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ES2849600T3 - Conjugados de oligonucleótidos antisentido modificados y su uso para modular la expresión de PKK - Google Patents

Conjugados de oligonucleótidos antisentido modificados y su uso para modular la expresión de PKK Download PDF

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ES2849600T3
ES2849600T3 ES15786489T ES15786489T ES2849600T3 ES 2849600 T3 ES2849600 T3 ES 2849600T3 ES 15786489 T ES15786489 T ES 15786489T ES 15786489 T ES15786489 T ES 15786489T ES 2849600 T3 ES2849600 T3 ES 2849600T3
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antisense
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Thazha P Prakash
Punit P Seth
Eric E Swayze
Susan M Freier
Huynh-Hoa Bui
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Ionis Pharmaceuticals Inc
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Abstract

Un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados y tiene la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 570, y en donde el grupo conjugado está enlazado covalentemente con el oligonucleótido modificado en el extremo 5' del oligonucleótido modificado.

Description

DESCRIPCIÓN
Conjugados de oligonucleótidos antisentido modificados y su uso para modular la expresión de PKK
Campo
Se proporcionan compuestos, composiciones y métodos para reducir la expresión de ARNm y proteína de precalicreína plasmática humana (PKK) en un animal. Tales composiciones y métodos son útiles para tratar, prevenir o mejorar afecciones inflamatorias y tromboembólicas.
Antecedentes
La precalicreína plasmática (PKK) es el precursor de la calicreína plasmática (PK), que está codificada por el gen KLKB1. La PKK es una glicoproteína que participa en la activación dependiente de la superficie de la coagulación sanguínea, fibrinólisis, generación de quininas e inflamación. La PKK se convierte en PK por el Factor XIIa mediante la escisión de un enlace peptídico Arg-Ile interno. La PK libera quininas de quininógenos y también genera plasmina a partir de plasminógeno. La PK es un miembro de la vía quinina-calicreína, que consiste de varias proteínas que desempeñan un papel en la inflamación, el control de la presión sanguínea, la coagulación y el dolor.
La WO 2013/003808 describe métodos para modular la expresión de calicreína (klkb1). La WO 2013/033230 describe complejos oligómero-conjugado y sus usos. R. Kallanthottathil, 29 de octubre de 2012, 8a Reunión Anual de la Oligonucleotide Therapeutics Society, describe estrategias de conjugación para la administración de ARNip in vivo. Bhattacharjee et al., 2013, Nucleic Acid Therapeutics, 23(3), 175-187, describe la inhibición de la permeabilidad vascular mediante inhibición mediada antisentido de calicreína plasmática y el factor de coagulación 12.
Sumario
La invención proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados y tiene la secuencia de nucleobases de la SEQ ID NO: 570, y en donde el grupo conjugado está enlazado covalentemente con el oligonucleótido modificado en el extremo 5' del oligonucleótido modificado.
La invención también proporciona un compuesto que comprende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado es un gapmer que consiste de un segmento de ala 5', un segmento de hueco central y un segmento de ala 3', en el que:
el segmento de ala 5' consiste de cinco nucleósidos de 2'-O-metoxietilo
el segmento de hueco central consiste de diez p-D-desoxirribonucleósidos y
el segmento de ala 3' consiste de cinco nucleósidos de 2'-O-metoxietilo
en donde el oligonucleótido modificado tiene la secuencia de nucleobases 5’-TGCAAGTCTCTTGGCAAACA-3’ (SEQ ID NO: 570), en donde cada citosina es una 5-metilcitosina, en donde los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido modificado son ssoosssssssssssooss de 5' a 3', en donde cada s es un enlace de fosforotioato y cada o es un enlace de fosfodiéster, en donde el grupo conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 5' del oligonucleótido modificado, y en donde el grupo conjugado tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000002_0001
La invención también proporciona una sal de un compuesto, en donde el anión de la sal tiene la siguiente estructura química:
Figure imgf000003_0001
(SEQ ID NO: 570)
La invención también proporciona un compuesto de acuerdo con la siguiente estructura química:
Figure imgf000004_0001
(SEQ ID NO: 570) , o una sal de la misma.
La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende o consiste esencialmente de un compuesto, o una sal de un compuesto de la invención y un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, en donde opcionalmente el diluyente farmacéuticamente aceptable es solución salina tamponada con fosfato (PBS).
La invención también proporciona un compuesto, una sal de un compuesto, o una composición farmacéutica de la invención, para su uso en el tratamiento de una enfermedad tromboembólica, una enfermedad inflamatoria, o edema, opcionalmente en donde el edema es angioedema hereditaria, angioedema de los párpados, edema macular, edema ocular, o edema cerebral.
En la presente se describen compuestos, composiciones y métodos para modular la expresión de ARNm y proteína de PKK. En ciertas realizaciones, los compuestos útiles para modular la expresión de ARNm y proteína de PKK son compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son oligonucleótidos antisentido.
En ciertas realizaciones, la modulación puede producirse en una célula o tejido. En ciertas realizaciones, la célula o tejido está en un animal. En ciertas realizaciones, el animal es un humano. En ciertas realizaciones, se reducen los niveles de ARNm de PKK. En ciertas realizaciones, se reducen los niveles de proteína de PKK. Tal reducción puede producirse de manera dependiente del tiempo o de manera dependiente de la dosis.
También se describen compuestos, composiciones y métodos útiles para prevenir, tratar y mejorar enfermedades, trastornos y afecciones asociadas con PKK. En ciertas realizaciones, tales enfermedades, trastornos y afecciones asociadas a PKK son enfermedades inflamatorias. En ciertas realizaciones, la enfermedad inflamatoria puede ser una enfermedad inflamatoria aguda o crónica. En ciertas realizaciones, tales enfermedades inflamatorias pueden incluir angioedema hereditario (HAE), edema, angioedema, hinchazón, angioedema de los párpados, edema ocular, edema macular y edema cerebral. En ciertas realizaciones, tales enfermedades, trastornos y afecciones asociadas a PKK son enfermedades tromboembólicas. En ciertas realizaciones, tales enfermedades tromboembólicas pueden incluir trombosis, embolia, tromboembolia, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, apoplejía e infarto.
Tales enfermedades, trastornos y afecciones pueden tener uno o más factores de riesgo, causas o resultados en común.
Ciertos factores de riesgo y causas para el desarrollo de una enfermedad inflamatoria incluyen la predisposición genética a una enfermedad inflamatoria y factores ambientales. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene un gen del inhibidor de la esterasa del complemento 1 mutado (C1-INH) o un gen del Factor 12 mutado. En ciertas realizaciones, el sujeto ha tomado o está tomando inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de ACE) o bloqueadores del receptor de angiotensina II (ARB). En ciertas realizaciones, el sujeto ha tenido una reacción alérgica que lleva a angioedema. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene HAE de tipo I. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene HAE de tipo II. En ciertas realizaciones, el sujeto tiene HAE de tipo III.
Ciertos resultados asociados con el desarrollo de una enfermedad inflamatoria incluyen edema/hinchazón en varias partes del cuerpo, incluyendo las extremidades (es decir, manos, pies, brazos, piernas), los intestinos (abdomen), la cara, los genitales, la laringe (es decir, la caja de voz); permeabilidad vascular; fuga vascular; inflamación generalizada; dolor abdominal; hinchazón; vómitos; diarrea; picazón en la piel; reacciones respiratorias (asmáticas); rinitis; anafilaxia; broncoconstricción; hipotension; coma; y muerte.
Ciertos factores de riesgo y causas para el desarrollo de una enfermedad tromboembólica incluyen predisposición genética a una enfermedad tromboembólica, inmovilidad, cirugía (particularmente cirugía ortopédica), enfermedad maligna, embarazo, edad avanzada, uso de anticonceptivos orales, fibrilación auricular, afección tromboembólica previa, enfermedad inflamatoria crónica, y trastornos de la coagulación protrombóticos heredados o adquiridos. Ciertos resultados asociados con el desarrollo de una afección tromboembólica incluyen disminución del flujo sanguíneo a través de un vaso afectado, muerte del tejido y muerte.
En ciertas realizaciones, los métodos de tratamiento incluyen administrar un compuesto antisentido de PKK a un individuo con necesidad de ello. En ciertas realizaciones, los métodos de tratamiento incluyen administrar un oligonucleótido antisentido de PKK a un individuo con necesidad de ello.
Descripción detallada
Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la descripción detallada siguiente son solamente ejemplares y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se define en las reivindicaicones adjuntas. En la presente, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. Como se usa en la presente, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como de otras formas, como "incluye" e "incluido", no es limitativo. Además, términos como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.
A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritas en la presente son las bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Pueden usarse técnicas estándar para síntesis química y análisis químico. Ciertas de tales técnicas y procedimientos pueden encontrarse, por ejemplo, en "Carbohydrate Modifications in Antisense Research" Editado por Sangvi and Cook, American Chemical Society , Washington D.C., 1994; "Remington’s Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., 21a edición, 2005; y "Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications" editado por Stanley T. Crooke, CRC Press, Boca Raton, Florida; y Sambrook et al., "Molecular Cloning, A laboratory Manual," 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989
Los encabezados de las secciones que se usan en la presente son con propósitos organizativos solamente y no deben interpretarse como limitativos de la materia descrita.
Definiciones
A menos que se indique lo contrario, los siguientes términos tienen los siguientes significados:
“2'-O-metoxietilo” (también 2 '-M ü E y 2'-OCH2CH2-OCH3 y MOE) se refiere a una modificación de O-metoxietilo de la posición 2' de un anillo de furanosa. Un azúcar modificado con 2'-O-metoxietilo es un azúcar modificado.
"Nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo" (también "nucleósido 2'-MOE") significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar modificado con 2'-MOE.
"Nucleósido 2’-sustituido" significa un nucleósido que comprende un sustituyente en la posición 2' del anillo de furanosa distinto de H u OH. En ciertas realizaciones, los nucleósidos 2' sustituidos incluyen nucleósidos con modificaciones de azúcar bicíclico.
"2'-desoxinucleósido" significa un nucleósido que comprende un hidrógeno en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleósido.
"Sitio objetivo 3' " se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 3' de un compuesto antisentido particular.
“Sitio objetivo 5' ” se refiere al nucleótido de un ácido nucleico objetivo que es complementario al nucleótido más 5' de un compuesto antisentido particular.
“5-metilcitosina” significa una citosina modificada con un grupo metilo unido a la posición 5. Una 5-metilcitosina es una nucleobase modificada.
“Aproximadamente” significa dentro del ±7% de un valor. Por ejemplo, si se indica, "los compuestos afectaron por lo menos a aproximadamente el 70% de inhibición de PKK", se implica que los niveles de PKK se inhiben dentro de un intervalo del 63% y el 77%.
"Administrado concomitantemente" se refiere a la coadministración de dos agentes farmacéuticos de cualquier manera en la que los efectos farmacológicos de ambos se manifiesten en el paciente al mismo tiempo. La administración concomitante no requiere que ambos agentes farmacéuticos se administren en una única composición farmacéutica, en la misma forma de dosificación o por la misma vía de administración. No es necesario que los efectos de ambos agentes farmacéuticos se manifiesten al mismo tiempo. Los efectos solo necesitan superponerse durante un período de tiempo y no es necesario que sean coextensivos.
"Administrar" significa proporcionar un agente farmacéutico a un animal e incluye, pero no se limita a, la administración por un profesional médico y la autoadministración.
"Alquilo", como se usa en la presente, significa un radical hidrocarbonado saturado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen, sin limitación, metilo, etilo, propilo, butilo, isopropilo, n-hexilo, octilo, decilo, dodecilo y similares. Los grupos alquilo incluyen típicamente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono (alquilo C1-C12) prefiriéndose más de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono.
Como se usa en la presente, "alquenilo" significa un radical de cadena de hidrocarburos lineal o ramificada que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene por lo menos un enlace doble carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen, sin limitación, etenilo, propenilo, butenilo, 1 -metil-2-buten-1 -ilo, dienos como 1,3-butadieno y similares. Los grupos alquenilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, prefiriéndose más de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquenilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alquinilo" significa un radical hidrocarbonado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono y que tiene por lo menos un enlace triple carbono-carbono. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen, sin limitación, etinilo, 1 -propinilo, 1 -butinilo y similares. Los grupos alquinilo incluyen típicamente de 2 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 2 a aproximadamente 12 átomos de carbono, prefiriéndose más de 2 a aproximadamente 6 átomos de carbono. Los grupos alquinilo como se usan en la presente pueden incluir opcionalmente uno o más grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "acilo" significa un radical formado por la eliminación de un grupo hidroxilo de un ácido orgánico y tiene la Fórmula general -C(O)-X donde X es típicamente alifático, alicíclico o aromático. Los ejemplos incluyen carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonilos alifáticos, sulfinilos aromáticos, sulfinilos alifáticos, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos y similares. Los grupos acilo, como se usa en la presente, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alicíclico" significa un sistema de anillo cíclico en el que el anillo es alifático. El sistema de anillos puede comprender uno o más anillos en los que por lo menos un anillo es alifático. Los alicíclicos preferidos incluyen anillos que tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 9 átomos de carbono en el anillo. Alicíclico, como se usa en la presente, puede incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alifático" significa un radical hidrocarbonado lineal o ramificado que contiene hasta veinticuatro átomos de carbono en donde la saturación entre dos átomos de carbono cualquiera es un enlace sencillo, doble o triple. Un grupo alifático contiene preferiblemente de 1 a aproximadamente 24 átomos de carbono, más típicamente de 1 a aproximadamente 12 átomos de carbono, prefiriéndose más de 1 a aproximadamente 6 átomos de carbono. La cadena lineal o ramificada de un grupo alifático puede interrumpirse con uno o más heteroátomos que incluyen nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo. Tales grupos alifáticos interrumpidos por heteroátomos incluyen, sin limitación, polialcoxis como polialquilenglicoles, poliaminas y poliiminas. Los grupos alifáticos, como se usan en la presente, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "alcoxi" significa un radical formado entre un grupo alquilo y un átomo de oxígeno en donde el átomo de oxígeno se usa para unir el grupo alcoxi a una molécula original. Los ejemplos de grupos alcoxi incluyen, sin limitación, metoxi, etoxi, propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butoxi, terc-butoxi, n-pentoxi, neopentoxi, n-hexoxi y similares. Los grupos alcoxi, como se usa en la presente, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
Como se usa en la presente, "aminoalquilo" significa un radical alquilo C1-C12 sustituido con amino. La porción alquilo del radical forma un enlace covalente con una molécula original. El grupo amino puede estar localizado en cualquier posición y el grupo aminoalquilo puede estar sustituido con un grupo sustituyente adicional en las porciones alquilo y/o amino.
Como se usa en la presente, "aralquilo" y "arilalquilo" significan un grupo aromático que está enlazado covalentemente a un radical alquilo C1-C12. La porción del radical alquilo del grupo aralquilo (o arilalquilo) resultante forma un enlace covalente con una molécula original. Los ejemplos incluyen, sin limitación, bencilo, fenetilo y similares. Los grupos aralquilo, como se usa en la presente, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales unidos al alquilo, el arilo o ambos grupos que forman el grupo radical.
Como se usa en la presente, "arilo" y "aromático" significan radicales del sistema de anillo carbocíclicos mono o policíclicos que tienen uno o más anillos aromáticos. Los ejemplos de grupos arilo incluyen, sin limitación, fenilo, naftilo, tetrahidronaftilo, indanilo, idenilo y similares. Los sistemas de anillos de arilo preferidos tienen de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono en uno o más anillos. Los grupos arilo, como se usan en la presente, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
"Mejoría" se refiere a una disminución, ralentización, detención o reversión de por lo menos un indicador de la gravedad de una afección o enfermedad. La gravedad de los indicadores puede determinarse mediante medidas subjetivas u objetivas, que son conocidas por los expertos en la técnica.
"Animal" se refiere a un animal humano o no humano, incluyendo, pero no limitados a, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cerdos y primates no humanos, incluyendo, pero no limitados a, monos y chimpancés.
"Actividad antisentido" significa cualquier actividad detectable o medible atribuible a la hibridación de un compuesto antisentido con su ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la actividad antisentido es una disminución en la cantidad o expresión de un ácido nucleico o proteína objetivo codificados por dicho ácido nucleico objetivo. "Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo mediante enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y de cadena doble como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc y compuestos basados en la ocupación.
"Compuesto antisentido" significa un compuesto oligomérico que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo a través de enlaces de hidrógeno. Los ejemplos de compuestos antisentido incluyen compuestos de cadena sencilla y de cadena doble, como oligonucleótidos antisentido, ARNip, ARNhc, ARNmc y compuestos basados en la ocupación.
“Inhibición antisentido” significa reducción de los niveles del ácido nucleico objetivo en presencia de un compuesto antisentido complementario con un ácido nucleico objetivo en comparación con los niveles de ácido nucleico objetivo o en ausencia del compuesto antisentido. "Mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con ácido nucleico objetivo, en donde el resultado o efecto de la hibridación es o la degradación o la ocupación del objetivo con estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o corte y empalme.
Los "mecanismos antisentido" son todos aquellos mecanismos que implican la hibridación de un compuesto con un ácido nucleico objetivo, en donde el resultado o efecto de la hibridación es o la degradación o la ocupación del objetivo con el estancamiento concomitante de la maquinaria celular que implica, por ejemplo, transcripción o corte y empalme.
"Oligonucleótido antisentido" significa un oligonucleótido de cadena sencilla que tiene una secuencia de nucleobases que permite la hibridación con un segmento correspondiente de un ácido nucleico objetivo. "Complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico objetivo (es decir, hibridación), y está mediada por unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversa entre nucleobases correspondientes.
"Complementariedad de bases" se refiere a la capacidad para el emparejamiento de bases preciso de nucleobases de un oligonucleótido antisentido con nucleobases correspondientes en un ácido nucleico objetivo (es decir, hibridación), y está mediada por unión de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen inversa entre nucleobases correspondientes.
"Azúcar bicíclico" significa un anillo de furanosa modificado por el puente de dos átomos. Un azúcar bicíclico es un azúcar modificado.
"Nucleósido bicíclico" (también BNA) significa un nucleósido que tiene una fracción de azúcar que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar, formando de este modo un sistema de anillo bicíclico. En ciertas realizaciones, el puente conecta el carbono 4' y el carbono 2' del anillo de azúcar.
"Estructura de tapa" o "fracción de tapa terminal" significa modificaciones químicas, que se han incorporado en cualquier extremo terminal de un compuesto antisentido.
"Carbohidrato" significa un carbohidrato de origen natural, un carbohidrato modificado o un derivado de carbohidrato.
“Agrupación de carbohidratos” significa un compuesto que tiene uno o más residuos de carbohidratos unidos a un andamiaje o grupo conector. (ver, por ejemplo, Maier et al., "Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting," Bioconjugate Chemistry, 2003, (14): 18-29, o Rensen et al., "Design and Synthesis of Novel N-Acetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asiaglycoprotein Receptor," J. Med. Chem. 2004, (47): 5798-5808, para ejemplos de agrupaciones de conjugados de carbohidratos).
"Derivado de carbohidrato" significa cualquier compuesto que puede sintetizarse usando un carbohidrato como material de partida o producto intermedio.
"CEt" o "etilo restringido" significa un nucleósido bicíclico que tiene una fracción de azúcar que comprende un puente que conecta el carbono 4' y el carbono 2’, en donde el puente tiene la fórmula: 4'-CH(CH3)-O-2\ “Nucleósido modificado con cEt” (también “nucleósido de etilo restringido”) significa un nucleósido que comprende una fracción de azúcar bicíclico que comprende un puente 4'-CH(CH3)-O-2'.
"Región químicamente distinta" se refiere a una región de un compuesto antisentido que de alguna manera es químicamente diferente de otra región del mismo compuesto antisentido. Por ejemplo, una región que tiene nucleósidos de 2'-O-metoxietilo es químicamente distinta de una región que tiene nucleósidos sin modificaciones de 2'-O-metoxietilo.
"Modificación química" significa una diferencia química en un compuesto en comparación con una contrapartida de origen natural. Las modificaciones químicas de oligonucleótidos incluyen modificaciones de nucleósidos (incluyendo modificaciones de fracciones de azúcar y modificaciones de nucleobases) y modificaciones de enlaces internucleosídicos. En referencia a un oligonucleótido, la modificación química no incluye diferencias solo en la secuencia de nucleobases.
"Compuesto antisentido quimérico" significa un compuesto antisentido que tiene por lo menos dos regiones químicamente distintas, cada posición teniendo una pluralidad de subunidades.
“Enlace escindible” significa cualquier enlace químico que puede dividirse. En ciertas realizaciones, un enlace escindible se selecciona de entre: una amida, una poliamida, un éster, un éter, uno o ambos ésteres de un fosfodiéster, un éster fosfato, un carbamato, un disulfuro o un péptido.
"Fracción escindible" significa un enlace o grupo que puede dividirse en condiciones fisiológicas. En ciertas realizaciones, una fracción escindióle se escinde dentro de una célula o compartimentos subcelulares, como un lisosoma. En ciertas realizaciones, una fracción escindióle se escinde por enzimas endógenas, como nucleasas. En ciertas realizaciones, una fracción escindióle comprende un grupo de átomos que tienen uno, dos, tres, cuatro o más de cuatro enlaces escindibles.
"Coadministración" significa la administración de dos o más agentes farmacéuticos a un individuo. Los dos o más agentes farmacéuticos pueden estar en una única composición farmacéutica o pueden estar en composiciones farmacéuticas separadas. Cada uno de los dos o más agentes farmacéuticos puede administrarse a través de la misma vía o diferentes vías de administración. La coadministración comprende la administración paralela o secuencial.
"Complementariedad" significa la capacidad de emparejarse entre nucleobases de un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico.
"Comprender", "comprende" y "que comprende" se entenderá que implica la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.
"Conjugado" o "grupo conjugado" significa un átomo o grupo de átomos unidos a un oligonucleótido o compuesto oligomérico. En general, los grupos conjugados modifican una o más propiedades del compuesto al que están unidos, incluyendo, pero no limitado a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o depuración.
"Conector conjugado" o "conector" en el contexto de un grupo conjugado significa una porción de un grupo conjugado que comprende cualquier átomo o grupo de átomos y que enlaza covalentemente (1 ) un oligonucleótido con otra porción del grupo conjugado o (2) dos o más porciones del grupo conjugado.
Los grupos conjugados se muestran en la presente como radicales, que proporcionan un enlace para formar una unión covalente con un compuesto oligomérico, como un oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 3' del grupo hidroxilo 3' del nucleósido 3' terminal del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, el punto de unión en el compuesto oligomérico es el átomo de oxígeno 5' del grupo hidroxilo 5' del nucleósido 5' terminal del compuesto oligomérico. En ciertas realizaciones, el enlace para formar la unión con el compuesto oligomérico es un enlace escindible. En ciertas de tales realizaciones, dicho enlace escindible constituye todo o parte de una fracción escindible.
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden una fracción escindible (por ejemplo, un enlace escindible o nucleósido escindible) y una porción de agrupación de carbohidratos, como una porción de agrupación de GalNAc. Tal porción de agrupación de carbohidratos comprende: una fracción de direccionamiento y, opcionalmente, un conector conjugado. En ciertas realizaciones, la parte de agrupación de carbohidratos se identifica por el número y la identidad del ligando. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la porción de agrupación de carbohidratos comprende 3 grupos GalNAc y se designa "GalNAc3". En ciertas realizaciones, la porción de agrupación de carbohidratos comprende 4 grupos GalNAc y se designa "GalNAc4”. Las porciones de agrupaciones de carbohidratos específicas (que tienen grupos conectores de anclaje, ramificación y conjugados específicos) se describen en la presente y se designan con números romanos seguidos del subíndice "a". Por consiguiente, "GalNac3-1a" se refiere a una porción de agrupación de carbohidratos específica de un grupo conjugado que tiene 3 grupos GalNac y grupos de anclaje, ramificación y ligamiento identificados específicamente. Tal fragmento de agrupación de carbohidratos se une a un compuesto oligomérico mediante una fracción escindible, como un enlace escindible o nucleósido escindible.
"Compuesto conjugado" significa cualquier átomo, grupo de átomos o grupo de átomos enlazados adecuado para su uso como grupo conjugado. En ciertas realizaciones, los compuestos conjugados pueden poseer o impartir una o más propiedades, que incluyen, pero no se limitan a, propiedades farmacodinámicas, farmacocinéticas, de unión, absorción, distribución celular, captación celular, carga y/o depuración.
"Nucleobases contiguas" significa nucleobases inmediatamente adyacentes entre sí.
"Diseño" o "Diseñado para" se refiere al proceso para crear un compuesto oligomérico que hibrida específicamente con una molécula de ácido nucleico seleccionada.
"Diluyente" significa un ingrediente en una composición que carece de actividad farmacológica, pero que es farmacéuticamente necesario o deseable. Por ejemplo, en los fármacos que se inyectan, el diluyente puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina.
"Dosis" significa una cantidad especificada de un agente farmacéutico proporcionada en una única administración o en un período de tiempo especificado. En ciertas realizaciones, una dosis puede administrarse en uno, dos o más bolos, comprimidos o inyecciones. Por ejemplo, en ciertas realizaciones en las que se desea la administración subcutánea, la dosis deseada requiere un volumen que no se adapta fácilmente con una sola inyección, por lo tanto, pueden usarse dos o más inyecciones para lograr la dosis deseada. En ciertas realizaciones, el agente farmacéutico se administra mediante infusión durante un período de tiempo prolongado o de forma continua. Las dosis pueden indicarse como la cantidad de agente farmacéutico por hora, día, semana o mes.
"En sentido descendente" se refiere a la dirección relativa hacia el extremo 3' o el extremo C-terminal de un ácido nucleico.
"Cantidad eficaz" en el contexto de modular una actividad o de tratar o prevenir una afección significa la administración de esa cantidad de agente farmacéutico a un sujeto con necesidad de dicha modulación, tratamiento o profilaxis, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, que es eficaz para la modulación de ese efecto, o para el tratamiento o profilaxis o mejora de esa afección. La cantidad eficaz puede variar entre individuos dependiendo de la salud y condición física del individuo a tratar, el grupo taxonómico de los individuos a tratar, la formulación de la composición, la evaluación de la condición médica del individuo y otros factores relevantes.
"Eficacia" significa la capacidad de producir un efecto deseado.
"Expresión" incluye todas las funciones mediante las cuales la información codificada de un gen se convierte en estructuras presentes y que operan en una célula. Tales estructuras incluyen, pero no se limitan a, los productos de transcripción y traducción.
"Completamente complementario" o "100% complementario" significa que cada nucleobase de un primer ácido nucleico tiene una nucleobase complementaria en un segundo ácido nucleico. En ciertas realizaciones, un primer ácido nucleico es un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo es un segundo ácido nucleico.
"Gapmer" significa un compuesto antisentido quimérico en el que una región interna que tiene una pluralidad de nucleósidos que soportan la escisión de la RNasa H se coloca entre regiones externas que tienen uno o más nucleósidos, en donde los nucleósidos que comprenden la región interna son químicamente distintos del nucleósido o nucleósidos que comprenden las regiones externas. A la región interna puede hacerse referencia como "hueco" y a las regiones externas puede hacerse referencia como "alas".
"Halo" y "halógeno" significan un átomo seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo.
“Heteroarilo” y “heteroaromático” significan un radical que comprende un anillo, un sistema de anillo o un sistema de anillo fusionado aromático mono- o policíclico en donde por lo menos uno de los anillos es aromático e incluye uno o más heteroátomos. También se pretende que heteroarilo incluya sistemas de anillos fusionados que incluyen sistemas en los que uno o más de los anillos fusionados no contienen heteroátomos. Los grupos heteroarilo incluyen típicamente un átomo de anillo seleccionado entre azufre, nitrógeno u oxígeno. Los ejemplos de grupos heteroarilo incluyen, sin limitación, piridinilo, pirazinilo, pirimidinilo, pirrolilo, pirazolilo, imidazolilo, tiazolilo, oxazolilo, isooxazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, tiofenilo, furanilo, quinolinilo, isoquinolinilo, bencimidazolilo, benzooxazolilo, quinoxalinilo y similares. Los radicales heteroarilo pueden unirse a una molécula original directamente o mediante una fracción de enlace como un grupo alifático o heteroátomo. Los grupos heteroarilo, como se usan en la presente, pueden incluir opcionalmente grupos sustituyentes adicionales.
"Hibridación" significa el apareamiento de moléculas de ácidos nucleicos complementarias. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos complementarias incluyen, pero no se limitan a, un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, las moléculas de ácidos nucleicos complementarias incluyen, pero no se limitan a, un oligonucleótido antisentido y un objetivo de ácido nucleico.
"Identificar un animal que tiene una enfermedad inflamatoria" significa identificar un animal al que se le ha diagnosticado una enfermedad inflamatoria o que está predispuesto a desarrollar una enfermedad inflamatoria. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad inflamatoria incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad inflamatoria, incluyendo factores ambientales, que tienen historial personal o familiar o predisposición genética a una o más enfermedades inflamatorias. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como pruebas genéticas.
"Identificar un animal que tiene una enfermedad asociada a PKK" significa identificar a un animal al que se le ha diagnosticado una enfermedad asociada a PKK o que está predispuesto a desarrollar una enfermedad asociada a PKK. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad asociada a PKK incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo para desarrollar una enfermedad asociada a PKK que incluyen tener un historial personal o familiar, o predisposición genética a una o más enfermedades asociadas a PKK. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como pruebas genéticas.
“identificar un animal que tiene una enfermedad tromboembólica” significa identificar un animal al que se le ha diagnosticado una enfermedad tromboembólica o está predispuesto a desarrollar una enfermedad tromboembólica. Los individuos predispuestos a desarrollar una enfermedad tromboembólica incluyen aquellos que tienen uno o más factores de riesgo de desarrollar una enfermedad tromboembólica, incluyendo historial personal o familiar, o predisposición genética a una o más enfermedades tromboembólicas, inmovilidad, cirugía (particularmente cirugía ortopédica), enfermedad maligna, embarazo, edad avanzada, uso de anticonceptivos orales, fibrilación auricular, afección tromboembólica previa, enfermedad inflamatoria crónica y trastornos de la coagulación protrombóticos heredados o adquiridos. Dicha identificación puede lograrse mediante cualquier método, incluyendo la evaluación del historial médico de un individuo y pruebas o evaluaciones clínicas estándar, como pruebas genéticas.
"Inmediatamente adyacente" significa que no hay elementos intermedios entre los elementos inmediatamente adyacentes. "Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Individuo" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Inhibir PKK" significa reducir el nivel o la expresión de un ARNm y/o proteína de PKK. En ciertas realizaciones, los niveles de ARNm y/o proteínas de PKK se inhiben en presencia de un compuesto antisentido dirigido a PKK, incluyendo un oligonucleótido antisentido dirigido a PKK, en comparación con la expresión de niveles de ARNm y/o proteína de PKK en ausencia de un compuesto antisentido de PKK, como un oligonucleótido antisentido.
"Inhibir la expresión o actividad" se refiere a una reducción o bloqueo de la expresión o actividad y no indica necesariamente una eliminación total de la expresión o actividad.
"Enlace internucleosídico" se refiere al enlace químico entre nucleósidos.
"Grupo de enlace neutro internucleosídico" significa un grupo de enlace neutro que une directamente dos nucleósidos.
"Grupo de enlace de fósforo internucleosídico" significa un grupo de enlace de fósforo que enlaza directamente dos nucleósidos.
"Motivo de enlace" significa un patrón de modificaciones de enlace en un oligonucleótido o región del mismo. Los nucleósidos de tal oligonucleótido pueden estar modificados o sin modificar. A menos que se indique lo contrario, se pretende que los motivos de la presente que describen únicamente enlaces sean motivos de enlace. Por tanto, en tales casos, los nucleósidos no están limitados.
"Nucleósidos enlazados" significa nucleósidos adyacentes enlazados entre sí por un enlace internucleosídico.
"Ácido nucleico bloqueado" o "LNA" o "nucleósidos de LNA" significa monómeros de ácido nucleico que tienen un puente que conecta dos átomos de carbono entre la posición 4' y 2' de la unidad de azúcar de nucleósido, formando de este modo un azúcar bicíclico. Ejemplos de tales azúcares bicíclicos incluyen, pero no se limitan a A) a-L-Metilenoxi (4'-CH2-O-2')LNA, (B) p-D-Metilenoxi(4'-CH2-O-2') LNA, (C) Etilenoxi (4 '-(Ch2)2-O-2') LNA, (D) Aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2')LNA y (E) Oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') LNA, como se representa a continuación.
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Como se usa en la presente, los compuestos de LNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre la posición 4' y 2' del azúcar en donde cada uno de los puentes comprende independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- y -N(R1)--; en donde: x es 0, 1 o 2 ; n es 1, 2, 3 o 4; cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C2, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S(=O)2-Ji ) o sulfoxilo (S(=O)-Ji ); y cada Ji y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1 -C12, aminoalquilo C1 -C12 sustituido o un grupo protector.
Ejemplos de grupos puente 4'-2' incluidos en la definición de LNA incluyen, pero no se limitan a, una de las fórmulas: -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- o -C(R1R2)-O-N(R1)-. Además, otros grupos puente incluidos en la definición de L n A son puentes 4,-CH2-2,,4,-(CH2)2-2,,4,-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' y 4 lC H 2-N (R 1) -O -2 S en donde cada R1 y R2 es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
También se incluyen dentro de la definición de LNA de acuerdo con la invención los LNA en los que el grupo 2'-hidroxilo del anillo de azúcar ribosilo está conectado al átomo de carbono 4' del anillo de azúcar, formando de este modo un metilenoxi (4'-CH2-O-2') para formar la fracción de azúcar bicíclico. El puente también puede ser un grupo metileno (-CH2-) que conecta el átomo de oxígeno 2' y el átomo de carbono 4', para lo cual se usa el término metilenoxi (4'-CH2-O-2') LNA. Además; en el caso de la fracción de azúcar bicíclico que tiene un grupo puente de etileno en esta posición, se usa el término etilenoxi (4'-CH2CH2-O-2') LNA. a-L-metilenoxi (4LCH2-O-2,), un isómero de metilenoxi (4,-CH2-O-2') LNA también se incluye dentro de la definición de LNA, como se usa en la presente.
"Malapareamiento" o "nucleobase no complementaria" se refiere al caso en el que una nucleobase de un primer ácido nucleico no es capaz de emparejarse con la correspondiente nucleobase de un segundo ácido nucleico o ácido nucleico objetivo.
"Enlace internucleosídico modificado" se refiere a una sustitución o cualquier cambio de un enlace internucleosídico de origen natural (es decir, un enlace internucleosídico de fosfodiéster).
“Nucleobase modificada” significa cualquier nucleobase distinta de adenina, citosina, guanina, timidina (también conocida como 5-metiluracilo) o uracilo. Una "nucleobase no modificada" significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleósido modificado" significa un nucleósido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado y/o nucleobase modificada.
"Nucleótido modificado" significa un nucleótido que tiene, independientemente, una fracción de azúcar modificado, enlace internucleosídico modificado y/o nucleobase modificada.
"Oligonucleótido modificado" significa un oligonucleótido que comprende por lo menos un enlace internucleosídico modificado, azúcar modificado y/o nucleobase modificada.
"Azúcar modificado" significa sustitución y/o cualquier cambio de una fracción de azúcar natural.
Se pretende que "sistema de anillo mono o policíclico" incluya todos los sistemas de anillo seleccionados de sistemas de anillos de radicales simples o policíclicos en los que los anillos están fusionados o enlazados y se pretende que incluya sistemas de anillos únicos y mixtos seleccionados individualmente de alifático, alicíclico, arilo, heteroarilo, aralquilo, arilalquilo, heterocíclico, heteroarilo, heteroaromático y heteroarilalquilo. Tales estructuras mono y policíclicas pueden contener anillos que tienen cada uno el mismo nivel de saturación o cada uno, independientemente, tiene grados variables de saturación que incluyen completamente saturados, parcialmente saturados o completamente insaturados. Cada anillo puede comprender átomos de anillo seleccionados de C, N, O y S para dar lugar a anillos heterocíclicos así como anillos que comprenden solo átomos de anillo C que pueden estar presentes en un motivo mixto como, por ejemplo, bencimidazol en donde un anillo tiene solo átomos de carbono en el anillo y el anillo fusionado tiene dos átomos de nitrógeno. El sistema de anillo mono o policíclico puede sustituirse además con grupos sustituyentes como, por ejemplo, ftalimida que tiene dos grupos =O unidos a uno de los anillos. Los sistemas de anillos mono o policíclicos pueden unirse a moléculas originales usando varias estrategias, como directamente a través de un átomo del anillo, fusionarse a través de múltiples átomos del anillo, a través de un grupo sustituyente o a través de una fracción de enlace bifuncional.
"Monómero" significa una sola unidad de un oligómero. Los monómeros incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos y nucleótidos, ya sean de origen natural o modificados.
"Motivo" significa el patrón de nucleósidos modificados y no modificados en un compuesto antisentido. "Fracción de azúcar natural" significa una fracción de azúcar que se encuentra en el ADN (2LH) o ARN (2,-OH).
"Enlace internucleosídico de origen natural" significa un enlace fosfodiéster 3' a 5'.
"Grupo de enlace neutro" significa un grupo de enlace que no está cargado. Los grupos de enlace neutros incluyen, sin limitación, fosfotriésteres, metilfosfonatos, MMI (-CH2-N(CH3)-O-), amida-3 (-CH2-C(O)-N(H)-), amida-4 (-CH2-N(H)-C(=O)-), formacetal (-O-CH2-O-) y tioformacetal (-S-CH2-O-). Otros grupos de enlace neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden siloxano (dialquilsiloxano), éster de carboxilato, carboxamida, sulfuro, éster de sulfonato y amidas (ver, por ejemplo: Carbohydrate Modifications in Antisense Research; Y.S. Sanghvi and P.D. Cook Eds. ACS Symposium Series 580; Capítulos 3 y 4, (páginas 40-65)). Otros grupos de enlace neutros incluyen enlaces no iónicos que comprenden partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas.
"Nucleobase no complementaria" se refiere a un par de nucleobases que no forman enlaces de hidrógeno entre sí ni soportan de otra manera la hibridación.
"Grupo de enlace neutro no internucleosídico" significa un grupo de enlace neutro que no enlaza directamente dos nucleósidos. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza un nucleósido con un grupo distinto de un nucleósido. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace neutro no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
"Grupo de enlace de fósforo no internucleosídico" significa un grupo de enlace de fósforo que no enlaza directamente dos nucleósidos. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza un nucleósido a un grupo distinto de un nucleósido. En ciertas realizaciones, un grupo de enlace de fósforo no internucleosídico enlaza dos grupos, ninguno de los cuales es un nucleósido.
"Ácido nucleico" se refiere a moléculas compuestas de nucleótidos monoméricos. Un ácido nucleico incluye, pero no se limita a, ácidos ribonucleicos (ARN), ácidos desoxirribonucleicos (ADN), ácidos nucleicos de cadena sencilla, ácidos nucleicos de cadena doble, ácidos ribonucleicos interferentes pequeños (ARNip) y microARN (ARNmi).
"Nucleobase" significa una fracción heterocíclica capaz de emparejarse con una base de otro ácido nucleico.
"Complementariedad de nucleobases" se refiere a una nucleobase que es capaz de emparejamiento de bases con otra nucleobase. Por ejemplo, en el ADN, la adenina (A) es complementaria con la timina (T). Por ejemplo, en el ARN, la adenina (A) es complementaria con el uracilo (U). En ciertas realizaciones, nucleobase complementaria se refiere a una nucleobase de un compuesto antisentido que es capaz de emparejamiento de bases con una nucleobase de su ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, si una nucleobase en una cierta posición de un compuesto antisentido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con una nucleobase en una cierta posición de un ácido nucleico objetivo, entonces la posición de los enlaces de hidrógeno entre el oligonucleótido y el ácido nucleico objetivo se considera que es complementaria en ese par de nucleobases.
"Motivo de modificación de nucleobases" significa un patrón de modificaciones de nucleobases a lo largo de un oligonucleótido. A menos que se indique lo contrario, un motivo de modificación de nucleobases es independiente de la secuencia de nucleobases.
“Secuencia de nucleobases” significa el orden de nucleobases contiguas independientemente de cualquier azúcar, enlace y/o modificación de nucleobases.
"Nucleósido" significa una nucleobase enlazada con un azúcar.
"Mimético de nucleósidos" incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el azúcar o el azúcar y la base y no necesariamente el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, miméticos de nucleósidos que tienen miméticos de azúcares de morfolino, ciclohexenilo, ciclohexilo, tetrahidropiranilo, biciclo o triciclo, por ejemplo, unidades de azúcar no de furanosa. El mimético de nucleótidos incluye aquellas estructuras usadas para reemplazar el nucleósido y el enlace en una o más posiciones de un compuesto oligomérico como, por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos o morfolinos (morfolinos enlazados por -N(H)-C(=)-O- u otro enlace no fosfodiéster). El sustituto de azúcar se superpone con el término un poco más amplio mimético de nucleósidos, pero se pretende que indique el reemplazo de la unidad de azúcar (anillo de furanosa) solamente. Los anillos de tetrahidropiranilo proporcionados en la presente son ilustrativos de un ejemplo de un sustituto de azúcar en donde el grupo de azúcar de furanosa ha sido reemplazado por un sistema de anillo de tetrahidropiranilo. "Mimético" se refiere a grupos que están sustituidos por un azúcar, una nucleobase y/o un enlace internucleosídico. Generalmente, se usa un mimético en lugar del azúcar o la combinación de enlace azúcarinternucleosídico, y la nucleobase se mantiene para la hibridación con un objetivo seleccionado.
"Motivo de nucleósidos" significa un patrón de modificaciones de nucleósidos en un oligonucleótido o una región del mismo. Los enlaces de dicho oligonucleótido pueden modificarse o no modificarse. A menos que se indique lo contrario, se pretende que los motivos en la presente que describen solo nucleósidos sean motivos de nucleósidos. Por tanto, en tales casos, los enlaces no están limitados.
"Nucleótido" significa un nucleósido que tiene un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido.
"Efecto fuera del objetivo" se refiere a un efecto biológico no deseado o perjudicial asociado con la modulación del ARN o la expresión de proteínas de un gen distinto del ácido nucleico objetivo deseado.
"Compuesto oligomérico" u "oligómero" significa un polímero de subunidades monoméricas enlazadas que es capaz de hibridar con por lo menos una región de una molécula de ácido nucleico.
“Oligonucleótido” significa un polímero de nucleósidos enlazados, cada uno de los cuales puede modificarse o no modificarse, independientemente uno del otro.
