ES2709748T3 - Isoformas de MASP como inhibidores de la activación del complemento - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado asociado a ficolina que tiene en su extremo C-terminal la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4, polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos 20-380 de la SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de la misma que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1.

Description

DESCRIPCION

Isoformas de MASP como inhibidores de la activacion del complemento

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a nuevos polipeptidos asociados a ficolina y polipeptidos derivados de estos polipeptidos asociados a ficolina para el uso en el tratamiento de afecciones asociadas con inflamacion, apoptosis, autoinmunidad, coagulacion, enfermedades tromboticas o coagulopaticas relacionadas. La presente invencion se refiere ademas a anticuerpos que reconocen tales novedosos polipeptidos asociados a ficolina y polipeptidos derivados de los mismos, a moleculas de acido nucleico que codifican tales polipeptidos, a vectores y a celulas huesped utilizadas en la produccion de los polipeptidos.

Antecedentes de la invencion

La activacion del sistema del complemento (C) se realiza a traves de tres vfas de iniciacion diferentes: La ruta alternativa (AP), el clasico (CP), o la de a lectina (LCP). La activacion de AP se produce en las superficies extranas y es causada por una lenta hidrolisis espontanea de C3 y la actividad de los factores properdina, el factor B y el factor D para formar la C3 convertasa C3bBb funcional. La Ap tambien funciona como una ruta de amplificacion (el bucle de amplificacion) de las otras dos vfas. Recientemente se ha demostrado que el ensamblaje de la convertasa alternativa tambien puede iniciarse mediante la union no covalente de properdina a algunas superficies objetivo. Por otro lado, la activacion de la CP se inicia cuando C1q se une a inmunoglobulinas en complejos con antigenos, que desencadena la activacion de las serina proteasas C lr y C1s asociadas a C1q. C1s escinde y activa C4 y C2 para formar la CP C3 convertasa C4b2a. La LCP se activa cuando la lectina de union a manosa (MBL) o las ficolinas se unen a patrones restringidos de carbohidratos o compuestos acetilados, por ejemplo, en la superficie de los microorganismos o cuando se exponen en celulas huesped moribundas. Al unirse al ligando, la serina proteasa asociada MASP-2 activa y escinde C4 y C2 para formar la LCP C3 convertasa C4b2a. Se ha sugerido que la funcion de MASP-1 implica una estabilizacion de la escision de MASP-2 de C2 y tambien la escision directa de grado bajo de C3. Sin embargo, otros estudios relacionan la funcion y la actividad de MASP-1 y MASP-2 con una comunicacion del sistema de coagulacion que involucra a la protrombina, al fibrinogeno y al factor XIII. Usando ratones defectivos en MASP1/3, recientemente se demostro que MASP-1 de hecho contribuye a la actividad del complemento. La funcion exacta de la serina proteasa asociada a MBL mas recientemente descubierta MASP-3 aun no se ha dilucidado. Estudios que indican que MASP-3 se asocia con un rango limitado de oligomeros de MBL y que MASP-3 y la pequena protema asociada a MBL (sMAP) estan involucrados en la regulacion o inhibicion de la activacion del complemento de LCP dependiente de MBL.

MASP-1 y -3 derivan del mismo gen MASP1/3 (presente en el cromosoma 3q27-q28) a traves de corte y empalme diferencial. Contienen una cadena A identica a excepcion de 15 residuos C-terminales. La cadena A se compone de dos dominios CUB (C1r/C1s, urquina-EGF, protema morfogenetica osea) separados por un dominio de EGF (factor de crecimiento epidermico) y seguidos por dos dominios CCP (protema de control del complemento). La cadena B que incluye el dominio de serina proteasa es diferente para MASP-1 y MASP-3. MASP-2 y el sMAP tambien derivan del mismo gen (presente en el cromosoma 1p36-p36.2), donde el sMAP es una forma truncada que carece del dominio de serina proteasa y una parte importante de la cadena A. Se ha demostrado que el gen MASP1/3 es polimorfico, pero la importancia funcional de esto todavfa es poco conocida. Sin embargo, existe cierta evidencia de que los polimorfismos en el gen MASP2/sMAP estan asociados con un mayor riesgo de infecciones. La expresion de las MASP se localiza en los hepatocitos del fugado, pero un estudio reciente ha descrito que el ARNm de MASP-3 humana (como el unico ARNm de MASP) se expresaba en una amplia gama de tejidos.

El documento US2007093443 parece desvelar la provision de proteasas modificadas que inhiben la activacion del complemento. Desvela un procedimiento de modulacion de la activacion del complemento, que comprende poner en contacto una proteasa no del complemento con uno o mas sustratos diana de una ruta del complemento.

BASE DE DATOS UniProt [En lmea] 7 de julio de 2009 (07/07/2009), obtenido de la EBI con numero de acceso UNIPROT:B4DUI7 el numero de acceso en la base de datos B4DUI7 desvela la protema humana 354 AA que es muy similar al componente de activacion del complemento del factor reactivo con Ra (EC 3.4.21.-).

"Mannan-binding lectin serine protease 2" recuperado del numero de acceso EBI UNIPROT:000187 n.° de acceso en la base de datos 000187 desvela la lectina serina proteasas 2 de union a manano humana (EC=3.4.21.104) [0010] "Human MBLD4 associated serine protease-2 CUBI-EGF-CUBII domain, SEQ ID 10." XP002600315 recuperado del numero de acceso EBI GSP:AGE19338 n.° de acceso en la base de datos AGE19338 desvela la serina proteasa 2 asociada a MBL humana AA 293-dominio CUBI-EGF-CUBII domain BEINROHR LASZLO y col.,: t Re NDS IN MOLECULAR MEDICINE DEC 2008 LNKDPUBMED:18977695, vol. 14, n.° 12, Diciembre de 2008 (2008-12), paginas 511-521, desvela C1, MBL-MASP e inhibidor de C1: novedosos enfoques para atacar la inflamacion mediada por el complemento. FUJITA TEIZO y col.,: IMMUNOLOGICAL REVIEWS APR 2004 LNKDPU^b M^e D:15199963, vol. 198, Abril 2004 (2004-04), pagina 185-202, desvela el papel en la inmunidad innata y la evolucion de la ruta del complemento de lectina. El documento US 2005/032157 desvela la disposicion de la preparacion recombinante del fragmento C-terminal plegado no glicosilado de serina proteasa multidominio, produciendo un fragmento en el huesped bacteriano utilizando un vector que expresa el fragmento codificante del inserto de ADN, obteniendo el fragmento en forma plegada del huesped.

Teillet Feta.," Journal of Biological Chemistry, VOL.283, NR.37, PG. 25715 - 25724 desvela la estructura del dominio CUB1 -EGF-CUB2 de MASP-1/3 humana y la identificacion de sus sitios de interaccion con lectinas y ficolinas de union a manano.

Objeto de la invencion

Es un objeto de las realizaciones de la invencion proporcionar polipeptidos adecuados para el tratamiento de afecciones asociadas con inflamacion, apoptosis, autoinmunidad, coagulacion, y/o enfermedades tromboticas o coagulopaticas relacionadas.

Sumario de la invencion

El inventor o inventores descubrieron que los nuevos polipeptidos que se asocian con las moleculas de reconocimiento de la ruta del complemento de lectina, asf como los polipeptidos, tales como los fragmentos derivados de los mismos se pueden usar en el tratamiento de afecciones medicas espedficas asociadas con inflamacion, apoptosis, autoinmunidad, coagulacion, y/o enfermedades tromboticas o coagulopaticas relacionadas. Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invencion se refiere a un polipeptido asociado a ficolina aislado que tiene en su extremo C-terminal la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, en el que el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos 20-380 de la SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de la misma que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO:1.

En un segundo aspecto, la presente invencion se refiere a un anticuerpo que se une espedficamente a un polipeptido de acuerdo con la invencion.

En un tercer aspecto, la presente invencion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido de acuerdo con la invencion.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 70 % identica a la secuencia de la SEQ NO:2.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un vector que comprende una molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido de acuerdo con la invencion.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a una celula huesped que comprende un vector que comprende una molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido de acuerdo con la invencion.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un procedimiento para producir el polipeptido de acuerdo con la invencion, comprendiendo el procedimiento cultivar una celula de acuerdo con la invencion en un medio de crecimiento apropiado en condiciones que permitan la expresion de la construccion de polinucleotido y recuperar el polipeptido resultante del medio de cultivo.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende un polipeptido de acuerdo con la invencion.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido de acuerdo con la invencion.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un procedimiento para detectar un polipeptido de acuerdo con la presente invencion en una muestra biologica, comprendiendo el procedimiento:

a) obtener una muestra biologica;

b) poner en contacto la muestra biologica con un anticuerpo de acuerdo con la invencion; y

c) detectar complejos del anticuerpo y el polipeptido, si hay alguno;

como una indicacion de la presencia del polipeptido en la muestra.

