ES2713648T3 - Método para determinar la radiosensibilidad - Google Patents
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Abstract
Método para la determinación in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende las etapas de: a) inducir un estrés exógeno mediante por lo menos un método seleccionado de entre irradiación, contacto con por lo menos un agente radiomimético y una combinación de los mismos, en una primera fracción de una muestra biológica que comprende células, b) determinar en la fracción de la etapa a) la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto intracelular, c) determinar la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto en una segunda fracción de dicha muestra biológica que no se ha sometido a dicho estrés exógeno, d) comparar los resultados de la determinación de la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto en dicha primera y en dicha segunda fracción y seleccionar por lo menos un compuesto que se expresa de manera diferencial entre dicha primera y dicha segunda fracción, e) inducir un estrés exógeno como se define en la etapa a) en una muestra de prueba biológica que comprende células de dicho sujeto, f) determinar en la muestra de prueba de la etapa e) la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto seleccionado en la etapa d), g) comparar los resultados de la determinación de la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto en dicha etapa f) con la presencia o el nivel del mismo compuesto en una muestra de referencia biológica, y h) determinar a partir de la comparación de la etapa g) la radiosensibilidad de dicho sujeto, seleccionándose la muestra biológica que comprende células en la etapa a) y la muestra de prueba biológica que comprende células de dicho sujeto en la etapa e) de entre el grupo que consiste en: extracto de sangre completa que contiene glóbulos blancos, extracto de sangre completa que contiene linfocitos y extracto de sangre completa que contiene linfocitos T.
Description
DESCRIPCION
Metodo para determinar la radiosensibilidad.
La presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto. Mas particularmente, la invencion se refiere a un metodo que comprende la induccion de un estres exogeno en una muestra biologica de un sujeto y la comparacion del nivel de por lo menos un compuesto identificado entre dicha muestra biologica y una muestra de referencia. La presente invencion se refiere asimismo a la utilizacion de dicho por lo menos un compuesto como biomarcador predictivo de la radiosensibilidad de un sujeto. La invencion se refiere asimismo a un kit, que puede utilizarse en un metodo segun la invencion, para la deteccion del nivel de por lo menos uno de dichos compuestos identificados.
El exito de la radioterapia depende principalmente de la dosis administrada total. Los individuos vanan ampliamente en cuanto a la susceptibilidad del tejido al dano por radiacion ionizante. Cada ano, aproximadamente 4 millones de personas se tratan mediante radioterapia en todo el mundo. Las estimaciones actuales sugieren que el 5-10% de los pacientes que reciben radioterapia presentan reaccion adversa debida a hipersensibilidad. Los pacientes hipersensibles a radiaciones ionizantes pueden desarrollar importantes efectos secundarios inducidos por radiacion. La prediccion de estos efectos secundarios sigue siendo imposible en la actualidad, implicando limitacion de la dosis administrada con el riesgo de reducir el beneficio terapeutico para los pacientes. Hasta el momento, los metodos de laboratorio para evaluar la radiosensibilidad eran demasiado laboriosos como para examinar grandes poblaciones.
Se han desarrollado unas pocas pruebas para predecir la radiotoxicidad, sin embargo, hasta ahora, ninguna de ellas puede utilizarse en la rutina clmica.
Una prueba clonogenica evalua la perdida de la capacidad de proliferacion de linfocitos tras la irradiacion (West et al., 1995). Otras pruebas se basan en la deteccion de micronucleos tras la irradiacion (Floyd y Cassoni, 1994). Sin embargo, la implementacion rutinaria de estas pruebas es limitada y ninguna de ellas se utilizan en entorno clmico.
El ensayo de apoptosis de linfocitos inducida por radiacion (RILA) mide la apoptosis en linfocitos T CD4 y CD8 tras la irradiacion (0.5-8 Gy) mediante citometna de flujo (Ozsahin et al., 1997, Azria et al., 2009). Se confirmaron resultados en una cohorte de 399 pacientes (Ozsahin et al., 2005). Esta medida se basa en la disminucion de la fluorescencia de ADN nuclear debido a cambios de cromatina espedficos que acompanan a la apoptosis y puede identificar pacientes hipersensibles. El valor predictivo positivo del ensayo de RILA es debil, no presentando ninguna toxicidad tardfa el 80% de los pacientes de la poblacion detectada con nivel de apoptosis debil. El ensayo de RILA presenta una sensibilidad de 0.70 y una especificidad inferior a 0.50 (Ozsahin et al., 2005). Se ha estudiado una correlacion entre algunas variaciones geneticas, tales como polimorfismo de un solo nucleotido (SNP), variabilidad del numero de copias (CNV) o modificaciones epigeneticas, y la radiotoxicidad (Azria et al., 2008, Azria et al., 2012). Se han identificado algunos genes relacionados con la reparacion del ADN durante el estres oxidativo o en la inflamacion y se han asociado con la toxicidad temprana o tardfa. Sin embargo, hasta ahora, no se ha mostrado ninguna relacion entre genotipo y radiotoxicidad y ningun marcador genetico fuerte de radiotoxicidad.
Algunos estudios proteomicos han abordado provisionalmente la determinacion de marcadores radiosensibles. El documento WO 2013/001507 describe un metodo que incluye crear o adaptar un plan de tratamiento para un paciente sometido a radioterapia, en el que dicho metodo se basa en un conjunto de polipeptidos en suero del paciente que son indicativos de una radiotoxicidad. Se encontro que alfa 1 anti-tripsina, ApOA1 y el complemento C3 estaban regulados por incremento en el suero de un modelo de raton expuesto a radiacion ionizante (Guipaud et al., 2007). Cai et al. (2011) dan a conocer un analisis proteomico de pacientes que reciben radiacion para cancer de pulmon de celulas no pequenas. Tambien se encontro que el complemento C3, la cadena alfa de la protema de union a C4b y vitronectina estaban reguladas por incremento en una pequena cohorte de pacientes con toxicidad de pulmon inducida por radiacion de grado > 2 (Cai et al., 2010; Cai et al., 2011). Skvortsova et al. (2008) dan a conocer el perfil de proteoma de lmeas celulares de carcinoma de prostata y lmeas celulares de cancer de prostata resistentes a la radiacion. Stenmark et al. (2011) dan a conocer niveles de citocinas circulantes de pacientes que reciben terapia por radiacion. Finalmente, Oh et al. propusieron un analisis in silico original e identificaron a-2-macroglobulina como posiblemente asociada con un riesgo aumentado de inflamacion de pulmon inducida por radiacion en pacientes con cancer de pulmon, pero no validaron este resultado en una cohorte independiente (Oh et al., 2011).
Ninguna de las pruebas predictivas existentes para determinar la radiosensibilidad puede utilizarse en la rutina clmica, debido a dos inconvenientes principales: i) su falta de sensibilidad y/o especificidad, no presentando ninguna de ellas un valor predictivo tanto positivo como negativo suficientemente bueno, ii) su falta de viabilidad tecnica y requisitos de largos plazos, de medicos altamente cualificados, su alto coste y la recogida invasiva de muestras biologicas.
Por tanto, todavfa existe una necesidad de un metodo sencillo, rapido y fiable que muestre un alto valor predictivo positivo y negativo de radiosensibilidad de un sujeto.
En el contexto de la presente invencion se ha mostrado que, tras la induccion de un estres exogeno en una muestra biologica de un sujeto o un paciente, la determinacion de por lo menos uno de los compuestos expresados de manera diferencial identificados refleja la radiosensibilidad de dicho sujeto o paciente. Por tanto, esta prueba permite la prediccion de toxicidad radioinducida tardfa.
Un metodo y una utilizacion segun la invencion proporcionan al medico detalles de radiosensibilidad tisular, y por tanto ayudan al reconocimiento temprano y al manejo apropiado de estos pacientes hipersensibles. Ademas, tal metodo o ensayo puede aumentar la dosis de radiacion total para la mayona de los pacientes que se predice que no son hipersensibles y posiblemente obtengan una mayor tasa de cura o control en estos pacientes. En teona, el control tumoral local puede mejorarse significativamente en varios pacientes aumentando moderadamente la dosis de radiacion total. Se ha sugerido que un aumento del 20% de las tasas de control es viable.
La presente invencion da a conocer un metodo que confirma resultados del ensayo de RILA y presenta una mayor predictibilidad positiva. Ademas, dicho metodo segun la invencion puede utilizarse como combinacion con otras pruebas, aumentando por tanto el valor predictivo de la deteccion. La combinacion del ensayo de RILA y un metodo segun la invencion puede conducir a una sensibilidad de 0.90 y una especificidad de 0.80 con una tasa de prevalencia del 10%. Este resultado puede permitir implementar dicha prueba en la practica clmica diaria. Un metodo segun la invencion representa una herramienta util dentro de un protocolo terapeutico, una ayuda valiosa en la toma de decisiones y tambien puede utilizarse dentro de la prevencion de toxicidad radioinducida. Un metodo segun la invencion permite, a partir de una simple extraccion de sangre y dentro del plazo de cinco dfas, determinar el perfil de protema de la radiosensibilidad individual de tejidos. La rapidez, reproducibilidad y simplicidad logfstica de esta prueba son fuertes argumentos a favor de su implementacion en la rutina clmica. Descripcion detallada
La presente invencion se pondra mas claramente de manifiesto a partir de la descripcion detallada proporcionada en la presente memoria y a partir de los dibujos adjuntos, proporcionados unicamente a tttulo ilustrativo y no limitativo del alcance previsto de la invencion.
