ES2884119T3 - Fórmulas liofilizadas para antídoto contra el factor Xa - Google Patents

Abstract

Una composición liofilizada que se puede obtener liofilizando una formulación acuosa, en la que: la formulación acuosa comprende un estabilizador, de 25 mM a 110 mM de arginina, y al menos 15 mg/ml de un polipéptido de dos cadenas que comprende una primera cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, y una segunda cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, en la que el polipéptido no puede ensamblarse en un complejo de protrombinasa; la formulación acuosa tiene un pH de 7,5 a 8; el estabilizador es de 5,5% a 7,5% de sacarosa (p/v); y la relación molar del estabilizador al polipéptido es al menos 100.

Description

DESCRIPCIÓN

Fórmulas liofilizadas para antídoto contra el factor Xa

ANTECEDENTES

Los anticoagulantes satisfacen una necesidad en el mercado en el tratamiento o prevención de trombosis no deseadas en pacientes con tendencia a formar coágulos sanguíneos, tales como, por ejemplo, aquellos pacientes que tienen trastornos de la coagulación, confinados a periodos de inmovilidad o sometidos a cirugías médicas. Sin embargo, una de las principales limitaciones de la terapia anticoagulante es el riesgo de hemorragia asociado con los tratamientos, y las limitaciones en la capacidad de revertir rápidamente la actividad anticoagulante en caso de sobredosis o si se requiere un procedimiento quirúrgico urgente. De este modo, son muy deseables antídotos específicos y eficaces para todas las formas de terapia anticoagulante. El documento US 9.056.106 se refiere a formulaciones de dosis unitarias de antídotos para anticoagulantes dirigidos al factor Xa.

La administración de proteínas biológicamente activas por inyección es generalmente la vía de administración de elección cuando la administración oral no es práctica o se requiere una actividad terapéutica inmediata. Sin embargo, las barreras biológicas, químicas y físicas, tales como el almacenamiento a largo plazo, la osmolalidad, la solubilidad y la estabilidad deficientes, hacen que la administración de agentes biológicamente activos por inyección a los mamíferos sea problemática. La liofilización puede resolver problemas de almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, existen problemas que también ocurren con la liofilización, tales como la escasa solubilidad y estabilidad del liofilizado. Por lo tanto, existe una necesidad de preparaciones inyectables mejoradas de antídotos para anticoagulantes, que sean estables y solubles. La descripción satisface estas y otras necesidades.

SUMARIO

Las reivindicaciones describen una composición liofilizada que se puede obtener liofilizando una formulación acuosa, en la que: la formulación acuosa comprende un estabilizador, de 25 mM a 110 mM de arginina, y al menos 15 mg/ml de un polipéptido de dos cadenas que comprende una primera cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, y una segunda cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, en la que el polipéptido no puede ensamblarse en un complejo de protrombinasa; la formulación acuosa tiene un pH de 7,5 a 8; el estabilizador es de 5,5% a 7,5% de sacarosa (p/v); y la relación molar del estabilizador al polipéptido es al menos 100.

La presente descripción proporciona formulaciones liofilizadas de un derivado de la proteína del factor Xa (fXa), denominado “antídoto r” (SEQ ID NO: 8) o sus variantes (por ejemplo, SEQ ID NO: 9). En comparación con la proteína fXa de tipo salvaje, el antídoto r y sus variantes incluyen modificaciones en el dominio Gla y el sitio activo, retienen la capacidad de fXa para unirse a un inhibidor de fXa pero no pueden ensamblarse en un complejo de protrombinasa. El antídoto r es un polipéptido de dos cadenas (véase SEQ ID NO. 7 en la Tabla 3, que incluye una cadena ligera (SEQ ID NO. 2) y una cadena pesada (SEQ ID NO. 3) conectadas con un solo enlace de disulfuro entre la Cisteína 98 (Cys98) de la cadena ligera y la Cisteína 108 (Cys108) de la cadena pesada.

También, al igual que el fXa de tipo salvaje, el antídoto r sufre modificaciones postraduccionales que dan como resultado la glicosilación en ciertos restos de aminoácidos, por ejemplo Ser56, Ser72, Ser76 y Thr82 de la cadena ligera y Thr249 de la cadena pesada, y un resto modificado, (3R)-3-hidroxiAsp en Asp29 de la cadena ligera. Adicionalmente, además del enlace de disulfuro entre cadenas, existen enlaces de disulfuro intracatenarios formados entre las Cisteínas 16 y 27, 21 y 36, 38 y 47, 55 y 66, 62 y 75, y 77 y 90 de la cadena ligera, y entre las Cisteínas 7 y 12, 27 y 43, 156 y 170, y 181 y 209 de la cadena pesada.

Las proteínas, tales como el antídoto r, pueden agregarse y formar partículas en interfaces hidrófobas cuando se formulan en composiciones adecuadas para la administración. Por tanto, durante los procedimientos de congelación y liofilización, se puede desear mantener las proteínas en una fase amorfa con diversos crioprotectores y lioprotectores. También es deseable desarrollar una formulación amorfa adecuada para altas concentraciones de las proteínas.

Por consiguiente, se proporcionan aquí composiciones liofilizadas de proteínas tales como el antídoto r. También se proporcionan aquí formulaciones acuosas de proteínas, tales como el antídoto r, adecuadas para liofilización. En algunas realizaciones, las composiciones liofilizadas se pueden obtener liofilizando una formulación acuosa como se describe aquí.

Algunas realizaciones proporcionan una composición liofilizada que se puede obtener liofilizando una formulación acuosa, en la que la formulación acuosa comprende un estabilizador, de 25 mM a 110 mM de arginina, y al menos 15 mg/ml de un polipéptido de dos cadenas que comprende una primera cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, y una segunda cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO.

5, en la que el polipéptido no puede ensamblarse en un complejo de protrombinasa; la formulación acuosa tiene un pH de 7,5 a 8; el estabilizador comprende de 5,5% a 7,5% de sacarosa (p/v); y la relación molar de estabilizador al polipéptido es al menos 100.

En algunas realizaciones, una composición liofilizada se puede obtener liofilizando una formulación acuosa, en la que la formulación acuosa comprende alrededor de 45 mM de arginina, alrededor de 6% de sacarosa (p/v), 0% de manitol, y alrededor de 20 mg/ml de un polipéptido de dos cadenas que comprende una primera cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, y una segunda cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, en la que el polipéptido no puede ensamblarse en un complejo de protrombinasa; y la formulación acuosa tiene un pH de alrededor de 7,8.

En algunas realizaciones, una composición liofilizada se puede obtener liofilizando una formulación acuosa, en la que la formulación acuosa comprende alrededor de 100 mM de arginina, alrededor de 6% de sacarosa (p/v), 0% de manitol, y alrededor de 40 mg/ml de un polipéptido de dos cadenas que comprende una primera cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, y una segunda cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, en la que el polipéptido no puede ensamblarse en un complejo de protrombinasa; y la formulación acuosa tiene un pH de alrededor de 7,8.

Otra realización de la presente descripción proporciona una disolución preparada disolviendo la composición liofilizada de la descripción. En algunos aspectos, el disolvente es agua o disolución salina.

Aún otra realización proporciona una composición liofilizada para uso en un método para reducir la hemorragia en un sujeto sometido a terapia anticoagulante con un inhibidor del factor Xa, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de una disolución de la descripción. En algunos aspectos, el inhibidor del factor Xa es apixaban, rivaroxaban o betrixaban.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

I. Definiciones

Todas las designaciones numéricas, por ejemplo pH, temperatura, tiempo, concentración y peso molecular, incluyerndo los intervalos, son aproximaciones que varían (+) o (-) en incrementos de 0,1 o 10%. Debe entenderse, aunque no siempre se indica explícitamente, que todas las designaciones numéricas están precedidas por la expresión “alrededor de”. También debe entenderse, aunque no siempre se indica explícitamente, que los reactivos descritos aquí son meramente ejemplares, y que en la técnica se conocen equivalentes de los mismos.

Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión “un vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye una pluralidad de vehículos farmacéuticamente aceptables, incluyendo mezclas de los mismos.

Como se usa aquí, la expresión “que comprende” pretende significar que las composiciones y métodos incluyen los elementos enumerados, pero no excluyen otros. “Que consiste esencialmente en”, cuando se usa para definir composiciones y métodos, significará excluir otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación para el uso pretendido. De este modo, una composición que consiste esencialmente en los elementos definidos aquí no excluiría trazas de contaminantes del método de aislamiento y purificación y vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como disolución salina amortiguada con fosfato, conservantes, y similares. “Que consiste en” significará excluir más que oligoelementos de otros ingredientes y etapas sustanciales del método para administrar las composiciones de esta descripción. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta descripción.