"Administración parenteral" significa la administración mediante inyección (por ejemplo, Inyección en bolo) o infusión. La administración parenteral incluye administración subcutánea, administración intravenosa, administración intramuscular, administración intraarterial, administración intraperitoneal o administración intracraneal, por ejemplo, administración intratecal o intracerebroventricular.
"Péptido" significa una molécula formada enlazando por lo menos dos aminoácidos mediante enlaces amida. Sin limitación, como se usa en la presente, péptido se refiere a polipéptidos y proteínas.
"Agente farmacéutico" significa una sustancia que proporciona un beneficio terapéutico cuando se administra a un individuo. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un oligonucleótido antisentido dirigido a PKK es un agente farmacéutico.
"Composición farmacéutica" significa una mezcla de sustancias adecuadas para administrar a un sujeto. Por ejemplo, una composición farmacéutica puede comprender un oligonucleótido antisentido y una solución acuosa estéril.
"Derivado farmacéuticamente aceptable" abarca sales, conjugados, profármacos o isómeros farmacéuticamente aceptables de los compuestos descritos en la presente.
"Sales farmacéuticamente aceptables" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten efectos toxicológicos no deseados a los mismos.
"Enlace fosforotioato" significa un enlace entre nucleósidos en el que el enlace fosfodiéster se modifica reemplazando uno de los átomos de oxígeno que no forman puentes por un átomo de azufre. Un enlace fosforotioato es un enlace internucleosídico modificado.
"Grupo de enlace de fósforo" significa un grupo de enlace que comprende un átomo de fósforo. Los grupos de enlace de fósforo incluyen, sin limitación, grupos que tienen la fórmula:
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en donde:
Ra y Rd son cada uno, independientemente, O, S, CH2, NH, o NJi en donde Ji es alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
Rb es O o S;
Rc es OH, SH, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alcoxi C1-C6, alcoxi C1-C6 sustituido, amino o amino sustituido; y
J1 es Rb es O o S.
Los grupos de enlace de fósforo incluyen, sin limitación, fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato, fosforamidato, fosforotioamidato, tionoalquilfosfonato, fosfotriésteres, tionoalquilfosfotriéster y boranofosfato.
"PKK" significa precalicreína plasmática de mamífero, incluyendo la precalicreína plasmática humana. La precalicreína plasmática (PKK) es el precursor de la calicreína plasmática (PK), que está codificada por el gen KLKB 1.
"Enfermedad asociada a PKK" significa cualquier enfermedad asociada con cualquier ácido nucleico de PKK o producto de expresión del mismo. Tales enfermedades pueden incluir una enfermedad inflamatoria o una enfermedad tromboembólica. Tales enfermedades pueden incluir angioedema hereditario (HAE).
"ARNm de PKK" significa cualquier producto de expresión de ARN mensajero de una secuencia de ADN que codifica PKK.
"Ácido nucleico de PKK" significa cualquier ácido nucleico que codifica PKK. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, un ácido nucleico de PKK incluye una secuencia de ADN que codifica PKK, una secuencia de ARN transcrita a partir de ADN que codifica PKK (incluyendo ADN genómico que comprende intrones y exones) y una secuencia de ARNm que codifica PKK. "ARNm de PKK" significa un ARNm que codifica una proteína de PKK. "Proteína de PKK" significa el producto de expresión polipeptídica de un ácido nucleico de PKK.
"Porción" significa un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) de un ácido nucleico. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción es un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido.
"Prevenir" o "prevención" se refiere a retrasar o impedir la aparición o el desarrollo de una enfermedad, trastorno o afección durante un período de tiempo de minutos a días, de semanas a meses o indefinidamente. "Profármaco" significa un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte en una forma activa (es decir, un fármaco) dentro del cuerpo o células del mismo mediante la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones.
"Cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio profiláctico o preventivo a un animal.
"Grupo protector" significa cualquier compuesto o grupo protector conocido por los expertos en la técnica. Ejemplos no limitativos de grupos protectores pueden encontrarse en "Protective Groups in Organic Chemistry", T.W. Greene, P.G.M. Wuts, ISBN 0-471-62301-6, John Wiley & Sons, Inc, Nueva York.
"Región" se define como una porción del ácido nucleico objetivo que tiene por lo menos una estructura, función o característica identificable.
"Ribonucleótido" significa un nucleótido que tiene un hidroxi en la posición 2' de la porción de azúcar del nucleótido. Los ribonucleótidos pueden modificarse con cualquiera de una variedad de sustituyentes.
"Compuesto antisentido basado en RISC" significa un compuesto antisentido en el que por lo menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible al complejo silenciador inducido por ARN (RISC).
"Compuesto antisentido basado en RNasa H" significa un compuesto antisentido en el que por lo menos parte de la actividad antisentido del compuesto antisentido es atribuible a la hibridación del compuesto antisentido a un ácido nucleico objetivo y la posterior escisión del ácido nucleico objetivo por RNasa H.
"Sales" significa sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de compuestos antisentido, es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del oligonucleótido original y no imparten al mismo efectos toxicológicos no deseados.
Los "segmentos" se definen como sub-porciones más pequeñas de regiones dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Regiones separadas" significa porciones de un oligonucleótido en las que las modificaciones químicas o el motivo de modificaciones químicas de cualquier porción colindante incluyen por lo menos una diferencia para permitir que las regiones separadas se distingan entre sí.
"Motivo de secuencia" significa un patrón de nucleobases dispuestas a lo largo de un oligonucleótido o porción del mismo. A menos que se indique lo contrario, un motivo de secuencia es independiente de las modificaciones químicas y, por tanto, puede tener cualquier combinación de modificaciones químicas, incluyendo modificaciones químicas.
"Efectos secundarios" significa respuestas fisiológicas atribuibles a un tratamiento distintas a los efectos deseados. En ciertas realizaciones, los efectos secundarios incluyen, sin limitación, reacciones en el lugar de inyección, anomalías en las pruebas de función hepática, anomalías en la función renal, toxicidad hepática, toxicidad renal, anomalías del sistema nervioso central y miopatías.
"Oligonucleótido de cadena sencilla" significa un oligonucleótido que no está hibridado con una cadena complementaria.
"Sitios", como se usa en la presente, se definen como posiciones de nucleobases únicas dentro de un ácido nucleico objetivo.
"Específicamente hibridable" o "hibrida específicamente" se refiere a un compuesto antisentido que tiene un grado suficiente de complementariedad entre un oligonucleótido antisentido y un ácido nucleico objetivo para inducir un efecto deseado, a la vez que muestra efectos mínimos o nulos sobre ácidos nucleicos no objetivo en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo y tratamientos terapéuticos.
"Condiciones de hibridación rigurosas" o "condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones en las que un compuesto oligomérico hibridará con su secuencia objetivo, pero con un número mínimo de otras secuencias.
"Sujeto" significa un animal humano o no humano seleccionado para tratamiento o terapia.
"Sustituyente" y "grupo sustituyente" significa un átomo o grupo que reemplaza al átomo o grupo de un compuesto original mencionado. Por ejemplo, un sustituyente de un nucleósido modificado es cualquier átomo o grupo que difiere del átomo o grupo que se encuentra en un nucleósido de origen natural (por ejemplo, un sustituyente 2' modificado es cualquier átomo o grupo en la posición 2' de un nucleósido distinto de H u OH). Los grupos sustituyentes pueden estar protegidos o desprotegidos. En ciertas realizaciones, los compuestos de la presente divulgación tienen sustituyentes en una o más de una posición del compuesto original. Los sustituyentes también pueden sustituirse adicionalmente con otros grupos sustituyentes y pueden unirse directamente o mediante un grupo de enlace como un grupo alquilo o hidrocarbilo, a un compuesto original.
De igual manera, como se usa en la presente, "sustituyente" en referencia a un grupo funcional químico significa un átomo o grupo de átomos que difiere del átomo o un grupo de átomos normalmente presentes en el grupo funcional mencionado. En ciertas realizaciones, un sustituyente reemplaza un átomo de hidrógeno del grupo funcional (por ejemplo, en ciertas realizaciones, el sustituyente de un grupo metilo sustituido es un átomo o grupo distinto de hidrógeno que reemplaza uno de los átomos de hidrógeno de un grupo metilo no sustituido). A menos que se indique lo contrario, los grupos susceptibles de usarse como sustituyentes incluyen, sin limitación, halógeno, hidroxilo, alquilo, alquenilo, alquinilo, acilo (-C(O)Raa), carboxilo (-C(O)O-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcoxi oxi substituido (-O-Raa), arilo, aralquilo, radical heterocíclico, heteroarilo, heteroarilalquilo, amino (-N(Rbb)(Rcc)), imino(=NRbb), amido (-C(O)N(Rbb)(Rcc) or -N(Rbb)C(O)Raa), azido (-N3), nitro (-NO2), ciano (-CN), carbamido (-OC(O)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(O)ORaa), ureido (-N(Rbb)C(O)N(Rbb)(Rcc)), tioureido (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)-(Rcc)), guanidinilo (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinilo (-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfinilo (-S(O)Rbb), sulfonilo (-S(O)2Rbb) ysulfonamidilo (-S(O)2N(Rbb)(Rcc) o -N(Rbb)S-(O)2Rbb). En donde cada Raa, Rbb y Rcc es, independientemente, H, un grupo funcional químico opcionalmente enlazado o un grupo sustituyente adicional con una lista preferida que incluye, sin limitación, alquilo, alquenilo, alquinilo, alifático, alcoxi, acilo, arilo, aralquilo, heteroarilo, alicíclico, heterocíclico y heteroarilalquilo. Los sustituyentes seleccionados dentro de los compuestos descritos en la presente están presentes en un grado recurrente.
"Fracción de azúcar sustituido" significa un furanosilo que no es una fracción de azúcar de origen natural. Los fracciones de azúcar sustituido incluyen, pero no se limitan a, furanosilos que comprenden sustituyentes en la posición 2', la posición 3', la posición 5' y/o la posición 4'. Ciertas fracciones de azúcar sustituido son fracciones de azúcar bicíclicos.
"Fracción de azúcar" significa una fracción de azúcar de origen natural o una fracción de azúcar modificado de un nucleósido.
"Motivo de azúcar" significa un patrón de modificaciones de azúcar en un oligonucleótido o una región del mismo.
"Sustituto de azúcar" significa una estructura que no comprende un furanosilo y que es capaz de reemplazar la fracción de azúcar de origen natural de un nucleósido, de tal manera que las subunidades de nucleósidos resultantes son capaces de enlazarse entre sí y/o enlazarse con otros nucleósidos para formar un compuesto oligomérico que es capaz de hibridar con un compuesto oligomérico complementario. Tales estructuras incluyen anillos que comprenden un número de átomos diferente al del furanosilo (por ejemplo, anillos de 4, 6 o 7 miembros); reemplazo del oxígeno de un furanosilo con un átomo que no es oxígeno (por ejemplo, carbono, azufre o nitrógeno); o tanto un cambio en el número de átomos como un reemplazo del oxígeno. Tales estructuras también pueden comprender sustituciones correspondientes a las descritas para fracciones de azúcar sustituido (por ejemplo, sustitutos de azúcar bicíclico carbocíclico de 6 miembros que comprenden opcionalmente sustituyentes adicionales). Los sustitutos de azúcar también incluyen reemplazos de azúcar más complejos (por ejemplo, los sistemas no de anillo de ácido nucleico peptídico). Los sustitutos del azúcar incluyen, sin limitación, morfolinos, ciclohexenilos y ciclohexitoles.
"Objetivo" se refiere a una proteína, cuya modulación se desea.
"Gen objetivo" se refiere a un gen que codifica un objetivo.
"Dirigir" o "dirigido" significa el proceso de diseño y selección de un compuesto antisentido que hibridará específicamente con un ácido nucleico objetivo e inducirá un efecto deseado.
“Ácido nucleico objetivo”, “ARN objetivo” y “transcripción de ARN objetivo” y “ácido nucleico objetivo” significan todos un ácido nucleico capaz de ser dirigido por compuestos antisentido.
"Región objetivo" significa una porción de un ácido nucleico objetivo a la que se dirigen uno o más compuestos antisentido.
"Segmento objetivo" significa la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico objetivo al que se dirige un compuesto antisentido. "Sitio objetivo 5' " se refiere al nucleótido más 5' de un segmento objetivo. "Sitio objetivo 3' " se refiere al nucleótido más 3' de un segmento objetivo.
"Grupo terminal" significa uno o más átomos unidos a uno, o ambos, del extremo 3' o del extremo 5' de un oligonucleótido. En ciertas realizaciones, un grupo terminal es un grupo conjugado. En ciertas realizaciones, un grupo terminal comprende uno o más nucleósidos del grupo terminal.
"Enlace internucleosídico terminal" significa el enlace entre los dos últimos nucleósidos de un oligonucleótido o una región definida del mismo.
"Cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de un agente farmacéutico que proporciona un beneficio terapéutico a un individuo.
"Tratar" o "tratando" o "tratamiento" se refiere a administrar una composición para efectuar una mejora de la enfermedad o afección.
"Tipo de modificación" en referencia a un nucleósido o un nucleósido de un "tipo" significa la modificación química de un nucleósido e incluye nucleósidos modificados y no modificados. Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, un "nucleósido que tiene una modificación de un primer tipo" puede ser un nucleósido no modificado.
“Nucleobases no modificadas” significa las bases de purina adenina (A) y guanina (G), y las bases de pirimidina timina (T), citosina (C) y uracilo (U).
"Nucleótido no modificado" significa un nucleótido compuesto de nucleobases de origen natural, fracciones de azúcar y enlaces internucleosídicos. En ciertas realizaciones, un nucleótido no modificado es un nucleótido de ARN (es decir, p-D-ribonucleósidos) o un nucleótido de ADN (es decir, p-D-desoxirribonucleósido).
"En sentido ascendente" se refiere a la dirección relativa hacia el extremo 5' o el extremo N-terminal de un ácido nucleico.
"Segmento de ala" significa una pluralidad de nucleósidos modificados para impartir a un oligonucleótido propiedades como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada para un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Ciertas realizaciones
Ciertas realizaciones divulgan compuestos, composiciones y métodos para inhibir la expresión de ARNm y proteína de precalicreína plasmática (PKK). Ciertas realizaciones divulgan compuestos, composiciones y métodos para disminuir los niveles de proteína y ARNm de PKK. Todas las realizaciones no cubiertas por las reivindicaciones son meramente aspectos de la presente divulgación y no forman parte de la invención.
En ciertas realizaciones, el compuesto consiste en un oligonucleótido modificado de cadena sencilla.
En ciertas realizaciones, por lo menos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado.
En ciertas realizaciones, por lo menos un enlace internucleosídico modificado del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 enlaces internucleosídicos de fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado se selecciona de un enlace internucleosídico de fosfodiéster y un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, por lo menos un nucleósido del oligonucleótido modificado comprende una nucleobase modificada.
En ciertas realizaciones, la nucleobase modificada es una 5-metilcitosina.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende por lo menos un azúcar modificado. En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es un azúcar 2’ modificado, un BNA o un THP.
En ciertas realizaciones, el azúcar modificado es cualquiera de un 2'-O-metoxietilo, 2'-O-metilo, un etilo restringido, un LNA o un 3'-fluoro-HNA.
En ciertas realizaciones, el compuesto comprende por lo menos un nucleósido de 2'-O-metoxietilo, nucleósido de 2'-O-metilo, nucleósido de etilo restringido, nucleósido de LNA o nucleósido de 3'-fluoro-HNA.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado comprende:
un segmento de hueco que consiste de 10 desoxinucleósidos enlazados;
un segmento de ala 5' que consiste de 5 nucleósidos enlazados; y
un segmento de ala 3' que consiste de 5 nucleósidos enlazados;
en donde el segmento de hueco está colocado entre el segmento de ala 5' y el segmento de ala 3' y en donde cada nucleósido de cada segmento de ala comprende un azúcar modificado.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste de 19 nucleósidos enlazados.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido modificado consiste de 18 nucleósidos enlazados.
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos que consisten de un grupo conjugado y un oligonucleótido modificado de acuerdo con la siguiente fórmula: Tes Ges mCes Aes Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCes Ae; en donde,
A = una adenina,
mC = una 5'-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo,
d = un 2 '-desoxinucleósido, y
s = un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el grupo conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 5' del oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones de la divulgación, el grupo conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 3' del oligonucleótido modificado. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado comprende por lo menos una N-Acetilgalactosamina (GalNAc), por lo menos dos N-Acetilgalactosaminas (GalNAcs) o por lo menos tres N-Acetilgalactosaminas (GalNAcs).
Ciertas realizaciones proporcionan compuestos de acuerdo con la siguiente fórmula:
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En ciertas realizaciones, un compuesto que tiene la siguiente estructura química comprende o consiste de ISIS 721744 con un 5'-X, donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc como se describe en la presente:
Figure imgf000020_0001
En ciertas realizaciones, un compuesto que tiene la siguiente estructura química comprende o consiste de ISIS 546254 con un 5'-X, en donde X es un grupo conjugado que comprende GalNAc como se describe en la presente:
Figure imgf000021_0001
Ciertas realizaciones proporcionan un compuesto que comprende o consiste de la fórmula siguiente:
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Ciertas realizaciones proporcionan un compuesto que comprende o consiste de la formula siguiente:
Figure imgf000023_0001
en donde cualquier R1 es -OCH2CH2OCH3 (MOE) y R2 es H; o R1 y R2 juntos forman un puente, en donde R1 es -O- y R2 es -CH2-, -CH(CH3) -, o -CH2CH2-, y R1 y R2 están conectados directamente de tal manera que el puente resultante se seleccione de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
y para cada par de R3 y R4 en el mismo anillo, independientemente para cada anillo: cualquier R3 se selecciona de H y -OCH2CH2OCH3 y R4 es H; o R3 y R4 juntos forman un puente, en donde R3 es -O-, y R4 es -CH2-, -CH(CH3)-, o -CH2CH2- y R3 y R4 están conectados directamente de tal manera que el puente resultante se selecciona de: -O-CH2-, -O-CH(CH3)- y -O-CH2CH2-;
y R5 se selecciona de H y -CH3;
y Z se selecciona de S- y O- .
Ciertas realizaciones proporcionan composiciones que comprenden un compuesto como se describe en la presente o una sal del mismo y por lo menos uno de un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Ciertas realizaciones divulgan métodos que comprenden administrar a un animal el compuesto o composición como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, el animal es un humano.
En ciertas realizaciones, la administración del compuesto previene, trata o mejora una enfermedad, trastorno o afección asociada a PKK.
En ciertas realizaciones, la enfermedad, trastorno o afección asociada a PKK es un angioedema hereditario (HAE), edema, angioedema, hinchazón, angioedema de los párpados, edema ocular, edema macular, edema cerebral, trombosis, embolia, tromboembolismo, trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio, ataque cerebral o infarto.
Ciertas realizaciones divulgan el uso de un compuesto o composición como se describe en al presente para la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria o una enfermedad tromboembólica.
Compuestos antisentido
Los compuestos oligoméricos incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, oligonucleósidos, análogos de oligonucleótidos, miméticos de oligonucleótidos, compuestos antisentido, oligonucleótidos antisentido y ARNip. Un compuesto oligomérico puede ser "antisentido" para un ácido nucleico objetivo, lo que significa que es capaz de experimentar hibridación con un ácido nucleico objetivo mediante enlaces de hidrógeno.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que se dirige. En ciertas de tales realizaciones, un oligonucleótido antisentido tiene una secuencia de nucleobases que, cuando se escribe en la dirección 5' a 3', comprende el complemento inverso del segmento objetivo de un ácido nucleico objetivo al que se dirige.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PKK pueden acortarse o truncarse. Por ejemplo, puede eliminarse una sola subunidad del extremo 5' (truncamiento 5') o, alternativamente, del extremo 3' (truncamiento 3 '). Un compuesto antisentido acortado o truncado dirigido a un ácido nucleico de PKK puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 5', o alternativamente puede tener dos subunidades eliminadas del extremo 3', del compuesto antisentido. Alternativamente, los nucleósidos eliminados pueden estar dispersos por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene un nucleósido eliminado del extremo 5' y un nucleósido eliminado del extremo 3'.
Cuando solo hay una única subunidad adicional en un compuesto antisentido alargado, la subunidad adicional puede estar localizada en el extremo 5 'o 3' del compuesto antisentido. Cuando hay dos o más subunidades adicionales, las subunidades añadidas pueden ser adyacentes entre sí, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene dos subunidades añadidas en el extremo 5' (adición 5'), o alternativamente en el extremo 3' (adición 3’), del compuesto antisentido. Alternativamente, las subunidades añadidas pueden estar dispersas por todo el compuesto antisentido, por ejemplo, en un compuesto antisentido que tiene una subunidad añadida al extremo 5' y una subunidad añadida al extremo 3'.
Es posible aumentar o disminuir la longitud de un compuesto antisentido, como un oligonucleótido antisentido, y/o introducir bases malapareadas sin eliminar la actividad. Por ejemplo, en Woolf et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992), se probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 13-25 nucleobases de longitud para determinar su capacidad para inducir la escisión de un ARN objetivo en un modelo de inyección de ovocitos. Los oligonucleótidos antisentido de 25 nucleobases de longitud con 8 u 11 bases malapareadas cerca de los extremos de los oligonucleótidos antisentido pudieron dirigir la escisión específica del ARNm objetivo, aunque en menor medida que los oligonucleótidos antisentido que no contenían malapareamientos. De manera similar, la escisión específica del objetivo se logró usando 13 oligonucleótidos antisentido de nucleobases, incluyendo aquellos con 1 o 3 malapareamientos.
Gautschi et al (J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, marzo de 2001) demostraron la capacidad de un oligonucleótido que tiene una complementariedad del 100% con el ARNm de bcl-2 y que tiene 3 malapareamientos con el ARNm de bcl-xL para reducir la expresión de tanto bcl-2 como bcl-xL in vitro e in vivo. Además, este oligonucleótido demostró una potente actividad antitumoral in vivo.
Maher y Dolnick (Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988) probaron una serie de oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases en tándem, y oligonucleótidos antisentido de 28 y 42 nucleobase compuestos de la secuencia de dos o tres de los oligonucleótidos antisentido en tándem, respectivamente, para determinar su capacidad para detener la traducción de DHFR humano en un ensayo de reticulocitos de conejo. Cada uno de los tres oligonucleótidos antisentido de 14 nucleobases por sí solo pudo inhibir la traducción, aunque a un nivel más modesto que los oligonucleótidos antisentido de 28 o 42 nucleobases.
Motivos de compuestos antisentido
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de PKK tienen subunidades químicamente modificadas dispuestas en patrones, o motivos, para conferir a los compuestos antisentido propiedades como actividad inhibidora mejorada, afinidad de unión aumentada para un ácido nucleico objetivo, o resistencia a la degradación por nucleasas in vivo.
Los compuestos antisentido quiméricos contienen típicamente por lo menos una región modificada para conferir una resistencia aumentada a la degradación por nucleasas, captación celular aumentada, afinidad de unión aumentada por el ácido nucleico objetivo y/o actividad inhibidora aumentada. Una segunda región de un compuesto antisentido quimérico puede servir opcionalmente como sustrato para la endonucleasa celular RNasa H, que escinde la cadena de ARN de un dúplex A r N :A DN.
Los compuestos antisentido que tienen un motivo gapmer se consideran compuestos antisentido quiméricos. En un gapmer, una región interna que tiene una pluralidad de nucleótidos que soporta la escisión de RNasaH se coloca entre regiones externas que tienen una pluralidad de nucleótidos que son químicamente distintos de los nucleósidos de la región interna. En el caso de un oligonucleótido antisentido que tiene un motivo gapmer, el segmento de hueco generalmente sirve como sustrato para la escisión de endonucleasas, mientras que los segmentos de ala comprenden nucleósidos modificados. En ciertas realizaciones, las regiones de un gapmer se diferencian por los tipos de fracciones de azúcar que comprenden cada región distinta. Los tipos de fracciones de azúcar que se usan para diferenciar las regiones de un gapmer pueden incluir en algunas realizaciones p-D-ribonucleósidos, p-D-desoxirribonucleósidos, nucleósidos 2’ modificados (tales nucleósidos 2’-modificados pueden incluir 2’-MOE, and 2 ’-O-C3, entre otros) y nucleósidos modificados con azúcar bicíclico (tales nucleósidos modificados con azúcar bicíclico pueden incluir aquellos que tienen un puente 4'-(CH2 n-O-2', donde n = 1 o n = 2 y 4'-CH2-O-CH2-2'). En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias fracciones de azúcar modificado, que incluyen, por ejemplo, 2'-MOE. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias fracciones de azúcar modificado y no modificado. En ciertas realizaciones, las alas pueden incluir varias combinaciones de nucleósidos 2'-MOE y 2'-desoxinucleósidos.
Cada región distinta puede comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes, o fracciones de azúcar alternas. El motivo del ala-hueco-ala se describe con frecuencia como "X-Y-Z", donde "X" representa la longitud del ala 5', "Y" representa la longitud del hueco y "Z" representa la longitud del ala 3'. "X" y "Z" pueden comprender fracciones de azúcar uniformes, variantes o alternas. En ciertas realizaciones, "X" e "Y" pueden incluir uno o más 2'-desoxinucleósidos. "Y" puede comprender 2'-desoxinucleósidos. Como se usa en la presente, un gapmer descrito como "X-Y-Z" tiene una configuración tal que el hueco está colocado inmediatamente adyacente a cada una de las alas 5' y 3'. Por tanto, no hay nucleótidos intermedios entre el ala 5' y el hueco, o el hueco y el ala 3'. Cualquiera de los compuestos antisentido descritos en la presente puede tener un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, "X" y "Z" son iguales; en otras realizaciones son diferentes.
En ciertas realizaciones, los gapmer proporcionados en la presente incluyen, por ejemplo, 20-meros que tienen un motivo de 5-10-5.
Ácidos nucleicos objetivo, regiones objetivo y secuencias de nucleótidos
Las secuencias de nucleótidos que codifican precalicreína plasmática humana (PKK) incluyen, sin limitación, las siguientes: N° de Registro GENBANK NM_000892.3 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 1), N° de Registro GENBANK DC412984.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 2), N° de Registro GENBANK CN265612.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 3), N° de Registro GENBANK AK297672.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 4), N° de Registro G e N b A N K DC413312.1 (incorporada en la presente como S e Q ID NO: 5), N° de Registro GENBANK AV688858.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 6), N° de Registro GENBANK CD652077.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 7), N° de Registro GENBANK BC143911.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 8), N° de Registro GENBANK CB162532.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 9), N° de Registro GENBANK NT_016354.19 truncada de las nucleobases 111693001 a 111730000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 10), N° de Registro GENBANK NM_008455.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 11), N° de Registro GENBANK BB598673.1 (incorporada en la presente como S e Q ID NO: 12), N° de Registro G e N b A N K NT_039460.7 truncada de las nucleobases 6114001 a 6144000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 13), N° de Registro GENBANK NM_012725.2 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 14), N° de Registro GENBANK NW_047473.1 truncada de las nucleobases 10952001 a 10982000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 15), N° de Registro GENBANK XM_002804276.1 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 17), y N° de Registro GENBANK NW_001118167.1 truncada de las nucleobases 2358000 a 2391000 (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 18).
Se entiende que la secuencia expuesta en cada SEQ ID NO en los Ejemplos contenidos en la presente es independiente de cualquier modificación de una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Como tales, los compuestos antisentido definidos por una SEQ ID NO pueden comprender, independientemente, una o más modificaciones de una fracción de azúcar, un enlace internucleosídico o una nucleobase. Los compuestos antisentido descritos por el número de Isis (N° de Isis) indican una combinación de secuencia y motivo de nucleobases.
En ciertas realizaciones, una región objetivo es una región estructuralmente definida del ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, una región objetivo puede abarcar una UTR 3', una UTR 5', un exón, un intrón, una unión exón/intrón, una región codificante, una región de inicio de la traducción, una región de terminación de la traducción u otra región definida del ácido nucleico. Las regiones estructuralmente definidas para PKK pueden obtenerse mediante el número de acceso a partir de bases de datos de secuencias como NCBI. En ciertas realizaciones, una región objetivo puede abarcar la secuencia desde un sitio objetivo 5' de un segmento objetivo dentro de la región objetivo hasta un sitio objetivo 3' de otro segmento objetivo dentro de la misma región objetivo.
El direccionamiento incluye la determinación de por lo menos un segmento objetivo con el que hibrida un compuesto antisentido, de manera que se produce el efecto deseado. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es una reducción en los niveles de ácido nucleico objetivo de ARNm. En ciertas realizaciones, el efecto deseado es la reducción de los niveles de proteína codificada por el ácido nucleico objetivo o un cambio fenotípico asociado con el ácido nucleico objetivo.
Una región objetivo puede contener uno o más segmentos objetivo. Es posible que se superpongan múltiples segmentos objetivo dentro de una región objetivo. Alternativamente, pueden no superponerse. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de aproximadamente 300 nucleótidos. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por un número de nucleótidos que es, es aproximadamente, no es más de, no es más de aproximadamente, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 o 10 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo, o es un intervalo definido por dos cualquiera de los valores precedentes. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo dentro de una región objetivo están separados por no más de, o no más de aproximadamente 5 nucleótidos en el ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, los segmentos objetivo son contiguos. Se contemplan regiones objetivo definidas por un intervalo que tiene un ácido nucleico de inicio que es cualquiera de los sitios objetivo 5’ o los sitios objetivo 3’ enumerados en la presente.
Los segmentos objetivo adecuados pueden encontrarse dentro de una UTR 5', una región codificante, una UTR 3', un intrón, un exón o una unión exón/intrón. Los segmentos objetivo que contienen un codón de inicio o un codón de parada también son segmentos objetivo adecuados. Un segmento objetivo adecuado puede excluir específicamente una determinada región estructuralmente definida, como el codón de inicio o el codón de parada.
La determinación de segmentos objetivo adecuados puede incluir una comparación de la secuencia de un ácido nucleico objetivo con otras secuencias en todo el genoma. Por ejemplo, puede usarse el algoritmo BLAST para identificar regiones de similitud entre diferentes ácidos nucleicos. Esta comparación puede evitar la selección de secuencias de compuestos antisentido que pueden hibridar de manera no específica con secuencias distintas de un ácido nucleico objetivo seleccionado (es decir, secuencias no objetivo o fuera del objetivo).
Puede haber variación en la actividad (por ejemplo, como se define por el porcentaje de reducción de los niveles de ácido nucleico objetivo) de los compuestos antisentido dentro de una región objetivo activa. En ciertas realizaciones, las reducciones en los niveles de ARNm de PKK son indicativas de la inhibición de la expresión de PKK. Las reducciones en los niveles de una proteína de PKK también son indicativas de la inhibición de la expresión del ARNm objetivo. Además, los cambios fenotípicos son indicativos de inhibición de la expresión de PKK. Por ejemplo, la inflamación reducida o prevenida puede ser indicativa de inhibición de la expresión de PKK. En otro ejemplo, el edema/hinchazón reducido o prevenido puede ser indicativo de inhibición de la expresión de PKK. En otro ejemplo, la permeabilidad vascular reducida o prevenida puede ser indicativa de inhibición de la expresión de PKK. En otro ejemplo, la pérdida vascular reducida o prevenida puede ser indicativa de inhibición de la expresión de PKK. En ciertas realizaciones, la permeabilidad vascular se mide mediante la cuantificación de un colorante, como el azul de Evans.
Hibridación
En algunas realizaciones, se produce la hibridación entre un compuesto antisentido divulgado en la presente y un ácido nucleico objetivo. El mecanismo de hibridación más común implica enlaces de hidrógeno (por ejemplo, enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertidos) entre nucleobases complementarias de las moléculas de ácido nucleico.
La hibridación puede producirse bajo condiciones variables. Las condiciones rigurosas dependen de la secuencia y están determinadas por la naturaleza y composición de las moléculas de ácido nucleico que se van a hibridar.
Los métodos para determinar si una secuencia puede hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo son bien conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente pueden hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo.
Complementariedad
Un compuesto antisentido y un ácido nucleico objetivo son complementarios entre sí cuando un número suficiente de nucleobases del compuesto antisentido puede unirse mediante hidrógeno con las nucleobases correspondientes del ácido nucleico objetivo, de tal manera que se producirá el efecto deseado (por ejemplo, inhibición antisentido de un ácido nucleico objetivo, como un ácido nucleico de PKK).
Pueden tolerarse nucleobases no complementarias entre un compuesto antisentido y un ácido nucleico de PKK siempre que el compuesto antisentido siga siendo capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico objetivo. Además, un compuesto antisentido puede hibridar sobre uno o más segmentos de un ácido nucleico de PKK de tal manera que los segmentos intermedios o adyacentes no estén implicados en el evento de hibridación (por ejemplo, una estructura de giro, malapareamiento o una estructura de horquilla).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o una porción específica de los mismos, son, o son por lo menos, un 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% complementarios con un ácido nucleico de PKK, una región objetivo, segmento objetivo, o una parte especificada del mismo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con un ácido nucleico objetivo puede determinarse usando métodos rutinarios.
Por ejemplo, un compuesto antisentido en el que 18 de 20 nucleobases del compuesto antisentido son complementarias con una región objetivo y, por lo tanto, hibridaría específicamente, representaría un 90 por ciento de complementariedad. En este ejemplo, las nucleobases no complementarias restantes pueden agruparse o intercalarse con nucleobases complementarias y no es necesario que sean contiguas entre sí o con nucleobases complementarias. Como tal, un compuesto antisentido que tiene 18 nucleobases de longitud que tiene cuatro nucleobases no complementarias que están flanqueadas por dos regiones de complementariedad completa con el ácido nucleico objetivo tendría un 77,8% de complementariedad total con el ácido nucleico objetivo. El porcentaje de complementariedad de un compuesto antisentido con una región de un ácido nucleico objetivo puede determinarse rutinariamente usando programas BLAST (herramientas de búsqueda de alineación local básicas) y programas PowerBLAST conocidos en la técnica (Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403410; Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656). El porcentaje de homología, identidad de secuencia o complementariedad puede determinarse, por ejemplo, mediante el programa Gap (Paquete de análisis de secuencia de Wisconsin, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando la configuración predeterminada, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Adv. Appl. Math., 1981,2, 482489).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente, o porciones especificadas de los mismos, son completamente complementarios (es decir, 100% complementarios) con un ácido nucleico objetivo, o una porción especificada del mismo. Por ejemplo, un compuesto antisentido puede ser completamente complementario con un ácido nucleico de precalicreína plasmática, o una región objetivo, o un segmento objetivo o secuencia objetivo del mismo. Como se usa en la presente, "completamente complementario" significa que cada nucleobase de un compuesto antisentido es capaz de emparejamiento de bases preciso con las nucleobases correspondientes de un ácido nucleico objetivo. Por ejemplo, un compuesto de 20 nucleobases antisentido es completamente complementario con una secuencia objetivo que tiene 400 nucleobases de longitud, siempre que haya una porción correspondiente de 20 nucleobases del ácido nucleico objetivo que sea completamente complementaria con el compuesto antisentido. También puede usarse complementariedad completa en referencia a una porción específica del primer y/o segundo ácido nucleico. Por ejemplo, una porción de 20 nucleobases de un compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser "completamente complementaria" con una secuencia objetivo que tiene 400 nucleobases de longitud. La porción de 20 nucleobases del oligonucleótido de 30 nucleobases es completamente complementaria con la secuencia objetivo si la secuencia objetivo tiene una porción de 20 nucleobases correspondiente en la que cada nucleobase es complementaria a la porción de 20 nucleobases del compuesto antisentido. Al mismo tiempo, todo el compuesto antisentido de 30 nucleobases puede ser o no completamente complementario con la secuencia objetivo, dependiendo de si las 10 nucleobases restantes del compuesto antisentido también son complementarias con la secuencia objetivo.
La localización de una nucleobase no complementaria puede estar en el extremo 5' o en el extremo 3' del compuesto antisentido. Alternativamente, la nucleobase o las nucleobases no complementarias pueden estar en una posición interna del compuesto antisentido. Cuando hay dos o más nucleobases no complementarias, pueden ser contiguas (es decir, estar enlazadas) o no contiguas. En una realización, una nucleobase no complementaria está localizada en el segmento de ala de un oligonucleótido antisentido gapmer.
Los compuestos antisentido proporcionados también incluyen aquellos que son complementarios con una porción de un ácido nucleico objetivo. Como se usa en la presente, "porción" se refiere a un número definido de nucleobases contiguas (es decir, enlazadas) dentro de una región o segmento de un ácido nucleico objetivo. Una "porción" también puede referirse a un número definido de nucleobases contiguas de un compuesto antisentido. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 8 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 9 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 10 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 11 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 12 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 13 nucleobase de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 14 nucleobases de un segmento objetivo. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido son complementarios con por lo menos una porción de 15 nucleobases de un segmento objetivo. También se contemplan compuestos antisentido que son complementarios con por lo menos una porción de 9, 10, 11 , 12 , 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleobases de un segmento objetivo, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores.
Identidad
Los compuestos antisentido proporcionados en la presente también pueden tener un porcentaje definido de identidad con una secuencia de nucleótidos particular, SEQ ID NO, o compuesto representado por un número Isis específico, o parte del mismo. Como se usa en la presente, un compuesto antisentido es idéntico a la secuencia divulgada en la presente si tiene la misma capacidad de emparejamiento de nucleobases. Por ejemplo, un ARN que contiene uracilo en lugar de timidina en una secuencia de ADN divulgada se consideraría idéntico a la secuencia de ADN ya que tanto el uracilo como la timidina se emparejan con adenina. También se contemplan versiones acortadas y alargadas de los compuestos antisentido descritos en la presente, así como compuestos que tienen bases no idénticas con respecto a los compuestos antisentido proporcionados en la presente. Las bases no idénticas pueden estar adyacentes entre sí o dispersas por todo el compuesto antisentido. El porcentaje de identidad de un compuesto antisentido se calcula de acuerdo con el número de bases que tienen emparejamiento de bases idéntico con respecto a la secuencia con la que se está comparando.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido, o porciones de los mismos, son por lo menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idénticos a uno o más de los compuestos antisentido o SEQ ID NO, o una porción de los mismos, divulgados en la presente.
En ciertas realizaciones, una porción del compuesto antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo.
En ciertas realizaciones, una porción del oligonucleótido antisentido se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, una porción de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleobases se compara con una porción de igual longitud del ácido nucleico objetivo. Modificaciones
Un nucleósido es una combinación de base-azúcar. La porción de nucleobase (también conocida como base) del nucleósido es normalmente una fracción de base heterocíclica. Los nucleótidos son nucleósidos que incluyen además un grupo fosfato enlazado covalentemente a la porción de azúcar del nucleósido. Para aquellos nucleósidos que incluyen un azúcar de pentofuranosilo, el grupo fosfato puede enlazarse a la fracción hidroxilo 2', 3' o 5' del azúcar. Los oligonucleótidos se forman a través del enlace covalente de nucleósidos adyacentes entre sí, para formar un oligonucleótido polimérico lineal. Dentro de la estructura de oligonucleótidos, se hace referencia a los grupos fosfato comúnmente como formadores de los enlaces internucleosídicos del oligonucleótido.
Las modificaciones de compuestos antisentido abarcan sustituciones o cambios en enlaces internucleosídicos, fracciones de azúcar o nucleobases. Los compuestos antisentido modificados a menudo se prefieren a las formas nativas debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por el ácido nucleico objetivo, estabilidad aumentada en presencia de nucleasas o actividad inhibidora aumentada.
También pueden emplearse nucleósidos químicamente modificados para aumentar la afinidad de unión de un oligonucleótido antisentido acortado o truncado por su ácido nucleico objetivo. En consecuencia, a menudo pueden obtenerse resultados comparables con compuestos antisentido más cortos que tienen tales nucleósidos químicamente modificados.
Enlaces intemucleosídicos modificados
El enlace internucleosídico de origen natural de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3' a 5'. Los compuestos antisentido que tienen uno o más enlaces internucleosídicos modificados, es decir, no naturales, se seleccionan a menudo sobre compuestos antisentido que tienen enlaces internucleosídicos de origen natural debido a propiedades deseables como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad mejorada por los ácidos nucleicos objetivo y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
Los oligonucleótidos que tienen enlaces internucleosídicos modificados incluyen enlaces internucleosídicos que retienen un átomo de fósforo así como enlaces internucleosídicos que no tienen un átomo de fósforo. Los enlaces internucleosídicos que contienen fósforo representativos incluyen, pero no se limitan a, fosfodiésteres, fosfotriésteres, metilfosfonatos, fosforamidato y fosforotioatos. Los métodos de preparación de enlaces que contienen fósforo y que no contienen fósforo son bien conocidos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido dirigidos a un ácido nucleico de precalicreína plasmática comprenden uno o más enlaces internucleosídicos modificados. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos modificados son enlaces de fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico de un compuesto antisentido es un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden enlaces internucleosídicos modificados dispuestos a lo largo del oligonucleótido o región del mismo en un patrón definido o motivo de enlace internucleosídico modificado. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos se disponen en un motivo con huecos. En tales realizaciones, los enlaces internucleosídicos en cada una de las dos regiones de ala son diferentes de los enlaces internucleosídicos en la región de hueco. En ciertas realizaciones, los enlaces internucleosídicos en las alas son de fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos en el hueco son de fosforotioato. El motivo de nucleósido se selecciona independientemente, por lo que tales oligonucleótidos que tienen un motivo de enlace internucleosídico con huecos pueden tener o no un motivo de nucleósidos con huecos y si tiene un motivo de nucleósidos con huecos, las longitudes del ala y del hueco pueden ser iguales o no.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región que tiene un motivo de enlace internucleosídico alterno. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden una región de enlaces internucleosídicos uniformemente modificados. En ciertas de tales realizaciones, el oligonucleótido comprende una región que está uniformemente enlazada por enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido está uniformemente enlazado por fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato. En ciertas realizaciones, cada enlace internucleosídico del oligonucleótido se selecciona de fosfodiéster y fosforotioato y por lo menos un enlace internucleosídico es fosforotioato.
En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 6 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 8 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 10 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido comprende por lo menos un bloque de por lo menos 12 enlaces internucleosídicos de fosforotioato consecutivos. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado en el extremo 3' del oligonucleótido. En ciertas de tales realizaciones, por lo menos uno de tales bloques está localizado dentro de 3 nucleósidos del extremo 3' del oligonucleótido.
En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos comprenden uno o más enlaces de metilfosfonato. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que tienen un motivo de nucleósido gapmer comprenden un motivo de enlace que comprende todos los enlaces de fosforotioato excepto por uno o dos enlaces de metilfosfonato. En ciertas realizaciones, un enlace de metilfosfonato está en el hueco central de un oligonucleótido que tiene un motivo de nucleósido gapmer.
