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ES2859604T3 - Anticuerpos conjugados contra LY75 para el tratamiento del cáncer - Google Patents

Anticuerpos conjugados contra LY75 para el tratamiento del cáncer Download PDF

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ES2859604T3
ES2859604T3 ES14789591T ES14789591T ES2859604T3 ES 2859604 T3 ES2859604 T3 ES 2859604T3 ES 14789591 T ES14789591 T ES 14789591T ES 14789591 T ES14789591 T ES 14789591T ES 2859604 T3 ES2859604 T3 ES 2859604T3
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James Edward Ackroyd
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Oxford Biotherapeutics Ltd
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Abstract

Un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a LY75, comprendiendo dicho anticuerpo: a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 5; ii) una segundo vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 6; y iii) una tercer vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 7; y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una primera vICDR que comprende la SEQ ID NO: 8; ii) una segunda vICDR que comprende la SEQ ID NO: 9; y iii) una tercera vICDR que comprende la SEQ ID NO: 10, en el que una cualquiera o más de las SEQ ID NOs anteriores comprenden independientemente una o dos sustituciones de aminoácidos y en el que el anticuerpo está internalizado.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos conjugados contra LY75 para el tratamiento del cáncer
Introducción
La presente divulgación se refiere en general a los campos de la inmunología y la biología molecular. Más específicamente, en este documento se proporcionan anticuerpos y otras proteínas terapéuticas dirigidas contra LY75, ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos y proteínas terapéuticas, métodos para preparar anticuerpos monoclonales y otras proteínas terapéuticas y métodos para el tratamiento de enfermedades, tales como cánceres mediados por la expresión/actividad de LY75 y/o asociados con la expresión/actividad anormal de ligandos para el mismo.
Antecedentes
El antígeno de linfocitos 75 actúa como un receptor endocítico para dirigir antígenos capturados desde el espacio extracelular al compartimento especializado de procesamiento de antígenos y se cree que causa una reducción en la proliferación de linfocitos B. La expresión del antígeno linfocitario 75 se ha observado en cánceres de páncreas, ovario, mama, colorrectal, esófago, piel, tiroides y pulmón (células no pequeñas), así como en mieloma múltiple y muchos subtipos diferentes de linfomas y leucemias.
El documento WO2009/061996 divulga anticuerpos monoclonales aislados que se unen a DEC-205 (LY75) humano y composiciones y moléculas basadas en anticuerpos relacionados. También se divulgan composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos, así como métodos terapéuticos y de diagnóstico para usar los anticuerpos.
El documento WO2008/104806 divulga reactivos de afinidad capaces de unirse a LY75 para uso en el tratamiento o profilaxis del cáncer.
El documento WO96/23882 divulga la identificación y caracterización de DEC-205. También divulga métodos para identificar ligandos para DEC-205 que pueden dirigirse a células que expresan el antígeno.
Giridhar, P.V. et al., (2011) Clin Exp Metastasis 28: 887-897, divulga que el bloqueo de LY75 con anticuerpo reduce la adherencia de las células tumorales que sobreexpresan IL6Ra a matrices in vitro y al Omento. Sugiere además que el bloqueo de LY75 podría ser una estrategia clínica valiosa para reducir la metástasis temprana del cáncer de ovario. Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos dirigidos contra LY75, ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos, células huésped que comprenden dichos ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención, métodos para preparar anti-LY75 y métodos para el tratamiento de enfermedades, tales como los trastornos mediados por LY75, por ejemplo, cánceres humanos, incluyendo cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, leucemia, mieloma múltiple y linfoma.
La divulgación describe un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que: (a) se une a un epítopo en LY75 que es reconocido por un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1 y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2, o (b) compite por unirse a LY75 con un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, y una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2.
En un ejemplo, el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo se une al LY75 humano y comprende una región variable de cadena pesada que comprende 1, 2 o 3 CDR seleccionadas del grupo que consiste en las CDR que comprenden las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, y/o una región variable de cadena ligera que comprende 1, 2 o 3 CDR seleccionadas del grupo que consiste en las CDR que comprenden las SEQ ID NO: 8, 9 y 10.
En realizaciones preferidas, dichos anticuerpos son anticuerpos aislados.
Los anticuerpos de la invención se unen a LY75 (SEQ ID No: 15) y son internalizados por una célula que expresa LY75, provocan una respuesta de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras o provocan respuesta de células T citotóxicas en presencia de células efectoras.
En un aspecto, el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y/o ligera o regiones variables (VR) del anticuerpo particular descrito en el presente documento (por ejemplo, denominado en el presente documento "LY75_A1"). Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo comprende los dominios de CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo LY75_A1 que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, y/o los dominios de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera (VL) de LY75_A1 que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2. En otra realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 5; una segunda vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 6; y una tercera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 7; y/o una región variable de cadena ligera que comprende una primera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 8; una segunda vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 9; y una tercera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 10, en el que una cualquiera o más de las CDR comprenden independientemente una o dos sustituciones de aminoácidos.
En otra realización, los anticuerpos de la invención se unen a LY75 humano e incluyen una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 1 y/o modificaciones de secuencias conservadoras de la misma. El anticuerpo puede incluir además una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 2 y/o modificaciones de secuencia conservadoras de la misma.
En una realización adicional, los anticuerpos de la invención se unen a LY75 humano e incluyen una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que incluyen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 1 y/o 2, respectivamente, y modificaciones de secuencia conservadoras de las mismas.
Anticuerpos aislados que incluyen regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 91%, o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98%, o al menos el 99%, o más identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias anteriores también se incluyen en la presente invención. También se pretenden que estén abarcados por la presente invención los intervalos intermedios de los valores mencionados anteriormente, por ejemplo, regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen al menos 80-85%, 85-90%, 90-95% o 95-100% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias anteriores. En una realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 1. En otra realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 2 o una secuencia que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 2. En otra realización, el anticuerpo comprende una región marco de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos al menos 98%, al menos 99% idéntica al marco de la región variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 como se muestra en las SEQ ID NOs: 16, 17, 18 y 19. En otra realización, el anticuerpo comprende una región marco de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica al marco de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2 como se muestra en las SEQ ID NOs: 20, 21,22 y 23.
También se describen anticuerpos que compiten por unirse a LY75 con los anticuerpos de la invención. En un ejemplo, el anticuerpo compite por unirse a LY75 con un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente, o secuencias de aminoácidos al menos 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos un 99% idénticas a las mismas. En otro ejemplo, el anticuerpo compite por unirse a LY75 con un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 1 y 2 (LY75_A1).
Otros anticuerpos de la descripción se unen al mismo epítopo o un epítopo en LY75 reconocido por los anticuerpos descritos en este documento. En otro ejemplo, el anticuerpo se une a un epítopo en LY75 reconocido por un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente, o las secuencias de aminoácidos al menos 80 % idénticas a las mismas. En otro ejemplo, el anticuerpo se une a un epítopo en LY75 reconocido por un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1 y 2 (LY75_A1).
En un ejemplo adicional, los anticuerpos de la invención se unen específicamente a uno o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, péptidos seleccionados del grupo que comprende las SEQ ID NOs: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o 37 o fragmentos de las mismas, en las que dichos fragmentos comprenden al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 aminoácidos contiguos. En una realización adicional, el epítopo reconocido por los anticuerpos de la presente invención comprende uno o más péptidos, dos o más o tres o más péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 27, 29, 30, 34, 35, 36 o 37 o fragmentos de los mismos en los que dichos fragmentos comprenden al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 aminoácidos contiguos. En un ejemplo adicional, el epítopo reconocido por los anticuerpos de la presente invención comprende uno o más péptidos, por ejemplo, dos o tres péptidos seleccionados del grupo que consiste en SEQ ID NO: 30, 36 y 37 o fragmentos de los mismos en los que dichos fragmentos comprenden al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 aminoácidos contiguos.
En un ejemplo adicional, los anticuerpos comprenden las CDR variables en comparación con los anticuerpos originales descritos en el presente documento. Por lo tanto, la invención proporciona anticuerpos variantes que comprenden regiones variables variantes de un anticuerpo original, en el que el anticuerpo original comprende una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 5, una segunda vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 6, una tercera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 7. , una primera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 8, una segunda vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 9 y una tercera vlCDR que comprende una SEQ ID NO: 10, y en la que el anticuerpo variante tiene 1, 2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones de aminoácidos colectivamente en el conjunto de la primera vhCDR, la segunda vhCDR, la tercera vhCDR, la primera vICDR, la segunda vlCDR y la tercera vICDR, con 1 a 4, 1 a 3 o 1 a 2 sustituciones de uso particular, y en las que el anticuerpo retiene la unión específica a LY75.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa, por ejemplo, cualquiera de los siguientes isotipos: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos tales como una porción de unión a antígeno o un anticuerpo de cadena sencilla (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv, un Fv de cadena sencilla, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada o una combinación de dos o más CDR aisladas). Los anticuerpos pueden ser cualquier tipo de anticuerpo, incluidos, entre otros, anticuerpos humanos, humanizados y quiméricos.
En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención están en la forma de un inmunoconjugado (es decir, incluyen además una fracción unida covalentemente). En una realización particular, la fracción es un fármaco, tal como un maitansinoide, una dolastatina, una auristatina, un tricoteceno, una caliqueamicina, CC1065 o derivados de los mismos. En una realización preferida, la fracción del fármaco es DM1 o DM4.
En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención abarcan además una molécula biespecífica y, como tales, pueden provocar una respuesta de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras, matando así las células que expresan LY75.
En otras realizaciones, los anticuerpos de la invención abarcan además una molécula biespecífica y, como tal, pueden provocar una respuesta de células T citotóxicas en presencia de células efectoras, matando así las células que expresan LY75.
En otro aspecto, la invención proporciona ácidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos de la invención. En una realización, se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la invención o la porción de unión al antígeno del mismo. En otra realización, se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la invención o la porción de unión a antígeno del mismo. En una realización adicional, se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos de la invención.
En una realización, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado que se une a LY75 humano, en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera codificada por secuencias de ácido nucleico que comprenden las SEQ ID NOs: 3 y 4, respectivamente, o secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99 % de identidad con las secuencias de ácido nucleico antes mencionadas o secuencias que difieren de las SEQ ID NOs: 3 y 4 debido a la degeneración del código genético.
En otro aspecto de la presente invención, se proporcionan vectores de expresión que comprenden ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadena pesada y/o ligera de los anticuerpos de la invención operativamente unidos a uno o más elementos reguladores.
En otro aspecto, la invención proporciona células huésped que contienen ácidos nucleicos que codifican regiones variables de cadena pesada y/o ligera o las porciones de unión a antígeno de las mismas de los anticuerpos anteriores. Preferiblemente, en el que la célula huésped expresa dichas regiones variables de cadena pesada y/o ligera o las porciones de unión a antígeno de las mismas cuando la célula huésped se cultiva bajo condiciones en el que se expresan el ácido o ácidos nucleicos.
En una realización preferida, la célula huésped comprende: (i) un vector de expresión según la presente invención; o (ii) un primer vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la invención o la porción de unión al antígeno del mismo y un segundo vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la invención o la porción de unión a antígeno del mismo.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona la preparación de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la presente invención bajo condiciones en las que se expresa el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo y, opcionalmente, aislar el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo. También se describe un método para tratar el cáncer que comprende administrar a un paciente que lo necesita un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo es internalizado por una célula que expresa LY75, comprendiendo dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno un conjugado de fármaco unido covalentemente. Se entenderá que el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de la invención es uno que se une a LY75 (SEQ ID No: 15). En un ejemplo, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 5; una segunda vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 6; y una tercera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera que comprende una primera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 8; una segunda vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 9; y una tercera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 10 y un conjugado de fármaco unido covalentemente.
También se describe un método para tratar cáncer, en el que a un paciente que lo necesita se le administra un anticuerpo o anticuerpos o una porción de unión a antígeno del mismo de la invención y en el que dicho anticuerpo o anticuerpos o una porción de unión a antígeno del mismo de la invención provoca una respuesta de ADCC en presencia de células efectoras. En un ejemplo, el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 5; una segunda vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 6; y una tercera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera que comprende una primera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 8; una segunda vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 9; y una tercera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 10.
En un ejemplo adicional, se proporciona un método para tratar cáncer, en el que a un paciente que lo necesita se le administra un anticuerpo o anticuerpos o una porción de unión a antígeno del mismo de la invención y en el que dicho anticuerpo o anticuerpos o una porción de unión a antígeno de los mismos de la invención provocan una respuesta de células T citotóxicas en presencia de células efectoras. En un ejemplo, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 5; una segunda vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 6; y una tercera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera que comprende una primera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 8; una segunda vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 9; y una tercera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 10.
En un aspecto adicional de la presente invención, se proporcionan uno o más anticuerpos de la invención para uso en el tratamiento del cáncer.
También se describe el uso de uno o más anticuerpos de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
En algunas realizaciones, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, leucemia, mieloma, preferiblemente mieloma múltiple y linfoma. Los cánceres particularmente preferidos incluyen linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de células B, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT), linfoma de células B rico en histiocitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma de células T, linfoma periférico de células T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma angioinmunoblástico de células T, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas y cáncer de mama triple negativo.
También se describe un método para detectar, diagnosticar y/o cribar o controlar la progresión de un cáncer en el que LY75 se expresa en dicho cáncer, o para controlar el efecto de un fármaco o terapia contra el cáncer dirigida a dicho cáncer, en un sujeto que comprende detectar la presencia o el nivel de anticuerpos capaces de unirse inmunoespecíficamente a LY75, o uno o más fragmentos del mismo. El cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de ovario, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de tiroides, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, cáncer de pulmón, leucemia, mieloma, preferiblemente mieloma múltiple y linfoma. Los cánceres particularmente preferidos incluyen linfoma no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de células B, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosa (MALT), linfoma de células B rico células T/histiocitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma de células T, linfoma periférico de células T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma angioinmunoblástico de células T, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, cáncer de vejiga cáncer de páncreas y cáncer de mama triple negativo.
También se describen kits que comprenden las composiciones (por ejemplo, anticuerpos) de la invención y, opcionalmente, instrucciones de uso. El kit puede contener además al menos un reactivo adicional o uno o más anticuerpos adicionales de la invención.
Otras características y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa la alineación de la cadena pesada de LY75_A1 (SEQ ID NO: 1), la línea germinal VH 3-15 humana (SEQ ID NO: 11) y la línea germinal JH4 humana (SEQ ID NO: 12). Las regiones CDR de la cadena pesada de LY75_A1 están subrayadas.
La Figura 2 representa la alineación de la cadena ligera de LY75_A1 (SEQ ID NO: 2), la línea germinal VK 012 humana (SEQ ID NO: 13) y la línea germinal JK4 humana (SEQ ID NO: 14). Las regiones c Dr de la cadena ligera de LY75_A1 están subrayadas.
La Figura 3a representa la actividad citotóxica de los anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 en HT-29 y muestra que, mientras que la mayoría de los anticuerpos se unen a LY75, solo unos pocos muestran eficacia. La Figura 3b representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en HT-29. La Figura 3c representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células RAJI. La Figura 3d representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células de Namalwa.
La Figura 3e representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células Karpas 299.
La Figura 3f representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células BxPC3. La Figura 3g representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células HupT4. La Figura 3h representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células HPAFFII.
La Figura 3i representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células EHEB. La Figura 3j representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células Mec-1.
La Figura 3k representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células AML-193.
La Figura 3I representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células HCC 70.
La Figura 3m representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células HCC 1806.
La Figura 3n representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células MDA-MB-468.
La Figura 3o representa la actividad citotóxica de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células RT4.
La Figura 3p representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células 5637. La Figura 3q representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células SW780.
La Figura 3r representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células SCC-9.
La Figura 3s representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células OE 19.
La Figura 3t representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células OVCAR-3.
La Figura 3u representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células SK-OV-3.
La Figura 3v representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células MOLP-8.
La Figura 3w representa la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en células RPMI8226.
La Figura 4a representa la eficacia de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en el modelo de xenoinjerto de ratón SCID de linfoma de Raji Burkitt.
La Figura 4b representa la eficacia de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en el modelo de xenoinjerto de ratón SCID de linfoma de Namalwa Burkitt.
La Figura 4c representa la eficacia de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo atímico de adenocarcinoma pancreático HPAFII.
La Figura 4d representa la eficacia de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en el modelo de xenoinjerto de ratón SCID de carcinoma de vejiga humano SW780.
La Figura 4e representa la eficacia de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo atímico MDA-MB-468.
La Figura 4f representa la eficacia de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 o DM4 en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo atímico de adenocarcinoma colorrectal COLO205.
La Figura 5a muestra la unión competitiva de mAb anti-LY75 y un mAb anti-LY75 conjugado con MCC-DM1.
La Figura 5b muestra la unión no competitiva de LY75_A1 y un mAb anti-LY75 conjugado con MCC-DM1.
Las Figuras 6a-6j muestran representaciones gráficas de la unión del anticuerpo LY75_A1 con péptidos LY75 en un microarreglo de péptidos.
La Figura 7 muestra un alineamiento de aminoácidos de péptidos unidos por el anticuerpo LY75_A1 tanto en el ensayo de microarreglo de péptidos como en el ensayo de extracción de péptidos. Los péptidos resaltados son aquellos que probablemente formen el epítopo reconocido por el anticuerpo LY75_A1.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación se refiere a anticuerpos aislados que se unen a la proteína LY75 descrita en la SEQ ID No: 15 como se describe en el presente documento.
Además, los anticuerpos LY75 de la presente invención pueden ser una molécula biespecífica y, como tales, pueden provocar una respuesta de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras, matando así las células que expresan LY75.
Además, los anticuerpos LY75 de la presente invención pueden ser una molécula biespecífica y, como tales, pueden provocar una respuesta de células T citotóxicas en presencia de células efectoras, matando así las células que expresan LY75.
Además, los anticuerpos LY75 de la presente invención pueden internalizarse cuando se ponen en contacto con células que expresan al receptor LY75. Como se analiza en el presente documento, el receptor de LY75 se sobreexpresa y/o se expresa diferencialmente en ciertas células cancerosas, que incluyen, entre otros, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de tiroides, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, leucemia preferiblemente leucemia mieloide aguda o leucemia linfocítica crónica, mieloma, preferiblemente mieloma múltiple, linfoma, preferiblemente linfoma de células B DLBCL, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de tejido linfoide asociado a la mucosa (MALT), linfoma de células B rico en células T/histiocitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma de células T, linfoma periférico de células T, linfoma anaplásico de células grandes y angioblastos, linfoma de células T y cáncer de pulmón.
Como tal, cuando los anticuerpos LY75 de la presente invención se conjugan con fármacos (a veces denominados en el presente documento "conjugados anticuerpo-fármaco" o "ADC"), la internalización de estas moléculas de ADC en células cancerosas da como resultado la muerte celular y por lo tanto, el tratamiento del tumor.
La presente invención proporciona anticuerpos que poseen características estructurales particulares tales como regiones CDR con secuencias de aminoácidos particulares. En el presente documento se describe un conjunto de CDR que pueden formar un reactivo de afinidad, por ejemplo, un anticuerpo, que exhibe unión a LY75.
Por lo tanto, la divulgación proporciona anticuerpos, preferiblemente anticuerpos aislados (que, como se describe a continuación, incluye una amplia variedad de estructuras de, derivados, miméticos y conjugados de anticuerpos bien conocidos), ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos, células huésped utilizadas para fabricar los anticuerpos, métodos para fabricar los anticuerpos y composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y opcionalmente un vehículo farmacéutico, métodos de tratamiento y diagnóstico que comprenden el uso de los anticuerpos y el uso de los anticuerpos para el tratamiento de cánceres.
Proteínas LY75
El antígeno linfocitario 75 actúa como un receptor endocítico para dirigir los antígenos capturados desde el espacio extracelular hasta un compartimento especializado de procesamiento de antígenos y se cree que causa una reducción en la proliferación de linfocitos B.
De acuerdo con SWISS-PROT, el antígeno linfocitario 75 se expresa en linfocitos de bazo, timo, colon y sangre periférica. Se ha detectado en líneas celulares mieloides y linfoide B. Las isoformas designadas en el presente documento OGTA076b y OGTA076c se expresan en células malignas de linfoma de Hodgkin llamadas células de Hodgkin y Reed-Sternberg (HRS). LY75 actúa como un receptor endocítico para dirigir los antígenos capturados desde el espacio extracelular a un compartimento especializado de procesamiento de antígenos. Provoca proliferación reducida de linfocitos B.
Se ha observado la expresión de LY75 en cánceres de páncreas, vejiga, ovario, mama (incluyendo triple negativo), colorrectal, esofágico, piel, tiroides y pulmón (de células no pequeñas), así como mieloma múltiple y muchos subtipos diferentes de linfomas (incluido el LDCBG) y leucemias.
El anticuerpo de la invención puede, en ciertos casos, reaccionar de forma cruzada con el LY75 de especies distintas de la humana. Por ejemplo, para facilitar las pruebas clínicas, los anticuerpos de la invención pueden reaccionar de forma cruzada con moléculas de LY75 murinas o de primates. Alternativamente, en ciertas realizaciones, los anticuerpos pueden ser completamente específicos para LY75 humano y pueden no exhibir especies u otros tipos de reactividad cruzada no humana.
Anticuerpos
La presente invención proporciona anticuerpos anti-LY75, generalmente anticuerpos terapéuticos y/o de diagnóstico como se describe en el presente documento. Los anticuerpos que encuentran uso en la presente invención pueden adoptar varios formatos como se describe en el presente documento, incluidos los anticuerpos tradicionales, así como los derivados, fragmentos y miméticos de anticuerpo, que se describen a continuación. La invención proporciona estructuras de anticuerpos que contienen un conjunto de 6 CDR como se define en el presente documento (que incluyen un número pequeño de cambios de aminoácidos como se describe a continuación).
"Anticuerpo", como se usa en el presente documento, incluye una amplia variedad de estructuras, como apreciarán los expertos en la técnica, que en algunas realizaciones contienen como mínimo un conjunto de 6 CDR como se define en el presente documento; incluidos, entre otros, anticuerpos tradicionales (incluyendo tanto anticuerpos monoclonales como policlonales), anticuerpos humanizados y/o quiméricos, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos modificados (por ejemplo, con modificaciones de aminoácidos como se describe a continuación), anticuerpos multiespecíficos (incluidos anticuerpos biespecíficos) y otros análogos conocidos en la técnica.
Las unidades estructurales de anticuerpos tradicionales comprenden típicamente un tetrámero. Cada tetrámero se compone típicamente de dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, cada par tiene una cadena "ligera" (normalmente con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (normalmente con un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican como mu, delta, gamma, alfa o épsilon y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, que incluyen, entre otras, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tiene subclases, que incluyen, entre otras, IgM1 e IgM2. Por lo tanto, "isotipo", como se usa en el presente documento, significa cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Los isotipos de inmunoglobulina humana conocidos son IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD e IgE. Debe entenderse que los anticuerpos terapéuticos también pueden comprender híbridos de cualquier combinación de isotipos y/o subclases.
En muchas realizaciones, los isotipos de IgG se usan en la presente invención, encontrando IgG1 un uso particular en varias aplicaciones.
La porción del terminal amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos. En la región variable, se juntan tres bucles para cada uno de los dominios V de la cadena pesada y la cadena ligera para formar un sitio de unión a antígeno. Cada uno de los bucles se denomina región determinante de complementariedad (en lo sucesivo, "CDR"), en la que la variación en la secuencia de aminoácidos es la más significativa. "Variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de la región variable difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos. La variabilidad dentro de la región variable no se distribuye uniformemente. En cambio, las regiones V consisten en tramos relativamente invariantes llamados regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos separados por regiones más cortas de extrema variabilidad llamadas "regiones hipervariables" que tienen cada una de 9-15 aminoácidos de longitud o más.
Cada VH y VL se compone de tres regiones hipervariables ("regiones determinantes de complementariedad", "CDR") y cuatro FR, organizadas desde el extremo amino hasta el terminal carboxilo en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2- FR3-CDR3-FR4.
La región hipervariable generalmente abarca residuos de aminoácidos de aproximadamente los residuos de aminoácidos 24-34 (LCDR1; "L" indica cadena ligera), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3) en la región variable de cadena ligera y alrededor de aproximadamente 31-35B (Hc DR1; "H" indica cadena pesada), 50-65 (HCDR2) y 95-102 (HCDR3) en la región variable de cadena pesada; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTERe St , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) y/o aquellos residuos que forman un bucle hipervariable (por ejemplo, residuos 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) y 91-96 (LCDR3) en la región variable de cadena ligera y 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) y 96-101 (HCDr 3) en la región variable de cadena pesada; Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. Las CDR específicas de la invención se describen a continuación.