La presente invencion se refiere en primer lugar a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende las etapas de:
a) inducir un estres exogeno mediante por lo menos un metodo seleccionado de entre irradiacion, puesta en contacto con por lo menos un agente radiomimetico y una combinacion de los mismos, en una primera fraccion de una muestra biologica que comprende celulas,
b) determinar en la fraccion de la etapa a) la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto intracelular, c) determinar la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto en una segunda fraccion de dicha muestra biologica que no se ha sometido a dicho estres exogeno,
d) comparar los resultados de la determinacion de la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto en dicha primera fraccion y en dicha segunda fraccion, y seleccionar por lo menos un compuesto que se expresa de manera diferencial entre dicha primera y dicha segunda fraccion, e) inducir un estres exogeno tal como se definio en la etapa a) en una muestra de prueba biologica que comprende celulas de dicho sujeto,
f) determinar en la muestra de prueba de la etapa e) la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto seleccionado en la etapa d),
g) comparar los resultados de la determinacion de la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto los resultados de la etapa f) con la presencia o el nivel de los mismos compuestos en una muestra de referencia biologica, y
h) determinar a partir de la comparacion de la etapa g) la radiosensibilidad de dicho sujeto, seleccionandose la muestra biologica que comprende celulas en la etapa a) y la muestra de prueba biologica que comprende celulas de dicho sujeto en la etapa e) del grupo que consiste en: extracto de sangre completa que contiene globulos blancos, extracto de sangre completa que contiene linfocitos y extracto de sangre completa
que contiene linfocitos T
El termino “radiosensibilidad” se refiere a la susceptibilidad intrmseca de celulas, tejidos, organos y/u organismos a los danos por radiacion ionizante perjudicial, que es o bien letal o bien subletal. En un metodo segun la presente invencion, dicha exposicion a radiacion ionizante tiene lugar durante una radioionizacion terapeutica, tambien denominada “radioterapia” o “terapia por radiacion”. Se someten pacientes a una utilizacion medica de radiaciones ionizantes para controlar o destruir celulas diana segun la practica clmica, y en particular a dosis irradiantes, ampliamente descritas y bien conocidas por los medicos y radioterapeutas.
La presente invencion se refiere en primer lugar a un metodo para la determinacion y/o para la prediccion de radiosensibilidad intrmseca de un sujeto.
Los mecanismos subyacentes a los efectos de irradiacion en tejidos implican dano molecular, seleccion como diana en particular de ADN y membrana plasmatica, conducir a la formacion de radicales libres y roturas de ADN bicatenarias, y una multitud de mecanismos celulares, tales como defensa celular, apoptosis, respuesta a estres y procedimientos de reparacion (Lacombe et al., 2013).
En un metodo segun la invencion, un “estres exogeno” es un estres inducido en celulas, tejidos y/u organos mediante radiaciones ionizantes o mediante un agente radiomimetico. En un metodo segun la invencion, se afsla una “muestra biologica que comprende celulas” del cuerpo humano, y se induce dicho estres exogeno ex vivo en dicha muestra biologica que comprende celulas.
En un aspecto de un metodo segun la divulgacion, una “muestra biologica que comprende celulas” comprende cualquier tipo de celulas, en el que dichas celulas se eligen preferentemente del grupo que consiste en: celulas sangumeas, mas preferentemente globulos blancos, incluso mas preferentemente linfocitos, e incluso mas preferentemente linfocitos T CD4+ o linfocitos T CD8+.
En un aspecto particular de un metodo segun la invencion, en las etapas a), b), c) y e), se afsla una muestra biologica que comprende celulas de un sujeto, o de un grupo de sujetos, que son diferentes del sujeto para el que se desea determinar la radiosensibilidad. Segun este aspecto particular de un metodo segun la invencion, dicha muestra biologica que comprende celulas se afsla del cuerpo de un ser humano. En un aspecto particular de un metodo segun la invencion, en las etapas a), b), c) y e), se afsla una muestra biologica que comprende celulas de un grupo de sujetos que padecen la misma enfermedad que el sujeto para el que se desea determinar la radiosensibilidad.
En un metodo segun la invencion, un compuesto segun una cualquiera de las etapas b), c), d), f) y g) es un compuesto intracelular. En una forma de realizacion particular de la invencion, dicho compuesto es una protema, definiendose dicha protema por su secuencia de aminoacidos. En una forma de realizacion mas particular, la invencion comprende la deteccion de la presencia o el nivel de dicha protema o de un fragmento espedfico de la misma. Por “fragmento espedfico de la misma” segun un ejemplo de la divulgacion, quiere decirse un fragmento que resulta, por ejemplo, de la escision intracelular de un precursor, una protema que es un fragmento de una pre-pro-protema y de una pre-protema. En un aspecto de la invencion, un “fragmento espedfico” es un fragmento o un epftopo de la protema reconocido espedficamente por un ligando de la protema, tal como un anticuerpo. En otro aspecto de la invencion, la invencion comprende la deteccion de la presencia o el nivel de una molecula de acido nucleico que codifica para dicha protema, siendo dicha molecula preferentemente una molecula de ARNm o de ADNc, y definiendose por su secuencia de nucleotidos.
La determinacion de la “presencia” de un compuesto conduce a una indicacion de su presencia o ausencia en una muestra. La determinacion del “nivel” de un compuesto puede conducir a una estimacion de su cantidad en una muestra. El nivel de un compuesto en una muestra puede expresarse con respecto a una muestra de referencia, por ejemplo como razon o porcentaje. Dicho nivel tambien puede expresarse como la intensidad o localizacion de una senal, segun el metodo utilizado para dicha determinacion. Dicho nivel tambien puede expresarse como una concentracion de dicho compuesto en una muestra. Preferentemente, la concentracion de dicho compuesto en una muestra se expresa tras la normalizacion de la concentracion total de compuestos relevantes en dicha muestra. En un metodo segun la invencion, el nivel de un compuesto en una primera fraccion de dicha muestra biologica se compara con el nivel de los mismos compuestos en una segunda fraccion de dicha muestra biologica, en el que dicha comparacion se expresa posiblemente como estimacion de la razon de dicho compuesto en la primera y la segunda fraccion, o como porcentaje del nivel de dicho compuesto en una de las fracciones. En una forma de realizacion preferida, los niveles cuantitativos de dicho compuesto en cada fraccion se comparan de manera estadfstica, segun metodos conocidos por un experto en la materia, para demostrar una expresion diferencial de un compuesto dentro de dichas dos fracciones.
En un metodo segun la invencion, el nivel de dicho compuesto se determina (en la etapa f)) en una muestra de prueba de dicho sujeto. En una forma de realizacion particular, dicha muestra de prueba es una muestra biologica de la misma naturaleza que la muestra biologica utilizada para seleccionar compuestos expresados de manera diferencial (en la etapa d)). Como ejemplo, las muestras de las etapas d) y f) pueden recogerse y
prepararse segun el mismo metodo. En otra forma de realizacion particular, dicha muestra de prueba de la etapa f) y dicha muestra de la etapa d) son muestras biologicas que se preparan segun metodos diferentes.
En una forma de realizacion de un metodo segun la invencion, una muestra de referencia es una muestra preparada a partir del mismo sujeto antes de la induccion de ningun estres exogeno, y es preferentemente una fraccion de dicha muestra de prueba biologica de dicho sujeto que no se ha sometido a un estres exogeno. En otra forma de realizacion, una muestra de referencia es una muestra de un sujeto diferente para el que se determina la radiosensibilidad, por ejemplo, mediante deteccion clmica.
En una forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende las etapas de:
a) inducir un estres exogeno en una muestra de prueba biologica que comprende celulas de dicho sujeto, b) determinar en la muestra de la etapa a) la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto, siendo dicho compuesto una protema seleccionada de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), anexina 1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos,
c) comparar la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto con la presencia o el nivel de los mismos compuestos en una muestra de referencia, y
d) determinar, a partir de la comparacion de la etapa c), la radiosensibilidad de dicho sujeto.
En una forma de realizacion de un metodo segun la invencion, el por lo menos un compuesto expresado de manera diferencial en dicha muestra biologica, que se somete, o no, a un estres exogeno, se elige de protemas implicadas en mecanismos incluyendo metabolismo, produccion de energfa, apoptosis, protema de union a calcio, reparacion de dano del ADN y en la regulacion del nivel de especies reactivas de oxfgeno intracelulares (ROS). En otra forma de realizacion particular, el por lo menos un compuesto que se expresa de manera diferencial en muestras sometidas, o no, a un estres exogeno, se elige de protemas mitocondriales. En una forma de realizacion particular, las protemas implicadas en la regulacion del nivel de especies reactivas de oxfgeno intracelulares (ROS) se eligen del grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, APEX, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1) y protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70).
Segun una forma de realizacion particular, la invencion comprende la determinacion en una muestra de prueba biologica del nivel de por lo menos una de las protemas seleccionadas de entre grupo que consiste en las protemas que se sabe que estan implicadas en la respuesta celular al estres. En una forma de realizacion mas particular, una protema implicada en la respuesta celular al estres se elige del grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1) y protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70).
La isocitrato deshidrogenasa 2 mitocondrial (NADP+) (secuencia de aminoacidos: SEC ID n° 1, secuencia de ARNm: SEC ID n° 6, GenelD: 3418; UniProt ID: P48735) tambien se define como IDH2, ICD-M, IDP, ICDH espedfica de NADP+, oxalosuccinato descarboxilasa o se designa mediante el nombre genico IDH2. Contiene un peptido senal mitocondrial N-terminal y se localiza en la mitocondria. Desempena un papel clave en la regulacion de ciclo de TCA en multiples tejidos catalizando la conversion reversible de isocitrato en acetoglutarato y de NADP+ en NADPH. Por tanto, IDH2 es un componente cntico en la ruta antioxidante mitocondrial porque NADPH es necesario para la regeneracion de glutation reducido (GSH), el principal antioxidante responsable de prevenir el dano por ROS (Lee et al., 2004). IDH2 se regula mediante SlRT3 que puede desacetilar y por tanto activar IDH2, conduciendo a niveles de NADPH aumentados y a una razon aumentada de glutation reducido con respecto a oxidado en la mitocondria (Someya et al., 2010). IDH2 tambien puede desempenar un papel importante en la regulacion de la apoptosis inducida mediante radiacion ionizante (Lee et al., 2007).