Los términos “proteína” y “polipéptido” se usan indistintamente y en su sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más subunidades de aminoácidos, análogos de aminoácidos, o peptidomiméticos. Las subunidades pueden estar unidas por enlaces peptídicos. En otra realización, la subunidad puede estar unida por otros enlaces, por ejemplo éster, éter, etc. Una proteína o péptido debe contener al menos dos aminoácidos, y no se impone ninguna limitación al número máximo de aminoácidos que puede comprender una secuencia de proteína o de péptido. Como se usa aquí, el término “aminoácido” se refiere a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, que incluyen glicina y los isómeros ópticos D y L, análogos de aminoácidos, y peptidomiméticos. A continuación se enumeran las abreviaturas de una y tres letras de los aminoácidos naturales.

“Factor Xa” o “fXa” o “proteína fXa” es una serina proteasa en la ruta de coagulación sanguínea, que se produce a partir del factor X inactivo (fX, SEQ ID NO. 1, Tabla 1). La secuencia nucleotídica que codifica el factor X humano (“fX”) se puede encontrar en GenBank con el número de acceso “NM_000504”. Tras la escisión catalítica de los primeros 52 restos de la cadena pesada, fX se activa a fXa. fXa contiene una cadena ligera y una cadena pesada. Los primeros 45 restos de aminoácidos (restos 1 -45 de SEQ ID NO. 1) de la cadena ligera se denominan dominio Gla debido a que contiene 11 restos de ácido D-carboxiglutámico postraduccionalmente modificados (Gla). También contiene una secuencia de apilamiento aromática corta (6 restos de aminoácidos) (restos 40-45 de SEQ ID NO. 1). La digestión con quimotripsina elimina selectivamente los restos 1-44, dando como resultado fXa sin dominio Gla. El dominio catalítico de serina proteasa de fXa se localiza en la cadena pesada C-terminal. La cadena pesada de fXa es altamente homóloga a otras serina proteasas, tales como trombina, tripsina, y proteína C activada.

“fXa nativo” o “fXa de tipo salvaje” se refiere al fXa presente de forma natural en el plasma o aislado en su forma original, sin modificar, que procesa la actividad biológica de protrombina activante, promoviendo por lo tanto la formación de coágulos de sangre. La expresión incluye polipéptidos de origen natural aislados de muestras de tejido, así como fXa producido de forma recombinante. “fXa activo” se refiere a fXa que tiene la actividad procoagulante de protrombina activante. El “fXa activo” puede ser un fXa nativo o un fXa modificado que retiene la actividad procoagulante.

Como se usa aquí, “derivados de fXa” se refiere a proteínas fXa modificadas que no compiten con fXa en el ensamblaje en el complejo de protrombinasa y tienen actividades procoagulantes o catalíticas reducidas o nulas, y sin embargo se unen y/o neutralizan sustancialmente los anticoagulantes, tales como los inhibidores de fXa. La “actividad procoagulante” de una proteína fXa o derivado de fXa, en algunos aspectos, se refiere a la actividad enzimática que porta el polipéptido fXa activo de tipo salvaje. Los ejemplos de derivados de fXa y métodos para obtener estos derivados se proporcionan en las Patentes US n° 8.153.590, 8.455.441, 9.062.298, 8.268.783, y 9.109.046, Publicación de Patente U.S. n° 2015/0376592, y Publicaciones PCT WO2009/042962 y WO2010/056765, y se proporcionan adicionalmente aquí, tales como SEQ ID NO: 7-9 y equivalentes biológicos de los mismos.

La “actividad enzimática” de un polipéptido fXa o derivados del mismo se refiere a la capacidad del polipéptido para catalizar una reacción bioquímica con un sustrato a través de la interacción directa con el sustrato.

SEQ ID NO: 7 contiene 3 mutaciones con respecto al fXa de tipo salvaje. La primera mutación es la eliminación de 6-39 aa en el dominio Gla de fX. La segunda mutación se obtiene reemplazando la secuencia del péptido de activación 143-194 aa por -RKR-. Esto produce un enlazador -RKRRKR-(SEQ ID NO: 6) que conecta la cadena ligera (SEQ ID NO: 2) y la cadena pesada (SEQ ID NO: 3). Tras la secreción, este enlazador se escinde, dando como resultado un polipéptido de dos cadenas, SEQ ID NO: 8 (antídoto r). La tercera mutación es la mutación del resto del sitio activo S379 en un resto Ala. Esta sustitución de aminoácidos está en negrita en SEQ ID NO: 7-9 en las Tablas 2-4.

La expresión “antídoto r” se refiere a un producto de procesamiento de polipéptidos de dos cadenas procesado de SEQ ID NO: 7, después de la escisión del enlazador. Esto está representado por SEQ ID NO: 8. El antídoto r se describe en, por ejemplo, el documento US 8.153.590. El antídoto r incluye una cadena ligera (SEQ ID NO. 2) y una cadena pesada (SEQ ID NO. 3) conectadas con un solo enlace de disulfuro entre la Cisteína 98 (Cys98) de la cadena ligera y la Cisteína 108 (Cys108) de la cadena pesada. Al igual que el fXa de tipo salvaje, en ciertos lotes de producción, el antídoto r sufre modificaciones postraduccionales que dan como resultado la glicosilación en ciertos restos de aminoácidos, por ejemplo Ser56, Ser72, Ser76 y Thr82 de la cadena ligera y Thr249 de la cadena pesada, y un resto modificado, (3R)-3-hidroxiAsp en Asp29 de la cadena ligera. Adicionalmente, además del enlace de disulfuro entre cadenas, puede haber enlaces de disulfuro intracatenarios formados entre las Cisteínas 16 y 27, 21 y 36, 38 y 47, 55 y 66, 62 y 75, y 77 y 90 de la cadena ligera, y entre las Cisteínas 7 y 12, 27 y 43, 156 y 170, y 181 y 209 de la cadena pesada.

Ciertas variantes del antídoto r, tales como las descritas en las Patentes U.S. nos 8.153.590, 8.455.441, 9.062.298, 8.268.783, y 9.109.046, tienen propiedades químicas y actividades biológicas similares a las del antídoto r. Por ejemplo, SEQ ID NO: 9 (Tabla 4) muestra una variante de dos cadenas que incluye los aminoácidos 129-139 de SEQ ^ID nO: ^{1 (es decir, con eliminaciones del dominio Gla (1-45), el dominio EGF1 (46-84), y el dominio EGF2 (85-128))} y los aminoácidos 429-448 de SEQ ID NO: 1 (es decir, con eliminación del beta-péptido), que es más corta que el antídoto r pero conserva sus actividades de antídoto.

Tabla 1. Secuencia Polipeptídica de Factor X Humano Inactivo (SEQ ID NO: 1)

T l 4. E m l v ri n l n í r E ID N :

La presente descripción también proporciona una variedad de equivalentes biológicos de antídoto r (o sus precursores, representados por SEQ ID NO: 7), o alternativamente polipéptidos que tienen cierta identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8 o 9. En un aspecto, tales equivalentes biológicos conservan las características estructurales de SEQ ID NO: 8 o 9, es decir, un sitio activo modificado y un dominio Gla eliminado o modificado, opcionalmente con eliminación o modificación de los dominios EGF1 y/o EGF2. En otro aspecto, tales equivalentes biológicos retienen las características funcionales de SEQ ID NO: 8 o 9, es decir, no compiten con fXa en el ensamblaje en el complejo de protrombinasa y tienen actividades procoagulantes (por ejemplo, enzimáticas o catalíticas) reducidas o nulas.

La expresión “sitio activo” se refiere a la parte de una enzima o anticuerpo en la que ocurre una reacción química. Un “sitio activo modificado” es un sitio activo que se ha modificado estructuralmente para proporcionar al sitio activo una reactividad química o especificidad aumentada o disminuida. Los ejemplos de sitios activos incluyen, pero no se limitan a, el dominio catalítico del factor X humano que comprende los restos de aminoácidos 235-488, y el dominio catalítico del factor Xa humano que comprende los restos de aminoácidos 195-448. Los ejemplos de sitio activo modificado incluyen, pero no se limitan a, el dominio catalítico del factor Xa humano que comprende los restos de aminoácidos 195-448 en SEQ ID NO: 1 con al menos una sustitución de aminoácido en la posición Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414, o Arg424.

Una “composición” pretende significar una combinación de agente activo y otro compuesto o composición, inerte (por ejemplo, un agente detectable o marcador) o activo, tal como un adyuvante.

Se pretende que una “composición farmacéutica” incluya la combinación de un agente activo con un vehículo, inerte o activo, haciendo que la composición sea adecuada para uso diagnóstico o terapéutico in vitro, in vivo o ex vivo.

La expresión “formulación liofilizada” se refiere a una formulación o composición farmacéutica que comprende un polipéptido de interés que se liofiliza.