A lo largo de la presente memoria descriptiva, el sistema de numeración de Kabat se usa generalmente cuando se hace referencia a un residuo en el dominio variable (aproximadamente, los residuos 1-107 de la región variable de la cadena ligera y los residuos 1-113 de la región variable de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat et al., citado anteriormente (1991)).
Las CDR contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno, o más específicamente, al sitio de unión al epítopo de los anticuerpos. El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que se une específicamente una inmunoglobulina o un anticuerpo. Los epítopos pueden formarse tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos se retienen típicamente al exponerlos a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por plegamiento terciario se pierden típicamente en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo incluye típicamente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Como se describe en el presente documento, los métodos para determinar qué epítopos están unidos por un anticuerpo dado (es decir, mapeo de epítopos) son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación, en los que los péptidos superpuestos o contiguos de LY75 se prueban para determinar la reactividad con el anticuerpo anti-LY75 dado. Los métodos para determinar la conformación espacial de epítopos incluyen técnicas en el arte y las descritas en este documento, por ejemplo, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional (véase, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, GE Morris, Ed. (1996)). El término "mapeo de epítopos" se refiere al proceso de identificación de los determinantes moleculares para el reconocimiento de anticuerpo-antígeno.
La porción del terminal carboxilo de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Kabat et al. recogieron numerosas secuencias primarias de las regiones variables de cadenas pesadas y cadenas ligeras. Basándose en el grado de conservación de las secuencias, clasificaron las secuencias primarias individuales en la CDR y el marco y elaboraron una lista de las mismas (véase SEQUENCES OF IMMUNo Lo GICAL INTEREST, 5a edición, publicación del NIH, No. 91-3242, EA Kabat et al.).
En la subclase de inmunoglobulinas IgG, hay varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. Por "dominio de inmunoglobulina (Ig)" en el presente documento se entiende una región de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria distinta. Son de interés en la presente invención los dominios de cadena pesada, incluidos los dominios pesados constantes (CH) y los dominios bisagra. En el contexto de los anticuerpos IgG, los isotipos IgG tienen cada uno tres regiones CH. Por consiguiente, los dominios "CH" en el contexto de IgG son los siguientes: "CH1" se refiere a las posiciones 118-220 de acuerdo con el índice EU como en Kabat. "CH2" se refiere a las posiciones 237-340 de acuerdo con el índice EU como en Kabat, y "CH3" se refiere a las posiciones 341-447 de acuerdo con el índice EU como en Kabat.
Otro tipo de dominio DE Ig de cadena pesada es la región bisagra. Por "bisagra" o "región bisagra" o "región bisagra del anticuerpo" o "región bisagra de inmunoglobulina" se entiende en el presente documento el polipéptido flexible que comprende los aminoácidos entre el primer y segundo dominios constantes de un anticuerpo. Estructuralmente, el dominio CH1 de IgG termina en la posición 220 de EU y el dominio CH2 de IgG comienza en el residuo de la posición 237 de EU. Por lo tanto, para IgG, la bisagra del anticuerpo se define en el presente documento para incluir las posiciones 221 (D221 en IgG1) a 236 (G236 en IgG1), en las que la numeración está de acuerdo con el índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, por ejemplo, en el contexto de una región Fc, la bisagra inferior está incluida, con la "bisagra inferior" generalmente refiriéndose a las posiciones 226 o 230.
De particular interés en la presente invención son las regiones Fc. Por "Fc" o "región Fc" o "dominio Fc" como se usa en este documento se entiende el polipéptido que comprende la región constante de un anticuerpo excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante y, en algunos casos, parte de la bisagra. Por lo tanto, Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG, los últimos tres dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, y la bisagra flexible de terminal N para estos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, el dominio Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cy2 y Cy3 (Cy2 y Cy3) y la región de bisagra inferior entre Cy1 (Cy1) y Cy2 (Cy2). Aunque los límites de la región Fc pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana se define habitualmente para incluir los residuos C226 o P230 en su terminal carboxilo, en el que la numeración está de acuerdo con el índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, como se describe con más detalle a continuación, se realizan modificaciones de aminoácidos en la región Fc, por ejemplo, para alterar la unión a uno o más receptores FcyR o al receptor FcRn.
En algunas realizaciones, los anticuerpos son de longitud completa. Por "anticuerpo de longitud completa" en el presente documento se entiende la estructura que constituye la forma biológica natural de un anticuerpo, que incluye regiones variables y constantes, que incluyen una o más modificaciones como se describe en el presente documento.
Alternativamente, los anticuerpos pueden ser una variedad de estructuras, que incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados en el presente documento "miméticos de anticuerpos"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpos (a veces denominados "conjugados de anticuerpos") y fragmentos de cada uno, respectivamente. Las estructuras que se basan en el uso de un conjunto de CDR se incluyen dentro de la definición de "anticuerpo".
En una realización, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos específicos incluyen, pero no se limitan a, (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546) que consta de una única región variable, (v) regiones CDR aisladas, (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en las que un dominio VH y un dominio VL están enlazados mediante un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al., 1988, Science 242: 423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883), (viii) Fv biespecífico de cadena sencilla (documento WO 03/11161) y (ix) "diacuerpos" o "triacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión de genes (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326: 461-479; documento WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 6444-6448).
Anticuerpos quiméricos y humanizados
En algunas realizaciones, el anticuerpo puede ser una mezcla de diferentes especies, por ejemplo, un anticuerpo quimérico y/o un anticuerpo humanizado. Es decir, en la presente invención, los conjuntos de c Dr pueden usarse con regiones estructurales y constantes distintas de las descritas específicamente por secuencia en el presente documento.
En general, tanto los "anticuerpos quiméricos" como los "anticuerpos humanizados" se refieren a anticuerpos que combinan regiones de más de una especie. Por ejemplo, los "anticuerpos quiméricos" comprenden tradicionalmente la región o regiones variables de un ratón (o rata, en algunos casos) y la región o regiones constantes de un ser humano. "Anticuerpos humanizados" generalmente se refiere a anticuerpos no humanos a los que se les han intercambiado las regiones marco de dominio variable por secuencias encontradas en anticuerpos humanos. Generalmente, en un anticuerpo humanizado, el anticuerpo completo, excepto las CDR, está codificado por un polinucleótido de origen humano o es idéntico a dicho anticuerpo excepto dentro de sus CDR. Las CDR, algunas o todas codificadas por ácidos nucleicos que se originan en un organismo no humano, se injertan en el marco de lamina beta de una región variable de anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad está determinada por las CDR injertadas. La creación de tales anticuerpos se describe en, por ejemplo, en el documento WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239: 1534-1536. La "retromutación" de los residuos del marco aceptor seleccionado con los correspondientes residuos del donante se requiere a menudo para recuperar la afinidad que se pierde en el constructo injertado inicial (documentos US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213). El anticuerpo humanizado también comprenderá de manera óptima al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana, y por lo tanto comprenderá típicamente una región Fc humana. Los anticuerpos humanizados también se pueden generar utilizando ratones con un sistema inmunológico genéticamente modificado. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20: 639-654. Se conocen bien en la técnica una variedad de técnicas y métodos para humanizar y remodelar anticuerpos no humanos (véase Tsurushita & Vásquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (e E. UU.), y las referencias allí citadas). Los métodos de humanización incluyen, pero no se limitan a métodos descritos en Jones et al., 1986, Nature 321: 522-525; Riechmann et al., 1988; Nature 332: 323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86: 10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89: 4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57 (20): 4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11: 321-8. La humanización u otros métodos para reducir la inmunogenicidad de regiones variables de anticuerpos no humanos pueden incluir métodos de reparación, como se describe, por ejemplo, en Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 91: 969-973. En una realización, el anticuerpo original ha madurado por afinidad, como se conoce en la técnica. Pueden emplearse métodos basados en estructuras para humanización y maduración por afinidad, por ejemplo, como se describe en el documento USSN 11/004.590. Pueden emplearse métodos basados en selección para humanizar y/o madurar por afinidad regiones variables de anticuerpos, incluidos, entre otros, los métodos descritos en Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294: 151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272 (16): 10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 (37): 22611­ 22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16 (10): 753-759. Otros métodos de humanización pueden implicar el injerto de solo partes de las CDR, incluidos, entre otros, los métodos descritos en el documento USSN 09/810.510; Tan et al., 2002, J. Immunol. 169: 1119-1125; De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169: 3076-3084.
En una realización, los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos multiespecíficos y, en particular, anticuerpos biespecíficos, también denominados a veces "diacuerpos". Estos son anticuerpos que se unen a dos (o más) antígenos diferentes, o diferentes epítopos del mismo antígeno. Los diacuerpos pueden fabricarse de diversas formas conocidas en la técnica (Holliger y Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449), por ejemplo, prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos.
En una realización, el anticuerpo es un minicuerpo. Los minicuerpos son proteínas similares a anticuerpos minimizadas que comprenden un scFv unido a un dominio CH3. Hu et al., 1996, Cancer Res. 56: 3055-3061. En algunos casos, el scFv se puede unir a la región Fc y puede incluir parte o la región de bisagra completa. Cabe señalar que los minicuerpos se incluyen dentro de la definición de "anticuerpo" a pesar de que no tiene un conjunto completo de CDR.
Los anticuerpos de la presente invención son generalmente aislados o recombinantes. "Aislado", cuando se usa para describir los diversos polipéptidos divulgados en este documento, significa un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de una célula o cultivo celular a partir del cual se expresó. Por lo tanto, un anticuerpo aislado pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente al LY75 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de LY75). Por lo tanto, un anticuerpo "aislado" es uno que se encuentra en una forma que normalmente no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, de origen no natural). Un anticuerpo aislado como se define en el presente documento puede, en una realización, incluir al menos un aminoácido que no se encuentra en el anticuerpo de origen "natural". Este aminoácido puede introducirse mediante adición o sustitución. Se entenderá que el aminoácido introducido puede ser un aminoácido de origen natural o no natural. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención son proteínas recombinantes, proteínas aisladas o proteínas sustancialmente puras. Una proteína "aislada" no está acompañada por al menos parte del material con el que normalmente está asociada en su estado natural, por ejemplo, constituye al menos aproximadamente el 5%, o al menos aproximadamente el 50% en peso de la proteína total en una muestra determinada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir del 5 al 99,9% del peso del contenido total de proteína dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, la proteína se puede producir a una concentración significativamente mayor mediante el uso de un promotor inducible o un promotor de alta expresión, de modo que la proteína se produzca con mayores niveles de concentración. En el caso de las proteínas recombinantes, la definición incluye la producción de un anticuerpo en una amplia variedad de organismos y/o células huésped que se conocen en la técnica en las que no se produce de forma natural. Normalmente, un polipéptido aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. Un "anticuerpo aislado" se refiere a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas. Por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a LY75 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de LY75.
Los anticuerpos monoclonales aislados, que tienen diferentes especificidades, se pueden combinar en una composición bien definida. Por lo tanto, por ejemplo, el anticuerpo de la invención se puede incluir o excluir opcional e individualmente en una formulación, como se analiza más adelante.
Los anticuerpos anti-LY75 de la presente invención se unen específicamente a LY75 (por ejemplo, la SEQ ID No: 15). "Unión específica" o "se une específicamente a" o es "específico para" un antígeno particular o un epítopo significa una unión que es mediblemente diferente de una interacción no específica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, determinando la unión de una molécula en comparación con la unión de una molécula de control, que generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de unión. Por ejemplo, la unión específica se puede determinar por competencia con una molécula de control que sea similar al objetivo.
La unión específica para un antígeno particular o un epítopo se puede exhibir, por ejemplo, por un anticuerpo que tiene una Kd para un antígeno o epítopo de al menos aproximadamente 10-4 M, al menos aproximadamente 10-5 M, al menos alrededor de 10-6 M, al menos alrededor de 10-7 M, al menos alrededor de 10-8 M, al menos alrededor de 10-9 M, alternativamente al menos alrededor de 10-10 M, al menos aproximadamente 10-11 M, al menos aproximadamente 10-12 M o más, cuando Kd se refiere a una tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Normalmente, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno tendrá una Kd que es 20, 50, 100, 500, 1000, 5.000, 10.000 o más veces mayor para una molécula de control con respecto al antígeno o epítopo. Sin embargo, en la presente invención, cuando se administran ADC de los anticuerpos LY75 de la invención, lo importante es que la Kd sea suficiente para permitir la internalización y, por lo tanto, la muerte celular sin efectos secundarios significativos.
Además, la unión específica para un antígeno o un epítopo particular puede ser exhibida, por ejemplo, por un anticuerpo que tiene una Ka o Ka para un antígeno o epítopo de al menos 20, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000 o más veces mayor para el epítopo en relación con un control, en el que Ka o Ka se refiere a una tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
Se pueden realizar ensayos estándar para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia LY75 a nivel de proteína o celular y son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ELISA, transferencias Western, RIA, ensayos BIAcore® y análisis de citometría de flujo. Los ensayos adecuados se describen en detalle en los Ejemplos. La cinética de unión (por ejemplo, afinidad de unión) de los anticuerpos también puede evaluarse mediante ensayos estándar conocidos en la técnica, tales como por el análisis del sistema BIAcore®. Para evaluar la unión a células tumorales de células B Raji o Daudi, las células Raji (ATCC Depósito No. CCL-86) o Daudi (ATCC Depósito No. CCL-213) se pueden obtener de fuentes disponibles públicamente, tal como la American Type Culture Collection, y se utilizan en ensayos estándar, tales como análisis de citometría de flujo.
Anticuerpos LY75
La presente invención proporciona anticuerpos LY75 que se unen a LY75 (SEQ ID No: 15) y pueden internalizarse cuando se ponen en contacto con células que expresan LY75 en la superficie celular o pueden provocar una respuesta de ADCC en presencia de células efectoras o provocar una respuesta de células T citotóxicas en presencia de células efectoras. Estos anticuerpos se denominan en el presente documento anticuerpos "anti-LY75" o, para facilitar la descripción, "anticuerpos LY75".
Los anticuerpos LY75 se internalizan al entrar en contacto con células, particularmente células tumorales, que expresan LY75 en la superficie. Es decir, los anticuerpos LY75, como se definen en el presente documento, que también comprenden conjugados de fármacos, son internalizados por las células tumorales, lo que da como resultado la liberación del fármaco y la posterior muerte celular, lo que permite el tratamiento de cánceres que muestran expresión de LY75. La internalización en este contexto se puede medir de varias formas. En una realización, los anticuerpos LY75 de la invención se ponen en contacto con células, tales como una línea celular como se describe en este documento, usando ensayos estándar tales como MAbZap. Para el experto en la materia estará claro que el ensayo MAbZap es representativo del efecto que se esperaría observar con un conjugado anticuerpo-fármaco (ADC). En el último caso, el ADC se internalizaría, llevando así el fármaco a la célula. Un fármaco tóxico tendría la capacidad de matar la célula, es decir, de matar la célula cancerosa objetivo. Los expertos en la técnica aceptan fácilmente los datos de los ensayos MAbZap como representativos de los ensayos de ADC (Kohls, M y Lappi, D., [2000] Biotechniques, vol. 28, No. 1, 162-165).
En estas realizaciones de ensayo in vitro, se añaden los anticuerpos LY75 de la invención, junto con un anticuerpo anti-LY75 que comprende una toxina; por ejemplo, el anticuerpo lY75 puede ser murino o humanizado y el anticuerpo anti-LY75 puede ser anti-murino o anti-humanizado y contener una toxina tal como saporina. Tras la formación del complejo [anticuerpo LY75 de la invención] -[conjugado anticuerpo anti-LY75-fármaco], el complejo se internaliza y se libera el fármaco (por ejemplo, saporina), dando como resultado la muerte celular. Solo después de la internalización se libera el fármaco y, por lo tanto, las células permanecen viables en ausencia de internalización. Como se describe a continuación, sin estar ligado a ninguna teoría, en aplicaciones terapéuticas, el anticuerpo anti-LY75 contiene la toxina y, tras la internalización, el enlace entre el anticuerpo y la toxina se escinde, liberando la toxina y matando la célula.
Además, los anticuerpos LY75 provocan una respuesta de ADCC en presencia de células efectoras, particularmente células tumorales, que expresan LY75 en la superficie.
En una realización, el anticuerpo comprende las regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada y ligera (CDR) o regiones variables (VR) del anticuerpo particular descrito en el presente documento (por ejemplo, denominado en el presente documento "LY75_A1"). Por consiguiente, en una realización, el anticuerpo comprende los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de la cadena pesada (VH) del anticuerpo LY75_A1 que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 1, y los dominios CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo LY75_A1 que tiene la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 2.
En otra realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 5; una segunda vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 6; y una tercera vhCDR que comprende SEQ ID NO: 7; y una región variable de cadena ligera que comprende una primera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 8; una segunda vlCDR que comprende la s Eq ID NO: 9; y una tercera vlCDR que comprende la SEQ ID NO: 10.
En otro ejemplo, los anticuerpos descritos se unen a LY75 humano e incluyen una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 1, y modificaciones de secuencia conservadoras de la misma. El anticuerpo puede incluir además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende la SEQ ID NO: 2 y modificaciones de secuencia conservadoras de la misma.
En una realización adicional, los anticuerpos de la invención se unen a LY75 humano e incluyen una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1 y/o 2, respectivamente. Como se usa en este documento, el término modificación de secuencia conservadora se refiere, por ejemplo, a la sustitución de un aminoácido por un aminoácido que tiene características similares. Es de conocimiento general común para un experto en la técnica qué tales sustituciones pueden considerarse conservadoras. Otras modificaciones que pueden considerarse modificaciones de secuencia conservadoras incluyen, por ejemplo, glicosilación.
Anticuerpos aislados que incluyen regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 91%, o al menos 92%, o al menos 93%, o al menos el 94%, o al menos el 95%, o al menos el 96%, o al menos el 97%, o al menos el 98%, o al menos el 99%, o más identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias anteriores también se incluyen en la presente invención. También pretenden ser abarcados por la presente invención los valores intermedios para los valores mencionados anteriormente, por ejemplo, regiones variables de cadena pesada y ligera que tienen al menos 80-85%, 85-90%, 90-95% o 95-100% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias anteriores. En una realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 1 o una secuencia que es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 1. En otra realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 2 o una secuencia que es al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98%, al menos 99% idéntica a la SEQ ID NO: 2. En otra realización, el anticuerpo comprende una región marco de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, en al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica al marco de la región variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 1 que comprende las SEQ ID NOs: 16 , 17 y 18. En otra realización, el anticuerpo comprende una región marco de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90%, al menos el 91%, al menos el 92%, al menos el 93%, al menos el 94%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos 98%, al menos 99% idéntica al marco de la región variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 2 que comprende las SEQ ID NOs: 19, 20 y 21.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo anti-LY75 (denominado en el presente documento "anticuerpo LY75_A1") que comprende las siguientes CDR, así como variantes que contienen un número limitado de variantes de aminoácidos:
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En el presente documento también se divulgan cadenas pesadas y ligeras variables que comprenden los conjuntos de CDR de la invención, así como cadenas pesadas y ligeras de longitud completa (por ejemplo, que también comprenden regiones constantes). Como apreciarán los expertos en la técnica, los conjuntos de CDR de la invención pueden incorporarse en regiones constantes murinas, humanizadas o humanas (incluidas las regiones marco). En consecuencia, la presente invención proporciona cadenas ligeras y pesadas variables que son al menos aproximadamente 90% -99% idénticas a las SEQ ID divulgadas en este documento, con 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 y 99% encontrando todas uso en la presente invención.
Anticuerpos que se unen al mismo epítopo que los anticuerpos LY75 de la invención
También se describen anticuerpos que se unen al mismo epítopo en el LY75 humano como cualquiera de los anticuerpos monoclonales LY75 de la invención. El término "se une al mismo epítopo" con referencia a dos o más anticuerpos significa que los anticuerpos compiten por unirse a un antígeno y se unen al mismo, solapando o abarcando segmentos continuos o discontinuos de aminoácidos. Los expertos en la técnica entienden que la frase "se une al mismo epítopo" no significa necesariamente que los anticuerpos se unen exactamente a los mismos aminoácidos, aunque en un ejemplo se puede definir como tal. En otro ejemplo, los aminoácidos precisos a los que se unen los anticuerpos pueden diferir. Por ejemplo, un primer anticuerpo puede unirse a un segmento de aminoácidos que está completamente abarcado por el segmento de aminoácidos unido por un segundo anticuerpo. En otro ejemplo, un primer anticuerpo se une a uno o más segmentos de aminoácidos que se superponen significativamente a uno o más segmentos unidos por el segundo anticuerpo. Para los propósitos de este documento, se considera que tales anticuerpos "se unen al mismo epítopo".
Por lo tanto, también se describen anticuerpos que se unen a un epítopo en LY75 que comprende todo o una porción de un epítopo reconocido por los anticuerpos particulares descritos en este documento (por ejemplo, la misma región o una región de solapamiento o una región entre o que abarca la región). También se describen anticuerpos que se unen específicamente a al menos uno, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, péptidos seleccionados del grupo que comprende las SEQ ID NOs: 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o 37 o un fragmento de las mismas, en las que dicho fragmento comprende al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 aminoácidos contiguos. En un ejemplo adicional, el epítopo reconocido por los anticuerpos comprende al menos un péptido, al menos dos o al menos tres péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 27, 29, 30, 34, 35, 36 o 37 o fragmentos de los mismos en los que dichos fragmentos comprenden al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 aminoácidos contiguos. En un ejemplo adicional, el epítopo reconocido por los anticuerpos comprende al menos un péptido, por ejemplo, uno, dos o tres péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 30, 36 y 37 o fragmentos de los mismos, en los que dichos fragmentos comprenden al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6, al menos 7, al menos 8, al menos 9 o al menos 10 aminoácidos contiguos.
También se describen anticuerpos que se unen al mismo epítopo y/o anticuerpos que compiten por unirse a un LY75 humano con los anticuerpos descritos en el presente documento. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo o compiten por la unión pueden identificarse usando técnicas de rutina. Tales técnicas incluyen, por ejemplo, un inmunoensayo, que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno objetivo, es decir, un ensayo de unión competitiva. La unión competitiva se determina en un ensayo en el que la inmunoglobulina bajo prueba inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común, tal como LY75. Se conocen numerosos tipos de ensayos de unión competitiva, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto (RIA) en fase sólida, inmunoensayo enzimático directo o indirecto (EIA) en fase sólida, ensayo de competición en sándwich (véase Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242 (1983)); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (véase Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614 (1986)); ensayo marcado en forma directa en fase sólida, ensayo sándwich marcado en forma directa en fase sólida (véase Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcación directa en fase sólida usando como marcador I-125 (véase Morel et al., Mol. Immunol. 25 (1): 7 (1988)); EIA de biotina-avidina directo en fase sólida (Cheung et al., Virology 176: 546 (1990)); y RIA marcado en forma directa (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Normalmente, tal ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de prueba no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o células en presencia de la inmunoglobulina de prueba. Por lo general, la inmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Por lo general, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-99% o más.
Otras técnicas incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítopos, tales como análisis de rayos X de cristales de complejos de antígeno: anticuerpo, que proporcionan resolución atómica del epítopo. Otros métodos controlan la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno en los que la pérdida de unión debido a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno a menudo se considera una indicación de un componente del epítopo. Además, también se pueden usar métodos combinatorios informáticos para mapeo de epítopos. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés para aislar por afinidad péptidos cortos específicos de bibliotecas de péptidos de presentación en fagos combinatorios. Los péptidos se consideran entonces como guías para la definición del epítopo correspondiente al anticuerpo usado para cribar la biblioteca de péptidos. Para el mapeo de epítopos, también se han desarrollado algoritmos informáticos que se ha demostrado que mapean epítopos conformacionales discontinuos.
En un ejemplo particular, el anticuerpo compite por unirse a LY75 con un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente, o secuencias de aminoácidos al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 96%, al menos el 97%, al menos el 98% o al menos el 99% idénticas a las mismas. En otro ejemplo, el anticuerpo compite por unirse a LY75 con un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1 y 2 (LY75_A1).