En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un polipeptido de acuerdo con la invencion para su uso como un medicamento.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Transcripcion alternativa del gen de MASP-1. Se detecto una transcripcion alternativa del gen MASP1 en el ADNc de hngado. Los transcritos de MASP1, MASP3 y FAP se amplificaron utilizando un cebador directo comun ubicado en el exon 6 y los cebadores inversos espedficos ubicados en el exon 12 (MASP1), el exon 11 (MASP3) y el exon 8a (FAP). MASP1 genera un fragmento de 500 pb, MASP3 genera un fragmento de 506 pb y FAP genera un fragmento de 309 pb.

Figura 2: Corte y empalme alternativo del gen MASP1. MASP1 se genera mediante corte y empalme de 8a y el exon 11, conteniendo ambos una secuencia de codon de terminacion (marcada con recuadros negros). La secuencia de MASP1 contiene un codon de terminacion en el exon 17. MASP3 se genera mediante el corte y empalme del exon 8a y FAP se genera si no se produce el corte y empalme del exon 8a. La protema FAP contiene los dos dominios CUB, el dominio EFG y el primer dominio CCP1.

Figura 3: Expresion tisular del fragmento FAP. Las distribuciones tisulares de los genes de MASP-1, MASP3 y FAP se investigaron en paneles de ADNc de Clontech. Los transcritos de MASP-1, MASP-3 y FAP se amplificaron utilizando un cebador directo comun y cebadores inversos espedficos. Se uso GADPH como gen de referencia. Los tres genes estaban altamente expresfados en el tngado y, ademas, el de FAP se expresaron fuertemente en tejido cardfaco (marcado con flechas negras). Se detecto una expresion menor del gen de FAP en el cerebro, colon, prostata, musculo esqueletico e intestino delgado (marcado con flechas blancas).

Figura 4: Alineacion de MASP-1, MASP-3 y FAP. Las secuencias proteicas de MASP-1, MASP-3 y FAP se alinearon utilizando el software BioEdit. MASP-1 y MASP-3 contienen diferentes dominios de serina proteasa en C-terminal, mientras que FAP no contiene ningun dominio de serina proteasa. En su lugar, la protema contiene 17 aminoacidos nuevos en la region C-terminal.

Figura 5: Secuencia de ADNc y secuencia proteica correspondiente de FAP. La secuencia de ADNc se muestra en la fila superior y la secuencia proteica correspondiente se muestra a continuacion. Las regiones de los exones estan divididas por lmeas verticales negras. Los aminoacidos que se cree que estan involucrados en la union a MBL/ficolinas estan marcados con recuadros de color amarillo claro.

Figura 6: Activacion del complemento MASP-1. Los MBL humanos se incubaron con una cantidad mayor de MASP-1. MASP-1 pudo activar las protemas del complemento C3 y C4.

Figura 7: Activacion del complemento MASP-2. Los MBL humanos se incubaron con una cantidad mayor de MASP-2. MASP-2 pudo activar fuertemente las protemas del complemento C3 y C4.

Figura 8: Inhibicion de MASP-3 del complemento. Los MBL humanos se incubaron con una cantidad mayor de MASP-3. MASP-3 pudo inhibir la activacion de las protemas del complemento C3 y C4.

Figura 9: Inmunoprecipitacion. Inmunoprecipitacion de Ficolina/MBL en suero con el mAb anti-MBL 131-11, clon 219 anti-ficolina-2 y clon 334 anti-ficolina-3. Seguido por la separacion magnetica de esferas Dynal, SDS-PAGE, transferencia de tipo Western y clon 8B3 anti-MASP-1/MASP-3 marcada como anticuerpo de senal.

Figura 10: La FAP interacciona con la ficolina cuando se une a la seroalbumina humana acetilada (AcHSA). Union de ficolina serica eluida a AcHSA. Transferencia de tipo Western con clon 8B3 anti-MASP-1/MASP-3 marcado como anticuerpo de senal.

Figura 11: Constantes cineticas y de disociacion para la interaccion entre MASP-1 y MASP-3 y rficolina-2 (Hummelsh0j T y col., Mol. Immunol., 2007).

Figura 12: Alineacion de GULF y los 17 aminoacidos unicos de FAP.

Figura 13: Activacion del complemento de C4 en un ensayo ELISA de manano/MBL. Los pocillos recubiertos con manano se incubaron con o sin MBL humana recombinantes, seguido de incubacion con suero deficiente en MBL homocigoto en diluciones en serie. La deposicion de C4 se midio utilizando anticuerpos policlonales anti-C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estandar en determinaciones dobles de cada punto en las curvas.

Figura 14: Activacion del complemento de C4 en un ensayo ELISA de BSA acetilada/ficolina-3. Los pocillos recubiertos con AcBSA se incubaron con o sin ficolina-3 humana recombinante, seguido de incubacion con suero deficiente en ficolina-3 homocigoto en diluciones en serie. La deposicion de C4 se midio utilizando anticuerpos policlonales anti-C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estandar en determinaciones dobles de cada punto en las curvas.

Figura 15: Activacion del complemento de C4 en un ensayo ELISA de manano/MBL. Los pocillos recubiertos con manano se incubaron con MBL humana recombinante seguido de incubacion con diluciones en serie de rMASP-1 como sobrenadantes de cultivo en medio sin suero en una dimension. El suero deficiente en MBL homocigoto se incubo posteriormente en diluciones en serie en la segunda dimension. La deposicion de C4 se midio utilizando anticuerpos policlonales anti-C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estandar en determinaciones dobles de cada punto en las curvas.

Figura 16: Activacion del complemento de C4 en un ensayo ELISA de BSA Ac/Ficolina-3. Los pocillos recubiertos con AcBSA se incubaron con ficolina-3 humana recombinante seguido de incubacion con diluciones en serie de rMASP-1 como sobrenadantes de cultivo en medio sin suero en una dimension. El suero deficiente en ficolina-3 homocigoto se incubo posteriormente en diluciones en serie en la segunda dimension. La deposicion de C4 se midio utilizando anticuerpos policlonales anti-C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estandar en determinaciones dobles de cada punto en las curvas.

Figura 17: Activacion del complemento de C4 en un ELISA de manano/MBL. Los pocillos recubiertos con manano se incubaron con MBL humana recombinante seguido de incubacion con diluciones en serie de rMASP-2 como sobrenadantes de cultivo en medio sin suero en una dimension. El suero deficiente en MBL homocigoto se incubo posteriormente en diluciones en serie en la segunda dimension. La deposicion de C4 se midio utilizando anticuerpos policlonales anti-C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estandar en determinaciones dobles de cada punto en las curvas.

Figura 18: Activacion del complemento de C4 en un ensayo ELISA de BSA Ac/Ficolina-3. Los pocillos recubiertos con AcBSA se incubaron con ficolina-3 humana recombinante seguido de incubacion con diluciones en serie de rMASP-2 como sobrenadantes de cultivo en medio sin suero en una dimension. El suero deficiente en ficolina-3 homocigoto se incubo posteriormente en diluciones en serie en la segunda dimension. La deposicion de C4 se midio utilizando anticuerpos policlonales anti-C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estandar en determinaciones dobles de cada punto en las curvas.

Figura 19: Activacion del complemento de C4 en un ensayo ELISA de manano/MBL. Los pocillos recubiertos con manano se incubaron con MBL humana recombinante seguido de incubacion con diluciones en serie de rMASP-3 como sobrenadantes de cultivo en medio sin suero en una dimension. El suero deficiente en MBL homocigoto se incubo posteriormente en diluciones en serie en la segunda dimension. La deposicion de C4 se midio utilizando anticuerpos policlonales anti-C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estandar en determinaciones dobles de cada punto en las curvas.

Figura 20: Activacion del complemento de C4 en un ensayo ELISA de BSA Ac/Ficolina-3. Los pocillos recubiertos con AcBSA se incubaron con ficolina-3 humana recombinante seguido de incubacion con diluciones en serie de rMASP-3 como sobrenadantes de cultivo en medio sin suero en una dimension. El suero deficiente en ficolina-3 homocigoto se incubo posteriormente en diluciones en serie en la segunda dimension. La deposicion de C4 se midio utilizando anticuerpos policlonales anti-C4c. Las barras de error indican dos veces las desviaciones estandar en determinaciones dobles de cada punto en las curvas.

