína manipulada o proteína similar a anticuerpo también puede ser un anticuerpo biespecífico o un anticuerpo triespecífico, o un anticuerpo dimérico, trimérico o multimérico, o un diacuerpo, un DVD-Ig, un CODV-Ig, un Affibody® o un Nanobody®.

La expresión "fragmento de anticuerpo", "fragmento de unión a antígeno" o expresiones similares son conocidas en la técnica y pueden referirse, por ejemplo, a un fragmento de un anticuerpo que retiene la capacidad de unirse a un antígeno diana (por ejemplo, C5 humana) e inhibe la actividad de la proteína diana. Dichos fragmentos incluyen, por ejemplo, un anticuerpo monocatenario, un fragmento Fv monocatenario (scFv), un fragmento Fd, un fragmento Fab, un fragmento Fab' o un fragmento F(ab')2. Un fragmento scFv es una sola cadena polipeptídica que incluye las regiones variables tanto de la cadena pesada como de la ligera del anticuerpo del que deriva el scFv. Además, intracuerpos, minicuerpos, triacuerpos y diacuerpos también se incluyen en la definición de anticuerpo y son compatibles para su uso en los métodos descritos en este documento. Véase, por ejemplo, Todorovska et al. (2001) J Immunol Methods 248(1):47-66; Hudson y Kortt (1999) J Immunol Methods 231 (1):177-189; Poljak (1994) Structure 2(12):1121-1123; Rondon y Marasco (1997) Annual Review of Microbiology 51:257-283. Un fragmento de unión a antígeno también puede incluir la región variable de un polipéptido de la cadena pesada y la región variable de un polipéptido de la cadena ligera. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender, por tanto, las CDR del polipéptido de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo.

La expresión "fragmento de anticuerpo" también puede incluir, por ejemplo, anticuerpos de un solo dominio tales como anticuerpos de un solo dominio camelizados. Véase, por ejemplo, Muyldermans et al. (2001) Trends Biochem Sci 26:230-235; Nuttall et al. (2000) Curr Pharm Biotech 1:253-263; Reichmann et al. (1999) J Immunol Meth 231:25-38; publicaciones de solicitud PCT n.° WO 94/04678 y WO 94/25591; y patente de Estados Unidos n.° 6.005.079. La expresión "fragmento de anticuerpo" también incluye anticuerpos de un solo dominio que comprenden dos dominios VH con modificaciones de modo que se formen anticuerpos de un solo dominio.

El término "anticuerpo" también incluye "fragmento de unión a antígeno" y "fragmento de anticuerpo".

El término "ka" es bien conocido en la técnica y puede referirse a la constante de velocidad para la asociación de un anticuerpo a un antígeno. El término "kd" también es conocido en la técnica y puede referirse a la constante de velocidad para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antígeno. Y el término "Kd" es conocido en la técnica y puede referirse a la constante de disociación en equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno. La constante de disociación en equilibrio se deduce de la relación de las constantes de velocidad cinéticas, Kd = ka/kd. Dichas determinaciones se miden típicamente a, por ejemplo, 25 °C o 37 °C. Por ejemplo, la cinética de la unión del anticuerpo a C5 humana puede determinarse a pH 8,0, 7,4, 7,0, 6,5 y 6,0 mediante resonancia de plasmones superficiales ("SPR") en un instrumento BIAcore 3000 usando un método de captura anti-Fc para inmovilizar el anticuerpo.

Para las expresiones "por ejemplo" y "tal/es como" y equivalencias gramaticales de las mismas, se entiende que les sigue la expresión "y sin limitación" salvo que se indique explícitamente de otro modo. Como se usa en este documento, se entiende que el término "aproximadamente" representa variaciones debidas a error experimental. Se entiende que todas las mediciones presentadas en este documento están modificadas por el término "aproximadamente", se use explícitamente o no el término, salvo que se indique explícitamente de otro modo. Como se usan en este documento, las formas singulares "un/o", "una", y "el/la" incluyen referentes plurales salvo que el contexto indique claramente lo contrario.

Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. En este documento se describen métodos y materiales para su uso en la presente invención; también pueden usarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

El sistema del complemento

Como es bien conocido, el sistema del complemento actúa junto con otros sistemas inmunológicos del organismo para defenderse contra la intrusión de patógenos celulares y víricos. Hay al menos 25 proteínas del complemento. Los componentes del complemento consiguen sus funciones defensivas inmunitarias interactuando en una serie de acontecimientos intricados, pero precisos, de escisión enzimática y unión a membrana. La reacción en cadena del complemento da lugar a la producción de productos con funciones opsónicas, inmunorreguladoras y líticas.

La reacción en cadena del complemento progresa mediante la ruta clásica ("CP"), la ruta de lectina ("LP") o la ruta alternativa ("AP"). La ruta de lectina se inicia típicamente con la unión de lectina de unión a manosa ("MBL") a sustratos con alto contenido de manosa. La AP puede ser independiente de anticuerpos, y puede iniciarse mediante determinadas moléculas en superficies de patógenos. La CP se inicia típicamente mediante el reconocimiento de anticuerpos de, y unión a, un sitio antigénico en una célula diana. Estas rutas convergen en la C3 convertasa, el pinto donde el componente C3 del complemento se escinde por una proteasa activa para producir C3a y C3b.

La C3 convertasa de AP se inicia por la hidrólisis espontánea del componente C3 del complemento, que es abundante en el plasma en la sangre. Este proceso, también conocido como "activación basal" se produce a través de la escisión espontánea de un enlace tioéster en C3 para formar C3i o C3(H2O). La activación basal se facilita por la presencia de superficies que mantienen la unión de C3 activada y/o tienen características de carga neutra o positiva (por ejemplo, superficies celulares bacterianas). Esta formación de C3(H2O) permite la unión de la proteína plasmática Factor B, que a su vez permite que el Factor D escinda el Factor B en Ba y Bb. El fragmento Bb permanece unido a C3 para formar un complejo que contiene C3(H2O)Bb, la C3 convertasa de "fase líquida" o "inicio". Aunque solamente se produce en pequeñas cantidades, la C3 convertasa en fase líquida puede escindir múltiples proteínas C3 en C3a y C3b y provoca la generación de C3b y su posterior unión covalente a una superficie (por ejemplo, una superficie bacteriana). El Factor B unido a la C3b unida a superficie se escinde por el Factor D para formar, por tanto, el complejo de C3 convertasa de AP unido a superficie que contiene C3b,Bb. Véase, por ejemplo, Müller-Eberhard (1988) Ann Rev Biochem 57:321-347.

La C5 convertasa de AP, (C3b)2,Bb, se forma tras la adición de un segundo monómero de C3b a la C3 convertasa de AP. Véase, por ejemplo, Medicus et al. (1976) J Exp Med 144:1076-1093 y Fearon et al. (1975) J Exp Med 142:856-863. La función de la segunda molécula de C3b es unirse a C5 y presentarla para escisión por Bb. Véase, por ejemplo, Isenman et al. (1980) J Immunol 124:326-331. Las C3 y C5 convertasas de AP se estabilizan mediante la adición de la proteína trimérica properdina como se describe en, por ejemplo, Medicus et al. (1976), supra. Sin embargo, no se requiere la unión de properdina para formar una C3 o C5 convertasa de la ruta alternativa que funcione. Véase, por ejemplo, Schreiber et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3948-3952, y Sissons et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77: 559-562.

La C3 convertasa de CP se forma tras la interacción del componente C1 del complemento, que es un complejo de C1q, C1r y C1s, con un anticuerpo que se une a un antígeno diana (por ejemplo, un antígeno microbiano). La unión de la parte C1q de C1 al complejo de anticuerpo-antígeno provoca un cambio conformacional en C1 que activa C1r. C1 r activa entonces escinde la C1 s asociada a C1 para generar de ese modo una serina proteasa activa. C1 s activa escinde el componente C4 del complemento en C4b y C4a. Como C3b, el fragmento C4b recién generado contiene un tiol altamente reactivo que forma fácilmente enlaces amida o éster con moléculas adecuadas en una superficie diana (por ejemplo, una superficie celular microbiana). C1s también escinde el componente C2 del complemento en C2b y C2a. El complejo formado por C4b y C2a es la C3 convertasa de CP, que puede procesar C3 en C3a y C3b. La C5 convertasa de CP, C4b,C2a,C3b, se forma tras la adición de un monómero C3b a la C3 convertasa de CP. Véase, por ejemplo, Müller-Eberhard (1988), supra y Cooper et al. (1970) J Exp Med 132:775-793.