Otros anticuerpos descritos se unen a un epítopo en LY75 reconocido por los anticuerpos descritos en el presente documento. En otro ejemplo particular, el anticuerpo se une a un epítopo en LY75 reconocido por un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente, o secuencias de aminoácidos al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98% o al menos 99% idénticas a los mismas. En otra realización, el anticuerpo se une a un epítopo en LY75 reconocido por un anticuerpo que comprende regiones variables de cadena pesada y/o ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1 y 2 (LY75).
Caracterización de anticuerpos monoclonales para LY75
Los anticuerpos monoclonales de la invención pueden caracterizarse por unirse a LY75 usando una variedad de técnicas conocidas. Generalmente, los anticuerpos se caracterizan inicialmente por ELISA. Brevemente, las placas de microtitulación se pueden recubrir con LY75 purificado en PBS y luego se pueden bloquear con proteínas irrelevantes tales como albúmina de suero bovino (BSA) diluida en PBS. Se añaden diluciones de plasma de ratones inmunizados con LY75 a cada pocillo y se incuban durante 1-2 horas a 37 °C. Las placas se lavan con PBS/Tween 20 y luego se incuban con un reactivo policlonal específico de Fc de IgG antihumano de cabra conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37 °C. Después del lavado, las placas se revelan con sustrato ABTS y se analizan a una DO de 405. Preferiblemente, los ratones que desarrollan los títulos más altos se utilizarán para las fusiones.
Puede usarse un ensayo ELISA como se describió anteriormente para seleccionar anticuerpos y, por lo tanto, hibridomas que producen anticuerpos que muestran reactividad positiva con el inmunógeno LY75. Los hibridomas que se unen, preferiblemente con alta afinidad, a LY75 pueden subclonarse y caracterizarse adicionalmente. A continuación, se puede elegir un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células originales (mediante ELISA), para elaborar un banco de células y para la purificación de anticuerpos.
Para purificar anticuerpos anti-LY75, se pueden cultivar hibridomas seleccionados en botellas rotatorias, matraces giratorios de dos litros u otros sistemas de cultivo. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-Sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ) para purificar la proteína. Después del intercambio de tampón por PBS, la concentración se puede determinar mediante DO280 usando un coeficiente de extinción de 1,43 o preferiblemente mediante análisis nefelométrico. IgG puede comprobarse mediante electroforesis en gel y mediante un método específico de antígeno.
Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-LY75 seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo se puede biotinilar usando reactivos disponibles comercialmente (Pierce, Rockford, iL). La unión de MAb biotinilado se puede detectar con una sonda marcada con estreptavidina. Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se pueden realizar ELISA de isotipo usando técnicas reconocidas en el arte. Por ejemplo, los pocillos de las placas de microtitulación se pueden recubrir con 10 pg/ml de anti-Ig durante la noche a 4 °C. Después del bloqueo con BSA al 5%, las placas se hacen reaccionar con 10 pg/ml de anticuerpos monoclonales o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. A continuación, los pocilios se pueden hacer reaccionar ya sea con IgGI u otras sondas conjugadas específicas de isotipo. Las placas se desarrollan y analizan como se describió anteriormente.
Para probar la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan LY75, puede usarse citometría de flujo. Brevemente, se mezclan líneas celulares y/o PBMC humanas que expresan LY75 unido a membrana (cultivado en condiciones de crecimiento estándar) con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene BSA al 0,1% a 4 °C durante 1 hora. Después del lavado, las células se hacen reaccionar con el anticuerpo anti-IgG marcado con fluoresceína en las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras se pueden analizar mediante el instrumento FACScan utilizando propiedades de dispersión lateral y de luz para seleccionar las células individuales y se determina la unión de los anticuerpos marcados. Se puede usar un ensayo alternativo que usa microscopía de fluorescencia (además o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células pueden teñirse con exactitud como se describió anteriormente y examinarse mediante microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener una sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antígeno.
Las IgG anti-LY75 se pueden ensayar adicionalmente para determinar la reactividad con el antígeno LY75 mediante transferencia Western. Brevemente, se pueden preparar extractos celulares de células que expresan LY75 y someterlas a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transferirán a membranas de nitrocelulosa, se bloquearán con suero de ratón al 20% y se sondarán con los anticuerpos monoclonales que se analizarán. La unión de IgG puede detectarse usando fosfatasa alcalina anti-IgG y desarrollarse con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).
Los métodos para analizar la afinidad de unión, la reactividad cruzada y la cinética de unión de varios anticuerpos anti-LY75 incluyen ensayos estándar conocidos en la técnica, por ejemplo, análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR) BiacoreMR usando un instrumento de SPR BiacoreMR 2 0 O0 (Biacore AB, Uppsala, Suecia).
El anticuerpo se une específicamente a LY75 humano que comprende la SEQ ID NO: 15. Preferiblemente, un anticuerpo de la invención se une a LY75 humano con alta afinidad.
Preferiblemente, un anticuerpo de la invención se une a una proteína LY75 con una Kd de 5 x 1°'8 <-8> M o menos, se une a una proteína LY75 con una Kd de 2 x 1°'8 M o menos, se une a una proteína LY75 con una Kd de 5 x 1°'9 <­ 9> M o menos, se une a una proteína LY75 con una Kd de 4 x 1°'9 <-9> M o menos, se une a una proteína LY75 con una Kd de 3 x 1°'9 M o menos, se une a una proteína LY75 con una Kd de 2 x 1°'9 M o menos, se une a una proteína LY75 con una Kd de 1 x 1°'9 M o menos, se une a una proteína LY75 con una Kd de 5 x 10'1° A {-10} M o menos, o se une a una proteína LY75 con una Kd de 1 x 10'1° M o menos.
En un ejemplo, los anticuerpos compiten (por ejemplo, compiten de forma cruzada) por unirse a LY75 con los anticuerpos anti-LY75 particulares descritos en este documento (por ejemplo, LY75_A1). Dichos anticuerpos competidores pueden identificarse con base en su capacidad para inhibir competitivamente la unión a LY75 de uno o más de los mAb en ensayos de unión estándar a LY75. Por ejemplo, pueden usarse ensayos estándar ELISA en los que se inmoviliza una proteína LY75 humana recombinante en una placa, uno de los anticuerpos está marcado en forma fluorescente y se evalúa la capacidad de los anticuerpos no marcados para competir fuera de la unión del anticuerpo marcado. Adicional o alternativamente, se puede utilizar un análisis BIAcore para evaluar la capacidad de los anticuerpos para competir de forma cruzada. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de un anticuerpo anti-LY75 de la invención al LY75 humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con el anticuerpo por la unión al LY75 humano.
En un ejemplo, el anticuerpo que compite es un anticuerpo que se une al mismo epítopo en LY75 humano como los anticuerpos monoclonales anti-LY75 particulares descritos en este documento (por ejemplo, LY75_A1). Pueden usarse técnicas estándar de mapeo de epítopos, tales como la cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear bidimensional, para determinar si un anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo de referencia (vease, por ejemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, GE Morris, Ed. (1996)).
En un ejemplo, el anticuerpo que compite por la unión a LY75 y/o que se une al mismo epítopo en LY75 humano es un anticuerpo humano.
Una vez que se ha aislado un único mAb anti-LY75 arquetípico que tiene las propiedades deseadas descritas en el presente documento, se pueden generar otros mAb con propiedades similares, por ejemplo, que tengan el mismo epítopo. Por ejemplo, se pueden inmunizar ratones con LY75 como se describe en el presente documento, se pueden producir hibridomas y se pueden cribar los mAb resultantes para determinar la capacidad de competir con el mAb arquetípico por la unión a LY75. Los ratones también pueden inmunizarse con un fragmento más pequeño de LY75 que contiene el epítopo al que se une el mAb arquetípico. El epítopo se puede localizar, por ejemplo, mediante el cribado de la unión a una serie de péptidos superpuestos que abarcan LY75. Alternativamente, se puede usar el método de Jespers et al., Biotechnology 12: 899, 1994 para guiar la selección de los mAb que tienen el mismo epítopo y, por lo tanto, propiedades similares al mAb arquetípico. Usando la presentación en fagos, primero la cadena pesada del anticuerpo arquetípico se empareja con un repertorio de cadenas ligeras (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb de unión a LY75, y luego la nueva cadena ligera se empareja con un repertorio de cadenas pesadas (preferiblemente humanas) para seleccionar un mAb de unión a LY75 (preferiblemente humano) que tenga el mismo epítopo que el mAb arquetípico. Alternativamente, pueden obtenerse variantes del mAb arquetípico mediante mutagénesis de ADNc que codifica las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.
Mapeo de epítopos, por ejemplo, como se describe en Champe et al., (1995) J. Biol. Chem. 270: 1388-1394, se puede realizar para determinar si el anticuerpo se une a un epítopo de interés. También se puede utilizar la "mutagénesis de escaneo de alanina", como lo describen Cunningham y Wells (1989) Science 244: 1081-1085, o alguna otra forma de mutagénesis puntual de residuos de aminoácidos en LY75 humano para determinar el epítopo funcional para un anticuerpo anti-LY75 de la presente invención. Los estudios de mutagénesis, sin embargo, también pueden revelar residuos de aminoácidos que son cruciales para la estructura tridimensional general de LY75 pero que no están directamente involucrados en los contactos anticuerpo-antígeno y, por lo tanto, pueden ser necesarios otros métodos para confirmar un epítopo funcional determinado usando este método.
El epítopo unido por un anticuerpo específico también puede determinarse evaluando la unión del anticuerpo a péptidos que comprenden fragmentos de LY75 humano. Una serie de péptidos superpuestos que abarcan la secuencia de LY75 pueden sintetizarse y seleccionarse para la unión, por ejemplo, en un ELISA directo, un ELISA competitivo (en el que se evalúa la capacidad del péptido para prevenir la unión de un anticuerpo a LY75 unido a un pocillo de una placa de microtitulación), o en un chip. Dichos métodos de detección de péptidos pueden no ser capaces de detectar algunos epítopos funcionales discontinuos, es decir, epítopos funcionales que involucran residuos de aminoácidos que no son contiguos a lo largo de la secuencia primaria de la cadena polipeptídica LY75.
El epítopo unido por los anticuerpos de la presente invención también se puede determinar mediante métodos estructurales, tales como la determinación de la estructura cristalina de rayos X (por ejemplo, el documento WO2005/044853), modelado molecular y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), incluida la determinación de RMN de los tipos de cambio de HD de los hidrógenos de amida lábiles en LY75 cuando están libres y cuando están unidos en un complejo con un anticuerpo de interés (Zinn-Justin et al. (1992) Biochemistry 31, 11335­ 11347; Zinn-Justin et al. (1993) Biochemistry 32, 6884-6891).
Con respecto a la cristalografía de rayos X, la cristalización se puede lograr usando cualquiera de los métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Giege et al. (1994) Acta Crystallogr. D50: 339-350; McPherson (1990) Eur. J. Biochem.189: 1-23), incluyendo microlotes (por ejemplo, Chayen (1997) Structure 5: 1269-1274), difusión de vapor de gota colgante (por ejemplo, McPherson (1976) J. Biol. Chem. 251: 6300-6303), siembra y diálisis. Es deseable utilizar una preparación de proteína que tenga una concentración de al menos aproximadamente 1 mg/ml y preferiblemente de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml. La cristalización se puede lograr mejor en una solución precipitante que contenga polietilenglicol 1000-20.000 (PEG; peso molecular promedio que varía de aproximadamente 1000 a aproximadamente 20.000 Da), preferiblemente de aproximadamente 5000 a aproximadamente 7000 Da, más preferiblemente de aproximadamente 6000 Da, con concentraciones que varían de aproximadamente 10% a aproximadamente 30% (p/v). También puede ser deseable incluir un agente estabilizador de proteínas, por ejemplo, glicerol a una concentración que oscila entre aproximadamente el 0,5% y aproximadamente el 20%. También puede ser deseable una sal adecuada, tal como cloruro de sodio, cloruro de litio o citrato de sodio en la solución precipitante, preferiblemente en una concentración que varía de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 1000 mM. El precipitante se tampona preferiblemente a un pH de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 5,0, preferiblemente aproximadamente 4,0. Los tampones específicos útiles en la solución precipitante pueden variar y son bien conocidos en la técnica (Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Tercera ed., (1994) Springer-Verlag, Nueva York). Ejemplos de tampones útiles incluyen, pero no se limitan a, HEPES, Tris, MES y acetato. Los cristales se pueden cultivar en una amplia gama de temperaturas, que incluyen 2 °C, 4 °C, 8 °C y 26 °C.
Los cristales de anticuerpo: antígeno se pueden estudiar usando técnicas de difracción de rayos X bien conocidas y se pueden refinar usando software informático tal como X-PLOR (Universidad de Yale, 1992, distribuido por Molecular Simulations, Inc.; vease, por ejemplo, Blundell & Johnson (1985) Meth. Enzymol. 114 & 115, HW Wyckoff et al., Eds., Academic Press; publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2004/0014194), y BUSTER (Bricogne (1993) Acta Cryst. D49: 37-60; Bricogne (1997) Meth. Enzymol. 276A: 361-423, Carter & Sweet, eds.; Roversi et al., (2000) Acta Cryst. D56: 1313-1323).
Los ensayos de competición de anticuerpos, como se describe en el presente documento, pueden usarse para determinar si un anticuerpo "se une al mismo epítopo" como otro anticuerpo. Normalmente, competencia del 50% o más, 60% o más, 70% o más, tal como 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% , 96%, 97%, 98%, 99% o más, de un anticuerpo que se sabe que interactúa con el epítopo por un segundo anticuerpo en condiciones en las que el segundo anticuerpo está en exceso y el primero satura todos los sitios, es indicativo de que los anticuerpos se "unen al mismo epítopo". Para evaluar el nivel de competencia entre dos anticuerpos, por ejemplo, se pueden usar radioinmunoensayos o ensayos que usan otros marcadores para los anticuerpos. Por ejemplo, un antígeno LY75 se puede incubar con una cantidad saturante de un primer anticuerpo anti-LY75 o un fragmento de unión a antígeno del mismo conjugado con un compuesto marcado (por ejemplo, 3H, 125I, biotina o rubidio) en la presencia de la misma cantidad de un segundo anticuerpo anti-LY75 no marcado. A continuación, se evalúa la cantidad de anticuerpo marcado que se une al antígeno en presencia del anticuerpo de bloqueo no marcado y se compara con la unión en ausencia del anticuerpo de bloqueo no marcado. La competencia se determina por el cambio porcentual en las señales de unión en presencia del anticuerpo de bloqueo no marcado en comparación con la ausencia del anticuerpo de bloqueo. Por lo tanto, si hay una inhibición del 50% de la unión del anticuerpo marcado en presencia del anticuerpo de bloqueo en comparación con la unión en ausencia del anticuerpo de bloqueo, entonces existe una competencia entre los dos anticuerpos del 50%. Por lo tanto, la referencia a la competencia entre un primer y un segundo anticuerpo de 50% o más, 60% o más, 70% o más, tal como 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, significa que el primer anticuerpo inhibe la unión del segundo anticuerpo (o viceversa) al antígeno en un 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más (en comparación con la unión del antígeno por el segundo anticuerpo en ausencia del primer anticuerpo). Por lo tanto, la inhibición de la unión de un primer anticuerpo a un antígeno por un segundo anticuerpo del 50%, 60%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% o más indica que los dos anticuerpos se unen al mismo epítopo.
Modificaciones de anticuerpos
La presente invención proporciona además anticuerpos variantes, a veces también denominados "derivados de anticuerpos" o "análogos de anticuerpos". Es decir, hay una serie de modificaciones que se pueden realizar en los anticuerpos de la invención, que incluyen, entre otras, modificaciones de aminoácidos en las CDR (maduración por afinidad), modificaciones de aminoácidos en las regiones marco, modificaciones de aminoácidos en la región Fc, variantes de glicosilación, modificaciones covalentes de otros tipos (por ejemplo, para la unión de conjugados de fármacos, etc.).
Por "variante" en el presente documento se entiende una secuencia polipeptídica que difiere de la de un polipéptido original en virtud de al menos una modificación de aminoácido. En este caso, el polipéptido original son ya sea las cadenas ligeras o pesadas variables de longitud completa, enumeradas en las SEQ ID Nos: 1 o 2, respectivamente, o las regiones CDR o las regiones marco de las cadenas pesadas y ligeras enumeradas en las SEQ ID NOs 5-10 y 16-21. Las modificaciones de aminoácidos pueden incluir sustituciones, inserciones y eliminaciones, prefiriéndose las primeras en muchos casos. Se entenderá que una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservadora o no conservadora, prefiriéndose las sustituciones conservadoras. Además, dicha sustitución puede ser una sustitución con un aminoácido natural o no natural.
En general, las variantes pueden incluir cualquier número de modificaciones, siempre que la función del anticuerpo todavía esté presente, como se describe en el presente documento. Es decir, LY75_a 1, por ejemplo, el anticuerpo aún debería unirse específicamente al LY75 humano. De manera similar, si se generan variantes de aminoácidos con la región Fc, por ejemplo, los anticuerpos variantes deben mantener las funciones de unión al receptor requeridas para la aplicación o indicación particular del anticuerpo.
En este caso, las "variantes" se pueden preparar en las secuencias CDR enumeradas, el marco o las regiones Fc del anticuerpo.
Sin embargo, en general, se utilizan normalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones de aminoácidos ya que a menudo el objetivo es alterar la función con un número mínimo de modificaciones. En algunos casos, hay de 1 a 5 modificaciones (por ejemplo, sustituciones, inserciones o eliminaciones de aminoácidos individuales), y de 1-2, 1-3 y 1-4 también encuentran uso en muchas realizaciones. El número de modificaciones puede depender del tamaño de la región que se modifica; por ejemplo, en general, se desean menos modificaciones en las regiones CDR. El experto en la materia entenderá que incluso dentro de las regiones CDR, la ubicación de la modificación puede alterar significativamente el efecto. En una realización, las modificaciones se pueden realizar en cualquiera de CDR1, CDR2 o CDR3 de las cadenas pesadas y/o ligeras. En una realización adicional, las modificaciones se realizan en cualquiera de las CDR1 o CDR2 de las cadenas pesadas y/o ligeras. En otra realización más, las modificaciones se localizan en CDR1 de las cadenas pesadas y/o ligeras.
Debe tenerse en cuenta que el número de modificaciones de aminoácidos puede estar dentro de dominios funcionales: por ejemplo, puede ser deseable tener de 1 a 5 modificaciones en la región Fc de proteínas de tipo silvestre o modificadas, así como de 1 a 5 modificaciones en la región Fv, por ejemplo. Una secuencia polipeptídica variante poseerá preferiblemente al menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con las secuencias originales (por ejemplo, las regiones variables, las regiones constantes y/o las secuencias de cadena pesada y ligera y/o las c Dr de LY75_A1). Cabe señalar que, dependiendo del tamaño de la secuencia, el porcentaje de identidad dependerá del número de aminoácidos.
Por "sustitución de aminoácidos" o "sustitución" en el presente documento se entiende el reemplazo de un aminoácido en una posición particular en una secuencia polipeptídica original por otro aminoácido que puede ser un aminoácido natural o no natural. Por ejemplo, la sustitución S100A se refiere a un polipéptido variante en el que la serina en la posición 100 se reemplaza con alanina. Por "inserción de aminoácidos" o "inserción", como se usa en el presente documento, se entiende la adición de un aminoácido en una posición particular en una secuencia de polipéptido original. Por "eliminación de aminoácidos" o "eliminación", como se usa en este documento, se entiende la eliminación de un aminoácido en una posición particular en una secuencia de polipéptido original.
Por "polipéptido original", "proteína original", "polipéptido precursor" o "proteína precursora", como se usa en el presente documento, se entiende un polipéptido no modificado que se modifica posteriormente para generar una variante. En general, los polipéptidos originales del presente documento son LY75_A1. Por consiguiente, por "anticuerpo original", como se usa en el presente documento, se entiende un anticuerpo que se modifica para generar un anticuerpo variante.
Por "tipo silvestre" o "WT" o "nativo" en el presente documento se entiende una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que se encuentra en la naturaleza, incluidas las variaciones alélicas. Una proteína, polipéptido, anticuerpo, inmunoglobulina, IgG, etc. de WT tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de nucleótidos que no se ha modificado intencionalmente.
Por "región Fc variante" en el presente documento se entiende una secuencia de Fc que difiere de la de una secuencia de Fc de tipo silvestre en virtud de al menos una modificación de aminoácido. La variante Fc puede referirse al polipéptido Fc en sí mismo, composiciones que comprenden el polipéptido variante Fc o la secuencia de aminoácidos.
En algunas realizaciones, se realizan una o más modificaciones de aminoácidos en una o más de las CDR de LY75_A1. En general, solo 1 o 2 aminoácidos están sustituidos en una única CDR. Sin embargo, debe apreciarse que cualquier combinación sin sustituciones, 1 o 2 sustituciones en cualquier CDR puede combinarse de forma independiente y opcional con cualquier otra sustitución. Será evidente que se pueden realizar sustituciones en cualquiera de las 6 CDR. En una realización, se realizan sustituciones en CDR1 de las cadenas pesadas y/o ligeras.
En algunos casos, las modificaciones de aminoácidos en las CDR se denominan "maduración por afinidad". Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno que tiene una o más alteraciones en una o más CDR que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo original que no posee esas alteraciones. En algunos casos, aunque es raro, puede ser deseable disminuir la afinidad de un anticuerpo por su antígeno, pero esto generalmente no se prefiere.
La maduración por afinidad se puede realizar para aumentar la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno en al menos aproximadamente un 10%, aproximadamente un 20%, aproximadamente un 30%, aproximadamente un 40%, aproximadamente un 50%, aproximadamente un 60%, aproximadamente un 70% aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 100%, aproximadamente 110%, aproximadamente 120%, aproximadamente 130%, aproximadamente 140%, aproximadamente 150% o más, o 1, 2, 3, 4 a 5 veces en comparación con "el anticuerpo original". Los anticuerpos madurados por afinidad preferidos tendrán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad se producen mediante procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Marks et al., 1992, Biotechnology 10: 779-783 que describe la maduración por afinidad mediante la reorganización de dominios de cadena pesada variable (VH) y cadena ligera variable (VL). La mutagénesis aleatoria de CDR y/o residuos marco se describe en: Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154 (7): 3310-9; y Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896, por ejemplo.
Alternativamente, se pueden realizar modificaciones de aminoácidos en una o más de las CDR de los anticuerpos de la invención que son "silenciosas", por ejemplo, que no alteran significativamente la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Estos se pueden preparar por varias razones, incluida la optimización de la expresión (como se puede hacer para los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención).
Por lo tanto, en la definición de las CDR y los anticuerpos de la invención se incluyen las CDR variantes y los anticuerpos; es decir, los anticuerpos de la invención pueden incluir modificaciones de aminoácidos en una o más de las CDR de LY75_A1. Además, como se describe a continuación, las modificaciones de aminoácidos también pueden realizarse de forma independiente y opcional en cualquier región fuera de las CDR, incluidas las regiones marco y constantes como se describe en este documento.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-LY75 de la invención están compuestos por un dominio Fc variante. Como se conoce en la técnica, la región Fc de un anticuerpo interactúa con varios receptores y ligandos de Fc, impartiendo una serie de capacidades funcionales importantes denominadas funciones efectoras. Estos receptores de Fc incluyen, pero no se limitan a, (en seres humanos) FcyRI (CD64), incluidas las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), incluidas las isoformas FcYRIIa (incluidos los alotipos H131 y R131), FcYRIIb (incluidos FcYRIlb-1 y FcYRIIb-2) y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), incluidas las isoformas FcYRIIIa (incluidos los alotipos V158 y F158, correlacionada con la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)) y FcYRIIIb (incluidos los alotipos FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2), FcRn (el receptor neonatal), C1q (proteína del complemento involucrada en la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)) y FcRn (el receptor neonatal implicado en la semivida en suero). Se pueden realizar modificaciones adecuadas en una o más posiciones como se describe generalmente, por ejemplo, en la solicitud de patente de los Estados Unidos 11/841.654 y las referencias citadas en la misma, los documentos, US 2004/013210, US 2005/0054832, US 2006/0024298, US 2006/0121032, US 2006/0235208, US 2007/0148170, USSN 12/341.769, la patente de los Estados Unidos No. 6.737.056, la patente de los Estados Unidos No. 7.670.600, la patente de los Estados Unidos No. 6.086.875.
Además de las modificaciones descritas anteriormente, se pueden realizar otras modificaciones. Por ejemplo, las moléculas pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14: 1239-1245).