Figura 21: Distribucion tisular de FAP, MASP1 y MASP3. FAP se expreso mucho mas en el tejido cardfaco en comparacion con MASP1 y MASP3. FAP se expreso tres veces mas en el tejido cardfaco en comparacion con la expresion de FAP en el hngado. Ademas, se observo una mayor expresion de FAP en el hngado en comparacion con la expresion de MASP1 y MASP3 en el hngado. Tambien se detecto una considerable expresion de FAP en el cerebro, musculo esqueletico y tejidos prostaticos. El experimento se realizo tres veces por duplicado. Se indican los errores estandar de la media.

Figura 22: Localizacion inmunohistoqmmica hepatica de MAP-1 utilizando antisuero policlonal de raton generado contra los 17 residuos C-terminales espedficos de FAP de la protema. La tincion de control fue negativa. Varios anticuerpos policlonales diferentes producidos contra FAP (conejo y raton) mostraron el mismo patron de tincion. Figura 23: Analisis inmunohistoqmmico de la localizacion del tejido MAP-1 (OM X10). El panel izquierdo muestra la tincion con un mAb (12B11) a MAP-1. El panel derecho muestra la tincion de control de isotipo con un mAb IgG1k no relacionado. (A-B): Miocardio, (C-D): musculo esqueletico, (E-F): muestra de hngado, (G-H): tejido aortico. La barra de la esquina inferior derecha indica 50 pm en todos los portaobjetos.

Figura 24: Inmunoprecipitacion de los complejos sericos MAP-1 y MASP-1/3. (A) MAP-1 y MASP-1/3 se inmunoprecipitaron en suero usando el mAb 20C4 (anti MAP-1) y el mAb 8B3 (anti MASP-1/3, con un epttopo en la cadena pesada comun). Las muestras reducidas se sometieron a electrotransferencia y se desarrollaron con pAb frente a MAP-1 o mAb biotinilados frente a ficolina-3 (FCN334) y MBL (Hyb 131-1). (B) Inmunoprecipitacion con mAb frente a MBL (Hyb 131-11), ficolina-2 (FCN219) y ficolina-3 (FCN334) de 1 ml, 300 pl y 100 pl de suero, respectivamente (lado izquierdo). Los controles fueron MAP-1 precipitada en suero (sMAP-1) y rMAP-1 del sobrenadante de cultivo (rMAP-1) usando el mAb anti MAP-1 20C4 (lado derecho). Las muestras se analizaron mediante transferencia Western con sondas de pAb a MAP-1.

Figura 25: Influencia de MASP-2 y MAP-1 en MBL y deposicion de C4 del complemento mediada por ficolina-3. Las deposiciones de C4 se midieron utilizando un anticuerpo policlonal contra C4 y se dan como valores de DO490-650 nm. Las barras de error indican dos veces la desviacion estandar de determinaciones dobles. Concentraciones aproximadas de rMBL, rficolina-3. rMAP-1 y rMASP-2 se dan en las etiquetas de las figuras. (A) Reconstitucion de la deposicion de C4 en una superficie recubierta con manano utilizando suero deficiente en MBL con rMBL a 400 ng/ml. El control fue sin adicion de rMBL. (B) Efecto dependiente de la dosis de rMASP-2 en la deposicion de C4 mediada por rMBL. (C) Efecto dependiente de la dosis de rMAP-1 en la deposicion de C4 mediada por rMBL. (D) Reconstitucion de la deposicion de C4 en una superficie recubierta con AcBSA usando suero deficiente en ficolina-3 con rficolina-3 a 400 ng/ml. El control fue sin adicion de rficolina-3. (E) Efecto dependiente de la dosis de rMASP-2 sobre la deposicion de C4 mediada por rficolina-3. (F) Efecto dependiente de la dosis de rMAP-1 sobre la deposicion de C4 mediada por rficolina-3.

Figura 26: Influencia de MASP-2 y MAP-1 en la deposicion del complemento C4 en un sistema puro. Se preincubo rMBL en una superficie de manano con diluciones en serie de rMASP-2 en la primera dimension. Luego se aplicaron diluciones en serie de rMAP-1 en la segunda dimension, seguido de la aplicacion de C4 purificado a 1 |jg/ml. Las deposiciones de C4 se midieron con un pAb frente a C4 y se dan como valores de DO490-650 nm. Las barras de error indican dos veces la desviacion estandar de determinaciones dobles. Las concentraciones aproximadas de rMAP-1 y rMASP-2 se dan en las etiquetas de la figura.

Figura 27: Analisis SDS-PAGE de rMAP-1. El lado izquierdo muestra el analisis de inmunotransferencia /-tratamiento con N-glicosidasa F (ENDO-F). En el lado derecho se muestra la correspondiente tincion de coomassie.

Figura 28A, B. Curvas de calibracion. A) Curva de calibracion generada por el ELISA de mAb 20C4/mAb-8B3 de dos vfas con diluciones en serie al doble de rMAP-1 aplicada a un grupo de suero humano normal con deplecion de MAP-1 (pNHS) o diluciones en serie de rMAP-1 diluida en PBS/0,05 % de Tweem/EDTA 10 mM. Las barras de error indican dos veces la desviacion estandar de ocho determinaciones. B) Inmunotransferencia de suero con deplecion de MAP-1, suero humano normal y suero con deplecion de MAP-1 enriquecido con rMAP-1.

Figura 29A-C. Concentracion serica de MAP-1. A) Concentraciones sericas e intervalo de distribucion de MAP-1 en 100 donantes de sangre daneses. Nivel serico medio: 240 ng/ml. Intervalo: 115-466 ng/ml; B) Correlacion entre los niveles sericos de MASP-3 y MAP-1; C) Influencia de la congelacion y descongelacion del suero. El suero se congelo y descongelo en 8 rondas y se midio el nivel de MAP-1 para cada ronda. Las barras de error indican dos veces la desviacion estandar de determinaciones dobles.

Figura 30. A) Niveles de asociacion (en unidades relativas de D.O. a 490-650 nm) entre MAP-1 y MBL, ficolina-2 y ficolina-3, respectivamente en 100 donantes de sangre daneses. Los valores de p se obtuvieron mediante una prueba t no parametrica de dos colas. B) Correlacion entre los niveles sericos de ^mAP-1 y la asociacion relativa a MBL, ficolina-2 y ficolina-3 (lado izquierdo). Correlacion entre los niveles sericos de MBL, ficolina-2 y ficolina-3 y la asociacion relativa con MAP-1 (lado derecho). Se calcularon los valores de correlacion p y r sutilizando la prueba de correlacion de rango de Spearman no parametrica.

Figura 31A-C. Ultracentrifugacion en gradiente de sacarosa. A) Fracciones recolectadas (1-27) del suero sometido a un gradiente de densidad de sacarosa del 10-30 %. Las fracciones se analizaron mediante ELISA espedfico para: MAP-1, MASP-3, MBL, ficolina-2 y ficolina-3. Los picos de IgM (19S) e IgG (7S) en suero se indicaron en la parte superior del grafico. B) Las fracciones numero 8-23 analizadas por inmunotransferencia para: MAP-1, ^mA^s P-1, M^a SP-3, sMAP, MASP-2, MBL, ficolina-2 y ficolina-3. C) Las fracciones 1-27 analizadas por la capacidad de activar C4 humano aplicado exogenamente sobre BSA acetilada inmovilizada (un ligando de ficolina-3) o manano (un ligando de MBL).

Divulgacion detallada de la invencion

Los presentes inventores han descubierto una nueva protema plasmatica de 40 kDa asociada con las moleculas de reconocimiento de la ruta del complemento de lectina e identificaron esto como una nueva variante de transcripcion alternativa de MASP-1/MASP-3 que, a su vez, corresponde a la protema plasmatica recien descubierta.

Los inventores de la presente invencion han demostrado que la nueva protema (que los inventores han denominado FAP (protema asociada a Ficolina A) o MAP-1 (MBL/protema 1 asociada a Ficolina) carece de un dominio enzimatico pero que contiene el dominio de union ficolina/MBL y, por lo tanto, se espera que este involucrado en la regulacion e inhibicion de las funciones de complemento y coagulacion a traves de la competicion el desplazamiento de las MASP o, alternativamente, pero no se excluyen mutuamente como una protema implicada en las funciones de captacion o senalizacion.