En ciertas realizaciones, es deseable disponer el número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato y enlaces internucleosídicos de fosfodiéster para mantener la resistencia a nucleasas. En ciertas realizaciones, es deseable disponer el número y la posición de los enlaces internucleosídicos de fosforotioato y el número y la posición de los enlaces internucleosídicos de fosfodiéster para mantener la resistencia a las nucleasas. En ciertas realizaciones, el número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato puede reducirse y el número de enlaces internucleosídicos de fosfodiéster puede aumentarse. En ciertas realizaciones, el número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato puede disminuirse y el número de enlaces internucleosídicos de fosfodiéster puede aumentarse a la vez que se mantiene la resistencia a las nucleasas. En ciertas realizaciones, es deseable disminuir el número de enlaces internucleosídicos de fosforotioato a la vez que se conserva la resistencia a las nucleasas. En ciertas realizaciones, es deseable aumentar el número de enlaces internucleosídicos de fosfodiéster a la vez que se conserva la resistencia a las nucleasas.
Fracciones de azúcar modificado
Los compuestos antisentido pueden contener opcionalmente uno o más nucleósidos en donde el grupo de azúcar se ha modificado. Dichos nucleósidos modificados con azúcar pueden impartir estabilidad a nucleasas mejorada, afinidad de unión aumentada o alguna otra propiedad biológica beneficiosa a los compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, los nucleósidos comprenden fracciones de anillo de ribofuranosa modificadas químicamente. Los ejemplos de anillos de ribofuranosa químicamente modificados incluyen, sin limitación, la adición de grupos sustituyentes (incluyendo los grupos sustituyentes 5' y 2', formación de puentes de átomos del anillo no geminal para formar ácidos nucleicos bicíclicos (BNA), la sustitución del átomo de oxígeno del anillo ribosilo por S, N(R) o C(R1)(R2) (R, R1 y R2 son cada uno independientemente H, alquilo C1-C12 o un grupo protector) y combinaciones de los mismos. Ejemplos de azúcares modificados químicamente incluyen nucleósido sustituido con 2'-F-5'-metilo (ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21 de agosto de 2008 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos divulgados) o el reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S con sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5' de un BNA (ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2007/134181 publicada el 22 de noviembre de 2007, en donde el LNA está sustituido con, por ejemplo, un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo).
Los ejemplos de nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden 5'-vinilo, 5'-metilo (R o S), grupos sustituyentes 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 2 '-OCH2CH3, 2'-OCH2CH2F y 2'-O(CH2)2OCH3. El sustituyente en la posición 2' también puede seleccionarse de alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O- alquilo C1-C10, OCF 3, OCH2F, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), y O-CH2-C(=O)-N(Rl)-(CH2)2-N(Rm)(Rn), en donde cada R1, Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido.
Como se usa en la presente, "nucleósidos bicíclicos" se refiere a nucleósidos modificados que comprenden una fracción de azúcar bicíclico. Los ejemplos de nucleósidos bicíclicos incluyen, sin limitación, nucleósidos que comprenden un puente entre los átomos del anillo de ribosilo 4' y 2'. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido proporcionados en la presente incluyen uno o más nucleósidos bicíclicos que comprenden un puente 4' a 2'. Ejemplos de tales nucleósidos bicíclicos con puente 4' a 2' incluyen, pero no se limitan a una de las fórmulas: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' (también denominado etilo restringido o cEt) y 4'-c H(CH2Oc H3)-O-2' (y análogos de los mismos, ver la Patente de Estados Unidos N° 7.399.845, concedida el 15 de julio de 2008); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' (y análogos de los mismos, ver la Solicitud Internacional publicada WO/2009/006478, publicada el 8 de enero de 2009); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (y análogos del mismo, ver la Solicitud Internacional publicada WO/2008/150729, publicada el 11 de diciembre de 2008); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2004-0171570, publicada el 2 de septiembre de 2004); 4'-CH2-N(R)-O-2', en donde R es H, alquilo C1-C12 o un grupo protector (ver la Patente de Estados Unidos N° 7.427.672, concedida el 23 de septiembre de 2008); 4'-CH2-C(H)(c H3)-2' (ver Zhou et al., J. Org. Chem., 2009, 74, 118-134); y 4'-CH2-C(=CH2)-2' (y análogos de los mismos, ver la Solicitud Internacional publicada WO 2008/154401, publicada el 8 de diciembre de 2008).
Informes adicionales relacionados con nucleósidos bicíclicos también pueden encontrarse en la bibliografía publicada (ver por ejemplo: Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invest. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol., 2001,8, 1-7; and Orum et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001,3, 239-243; Patentes de Estados Unidos N° 6,268,490; 6,525,191; 6,670,461; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 7,053,207; 7,399,845; 7,547,684; y 7,696,345; Publicación de Patente de Estados Unidos N° US2008-0039618; US2009-0012281; Patentes de Estados Unidos N° de Serie 61/026,995 y 61/097,787; Solicitudes Internacionales de PCT publciadas WO 1999/014226; WO 2004/106356; WO 2005/021570; WO 2007/134181; WO 2008/15072. Cada uno de los nucleósidos bicíclicos anteriores puede prepararse con una o más configuraciones de azúcar estereoquímicas que incluyen, por ejemplo, a-L-ribofuranosa y p-D-ribofuranosa (ver la solicitud internacional de PCT PCT/DK98/00393, publicada el 25 de marzo de 1999 como WO 99/14226).
En ciertas realizaciones, las fracciones de azúcar bicíclico de nucleósidos de BNA incluyen, pero no se limitan a, compuestos que tienen por lo menos un puente entre la posición 4' y 2' de la fracción de azúcar de pentofuranosilo en donde tales puentes comprenden independientemente 1 o de 2 a 4 grupos enlazados seleccionados independientemente de -[C(Ra)(Rb)]n-, -C(Ra)=C(Rb)-, -C(Ra)=N-, -C(=O)-, -C(=NRa)-, -C(=S)-, -O-, -Si(Ra)2-, -S(=O)x-, y -N(Ra)-; en donde:
x es 0, 1 o 2 ;
n es 1,2, 3 o 4;
cada Ra y Rb es, independientemente, H, un grupo protector, hidroxilo, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, radical heterociclo, radical heterociclo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, radical alicíclico C5-C7, radical alicíclico C5-C7 sustituido, halógeno, OJi, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, CN, sulfonilo (S (= O)2-J1) o sulfoxilo (S (=O)-J1); y
cada J1 y J2 es, independientemente, H, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2 -C12 sustituido, arilo C5-C20, arilo C5-C20 sustituido, acilo (C(=O)-H), acilo sustituido, un radical heterociclo, un radical heterociclo sustituido, aminoalquilo C1-C12, aminoalquilo C1-C12 sustituido o un grupo protector.
En ciertas realizaciones, el puente de una fracción de azúcar bicíclico es -[C(Ra)(Rb)]n-, -[C(Ra)(Rb)]n-O-, -C(RaRb)-N(R)-O- o -C(RaRb)-O-N(R)-. En ciertas realizaciones, el puente es 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(Ch2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R)-2' y 4'-CH2-N(R)-O-2'- en donde cada R es, independientemente, H, un grupo protector o alquilo C1-C12.
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos se definen además por su configuración isomérica. Por ejemplo, un nucleósido que comprende un puente 4'-2' metileno-oxi, puede estar en la configuración a-L o en la configuración p-D. Anteriormente, se han incorporado a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA en oligonucleótidos antisentido que mostraban actividad antisentido (Frieden et al., Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
En ciertas realizaciones, los nucleósidos bicíclicos incluyen, pero no se limitan a, (A) a-L-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (B) p-D-metilenoxi (4'-CH2-O-2') BNA, (C) etilenoxi (4'-(CH2)2-O-2') BNA, (D) aminooxi (4'-CH2-O-N(R)-2') BNA, (E) oxiamino (4'-CH2-N(R)-O-2') BNA y (F) metil(metilenoxi) (4'-CH(CH3)-O-2') BNA, (G) metilen-tio (4'-CH2-S-2') BNA, (H) metilen-amino (4'-CH2-N(R)-2') BNA, (I) metil carbocíclico (4'-CH2-CH(CH3)-2') BNA, (J) propileno carbocíclico (4'-(CH2)3-2') BNA y (K) vinilo BNA como se representa a continuación:
Figure imgf000031_0001
en donde Bx es la fracción de base y R es independientemente H, un grupo protector, alquilo C1-C12 o alcoxi C1-C12. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula I:
Figure imgf000031_0002
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
-Qa-Qb-Qc- es -CH2-N(Rc)-CH2-, -C(=O)-N(Rc)-CH2-, -CH2-O-N(Rc)-, -CH2-N(Rc)-O- or -N(Rc)-O-CH2;
Rc es alquilo C1-C12 o un grupo protector de amino; y
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula II:
Figure imgf000032_0001
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Za es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, amida sustituida, tiol o tio sustituido.
En una realización, cada uno de los grupos sustituidos está, independientemente, mono o poli sustituido con grupos sustituyentes seleccionados independientemente de halógeno, oxo, hidroxilo, OJc, NJcJd, SJc, N3, OC(=X)Jc, y NJeC(=X)NJcJd, en donde cada Jc, Jd y Je es, independientemente, H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido y X es O o NJc.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula III:
Figure imgf000032_0002
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Zb es alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2 -C6 sustituido o acilo sustituido (C(=O)-).
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula IV:
Figure imgf000033_0001
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
Rd es alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido;
cada qa, qb, qc y qd es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido, alcoxilo C1-C6, alcoxilo C1-C6 sustituido, acilo, acilo sustituido, aminoalquilo C1-C6 o aminoalquilo C1-C6 sustituido;
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula V:
Figure imgf000033_0002
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
qa, qb, qe y qf son cada uno, independientemente, hidrógeno, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxi C1-C12, alcoxi C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk;
o qe y qf juntos son =C(qg)(qh);
qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se ha descrito la síntesis y preparación de los monómeros metilenoxi (4'-CH2-O-2')BNA adenina, citosina, guanina, 5-metil-citosina, timina y uracilo, junto con su oligomerización y propiedades de reconocimiento de ácidos nucleicos. (Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). Los BNA y su preparación también se describen en la WO 98/39352 y la WO 99/14226.
También se han preparado análogos de metilenoxi (4'-CH2-O-2')BNA y 2'-tio-BNA (Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). También se ha descrito la preparación de análogos de nucleósidos bloqueados que comprenden dúplex de oligodesoxirribonucleótidos como sustratos para polimerasas de ácido nucleico (Wengel et al., WO 99/14226). Además, se ha descrito en la técnica la síntesis de 2'-amino-BNA, un nuevo análogo de oligonucleótido de alta afinidad restringido conformacionalmente ((Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). Además, se han preparado 2'-amino- y 2'-metilamino-BNA y se ha informado con anterioridad de la estabilidad térmica de sus dúplex con cadenas complementarias de ARN y ADN.
En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos bicíclicos que tienen la Fórmula VI:
Figure imgf000034_0001
en donde:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado, un grupo de fósforo reactivo, una fracción de fósforo o una unión covalente a un medio de soporte;
cada qi, qj, qk y ql es, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12, alquilo C1-C12 sustituido, alquenilo C2-C12, alquenilo C2-C12 sustituido, alquinilo C2-C12, alquinilo C2-C12 sustituido, alcoxilo C1-C12, alcoxilo C1-C12 sustituido, OJj, SJj, SOJj, SO2Jj, NJjJk, N3, CN, C(=O)OJj, C(=O)NJjJk, C(=O)Jj, O-C(=O)NJjJk, N(H)C(=NH)NJjJk, N(H)C(=O)NJjJk o N(H)C(=S)NJjJk; y
qi y qj o ql y qk juntos son =C(qg)(qh), donde qg y qh son cada uno, independientemente, H, halógeno, alquilo C1-C12 o alquilo C1-C12 sustituido.
Se ha descrito un nucleósido carbocíclico bicíclico que tiene un puente 4'-(CH2)3-2' y el puente análogo alquenilo 4'-CH=CH-CH2-2' (Freier et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4429-4443 y Albaek et al., J. Org. Chem., 2006, 71, 7731-7740). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos carbocíclicos bicíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007,129(26), 8362-8379).
Como se usa en la presente, "nucleósido bicíclico 4'-2' " o "nucleósido bicíclico 4' a 2' " se refiere a un nucleósido bicíclico que comprende un anillo de furanosa que comprende un puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de furanosa que conecta el átomo de carbono 2' y el átomo de carbono 4' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "nucleósidos monocíclicos" se refiere a nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar modificado que no son fracciones de azúcar bicíclicas. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar, o el análogo de fracción de azúcar, de un nucleósido puede modificarse o sustituirse en cualquier posición.
Como se usa en la presente, "azúcar 2’ modificado" significa un azúcar de furanosilo modificado en la posición 2'. En ciertas realizaciones, tales modificaciones incluyen sustituyentes seleccionados de: un haluro, que incluye, pero no se limita a, alcoxi sustituido y no sustituido, tioalquilo sustituido y no sustituido, amino alquilo sustituido y no sustituido, alquilo sustituido y no sustituido, alilo sustituido y no sustituido y alquinilo sustituido y no sustituido. En ciertas realizaciones, las modificaciones 2' se seleccionan de sustituyentes que incluyen, pero no se limitan a: O[(CH2)nO]mCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)CH3 , O(CH2)nF, O(CH2)nONH2, OCH2C(=O)N(H)CH3 , y O(CH2)nON[(CH2)nCH3]2, donde n y m son de 1 a aproximadamente 10. Otros grupos 2'-sustituyentes también pueden seleccionarse de: alquilo C1-C12, alquilo sustituido, alquenilo, alquinilo, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo u O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, F, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, sililo sustituido, un grupo de escisión de ARN, un grupo informador, un intercalador, un grupo para mejorar las propiedades farmacocinéticas o un grupo para mejorar las propiedades farmacodinámicas de un compuesto antisentido y otros sustituyentes que tienen propiedades similares. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados comprenden una cadena lateral 2'-MOE (Baker et al., J. Biol. Chem., 1997, 272, 11944-12000). Se ha descrito que dicha sustitución 2'-MOE tiene una afinidad de unión mejorada en comparación con los nucleósidos no modificados y con otros nucleósidos modificados, tales como 2'-O-metilo, O-propilo y O-aminopropilo. También se ha demostrado que los oligonucleótidos que tienen el sustituyente 2'-MOE son inhibidores antisentido de la expresión génica con características prometedoras para uso in vivo (Martin, Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Altmann et al., Chimia, 1996, 50, 168-176; Altmann et al., Biochem. Soc. Trans., 1996, 24, 630-637; y Altmann et al., Nucleosides Nucleotides, 1997, 16, 917-926).
Como se usa en la presente, un "nucleósido de tetrahidropirano modificado" o "nucleósido de THP modificado" significa un nucleósido que tiene un "azúcar" de tetrahidropirano de seis miembros sustituido por el residuo de pentofuranosilo en nucleósidos normales (un sustituto de azúcar). Los nucleósidos de THP modificados incluyen, pero no se limitan a, a lo que se hace referencia en la técnica como ácido nucleico de hexitol (HNA), ácido nucleico de anitol (ANA), ácido nucleico de manitol (MNA) (ver Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-1954) o fluoro HNA (F-HNA) que tiene un sistema de anillo de tetrahidropirano como se ilustra a continuación:
Figure imgf000035_0001
En ciertas realizaciones, se seleccionan sustitutos de azúcar que tienen la Fórmula VII:
Figure imgf000035_0002
en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de tetrahidropirano de Fórmula VII:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
Ta y Tb son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido o uno de Ta y Tb es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano con el compuesto antisentido y el otro de Ta y Tb es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5’ o 3'-terminal; q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno independientemente, H, alquilo C1-C6, alquilo C1-C6 sustituido, alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6 o alquinilo C2-C6 sustituido; y cada uno de R1 y R2 se selecciona de hidrógeno, hidroxilo, halógeno, alcoxi sustituido o no sustituido, NJ1J2, SJ1, N3, OC(=X)J1, OC(=X)NJ1J2, NJ3C(=X)NJJ y CN, donde X es O, S o NJ1 y cada J1, J2 y J3 es, independientemente, H o alquilo C1-C6.
En ciertas realizaciones, se proporcionan los nucleósidos de THP modificados de Fórmula VII en donde q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 son cada uno H. En ciertas realizaciones, por lo menos uno de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es diferente de H. En ciertas realizaciones, por lo menos una de q1, q2, q3, q4, q5, q6 y q7 es metilo. En ciertas realizaciones, se proporcionan nucleósidos de THP de Fórmula VII en los que uno de R1 y R2 es flúor. En ciertas realizaciones, R1 es flúor y R2 es H; R1 es metoxi y R2 es H, y R1 es metoxietoxi y R2 es H.
En ciertas realizaciones, los sustitutos de azúcar comprenden anillos que tienen más de 5 átomos y más de un heteroátomo. Por ejemplo, se ha informado de nucleósidos que comprenden fracciones de azúcar morfolino y su uso en compuestos oligoméricos (ver, por ejemplo: Braasch et al., Biochemistry, 2002, 41,4503-4510; y las Patentes de Estados Unidos N° 5.698.685; 5.166.315; 5.185.444; y 5.034.506). Como se usa en la presente, el término "morfolino" significa un sustituto del azúcar que tiene la siguiente fórmula:
Figure imgf000035_0003
En ciertas realizaciones, los morfolinos pueden modificarse, por ejemplo, añadiendo o alterando varios grupos sustituyentes de la estructura morfolino anterior. A tales sustitutos de azúcar se hace referencia en la presente como "morfolinos modificados".
También se proporcionan combinaciones de modificaciones sin limitación, como nucleósidos sustituidos con 2'-F-5'-metilo (ver la Solicitud Internacional de PCT WO 2008/101157 publicada el 21 de agosto de 2008 para otros nucleósidos 5',2'-bis sustituidos divulgados) y reemplazo del átomo de oxígeno del anillo de ribosilo con S y sustitución adicional en la posición 2' (ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005-0130923, publicada el 16 de junio de 2005) o, alternativamente, la sustitución 5' de un ácido nucleico bicíclico (ver la Solicitud Internacional de pCt WO 2007/134181, publicada el 22 de noviembre de 2007 en donde un nucleósido 4'-CH2-O-2' bicíclico está además sustituido en la posición 5' con un grupo 5'-metilo o 5'-vinilo). También se ha descrito la síntesis y preparación de nucleósidos bicíclicos carbocíclicos junto con su oligomerización y estudios bioquímicos (ver, por ejemplo, Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc. 2007, 129(26), 8362-8379).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos de ciclohexenilo modificados, que es un nucleósido que tiene un ciclohexenilo de seis miembros en lugar del residuo de pentofuranosilo en los nucleósidos de origen natural. Los nucleósidos de ciclohexenilo modificados incluyen, pero no se limitan a los descritos en la técnica (ver, por ejemplo, la Solicitud de PCT publicada WO 2010/036696 de propiedad común, publicada el 10 de abril de 2010, Robeyns et al., J. Am. Chem. Soc., 2008,130(6), 1979-1984; Horváth et al., Tetrahedron Letters, 2007, 48, 3621-3623; Nauwelaerts et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(30), 9340-9348; Gu et al.,, Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2005, 24(5-7), 993-998; Nauwelaerts et al., Nucleic Acids Research, 2005, 33(8), 2452-2463; Robeyns et al., Acta Crystallographica, Section F: Structural Biology and Crystallization Communications, 2005, F61(6), 585-586; Gu et al., Tetrahedron, 2004, 60(9), 2111-2123; Gu et al., Oligonucleotides, 2003, 13(6), 479-489; Wang et al., J. Org. Chem., 2003, 68, 4499-4505; Verbeure et al., Nucleic Acids Research, 2001,29(24), 4941-4947; Wang et al., J. Org. Chem., 2001,66, 8478-82; Wang et al., Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001,20(4-7), 785-788; Wang et al., J. Am. Chem., 2000, 122, 8595-8602; Solicitud de PCT publicada, WO 06/047842; y solicitud de PCT publicada w O 01/049687). Ciertos nucleósidos de ciclohexenilo modificados tienen la fórmula X.
Figure imgf000036_0001
en donde independientemente para cada uno de dichos por lo menos un análogo de nucleósido de ciclohexenilo de Fórmula X:
Bx es una fracción de base heterocíclica;
T3 y T4 son cada uno, independientemente, un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de ciclohexenilo a un compuesto antisentido o uno de T3 y T4 es un grupo de enlace internucleosídico que enlaza el análogo de nucleósido de tetrahidropirano a un compuesto antisentido y el otro de T3 y T4 es H, un grupo protector de hidroxilo, un grupo conjugado enlazado o un grupo 5' o 3'-terminal; y
q1, q2, q3, q4, q5, q6, q7, qs y q9 son cada uno, independientemente, H, alquilo alquenilo C2-C6, alquenilo C2-C6 sustituido, alquinilo C2-C6, alquinilo C2 -C6 sustituido u otro grupo sustituyente de azúcar.
Como se usa en la presente, "2'-modificado" o "2'-sustituido" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un sustituyente en la posición 2' distinto de H u OH. Los nucleósidos 2’-modificados incluyen, pero no se limitan a, nucleósidos bicíclicos en los que el puente que conecta dos átomos de carbono del anillo de azúcar conecta el carbono 2' y otro carbono del anillo de azúcar; y nucleósidos con sustituyentes 2' que no forman puentes, como alilo, amino, azido, tio, O-alilo, O- alquilo C1-C10, -OCF3, O-(CH2)2-O-CH3, 2'-O(CH2)2SCH3, O-(CH2)2-O-N (Rm)(Rn), o O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn), donde cada Rm y Rn es, independientemente, H o alquilo C1-C10 sustituido o no sustituido. Los nucleósidos 2’-modificados pueden comprender además otras modificaciones, por ejemplo en otras posiciones del azúcar y/o en la nucleobase.
Como se usa en la presente, "2'-F" se refiere a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo fluoro en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "2'-OMe" o "2'-OCH3" o "2'-O-metilo" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "MOE" o "2'-MOE" o "2'-OCH2CH2OCH3" o "2'-O-metoxietilo" se refieren cada uno a un nucleósido que comprende un azúcar que comprende un grupo -OCH2CH2OCH3 en la posición 2' del anillo de azúcar.
Como se usa en la presente, "oligonucleótido" se refiere a un compuesto que comprende una pluralidad de nucleósidos enlazados. En ciertas realizaciones, uno o más de la pluralidad de nucleósidos está modificado. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido comprende uno o más ribonucleósidos (ARN) y/o desoxirribonucleósidos (ADN).
También se conocen en la técnica muchos otros sistemas de anillos sustitutos de azúcar biciclo y triciclo que pueden usarse para modificar nucleósidos para su incorporación en compuestos antisentido (ver, por ejemplo, artículo de revisión: Leumann, Bioorg. Med. Chem., 2002, 10, 841-1954). Tales sistemas de anillos pueden experimentar varias sustituciones adicionales para mejorar la actividad.
Los métodos para la preparación de azúcares modificados son bien conocidos por los expertos en la técnica. Algunas Patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de tales azúcares modificados incluyen, sin limitación, U.S.: 4.981.957; 5.118.800; 5.319.080; 5.359.044; 5.393.878; 5.446.137; 5.466.786; 5.514.785; 5.519.134; 5.567.811; 5.576.427; 5.591.722; 5.597.909; 5.610.300; 5.627.053; 5.639.873; 5.646.265; 5.670.633; 5.700.920; 5.792.847 y 6.600.032 y la Solicitud Internacional PCT/US2005/019219, presentada el 2 de junio de 2005 y publicada como WO 2005/121371 el 22 de diciembre de 2005.
En nucleótidos que tienen fracciones de azúcar modificados, las fracciones de nucleobases (naturales, modificadas o una combinación de los mismos) se mantienen para la hibridación con un objetivo de ácido nucleico apropiado.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido comprenden uno o más nucleósidos que tienen fracciones de azúcar modificado. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es 2'-MOE. En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados con 2'-MOE están dispuestos en un motivo gapmer. En ciertas realizaciones, la fracción de azúcar modificado es un nucleósido bicíclico que tiene un grupo puente (4'-CH(CH3)-O-2'). En ciertas realizaciones, los nucleósidos modificados (4'-CH(CH3)-O-2') están dispuestos a lo largo de las alas de un motivo gapmer.
Compuestos antisentido conjugados
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados que comprenden un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido complementario a un transcrito de ácido nucleico. En ciertas realizaciones, la presente divulgación describe métodos que comprenden poner en contacto una célula con un compuesto antisentido conjugado que comprende un oligonucleótido antisentido y reducir la cantidad o actividad de un transcrito de ácido nucleico en una célula.
El receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) se ha descrito con anterioridad. Ver, por ejemplo, Park et al., PNAS vol. 102, N° 47, págs. 17125-17129 (2005). Tales receptores se expresan en células hepáticas, particularmente hepatocitos. Además, se ha demostrado que los compuestos que comprenden agrupaciones de tres ligandos de N-acetilgalactosamina (GalNAc) son capaces de unirse al ASGP-R, dando como resultado la captación del compuesto en la célula. Ver, por ejemplo, Khorev et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry, 16, 9, págs. 5216­ 5231 (mayo de 2008). Por consiguiente, se han usado conjugados que comprenden tales agrupaciones de GalNAc para facilitar la captación de ciertos compuestos en células hepáticas, específicamente los hepatocitos. Por ejemplo, se ha demostrado que ciertos conjugados que contienen GalNAc aumentan la actividad de los compuestos de ARNip dúplex en células hepáticas in vivo. En tales casos, el conjugado que contiene GalNAc se une típicamente a la cadena de sentido del dúplex de ARNip. Como la cadena de sentido se descarta antes de que la cadena antisentido hibride finalmente con el ácido nucleico objetivo, hay poca preocupación de que el conjugado interfiera con la actividad. Típicamente, el conjugado se une al extremo 3' de la cadena de sentido del ARNip. Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 8.106.022. Ciertos grupos conjugados descritos en la presente son más activos y/o más fáciles de sintetizar que los grupos conjugados descritos anteriormente.
En ciertas realizaciones, los conjugados se unen a compuestos antisentido de cadena sencilla, incluyendo, pero no limitados a, compuestos antisentido basados en RNasa H y compuestos antisentido que alteran el corte y empalme de un ácido nucleico objetivo pre-ARNm. En tales realizaciones, el conjugado debe permanecer unido al compuesto antisentido el tiempo suficiente para proporcionar un beneficio (captación mejorada en las células) pero luego debe o escindirse o no interferir de otro modo con los pasos subsiguientes necesarios para la actividad, como la hibridación con un ácido nucleico objetivo y la interacción con RNasa H o enzimas asociadas con el corte y empalme o modulación del corte y empalme. Este equilibrio de propiedades es más importante en el establecimiento de compuestos antisentido de cadena sencilla que en compuestos de ARNip, donde el conjugado puede simplemente unirse a la cadena de sentido. En la presente se divulgaen compuestos antisentido de cadena sencilla conjugados que tienen una potencia mejorada en células hepáticas in vivo en comparación con el mismo compuesto antisentido que carece del conjugado. Dado el equilibrio requerido de propiedades para estos compuestos, tal potencia mejorada es sorprendente.
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados de la presente comprenden una fracción escindible. Como se ha indicado, sin querer estar limitado a ningún mecanismo, es lógico que el conjugado permanezca en el compuesto el tiempo suficiente para proporcionar una mejora en la captación, pero después de eso, es deseable que una parte o, idealmente, todo el conjugado se escinda, liberando el compuesto original (por ejemplo, compuesto antisentido) en su forma más activa. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es un nucleósido escindible. Tales realizaciones aprovechan las nucleasas endógenas en la célula uniendo el resto del conjugado (la agrupación) al oligonucleótido antisentido a través de un nucleósido mediante uno o más enlaces escindibles, como los de un enlace de fosfodiéster. En ciertas realizaciones, la agrupación se une al nucleósido escindible a través de un enlace de fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el nucleósido escindible se une al oligonucleótido antisentido (compuesto antisentido) mediante un enlace de fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado puede comprender dos o tres nucleósidos escindibles. En tales realizaciones, tales nucleósidos escindibles se enlazan entre sí, con el compuesto antisentido y/o con el grupo mediante enlaces escindibles (como los de un enlace de fosfodiéster). Ciertos conjugados de la presente no comprenden un nucleósido escindible y en su lugar comprenden un enlace escindible. Se muestra que esa escisión suficiente del conjugado del oligonucleótido es proporcionada por al menos un enlace que es vulnerable a la escisión en la célula (un enlace escindible).
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados son profármacos. Estos profármacos se administran a un animal y se metabolizan en última instancia a una forma más activa. Por ejemplo, los compuestos antisentido conjugados se escinden para eliminar todo o parte del conjugado dando como resultado la forma activa (o más activa) del compuesto antisentido que carece de todo o parte del conjugado.
En ciertas realizaciones, los conjugados se unen al extremo 5' de un oligonucleótido. Ciertos de tales conjugados 5' se escinden de manera más eficaz que sus contrapartidas que tienen un grupo conjugado similar unido en el extremo 3'. En ciertas realizaciones, la actividad mejorada puede correlacionarse con una escisión mejorada. En ciertas realizaciones, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 5' tienen mayor eficacia que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado en el extremo 3' (ver, por ejemplo, los Ejemplos 56, 81,83 y 84). Además, la unión 5' permite una síntesis de oligonucleótidos más simple. Típicamente, los oligonucleótidos se sintetizan sobre un soporte sólido en la dirección 3' a 5'. Para elaborar un oligonucleótido 3’ conjugado, típicamente se une un nucleósido 3' preconjugado al soporte sólido y luego se construye el oligonucleótido como de costumbre. Sin embargo, la unión de ese nucleósido conjugado al soporte sólido complica la síntesis. Además, usando ese enfoque, el conjugado está presente a lo largo de la síntesis del oligonucleótido y puede degradarse durante los pasos posteriores o puede limitar los tipos de reacciones y reactivos que pueden usarse. Usando las estructuras y técnicas descritas en la presente para oligonucleótidos 5’ conjugados, puede sintetizarse el oligonucleótido usando técnicas automatizadas estándar e introducir el conjugado con el nucleósido final (el más 5') o después de que el oligonucleótido se haya escindido del soporte sólido.
En vista de la técnica y la presente divulgación, un experto en la técnica puede elaborar fácilmente cualquiera de los conjugados y oligonucleótidos conjugados de la presente. Además, la síntesis de determinados de tales conjugados y oligonucleótidos conjugados divulgados en la presente es más fácil y/o requiere pocos pasos y, por lo tanto, es menos costosa que la de los conjugados divulgados con anterioridad, proporcionando ventajas en la fabricación. Por ejemplo, la síntesis de ciertos grupos conjugados consiste de menos pasos sintéticos, lo que da como resultado un mayor rendimiento, con respecto a los grupos conjugados descritos anteriormente. Los grupos conjugados como GalNAc3-10 en el Ejemplo 46 y GalNAc3-7 en el Ejemplo 48 son mucho más simples que los conjugados descritos anteriormente como los descritos en la Patente de Estados Unidos 8.106.022 o la Patente de Estados Unidos 7.262.177 que requieren ensamblaje de más productos químicos intermedios. Por consiguiente, estos y otros conjugados descritos en la presente tienen ventajas sobre los compuestos descritos anteriormente para su uso con cualquier oligonucleótidos, incluyendo oligonucleótidos de cadena sencilla y y cualquier cadena de oligonucleótidos de cadena doble (por ejemplo, ARNip).
De manera similar, en la presente se divulgan grupos conjugados que tienen solo uno o dos ligandos de GalNAc. Como se muestra, tales grupos conjugados mejoran la actividad de los compuestos antisentido. Tales compuestos son mucho más fáciles de preparar que los conjugados que comprenden tres ligandos de GalNAc. Los grupos conjugados que comprenden uno o dos ligandos de GalNAc pueden unirse a cualquier compuesto antisentido, incluyendo oligonucleótidos de cadena sencilla y cualquier cadena de oligonucleótidos de cadena doble (por ejemplo, ARNip).
En ciertas realizaciones, los conjugados de la presente no alteran sustancialmente ciertas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en la presente se muestra que los compuestos antisentido conjugados no son más inmunogénicos que los compuestos originales no conjugados. Como se mejora la potencia, las realizaciones en las que la tolerabilidad permanece igual (o incluso si la tolerabilidad empeora sólo ligeramente en comparación con las ganancias en potencia) tienen propiedades mejoradas para terapia.
En ciertas realizaciones, la conjugación permite alterar compuestos antisentido de formas que tienen consecuencias menos atractivas en ausencia de conjugación. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, reemplazar uno o más enlaces de fosforotioato de un compuesto antisentido totalmente de fosforotioato por enlaces fosfodiéster da como resultado una mejora en algunas medidas de tolerabilidad. Por ejemplo, en ciertos casos, tales compuestos antisentido que tienen uno o más fosfodiéster son menos inmunogénicos que el mismo compuesto en el que cada enlace es un fosforotioato. Sin embargo, en ciertos casos, como se muestra en el Ejemplo 26, ese mismo reemplazo de uno o más enlaces de fosforotioato con enlaces de fosfodiéster también da como resultado una captación celular reducida y/o pérdida de potencia. En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados descritos en la presente toleran tal cambio en los enlaces con poca o ninguna pérdida de captación y potencia en comparación con la contrapartida de fosforotioato completo conjugado. De hecho, en ciertas realizaciones, por ejemplo, en los Ejemplos 44, 57, 59 y 86, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado y por lo menos un enlace internucleosídico fosfodiéster muestran realmente una potencia aumentada in vivo incluso con respecto a una contrapartida completa de fosforotioato que también comprende el mismo conjugado. Además, como la conjugación da como resultado aumentos sustanciales en la captación/potencia, una pequeña pérdida de esa ganancia sustancial puede ser aceptable para lograr una tolerabilidad mejorada. Por consiguiente, en ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden por lo menos un enlace de fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, la conjugación de los compuestos antisentido de la presente invención da como resultado un aumento de la administración, captación y actividad en los hepatocitos. Por tanto, se administra más compuesto al tejido hepático. Sin embargo, en ciertas realizaciones, esa liberación aumentada por sí sola no explica el aumento total de la actividad. En ciertas de tales realizaciones, entra más compuesto en los hepatocitos. En ciertas realizaciones, incluso esa captación de hepatocitos aumentada no explica todo el aumento de actividad. En tales realizaciones, aumenta la captación productiva del compuesto conjugado. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 102, ciertas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc aumentan el enriquecimiento de oligonucleótidos antisentido en hepatocitos frente a células no parenquimatosas. Este enriquecimiento es beneficioso para los oligonucleótidos que se dirigen a genes que se expresan en hepatocitos.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados de la presente invención dan como resultado una exposición renal reducida. Por ejemplo, como se muestra en el Ejemplo 20, las concentraciones de oligonucleótidos antisentido que comprenden ciertas realizaciones de conjugados que contienen GalNAc son menores en el riñón que las de los oligonucleótidos antisentido que carecen de un conjugado que contiene GalNAc. Esto tiene varias implicaciones terapéuticas beneficiosas. Para indicaciones terapéuticas en las que no se busca actividad renal, la exposición al riñón conlleva el riesgo de toxicidad renal sin el beneficio correspondiente. Además, una alta concentración en el riñón generalmente da como resultado la pérdida de compuesto en la orina, lo que da como resultado una depuración más rápida. Por consiguiente, para los objetivos no renales, no se desea acumulación renal.
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona compuestos antisentido conjugados representados por la fórmula:
A --------B-------- C-------- D-----[— E------Fj
' q
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es la fracción escindible
C es el conector conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En el diagrama anterior y en diagramas similares de la presente, el grupo de ramificación "D" se ramifica tantas veces como sea necesario para acomodar el número de grupos (E-F) como se indica por "q". Por tanto, cuando q = 1, la fórmula es:
A-B-C-D-E-F
cuando q = 2, la fórmula es:
Figure imgf000040_0001
cuando q = 3, la fórmula es:
Figure imgf000040_0002
cuando q = 4, la fórmula es:
Figure imgf000040_0003
cuando q = 5, la fórmula es:
Figure imgf000040_0004
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
Figure imgf000041_0001
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
Fracción de direccionamiento celular
Figure imgf000041_0002
NHAc Grupo de ramificación
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
Figure imgf000042_0001
NHAc Grupo de ramificación
En ciertas realizaciones, se proporcionan compuestos antisentido conjugados que tienen la estructura:
ASO
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000042_0003
Fracción de direccionamiento celular
En realizaciones que tienen más de una variable particular (por ejemplo, más de una "m" o "n"), a menos que se indique lo contrario, cada una de dichas variables particulares se selecciona independientemente. Por tanto, para una estructura que tiene más de una n, cada n se selecciona independientemente, por lo que pueden ser o no iguales entre sí.
i. Ciertas fracciones escindibles (CM)
En ciertas realizaciones, una fracción escindible es un enlace escindible. En ciertas realizaciones, una fracción escindible comprende un enlace escindible. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado comprende una fracción escindible. En ciertas de tales realizaciones, la fracción escindible se une al oligonucleótido antisentido. En ciertas de tales realizaciones, la fracción escindible se une directamente a la fracción de direccionamiento celular. En ciertas de tales realizaciones, la fracción escindible se une al conector conjugado. En ciertas realizaciones, la fracción escindible comprende un fosfato o fosfodiéster. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es un nucleósido o análogo de nucleósido escindible. En ciertas realizaciones, el nucleósido o análogo de nucleósido comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada de una purina, purina sustituida, pirimidina o pirimidina sustituida. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es un nucleósido que comprende una base heterocíclica opcionalmente protegida seleccionada entre uracilo, timina, citosina, 4-N-benzoilcitosina, 5-metilcitosina, 4-N-benzoil-5-metilcitosina, adenina, 6-N- benzoiladenina, guanina y 2-N-isobutirilguanina. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es 2'-desoxi nucleósido que está unido a la posición 3' del oligonucleótido antisentido mediante un enlace de fosfodiéster y está unido al conector mediante un enlace de fosfodiéster o fosforotioato. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es 2'-desoxi adenosina que se une a la posición 3' del oligonucleótido antisentido mediante un enlace de fosfodiéster y se une al conector mediante un enlace de fosfodiéster o fosforotioato. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es 2'-desoxi adenosina que se une a la posición 3' del oligonucleótido antisentido mediante un enlace de fosfodiéster y se une al conector mediante un enlace de fosfodiéster.
En ciertas realizaciones, la fracción escindible se une a la posición 3' del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, la fracción escindible se une a la posición 5' del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, la fracción escindible se une a una posición 2' del oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, la fracción escindible se une al oligonucleótido antisentido mediante un enlace de fosfodiéster. En ciertas realizaciones, la fracción escindible se une al conector mediante un enlace de fosfodiéster o fosforotioato. En ciertas realizaciones, la fracción escindible se une al conector mediante un enlace de fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado no incluye una fracción escindible.
En ciertas realizaciones, la fracción escindible se escinde después de que se haya administrado el complejo a un animal solo después de ser internalizado por una célula objetivo. Dentro de la célula, la fracción escindible se escinde, liberando de este modo el oligonucleótido antisentido activo. Sin querer estar limitado a ninguna teoría, se cree que la fracción escindible es escindida por una o más nucleasas dentro de la célula. En ciertas realizaciones, la una o más nucleasas escinden el enlace de fosfodiéster entre la fracción escindible y el conector. En ciertas realizaciones, la fracción escindible tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:
Figure imgf000043_0001
en donde cada uno de Bx, Bx1, Bx2 y Bx3 es independientemente una fracción de base heterocíclica. En ciertas realizaciones, la fracción escindible tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:
Figure imgf000044_0001
ii. Ciertos conectores
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden un conector. En ciertas de tales realizaciones, el conector se une covalentemente a la fracción escindible. En ciertas de tales realizaciones, el conector se une covalentemente al oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el conector se une covalentemente a una fracción de direccionamiento celular. En ciertas realizaciones, el conector comprende además una unión covalente a un soporte sólido. En ciertas realizaciones, el conector comprende además una unión covalente a una fracción de unión a proteína. En ciertas realizaciones, el conector comprende además una unión covalente a un soporte sólido y comprende además una unión covalente a una fracción de unión a proteína. En ciertas realizaciones, el conector incluye múltiples posiciones para la unión de ligandos anclados. En ciertas realizaciones, el conector incluye múltiples posiciones para la unión de ligandos anclados y no está unido a un grupo de ramificación. En ciertas realizaciones, el conector comprende además uno o más enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado no incluye un conector.
En ciertas realizaciones, el conector incluye por lo menos un grupo lineal que comprende grupos seleccionados de grupos alquilo, amida, disulfuro, polietilenglicol, éter, tioéter (-S-) e hidroxilamino (-O-N(H)-). En ciertas realizaciones, el grupo lineal comprende grupos seleccionados de grupos alquilo, amida y éter. En ciertas realizaciones, el grupo lineal comprende grupos seleccionados de grupos alquilo y éter. En ciertas realizaciones, el grupo lineal comprende por lo menos un grupo de enlace de fósforo. En ciertas realizaciones, el grupo lineal comprende por lo menos un grupo fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el grupo lineal incluye por lo menos un grupo de enlace neutro. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente a la fracción de direccionamiento celular y a la fracción escindible. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente a la fracción de direccionamiento celular y al oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente a la fracción de direccionamiento celular, la fracción escindible y un soporte sólido. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente a la fracción de direccionamiento celular, la fracción escindible, un soporte sólido y una fracción de unión a proteínas. En ciertas realizaciones, el grupo lineal incluye uno o más enlaces escindibles.
En ciertas realizaciones, el conector incluye el grupo lineal unido covalentemente a un grupo de andamiaje. En ciertas realizaciones, el andamiaje incluye un grupo alifático ramificado que comprende grupos seleccionados de grupos alquilo, amida, disulfuro, polietilenglicol, éter, tioéter e hidroxilamino. En ciertas realizaciones, el andamiaje incluye un grupo alifático ramificado que comprende grupos seleccionados de grupos alquilo, amida y éter. En ciertas realizaciones, el andamiaje incluye por lo menos un sistema de anillo mono o policíclico. En ciertas realizaciones, el andamiaje incluye por lo menos dos sistemas de anillos mono o policíclicos. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente al grupo de andamiaje y el grupo de andamiaje está unido covalentemente a la fracción escindible y al conector. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente al grupo de andamiaje y el grupo de andamiaje está unido covalentemente a la fracción escindible, el conector y un soporte sólido. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente al grupo de andamiaje y el grupo de andamiaje está unido covalentemente a la fracción escindible, el conector y una fracción de unión a proteínas. En ciertas realizaciones, el grupo lineal está unido covalentemente al grupo de andamiaje y el grupo de andamiaje está unido covalentemente a la fracción escindible, el conector, una fracción de unión a proteínas y un soporte sólido. En ciertas realizaciones, el grupo de andamiaje incluye uno o más enlaces escindibles.