Además, las modificaciones en las cisteínas son particularmente útiles en aplicaciones de conjugado anticuerpofármaco (ADC), que se describen con más detalle a continuación. En algunas realizaciones, la región constante de los anticuerpos se puede modificar para que contenga una o más cisteínas que sean particularmente "reactivas con tiol", para permitir una colocación más específica y controlada de la fracción del fármaco. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 7.521.541.
Además, existe una variedad de modificaciones covalentes de anticuerpos que se pueden preparar como se describe a continuación.
Las modificaciones covalentes de anticuerpos se incluyen dentro del alcance de esta invención y, en general, pero no siempre, se realizan de forma postraduccional. Por ejemplo, varios tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar residuos de aminoácidos específicos del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos del terminal N o C.
Los residuos de cisteinilo se hacen reaccionar más comúnmente con a-haloacetatos (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para producir derivados de carboximetilo o carboxiamidometilo. Los residuos de cisteinilo también se pueden derivatizar por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-p-(5-imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, disulfuro de 2-piridil metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol.
Los residuos de histidilo se derivatizan por reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente específico para la cadena lateral de histidilo. También es útil el bromuro de parabromofenacilo; la reacción se realiza preferiblemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.
Los residuos de lisinilo y del terminal amino se hacen reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos de lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatizar residuos que contienen alfa-amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción catalizada por transaminasas con glioxilato.
Los residuos de arginilo se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se realice en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como con el grupo épsilon-amino de la arginina.
Se puede realizar la modificación específica de residuos de tirosilo, con particular interés en la introducción de marcadores espectrales en residuos de tirosilo mediante reacción con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Más comúnmente, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetil tirosilo y derivados 3-nitro, respectivamente. Los residuos de tirosilo se yodan usando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para uso en radioinmunoensayo, siendo adecuado el método de cloramina T descrito anteriormente.
Los grupos laterales carboxilo (aspartilo o glutamilo) se modifican selectivamente por reacción con carbodiimidas (R'-N=C=N-R'), en las que R y R' son grupos alquilo opcionalmente diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los residuos de aspartilo y glutamilo se convierten en residuos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones de amonio.
La derivatización con agentes bifuncionales es útil para entrecruzar anticuerpos con una matriz o superficie de soporte insoluble en agua para uso en una variedad de métodos, además de los métodos descritos a continuación. Los agentes de entrecruzamiento usados comúnmente incluyen, por ejemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldehído, ésteres de N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres homobifuncionales, incluyendo ésteres de disuccinimidilo como 3,3'-ditiobis(succinimidilpropionato) y maleimidas bifuncionales tales como bis-N-maleimido-1,8-octano. Los agentes derivatizantes tales como metil-3-[(p-azidofenil) ditio]propioimidato producen compuestos intermedios fotoactivables que son capaces de formar entrecruzamientos en presencia de luz. Alternativamente, matrices reactivas insolubles en agua tales como carbohidratos activados con bromuro de cinomolgusógeno y los sustratos reactivos descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; y 4.330.440, se emplean para la inmovilización de la proteína.
Los residuos de glutaminilo y asparaginilo se desamidan frecuentemente a los correspondientes residuos de glutamilo y aspartilo, respectivamente. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones ligeramente ácidas. Cualquiera de las formas de estos residuos cae dentro del alcance de esta invención.
Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de serilo o treonilo, metilación de los grupos a-amino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (TE Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, WH Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 [1983]), acetilación de la amina del terminal N y amidación de cualquier grupo carboxilo del terminal C.
Además, como apreciarán los expertos en la técnica, se pueden añadir marcadores (incluidos fluorescentes, enzimáticos, magnéticos, radiactivos, etc.) a los anticuerpos (así como a las otras composiciones de la invención).
Moléculas biespecíficas
En otro aspecto, la presente invención presenta moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-LY75, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o porciones de unión a antígeno del mismo, pueden derivatizarse o unirse a otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos sitios de unión o moléculas objetivo diferentes. De hecho, el anticuerpo de la invención puede derivatizarse o unirse a más de una molécula funcional diferente para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas objetivo; también se pretende que dichas moléculas multiespecíficas estén englobadas por el término "molécula biespecífica" como se utiliza en el presente documento. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más moléculas de unión, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de modo que resulta una molécula biespecífica.
Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para un primer epítopo objetivo (es decir, LY75) y una segunda especificidad de unión para un segundo epítopo objetivo. El segundo epítopo objetivo puede estar presente en la misma proteína objetivo que la unida por la primera especificidad de unión; o el segundo epítopo objetivo puede estar presente en una proteína objetivo diferente a la unida por la primera proteína a la unida por la primera especificidad de unión. El segundo epítopo objetivo puede estar presente en la misma célula que el primer epítopo objetivo (es decir, LY75); o el segundo epítopo objetivo puede estar presente en un objetivo que no es mostrado por la célula que presenta el primer epítopo objetivo. Como se usa en este documento, el término "especificidad de unión" se refiere a una fracción que comprende al menos un dominio variable de anticuerpo.
En una realización de la invención, el segundo epítopo objetivo es un receptor Fc, por ejemplo, FcyRI humano (CD64) o un receptor Fca humano (CD89). Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas capaces de unirse tanto a células efectoras que expresan FcyR o FcaR (por ejemplo, monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN) como a células objetivo que expresan LY75. Estas moléculas biespecíficas se dirigen a células que expresan LY75 a células efectoras y desencadenan actividades de células efectoras mediadas por receptores de Fc, tales como fagocitosis de células que expresan LY75, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), liberación de citocinas o generación del anión superóxido.
En otra realización de la invención, el segundo epítopo objetivo es CD3 o CD5. Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas capaces de unirse tanto a células efectoras que expresan CD3 o CD5 (por ejemplo, células T citotóxicas que expresan CD3 o CD5) como a células objetivo que expresan LY75. Estas moléculas biespecíficas se dirigen a células que expresan LY75 a células efectoras y desencadenan actividades de células efectoras mediadas por CD3 o CD5, tales como la expansión clonal de células T y la citotoxicidad de las células T. En esta realización, el anticuerpo biespecífico de la invención puede tener un total de dos o tres dominios variables de anticuerpo, en los que la primera porción del anticuerpo biespecífico es capaz de reclutar la actividad de una célula efectora inmune humana al unirse específicamente a un antígeno efector localizado en la célula efectora inmunitaria humana, en la que el antígeno efector es el antígeno CD3 humano o el antígeno CD5 humano, dicha primera porción consiste en un dominio variable de anticuerpo, y una segunda porción del anticuerpo biespecífico es capaz de unirse específicamente a un antígeno objetivo distinto del antígeno efector, por ejemplo, LY75, estando localizado dicho antígeno objetivo en una célula objetivo distinta de dicha célula efectora inmunitaria humana, y dicha segunda porción comprende uno o dos dominios variables del anticuerpo.
En una realización de la invención en la que la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir además una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de unión anti-Fc o una especificidad de unión anti-CD3 o anti-CD5 y una especificidad de unión anti-LY75. En una realización, la tercera especificidad de unión es una porción anti-factor de mejora (EF), por ejemplo, una molécula que se une a una proteína de superficie involucrada en la actividad citotóxica y, por lo tanto, aumenta la respuesta inmune contra la célula objetivo. La "porción anti-factor de mejora" puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molécula determinada, por ejemplo, un antígeno o un receptor, y de ese modo da como resultado una mejora del efecto de los determinantes de unión para el receptor Fc o el antígeno de la célula objetivo. La "porción anti-factor de mejora" puede unirse a un receptor Fc o un antígeno de la célula objetivo. Alternativamente, la porción anti-factor de mejora puede unirse a una entidad que es diferente de la entidad a la que se unen la primera y la segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la porción anti-factor de mejora puede unirse a una célula T citotóxica (por ejemplo, a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que da como resultado una mayor respuesta inmunitaria contra la célula objetivo).
En una realización, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, incluyendo, por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb o un Fv de cadena sencilla. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o un constructo de cadena sencilla como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 4.946.778.
En una realización, la especificidad de unión para un receptor Fcy es proporcionada por un anticuerpo monoclonal, cuya unión no está bloqueada por inmunoglobulina G humana (IgG). Como se usa en este documento, el término "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena y ubicados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor transmembrana o soluble que se agrupan en tres clases de receptores Fcy : Fcy RI (CD64), Fcy RII (CD32) y Fcy RIII (CD16). En una realización preferida, el receptor de -Fcy es un Fcy RI humano de alta afinidad. El Fcy RI humano es una molécula de 72 kDa, que muestra una alta afinidad por la IgG monomérica (108 - 109 M-1).
La producción y caracterización de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fcy preferidos se describen en la publicación PCT WO 88/00052 y en la patente de los Estados Unidos No. 4.954.617. Estos anticuerpos se unen a un epítopo de Fcy RI, Fcy RII o Fcy RIII en un sitio que es distinto del sitio de unión a Fcy del receptor y, por lo tanto, su unión no se bloquea sustancialmente por los niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos anti-Fcy RI específicos útiles en esta invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El mAb 32 productor de hibridoma está disponible en la American Type Culture Collection, ATCC No. de acceso HB9469. En otras realizaciones, el anticuerpo anti-receptor Fcy es una forma humanizada de anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R.F. et al., (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y la publicación PCT WO 94/10332. La línea celular productora de anticuerpos H22 se depositó en la American Type Culture Collection con la designación HA022CL1 y tiene el número de acceso CRL 11177.
En otras realizaciones preferidas adicionales, la especificidad de unión para un receptor Fc es proporcionada por un anticuerpo que se une a un receptor de IgA humano, por ejemplo, un receptor Fc-alfa [FcaRI (CD89)], cuya unión preferiblemente no está bloqueada por inmunoglobulina A humana (IgA). El término "receptor de IgA" pretende incluir el producto génico de un gen a (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas transmembrana empalmadas alternativamente de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinófilos y neutrófilos, pero no en poblaciones de células no efectoras. El FcaRI tiene una afinidad media (“ 5 * 107 M'1) tanto para IgA1 como para IgA2, que aumenta con la exposición a citocinas tales como G-CSF o GM-Cs F [Morton, H.C. et al., (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440]. Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales específicos de FcaRI, identificados como A3, A59, a 62 y A77, que se unen a FcaRI fuera del dominio de unión del ligando de IgA [Monteiro, R.C. et al., (1992) J. Immunol. 148: 1764].
FcaRI y Fcy RI son receptores de activación preferidos para uso en las moléculas biespecíficas de la invención porque (1) se expresan principalmente en células efectoras inmunes, por ejemplo, monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas; (2) expresan a niveles altos (por ejemplo, 5.000-100.000 por célula); (3) mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); y (4) median en la presentación mejorada de antígenos de los antígenos, incluidos los autoantígenos, dirigidos a ellos.
Los anticuerpos que se pueden emplear en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales murinos, humanos, quiméricos y humanizados.
Las moléculas biespecíficas de la presente invención se pueden preparar conjugando las especificidades de unión de los constituyentes, por ejemplo, las especificidades de unión anti-FcR, anti-CD3, anti-CD5 y anti-LY75, usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la especificidad de unión de cada molécula biespecífica puede generarse por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, se puede usar una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes de entrecruzamiento incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis(ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP) y 4-(N-maleimidometil)ciclohaxano-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) [véase por ejemplo, Karpovsky et al., (1984) J. Exp. Medicina. 160: 1686; Liu, MA et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. Us a 82: 8648]. otros métodos incluyen los descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. Número 78, 118-132; Brennan et al., (1985) Science 229: 81-83 y Glennie et al., (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375. Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles a través de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL)].
Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, se pueden conjugar mediante enlaces sulfhidrilo de las regiones de bisagra del terminal C de las dos cadenas pesadas. En una realización particularmente preferida, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugación.
Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse y ensamblarse en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligando x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de unión, o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas de cadena sencilla. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen, por ejemplo, en las patentes de los estados Nos. 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; y 5.482.858.
Los anticuerpos de la invención pueden ser acopladores de células T biespecíficos (BiTE). Los BiTE son una clase de anticuerpos monoclonales biespecíficos artificiales. Dirigen el sistema inmunológico del huésped, más específicamente la actividad citotóxica de las células T, contra las células cancerosas. Los BiTE son generalmente proteínas de fusión que consisten en dos fragmentos variables de cadena sencilla (scFv) de diferentes anticuerpos, o secuencias de aminoácidos de cuatro genes diferentes, en una única cadena peptídica, preferiblemente de aproximadamente 55 kilodaltons. Preferiblemente, uno de los scFv se une a las células T a través del receptor CD3 y el otro a una célula tumoral a través de una molécula específica del tumor.
La unión de las moléculas biespecíficas a sus objetivos específicas se puede confirmar mediante, por ejemplo, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, bioensayo (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o ensayo de transferencia Western. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos proteína-anticuerpo de interés particular mediante el empleo de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos FcR-anticuerpo pueden detectarse usando, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo ligado a enzima que reconoce y se une específicamente a los complejos anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden detectarse usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radiactivamente y usarse en un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo de 1986). El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo o por autorradiografía.
Glicosilación
Otro tipo de modificación covalente son las alteraciones en la glicosilación. En algunas realizaciones, los anticuerpos divulgados en el presente documento se pueden modificar para incluir una o más glicoformas modificadas genéticamente. Por "glicoforma modificada", como se usa en el presente documento, se entiende una composición de carbohidratos que está unida covalentemente al anticuerpo, en la que la composición de carbohidratos difiere químicamente de la de un anticuerpo original. Las glicoformas modificadas pueden ser útiles para una variedad de propósitos, que incluyen, pero no se limitan a mejorar o reducir la función efectora. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo que carece de glicosilación). La glicosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación del marco de la región variable para eliminar de ese modo la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Un enfoque de este tipo se describe con más detalle en las patentes de Estados Unidos Nos. 5.714.350 y 6.350.861 de Co et al., y se puede lograr removiendo la asparagina en la posición 297.
Una forma preferida de glicoforma modificada es la afucosilación, que se ha demostrado que está correlacionada con un aumento en la función de ADCC, presumiblemente a través de una unión más estrecha al receptor FcyRIIIa. En este contexto, "afucosilación" significa que la mayoría del anticuerpo producido en las células huésped está sustancialmente desprovisto de fucosa, por ejemplo, el 90-95-98% de los anticuerpos generados no tienen fucosa apreciable como componente de la fracción carbohidrato del anticuerpo (generalmente unido a N297 en la región Fc). Definidos funcionalmente, los anticuerpos afucosilados generalmente exhiben al menos un 50% o más de afinidad por el receptor FcyRIIIa.
Las glicoformas modificadas se pueden generar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (Umaña et al., 1999, Nat Biotechnol 17: 176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields et al. al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473; US 6.602.684; USSN 10/277.370; USSN 10/113.929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCT WO 02/30954A1; (tecnología POTELLIGENT® [Biowa, Inc., Princeton, NJ]; tecnología de modificación de glicosilación GlycoMAb® [Glycart Biotechnology AG, Zúrich, Suiza]). Muchas de estas técnicas se basan en controlar el nivel de oligosacáridos fucosilados y/o bisectantes que se unen covalentemente a la región Fc, por ejemplo, expresando una IgG en varios organismos o líneas celulares, modificadas o no (por ejemplo, células CHO Lec-13 o células YB2/0, de hibridoma de rata regulando la enzimas involucradas en la vía de glicosilación (por ejemplo, FUT8 [a1,6-fucosiltranserasa] y/o p1-4- N-acetilglucosaminiltransferasa III [GnTIII]), o modificando el carbohidrato o carbohidratos después de que se haya expresado IgG. Por ejemplo, el "anticuerpo modificado con azúcar" o la "tecnología SEA" de Seattle Genetics funciona mediante la adición de sacáridos modificados que inhiben la fucosilación durante la producción; vease, por ejemplo, el documento US2009/0317869. "Glicoforma modificada" se refiere típicamente a los diferentes carbohidratos u oligosacáridos en comparación con el anticuerpo elaborado en ausencia de la tecnología de glicosilación; por lo tanto, un anticuerpo puede incluir una glicoforma modificada.
Alternativamente, la glicoforma modificada puede referirse a la variante de IgG que comprende los diferentes carbohidratos u oligosacáridos. Como se conoce en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos de aminoácidos de glicosilación particulares, discutidos a continuación) como de la célula u organismo huésped en el que se produce la proteína. Los sistemas de expresión particulares se analizan a continuación.
La glicosilación de polipéptidos está típicamente ligada a N o bien a O. Ligada a N se refiere a la unión de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en las que X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la fracción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por lo tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación ligada a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa, a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.
La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación ligados a N). La alteración también puede realizarse mediante la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia de partida (para los sitios de glicosilación ligados a O). Para mayor facilidad, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se altera preferiblemente mediante cambios a nivel del ADN, particularmente mutando el ADN que codifica el polipéptido objetivo en bases preseleccionadas de modo que se generen codones que se traducirán en los aminoácidos deseados.
Otro medio para aumentar el número de fracciones de carbohidratos en el anticuerpo es mediante el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos son ventajosos porque no requieren la producción de la proteína en una célula huésped que tiene capacidades de glicosilación para la glicosilación ligada a N y O. Dependiendo del modo de acoplamiento utilizado, el o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo libres tales como aquellos de cisteína, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330 y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., Páginas 259-306.
La eliminación de las fracciones de carbohidratos presentes en el anticuerpo de partida (por ejemplo, postraduccionalmente) se puede realizar de forma química o enzimática. La desglicosilación química requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico. Este tratamiento da como resultado la escisión de la mayoría o de todos los azúcares, excepto el azúcar del enlace (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), dejando intacto el polipéptido. La desglicosilación química está descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 y por Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. La escisión enzimática de fracciones de carbohidratos en polipéptidos se puede lograr mediante el uso de una variedad de endo y exoglucosidasas como lo describen Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350, incluida la eliminación de residuos de fucosa usando una enzima fucosidasa como se conoce en la técnica. La glicosilación en sitios potenciales de glicosilación se puede prevenir mediante el uso del compuesto tunicamicina como lo describen Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257: 3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicósido.
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende unir el anticuerpo a varios polímeros no proteináceos, incluidos, entre otros, varios polioles tales como polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en, por ejemplo, Catálogo de PEG 2005-2006 de Nektar Therapeutics (disponible en el sitio web de Nektar), patentes de los estados Unidos Nos. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Además, como se conoce en la técnica, se pueden realizar sustituciones de aminoácidos en varias posiciones dentro del anticuerpo para facilitar la adición de polímeros tales como PEG. Vease, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2005/0114037A1.
En realizaciones adicionales, por ejemplo, en el uso de los anticuerpos de la invención con fines de diagnóstico o detección, los anticuerpos pueden comprender un marcador. Por "marcado" en el presente documento se entiende que un compuesto tiene al menos un elemento, isótopo o compuesto químico unido para permitir la detección del compuesto. En general, los marcadores se dividen en tres clases: a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radiactivos o pesados; b) magnéticos, eléctricos, térmicos; y c) tintes coloreados o luminiscentes; aunque los marcadores también incluyen enzimas y partículas tales como partículas magnéticas. Los marcadores preferidos incluyen, entre otros, complejos de lantánidos fluorescentes (incluidos los de europio y terbio) y marcadores fluorescentes que incluyen, entre otros, puntos cuánticos, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metilcumarinas, pireno, verde de malaquita, estilbeno, amarillo Lucifer, azul cascada, rojo Texas, los tintes Alexa, los tintes Cy y otros descritos en la sexta edición del Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland.
Conjugados anticuerpo-fármaco
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-LY75 de la invención se conjugan con fármacos para formar conjugados anticuerpo-fármaco (ADC). En general, los ADC se utilizan en aplicaciones oncológicas, en las que el uso de conjugados anticuerpo-fármaco para la administración local de agentes citotóxicos o citostáticos permite la administración dirigida de la fracción del fármaco a los tumores, lo que puede permitir una mayor eficacia, menor toxicidad, etc. Se proporciona una descripción general de esta tecnología en Ducry et al., Bioconjugate Chem., 21: 5­ 13 (2010), Carter et al., Cancer J. 14 (3): 154 (2008) y Senter, Current Opin. Chem. Biol. 13: 235-244 (2009).
Por lo tanto, la invención proporciona anticuerpos anti-LY75 conjugados con fármacos. Generalmente, la conjugación se realiza mediante unión covalente al anticuerpo, como se describe con más detalle a continuación, y generalmente se basa en un enlazador, a menudo un enlace peptídico (que, como se describe a continuación, puede diseñarse para ser sensible a la escisión por proteasas en el sitio objetivo o no). Además, como se describió anteriormente, la unión de la unidad enlazadora-fármaco (LU-D) se puede realizar mediante la unión a cisteínas dentro del anticuerpo. Como apreciarán los expertos en la técnica, el número de fracciones de fármaco por anticuerpo puede cambiar, dependiendo de las condiciones de la reacción, y puede variar de 1:1 a 10:1 fármaco: anticuerpo. Como apreciarán los expertos en la técnica, el número real es un promedio.
Por lo tanto, la invención proporciona anticuerpos anti-LY75 conjugados con fármacos. Como se describe a continuación, el fármaco del ADC puede ser cualquier número de agentes, incluidos, entre otros, agentes citotóxicos tales como agentes quimioterapéuticos, agentes inhibidores del crecimiento, toxinas (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos del mismo), o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconjugado). En otras realizaciones, la invención proporciona además métodos para usar los ADC.
Los fármacos para uso en la presente invención incluyen fármacos citotóxicos, particularmente aquellos que se utilizan para la terapia del cáncer. Dichos fármacos incluyen, en general, agentes que dañan el ADN, antimetabolitos, productos naturales y sus análogos. Ejemplos de clases de agentes citotóxicos incluyen los inhibidores de enzimas tales como inhibidores de dihidrofolato reductasa e inhibidores de timidilato sintasa, intercaladores de ADN, escindidores de ADN, inhibidores de topoisomerasa, la familia de fármacos de antraciclina, los fármacos de la vinca, las mitomicinas, las bleomicinas, los nucleósidos citotóxicos, las familias de fármacos de pteridina, diinenos, podofilotoxinas, dolastatinas, maitansinoides, inductores de diferenciación y taxoles.
Los miembros de estas clases incluyen, por ejemplo, taxol, metotrexato, metopterina, diclorometotrexato, 5-fluorouracilo, 6-mercaptopurina, arabinósido de citosina, melfalán, leurosina, leurosideína, actinomicina, daunorrubicina, mitomicina C, mitomicina A, caminomicina, aminopterina, talisomicina, podofilotoxina y derivados de podofilotoxina tales como etopósido o fosfato de etopósido, vinblastina, vincristina, vindesina, taxanos que incluyen taxol, ácido taxotero retinoico, ácido butírico, N8-acetil espermidina, camptotecina, caliqueamicina, esperamicina, ndiinos, duocarmicina A, duocarmicina SA caliqueamicina, camptotecina, hemiasterlinas, maitansinoides (incluido DM1), monometilauristatina E (MMAE), monometilauristatina F (MMAF) y maitansinoides (DM4) y sus análogos.
Las toxinas se pueden usar como conjugados anticuerpo-toxina e incluyen toxinas bacterianas tales como toxina diftérica, toxinas vegetales tales como ricina, toxinas de molécula pequeña tales como geldanamicina (Mandler et al., (2000) J. Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler et al., (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al., (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623) y caliqueamicina (Lode et al., (1998) Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al., (1993) Cancer Res. 53: 3336-3342), hemiasterlinas (documento WO2004/026293; Zask et al., (2004) J. Med. Chem, 47: 4774­ 4786). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos y citostáticos mediante mecanismos que incluyen la unión a la tubulina, la unión al ADN o la inhibición de la topoisomerasa.
También se pueden usar conjugados de un anticuerpo anti-LY75 y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como maitansinoides, dolastatinas, auristatinas, un tricoteceno, caliqueamicina y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tienen actividad de toxina.
Maitansinoides
Los compuestos de maitansina adecuados para uso como fracciones de fármaco maitansinoides son bien conocidos en la técnica y pueden aislarse de fuentes naturales de acuerdo con métodos conocidos, producidos usando técnicas de ingeniería genética (vease Yu et al., (2002) PNAS 99: 7968-7973), o maitansinol y análogos de maitansinol preparados sintéticamente de acuerdo con métodos conocidos. Como se describe a continuación, los fármacos pueden modificarse mediante la incorporación de un grupo funcionalmente activo, tal como un grupo tiol o amina, para la conjugación con el anticuerpo.