Además de su función en las C3 y C5 convertasas, C3b también funciona como una opsonina a través de su interacción con receptores del complemento presentes en las superficies de células presentadoras de antígeno tales como macrófagos y células dendríticas. La función opsónica de C3b se considera en general una de las funciones antiinfecciosas más importantes del sistema del complemento. Pacientes con lesiones genéticas que bloquean la función de C3b son propensos a infección por una amplia diversidad de organismos patógenos, mientras que se encuentra que pacientes con lesiones posteriores en la secuencia de reacción en cadena del complemento, es decir, pacientes con lesiones que bloquean las funciones de C5 son más propensos solamente a infección por Neisseria, y entonces solamente algo más propensos.

Las C5 convertasas de AP y CP escinden C5, que es una beta globulina de 190 kDa encontrada en suero humano normal a aproximadamente 75 pg/ml (0,4 pM). C5 está glucosilada, con aproximadamente un 1,5-3 por ciento de su masa atribuida a carbohidrato. C5 madura es un heterodímero de una cadena alfa de 999 aminoácidos de 115 kDa que está unida por disulfuro a una cadena beta de 655 aminoácidos de 75 kDa. C5 se sintetiza como un producto proteínico precursor monocatenario de un gen de una sola copia (Haviland et al. (1991) J Immunol. 146:362-368). La secuencia de ADNc del transcrito de este gen humano predice un precursor pro-C5 secretado de 1658 aminoácidos junto con una secuencia líder de 18 aminoácidos. Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.355.245.

El precursor pro-C5 se escinde después de los aminoácidos 655 y 659, para producir la cadena beta como un fragmento aminoterminal (residuos aminoacídicos 1 a 655 de la secuencia anterior) y la cadena alfa como un fragmento carboxiterminal (residuos aminoacídicos 660 a 1658 de la secuencia anterior), con cuatro aminoácidos (residuos aminoacídicos 656-659 de la secuencia anterior) eliminados entre los dos.

C5a se escinde de la cadena alfa de C5 por la C5 convertasa alternativa o clásica como un fragmento aminoterminal que comprende los primeros 74 aminoácidos de la cadena alfa (es decir, los residuos aminoacídicos 660-733 de la secuencia anterior). Aproximadamente un 20 por ciento de la masa de 11 kDa de C5a se atribuye a carbohidrato. El sitio de escisión para la acción de la convertasa está en, o inmediatamente adyacente a, el residuo aminoacídico 733. Un compuesto que se uniera en, o adyacente a, este sitio de escisión tendría el potencial de bloquear el acceso de las enzimas C5 convertasa al sitio de escisión y de ese modo actuaría como un inhibidor del complemento. Un compuesto que se une a C5 en un sitio distal del sitio de escisión también podría tener el potencial de bloquear la escisión de C5, por ejemplo, mediante inhibición mediada por impedimento estérico de la interacción entre C5 y la C5 convertasa. Un compuesto, en un mecanismo de acción coherente con el del inhibidor del complemento de la saliva de la garrapata, inhibidor C de Ornithodoros moubata ("OmCI"), también puede evitar la escisión de C5 reduciendo la flexibilidad del dominio C345C de la cadena alfa de C5, que reduce el acceso de la C5 convertasa al sitio de escisión de C5. Véase, por ejemplo, Fredslund et al. (2008) Nat Immunol 9(7):753-760.

C5 también puede activarse por un medio distinto de la actividad C5 convertasa. La digestión con tripsina limitada (véase, por ejemplo, Minta y Man (1997) J Immunol 119:1597-1602 y Wetsel y Kolb (1982) J Immunol 128:2209-2216) y el tratamiento ácido (Yamamoto y Gewurz (1978) J Immunol 120:2008 y Damerau et al. (1989) Molec Immunol 26:1133-1142) también pueden escindir C5 y producir C5b activa.

La escisión de C5 libera C5a, una anafilotoxina potente y factor quimiotáctico, y da lugar a la formación del complejo terminal lítico del complemento, C5b-9. C5a y C5b-9 también tienen propiedades de activación celular pleiotrópicas, amplificando la liberación de factores inflamatorios posteriores, tales como enzimas hidrolíticas, especies reactivas de oxígeno, metabolitos de ácido araquidónico y diversas citocinas.

La primera etapa en la formación del complejo terminal del complemento implica la combinación de C5b con C6, C7 y C8 para formar el complejo C5b-8 en la superficie de la célula diana. Tras la unión del complejo C5b-8 con varias moléculas C9, se forma el complejo de ataque a la membrana ("MAC", C5b-9, complejo terminal del complemento --"TCC"). Cuando suficientes números de MAC se insertan en las membranas de células diana, las aberturas que crean (poros MAC) median la lisis osmótica rápida de las células diana, tales como glóbulos rojos. Concentraciones no líticas inferiores de MAC pueden producir otros efectos. En particular, la inserción en la membrana de pequeños números de los complejos C5b-9 en células endoteliales y plaquetas pueden provocar activación celular perjudicial. En algunos casos, la activación puede preceder la lisis celular.

C3a y C5a son anafilotoxinas. Estos componentes del complemento activados pueden desencadenar la desgranulación de mastocitos, lo que libera histamina desde basófilos y mastocitos, y otros mediadores de inflamación, provocando la contracción del músculo liso, permeabilidad vascular aumentada, activación de leucocitos y otros fenómenos inflamatorios incluyendo proliferación celular que provoca hipercelularidad. C5a también funciona como un péptido quimiotáctico que sirve para atraer granulocitos proinflamatorios al sitio de activación del complemento.

Se encuentran receptores de C5a en las superficies de células epiteliales bronquiales y alveolares y células de músculo liso bronquiales. También se han encontrado receptores de C5a en eosinófilos, mastocitos, monocitos, neutrófilos y linfocitos activados.

Aunque un sistema del complemento que funcione apropiadamente proporciona una defensa robusta contra microbios infecciosos, la regulación o activación inapropiada del complemento se ha implicado en la patogenia de una diversidad de trastornos incluyendo, por ejemplo, artritis reumatoide; nefritis lúpica; asma; lesión por isquemia-reperfusión; síndrome urémico hemolítico atípico ("aHUS"); enfermedad por depósitos densos; hemoglobinuria nocturna paroxísmica (PNH); degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular senil; hemólisis, enzimas hepáticas elevadas y síndrome de baja cantidad de plaquetas (HELLP); púrpura trombocitopénica trombótica (TTP); muerte fetal espontánea; vasculitis oligoinmunitaria; epidermólisis ampollosa; muerte fetal recurrente; esclerosis múltiple (MS); lesión cerebral traumática; y lesión resultante de infarto de miocardio, circulación extracorpórea y hemodiálisis. Véase, por ejemplo, Holers et al. (2008) Immunological Reviews 223:300-316.