La APEX1 (secuencia de aminoacidos: SEC ID n° 2, secuencia de ARNm: SEC ID n° 7, GenelD: 328; UniProt ID: P27695) se denomina APEX nucleasa (APEN), endonucleasa apurmica-apirimidmica 1 (AP endonucleasa 1, APE-1), REF-1, factor redox 1 o se designa mediante los nombres genicos APEX1, APE, APE1, APEX, APX, HAP1 o REF1. Es la principal endonucleasa apurmica/apiriirndica en celulas eucariotas que desempena un papel central en la ruta de reparacion de escision de bases de ADN de todas las lesiones de ADN (sitios de uracilo, alquilados y oxidados, y abasicos), incluyendo roturas monocatenarias, y tambien presenta actividad cotranscripcional modulando la expresion de genes regulados directamente por sus factores de transcripcion ubicuos (es decir, AP-1, Egr-1, NF-kB, p53 e HIF) y espedficos de tejido (es decir, PEBP-2, Pax-5 y -8, y tTf-1). Ademas, controla el estado redox intracelular inhibiendo la produccion de especies reactivas de oxfgeno (ROS) mediante su efecto inhibidor sobre Rac1, la subunidad reguladora de un sistema de NAD(P)H oxidasa no
fagodtico de membrana (Tell et al., 2009). Estas actividades estan localizadas en dos dominios funcionalmente distintos: el extremo N-terminal esta dedicado principalmente a la actividad redox mientras que el extremo C-terminal ejerce la actividad enzimatica sobre los sitios abasicos de ADN. Varios estudios demostraron que los polimorfismos funcionales de APEX1 pueden servir como biomarcadores predictivos inducidos por radiacion. Yin et al. mostraron que los polimorfismos de APEX1 pueden predecir el riesgo de neumonitis por radiacion en pacientes con cancer de pulmon de celulas no pequenas tratados con terapia por radiacion definitiva (Yin et al., 2011). Chang-Claude et al. demostraron que el alelo 148Glu de APE1 puede ser protector contra el desarrollo de efectos secundarios agudos tras la radioterapia (Chang-Claude et al., 2005).
La protema cognada de choque termico de 71 kDa (secuencia de aminoacidos: SEC ID n° 3, secuencia de ARNm: SEC ID n° 8, GenelD: 3312; UniProt ID: P11142) se denomina protema de choque termico de 70 kDa 8 o se designa mediante los nombres genicos HSPA8, HSC70, HSP73 o HSPA10. Es una chaperona molecular expresada de manera constitutiva que pertenece a la familia de la protema de choque termico 70 (HSP70). HSC70 comparte algo de similitud estructural y funcional con HSp70 pero tambien presenta propiedades diferentes en comparacion con la misma y con otros miembros de la familia de choque termico. HSC70 realiza sus funciones completas mediante la actuacion conjunta de cochaperonas. Tambien interacciona con muchas otras moleculas y regula diversas funciones celulares (Liu et al., 2012). Tambien esta implicada en diversas enfermedades y puede convertirse en un biomarcador para el diagnostico y posibles dianas terapeuticas para el diseno, descubrimiento y desarrollo de nuevos farmacos para tratar diversas enfermedades (Liu et al., 2012). Estudios demostraron que la sobreexpresion de HSC70 proporciona un efecto protector contra ROS generadas tanto endogenas como exogenas (Chong et al., 1998). Fomenta la ubiquitinacion y degradacion de protemas de Nox y por tanto reduce la produccion de ROS (Chen et al., 2012).
En otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a la deteccion del nivel de por lo menos un compuesto, siendo dicho compuesto una protema seleccionada de entre grupo que consiste en: adenilato cinasa (AK2) y anexina A1 (ANX1).
La adenilato cinasa 2 (secuencia de aminoacidos: SEC ID n° 4, secuencia de ARNm: SEC ID n° 9, GenelD: 204; UniProt ID: P54819) se denomina AK 2, ATP-AMP transfosforilasa 2 o se designa mediante los nombres genicos AK2 o ADK2. Esta localizada en el espacio intermembranario mitocondrial que controla los niveles de nucleotido de adenina. AK2 es un miembro de una antigua familia de protemas, presentes desde bacterias hasta seres humanos, que catalizan la reaccion reversible ATP AMP = 2ADP. De manera clasica se describe que la funcion de AK es el mantenimiento de una concentracion constante y una razon fija de nucleotidos de adenina y la monitorizacion del estado de energfa celular mediante la deteccion y senalizacion de nucleotidos que es esencial para el mantenimiento y el crecimiento celular. Recientes estudios indican que AK2 tambien se requiere para la respuesta a protemas desplegadas (UPR) (Burkat et al., 2011). Alteraciones en la homeostasis del retmulo endoplasmatico (ER) provocan la acumulacion de protemas mal plegadas/desplegadas en el ER y para mantener la homeostasis del Er , celulas han desarrollado la UPR. La UPR es una ruta de senalizacion intracelular adaptativa esencial que responde a rutas metabolicas, de estres oxidativo y de respuesta inflamatoria.
La ANX1 (secuencia de aminoacidos: SEC ID n° 5, secuencia de ARNm: SEC ID n° 10, GeneID: 301; UniProt ID: P04083) se denomina anexina I, anexina 1, calpactina II, calpactina 2, cromobindina 9, lipocortina I, protema inhibidora de fosfolipasa A2, p35 o se designa mediante los nombres genicos ANXA1, ANX1 o LPC1. Se describio por primera vez a finales de la decada de 1970. Esta protema de union a calcio y fosfolfpidos de 37 kDa es un fuerte inhibidor de la smtesis de eicosanoides inducida por glucocorticoides y PLA2. Un reciente interes en la actividad biologica de esta intrigante molecula ha desvelado importantes atributos funcionales de anexina 1 en una variedad de rutas inflamatorias, en la maquinaria de proliferacion celular, en la regulacion de la senalizacion de muerte celular, en el aclaramiento fagodtico de celulas apoptoticas, y lo mas importante, en el procedimiento de carcinogenesis (Lim et al., 2007).
La tabla 1 resume las protemas identificadas y sus referencias.
Tabla 1
En la presente solicitud, las protemas se definen mediante una secuencia de aminoacidos particular y mediante una secuencia de acido nucleico espedfica correspondiente, que es preferentemente una secuencia de acido nucleico de ARNm o ADNc. La presente invencion comprende la deteccion de dichas protemas o acidos nucleicos, incluyendo cualquier variante natural de dicha protema que presenta una secuencia seleccionada de entre grupo que consiste en SEC ID n° 1 a SEC ID n° 5, o variantes de moleculas de acido nucleico que presentan una secuencia seleccionada de entre grupo que consiste en: SEC ID n° 6 a SEC ID n° 10. La presente invencion tambien comprende la deteccion de fragmentos espedficos de moleculas de acido nucleico que presentan una secuencia correspondiente a un fragmento de una secuencia seleccionada de entre grupo que consiste en: SEC ID n° 6 a SEC ID n° 10 en los que dicho fragmento de acido nucleico corresponde a un fragmento codificante de dicha molecula de acido nucleico, o en los que dicho fragmento de acido nucleico codifica para un fragmento espedfico de una protema que presenta una secuencia seleccionada de entre grupo que consiste en: SEC ID n° 1 a SEC ID n° 5.
Un metodo segun la presente invencion comprende la deteccion de variantes de protemas que comprenden o que presentan una secuencia de aminoacidos que presenta por lo menos el 80%, preferentemente el 90%, mas preferentemente el 95% e incluso mas preferentemente el 98% de identidad con una secuencia seleccionada de entre grupo que consiste en SEC ID n° 1 a SEC ID n° 5. La presente invencion comprende la deteccion de variantes de ARNm que comprenden o que presentan una secuencia de nucleotidos que presenta por lo menos el 80%, preferentemente el 90%, mas preferentemente el 95% e incluso mas preferentemente el 98% de identidad con una secuencia seleccionada de entre grupo que consiste en SEC ID n° 6 a SEC ID n° 10. Tal como se utiliza en la presente memoria el termino “identidad” en la presente memoria significa que dos secuencias de aminoacidos, o secuencias de acido nucleico, son identicas (es decir basandose en cada aminoacido, o en cada acido nucleico) a lo largo del intervalo de comparacion.
El termino “porcentaje de identidad de secuencia” se calcula comparando dos secuencias alineadas de manera optima a lo largo del intervalo de comparacion, determinando el numero de posiciones en las que se producen los residuos de aminoacido identicos en ambas secuencias para proporcionar el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes entre el numero total de posiciones en el intervalo de comparacion (es decir el tamano de intervalo) y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia. El porcentaje de identidad de secuencia de una secuencia de aminoacidos tambien puede calcularse utilizando el software BLAST con los parametros por defecto o definidos por el usuario. Segun se aplica a polipeptidos, el termino identidad sustancial significa que dos secuencias peptfdicas, cuando estan alineadas de manera optima, comparten por lo menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia, preferentemente por lo menos aproximadamente el 90% de identidad de secuencia, mas preferentemente por lo menos aproximadamente el 95% de identidad de secuencia o mas (por ejemplo, el 99% de identidad de secuencia). Tal como se utiliza en la presente memoria, un “derivado” o “secuencia derivada de” se refiere a una secuencia de aminoacidos que presenta por lo menos el 80% de identidad, mas preferentemente por lo menos el 90% de identidad e incluso mas preferentemente por lo menos el 95% de identidad o mas, tal como el 99% de identidad.