Los ejemplos de fracciones de fármaco maitansinoide incluyen aquellos que tienen un anillo aromático modificado, tales como: C-19-decloro (patente de los Estados Unidos No. 4.256.746) (preparados por reducción con hidruro de litio y aluminio de ansamitocina P2); C-20-hidroxi (o C-20-desmetilo) /- C-19-decloro (patentes de los Estados Unidos Nos. 4.361.650 y 4.307.016) (preparado por desmetilación usando Streptomyces o Actinomyces o decloración usando LAH); y C-20-desmetoxi, C-20-aciloxi (-OCOR), /- decloro (patente de los Estados Unidos No 4.294.757) (preparados por acilación usando cloruros de acilo) y los que tienen modificaciones en otras posiciones.
Los ejemplos de fracciones de fármaco maitansinoide también incluyen aquellos que tienen modificaciones tales como: C-9-Sh (patente de los Estados Unidos No. 4.424.219) (preparado mediante la reacción de maitansinol con H2S o P2S5); C-14-alcoximetil (desmetoxi/CH2OR) (patente de los Estados unidos No. 4.331.598); C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH2OH o CH2OAc) (patente de los Estados Unidos No. 4.450.254) (preparado a partir de Nocardia); C-15-hidroxi/aciloxi (patente de los Estados Unidos No. 4.364.866) (preparado mediante la conversión de maitansinol por Streptomyces); C-15-metoxi (patentes de los Estados Unidos Nos. 4.313.946 y 4.315.929) (aislado de Trewia nudlflora); C-18-N-demetilo (patentes de los Estados Unidos Nos. 4.362.663 y 4.322.348) (preparado por la desmetilación de maitansinol por Streptomyces); y 4,5-desoxi (patente de los Estados Unidos No. 4.371.533) (preparado mediante la reducción de maitansinol con tricloruro de titanio/LAH).
Son de uso particular DM1 (divulgado en la patente de los Estados Unidos No. 5.208.020) y DM4 (divulgado en la patente de los Estados Unidos No. 7.276.497). Véanse también varios derivados y métodos de maitansinoides adicionales en la patente de los Estados Unidos No. 5.416.064, WO/01/24763, patentes de los Estados Unidos Nos.
7.303.749, 7.601.354, USSN 12/631.508, WO02/098883, patentes de los Estados Unidos Nos.6.441.163, 7.368.565, WO02/16368 y WO04/1033272.
Los ADC que contienen maitansinoides, los métodos para prepararlos y su uso terapéutico se divulgan, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.208.020; 5.416.064; 6.441.163 y la patente europea EP 0425 235 B1. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 8618-8623 (1996) describieron a Dc que comprenden un maitansinoide designado como DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra el cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado era altamente citotóxico para las células de cáncer de colon cultivadas y mostraba actividad antitumoral en un ensayo de crecimiento tumoral in vivo.
Chari et al., Cancer Research 52: 127-131 (1992) describen ADC en los que un maitansinoide se conjugó mediante un enlazador disulfuro al anticuerpo murino A7 que se une a un antígeno en líneas celulares de cáncer de colon humano, o a otro anticuerpo monoclonal TA.1 murino que se une al oncogén HER-2/neu. La citotoxicidad del conjugado TA.1-maitansonoide se ensayó in vitro en la línea celular de cáncer de mama humana SK-BR-3, que expresa 3x105 antígenos de superficie HER-2 por célula. El conjugado de fármaco alcanzó un grado de citotoxicidad similar al fármaco maitansinoide libre, que podría incrementarse aumentando el número de moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo. El conjugado A7-maitansinoide mostró una baja citotoxicidad sistémica en ratones.
Auristatinas y Dolastatinas
En algunas realizaciones, el ADC comprende un anticuerpo anti-LY75 conjugado con dolastatinas o análogos y derivados peptídicos de dolostatina, las auristatinas (patentes de los Estados Unidos Nos 5.635.483; 5.780.588). Se ha demostrado que las dolastatinas y las auristatinas interfieren con la dinámica de los microtúbulos, la hidrólisis de GTP y la división celular y nuclear (Woyke et al., (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45 (12): 3580-3584) y tienen actividad anticancerígena (patente de los Estados Unidos No 5.663.149) y antifúngica (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42: 2961-2965). La fracción del fármaco dolastatina o auristatina puede unirse al anticuerpo a través del terminal N (amino) o el terminal C (carboxilo) de la fracción del fármaco peptídico (documento WO 02/088172).
Los ejemplos de realizaciones de auristatina incluyen las fracciones DE y DF del fármaco monometilauristatina unidas al terminal N, divulgadas en Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer Research, Volumen 45, Resumen número 623, presentado el 28 de marzo de 2004 y descrito en la publicación de patente de los Estados Unidos No. 2005/0238648.
Un ejemplo de una realización con auristatina es MMAE (mostrada en la Figura 10, en la que la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco; véase la patente de los Estados Unidos No. 6.884.869).
Otro ejemplo de realización con auristatina es MMAF, que se muestra en la Figura 10, en la que la línea ondulada indica la unión covalente a un enlazador (L) de un conjugado anticuerpo-fármaco (publicación de patente de los Estados Unidos No. 2005/0238649, patentes de los Estados Unidos Nos. 5.767.237 y 6.124.431):
Ejemplos adicionales de realizaciones que comprenden MMAE o MMAF y varios componentes enlazadores (descritos más adelante en este documento) tienen las siguientes estructuras y abreviaturas (en las que Ab significa anticuerpo y p es 1 a aproximadamente 8):
Normalmente, las fracciones de fármaco basadas en péptidos se pueden preparar formando un enlace peptídico entre dos o más aminoácidos y/o fragmentos peptídicos. Dichos enlaces peptídicos se pueden preparar, por ejemplo, de acuerdo con el método de síntesis en fase líquida (vease E. Schroder y K. Lubke, "The Peptides", volumen 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que es bien conocido en el campo de la química de péptidos. Las fracciones del fármaco auristatina/dolastatina se pueden preparar de acuerdo con los métodos de: patente de Estados Unidos No 5.635.483; patente de Estados Unidos No 5.780.588; Pettit et al., (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465; Pettit et al., (1998) Anti-Cancer Drug Design 13: 243-277; Pettit, G. R. et al., Synthesis, 1996, 719-725; Pettit et al., (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 15: 859-863; y Doronina (2003) Nat Biotechnol 21 (7): 778-784.
Caliqueamicina
En otras realizaciones, el ADC comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. Por ejemplo, Mylotarg es el primer fármaco ADC comercial y utiliza caliqueamicina y1 como carga útil (véase la patente de los Estados Unidos No. 4.970.198). Derivados de caliqueamicina adicionales se describen en las patentes de los Estados Unidos Nos 5.264.586, 5.384.412, 5.550.246, 5.739.116, 5.773.001, 5.767.285 y 5.877.296. La familia de antibióticos de la caliqueamicina es capaz de producir roturas de ADN de doble cadena a concentraciones subpicomolares. Para la preparación de conjugados de la familia de las caliqueamicinas, véase las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todos de American Cyanamid Company). Los análogos estructurales de caliqueamicina que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, y1I, a2I, a2I, N-acetil-Y1I, PSAG y 0I1 (Hinman et al., Cancer Research 53: 3336-3342 (1993), Lode et al. al., Cancer Research 58: 2925-2928 (1998) y las patentes de los estados Unidos antes mencionadas de American Cyanamid). Otro fármaco antitumoral con el que se puede conjugar el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como QFA tienen sitios de acción intracelulares y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por anticuerpos mejora en gran medida sus efectos citotóxicos.
Duocarmicinas
CC-1065 (véase la patente de los Estados Unidos No. 4.169.888) y las duocarmicinas son miembros de una familia de antibióticos antitumorales utilizados en los ADC. Estos antibióticos parecen actuar mediante la alquilación selectiva de secuencias de ADN en el N3 de la adenina en el surco menor, lo que inicia una cascada de eventos que dan como resultado la apoptosis.
Miembros importantes de las duocarmicinas incluyen duocarmicina A (patente de los Estados Unidos No. 4.923.990) y duocarmicina SA (patente de los Estados Unidos No. 5.101.038), y un gran número de análogos como se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos 7.517.903; 7.691.962; 5.101.038; 5.641.780; 5.187.186; 5.070.092; 5.070.092; 5.641.780; 5.101.038; 5.084.468; 5.475.092; 5.585.499; 5.846.545; WO2007/089149; WO2009/017394A1; patentes de los Estados Unidos Nos 5.703.080; 6.989.452; 7.087.600; 7.129.261; 7.498.302 y 7.507.420.
Pirrolobenzodiazepinas
Las pirrolobenzodiazepinas (PBD) (Journal of Medicinal Chemistry 2001, 44, 737-748) son agentes que interactúan con el ADN con una citotoxicidad significativa. Se han aislado trece estructuras de esta familia, incluidos compuestos tales como antramicina, mazetramicina, porotramicina, protracarcina, sibanomicina, tomaimicina, sibiromicina, chicamicina A, neotramicina A, B y DC-81 (Medicinal Chemistry and Drug Design, ISBN: 978-953-51- 0513-8, Ahmed Kamal et al., DOI: 10.5772/38869). Se han preparado otros análogos de esta familia y se han conjugado con anticuerpos como se describe en las patentes Nos. WO2011/130598 y WO2011/130616.
Otros agentes citotóxicos
Otros agentes antitumorales que se pueden conjugar con los anticuerpos de la invención incluyen BCNU, estreptozocina, vincristina y 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocida colectivamente como complejo LL-E33288 descrito en las patentes de los Estados Unidos Nos 5.053.394, 5.770.710, así como esperamicinas (patente de los Estados Unidos No. 5.877.296).
Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden usarse incluyen la cadena A de la difteria, los fragmentos activos no enlazantes de la toxina de la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina, la cadena A de la modecina, la alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenos. Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232 publicado el 28 de octubre de 1993.
La presente invención contempla además un ADC formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa tal como una desoxirribonucleasa; DNasa).
Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radiactivo. Se dispone de una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados. Los ejemplos incluyen 211 At, 131I, I125, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb e isótopos radiactivos de Lu.
Los radiomarcadores u otros marcadores pueden incorporarse en el conjugado de formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede biosintetizarse o puede sintetizarse mediante síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que implican, por ejemplo, flúor 19 en lugar de hidrógeno. Las etiquetas tales como 99mTc o 123I, 186Re, 188Re e 111In se pueden unir mediante un residuo de cisteína en el péptido. El itrio 90 se puede unir mediante un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 se puede utilizar para incorporar yodo 123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe otros métodos en detalle.
Para las composiciones que comprenden una pluralidad de anticuerpos, la carga de fármaco está representada por p, el número medio de moléculas de fármaco por anticuerpo. La carga de fármaco puede variar de 1 a 20 fármacos (D) por anticuerpo. El número promedio de fármacos por anticuerpo en la preparación de reacciones de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopia de masas, ensayo ELISA y HPLC. También se puede determinar la distribución cuantitativa de conjugados de anticuerpo-fármaco en términos de p.
En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de conjugados homogéneos de anticuerpo-fármaco en los que p es un cierto valor de conjugados anticuerpo-fármaco con otras cargas de fármaco puede lograrse medios tales como HPLC de fase inversa o electroforesis. En ejemplos de realizaciones, p es 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 o una fracción del mismo.
La generación de compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco se puede realizar mediante cualquier técnica conocida por el experto en la materia. Brevemente, los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco pueden incluir un anticuerpo anti-LY75 como unidad de anticuerpo, un fármaco y, opcionalmente, un enlazador que une el fármaco y el agente de unión.
Están disponibles varias reacciones diferentes para la unión covalente de fármacos y/o enlazadores a agentes de unión. Esto se puede lograr mediante la reacción de los residuos de aminoácidos del agente de unión, por ejemplo, la molécula de anticuerpo, incluidos los grupos amina de lisina, los grupos de ácido carboxílico libre de ácido glutámico y aspártico, los grupos sulfhidrilo de cisteína y las diversas fracciones de los aminoácidos aromáticos. Un método no específico de unión covalente comúnmente usado es la reacción de carbodiimida para unir un grupo carboxilo (o amino) de un compuesto a grupos amino (o carboxilo) del anticuerpo. Además, se han utilizado agentes bifuncionales tales como dialdehídos o imidoésteres para unir el grupo amino de un compuesto a los grupos amino de una molécula de anticuerpo.
También está disponible para la unión de fármacos a agentes aglutinantes la reacción de base de Schiff. Este método implica la oxidación con peryodato de un fármaco que contiene grupos glicol o hidroxilo, formando así un aldehído que luego se hace reaccionar con el agente de unión. La unión se produce mediante la formación de una base de Schiff con grupos amino del agente de unión. Los isotiocianatos también se pueden usar como agentes de acoplamiento para unir fármacos a agentes aglutinantes de forma covalente. El experto en la materia conoce otras técnicas y están dentro del alcance de la presente invención.
En algunas realizaciones, un compuesto intermedio, que es el precursor del enlazador, se hace reaccionar con el fármaco en condiciones apropiadas. En otras realizaciones, se usan grupos reactivos en el fármaco y/o el compuesto intermedio. El producto de la reacción entre el fármaco y el compuesto intermedio, o el fármaco derivatizado, se hace reaccionar posteriormente con un anticuerpo anti-LY75 de la invención bajo condiciones apropiadas.
Se entenderá que también se pueden realizar modificaciones químicas en el compuesto deseado con el fin de hacer que las reacciones de ese compuesto sean más convenientes con el fin de preparar conjugados de la invención. Por ejemplo, un grupo funcional, por ejemplo, amina, hidroxilo o sulfhidrilo, se pueden añadir al fármaco en una posición que tenga un efecto mínimo o aceptable sobre la actividad u otras propiedades del fármaco.
Unidades enlazadoras
Normalmente, los compuestos conjugados de anticuerpo-fármaco comprenden una unidad enlazadora entre la unidad de fármaco y la unidad de anticuerpo. En algunas realizaciones, el enlazador se puede escindir en condiciones intracelulares o extracelulares, de modo que la escisión del enlazador libera la unidad de fármaco del anticuerpo en el entorno apropiado. Por ejemplo, los tumores sólidos que secretan ciertas proteasas pueden servir como objetivo del enlazador escindible; en otras realizaciones, son las proteasas intracelulares las que se utilizan. En otras realizaciones más, la unidad enlazadora no se puede escindir y el fármaco se libera, por ejemplo, por degradación de anticuerpos en lisosomas.
En algunas realizaciones, el enlazador se puede escindir mediante un agente de escisión que está presente en el entorno intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador peptidilo que es escindido por una enzima proteasa o peptidasa intracelular, que incluye, pero no se limita a, una proteasa lisosómica o endosómica. En algunas realizaciones, el enlazador peptidilo tiene al menos dos aminoácidos de largo o al menos tres aminoácidos de largo o más.
Los agentes de escisión pueden incluir, sin limitación, catepsinas B y D y plasmina, todas las cuales son conocidas por hidrolizar derivados de fármacos dipeptídicos dando como resultado la liberación de fármaco activo dentro de las células objetivo (véase, por ejemplo, Dubowchik y Walker, 1999, Pharm Therapeutics 83: 67-123). Enlazadores de peptidilo que se pueden escindir mediante enzimas presentes en las células que expresan LY75. Por ejemplo, se puede usar un enlazador peptidilo que se puede escindir por la proteasa catepsina-B dependiente de tiol, que se expresa en gran medida en tejido canceroso (por ejemplo, Un enlazador Phe-Leu o un enlazador Gly-Phe-Leu-Gly (SEQ ID NO: X)). Otros ejemplos de tales enlazadores se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 6.214.345.
En algunas realizaciones, el enlazador peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un enlazador Val-Cit o un enlazador Phe-Lys (vease, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 6.214.345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el enlazador val-cit).
En otras realizaciones, el enlazador escindible es sensible al pH, es decir, sensible a la hidrólisis a ciertos valores de pH. Normalmente, el enlazador sensible al pH se hidroliza en condiciones ácidas. Por ejemplo, se puede utilizar un enlazador lábil en ácido que sea hidrolizable en el lisosoma (por ejemplo, una hidrazona, semicarbazona, tiosemicarbazona, amida cis-aconítica, ortoéster, acetal, cetal) (véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 5.122.368; 5.824.805; 5.622.929; Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83: 67-123; Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264: 14653-14661.) Tales enlazadores son relativamente estables en condiciones de pH neutro, tales como los de la sangre, pero son inestables por debajo de pH 5,5 o 5,0, el pH aproximado del lisosoma. En determinadas realizaciones, el enlazador hidrolizable es un enlazador tioéter (tal como, por ejemplo, un tioéter unido al agente terapéutico mediante un enlace acilhidrazona (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No.
5.622.929).
En otras realizaciones adicionales, el enlazador se puede escindir en condiciones reductoras (por ejemplo, un enlazador disulfuro). Se conocen en la técnica una variedad de enlazadores disulfuro, incluidos, por ejemplo, los que se pueden formar usando SATA (N-succinimidil-5-acetiltioacetato), SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato), SPDB (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)butirato) y SMPT (N-succinimidil-oxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio) tolueno), SPDB y SMPT (véase, por ejemplo, Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47: 5924-5931; Wawrzynczak et al., En Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (CW Vogel ed., Oxford U. Press, 1987. Véase también la patente de los Estados Unidos No. 4.880.935).
En otras realizaciones, el enlazador es un enlazador malonato (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93), un enlazador maleimidobenzoilo (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1299-1304), o un análogo de 3'-N-amida (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3 (10): 1305-12).
En aun otras realizaciones, la unidad enlazadora no se puede escindir y el fármaco se libera por degradación del anticuerpo (véase la publicación de patente de los Estados Unidos No. 2005/0238649).
En muchas realizaciones, el enlazador es autoinmolativo. Como se usa en este documento, el término "espaciador autoinmolativo" se refiere a una fracción química bifuncional que es capaz de unir covalentemente dos fracciones químicas espaciadas en una molécula tripartita estable. Se separará espontáneamente de la segunda fracción química si se escinde su enlace con la primera fracción. Véanse, por ejemplo, los documentos WO 2007/059404A2, WO06/110476A2, WO05/112919A2, WO2010/062171, WO09/017394, WO07/089149, WO 07/018431, WO04/043493 y WO02/083180, que están dirigidos a sustratos escindibles con fármacos conjugados en los que el fármaco y el sustrato escindible se unen opcionalmente a través de un enlazador autoinmolativo.
A menudo, el enlazador no es sustancialmente sensible al entorno extracelular. Como se usa en este documento, "no sustancialmente sensible al entorno extracelular", en el contexto de un enlazador, significa que no más de aproximadamente 20%, 15%, 10%, 5%, 3% o no más de aproximadamente 1% de los enlazadores, en una muestra de compuesto conjugado anticuerpo-fármaco, se escinden cuando el compuesto conjugado anticuerpo-fármaco se presenta en un entorno extracelular (por ejemplo, en plasma).
Se puede determinar si un enlazador no es sustancialmente sensible al entorno extracelular, por ejemplo, incubando con plasma el compuesto conjugado anticuerpo-fármaco durante un período de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4, 8, 16 o 24 horas) y luego cuantificar la cantidad de fármaco libre presente en el plasma.
En otras realizaciones no excluyentes entre sí, el enlazador promueve la internalización celular. En determinadas realizaciones, el enlazador promueve la internalización celular cuando se conjuga con el agente terapéutico (es decir, en el medio de la fracción enlazador-agente terapéutico del compuesto conjugado anticuerpo-fármaco como se describe en el presente documento). En otras realizaciones más, el enlazador promueve la internalización celular cuando se conjuga tanto con el compuesto de auristatina como con los anticuerpos anti-LY75 de la invención.
Se describen una variedad de ejemplos de enlazadores que pueden usarse con las presentes composiciones y métodos en los documentos WO 2004/010957, publicación de patente de los Estados Unidos No. 2006/0074008, publicación de patente de los Estados Unidos No. 20050238649 y publicación de patente de los Estados Unidos No.
2006/0024317 que.
Carga de fármacos
La carga de fármacos está representada por p y es el número promedio de fracciones de fármaco por anticuerpo en una molécula. La carga de fármacos ("p") puede ser 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más fracciones (D) por anticuerpo, aunque con frecuencia el número promedio es una fracción o un decimal. Generalmente, la carga de fármacos de 1 a 4 es con frecuencia útil, y también es útil de 1 a 2. Los ADC de la invención incluyen colecciones de anticuerpos conjugados con una variedad de fracciones de fármaco, de 1 a 20, por ejemplo, 1-15, 1-10, 2-9, 3-8, 4-7, 5-6. El número promedio de fracciones de fármaco por anticuerpo en preparaciones de ADC a partir de reacciones de conjugación puede caracterizarse por medios convencionales tales como espectroscopia de masas y ensayo ELISA.
También se puede determinar la distribución cuantitativa de ADC en términos de p. En algunos casos, la separación, purificación y caracterización de ADC homogéneo cuando p es un cierto valor de ADC con otras cargas de fármacos puede lograrse por medios tales como electroforesis.
Para algunos conjugados anticuerpo-fármaco, p puede estar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo. Por ejemplo, cuando la unión es un tiol de cisteína, como en los ejemplos de realizaciones anteriores, un anticuerpo puede tener solo uno o varios grupos tiol de cisteína, o puede tener solo uno o varios grupos tiol suficientemente reactivos a través de los cuales se puede unir un enlazador. En determinadas realizaciones, una mayor carga de fármaco, por ejemplo, p>5, puede causar agregación, insolubilidad, toxicidad o pérdida de permeabilidad celular de ciertos conjugados anticuerpo-fármaco. En ciertas realizaciones, la carga de fármacos para un ADC de la invención varía de 1 a aproximadamente 8; de aproximadamente 2 a aproximadamente 6; de aproximadamente 3 a aproximadamente 5; de aproximadamente 3 a aproximadamente 4; de aproximadamente 3,1 a aproximadamente 3,9; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,8; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,7; de aproximadamente 3,2 a aproximadamente 3,6; de aproximadamente 3,3 a aproximadamente 3,8; o de aproximadamente 3,3 a aproximadamente 3,7. De hecho, se ha demostrado que para ciertos ADC, la relación óptima de fracciones de fármaco por anticuerpo puede ser menor de 8, y puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. Véase el documento US 2005/0238649 A1.
En determinadas realizaciones, menos del máximo teórico de fracciones de fármaco se conjugan con un anticuerpo durante una reacción de conjugación. Un anticuerpo puede contener, por ejemplo, residuos de lisina que no reaccionan con el compuesto intermedio fármaco-enlazador o el reactivo enlazador, como se describe a continuación. Generalmente, los anticuerpos no contienen muchos grupos tiol de cisteína libres y reactivos que puedan estar unidos a una fracción de fármaco; de hecho, la mayoría de los residuos de tiol de cisteína en los anticuerpos existen como puentes disulfuro. En determinadas realizaciones, un anticuerpo puede reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP), en condiciones de reducción parcial o total, para generar grupos tiol de cisteína reactivos. En determinadas realizaciones, un anticuerpo se somete a condiciones de desnaturalización para revelar grupos nucleofílicos reactivos tales como lisina o cisteína.
La carga (relación fármaco/anticuerpo) de un ADC puede controlarse de diferentes formas, por ejemplo, mediante: (i) limitar el exceso molar de compuesto intermedio fármaco-enlazador o reactivo enlazador con respecto al anticuerpo, (ii) limitar la conjugación tiempo o temperatura de reacción, (iii) condiciones reductoras parciales o limitantes para la modificación del tiol de cisteína, (iv) modificar mediante técnicas recombinantes la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de manera que el número y la posición de los residuos de cisteína se modifique para controlar el número y/o posición de las uniones enlazador-fármaco (tales como tioMab o tioFab preparados como se describe en el presente documento y en el documento WO2006/034488).
Debe entenderse que cuando más de un grupo nucleófilo reacciona con un compuesto intermedio fármaco-enlazador o reactivo enlazador seguido por un reactivo de la fracción de fármaco, entonces el producto resultante es una mezcla de compuestos ADC con una distribución de uno o más fracciones de fármaco unido a un anticuerpo. El número medio de fármacos por anticuerpo puede calcularse a partir de la mezcla mediante un ensayo dual de anticuerpos por ELISA, que es específico para el anticuerpo y específico para el fármaco. Las moléculas de ADC individuales pueden identificarse en la mezcla mediante espectroscopía de masas y separarse mediante HPLC, por ejemplo, cromatografía de interacción hidrófoba.