Como se usa en este documento, el término "C5a" se refiere a un fragmento proteínico liberado de la escisión del componente C5 del complemento humano por la proteasa C5-convertasa en fragmentos C5a y C5b. La proforma de C5 humana, una proteína precursora de 1676 residuos aminoacídico, se procesa mediante una serie de acontecimientos de escisión proteolítica. Los primeros 18 péptidos (numerados -18 a - 1) constituyen un péptido señal que se escinde de la proteína precursora. La proteína restante de 1658 aminoácidos se escinde en dos sitios para formar las cadenas alfa y beta. El primer acontecimiento de escisión se produce entre los residuos aminoacídicos 655 y 656. La segundad escisión se produce entre los residuos aminoacídicos 659 y 660. Los dos acontecimientos de escisión provocan la formación de tres fragmentos polipeptídicos distintos: (i) un fragmento que comprende los aminoácidos 1 a 655, que se denomina cadena beta; (ii) un fragmento que comprende los aminoácidos 660 a 1658, que se denomina cadena alfa; y (iii) un fragmento tetrapeptídico que consiste en los aminoácidos 656 a 659. Los fragmentos polipeptídicos de la cadena alfa y la cadena beta se conectan entre sí mediante enlace disulfuro y constituyen la proteína C5 madura. La C5 convertasa de CP o AP activa C5 madura escindiendo la cadena alfa entre los residuos 733 y 734, lo que provoca la liberación del fragmento C5a (aminoácidos 660 a 733). La parte restante de C5 madura es el fragmento C5b, que contiene los residuos 734 a 1658 de la cadena alfa unida por disulfuro a la cadena beta. In vivo, C5a se metaboliza rápidamente por una enzima sérica, carboxipeptidasa B, en una forma de 73 aminoácidos denominada "C5a desArg", que ha perdido el residuo arginina carboxiterminal.

Anticuerpo anti-C5a

Los anticuerpos anti-C5a (o dominios V^h/V^l derivados de los mismos) adecuados para su uso en los métodos divulgados en este documento pueden generarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, pueden usarse anticuerpos anti-C5a reconocidos en la técnica. También pueden usarse anticuerpos que compiten con cualquiera de estos anticuerpos reconocidos en la técnica por la unión a C5a.

Un anticuerpo anti-C5a ejemplar es BNJ383 (también conocido como "ALXN1007") que comprende las cadenas pesada y ligera que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 10 y 2, respectivamente, o fragmentos de unión a antígeno del mismo. BNJ383 se describe en la publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2011/137395 (por ejemplo, tabla 2) y la patente de Estados Unidos n.°: 9.011.852. BNJ383 es un anticuerpo monoclonal humanizado recombinante que se une al componente C5a del complemento y su metabolito C5a desArg. Los datos no clínicos in vitro e in vivo y los datos de estudios clínicos en fase 1 en curso han demostrado que BNJ383 se tolera bien, es muy específico por su epítopo, es un potente antagonista de la señalización mediada por C5a y reduce C5a/C5a desArg de la circulación.

En otras realizaciones, el anticuerpo comprende las CDR o regiones variables de la cadena pesada y ligera de BNJ383. En una realización, el anticuerpo comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VH de BNJ383 que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 12, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región VL de BNJ383 que tienen la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 4. En otra realización, el anticuerpo comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que tienen las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 13, 14 y 15, respectivamente, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que tienen las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente. En otra realización, el anticuerpo comprende una región VH que tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 12. En otra realización, el anticuerpo comprende una región VL que tiene las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 4. En otra realización, el anticuerpo comprende regiones VH y VL que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 4, respectivamente.

Los límites exactos de las CDR se han definido de manera diferente de acuerdo con diferentes métodos. En algunas realizaciones, las posiciones de las CDR o las regiones flanqueantes dentro de un dominio variable de la cadena ligera o pesada pueden ser como se define por Kabat et al. [(1991) "Sequences of Proteins of Immunological Interest." Publicación NIH n.° 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda, MD]. En dichos casos, las CDR pueden denominarse "CDR de Kabat" (por ejemplo, "LCDR2 de Kabat" o "HCDR1 de Kabat"). En algunas realizaciones, las posiciones de las CDR de una región variable de la cadena ligera o pesada pueden ser como se define por Chotia et al. (1989) Nature 342:877-883. Por consiguiente, estas regiones pueden denominarse "CDR de Chotia" (por ejemplo, "LCDR2 de Chotia" o "HCDR3 de Chotia"). En algunas realizaciones, las posiciones de las CDR de las regiones variables de la cadena ligera y pesada pueden ser como se define por la definición combinada de Kabat y Chotia. En dichas realizaciones, estas regiones pueden denominarse "CDR combinadas de Kabat y Chotia". Thomas et al. [(1996) Mol Immunol 33(17/18):1389-1401] ejemplifica la identificación de límites de CDR de acuerdo con las definiciones de Kabat y Chotia.

Los métodos para determinar si un anticuerpo se une a un antígeno proteínico y/o la afinidad de un anticuerpo por un antígeno proteínico son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la unión de un anticuerpo a un antígeno proteínico puede detectarse y/o cuantificarse usando una diversidad de técnicas tales como, aunque sin limitación, inmunoelectrotransferencia, transferencia puntual, método de resonancia de plasmones superficiales (SPR) (por ejemplo, sistema BIAcore; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.) o ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA). Véase, por ejemplo, Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering: Methods and Protocols," Humana Press (ISBN: 1588290921); Johne et al. (1993) J Immunol Meth 160:191-198; Jonsson et al. (1993) Ann Biol Clin 51:19-26; y Jonsson et al. (1991) Biotechniques 11:620-627.

En una realización, el anticuerpo anti-C5a, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a una proteína C5a de mamífero (por ejemplo, humana). Por ejemplo, el anticuerpo anti-C5a, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede unirse a una proteína C5a humana que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: TLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCI KAFTECCVVASQLRANISHKDMQLGR (SEQ ID NO:17). En otra realización, el anticuerpo anti-C5a, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a una proteína C5a humana desarginada que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

TLQKKIEEIAAKYKHSVVKKCCYDGACVNNDETCEQRAARISLGPRCIKAFTECCVVASQLRANISHKDM QLG (SEQ ID NO:18). Un anticuerpo anti-C5a, o fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito en este documento, puede unirse tanto a C5a humana de longitud completa como a C5a humana desarginada.

En una realización, el anticuerpo anti-C5a, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a C5a humana libre (hC5a; por ejemplo, una proteína C5a humana que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:17). En otra realización, el anticuerpo anti-C5a, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a una forma desarginada de C5a libre, por ejemplo, la forma desarginada de C5a humana que comprende, o que consiste en, la secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID NO:18. El anticuerpo puede unirse a un neoepítopo de C5a libre, que es un epítopo que no está presente en C5 sin escindir o está presente en solamente una fracción escasa de C5 sin escindir total.

En una realización, el anticuerpo compite por la unión con, y/o se une al mismo epítopo en C5a que, los anticuerpos descritos en este documento. La expresión "se une al mismo epítopo" con referencia a dos o más anticuerpos significa que los anticuerpos se unen al mismo segmento de residuos aminoacídicos, como se determina por un método dado. Las técnicas para determinar si los anticuerpos se unen al "mismo epítopo en C5a" con los anticuerpos descritos en este documento incluyen, por ejemplo, métodos de cartografiado de epítopos, tales como análisis por rayos x de cristales de complejos de antígeno:anticuerpo que proporciona resolución atómica del epítopo y espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS). Otros métodos supervisan la unión del anticuerpo a fragmentos antigénicos peptídicos o variaciones mutadas del antígeno donde la pérdida de unión debida a una modificación de un residuo aminoacídico dentro de la secuencia antigénica a menudo se considera una indicación de un componente epitópico. Además, también pueden usarse métodos combinatorios informáticos para el cartografiado de epítopos. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés de aislar por afinidad péptidos cortos específicos de colecciones combinatorias de péptidos de presentación en fagos. Se espera que anticuerpos que tengan la misma VH y VL o las mismas secuencias CDR1,2 y 3 se unan al mismo epítopo.

Los anticuerpos que "compiten con otro anticuerpo por la unión a una diana" se refieren a anticuerpos que inhiben (parcial o completamente) la unión del otro anticuerpo a la diana. Que dos anticuerpos compitan entre sí por la unión a una diana, es decir, que un anticuerpo inhiba y en qué grado la unión del otro anticuerpo a una diana, puede determinarse usando experimentos conocidos de competición. En determinadas realizaciones, un anticuerpo compite con, e inhibe la unión de otro anticuerpo a una diana en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 %. El nivel de inhibición o competición puede ser diferente dependiendo del anticuerpo que sea el "anticuerpo bloqueante" (es decir, el anticuerpo frío que se incuba en primer lugar con la diana). Los anticuerpos competidores se unen al mismo epítopo, un epítopo solapante o a epítopos adyacentes (por ejemplo, como se evidencia por impedimento estérico).