La activacion incontrolada del sistema del complemento y/o la cascada de coagulacion esta fuertemente asociada con resultados graves y fatales en diversas enfermedades que van desde la inflamacion sistemica y la sepsis, al infarto de miocardio y autoinmunidad.

Se ha demostrado que la inhibicion de la coagulacion y la activacion del complemento es una herramienta terapeutica prometedora.

La presente invencion describe tanto un posible nuevo inhibidor de las funciones del complemento como de la coagulacion. Sin embargo, los polipeptidos de acuerdo con la presente invencion pueden tener otras funciones, tal como una funcion de captacion y/o senalizacion. Ademas, puede usarse como un nuevo biomarcador en varios entornos de enfermedades, incluyendo enfermedades malignas, autoinmunes, y afecciones metabolicas y/o inflamatorias.

Los inventores de la presente invencion han descubierto una protema plasmatica presente in vivo denominada Protema Asociada a Ficolina (FAP) y demostraron que esta asociada principalmente con las ficolinas (figura 9), pero que probablemente tambien este asociada con la lectina que se une a la manosa. Al buscar en la base de datos de nucleotidos del NCBI, los inventores de la presente invencion descubrieron una posible variante de transcripcion que corresponde a un fragmento truncado de MASP-1. Segun esta secuencia, los cebadores se disenaron para amplificar la nueva transcripcion del gen putativo. Posteriormente, utilizando ADNc de Idgado humano se identifico una nueva variante de transcripcion alternativa del gen de MASP-1 (figura 1). Esta cepa de ARNm se secuencio y, en consecuencia, se determino la secuencia de aminoacidos, que corresponde al peso molecular de la protema observada en plasma/suero de 40 kDa (figura 5). La nueva protema es parcialmente identica a MASP-1 y MASP-3, pero carece de un dominio de serina proteasa, pero contiene un nuevo exon que codifica 17 aminoacidos seguidos de un codon de terminacion. Este exon se corta en el transcrito de MASP1 y MASP3 (figura 2). Al utilizar un panel de bibliotecas de expresion de ARNm, los presentes inventores han descubierto evidencias de que esta protema se expresa fuertemente en el corazon y en el Idgado, seguido de musculo esqueletico (figura 3). Se observo expresion debil en el cerebro, el tracto digestivo, la prostata y el bazo (figura 3). El analisis Taqman confirmo la expresion en celulas de corazon e Idgado. FAP se expreso mucho mas en el tejido cardfaco en comparacion con MASP1 y MASP3. FAP se expreso tres veces mas en el tejido cardfaco en comparacion con la expresion de FAP en el Idgado. Ademas, se observo una mayor expresion de FAP en el Idgado en comparacion con la expresion de MASP1 y MASP3 en el Idgado. Tambien se detecto una considerable expresion de FAP en el cerebro, musculo esqueletico y tejidos prostaticos. El experimento se realizo tres veces por duplicado.

La alta expresion en el corazon es muy prominente y ha hecho que los presentes inventores sugieran un uso de los polipeptidos de acuerdo con la presente invencion como protectores muy utiles contra el dano tisular en autoinmunidad, afecciones metabolicas y/o inflamatorias, tales como afecciones medicas asociadas con el corazon. Los presentes inventores han establecido ensayos para evaluar la actividad del complemento iniciada por las ficolinas y la lectina de union a manosa y, por lo tanto, los presentes inventores han podido mostrar una posible inhibicion funcional del complemento de fAp .

Los presentes inventores han establecido ensayos cuantitativos en tiempo real para medir el nivel de expresion relativa exacto en diferentes tejidos.

Los polipeptidos de acuerdo con la presente invencion pueden producirse mediante tecnicas recombinantes. Los conejos o ratones pueden inmunizarse con un peptido unico de 17 aminoacidos para obtener anticuerpos policlonales y monoclonales espedficos de FAP, respectivamente.

Se pueden usar anticuerpos espedficos contra FAP para la medicion cuantitativa de FAP y la deteccion inmunohistoqmmica en diferentes tejidos.

Las constantes de union entre FAP y diferentes parejas de union como se describe en el presente documento pueden determinarse en ELISA y utilizando la tecnologfa de resonancia de plasmon superficial (Biacore).

Una protema aceptora espedfica de FAP, tal como un receptor unido a la superficie celular espedfico puede identificarse mediante ensayos estandar conocidos por los expertos en la tecnica, tales como ensayos en los que la protema esta unida directamente a las celulas.

La nueva protema asociada a ficolina (FAP) es una variante alternativa de corte y empalme de MASP1. La protema carece del dominio serina proteasa pero todavfa contiene los dominios que estan involucrados en la union a los iniciadores de la ruta de la lectina del sistema del complemento. Por tanto, los presentes inventores esperan que la protema este involucrada en la regulacion e inhibicion de la funcion de MASP-1 y MASP-3 (complemento, funciones de coagulacion y otros sustratos enzimaticos) a traves de las competencias y el desplazamiento de las MASP. Como alternativa, pero no la FAP mutuamente excluyente, puede funcionar como molecula secuestrante que facilita la eliminacion de complejos de FAP/MBL/ficolina unidos a material de desecho endogeno o patogenos.

La activacion incontrolada del sistema del complemento y la cascada de coagulacion se asocian con resultados adversos e inhibidores funcionales, tales como los polipeptidos de acuerdo con la presente invencion pueden ser muy utiles para el control del sistema del complemento y la cascada de coagulacion. Ademas, los polipeptidos de acuerdo con la presente invencion se pueden usar en otros entornos. Otro angulo podna ser el uso de la protema como biomarcador en diferentes entornos de enfermedades.

La protema es unica y puede proporcionar la base para nuevos medicamentos y/o nuevas herramientas de diagnostico.

Los polipeptidos de acuerdo con la presente invencion que comprenden la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4 o un fragmento inmunologico o variante de la misma pueden tener una funcion espedfica asociada con esta secuencia de aminoacidos. Los presentes inventores sugieren que dichos polipeptidos pueden tener una funcion o actividad correspondiente a la actividad de una o mas protemas seleccionadas de ADN de DNMT1 (citosina-5-)-metiltransferasa 1 (DNMT1), miembro 1 de la subfamilia B de Golgin (GOLGB1), protema 9 de anclaje a quinasa (AKAP9), protema asociada a linfocitos B y T (antfgeno CD272), protema 1 adaptadora de envolvimiento que contiene el dominio PTB (GULP) y protema 2 que contiene el dominio MACRO.

En algunas realizaciones interesantes particulares, los polipeptidos de acuerdo con la presente invencion tienen una funcion o actividad correspondiente a la actividad de la protema 1 adaptadora del envolvimiento que contiene el dominio PTB (GULP).

Definiciones

La expresion "polipeptido asociado a ficolina", como se usa en el presente documento, significa cualquier protema o polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos 20-380 de la protema asociada a ficolina humana nativa (FAP) (SEQ ID NO: 1) o la secuencia de aminoacidos de 16-363 de la SEQ ID NO: 9, variantes funcionales, versiones truncadas funcionales de los mismos, asf como derivados o conjugados funcionales, cuyo polipeptido no tiene actividad de complemento, pero posee la habilidad de competir con MASP-1, MASP-2 o MASP-3 por la union a ficolina-3, MBL, C1q, protemas surfactantes de pulmon SP-A y/o SP-D y/o CL-L1 (y otros miembros de la familia de la colectina). Esto incluye, pero sin limitaciones, el polipeptido asociado a ficolina humana (FAP) que tiene la SEQ ID NO:1 y variantes de la misma.

La expresion "protema asociada a ficolina (FAP)" como se usa en el presente documento significa protemas que tienen la secuencia de aminoacidos 1-380 (con o sin peptido senal, tal como la secuencia de aminoacidos 20-380) de la FAP humana nativa (SEQ ID NO: 1), variaciones alelicas naturales y homologas de las mismas. Tambien incluye protemas con una secuencia de aminoacidos ligeramente modificada, por ejemplo, un extremo N o C terminal modificado que incluye deleciones o adiciones de aminoacidos en los extremos N o C terminales siempre que esas protemas conserven sustancialmente la actividad de FAP. La expresion "protema asociada a ficolina (FAP)" se usa en el presente documento de manera intercambiable con los terminos "MAP-1" o "protema 1 asociada a MBL/Ficolina". "FAP" dentro de la definicion anterior tambien incluye variaciones alelicas naturales que pueden existir y ocurrir de un individuo a otro. El termino tambien incluye protemas con secuencia homologa y funcion similar derivada de otras especies que no son humanas, tales como bovinas, de cerdo, perro, caballo, rata y raton. Asimismo, el grado y la ubicacion de la glicosilacion u otras modificaciones posteriores a la traduccion pueden variar segun las celulas huesped elegidas y la naturaleza del entorno celular del huesped.