La expresión material “sustancialmente amorfo” abarca material que no tiene más de alrededor de 10% de cristalinidad; y el material “amorfo” abarca material que no tiene más de alrededor de 2% de cristalinidad.

Como se usa aquí, la expresión “agente de carga” se refiere a un ingrediente que proporciona volumen a la formulación liofilizada. Los ejemplos de agentes de carga incluyen, sin limitación, manitol, trehalosa, lactosa, sacarosa, polivinilpirrolidona, sacarosa, glucosa, glicina, ciclodextrinas, dextrano, PEG sólidos y derivados, y mezclas de los mismos. En una realización, una formulación de la presente descripción incluye opcionalmente un agente de carga.

Como se usa aquí, el término “liofilización” o secado por congelación se refiere a un procedimiento en el que se elimina el agua de un producto después de que se congela y se coloca a vacío, permitiendo que el hielo cambie directamente de sólido a vapor sin pasar por una fase líquida. El procedimiento consiste en tres procedimientos separados, únicos e interdependientes; congelación, secado primario (sublimación), y secado secundario (desorción). Los métodos para liofilizar polipéptidos usados en esta descripción se describen aquí y son bien conocidos en la técnica.

El término “estabilizador” denota un excipiente farmacéutico aceptable, que protege el ingrediente activo (por ejemplo, los polipéptidos derivados de fXa) y/o la formulación de la degradación química y/o física durante la fabricación, almacenamiento y aplicación. El estabilizador puede ser un crioprotector o lioprotector. En algunas realizaciones, el estabilizador es amorfo.

Los “crioprotectores” son conocidos en la técnica, e incluyen, sin limitación, por ejemplo, sacarosa, trehalosa y glicerol. Generalmente se usa un crioprotector que presenta baja toxicidad en sistemas biológicos.

Un “lioprotector” se refiere a una sustancia farmacéuticamente aceptable que estabiliza una proteína durante la liofilización (el procedimiento de congelación rápida y secado a alto vacío). Los ejemplos de lioprotectores incluyen, sin limitación, sacarosa o trehalosa.

Como se usa aquí, el término “tensioactivo” se refiere a una sustancia orgánica farmacéuticamente aceptable que tiene estructuras anfipáticas; a saber, está compuesto por grupos de tendencias de solubilidad opuestas, típicamente una cadena hidrocarbonada soluble en aceite y un grupo iónico soluble en agua. Los tensioactivos se pueden clasificar, dependiendo de la carga del resto tensioactivo, en tensioactivos aniónicos, catiónicos y no iónicos. Los tensioactivos pueden reducir la tensión superficial (o tensión interfacial) entre dos líquidos, o entre un líquido y un sólido. Dichos tensioactivos, por ejemplo, minimizan la agregación de partículas liofilizadas durante la reconstitución del producto. Los tensioactivos se utilizan a menudo como agentes humectantes, emulsionantes, solubilizantes y dispersantes para diversas composiciones farmacéuticas y preparaciones de materiales biológicos. En algunas realizaciones de las formulaciones farmacéuticas descritas aquí, la cantidad de tensioactivo se describe como un porcentaje expresado en porcentaje en peso/volumen (% p/v). Los tensioactivos farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, el grupo de ácidos grasos y alquilsulfonatos, cloruro de benzetanio (por ejemplo, HY AMINE 1622); ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán (Tween), éteres de alquilo de polioxietileno (Brij), éteres de alquilfenilpolioxietileno (Triton-X), copolímero de polioxietileno-polioxipropileno (Poloxamer, Pluronic), o dodecilsulfato de sodio (SDS). Los ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitán incluyen polisorbato 20 (vendido bajo la marca comercial Tween 20™) y polisorbato 80 (vendido bajo la marca comercial Tween 80™). Los copolímeros de polietileno-polipropileno incluyen los vendidos con los nombres Pluronic® F68 o Poloxamer 188™. Los éteres de alquilo de polioxietileno incluyen los vendidos con la marca comercial Brij™. Los éteres de alquilfenolpolioxietileno incluyen los vendidos con el nombre comercial Triton-X. También pueden usarse tensioactivos naturales, tales como ácido taurocólico de sodio, 1-palmitoil-2-Sn-glicero-3-fosfocolina, lecitina, y otros fosfolípidos. Los tensioactivos pueden comprender desde alrededor de 0,001% hasta alrededor de 5% p/v.

Un “componente cristalino” se refiere a una molécula que forma una matriz cristalina en una formulación que incluye un polipéptido, durante un procedimiento de liofilización. Los ejemplos no limitantes de componentes cristalinos incluyen manitol y glicina.

La expresión “agente solubilizante” se refiere a sales, iones, hidratos de carbono, agentes complejantes, polímeros, y otros compuestos que, cuando están presentes en disolución, aumentan la solubilidad de otra molécula (por ejemplo, un ingrediente activo) en la disolución. Los ejemplos no limitantes de agentes solubilizantes incluyen arginina y citrato. En un aspecto, el agente solubilizante es arginina. En un aspecto, el agente solubilizante es citrato.

El término “amortiguador”, como se usa aquí, denota un excipiente farmacéuticamente aceptable, que estabiliza el pH de una preparación farmacéutica. Los amortiguadores adecuados son bien conocidos en la técnica, y se pueden encontrar en la bibliografía. Los amortiguadores farmacéuticamente aceptables comprenden, pero no se limitan a, amortiguadores tris, amortiguadores de arginina, amortiguadores de histidina, amortiguadores de citrato, amortiguadores de succinato, y amortiguadores de fosfato. Independientemente del amortiguador usado, el pH se puede ajustar con un ácido o una base conocida en la técnica, por ejemplo ácido succínico, ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, y ácido cítrico, succinato, citrato, base tris, histidina, histidina HCl, hidróxido de sodio, e hidróxido de potasio. Los amortiguadores adecuados incluyen, sin limitación, amortiguador de histidina, ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES), cacodilato, fosfato, acetato, succinato, y citrato. La concentración del amortiguador puede estar entre alrededor de 4 mM y alrededor de 60 mM, o alternativamente alrededor de 4 mM a alrededor de 40 mM, o alternativamente alrededor de 5 mM a alrededor de 25 mM.

Un “antioxidante” se refiere a una molécula capaz de ralentizar o prevenir la oxidación de otras moléculas. La oxidación es una reacción química que transfiere electrones de una sustancia a un agente oxidante. Las reacciones de oxidación pueden producir radicales libres, que inician reacciones en cadena que desestabilizan la sustancia terapéutica proteica, y finalmente afectan la actividad del producto. Los antioxidantes terminan estas reacciones en cadena al eliminar los intermedios de radicales libres, e inhiben otras reacciones de oxidación al oxidarse ellos mismos. Como resultado, los antioxidantes son a menudo agentes reductores, agentes quelantes, y captadores de oxígeno tales como citrato, EDTA, DPTA, tioles, ácido ascórbico, o polifenoles. Los ejemplos no limitantes de antioxidantes incluyen ácido ascórbico (AA, E300), tiosulfato, metionina, tocoferoles (E306), galato de propilo (PG, E310), butilhidroquinona terciaria (TBHQ), hidroxianisol butilado (BHA, E320), e hidroxitolueno butilado (BHT, E321).

Un “conservante” es una sustancia química natural o sintética que se añade a productos tales como alimentos, sustancias farmacéuticas, pinturas, muestras biológicas, madera, etc., para evitar la descomposición por crecimiento microbiano o por cambios químicos indeseables. Los aditivos conservantes se pueden utilizar solos o junto con otros métodos de conservación. Los conservantes pueden ser conservantes antimicrobianos, que inhiben el crecimiento de bacterias y hongos, o antioxidantes tales como los absorbentes de oxígeno, que inhiben la oxidación de los constituyentes. Los conservantes antimicrobianos comunes incluyen cloruro de benzalconio, ácido benzoico, clorohexidina, glicerina, fenol, sorbato de potasio, timerosal, sulfitos (dióxido de azufre, bisulfito de sodio, hidrogenosulfito de potasio, etc.), y EDTA disódico. Otros conservantes incluyen los usados comúnmente en las proteínas parenterales tales como alcohol bencílico, fenol, m-cresol, clorobutanol, o metilparabeno.

La expresión “agente de tonicidad”, como se usa aquí, denota agentes farmacéuticamente aceptables usados para modular la tonicidad de la formulación. La isotonicidad se refiere generalmente a la presión osmótica con respecto a una disolución, generalmente con respecto a la del suero sanguíneo humano. Una formulación puede ser hipotónica, isotónica, o hipertónica. En un aspecto, la formulación es isotónica. Una formulación isotónica es líquida o líquida reconstituida a partir de una forma sólida, por ejemplo de una forma liofilizada, y denota una disolución que tiene la misma tonicidad que alguna otra disolución con la que se compara, tal como la disolución salina fisiológica y el suero sanguíneo. Los agentes de isotonicidad adecuados incluyen, pero no se limitan a, cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, y cualquier componente del grupo de aminoácidos, azúcares, como se define aquí, así como combinaciones de los mismos.