Los anticuerpos anti-C5a, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos en este documento, usados en los métodos descritos en este documento pueden generarse usando una diversidad de técnicas reconocidas en la técnica.

Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales por diversas técnicas familiares para los expertos en la materia. En resumen, se inmortalizan esplenocitos de un animal inmunizado con un antígeno deseado, normalmente por fusión con una célula de mieloma (véase, Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976)). Métodos alternativos de inmortalización incluyen transformación con virus de Epstein Barr, oncogenes o retrovirus, u otros métodos bien conocidos en la técnica. Las colonias que surgen de células inmortalizadas individuales se criban para la producción de anticuerpos de la especificidad y afinidad deseadas por el antígeno, y el rendimiento de los anticuerpos monoclonal producidos por dichas células puede potenciarse mediante diversas técnicas, incluyendo inyección en la cavidad peritoneal de un hospedador vertebrado. Como alternativa, se pueden aislar secuencias de ADN que codifican un anticuerpo monoclonal o un fragmento de unión del mismo cribando una colección de ADN de linfocitos B humanos de acuerdo con el protocolo general resumido por Huse, etal., Science 246: 1275-1281 (1989).

Un anticuerpo anti-C5a puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimerizado, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo monocatenario, un anticuerpo biespecífico, etc. Un anticuerpo anti-C5a puede ser una proteína de fusión. La proteína de fusión puede construirse de forma recombinante de modo que la proteína de fusión se exprese a partir de un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión. La proteína de fusión puede comprender uno o más segmentos polipeptídicos de unión a C5a.

En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-C5 se fusionan a un resto de dirección. Por ejemplo, una construcción puede contener un polipéptido de unión a C5 y un resto de dirección que dirige el polipéptido a un sitio de activación del complemento. Dichos restos de dirección pueden incluir, por ejemplo, la forma soluble del receptor 1 del complemento (CR1), una forma soluble del receptor 2 del complemento (CR2) o un anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) que se une a C3b y/o C3d.

Los métodos para generar proteínas de fusión (por ejemplo, proteínas de fusión que contienen un polipéptido de unión a C5a y una forma soluble de CR1 humano o CR2 humano), incluyendo tecnología de ADN recombinante, son conocidos en la técnica y se describen en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6.897.290; la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2005265995; y Song et al. (2003) J Clin Invest 11 (12):1875-1885.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-C5a es un anticuerpo biespecífico. Los métodos para producir un anticuerpo biespecífico (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-C5a y un anticuerpo que se une a C3b y/o C3d) también son conocidos en la técnica. Se contempla un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo de unión a C5 y cualquier otro anticuerpo.

Se conoce en la técnica una amplia diversidad de formatos de anticuerpo biespecífico de manipulación de anticuerpos y los métodos para generar los anticuerpos biespecíficos (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico que comprende un anticuerpo anti-C5a [es decir, un anticuerpo de unión a C5a] y un anticuerpo que se une a C3b, C3d, o un antígeno específico de tejido) pertenecen al ámbito de los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Suresh et al. (1986) Methods in Enzymology 121:210; publicación PCT n.° WO 96/27011.

Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos reticulados o heteroconjugados. Los anticuerpos heteroconjugados pueden generarse usando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, y se divulgan en la patente de Estados Unidos n.° 4.676.980, junto con varias técnicas de reticulación. La patente de Estados Unidos n.° 5.534.254 describe varios tipos diferentes de anticuerpos biespecíficos incluyendo, por ejemplo, fragmentos Fv monocatenarios ligados juntos mediante acopladores peptídicos, agentes quelantes o acoplamientos químicos o disulfuro. En otro ejemplo, Segal y Bast [(1995) Curr Protocols Immunol Suppl. 14:2.13.1-2.13.16] describe métodos para reticular químicamente dos anticuerpos monoespecíficos para formar, por tanto, un anticuerpo biespecífico. Un anticuerpo biespecífico puede formarse, por ejemplo, conjugando dos anticuerpos monocatenarios que se seleccionan de, por ejemplo, un anticuerpo de unión a C5 y un anticuerpo que se une a, por ejemplo, C3b, C3d o un antígeno específico de pulmón, un antígeno específico de ojo, un antígeno específico de riñón, etc.

El anticuerpo biespecífico puede ser un fragmento Fv monocatenario (sc) en tándem, que contiene dos fragmentos scFv diferentes fijados covalentemente juntos mediante un conector (por ejemplo, un conector polipeptídico). Véase, por ejemplo, Ren-Heidenreich et al. (2004) Cancer 100:1095-1103 y Korn etal. (2004) J Gene Med 6:642-651.

Un anticuerpo biespecífico también puede ser un diacuerpo. La tecnología de diacuerpo descrita por, por ejemplo, Hollinger et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:6444-6448 ha proporcionado un mecanismo alternativo para generar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de la cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de la cadena ligera (VL) mediante un conector que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se obligan a emparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de ese modo dos sitios de unión a antígeno. Véase también Zhu et al. (1996) Biotechnology 14:192-196 y Helfrich et al. (1998) Int J Cancer 76:232-239. Los diacuerpos monocatenarios biespecíficos (''scDb''), así como los métodos para generar scDb se describen en, por ejemplo, Brüsselbach et al. (1999) Tumor Targeting 4:115-123; Kipriyanov et al. (1999) J Mol Biol 293:41 -56; y Nettlebeck et al. (2001) Mol Ther 3:882-891.

También pueden usarse formas variantes de anticuerpos biespecíficos tales como las moléculas de inmunoglobulina tetravalentes de dominio variable doble (DVD-Ig) descritas en Wu et al. (2007) Nat Biotechnol 25(11):1290-1297 en los métodos de esta invención. Las moléculas DVD-Ig se diseñan de modo que dos dominios variables de la cadena ligera (VL) diferentes de dos anticuerpos originales diferentes se liguen en tándem directamente o mediante un conector corto por técnicas de ADN recombinante, seguido del dominio constante de la cadena ligera. Los métodos para generar moléculas DVD-Ig a partir d dos anticuerpos originales se describen adicionalmente en, por ejemplo, las publicaciones PCT n.° WO 08/024188 y WO 07/024715. También se abarca el formato biespecífico descrito en, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 20070004909. Otro formato biespecífico que puede usarse es la región V doble cruzada (CODV-Ig) que es un formato para manipular moléculas similares a anticuerpo de cuatro dominios descritas en el documento WO2012/135345. Se demostró que CODV-Ig es útil en manipulación de moléculas similares a anticuerpo biespecífico donde el impedimento estérico en los dominios V C terminales (internos) puede evitar la construcción de una DVD-Ig.

Los anticuerpos de unión a C5a y/o restos de dirección que se usan para formar las moléculas de anticuerpo biespecífico pueden ser, por ejemplo, quiméricos, humanizados, rehumanizados, desinmunizados o completamente humanos, de los que todos ellos son bien conocidos en la técnica.

Un anticuerpo anti-C5a puede producirse por técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, puede insertarse un ácido nucleico que codifica un polipéptido de unión a C5a en un vector de expresión que contiene secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales, que incluyen, por ejemplo, secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma, secuencias de inicio y parada transcripcional, secuencias de inicio y parada traduccional, señales terminadoras de la transcripción, señales de poliadenilación y secuencias potenciadoras o activadoras. Las secuencias reguladoras incluyen un promotor y secuencias de inicio y parada transcripcional. Además, el vector de expresión puede incluir más de un sistema de replicación de modo que pueda mantenerse en dos organismos diferentes, por ejemplo, en células de mamífero o insecto para su expresión y en una hospedadora procariota para clonación y amplificación.

Están disponibles varios sistemas de vector posibles (tales como sistemas de vector plasmídico) bien conocidos en la técnica para la expresión de un anticuerpo anti-C5 a partir de ácidos nucleicos en varias células, incluyendo en células de mamífero.