La expresion "serina proteasa 1 asociada a MBL" o "MASP-1", como se usa en el presente documento, significa protemas que tienen la secuencia de aminoacidos 1-699 (con o sin peptido senal, tal como la secuencia de aminoacidos 20-699) de MASP-1 humana nativa (SEC ID NO: 5), variaciones alelicas naturales y homologas de las mismas. Debe entenderse que la secuencia puede estar en una o mas cadenas peptfdicas, tal como en dos cadenas, es decir, las cadenas pesadas y ligeras de la protema humana nativa.

La expresion "serina proteasa 3 asociada a MBL" o "MASP-3", como se usa en el presente documento, significa protemas que tienen la secuencia de aminoacidos 1-728 (con o sin peptido senal, tal como la secuencia de aminoacidos 20-728) de MASP-3 humana nativa (SEC ID NO: 7), variaciones alelicas naturales y homologas de las mismas. Debe entenderse que la secuencia puede estar en una o mas cadenas peptfdicas, tal como en dos cadenas, es decir, las cadenas pesadas y ligeras de la protema humana nativa.

La expresion "serina proteasa 2 asociada a MBL" o "MASP-2", como se usa en el presente documento, significa protemas que tienen la secuencia de aminoacidos 1-686 (con o sin peptido senal, tal como la secuencia de aminoacidos 16-686) de MASP-2 humana nativa (SEQ ID NO: 9), variaciones alelicas naturales y homologas de las mismas. Debe entenderse que la secuencia puede estar en una o mas cadenas peptfdicas, tal como en dos cadenas, es decir, las cadenas pesadas y ligeras de la protema humana nativa.

Las expresiones "pequena protema asociada a MBL", "sMAP", "protema plasmatica asociada a MBL de 19 kD" o, "MAp19" como se usa en el presente documento significa protemas que tienen la secuencia de aminoacidos 1-185 (con o sin peptido senal, como la secuencia de aminoacidos 16-185) de la sMAP humana nativa (SEQ ID NO:11), variaciones alelicas naturales y homologas de las mismas.

Los terminos "variante" o "variantes", como se usa en el presente documento, pretenden designar un polipeptido asociado a ficolina que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:4, el la que uno o mas aminoacidos han sido sustituidos por otro aminoacido y/o en la que uno o mas aminoacidos se han delecionado y/o en la que uno o mas aminoacidos se han insertado en el polipeptido y/o en la que uno o mas aminoacidos se han anadido al polipeptido. Dicha adicion puede tener lugar en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal o en ambos. La "variante" o "variantes" dentro de esta definicion aun tienen actividad funcional. En alguna realizacion, una variante tiene una identidad de secuencia del 70 % con la secuencia de la SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 80 % con la secuencia de la SEQ ID NO:1. En otras realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 90 % con la secuencia de SEQ ID NO:1. En una realizacion adicional, una variante tiene una identidad de secuencia del 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 1.

En algunas realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 70 % con la secuencia de la SEQ ID NO:4. En algunas realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 80 % con la secuencia de la SEQ ID NO:4. En otras realizaciones, una variante tiene una identidad de secuencia del 90 % con la secuencia de SEQ ID NO:4. En una realizacion adicional, una variante tiene una identidad de secuencia del 95 % con la secuencia de SEQ ID NO: 4.

Las frases "variante funcional", "versiones funcionales truncadas" y "derivados funcionales" como se usa en el presente documento se refiere a variantes, versiones truncadas, asf como derivados de SEQ ID NO: 1, cuyos polipeptidos comprenden partes de secuencia esenciales de la SEQ ID NO:1 y al menos tienen la capacidad de competir con MASP-1 o MASP-3 para unirse a las ficolinas o MBL sin tener la actividad del complemento y/o la actividad de serina proteasa. Debe entenderse que un polipeptido asociado a ficolina puede tener dos o tres caractensticas seleccionadas de ser tanto una variante como un truncado y/o un derivado.

Una variante funcional de un polipeptido asociado a ficolina abarca aquellos que exhiben al menos aproximadamente el 25 %, tal como al menos aproximadamente el 50 %, tal como al menos aproximadamente el 75 %, tal como al menos aproximadamente el 90 % de la actividad espedfica de FAP de tipo salvaje que se ha producido en el mismo tipo de celula, cuando se prueba en los ensayos como se describe en el presente documento. La expresion "fragmento inmunologico" como se usa en el presente documento se refiere a un fragmento de una secuencia de aminoacidos que posee esencialmente las mismas actividades funcionales y la misma orientacion espacial reconocida por un anticuerpo. Por consiguiente, un anticuerpo espedfico se unira tanto al polipeptido como a sus fragmentos inmunologicos.

La expresion "otro aminoacido" como se usa en el presente documento significa un aminoacido que es diferente de ese aminoacido presente naturalmente en esa posicion. Esto incluye, pero sin limitaciones, aminoacidos que pueden estar codificados por un polinucleotido. En algunas realizaciones, el aminoacido diferente esta en la forma L natural y puede estar codificado por un polinucleotido.

El termino "derivado" como se usa en el presente documento, esta destinado a designar un polipeptido asociado a ficolina que exhibe sustancialmente la misma o mejor actividad biologica en relacion con la FAP humana de tipo salvaje, en la que uno o mas de los aminoacidos del peptido original se han modificado qmmicamente, por ejemplo mediante alquilacion, PEGilacion, acilacion, formacion de esteres o formacion de amidas o similares.

La expresion "actividad del complemento", como se usa en el presente documento, significa la capacidad para activar el sistema del complemento. La actividad del complemento se puede medir con un ensayo como se describe en la seccion titulada "Ensayos".

La expresion "lectina de union a manosa (MBL)" como se usa en el presente documento tambien significa lectina de union a manano, protema de union a manosa (MBP1) y protema de union a manano, terminos que se pueden usar indistintamente.

La expresion "capaz de asociarse" como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de las protemas de acuerdo con la presente invencion para unirse espedficamente en la solucion a uno o mas de los iniciadores de la ruta de lectina del sistema del complemento u otras protemas que pueden estar involucradas en el efecto del polipeptido.

El termino "construccion" pretende indicar un segmento de polinucleotido que puede basarse en una secuencia de nucleotidos natural completa o parcial que codifica el polipeptido de interes. La construccion puede contener, opcionalmente, otros segmentos polinucleotfdicos. De una manera similar, la expresion "aminoacidos que pueden estar codificados por construcciones polinucleotfdicas" cubre los aminoacidos que pueden estar codificados por las construcciones polinucleotfdicas definidas anteriormente, es decir, aminoacidos tales como Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Glu, Lys, Arg, His, Asp y Gln.

El termino "vector", como se usa en el presente documento, significa cualquier entidad de acido nucleico capaz de amplificarse en una celula huesped. Por tanto, el vector puede ser un vector de replicacion autonoma, es decir, un vector, que existe como entidad extracromosomica, cuya replicacion es independiente de la replicacion cromosomica, por ejemplo, un plasmido. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una celula huesped, se integra en el genoma de la celula huesped y se replica junto con el cromosoma A) en el que se ha integrado. La eleccion del vector dependera a menudo de la celula huesped en la que se va a introducir. Los vectores incluyen, pero sin limitaciones, vectores plasmfdicos, vectores fagos, virus o vectores cosmidos. Los vectores generalmente contienen un origen de replicacion y al menos un gen seleccionable, es decir, un gen que codifica un producto que es facilmente detectable o cuya presencia es esencial para el crecimiento celular.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona una celula huesped recombinante que comprende la construccion de polinucleotido o el vector. En algunas realizaciones, la celula huesped recombinante es una celula eucariota. En otras realizaciones, la celula huesped recombinante es de origen mairnfero. En una realizacion adicional, la celula huesped recombinante se selecciona del grupo que consiste en celulas CHO, celulas HEK y celulas BHK.

El termino "una celula huesped", como se usa en el presente documento, representa cualquier celula, incluyendo celulas hfbridas, en la que se puede expresar ADN heterologo. Las celulas huesped tfpicas incluyen, pero sin limitacion, celulas de insectos, celulas de levadura, celulas de mamffero, incluidas celulas humanas, tales como BHK, CHO, HEK y COS. En la practica de la presente invencion, las celulas huesped que se cultivan son, preferentemente, celulas de mamffero, mas preferentemente una lmea celular de mamffero establecida, que incluyen, sin limitacion, las lmeas celulares ^c H^o (por ejemplo, ATCC CCL 61), COS-1 (por ejemplo, ATCC CRL 1650), de rinon de hamster neonato (BHK) y HEK293 (por ejemplo, ATCC CRL 1573; Graham y col., J. Gen. Virol.