Segun una forma de realizacion preferida, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos.
Segun otra forma de realizacion, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos.
Segun otra forma de realizacion, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos.
Segun otra forma de realizacion, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: adenilato cinasa (AK2), un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos.
Segun otra forma de realizacion, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: anexina A1 (ANX1), un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos.
Segun otra forma de realizacion preferida, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de:
- al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos, y
- al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), anexina A1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos.
Segun otra forma de realizacion preferida, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de:
- al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEXI), un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos, y
- al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), anexina A1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos.
Segun otra forma de realizacion preferida, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de:
- al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos, y
- al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), adenilato cinasa (AK2), anexina A1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos.
Segun otra forma de realizacion preferida, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de:
- al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: adenilato cinasa (AK2), un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos, y
- al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1) y protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), anexina A1 (ANXl), un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos.
Segun otra forma de realizacion preferida, la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de:
- al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: anexina A1 (ANX1), un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos, y - al menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos.
Segun una forma de realizacion particular, un metodo segun la invencion comprende la determinacion en una
muestra biologica de la presencia o el nivel de por lo menos dos compuestos, siendo dichos compuestos protemas seleccionadas de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, adenilato cinasa (AK2), anexina A1 (An x 1), ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70) un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos.
Segun una forma de realizacion particular, un metodo segun la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de por lo menos tres compuestos, siendo dichos compuestos protemas seleccionadas de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, adenilato cinasa (AK2), anexina A1 (An x 1), ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos
Segun una forma de realizacion particular, un metodo segun la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de por lo menos cuatro compuestos, siendo dichos compuestos protemas seleccionadas de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, adenilato cinasa (AK2), anexina A1 (An x 1), ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos.
Segun una forma de realizacion particular, un metodo segun la invencion comprende la determinacion en una muestra biologica de la presencia o el nivel de cinco compuestos, siendo dichos compuestos protemas del grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, adenilato cinasa (AK2), anexina A1 (ANX1), ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70) un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos.
En otra forma de realizacion, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende las etapas de:
a) inducir un estres exogeno en una muestra de prueba biologica que comprende linfocitos de dicho sujeto, b) determinar el nivel de apoptosis inducida en dicha muestra de prueba biologica,
c) inducir un estres exogeno en una muestra de prueba biologica del mismo sujeto y determinar la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto, en el que dicho compuesto se elige del grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), anexina 1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos,
d) comparar la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto con la presencia o el nivel de los mismos compuestos en una muestra de referencia, y
e) determinar, a partir del nivel de apoptosis inducida de la etapa b) y a partir de la comparacion de la etapa d), la radiosensibilidad de dicho sujeto.
Segun esta forma de realizacion particular, un metodo segun la invencion comprende la deteccion de apoptosis de linfocitos inducida mediante un estres exogeno y la determinacion de la radiosensibilidad de un sujeto segun un metodo de la invencion. En una forma de realizacion mas particular de la invencion, se induce apoptosis de linfocitos mediante radiaciones ionizantes. En una forma de realizacion incluso mas particular, la deteccion de apoptosis de linfocitos inducida por radiacion se realiza mediante un ensayo de RILA tal como se describe en Ozsahin et al. (2005). En otra forma de realizacion particular, se detecta apoptosis mediante un metodo elegido en la deteccion de fragmentacion de ADN (ensayo cometa, ensayo TUNEL) y la deteccion de ruta mitocondrial (deteccion de caspasa 3, deteccion de citocromo C).
En una forma de realizacion particular, la deteccion de apoptosis de linfocitos y la determinacion de la radiosensibilidad de un sujeto segun un metodo de la invencion se realizan en diferentes muestras biologicas del mismo sujeto. En otra forma de realizacion particular, la deteccion de apoptosis de linfocitos y la determinacion de la radiosensibilidad de un sujeto segun un metodo de la invencion se realizan en muestras biologicas de la misma naturaleza, por ejemplo un extracto de globulos blancos de la sangre. En una forma de realizacion incluso mas particular, el metodo segun la invencion y un ensayo de RILA se realizan en diferentes fracciones de la misma muestra biologica que comprende linfocitos del sujeto.
En otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para predecir in vitro la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, que comprende:
- un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto segun la invencion, y - una etapa de predecir la susceptibilidad a toxicidad radioinducida ta ^ a de dicho sujeto si dicho por lo menos un compuesto esta presente en dicha muestra de prueba biologica y ausente en dicha muestra de referencia y/o si el nivel de dicho por lo menos un compuesto en dicha muestra de prueba biologica es superior al nivel de los mismos compuestos en dicha muestra de referencia.
La presente invencion se refiere a un metodo para determinar la radiosensibilidad, o sensibilidad a radiacion, de tejidos y/o celulas de un sujeto, en el que los tejidos y/o celulas sometidos a radiacion ionizante comprenden tejidos y/o celulas seleccionados espedficamente como diana por la irradiacion, y tambien tejidos y/o celulas normales o “sanos” que no se seleccionan espedficamente como diana por la radioterapia pero que estan incluidos en el volumen irradiado de tejidos y/o celulas. En una forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para determinar la radiosensibilidad, o sensibilidad a radiacion, de tejidos sanos del paciente, en el que “tejidos (o celulas) sanos” se definen como tejidos (o celulas) no seleccionados espedficamente como diana por la radioterapia. Dichos “tejidos sanos” se refieren a tejidos o celulas adyacentes al, o que rodean el, tejido diana. Pueden aparecer “efectos secundarios tardfos” o “efectos secundarios a largo plazo” o “toxicidad tardfa” comenzando de 3 a 6 meses tras la irradiacion. Los smtomas son multiples, incluyendo con frecuencia fibrosis, necrosis tisular, atrofia, dano vascular y, en casos muy intensos, canceres inducidos por radiacion y muestran empeoramiento a lo largo del tiempo, incluso 20-34 anos tras la radioterapia (Lacombe et al., 2013). En un aspecto particular, la toxicidad tardfa es inflamacion pulmonar inducida por radiacion.
En una forma de realizacion particular, un metodo segun la invencion permite la deteccion de pacientes propensos a verse afectados por radio-hipersensibilidad tardfa. La intensidad de los smtomas de toxicidad tardfa se clasifica segun grados. En un aspecto particular, un metodo segun la invencion permite la determinacion de radiosensibilidad tardfa de grado 2 y superior (grado 3 y mas).
Segun una forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, comprendiendo dicho metodo:
- la determinacion de la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1, un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos,
- al menos otro metodo predictivo de radiosensibilidad tal como se describe en la tecnica anterior. Dicho otro metodo predictivo es posiblemente, pero no se limita a, un ensayo de RILA o un ensayo de deteccion de SNP
Segun una forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende:
- la determinacion de la presencia o el nivel de IDH2, un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos,
- al menos otro metodo predictivo de radiosensibilidad, preferentemente un ensayo de RILA o un ensayo de deteccion de SNP (Azria et al., 2008).
Segun otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende:
- la determinacion de la presencia o el nivel de IDH2, un fragmento espedfico de la misma, un acido nucleico que codifica para la misma y una combinacion de los mismos,
- la determinacion de la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: APEXl, HSC70, AK2 y ANX1, un fragmento espedfico de las mismas, un acido nucleico que codifica para las mismas y una combinacion de los mismos,
- al menos otro metodo predictivo de radiosensibilidad, preferentemente un ensayo de RILA o un ensayo de deteccion de SNP.
Segun otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende:
- la determinacion de la presencia o el nivel de: 1) IDH2, un fragmento espedfico de la misma o un acido nucleico que codifica para la misma, 2) APEX1, un fragmento espedfico de la misma o un acido nucleico que codifica para la misma, 3) HSC70, un fragmento espedfico de la misma o un acido nucleico que
codifica para la misma, 4) AK2, un fragmento espedfico de la misma o un acido nucleico que codifica para la misma, 5) ANX1, un fragmento espedfico de la misma o un acido nucleico que codifica para la misma, y
- al menos otro metodo predictivo de radiosensibilidad, preferentemente un ensayo de RILA o un ensayo de deteccion de SNP
En una forma de realizacion particular, un metodo para la determinacion de la radiosensibilidad segun la invencion se realiza en una muestra biologica de un sujeto para el que se conocen los resultados de una prueba de apoptosis de linfocitos inducida. En una forma de realizacion mas particular, un metodo para la determinacion de la radiosensibilidad segun la invencion se realiza en una muestra biologica de un sujeto para el que los resultados de ensayo de RILA son indicativos de un nivel bajo de apoptosis inducida, y preferentemente una apoptosis inducida inferior al 16%.
En un aspecto de la invencion, la presente invencion se refiere a un metodo en el que dicho estres exogeno se induce mediante por lo menos un metodo seleccionado de entre los siguientes: irradiacion y puesta en contacto con por lo menos un agente radiomimetico. En una primera forma de realizacion particular, dicho estres exogeno se genera mediante irradiacion. En otra forma de realizacion particular, dicho estres exogeno se genera mediante puesta en contacto con por lo menos un agente radiomimetico. En otra forma de realizacion particular, dicho estres exogeno se genera mediante una irradiacion y mediante puesta en contacto con por lo menos un agente radiomimetico.