Los vectores de expresión pueden introducirse por métodos bien conocidos en la técnica en células de una manera adecuada para expresión posterior del ácido nucleico.

Un anticuerpo anti-C5a puede expresarse en cualquier célula hospedadora apropiada. Las células hospedadoras apropiadas incluyen, por ejemplo, células de levadura, bacteria, insecto, planta y mamífero, incluyendo bacterias tales como E. coli, hongos tales como Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, células de insecto tales como SF9, líneas celulares de mamífero (por ejemplo, líneas celulares humanas), líneas celulares primarias (por ejemplo, células de mamífero primarias), células de ovario de hámster chino ("CHO") y una línea celular de mieloma adecuada tal como NSO.

En algunas realizaciones, un anticuerpo anti-C5a puede expresarse en, y purificarse de, animales transgénicos (por ejemplo, mamíferos transgénicos). Por ejemplo, un anticuerpo anti-C5a puede producirse en mamíferos no humanos transgénicos (por ejemplo, roedores, ovejas y cabras) y aislarse de la leche como se describe en, por ejemplo, Houdebine (2002) Curr Opin Biotechnol 13(6):625-629; van Kuik-Romeijn et al. (2000) Transgenic Res 9(2):155-159; y Pollock et al. (1999) J Immunol Methods 231 (1-2):147-157.

El anticuerpo anti-C5a puede producirse a partir de células cultivando una célula hospedadora transformada con el vector de expresión que contiene ácido nucleico que codifica los polipéptidos, en condiciones y durante una cantidad de tiempo suficientes para permitir la expresión de las proteínas. Dichas condiciones para la expresión de proteínas variarán con la elección del vector de expresión y la célula hospedadora, y las averiguarán fácilmente los expertos en la materia a través de experimentación rutinaria. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning--A Laboratory Manual --3A Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001), que tiene una divulgación exhaustiva de la tecnología de ADN recombinante.

Después de la expresión, el anticuerpo anti-C5a puede aislarse o purificarse de una diversidad de maneras conocidas por los expertos en la materia.

Un anticuerpo anti-C5a puede usarse como agente terapéutico y se administra a un paciente que lo necesita como cualquier formulación/composición adecuada y por cualquier vía adecuada (tal como por inyección IV). Un anticuerpo anti-C5a también puede usarse como anticuerpos de captura o anticuerpo de detección en métodos divulgados en este documento.

Modelado en ensayo ELSIA de retrodisociación

Cuando se cuantifican biomarcadores de diana/eficacia, los ensayos de unión a ligando basados en placa tradicionales tienen el potencial de sobreestimar el analito libre. La sobreestimación del analito libre en dichas situaciones sugiere una menor ausencia de eficacia que la que existe realmente in vivo. Eculizumab es un mAb terapéutico aprobado para 2 indicaciones de enfermedad muy infrecuentes, y aborda el factor C5 del complemento (190 kDa). La cuantificación apropiada de C5 libre en presencia de fármaco es crucial.

La evidencia experimental muestra que la unión del antígeno a la placa de ELSIA requiere al menos 30 horas para la solución y la placa lleguen a equilibrio.

Los parámetros cruciales son tiempo de incubación, tiempo d dilución, temperatura de dilución e intervalo de muestra frente a ensayo. Un tiempo de incubación en placa más corto puede disminuir la disociación. Enfriamiento durante dos etapas de dilución puede ralentizar la velocidad de disociación kd y evitar que el antígeno-mAb y antígeno-mAbantígeno se disocien. Un tiempo de dilución más corto puede disminuir la disociación. Menos dilución puede disminuir la disociación. Se miden las muestras netas si es posible.

El desacoplamiento de datos de concentración de antígeno y concentración de mAb (PK) se debe a: Diferentes diluciones y tiempos de ensayo; la concentración de antígeno medida está sobreestimando el antígeno libre; y el mAb medido (PK) está sobreestimando el mAb libre real debido a disociación de la dilución e infraestimando el mAb total debido a antígeno en solución.

El modelado de hemólisis (usando ensayo hemolítico de muestras de suero humano que contienen C5) sugiere que los datos de antígeno, PK y hemólisis (PD) se desacoplan debido a: Diferentes diluciones y tiempos de ensayo; la concentración de antígeno medida está sobreestimando el antígeno libre en ensayo de hemólisis; el mAb medido -eculzumab --(PK) está sobreestimando el mAb libre real debido a disociación de la dilución e infraestimando el mAb total debido a antígeno en solución; y la hemólisis medida está sobreestimando el antígeno libre real debido a disociación de la dilución.

Ecuación de equilibrio

kon

mAb L = mAb * L

koff

Kd = constante de disociación, Ka = constante de asociación

Koff = velocidad de disociación, kon = velocidad de asociación

Después de la dosificación, se supuso que la unión de mAb a L (ligando) soluble in vivo seguía la ley de acción de masas. Las condiciones ex vivo tales como recogida de muestras, almacenamiento, etc. pueden desplazar el equilibrio a condiciones diferentes de la de in vivo.

Los valores de koff a menudo son fuertemente sensibles a la temperatura y el tampón. El tiempo de equilibrado aumenta en aproximadamente 30 veces a 0 °C en comparación con 30 °C. La constante de velocidad de disociación siembre debe determinarse en las condiciones de ensayo.

Mediciones de Liibre

Usadas cada vez más en el desarrollo de fármacos para guiar las decisiones; útiles en la selección de dosis y pauta. La comprensión de la cinética de L puede ayudar a definir los niveles eficaces de mAblibre.

Determinados métodos de realización de cuantificación de C5a libre

Cuando se cuantifican biomarcadores de diana/eficacia, los ensayos de unión a ligando basados en placa tradicionales tienen el potencial de sobreestimar el analito libre. La sobreestimación del analito libre en dichas situaciones sugiere una menor ausencia de eficacia que la que existe realmente in vivo. ALXN1007 es un mAb terapéutico que se está sometiendo a ensayos clínicos para tratar a pacientes humanos que padecen enfermedad de injerto contra hospedador y se dirige al factor C5a del complemento. La cuantificación apropiada de C5a libre en presencia de fármaco es crucial.

No hay anticuerpo conocido que se una específicamente a C5a y no se une específicamente a C5. Por tanto, C5 se retira primero de una muestra antes de capturar y detectar C5a libre en el sistema Gyros. C5 puede retirarse incubando la muestra con anticuerpo específico de C5 unido a microesferas magnéticas y retirando C5 al capturar las microesferas magnéticas con anticuerpo específico de C5 unido y C5 con un imán, produciendo sobrenadante que comprende C5a.

El sistema Gyros (Gyros AB, Uppsala, Suecia; www.gyros.com) se usa en los métodos divulgados en este documento. Como un ensayo Gyros pasa muestras a lo largo de las microestructuras en cuestión de segundos, puede no haber oportunidad de que se produzca retrodisociación. El sistema Gyros usa un formato de flujo directo de afinidad y elimina las incubaciones y acorta los tiempos de procesamiento. La plataforma Gyros usa la tecnología CD patentada de Gyros diseñada con microfluidos de nanolitros altamente reproducibles integrados con plataformas Gyrolab, que automatizan los inmunoensayos con procesamiento paralelo usando detección de fluorescencia inducida por láser. Esto es posible a través de control preciso y automatizado de las fuerzas centrífuga y capilar que conducen el flujo de líquido a través de estructuras de microfluidos a escala de nanolitros contenidas dentro del CD.