II. Formulaciones

Como se proporciona, el fXa de tipo salvaje es un polipéptido de dos cadenas. También lo son muchas formas de antídotos contra fXa, incluyendo el antídoto r (SEQ ID NO: 8 y 9), que incluye una cadena ligera (SEQ ID NO. 2 o 4) y una cadena pesada (SEQ ID NO. 3 o 5) conectadas con un único enlace de disulfuro entre Cisteína 98 (Cys98 en SEQ ID NO: 2, o Cys4 en SEQ ID NO: 4) de la cadena ligera y Cisteína 108 (Cys108 en SEQ ID NO: 3 o 5) de la cadena pesada. También como el fXa de tipo salvaje, el antídoto r expresado en las células sufre modificaciones postraduccionales que dan como resultado la glicosilación en ciertos restos de aminoácidos, por ejemplo Ser56, Ser72, Ser76 y Thr82 de la cadena ligera y Thr249 de la cadena pesada, y un resto modificado, (3R)-3-hidroxi Asp en Asp29 de la cadena ligera. Adicionalmente, además del enlace de disulfuro entre cadenas, puede haber uno o más enlaces de disulfuro intracatenarios formados entre las Cisteínas 16 y 27, 21 y 36, 38 y 47, 55 y 66, 62 y 75, y 77 y 90 de la cadena ligera, y entre las Cisteínas 7 y 12, 27 y 43, 156 y 170, y 181 y 209 de la cadena pesada.

Dada la estructura de dos cadenas y las diversas modificaciones postraduccionales de los antídotos contra fXa, el desarrollo de una formulación liofilizada estable que incluya una alta concentración del polipéptido es un gran desafío.

Es deseable desarrollar una formulación amorfa adecuada para altas concentraciones del polipéptido. Con concentraciones más altas de polipéptido, pueden ser necesarias concentraciones más altas de estabilizador amorfo (es decir, crioprotectores y lioprotectores), mientras se mantiene una osmolalidad apropiada para la administración. En sistemas mixtos de componentes amorfos y cristalinos, cantidades más altas del estabilizador amorfo (es decir, crioprotectores y lioprotectores) pueden aumentar la temperatura de transición vítrea (Tg’), mientras que un componente cristalino disminuye la Tg’ en formulaciones que comprenden altas concentraciones de un polipéptido. Como tal, concentraciones más altas de un estabilizador y concentraciones más bajas de un componente cristalino pueden aumentar la Tg’. Las formulaciones con alta Tg’ son deseables, ya que estas formulaciones pueden ser más fáciles de liofilizar, si es necesario.

Por consiguiente, se encontró que, cuando están presentes manitol y sacarosa en las formulaciones de la presente descripción, las formulaciones con una relación de sacarosa a manitol mayor de 1 eran amorfas y exhibían una Tg’. También se encontró que se pueden lograr formulaciones amorfas liofilizadas cuando no está presente un componente cristalino y se incluye un estabilizador amorfo en la formulación. También se contempla que concentraciones crecientes del estabilizador (tal como un agente lioprotector) pueden aumentar la estabilidad del polipéptido.

También se encontró que concentraciones crecientes de un polipéptido como se describe aquí pueden aumentar la Tg’. Se pueden lograr altas concentraciones de un polipéptido a un pH más alto o aumentando la adición de un agente solubilizante, tal como arginina.

Más específicamente, se puede generar una formulación amorfa liofilizada adecuada a partir de formulaciones acuosas como se describe aquí. Una disolución de antídoto r ejemplar incluye alrededor de 100 mM de arginina (90 mM a alrededor de 110 mM), alrededor de 6% de sacarosa, y 0% de manitol (es decir, no incluye manitol). Otro ejemplo de disolución de antídoto r incluye alrededor de 45 mM de arginina (35 mM a alrededor de 55 mM), alrededor de 6% de sacarosa, y 0% de manitol (es decir, no incluye manitol). Además, estas disoluciones incluyen alrededor de 10 mM de tris (alrededor de 5 mM a alrededor de 15 mM), y 0,01%-0,02% (0,001% -0,5%) de polisorbato 80 (PS80) junto con una cantidad deseada de antídoto r (por ejemplo, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml, 50 mg/ml, 55 mg/ml, 60 mg/ml, 65 mg/ml, 70 mg/ml, 75 mg/ml, 80 mg/ml, 85 mg/ml, 90 mg/ml, 95 mg/ml, 100 mg/ml, 110 mg/ml, 115 mg/ml, 120 mg/ml, 125 mg/ml, 130 mg/ml, 135 mg/ml, 140 mg/ml, 145 mg/ml, o 150 mg/ml), y tiene un pH de alrededor de 7,8.

En consecuencia, cuando estas disoluciones se liofilizan, formarán una composición que mantiene el estabilizador (sacarosa) y/o polipéptido en forma amorfa. En algunas realizaciones, las formulaciones descritas aquí exhiben una temperatura de transición vítrea de alrededor de -5°C a alrededor de -50°C, -10°C a alrededor de -45°C, -15°C a alrededor de -40°C, -20°C a alrededor de -30°C, o alrededor de -27°C a alrededor de -37°C.

Los resultados observados con el antídoto r pueden extrapolarse fácilmente a otros antídotos contra fXa que tienen estructuras similares, incluyendo los equivalentes biológicos de antídoto r (o sus precursores, representados por SEQ ID NO: 2). En un aspecto, dichos equivalentes biológicos tienen al menos 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 8 o 9. En un aspecto, dichos equivalentes biológicos incluyen dos cadenas peptídicas, teniendo cada una al menos 80%, 85%, 90% o 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 o 4 o SeQ ID NO: 3 o 5, respectivamente. En un aspecto, tales equivalentes biológicos conservan las características estructurales de SEQ ID NO: 8, es decir, un sitio activo modificado y un dominio Gla eliminado o modificado. En otro aspecto, tales equivalentes biológicos retienen las características funcionales de SEQ ID NO: 8, es decir, no compiten con fXa en el ensamblaje en el complejo de protrombinasa y tienen actividades procoagulantes (por ejemplo, enzimáticas o catalíticas) reducidas o nulas. En un aspecto, tales equivalentes biológicos conservan las características estructurales de SEQ ID NO: 9, es decir, un sitio activo modificado y un Gla eliminado o modificado y uno o ambos dominios EGF1 y EGF2. En otro aspecto, tales equivalentes biológicos retienen las características funcionales de SEQ ID NO: 9, es decir, no compiten con fXa en el ensamblaje en el complejo de protrombinasa y tienen actividades procoagulantes (por ejemplo, enzimáticas o catalíticas) reducidas o nulas.

También, se contempla que la arginina se puede sustituir por otro agente solubilizante, ejemplos adecuados de cada uno de los cuales están disponibles en la técnica y se proporcionan en la presente descripción.

A. Disolución de polipéptidos apta para liofilización

En una realización, la presente descripción proporciona una formulación acuosa adecuada para liofilización, formulación la cual incluye un antídoto contra fXa como se describe aquí o sus equivalentes biológicos, junto con un agente solubilizante y un estabilizador (es decir, crioprotector o lioprotector), en la que la relación molar del estabilizador del antídoto contra fXa es alrededor de 100 o más. La formulación acuosa puede incluir además un tensioactivo y/o un amortiguador. En algunos aspectos, la presencia de cada uno de estos agentes mantiene el antídoto contra fXa en forma amorfa. En algunos aspectos, la presencia de cada uno de estos agentes evita que el antídoto contra fXa colapse durante la liofilización, por ejemplo cuando la temperatura de liofilización es mayor que -30°C, -25°C, -20°C, -15°C, -102C, -5°C, o 0°C.

Una realización de la descripción proporciona una formulación acuosa que puede usarse para liofilización. La formulación acuosa incluye un polipéptido derivado de fXa, por ejemplo un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8 o 9, o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO. 8 o 9. Además del polipéptido, la formulación acuosa incluye además un agente solubilizante y un estabilizador, en la que la relación molar del estabilizador al polipéptido derivado de fXa es alrededor de 100 o más.