En una forma de realizacion mas particular, dicho estres exogeno se induce mediante una irradiacion, en la que la dosis de irradiacion esta comprendida entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 16 Gy, preferentemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 14 Gy, mas preferentemente superior a aproximadamente 4 Gy, preferentemente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 Gy, preferentemente entre aproximadamente 6 y aproximadamente 10 Gy, y mas preferentemente de aproximadamente 8 Gy. El termino “aproximadamente” significa una variacion posible de /-10% en la dosis administrada. En un metodo segun la invencion, se irradian muestras biologicas mediante rayos X a 8 Gy.
En una forma de realizacion particular, las muestras reciben 8 Gy con un caudal de dosis de 1 Gy/min. Los parametros utilizados para la irradiacion son indicativos y pueden adaptarse por los expertos en la materia segun su practica y el dispositivo utilizado para aceleracion lineal. En una forma de realizacion particular, se realiza irradiacion a traves de una placa de cultivo celular de 6 pocillos de poliestireno de 15 mm de grosor. Se irradian muestras mediante un haz de 6 MV, con una distancia de fuente a superficie de 145 cm y un campo de irradiacion de 25 x 25 cm en el colimador. Como ejemplo, para suministrar una dosis de 8 Gy, cuando se utiliza un acelerador lineal “GE Saturne 43”, tiene que suministrarse una dosis de 1520 UM (unidades de monitor) por el acelerador, mientras que utilizando un acelerador lineal “Varian”, tiene que suministrarse una dosis de 1600 UM por el acelerador.
En otra forma de realizacion particular, dicho estres exogeno se induce mediante puesta en contacto de la muestra con por lo menos un agente radiomimetico. Un “agente radiomimetico” es una sustancia que induce efectos sobre celulas que son similares a los provocados por radiaciones ionizantes, puede considerarse que un agente radiomimetico “imita” por lo menos una parte de los efectos de radiaciones ionizantes sobre celulas. Como ejemplos no limitativos, un agente radiomimetico puede provocar roturas de ADN monocatenarias y/o bicatenarias o puede conducir a la presencia de radicales libres en la celula. En una forma de realizacion particular, se pone la muestra en contacto con un unico agente radiomimetico. En otra forma de realizacion particular, se pone la muestra en contacto con dos o mas agentes radiomimeticos, utilizandose dichos agentes de manera simultanea o sucesiva. Un agente radiomimetico que puede utilizarse para un metodo segun la invencion puede elegirse del grupo que consiste en: afidicolina, bleomicina, antibioticos de enodiino y peroxido de hidrogeno. Se sabe que la bleomicina provoca roturas de ADN mono o bicatenarias, mientras que se sabe que el peroxido de hidrogeno induce radicales libres. Un metodo segun la invencion no se limita a la utilizacion de un agente radiomimetico particular y un experto en la materia elegira facilmente el agente adaptado para poner en practica un metodo particular segun la invencion. Segun dicha forma de realizacion particular, dicha puesta en contacto con un agente radiomimetico se realiza siguiendo condiciones tal como se describe en Kennedy et al. (2006), Adema et al. (2003), Cloos J et al. (1999) o Tedeschi et al. (2004). En una forma de realizacion particular, la apoptosis de linfocitos en un metodo segun la invencion se induce mediante puesta en contacto con un agente radiomimetico tal como se describe en la presente solicitud.
En un aspecto de la invencion, un metodo segun la invencion comprende la preparacion de una muestra biologica, eligiendose dicha muestra del grupo que consiste en: sangre completa, extracto de sangre completa que contiene celulas, extracto de sangre completa que contiene globulos blancos, extracto de sangre completa que contiene linfocitos y extracto de sangre completa que contiene linfocitos T CD4+ y/o CD8+.
Los extractos de sangre completa que contienen celulas se preparan segun metodos bien conocidos por los expertos en la materia de la manipulacion de muestras de sangre para pruebas biologicas. Tal metodo puede
incluir, por ejemplo, separacion de constituyentes de la sangre en gradientes de Ficoll, metodo de separacion rapida de celulas sangumeas utilizando RosetteSep™ de StemCell o utilizando un citometro de flujo.
Un metodo segun la presente invencion comprende la preparacion de muestras biologicas y la induccion de un estres exogeno en una fraccion de dicha muestra.
En una forma de realizacion mas particular, la presente invencion se refiere a un metodo en el que se preparan muestras biologicas segun el siguiente metodo:
a) aislar linfocitos a partir de dicho extracto de sangre completa,
b) irradiar dichos linfocitos aislados de la etapa a), y
c) extraer protemas a partir los linfocitos de la etapa b).
En una forma de realizacion mas particular, la presente invencion se refiere a un metodo en el que la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto se determina mediante por lo menos un metodo seleccionado de entre grupo que consiste en: un metodo basado en inmunodeteccion, un metodo basado en inmunotransferencia de tipo Western, un metodo basado en cromatograffa, y preferentemente cromatograffa de lfquidos, un metodo basado en espectrometna de masas, un metodo basado en citometna de flujo y un metodo para deteccion espedfica de acido nucleico.
Estos metodos son bien conocidos por un experto en la materia de la deteccion y cuantificacion de compuestos, y particularmente protemas, en los que la presencia y nivel de expresion de protemas puede determinarse directamente o analizarse a nivel de acido nucleico detectando, y preferentemente cuantificando, acidos nucleicos espedficos de protema, y particularmente ARNm.
En una primera etapa, se afslan protemas y/o acidos nucleicos a partir de la muestra biologica. Un metodo segun la invencion puede incluir extraccion, purificacion y caracterizacion de protemas, utilizando metodos de bioqmmica bien conocidos.
Los metodos para la deteccion espedfica de una protema basandose en espectrometna de masas incluyen, pero no se limitan a, monitorizacion de reaccion seleccionada (SRM) y monitorizacion de multiples reacciones (m Rm ). Los metodos basados en citometna de flujo incluyen, pero no se limitan a, un ensayo multiplex tal como Luminex®XMAP, que combina citometna de flujo con microesferas y laseres.
Los metodos para la deteccion espedfica de acidos nucleicos implican metodos para analizar ADN y ARN, particularmente ARNm. Los metodos utilizados de manera clasica en biologfa molecular los conocen bien los expertos en la materia del analisis de acidos nucleicos y se describen completamente en la bibliograffa (Maniatis T et al., edicion 1999). Las moleculas de acido nucleico que comprenden secuencias de acido nucleico que presentan por lo menos el 80% de identidad con una secuencia seleccionada de entre grupo que consiste en SEC ID n° 6 a SEC ID n° 10 son preferentemente secuencias que codifican para las mismas secuencias de aminoacidos, en relacion con la degeneracion del codigo genetico, o secuencias complementarias que pueden hibridarse espedficamente con una secuencia seleccionada de entre grupo que consiste en SEC ID n° 6 a SEC ID n° 10 en condiciones de fuerte rigurosidad. Condiciones de fuerte rigurosidad significa que las condiciones de temperatura y fuerza ionica se seleccionan para permitir la hibridacion mantenida entre dos moleculas de acido nucleico complementarias o fragmentos. En una forma de realizacion, un metodo segun la invencion comprende la utilizacion de secuencias oligonucleotidicas cortas que pueden hibridarse espedficamente a moleculas de ARNm de SEC ID n° 6 a SEC ID n° 10.
En una forma de realizacion particular, un metodo segun la invencion comprende la extraccion de ARN a partir de la muestra biologica. Tras la extraccion con reactivo Trizol, se realizan respuestas transcripcionales por todo el genoma mediante secuenciacion de ejecucion global. Un analisis transcriptomico mediante secuenciacion de ARN (sec. ARN) permite la cuantificacion de transcriptos. sec. ARN permite la deteccion de transcriptos de corte y empalme alternativo asf como de SNP Adicionalmente, ademas de los genes codificantes modulados de manera transcripcional, puede realizarse un seguimiento de genes no codificantes tales como los que producen ARN no codificantes largos o microARN.
En una forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, comprendiendo dicho metodo la deteccion de la presencia o el nivel de por lo menos dos de las protemas seleccionadas de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), y anexina 1 (ANX1).
En otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir in vitro la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, comprendiendo dicho metodo la deteccion de la presencia o el nivel de isocitrato deshidrogenasa 2
(IDH2) mitocondrial y ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1). En otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, comprendiendo dicho metodo la deteccion de la presencia o el nivel de isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial y de protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70). En otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, comprendiendo dicho metodo la deteccion de la presencia o el nivel de isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial y de adenilato cinasa (AK2). En otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, comprendiendo dicho metodo la deteccion de la presencia o el nivel de isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial y de anexina 1 (ANX1).
En otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, comprendiendo dicho metodo la deteccion de la presencia o el nivel de por lo menos tres de las protemas seleccionadas de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), y anexina 1 (ANX1).
En otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, comprendiendo dicho metodo la deteccion de la presencia o el nivel de las cinco protemas del grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), y anexina 1 (ANX1).
Segun la presente invencion, el metodo permite la deteccion de la radiosensibilidad de un sujeto que esta afectado por una enfermedad propensa a tratarse mediante radioterapia. En una forma de realizacion particular, dicha enfermedad se selecciona del grupo no limitativo que consiste en: cancer, enfermedad de Basedow (o enfermedad de Grave), hipertiroidismo, adenoma de hipofisis (o adenoma), meningioma y talalgia.
En una forma de realizacion particular, un metodo segun la invencion permite determinar la radiosensibilidad de un sujeto afectado por cancer, incluyendo, pero sin limitarse a, cancer de mama, cancer colorrectal, cancer de prostata, cancer de pulmon, cancer de cabeza y cuello.