En algunas realizaciones, un ADC homogéneo con un valor de carga único puede aislarse de la mezcla de conjugación mediante electroforesis o cromatografía.
Métodos para determinar el efecto citotóxico de los ADC
Se conocen métodos para determinar si un fármaco o un conjugado anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citostático y/o citotóxico sobre una célula. Generalmente, la actividad citotóxica o citostática de un conjugado anticuerpo-fármaco se puede medir mediante: exposición de células de mamífero que expresan una proteína objetivo del conjugado anticuerpo-fármaco en un medio de cultivo celular; cultivar las células durante un período de aproximadamente 6 horas a aproximadamente 5 días; y medir de la viabilidad celular. Pueden usarse ensayos in vitro con base en células para medir la viabilidad (proliferación), la citotoxicidad y la inducción de apoptosis (activación de caspasa) del conjugado anticuerpo-fármaco.
Para determinar si un conjugado anticuerpo-fármaco ejerce un efecto citostático, puede usarse un ensayo de incorporación de timidina. Por ejemplo, las células cancerosas que expresan un antígeno objetivo a una densidad de 5.000 células/pocillo de una placa de 96 pocillos pueden cultivarse durante un período de 72 horas y exponerse a 0,5 |jC¡ de 3H-timidina durante las 8 horas finales del período de 72 horas. La incorporación de 3H-timidina en las células del cultivo se mide en presencia y ausencia del conjugado anticuerpo-fármaco.
Para determinar la citotoxicidad, se puede medir la necrosis o apoptosis (muerte celular programada). La necrosis suele ir acompañada de una mayor permeabilidad de la membrana plasmática; hinchazón de la célula y ruptura de la membrana plasmática. La apoptosis se caracteriza típicamente por formación de ampollas en la membrana, condensación del citoplasma y activación de endonucleasas endógenas. La determinación de cualquiera de estos efectos sobre las células cancerosas indica que un conjugado anticuerpo-fármaco es útil en el tratamiento de cánceres.
La viabilidad celular se puede medir determinando en una célula la absorción de un tinte tal como rojo neutro, azul de tripano o azul ALAMARmr (véase, por ejemplo, Page et al., 1993, Intl. J. Oncology 3: 473 -476). En tal ensayo, las células se incuban en un medio que contiene el tinte, las células se lavan y el tinte restante, que refleja la captación celular del tinte, se mide espectrofotométricamente. El colorante de unión a proteínas sulforrodamina B (SRB) también se puede usar para medir la citotoxicidad (Skehan et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-12).
Alternativamente, se usa una sal de tetrazolio, tal como MTT, en un ensayo colorimétrico cuantitativo para la supervivencia y proliferación de células de mamíferos mediante la detección de células vivas, pero no muertas (véase, por ejemplo, Mosmann, 1983, J. Immunol. Methods 65: 55-63).
La apoptosis se puede cuantificar midiendo, por ejemplo, la fragmentación del ADN. Se encuentran disponibles métodos fotométricos comerciales para la determinación cuantitativa in vitro de la fragmentación del ADN. Ejemplos de tales ensayos, incluido TUNEL (que detecta la incorporación de nucleótidos marcados en ADN fragmentado) y ensayos basados en ELISA, se describen en Biochemica, 1999, no. 2, páginas 34-37 (Roche Molecular Biochemicals).
La apoptosis también se puede determinar midiendo los cambios morfológicos en una célula. Por ejemplo, al igual que con la necrosis, la pérdida de la integridad de la membrana plasmática se puede determinar midiendo la absorción de ciertos tintes (por ejemplo, un tinte fluorescente tal como, por ejemplo, naranja de acridina o bromuro de etidio). Duke y Cohen, Current Protocols in Immunology (Coligan et al. Eds., 1992, páginas 3.17.1-3.17.16) han descrito un método para medir el número de células apoptóticas. Las células también pueden marcarse con un colorante de ADN (por ejemplo, naranja de acridina, bromuro de etidio o yoduro de propidio) y observar las células para determinar la condensación y la marginación de la cromatina a lo largo de la membrana nuclear interna. Otros cambios morfológicos que pueden medirse para determinar la apoptosis incluyen, por ejemplo, condensación citoplásmica, aumento de la formación de ampollas en la membrana y contracción celular.
La presencia de células apoptóticas se puede medir tanto en los compartimentos unidos como en los "flotantes" de los cultivos. Por ejemplo, ambos compartimentos se pueden recolectar eliminando el sobrenadante, tripsinizando las células unidas, combinando las preparaciones después de una etapa de lavado por centrifugación (por ejemplo, 10 minutos a 2000 rpm) y detectando la apoptosis (por ejemplo, midiendo la fragmentación del ADN). (Véase, por ejemplo, Piazza et al., 1995, Cancer Research 55: 3110-16).
In vivo, el efecto de una composición terapéutica del anticuerpo anti-LY75 de la invención puede evaluarse en un modelo animal adecuado. Por ejemplo, pueden usarse modelos de cáncer xenogénico, en los que se introducen explantes de cáncer o tejidos de xenoinjerto pasados en animales inmunodeprimidos, tales como ratones desnudos o SCID (Klein et al., 1997, Nature Medicine 3: 402-408). La eficacia se puede medir usando ensayos que miden la inhibición de la formación de tumores, la regresión del tumor o la metástasis.
Las composiciones terapéuticas utilizadas en la práctica de los métodos anteriores se pueden formular en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el método de administración deseado. Los vehículos adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y generalmente no reacciona con el sistema inmunológico del paciente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de varios vehículos farmacéuticos estándar tales como soluciones salinas estériles tamponadas con fosfato, agua bacteriostática (véase, en general, Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, A. Osal., Ed., 1980).
Métodos para producir los anticuerpos de la invención.
La presente invención proporciona además métodos para producir los anticuerpos anti-LY75 divulgados. Estos métodos abarcan el cultivo de una célula huésped que contiene ácido nucleico aislado que codifica los anticuerpos de la invención. Como apreciarán los expertos en la técnica, esto se puede hacer de diversas formas, dependiendo de la naturaleza del anticuerpo. En algunas realizaciones, en el caso de que los anticuerpos de la invención sean anticuerpos tradicionales de longitud completa, por ejemplo, una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera bajo condiciones tales que se produzca un anticuerpo y pueda aislarse.
Las cadenas pesadas y ligeras variables de LY75_A1 se divulgan en el presente documento (secuencias de proteínas y de ácidos nucleicos); como se apreciará en la técnica, estos pueden aumentarse fácilmente para producir cadenas ligeras y pesadas de longitud completa. Es decir, habiendo proporcionado los fragmentos de ADN que codifican los segmentos Vh y Vk como se describe en este documento, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas estándar de ADN recombinante, por ejemplo, para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpos de longitud completa, en genes de fragmentos Fab, o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica Vk o Vh se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "operativamente enlazado", tal como se utiliza en este contexto, pretende indicar que los dos fragmentos de ADN están unidos de manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanezcan en el marco.
El ADN aislado que codifica la región Vh se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa uniendo operativamente el ADN que codifica Vh a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (Ch1, Ch2 y Ch3). Las secuencias de genes de la región constante de cadena pesada murina se conocen en la técnica [véase, por ejemplo, Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación del NIH No. 91-3242] y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero lo más preferiblemente es una región constante de IgG1 o IgG4. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica Vh puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica sólo la región constante Ch1 de cadena pesada.
El ADN aislado que codifica la región Vl/Vk se puede convertir en un gen de cadena ligera de longitud completa (así como en un gen de cadena ligera de Fab) uniendo operativamente el ADN que codifica Vl a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, Cl. Las secuencias de genes de región constante de cadena ligera murina se conocen en la técnica [véase, por ejemplo, Kabat, E. A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación del NIH No. 91-3242] y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación estándar por PCR. En realizaciones preferidas, la región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.
Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican Vh y Vl/Vk se unen operativamente a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, por ejemplo, que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de modo que las secuencias de Vh y Vl/Vk pueden expresarse como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones Vl/Vk y Vh unidas por el enlazador flexible [vease por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348: 552-554].
En general, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. Dichos polinucleótidos codifican tanto las regiones variables como las constantes de cada una de las cadenas pesada y ligera, aunque la presente invención también contempla otras combinaciones de acuerdo con las composiciones descritas en el presente documento. La presente invención también contempla fragmentos de oligonucleótidos derivados de los polinucleótidos divulgados y secuencias de ácido nucleico complementarias a estos polinucleótidos.
Los polinucleótidos pueden estar en forma de ARN o ADN. Los polinucleótidos en forma de ADN, ADNc, ADN genómico, análogos de ácidos nucleicos y ADN sintético están dentro del alcance de la presente invención. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario, puede ser la cadena codificante (sentido) o la cadena no codificante (antisentido). La secuencia codificante que codifica el polipéptido puede ser idéntica a la secuencia codificante proporcionada en este documento o puede ser una secuencia codificante diferente, secuencia que, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica los mismos polipéptidos que el ADN proporcionado en el presente documento.
En algunas realizaciones, el ácido o ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención se incorporan en vectores de expresión, que pueden ser extracromosómicos o diseñados para integrarse en el genoma de la célula huésped en la que se introducen. Los vectores de expresión pueden contener cualquier número de secuencias reguladoras apropiadas (incluidas, entre otras, secuencias de control de la transcripción y traducción, promotores, sitios de unión ribosómica, potenciadores, orígenes de replicación, etc.) u otros componentes (genes de selección, etc.), todos los cuales están enlazados operativamente como es bien conocido en la técnica. En algunos casos, se utilizan dos ácidos nucleicos y cada uno se coloca en un vector de expresión diferente (por ejemplo, cadena pesada en un primer vector de expresión, cadena ligera en un segundo vector de expresión) o, alternativamente, se pueden colocar en el mismo vector de expresión. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector o los vectores de expresión, incluida la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc.
En general, los ácidos nucleicos y/o la expresión se pueden introducir en una célula huésped adecuada para crear una célula huésped recombinante usando cualquier método apropiado para la célula huésped seleccionada (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección), de manera que la molécula o moléculas de ácido nucleico están unidas operativamente a uno o más elementos de control de la expresión (por ejemplo, en un vector, en un constructo creado por procesos en la célula, integrada en el genoma de la célula huésped). La célula huésped recombinante resultante se puede mantener en condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en presencia de un inductor, en un animal no humano adecuado, en un medio de cultivo adecuado complementado con sales apropiadas, factores de crecimiento, antibióticos, suplementos nutricionales, etc.), mediante el cual se producen el o los polipéptidos codificados. En algunos casos, las cadenas pesadas se producen en una célula y la cadena ligera en otra.
Las líneas celulares de mamíferos disponibles como huéspedes para la expresión se conocen en la técnica e incluyen muchas líneas celulares inmortalizadas disponibles a través de la American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, incluidas, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células HEK 293, células NSO, células HeLa, células de riñón de hámster bebe (BHK), células de riñón de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2) y varias otras líneas celulares. También se pueden usar células que no son de mamíferos, pero no se limitan a, bacterias, levaduras, insectos y plantas para expresar anticuerpos recombinantes. En algunas realizaciones, los anticuerpos se pueden producir en animales transgénicos tales como vacas o pollos.
Los métodos generales para la biología molecular, expresión, purificación y cribado de anticuerpos son bien conocidos, por ejemplo, véanse las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.816.567, 4.816.397, 6.331.415 y 7.923.221, así como Antibody Engineering, editado por Kontermann & Dubel, Springer, Heidelberg, 2001 y 2010 Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5: 683-689; Maynard y Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2: 339-76; y Morrison, S. (1985) Science 229: 1202.
Composiciones farmacéuticas
En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos LY75, o una porción o porciones de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención, formulada junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de anticuerpos (por ejemplo, dos o más diferentes), o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o biespecíficos) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en terapia de combinación, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anti-anticuerpo de la presente invención combinado con al menos otro agente antitumoral, o un agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Los ejemplos de agentes terapéuticos que pueden usarse en terapia de combinación se describen con mayor detalle a continuación en la sección sobre usos de los anticuerpos de la invención.
Como se usa en este documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, inmunoconjugado o molécula biespecífica, puede recubrirse con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.
Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado [véase, por ejemplo, Berge, S.M. et al., (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19]. Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácidos y sales de adición de bases. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos. Las sales de adición de bases incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N, N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína.
Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol; y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico.
Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización, citados anteriormente, y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede producirse mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones.
Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Puede conseguirse una absorción prolongada de las composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de microfiltración esterilizante. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada en forma estéril del mismo.
La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una única forma de dosificación variará dependiendo del sujeto que se esté tratando y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una única forma de dosificación será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, de un 100 por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente un 0,01 por ciento a aproximadamente un 99 por ciento de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente un 0,1 por ciento a aproximadamente un 70 por ciento, más preferiblemente de aproximadamente un 1 por ciento a aproximadamente un 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación, como se usa en este documento, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se desea lograr, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de la preparación de compuestos de este tipo de compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.
Para la administración del anticuerpo, la dosificación varía de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, por ejemplo, de 0,001 a 50 mg/kg, de 0,005 a 20 mg/kg, de 0,01 a 10 mg/kg y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosificaciones pueden ser de 0,05 mg/kg de peso corporal, 0,1 mg/kg de peso corporal, 0,3 mg/kg de peso corporal, 0,3 mg/kg de peso corporal, 0,5 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 2 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 4 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal 6 mg/kg de peso corporal, 7 mg/kg de peso corporal, 8 mg/kg de peso corporal, 9 mg/kg de peso corporal peso, 10 mg/kg de peso corporal, 12 mg/kg de peso corporal, 15 mg/kg de peso corporal, 20 mg/kg de peso corporal, 25 mg/kg de peso corporal, 30 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 0,1-20 mg/kg, 0,5-15 mg/kg, 1-10 mg/kg, 2-8 mg/kg, 3-7 mg/kg, 4-6 mg/kg. Un ejemplo de régimen de tratamiento implica la administración una vez al día, una vez cada 2 días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 6 semanas, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-LY75 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante administración intravenosa, y el anticuerpo se administra utilizando uno de los siguientes programas de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, luego cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.
En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo generalmente se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones únicas pueden ser, por ejemplo, en forma diaria, dos veces por semana, semanal, mensual, cada tres meses, cada seis meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indica midiendo los niveles en sangre de anticuerpo para el antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de anticuerpos en plasma de aproximadamente 1-1000 pg/ml, 5-750 pg/ml, 10-600 pg/ml, 15-500 pg/ml, 20-400 pg/ml y en algunos métodos, aproximadamente 25-300 pg/ml.
Alternativamente, el anticuerpo se puede administrar como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosificación y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguidos de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos y los anticuerpos no humanos. La dosificación y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta en intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de entonces, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares empleadas de la presente invención, o el éster, sal o amida de los mismos, la vía de administración, el momento de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración del tratamiento, otros medicamentos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historial médico previo del paciente que está siendo tratado, y factores similares bien conocidos en las artes médicas.
Una "dosificación terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-LY75 de la invención preferiblemente da como resultado una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos sin síntomas de la enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debida a la aflicción de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de los tumores mediados por LY75, una "dosificación terapéuticamente eficaz" inhibe preferiblemente el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente un 20%, al menos aproximadamente un 30%, más preferiblemente al menos aproximadamente un 40%, al menos aproximadamente 50% incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70% y aún más preferiblemente en al menos aproximadamente 80% o al menos aproximadamente 90%, con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral se puede evaluar en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición se puede evaluar examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, tal inhibición se puede medir in vitro mediante ensayos conocidos por el médico experto. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede reducir el tamaño del tumor o mejorar de otro modo los síntomas en un sujeto. Un experto en la técnica sería capaz de determinar tales cantidades con base en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto y la composición particular o vía de administración seleccionada.
Una composición de la presente invención se puede administrar mediante una o más vías de administración usando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos de la invención incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se usa en este documento significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, generalmente por inyección, e incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, inyección e infusión subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
Alternativamente, un anticuerpo de la invención se puede administrar por vía no parenteral, tal como vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.
Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán al compuesto contra una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como etileno acetato de etileno vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son generalmente conocidos por los expertos en la técnica [véase, por ejemplo, Sistemas de administración de fármacos de liberación sostenida y controlada (1978) J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., N.Y].
Las composiciones terapéuticas se pueden administrar con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición terapéutica de la invención se puede administrar con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos divulgados en las patentes de los Estados Unidos Nos 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Ejemplos de implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: la patente de los Estados Unidos No. 4.487.603, que divulga una bomba de microinfusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; la patente de los Estados Unidos No. 4.486.194, que divulga un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la patente de los Estados Unidos No 4.447.233, que divulga una bomba de infusión de medicación para administrar medicación a una velocidad de infusión precisa; la patente de los Estados Unidos No. 4.447.224, que divulga un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármacos; la patente de los Estados Unidos No 4.439.196, que divulga un sistema de suministro de fármaco osmótico que tiene compartimentos de múltiples cámaras; y la patente de los Estados Unidos No. 4.475.196, que divulga un sistema de administración de fármacos osmóticos. Los expertos en la técnica conocen muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden formular para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea), se pueden formular, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender una o más fracciones que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, mejorando así la administración de fármacos dirigida [véase, por ejemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685]. Los ejemplos de fracciones de direccionamiento incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 5.416.016); manósidos [Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Comun. 153: 1038]; anticuerpos [P.G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180]; receptor de proteína A tensioactivo [Briscoe et al., (1995) Enm. J. Physiol. 1233: 134]; p120 [Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090]; véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273.
Usos y métodos
Los anticuerpos, composiciones de anticuerpos y métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades diagnósticas y terapéuticas in vitro e in vivo que implican el diagnóstico y tratamiento de trastornos mediados por LY75.
En algunas realizaciones, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar una variedad de trastornos. Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos mediados por la actividad de LY75. Los métodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno asociado con la expresión aberrante de LY75. Cuando se administran anticuerpos contra LY75 junto con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente.
Dada la unión específica de los anticuerpos de la invención para LY75, los anticuerpos de la invención pueden usarse para detectar específicamente la expresión de LY75 en la superficie de las células y, además, pueden usarse para purificar LY75 mediante purificación por inmunoafinidad.
Además, dada la expresión de LY75 en células tumorales, los anticuerpos, las composiciones de anticuerpos y los métodos de la presente invención pueden usarse para tratar a un sujeto con un trastorno tumorigénico, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan LY75 o en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de dicho trastorno, que incluye, por ejemplo, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de hígado , cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, incluido cáncer de mama triple negativo, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, mieloma, leucemia, incluida leucemia linfocítica crónica y leucemia mieloide aguda, linfoma no Hodgkin, incluido DLBCL, Linfoma de células B, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT), linfoma de células B rico en células T/histiocitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma de células T, linfoma periférico de células T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma angioinmunoblástico de células T. Se ha demostrado que LY75 se internaliza en la unión de anticuerpos como se ilustra en los Ejemplos 5 y 7 a continuación, permitiendo así que los anticuerpos de la invención se utilicen en cualquier mecanismo de acción de carga útil, por ejemplo, un enfoque de ADC, radioinmunoconjugado o enfoque de ADEPT.
En un ejemplo, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, fragmentos de anticuerpos, Nanobody®, moléculas y composiciones multiespecíficas y biespecíficas, etc.) pueden usarse para detectar niveles de LY75, o niveles de células que contienen LY75 en la superficie de su membrana, niveles que luego pueden relacionarse con ciertos síntomas de la enfermedad. Alternativamente, los anticuerpos, generalmente administrados como ADC, pueden usarse para inhibir o bloquear la función de LY75 que, a su vez, puede vincularse a la prevención o mejora de ciertos síntomas de enfermedad, implicando así a LY75 como mediador de la enfermedad. Esto se puede lograr poniendo en contacto una muestra y una muestra de control con el anticuerpo anti-LY75 en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y LY75. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y LY75 se detecta y se compara en la muestra y el control.
En otro ejemplo, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas y composiciones multiespecíficas y biespecíficas) pueden probarse inicialmente para determinar la actividad de unión asociada con el uso terapéutico o diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones pueden ensayarse usando los ensayos de citometría de flujo descritos en los Ejemplos siguientes.
Los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas, inmunoconjugados y composiciones) de la invención tienen utilidad adicional en la terapia y diagnóstico de enfermedades relacionadas con LY75. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales, las moléculas multiespecíficas o biespecíficas y los inmunoconjugados pueden usarse para provocar in vivo o in vitro una o más de las siguientes actividades biológicas: inhibir el crecimiento y/o matar una célula que expresa LY75; mediar en la fagocitosis o ADCC de una célula que expresa LY75 en presencia de células efectoras humanas, o bloquear la unión del ligando LY75 a LY75.
En una realización particular, los anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas y composiciones multiespecíficas y biespecíficas) se usan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de enfermedades relacionadas con LY75. Ejemplos de enfermedades relacionadas con LY75 incluyen, entre otras, tejidos de cáncer humano que representan cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de riñón, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de vejiga, mieloma, leucemia, incluida la leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, linfoma no Hodgkin, incluido DLBCL, linfoma de células B, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT), Linfoma de células B rico en células T/histiocitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma de células T, linfoma periférico de células T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma angioinmunoblástico de células T y cáncer de pulmón.
Las vías adecuadas de administración de las composiciones de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención in vivo e in vitro son bien conocidas en la técnica y pueden seleccionarlas los expertos en la materia. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos se pueden administrar mediante inyección (por ejemplo, intravenosa o subcutánea). Las dosis adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y de la concentración y/o formulación de la composición del anticuerpo.
Como se describió previamente, los anticuerpos anti-LY75 de la invención pueden coadministrarse con uno u otros agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo se puede unir al agente (como un inmunocomplejo) o se puede administrar por separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo se puede administrar antes, después o al mismo tiempo que el agente o se puede coadministrar con otras terapias conocidas, por ejemplo, una terapia contra el cáncer, por ejemplo, radiación. Dichos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucilo y hidroxiurea de ciclofosfamida que, por sí mismos, solo son eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa en una dosis de 100 mg/kg una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa en una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. Otros agentes adecuados para la coadministración con los anticuerpos de la invención incluyen otros agentes usados para el tratamiento de cánceres, por ejemplo, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o cáncer de pulmón, tal como Avastin®, 5-FU y gemcitabina. La coadministración de los anticuerpos anti-LY75 o sus fragmentos de unión a antígeno de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anticancerígenos que operan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico en células tumorales humanas. Tal coadministración puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las haría no reactivas con el anticuerpo.
Células efectoras específicas del objetivo, por ejemplo, células efectoras unidas a composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden usarse como agentes terapéuticos. Las células efectoras para el direccionamiento pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células portadoras de receptores de IgG o IgA. Si se desea, se pueden obtener células efectoras del sujeto a tratar. Las células efectoras específicas del objetivo se pueden administrar como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 108 - 109, pero variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener la localización en la célula objetivo, por ejemplo, una célula tumoral que expresa LY75, y para afectar la muerte celular, por ejemplo, fagocitosis. Las vías de administración también pueden variar.
La terapia con células efectoras específicas del objetivo se puede realizar junto con otras técnicas para la eliminación de células objetivo. Por ejemplo, la terapia antitumoral que usa las composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención y/o células efectoras armadas con estas composiciones puede usarse junto con quimioterapia. Además, la inmunoterapia de combinación puede usarse para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de células tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-LY75 unidos a RI anti-Fc-gamma o anti-CD3 pueden usarse junto con agentes de unión específicos del receptor de IgG o IgA.
Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención también se pueden usar para modular los niveles de FcyR o FcyR en las células efectoras, como por ejemplo mediante la protección y eliminación de receptores en la superficie celular. También se pueden usar mezclas de receptores anti-Fc para este propósito.
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención que tienen sitios de unión del complemento, tales como porciones de IgG1, IgG2 o IgG3 o IgM que se unen al complemento, también se pueden usar en la presencia de complemento. En una realización, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprenden células objetivo con un agente de unión de la invención y células efectoras apropiadas puede complementarse mediante la adición de complemento o complemento que contiene suero. La fagocitosis de las células objetivo recubiertas con un agente de unión de la invención puede mejorarse mediante la unión de proteínas del complemento. En otra realización, las células objetivo recubiertas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden lisarse mediante el complemento. En otra realización más, las composiciones de la invención no activan el complemento.