En un aspecto, el polipéptido derivado de fXa tiene modificaciones en el dominio Gla y el sitio activo en comparación con la proteína fXa de tipo salvaje. En un aspecto, el polipéptido derivado de fXa retiene la capacidad de fXa para unirse a un inhibidor de fXa, pero no se ensambla en un complejo de protrombinasa. En un aspecto, el polipéptido derivado de fXa es un polipéptido de dos cadenas que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 8, que incluye una cadena ligera (SEQ ID NO. 2) y una cadena pesada (SEQ ID NO. 3) conectadas con un solo enlace de disulfuro entre la Cisteína 98 (Cys98) de la cadena ligera y la Cisteína 108 (Cys108) de la cadena pesada. En un aspecto, el polipéptido derivado de fXa es un polipéptido de dos cadenas que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 9, que incluye una cadena ligera (SEQ ID NO. 4) y una cadena pesada (SEQ ID NO. 5) conectadas con un solo enlace de disulfuro entre la Cisteína 4 (Cys4) de la cadena ligera y la Cisteína 108 (Cys108) de la cadena pesada. En un aspecto, la formulación acuosa incluye al menos 15 mg/ml del polipéptido. En un aspecto, la formulación acuosa incluye al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, o 150 mg/ml del polipéptido.

En algunos aspectos, se incluye un agente solubilizante en la formulación acuosa. Se demuestra aquí que la presencia del agente solubilizante es útil para mantener el polipéptido fXa soluble y estable en la formulación. En algunos aspectos, la concentración del agente solubilizante (por ejemplo, arginina) es al menos 40 mM, o alternativamente al menos 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, o 100 mM. En algunos aspectos, la concentración del agente solubilizante (por ejemplo, arginina) no es mayor que 150 mM, 145 mM, 140 mM, 135 mM, 130 mM, 125 mM, 120 mM, 115 mM, o 110 mM. En algunos aspectos, la concentración del agente solubilizante es de alrededor de 25 mM a alrededor de 110 mM, alrededor de 20 mM a alrededor de 130 mM, alrededor de 30 mM a alrededor de 120 mM, o alrededor de 40 mM a alrededor de 110 mM, o alrededor de 40 mM a alrededor de 105 mM. En algunos aspectos, la concentración del agente solubilizante es alrededor de 40 mM a alrededor de 50 mM o alrededor de 45 mM. En algunos aspectos, la concentración del agente solubilizante es alrededor de 90 mM a alrededor de 110 mM, o alrededor de 95 mM a alrededor de 105 mM, o alrededor de 100 mM. Se observa que, como se usa aquí, el término arginina se refiere al aminoácido así como a las sales (por ejemplo, arginina HCl) del mismo. La arginina tiene un peso molecular de alrededor de 174,2 Dalton, y la arginina HCl (por ejemplo, L-arginina HCl) tiene un peso molecular de alrededor de 210,7 Dalton.

Las reivindicaciones describen de 25 mM a 110 mM de arginina en la composición.

En una realización, el agente solubilizante es citrato o una sal del mismo. La sal de citrato es citrato de sodio. En un aspecto, el citrato comprende una concentración de alrededor de 1,0 mM a alrededor de 200,0 mM. En un aspecto adicional, la concentración del citrato es alrededor de 25 mM. En otro aspecto, la concentración del citrato es alrededor de 50 mM. En una realización adicional, la concentración del citrato es alrededor de 5 mM, 10 mM, o 20 mM. En otra realización, el citrato comprende una concentración de alrededor de 0,05 M a alrededor de 0,2 M.

En un aspecto, el estabilizador es sacarosa amorfa.

La concentración del estabilizador en la formulación acuosa (que es sacarosa) es de 5,5% a alrededor de 7,5% (p/v).

En un aspecto, la concentración de manitol en la formulación acuosa es de alrededor de 0% a alrededor de 5% (p/v), alrededor de 0% a alrededor de 4%, o alrededor de 0% a alrededor de 3%. En algunas realizaciones, la concentración de manitol en la formulación acuosa es al menos alrededor de 0,001%, alrededor de 0,5%, alrededor de 1%, alrededor de 1,5%, o alrededor de 2% (p/v). En un aspecto, la concentración del manitol en la formulación acuosa no es mayor que alrededor de 6%, alrededor de 5,5%, alrededor de 5%, alrededor de 4,5%, alrededor de 4%, o alrededor de 3,5% (p/v). En algunas realizaciones, la formulación acuosa no incluye manitol.

En un aspecto, la relación molar del estabilizador a la proteína en la formulación acuosa es al menos alrededor de 50, al menos alrededor de 75, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 200, al menos alrededor de 300, al menos alrededor de 400, al menos alrededor de 500, al menos alrededor de 600, al menos alrededor de 700, al menos alrededor de 800, al menos alrededor de 900, o al menos alrededor de 1000. En un aspecto, la relación molar del estabilizador a la proteína en la formulación acuosa es 10 a alrededor de 1000, alrededor de 50 a alrededor de 900, alrededor de 60 a alrededor de 800, alrededor de 70 a alrededor de 700, alrededor de 80 a alrededor de 800, alrededor de 90 a alrededor de 700, alrededor de 100 a alrededor de 600, alrededor de 100 a alrededor de 500, 100 a alrededor de 400, 110 a alrededor de 380, alrededor de 150 a alrededor de 200, alrededor de 175 a alrededor de 185, alrededor de 350 a alrededor de 400, o alrededor de 355 a alrededor de 365. En algunos aspectos, la relación molar del estabilizador a la proteína en la formulación acuosa es al menos alrededor de 90, 110, 120, 130, 140, o 150. Las reivindicaciones describen que la relación molar de los estabilizadores al polipéptido es al menos 100.

En algunos aspectos, la formulación acuosa puede incluir además un tensioactivo, un amortiguador, un agente de tonicidad, un crioprotector, un tensioactivo, un lioprotector, un conservante, o combinaciones de los mismos.

En algunos aspectos, la formulación acuosa tiene un pH que es 6 o más, 6,5 o más, 7 o más, o 7,5 o más. En algunos aspectos, el pH no es mayor que 9, 8,5, u 8. En algunos aspectos, el pH está entre 6 y 9, entre 6,5 y 8,5, entre 7 y 8,5, entre 7,5 y 8,2, entre 7,6 y 8,1, entre 7,7 y 7,9, o a alrededor de 6,7, 6,8, 6,9, 7, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, u 8. Las reivindicaciones describen que la formulación acuosa tiene un pH de 7,5 a 8.

En algunas realizaciones, además del polipéptido, la formulación acuosa incluye además un agente solubilizante, un componente cristalino (tal como manitol), y un estabilizador (sacarosa), en la que la relación del estabilizador al componente cristalino es suficientemente alta para prevenir la cristalización. Tales formulaciones tampoco colapsan durante la liofilización en las condiciones deseadas, y pueden liofilizarse para obtener composiciones amorfas liofilizadas. En un aspecto, la condición deseada es la liofilización a una temperatura que es mayor que -402C, o alternativamente mayor que -30°C, -25°C, -20°C, -15°C, o -10°C. En otro aspecto, la condición deseada es la liofilización a una temperatura que es menor que 5°C, 0°C, -5°C, o -10°C.

En algunos aspectos, la formulación acuosa puede incluir un amortiguador, en la que el amortiguador es Tris. En tales realizaciones, la formulación acuosa puede incluir al menos alrededor de 1 mM tris, 2 mM tris, 4 mM tris, 6 mM tris, 8 mM tris, 10 mM tris, 12 mM tris, 14 mM tris, 16 mM tris, 18 mM tris, o 20 mM tris. En algunos aspectos, la formulación acuosa puede incluir menos de alrededor de 35 mM tris, 33 mM tris, 30 mM tris, 28 mM tris, 26 mM tris, o 25 mM tris.

En algunos aspectos, la formulación acuosa puede incluir un tensioactivo, tal como polisorbato 80. En algunos aspectos, la concentración del polisorbato 80 es de alrededor de 0,0001% a alrededor de 1%, 0,001% a alrededor de 0,9%, 0,001% a alrededor de 0,5%, alrededor de 0,001% a alrededor de 0,3%, alrededor de 0,005% a alrededor de 0,03%, alrededor de 0,005% a alrededor de 0,02%, o alrededor de 0,01% a alrededor de 0,02%. En algunos aspectos, la concentración del polisorbato 80 es al menos alrededor de 0,0001%, 0,001%, o 0,002%.

En un aspecto, la formulación acuosa incluye alrededor de 45 mM de arginina, alrededor de 6% de sacarosa (p/v), y alrededor de 20 mg/ml de un antídoto r de dos cadenas, en la que la formulación tiene un pH de alrededor de 7,8. En un aspecto, la formulación acuosa incluye alrededor de 100 mM de arginina, alrededor de 6% de sacarosa (p/v), y alrededor de 40 mg/ml de un antídoto r de dos cadenas, en la que la formulación tiene un pH de alrededor de 7,8. En un aspecto, la formulación acuosa incluye alrededor de 100 mM de arginina, alrededor de 6% de sacarosa (p/v), y alrededor de 40 mg/ml de un antídoto r de dos cadenas, en la que la formulación tiene un pH de alrededor de 7,8. En un aspecto, la formulación acuosa incluye además 0,005%-0,02% (p/v) de Polisorbato 80 y un amortiguador. En un aspecto, la formulación acuosa incluye además 0,01% (p/v) de Polisorbato 80 y un amortiguador.