Segun un aspecto particular, la presente invencion se refiere a la utilizacion de por lo menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), y anexina 1 (ANX1) o una combinacion de los mismos, como marcadores para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa.
Segun otra forma de realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial y de por lo menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: APEX1, HSC70, AK2 y ANX1 o una combinacion de los mismos, como marcadores para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa de un sujeto. En una forma de realizacion mas particular, la presente invencion se refiere a la utilizacion de por lo menos dos compuestos seleccionados de entre que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1 o una combinacion de los mismos, como marcadores para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa. En una forma de realizacion incluso mas particular, la presente invencion se refiere a la utilizacion de por lo menos tres compuestos seleccionados de entre que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1 o una combinacion de los mismos, como marcadores para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto. En otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a la utilizacion de por lo menos cuatro compuestos seleccionados de entre que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1 como marcadores para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto. En una forma de realizacion incluso mas particular, la presente invencion se refiere a la utilizacion de a combinacion de IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1 como marcadores para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto.
Segun otra forma de realizacion, la presente invencion se refiere a la utilizacion de a por lo menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1, o una combinacion de los mismos, como marcadores para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, en un metodo segun la invencion.
Segun otra forma de realizacion particular, la presente invencion se refiere a un kit que puede utilizarse para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto o para predecir la susceptibilidad de toxicidad radioinducida ta ^ a en un sujeto, comprendiendo dicho kit por lo menos un reactivo para la deteccion espedfica de por lo menos un compuesto seleccionado de entre grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), y anexina 1 (ANX1), y un reactivo para la induccion y/o la deteccion de apoptosis celular. Un agente para la deteccion de apoptosis celular puede ser cualquier agente utilizado en un metodo de este tipo por un experto en la materia. Ejemplos de metodos y agentes que pueden utilizarse para la deteccion de apoptosis celular son la deteccion de fragmentacion de ADN (ensayo cometa, ensayo TUNEL), deteccion de ruta mitocondrial (deteccion de caspasa 3, deteccion de citocromo C), anexina A5.
En dicha forma de realizacion particular, un reactivo para la deteccion espedfica de por lo menos uno de los compuestos seleccionados de entre que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1 en un kit segun la invencion es un anticuerpo o un ligando espedfico para una de dichas protemas, incluyendo sus variantes naturales, o de un fragmento espedfico de las mismas. En otra forma de realizacion particular, un reactivo para la deteccion espedfica de por lo menos uno de los compuestos seleccionados de entre que consiste en: lDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1 en un kit segun la invencion es una molecula de acido nucleico que puede unirse espedficamente a una molecula de acido nucleico que codifica para una protema seleccionada de entre grupo que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1, o para un fragmento de las mismas.
En una forma de realizacion mas espedfica, un reactivo para la deteccion espedfica de por lo menos IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1 en un kit segun la invencion es un acido nucleico que se hibrida en condiciones rigurosas con una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia seleccionada de entre grupo que consiste en SEC ID n° 6 a SEC ID n° 10, o un fragmento de la misma que codifica para un fragmento espedfico de IDH2, APEX1, HSC70, AK2 o ANX1.
En una forma de realizacion mas espedfica, la presente invencion se refiere a un kit que comprende por lo menos un reactivo para la deteccion espedfica de IDH2 y reactivos para la deteccion espedfica de por lo menos APEX1, HSC70, a K2 y ANX1, o un fragmento espedfico de las mismas
En una forma de realizacion mas particular, la presente invencion se refiere a un kit que comprende por lo menos reactivos para la deteccion espedfica de por lo menos dos de los compuestos seleccionados de entre que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1, o un fragmento espedfico de las mismas
En una forma de realizacion mas particular, la presente invencion se refiere a un kit que comprende por lo menos reactivos para la deteccion espedfica, respectivamente, de por lo menos tres de los compuestos seleccionados de entre que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANXl, o un fragmento espedfico de las mismas.
En una forma de realizacion mas particular, la presente invencion se refiere a un kit que comprende por lo menos reactivos para la deteccion espedfica, respectivamente, de por lo menos cuatro de los compuestos seleccionados de entre que consiste en: IDH2, APEX1, HSC70, a K2 y ANX1, o un fragmento espedfico de las mismas.
En una forma de realizacion incluso mas particular, la presente invencion se refiere a un kit que comprende por lo menos reactivos para la deteccion espedfica, respectivamente, de los siguientes compuestos: lDH2, APEX1, HSC70, AK2 y ANX1, o un fragmento espedfico de las mismas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan en la presente memoria unicamente a tttulo ilustrativo y no limitativo a menos que se especifique lo contrario.
Breve descripcion de los dibujos
Figura 1: representacion esquematica del protocolo para la identificacion de protemas asociadas con radiotoxicidad tardfa a partir de una extraccion de sangre completa de cuatro pacientes. Paciente 1: toxicidad superior a grado 2 en el mes 36 tras la radioterapia (RT). Paciente 2: toxicidad superior a grado 2 en el mes 48 tras RT. Paciente 3: sin toxicidad en el mes 48 tras RT Paciente 4: sin toxicidad en el mes 54 tras RT Figura 2: Validacion del nivel de expresion de AK2, ANX1, HSC70, IDH2 y APEX1 dependiendo de la radiotoxicidad tardfa observada. B-actina es un control de la cantidad de protemas. Panel izquierdo: analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western de extractos de protemas de pacientes para los que el resultado del ensayo de RILA (=TALRI en la figura) era inferior al 16% y toxicidad superior a toxicidad de grado 2. Panel central: analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western de extractos de protemas de pacientes para los que el resultado del ensayo de RILA era inferior al 16% y toxicidad inferior a toxicidad de grado 2. Panel derecho: analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western de extractos de protemas de pacientes para los que el resultado del ensayo de RILA era superior al 16% y toxicidad inferior a toxicidad de grado 2.
Figura 3: deteccion cuantitativa de AK2, ANX1, HSC70, IDH2 y APEX1. Representacion en histograma del nivel de protema en extractos de pacientes que padecen toxicidad inferior a grado dos (panel izquierdo claro) y de pacientes que padecen toxicidad superior a grado dos (panel derecho oscuro), para, respectivamente de izquierda a derecha, AK2, ANX1, HSC70, IDH2 y APEX1.
Figura 4: representacion esquematica del protocolo de prueba para detectar la presencia de los biomarcadores.
Figuras 5A y 5B: deteccion de protemas en fibrosis inducida
Figura 5A: analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western de la expresion de CTGF, a-sm actina, HSC70, APEX1 en tejidos tras el contacto, o no, con TGFbl inductor de fibrosis.
Figura 5B: representacion en histograma de la expresion de CTGF, a-sm actina, HSC70, APEX1 en tejidos tras el contacto, o no, con TGFbl inductor de fibrosis.
Ejemplos
Ejemplo 1: Ensayo de apoptosis de linfocitos
Se desarrollo anteriormente un ensayo rapido y reproducible denominado RILA (apoptosis de linfocitos inducida por radiacion) que mide la apoptosis en linfocitos T CD4 y CD8 tras la irradiacion (0.5-8 Gy) mediante citometna de flujo. Esta medicion se basa en la disminucion de la fluorescencia de ADN nuclear debido a cambios de cromatina espedficos que acompanan a la apoptosis. Se utilizo RILA como factor de estratificacion principal en un estudio aleatorizado de fase II en cancer de mama temprano tras cirugfa conservadora en comparacion con radioterapia posoperatoria o bien de manera concomitante o bien de manera secuencial con letrozol en 150 pacientes, siendo el criterio de valoracion primario la fibrosis de mama (Azria et al., 2010). No se encontro que ningun paciente con una RILA >16% mostrara efectos tardfos inducidos por radiacion, lo que indica el alto valor predictivo negativo de esta prueba. Todos los pacientes con fibrosis subcutanea de grado 2 o peor presentaban una RILA<16%, lo que confirma el valor predictivo de la prueba. Sin embargo, entre los pacientes con una RILA<16%, el 20% padecieron radiotoxicidad tardfa y el 80% no, lo que indica un valor predictivo positivo debil para RILA. La sensibilidad del ensayo de RILA es de 0.70, mientras que la especificidad de esta prueba es inferior a 0.50. Se seleccionaron cuatro pacientes tratados para cancer de mama, y con un valor de RILA bajo, a partir del estudio prospectivo mencionado anteriormente. Dos pacientes desarrollaron una toxicidad de fibrosis intensa (superior a grado 2) (pacientes n.° 1 y n.° 2), mientras que pacientes no tuvieron ninguna toxicidad por lo menos cuatro anos tras el final del tratamiento por radioterapia (pacientes n.° 3 y n.° 4).
Ejemplo 2: Identificacion de marcadores predictivos de citotoxicidad inducida tardia
El protocolo para identificar marcadores predictivos se esquematiza en la figura 1. A partir de las cuatro pacientes anteriormente mencionadas, se recogieron 40 ml de sangre total en tubos heparinizados. Se aislaron linfocitos T a partir de sangre completa mediante seleccion negativa utilizando roseta (RosetteSep®, StemCell Technology) segun las instrucciones del fabricante, seguido por un gradiente de Ficoll (GE Healthcare). Despues se cultivaron los linfocitos en medio RPMI con FCS al 10% durante 24 h a 37°C y CO2 al 5%. Despues se irradio la mitad de los linfocitos in vitro a 8 Gy. Despues se cultivaron de nuevo los linfocitos irradiados y no irradiados a 37°C y CO2 al 5% durante 48 h. Tras este tiempo de incubacion, despues se sometieron linfocitos de cada paciente a fraccionamiento subcelular (kit de extraccion de proteoma subcelular ProteoExtract® (n.° de cat. 539790), Merckmillipore) permitiendo aislar fracciones de citosol, membrana y nuclear. Despues se analizo cada una de estas fracciones utilizando un flujo de trabajo de proteomica cuantitativo utilizando un marcaje con iTRAQ 8-plex. Tras varios fraccionamientos para optimizar la resolucion del analisis (fraccionamiento Offgel seguido por nanocromatograffa de lfquidos), se identificaron las protemas mediante espectrometna de masas en tandem (4800 plus MALDI TOF/TOF).