En ciertas realizaciones, el conector incluye una fracción de unión a proteínas. En ciertas realizaciones, la fracción de unión a proteínas es un lípido que incluye por ejemplo, pero no está limitado a, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina), una vitamina (por ejemplo, folato, vitamina A, vitamina E, biotina, piridoxal), un péptido, un carbohidrato (por ejemplo, monosacárido, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido, polisacárido), un componente endosomolítico, un esteroide (por ejemplo, uvaol, hecigenina, diosgenina), un terpeno (por ejemplo, triterpeno, por ejemplo, sarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivatizado con epifriedelanol) o un lípido catiónico. En ciertas realizaciones, la fracción de unión a proteínas es un ácido graso saturado o insaturado de cadena larga C16 a C22, colesterol, ácido cólico, vitamina E, adamantano o 1-pentafluoropropilo.
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000045_0001
en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20; y p es de 1 a 6.
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000046_0001
en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20.
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000047_0001
en donde n es de 1 a 20.
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000047_0002
Figure imgf000048_0001
en donde cada L es, independientemente, un grupo de enlace de fósforo o un grupo de enlace neutro; y cada n es, independientemente, de 1 a 20.
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000048_0002
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0002
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000051_0002
y
Figure imgf000052_0001
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000052_0002
en donde n es de 1 a 20.
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000052_0003
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000052_0004
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000052_0005
En ciertas realizaciones, el conector conjugado tiene la estructura:
Figure imgf000052_0006
En ciertas realizaciones, el conector conjugado tiene la estructura:
Figure imgf000052_0007
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000052_0008
En ciertas realizaciones, un conector tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000053_0001
en donde cada n es independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7.
iii. Ciertas fracciones de direccionamiento celular
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden fracciones de direccionamiento celular. Ciertas fracciones de direccionamiento celular aumentan la captación celular de compuestos antisentido. En ciertas realizaciones, las fracciones de direccionamiento celular comprenden un grupo de ramificación, uno o más anclajes y uno o más ligandos. En ciertas realizaciones, las fracciones de direccionamiento celular comprenden un grupo de ramificación, uno o más anclajes, uno o más ligandos y uno o más enlaces escindibles.
1. Ciertos grupos de ramificación
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden una fracción de direccionamiento que comprende un grupo de ramificación y por lo menos dos ligandos anclados. En ciertas realizaciones, el grupo de ramificación se une al conector conjugado. En ciertas realizaciones, el grupo de ramificación une la fracción escindible. En ciertas realizaciones, el grupo de ramificación une el oligonucleótido antisentido. En ciertas realizaciones, el grupo de ramificación se une covalentemente al conector y a cada uno de los ligandos anclados. En ciertas realizaciones, el grupo de ramificación comprende un grupo alifático ramificado que comprende grupos seleccionados de grupos alquilo, amida, disulfuro, polietilenglicol, éter, tioéter e hidroxilamino. En ciertas realizaciones, el grupo de ramificación comprende grupos seleccionados entre grupos alquilo, amida y éter. En ciertas realizaciones, el grupo de ramificación comprende grupos seleccionados de grupos alquilo y éter. En ciertas realizaciones, el grupo de ramificación comprende un sistema de anillo mono o policíclico. En ciertas realizaciones, el grupo de ramificación comprende uno o más enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, el grupo conjugado no incluye un grupo de ramificación.
En ciertas realizaciones, un grupo de ramificación tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000053_0002
Figure imgf000054_0001
en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20;
j es de 1 a 3; y
m es de 2 a 6.
En ciertas realizaciones, un grupo de ramificación tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000054_0002
Figure imgf000055_0001
en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20; y
m es de 2 a 6.
En ciertas realizaciones, un grupo de ramificación tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000055_0002
Figure imgf000056_0001
En ciertas realizaciones, un grupo de ramificación tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000056_0002
en donde cada A1 es independientemente, O, S, C=O o NH; y
cada n es, independientemente, de 1 a 20.
En ciertas realizaciones, un grupo de ramificación tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000056_0003
en donde cada A1 es independientemente, O, S, C=O o NH; y
cada n es, independientemente, de 1 a 20.
En ciertas realizaciones, un grupo de ramificación tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000057_0001
en donde Ai es O, S, C=O o NH; y
cada n es, independientemente, de 1 a 20.
En ciertas realizaciones, un grupo de ramificación tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000057_0002
En ciertas realizaciones, un grupo de ramificación tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000057_0003
En ciertas realizaciones, un grupo de ramificación tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000057_0004
2. Ciertos anclajes
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden uno o más anclajes unidos covalentemente al grupo de ramificación. En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden uno o más anclajes unidos covalentemente al grupo de enlace. En ciertas realizaciones, cada anclaje es un grupo alifático lineal que comprende uno o más grupos seleccionados de grupos alquilo, éter, tioéter, disulfuro, amida y polietilenglicol en cualquier combinación. En ciertas realizaciones, cada anclaje es un grupo alifático lineal que comprende uno o más grupos seleccionados de grupos alquilo, alquilo sustituido, éter, tioéter, disulfuro, amida, fosfodiéster y polietilenglicol en cualquier combinación. En ciertas realizaciones, cada anclaje es un grupo alifático lineal que comprende uno o más grupos seleccionados de grupos alquilo, éter y amida en cualquier combinación. En ciertas realizaciones, cada anclaje es un grupo alifático lineal que comprende uno o más grupos seleccionados de grupos alquilo, alquilo sustituido, fosfodiéster, éter y amida en cualquier combinación. En ciertas realizaciones, cada anclaje es un grupo alifático lineal que comprende uno o más grupos seleccionados de alquilo y fosfodiéster en cualquier combinación. En ciertas realizaciones, cada anclaje comprende por lo menos un grupo de enlace de fósforo o un grupo de enlace neutro.
En ciertas realizaciones, el anclaje incluye uno o más enlaces escindibles. En ciertas realizaciones, el anclaje se une al grupo de ramificación a través de una amida o un grupo éter. En ciertas realizaciones, el anclaje se une al grupo de ramificación a través de un grupo fosfodiéster. En ciertas realizaciones, el anclaje se une al grupo de ramificación a través de un grupo de enlace de fósforo o un grupo de enlace neutro. En ciertas realizaciones, el anclaje se une al grupo de ramificación a través de un grupo éter. En ciertas realizaciones, el anclaje se une al ligando a través de una amida o un grupo éter. En ciertas realizaciones, el anclaje se une al ligando a través de un grupo éter. En ciertas realizaciones, el anclaje se une al ligando a través de una amida o un grupo éter. En ciertas realizaciones, el anclaje se une al ligando a través de un grupo éter.
En ciertas realizaciones, cada anclaje comprende de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 átomos de longitud de cadena entre el ligando y el grupo de ramificación. En ciertas realizaciones, cada grupo de anclaje comprende de aproximadamente 10 a aproximadamente 18 átomos de longitud de cadena entre el ligando y el grupo de ramificación. En ciertas realizaciones, cada grupo de anclaje comprende aproximadamente 13 átomos de longitud de cadena.
En ciertas realizaciones, un anclaje tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000058_0001
en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20; y
cada p es de 1 a aproximadamente 6.
En ciertas realizaciones, un anclaje tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000058_0002
En ciertas realizaciones, un anclaje tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000058_0003
en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20.
En ciertas realizaciones, un anclaje tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000058_0004
en donde L es o un grupo de enlace de fósforo o un grupo de enlace neutro;
Z1 es C(=O)O-R2;
Z2 es H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido;
R2 es H, alquilo C1-C6 o alquilo C1-C6 sustituido; y
cada m1 es, independientemente, de 0 a 20 en donde por lo menos un m1 es mayor que 0 para cada anclaje.
En ciertas realizaciones, un anclaje tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000059_0001
En ciertas realizaciones, un anclaje tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000059_0002
en donde Z2 es H o CH3; y
cada m1 es, independientemente, de 0 a 20 en donde por lo menos un mu es mayor que 0 para cada anclaje.
En ciertas realizaciones, un anclaje tiene una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000059_0003
en donde cada n es independientemente 0, 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7.
En ciertas realizaciones, un anclaje comprende un grupo de enlace de fósforo. En ciertas realizaciones, un anclaje no comprende ningún enlace amida. En ciertas realizaciones, un anclaje comprende un grupo de enlace de fósforo y no comprende ningún enlace amida.
3. Ciertos ligandos
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona ligandos en donde cada ligando está unido covalentemente a un anclaje. En ciertas realizaciones, cada ligando se selecciona para que tenga afinidad por al menos un tipo de receptor en una célula objetivo. En ciertas realizaciones, se seleccionan ligandos que tienen afinidad para por lo menos un tipo de receptor en la superficie de una célula de hígado de mamífero. En ciertas realizaciones, se seleccionan ligandos que tienen afinidad por el receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGP-R). En ciertas realizaciones, cada ligando es un carbohidrato. En ciertas realizaciones, cada ligando se selecciona independientemente de galactosa, N-acetilgalactoseamina, manosa, glucosa, glucosamona y fucosa. En ciertas realizaciones, cada ligando es N-acetilgalactoseamina (GalNAc). En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento comprende de 2 a 6 ligandos. En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento comprende 3 ligandos. En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento comprende 3 ligandos de N-acetilgalactoseamina.
En ciertas realizaciones, el ligando es un carbohidrato, derivado de carbohidrato, carbohidrato modificado, agrupación de carbohidratos multivalentes, polisacárido, polisacárido modificado o derivado de polisacárido. En ciertas realizaciones, el ligando es un amino azúcar o un tio azúcar. Por ejemplo, los amino azúcares pueden seleccionarse de cualquier número de compuestos conocidos en la técnica, por ejemplo glucosamina, ácido siálico, a-D-galactosamina, N-acetilgalactosamina, 2-acetamido-2-desoxi-D-galactopiranosa (GalNAc), 2-Amino-3-O-[(R)-1-carboxietil]-2-desoxi-p-D-glucopiranosa (ácido p-murámico), 2-desoxi-2-metilamino-L-glucopiranosa, 4,6-Didesoxi-4-formamido-2,3-di-O-metil-D-manopiranosa, 2-desoxi-2-sulfoamino-D-glucopiranosa y N-sulfo-D-glucosamina, y ácido N-glicoloil-a-neuramínico. Por ejemplo, los tio azúcares pueden seleccionarse del grupo que consisten de 5-Tio-p-D-glucopiranosa, Metil 2,3,4-tri-0-acetil-1-tiio-6-0-tritil-a-D-glucopiranosida, 4-Tio-p-D-galactopiranosa, y etil 3,4,6,7-tetra-0-aceiyl-2-desoxi-1,5-ditio-a-D-g/uco-heptopiranosida.
En ciertas realizaciones, "GalNac" o "Gal-NAc" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, comúnmente denominada en la literatura como N-acetil galactosamina. En ciertas realizaciones, "N-acetil galactosamina" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa. En ciertas realizaciones, "GalNac" o "Gal-NAc" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa. En ciertas realizaciones, "GalNac" o "Gal-NAc" se refiere a 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, que incluye tanto la forma p: 2-(acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa. En ciertas realizaciones, pueden usarse indistintamente tanto la forma p: 2-(acetilamino)-2-desoxi-p-D-galactopiranosa como la forma a: 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa. Por consiguiente, en estructuras en las que se representa una forma, se pretende que estas estructuras incluyan también la otra forma. Por ejemplo, cuando se muestra la estructura de una forma a: 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa, también se pretende que esta estructura también incluya la otra forma. En ciertas realizaciones preferidas, la forma p 2-(acetilamino)-2-desoxi-D-galactopiranosa es la realización preferida.
Figure imgf000060_0001
En ciertas realizaciones, uno o más ligandos tienen una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000060_0002
en donde cada R1 se selecciona entre OH y NHCOOH.
En ciertas realizaciones, uno o más ligandos tienen una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000061_0002
En ciertas realizaciones, uno o más ligandos tienen una estructura seleccionada entre:
HOOH
N
HO^V'-'V'^ V
NHAc ^ -En ciertas realizaciones, uno o más ligandos tienen una estructura seleccionada entre:
Figure imgf000061_0001
i. Ciertos conjugados
En ciertas realizaciones, los grupos conjugados comprenden las características estructurales anteriores. En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000062_0001
en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20.
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000062_0002
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000062_0003
en donde cada n es, independientemente, de 1 a 20;
Z es H o un soporte sólido enlazado;
Q es un compuesto antisentido;
X es O o S; y
Bx es una fracción de base heterocíclica.
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000063_0001
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000063_0002
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000064_0001
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000064_0002
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000064_0003
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000066_0002
Figure imgf000067_0001
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000067_0002
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000067_0003
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura: HO UpHh
Figure imgf000068_0001
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000068_0002
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000068_0003
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000068_0004
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000069_0001
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
Figure imgf000069_0002
En ciertas de tales realizaciones, los grupos conjugados tienen la siguiente estructura:
En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000070_0001
en donde X es un anclaje sustituido o no sustituido de seis a once átomos enlazados consecutivamente.
En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000070_0002
en donde X es un anclaje sustituido o no sustituido de diez átomos unidos consecutivamente.
En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000070_0003
en donde X es un anclaje sustituido o no sustituido de cuatro a once átomos enlazados consecutivamente y en donde el anclaje comprende exactamente un enlace amida.
En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000071_0001
en donde Y y Z se seleccionan independientemente de un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C12 sustituido o no sustituido, o un grupo que comprende un éter, una cetona, una amida, un éster, un carbamato, una amina, una piperidina, un fosfato, un fosfodiéster, un fosforotioato, un triazol, una pirrolidina, un disulfuro o un tioéter.
En ciertas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000071_0002
en donde Y y Z se seleccionan independientemente de un grupo alquilo C1-C12 sustituido o no sustituido, o un grupo que comprende exactamente un éter o exactamente dos éteres, una amida, una amina, una piperidina, un fosfato, un fosfodiéster, o un fosforotioato.
En ciertas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000071_0003
en donde Y y Z se seleccionan independientemente de un grupo alquilo C1-C12 sustituido o no sustituido.
En ciertas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000072_0001
en donde m y n se seleccionan independientemente de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12.
En ciertas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000072_0002
en donde m es 4, 5, 6, 7 u 8, y n es 1, 2, 3 o 4.
En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000072_0003
en donde X es un anclaje sustituido o no sustituido de cuatro a trece átomos enlazados consecutivamente, y en donde X no comprende un grupo éter.
En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000073_0001
en donde X es un anclaje sustituido o no sustituido de ocho átomos unidos consecutivamente, y en donde X no comprende un grupo éter.
En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000073_0002
en donde X es un anclaje sustituido o no sustituido de cuatro a trece átomos enlazados consecutivamente, y en donde el anclaje comprende exactamente un enlace amida, y en donde X no comprende un grupo éter.
En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000073_0003
en donde X es un anclaje sustituido o no sustituido de cuatro a trece átomos enlazados consecutivamente y en donde el anclaje consiste de un enlace amida y un grupo alquilo C2-C11 sustituido o no sustituido.
En ciertas realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000074_0001
en donde Y se selecciona de un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C12 sustituido o no sustituido, o un grupo que comprende un éter, una cetona, una amida, un éster, un carbamato, una amina, una piperidina, un fosfato, un fosfodiéster, un fosforotioato, un triazol, una pirrolidina, un disulfuro o un tioéter.
En ciertas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000074_0002
en donde Y se selecciona de un grupo alquilo C1 -C12 sustituido o no sustituido, o un grupo que comprende un éter, una amina, una piperidina, un fosfato, un fosfodiéster o un fosforotioato.
En ciertas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000074_0003
en donde Y se selecciona de un grupo alquilo C1 -C12 sustituido o no sustituido.
En ciertas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000075_0001
en donde n es 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12.
En ciertas de tales realizaciones, la fracción de direccionamiento celular del grupo conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000075_0002
en donde n es 4, 5, 6, 7 u 8.
Ciertos compuestos antisentido conjugados
En ciertas realizaciones, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3', o 5' del nucleósido. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000075_0003
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es la fracción escindible
C es el conector conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000075_0004
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el conector conjugado
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas de tales realizaciones, el conector conjugado comprende por lo menos un enlace escindible. En ciertas de tales realizaciones, el grupo de ramificación comprende por lo menos un enlace escindible. En ciertas realizaciones, cada anclaje comprende por lo menos un enlace escindible.
En ciertas realizaciones, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3', o 5' del nucleósido.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000076_0001
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es la fracción escindible
C es el conector conjugado
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas realizaciones, los conjugados se unen a un nucleósido del oligonucleótido antisentido en la posición 2', 3', o 5' del nucleósido. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000076_0002
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
C es el conector conjugado
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000076_0003
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
B es la fracción escindible
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado tiene la siguiente estructura:
Figure imgf000077_0001
en donde
A es el oligonucleótido antisentido;
D es el grupo de ramificación
cada E es un anclaje;
cada F es un ligando; y
q es un número entero entre 1 y 5.
En ciertas de tales realizaciones, el conector conjugado comprende por lo menos un enlace escindible. En ciertas realizaciones, cada anclaje comprende por lo menos un enlace escindible.
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:
Fracción de dirección amiento
Figure imgf000077_0002
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:
Fracción de direccionamiento celular
Figure imgf000078_0001
NHAc Grupo de ramificación
En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado tiene una estructura seleccionada entre las siguientes:
Figure imgf000078_0002
N HAc Grupo de ramificación
Las patentes representativas de los Estados Unidos, las publicaciones de solicitud de patentes de los Estados Unidos y las publicaciones de solicitud de patentes internacionales que enseñan la preparación de algunos de los conjugados, compuestos antisentido conjugados, anclajes, conectores, grupos de ramificación, ligandos, fracciones escindibles, así como otras modificaciones indicados anteriormente incluyen sin limitación, US 5,994,517, US 6,300,319, US 6,660,720, US 6,906,182, US 7,262,177, US 7,491,805, US 8,106,022, US 7,723,509, US 2006/0148740, US 2011/0123520, WO 2013/033230 y WO 2012/037254.
Las publicaciones representativas que enseñan la preparación de algunos de los conjugados, compuestos antisentido conjugados, anclajes, conectores, grupos ramificados, ligandos, fracciones escindibles así como otras modificaciones indicados anteriormente incluyen, sin limitación, BIESSEN et al., "The Cholesterol Derivative of a Triantennary Galactoside with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor: a Potent Cholesterol Lowering Agent" J. Med. Chem. (1995) 38:1846-1852, BiEs SEN et al., "Synthesis of Cluster Galactosides with High Affinity for the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1995) 38:1538-1546, LEE et al., "New and more efficient multivalent glyco-ligands for asialoglycoprotein receptor of mammalian hepatocytes" Bioorganic & Medicinal Chemistry (2011) 19:2494-2500, RENSEN et al., "Determination of the Upper Size Limit for Uptake and Processing of Ligands by the Asialoglycoprotein Receptor on Hepatocytes in Vitro and in Vivo" J. Biol. Chem. (2001) 276(40):37577-37584, RENSEN et al., "Design and Synthesis of Novel NAcetylgalactosamine-Terminated Glycolipids for Targeting of Lipoproteins to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (2004) 47:5798-5808, SLIEDREGT et al., "Design and Synthesis of Novel Amphiphilic Dendritic Galactosides for Selective Targeting of Liposomes to the Hepatic Asialoglycoprotein Receptor" J. Med. Chem. (1999) 42:609-618, y Valentijn et al., "Solidphase synthesis of lysine-based cluster galactosides with high affinity for the Asialoglycoprotein Receptor" Tetrahedron, 1997, 53(2), 759-770.
En ciertas realizaciones, los compuestos antisentido conjugados comprenden un oligonucleótido basado en RNasa H (como un gapmer) o un oligonucleótido de modulación de corte y empalme (como un oligonucleótido completamente modificado) y cualquier grupo conjugado que comprenda por lo menos uno, dos o tres grupos GalNAc. En ciertas realizaciones, un compuesto antisentido conjugado comprende cualquier grupo conjugado que se encuentre en cualquiera de las siguientes referencias: Lee, Carbohydr Res, 1978, 67, 509-514; Connolly et al., J Biol Chem, 1982, 257, 939-945; Pavia et al., Int J Pep Protein Res, 1983, 22, 539-548; Lee et al., Biochem, 1984, 23, 4255-4261; Lee et al., Glycoconjugate J, 1987, 4, 317-328; Toyokuni et al., Tetrahedron Lett, 1990, 31, 2673-2676; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1538-1546; Valentijn et al., Tetrahedron, 1997, 53, 759-770; Kim et al., Tetrahedron Lett, 1997, 38, 3487-3490; Lee et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 762-765; Kato et al., Glycobiol, 2001, 11, 821-829; Rensen et al., J Biol Chem, 2001, 276, 37577-37584; Lee et al., Methods Enzymol, 2003, 362, 38-43; Westerlind et al., Glycoconj J, 2004, 21, 227-241; Lee et al., Bioorg Med Chem Lett, 2006, 16(19), 5132-5135; Maierhofer et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 7661-7676; Khorev et al., Bioorg Med Chem, 2008, 16, 5216-5231; Lee et al., Bioorg Med Chem, 2011, 19, 2494-2500; Kornilova et al., Analyt Biochem, 2012, 425, 43-46; Pujol et al., Angew Chemie Int Ed Engl, 2012, 51, 7445-7448; Biessen et al., J Med Chem, 1995, 38, 1846-1852; Sliedregt et al., J Med Chem, 1999, 42, 609-618; Rensen et al., J Med Chem, 2004, 47, 5798-5808; Rensen et al., Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2006, 26, 169-175; van Rossenberg et al., Gene Ther, 2004, 11,457-464; Sato et al., J Am Chem Soc, 2004, 126, 14013-14022; Lee et al., J Org Chem, 2012, 77, 7564-7571; Biessen et al., FASEB J, 2000, 14, 1784-1792; Rajur et al., Bioconjug Chem, 1997, 8, 935-940; Duff et al., Methods Enzymol, 2000, 313, 297-321; Maier et al., Bioconjug Chem, 2003, 14, 18-29; Jayaprakash et al., Org Lett, 2010, 12, 5410-5413; Manoharan, Antisense Nucleic Acid Drug Dev, 2002, 12 , 103-128; Merwin et al., Bioconjug Chem, 1994, 5, 612-620; Tomiya et al., Bioorg Med Chem, 2013, 21, 5275-5281; Solicitudes internacionales WO1998/013381; WO2011/038356; WO1997/046098 WO2008/098788 WO2004/l01619; WO2012/037254; WO2011/120053; WO2011/100131 WO2011/163121 WO2012/l77947; WO2013/033230; WO2013/075035; WO2012/083185; WO2012/083046 WO2009/082607 WO2009/134487 WO2010/144740; WO2010/148013; WO1997/020563; WO2010/088537 WO2002/043771 WO2010/129709 WO2012/068187; WO2009/126933; WO2004/024757; WO2010/054406 WO2012/089352 WO2012/089602 WO2013/166121; WO2013/165816; Patentes de Estados Unidos 4,751,219; 8,552,163 6,908,903 7,262,177 5,994,517 6,300,319; 8,106,022; 7,491,805; 7,491,805; 7,582,744; 8,137,695; 6,383,812; 6,525,031 6,660,720 7,723,509; 8,541,548; 8,344,125; 8,313,772; 8,349,308; 8,450,467; 8,501,930; 8,158,601; 7,262,177 6,906,182 6,620,916; 8,435,491; 8,404,862; 7,851,615; Publicaciones de Solicitud de Patente de Estados Unidas publicadas US2011/0097264; US2011/0097265; US2013/0004427; US2005/0164235; US2006/0148740 US2008/0281044 US2010/0240730 US2003/0119724 US2006/0183886 US2008/0206869 US2011/0269814 US2009/0286973 US2011/0207799 US2012/0136042 US2012/0165393 US2008/0281041 US2009/0203135 US2012/0035115 US2012/0095075 US2012/0101148 US2012/0128760 US2012/0157509 US2012/0230938 US2013/0109817 US2013/0121954 US2013/0178512 US2013/0236968 US2011/0123520 US2003/0077829 US2008/0108801 y US2009/0203132.
Tratamiento de cultivos celulares y compuestos antisentido
Los efectos de los compuestos antisentido sobre el nivel, la actividad o la expresión de los ácidos nucleicos de PKK pueden probarse in vitro en una variedad de tipos de células. Los tipos de células usados para tales análisis están disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, American Type Culture Collection, Manassas, VA; Zen-Bio, Inc., Research Triangle Park, NC; Clonetics Corporation, Walkersville, MD) y se cultivan de acuerdo con las instrucciones del proveedor utilizando reactivos disponibles comercialmente (por ejemplo, Life Technologies, Carlsbad, CA). Los tipos de células ilustrativos incluyen, pero no se limitan a, células T HepaRG™ y hepatocitos primarios de ratón.
Pruebas in vitro de oligonucleótidos antisentido
En la presente se describen métodos para el tratamiento de células con oligonucleótidos antisentido, que pueden modificarse apropiadamente para el tratamiento con otros compuestos antisentido.
Las células pueden tratarse con oligonucleótidos antisentido cuando las células alcanzan aproximadamente un 60-80% de confluencia en cultivo.
Un reactivo comúnmente usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye el reactivo de transfección de lípidos catiónicos LIPOFECTIN (Life Technologies, Carlsbad, CA). Los oligonucleótidos antisentido pueden mezclarse con LIPOFECTIN en OPTI-MEM 1 (Life Technologies, Carlsbad, CA) para lograr la concentración final deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTIN que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otro reactivo usado para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye LIPOFECTAMINE (Life Technologies, Carlsbad, CA). El oligonucleótido antisentido se mezcla con LIPOFECTAMINE en medio de suero reducido OPTI-MEM 1 (Life Technologies, Carlsbad, CA) para lograr la concentración deseada de oligonucleótido antisentido y una concentración de LIPOFECTAMINE que puede variar de 2 a 12 ug/ml por 100 nM de oligonucleótido antisentido.
Otra técnica usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la electroporación.
Otra técnica más usada para introducir oligonucleótidos antisentido en células cultivadas incluye la captación libre de los oligonucleótidos por las células.
Las células se tratan con oligonucleótidos antisentido mediante métodos rutinarios. Las células pueden recogerse 16-24 horas después del tratamiento con oligonucleótidos antisentido, momento en el que se miden los niveles de ARN o proteína de ácidos nucleicos objetivo mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en la presente. En general, cuando los tratamientos se realizan en múltiples repeticiones, los datos se presentan como la media de los tratamientos replicados.
La concentración de oligonucleótido antisentido usada varía de una línea celular a otra. Los métodos para determinar la concentración óptima de oligonucleótidos antisentido para una línea celular particular son bien conocidos en la técnica. Los oligonucleótidos antisentido se usan típicamente en concentraciones que varían de 1 nM a 300 nM cuando se transfectan con LIPOFECTAMINE. Los oligonucleótidos antisentido se usan a concentraciones más altas que varían de 625 a 20.000 nM cuando se transfectan usando electroporación.
Aislamiento de ARN
El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El ARN se prepara usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, usando el reactivo TRIZOL (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo con los protocolos recomendados por el fabricante.
Análisis de inhibición de niveles o expresión objetivo
La inhibición de los niveles o la expresión de un ácido nucleico de PKK puede ensayarse de una variedad de maneras conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de ácido nucleico objetivo pueden cuantificarse mediante, por ejemplo, análisis de transferencia Northern, reacción en cadena de la polimerasa competitiva (PCR) o PCR cuantitativa en tiempo real. El análisis de ARN puede realizarse en ARN celular total o ARNm poli(A)+. Los métodos de aislamiento de ARN son bien conocidos en la técnica. El análisis de transferencia Northern también es rutinario en la técnica. La PCR cuantitativa en tiempo real puede realizarse convenientemente usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 disponible comercialmente, disponible de PE-Applied Biosystems, Foster City, CA y usado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis de PCR cuantitativa en tiempo real de los niveles de ARN objetivo
La cuantificación de los niveles de ARN objetivo puede realizarse mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7600, 7700 o 7900 (PE-Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los métodos de PCR cuantitativa en tiempo real son bien conocidos en la técnica.
Antes de la PCR en tiempo real, el ARN aislado se somete a una reacción de transcriptasa inversa (RT), que produce ADN complementario (ADNc) que luego se usa como sustrato para la amplificación por PCR en tiempo real. Las reacciones de RT y PCR en tiempo real se realizan secuencialmente en el mismo pocillo de muestra. Los reactivos de RT y PCR en tiempo real pueden obtenerse de Life Technologies (Carlsbad, CA). Las reacciones de RT-PCR en tiempo real se llevan a cabo mediante métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Las cantidades objetivo de genes (o ARN) obtenidas por PCR en tiempo real se normalizan usando o el nivel de expresión de un gen cuya expresión es constante, como la ciclofilina A, o cuantificando el ARN total usando RIBOGREEN (Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA). La expresión de ciclofilina A se cuantifica mediante PCR en tiempo real, ejecutándose simultáneamente con el objetivo, multiplexando o por separado. El ARN total se cuantifica usando reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN (Invitrogen, Inc. Eugene, Oreg.). Los métodos de cuantificación de ARN por RIBOGREEN se enseñan en Jones, L.J., et al, (Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368­ 374). Se usa un instrumento CYTOFLUOR 4000 (PE Applied Biosystems) para medir la fluorescencia de RIBOGREEN.
Las sondas y los cebadores están diseñados para hibridar con un ácido nucleico de PKK. Los métodos para diseñar cebadores y sondas de PCR en tiempo real son bien conocidos en la técnica y pueden incluir el uso de software como el software PRIMER EXPRESS (Applied Biosystems, Foster City, CA).
Análisis de niveles de proteínas
La inhibición antisentido de los ácidos nucleicos de PKK puede evaluarse midiendo los niveles de proteína de PKK. Los niveles de proteína de PKK pueden evaluarse o cuantificarse de una variedad de maneras bien conocidas en la técnica, como inmunoprecipitación, análisis de transferencia Western (inmunotransferencia), ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), ensayos cuantitativos de proteínas, ensayos de actividad de proteínas (por ejemplo, ensayos de actividad de caspasa), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los anticuerpos dirigidos a un objetivo pueden identificarse y obtenerse de una variedad de fuentes, como el catálogo de anticuerpos MSRS (Aerie Corporation, Birmingham, MI), o pueden prepararse mediante métodos convencionales de generación de anticuerpos monoclonales o policlonales bien conocidos en la técnica.
Prueba in vivo de compuestos antisentido
Los compuestos antisentido, por ejemplo, los oligonucleótidos antisentido, se prueban en animales para evaluar su capacidad para inhibir la expresión de PKK y producir cambios fenotípicos.
En ciertas realizaciones, tales cambios fenotípicos incluyen aquellos asociados con una enfermedad inflamatoria como inflamación reducida, edema/hinchazón, permeabilidad vascular y pérdida vascular. En ciertas realizaciones, la inflamación se mide midiendo el aumento o la disminución del edema, la temperatura, el dolor, el color del tejido y la función abdominal en el animal.
En ciertas realizaciones, tales cambios fenotípicos incluyen aquellos asociados con una enfermedad tromboembólica como, aPTT prolongado, tiempo de aPTT prolongado junto con un PT normal, disminución de la cantidad de factor plaquetario 4 (PF-4) y formación reducida de trombos o tiempo aumentado para la formación de trombos.
Las pruebas pueden realizarse en animales normales o en modelos experimentales de enfermedades. Para la administración a animales, los oligonucleótidos antisentido se formulan en un diluyente farmacéuticamente aceptable, como solución salina tamponada con fosfato. La administración incluye vías de administración parenterales como intraperitoneal, intravenosa y subcutánea. El cálculo de la dosificación de oligonucleótidos antisentido y la frecuencia de dosificación está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica y depende de factores como la vía de administración y el peso corporal del animal. Después de un período de tratamiento con oligonucleótidos antisentido, se aísla el ARN del tejido hepático y se miden los cambios en la expresión del ácido nucleico de PKK.
Ciertas indicaciones
En ciertas realizaciones, en la presente se divulgan métodos para tratar a un individuo que comprenden administrar una o más composiciones farmacéuticas como se describe en la presente.
En ciertas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad inflamatoria. En ciertas realizaciones, el individuo tiene riesgo de desarrollar una afección inflamatoria incluyendo, pero no limitado a, angioedema hereditario (HAE), edema, angioedema, hinchazón, angioedema de los párpados, edema ocular, edema macular y edema cerebral. Esto incluye individuos con un problema, enfermedad o trastorno adquirido que conlleva un riesgo de inflamación, por ejemplo, predisposición genética a una afección inflamatoria, factores ambientales y exposición a ciertos medicamentos incluyendo, por ejemplo, inhibidores de ACE y ARBs. En ciertas realizaciones, se ha identificado que el individuo necesita una terapia antiinflamatoria. Ejemplos de tales individuos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que tienen una mutación en el código genético para el inhibidor de esterasa del complemento 1 (es decir, C1-INH) o Factor 12. En ciertas realizaciones, un código anormal puede llevar a una deficiencia en C1-INH (es decir, HAE tipo I), una incapacidad de C1-INH existente para funcionar apropiadamente (HAE tipo II9, o Factor 12 hiperfuncional (es decir, HAE tipo III).
En ciertas realizaciones, el individuo tiene una enfermedad tromboembólica. En ciertas realizaciones, el individuo tiene riesgo de padecer un trastorno de la coagulación sanguínea incluyendo, pero no limitado a, infarto, trombosis, embolia, tromboembolia como trombosis venosa profunda, embolia pulmonar, infarto de miocardio y ataque cerebral. Esto incluye individuos con un problema, enfermedad o trastorno adquirido que conlleva un riesgo de trombosis, por ejemplo, cirugía, cáncer, inmovilidad, sepsis, aterosclerosis, fibrilación auricular, así como predisposición genética, por ejemplo, síndrome antifosfolípido y la afección autosómica dominante, Factor V Leiden. En ciertas realizaciones, se ha identificado que el individuo necesita terapia de anticoagulación. Los ejemplos de tales individuos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que se someten a una cirugía ortopédica mayor (por ejemplo, reemplazo de cadera/rodilla o cirugía de fractura de cadera) y pacientes con necesidad de tratamiento crónico, como aquellos que padecen de fibrilación arterial para prevenir el ataque cerebral.
En ciertas realizaciones, en la presente se divulgan métodos para reducir profilácticamente la expresión de PKK en un individuo. Ciertas realizaciones incluyen tratar a un individuo con necesidad de ello administrando a un individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de PKK.
En una realización, la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de PKK se acompaña de la monitorización de los niveles de PKK en el suero de un individuo, para determinar la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido. Un médico usa la respuesta de un individuo a la administración del compuesto antisentido para determinar la cantidad y duración de la intervención terapéutica.
En ciertas realizaciones, la administración de un compuesto antisentido dirigido a un ácido nucleico de PKK da como resultado la reducción de la expresión de PKK en por lo menos un 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99%, o un intervalo definido por dos cualquiera de estos valores. En ciertas realizaciones, las composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto antisentido dirigido a PKK se usan para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a una enfermedad inflamatoria o enfermedad tromboembólica.
Ciertas composiciones
1. ISIS 546254
En ciertas realizaciones, ISIS 546254 se caracteriza como un gapmer 5-10-5 MOE, que tiene una secuencia de (de 5' a 3') TGCAAGTCTCTTGGCAAACA (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 570), en donde cada enlace internucleosídico es un enlace de fosforotioato, cada citosina es una 5'-metilcitosina, cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 son nucleósidos modificados con 2'-O-metoxietilo, y cada uno de los nucleósidos 6-15 son 2'-desoxinucleósidos.
En ciertas realizaciones, ISIS 546254 se describe mediante la siguiente notación química: Tes Ges mCes Aes Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aes Aes Aes mCes Ae; en donde,
A = una adenina,
mC = una 5'-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo,
d = un 2'-desoxinucleósido, y
s = un enlace internucleosídico de fosforotioato.
En ciertas realizaciones, ISIS 546254 se describe mediante la siguiente estructura química:
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Estructura 1. ISIS 546254
En ciertas realizaciones, como se proporciona en el Ejemplo 2 (a continuación en la presente), ISIS 546254 logró una inhibición del 95% de ARNm de PKK humana en células cultivadas HepaRG (densidad de 20.000 células por pocillo) cuando se transfectó usando electroporación con oligonucleótido antisentido de 5.000 nM después de un período de tratamiento de 24 horas y se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto de cebador sonda humano RTS3454 y se ajustó de acuerdo con el contenido de ARN total, medido por RIBOGREEN®.
En ciertas realizaciones, como se proporciona en el Ejemplo 5 (ver las Tablas 34 y 41 en la presente a continuación), ISIS 546254 logró una IC50 de 0,2 pM y 0,3 pM en una curva de respuesta a la dosis de 4 puntos (0,19 pM, 0,56 pM, 1,67 pM, y 5,0 pM) en células cultivadas HepaRG™ (densidad de 20.000 células por pocillo) cuando se transfectan usando electroporación después de un período de tratamiento de 16 y se mide mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando el conjunto cebador sonda humano RTS3454 y se ajusta de acuerdo con el contenido total de ARN, medido por RIBOGREEN®.
En ciertas realizaciones, como se proporciona en el Ejemplo 7 (en la presente a continuación), ISIS 546254 logró un 31%, 55%, 84% y 83% de inhibición del ARNm de PKK humana y un 0%, 36%, 51% y 76% de inhibición de la proteína de PKK humana en ratones transgénicos que albergan la secuencia del gen de pKk humana cuando se inyectan por vía subcutánea dos veces a la semana durante 3 semanas con 2,5 mg/kg/semana, 5,0 mg/kg/semana, 10 mg/kg/semana o 20 mg/kg/semana con ISIS 546254.
En ciertas realizaciones, como se proporciona en el Ejemplo 8 (en la presente a continuación), ISIS 546254 es eficaz para inhibir el ARNm de PKK y la expresión de proteínas y es tolerable en primates.
4. ISIS 721744
En ciertas realizaciones, ISIS 721744 se caracteriza como un gapmer 5-10-5 MOE, que tiene una secuencia de (de 5' a 3') TGCAAGTCTCTTGGCAAACA (incorporada en la presente como SEQ ID NO: 570), en donde los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 3 a 4, 4 a 5, 16 a 17 y 17 a 18 son enlaces de fosfodiéster y los enlaces internucleosídicos entre los nucleósidos 1 a 2, 2 a 3, 5 a 6, 6 a 7, 7 a 8, 8 a 9, 9 a 10, 10 a 11, 11 a 12, 12 a 13, 13 a 14, 14 a 15, 15 a 16, 18 a 19 y 19 a 20 son enlaces de fosforotioato, cada citosina es una 5'-metilcitosina, cada uno de los nucleósidos 1-5 y 16-20 son nucleósidos modificados con 2'-O-metoxietilo, y cada uno de los nucleósidos 6-15 son 2'-desoxinucleósidos.
En ciertas realizaciones, ISIS 721744 se describe mediante la siguiente notación química: GalNAc3-7a-o, Tes Ges mCeo Aeo Aes Gds Tds mCds Tds mCds Tds Tds Gds Gds mCds Aeo Aeo Aes mCes Ae; en donde,
A = una adenina,
mC = una 5'-metilcitosina
G = una guanina,
T = una timina,
e = un nucleósido modificado con 2'-O-metoxietilo,
d = un 2'-desoxinucleósido,
o = un enlace internucleosídico de fosfodiéster,
s = un enlace internucleosídico de fosforotioato, y
Figure imgf000084_0001
En ciertas realizaciones, ISIS 721744 se describe mediante la siguiente estructura química:
Figure imgf000085_0001
EJEMPLOS
Divulgación no limitativa
Aunque ciertos Compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente se han descrito con especificidad de acuerdo con ciertas realizaciones, los siguientes ejemplos sirven solamente para ilustrar los Compuestos descritos en la presente. Cualquier ejemplo que caiga fuera del alcance de las reivindicaciones no forman parte de la invención y se presenta solo con propósitos ilustrativos así como comparativos.
Los siguientes ejemplos ilustran ciertas realizaciones de la presente divulgación y no son limitativos. Además, cuando se proporcionan realizaciones específicas, los inventores han contemplado la aplicación genérica de esas realizaciones específicas. Por ejemplo, la divulgación de un oligonucleótido que tiene un motivo particular proporciona un soporte razonable para oligonucleótidos adicionales que tengan el mismo motivo o uno similar. Y, por ejemplo, cuando aparece una modificación de alta afinidad particular en una posición particular, se consideran adecuadas otras modificaciones de alta afinidad en la misma posición, a menos que se indique lo contrario.
Ejemplo 1: Método general para la preparación de fosforamiditas, Compuestos 1, 1a y 2
Figure imgf000086_0001
Bx es una base heterocíclica;
Los Compuestos 1, 1a y 2 se prepararon según los procedimientos bien conocidos en la técnica como se describe en la memoria descriptiva de la presente (ver Seth et al., Bioorg. Med. Chem., 2011, 21(4), 1122-1125, J. Org. Chem., 2010, 75(5), 1569-1581, Nucleic Acids Symposium Series, 2008, 52(1), 553-554); y ver también las solicitudes internacionales de PCT publicadas (WO 2011/115818, WO2010/077578, WO2010/036698, WO2009/143369, WO 2009/006478 y WO 2007/090071) y la Patente de Estados Unidos N27.569.686).
Ejemplo 2: Preparación del Compuesto 7
Figure imgf000086_0002
Los Compuestos 3 (2-acetamido-1,3,4,6-tetra-O-acetil-2-desoxi-p-Dgalactopiranosa o pentaacetato de galactosamina) están disponibles comercialmente. El Compuesto 5 se preparó según procedimientos publicados (Weber et al., J. Med. Chem., 1991,34, 2692).
Ejemplo 3: Preparación del Compuesto 11
Figure imgf000086_0003
Los Compuestos 8 y 9 están disponibles comercialmente.
Ejemplo 4: Preparación del Compuesto 18
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000087_0002
El Compuesto 11 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 3. El Compuesto 14 está disponible comercialmente. El Compuesto 17 se preparó usando procedimientos similares informados por Rensen et al., J. Med. Chem., 2004, 47, 5798-5808.
Ejemplo 5: Preparación del Compuesto 23
Figure imgf000088_0001
Los Compuestos 19 y 21 están disponibles comercialmente.
Ejemplo 6: Preparación del Compuesto 24
Figure imgf000088_0002
Los Compuestos 18 y 23 se prepararon según los procedimientos ilustrados en los Ejemplos 4 y 5.
Ejemplo 7: Preparación del Compuesto 25
Figure imgf000089_0001
El Compuesto 24 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 6.