B. Liofilización y composiciones liofilizadas

En algunas realizaciones, también se proporcionan métodos para liofilizar las formulaciones acuosas de la presente descripción.

En otro aspecto, el ciclo de liofilización incluye las etapas descritas en la Tabla 9. Se observa además que, una vez que se identifica una disolución acuosa adecuada para la liofilización, en consecuencia se puede derivar el método de liofilización de la disolución, con métodos conocidos en la técnica. En un aspecto, una, más o todas las etapas de secado se llevan a cabo a una temperatura de -402C o mayor. En un aspecto, las etapas de secado se llevan a cabo a una temperatura de alrededor de -35°C, -30°C, -25°C, -20°C, -15°C, -10°C, -5°C, o 0°C.

En algunos aspectos, también se proporcionan composiciones amorfas liofilizadas preparadas liofilizando la formulación acuosa de la presente descripción. Basándose en las concentraciones de cada agente en la formulación acuosa, se puede determinar fácilmente el contenido relativo del agente en la composición liofilizada.

En un aspecto, la composición liofilizada incluye al menos 5%, o alternativamente al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, o 60% (p/p) del polipéptido derivado de fXa. En algunas realizaciones, la composición liofilizada comprende sacarosa en forma amorfa.

Todavía, en algunos aspectos, se proporciona una disolución preparada disolviendo la composición liofilizada de la presente descripción en un disolvente. En algunos aspectos, el disolvente es agua o disolución salina. En un aspecto, el disolvente es agua. En un aspecto, la disolución incluye al menos 20 mg/ml o alternativamente al menos 40 mg/ml del polipéptido diana.

III. Métodos de uso de las formulaciones

La presente descripción también se refiere a composiciones para uso en métodos terapéuticos para tratar, prevenir o reducir la hemorragia en un sujeto sometido a terapia anticoagulante con un inhibidor de fXa, que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de la formulación liofilizada tras disolverla en un disolvente adecuado. Se contempla que los antídotos o derivados de la presente descripción pueden ser fármacos de corta duración para uso en situaciones electivas o de emergencia, que pueden neutralizar de forma segura y específica las propiedades anticoagulantes convencionales de un inhibidor de fXa sin causar efectos secundarios hemodinámicos perjudiciales o exacerbación de la respuesta vascular proliferativa a la lesión.

Como se usa aquí, los términos “tratar”, “tratamiento”, y similares, se usan aquí para significar la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir total o parcialmente un trastorno o signo o síntoma del mismo, y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para un trastorno y/o efecto adverso atribuible al trastorno.

“Tratar” también cubre cualquier tratamiento de un trastorno en un mamífero, e incluye:

(a) prevenir que aparezca un trastorno en un sujeto que puede estar predispuesto a un trastorno, pero que aún no se ha diagnosticado que lo tenga, por ejemplo prevenir hemorragias en un paciente con sobredosis de anticoagulante; (b) inhibir un trastorno, es decir, detener su desarrollo, por ejemplo inhibir el sangrado; o (c) aliviar o mejorar el trastorno, por ejemplo reducir el sangrado.

Como se usa aquí, “tratar” incluye además la mejora sistémica de los síntomas asociados con la patología, y/o un retraso en el comienzo de los síntomas. La evidencia clínica y subclínica de “tratamiento” variará con la patología, el individuo, y el tratamiento.

La “administración” puede efectuarse en una dosis, de forma continua o intermitente a lo largo del curso del tratamiento. Los expertos en la técnica conocen métodos para determinar los medios y dosis de administración más eficaces y variarán con la composición usada para la terapia, el fin de la terapia, la célula diana que se está tratando, y el sujeto que se está tratando. Se pueden realizar administraciones únicas o múltiples con el nivel de dosis y el patrón seleccionados por el médico tratante. Se conocen en la técnica formulaciones de dosificación adecuadas y métodos de administración de los agentes. Un “sujeto” de diagnóstico o tratamiento es una célula o un mamífero, incluyendo un ser humano. Los animales no humanos sujetos a diagnóstico o tratamiento incluyen, por ejemplo, múridos, tales como ratas, ratones, cánidos, tales como perros, lepóridos, tales como conejos, ganado, animales deportivos, y mascotas.

Los agentes y composiciones de la presente descripción se pueden usar en la fabricación de medicamentos y para el tratamiento de seres humanos y otros animales mediante la administración de acuerdo con procedimientos convencionales, tales como un ingrediente activo en composiciones farmacéuticas.

Un agente de la presente descripción se puede administrar para terapia por cualquier vía adecuada, específicamente por administración parental (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa, e intradérmica). También se apreciará que la vía preferida variará con el estado y la edad del receptor, y la enfermedad que se esté tratando.

La frase “polímero farmacéuticamente aceptable” se refiere al grupo de compuestos que se pueden conjugar con uno o más polipéptidos descritos aquí. Se contempla que la conjugación de un polímero con el polipéptido sea capaz de extender la vida media del polipéptido in vivo e in vitro. Los ejemplos no limitantes incluyen polietilenglicoles, polivinilpirrolidonas, polialcoholes vinílicos, derivados de celulosa, poliacrilatos, polimetacrilatos, azúcares, polioles, y mezclas de los mismos.

Los “agentes anticoagulantes” o “anticoagulantes” son agentes que inhiben la formación de coágulos sanguíneos. Los ejemplos de agentes anticoagulantes incluyen, pero no se limitan a, inhibidores específicos de trombina, factor IXa, factor Xa, factor XIa, factor XIIa, o factor VIIa, heparina y derivados, antagonistas de la vitamina K, y anticuerpos anti­ factor tisular. Los ejemplos de inhibidores específicos de la trombina incluyen hirudina, bivalirudina (Angiomax®), argatroban, y lepirudina (Refludan®). Los ejemplos de heparina y derivados incluyen heparina no fraccionada (UFH), heparina de bajo peso molecular (LMWH), tales como enoxaparina (Lovenox®), dalteparina (Fragmin®), y danaparoid (Orgaran®); y pentasacárido sintético, tal como fondaparinux (Arixtra®). Ejemplos de antagonistas de la vitamina K incluyen warfarina (Coumadin®), fenocumarol, acenocumarol (Sintrom®), clorindiona, dicumarol, difenadiona, biscumacetato de etilo, fenprocumón, fenindiona, y tioclomarol. En una realización, el anticoagulante es un inhibidor del factor Xa. En una realización, el anticoagulante es betrixaban.

“Terapia anticoagulante” se refiere a un régimen terapéutico que se administra a un paciente para prevenir trombosis o coágulos sanguíneos no deseados. Una terapia anticoagulante comprende administrar uno o una combinación de dos o más agentes anticoagulantes u otros agentes en una dosis y programa adecuados para tratar o prevenir los coágulos sanguíneos no deseados o la trombosis en el paciente.

La expresión “inhibidores del factor Xa” o “inhibidores de factor Xa” se refiere a compuestos que pueden inhibir, directa o indirectamente, la actividad del factor de coagulación Xa de catalizar la conversión de protrombina en trombina in vitro y/o in vivo.

Los “inhibidores directos del factor Xa” se unen al fXa directamente, y los ejemplos no limitantes incluyen NAP-5, rNAPc2, inhibidor de la ruta del factor tisular (TFPI), DX-DX-9065a (como se describe en, por ejemplo, Herbert, J.M., et al, J Pharmacol Exp Ther. 1996276(3): 1030-8), YM-60828 (como se describe en, por ejemplo, Taniuchi, Y., et al, Thromb Haemost. 1998 79(3):543-8), YM-150 (como se describe en, por ejemplo, Eriksson, B.I. et. al, Blood 2005;106(11), Abstract 1865), apixaban, rivaroxaban, TAK-442, PD-348292 (como se describe en, por ejemplo, Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market, 2007), otamixaban, edoxaban (como se describe en, por ejemplo, Hylek EM, Curr Opin Invest Drugs 20078(9):778-783), LY517717 (como se describe en, por ejemplo, Agnelli, G., et al, J. Thromb. Haemost. 20075(4):746-53), GSK913893, razaxaban, betrixaban, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y combinaciones de los mismos. En un aspecto particular, el inhibidor directo del factor Xa es rivaroxaban. En algunos aspectos, un inhibidor directo de fXa es un compuesto químico de molécula pequeña.