36: 59-72, 1977). Una lmea celular BHK preferida es la lmea celular tk-ts13 BHK (Waechter y Baserga, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79: 1106-1110, 1982), en lo sucesivo denominadas celulas BHK 570. La lmea celular BHK 570 esta disponible en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, con el numero de acceso ATCC CRL 10314. Tambien esta disponible una lmea celular tk' ts13 BHK de la ATCC con el numero de acceso CRL 1632. Otras lmeas celulares adecuadas incluyen, sin limitacion, Hep I de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Hep II de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de pulmon humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y celulas DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980). Tambien son utiles las celulas 3T3, celulas de Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas con otras celulas.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona un animal transgenico que contiene y expresa la construccion polinucleotfdica.

En un aspecto adicional, la invencion proporciona una planta transgenica que contiene y expresa la construccion polinucleotfdica.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un procedimiento para producir el polipeptido asociado a ficolina de la invencion, comprendiendo el procedimiento cultivar una celula que comprende la construccion polinucleotfdica en un medio de crecimiento apropiado en condiciones que permitan la expresion de la construccion polinucleotfdica y recuperar el polipeptido resultante del medio de cultivo.

Como se usa en el presente documento, la expresion "medio de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de celulas y la expresion de la secuencia de acido nucleico que codifica el polipeptido asociado a la ficolina de la invencion.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un procedimiento para producir el polipeptido asociado a ficolina, comprendiendo el procedimiento recuperar el polipeptido de la leche producida por el animal transgenico.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un procedimiento para producir el polipeptido asociado a ficolina, comprendiendo el procedimiento cultivar una celula de una planta transgenica que comprende la construccion polinucleotfdica y recuperar el polipeptido de la planta resultante.

En el presente contexto, el termino "tratamiento" pretende incluir tanto la prevencion de una afeccion esperada que involucra la activacion inadecuada del complemento, tal como la inflamacion y la lesion por reperfusion y la regulacion de una afeccion ya existente, tal como el infarto de miocardio y el accidente cerebrovascular con el fin de inhibir o minimizar el dano tisular. La administracion profilactica del polipeptido asociado a ficolina de acuerdo con la invencion se incluye, por tanto, en el termino "tratamiento".

El termino "sujeto", tal como se usa en el presente documento, pretende significar cualquier animal, en particular mamfferos, tales como seres humanos, y puede, cuando sea apropiado, usarse indistintamente con el termino "paciente".

La expresion "identidad de secuencia" como se conoce en la tecnica, se refiere a una relacion entre las secuencias de dos o mas moleculas polipeptfdicas o dos o mas moleculas de acido nucleico, como se determina al comparar las secuencias. En la tecnica, "identidad" tambien significa el grado de relacion de la secuencia entre las moleculas de acido nucleico o entre polipeptidos, segun sea el caso, segun lo determinado por el numero de coincidencias entre cadenas de dos o mas residuos de nucleotidos o dos o mas restos de aminoacidos. La "identidad" mide el porcentaje de coincidencias identicas entre la menor de dos o mas secuencias con alineaciones de huecos (si las hay) abordadas mediante un modelo matematico o programa informatico en particular (es decir, "algoritmos").

El termino "similitud" es un concepto relacionado, pero a diferencia de "identidad", se refiere a una relacion de secuencia que incluye coincidencias identicas y coincidencias de sustitucion conservadora. Si dos secuencias polipeptfdicas tienen, por ejemplo, (fraccion (10/20)) aminoacidos identicos y el resto son todas sustituciones no conservadoras, los porcentajes de identidad y similitud senan ambos 50 %. Si, en el mismo ejemplo, hay 5 posiciones mas en las que hay sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad permanece en el 50 %, pero el porcentaje de similitud sena del 75 % ((fraccion (15/20))). Por lo tanto, en los casos en los que hay sustituciones conservadoras, el grado de similitud entre dos polipeptidos sera mayor que el porcentaje de identidad entre esos dos polipeptidos.

Las modificaciones conservadoras de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 (y las modificaciones correspondientes de los nucleotidos codificantes) produciran polipeptidos asociados a ficolina que tienen caractensticas funcionales y qrnmicas similares a las de la FAP natural. En cambio, se pueden lograr modificaciones sustanciales en las caractensticas funcionales y/o qrnmicas de un polipeptido asociado a ficolina seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 1 que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura del esqueleto molecular en el area de la sustitucion, por ejemplo, como una conformacion en hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, o (c) la mayor parte de la cadena lateral.

Por ejemplo, una "sustitucion de aminoacido conservadora" puede implicar una sustitucion de un resto de aminoacido nativo con un residuo no nativo de tal manera que haya poco o ningun efecto sobre la polaridad o carga del resto de aminoacido en esa posicion. Ademas, cualquier residuo nativo en el polipeptido tambien puede estar sustituido con alanina, como se ha descrito anteriormente para la "mutagenesis de exploracion de alanina" (vease, por ejemplo, MacLennan y col., 1998, Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55-67; Sasaki y col., 1998, Adv. Biophys. 35: 1-24, que tratan la mutagenesis de exploracion de alanina).

Los expertos en la tecnica pueden determinar sustituciones de aminoacidos deseadas (conservadoras o no conservadoras) en el momento en el que se deseen dichas sustituciones. Por ejemplo, las sustituciones de aminoacidos pueden usarse para identificar residuos importantes de un polipeptido asociado a ficolina, o para aumentar o disminuir la afinidad de un polipeptido asociado a ficolina descrito en el presente documento.

Los residuos naturales se pueden dividir en clases segun las propiedades comunes de la cadena lateral:

1) hidrofobicos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) hidrofilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) acidos: Asp, Glu;

4) basicos: His, Lys, Arg;

(5) restos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro; y

6) aromaticos: Trp, Tyr, Phe.

Por ejemplo, las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con un miembro de otra clase. Dichos residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del polipeptido asociado a ficolina humana que son homologas con polipeptidos asociados con ficolina no humana, o en las regiones no homologas de la molecula.

Al hacer tales cambios, se puede considerar el mdice hidropatico de los aminoacidos. A cada aminoacido se le ha asignado un mdice hidropatico sobre la base de sus caractensticas de hidrofobicidad y carga, estos son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cistema/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

La importancia del mdice de aminoacidos hidropaticos para conferir una funcion biologica interactiva a una protema se entiende en la tecnica. Kyte y col., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Se sabe que ciertos aminoacidos se pueden sustituir por otros aminoacidos que tienen un mdice o puntuacion hidropatica similar y siguen conservando una actividad biologica similar. Al hacer cambios basados en el mdice hidropatico, se prefiere la sustitucion de aminoacidos cuyos indices hidropaticos estan dentro de ± 2, aquellos que estan dentro de ± 1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de ± 0,5 son incluso mas particularmente preferidos.

Tambien se entiende en la tecnica que la sustitucion de aminoacidos similares se puede realizar de manera eficaz sobre la base de la hidrofilicidad, particularmente cuando la protema o peptido biologicamente funcionalmente equivalente creada de este modo se destina al uso en realizaciones inmunologicas, como en el presente caso. La mayor hidrofilicidad local promedio de una protema, segun lo gobernado por la hidrofilicidad de sus aminoacidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biologica de la protema.

Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a los restos de aminoacidos: arginina (+3,0); lisina ('3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cistema (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptofano (-3,4). Al hacer cambios basados en valores de hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitucion de aminoacidos cuyos valores de hidrofilicidad estan dentro de ± 2, aquellos que estan dentro de ± 1 son particularmente preferidos, y aquellos dentro de ± 0,5 son incluso mas particularmente preferidos. Tambien se pueden identificar epftopos de secuencias de aminoacidos primarias sobre la base de la hidrofilicidad. Estas regiones tambien se denominan “regiones centrales epitopicas".