Se usa disco compacto (CD) circular Bioaffy. Pueden usarse placas de PCR para las muestras y los reactivos. Pueden usarse muchas placas de PCR disponibles. Las placas se sellan con lámina para evitar la evaporación. El reactivo de captura (tal como un anticuerpo biotinilado anti-C5a) entra en el CD por acción capilar. Interrupciones hidrófobas detienen el flujo de líquido. El CD se somete a fuerza centrífuga dentro de un instrumento especializado para el ensayo, tal como un Gyrolab xPlore o Gyrolab XP. La fuerza centrífuga dirige los reactivos a las columnas dentro del CD. El reactivo de captura se une a partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas. La muestra entonces entra en el CD por acción capilar y se aplica la muestra a las columnas activadas. El reactivo de detección (por ejemplo, anticuerpo marcado con AlexaFluor anti-C5a; uno que se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-C5a usado como reactivo de captura) entonces entra por acción capilar y se aplica a las columnas. Las columnas entonces se exploran por láser (112 columnas en 90 segundos). Puede usarse Rexxip A para los patrones, QC, muestras y Rexxip F para Ab de detección. Entonces se usa la fluorescencia inducida por láser para medir la concentración o cantidad de la muestra (por ejemplo, C5a).

El ensayo Gyros usa muy poco volumen de muestra (tal como 4 pl) y tarda muy poco tiempo (tal como 1,5 horas). Tiene un intervalo de calibrado de 0,78 pM - 300 pM.

Esta divulgación proporciona un método de cuantificación de la proteína del complemento C5a humana (C5a) libre (sin unirse) de una muestra, que comprende:

a. retirar C5 humana de la muestra; en el que la muestra se incuba con anticuerpos biotinilado específico de C5 acoplado a microesferas magnéticas y en el que las microesferas magnéticas acopladas a anticuerpo biotinilado específico de C5 unido a C5 humana se capturan con un imán;

b. unir anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a se añade mediante acción capilar a un Gyros Bioaffy 200 CD que comprende columnas con las partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro de un Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

c. capturar la C5a libre (sin unir) en la muestra en el anticuerpo de captura; en el que la muestra, después de la etapa a. se añade al CD mediante acción capilar; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, la muestra después de la etapa a. al anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a unido en las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

d. detectar la C5a libre capturada; en el que un anticuerpo de detección marcado con AlexaFluor anti-C5a se añade al CD mediante acción capilar, en el que dicho anticuerpo de detección anti-C5a se une a C5a en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo de captura; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de detección a la C5a libre unida al anticuerpo de captura unido en las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; y

e. cuantificar la C5a libre capturada usando detección de fluorescencia inducida por láser.

C5a en una muestra, tal como una muestra de suero de un paciente tratado con ALXN1007, puede estar libre (sin unir) o puede estar unido a ALXN1007.

Puede usarse cualquier instrumento adecuado para el uso de un ensayo Gyro, tal como Gyrolab xPlore o Gyrolab XP. En determinadas realizaciones, el método comprende además calcular la concentración o cantidad de anticuerpos contra C5a libre comparando el valor obtenido de la etapa e. con una curva patrón preparada a partir de cantidades conocidas de C5a añadidas a una muestra reducida de C5a. La muestra con los controles se procesa de la misma manera que la muestra del paciente. En determinadas realizaciones, el método comprende además calcular la concentración de anticuerpo contra C5a libre con el programa informático Gyros Evaluator, u otro programa informático adecuado.

En determinadas realizaciones, la muestra se obtiene de un paciente humano. En otras determinadas realizaciones, la muestra es una muestra de suero. En otras realizaciones más, la muestra es de un paciente que se está sometiendo a tratamiento con un anticuerpo anti-C5a, tal como ALXN1007. En determinadas realizaciones, la muestra se toma antes del tratamiento con ALXN1007. En otras realizaciones, la muestra se toma después del tratamiento con ALXN1007. La muestra puede ser cualquier muestra adecuada que pueda contener C5a y puede ser suero, plasma, sangre, orina, muestra sólida, etc. Las muestras pueden obtenerse y prepararse para su uso de acuerdo con métodos conocidos en la técnica.

En determinadas realizaciones, las microesferas magnéticas son microesferas magnéticas Dynabead. Puede usarse cualquier microesfera magnética adecuada e imanes.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo específico de C5 es N19/8 biotinilado. Puede usarse cualquier anticuerpo específico de C5 adecuado.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo de captura biotinilado es ALXN1007. El anticuerpo de captura biotinilado puede ser cualquier anticuerpo anti-C5a.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo de detección anti-C5a es el clon 2942. El anticuerpo de detección anti-C5a puede ser cualquier anticuerpo anti-C5a. El anticuerpo de detección anti-C5a en cualquier ensayo dado es uno que reconoce un epítopo diferente en C5a en comparación con el anticuerpo de captura usado en ese ensayo; y, por tanto, no compite por la unión a C5a con el anticuerpo de captura.

En determinadas realizaciones, se usa tampón Rexxip AN o tampón de 1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20 para diluir las muestras y se usa tampón Rexxip F para diluir el anticuerpo de detección. Puede usarse cualquier tampón adecuado, incluyendo ligeras variaciones en el tampón Rexxip AN, tampón de 1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20 o tampón Rexxip F.

En determinadas realizaciones, el instrumento Gyros se ceba dos veces distintas con lavado 1 Bioaffy 1 y tampón de pH 11. Puede usarse cualquier tampón adecuado y puede saltarse el cebado y puede hacerse cualquier número de veces adecuado.

Los métodos de conjugación de un anticuerpo con biotina o AlexaFluor son conocidos en la técnica.

Utilidad ejemplar

Los métodos divulgados en este documento pueden usarse con cualquier fin que requiera cuantificar la concentración o cantidad de C5a libre (sin unir) en una muestra. Los métodos, por ejemplo, pueden usarse para detectar la concentración o cantidad de C5a libre (sin unir) en una muestra de suero humano de un paciente que se está tratando mediante tratamiento con ALXN1007. La concentración o cantidad de C5a libre (sin unir) en dicha muestra permitiría supervisar la patología del paciente. Este ensayo tiene la ventaja en dicho ejemplo de cuantificar C5a libre (sin unir) y no las moléculas C5a unidas a eculizumab usadas como tratamiento. ALXN1007 se está sometiendo a ensayos clínicos para tratar a pacientes humanos que padecen la enfermedad de injerto contra hospedador.

La cuantificación apropiada de C5a libre es esencial por varias razones, tales como supervisión de la patología, modelado, selección de la dosificación y especificaciones del producto.

Ejemplos

Para comprender mejor esta invención, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son con fines de ilustración únicamente y no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención de ninguna manera. Ejemplo 1. Un ensayo Gyros para la cuantificación de C5a libre en plasma humano

La proteína del complemento C5a es un componente importante de la reacción en cadena alternativa del complemento, y una diana del fármaco de Alexion ALXN1007. La cuantificación apropiada de esta diana es esencial tanto para modelado como para especificaciones del producto. ALXN1007 tiene afinidad 60 pM por C5a, pero también tiene afinidad 5 nM por C5. La afinidad por C5 se basa en la disponibilidad del neoepítopo cuando la C5 convertasa escinde C5 en C5a y C5b, y es una función del tiempo. Esta afinidad de bajo nivel por C5 puede tener un efecto aditivo sobre la cuantificación de C5a en bioensayos porque, al igual que ALXN1007, no hay anticuerpos secundarios que sean específicos solamente para C5a; se unen a C5 a una menor afinidad también. Si C5 se une por ALXN1007 cuando el fármaco se usa como anticuerpo de captura en un formato de ensayo de unión a ligando, una proporción de la proteína se reconocerá y unirá por un anticuerpo anti-C5a, dando lugar, por tanto, a sobreestimación de lo que es verdaderamente C5a.

La tecnología Gyrolab se basa en lavados de ensayo, reactivos y rotación de las muestras por las microestructuras en un disco a intervalos prescritos. El tiempo requerido para que una muestra rote por una microestructura inmovilizada con reactivo de captura se aproximadamente seis segundos, de modo que teóricamente debe haber muy poca oportunidad de unión de baja afinidad de C5 cuando ALXN1007 es el reactivo de captura. Además, para reducir más la posibilidad de que C5 se una y tenga un efecto aditivo en el ensayo, se pretratan muestras de plasma humano con microesferas magnéticas a las que se une un anticuerpo específico de C5, retirando, por lo tanto, mucho de la C5 antes de cargarla en la placa de ensayo y disco. El tampón de microesferas es de alto contenido en sal y detergente, lo que disminuye la unión de baja afinidad.