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención también se pueden administrar junto con el complemento. En determinadas realizaciones, la presente divulgación proporciona composiciones que comprenden anticuerpos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones pueden ser ventajosas cuando el complemento se localiza muy cerca de los anticuerpos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas. Alternativamente, los anticuerpos, moléculas multiespecíficas o biespecíficas de la invención y el complemento o suero se pueden administrar por separado.
También se describen kits que comprenden las composiciones de anticuerpos de la invención (por ejemplo, anticuerpos monoclonales, moléculas biespecíficas o multiespecíficas o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit puede contener además uno o más reactivos adicionales, tal como un reactivo inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico, o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (por ejemplo, un anticuerpo que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno LY75 distinto del primer anticuerpo).
Por consiguiente, a los pacientes tratados con composiciones de anticuerpos de la invención se les puede administrar adicionalmente (antes, simultáneamente o después de la administración de un anticuerpo de la invención) con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que potencia o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos.
En otras realizaciones, el sujeto puede tratarse adicionalmente con un agente que modula, por ejemplo, potencia o inhibe la expresión o actividad de Fcy o receptores Fcy, por ejemplo, tratando al sujeto con una citocina. Las citocinas preferidas para la administración durante el tratamiento con la molécula multiespecífica incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), interferón Y (IFN-y) y factor de necrosis tumoral (TNF).
Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también se pueden usar para apuntar a células que expresan FcyR o LY75, por ejemplo, para marcar dichas células. Para tal uso, el agente de unión se puede unir a una molécula que se puede detectar. Por lo tanto, la descripción proporciona métodos para localizar células ex vivo o in vitro que expresan receptores Fc, tales como FcyR o LY75. El marcador detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático.
En un ejemplo, la descripción proporciona métodos para detectar la presencia del antígeno LY75 en una muestra, o medir la cantidad del antígeno LY75, que comprende poner en contacto la muestra y una muestra de control con un anticuerpo monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a LY75, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o parte del mismo y LY75. A continuación, se detecta la formación de un complejo, en el que una formación de complejo diferente entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia del antígeno lY75 en la muestra.
En otros ejemplos, la invención proporciona métodos para tratar un trastorno mediado por LY75 en un sujeto, por ejemplo, cánceres humanos, incluyendo cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de tiroides, cáncer de esófago, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de piel, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, incluido cáncer de mama triple negativo, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, mieloma, leucemia, que incluye leucemia linfocítica crónica y leucemia mieloide aguda, y linfoma no Hodgkin, que incluye DLBCL, linfoma de células B, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT), linfoma de células B rico en células T/histiocitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma de células T, linfoma periférico de células T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma angioinmunoblástico de células T.
En todas las realizaciones de la invención, los cánceres preferidos incluyen linfoma no Hodgkin, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica y cáncer de mama triple negativo, cáncer de vejiga y cáncer de páncreas.
La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben interpretarse como limitantes adicionales.
Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra el antígeno LY75
Siguiendo procedimientos estándar, se inmunizaron ratones (xenorratón IgG1) con células CHO transfectadas con LY75 de longitud completa.
La especificidad de los anticuerpos producidos contra LY75 se ensayó mediante citometría de flujo en células HEK293 transfectadas con LY75 y posteriormente en células HT29 que expresan LY75. Para probar la capacidad de los anticuerpos para unirse a la proteína LY75 de la superficie celular, los anticuerpos se incubaron con las células que expresan LY75. Las células se lavaron en tampón FACS (DPBS, FBS al 2%), se centrifugaron y se resuspendieron en 100 |jl del anticuerpo LY75 primario diluido (también diluido en tampón FACS). El complejo anticuerpo-línea celular se incubó en hielo durante 60 min y luego se lavó dos veces con tampón FACS como se describió anteriormente. El sedimento de células-anticuerpo se resuspendió en 100 j l del anticuerpo secundario diluido (también diluido en tampón FACS) y se incubó en hielo durante 60 minutos. El sedimento se lavó como antes y se resuspendió en 200 j l de tampón FACs . Las muestras se cargaron en el citómetro de flujo BD FACScanto II y los datos se analizaron utilizando el software BD FACSdiva (no se muestran los resultados).
Ejemplo 2: Caracterización estructural de anticuerpos monoclonales contra LY75
Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal LY75_A1 se obtuvieron usando técnicas de PCR estándar y se secuenciaron usando técnicas de secuenciación de ADN estándar.
Las secuencias de anticuerpos se pueden mutagenizar para revertir nuevamente a los residuos de línea germinal en uno o más residuos.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de LY75_A1 se muestran en las SEQ ID NOs: 3 y 1, respectivamente.
Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de LY75_A1 se muestran en las SEQ ID NOs: 4 y 2, respectivamente.
La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada LY75_A1 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas demostró que la cadena pesada LY75_A1 utiliza un segmento Vh de la línea germinal humana Vh 3-15 y un segmento Jh de la línea germinal humana Jh JH4. El análisis adicional de la secuencia de Vh de LY75_A1 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las SEQ ID NO: 5, 6 y 7, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias Vh de CDR1, CDR2 y CDR3 de LY75_A1 con la secuencia de línea germinal Vh 3-15 y línea germinal Jh JH4 se muestran en la Figura 1.
La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera LY75_A1 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de LY75_A1 utiliza un segmento Vk de la línea germinal humana Vk 012 y un segmento Jk de la línea germinal humana Jk JK4. El análisis adicional de la secuencia Vk de LY75_A1 usando el sistema Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las SEQ ID NO: 8, 9 y 10, respectivamente. Los alineamientos de las secuencias Vk CDR1, CDR2 y CDR3 de LY75_A1 con las secuencias de la línea germinal Vk O12 y Jk JK4 de la línea germinal se muestran en la Figura 2.
Ejemplo 3: Inmunohistoquímica con anticuerpo monoclonal para LY75
Usando los anticuerpos monoclonales humanos específicos para LY75, se realizó inmunohistoquímica en sedimentos de células HT-29 y A549, matrices de linfoma no Hodgkin y cáncer de páncreas FFPE, y tumores de linfoma/leucemia congelados en forma fresca, cáncer de ovario, cáncer de páncreas y secciones de cáncer de mama y una matriz de tejido normal.
Materiales y Métodos
Materiales
Xilenos (X5P-1gal) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Histoprep etanol al 100% (HC-800-1GAL) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Tampón de citrato 10x para la recuperación de epítopos inducida por calor (AP9003125) de Thermo Scientific, MA, EE. UU. Supresor de peroxidasa (35000) de Thermo Scientific, *Pierce* Thermo Scientific MA, EE. UU. Bloque de proteína libre de suero (X0909) de Dako, CA, EE. UU.
Anticuerpo secundario: anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con Fab-FITC (109-097-003) de Jackson Immunoresearch, PA, EE. UU.
IgG humana pura Chrome, molécula completa (09-000-003) de Jackson Immunoresearch, PA, EE. UU. Anticuerpo terciario: anti-FITC de ratón (ab10257) de Abcam, MA, EE. UU.
Control de isotipo de IgG humana purificada (1-001A) de R&D Systems, MN, EE. UU.
Tween-20 (BP337-100) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Acetona (BP2403-4) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Polímero Dual Link EnVision+ conjugado con HRP, ratón y conejo (K4063) de Dako, CA, EE. UU. Kit de solución DAB-2 (882014) de Invitrogen, NY, EE. UU.
Harris Hematoxilina (23-245-677) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medios de montaje Faramount (S302580) de Dako, CA, EE. UU.
Las secciones de tejido y las matrices se adquirieron en US Biomax Inc., MD, EE. UU. U Origene, MD, EE. UU. Preparación de portaobjetos FFPE: desparafinación y rehidratación
Los portaobjetos FFPE se desparafinaron en xileno (2 x 3 minutos) y luego se rehidrataron a través de xileno: etanol al 100% 1:1 (1 x 3 minutos), etanol al 100% (2 x 3 minutos), etanol al 95% (1 x 3 minutos), etanol al 70% (1 x 3 minutos), etanol al 50% (1 x 3 minutos) y agua corriente (1 x 3 minutos). Preparación de portaobjetos FFPE: recuperación de antígeno (Microondas).
El antígeno LY75 se recuperó usando calor de microondas, alta potencia hasta ebullición y luego baja potencia durante 10 minutos en 50 ml de tampón citrato 1x en un frasco Coplin. A continuación, los portaobjetos se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 15 minutos más y luego se lavaron con agua del grifo durante 3 minutos. Se dibujaron círculos alrededor de cada sección de tejido/TMA con una pluma de barrera hidrófoba y luego se lavaron los portaobjetos 3 veces en PBS, 3 minutos cada lavado.
Preparación de portaobjetos FF
Se sacaron los portaobjetos del almacenamiento a -80 °C y se dejaron secar a temperatura ambiente en la campana extractora durante 20-30 minutos. Los portaobjetos se fijaron durante 10 min en acetona enfriada con hielo a -20 °C, luego se dejaron secar durante 20 min en la campana extractora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron y rehidrataron en PBS, 3 lavados durante 3 min cada uno. Las secciones se delinearon con una pluma de barrera hidrófoba.
Preparación de complejos de anticuerpos
El anticuerpo anti-LY75 primario se diluyó en bloque de proteína libre de suero (SFPB) para obtener una solución con una concentración 20 veces mayor que la concentración final deseada (20 pg/ml para 1 pg/ml final). El anticuerpo secundario, fragmento de unión a antígeno (Fab), de cabra anti-inmunoglobulina G humana (IgG) se preparó de manera similar en SFPB para crear una solución de concentración igual.
Se combinaron volúmenes iguales de anticuerpos primarios y secundarios en un tubo etiquetado, se mezclaron suavemente y se incubaron durante 3 minutos a temperatura ambiente, lo que resultó en una concentración de anticuerpo primario 10 veces mayor que la concentración final deseada (10 pg/ml para 1 pg/ml final). Esta mezcla se diluyó 1:5 con SFPB, se mezcló suavemente y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente, dando como resultado una concentración de anticuerpo primario dos veces mayor que la concentración final deseada (2 pg/ml para 1 pg/ml final).
Para producir los complejos de tinción finales, se preparó una solución al 1% (10 pg/pl) de IgG humana en SFPB y se añadió un volumen igual a la mezcla de anticuerpos primario/secundario. Esta combinación se mezcló suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos, diluyendo a la mitad de la concentración de anticuerpo primario de la mezcla de anticuerpo primario/secundario y dando como resultado la concentración de anticuerpo primario final deseada (1 pg/ml).
Inmunotinción
Mientras tanto, la actividad de peroxidasa tisular endógena se bloqueó incubando tejidos con supresor de peroxidasa durante 5-10 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada. A continuación, los portaobjetos se lavaron en PBS 3 x 3 minutos en cada lavado. Los tejidos se incubaron en SFPB durante 30 minutos a temperatura ambiente en una cámara humidificada. Los complejos de tinción final se aplicaron a cada sección de tejido y/o microarreglo, y los portaobjetos se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada. A continuación, los portaobjetos se lavaron una vez en PBS y una vez en PBST (PBS Tween-20 al 0,125%), 3 minutos cada lavado. El anticuerpo terciario de ratón anti-FITC se aplicó a una concentración de 2 pg/ml durante 30 min, a temperatura ambiente, en una cámara humidificada. A continuación, las secciones se lavaron una vez en PBS y una vez en PBST, 3 min en cada lavado. A continuación, se aplicó el polímero Dual LinK EnVision+ anti-ratón/conejo conjugado con HRP a los tejidos y se incubaron los portaobjetos durante 30 min a temperatura ambiente en una cámara humidificada. A continuación, los portaobjetos se lavaron una vez en PBS, una vez en PBST, 3 minutos cada lavado. Los tejidos se incubaron en una solución de DAB preparada de acuerdo con las instrucciones del fabricante a temperatura ambiente durante 10 min. A continuación, los portaobjetos se lavaron una vez con agua corriente del grifo durante 2 minutos y una vez en PBS durante 3 minutos. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina durante 30 segundos a temperatura ambiente y se lavaron con agua corriente del grifo. Los portaobjetos se secaron a temperatura ambiente durante 30 minutos y luego se montaron cubreobjetos sobre los portaobjetos utilizando medios de montaje Faramount. Resultados
LY75_A1 mostró positividad en muestras de cáncer de mama triple negativo FFPE, en las que el 77% de las secciones mostraron tinción positiva y el 55% exhibió una tinción robusta (+++).
La tinción para LY75 en tejidos normales FF estuvo generalmente ausente o baja. El epitelio ductal de la mama, la glándula salival y el páncreas mostró una tinción marcada de baja a moderada, y el bazo se tiñó de forma positiva baja. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos a LY75 pueden tener utilidad como compuestos terapéuticos y diagnóstico en algunos de los cánceres probados y posiblemente otros tipos de cáncer que muestran expresión de LY75.
Ejemplo 4: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 en células HT-29
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 ha 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 pl/pocillo de PBS y 100 pl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
Los resultados representados en la Figura 3a muestran una subpoblación de anticuerpos, que se sabe que se unen a LY75, que pueden inducir la muerte celular de las células HT-29. Esto sugiere que, si bien los anticuerpos pueden unirse a LY75, solo unos pocos muestran eficacia cuando se conjugan con DM1. Los anticuerpos se eligieron luego de la subpoblación para un análisis adicional de la actividad citotóxica.
Ejemplo 5: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en células de cáncer colorrectal
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 pl/pocillo de PBS y 100 pl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3b muestra la actividad citotóxica de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia las células HT-29. Estos resultados demuestran un aumento en la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos y otros anticuerpos anti-LY75 conjugados con una toxina (seleccionados del Ejemplo 1).
Ejemplo 6: Eficacia de los anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en líneas celulares de linfoma
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 pl/pocillo de PBS y 100 pl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3c muestra la actividad citotóxica de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia las células RAJI. La Figura 3d muestra la actividad citotóxica de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia las células de Namalwa. La Figura 3e muestra la actividad citotóxica de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia las células Karpas 299. Estos resultados demuestran un aumento en la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos y otros anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 (seleccionados del Ejemplo 1).
Ejemplo 7: Eficacia de los anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugado con DM1 y conjugado con DM4 en líneas celulares de cáncer de páncreas
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 |jl/pocillo de suspensión de células a los pocilios de una placa de 96 pocilios con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 jl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 jl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 jl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 jl/pocillo de PBS y 100 j l de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3f muestra la actividad citotóxica de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células BxPC3. La Figura 3g muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células HupT4. La Figura 3h muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células HPAFFII. Estos resultados demuestran un aumento en la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos y otros anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 (seleccionados del Ejemplo 1).
Ejemplo 8: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugado con DM1 y conjugado con DM4 en líneas celulares de leucemia linfocítica crónica
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 jl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 jl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 jl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 jl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 jl/pocillo de PBS y 100 j l de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3i muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células EHEB. La Figura 3j muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células Mec-1. Estos resultados demuestran un aumento en la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos y otros anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 (seleccionados del Ejemplo 1).
Ejemplo 9: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en líneas celulares de leucemia monocítica aguda
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 pl/pocillo de PBS y 100 pl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3k muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células AML-193. Estos resultados demuestran un aumento en la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos y otros anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 (seleccionados del Ejemplo 1).
Ejemplo 10: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugado con DM1 y conjugado con DM4 en líneas celulares de cáncer de mama
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 pl/pocillo de PBS y 100 pl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3I muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células HCC 70 (negativas para ER, negativas para PR y negativas para Her2). La Figura 3m muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células HCC 1806 (negativas para ER, negativas para PR y negativas para Her2). La Figura 3n muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células MDA-MB-468. Estos resultados demuestran un aumento de la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos.
Ejemplo 11: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugado con DM1 y conjugado con DM4 en líneas celulares de cáncer de vejiga
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C. La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 pl/pocillo de PBS y 100 pl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3o muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células RT4. La Figura 3p muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células 5637. La Figura 3q muestra la actividad citotóxica de los anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células SW780. Estos resultados demuestran un aumento de la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos.
Ejemplo 12: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en líneas celulares de cáncer de cabeza y cuello
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 pl/pocillo de PBS y 100 pl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3r muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células SCC-9. Estos resultados demuestran un aumento de la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos. Ejemplo 13: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugado con DM1 y conjugado con DM4 en líneas celulares de cáncer de esófago
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 pl/pocillo de PBS y 100 pl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3s muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células OE 19. Estos resultados demuestran un aumento de la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos. Ejemplo 14: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en líneas celulares de cáncer de ovario
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 pl/pocillo de PBS y 100 pl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3t muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células OVCAR-3. La Figura 3u muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células SK-OV-3. Estos resultados demuestran un aumento de la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos.
Ejemplo 15: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en líneas celulares de mieloma múltiple
Materiales
Separador de células (disociación celular no enzimática) (MT-25-056CI) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
PBS pH 7,4 (1X) (SH30028LS) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
Medio RPMI 1640 (MT-10-041-CM) de Fisher Scientific, PA, EE. UU.
CellTiter-Glo (G7572) de Promega, WI, EE. UU.
Método
Las células se disociaron usando un separador de células y se contaron. 5e3 células/pocillo se centrifugaron hasta obtener un sedimento (para células en suspensión, se pueden usar más células dependiendo del tiempo de duplicación de las células, tal como 10e3 células/pocillo). El sedimento se resuspendió en medio de cultivo a una concentración de 1e5 células/ml.
Se añadieron 50 pl/pocillo de suspensión de células a los pocillos de una placa de 96 pocillos con fondo transparente y lados blancos. Los anticuerpos se diluyeron y valoraron en 8 puntos (valoraciones de 3 veces) correspondientes a concentraciones entre 0-20 nM (dos veces las concentraciones de prueba). Se agregaron anticuerpos diluidos o medio (para muestras no tratadas) (50 pl/pocillo) a los pocillos apropiados. Se añadió un exceso de medio (200 pl/pocillo) a las filas y columnas exteriores de la placa para evitar la evaporación. La placa se incubó durante 72 h a 37 °C.
La placa se retiró de la incubadora y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras tanto, se descongeló la solución CellTiter-Glo. La placa se sacudió y se lavó 1x con 100 pl/pocillo de PBS (para las células en suspensión, la placa se centrifuga primero para sedimentar las células). Se añadieron 100 |jl/pocillo de PBS y 100 |jl de CellTiter-Glo a cada pocillo y se trituró para mezclar. La placa se incubó en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos y se visualizó mediante microscopía para asegurar que se produjera una lisis celular eficaz. A continuación, se leyó la placa en un luminómetro Glomax.
Resultados
La Figura 3v muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células MOLP-8. La Figura 3w muestra la actividad citotóxica de anticuerpos anti-LY75 conjugados con DM1 y DM4 hacia células RPMI8226. Estos resultados demuestran un aumento de la actividad citotóxica proporcional a la concentración de anticuerpos.
Ejemplo 16: Eficacia de los anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en modelos de xenoinjerto Raji
La eficacia de LY75_DM1 y LY75_DM4 se ensayó en un modelo de xenoinjerto de ratón SCID de linfoma de Burkitt Raji subcutáneo.
Se inocularon subcutáneamente ratones SCID inmunodeficientes con células tumorales Raji (linfoma de Burkitt humano). Se permitió que los tumores se establecieran y los ratones se clasificaron en cinco grupos de tratamiento de 3-6 ratones por grupo. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó un tamaño promedio de 129-132 mm3 por grupo, cada grupo se trató con uno de los siguientes compuestos, administrados por vía intravenosa con las dosificaciones indicadas: Grupo 1 (Vehículo; solución salina tamponada con fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Control de isotipo-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (control de isotipo-SPBDDM4; 5 mg/kg). Se administró una segunda dosis una semana después. Se controlaron los pesos corporales (BW), los ratones se examinaron con frecuencia para determinar el estado de salud y los efectos secundarios adversos, y los tumores se midieron dos veces por semana. Los ratones fueron sacrificados cuando sus tumores alcanzaron el punto final de volumen tumoral de 2000 mm3 o después de 60 días, lo que ocurriera primero. La eficacia se determinó a partir del retraso del crecimiento tumoral (TGD), el aumento del tiempo medio transcurrido hasta el punto final (TTE) y del análisis del rango logarítmico de las diferencias en las curvas de supervivencia de Kaplan Meier en ratones tratados con ADC frente a ratones tratados con PBS. Se tomaron muestras de los primeros cinco ratones de control tratados con vehículo que alcanzaron el punto final en busca de tumores que se procesaron mediante fijación con formalina y se incluyeron en parafina.
Resultados
La Figura 4a muestra que LY75_DM1 y LY75_DM4 demostraron cada uno una actividad antitumoral significativa y una supervivencia significativamente prolongada en el modelo de xenoinjerto de ratón SCID de linfoma de Raji Burkitt en comparación con los controles; sin embargo, las dosis de 5 mg/kg de LY75_DM4 fueron significativamente más efectivas que las dosis de 10 mg/kg de LY75_DM1, lo que resultó en 5 de 6 ratones con regresión tumoral completa pero transitoria. Todos los tratamientos fueron bien tolerados y no se observaron signos clínicos de toxicidad. Estos datos sugieren el potencial de los ADC dirigidos hacia LY75, por ejemplo, LY75_DM1 y LY75_DM4, para proporcionar un beneficio clínico en el tratamiento de pacientes con cáncer de linfoma no Hodgkin humano.
Ejemplo 17: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugado con DM1 y conjugado con DM4 en modelos de xenoinjerto de Namalwa
La eficacia de LY75_DM1 y LY75_DM4 se ensayó en un modelo de xenoinjerto de ratón SCID de linfoma de Burkitt Namalwa subcutáneo.
Se inocularon subcutáneamente ratones SCID inmunodeficientes con células tumorales Namalwa (linfoma de Burkitt humano). Se permitió que los tumores se establecieran y los ratones se clasificaron en cinco grupos de tratamiento de 6 ratones por grupo. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó un tamaño promedio de 114 mm3 por grupo, cada grupo se trató con uno de los siguientes compuestos, administrados por vía intravenosa con las dosificaciones indicadas: Grupo 1 (Vehículo; solución salina tamponada con fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Control de isotipo-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (control de isotipo-SPBDDM4; 5 mg/kg). Se controlaron los pesos corporales (BW), los ratones se examinaron con frecuencia para determinar el estado de salud y los efectos secundarios adversos, y los tumores se midieron dos veces por semana. Los ratones fueron sacrificados cuando sus tumores alcanzaron el punto final de volumen tumoral de 2000 mm3 o después de 60 días, lo que ocurriera primero. La eficacia se determinó a partir del retraso del crecimiento tumoral (TGD), el aumento del tiempo medio transcurrido hasta el punto final (TTE) y del análisis del rango logarítmico de las diferencias en las curvas de supervivencia de Kaplan Meier en ratones tratados con ADC frente a ratones tratados con PBS. Se tomaron muestras de los primeros cinco ratones de control tratados con vehículo que alcanzaron el punto final en busca de tumores que se procesaron mediante fijación con formalina y se incluyeron en parafina.
Resultados
La Figura 4b muestra que LY75_DM1 y LY75_DM4 demostraron cada uno una actividad antitumoral significativa y una extensión de supervivencia en el modelo de xenoinjerto de ratón SCID de linfoma de Burkitt Namalwa en comparación con los controles; sin embargo, la dosis de LY75_DM4 de 5 mg/kg fue significativamente más eficaz que la dosis de LY75_DM1 de 10 mg/kg, lo que provocó una breve reducción del volumen tumoral. Todos los tratamientos fueron bien tolerados y no se observaron signos clínicos de toxicidad. Estos datos sugieren el potencial de los ADC dirigidos hacia LY75, por ejemplo, LY75_DM1 y LY75_DM4, para proporcionar un beneficio clínico en el tratamiento de pacientes con cáncer de linfoma no Hodgkin humano.
Ejemplo 18: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en modelos de xenoinjerto de cáncer de páncreas
La eficacia de LY75_DM1 y LY75_DM4 se ensayó en un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo atímico de adenocarcinoma pancreático HPAFII.