La inhibición mediante “inhibidores indirectos del factor Xa” de la actividad de fXa está mediada por uno o más factores adicionales. Ejemplos no limitantes de inhibidores indirectos del factor Xa incluyen fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragmina, tinzaparina, heparina de bajo peso molecular (“LMWH”), y combinaciones de los mismos. En un aspecto particular, el inhibidor indirecto del factor Xa es enoxaparina.

En una realización, el inhibidor del factor Xa se selecciona de edoxaban, fondaparinux, idraparinux, idraparinux biotinilado, enoxaparina, fragmina, NAP-5, rNAPc2, inhibidor de la ruta del factor tisular, DX-9065a, YM-60828, YM-150, apixaban, rivaroxaban, PD-348292, otamixaban, DU-176b, LY517717, GSK913893, razaxaban, heparina de bajo peso molecular, betrixaban, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, y combinaciones de los mismos.

El término “betrixaban” se refiere al compuesto “[2-({4-[(dimetilamino)iminometil]fenil}carbonilamino)-5-metoxifenil]-N-(5-cloro(2-piridil))carboxamida”, o sales farmacéuticamente aceptablea del mismo. “[2-({4-[(dimetilamino)iminometil]fenil}carbonilamino)-5-metoxifenil]-N-(5-cloro(2-piridil))carboxamida” se refiere al compuesto que tiene la siguiente estructura:

o un tautómero o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. En una realización, es la sal de maleato.

Betrixaban se describe en las Patentes U.S. nos 6.376.515 y 6.835.739, y en la Publicación de Solicitud de Patente U.S. n° 2007/0112039, presentada el 7 de noviembre de 2006.

Se sabe que el betrixaban es un inhibidor específico del factor Xa.

“Neutralizar”, “revertir”, o “contrarrestar” la actividad de un inhibidor de fXa, o frases similares, se refieren a inhibir o bloquear la función inhibidora o anticoagulante del factor Xa de un inhibidor de fXa. Dichas frases se refieren a la inhibición parcial o al bloqueo de la función, así como a la inhibición o el bloqueo de la mayor parte o la totalidad de la actividad del inhibidor de fXa, in vitro y/o in vivo.

“Una cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de derivado suficiente para inducir un resultado biológico y/o terapéutico deseado. Ese resultado puede ser el alivio de los signos, síntomas, o causas de una enfermedad, o cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. En la presente descripción, el resultado típicamente implicará uno o más de los siguientes: neutralización de un inhibidor de fXa que se ha administrado a un paciente, reversión de la actividad anticoagulante del inhibidor de fXa, eliminación del inhibidor de fXa del plasma, restauración de hemostasia, y reducción o cese del sangrado. La cantidad eficaz variará dependiendo del agente antídoto específico usado, el inhibidor de fXa específico que se le haya administrado al sujeto, el régimen de dosificación del inhibidor de fXa, el momento de administración del antídoto, el sujeto y la enfermedad que se está tratando, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la forma de administración, y similares, todo lo cual puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica.

En ciertos aspectos, la disolución se administra para administrar una cantidad del derivado de fXa (por ejemplo, el antídoto r) de alrededor de 10 miligramos (mg) a alrededor de 2 gramos (g). Otras cantidades del antídoto r usadas incluyen desde alrededor de 100 mg hasta alrededor de 1,5 g; de alrededor de 200 mg a alrededor de 1 g; y de alrededor de 400 mg a alrededor de 900 mg. En algunos aspectos, la cantidad del antídoto r usado es alrededor de 400 mg o 960 mg. En algunos aspectos, la cantidad del antídoto r usado es de alrededor de 10 mg a alrededor de 100 mg; de alrededor de 15 mg a alrededor de 95 mg; y de alrededor de 20 mg a alrededor de 80 mg.

En otra realización, la disolución se administra en una cantidad neutralizante que es al menos una relación molar de alrededor de 1:1 veces entre la concentración circulante de antídoto r y la concentración circulante del inhibidor del factor Xa durante un período de al menos alrededor de 30 minutos. En otras realizaciones, la relación molar es alrededor de 1:1 o alrededor de 2:1 o alrededor de 4:1.

La formulación, cuando se administra, neutraliza el inhibidor del factor Xa en al menos alrededor de 20%, o en al menos alrededor de 50%, o en al menos alrededor de 75%, o en al menos alrededor de 90%, o en al menos alrededor de 95%.

Se puede determinar si se logra el método, es decir, la inhibición o reversión de un inhibidor del factor Xa, mediante un número de ensayos in vitro, tal como el ensayo de generación de trombina, y ensayos clínicos de coagulación tales como aPTT, PT y ACT.

Un aspecto de la presente descripción se refiere a composiciones para uso en métodos de unión e inhibición selectiva de un inhibidor de fXa administrado exógenamente en un sujeto sometido a terapia anticoagulante con un inhibidor de fXa, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de una disolución de la formulación liofilizada. Los pacientes adecuados para esta terapia se han sometido a una terapia anticoagulante previa; por ejemplo, se les ha administrado uno o más de un anticoagulante, tal como un inhibidor directo o indirecto de fXa.

En algunas realizaciones, la disolución se administra después de la administración de una sobredosis de un inhibidor de fXa o antes de una cirugía, lo que puede exponer a los sujetos al riesgo de hemorragia. El sujeto puede ser una célula o un mamífero, tal como un ser humano.

En otro aspecto, la composición para uso en un método proporcionado aquí se une e inhibe selectivamente un inhibidor del factor Xa administrado exógenamente en un sujeto sometido a terapia anticoagulante con un inhibidor del factor Xa, que comprende administrar una disolución de la formulación liofilizada al sujeto. El sujeto puede ser una célula o un mamífero, tal como un ser humano.

Los sujetos que se beneficiarán de la administración de la formulación liofilizada disuelta descrita aquí y los métodos que la acompañan incluyen aquellos que están experimentando o están predispuestos a un episodio de hemorragia clínica importante o un episodio de hemorragia no importante clínicamente significativo. Los ejemplos de episodios de hemorragia importante clínicos se seleccionan del grupo que consiste en hemorragia, hemorragia en órganos vitales, hemorragia que requiere una nueva operación o un nuevo procedimiento terapéutico, y un índice de hemorragia de > 2,0 con hemorragia manifiesta asociada. (Turpie AGG, et al, NEJM, 2001,344: 619-625.) Además, el sujeto puede estar experimentando o predispuesto a un episodio hemorrágico no importante seleccionado del grupo que consiste en epistaxis que es persistente o recurrente y en una cantidad sustancial o no se detendrá sin intervención, hemorragia rectal o del tracto urinario que no aumenta hasta un nivel que requiera un procedimiento terapéutico, hematomas sustanciales en los lugares de inyección o en otros lugares que son espontáneos o que ocurren con un traumatismo trivial, pérdida de sangre sustancial más de lo habitual asociada con un procedimiento quirúrgico que no requiere drenaje, y hemorragia que requiere una transfusión no planificada.

En algunas realizaciones, la formulación liofilizada disuelta se administra después de la administración de una sobredosis de un inhibidor de fXa o antes de una cirugía, lo que puede exponer a los sujetos al riesgo de hemorragia.

En cualquiera de los métodos descritos aquí, debe entenderse, incluso si no siempre se indica explícitamente, que se administra al sujeto una cantidad eficaz de la formulación liofilizada disuelta. La cantidad puede ser determinada empíricamente por el médico tratante, y variará con la edad, sexo, peso, y salud del sujeto. Los factores adicionales que debe considerar el médico tratante incluyen, pero no se limitan a, la identidad y/o la cantidad de inhibidor del factor Xa, que puede haber sido administrado, el método o modo en que se administrará la formulación liofilizada al sujeto, y el criterio de valoración terapéutico para el paciente. Con estas variables en mente, un experto administrará una cantidad terapéuticamente eficaz al sujeto que se va a tratar.

EJEMPLOS

La descripción se entiende mejor por referencia a los siguientes ejemplos, que pretenden ser puramente ejemplares de la descripción. La presente descripción no está limitada, en el alcance, por las realizaciones ejemplificadas, que se pretende que sean ilustraciones de aspectos individuales de la descripción únicamente. Cualquier método que sea funcionalmente equivalente está dentro del alcance de la descripción. Diversas modificaciones de la descripción, además de las descritas aquí, resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y las figuras adjuntas. Tales modificaciones caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se indique lo contrario, todas las temperaturas están en grados Celsius. Además, en estos ejemplos y en otros lugares, las abreviaturas tienen los siguientes significados:

h= hora

M= molar

mg= miligramo

mg/kg= miligramo/kilogramo

mg/ml= miligramo/mililitro

min= minuto

ml= mililitro

mM= milimolar

PS80= Polisorbato 80

RH= humedad relativa

p/v= peso/volumen

pl o ul= microlitro

pM= micromolar

Ejemplo 1. Preparación de disoluciones acuosas para preparar formulaciones amorfas de antídoto r

El antídoto r se obtuvo en una formulación de 10 mM de tris, 45 mM de L-arginina HCl, 6% p/v de sacarosa, pH 7,8, mediante ultrafiltración/diafiltración. El antídoto r se intercambió de amortiguador en 10 mM de tris, 45 mM de L-arginina HCl, 6% p/v de sacarosa, pH 7,8, a 12 mg/ml, y después se concentró hasta 30 mg/ml. Después de la dilución, la concentración diana de antídoto r fue 20 mg/ml.