Ejemplo 8: Preparación del Compuesto 26
Figure imgf000090_0001
El Compuesto 24 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 6.
Ejemplo 10: ASO conjugados de preparación general que comprenden GalNAc3-1 en el extremo terminal 5', Compuesto 34
l.Terminaeión(AciO, NV1I. pyr) l .D C A . D C M 2. PADS o t-B uO O H 3. D C A .D C M
2. DCI. N M I. A CN
4. DCI. N M I. A CN Bloques de construcción Q - u n
de fosforamidita
Figure imgf000091_0001
Fosforamidita 1
Figure imgf000091_0002
Figure imgf000091_0003
Figure imgf000092_0001
El Unylinker™ 30 está disponible comercialmente. El Compuesto oligomérico 34 que comprende una agrupación deGalNAc3-1 en el extremo terminal 5' se prepara usando procedimientos estándar en síntesis de ADN/ARN automatizada (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed.,2006, 45, 3623-3627). Los bloques de construcción de fosforamidita, los Compuestos 1 y 1a se prepararon según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 1. Las fosforamiditas ilustradas se pretende que sean representativas y no se pretende que sean limitativas, ya que pueden usarse otros bloques de construcción de fosforamidita para preparar un Compuesto oligomérico que tenga una secuencia predeterminada y composición. El orden y la cantidad de fosforamiditas añadidas al soporte sólido pueden ajustarse para preparar Compuestos oligoméricos con huecos como se describe en la presente. Tales Compuestos oligoméricos con huecos pueden tener una composición y secuencia de bases predeterminadas según lo dicte cualquier objetivo dado.
Ejemplo 11: Preparación del Compuesto 39
Figure imgf000093_0001
Los Compuestos 4, 13 y 23 se prepararon según los procedimientos ilustrados en los Ejemplos 2, 4 y 5. El Compuesto 35 se preparó usando procedimientos similares publicados en Rouchaud et al., Eur. J. Org. Chem., 2011, 12, 2346-2353.
Ejemplo 12: Preparación del Compuesto 40
Figure imgf000094_0001
El Compuesto 38 se prepara según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 11.
Ejemplo 13: Preparación del Compuesto 44
Figure imgf000095_0001
Los Compuestos 23 y 36 se preparan según los procedimientos ilustrados en los Ejemplos 5 y 11. El Compuesto 41 se prepara usando procedimientos similares publicados en la WO 2009082607.
Ejemplo 14: Preparación del Compuesto 45
Figure imgf000096_0002
El Compuesto 43 se prepara según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 13.
Ejemplo 15: Preparación del Compuesto 47
Figure imgf000096_0001
El Compuesto 46 está disponible comercialmente.
Ejemplo 16: Preparación del Compuesto 53
Figure imgf000097_0001
Los Compuestos 48 y 49 están disponibles comercialmente. Los Compuestos 17 y 47 se preparan según los procedimientos ilustrados en los Ejemplos 4 y 15.
Ejemplo 17: Preparación del Compuesto 54
Figure imgf000098_0001
El Compuesto 53 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 16.
Ejemplo 18: Preparación del Compuesto 55
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Ejemplo 27: Compuesto 56
Figure imgf000099_0002
El Compuesto 56 está disponible comercialmente de Glen Research o puede prepararse de acuerdo con los procedimientos publicados informados por Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454. Ejemplo 28: Preparación del Compuesto 60
Figure imgf000100_0001
El Compuesto 4 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 2. El Compuesto 57 está disponible comercialmente. El Compuesto 60 se confirmó mediante análisis estructural.
Se pretende que el Compuesto 57 sea representativo y no limitativo, ya que pueden usarse otros alquil dioles monoprotegidos sustituidos o no sustituidos incluyendo, pero no limitados a, los presentados en la presente memoria descriptiva para preparar fosforamiditas que tienen una composición predeterminada.
Ejemplo 29: Preparación del Compuesto 63
Figure imgf000100_0002
Los Compuestos 61 y 62 se preparan usando procedimientos similares a los descritos por Tober et al., Eur. J. Org. Chem., 2013, 3, 566-577; y Jiang et al., Tetrahedron, 2007, 63(19), 3982-3988.
Alternativamente, el Compuesto 63 se prepara usando procedimientos similares a los descritos en la literatura científica y de patentes por Kim et al., Synlett, 2003, 12, 1838-1840; y Kim et al., Solicitud Internacional de PCT publicada, WO 2004063208.
Ejemplo 30: Preparación del Compuesto 63b
Figure imgf000100_0003
El Compuesto 63a se prepara usando procedimientos similares a los descritos por Hanessian et al., Canadian Journal of Chemistry, 1996, 74(9), 1731-1737.
Ejemplo 31: Preparación del Compuesto 63d
Figure imgf000101_0001
El Compuesto 63c se prepara usando procedimientos similares a los descritos por Chen et al., Chínese Chemical Letters, 1998, 9(5), 451-453.
Ejemplo 32: Preparación del Compuesto 67
Figure imgf000101_0003
El Compuesto 64 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 2. El Compuesto 65 se prepara usando procedimientos similares a los informados por Or et al., Solicitud Internacional de PCT publicada, WO 2009003009. Se pretende que los grupos protectores usados para el Compuesto 65 sean representativos y no se pretende que sean limitativos ya que pueden usarse otros grupos protectores, incluyendo pero no limitados a, los presentados en la presente memoria descriptiva.
Ejemplo 33: Preparación del Compuesto 70
Figure imgf000101_0002
El Compuesto 64 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 2. El Compuesto 68 está disponible comercialmente. Se pretende que el grupo protector usado para el Compuesto 68 sea representativo y no se pretende que sea limitativo ya que pueden usarse otros grupos protectores incluyendo pero no limitados a, los presentados en la presente memoria descriptiva.
Ejemplo 34: Preparación del Compuesto 75a
Figure imgf000102_0001
El Compuesto 75 se prepara de acuerdo con los procedimientos publicados informados por Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454.
Ejemplo 35: Preparación del Compuesto 79
Figure imgf000102_0002
El Compuesto 76 se preparó de acuerdo con los procedimientos publicados informados por Shchepinov et al., Nucleic Acids Research, 1997, 25(22), 4447-4454.
Ejemplo 36: Preparación del Compuesto 79a
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El Compuesto 77 se prepara según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 35.
Ejemplo 37: Método general para la preparación del compuesto oligomérico conjugado 82 que comprende un conjugado de GalNAc3-2 enlazado a fosfodiéster en el extremo terminal 5' vía soporte sólido (Método I)
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Figure imgf000104_0001
donde GalNAc3-2 tiene la estructura:
Figure imgf000104_0002
La porción de agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-2 (GalNAc3-2a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. Donde GalNAc3-2a tiene la fórmula:
Figure imgf000104_0003
El Compuesto oligomérico unido a VIMAD 79b se preparó usando procedimientos estándar para la síntesis automatizada de ADN/ARN (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). Los Compuestos de fosforamidita 56 y 60 se prepararon según los procedimientos ilustrados en los Ejemplos 27 y 28, respectivamente.
Se pretende que las fosforamiditas ilustradas sean representativas y no se pretende que sean limitativas, ya que pueden usarse otros bloques de construcción de fosforamiditas, incluyendo pero no limitados a, los presentados en la presente memoria descriptiva, para preparar un Compuesto oligomérico que tiene un grupo conjugado enlazado a fosfodiéster en el extremo terminal 5'. El orden y la cantidad de fosforamiditas añadidas al soporte sólido pueden ajustarse para preparar los compuestos oligoméricos como se describe en la presente que tienen cualquier secuencia y composición predeterminadas.
Ejemplo 38: Método alternativo para la preparación del compuesto oligomérico 82 que comprende un conjugado de GalNAc3-2 enlazado a fosfodiéster en el extremo terminal 5’ (Método II)
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Figure imgf000105_0002
Compuesto oligomérico 82
El compuesto oligomérico unido a VIMAD 79b se preparó usando procedimientos estándar para la síntesis automatizada de ADN/ARN (ver Dupouy et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 3623-3627). La fosforamidita de la agrupación de GalNAc3-2, Compuesto 79 se preparó según los procedimientos ilustrados en el ejemplo 35. Este método alternativo permite una instalación en un solo paso del conjugado de GalNAc3-2 enlazado por fosfodiéster al compuesto oligomérico en el paso final de la síntesis. Se pretende que las fosforamiditas ilustradas sean representativas y no se pretende que sean limitativas, ya que pueden usarse otros bloques de construcción de fosforamidita, incluyendo pero no limitados a, los presentados en la presente memoria descriptiva, para preparar compuestos oligoméricos que tienen un conjugado de fosfodiéster en el extremo terminal 5'. El orden y la cantidad de fosforamiditas añadidas al soporte sólido pueden ajustarse para preparar los compuestos oligoméricos como se describe en la presente que tienen cualquier secuencia y composición predeterminadas.
Ejemplo 39: Método General para la Preparación del compuesto oligoméricoc 83h que comprende un conjugado de GalNAc3-3 en el extremo terminal 5’ (GalNAc3-1 modificados para la unión del extremo 5’) a través de soporte sólido
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Figure imgf000107_0002
El Compuesto 18 se preparó según los procedimientos ilustrados en el Ejemplo 4. Los Compuestos 83a y 83b están disponibles comercialmente. El Compuesto oligomérico 83e que comprende una hexilamina enlazada a fosfodiéster se preparó usando procedimientos de síntesis de oligonucleótidos estándar. El tratamiento del compuesto oligomérico protegido con amoniaco acuoso proporcionó el compuesto oligomérico conjugado 5'-GalNAc3-3 (83h).
En donde GalNAc3-3 tiene la estructura:
Figure imgf000107_0001
La porción de agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-3 (GalNAc3-3a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En donde GalNAc3-3a tiene la fórmula:
Figure imgf000108_0001
Ejemplo 41: Método general para la preparación de ASO que comprenden un conjugado GalNAc3-2 enlazado a fosfodiéster (ver el Ejemplo 37, Bx es adenina) en la posición 5’ mediante técnicas de fase sólida (Preparación de ISIS 661134)
A menos que se indique lo contrario, todos los reactivos y soluciones usados para la síntesis de compuestos oligoméricos se adquieren de fuentes comerciales. Los bloques de construcción de fosforamidita estándar y el soporte sólido se usan para incorporar residuos de nucleósidos que incluyen, por ejemplo, residuos T, A, G y mC. Los compuestos de fosforamidita 56 y 60 se usaron para sintetizar el conjugado de GalNAc3-2 enlazado por fosfodiéster en el extremo terminal 5'. Se usó una solución 0,1 M de fosforamidita en acetonitrilo anhidro para p-D-2'-desoxirribonucleósido y 2'-MOE.
Las síntesis de ASO se realizaron en un sintetizador ABI 394 (escala de 1-2 pmol) o en un sintetizador de oligopiloto ÁKTA de GE Healthcare Bioscience (escala de 40-200 pmol) mediante el método de acoplamiento de fosforamidita en soporte sólido VIMAD (110 pmol/g, Guzaev et al., 2003) empaquetados en la columna. Para el paso de acoplamiento, las fosforamiditas se administraron en un exceso de 4 veces sobre la carga inicial del soporte sólido y el acoplamiento de fosforamiditas se llevó a cabo durante 10 min. Todos los demás pasos siguieron los protocolos estándar proporcionados por el fabricante. Se usó una solución de ácido dicloroacético al 6% en tolueno para eliminar los grupos dimetoxitritilo (DMT) de los grupos 5'-hidroxilo del nucleótido. Se usó 4,5-Dicianoimidazol (0,7 M) en CH3CN anhidro como activador durante el paso de acoplamiento. Los enlaces de fosforotioato se introdujeron mediante sulfuración con una solución 0,1 M de hidruro de xantano en piridina/CH3CN 1:1 durante un tiempo de contacto de 3 minutos. Se usó una solución de hidroperóxido de terc-butilo al 20% en CH3CN que contenía 6% de agua como agente oxidante para proporcionar enlaces internucleosídicos de fosfodiéster eon un tiempo de contacto de 12 minutos.
Después de ensamblar la secuencia deseada, se desprotegieron los grupos protectores de fosfato de cianoetilo usando dietilamina al 20% en tolueno (v/v) con un tiempo de contacto de 45 minutos. Los ASO unidos al soporte sólido se suspendieron en amoniaco acuoso (28-30% en peso) y se calentaron a 552C durante 6 h.
Luego se filtraron los ASO no unidos y se hirvió el amoniaco. El residuo se purificó mediante cromatografía líquida de alta presión en una columna de intercambio aniónico fuerte (GE Healthcare Bioscience, Source 30Q, 30 pm, 2,54 x 8 cm, A = acetato de amonio 100 mM en CH3CN acuoso al 30%, B = NaBr 1,5 M en A, 0-40% de B en 60 min, flujo 14 ml min-1, A = 260 nm). El residuo se desaló por HPLC en una columna de fase inversa para producir los ASO deseados con un rendimiento aislado del 15-30% en base a la carga inicial sobre el soporte sólido. Los ASO se caracterizaron mediante análisis de MS acoplado a HPLC de parejas de iones con el sistema Agilent 1100 MSD.
Tabla 34
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Subíndices: "e" indica nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; “k” indica nucleósido bicíclico 6'-(S)-CH3 (por ejemplo cET); "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO); y “o' ” indica -O-P(=O)(OH)-. El superíndice "m" indica 5 metilcitosinas. La estructura de GalNAc3-2a se muestra en el Ejemplo 37.
Ejemplo 42: Método general para la Preparación de ASO que comprenden un conjugado GalNAc3-3 en la posición 5’ mediante técnicas fase sólida (Preparación de ISIS 661166)
La síntesis para ISIS 661166 se realizó usando procedimientos similares a los ilustrados en los Ejemplos 39 y 41.
ISIS 661166 es un gapmer 5-10-5 MOE, en donde la posición 5' comprende un conjugado GalNAc3-3. El ASO se caracterizó mediante análisis de MS acoplado a HPLC de parejas de iones con el sistema Agilent 1100 MSD.
Tabla 34a
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Subíndices: "e" indica nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO); y “o' ” indica -O-P(=O)(OH)-. El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas. La estructura de “5'-GalNAc3-3a” se muestra en el Ejemplo 39.
Ejemplo 44: Efecto de enlaces de PO/PS sobre la inhibición antisentido de ASO que comprenden conjugado GalNAc3-1 (ver el Ejemplo 9) en el extremo terminal 3' dirigidos a SRB-1
Se probaron ISIS 655861 y 655862 que comprenden un conjugado GalNAc3-1 en el extremo terminal 3', cada uno dirigido a SRB-1 en un estudio de administración única para determinar su capacidad para inhibir SRB-1 en ratones. El compuesto original no conjugado, ISIS 353382, se incluyó en el estudio por comparación.
Los ASO son gapmers 5-10-5 MOE, en los que la región de hueco comprende diez 2'-desoxirribonucleósidos y cada región de ala comprende cinco nucleósidos modificados con 2'-MOE. Los ASO se prepararon usando métodos similares a los ilustrados anteriormente en el Ejemplo 19 y se describen en la Tabla 36, a continuación.
Tabla 36
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Subíndices: "e" indica nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica enlaces internucleosídicos de fosforotioato (PS); "o" indica enlaces internucleosídicos de fosfodiéster (PO); y “o' “ indica -O-P(=O)(OH)-. El superíndice "m" indica 5-metilcitosinas. La estructura de "GalNAc3-1" se muestra en el Ejemplo 9.
Tratamiento
Se inyectó subcutáneamente una vez a ratones Balb/c macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) A la dosificaciones mostradas a continuación con ISIS 353382, 655861, 655862 o con control tratado con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Antes del tratamiento, así como después de la última dosis, se extrajo sangre de cada ratón y se analizaron muestras de plasma. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 hepático usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de ARNm de SRB-1 se determinaron con respecto al ARN total (usando Ribogreen), antes de la normalización al control tratado con PBS. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizado al control tratado con PBS y se indica como "% de PBS". Las ED50 se midieron usando métodos similares a los descritos anteriormente y se informan a continuación.
Como se ilustra en la Tabla 37, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis en comparación con el control tratado con PBS. De hecho, los oligonucleótidos antisentido que comprenden el conjugado GalNAc3-1 en el extremo terminal 3' (ISIS 655861 y 655862) mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Además, ISIS 655862 con enlaces mixtos de PS/PO mostró una mejora en la potencia con respecto a PS completo (ISIS 655861).
Tabla 37
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Se midieron los niveles de transaminasas hepáticas, alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) en suero con respecto a los ratones inyectados con solución salina usando protocolos estándar. También se evaluaron los pesos de los órganos. Los resultados demostraron que no se observaron elevaciones en los niveles de transaminasas (Tabla 38) o pesos de los órganos (datos no mostrados) en ratones tratados con ASO en comparación con el control de PBS. Además, el ASO con enlaces de PS/PO mixtos (ISIS 655862) mostró niveles de transaminasas similares en comparación con el PS completo (ISIS 655861).
Tabla 38
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Ejemplo 45: Preparación de éster de PFP, Compuesto 110a
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El Compuesto 4 (9,5 g, 28,8 mmoles) se trató con el Compuesto 103a o 103b (38 mmoles), individualmente, y TMSOTf (0,5 eq.) y tamices moleculares en diclorometano (200 ml) y se agitó durante 16 horas a temperatura ambiente. En ese momento, la capa orgánica se filtró a través de celite, luego se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salmuera. Después, la capa orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a presión reducida. El aceite resultante se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (2%-->10% de metanol/diclorometano) para dar los Compuestos 104a y 104b con un rendimiento de >80%. La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los Compuestos 104a y 104b se trataron en las mismas condiciones que para los Compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar los Compuestos 105a y 105b con un rendimiento de >90%. La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los Compuestos 105a y 105b se trataron, individualmente, con el Compuesto 90 en las mismas condiciones que para los Compuestos 901a-d, para dar los Compuestos 106a (80%) y 106b (20%). La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los Compuestos 106a y 106b se trataron en las mismas condiciones que para los Compuestos 96a-d (Ejemplo 47), para dar 107a (60%) y 107b (20%). La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los Compuestos 107a y 107b se trataron en las mismas condiciones que para los Compuestos 97a-d (Ejemplo 47), para dar los Compuestos 108a y 108b con un rendimiento del 40-60%. La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Los Compuestos 108a (60%) y 108b (40%) se trataron en las mismas condiciones que para los Compuestos 100a-d (Ejemplo 47), para dar los Compuestos 109a y 109b con rendimientos de >80%. La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
El Compuesto 109a se trató en las mismas condiciones que para los Compuestos 101a-d (Ejemplo 47), para dar el Compuesto 110a con un rendimiento del 30-60%. La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura. Alternativamente, el Compuesto 110b puede prepararse de una manera similar comenzando con el Compuesto 109b.
Ejemplo 46: Procedimiento general de conjugación con ásteres de PFP (oligonucleótido 111); Preparación de ISIS 666881 (GalNAc3-10)
Se sintetizó y purificó un oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino usando procedimientos de oligonucleótidos en fase sólida estándar. El oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino se disolvió en tetraborato de sodio 0,1 M, pH 8,5 (200 pl) y se añadieron 3 equivalentes de una agrupación de GalNAc3 esterificada con PFP disuelta en DMSO (50 pl). Si el éster de PFP precipitaba tras la adición a la solución de ASO, se añadía DMSO hasta que todo el éster de PFP estaba en solución. La reacción se completó después de aproximadamente 16 h de mezclado a temperatura ambiente. La solución resultante se diluyó con agua hasta 12 ml y luego se centrifugó a 3000 rpm en un filtro giratorio con un corte de masa de 3000 Da. Este proceso se repitió dos veces para eliminar las impurezas de moléculas pequeñas. Luego la solución se liofilizó hasta la sequedad y se volvió a disolver en amoniaco acuoso concentrado y se mezcló a temperatura ambiente durante 2,5 h seguido de concentración al vacío para eliminar la mayor parte del amoniaco. El oligonucleótido conjugado se purificó y desaló mediante RP-HPLC y se liofilizó para proporcionar el oligonucleótido conjugado con GalNAc3.
Figure imgf000114_0001
El oligonucleótido 111 se conjuga con GalNAc3-10. La porción de agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-10 (GalNAc3-10a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)- como se muestra en el oligonucleótido (ISIS 666881) sintetizado con GalNAc3-10 a continuación. La estructura de GalNAc3-0 (GalNAc3-10a-CM-) se muestra a continuación:
Figure imgf000114_0002
Siguiendo este procedimiento general, se preparó ISIS 666881. El oligonucleótido modificado con 5'-hexilamino, ISIS 660254, se sintetizó y purificó usando procedimientos de oligonucleótidos en fase sólida estándar. Se disolvió ISIS 660254 (40 mg, 5,2 pmol) en tetraborato de sodio 0,1 M, pH 8,5 (200 pl) y se añadieron 3 equivalentes de éster de PFP (Compuesto 110a) disuelto en DMSO (50 pl). El éster de PFP precipitó tras la adición a la solución de ASO requiriendo DMSO adicional (600 pl) para disolver completamente el éster de PFP. La reacción se completó después de 16 h de mezclado a temperatura ambiente. La solución se diluyó con agua hasta un volumen total de 12 ml y se centrifugó a 3000 rpm en un filtro giratorio con un corte de masa de 3000 Da. Este proceso se repitió dos veces para eliminar las impurezas de moléculas pequeñas. La solución se liofilizó hasta la sequedad y se volvió a disolver en amoniaco acuoso concentrado con mezclado a temperatura ambiente durante 2,5 h seguido de concentración al vacío para eliminar la mayor parte del amoniaco. El oligonucleótido conjugado se purificó y desaló mediante RP-HPLC y se liofilizó para dar ISIS 666881 con un rendimiento del 90% en peso (42 mg, 4,7 gmol).
Oligonucleótido conjugado con GalNAc3-10
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Las letras mayúsculas indican la nucleobase de cada nucleósido y mC indica una 5-metilcitosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica un p-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internucleosídico de fosforotioato (PS); “o” indica un enlace internucleosídico de fosfodiéster (PO); y “o' ” indica -O-P(=O)(OH) -. Los grupos conjugados están en negrita.
Ejemplo 47: Preparación de oligonucleótidos 102 que comprende GalNAc3-8
Figure imgf000116_0001
96 a ; n = 1 , m =1
96 b : n = 1. m = 2
96 c : n = 2. m =1
a b a : n = 2. m = 2
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El triácido 90 (4 g, 14,43 mmol) se disolvió en DMF (120 ml) y N,N-di¡soprop¡let¡lam¡na (12,35 ml, 72 mmoles). Se añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo (8,9 ml, 52 mmoles), bajo argón, y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió boc-diamina 91a o 91b (68,87 mmol), junto con N,N-diisopropiletilamina (12,35 ml, 72 mmol) y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 16 horas. En ese momento, la DMF se redujo en >75% a presión reducida y luego la mezcla se disolvió en diclorometano. La capa orgánica se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salmuera. Luego, la capa orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a un aceite a presión reducida. El aceite resultante se purificó mediante cromatografía en gel de sílice (2% -> metanol/diclorometano al 10%) para dar los Compuestos 92a y 92b con un rendimiento aproximado del 80%. La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Se trató el Compuesto 92a o 92b (6,7 mmoles) con 20 ml de diclorometano y 20 ml de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente durante 16 horas. La solución resultante se evaporó y luego se disolvió en metanol y se trató con resina DOWEX-OH durante 30 minutos. La solución resultante se filtró y se redujo a un aceite a presión reducida para dar un rendimiento del 85-90% de los Compuestos 93a y 93b.
Los Compuestos 7 o 64 (9,6 mmoles) se trataron con HBTU (3,7 g, 9,6 mmoles) y N,N-diisopropiletilamina (5 ml) en DMF (20 ml) durante 15 minutos. A esto se le añadieron los Compuestos 93a o 93b (3 mmoles) y se dejó agitar a temperatura ambiente durante 16 horas. En ese momento, la DMF se redujo en >75% a presión reducida y luego la mezcla se disolvió en diclorometano. La capa orgánica se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salmuera. Luego la capa orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a un aceite a presión reducida. El aceite resultante se purificó mediante cromatografía sobre gel de sílice (metanol/diclorometano al 5% --> 20%) para dar los Compuestos 96a-d con un rendimiento del 20-40%. La LCMS y la NMR de protones fueron consistentes con la estructura.
Se hidrogenaron los Compuestos 96a-d (0,75 mmoles) individualmente sobre níquel Raney durante 3 horas en etanol (75 ml). En ese momento, el catalizador se eliminó mediante filtración a través de celite y el etanol se elim inó a presión reducida para dar los Com puestos 97a-d con un rendimiento del 80 -90 % . La L C M S y la NM R de protones fueron consistentes con la estructura.
El Com puesto 23 (0,32 g, 0 ,53 m moles) se trató con H B TU (0,2 g, 0 ,53 m moles) y N ,N-diisopropiletilam ina (0 ,19 ml, 1,14 m moles) en DM F (30 ml) durante 15 minutos. A esto se le añadieron los Com puestos 97a-d (0,38 mmoles), individualmente, y se dejaron agitar a temperatura ambiente durante 16 horas. En ese momento, la DM F se redujo en > 75 % a presión reducida y luego la m ezcla se disolvió en diclorometano. La ca p a orgánica se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salm uera. Luego, la ca p a orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a un aceite a presión reducida. El aceite resultante se purificó mediante crom atografía en gel de sílice (m etanol/diclorometano al 2 % --> 20 % ) para dar los Com puestos 98a-d con un rendimiento del 30 -40 % . La L C M S y la NM R de protones fueron consistentes con la estructura.
El Com puesto 99 (0 ,17 g, 0,76 m moles) se trató con H B TU (0,29 g, 0,76 mmoles) y N ,N-diisopropiletilam ina (0,35 ml, 2,0 mmoles) en D M F (50 ml) durante 15 minutos. A esto se le añadieron los Com puestos 97a-d (0,51 mmoles), individualm ente, y se dejó agitar a temperatura am biente durante 16 horas. En e se momento, la DM F se redujo en > 75 % a presión reducida y luego la m ezcla se disolvió en diclorometano. La cap a orgánica se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salm uera. Luego la ca p a orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a un aceite a presión reducida. El aceite resultante se purificó mediante crom atografía en gel de sílice (m etanol/diclorometano al 5 % --> 20 % ) para dar los Com puestos 100 a-d con un rendimiento del 40 -60 % . La L C M S y la NM R de protones fueron consistentes con la estructura.
Los Com puestos 100 a-d (0,16 mmoles), individualm ente, se hidrogenaron sobre Pd(O H )2/C al 10 % durante 3 horas en metanol/acetato de etilo ( 1 :1, 50 ml). En e se momento, el catalizador se eliminó mediante filtración a través de celite y los orgánicos se elim inaron a presión reducida para dar los Com puestos 101a -d con un rendimiento del 80 -90 % . La L C M S y la NM R de protones fueron consistentes con la estructura.
S e disolvieron los Com puestos 101a -d (0 ,15 mmoles) individualm ente, en DM F (15 ml) y piridina (0,016 ml, 0 ,2 mmoles). S e añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo (0,034 ml, 0,2 mmoles), bajo argón, y la reacción se dejó agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos. En ese momento, la DM F se redujo en > 75 % a presión reducida y luego la m ezcla se disolvió en diclorometano. La ca p a orgánica se lavó con bicarbonato de sodio, agua y salm uera. Luego, la ca p a orgánica se separó y se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se redujo a un aceite a presión reducida. El aceite resultante se purificó mediante crom atografía en gel de sílice (m etanol/diclorometano al 2 % - - > 5 % ) para dar los Com puestos 102 a -d con un rendimiento aproxim ado del 80 % . La L C M S y la NM R de protones fueron consistentes con la estructura.
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El Com puesto oligom érico 102 , que com prende un grupo conjugado G alN A c3-8, se preparó usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 46. La porción de agrupación de G a lN A c 3 del grupo conjugado G alN A c3-8 (GalNAc3-8a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En una realización preferida, la fracción escindible e s -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-.
La estructura de G alN A c3-8 (G alN A c3-8a-CM -) se m uestra a continuación:
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Ejemplo 48: Preparación de oligonucleótido 119 que comprende GalNAc3-7
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El Compuesto 112 se sintetizó siguiendo el procedimiento descrito en la bibliografía (J. Med. Chem. 2004, , 5798-5808).
S e disolvió el Com puesto 112 (5 g, 8,6 mmol) en metanol/acetato de etilo 1 :1 (22 m l/22 ml). S e añadió hidróxido de paladio sobre carbono (0,5 g). La m ezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La m ezcla de la reacción se filtró a través de una alm ohadilla de celite y la alm ohadilla se lavó con m etanol/acetato de etilo 1 : 1. El filtrado y los lavados se com binaron y concentraron hasta la sequedad para producir el Com puesto 105a (cuantitativo). La estructura fue confirm ada por LC M S .
S e disolvieron el Com puesto 113 (1,25 g, 2 ,7 mmol), H B T U (3,2 g, 8,4 mmol) y D IE A (2,8 ml, 16 ,2 mmol) en DM F anhidro (17 ml) y la m ezcla de la reacción se agitó a tem peratura ambiente durante 5 min. A esto se le añadió una solución del Com puesto 105 a (3,77 g, 8,4 mmol) en D M F anhidro (20 ml). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El solvente se elim inó a presión reducida para obtener un aceite. El residuo se disolvió en C H 2 C l2 (100 ml) y se lavó con una solución a cu o sa saturada de N aH CO 3 (100 ml) y salm uera (100 ml). La fase orgánica se separó, se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó m ediante crom atografía en colum na de gel de s ílice y se eluyó con M eOH del 10 al 20 % en diclorometano para producir el Com puesto 114 (1,45 g, 30 % ) . La estructura se confirmó m ediante L C M S y a ná lis is 1H NMR.
El Com puesto 114 (1,43 g, 0,8 mmol) se disolvió en metanol/acetato de etilo 1 :1 (4 ml/4 ml). S e añadió paladio sobre carbono (húmedo, 0 ,14 g). La m ezcla de la reacción se lavó abundantem ente con hidrógeno y se agitó a tem peratura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La m ezcla de la reacción se filtró a través de una alm ohadilla de celite. La alm ohadilla de celite se lavó con m etanol/acetato de etilo ( 1 :1). El filtrado y los lavados se com binaron y se evaporaron a presión reducida para producir el Com puesto 115 (cuantitativo). La estructura se confirmó mediante L C M S y a ná lis is 1H NM R.
El Com puesto 83a (0 ,17 g, 0 ,75 mmol), H B TU (0,31 g, 0,83 mmol) y D IE A (0,26 ml, 1,5 mmol) se disolvieron en D M F anhidro (5 ml) y la m ezcla de la reacción se agitó a tem peratura ambiente durante 5 min. A esto se le añadió una solución del Com puesto 115 (1,22 g, 0 ,75 mmol) en D M F anhidro y la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. El solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se disolvió en C H 2 C l2. La cap a orgánica se lavó con una solución a cuo sa saturada de N aH CO 3 y salm uera y se secó sobre Na2SO4 anhidro y se filtró. La cap a orgánica se concentró hasta la sequedad y el residuo obtenido se purificó m ediante crom atografía en colum na de gel de s ílice y se eluyó con M eOH del 3 al 15 % en diclorometano para producir el Com puesto 116 (0,84 g, 61 % ) . La estructura se confirmó por L C M S y a ná lis is 1H NM R.
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paladio sobre carbono (húmedo, 0,074 g). La m ezcla de la reacción se lavó abundantem ente con hidrógeno y se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 12 h. La m ezcla de la reacción se filtró a través de una alm ohadilla de celite. La alm ohadilla de celite se lavó con m etanol/acetato de etilo ( 1 :1). El filtrado y los lavados se com binaron y se evaporaron a presión reducida para producir el Com puesto 117 (0,73 g, 98 % ). La estructura se confirmó mediante L C M S y a ná lis is 1H NM R.
S e disolvió el Com puesto 117 (0,63 g, 0,36 mmol) en DM F anhidro (3 ml). A esta solución se le añadieron N,N-diisopropiletilam ina (70 gl, 0,4 mmol) y trifluoroacetato de pentafluorofenilo (72 gl, 0,42 mmol). La m ezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 12 h y se vertió en una solución a cuo sa saturada de N aH CÜ 3. La m ezcla se extrajo con diclorometano, se lavó con salm uera y se secó sobre Na2SÜ4 anhidro. La solución de diclorometano se concentró hasta la sequedad y se purificó con crom atografía en colum na de gel de sílice y se eluyó con M eOH del 5 al 10 % en diclorometano para producir el Com puesto 118 (0,51 g, 79 % ) . La estructura se confirmó por L C M S y 1H y 1H y 19F NMR.
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El Com puesto oligomérico 119 , que com prende un grupo conjugado G a lN A c3-7 , se preparó usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 46. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c3-7 (GalNAc3-7a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible e s -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-.
La estructura de G a lN A c3-7 (G alN A c3-7a-CM -) se m uestra a continuación:
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Ejemplo 49: Preparación del Oligonucleótido 132 que comprende GalNAc3-5
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S e disolvieron el Com puesto 120 (14 ,01 g, 40 mmol) y H B TU (14,06 g, 37 mmol) en DM F anhidro (80 ml). S e añadió trietilamina ( 11,2 ml, 80,35 mmol) y se agitó durante 5 min. La m ezcla de la reacción se enfrió en un baño de hielo y se añadió una solución del com puesto 121 (10 g, mmol) en D M F anhidro (20 ml). S e añadió trietilamina adicional (4,5 ml, 32 ,28 mmol) y la m ezcla de la reacción se agitó durante 18 h en una atm ósfera de argón. La reacción se controló mediante T L C (acetato de etilo: hexano; 1 : 1 ; Rf = 0,47). E l solvente se eliminó a presión reducida. El residuo se recogió en EtO Ac (300 ml) y se lavó con N aH SO 4 1M (3 x 150 ml), solución a cuo sa saturada de N aH CO 3 (3 x 150 ml) y salm uera (2 x 100 ml). La cap a orgánica se secó con Na2SO4.. El agente de secado se elim inó por filtración y la ca p a orgánica se concentró m ediante evaporación rotatoria. La m ezcla bruta se purificó m ediante crom atografía en colum na de gel de sílice y se eluyó usando EtO Ac al 35 -50 % en hexano para producir un com puesto 122 (15 ,50 g, 78 ,13 % ) . La estructura se confirmó m ediante L C M S y a ná lis is de 1H NM R. M asa m/z 589.3 [M+H]+.
S e añadió una solución de LiO H (92 ,15 mmol) en agua (20 ml) y T H F (10 ml) a una solución enfriada del Com puesto 122 (7,75 g, 13 ,16 mmol) disuelto en metanol (15 ml). La m ezcla de la reacción se agitó a temperatura am biente durante 45 min. y se monitorizó por T L C (EtO A c: hexano; 1 :1). La m ezcla de la reacción se concentró a la mitad del volum en a presión reducida. La solución restante se enfrió en un baño de hielo y se neutralizó añadiendo H C l concentrado. La m ezcla de la reacción se diluyó, se extrajo con EtO Ac (120 ml) y se lavó con salm uera (100 ml). S e formó una em ulsión y se aclaró tras reposar durante la noche. La ca p a orgánica se separó y se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó para producir el Com puesto 123 (8,42 g). La sal residual e s la ca u sa probable del exceso de m asa. L C M S es consistente con la estructura. El producto se usó sin m ás purificación. M .W .cal: 574 ,36 ; M.W.fd: 575 ,3 [M+H]+.
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El Com puesto 126 se sintetizó siguiendo el procedimiento descrito en la bibliografía (J. Am. Chem . Soc.
20 11, 133 , 958-963).
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S e disolvieron el Com puesto 123 (7 ,419 g, 12 ,91 mmol), HOBt (3,49 g, 25 ,82 mmol) y el Com puesto 126 (6,33 g, 16 ,14 mmol) y D M F (40 ml) y la m ezcla de la reacción resultante se enfrió en un baño de hielo. A esto se le añadieron N ,N -diisopropiletilam ina (4,42 ml, 25 ,82 mmol), PyBop (8,7 g, 16 ,7 mmol) seguido de reactivo de acoplam iento Bop ( 1, 17 g, 2,66 mmol) en una atm ósfera de argón. S e retiró el baño de hielo y se dejó calentar la solución a tem peratura ambiente. L a reacción se completó después de 1 h según se determinó por T L C (D CM :M eO H :A A ; 89 :10 :1) . La reacción de la m ezcla se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en EtO Ac (200 ml) y se lavó con N aH SO 4 1M (3 x 100 ml), N aH CO 3 acuoso saturado (3 x 100 ml) y salm uera (2 x 100 ml). La fase orgánica sep arada se secó (Na2 S O 4 ), se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante crom atografía en colum na de gel de s ílice con un gradiente del 50 % de h exa n o s/EtO A C al 100 % de EtO Ac para producir el Com puesto 127 (9,4 g) como una esp um a blanca. L C M S y 1H NM R fueron consistentes con la estructura. M asa m/z 778 ,4 [M+H]+.
S e añadió ácido trifluoroacético (12 ml) a una solución del Com puesto 127 (1,57 g, 2 ,02 mmol) en diclorometano (12 ml) y se agitó a tem peratura ambiente durante 1 h. La m ezcla de la reacción se coevaporó con tolueno (30 ml) a presión reducida hasta la sequedad. El residuo obtenido se coevaporó dos ve ce s con acetonitrilo (30 ml) y tolueno (40 ml) para producir el Com puesto 128 (1,67 g) como sal de trifluoroacetato y se usó para el siguiente paso sin purificación adicional. L C M S y 1H NM R fueron consistentes con la estructura. M asa m/z 478 ,2 [M+H]+.
Se combinaron el Compuesto 7 (0,43 g, 0,963 mmol), HATU (0,35 g, 0,91 mmol), y HOAt (0,035 g, 0,26 mmol) y se secaron durante 4 h sobre P2O5 a presión reducida en un matraz de fondo redondo y luego se disolvieron en DMF anhidro (1 ml) y se agitaron durante 5 min. A esto se le añadió una solución del Compuesto 128 (0,20 g, 0,26 mmol) en DMF anhidro (0,2 ml) y N,N-diisopropiletilamina (0,2 ml). La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de argón. La reacción se completó después de 30 min como se determinó mediante LCMS y TLC (MeOH/DCM al 7%). La mezcla de la reacción se concentró a presión reducida. El residuo se disolvió en DCM (30 ml) y se lavó con NaHSO41M (3 x 20 ml), NaHCO3 acuoso saturado (3 x 20 ml) y salmuera (3 x 20 ml). La fase orgánica se separó, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice usando MeOH al 5-15% en diclorometano para producir el Compuesto 129 (96,6 mg). LC MS y 1H NMR son consistentes con la estructura. Masa m/z 883,4 [M+2H]+.
El Compuesto 129 (0,09 g, 0,051 mmol) se disolvió en metanol (5 ml) en un vial de centelleo de 20 ml. A esto se le añadió una pequeña cantidad de Pd/C al 10% (0,015 mg) y el recipiente de reacción se purgó con gas de H2. La mezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo una atmósfera de H2 durante 18 h. La mezcla de la reacción se filtró a través de una almohadilla de celite y la almohadilla de celite se lavó con metanol. Los lavados del filtrado se combinaron y se concentraron a presión reducida para producir el Compuesto 130 (0,08 g). LCMS y 1H NMR fueron consistentes con la estructura. El producto se usó sin purificación adicional. Masa m/z 838,3 [M+2H]+.
A un matraz de fondo redondo puntiagudo de 10 ml se le añadieron el Compuesto 130 (75,8 mg, 0,046 mmol), piridina 0,37 M/DMF (200 gl) y una barra de agitación. A esta solución se le añadió gota a gota trifluoroacetato de pentafluorofenilo 0,7 M/DMF (100 gl) con agitación. La reacción se completó después de 1 h como se determinó por LC MS. El solvente se eliminó a presión reducida y el residuo se disolvió en CHCl3 (~10 ml). La capa orgánica se repartió entre NaHSO4 (1 M, 10 ml), NaHCO3 acuoso saturado (10 ml) y salmuera (10 ml) tres veces cada uno. La fase orgánica se separó y se secó sobre Na2SO4., se filtró y se concentró para producir el Compuesto 131 (77,7 mg). LCMS es consistente con la estructura. Se usó sin purificación adicional. Masa m/z 921,3 [M+2H]+.
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El Compuesto oligomérico 132, que comprende un grupo conjugado GalNAc3-5, se preparó usando los procedimientos generales ilustrados en el Ejemplo 46. La porción de agrupación de GalNAc3 del grupo conjugado GalNAc3-5 (GalNAc3-5a) puede combinarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P(=O)(OH)-Ad-P(=O)(OH)-.
La estructura de GalNAc3-5 (GalNAc3-5a-CM-) se muestra a continuación:
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Ejemplo 50: Preparación del Oligonucleótidos 144 que comprende GalNAc4-11
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1 4 2
S ín te sis del Com puesto 134. A un matraz Merrifield se añadió resina VIM A D de aminometil (2,5 g, 450 pmol/g) que se lavó con acetonitrilo, dimetilformamida, diclorometano y acetonitrilo. La resina se hinchó en acetonitrilo (4 ml). El Com puesto 133 se preactivó en un matraz de fondo redondo de 100 ml añadiendo 20 (1,0 mmol, 0 ,747 g), T B T U (1,0 mmol, 0 ,321 g), acetonitrilo (5 ml) y D IEA (3,0 mmol, 0,5 ml). Esta solución se dejó agitar durante 5 min y luego se añadió al matraz Merrifield con agitación. S e dejó agitar la suspensión durante 3 h. S e drenó la m ezcla de la reacción y se lavó la resina con acetonitrilo, DM F y D CM . La nueva carga de resina se cuantificó m idiendo la abso rbancia del catión de DM T a 500 nm (coeficiente de extinción = 76000) en DCM y se determinó que era 238 pmol/g. La resina se tapo suspendiendo en solución anhidra acética durante diez minutos tres veces.
El Com puesto 141 unido al soporte sólido se sintetizó usando métodos iterativos de sín tesis de péptidos en fa se sólida basad o s en Fm oc. S e retiró una pequeña cantidad de soporte sólido y se suspendió en am oniaco acuoso ( 28 -30 % en peso) durante 6 h. El Com puesto escindido se analizó mediante L C -M S y la m asa observada fue consistente con la estructura. M asa m/z 1063,8 [M+2H]+.
El Com puesto 142 unido al soporte sólido se sintetizó usando métodos de sín tesis de péptidos en fase sólida.
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El Com puesto 143 unido al soporte sólido se sintetizó usando sín tesis en fase sólida estándar en un sintetizador de ADN.