Un experto en la tecnica sera capaz de determinar variantes adecuadas del polipeptido como se expone en la SEQ ID NO: 1 usando tecnicas bien conocidas. Para identificar areas adecuadas de la molecula que pueden cambiarse sin destruir la actividad, un experto en la materia puede apuntar a areas que no se consideran importantes para la actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipeptidos similares con actividades similares de la misma especie o de otras especies, un experto en la tecnica puede comparar la secuencia de aminoacidos de un polipeptido asociado a ficolina con tales polipeptidos similares. Con tal comparacion, se pueden identificar residuos y porciones de las moleculas que estan conservadas entre polipeptidos similares. Se apreciara que los cambios en areas de un polipeptido asociado a ficolina que no estan conservados en relacion con tales polipeptidos similares tendnan menos probabilidades de afectar de forma adversa a la actividad biologica y/o a la estructura del polipeptido asociado a ficolina. Un experto en la tecnica tambien sabna que, incluso en regiones relativamente conservadas, se pueden sustituir los aminoacidos qmmicamente similares por aminoacidos de origen natural al tiempo que conservan la actividad (sustituciones conservadoras de restos de aminoacidos). Por lo tanto, incluso las areas que pueden ser importantes para la actividad biologica o para la estructura pueden estar sujetas a sustituciones conservadoras de aminoacidos sin destruir la actividad biologica o sin afectar de forma adversa a la estructura del polipeptido.

De manera adicional, un experto en la tecnica puede revisar estudios de estructura-funcion que identifican residuos en polipeptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de tal comparacion, se puede predecir la importancia de los restos de aminoacidos en un polipeptido asociado a ficolina que corresponde a los restos de aminoacidos que son importantes para la actividad o la estructura en polipeptidos similares. Un experto en la tecnica puede optar por sustituciones de aminoacidos qmmicamente similares para tales restos de aminoacidos importantes predichos de polipeptidos asociados con ficolina y otros polipeptidos de la invencion.

El experto en la tecnica tambien puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoacidos en relacion con dicha estructura en polipeptidos similares. En vista de esa informacion, un experto en la materia puede predecir la alineacion de los restos de aminoacidos de un polipeptido asociado a ficolina con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la materia puede optar por no realizar cambios radicales en los restos de aminoacidos que se predice que estan en la superficie de la protema, ya que tales residuos pueden estar involucrados en interacciones importantes con otras moleculas. Ademas, un experto en la tecnica puede generar variantes de prueba que contienen una unica sustitucion de aminoacido en cada resto de aminoacido deseado. Las variantes pueden seleccionarse despues utilizando ensayos de actividad como se describe en el presente documento. Tales variantes podnan usarse para recopilar informacion sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubriera que un cambio en un resto de aminoacido en particular se habfa destruido, reducido indeseablemente o una actividad inadecuada, se evitanan variantes con tal cambio. En otras palabras, segun la informacion obtenida de tales experimentos rutinarios, un experto en la materia puede determinar facilmente los aminoacidos en los que deben evitarse otras sustituciones, ya sea solas o en combinacion con otras mutaciones.

Se han dedicado numerosas publicaciones cientfficas a la prediccion de la estructura secundaria. Vease Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou y col., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou y col., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou y col., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47:45-148 (1978); Chou y col., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou y col., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Ademas, actualmente hay disponibles los programas informaticos para ayudar a predecir la estructura secundaria. Un procedimiento de prediccion de la estructura secundaria se basa en la modelacion de homologfa. Por ejemplo, dos polipeptidos o protemas, que tienen una identidad de secuencia superior al 30 % o una similitud superior al 40 % a menudo tienen topologfas estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural de protemas (PDB) ha proporcionado una mayor capacidad de prediccion de la estructura secundaria, incluyendo el numero potencial de veces dentro de la estructura de un polipeptido o protema. Vease Holm y col., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner y col., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) que hay un numero limitado de veces en un polipeptido o protema dado y que una vez que se ha resuelto un numero cntico de estructuras, la prediccion estructural ganara espectacularmente en precision.

Los procedimientos adicionales para predecir la estructura secundaria incluyen "subprocedimientos" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl y col., Structure, 4(1): 15-9 (1996)), "analisis del perfil" (Bowie y col., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov y col., Meth. Enzymol., 183:146-159 (1990); Gribskov y col., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)) y "union evolutiva" (vease Home, citado anteriormente y Brenner, citado anteriormente).

La identidad y similitud de los polipeptidos relacionados se pueden calcular facilmente mediante procedimientos conocidos. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitacion, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo y col., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).

Se disenan procedimientos preferidos para determinar la identidad y/o similitud para dar la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los procedimientos para determinar la identidad y la similitud se describen en programas informaticos disponibles al publico. Los procedimientos preferidos del programa informatico para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitacion, el paquete del programa GCG, incluyendo GAP (Devereux y col., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul y col., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX esta publicamente disponible en el Centro Nacional para la Informacion Biotecnologica (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul y col., NCB/NLM/NIH Bethesda, Md.

20894; Altschul y col., citado anteriormente). Tambien se puede usar el algoritmo bien conocido de SmithWaterman para determinar la identidad.

Ciertos esquemas de alineacion para alinear dos secuencias de aminoacidos pueden dar como resultado el apareamiento de solo una region corta de las dos secuencias, y esta region alineada pequena puede tener una identidad de secuencia muy alta incluso si no existe una relacion significativa entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, en una realizacion preferida, el procedimiento de alineacion seleccionado (programa GAP) dara como resultado una alineacion que abarca al menos 50 aminoacidos contiguos del polipeptido objetivo. Por ejemplo, utilizando el algoritmo informatico GAP (Genetics Computer Group), Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), dos polipeptidos para los que se determinara el porcentaje de identidad de secuencia estan alineados para una coincidencia optima de sus respectivos aminoacidos (el "tramo emparejado", segun lo determinado por el algoritmo). Una penalizacion por apertura de hueco (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparacion que se utiliza; la "diagonal" es la puntuacion o el numero asignado a cada coincidencia perfecta de aminoacidos por la matriz de comparacion particular) y una penalizacion por extension de hueco (que generalmente es {fraccion (1/10)} veces la penalizacion de apertura de hueco), asf como una matriz de comparacion, tal como PAM 250 o BLOSU^m 62 se utilizan junto con el algoritmo. Una matriz de comparacion estandar (vease Dayhoff y col., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) para la matriz de comparacion PAM 250; Henikoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) para la matriz de comparacion BLOSUM 62) tambien es utilizada por el algoritmo. Los parametros preferidos para una comparacion de secuencias de polipeptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman y col., J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970); Matriz de comparacion: BLOSUM 62 de Henikoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992); Penalizacion por hueco: 12, penalizacion por longitud de hueco: 4, Umbral de similitud: 0.

El programa GAP es util con los parametros anteriores. Los parametros mencionados anteriormente son los parametros predeterminados para las comparaciones de polipeptidos (junto con ninguna penalizacion para los huecos finales) utilizando el algoritmo GAP.

Los parametros preferidos para las comparaciones de secuencias de moleculas de acido nucleico incluyen los siguientes: Algoritmo: Needleman y col., J. Mol Biol., 48:443-453 (1970); Matriz de comparacion: coincidencias = 10, apareamiento erroneo = 0, Penalizacion por hueco: 50, penalizacion por longitud de hueco: 3.

El programa GAP tambien es util con los parametros anteriores. Los parametros mencionados anteriormente son los parametros predeterminadoso para las comparaciones de moleculas de acido nucleico.

Pueden usarse otros algoritmos de ejemplo, penalizaciones por abertura de hueco, penalizaciones por extension de huecos, matrices de comparacion, umbrales de similitud, incluidos los establecidos en el Program Manual, Paquete Wisconsin, Version 9, septiembre de 1997. Las elecciones particulares que se deben realizar seran evidentes para los expertos en la tecnica y dependeran de la comparacion espedfica que se realice, tal como ADN a ADN, protema a protema, protema a ADN; y, adicionalmente, si la comparacion es entre pares de secuencias dados (en cuyo caso generalmente se prefiere gAp o BestFit) o entre una secuencia y una gran base de datos de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA).

Preparacion de polipeptidos asociados con ficolina y otros polipeptidos de la invencion

La invencion tambien se refiere a un procedimiento para preparar polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de la invencion como se ha mencionado anteriormente. Los polipeptidos asociados con ficolina y otros polipeptidos de la invencion descritos en el presente documento pueden producirse por medio de tecnicas de acido nucleico recombinante. En general, una secuencia de acido nucleico de FAP de tipo salvaje clonada se modifica para codificar la protema deseada. A continuacion, esta secuencia modificada se inserta en un vector de expresion, que a su vez se transforma o transfecta en celulas huesped. Las celulas eucariotas superiores, en particular celulas cultivadas de mamffero, se prefieren como celulas huesped. Las secuencias completas de aminoacidos y nucleotidos para la FAP humana se proporcionan en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO:2.