Se inocularon subcutáneamente ratones desnudos atímicos inmunodeficientes con células tumorales HPAFII (adenocarcinoma pancreático humano). Se permitió que los tumores se establecieran y los ratones se clasificaron en cinco grupos de tratamiento de 6 ratones por grupo. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó un tamaño promedio de aproximadamente 114 mm3 por grupo, cada grupo se trató con uno de los siguientes compuestos, administrados por vía intravenosa con las dosificaciones indicadas: Grupo 1 (Vehículo; solución salina tamponada con fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Control de isotipo-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (lY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (control de isotipo-SPBDDM4; 5 mg/kg). Se controlaron los pesos corporales (BW), los ratones se examinaron con frecuencia para determinar el estado de salud y los efectos secundarios adversos, y los tumores se midieron tres veces por semana. Los ratones fueron sacrificados cuando sus tumores alcanzaron el punto final de volumen tumoral de 2000 mm3 o después de 90 días, lo que ocurriera primero. La eficacia se determinó a partir del efecto del tratamiento sobre el volumen tumoral y del análisis del rango logarítmico de las diferencias en las curvas de supervivencia de Kaplan Meier en ratones tratados con ADC o tratados con PBS. Se tomaron muestras de los ratones de control tratados con vehículo y se procesaron mediante fijación con formalina y se incluyeron en parafina.
Resultados
La Figura 4c muestra LY75_DM1 y LY75_DM4 mostraron una actividad antitumoral significativa y similarmente potente y una extensión de la supervivencia en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo HPAFII en comparación con los controles. Todos los tratamientos fueron bien tolerados y no se observaron signos clínicos de toxicidad. Estos datos sugieren el potencial de los ADC dirigidos hacia LY75, por ejemplo, LY75_DM1 y LY75_DM4, para proporcionar un beneficio clínico en el tratamiento de pacientes con cáncer de páncreas humano.
Ejemplo 19: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en modelos de xenoinjerto de cáncer de vejiga
Se ensayó la eficacia de LY75_DM1 y LY75_DM4 en el modelo de xenoinjerto de ratón SCID de carcinoma de vejiga humano SW780 subcutáneo.
Se inocularon ratones desnudos atímicos inmunodeficientes por vía subcutánea con células tumorales HPAFII (adenocarcinoma pancreático humano). Se permitió que los tumores se establecieran y los ratones se clasificaron en cinco grupos de tratamiento de 6 ratones por grupo. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó un tamaño promedio de aproximadamente 114 mm3/grupo, cada grupo se trató con uno de los siguientes compuestos, administrados por vía intravenosa a las dosificaciones indicadas: Grupo 1 (Vehículo; solución salina tamponada con fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 1 mg/kg), Grupo 3 (LY75_DM1; 2,5 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM1; 5 mg/kg), Grupo 5 (LY75_DM4; 1 mg/kg)), Grupo 6 (LY75_DM4; 2,5 mg/kg)), Grupo 7 (LY75_DM4; 5 mg/kg)), Grupo 8 (control de isotipo-SPBDDM4; 5 mg/kg). Se controlaron los pesos corporales (BW), los ratones se examinaron con frecuencia para determinar el estado de salud y los efectos secundarios adversos, y los tumores se midieron tres veces por semana. Los ratones fueron sacrificados cuando sus tumores alcanzaron el punto final de volumen tumoral de 2000 mm3 o después de 90 días, lo que ocurriera primero. La eficacia se determinó a partir del efecto del tratamiento sobre el volumen del tumor y del análisis de rango logarítmico de las diferencias en las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier en ratones tratados con ADC o tratados con PBS. Se tomaron muestras de los tumores de ratones de control tratados con vehículo y se procesaron mediante fijación con formalina y se incluyeron en parafina.
Resultados
La Figura 4d muestra que LY75_DM1 y LY75_DM4 mostraron una actividad antitumoral significativa y similarmente potente y una extensión de la supervivencia en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo SW780 en comparación con los controles. Todos los tratamientos fueron bien tolerados y no se observaron signos clínicos de toxicidad. Estos datos sugieren el potencial de los ADC dirigidos hacia LY75, por ejemplo, LY75_DM1 y LY75_DM4, para proporcionar un beneficio clínico en el tratamiento de pacientes con cáncer de vejiga humano.
Ejemplo 20: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en modelos de xenoinjerto de cáncer de mama
Se ensayó la eficacia de LY75_DM1 y LY75_DM4 en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo atímico MDA-MB-468 subcutáneo.
Se inocularon ratones desnudos atímicos inmunodeficientes por vía subcutánea con células tumorales MDA-MB-468 (adenocarcinoma de mama humano triple negativo). Se permitió que los tumores se establecieran y los ratones se clasificaron en siete grupos de tratamiento de 10 ratones por grupo. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó un tamaño promedio de 167 mm3 por grupo, cada grupo se trató con uno de los siguientes compuestos, administrados por vía intravenosa a las dosificaciones indicadas: Grupo 1 (Vehículo; succinato de sodio 20 mM, pH 5,0, trehalosa al 6%, Polisorbato al 0,04%); Grupo 2 (LY75_DM1; 5 mg/kg), Grupo 3 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (LY75_DM4; 2.5 mg/kg), Grupo 6 (LY75_DM4; 1 mg/kg), Grupo 7 (Control de isotipo-DM4; 5 mg/kg). Se controlaron los pesos corporales (BW), los ratones se examinaron con frecuencia para determinar el estado de salud y los efectos secundarios adversos, y los tumores se midieron dos veces por semana. Los ratones se sacrificaron 82 días después de la inoculación del tumor. La eficacia se determinó a partir de la actividad antitumoral (tamaño medio del tumor en el grupo de tratamiento/tamaño medio del tumor en el grupo de control x 100) y el aumento del tiempo medio transcurrido hasta el punto final (TTE) en ratones tratados con ADC frente a ratones tratados con PBS. Se tomaron muestras de los cinco tumores más grandes en ratones de control tratados con vehículo el día 71 después de la inoculación, procesadas mediante fijación con formalina y embebidas en parafina.
Resultados
La Figura 4e muestra que LY75_DM1 y LY75_DM4 demostraron cada uno una actividad antitumoral dramática en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo MDA-MB-468 en comparación con los controles. Se observó actividad dependiente de la dosis con LY75_DM4, en la que 2,5 y 5 mg/kg fueron mucho más potentes que 1 mg/kg. A 5 mg/kg, LY75_DM1 y LY75_DM4 fueron igualmente efectivos. Se observaron regresiones sostenidas en el volumen tumoral medio para LY75_DM1 a 10 y 5 mg/kg y LY75_DM4 a 5 y 2,5 mg/kg. Todos los tratamientos fueron bien tolerados y no se observaron signos clínicos de toxicidad. Estos datos sugieren el potencial de los ADC dirigidos hacia LY75, por ejemplo, LY75_DM1 y LY75_DM4, para proporcionar un beneficio clínico en el tratamiento de pacientes con cáncer de mama triple negativo humano.
Ejemplo 21: Eficacia de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en modelos de xenoinjerto de cáncer colorrectal
Se ensayó la eficacia de LY75_DM1 y LY75_DM4 en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo atímico de adenocarcinoma colorrectal COLO205 subcutáneo.
Se inocularon ratones desnudos atímicos inmunodeficientes por vía subcutánea con células tumorales COLO205 (adenocarcinoma colorrectal humano). Se permitió que los tumores se establecieran y los ratones se clasificaron en cinco grupos de tratamiento de 6 ratones por grupo. Cuando el volumen tumoral medio alcanzó un tamaño promedio de 117 mm3 por grupo, cada grupo se trató con uno de los siguientes compuestos, administrados por vía intravenosa a las dosis indicadas: Grupo 1 (Vehículo; solución salina tamponada con fosfato (PBS)); Grupo 2 (LY75_DM1; 10 mg/kg), Grupo 3 (Control de isotipo-DM1; 10 mg/kg), Grupo 4 (LY75_DM4; 5 mg/kg), Grupo 5 (Control de isotipo-DM4; 5 mg/kg). Se administró una segunda dosis doce días después de la primera. Se controlaron los pesos corporales (BW), los ratones se examinaron con frecuencia para determinar el estado de salud y los efectos secundarios adversos, y los tumores se midieron dos veces por semana. Los ratones se sacrificaron cuando sus tumores alcanzaron el punto final de volumen tumoral de 1000 mm3 o después de 60 días, lo que ocurriera primero. La eficacia se determinó a partir del retraso del crecimiento tumoral (TGD), el aumento del tiempo medio transcurrido hasta el punto final (TTE) y del análisis de rango logarítmico de las diferencias en las curvas de supervivencia de Kaplan Meier en ratones tratados con ADC frente a ratones tratados con PBS. Se tomaron muestras de los primeros cinco ratones de control tratados con vehículo que alcanzaron el punto final en busca de tumores que se procesaron mediante fijación con formalina y se incluyeron en parafina.
Resultados
La Figura 4f muestra que LY75_DM1 y LY75_DM4 exhibieron una actividad antitumoral modesta similar y una extensión de supervivencia en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo de adenocarcinoma colorrectal COLO205 en comparación con los controles. Todos los tratamientos fueron bien tolerados y no se observaron signos clínicos de toxicidad. Estos datos sugieren el potencial de los ADC dirigidos hacia LY75, por ejemplo, LY75_DM1 y LY75_DM4, para proporcionar un beneficio clínico en el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal humano.
Ejemplo 22: Toxicidad de anticuerpos monoclonales anti-LY75 conjugados con DM1 y conjugados con DM4 en monos Cynomolgus
Se asignaron seis monos machos al estudio con 2 monos/grupo. Se administró vehículo (PBS), LY75_DM4 (escindible) 0 LY75_DM1 (no escindible) dos veces (el día 1 y el día 29) mediante una infusión intravenosa de 15 minutos a razón de 0 mg/kg/dosis (PBS, vehículo), 5 mg/kg/dosis (LY75_DM4, escindible) o 10 mg/kg/dosis (LY75_DM1, no escindible). Se recolectaron muestras de sangre para evaluaciones toxicocinéticas antes del inicio de la dosis (día 1) y 1, 2, 3, 7, 14, 21 y 28 días después de cada dosis. Se recolectaron muestras de sangre para análisis de patología clínica antes del inicio de la dosis (día 1), y 1, 3, 7, 14, 21 y 28 días después de cada dosis (28 días después de la primera dosis también sirvió como punto de tiempo antes de la dosis para la segunda dosis). Todos los animales del estudio fueron sacrificados y sometidos a necropsia después de la extracción de sangre final el día 57. El plasma separado de cada extracción de sangre se aisló, se congeló y se envió a Oxford BioTherapeutics, Inc. para analizar la concentración de ADC mediante ELISA.
Los hallazgos de patología clínica relacionados con el tratamiento incluyeron una anemia regenerativa leve y disminuciones transitorias en el perfil de leucocitos en sangre, más notablemente en los recuentos de neutrófilos. Se observó anemia en ambos animales tratados con 5 mg/kg de LY75_DM4 y en uno de los dos animales tratados con 10 mg/kg de LY75_DM1. Se observó neutropenia grave una semana después de la dosis y una rápida recuperación en los recuentos en todos los animales; el punto más bajo en el recuento absoluto de neutrófilos fue menor en los animales tratados con LY75_DM4. No hubo efectos relacionados con el artículo de prueba sobre los parámetros de coagulación APTT y PT. Los cambios en la química del suero incluyeron aumentos transitorios en AST, CK, LDH (en 1 de 2 animales en cada grupo de tratamiento) y globulina luego de la administración de 5 mg/kg de LY75_DM4 y 10 mg/kg de LY75_DM1. Además, se observó un aumento transitorio de la enzima ALT específica del hígado solo en los animales tratados con LY75_DM4. La corta duración y/o la magnitud de los aumentos en los parámetros químicos en suero sugieren que no fueron adversos. No hubo hallazgos de análisis de orina relacionados con el artículo de prueba. Tras el examen en la necropsia después de un período de recuperación de 4 semanas, no hubo hallazgos de patología macroscópica relacionados con el tratamiento o cambios en los pesos absolutos y relativos de los órganos. Los hallazgos histopatológicos solo en la glándula tiroides (una alteración en la morfología coloidal en los folículos) y el riñón (túbulos dilatados en la corteza externa) se clasificaron como de gravedad mínima; no asociado con cambios en otros parámetros del estudio; y no adverso y de mínima importancia toxicológica. Conclusión: el tratamiento de dosis repetidas con dos dosis de 5 mg/kg de LY75_DM4 o 10 mg/kg de LY75_DM1 fue bien tolerado en monos Cynomolgus. Todos los hallazgos de toxicidad relacionados con el tratamiento fueron reversibles después de un período de recuperación de 4 semanas.
Ejemplo 23: Caracterización del epítopo de LY75 A1 mediante análisis de unión competitivo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)
Método
Se separaron células COLO205 (ATCC, catálogo No. CCL-222) de matraces de cultivo de tejidos con Cell Stripper (Cellgro, catálogo No. MT-25-056CI). Las células se lavaron y se resuspendieron en tampón FACS (PBS FBS al 2%), se neutralizaron con medio de crecimiento y se contaron. Las células se sembraron en placas a razón de 50.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos con fondo en V. Las células se lavaron una vez con tampón FACS (PBS (Fisher, catálogo No. SH30028-03) FBS al 2%). Se añadió un mAb anti-LY75 (seleccionado del Ejemplo 1) o LY75_A1 a los pocillos comenzando a 250 nM y se diluyó en serie 3 veces y se aplicó a los pocillos relevantes durante 45 minutos en hielo. Los pocillos de prueba que requerían etapas de tinción sencillas o múltiples se dejaron en tampón FACS según fuera apropiado para garantizar que la tinción final se completara simultáneamente para todas las condiciones probadas. Se dejaron dos pocillos sin teñir en tampón FACS como controles.
Después de la incubación con el anticuerpo de bloqueo, las células se lavaron dos veces en tampón FACS. Las células se resuspendieron en tampón FACS que contenía el mAb anti-LY75 conjugado con MCC-DM1 (1 nM) y se incubaron en hielo durante 45 minutos. Las células se lavaron como antes y se resuspendieron en tampón FACS más 1 pg/ml de anticuerpo anti-maitansina de ratón y se incubaron en hielo durante 45 minutos. Las células se lavaron como anteriormente y se resuspendieron en tampón FACS que contenía 2 pg/ml de RPE de cabra anti-kappa de ratón. Las células se incubaron en hielo durante 45 minutos y luego se lavaron como antes. Las células se resuspendieron en tampón FACS a razón de 200 pl por pocillo. La intensidad de fluorescencia media de cada muestra se determinó usando un citómetro de flujo Guava EasyCyte Plus HT (formatos de placa de 96 pocillos) y los datos sin procesar se analizaron usando Guava Cytosoft.
Resultados
La Figura 5a muestra que el bloqueo con el mAb anti-LY75 MCC-DM1 redujo la unión de mAb anti-LY75. El análisis de la unión de LY75_A1 con células COLO205 mostró que LY75_A1 es incapaz de bloquear la unión del mAb anti-LY75 MCC-DM1 (véase la Figura 5b). Por lo tanto, se puede determinar que el mAb anti-LY75 y LY75_A1 son anticuerpos no competidores y LY75_A1 reconoce un epítopo diferente y único de LY75 al de otros anticuerpos anti-LY75.
Ejemplo 24: Caracterización del epítopo de LY75_A1 mediante un ensayo de microarreglos de péptidos Método
El análisis de microarreglos de péptidos fue realizado por LC Sciences, Houston TX; en resumen, el método comprendió las siguientes etapas: - Se sintetizaron péptidos contiguos de 8 mer de la proteína LY75 que tiene un solapamiento de un aminoácido que abarca los residuos 216 a 1666 de la proteína LY75 de longitud completa e inmovilizado en un chip de microarreglos. El chip constaba de tres paneles de modo que el experimento se realizó por triplicado. El microarreglo se dirigió con LY75_A1 para identificar los péptidos a los que se unía el anticuerpo. El ensayo de unión se realizó en las siguientes condiciones: - El microarreglo que comprendía los péptidos contiguos por triplicado se lavó con 1 mL de tampón de unión a 4 °C durante 20 min. Luego se incubó con 1 pg/ml de LY75_A1 en tampón de unión (pH 7,0) a 4 °C durante 2 h. El arreglo se lavó de nuevo con 0,5 ml de tampón de lavado a 4 °C durante 30 min y luego se incubó con 25 ng/ml de anti-IgG humana conjugado con Alexa 647 en tampón de unión (pH 7,0) a 4 °C durante 1 h. La matriz se lavó de nuevo con 0,5 ml de tampón de lavado a 4 °C durante 30 min.
A continuación, el arreglo se escaneó a 635 nm y PMT 500 y se registró la intensidad de la señal. El péptido se clasificó como detectable si estaba presente en al menos 2/3 de los duplicados legales. La intensidad de la señal promedio de las réplicas se informó como la intensidad de la señal final.
Resultados
Como puede verse en la Figura 6, el anticuerpo LY75_A1 mostró unión específica a varios péptidos ubicados en el arreglo. La señal máxima observada para la unión de LY75_A1 fue de 25000 (escala 1-65535), siendo la señal promedio para todos los puntos en el arreglo de aproximadamente 885. Se estableció una intensidad de señal de 3000 como el punto de corte de fondo para la unión no específica. Con base en el nivel de intensidad de la señal de unión al anticuerpo observado, se identificaron las secuencias potenciales que forman el epítopo de LY75_A1. Estas regiones se muestran en las Figuras 6a - 6j y como las SEQ ID NOs: 22-31.
Ejemplo 25 Ensayo de extracción del péptido LY75_A1
Método
1.1 Ensayo de extracción
La proteína LY75 recombinante se digirió mediante proteólisis tríptica en perlas (Promega, EE. UU.). Los péptidos de digestión resultantes se recuperaron usando una columna de captura C18 (Thermo Fisher Scientific). Después, los péptidos purificados se incubaron con 200 pl de perlas de proteína A entrecruzadas con anticuerpo LY75_A1 durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se recogieron los péptidos no unidos y se lavaron las perlas con 1 ml de PBS dos veces. Los péptidos unidos al anticuerpo se eluyeron de las perlas calentándolas a 90 °C en 100 pl de PBS durante 5 minutos. Se repitió esta etapa de elución.
1.2 Espectrometría de masas
Las muestras se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas usando un sistema UPLC nanoACQUITY de Waters equipado con una columna C18 nanoACQUITY UPLC BEH 130, 75 pm x 250 mm (186003545) y un LTQ Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific). Los péptidos se eluyeron con un gradiente de 300 nl/min que aumentaba del 3% al 35% de acetonitrilo durante 120 min. Los espectros de masas de barrido completo se adquirieron con un poder de resolución de 60000 entre un intervalo de masas de 400-2000 m/z en el Orbitrap. En cada ciclo, se seleccionaron los veinte péptidos más intensos para barridos CID MS/MS en la trampa de iones lineal con una fuente de iones de nanoaspersión acoplada en el instrumento.
1.3 Análisis de la secuencia de aminoácidos del péptido
Los datos sin procesar generados a partir de LTQ Orbitrap Velos se procesaron a través del software Mascot (Matrix Science) que utiliza el algoritmo de Mowse (Curr Biol. 1 de junio de 1993; 3 (6): 327-3) para inferir secuencias de aminoácidos de las listas de picos buscando en una base de datos de secuencias que consta de Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html), IPI (www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhuman.html) y SwissProt (http://www.uniprot.org) junto con secuencias de proteínas contaminantes. Los criterios para la identificación de péptidos incluyeron digestión con tripsina, hasta 2 sitios de escisión perdidos y diversas modificaciones biológicas y químicas (metionina oxidada, modificación de cisteína por MMTS o yodoacetamida y fosforilación de serina, treonina y tirosina). Los péptidos clasificados con 1 con un valor esperado de 0,05% o menos, una puntuación de iones de 28 o más se cargaron en nuestra base de datos OGAP.
1.4 Discriminación de péptidos asociados a LY75
El proceso para identificar LY75 usó las secuencias de péptidos obtenidas experimentalmente por espectrometría de masas, como se describió anteriormente, de proteínas humanas de origen natural para identificar y organizar los exones codificantes en la secuencia del genoma humano publicada. Estas secuencias determinadas experimentalmente se compararon con la base de datos OGAP® que se compiló mediante procesamiento e integración de masas de péptidos, firmas de péptidos, EST y datos de secuencias genómicas de dominio público como se describe en la solicitud internacional de patente WO2009/087462.
Resultados
Los resultados del ensayo de extracción de péptidos usando el anticuerpo LY75_A1 se muestran en la Tabla 1 a continuación y en la Figura 7. Los péptidos que se identificaron en las eluciones de péptidos 1a y 1b en el ensayo de extracción y en el ensayo de microarreglos se consideraron los candidatos más probables para formar el epítopo.
T l 1 m r i n x rim n x r i n i mi r rr l i
Figure imgf000053_0002
La Tabla 1 muestra que se identificaron varias regiones de péptido LY75 superpuestas tanto en el ensayo de microarreglos de péptidos como en las eluciones 1a y 1b del ensayo de extracción de péptidos. Se considera que estas regiones son las más propensas a contener el epítopo reconocido por el anticuerpo LY75_A1 ya que están unidas por LY75_A1 ensayadas mediante las dos técnicas empleadas.
Listado de secuencias:
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a LY75, comprendiendo dicho anticuerpo:
a) una región variable de cadena pesada que comprende:
) una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 5;
i) una segundo vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 6; y
ii) una tercer vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 7; y
b) una región variable de cadena ligera que comprende:
) una primera vICDR que comprende la SEQ ID NO: 8;
i) una segunda vICDR que comprende la SEQ ID NO: 9; y
ii) una tercera vICDR que comprende la SEQ ID NO: 10,
en el que una cualquiera o más de las SEQ ID NOs anteriores comprenden independientemente una o dos sustituciones de aminoácidos y en el que el anticuerpo está internalizado.
2. Un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a LY75, comprendiendo dicho anticuerpo:
a) una región variable de cadena pesada que comprende:
) una primera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 5;
i) una segunda vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 6; y
ii) una tercera vhCDR que comprende la SEQ ID NO: 7; y
b) una región variable de cadena ligera que comprende:
) una primera vICDR que comprende la SEQ ID NO: 8;
i) una segunda vICDR que comprende la SEQ ID NO: 9; y
ii) una tercera vICDR que comprende la SEQ ID NO: 10.
3. El anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que comprende una cadena pesada que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 1 y una cadena ligera que tiene al menos 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO: 2.
4. El anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende además una fracción unida covalentemente, en el que opcionalmente dicha fracción es un fármaco.
5. El anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicho fármaco se selecciona del grupo que consiste en un maitansinoide, una dolastatina, una hemiasterlina, una auristatina, un tricoteceno, una caliqueamicina, CC1065 y derivados de los mismos, preferiblemente en el que dicho fármaco es un maitansinoide seleccionado del grupo que consiste en DM4 y DM1.
6. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, junto con uno o más diluyentes, excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables.
7. Un ácido nucleico que codifica:
i) una cadena pesada del anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
ii) una cadena ligera del anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. Un vector de expresión que comprende uno o ambos ácidos nucleicos de la reivindicación 7 unidos operativamente a uno o más elementos reguladores.
9. Una célula huésped que comprende:
(i) un vector de expresión que comprende los ácidos nucleicos de la reivindicación 7 unidos operativamente a uno o más elementos reguladores; o
(ii) un primer vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 7 unidos operativamente a uno o más elementos reguladores y un segundo vector de expresión que comprende el ácido nucleico que codifica la cadena ligera del anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 7 unido operativamente a uno o más elementos reguladores.
10. Un método para producir un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 9 en condiciones en las que se expresa el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo y opcionalmente aislar el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo.
11. El anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento del cáncer.
12. El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo es internalizado por una célula que expresa LY75.
13. El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo para uso de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, en el que el anticuerpo o porción de unión a antígeno comprende un conjugado de fármaco unido covalentemente, preferiblemente, en el que el conjugado de fármaco unido covalentemente es un maitansinoide, más preferiblemente DM4.
14. El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de páncreas, cáncer de ovario, cáncer de mama, preferiblemente cáncer de mama triple negativo, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer de piel, cáncer de tiroides, cáncer de pulmón, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, cáncer gástrico, leucemia, preferiblemente leucemia mieloide aguda o leucemia linfocítica crónica, mieloma, preferiblemente mieloma múltiple y linfoma, preferiblemente linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), linfoma de células B, linfoma folicular, linfoma de células del manto, linfoma de tejido linfoide asociado a mucosas (MALT), linfoma de células B rico en células T/histiocitos, linfoma de Burkitt, linfoma linfoplasmacítico, linfoma linfocito pequeño, linfoma de zona marginal, linfoma de células T, linfoma periférico de células T, linfoma anaplásico de células grandes y linfoma angioinmunoblástico de células T.
15. Un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en terapia o para uso como medicamento.
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