El Com puesto 143 unido al soporte sólido se suspendió en am oniaco acuoso ( 28 -30 % en peso) y se calentó a 55 ° C durante 16 h. La solución se enfrió y el soporte sólido se filtró. El filtrado se concentró y el residuo se disolvió en agua y se purificó por H P L C en una colum na de intercambio aniónico fuerte. Las fracciones que contenían el com puesto 144 de longitud com pleta se com binaron y se desalaron. El com puesto oligomérico conjugado G a lN A c 4 -11 resultante se analizó por L C -M S y la m asa observada fue consistente con la estructura.
La porción de agrupación de GalN A c4 del grupo conjugado G alN A c4-1 (G alN A c4 -11a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-.
La estructura de G a lN A c 4 -11 G alN A c4 -11a -C M se m uestra a continuación:
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Ejemplo 51: Preparación del Oligonucleótido 155 que comprende GalNAc3-6
Figure imgf000132_0002
El Com puesto 146 se sintetizó como se describe en la bibliografía (Analytical Biochem istry 1995, 229, 54 ­ 60).
Figure imgf000133_0001
E
Figure imgf000133_0002
Figure imgf000133_0003
El Com puesto 4 (15 g, 45 ,55 mmol) y el Com puesto 35b (14 ,3 gram os, 57 mmol) se disolvieron en C H 2 C I2 (200 ml). S e añadieron tam ices m oleculares activados (4 Á. 2 g, en polvo) y se dejó agitar la reacción durante 30 minutos bajo una atm ósfera de nitrógeno. S e añadió T M S -O T f (4,1 ml, 22 ,77 mmol) y se dejó agitar la reacción a temperatura ambiente durante la noche. T ra s com pletarse, la reacción se inactivó vertiéndola en N aH CO 3 acuoso saturado (500 ml) y hielo triturado ( ~ 150 g). La cap a orgánica se separó, se lavó con salm uera, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró hasta un aceite naranja a presión reducida. El material bruto se purificó mediante crom atografía en colum na de gel de sílice y se eluyó con M eOH al 2 - 10 % en C H 2 C l2 para dar el Com puesto 112 (16 ,53 g, 63 % ) . L C M S y 1H NM R fueron consistentes con el com puesto esperado.
S e disolvió el Com puesto 112 (4 ,27 g, 7 ,35 mmol) en M eO H /EtO A c 1 :1 (40 ml). La m ezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. S e añadió catalizador de Pearlm an (hidróxido de paladio sobre carbono, 400 mg) y se burbujeó g as hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez com pletada (T L C MeOH al 10 % en C H 2 C L y L C M S ), el catalizador se eliminó mediante filtración a través de una alm ohadilla de celite. El filtrado se concentró m ediante evaporación rotatoria y se secó brevemente a vacío alto para producir el Com puesto 105 a (3,28 g). L C M S y 1H NM R fueron consistentes con el producto deseado.
S e disolvió el Com puesto 147 (2,31 g, 11 mmol) en DM F anhidro (100 ml). S e añadió N ,N -diisopropiletilam ina (D IEA , 3,9 ml, 22 mmol), seguido de H B TU (4 g, 10 ,5 mmol). S e dejó agitar la m ezcla de la reacción durante aproxim adam ente ~ 15 minutos bajo nitrógeno. A esto se le añadió una solución del com puesto 105 a (3,3 g, 7,4 mmol) en DM F seco y se agitó durante 2 h bajo una atm ósfera de nitrógeno. La reacción se diluyó con EtO Ac y se lavó con N aH CO 3 acuoso saturado y salm uera. La fase orgánica se separó, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta un jarabe de naranja. El material en bruto se purificó por crom atografía en colum na de M eOH al 2 - 5 % en C H 2 C l2 para producir el Com puesto 148 (3,44 g, 73 % ) . L C M S y 1H NM R fueron consistentes con el producto esperado.
S e disolvió el com puesto 148 (3,3 g, 5 ,2 mmol) en M eO H /EtO A c 1 :1 (75 ml). La m ezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. S e añadió catalizador de Pearlm an (hidróxido de paladio sobre carbono) (350 mg). S e burbujeó g a s de hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez com pletada (T L C M eOH al 10 % en DCM y L C M S ), el catalizador se eliminó por filtración a través de una alm ohadilla de celite. El filtrado se concentró m ediante evaporación rotatoria y se secó brevemente a vacío alto para producir el Com puesto 149 (2,6 g). L C M S fue consistente con el producto deseado. El residuo se disolvió en D M F seco (10 ml) y se usó inm ediatam ente en el siguiente paso.
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Se disolvió el Compuesto 146 (0,68 g, 1,73 mmol) en DMF seco (20 ml). A esto se le añadieron DIEA (450 gl, 2,6 mmol, 1,5 eq.) y HBTU (1,96 g, 0,5,2 mmol). La mezcla de la reacción se dejó agitar durante 15 minutos a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Se añadió una solución del compuesto 149 (2,6 g) en DMF anhidro (10 ml). El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de DIEA (si era necesario). La reacción se dejó agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 h. Una vez completada, la reacción se diluyó con EtOAc (100 ml) y se lavó con NaHCO3 acuoso saturado, seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSO4, se filtró y se concentró. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice y se eluyó con MeOH al 2-10% en CH2Cl2 para producir el Compuesto 150 (0,62 g, 20%). LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto deseado.
Se disolvió el Compuesto 150 (0,62 g) en 1:1 de MeOH/EtOAc (5 l). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (60 mg). Se burbujeó gas hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración (filtro de teflón con punta de jeringa, 0,45 gm). El filtrado se concentró mediante evaporación rotatoria y se secó brevemente a vacío alto para producir el Compuesto 151 (0,57 g). La LCMS fue consistente con el producto deseado. El producto se disolvió en 4 ml de DMF seco y se usó inmediatamente en el paso siguiente.
Figure imgf000135_0001
Se disolvió el Compuesto 83a (0,11 g, 0,33 mmol) en DMF anhidro (5 ml) y se añadieron N,N-diisopropiletilamina (75 gl, 1 mmol) y PFP-TFA (90 gl, 0,76 mmol). La mezcla de la reacción se volvió magenta al entrar en contacto y gradualmente se volvió naranja durante los siguientes 30 minutos. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada (formación del éster de PFP), se añadió una solución del compuesto 151 (0,57 g, 0,33 mmol) en DMF. El pH de la reacción se ajustó a pH = 9-10 mediante la adición de N,N-Diisopropiletilamina (si era necesario). La mezcla de la reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~30 min. Una vez completada, se eliminó la mayor parte del solvente a presión reducida. El residuo se diluyó con CH2CL y se lavó con NaHCÜ3 acuoso saturado., seguido de salmuera. La fase orgánica se separó, se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se concentró hasta un jarabe de color naranja. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH al 2-10% en CH2CL) para producir el Compuesto 152 (0,35 g, 55%). LCMS y 1H NMR fueron consistentes con el producto deseado.
Se disolvió el Compuesto 152 (0,35 g, 0,182 mmol) en MeOH/EtOAc 1:1 (10 ml). La mezcla de la reacción se purgó burbujeando una corriente de argón a través de la solución durante 15 minutos. Se añadió catalizador de Pearlman (hidróxido de paladio sobre carbono) (35 mg). Se burbujeó gas de hidrógeno a través de la solución durante 30 minutos. Una vez completada (TLC MeOH al 10% en DCM y LCMS), el catalizador se eliminó por filtración (filtro de teflón con punta de jeringuilla, 0,45 gm). El filtrado se concentró mediante evaporación rotatoria y se secó brevemente a vacío alto para producir el Compuesto 153 (0,33 g, cuantitativo). La LCMS fue consistente con el producto deseado.
Se disolvió el Compuesto 153 (0,33 g, 0,18 mmol) en DMF anhidro (5 ml) con agitación bajo nitrógeno. A esto se le añadieron N,N-Diisopropiletilamina (65 gl, 0,37 mmol) y PFP-TFA (35 gl, 0,28 mmol). La mezcla de la reacción se agitó bajo nitrógeno durante ~30 min. La mezcla de la reacción se volvió magenta al entrar en contacto y gradualmente se volvió naranja. El pH de la mezcla de la reacción se mantuvo a pH = 9-10 añadiendo N,N-diisopropiletilamina adicional. El progreso de la reacción se monitorizó mediante TLC y LCMS. Una vez completada, se eliminó la m ayor parte del solvente a presión reducida. El residuo se diluyó con C H 2 C I2 (50 ml) y se lavó con N aH CÜ 3 acuoso saturado, seguido de salm uera. La cap a orgánica se secó sobre MgSÜ4, se filtró y se concentró hasta obtener un jarabe de naranja. El residuo se purificó por crom atografía en colum na y se eluyó con M eOH al 2 -10 % en C H 2 C l2 para producir el Com puesto 154 (0,29 g, 79 % ) . L C M S y 1H NM R fueron consistentes con el producto deseado.
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El Com puesto oligom érico 155 , que com prende un grupo conjugado G alN A c3-6, se preparó usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 46. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G alN A c3-6 (GalNAc3-6a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-.
La estructura de G alN A c3-6 (G alN A c3-6a-CM -) se m uestra a continuación:
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Ejemplo 52: Preparación de Oligonucleótido 160 que comprende GalNAc3-9
Figure imgf000137_0001
El Com puesto 156 se sintetizó siguiendo el procedimiento descrito en la bibliografía (J. Med. Chem . 2004, 47, 5798-5808).
S e disolvió el Com puesto 156 (18 ,60 g, 29 ,28 mmol) en metanol (200 ml). S e añadió paladio sobre carbono (6 ,15 g, 10 % en peso, carga (base seca), polvo de carbono de matriz, húmedo). La m ezcla de la reacción se agitó a temperatura ambiente bajo hidrógeno durante 18 h. La m ezcla de la reacción se filtró a través de un alm ohadilla de celite y el alm ohadilla de celite se lavó a fondo con metanol. El filtrado com binado se lavó y se concentró hasta la sequedad. El residuo se purificó m ediante crom atografía en colum na de gel de sílice y se eluyó con metanol al 5 -10 % en diclorometano para producir el Com puesto 157 (14 ,26 g, 89 % ) . M asa m/z 544,1 [M -H ]-.
S e disolvió el Com puesto 157 (5 g, 9 ,17 mmol) en DM F anhidro (30 ml). S e añadieron H B TU (3,65 g, 9,61 mmol) y N,N-diisopropiletilam ina (13 ,73 ml, 78,81 mmol) y la m ezcla de la reacción se agitó a temperatura am biente durante 5 minutos. A esto se le añadió una solución del com puesto 47 (2,96 g, 7,04 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 8 h. La m ezcla de la reacción se vertió en una solución acuo sa de N aH CO 3 saturada. La m ezcla se extrajo con acetato de etilo y la ca p a orgánica se lavó con salm uera y se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El residuo obtenido se purificó m ediante crom atografía en colum na de gel de sílice y se eluyó con acetato de etilo al 50 % en hexano para producir el Com puesto 158 (8,25 g, 73 ,3 % ) . La estructura fue confirm ada por M S y a ná lis is 1H NMR.
S e secó el Com puesto 158 (7,2 g, 7 ,61 mmol) sobre P 2 O 5 a presión reducida. El com puesto seco se disolvió en D M F anhidro (50 ml). A esto se le añadieron 1H -tetrazol (0,43 g, 6,09 mmol) y N-m etilim idazol (0,3 ml, 3,81 mmol) y 2-cianoetil-N,N,N',N'-tetraisopropil fosforodiamidita (3,65 ml, 11 ,50 mmol). La m ezcla de la reacción se agitó bajo una atm ósfera de argón durante 4 h. La m ezcla de la reacción se diluyó con acetato de etilo (200 ml). La m ezcla de la reacción se lavó con N aH CO 3 saturado y salm uera. La fase orgánica se separó, se secó (Na2SO4), se filtró y se evaporó. El residuo se purificó m ediante crom atografía en colum na de gel de sílice y se eluyó con acetato de etilo al 50 -90 % en hexano para producir el Com puesto 159 (7,82 g, 80 ,5 % ). La estructura se confirmó por L C M S y a ná lis is 31P NMR.
Figure imgf000138_0002
El Com puesto oligom érico 160, que com prende un grupo conjugado G alN A c3-9, se preparó usando procedim ientos de sín tesis de oligonucleótidos estándar. S e acoplaron tres unidades del com puesto 159 al soporte sólido, seguido de fosforam iditas de nucleótidos. El tratamiento del com puesto oligomérico protegido con am oniaco acuoso proporcionó elcCom puesto 160. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G alN A c3-9 (GalNAc3-9a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G alN A c3-9 (G alN Ac3-9a-CM ) se m uestra a continuación:
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Ejemplo 53: Procedimiento alternativo para la preparación del Compuesto 18 (GalNAc3-1a y GalNAc3-3a)
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S e hizo reaccionar lactona 161 con diam inopropano (3-5 eq) o diam inopropano protegido con M ono-Boc (1 eq) para proporcionar alcohol 162 a o 162b . Cuando se usó propanodiam ina desprotegida para la reacción anterior, el exceso de diam ina se elim inó por evaporación a vacío alto y el grupo am ino libre en 162 a se protegió usando C b z C l para proporcionar 162b como un sólido blanco d esp ués de purificación por crom atografía en colum na. El alcohol 162b se hizo reaccionar adicionalm ente con el Com puesto 4 en presencia de T M S O T f para proporcionar 163 a que se convirtió en 163b m ediante la elim inación del grupo C b z usando hidrogenación catalítica. El éster de pentafluorofenilo (P FP ) 164 se preparó haciendo reaccionar el triácido 113 (ver el Ejem plo 48) con P F P T F A (3,5 eq) y piridina (3,5 eq) en D M F (0,1 a 0,5 M). El triéster 164 se hizo reaccionar directam ente con la am ina 163 b (3-4 eq) y D IP E A (3-4 eq) para proporcionar el Com puesto 18. El método anterior facilita en gran m edida la purificación de productos intermedios y m inim iza la formación de subproductos que se forman usando el procedimiento descrito en el Ejem plo 4.
Ejemplo 54: Procedimiento alternativo para la Preparación del Compuesto 18 (GalNAc3-1a y GalNAc3-3a)
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El éster de triP F P 164 se preparó a partir del ácido 113 usando el procedimiento descrito en el ejem plo 53 anterior y se hizo reaccionar con d iam ina protegida con m ono-Boc para proporcionar 165 con un rendimiento esencialm ente cuantitativo. Lo s grupos Boc se elim inaron con ácido clorhídrico o ácido trifluoroacético para proporcionar la triam ina que se hizo reaccionar con el ácido 166 activado por P F P en presencia de una base ad ecu ad a como D IP E A para proporcionar el Com puesto 18.
El ácido de G a l-N A c protegido con P F P 166 se preparó a partir del ácido correspondiente mediante tratamiento con P F P T F A ( 1 - 1,2 eq) y piridina ( 1 - 1,2 eq) en DM F. El ácido precursor a su vez se preparó a partir del alcohol correspondiente m ediante oxidación usando T E M P O (0,2 eq) y B A IB en acetonitrilo y agua. El alcohol precursor se preparó a partir del a zú ca r intermedio 4 m ediante reacción con 1,6 -hexanodiol (o 1,5-pentanodiol u otro diol para otros valores de n) (2-4 eq) y T M S O T f usando las condiciones descritas anteriormente en el ejem plo 47. Ejemplo 56: Estudio dependiente de la dosis de oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado 3' o 5' (comparación de GalNAc3 -1,2, 3, 5, 6, 7 y 10) dirigido a SRB-1 in vivo
Los oligonucleótidos enum erados a continuación se probaron en un estudio dependiente de la d osis para la inhibición antisentido de S R B -1 en ratones. IS IS 353382 no conjugado se incluyó com o estándar. C a d a uno de los varios grupos conjugados de G alN A c3 se unió al extremo terminal 5' del oligonucleótido respectivo m ediante un nucleósido de 2'-desoxiad eno sina enlazado por fosfodiéster (fracción escindible) excepto para IS IS 655861 que tenía el grupo conjugado GalN A c3 unido en el extremo terminal 3 ’.
Tabla 42
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Las letras mayúsculas indican la nucleobase de cada nucleósido y mC indica una 5-metilcitosina. Subíndices: "e" indica un nucleósido modificado con 2'-MOE; "d" indica un P-D-2'-desoxirribonucleósido; "s" indica un enlace internucleosídico de fosforotioato (PS); “o” indica un enlace internucleosídico de fosfodiéster (PO); y “o' ” indica -O-P(=O)(OH)-. Los grupos conjugados están en negrita.
La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9. La estructura de GalNAc3-2a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 37. La estructura de GalNAc3-3a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 39. La estructura de GalNAc3-5a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 49. La estructura de GalNAc3-6a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 51. La estructura de GalNAc3-7a f se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 48. La estructura de GalNAc3-10a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 46.
Tratamiento
Se inyectó subcutáneamente una vez ratones Balb/c macho de seis semanas de edad (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a la dosis mostrada a continuación con ISIS 353382, 655861, 664507, 661161, 666224, 666961, 666981, 666881 o con solución salina. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final para determinar los niveles de ARNm de SRB-1 hepático usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje omedio de los niveles de ARNm de SRB-1 para cada grupo de tratamiento, normalizados al control de solución salina.
Como se ilustra en la Tabla 43, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de ARNm de SRB-1 de una manera dependiente de la dosis. De hecho, los oligonucleótidos antisentido conjugados mostraron una mejora sustancial en la potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido no conjugado (ISIS 353382). Los oligonucleótidos antisentido conjugados en 5' mostraron un ligero aumento de potencia en comparación con el oligonucleótido antisentido conjugado en 3'.
Tabla 43
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S e midieron los niveles de transam inasas hepáticas, a lanina am inotransferasa (ALT) y aspartato am inotransferasa (A ST), en suero con respecto a los ratones inyectados con solución sa lin a usando protocolos estándar. Tam bién se evaluaron la bilirrubina total y el BUN. El cam bio en el peso corporal se evaluó sin cam bios significativos con respecto al grupo de solución salina. Los valores de A L T , A S T , bilirrubina total y BUN se muestran \4 a continuación.
Tabla 44
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Preparación del compuesto oligomérico 175 que comprende GalNAc3-12
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El Com puesto 169 está disponible com ercialm ente. El Com puesto 172 se preparó mediante la adición de bencil(perfluorofenil) glutarato al Com puesto 171. El bencil(perfluorofenil) glutarato se preparó añadiendo P F P -T F A y D IEA a ácido 5-(benciloxi)-5-oxopentanoico en DM F. Com puesto oligom érico 175 , que com prende un grupo conjugado G a lN A c3 -12 , se preparó a partir del Com puesto 174 usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 46. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c 3 -12 (G alN A c3-12a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible e s -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G a lN A c 312 (G alN A c3-12a-C M -) se m uestra a continuación:
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Ejemplo 62: Preparación del compuesto oligomérico 180 que comprende GalNAc3-13
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El Com puesto 176 se preparó usando el procedimiento general mostrado en el Ejem plo 2. E L com puesto oligomérico 180, que com prende un grupo conjugado G a lN A c 3 -13 , se preparó a partir del Com puesto 177 usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 49. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c 3 -13 (G alN A c3-13a ) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G a lN A c 3 -13 (G alN A c3-13a -C M -) se m uestra a continuación:
Figure imgf000149_0001
Ejemplo 63: Preparación del compuesto oligomérico 188 que comprende GalNAc3-14
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187
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Los Com puestos 181 y 185 están disponibles com ercialm ente. El com puesto oligomerico 188, que com prende un grupo conjugado G a lN A c3 -14 , se preparó a partir del com puesto 187 usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 46. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c3 -14 (G alN A c3-14a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G alN A c3-14 (G alN A c3-14 a-C M -) se m uestra a continuación:
Figure imgf000151_0002
Ejemplo 64: Preparación del compuesto oligomérico 197 que comprende GalNAc3-15
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194
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El Com puesto 189 está disponible com ercialm ente. Com puesto 195 se preparó usando el procedimiento general mostrado en el Ejem plo 31. El com puesto oligomérico 197 , que com prende un grupo conjugado G a lN A c3 -15 , se preparó a partir de los com puestos 194 y 195 usando procedim ientos de s ín tesis de oligonucleótidos estándar. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c 3 -15 (G alN A c3-15a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizacio nes, la fracción escindible es -P (=O )(O H )-A d -P (= O )(O H )-. La estructura de G a lN A c 3 -15 (G alN A c3-15a -C M -) se m uestra a continuación:
Figure imgf000153_0002
Ejemplo 67: Preparación del compuesto oligomérico 199 que comprende GalNAc3-16
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AcHN 199
El com puesto oligom érico 199, que com prende un grupo conjugado G a lN A c3-16 , se prepara usando los procedim ientos generales ilustrados en los Ejem plos 7 y 9. La porción de agrupación de GalN A c3 del grupo conjugado G a lN A c3 -16 (G alN Ac3-16a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible e s -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G a lN A c3 -16 (G alN A c3-16 a-C M -) se m uestra a continuación:
Figure imgf000155_0001
Ejemplo 68: Preparación del compuesto oligomérico 200 que comprende GalNAc3-17
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200
El com puesto oligom érico 200, que com prende un grupo conjugado G a lN A c3 -17 , se preparó usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 46. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c 3 -17 (G alN A c3-17a) puede com binarse con cualquier escindible fracción para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G a lN A c 3 -17 (G alN A c3-17a -C M -) se m uestra a continuación:
Figure imgf000155_0002
Ejemplo 69: Preparación del compuesto oligomérico 201 que comprende GalNAc3-18
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AcHN 201
El com puesto oligom érico 201, que com prende un grupo conjugado G a lN A c3 -18 , se preparó usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 46. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c3 -18 (G alN Ac3-18a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible es -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G a lN A c3 -18 (G alN A c3-18 a-C M -) se m uestra a continuación:
Figure imgf000156_0001
Ejemplo 70: Preparación del compuesto oligomérico 204 que comprende GalNAc3-19
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Figure imgf000157_0002
El com puesto oligom érico 204, que com prende un grupo conjugado G a lN A c3 -19 , se preparó a partir del com puesto 64 usando los métodos generales ilustrados en el Ejem plo 52. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c3 -19 (G alN Ac3-19a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible e s -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G a lN A c3 -19 (G alN A c3-19a-C M -) se m uestra a continuación:
Figure imgf000158_0001
Ejemplo 71: Preparación del compuesto oligomérico 210 que comprende GalNAc3-20
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El Com puesto 205 se preparó añadiendo P F P -T F A y D IE A a ácido 6-(2,2,2-trifluoroacetam ido)hexanoico en acetonitrilo, que se preparó añadiendo anhídrido tríflico al ácido 6-am inohexanoico. La m ezcla de la reacción se calentó a 80° C y luego se bajó a rt. El com puesto oligomérico 210 , que com prende un grupo conjugado G alN A c3-20, se preparó a partir del com puesto 208 usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 52. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c3-20 (GalNAc3-20a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible e s P(=O )(O H )-A d-P(=O O H -. La estructura de G alN A c3-20 G alN A c3-20a-CM - se m uestra a continuación:
Figure imgf000160_0001
Ejemplo 72: Preparación del compuesto oligomérico 215 que comprende GalNAc3-21
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215
El Com puesto 211 está disponible com ercialm ente. El com puesto oligomérico 215 , que com prende un grupo conjugado G a lN A c 3 -21, se preparó a partir del com puesto 213 usando los procedim ientos generales ilustrados en el Ejem plo 52. La porción de agrupación de GalN A c3 del grupo conjugado G a lN A c3-21 (G alN A c3-21a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindióle e s -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G a lN A c3-21 (G alN A c3-21a-C M -) se m uestra a continuación:
Figure imgf000162_0001
Ejemplo 73: Preparación del compuesto oligomérico 221 que comprende GalNAc3-22
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El Com puesto 220 se preparó a partir del com puesto 219 usando tetrazoluro de diisopropilam onio. El com puesto oligom érico 221, que com prende un grupo conjugado G a lN A c 3 -21, se prepara a partir del Com puesto 220 usando el procedimiento general ilustrado en el Ejem plo 52. La porción de agrupación de GalN A c3 del grupo conjugado G a lN A c3 -22 (G alN A c3-22a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, la fracción escindible e s -P (=O )(O H )-A d -P (=O )(O H )-. La estructura de G a lN A c3 -22 (G alN A c3-22a-C M -) se m uestra a continuación:
Figure imgf000164_0001
Ejemplo 75: Análisis farmacocinético de oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado 5'
La P K de los A S O en las T a b la s 54, 57 y 60 anteriores se evaluó usando m uestras de hígado que se obtuvieron siguiendo los procedim ientos de tratamiento descritos en los Ejem plos 65, 66 y 74. L a s m uestras de hígado se trituraron y extrajeron usando protocolos estándar y se analizaron por IP - H P L C -M S junto con un estándar interno. El nivel tisular com binado (pg/g) de todos los metabolitos se midió integrando los picos U V apropiados, y se midió el nivel tisular del A S O completo que faltaba el conjugado ("original", que en este ca so e s Isis N ° 353382) usando los crom atogram as de iones extraídos (E IC ) apropiados.
Tabla 63
Figure imgf000164_0002
continuación
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Los resultados en la T a b la 63 anterior muestran que hubo m ayores niveles en tejido hepático de los oligonucleótidos que com prenden un grupo conjugado de G alN A c3 que del oligonucleótido original que no com prende un grupo conjugado de G alN A c3 (IS IS 353382) 72 horas d esp ués de la adm inistración de oligonucleótidos, particularmente cuando se toma en consideración las d iferencias en la dosificación entre los oligonucleótidos con y sin un grupo conjugado de G alN A c3. A dem ás, a las 72 horas, el 40 -98 % de cad a oligonucleótido que com prende un grupo conjugado de G alN A c3 se metabolizó al com puesto original, lo que indica que los grupos conjugados de G alN A c3 se escindieron de los oligonucleótidos.
Ejem plo 76: Preparación del com puesto oligom érico 230 que com prende G a lN A c3-23
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)fi-NH
1. Tampón de borato, DMSO, pH 8.5, rt
2. Amoniaco ac., rt
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NHAc 230
El Compuesto 222 está disponible comercialmente. Se trataron 44,48 ml (0,33 mol) del compuesto 222 con cloruro de tosilo (25,39 g, 0,13 mol) en piridina (500 ml) durante 16 horas. Después, la reacción se evaporó hasta un aceite, se disolvió en EtOAc y se lavó con agua, NaHCO3 saturado, salmuera y se secó sobre Na2SO4. El acetato de etilo se concentró hasta la sequedad y se purificó mediante cromatografía en columna, se eluyó con EtOAc/hexanos (1:1) seguido de metanol al 10% en CH2Cl2 para dar el compuesto 223 como un aceite incoloro. LCMS y NMR fueron consistentes con la estructura. Se trataron 10 g (32,86 mmol) de 1-Tosiltrietilen glicol (compuesto 223) con azida de sodio (10,68 g, 164,28 mmol) en DMSO (100 ml) a temperatura ambiente durante 17 horas. La mezcla de la reacción se vertió sobre agua, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua tres veces y se secó sobre Na2SO4. La capa orgánica se concentró hasta la sequedad para dar 5,3 g del compuesto 224 (92%). LCMS y NMR fueron consistentes con la estructura. Se trataron 1-azidotrietilen glicol (compuesto 224, 5,53 g, 23,69 mmol) y el compuesto 4 (6 g, 18,22 mmol) con tamices moleculares 4A (5 g), y TMSOTf (1,65 ml, 9,11 mmol) en diclorometano (100 ml) bajo una atmósfera inerte. Después de 14 horas, la reacción se filtró para eliminar los tamices, y la capa orgánica se lavó con solución NaHCO3 saturado, agua, salmuera, y se secó sobre Na2SO4. La capa orgánica se concentró hasta la sequedad y se purificó por cromatografía en columna, se eluyó con un gradiente del 2 al 4% de metanol en diclorometano para dar el compuesto 225. LCMS y NMR fueron consistentes con la estructura. El Compuesto 225 (11,9 g, 23,59 mmol) se hidrogenó en EtOAc/metanol (4:1,250 ml) sobre catalizador de Pearlman. Después de 8 horas, el catalizador se eliminó por filtración y los solventes se eliminaron hasta la sequedad para dar el compuesto 226. LCMS y NMR fueron consistentes con la estructura.
Para generar el compuesto 227, se trató gota a gota una solución de ácido nitrometanotrispropiónico (4,17 g, 15,04 mmol) y base de Hunig (10,3 ml, 60,17 mmol) en DMF (100 ml) con acetato de pentaflorotrifluoro (9,05 ml, 52,65 mmol). Después de 30 minutos, la reacción se vertió en agua con hielo y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua, salmuera y se secó sobre Na2SO4.. La capa orgánica se concentró hasta la sequedad y luego se recristalizó en heptano para dar el compuesto 227 como un sólido blanco. LCMS y NMR fueron consistentes con la estructura. El compuesto 227 (1,5 g, 1,93 mmol) y el compuesto 226 (3,7 g, 7,74 mmol) se agitaron a temperatura ambiente en acetonitrilo (15 ml) durante 2 horas. Luego la reacción se evaporó hasta sequedad y se purificó por cromatografía en columna, eluyendo con un gradiente del 2 al 10% de metanol en diclorometano para dar el compuesto 228. LCMS y NMR fueron consistentes con la estructura. El compuesto 228 (1,7 g, 1,02 mmol) se trató con níquel Raney (aproximadamente 2 g húmedo) en etanol (100 ml) en una atmósfera de hidrógeno. Después de 12 horas, el catalizador se eliminó por filtración y la capa orgánica se evaporó hasta un sólido que se usó directamente en el paso siguiente. LCMS y NMR fueron consistentes con la estructura. Este sólido (0,87 g, 0,53 mmol) se trató con ácido bencilglutárico (0,18 g, 0,8 mmol), HBTU (0,3 g, 0,8 mmol) y DIEA (273,7 pl, 1,6 mmol) en DMF (5 ml). Después de 16 horas, el DMF se eliminó a presión reducida a 65° C hasta un aceite y el aceite se disolvió en diclorometano. La capa orgánica se lavó con NaHCO3 saturado, salmuera y se secó sobre Na2SO4. Después de la evaporación de la capa orgánica, el compuesto se purificó mediante cromatografía en columna y se eluyó con un gradiente del 2 al 20% de metanol en diclorometano para dar el producto acoplado. LCMS y NMR fueron consistentes con la estructura. El éster bencílico se desprotegió con catalizador de Pearlman en atm ósfera de hidrógeno durante 1 hora. S e eliminó el catalizador por filtración y se elim inaron los solventes hasta sequedad para dar el ácido. L C M S y NM R fueron consistentes con la estructura. El ácido (486 mg, 0 ,27 mmol) se disolvió en DM F seco (3 ml). S e añadió piridina (53,61 gl, 0,66 mmol) y la reacción se purgó con argón. S e añadió lentamente acetato de pentaflorotrifluoro (46,39 gl, 0,4 mmol) a la m ezcla de la reacción. El color de la reacción cam bió de am arillo pálido a burdeos y emitió un humo ligero que fue arrastrado con una corriente de argón. S e dejó agitar la reacción a temperatura am biente durante una hora (se confirmó la finalización de la reacción mediante LC M S). El solvente se elim inó a presión reducida (rotavapor) a 70 ° C . El residuo se diluyó con DCM y se lavó con N aH SÜ 4 1N , salm uera, bicarbonato de sodio saturado y salm uera de nuevo. Los orgánicos se secaron sobre Na2SÜ4, se filtraron y se concentraron hasta la sequedad para dar 225 mg del com puesto 229 como una espum a am arilla quebradiza. L C M S y NM R fueron consistentes con la estructura.
El com puesto oligom érico 230, que com prende un grupo conjugado G alN A c3-23 , se preparó a partir del com puesto 229 usando el procedimiento general ilustrado en el Ejem plo 46. La porción de agrupación de G alN A c3 del grupo conjugado G a lN A c3-23 (G alN Ac3-23a) puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. La estructura de G a lN A c3-23 (G alN A c3-23a-CM ) se m uestra a continuación:
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Ejemplo 80: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a alfa-1 antitripsina (A1AT) que comprenden un conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enum erados en la T a b la 72 a continuación se probaron en un estudio para determ inar la inhibición dependiente de la dosis de A 1 A T en ratones.
Tabla 72
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La estructura de G a lN A c3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejem plo 9, G alN A c3-3a se ha mostrado en el Ejemplo 39, GalNAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48, GalNAc3-10a se ha mostrado en el Ejemplo 46, y GalNAc3-13a se ha mostrado en el Ejemplo 62.
Tratamiento
Se inyectaron a cada uno de los ratones C57BL/6 macho de seis semanas (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) por vía subcutánea una vez a la semana la dosis que se muestra a continuación, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 72 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la administración final. Los niveles de ARNm hepático de A1AT se determinaron usando PCR en tiempo real y reactivo de cuantificación de ARN RIBOGREEN® (Molecular Probes, Inc. Eugene, OR) de acuerdo con protocolos estándar. Los niveles de proteína en plasma de A1AT se determinaron usando el ELISA de alfa 1 -antitripsina de ratón (N° de catálogo 41-A1AMS-E01, Alpco, Salem, NH). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de ARNm y niveles de proteína plasmática hepáticos de A1AT para cada grupo de tratamiento, normalizados al control PBS.
Como se ilustra en la Tabla 73, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó los niveles de ARNm hepático de A1AT y de proteína plasmática de A1AT de una manera dependiente de la dosis. Los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc fueron significativamente más potentes que el original (ISIS 476366).
Tabla 73
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S e midieron los niveles de transam inasas hepáticas y BUN en plasm a en el momento del sacrificio usando protocolos estándar. Tam bién se midieron los pesos corporales y de los órganos. Los resultados se muestran en la T a b la 74 a continuación. El peso corporal se muestra como % con respecto al valor de referencia. Los pesos de los órganos se m uestran como % del peso corporal con respecto al grupo de control de P B S .
Tabla 74
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Ejemplo 81: Duración de la acción in vivo de oligonucleótidos dirigidos a A1AT que comprenden una agrupación de GalNAc3
Los oligonucleótidos enum erados en la Ta b la 72 se probaron en un estudio de dosis individual para determ inar la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
S e inyectó subcutáneam ente una vez a ratones C 57 B L /6 m acho de se is se m a n a s de edad ca d a uno con un oligonucleótido enum erado en la Ta b la 72 o con P B S . C a d a grupo de tratamiento co nsistía de 4 anim ales. S e extrajo sangre el d ía antes de la dosificación para determ inar el valor de referencia y a los 5, 12 , 19 y 25 d ía s d esp ués de la dosis. Los niveles de proteína A 1 A T en plasm a se midieron mediante E L IS A (ver el Ejem plo 80). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje promedio de los niveles de proteína A 1 A T en plasm a para ca d a grupo de tratamiento, norm alizados a los niveles de valor de referencia. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc eran más potentes y tenían una duración de acción más prolongada que el original que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 476366). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc (ISIS 678381, 678382, 678383, y 678384) fueron generalmente incluso más potentes con una duración de acción incluso más prolongada que el oligonucleótido que comprende conjugado 3’-GalNac (ISI 656326).
Tabla 75
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Ejemplo 83: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos al Factor XI que comprende una agrupación de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 a continuación se probaron en un estudio para determinar la inhibición dependiente de la dosis del Factor XI en ratones.
Tabla 77
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La estructura de GalNAc3-1a se ha mostrado anteriormente en el Ejemplo 9, GalNAc3-3a se ha mostrado en el Ejemplo 39, GalNAc3-7a se ha mostrado en el Ejemplo 48, GalNAc3-10a se ha mostrado en el Ejemplo 46, y GalNAc3 -13a se ha mostrado en el Ejemplo 62.
Tratamiento
A ratones de seis a ocho semanas de edad se les inyectó a cada uno por vía subcutánea una vez por semana a la dosis que se muestra a continuación, para un total de tres dosis, con un oligonucleótido enumerado a continuación o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Los ratones se sacrificaron 72 horas después de la dosis final. Los niveles de ARNm hepático del factor XI se midieron usando PCR en tiempo real y se normalizaron a ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. También se midieron las transaminasas hepáticas, BUN y bilirrubina. Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio para cada grupo de tratamiento, normalizado al control PBS.
Como se ilustra en la Tabla 78, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido disminuyó el ARNm hepático del Factor XI de una manera dependiente de la dosis. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc eran más potentes que el original que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron incluso más potentes que el oligonucleótido que comprende un conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 78
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Ejemplo 84: Duración de la acción in vivo de los oligonucleótidos dirigidos al Factor XI que comprenden un conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 77 se probaron en un estudio de dosis individual para determinar la duración de la acción en ratones.
Tratamiento
A ratones de seis a ocho semanas de edad se les inyectó subcutáneamente una vez a cada uno con un oligonucleótido enumerado en la Tabla 77 o con PBS. Cada grupo de tratamiento consistía de 4 animales. Se extrajo sangre por sangrado de la cola el día antes de la dosificación para determinar el valor de referencia y a los 3, 10 y 17 días después de la dosis. Los niveles de proteína del Factor XI en plasma se midieron mediante ELISA usando anticuerpos de captura y detección biotinilados de Factor XI de R & D Systems, Minneapolis, MN (N° de catálogo AF2460 y N° BAF2460, respectivamente) y conjunto de reactivos B OptEIA (N° de catálogo 550534, Bd Biosciences, San José, CA). Los resultados a continuación se presentan como el porcentaje medio de los niveles de proteína del Factor XI en plasma para cada grupo de tratamiento, normalizados a los niveles de valor de referencia. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc eran más potentes con una duración de acción más prolongada que el original que carece de un conjugado de GalNAc (ISIS 404071). Además, los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de 5'-GalNAc (ISIS 663086, 678347, 678348 y 678349) fueron incluso más potentes con una duración de acción incluso más prolongada que el oligonucleótido que comprende un conjugado de 3'-GalNAc (ISIS 656173).
Tabla 79
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Ejemplo 93: Inhibición antisentido in vivo por oligonucleótidos dirigidos a SRB-1 que comprenden alas mixtas y un conjugado de 5'-GalNAc3
Los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 100 se probaron en un estudio dependiente de la dosis para determinar la inhibición antisentido de SRB-1 en ratones.
Tabla 100
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La estructura de G alN A c3-3a se ha mostrado anteriormente en el Ejem plo 39, y la estructura de G a lN A c3-7a se ha mostrado anteriormente en el Ejem plo 48. S u b ín d ices: “e ” indica nucleósido modificado con 2'-M O E ; "d" indica p -D -2'-desoxirribonucleósido; "k" indica nucleósido bicíclico 6 '-(S)-C H 3 (cEt); "s" indica e n laces internucleosídicos de fosforotioato (P S); “o” indica e n laces internucleosídicos de fosfodiéster (PO). El superíndice "m" indica 5 -m etilcitosinas.
Tratamiento
S e inyectaron subcutáneam ente una vez a ratones C 57 B L /6 de se is a ocho sem a na s de edad (Jackson Laboratory, B ar Harbor, ME) a la dosis que se m uestra a continuación con un oligonucleótido enum erado en la Ta b la 100 o con solución salina. C a d a grupo de tratamiento co nsistía de 4 anim ales. Los ratones se sacrificaron 72 horas d esp u és de la adm inistración final. Los niveles de ARN m de S R B -1 hepático se midieron usando P C R en tiempo real. Los niveles de A RN m de S R B -1 se normalizaron a los niveles de A RN m de ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados se presentan com o el porcentaje medio de los niveles de A RN m de S R B -1 para ca d a grupo de tratamiento con respecto al grupo de control de solución salina. Com o se ilustra en la T a b la 101 , el tratamiento con oligonucleótidos antisentido redujo los niveles de A RN m de S R B -1 de una m anera dependiente de la dosis, y los oligonucleótidos gapm er que com prenden un conjugado de G a lN A c y que tienen a la s que eran m odificaciones de a zú ca r o c E T completo o mixtas fueron significativam ente m ás potentes que el oligonucleótido original que ca rece de un conjugado y com prende a las m odificadas con c E T completo.
Tam bién se midieron los pesos corporales, las transam inasas hepáticas, la bilirrubina total y el BUN, y los valores m edios para ca d a grupo de tratamiento se m uestran en la Ta b la 101. El peso corporal se m uestra como el porcentaje de peso corporal medio con respecto al peso corporal de referencia ( % P C ) medido justo antes de la dosis de oligonucleótidos.
Tabla 101
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Ejemplo 96: Unión a proteínas plasmáticas de oligonucleótidos antisentido que comprenden un grupo conjugado de GalNAc3
Los oligonucleótidos enum erados en la T a b la 70 que se dirigen a A poC-III y los oligonucleótidos en la Tab la 106 que se dirigen a Apo(a) se probaron en un ensayo de ultrafiltración para evaluar la unión a proteínas plasm áticas.
Tabla 106
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V e r el Ejem plo 74 para la leyenda de la tabla. La estructura de G alN A c3 -7 a se ha mostrado anteriornente en el Ejem plo 48.
S e preacondicionaron unidades de ultrafiltración Ultrafree-M C (30.000 NM W L, m em brana de celu lo sa regenerada de baja unión, Millipore, Bedford, MA) con 300 gl de Tw een 80 al 0 ,5 % y se centrifugaron a 2000 g durante 10 minutos, luego con 300 gl de un Solución de 300 gg/ml de un oligonucleótido de control en H2 O y se centrifugó a 2000 g durante 16 minutos. P a ra evalu ar la unión no e sp ecífica a los filtros de cad a oligonucleótido de prueba a partir de las T a b la s 70 y 106 a u sar en los estudios, se colocaron 300 gl de una solución 250 ng/ml de oligonucleótido en H 2 O a pH 7,4 en los filtros preacondicionados y se centrifugó a 2000 g durante 16 minutos. Las m uestras filtradas y no filtradas se analizaron mediante un ensayo E L IS A para determ inar las concentraciones de oligonucleótidos. S e usaron tres réplicas para obtener una concentración m edia para cad a muestra. La concentración m edia de la m uestra filtrada con respecto a la m uestra sin filtrar se usa para determ inar el porcentaje de oligonucleótido que se recupera a través del filtro en a usen cia de plasm a ( % de recuperación).