Materiales y métodos

Materiales:

Discos Bioaffy 1000, tampón Rexxip AN, tampón Rexxip F, tampón de pH 11, lámina de placa (Gyros US, Inc., Warren NJ)

C5a humana purificada (CompTech, Tyler TX)

ALXN1007 biotinilado, anticuerpo N19/8 biotinilado (Alexion Pharmaceuticals, New Haven CT)

Clon 2942 marcado con AlexaFluor (Hycult Biotech, Plymouth Meeting, PA)

Placas de PCR de 96 pocillos, lavado 1 Bioaffy (PBS con un 0,1 % de Tween 20, un 0,02 % de azida sódica (ingredientes de lavado)), Dynabeads MyOne estreptavidina C, 1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20 (ingredientes de tampón) (ThermoFisher, Waltham MA)

Equipo:

Instrumento de Gyros xPlore o XP Workstation (Gyros US, Inc., Warren NJ)

Método:

El instrumento Gyros se ceba dos veces distintas con lavado 1 Bioaffy y tampón de pH 11, cada tampón con su propio puesto. Durante estos ciclos de cebado (aproximadamente veinte minutos cada uno), se preparan reactivos de ensayo, lavados y muestras como se describe a continuación. El número de discos Bioaffy 1000 requeridos para el procesamiento (uno para Gyros xPlore, hasta cinco para Gyros XP Workstation) se retira del almacenamiento refrigerado y se deja que lleguen a temperatura ambiente.

Se diluyen muestras de plasma humano desconocidas en Dynabeads acopladas a anticuerpo biotinilado N19/8. La dilución se realiza a una relación de dos partes de microesferas por una parte de plasma. Esta dilución se realiza en una placa de polipropileno de fondo redondo durante una hora a temperatura ambiente con agitación vigorosa.

Después de esta incubación de una hora, la placa se pone en un imán y después de dos minutos las muestras de plasma diluidas se pipetean de los sedimentos de microesferas y se ponen en la placa de PCR en sus posiciones respectivas y en sus volúmenes requeridos. No es necesaria más dilución de las muestras de plasma desconocidas.

La curva patrón del ensayo se prepara a partir de proteína C5a humana purificada que se añade en tampón Rexxip AN a 60 ng/ml y después se diluye en factor 2 como sigue: 60 (adición inicial), 30, 15, 7,5, 3,75, 1,88, 0,938, 0,469, 0,234, 0,117 y 0,058 ng/ml. Las muestras patrón de 0,058 y 60 ng/ml son puntos de anclaje. Una vez formulada en tampón Rexxip AN, la curva se diluye 1:2 en NaCl 1 M/Tween 20 al 0,5 % y se mezcla. Los patrones diluidos se ponen en la placa de PCR en sus posiciones respectivas y en sus volúmenes requeridos.

Las muestras de control de calidad (QC) se formulan de la misma manera que las muestras patrón. C5a humana purificada se añade en tampón Rexxip AN a 25, 5 y 0,5 ng/ml. Estas muestras entonces se diluyen 1:2 en NaCl 1 M/Tween 20 al 0,5 % como se describe para las muestras de curva patrón. Cuando se requiere, las muestras en los límites de detección (45 ng/ml para el límite superior de detección (ULOQ) y 0,120 ng/ml para el límite inferior de detección (LLOQ)) se formula de la misma manera. Los QC diluidos se ponen en la placa de PCR en sus posiciones respectivas y en sus volúmenes requeridos.

El reactivo de captura biotinilado (ALXN1007) se formula a una concentración de trabajo de 100 pg/ml en lavado 1 Bioaffy, y el clon 2942 marcado con AlexaFluor se formula a una concentración de trabajo de 4 pg/ml en Rexxip F. Estos dos reactivos se colocan en sus respectivas ubicaciones predeterminadas en la placa de PCR a sus volúmenes requeridos. El lavado 1 Bioaffy se usa como tampón de ensayo y se carga en las respectivas ubicaciones predeterminadas en la placa de PCR.

La placa de PCR cargada con patrones, QC, cualquier muestra de plasma desconocida, reactivos de ensayo y lavados de ensayo se sella con lámina y después se carga en el instrumento Gyros. El número requerido de discos Bioaffy 1000 también se carga en el instrumento.

Los ensayos se procesan en el sistema Gyros usando el programa informático Gyros Client. Este es un ensayo de tres etapas (captura, analito, detección) por el que el anticuerpo de captura, la muestra y el anticuerpo de detección se añaden a intervalos programados y entre etapas de lavado intermitentes. El tiempo de procesamiento de ensayo es aproximadamente una hora por disco. Los datos se procesan mediante el programa informático Gyros Evaluator, o pueden exportarse para importarlos en un sistema de información de laboratorio (LIMS) tal como Watson. Este ensayo usa un ajuste de curva 5PL con ponderación de respuesta y un ajuste de 1 % de PMT. Debido a las diferencias en la dilución de la curva patrón y las muestras de plasma (1:1 para los patrones, 1:2 para muestras de plasma), se aplica un factor de dilución de 1,5 a cualquier resultado de plasma.

Resultados

El ensayo Gyros para la cuantificación de C5a libre en plasma humano tiene un intervalo dinámico de 0,120 - 45 ng/ml, que se traduce en 0,180 - 67,5 ng/ml en plasma después de corrección del factor de dilución. Los efectos del tratamiento con microesferas para las muestras de plasma se observan de tres maneras: primera, en reducción de C5 disponible a medir en el ensayo Gyros para la cuantificación de C5 libre usando eculizumab como reactivo de captura (como se prescribe en ese método de ensayo); segundo, en la reducción de la unión de C5 por ALXN1007 cuando se usa como anticuerpo de captura en lugar de eculizumab en el mismo formato de ensayo; y tercero, en la cantidad de C5a unida por el ensayo de C5a libre Gyros. Aunque las diferencias entre los dos tampones de microesferas (Rexxip AN o 1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20) son mínimas en términos de medición de C5a libre, hay una diferencia evidente en términos de C5 libre medida. Por esta razón, el tampón de 1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20 es el diluyente de elección para el tratamiento con microesferas de muestras de plasma, y el diluyente de ensayo tanto para el patrón como las muestras QC.

Tabla 1 Efecto del tratamiento de microesferas sobre C5 libre (eculizumab de captura y ALXN1007 de captura) C5a libre usando tampón Rexxip AN buffer o 1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20 como tampón de microesferas

La selectividad de un ensayo de biomarcadores diana es un parámetro de ensayo importante. La tabla 2 muestra los datos para plasma donador añadido con 5 ng/ml de material de referencia de C5a purificado, que tiene un efecto aditivo sobre la medición de los niveles de C5a endógena ya en cada muestra. El ensayo Gyros mide de forma precisa C5a purificada añadida en muestras que contienen el equivalente endógeno en ajustes tanto de 1 % como 5 % PMT para un 80 % del tamaño de muestra pequeño ensayado.

T l 2 l ivi r r li r n l m h m n n ml

El paralelismo es un elemento importante a determinar en un ensayo de biomarcadores, ya que puede ser una determinación del buen ajuste de una curva patrón de matriz sustituta (aquí, tampón Rexxip a N) y su material de referencia purificado (aquí, C5a humana purificada). Pretratando las muestras de matriz con diluciones adicionales antes del tratamiento de microesferas prescrito, el paralelismo puede mostrar diferencias en la respuesta de ensayo entre la curva de sustituto y las muestras desconocidas medidas a partir de la misma. La FIG. 1 muestra los resultados de paralelismo para cinco plasmas donadores. Estos datos sugieren que el ensayo tiene paralelismo, y que la curva de sustituto es apropiada.

Análisis

El ensayo Gyros para la cuantificación de C5a libre en plasma humano tiene un intervalo dinámico de 0,120 - 45 ng/ml, que se traduce en 0,180 - 67,5 ng/ml en plasma después de corrección del factor de dilución.