Ejemplo 2a. Caracterización térmica

Se prepararon once formulaciones diferentes para evaluar los efectos del pH, manitol (componente cristalino), sacarosa (estabilizador), y concentración de antídoto r sobre la Tg’ (temperatura de transición vítrea) de la formulación. La Tg’ se midió mediante calorimetría diferencial de barrido (DSC). La cantidad de cada componente y la Tg’ de estas formulaciones se resumen en la Tabla 5.

Basándose en la caracterización térmica anterior, se encontró que las formulaciones que contenían antídoto r, Tris, hidrocloruro de L-arginina, manitol, sacarosa, y polisorbato 80 en las que la relación de sacarosa a manitol era mayor que 1, eran amorfas y exhibían una Tg’. En formulaciones, tal como la Formulación 10a en la Tabla 5, en las que la relación de sacarosa a manitol fue menor de 1, se observó un evento de cristalización. El análisis estadístico indica que cantidades crecientes de sacarosa y antídoto r aumentan la Tg’, mientras que cantidades crecientes de manitol disminuyen la Tg’ para las formulaciones amorfas.

Ejemplo 2b. Caracterización térmica

Se evaluaron por DSC formulaciones de concentraciones crecientes de antídoto r en 10 mM de Tris, 100 mM de hidrocloruro de L-arginina a pH 8,0. Todas las formulaciones con una Tg’ fueron amorfas. Como se muestra en la Tabla 6 a continuación, a medida que aumenta la concentración de proteína, aumenta la Tg’. Son deseables las formulaciones con alta Tg’, ya que son más fáciles de liofilizar, si es necesario.

Tabla 6

Ejemplo 3. Estabilidad de formulaciones líquidas

Las formulaciones líquidas de la Tabla 5 se estabilizaron. Las formulaciones se ensayaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) después de 14 días a 5°C y 25°C/60%RH, y después de 4 días a 40°C/75%RH. La cromatografía de intercambio iónico (IEX) también se realizó después de 4 días a 25°C/60%RH y 40°C/75%RH. La formación de especies de alto peso molecular (HMW) SEC se vio afectada principalmente por el pH, pero en general, todas las formulaciones retuvieron un alto contenido de monómero SEC. Para IEX, no hubo cambios después de 4 días a 25°C/60%RH, y un aumento en las especies ácidas con una disminución en las especies básicas después de 4 días a 40°C/75%RH. En general, las formulaciones fueron estables como muestran SEC e IEX (Tabla 7).

Tabla 7

Ejemplo 4. Temperatura de colapso

Se evaluaron dos formulaciones mediante microscopía de secado por congelación para identificar su temperatura de colapso.

Se dispensaron aproximadamente 0,15 ml de disolución en una celda de vidrio. La celda se colocó en una pletina de liofilización con temperatura controlada. La celda de muestra tenía 2 termopares colocados directamente en el material en la parte inferior y central de la celda. Las muestras líquidas se enfriaron a 0,52C/min hasta -602C. La cámara de la pletina se evacuó para iniciar la sublimación. A continuación, la pletina se calentó entonces a una velocidad media de 0,5°C/min. Se examinó el colapso de la muestra utilizando un microscopio Infinivar capaz de un aumento de 16 a 330X, acoplado a una cámara CCD Super WDR.

Una formulación de 20 mg/ml de antídoto r, 10 mM de tris, 45 mM de L-arginina, 6% p/v de sacarosa, 0,01% p/v de polisorbato 80 a pH 7,8, exhibió una temperatura de colapso de -26°C.

Una formulación de 40 mg/ml de antídoto r, 10 mM de tris, 45 mM de L-arginina, 6% p/v de sacarosa, 0,01% p/v de polisorbato 80 a pH 7,8, exhibió una temperatura de colapso de -24°C.

La temperatura de colapso de las dos formulaciones es suficientemente alta para el desarrollo de un ciclo de liofilización.

Ejemplo 5. Liofilización

Las formulaciones resumidas en la Tabla 8 se liofilizaron usando el ciclo de liofilización resumido en la Tabla 9. Se cargaron 2,5 ml de cada formulación en viales de vidrio de 5 ml, y se taparon parcialmente antes del inicio del ciclo de liofilización.

Tabla 8

Tabla 9

Todas las formulaciones liofilizadas eran de aspecto sólido y farmacéuticamente elegantes. La Formulación 1b exhibió un colapso menor, mientras que las Formulaciones 2b y 3b no mostraron ningún colapso.

Ejemplo 6. Estabilidad de formulaciones liofilizadas

Las formulaciones liofilizadas se colocaron en estabilidad acelerada a 40°C/75% RH durante un tiempo de hasta 1 mes. Los resultados de estabilidad determinados por SEC, HPLC e IEX se muestran a continuación en las Tablas 10, 11 y 12, respectivamente. Las formulaciones son estables hasta 1 mes a 40°C.

Tabla 10

Tabla 11

Tabla 12

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una composición liofilizada que se puede obtener liofilizando una formulación acuosa, en la que:

la formulación acuosa comprende un estabilizador, de 25 mM a 110 mM de arginina, y al menos 15 mg/ml de un polipéptido de dos cadenas que comprende una primera cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, y una segunda cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, en la que el polipéptido no puede ensamblarse en un complejo de protrombinasa;

la formulación acuosa tiene un pH de 7,5 a 8;

el estabilizador es de 5,5% a 7,5% de sacarosa (p/v); y

la relación molar del estabilizador al polipéptido es al menos 100.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que:

(i) la formulación acuosa comprende de 40 mM a 50 mM de arginina, de 5,5% a 7,5% de sacarosa (p/v), y 20 mg/ml del polipéptido; o

(ii) la formulación acuosa comprende de 90 mM a 110 mM de arginina, de 5,5% a 7,5% de sacarosa (p/v), y al menos 30 mg/ml del polipéptido; o

(iii) la formulación acuosa no comprende manitol y 40 mg/ml del polipéptido.

3. La composición de la reivindicación 2(ii), en la que la formulación acuosa comprende 45 mg/ml del polipéptido.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la formulación acuosa no comprende manitol.

5. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el polipéptido comprende un resto de aminoácido que se modifica para que sea diferente de los aminoácidos naturales.

6. La composición de la reivindicación 2(iii), en la que el resto Asp29 de la primera cadena se modifica a (3R)-3-hidroxiAsp en Asp29.

7. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que el polipéptido comprende al menos un enlace de disulfuro intracatenario para cada una de las cadenas primera y segunda.

8. La composición liofilizada que se puede obtener liofilizando una formulación acuosa de la reivindicación 1, en la que:

la formulación acuosa comprende 45 mM de arginina, 6% de sacarosa (p/v), 0% de manitol, y 20 mg/ml de un polipéptido de dos cadenas que comprende una primera cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, y una segunda cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, en la que el polipéptido no puede ensamblarse en un complejo de protrombinasa; y

la formulación acuosa tiene un pH de 7,8.

9. La composición liofilizada que se puede obtener liofilizando una formulación acuosa de la reivindicación 1, en la que:

la formulación acuosa comprende 100 mM de arginina, 6% de sacarosa (p/v), 0% de manitol, y 40 mg/ml de un polipéptido de dos cadenas que comprende una primera cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4, y una segunda cadena que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 5, en la que el polipéptido no puede ensamblarse en un complejo de protrombinasa; y

la formulación acuosa tiene un pH de 7,8.

10. La composición de la reivindicación 9, en la que el polipéptido de dos cadenas tiene modificaciones en el dominio Gla y el sitio activo en comparación con la proteína fXa de tipo salvaje, es capaz de unirse a un inhibidor de fXa pero no se ensambla en un complejo de protrombinasa.

11. La composición de la reivindicación 1, en la que la temperatura de transición vitrea es desde -27°C hasta -37°C.

12. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la formulación acuosa comprende además un tensioactivo y un amortiguador.

13. Un método para preparar la composición amorfa liofilizada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -12.

14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, para uso en un método para reducir el sangrado en un sujeto sometido a terapia anticoagulante con un inhibidor del factor Xa, que comprende administrar al sujeto una disolución preparada disolviendo la composición en un disolvente acuoso.

15. La composición para uso de la reivindicación 14, en la que el inhibidor del factor Xa es apixaban, rivaroxaban, o betrixaban.