S e adquirieron m uestras de plasm a entero congelado recogidas en K 3 -E D T A de voluntarios hum anos, monos cinom olgus y ratones C D -1 norm ales libres de fárm acos de Bioreclam ation L L C (W estbury, NY). Los oligonucleótidos de prueba se añadieron a a lícuotas de plasm a de 1,2 ml a dos concentraciones (5 y 150 gg/ml). S e colocó una alícuota (300 gl) de ca d a m uestra de p lasm a enriquecida en una unidad de filtro preacondicionada y se incubó a 37 ° C durante 30 minutos, seguido inm ediatam ente de centrifugación a 2000 g durante 16 minutos. S e analizaron alícuotas de m uestras de plasm a enriquecidas filtradas y no filtradas mediante un E L IS A para determ inar la concentración de oligonucleótidos en cad a m uestra. S e usaron tres réplicas por concentración para determ inar el porcentaje medio de oligonucleótidos unidos y no unidos en cad a m uestra. La concentración m edia de la muestra filtrada con respecto a la concentración de la muestra no filtrada se u sa para determ inar el porcentaje de oligonucleótido en el p lasm a que no está unido a las proteínas p lasm áticas ( % no unido). Los valores finales de oligonucleótidos no unidos se corrigen para la unión no e sp ecífica dividiendo el % no unido por el % de recuperación para ca d a oligonucleótido. Los valores de % final de oligonucleótidos unidos se determinan restando los valores de % final de no unidos de 100. Los resultados se muestran en la Ta b la 107 para las dos concentraciones de oligonucleótidos probadas (5 y 150 gg/ml) en ca d a especie de plasm a. Los resultados muestran que los grupos conjugados de G a lN A c no tienen un impacto significativo sobre la unión a proteínas plasm áticas. A dem ás, los oligonucleótidos con e n laces internucleosídicos de P S com pletos y en la ce s mixtos P O /P S se unen am bos a proteínas p lasm áticas, y aquellos con e n laces de P C com pletos se unen a proteínas p lasm áticas con un grado de algún modo m ayor que aquellos con en laces de P O /P S mixtos.
Tabla 107
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Ejemplo 98: Evaluación de los efectos proinflamatorios de los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc en el ensayo hPMBC
Los oligonucleótidos enum erados en la Ta b la 109 se analizaron para determ inar los efectos proinflamatorios en un ensayo de h P M B C como se describe en los Ejem plos 23 y 24 (ver las T a b la s 30, 83, 95 y 108 para obtener descripciones de los oligonucleótidos). IS IS 353512 e s de alta respuesta usado como control positivo, y los otros oligonucleótidos se describen en las T a b la s 83, 95 y 108. Los resultados mostrados en la Ta b la 109 se obtuvieron usando sangre de un donante voluntario. Los resultados m uestran que los oligonucleótidos que com prenden en la ce s internucleosídicos de P O /P S mixtos produjeron respuestas proinflamatorias significativam ente m ás b ajas en com paración con los m ism os oligonucleótidos que tienen en la ce s de P S completos. A dem ás, el grupo conjugado de G a lN A c no tuvo un efecto significativo en este ensayo.
Tabla 109
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Ejemplo 99: Afinidades de unión de los oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAc para el receptor de asialoglicoproteína
Se probaron las afinidades de unión de los oligonucleótidos enumerados en la Tabla 110 (ver Tabla 76 para descripciones de los oligonucleótidos) para el receptor de asialoglicoproteína en un ensayo de unión de receptor competitivo. El ligando competidor, a1-glicoproteína ácida (AGP), se incubó en tampón de acetato de sodio 50 mM (pH 5) con 1 U de neuraminidasa-agarosa durante 16 horas a 37° C, y >90% de desialilación se confirmó con ensayo de ácido siálico o cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). Se usó monocloruro de yodo para yodar el AGP de acuerdo con el procedimiento de Atsma et al. (ver J Lipid Res. Enero de 1991 32(1 ):173-81.) En este método, se añadió glicoproteína ácida a1 desialilada (de-AGP) a cloruro de yodo 10 mM, Na125I y glicina 1 M en NaOH 0,25 M. Después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, se separó de-AGP marcado con 125I del 125I libre concentrando la mezcla dos veces utilizando una columna de centrifugación 3 KDMWCO. Se probó la eficacia y pureza del marcado de la proteína en un sistema de HPLC equipado con una columna Agilent SEC-3 (7,8 x 300 mm) y un contador de p-RAM. Los experimentos de competición que utilizan de-AGP marcado con 125I y varios ASO que contienen agrupaciones de GalNAc se realizaron de la siguiente manera. Se colocaron en placas células HepG2 humanas (106 células/ml) en placas de 6 pocillos en 2 ml de medio de crecimiento apropiado. Se usó medio MEM suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, L-glutamina 2 mM y HEPES 10 mM. Las células se incubaron de 16 a 20 horas a 37° C con CO2 al 5% y al 10% respectivamente. Las células se lavaron con medio sin FBS antes del experimento. Las células se incubaron durante 30 min a 37° C con 1 ml de mezcla de competición que contenía los medios de crecimiento adecuados con FBS al 2%, de-AGP marcado con 125I 10-8 M y ASO que contienen agruapción de GalNAc a concentraciones que varían de 10-11 a 10-5 M. La unión no específica se determinó en presencia de 10-2 M de azúcar de GalNAc. Las células se lavaron dos veces con medio sin FBS para eliminar el de-AGP marcado con 125I no unido y el ASO de GalNAc competidor. Las células se lisaron usando tampón RLT de Qiagen que contenía 1% de p-mercaptoetanol. Los lisados se transfirieron a tubos de ensayo de fondo redondo después de un breve ciclo de congelación/descongelación de 10 minutos y se analizaron en un contador y. La unión no específica se restó antes de dividir los recuentos de proteínas 125I por el valor de los recuentos de concentración de GalNAc-ASO más bajos. Las curvas de inhibición se ajustaron de acuerdo con una ecuación de unión competitiva de un solo sitio usando un algoritmo de regresión no lineal para calcular las afinidades de unión (Kd).
Los resultados de la Tabla 110 se obtuvieron a partir de experimentos realizados en cinco días diferentes. Los resultados de los oligonucleótidos marcados con un superíndice "a" son la media de los experimentos realizados en dos días diferentes. Los resultados muestran que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc en el extremo 5' se unen al receptor de asialoglicoproteína en células HepG2 humanas con una afinidad de 1,5 a 16 veces mayor que los oligonucleótidos que comprenden un grupo conjugado de GalNAc en el extremo 3'.
Tabla 110
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Ejemplo 101: Inhibición antisentido por oligonucleótidos que comprenden una agrupación de GalNAc enlazado a través de una fracción estable
Los oligonucleótidos enum erados en la T a b la 112 se probaron para determ inar la inhibición de la expresión de A P O C -N I de ratón in vivo. A ca d a ratón C 57 B l/6 se le inyectó por v ía subcutánea una vez con un oligonucleótido enum erado en la T a b la 112 o con P B S . C a d a grupo de tratamiento co nsistía de 4 anim ales. C a d a ratón tratado con IS IS 440670 recibió una dosis de 2, 6, 20 o 60 mg/kg. C a d a ratón tratado con IS IS 680772 o 696847 recibió 0,6, 2, 6 o 20 mg/kg. El grupo conjugado de G a lN A c de IS IS 696847 está enlazado mediante una fracción estable, un enlace de fosforotioato en lugar de un en lace que contiene fosfodiéster fácilm ente escindible. Los anim ales se sacrificaron 72 horas d esp ués de la dosis. Los niveles de A RN m de A P O C -III hepáticos se midieron usando P C R en tiempo real. Los niveles de A RN m de A P O C -III se norm alizaron a los niveles de A RN m de ciclofilina de acuerdo con protocolos estándar. Los resultados se presentan en la Tab la 112 como el porcentaje medio de niveles de A RN m de A P O C -III para ca d a grupo de tratamiento con respecto al grupo de control de solución salina. Los resultados m uestran que los oligonucleótidos que com prenden un grupo conjugado de G a lN A c fueron significativam ente m ás potentes que el oligonucleótido que ca rece de un grupo conjugado. A dem ás, el oligonucleótido que com prende un grupo conjugado de G a lN A c enlazado al oligonucleótido mediante una fracción escindible (IS IS 680772) fue incluso m ás potente que el oligonucleótido que com prende un grupo conjugado de G a lN A c enlazado al oligonucleótido mediante una fracción estable (IS IS 696847).
Tabla 112
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La estructura de G alN A c3-7a se ha mostrado en el Ejem plo 48.
Ejemplo 104: Síntesis de oligonucleótidos que comprenden un conjugado 5'-GalNAc2
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El Com puesto 120 está disponible com ercialm ente y la s ín tesis del Com puesto 126 se describe en el ejem plo 49. S e disolvieron el Com puesto 120 (1 g, 2,89 mmol), H B TU (0,39 g, 2,89 mmol) y HO Bt (1,64 g, 4 ,33 mmol) en D M F (10 ml y N,N-diisopropiletilam ina (1,75 ml, 10 ,1 mmol). D espués de aproxim adam ente 5 min, se añadió éster bencílico del ácido am inohexanoico (1,36 g, 3,46 mmol) a la reacción. D espués de 3 h, se vertió la m ezcla de la reacción en 100 ml de N a H S O 4 1M y se extrajo con 2 x 50 ml de acetato de etilo. Las ca p a s orgánicas se com binaron y lavaron con 3 x 40 ml de N aH CO 3 saturado y 2 x salm uera, se secaron con Na2SO4, se filtraron y se concentraron. El producto se purificó m ediante crom atografía en colum na de gel de sílice (D C M :E A :H ex, 1 : 1 : 1 ) para producir el Com puesto 231. L C M S y NM R fueron consistentes con la estructura. El com puesto 231 (1,34 g, 2 ,438 mmol) se disolvió en diclorometano (10 ml) y se añadió ácido trifluoroacético (10 ml). D espués de agitar a temperatura ambiente durante 2 h, la m ezcla de la reacción se concentró a presión reducida y se coevaporó con tolueno (3 x 10 ml). El residuo se secó a presión reducida para producir el com puesto 232 como la sal de trifluoracetato. La sín tesis del com puesto 166 se describe en el Ejem plo 54. El com puesto 166 (3,39 g, 5,40 mmol) se disolvió en D M F (3 ml). S e disolvió una solución del com puesto 232 (1,3 g, 2 ,25 mmol) en D M F (3 ml) y se añadió N,N-diisopropiletilam ina (1,55 ml). La reacción se agitó a tem peratura ambiente durante 30 minutos, luego se vertió en agua (80 ml) y la ca p a a cuo sa se extrajo con EtO Ac (2 x 100 ml). La fase orgánica se separó y se lavó con una N aH CO 3 saturado acuoso (3 x 80 ml), N aH SO 4 1 M (3 x 80 ml) y salm uera (2 x 80 ml), luego se secó (Na2SO4), se filtró y se concentró. El residuo se purificó m ediante crom atografía en colum na de gel de sílice para producir el com puesto 233. L C M S y NMR fueron consistentes con la estructura. S e disolvió el com puesto 233 (0,59 g, 0,48 mmol) en metanol (2,2 ml) y acetato de etilo (2,2 ml). S e añadió paladio sobre carbono ( 10 % en peso de Pd/C, húmedo, 0,07 g) y la m ezcla de la reacción se agitó en una atm ósfera de hidrógeno durante 3 h. La m ezcla de la reacción se filtró a través de una alm ohadilla de celite y se concentró para producir el ácido carboxílico. El ácido carboxílico (1,32 g, 1, 15 mmol, ácido libre de agrupación) se disolvió en D M F (3,2 ml). A esto se le añadieron N ,N -diisopropiletilam ina (0,3 ml, 1,73 mmol) y P F P T F A (0,30 ml, 1,73 mmol). D espués de 30 min de agitación a temperatura ambiente, la m ezcla de la reacción se vertió en agua (40 ml) y se extrajo con EtO Ac (2 x 50 ml). S e completó un tratamiento estándar como se ha descrito anteriormente para producir el com puesto 234. L C M S y NM R fueron consistentes con la estructura. El oligonucleótido 235 se preparó usando el procedimiento general descrito en el Ejem plo 46. La porción de agrupación de G a lN A c 2 (GalNAc2-24a) del grupo conjugado G a lN A c2-24 puede com binarse con cualquier fracción escindible presente en el oligonucleótido para proporcionar una variedad de grupos conjugados. La estructura de G a lN A c2-24 (G alN A c2-24a-CM ) se m uestra a continuación:
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Ejemplo 105: Síntesis de oligonucleótidos que comprenden un conjugado de GalNAci-25
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La síntesis del Com puesto 166 se describe en el Ejem plo 54. El oligonucleótido 236 se preparó usando el procedimiento general descrito en el Ejem plo 46.
Alternativamente, el oligonucleótido 236 se sintetizó usando el esq uem a que se muestra a continuación, y el com puesto 238 se usó para form ar el oligonucleótido 236 usando los procedim ientos descritos en el Ejem plo 10.
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Síntesis de
oligonucleotidos
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236
La porción de agrupación de G a lN A c 1 (G a lN A c 1-2 a) del grupo conjugado G a lN A c 1-25 puede com binarse con cualquier fracción escindible presente en el oligonucleótido para proporcionar una variedad de grupos conjugados. La estructura de G a lN A c 1-25 (G alN A c1-25a -C M ) se m uestra a continuación:
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Ejemplo 107: Síntesis de oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAci-26 o GalNAci-27
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El oligonucleótido 239 se sintetiza mediante el acoplam iento del Com puesto 47 (ver el Ejem plo 15 ) al ácido 64 (ver el Ejem plo 32) usando H B TU y D IE A en DM F. La am ida resultante que contiene com puesto se fosfitila, d esp u és se añadió al extremo 5' de un oligonucleótido usando los procedim ientos descritos en el Ejem plo 10. La porción de agrupación de G a lN A c 1 (G a lN A c 1-2 a) del grupo conjugado G a lN A c 1-26 puede com binarse con cualquier fracción escindible presente en el oligonucleótido para proporcionar una variedad de grupos conjugados. La estructura de G a lN A c 1-26 (G alN A c1-26 a-C M ) se m uestra a continuación:
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P ara añadir el grupo conjugado G a lN A c 1 al extremo 3' de un oligonucleótido, la am ida form ada a partir de la reacción de los com puestos 47 y 64 se añade a un soporte sólido usando los procedim ientos descritos en el Ejem plo 7. La síntesis de oligonucleótidos se com pleta luego usando procedim ientos descritos en el Ejem plo 9 para formar el oligonucleótido 240.
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La porción de agrupación de G a lN A c 1 (G alN A c1-27a) del grupo conjugado G a lN A c 1-27 puede com binarse con cualquier fracción escindible presente en el oligonucleótido para proporcionar una variedad de grupos conjugados. La estructura de G a lN A c 1-27 (G alN A c1-27a -C M ) se m uestra a continuación:
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Ejemplo 109: Síntesis de oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc1-28 o GalNAc1-29
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El oligonucleótido 241 se sintetiza usando procedim ientos sim ilares a los descritos en el Ejem plo 71 para form ar el producto intermedio de fosforamidita, seguido de los procedim ientos descritos en el Ejem plo 10 para sintetizar el oligonucleótido. La porción de agrupación de G a lN A c 1 (G alN Ac1-28a) del grupo conjugado G a lN A c1-28 puede com binarse con cualquier fracción escindible presente en el oligonucleótido para proporcionar una variedad de grupos conjugados. La estructura de G a lN A c1-28 (G alN A c1-28 a-C M ) se m uestra a continuación:
Figure imgf000183_0001
P ara añadir el grupo conjugado G a lN A c 1 al extremo 3' de un oligonucleótido, se usan procedim ientos sim ilares a los descritos en el Ejem plo 71 para form ar el producto intermedio de hidroxilo, que luego se añade al soporte sólido usando los procedim ientos descritos en el Ejem plo 7. La síntesis de oligonucleótidos se com pleta luego usando los procedim ientos descritos en el Ejem plo 9 para formar el oligonucleótido 242.
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La porción de agrupación de G a lN A c 1 (G alN Ac1-29a) del grupo conjugado G a lN A c1-29 puede com binarse con cualquier fracción escindible presente en el oligonucleótido para proporcionar una variedad de grupos conjugados. La estructura de G a lN A c 1-29 (G alN A c1-29 a-C M ) se m uestra a continuación:
Figure imgf000183_0003
Ejemplo 110: Síntesis de oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAci-30
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. Nhk/MeOH ODMTr
2. DMTrC A c O / 1.TBAF
2. Fosfiti ación3. A coO , pyr
AcO Í Í ^ ° x x ^ ^ O T B D P S
AcHN 244
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usando
en m o os e pur cac n
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El oligonucleótido 246 que com prende un grupo conjugado G a lN A c i-30 , en donde Y se seleccio na de O, S, un alquilo C 1- C 10 sustituido o no sustituido, amino, amino sustituido, azido, alquenilo o alquinilo, se sintetiza como se ha mostrado anteriormente. La porción de agrupación de G a lN A c 1 (G alN Ac1-30a) del grupo conjugado G a lN A c1-30 puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, Y es parte de la fracción escindible. En ciertas realizaciones, Y es parte de una fracción estable y la fracción escindible está presente en el oligonucleótido. La estructura de G alN A c1-30 a se muestra a continuación:
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Ejemplo 111: Síntesis de oligonucleótidos que comprenden un conjugado GalNAc2-31 o GalNAc2-32
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El oligonucleótido 250 que com prende un grupo conjugado G a lN A c 2 -31, en donde Y se seleccio na de O, S, un alquilo C 1- C 10 sustituido o no sustituido, amino, amino sustituido, azido, alquenilo o alquinilo, se sintetiza como se ha mostrado anteriormente. La porción de agrupación de G a lN A c 2 (G alN A c2-31a) del grupo conjugado G a lN A c2-31 puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, el grupo que contiene Y directam ente adyacente al extremo 5' del oligonucleótido e s parte de la fracción escindible. En ciertas realizaciones, el grupo que contiene Y directam ente adyacente al extremo 5' del oligonucleótido e s parte de una fracción estable, y la fracción escindible está presente en el oligonucleótido. La estructura de G a lN A c2-31a se m uestra a continuación:
Figure imgf000184_0003
La síntesis de un oligonucleótido que com prende un conjugado G a lN A c2-32 se m uestra a continuación.
1. DMTrCI
2. Alilo Br
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E l oligonucleótido 252 que com prende un grupo conjugado G a lN A c 2 -32 , en donde Y se seleccio na de O , S , un alquilo C 1- C 10 sustituido o no sustituido, amino, amino sustituido, azido, alquenilo o alquinilo, se sintetiza como se ha mostrado anteriormente. La porción de agrupación de G a lN A c 2 (G alN Ac2-32a) del grupo conjugado G a lN A c2-32 puede com binarse con cualquier fracción escindible para proporcionar una variedad de grupos conjugados. En ciertas realizaciones, el grupo que contiene Y directam ente adyacente al extremo 5' del oligonucleótido e s parte de la fracción escindible. En ciertas realizaciones, el grupo que contiene Y directam ente adyacente al extremo 5' del oligonucleótido e s parte de una fracción estable, y la fracción escindible está presente en el oligonucleótido. La estructura de G alN A c2-32a se m uestra a continuación:
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Ejemplo 113: Oligonucleótidos antisentido dirigidos a la calicreína B, plasma (factor de Fletcher) 1 que comprende una agrupación de GalNAc
Los oligonucleótidos de la Ta b la 121 se diseñaron para dirigirse a la ca licre ín a B hum ana, el p lasm a (factor de Fletcher) 1 o la precalicreína (PKK).
Tabla 121
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Ejemplo 115: Inhibición antisentido de PKK humana en células HepaRG™ por oligonucleótidos antisentido con modificaciones de azúcar 2'-MOE
S e diseñaron oligonucleótidos antisentido adicionales dirigidos a un ácido nucleico de P K K y se probaron su s efectos sobre el A RN m de P K K in vitro.
Los oligonucleótidos antisentido quim éricos en las tablas siguientes se diseñaron como gapm ers 5 -10 -5 M O E. Los gapm ers 5 -10 -5 M O E tienen 20 nucleósidos de longitud, en donde el segm ento del hueco central com prende diez 2'-desoxinucleósidos y está flanqueado por segm entos de ala en la dirección 5' y la dirección 3' que com prenden cinco nucleósidos cad a uno. C a d a nucleósido en el segm ento del ala 5' y cad a nucleósido en el segm ento del ala 3' tiene una m odificación 2'-O-m etoxietilo. Los en laces internucleosídicos a lo largo de cad a gapm er son e n laces de fosforotioato. Todos los residuos de citosina en cad a gapm er son 5-m etilcitosinas. “Sitio de inicio” indica el nucleósido m ás 5' al que se dirige el gapm er en la se cu en cia del gen humano. "Sitio de parada" indica el nucleósido m ás 3' al que se dirige el gapm er en la se cu en cia del gen humano. C a d a gapm er enum erado en las tablas siguientes se dirige a la S E Q ID NO: 1 o la S E Q ID NO: 10. "n/a" indica que el oligonucleótido antisentido no se dirige a e s a se cu en cia genética particular.
S e transfectaron cé lu las H e p a R G ™ cultivadas a una densidad de 20.000 cé lu las por pocillo usando electroporación con oligonucleótido antisentido 5.000 nM. D espués de un período de tratamiento de aproxim adam ente 24 horas, se aisló el A R N de las cé lu la s y se midieron los niveles de ARN m de P K K mediante P C R cuantitativa en tiempo real. S e usó el conjunto cebador sonda humano R T S 3454 para medir los niveles de A RN m . Los niveles de A RN m de P K K se ajustaron de acuerdo con el contenido de A R N total, medido por R IB O G R E E N ® . Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experim entos que tenían condiciones de cultivo sim ilares. Los resultados de ca d a experimento se presentan en tablas sep a ra d as que se m uestran a continuación. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PK K , con respecto a las cé lu las de control no tratadas.
Tabla 126
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Tabla 127
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Tabla 128
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Tabla 129
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Tabla 130
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continuación
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Tabla 131
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Tabla 132
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Tabla 133
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Tabla 134
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Tabla 135
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Tabla 136
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Tabla 137
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Tabla 138
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Tabla 139
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Ejemplo 118: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de PKK humana en células HepaRG™
S e seleccionaron y probaron gapm ers de los estudios descritos anteriormente que mostraban una inhibición in vitro significativa del A RN m de P K K a varias dosis en cé lu las H e p a R G ™ . Las cé lu las se colocaron en p lacas a una densidad de 20.000 cé lu las por pocillo y se transfectaron mediante electroporación con concentraciones de oligonucleótido antisentido de 0 ,19 pM, 0,56 pM, 1,67 pM y 5,00 pM. D espués de un período de tratamiento de aproxim adam ente 16 horas, se aisló el A R N de las cé lu la s y se midieron los niveles de ARN m de P K K mediante P C R cuantitativa en tiempo real. S e usó el conjunto cebador sonda de P K K hum ana R T S 3454 para m edir los niveles de A R N m . Los niveles de A RN m de P K K se ajustaron de acuerdo con el contenido de A RN total, medido por R IB O G R E E N ® . Los oligonucleótidos antisentido se probaron en una serie de experim entos que tenían condiciones de cultivo sim ilares. Los resultados de ca d a experimento se presentan en tablas sep a ra d as que se m uestran a continuación. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de P K K con respecto a las cé lu la s de control no tratadas. "n/a" indica que no se realizó ninguna medición para e se oligonucleótido antisentido particular para e s a dosis particular.
Tam bién se presenta la concentración inhibidora m áxim a (IC 50) de cad a oligonucleótido. Los niveles de A RN m de P K K se redujeron significativam ente de una m anera dependiente de la dosis en cé lu las tratadas con oligonucleótidos antisentido.
Tabla 155
Figure imgf000252_0001
(continuación)
Figure imgf000253_0001
Tabla 157
Figure imgf000253_0002
Tabla 158
Figure imgf000253_0003
(continuación)
Figure imgf000254_0001
Tabla 159
Figure imgf000254_0002
Tabla 160
Figure imgf000254_0003
continuación
Figure imgf000255_0001
Tabla 161
Figure imgf000255_0002
(continuación)
Figure imgf000256_0002
Tabla 162
Figure imgf000256_0001
(continuación)
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Tabla 164
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Ejemplo 120: Eficacia de los oligonucleótidos antisentido dirigidos a PKK humana en ratones transgénicos
S e trataron ratones transgénicos que contenían un fragmento de 37.390 pares de b ase s de la se cu en cia del gen K LK B 1 hum ano (crom osom a 4: posición 187148672 -187179625 , N ° de registro: N C _ 000004.11) con oligonucleótidos antisentido IS IS seleccio nado s de los estudios descritos anteriormente, cu ya eficacia se evaluó en este modelo.
Tratamiento
Se inyecto a grupos de ratones transgénicos por vía subcutánea dos veces por semana durante 3 semanas con 2 ,5 m g/kg/sem ana, 5,0 m g/kg/sem ana, 10 m g/kg/sem ana o 20 m g/kg/sem ana de IS IS 546232, IS IS 546251, IS IS 546254, IS IS 546343, IS IS 546828, IS IS 547455, IS IS 547457, IS IS 547927 e IS IS 548048. A un grupo de ratones transgénicos se le inyectó por v ía subcutánea dos v e ce s por sem ana durante 3 se m a n a s con P B S . Lo s ratones se sacrificaron 48 horas d esp ués de la última dosis y se recogieron los órganos y el p lasm a para un a nális is adicional.
Análisis de ARN
P ara evaluar el efecto de los oligonucleótidos IS IS sobre la reducción del objetivo, se extrajo A R N del tejido hepático para un a ná lis is de P C R en tiempo real de P K K hum ana. Los resultados se presentan como inhibición porcentual del A RN m de P K K con respecto al control de P B S . Com o se m uestra en la Ta b la 169, el tratamiento con oligonucleótidos antisentido IS IS dio como resultado una reducción significativa del A RN m de P K K en com paración con el control de P B S .
Tabla 169
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continuación
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Análisis de proteínas
S e evaluaron los niveles de proteína de P K K en plasm a en todos los grupos. Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de la proteína de P K K con respecto al control de P B S . Com o se m uestra en la Ta b la 170 , el tratamiento con oligonucleótidos antisentido IS IS dio como resultado una reducción significativa de los niveles de proteína de P K K en com paración con el control de P B S .
Tabla 170
Figure imgf000259_0001
continuación
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Ejemplo 121: Efecto de los oligonucleótidos antisentido de ISIS dirigidos a PKK humano en monos Cynomolgus
S e trataron monos Cynom olgus con oligonucleótidos antisentido IS IS seleccio nados de los estudios descritos anteriormente. S e evaluaron la eficacia y la tolerabilidad de los oligonucleótidos antisentido. Los oligonucleótidos antisentido hum anos probados presentan reactividad cruzada con la se cu en cia genóm ica de rhesus (G E N B A N K N ° de registro N W _ 001118167.1 truncado de los nucleótidos 2358000 a 2391000 y designado en la presente como S E Q ID NO: 18). El sitio de inicio objetivo de ca d a oligonucleótido para la S E Q ID NO: 18 se presenta en la T a b la 171. "M alapareamientos" indica que el número de nucleótidos por el cual el oligonucleótido está m alapareado con la secu en cia de rhesus. Cuanto m ayor se a la com plem entariedad entre el oligonucleótido hum ano y la secu en cia del mono rhesus, m ás probable será que el oligonucleótido hum ano pueda reaccionar de forma cruzada con la secu en cia del mono rhesus. ‘n /a ’ indica que el oligonucleótido tiene m ás de 3 m alapaream ientos con la secu en cia génica de rhesus.
Tabla 171
Figure imgf000260_0001
continuación
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Tratamiento
A ntes del estudio, los monos se mantuvieron en cuarentena durante un período de 30 d ías, durante el cual se observó a los anim ales diariam ente para verificar su salud general. Los monos tenían entre 2 y 4 años y pesaban entre 2 y 4 kg. S e inyectó subcutáneam ente a diez grupos de cuatro monos cynom olgus m acho asignados aleatoriam ente ca d a uno con oligonucleótido IS IS o P B S . La solución de P B S o los oligonucleótidos IS IS a una dosis de 40 mg/kg se administraron inicialm ente con un régimen de carga que co nsistía de cuatro dosis en la primera sem ana del estudio (d ías 1, 3, 5 y 7), seguido de un régimen de mantenimiento que co nsistía de adm inistración una vez a la sem ana com enzando el d ía 14 (sem anas 2 a 13 ) . La s inyeccio nes subcutáneas se realizaron en rotaciones en el sentido de las agujas del reloj en 4 sitios de la e sp a ld a ; un sitio por dosis. Los lugares de inyección se delimitaron con un tatuaje, m ientras estaban sedados con ketam ina, y estaban separados por un mínim o de 3 cm.
Durante el período de estudio, se observó a los monos por lo m enos una vez al d ía para detectar signos de enferm edad o angustia. S e informó de inmediato de cualquier anim al que experim entase un dolor o angustia m ás que m omentáneo o leve debido al tratamiento, lesión o enferm edad al veterinario responsable y al Director del Estudio. S e identificó cualquier anim al con m ala salud o en una posible condición m oribunda para una monitorización adicional y posible eutanasia. Por ejemplo, dos monos tratados con IS IS 547445 fueron sacrificados debido a su comportamiento apagado, posición lateral, falta de respuesta a los estím ulos y dism inución de la respiración. Los protocolos descritos en el Ejem plo fueron aprobados por el Com ité Institucional de Uso y Cuidado de A nim ales (IA C U C ).
Reducción de objetivo
Análisis de ARN
El d ía 87 u 88, 48 horas d esp ués de la dosis final, se extrajo A RN del tejido hepático para el a ná lis is por P C R en tiempo real de P K K usando el conjunto cebador sonda R T S 3455 (secuencia directa C C T G T G T G G A G G G T C A C T C A , d esign ad a en la presente como S E Q ID NO: 23 ; secu en cia inversa C C A C T A T A G A T G C G C C A A A C A T C , d esignada en la presente como S E Q ID NO: 24; secu en cia de sonda C C C A C T G C T T T G A T G G G C T T C C C , d esignada en la presente com o S E Q ID NO: 25). Los resultados se norm alizaron al gen de mantenimiento, ciclofilina. Los resultados se presentan como inhibición porcentual del ARN m de P K K con respecto al control de P B S . Com o se muestra en la T a b la 172 , el tratamiento con oligonucleótidos antisentido IS IS dio como resultado una reducción significativa del A RN m de P K K en com paración con el control de P B S .
Tabla 172
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Análisis de proteínas
S e recogieron aproxim adam ente 0,9 ml de sangre ca d a vez de todos los anim ales disponibles antes de la dosis, d ía 17 , d ía 31, d ía 45, d ía 59 y d ía 73, y se colocaron en tubos que contenían citrato de sodio al 3 ,2 % . Los tubos se centrifugaron (3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente) para obtener plasm a. Los niveles de proteína de P K K se midieron en plasm a mediante E L IS A . Los resultados se presentan en la Ta b la 173 , expresados como porcentaje de inhibición en com paración con los niveles de control de P B S . Los resultados indican que los oligonucleótidos de IS IS redujeron significativam ente los n iveles de proteína PKK.
Tabla 173
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Estudios de tolerabilidad
Función hepática
P ara evaluar el efecto de los oligonucleótidos IS IS sobre la función hepática, los monos se mantuvieron en ayu nas durante la noche. S e recogieron aproxim adam ente 1,5 ml de m uestras de sangre de todos los grupos de estudio. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínim o de 90 min y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 min. S e midieron los niveles de varios m arcadores de la función hepática usando un analizador quím ico To sh ib a 120 F R N E O (Toshiba C o ., Japón). Los resultados se presentan en la T a b la 174 e indican que los oligonucleótidos antisentido no tuvieron ningún efecto sobre la función hepática fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido.
Tabla 174
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Hematología
P ara evalu ar cualquier efecto de los oligonucleótidos IS IS en monos cynom olgus sobre los parám etros hem atológicos, se recogieron m uestras de sangre de aproxim adam ente 1,2 ml de sangre antes de la dosis y el d ía 87 o el d ía 88 de cad a uno de los anim ales de estudio disponibles en tubos que contenían K2 -E D T A . La s m uestras se analizaron para el recuento de glóbulos rojos (R B C ), recuento de glóbulos blancos (W BC), recuento de plaquetas, contenido de hem oglobina y hematocrito, utilizando un analizador de hem atología A D V IA 2120 i (S IE M E N S , USA). Los datos se presentan en la T a b la 175.
Los datos indican que el tratamiento con la m ayoría de los oligonucleótidos no provocó ningún cam bio en los parám etros hem atológicos fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido a esta dosis.
Tabla 175
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Función renal
P ara evaluar el efecto de los oligonucleótidos IS IS sobre la función renal, los monos se mantuvieron en a yu na s durante la noche. S e recogieron aproxim adam ente 1,5 ml de m uestras de sangre de todos los grupos de estudio. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a tem peratura ambiente durante un mínim o de 90 min y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 min. Los niveles de BUN y creatinina se midieron usando un analizador quím ico To sh ib a 120 F R N E O (Toshiba Co., Japón).
Los resultados se presentan en la Tab la 176 , expresados en mg/dl. Los datos de la quím ica plasm ática indican que la m ayoría de los oligonucleótidos IS IS no tuvieron ningún efecto sobre la función renal fuera del intervalo esperado para los oligonucleótidos antisentido. Específicam ente, el tratamiento con IS IS 546254 fue bien tolerado en términos de la función renal de los monos.
La función renal también se evaluó mediante an á lis is de orina. S e recogió la orina fresca de todos los anim ales usando una bandeja de jau la lim pia sobre hielo húmedo. Los alim entos se retiraron durante la noche el d ía anterior a la recogida de orina fresca, pero se sum inistró agua. Los niveles totales de proteína y creatinina se midieron usando un analizador quím ico automático To sh ib a 120 F R N E O (Toshiba Co., Japón) y se calculó la relación de proteína a creatinina. Los resultados se presentan en la Ta b la 177.
Tabla 176
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Tabla 177
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Análisis del nivel de proteína C reactiva
P ara evaluar cualquier efecto inflamatorio de los oligonucleótidos IS IS en monos cynom olgus, los monos se mantuvieron en ayunas durante la noche. S e recogieron aproxim adam ente 1 ,5 ml de m uestras de sangre de todos los grupos de estudio. La sangre se recogió en tubos sin anticoagulante para la separación del suero. Los tubos se mantuvieron a temperatura ambiente durante un mínim o de 90 min y luego se centrifugaron a 3.000 rpm durante 10 min. La proteína C reactiva (P C R ), que se sintetiza en el hígado y que sirve como m arcador de inflam ación, se midió usando un analizador quím ico To sh ib a 120 F R N E O (Toshiba C o ., Japón). El complemento C 3 también se midió de m anera sim ilar y los datos se presentan como un porcentaje de los valores de referencia. Los resultados se presentan en la T a b la 178 e indican que el tratamiento con oligonucleótidos IS IS no provocó inflamación en los monos.
Tabla 178
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Ejemplo 123: Inhibición antisentido del ARNm de PKK en ratones BALB/c
S e probó el efecto de IS IS 482584 sobre el A RN m de P K K murino in vivo.
Tratamiento
S e trataron se is grupos de ratones m acho B A L B /c con 2 ,5 mg/kg, 5,0 mg/kg, 10 ,0 mg/kg, 20,0 mg/kg, 40,0 mg/kg o 80,0 mg/kg de IS IS 482584, adm inistrados por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem anas (dosis sem a na le s de 5,0 mg/kg, 10 ,0 mg/kg, 20,0 mg/kg, 40,0 mg/kg, 80,0 mg/kg o 160,0 mg/kg). Un grupo de control de ratones B A L B /c se trató con P B S , adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem a na durante 3 sem a na s. D o s d ía s d esp ués de la últim a dosis de oligonucleótido antisentido o P B S , los ratones de todos los grupos se anestesiaron con 150 mg/kg de ketam ina m ezclada con 10 mg/kg de xilazina, adm inistrada mediante inyección intraperitoneal. S e recogió hígado para a nális is de A RN .
Análisis de ARN
S e extrajo A R N del tejido hepático para el a ná lis is por P C R en tiempo real de PK K . Los niveles de ARN m de P K K se midieron usando el conjunto cebador sonda murino (secuencia directa A C A A G T G C A T T T T A C A G A C C A G A G T A C , d esign ad a en la presente como S E Q ID NO: 2231 ; se cu en cia inversa G G T T G T C C G C T G A C T T T A T G C T , design ad a en la presente como S E Q ID NO: 2232 ; se cu en cia de sonda A A G C A C A G T G C A A G C G G A A C C C , design ad a en la presente como S E Q ID NO: 2231;) . Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de P K K con respecto al control de P B S . Com o se m uestra en la T a b la 180, el tratamiento con IS IS 482584 dio como resultado una reducción significativa dependiente de la dosis del A RN m de P K K en com paración con el control de P B S .
Tabla 180
Figure imgf000266_0002
Análisis de proteínas
El p lasm a se recogió en tubos que contenían citrato de sodio como anticoagulante. La s m uestras se procesaron en un gel de p o liacrilam id a -S D S en gradiente del 4 - 12 % (Invitrogen), seguido de inm unotransferencia con anticuerpo de P K K murino (R&D System s). Las transferencias se incubaron con anticuerpos secundarios m arcados con fluoróforos (L I-C O R ) y se tomaron im ágenes en un O d ysse y Im ager (L I-C O R ). Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de P K K con respecto al control de P B S . Com o se m uestra en la T a b la 181, el tratamiento con IS IS 482584 dio como resultado una reducción significativa dependiente de la dosis de la proteína plasm ática de P K K en com paración con el control P B S .
Tabla 181
Figure imgf000266_0001
Ejemplo 124: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina en un modelo de ratón de angioedema
El angioedem a hereditario (H AE) se caracteriza por hinchazón local y aumento de la perm eabilidad v a sc u la r en los tejidos subcutáneos (Morgan, B .P .N . Engl. J. Med. 363: 581-83 , 2010 ). Está provocado por una deficiencia del inhibidor de C 1, una proteína del sistem a del complemento. S e usaron dos modelos de ratón en este estudio, incluyendo un modelo de ratón establecido de deficiencia de C 1 -IN H y un modelo de edem a inducido por captopril, los cuales provocan perm eabilidad vascular, un signo distintivo del h A e . La reversión de la perm eabilidad v ascu la r v a acom pañada de un aumento de los niveles plasm áticos de cininógeno de alto peso m olecular (HMW K).
En el primer modelo, el angioedem a fue inducido por el tratamiento con captopril, un conocido agente antihipertensivo, que aum enta la perm eabilidad v a sc u la r en ratones y replica la patología del angioedem a hereditario.
En el segundo modelo, el angioedem a fue inducido por el tratamiento con IS IS 461756 , un oligonucleótido antisentido que se dirige al A RN m inhibidor de C 1 murino, que aum enta la perm eabilidad v ascu la r en ratones y replica la patología del angioedem a hereditario. IS IS 461756 ( S e Q ID NO: 2245 ; A A A G T G G T T G A T A C C C T G G G ) es un gapm er 5 -10 -5 M O E que se dirige a los nucleósidos 1730 -1749 de N M _009776.3 (S E Q ID NO: 2243).
El efecto de H O E -140 e IS IS 482584, un inhibidor de oligonucleótidos antisentido de PKK, se evaluó en m odelos de perm eabilidad v a sc u la r inducidos por Captopril e IS IS 461756 en ratones. A lgunos de los grupos murinos se trataron con H O E -140 , un antagonista selectivo del receptor de bradiquinina B2, que bloquea la vasodilatación y la perm eabilidad va sc u la r (Cruden y Newby, Expert Opin. Pharm acol. 9 :2383-90, 2008). Otros ratones se trataron con IS IS 482584, que inhibe la expresión de A RN m de PK K . El efecto del tratamiento con H O E -140 se com paró con el efecto del tratamiento con IS IS 482584.
Tratamiento
Los varios grupos de tratamiento para este ensayo se presentan en la Ta b la 182.
El grupo 1 co nsistía de 4 ratones C 57 B L /6 J -T y rc -2 J tratados con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem a na durante 4 sem anas. No se administró ningún otro tratamiento al Grupo 1, que sirvió como grupo de control para m edir el nivel de referencia de perm eabilidad vascular.
El grupo 2 co nsistía de 8 ratones C 57 B L /6 J -T y rc -2 J tratados con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 4 sem a na s. Al final del tratamiento, se administraron a los ratones por v ía intraperitoneal 20 |ug de captopril. El grupo 2 sirvió como grupo de control de P B S para la perm eabilidad vascu la r inducida por captopril.
El grupo 3 co nsistía de 8 ratones C 57 B L /6 J -T y rc -2 J tratados con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 4 sem anas. El d ía 14 , los ratones se trataron con 50 mg/kg del oligonucleótido antisentido dirigido al inhibidor de C 1, IS IS 461756 , adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 2 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 |ug de captopril. El grupo 3 sirvió como grupo de control de P B S para la perm eabilidad v ascu la r inducida por captopril e IS IS 461756.
El grupo 4 co nsistía de 8 ratones C 57 B L /6 J -T y rc -2 J tratados con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 4 sem a na s. El d ía 14 , los ratones se trataron con 50 mg/kg del i oligonucleótido antisentido dirigido al inhibidor de C 1, IS IS 461756 , adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 2 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 |ug de captopril. A los ratones también se les administraron luego por v ía intraperitoneal 30 |ug de H O E -140. El grupo 4 sirvió como control positivo para la inhibición de la perm eabilidad v a sc u la r con H O E -140.
El grupo 5 co nsistía de 8 ratones C 57 B L /6 J -T y rc -2 J tratados con 40 mg/kg de oligonucleótido de control IS IS 141923 , un gapm er 5 -10 -5 M O E sin objetivo murino conocido, ( C C T T C C C T G A A G G T T C C T C C ; S E Q ID NO: 2246) adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 4 sem a na s. El d ía 14, los ratones se trataron con 50 mg/kg del oligonucleótido antisentido dirigido al inhibidor de C 1, IS IS 461756 , adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 2 sem anas. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 |ug de captopril. El grupo 5 sirvió como grupo de control para la perm eabilidad v ascu la r inducida por captopril e IS IS 461756.
El grupo 6 co nsistía de 8 ratones C 57 B L /6 J -T y rc -2 J y se trató con 40 mg/kg de IS IS 482584 adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem a na durante 4 sem anas. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 |ug de captopril. El grupo 6 sirvió como grupo de tratamiento experimental para exam inar el efecto de A S O de P K K sobre la perm eabilidad v ascu la r inducida por captopril.
El grupo 7 co nsistía de 8 ratones C 57 B L /6 J -T y rc -2 J tratados con 40 mg/kg de IS IS 482584 adm inistrados por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem a na durante 4 sem anas. El d ía 14, los ratones se trataron con 50 mg/kg del oligonucleótido antisentido dirigido al inhibidor de C 1, IS IS 461756 , adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s por sem ana durante 2 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 |ug de captopril. El grupo 7 sirvió como grupo de tratamiento experimental para exam inar el efecto de A S O de P K K sobre la perm eabilidad va sc u la r inducida por captopril e IS IS 461756.