En resumen, se redujeron 50 |ig de protemas de cada paciente, de linfocitos irradiados y no irradiados, se alquilaron y se trataron con tripsina antes de marcarse con una etiqueta de iTRAQ. Para cada fraccion (citosol, membrana y nuclear), se combinaron los 8 marcajes para cada paciente, incluyendo fracciones con linfocitos irradiados y no irradiados, y se fraccionaron mediante isoelectroenfoque en un tipo de medio lfquido Offgel (dispositivo de fraccionamiento Agilent 3100 Offgel). De este modo se obtienen 12 fracciones secundarias. Despues se separa cada una de estas fracciones secundarias mediante nanocromatograffa de lfquidos de alta resolucion en fase inversa (HPLC) (Ultimate 3000 LC Systems, Dionex) acoplada a un automata de marcacion de puntos. Despues se ponen las 12 fracciones secundarias de Offgel, con 600 puntos para cada una, en placas de MALDI. Se realizo HPLC por duplicado. Se utilizaron 8 placas de MALDI para cada fraccion (citosol, membrana y nuclear), conduciendo a un total de 24 placas. Despues se realizo la identificacion mediante espectrometna de masas en un sistema MALDI TOF/TOF® 4800 Proteomics Analyzer d'AbSciex. Se adquirieron espectros de m/z 700-1400 en un modo positivo, utilizando 1500 impulsos de laser. Los iones precursores de los diez peptidos
mas abundantes, con una relacion senal/ruido superior o igual a 50, se seleccionan para un analisis de EM/EM utilizando 3500 impulsos de laser de m/z 300-1500. Se comparan espectros de EM/EM con la base de datos de protemas Uniprot (uniprot_sprot300108) del European Institute for Bioinformatics, utilizando el software ProteinPilot® 2.0 y el metodo Paragon (Ab Sciex, Software version 50861). Se considera que se identifican de manera positiva las protemas correspondientes a un unico peptido con un alto intervalo de confianza (>95%). Resultados:
Se realizo una comparacion de razones entre protemas expresadas de manera diferencial a 0 Gy y 8 Gy entre las dos pacientes que habfan desarrollado una toxicidad tardfa y las dos pacientes sin ningun efecto toxico. Se identificaron mas de 1300 protemas totales con alta confianza (95%, un unico peptido). A 0 Gy, 135 protemas se expresaban de manera diferencial entre pacientes con o sin toxicidad radioinducida intensa (p<0.05). En linfocitos T irradiados (8 Gy), 107 protemas se expresaban de manera diferencial entre pacientes con o sin toxicidad radioinducida intensa (p<0.05). Las protemas seleccionadas para la etapa de validacion son las expresadas de manera diferencial a 8 Gy, con la mayor razon de expresion de protemas (>1.5) y que no mostraron diferencia de razon de expresion en controles a 0 Gy.
Se han seleccionado cinco protemas para validacion consecutiva: isocitrato deshidrogenasa 2 (NADP+) (IDH2), ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa 2 (AK2) y anexina 1 (ANX1). Estas protemas estan implicadas en varios mecanismos incluyendo metabolismo y produccion de energfa, apoptosis, protema de union a calcio y reparacion de danos del ADN. Ejemplo 3: Confirmacion de la expresion diferencial de biomarcadores en un numero mayor de pacientes tras la radioterapia.
Se validaron estas cinco protemas mediante analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western en una poblacion adicional de 18 pacientes, habiendo desarrollado 5 pacientes una fibrosis de mama de grado > 2 y habiendo desarrollado 13 pacientes solo toxicidad debil o sin toxicidad. Las 10 pacientes presentaban un valor de RILA bajo. Se extrajeron muestras de sangre y se trataron tal como se describio en el ejemplo anterior, hasta la incubacion tras la irradiacion. Despues se sometieron linfocitos a lisis en un tampon de RIPA. Despues se cuantificaron las protemas y despues se pusieron 10 |ig de cada una en un gel de poliacrilamida al 12% para una inmunotransferencia de tipo Western. Tras la migracion y transferencia en una membrana de PVDF durante 1 h a 300 mA a 4°C, despues se saturo la membrana durante 2 horas en PBS-Tween al 0.05% - leche al 5% y se incubaron los anticuerpos contra las protemas de interes durante la noche a 4°C con agitacion en el mismo tampon de saturacion. Tras 5 lavados sucesivos de 5 min en tampon de PBS-Tween al 0.05%, despues se anadio el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente en un tampon de PBS-Tween al 0.05%. Tras otros 5 lavados de 5 min en tampon de PBS-Tween al 0.05%, se realizo un revelado mediante ECL.
Resultados:
Los resultados muestran que estas cinco protemas se sobreexpresaron en linfocitos T irradiados de los pacientes que habfan experimentado toxicidad intensa en comparacion con pacientes sin toxicidad tardfa (figura 2). El analisis de expresion cuantitativa confirmo la significacion estadfstica de estas diferencias (tabla 2 y figura 3).
Tabla 2
Como conclusion, los cinco biomarcadores identificados permiten distinguir entre pacientes que se identificaron inicialmente como propensos a radiosensibilidad, con una RILA debil. Por tanto, la presente prueba no solo confirma los resultados de RILA sino que ademas demuestra una mayor capacidad de distincion.
Ejemplo 4: Analisis proteomico de muestras de pacientes
Extraccion de muestras: se extrajeron 21 ml de sangre completa heparinizada de cada paciente, preferentemente antes de iniciar la radioterapia.
Separacion de linfocitos T: inmediatamente se purificaron linfocitos T mediante seleccion negativa utilizando el sistema complejo tetramerico de roseta (RosetteSep, StemCell Technologies) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Este protocolo permite la recuperacion de 7.5 a 15 millones de celulas por paciente.
Cultivo celular primario de linfocitos T: se cultivan linfocitos T purificados en dos placas que contienen medio RPMI 1640 (Gibco BRL Invitrogen) complementado con FCS al 10% durante 24 h.
Irradiacion de cultivo celular de linfocitos T: para cada paciente, se irradia una placa de cultivo celular a 8 Gy y se incuba durante 48 horas. La otra placa de cultivo celular se somete a irradiacion simulada y se considera como control (0 Gy).
Analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western: se extraen protemas de linfocitos T mediante tampon de RIPA de dos tercios de las celulas (un tercio puede almacenarse para estudios complementarios). Se cuantifican los lisados celulares utilizando el kit de ensayo de protemas BCA (ThermoFisherScientific, Rockford, IL) segun el protocolo del fabricante. Despues se cargan diez microgramos de protemas y se separan en SDS-PAGE al 12% y despues se transfieren a una membrana de PVDF. Se bloquea la union no espedfica a la membrana durante 1 hora a temperatura ambiente con leche desnatada al 5%. Se incuban las membranas durante la noche a 4°C con los anticuerpos primarios diluidos de la siguiente manera: AK2 (1/100, sc-28786; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz cA), anexina 1 (1/100, sc-11387; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA), HSC70 (1/200, sc-7298; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA), IDH2 (1/100, sc-134923; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA) y Ref-1 (1/200, sc-5572; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz CA). Despues se incuban las membranas con anticuerpo secundario (anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo (H+L), G21234; Invitrogen para AK2, anexina 1, IDH2, Ref-1 y anticuerpo de cabra anti-IgG de raton (H+L), 115-035 146; Jackson ImmunoResearch para HSC70) durante 1 hora a temperatura ambiente. Se revelan las inmunotransferencias utilizando el sistema de deteccion por quimioluminiscencia potenciada con la utilizacion de un kit de sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Pico (Pierce). Se realizan analisis de imagenes utilizando el software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
Desarrollo de un ensayo ELISA para las cinco protemas candidatas: con el fin de proponer un ensayo fiable, rapido y facil de utilizar, se desarrolla una estrategia de ELISA. Se producen dos anticuerpos para cada protema mediante Abnova contra peptidos antigenicos. Ya se someten a prueba dichos anticuerpos para ELISA. Se establece una prueba ELISA de tipo sandwich en un formato de 96 pocillos, utilizando el antfgeno utilizado para la produccion de anticuerpos. Este ultimo tambien sirve como patron de cuantificacion. Para cada protema, un anticuerpo sirve para capturar la diana y se utiliza para recubrir los pocillos. El otro anticuerpo se une a biotina con el kit de sulfo-NHS-biotinilacion EZ-Link de Pierce. Se utiliza estreptavidina-HRP junto con un tampon de sustrato apropiado para la deteccion. Se mide la concentracion de las cinco protemas candidatas en los extractos celulares obtenidos anteriormente con esta prueba.