La selectividad y paralelismo del ensayo muestran que la matriz sustituta y el material de referencia son apropiados para el equivalente endógeno que se está midiendo en plasma humano.

Las datos de las muestras de plasma endógenas procesadas en el ensayo Gyros con y sin tratamiento de microesferas sugieren que el ensayo Gyros reduce la cantidad de unión de C5 de baja afinidad que puede tener un efecto aditivo sobre los resultados. Este tratamiento de microesferas, junto con el tiempo de incubación de la muestra ya muy breve de la tecnología Gyros, produce un ensayo para la cuantificación de C5a libre que es más específico que otros métodos.

Ejemplo 2. Un ensayo Gyros para la cuantificación de C5a libre en plasma humano

ALXN1007 es un mAb humanizado que se dirige a C5a/C5a desArg (10,4 kDa, ruta alternativa). Está programado para un ensayo clínico en fase M/III adaptativo para GVHD (enfermedad de injerto contra hospedador).

Se necesita cuantificación precisa y sensible de biomarcador (C5a humana) para modelado/eficacia apropiados. Las dificultades son que ALXN1007 también se une a C5, aunque unos pocos órdenes de magnitud menos que a C5a (5 nM frente a 60 pM); esta unión de C5 es una función del tiempo y la disponibilidad de neoepítopo. Sin duda no hay anticuerpos que se unan solamente a C5a y no a C5 en algún grado. El efecto aditivo afecta a la sensibilidad del ensayo.

Como el ensayo Gyros típico pasa muestras a lo largo de las microestructuras en cuestión de segundos, puede no haber oportunidad real de que ALXN1007 se una a C5.

La FIG. 2 y la tabla 3 muestran la importancia de los triplicados.

Tabla 3

Parámetros de ensayo Gyros

Ab de captura a 100 pg/ml

Ab de detección a 4 pg/ml

C5a humana purificada como material de referencia

Rexxip AN para formulación de patrones y QC

Discos Bioaffy 1000 ni

Rexxip AN para dilución de patrones, QC, muestras (dilución 2 de muestra)

Rexxip F para Ab de detección

Lavado 1: lavado 1 Bioaffy

Lavado 2: tampón de pH 11

Ensayo de 3 etapas (C-A-D)

PMT 1 %

El formato de ensayo ECL basado en placa actual tiene intervalo dinámico de 0,280 - 40,0 ng/ml

Dilución de muestra 1:4

Intervalo de curva propuesto 0,117 - 60,0 ng/ml

Para reducir más la unión a C5, las moléculas de proteína C5 de la muestra se retiran con Dynabeads unidas a anticuerpo biotinilado anti-C5. El diluyente final de las microesferas acopladas es Rexxip AN. Preincubación de las microesferas acopladas con muestras de matriz para la reducción de C5.

La FIG. 3 muestra el efecto de las microesferas sobre C5a y C5. La FIG. 4 muestra el efecto de las microesferas -Rexxip AN frente a 1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20; no tiene mucho efecto sobre la unión de C5a, pero la unión al fármaco de C5 parece verse afectada.

Parámetros de ensayo de C5a libre actualizados

Ab de captura a 100 pg/ml

Ab de detección a 4 pg/ml

C5a humana purificada como material de referencia

Rexxip AN para formulación de patrones y QC

Discos Bioaffy 1000 nl

1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20 para dilución de patrones y QC (MRD 2)

Dynabeads acopladas (20 pg/ml de Ab) en 1 M de NaCl/0,5 % de Tween 20 para dilución de muestras de matriz, relación 2:1, incubación a temperatura ambiente durante una hora con agitación

Rexxip F para Ab de detección

Lavado 1: lavado 1 Bioaffy

Lavado 2: tampón de pH 11

Ensayo de 3 etapas (C-A-D)

PMT 1 %

Intervalo de curva propuesto 0,117 - 60,0 ng/ml

LLOQ 0,176 en la matriz

La FIG. 5 muestra la selectividad del tratamiento con microesferas temprano de C5a libre y la FIG. 1 muestra el paralelismo de tratamiento con microesferas temprano de C5a libre.

La mayoría de los ensayos que usan fármaco para capturar diana libre tienen el potencial de sobreestimar lo que realmente está libre. Gyros posibilita una cuantificación más precisa de biomarcadores diana debido a incubación de muestra truncada. Por la misma razón, Gyros (en solitario o junto con tratamiento de la muestra) también puede ayudar a reducir la unión no específica o de baja afinidad.

Otras realizaciones

La descripción anterior divulga solamente realizaciones ejemplares de la invención.

Debe apreciarse que, aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior está destinada a ilustrar y no a limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Por tanto, aunque se han ilustrado y descrito solamente determinados rasgos característicos de la invención, se les ocurrirán muchas modificaciones y cambios a los expertos en la materia. Por lo tanto, se debe entender que las reivindicaciones adjuntas están destinadas a cubrir todas estas modificaciones y cambios que están dentro del verdadero espíritu de la invención.

Tabla 4 Resumen de secuencias

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un método de cuantificación de la proteína del complemento C5a humana (C5a) libre (sin unirse) de una muestra, que comprende:

a. retirar C5 humana de la muestra; en el que la muestra se incuba con anticuerpos biotinilado específico de C5 acoplado a microesferas magnéticas y en el que las microesferas magnéticas acopladas a anticuerpo biotinilado específico de C5 unido a C5 humana se capturan con un imán;

b. unir anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a se añade mediante acción capilar a un Gyros Bioaffy 200 CD que comprende columnas con las partículas recubiertas de estrepavidina; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro de un Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

c. capturar la C5a libre (sin unir) en la muestra en el anticuerpo de captura; en el que la muestra después de la etapa a. se añade al CD mediante acción capilar;

en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, la muestra después de la etapa a. al anticuerpo de captura biotinilado anti-C5a unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas;

d. detectar la C5a libre capturada; en el que un anticuerpo de detección marcado con AlexaFluor anti-C5a se añade al CD mediante acción capilar, en el que dicho anticuerpo de detección anti-C5a se une a C5a en un epítopo diferente del epítopo unido por el anticuerpo de captura; en el que dicho CD se somete a fuerza centrífuga dentro del Gyrolab xPlore o un instrumento Gyrolab XP, dirigiendo, por tanto, el anticuerpo de detección a la C5a libre unida al anticuerpo de captura unido a las partículas recubiertas de estrepavidina en las columnas; y

e. cuantificar la C5a libre capturada usando detección de fluorescencia inducida por láser.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (a) usa un tampón de aproximadamente 1 M de NaCl/aproximadamente un 0,5 % de Tween 20.

3. El método de la reivindicación 1 o reivindicación 2, que comprende además calcular la concentración o cantidad de anticuerpos contra C5a libre comparando el valor obtenido de la etapa e. con una curva patrón preparada a partir de cantidades conocidas de C5a añadidas a una muestra reducida de C5a usando el método de la reivindicación 1 o reivindicación 2.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la muestra se obtiene de un paciente humano.

5. El método de la reivindicación 4, en el que dicha muestra es una muestra de suero o una muestra de plasma.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el paciente se ha tratado con un anticuerpo anti-C5a.

7. El método de la reivindicación 6, en el que el paciente se ha tratado con un anticuerpo que comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que tienen las secuencias de SEQ ID No: 13, 14 y 15 y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID No: 5, 6 y 7.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el paciente se ha tratado con un anticuerpo que comprende las cadenas pesada y ligera que tienen las secuencias de SEQ ID No: 10 y 2.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las microesferas magnéticas son microesferas magnéticas Dynabead.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el anticuerpo de captura biotinilado comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada que tienen las secuencias de SEQ ID No: 13, 14 y 15 y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera que tienen las secuencias de SEQ ID No: 5, 6 y 7.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el anticuerpo de captura biotinilado comprende las cadenas pesada y ligera que tienen las secuencias de SEQ ID No: 10 y 2.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además cebar el instrumento Gyros dos veces distintas con PBS con un 0,1 % de Tween 20, un 0,02 % de azida sódica y tampón de pH 11.