Luego se inyectaron a todos los grupos 30 mg/kg de solución de Azul de E va ns en la ven a de la cola. Los ratones se sacrificaron 30 minutos d esp ués de la adm inistración de la solución de Azul de E va ns y se recogieron el colon, los pies, las orejas y los intestinos. S e tomaron m uestras de sangre mediante punción card íaca.
Tabla 182
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Cuantificación de la permeabilidad vascular
Los tejidos recogidos de los pies, el colon, las orejas y los intestinos se colocaron por separado en una solución de form am ida durante la noche para filtrar el colorante Azul de E va ns. La solución de form am ida que contenía tejido de orejas y pies se calentó a 55 ° C y se dejó durante la noche. La intensidad del color de la solución de form am ida infundida con colorante se midió a continuación a D Ü 600nm y se presenta en la T a b la 183. Los ratones que presentan cualquier m anifestación de angioedem a absorben m ás colorante y, por lo tanto, muestran valores altos de DO.
Com o se presenta en la Ta b la 183, el tratamiento con IS IS 482584 previene la perm eabilidad v ascu la r en ratones tratados con captopril (Grupo 6) y en ratones tratados con captopril e IS IS 461756 (Grupo 7) en com paración con los grupos de control de P B S respectivos (Grupos 2 y 3). La s m edidas de perm eabilidad v a sc u la r en ratones de los G rupos 6 y 7 también se redujeron en la m ayoría de los tejidos en com paración con los ratones tratados con el oligonucleótido de control, IS IS 141923 (Grupo 5), donde se indujo la perm eabilidad v ascu la r con captopril e IS IS 461756. La s M edidas de la perm eabilidad vascu la r en los tejidos del colon y de los pies de am bos grupos de tratamiento (Grupos 6 y 7) fue com parable a los niveles de referencia, como se observó en los ratones tratados solo con P B S (Grupo 1). La reducción en la perm eabilidad v ascu la r en ratone tratados con IS IS 482584 fue com parable a la observada en ratones tratados con el antagonista del receptor de bradicinina 2, H O E 140 , que sirvió como control positivo en este ensayo.
Por lo tanto, la inhibición antisentido del A RN m de P K K puede se r beneficiosa para el tratamiento y la prevención de la perm eabilidad vascular, que e s sintom ática de H A E.
Tabla 183
Figure imgf000268_0001
Cuantificación de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)
La cuantificación por transferencia de W estern de HM W K de m uestras de sangre se presenta en la Figura 1.
Com o se m uestra en la Figura 1, las m uestras de los G rupos 1 y 2 tienen niveles bajos de HM W K en com paración con los G rupos 6 y 7, lo que indica que la perm eabilidad va sc u la r se invierte en los G rupos 6 y 7. Com o también se m uestra en la Figura 1, las m uestras de los G rupos 1 y 2 tienen un producto de escisió n de HM W K aum entado como en com paración con los G rupos 6 y 7. Por tanto, la falta de HM W K está provocada por la escisión por P K K de HM W K en productos de escisió n (incluyendo bradiquinina y HKa).
Ejemplo 125: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina sobre la permeabilidad de referencia y la permeabilidad inducida por captopril en ratones
La perm eabilidad de referencia e s el nivel de perm eabilidad v ascu la r que se produce en los tejidos de ratones sin tratamiento previo. S e evaluó el efecto de IS IS 482584 en la prevención de la perm eabilidad vascular, ya se a de referencia o inducida por captopril.
Tratamiento
Los varios grupos de tratamiento para este ensayo se presentan en la Ta b la 184.
El grupo 1 co nsistía de 8 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 4 sem a na s. No se administró ningún otro tratamiento al Grupo 1, que sirvió como grupo de control para medir los niveles b asa le s de perm eabilidad vascular.
El grupo 2 co nsistía de 8 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 4 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 pg de captopril. El grupo 2 sirvió como grupo de control negativo para la perm eabilidad va sc u la r inducida por captopril.
El grupo 3 co nsistía de 8 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 4 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 30 pg de H O E -140. El grupo 3 sirvió como control positivo para la inhibición de la perm eabilidad v a sc u la r de referencia.
El grupo 4 co nsistía de 8 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 4 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 pg de captopril. A los ratones también se les administraron por v ía intraperitoneal 30 pg de H O E -140. El grupo 4 sirvió como control positivo para la inhibición de la perm eabilidad vascu la r inducida por captopril.
El grupo 5 co nsistía de 8 ratones y se trató con 40 mg/kg de IS IS 482584 adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 4 sem a na s. El grupo 5 sirvió como grupo de tratamiento experim ental para exam inar el efecto de IS IS 482584 sobre la perm eabilidad v a sc u la r de referencia.
El grupo 6 co nsistía de 8 ratones y se trató con 40 mg/kg de IS IS 482584 adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 4 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 pg de captopril. El grupo 6 sirvió como grupo de tratamiento experim ental para exam inar el efecto de IS IS 482584 sobre la perm eabilidad va sc u la r inducida por captopril.
A continuación, se inyectaron a todos los grupos 30 mg/kg de solución de Azul de Evans. Los ratones se sacrificaron 30 minutos después de la adm inistración de la solución de Azul de E va ns y se recogieron el colon, los pies, las orejas y los intestinos.
Tabla 184
Figure imgf000269_0001
Cuantificación de la permeabilidad vascular
Los tejidos recogidoos de los pies, el colon, el intestino y las orejas se colocaron por separado en una solución de form am ida durante la noche para filtrar el colorante Azul de E va ns. La solución de form am ida que contenía pies y tejido de orejas se calentó a 55 ° C y se dejó durante la noche. La intensidad del color de la solución de form am ida infundida con colorante se midió luego a D Ü 600nm, y se presenta en la Ta b la 185. Los ratones que m uestran cualquier m anifestación de angioedem a absorben m ás colorante y, por lo tanto, muestran valores altos de DO.
Com o se presenta en la Tab la 185 , los ratones tratados con IS IS 482584 demostraron una perm eabilidad v ascu la r de referencia reducida en com paración con el control de P B S (Grupo 5 frente al Grupo 1). La reducción de la perm eabilidad v ascu la r de referencia por el tratamiento con IS IS 482584 fue com parable a la provocada por el tratamiento con H O E -140 (Grupo 3, que sirvió como control positivo). Los ratones tratados con IS IS 482584 también demostraron una perm eabilidad vascu la r inducida por captopril reducida en la m ayoría de los tejidos en com paración con el control de P B S (Grupo 6 frente al Grupo 2). La reducción de la perm eabilidad v ascu la r inducida por captopril por el tratamiento con IS IS 482584 fue com parable a la provocada por el tratamiento con H O E -140 (Grupo 4, que sirvió como control positivo).
Tabla 185
Figure imgf000270_0001
Ejemplo 126: Efecto dependiente de la dosis de la inhibición antisentido de PKK murina sobre la permeabilidad vascular inducida por captopril
S e evaluó el efecto de dosis variab les de IS IS 482584 sobre la perm eabilidad vascu la r inducida por captopril.
Tratamiento
Los varios grupos de tratamiento para este ensayo se presentan en la Ta b la 186.
El grupo 1 co nsistía de 4 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem a na s. No se administró ningún otro tratamiento al Grupo 1, que sirvió como grupo de control para medir los niveles de referencia de perm eabilidad vascular.
El grupo 2 co nsistía de 8 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 gg de captopril. El grupo 2 sirvió como grupo de control para la perm eabilidad v a sc u la r inducida por captopril. El grupo 3 co nsistía de 4 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 20 gg de captopril. A los ratones también se les administraron por v ía intraperitoneal 30 gg de Icatibant (H O E -140). El grupo 4 sirvió como control positivo para la inhibición de la perm eabilidad vascu la r inducida por captopril. Los grupos 4, 5, 6, 7, 8 y 9 consistían de 8 ratones ca d a uno y fueron tratados con 2 ,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg u 80 mg/kg (correspondiente a 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg o 160 mg/kg a la sem ana), respectivam ente de IS IS 482584 adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem anas. Al final del período de tratamiento, a los ratones de todos los grupos se les administraron por v ía intraperitoneal 20 g de captopril. Los grupos 4-9 sirvieron como grupos de tratamiento experim ental para exam inar el efecto de diferentes dosis de IS IS 482584 sobre la perm eabilidad v ascu la r inducida por captopril.
Luego se inyectaron a todos los grupos 30 mg/kg de solución de Azul de E va ns en la ven a de la cola. Los ratones se sacrificaron 30 minutos después de la adm inistración de la solución de Azul de E va ns y se recogieron el colon, los pies, las orejas y los intestinos. S e tomaron m uestras de sangre mediante punción card íaca.
Tabla 186
Figure imgf000271_0002
Cuantificación de la permeabilidad vascular
Los tejidos recogidos se colocaron en una solución de form am ida durante la noche para lixiviar el colorante Azul de Evans. La solución de form am ida que contenía pies y tejido de orejas se calentó a 55 ° C y se dejó durante la noche. La intensidad del color de la solución de form am ida infundida con colorante se midió luego a D O 600 nm, y se presenta en la T a b la 187. Los ratones que m uestran cualquier m anifestación de angioedem a absorben m ás colorante y, por lo tanto, muestran valores altos de DO.
Com o se presenta en la Ta b la 187 , los ratones tratados con dosis m ás altas de IS IS 482584 (Grupos 4, 5 y 6) tenían niveles reducidos de perm eabilidad v ascu la r inducida por captopril en com paración con el grupo de control de P B S correspondiente (Grupo 2). La reducción de la perm eabilidad v ascu la r en ratones de estos grupos de tratamiento (Grupos 4 y 5) fue com parable a los niveles de perm eabilidad v a sc u la r de referencia (como se muestra en el Grupo 1) a s í como en ratones tratados con H O E -140 (Grupo 3).
Tabla 187
Figure imgf000271_0001
Cuantificación de la perdida vascular
La sangre extraída a través de una punción c a rd ía ca se m ezcló inm ediatam ente con 3 v e ce s el volum en de etanol enfriado con hielo. La solución se centrifugó a 15.000 g durante 20 minutos a 4 ° C para elim inar los desecho s celu lares y las proteínas p lasm áticas precipitadas. Los extractos de etanol se purificaron adicionalm ente mediante ultrafiltración a través de un filtro M W C O de 10 kD a. La intensidad del color de la solución de plasm a extraída con etanol se midió luego a D O 620nm.. Los resultados se presentan en la Ta b la 188 como porcentaje de aumento o dism inución de los valores de DO del control de P B S del Grupo 1. S e esp erab a que los tejidos de los ratones que mostraban m anifestaciones de angioedem a filtraran m ás colorante del p lasm a y, por lo tanto, mostraran valores bajos de DO, m ientras que los grupos de tratamiento pueden m ostrar valores de DO m ás altos debido a la reducción de la pérdida vascular. Los ratones tratados con 160 m g/kg/sem ana y 80 m g/kg/sem ana de IS IS 482584 (G rupos 4 y 5) demostraron m enos pérdida v ascu la r en com paración con el control negativo de P B S tratado con captopril (Grupo 2). Los resultados de los G rupos 4 y 5 fueron com parables a los del control positivo tratado con H O E -140 (Grupo 3).
Tabla 188
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Ejemplo 127: Efecto dependiente de la dosis de la inhibición antisentido de PKK murina sobre la permeabilidad de referencia en ratones
S e evaluó el efecto de dosis variab les de IS IS 482584 sobre la perm eabilidad v ascu la r de referencia.
Tratamiento
Los varios grupos de tratamiento para este ensayo se presentan en la Ta b la 189.
El grupo 1 co nsistía de 8 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem a na s. No se administró ningún otro tratamiento al Grupo 1, que sirvió como grupo de control para medir los niveles de referencia de perm eabilidad vascular.
El grupo 2 co nsistía de 4 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem a na s. Al final del período de tratamiento, a los ratones se les administraron por v ía intraperitoneal 30 pg de H O E -140. El grupo 2 sirvió como control positivo para la inhibición de la perm eabilidad v a sc u la r de referencia.
Los grupos 3, 4, 5, 6, 7 y 8 consistían de 8 ratones ca d a uno y fueron tratados con 2 ,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg u 80 mg/kg (correspondiente a 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg, 80 mg/kg o 160 mg/kg a la sem ana), respectivam ente de IS IS 482584 adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem anas. Los grupos 4-9 sirvieron como grupos de tratamiento experim ental para exam inar el efecto de diferentes dosis de IS IS 482584 sobre la perm eabilidad v a sc u la r de referencia.
Luego a todos los grupos se inyectaron 30 mg/kg de solución de Azul de E va ns en la ven a de la cola. Los ratones se sacrificaron 30 minutos d esp ués de la adm inistración de la solución de Azul de E va ns y se recogieron el colon, los pies y las orejas y se exam inaron para detectar defectos de perm eabilidad. S e tomaron m uestras de sangre mediante punción card íaca.
Tabla 189
Figure imgf000273_0002
Cuantificación de la permeabilidad vascular
Los tejidos recogidos de los pies, el colon y las orejas se colocaron en una solución de form am ida durante la noche para elim inar el colorante de Azul de E va ns. La solución de form am ida que contenía tejido de pies y orejas se calentó a 55 ° C y se dejó durante la noche. La intensidad del color de la solución de form am ida infundida con colorante se midió luego a D Ü 600nm y se presenta en la Ta b la 190. Los valores de DO m ás altos están aso ciado s con niveles m ás altos de perm eabilidad.
Com o se presenta en la Ta b la 190, la m ayoría de los tejidos de ratones tratados con IS IS 482584 en todas las dosis (G rupos 3-8) demostraron una perm eabilidad v a sc u la r de referencia reducida en com paración con el control de P B S (Grupo 1). La reducción de la perm eabilidad v a sc u la r de referencia de los grupos tratados con oligonucleótidos IS IS fue com parable a la m ism a dem ostrada en el grupo de control positivo tratado con H O E -140 (Grupo 2).
Tabla 190
Figure imgf000273_0001
Cuantificación de la fuga vascular
La sangre extraída a través de una punción c a rd ía ca se m ezcló inm ediatam ente con 3 v e ce s el volum en de etanol enfriado en hielo. La solución se centrifugó a 15.000 g durante 20 minutos a 4 ° C para elim inar los desecho s celu lares y las proteínas p lasm áticas precipitadas. Los extractos de etanol se purificaron adicionalm ente mediante ultrafiltración a través de un filtro M W C O de 10 kD a. Luego, se midió la intensidad del color de la solución de plasm a extraída con etanol a D O 620nm. Los resultados se presentan en la Ta b la 191 como porcentaje de aumento o dism inución de los valores de DO del control de P B S del Grupo 1. S e esperaba que los grupos de tratamiento pudieran mostrar valores de DO m ás altos debido a la reducción de la pérdida vascular. To dos los ratones de los grupos tratados con oligonucleótidos IS IS demostraron una pérdida va sc u la r significativam ente reducida en com paración con el control negativo de P B S .
Tabla 191
Figure imgf000274_0001
Cuantificación de cininógeno de alto peso molecular (HMWK)
La cuantificación por transferencia W estern de HM W K de m uestras de sangre se presenta en las T a b la s 192 y 193.
Com o se m uestra en la Ta b la 192 , los grupos tratados con 482584 tienen niveles m ás altos de HM W K en com paración con el control de P B S , aum entando de una m anera dependiente de la dosis. E l tratamiento con oligonucleótidos antisentido de P K K da como resultado la estabilización de HM W K. P o r tanto, la perm eabilidad v a sc u la r se reduce en los grupos tratados con IS IS 482584 de una m anera dependiente de la dosis. Com o se m uestra en la Ta b la 193, los grupos tratados con IS IS 482584 tienen menor producto de escisión de HM W K en com paración con el control de P B S , dism inuyendo de m anera dependiente de la dosis. P o r tanto, la H M W K reducida e s provocada por la escisió n por P K K de HM W K en productos de escisió n (que incluyen bradiquinina y HKa). Los datos se presentan en unidades de intensidad m edidas por densitómetro.
Tabla 192
Figure imgf000274_0003
Tabla 193
Figure imgf000274_0002
Ejemplo 130: Inhibición de la activación de la proteína del Factor 12 por ISIS 482584
S e evaluó el efecto de la inhibición antisentido del A RN m de P K K sobre la activación de la proteína del Factor 12.
Tratamiento
Los varios grupos de tratamiento para este ensayo se presentan en la Ta b la 198.
El grupo 1 co nsistía de 8 ratones y se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem a na s. No se administró ningún otro tratamiento al Grupo 1, que sirvió como grupo de control para medir la activación del Factor 12.
Los grupos 2, 3, 4, 5 y 6 consistían de 8 ratones ca d a uno y se trataron con 2 ,5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg (correspondiente a 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg u 80 mg/kg a la sem ana), respectivam ente de IS IS 482584 adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem a na durante 3 sem anas. Los grupos 2-6 sirvieron como grupos de tratamiento para medir el efecto de IS IS 482584 sobre la activación del factor 12.
Al final del período de tratamiento, se recogió plasm a de los ratones para el ensayo am idolítico basado en Spectro zym e® Factor 12 a para el Factor 12 en plasm a.
Tabla 198
Figure imgf000275_0002
Ensayo de activación del factor 12 en plasma
S e añadió plasm a (5 pl) a 85 pl de P B S con 1 pg/ml de sulfato de dextrano (500 kDa) en una m icroplaca de polipropileno de 96 pocillos y la solución se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. S e añadieron Spectro zym e® F X IIa (10 pl de una solución 2 mM) y una solución de K A L L IS T O P ™ 0,2 mM y se midió la cinética de abso rbancia a 405 nm. La activación del Factor 12 se midió en la fase lineal de acum ulación de absorbancia. Los resultados se presentan en la T a b la 199 como un porcentaje de la activación del Factor 12 m edida en la m uestra de control de P B S . Com o se observa en la T a b la 199, la inhibición de P K K por IS IS 482584 da como resultado una activación dism inuida del Factor 12 por su sustrato, lo que im plica que se requiere P K K para la activación apropiada del Factor 12.
Tabla 199
Figure imgf000275_0001
Ejemplo 131: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina sobre la permeabilidad vascular inducida por oligonucleótidos antisentido C1-INH
La perm eabilidad v ascu la r inducida por IS IS 461756 , un oligonucleótido antisentido que se dirige al ARN m inhibidor de C 1 murino, aum enta la perm eabilidad v ascu la r en ratones y replica la patología del angioedem a hereditario. S e evaluó el efecto de IS IS 482584 en este modelo.
Tratamiento
S e trató a un grupo de 8 ratones con 40 mg/kg de IS IS 482584 adm inistrado por v ía subcutánea dos veces a la sem ana durante 3 sem a na s (dosis sem anal de 80 mg/kg). Un segundo grupo de 8 ratones se trató con 40 mg/kg del oligonucleótido de control, IS IS 141923 , adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 3 se m a n a s (dosis sem anal de 80 mg/kg). Un tercer grupo de 8 ratones se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem anas. El d ía 14 , todos los grupos se trataron con 12 ,5 mg/kg de IS IS 461756 adm inistrados por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 3 sem a na s (dosis sem anal de 25 mg/kg). Un grupo de control de ratones se trató con P B S adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 3 se m a n a s pero no se le administró IS IS 461756.
Al final del período de tratamiento, a todos los grupos se les inyectaron 30 mg/kg de solución de Azul de E va n s en la vena de la cola. Los ratones se sacrificaron 30 minutos d esp ués de la adm inistración de la solución de Azul de E va ns y se recogieron el colon, los pies, las orejas y los intestinos. Tam bién se recogió el hígado para el an á lis is de A RN .
Análisis de ARN
S e aisló A R N del hígado para el a nális is por R T -P C R de los A RN m de C 1 -IN H y PK K . El conjunto cebador sonda para C 1 -IN H e s R T S 3218 (secuencia directa G A G T C C C C C A G A G C C T A C A G T , designada en la presente como S E Q ID NO: 2234 ; secu en cia inversa T G T C A T T T G T T A T T G T G A T G G C T A C A , d esign ad a en la presente como S E Q ID NO: 2235 ; se cu en cia de sonda C T G C C C T C T A C C T G G C C A A C A Q C A , design ad a en la presente como S E Q ID NO: 2234). El conjunto cebador sonda para P K K e s R T S 3287 (secuencia directa A C A A G T G C A T T T T A C A G A C C A G A G T A C , d esign ad a en la presente como S E Q ID NO: 2237 ; se cu en cia inversa G G T T G T C C G C T G A C T T T A T G C T , design ad a en la presente como S E Q ID NO: 2238 ; se cu en cia de sonda A A G C A C A G T G C A A G C G G A A C Q C C , d esign ad a en la presente como S E Q ID: 2239). Los resultados se presentan en la Ta b la 200 como porcentaje de inhibición en com paración con el control de P B S no tratado con IS IS 461756. Los datos indican que IS IS 461756 redujo significativam ente la expresión de A R N ; de C 1 -IN H y el tratamiento con IS IS 482584 redujo significativam ente la expresión de PKK.
Tabla 200
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Cuantificación de la permeabilidad vascular
Los tejidos recogidos de los pies, el colon y los intestinos se colocaron en una solución de form am ida durante la noche para lixiviar el colorante Azul de E va ns. La solución de form am ida que contenía tejido de pies se calentó a 55 ° C y se dejó durante la noche. Luego, se midió la intensidad del color de la solución de form am ida infundida con colorante a D O 600nm. Los datos se presentan en la Ta b la 201 como porcentaje de aumento o reducción en com paración con el control de P B S no tratado con IS IS 461756. Los datos indican que el tratamiento con IS IS 482584 previno la perm eabilidad v ascu la r inducida por IS IS 461756.
Tabla 201
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Ejemplo 132: Efecto in vivo de inhibición antisentido de PKK murina en el modelo de trombosis de vena cava inferior inducida por FeCl3
S e evaluó IS IS 482584, que demostró inhibición significativa in vitro e in vivo de PK K , en el modelo de ratón de trombosis de vena ca v a inferior inducida por FeCl3
Tratamiento
S e trataron tres grupos de 8 ratones m acho B A L B /c con 10 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg de IS IS 482584, adm inistrados por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem a na durante 3 se m a n a s (dosis sem anale s de 20 mg/kg, 40 mg/kg u 80 mg/kg). S e trataron dos grupos de control de 12 ratones B A L B /c ca d a uno con P B S , adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem a na durante 3 sem anas. Dos d ía s d esp ués de la última dosis de oligonucleótido antisentido o P B S , los ratones de todos los grupos se anestesiaron con 150 mg/kg de ketam ina m ezclada con 10 mg/kg de xilazina, adm inistrada mediante inyección intraperitoneal. La formación de trombos se indujo con F e C h en todos los grupos de ratones anestesiado s excepto el primer grupo de control.
En ratones som etidos a tratamiento con FeCta, se indujo la formación de trombos aplicando un trozo de papel de filtro (2 x 4 mm) saturado previam ente con una solución de FeCta al 10 % directamente sobre la ven a cava. D espués de 3 minutos de exposición, se retiró el papel de filtro. Treinta minutos después de la aplicación del papel de filtro, se disecó una longitud fija de la ven a que contenía el trombo para el a ná lis is de plaquetas. S e recogió hígado para a ná lis is de A RN .
Cuantificación de la composición plaquetaria
S e usó cuantificación por P C R en tiempo real del factor plaquetario-4 (P F-4) para cuantificar las plaquetas en la vena ca va como m edida de la formación de trombos. Los niveles de A RN m de P F -4 se midieron usando el conjunto cebador sonda murinos m P F 4 _ LT S_ 00086 (secuencia directa A G A C C C A T T T C C T C A A G G T A G A A C T , d esign ad a en la presente como S E Q ID NO: 2240 ; secu en cia inversa C G C A G C G A C G C T C A T G , designada en la presente como S E Q ID NO: 2241 ; secu en cia de sonda T C T T T G G G T C C A G T G G C A C C C T C T T , d esign ad a en la presente como S E Q ID NO: 2242). Los resultados se presentan como un porcentaje de P F -4 en ratones tratados con oligonucleótidos IS IS , en com paración con los dos grupos de control tratados con P B S . Com o se muestra en la Ta b la 202, el tratamiento con IS IS 482584 dio como resultado una reducción significativa de P F -4 en com paración con el control de P B S . Por tanto, la reducción de P K K por el com puesto proporcionado en la presente e s útil para inhibir la formación de trombos.
Tabla 202
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Ejemplo 133: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina en un ensayo de sangrado de la cola S e midió el sangrado de la cola para observar si el tratamiento con IS IS 482584 provoca un sangrado o hem orragia ex cesivo s en ratones.
Tratamiento
S e trataron grupos de 10 ratones m acho B A L B /c con 10 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg de IS IS 482584, adm inistrados por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem a na durante 3 se m a n a s (dosis sem anale s de 20 mg/kg, 40 mg/kg, u 80 mg/kg). Un grupo de control de 8 ratones B A L B /c se trató con P B S , adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem anas.
Ensayo de sangrado de la cola
Dos d ía s d esp ués del tratamiento final de los oligonucleótidos IS IS o P B S , los ratones se colocaron en una cá m ara de sangrado de la cola. Los ratones se anestesiaron en la cám ara con isoflurano. Luego, se cortó un pequeño trozo de cola (aproxim adam ente a 4 mm de la punta) con tijeras estériles. La cola cortada se colocó inm ediatam ente en un tubo Falcon de 15 ml lleno con aproxim adam ente 10 ml de solución tampón de N aC l al 0 ,9 % calentada a 37 ° C . La sangre se recogió en el transcurso de 40 minutos. Los tubos llenos de solución sa lin a se pesaron antes y d esp ués del sangrado. Los resultados se proporcionan en la T a b la 203.
El tratamiento con IS IS 482584 no afectó significativam ente al sangrado. Estos datos sugieren que el potencial hemorrágico de los com puestos proporcionados en la presente es bajo. Estos datos tom ados con los resultados proporcionados en el Ejem plo 19 sugieren que la inhibición de P K K con los com puestos descritos en la presente son útiles para proporcionar actividad antitrombótica sin riesgo de sangrado asociado.
Tabla 203
Figure imgf000278_0001
Ejemplo 134: Efecto in vivo de inhibición de antisentido de PKK murina en modelo de trombosis mesentérica inducida por FeCl3
S e evaluó IS IS 482584 en el modelo de ratón con trombosis m esentérica inducida por FeCl3.
Tratamiento
Un grupo de 6-8 ratones S w iss-W e b ster se trató con 40 mg/kg de IS IS 482584, adm inistrado por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem a na s (dosis sem anal de 80 mg/kg). Un grupo de control de 6 ratones S w iss-W e bster se trató con P B S , adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 3 sem anas. Dos d ía s d esp ués de la última dosis de oligonucleótido antisentido o P B S , los ratones de todos los grupos se anestesiaron con 75 mg/kg de ketam ina m ezclada con 25 mg/kg de xilazina, adm inistrada mediante inyección subcutánea.
S e inyectó por v ía subcutánea colorante de rodam ina 6G a una dosis de 5 mg/kg para teñir las plaquetas. S e inyectó anticuerpo anti-fibrinógeno m arcado con A lex a-647 a una dosis de 1 mg/kg mediante inyección en la vena de la cola para teñir la fibrina. El abdom en se abrió mediante una incisión en el medio. S e esparció el mesenterio visceral sobre un cubreobjetos de vidrio y se localizaron las arteriolas m esentéricas (70 -120 pm) mediante observación bajo m icroscopio. La formación de trombos se indujo aplicando hilos de algodón (2 x 0,3 mm) presaturados con una solución de FeCl3 al 6 % directam ente sobre el vaso objetivo. D espués de tres minutos de exposición, se retiró el hilo y se registraron las intensidades de color de am bos colorantes mediante m icroscopía fluorescente (m icroscopio de barrido láser confocal O lym pus FluoView 1000) con filtros apropiados durante 70 min.
Los resultados para la agregación plaquetaria en los grupos de control y tratamiento se presentan en la T a b la 204, expresados en unidades arbitrarias (a.u.). La agregación plaquetaria se redujo en ratones tratados con IS IS 482584 a una dosis de 80 m g/kg/sem ana en com paración con los ratones tratados con P B S . Los resultados de la formación de fibrina en los grupos de control y tratamiento se presentan en la Ta b la 205, también expresados en unidades arbitrarias (a.u.). La formación de fibrina se redujo en ratones tratados con IS IS 482584 a una dosis de 80 m g/kg/sem ana en com paración con los ratones tratados con P B S . Por lo tanto, estos resultados sugieren que IS IS 482584 inhibe la formación de trombos.
Tabla 204
Figure imgf000279_0001
Tabla 205
Figure imgf000279_0002
Ejemplo 135: Efecto in vivo de la inhibición antisentido de PKK murina en el modelo de trombosis de vena cava inferior inducida por estenosis
IS IS 482584 se evaluó en el modelo de trom bosis de la vena ca v a inferior (IVC) inducida por estenosis. La reducción del flujo sang uíneo y el daño endotelial son signos distintivos de este modelo, también conocido como modelo St. To m as.
Tratamiento
S e trataron cuatro grupos de 6-8 ratones B A L B /c con 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg o 40 mg/kg de IS IS 482584, adm inistrados por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem a na durante 3 se m a n a s (dosis sem a na le s de 10 mg/kg, 20 mg/kg, 40 mg/kg u 80 mg/kg). Un grupo de control de 8 ratones B A L B /c se trató con P B S , administrado por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 3 sem a na s. Dos d ía s d esp ués de la adm inistración de la última dosis de oligonucleótido antisentido o P B S , los ratones de todos los grupos se anestesiaron con isoflurano inhalante al 2 ,5 % . La IV C de los ratones se expuso mediante una incisión abdom inal en la línea m edia por debajo de la vena renal izquierda y se separó de la aorta abdom inal mediante disección roma. S e colocó una atadura de se d a 6-0 (Ethicon, Reino Unido) detrás del vaso sanguíneo justo debajo de la vena renal izquierda y se colocó una sutura de metal 4-0 (Ethicon, Reino Unido) longitudinalmente sobre la V C I para atar la atadura de se d a en la parte superior. Luego se retiró la sutura de metal. S e colocaron dos grapas quirúrgicas neurovasculares (Braun M edical Inc, PA) en dos posiciones sep arad as debajo de la ligadura durante 20 segundos cad a una, d esp ués de lo cual se retiraron. Luego se reem plazó el contenido de la cavidad abdom inal y se cerró el abdom en. D espués de 24 horas, se expuso la V C I y se comprobó la formación de trombos. Todos los trombos form ados se recogieron y fijaron en form alina al 10 % durante 24 horas.
S e pesaron los trombos y los resultados se presentan en la T a b la 206, expresados en miligram os. Com o dem uestran los resultados, el tratamiento con dosis crecientes de IS IS 482584 dio como resultado una dism inución correspondiente en el peso del trombo. Los resultados indican que la inhibición antisentido de P K K e s útil para inhibir la formación de trombos.
Tabla 206
Figure imgf000280_0002
Ejemplo 136: Inhibición de PKK murina con un oligonucleótido antisentido que comprende un grupo conjugado GalNAc3
S e probaron IS IS 482584 e IS IS 722059 , que se muestran en la tabla siguiente, para determ inar sus efectos sobre el A RN m de P K K murino in vivo.
Tabla 207
Figure imgf000280_0001
Su b ín d ice s: "e" indica nucleósido modificado con 2'-M O E ; "d" indica p-D -2'-desoxirribonucleósido; "d" indica en laces internucleosídicos de fosforotioato (P S); "o" indica en la ce s internucleosídicos de fosfodiéster (PO ); y “o ’ ” indica -O -P(=O )(O H )-. El superíndice "m" indica 5-m etilcitosinas. La estructura de “G a lN A c3 -7” se m uestra en el Ejem plo 48. Tratamiento
Cuatro grupos de cuatro ratone C 57 B 1/6 J -T y rc-2J ca d a uno se trataron con 5,0 mg/kg, 10 ,0 mg/kg, 20,0 mg/kg o 40,0 mg/kg de IS IS 482584, adm inistrados por v ía subcutánea dos v e ce s a la sem ana durante 3 sem anas (dosis sem anale s de 10 ,0 mg/kg, 20,0 mg/kg, 40,0 mg/kg o 80,0 mg/kg). Cuatro grupos de cuatro ratones B A LB /c ca d a uno se trataron con 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg o 8,0 mg/kg de IS IS 722059 , adm inistrados por v ía subcutánea dos ve ce s a la sem ana durante 3 sem a na s (dosis sem anale s de 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg, 8,0 mg/kg o 16,0 mg/kg). Un grupo de control de cuatro ratones B A L B /c se trató con P B S , adm inistrado por v ía subcutánea dos ve ces a la sem a na durante 3 sem a na s. Tre s d ía s d esp ués de la última dosis de oligonucleótido antisentido o P B S , los ratones de todos los grupos se anestesiaron con isoflurano vaporizado en aire al 2 , 5 % para la inducción, seguido de isoflurano al 1 - 2 % por cono nasal para el mantenimiento. A esto le siguió una dislocación cervical. D espués de la eutanasia, se recogió el h ígado para a ná lis is de A RN .
Análisis de ARN
S e extrajo A R N del tejido hepático para el a nális is de P C R en tiempo real de PK K . Los niveles de A RN m de P K K se midieron usando el conjunto cebador sonda murino (secuencia directa A C A A G T G C A T T T T A C A G A C C A G A G T A C , d esign ad a en la presente como S E Q ID NO: 2231 ; se cu en cia inversa G G T T G T C C G C T G A C T T T A T G C T , design ad a en la presente como S E Q ID NO: 2232 ; se cu en cia de sonda A A G C A C A G T G C A A G C G G A A C C C , design ad a en la presente como S E Q ID NO: 2231;) . Los resultados se presentan como porcentaje de inhibición de PK K , con respecto al control de P B S . Com o se m uestra en la T a b la 208 a continuación, Isis 722059 , que com prende un grupo conjugado G a lN A c3 , redujo el A RN m de P K K significativam ente de m anera m ás potente que el oligonucleótido antisentido original, Isis 482584. Este resultado es consistente con los resultados de los ejem plos anteriores, en los que oligonucleótidos antisentido que com prenden un grupo conjugado G a lN A c 3 fueron significativam ente m ás potentes que sus oligonucleótidos antisentido originales, para m uchos genes objetivo tanto en ratón como en hum anos. Por tanto, se espera que los oligonucleótidos antisentido de P K K hum ana que com prenden un grupo conjugado de G alN A c3 reduzcan de igual m anera el ARN m de P K K hum ana significativam ente de m anera m ás potente que su s oligonucleótidos antisentido originales que no com prenden un grupo conjugado.
Tabla 208
Figure imgf000281_0001
Ejemplo 137: Inhibición de PKK humana con un oligonucleótido antisentido que comprende un grupo conjugado GalNAc3
S e probaron IS IS 546254 e IS IS 721744 , que se muestran en la tabla siguiente, para determ inar sus efectos sobre el A RN m de P K K hum ana in vitro.
Tabla 209
Figure imgf000282_0001
Su b ín d ice s: "e" indica nucleósido modificado con 2 '-M O E ; "d" indica p-D -2'-desoxirribonucleósido; "s" indica un en lace internucleosídico de fosforotioato (P S); y "o" indica un en lace internucleosídico de fosfodiéster (PO). El superíndice "m" indica 5-m etilcitosina. La estructura de "GalNAc3-7" se m uestra en el Ejem plo 48, y "GalNAc3-7a-o ' " indica un grupo conjugado G a lN A c3-7 en el que la fracción escindible e s -O P (=O )(O H )-.
S e usaron cocultivos prim arios de hepatocitos hum anos que incluyen cé lu las estrom ales para imitar el microambiente fisiológico del hígado in vitro (kit HepatoPac H P H U -T X -96 S , Hepregen, Medford, MA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. S e añadió una concentración de oligonucleótido de Isis enum erado en la tabla siguiente o P B S a cad a pocillo en a usen cia de cualquier reactivo de transfección. 96 horas después, las cé lu las se lisaron y se aisló el A R N de las célu las. Los n iveles de A RN m de P K K se midieron mediante P C R cuantitativa en tiempo real usando el conjunto cebador sonda R T S 3454 y se normalizaron al contenido de A R N total, medido por R IB O G R E E N ® . Los resultados se presentan en la tabla siguiente como porcentaje de inhibición de los niveles de A RN m de P K K con respecto a las cé lu las tratadas con P B S ; y los valores de IC 50 se calcularon usando un modelo logístico de 4 parám etros (JM P Software, C ary , N C). Los resultados muestran que, en condiciones de captación libre en las que no se usaron reactivos o técnicas de electroporación para promover artificialmente la entrada de los oligonucleótidos en las célu las, el oligonucleótido que com prende un conjugado de G a lN A c fue significativam ente m ás potente que el oligonucleótido original que no com prende un conjugado de G a lN A c.
Tabla 210
Figure imgf000282_0002

Claims (1)

  1. R E IV IN D IC A C IO N E S
    1. Un com puesto que com prende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado consiste de 20 nucleósidos en lazado s y tiene la se cu e n cia de nucleo bases de la S E Q ID NO: 570, y en donde el grupo conjugado está enlazado covalentem ente con el oligonucleótido modificado en el extremo 5' del oligonucleótido modificado.
    2. El com puesto de la reivindicación 1, en donde el com puesto consiste del oligonucleótido m odificado y el grupo conjugado, y en donde el oligonucleótido modificado e s de cad en a sencilla .
    3. El com puesto de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde por lo m enos un enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado es un enlace internucleosídico modificado, opcionalm ente en donde el por lo m enos un enlace internucleosídico modificado es un en lace internucleosídico de fosforotioato.
    4. El com puesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -3 , en donde:
    a) el oligonucleótido modificado com prende por lo m enos uno, por lo m enos dos, por lo m enos tres, por lo m enos cuatro, por lo m enos cinco, por lo m enos se is o por lo m enos siete en la ces internucleosídicos de fosfodiéster; y/o b) ca d a enlace internucleosídico del oligonucleótido modificado se se leccio na de un enlace internucleosídico de fosfodiéster y un en lace internucleosídico de fosforotioato.
    5. El com puesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -4 , en donde por lo m enos un nucleósido del oligonucleótido modificado com prende una nucleobase modificada, opcionalm ente en donde la por lo m enos una nucleobase es una 5-m etilcitosina.
    6. El com puesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -5 , en donde por lo m enos un nucleósido del oligonucleótido modificado com prende por lo m enos un a zúcar modificado.
    7. El com puesto de la reivindicación 6, en donde por lo m enos un nucleósido del oligonucleótido modificado com prende un a zú ca r 2 ’ modificado, un a zú ca r bicíclico, o un sustituto de azúcar, opcionalm ente en donde el a zúcar 2 ’ modificado e s un a zú ca r modificado con 2 ’-O-m etoxietilo o un a zú ca r modificado con 2 ’-O -m etilo, y opcionalm ente en donde el a zú ca r bicíclico e s un etilo restringido o un LNA, y opcionalm ente en donde el sustituto de a zú ca r es T H P o un 3 ’-fluoro-HNA.
    8. El com puesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7 , en donde el oligonucleótido modificado com prende: un segm ento de hueco que consiste de 10 desoxinucleósidos enlazado s;
    un segm ento de a la 5 ’ que consiste de 5 nucleósidos en lazado s; y
    un segm ento de a la 3 ’ que consiste de 5 nucleósidos enlazado s;
    en donde el segm ento de hueco está colocado entre el segm ento de ala 5 ’ y el segm ento de ala 3 ’ y en donde ca d a nucleósido de ca d a segm ento de a la com prende un a zú ca r modificado.
    9. El com puesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 , en donde el grupo conjugado com prende por lo menos una N -A cetilgalactosam ina (G alN Ac).
    10. El com puesto de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 , en donde el grupo conjugado com prende una fracción de direccionam iento celular, opcionalm ente en donde la fracción de direccionam iento celu lar tiene la estructura siguiente:
    Figure imgf000283_0001
    11. El com puesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 -10 , en donde el grupo conjugado com prende:
    Figure imgf000284_0001
    12. El com puesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 11, en donde el grupo conjugado com prende una fracción escindible, en donde la fracción escindible e s un en lace o grupo que e s ca p a z de dividirse en condiciones fisiológicas, opcionalm ente en donde el grupo conjugado com prende:
    Figure imgf000284_0002
    en donde (C M ) es la fracción escindible, por ejem plo en donde el grupo conjugado com prende:
    Figure imgf000284_0003
    13. Un com puesto de la reivindicación 1 que com prende un oligonucleótido modificado y un grupo conjugado, en donde el oligonucleótido modificado e s un gapm er que consiste de un segm ento de a la 5', un segm ento de hueco central, y un segm ento de ala 3', en donde:
    el segm ento de a la 5' consiste de cinco nucleósidos de 2'-O-m etoxietilo
    el segm ento de hueco central consiste de diez p-D -desoxirribonucleósidos y
    el segm ento de a la 3' consiste de cinco nucleósidos de 2'-O-m etoxietilo
    en donde el oligonucleótido modificado tiene la se cu e n cia de nucleo bases 5 '-T G C A A G T C T C T T G G C A A A C A -3 ' (S E Q ID NO: 570), en donde ca d a citosina e s una 5-m etilcitosina, en donde los e n la ces internucleosídicos del oligonucleótido m odificado son s s o o s s s s s s s s s s s o o s s de 5' a 3', en donde ca d a s e s un en lace de fosforotioato y ca d a o es un enlace de fosfodiéster, en donde el grupo conjugado está enlazado al oligonucleótido modificado en el extremo 5' del oligonucleótido modificado, y en donde el grupo conjugado tiene la siguiente estructura quím ica:
    Figure imgf000285_0001
    AcHN
    14. Una sal de un com puesto de la reivindicación 1, en donde el anión de la sal tiene la siguiente estructura quím ica:
    Figure imgf000285_0002
    (S E Q ID NO: 570).
    15. Un com puesto de la reivindicación 1 de acuerdo con la siguiente estructura quím ica:
    Figure imgf000286_0001
    (S E Q ID NO: 570), o una sal del mismo.
    16. Una com posición farm acéutica que com prende o consiste esencialm ente del com puesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13 y 15 , o la sal de un com puesto de la reivindicación 14 , y un portador o diluyente farm acéuticam ente aceptable, en donde opcionalm ente el diluyente farm acéuticam ente aceptable es solución salina tam ponada con fosfato (P B S).
    17. El com puesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13 y 15 , la sal de un com puesto de la reivindicación 14 , o la com posición farm acéutica de acuerdo con la reivindicación 16 , para su uso en el tratamiento de:
    a) una enferm edad trom boem bólica;
    b) una enferm edad inflamatoria; o
    c) edem a, opcionalm ente en donde el edem a e s angioedem a hereditaria, angioedem a de los párpados, edem a m acular, edem a ocular, o edem a cerebral
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