En la figura 4 se presenta un protocolo para analisis de protemas, y comprende la evaluacion de por lo menos una, y preferentemente todas, de las siguientes etapas: analisis mediante inmunotransferencia de tipo Western, ELISA y secuenciacion de ARN, en por lo menos uno, y preferentemente por lo menos una combinacion de dos, tres, cuatro o cinco, de los marcadores de protema identificados. Un tercio de las celulas (de 2.5 a 5 millones de celulas por paciente) obtenidas anteriormente, de pacientes que presentaban toxicidad tardfa y donantes coincidentes sirvieron para extraer ARN con reactivo Trizol. El mejor experimento para medir respuestas transcripcionales por todo el genoma es la secuenciacion de ejecucion global. Puede realizarse un analisis transcriptomico mediante secuenciacion de ARN (sec. ARN), siendo una prueba alternativa las micromatrices, aunque esta ultima tecnica es menos sensible. De manera importante, sec. ARN permite la deteccion de transcriptos de corte y empalme alternativo asf como de SNP
Ejemplo 5: Confirmacion del papel predictivo de las protemas identificadas.
Para confirmar el papel predictivo de las 5 protemas (AK2, IDH2, ANX1, APEX1 y HSC70) en los efectos secundarios tardfos inducidos por radiacion en cuanto a fibrosis subcutanea de grado > 2 tras cirugfa conservadora de mama para cancer de mama localizado y radioterapia adyuvante con finalidad curativa como directriz convencional. Todas las muestras de sangre se extraen antes de la radioterapia. Se estudia la induccion de la transcripcion de AK2, IDH2, ANX1, APEX1 y HSC70 tras la irradiacion ionizante. Se estudia la expresion de AK2, IDH2, ANX1, APEX1 y HSC70 tras la induccion con TgFb1 en fibroblastos y en fibras de musculo intersticial liso humano (figuras 5A y 5B).
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Claims (15)
1. Metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende las etapas de: a) inducir un estres exogeno mediante por lo menos un metodo seleccionado de entre irradiacion, contacto con por lo menos un agente radiomimetico y una combinacion de los mismos, en una primera fraccion de una muestra biologica que comprende celulas,
b) determinar en la fraccion de la etapa a) la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto intracelular, c) determinar la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto en una segunda fraccion de dicha muestra biologica que no se ha sometido a dicho estres exogeno,
d) comparar los resultados de la determinacion de la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto en dicha primera y en dicha segunda fraccion y seleccionar por lo menos un compuesto que se expresa de manera diferencial entre dicha primera y dicha segunda fraccion,
e) inducir un estres exogeno como se define en la etapa a) en una muestra de prueba biologica que comprende celulas de dicho sujeto,
f) determinar en la muestra de prueba de la etapa e) la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto seleccionado en la etapa d),
g) comparar los resultados de la determinacion de la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto en dicha etapa f) con la presencia o el nivel del mismo compuesto en una muestra de referencia biologica, y
h) determinar a partir de la comparacion de la etapa g) la radiosensibilidad de dicho sujeto, seleccionandose la muestra biologica que comprende celulas en la etapa a) y la muestra de prueba biologica que comprende celulas de dicho sujeto en la etapa e) de entre el grupo que consiste en: extracto de sangre completa que contiene globulos blancos, extracto de sangre completa que contiene linfocitos y extracto de sangre completa que contiene linfocitos T
2. Metodo para la determinacion in vitro de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende las etapas de: a) inducir un estres exogeno mediante por lo menos un metodo seleccionado de entre irradiacion, contacto con por lo menos un agente radiomimetico y una combinacion de los mismos, en una muestra de prueba biologica que comprende celulas de dicho sujeto,
b) determinar en la muestra de la etapa a) la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto, siendo dicho compuesto una protema seleccionada de entre el grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), anexina 1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas seleccionado de entre un fragmento resultante de escision intracelular de una pre-pro-protema o de una pre-protema, o un epttopo de la protema reconocido espedficamente por un anticuerpo contra la protema, un acido nucleico que codifica las mismas y una combinacion de los mismos,
c) comparar la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto con la presencia o el nivel del mismo compuesto en una muestra de referencia, y
d) determinar, a partir de la comparacion de la etapa c), la radiosensibilidad de dicho sujeto, seleccionandose la muestra de prueba biologica que comprende celulas de dicho sujeto de entre el grupo que consiste en: extracto de sangre completa que contiene globulos blancos, extracto de sangre completa que contiene linfocitos y extracto de sangre completa que contiene linfocitos T
3. Metodo segun la reivindicacion 2, comprendiendo dicho metodo las etapas de:
a) inducir un estres exogeno en una muestra de prueba biologica que comprende linfocitos de dicho sujeto, b) determinar el nivel de apoptosis inducida en dicha muestra de prueba biologica,
c) inducir un estres exogeno en una muestra de prueba biologica del mismo sujeto y determinar en dicha muestra de prueba biologica la presencia o el nivel de por lo menos un compuesto, en el que dicho compuesto se selecciona de entre el grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de
71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), anexina 1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas seleccionado de entre un fragmento resultante de escision intracelular de una pre-pro-protema o de una pre-protema, o un epftopo de la protema reconocido espedficamente por un anticuerpo contra la protema, un acido nucleico que codifica las mismas, y una combinacion de los mismos,
d) comparar la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto con la presencia o el nivel del mismo compuesto en una muestra de referencia, y
e) determinar, a partir de la determinacion del nivel de apoptosis inducida de la etapa b) y a partir de la comparacion de la etapa d), la radiosensibilidad de dicho sujeto.
4. Metodo para predecir in vitro la susceptibilidad de toxicidad radioinducida tardfa en un sujeto, que comprende un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, y una etapa de predecir la susceptibilidad a toxicidad radioinducida tardfa de dicho sujeto si dicho por lo menos un compuesto esta presente en dicha muestra de prueba biologica y ausente en dicha muestra de referencia y/o si el nivel de dicho por lo menos un compuesto en dicha muestra de prueba biologica es superior al nivel del mismo compuesto en dicha muestra de referencia.
5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho estres exogeno se induce mediante por lo menos irradiacion.
6. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que la dosis de irradiacion esta comprendida entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 16 Gy, preferentemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 14 Gy, mas preferentemente es superior a aproximadamente 4 Gy, y mas preferentemente es de aproximadamente 8 Gy.
7. Metodo segun la reivindicacion 1 a 4, en el que dicho por lo menos un agente radiomimetico se selecciona de entre el grupo que consiste en: afidicolina, bleomicina, antibioticos de enodiino y peroxido de hidrogeno.
8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha muestra biologica es un extracto de sangre completa que contiene linfocitos.
9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y 8, en el que dicha muestra biologica se prepara mediante un procedimiento que comprende las etapas de:
a) aislar linfocitos a partir de un extracto de sangre completa,
b) irradiar dichos linfocitos aislados de la etapa a), y
c) extraer protemas a partir de los linfocitos de la etapa b).
10. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la presencia o el nivel de dicho por lo menos un compuesto se determina mediante por lo menos un metodo seleccionado de entre el grupo que consiste en: un metodo basado en la inmunodeteccion, un metodo basado en la inmunotransferencia de tipo Western, un metodo basado en la espectrometna de masas, un metodo basado en la cromatograffa, un metodo basado en la citometna de flujo y un metodo para la deteccion espedfica de la presencia o el nivel de un acido nucleico.
11. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, comprendiendo dicho metodo la deteccion de la presencia o el nivel de:
- una protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), un fragmento espedfico de la misma seleccionado de entre un fragmento resultante de la escision intracelular de una pre-pro-protema o de una pre-protema, o un epftopo de la protema reconocido espedficamente por un anticuerpo contra la protema, o un acido nucleico que codifica la misma, y
- por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apunnico o apirimidfnico) liasa (APEX1), adenilato cinasa (AK2), anexina 1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas seleccionado de entre un fragmento resultante de la escision intracelular de una pre-pro-protema o de una pre-protema, o un epftopo de la protema reconocido espedficamente por un anticuerpo contra la protema, un acido nucleico que codifica las mismas y una combinacion de los mismos.
12. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho sujeto esta afectado por una enfermedad susceptible a ser tratada mediante radioterapia, seleccionandose dicha enfermedad de entre el grupo que consiste en: cancer, enfermedad de Basedow, adenoma hipofisario, meningioma y talalgia.
13. Utilizacion de por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2) y anexina 1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas seleccionado de entre un fragmento resultante de la escision intracelular de una pre-pro-protema o de una pre-protema, o un epftopo de la protema
reconocido espedficamente por un anticuerpo contra la protema, una molecula de acido nucleico que codifica las mismas y una combinacion de los mismos, como un marcador en un metodo para la determinacion de la radiosensibilidad de un sujeto.
14. Kit adecuado para un metodo para la determinacion de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende por lo menos un reactivo para la deteccion espedfica de por lo menos un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apurmico o apirimidmico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), anexina 1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas seleccionado de entre un fragmento resultante de la escision intracelular de una pre-pro-protema o de una pre-protema, o un epttopo de la protema reconocido espedficamente por un anticuerpo contra la protema, una molecula de acido nucleico que codifica las mismas y una combinacion de los mismos, y un reactivo para la deteccion de la apoptosis celular.
15. Kit adecuado para un metodo para la determinacion de la radiosensibilidad de un sujeto, que comprende por lo menos unos reactivos para la deteccion de por lo menos dos compuestos seleccionados de entre el grupo que consiste en: isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) mitocondrial, ADN-(sitio apunnico o apirimidfnico) liasa (APEX1), protema cognada de choque termico de 71 kDa (HSC70), adenilato cinasa (AK2), anexina 1 (ANX1), un fragmento espedfico de las mismas seleccionado de entre un fragmento resultante de la escision intracelular de una pre-pro-protema o de una pre-protema, o un epttopo de la protema reconocido espedficamente por un anticuerpo contra la protema, un acido nucleico que codifica las mismas y una combinacion de los mismos, y un reactivo para la deteccion de apoptosis celular.
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