Las alteraciones de la secuencia de aminoacidos pueden realizarse mediante diversas tecnicas. La modificacion de la secuencia de acido nucleico puede realizarse mediante mutagenesis espedfica del sitio. Las tecnicas para la mutagenesis espedfica del sitio son bien conocidas en la materia y se describen en, por ejemplo, Zoller y Smith (DNA 3:479-488, 1984) o "Splicing by extension overlap", Horton y col., Gen 77, 1989, pp. 61-68. Por tanto, utilizando las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de FAP, se pueden introducir la o las alteraciones de eleccion. Igualmente, los procedimientos para preparar una construccion de ADN utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa utilizando cebadores espedficos son bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, EE.UU.).

Los polipeptidos de la presente invencion tambien pueden comprender restos de aminoacidos no naturales. Los aminoacidos no naturales incluyen, sin limitacion, beta-alanina, desaminohistidina, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcistema, hidroxietilhomocistema, nitroglutamina, homoglutamina, acido pipecolico, acido tiazolidin carboxflico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, ferc-leucina, nor-valina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. En la tecnica se conocen varios procedimientos para incorporar restos de aminoacidos no naturales en protemas. Por ejemplo, se puede emplear un sistema in vitro en el que se suprimen las mutaciones sin sentido usando ARNt supresores qmmicamente aminoacilados. En la tecnica se conocen procedimientos para sintetizar aminoacidos y aminoacilar ARNt. La transcripcion y traduccion de plasmidos que contienen mutaciones sin sentido se lleva a cabo en un sistema libre de celulas que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas disponibles comercialmente y otros reactivos. Los polipeptidos se purifican mediante cromatograffa. Vease, por ejemplo, Robertson y col., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman y col., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung y col., Science 259: 806-9, 1993; y Chung y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). En un segundo procedimiento, la traduccion se lleva a cabo en ovocitos de Xenopus mediante microinyeccion de ARNm mutado y ARNt supresores qmmicamente aminoacilados (Turcatti y col., J. Biol. Chem.

271:19991-8, 1996). En un tercer procedimiento, las celulas de E. coli se cultivan en ausencia de un aminoacido natural que se va a reemplazar (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia del o los aminoacidos no naturales deseados (por ejemplo, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoacido no natural se incorpora al polipeptido en lugar de su homologo natural. Vease, Koide y col., Biochem. 33:7470-6, 1994). Los restos de aminoacidos de origen natural se pueden convertir en especies no naturales mediante modificacion qmmica in vitro. La modificacion qmmica se puede combinar con mutagenesis dirigida a sitio para expandir adicionalmente el intervalo de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).

La construccion de acido nucleico que codifica los polipeptidos asociados a ficolina y otros polipeptidos de la invencion puede ser adecuadamente de origen genomico o de ADNc, obtenido, por ejemplo, mediante la preparacion de una biblioteca genomica o de ADNc y la deteccion selectiva de secuencias de ADN que codifican todo o parte del polipeptido mediante hibridacion utilizando sondas oligonucleotidicas sinteticas de acuerdo con tecnicas estandar (vease Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed. Puerto de primavera fna Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

La construccion de acido nucleico que codifica un polipeptido asociado a ficolina tambien puede prepararse sinteticamente mediante procedimientos estandar establecidos, por ejemplo, el procedimiento de fosfoamidita descrito por Beaucage y Caruthers, Tetrahedron Letters 22 (1981), 1859-1869, o el procedimiento descrito por Matthes y col., EMBO Journal 3 (1984), 801 - 805. Segun el procedimiento de la fosfoamidita, se sintetizan los oligonucleotidos, por ejemplo, en un sintetizador de ADN automatico, se purifican, hibridan, ligan y clonan en vectores adecuados. Las secuencias de ADN que codifican los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de la invencion tambien se pueden preparar mediante reaccion en cadena de la polimerasa usando cebadores espedficos, por ejemplo, como se describe en el documento US 4.683.202, Saiki y col., Science 239 (1988), 487 - 491, o Sambrook y col., citado anteriormente.

Ademas, la construccion de acido nucleico puede ser de origen mixto sintetico y genomico, mixto sintetico y de ADNc o mixto genomico y ADNc preparada mediante union de fragmentos de origen sintetico, genomico o ADNc (segun corresponda), correspondiendo los fragmentos a varias partes de la totalidad de la construccion de acido nucleico, de acuerdo con tecnicas estandar.

La construccion de acido nucleico es, preferentemente, una construccion de ADN. Las secuencias de ADN para su uso en la produccion de polipeptidos asociados a ficolina y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion codificaran tfpicamente un polipeptido pre-pro en el extremo amino de FAP para obtener el procesamiento y la secrecion postraduccionales adecuados desde la celula huesped.

Las secuencias de ADN que codifican los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion se insertan habitualmente en un vector recombinante que puede ser cualquier vector, que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y la eleccion del vector dependera a menudo de la celula huesped en la que se va a introducir. Por tanto, el vector puede ser un vector de replicacion autonoma, es decir, un vector, que existe como una entidad extracromosomica, cuya replicacion es independiente de la replicacion cromosomica, por ejemplo, un plasmido. Como alternativa, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una celula huesped, se integra en el genoma de la celula huesped y se replica junto con el o los cromosomas en el o los que se ha integrado.

El vector es, preferentemente, un vector de expresion en el que la secuencia de ADN que codifica los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion esta unida operativamente a segmentos adicionales requeridos para la transcripcion del ADN. En general, el vector de expresion deriva de ADN plasmfdico o viral, o puede contener elementos de ambos. La expresion, "unido operativamente" indica que los segmentos estan organizados de modo que funcionen en concierto para los fines previstos, por ejemplo, la transcripcion se inicia en un promotor y procede a traves de la secuencia de ADN que codifica el polipeptido.

Los vectores de expresion para su uso en la expresion de polipeptidos asociados a ficolina y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion comprenderan un promotor capaz de dirigir la transcripcion de un gen clonado o ADNc. El promotor puede ser cualquier secuencia de ADN, que muestra actividad transcripcional en la celula huesped de eleccion y puede derivarse de genes que codifican protemas homologas o heterologas a la celula huesped.

Ejemplos de promotores adecuados para dirigir la transcripcion del ADN que codifica el polipeptido asociado a ficolina humana en celulas de mairnfero son el promotor SV40 (Subramani y col., Mol. Cell Biol. 1 (1981), 854 -864), el promotor de MT-1 (gen de metalotionema) (Palmiter y col., Science 222 (1983), 809 - 814), el promotor de C^m V (Boshart y col., Cell 41: 521-530, 1985) o el promotor tardm principal del adenovirus 2 (Kaufman y Sharp, Mol. Cell. Biol, 2:1304-1319, 1982).

Un ejemplo de un promotor adecuado para su uso en celulas de insecto es el promotor de polihedrina (documento US 4.745.051; Vasuvedan y col., FEBS Lett. 311, (1992) 7 - 11), el promotor de P10 (J.M. Vlak y col., J. Gen. Virology 69, 1988, pag. 765-776), el promotor de la protema basica del virus de la polihedrosis de Autographa californica (documento EP 397 485), el promotor del gen 1 temprano inmediato de baculovirus (documento US 5.155.037; documento US 5.162.222), o el promotor del gen del temprano retardado de baculovirus 39K (documento US 5.155.037; documento US 5.162.222).

Los ejemplos de promotores adecuados para su uso en celulas huesped de levadura incluyen promotores de genes glicolfticos de levadura (Hitzeman y col., J. Biol. Chem. 255 (1980), 12073 - 12080; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 419 - 434) o genes de la alcohol deshidrogenasa (Young y col., En Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals (Hollaender y col.,, eds.), Plenum Press, New York, 1982), o los promotores de TPI1 (documento US 4.599.311) o ADH2-4c (Russell y col., Nature 304 (1983), 652 - 654).

Los ejemplos de promotores adecuados para su uso en celulas huesped de hongos filamentosos son, por ejemplo, el promotor de a Dh3 (McKnight y col., The EMBO J. 4 (1985), 2093 - 2099) o el promotor de tpiA. Los ejemplos de otros promotores utiles son los derivados del gen que codifica la amilasa TAKA de A. oryzae, proteinasa aspartica de Rhizomucor miehei, alfa-amilasa neutra de A. niger, alfa-amilasa estable al acido de A. niger, glucoamilasa de A. niger o A. awamori (gluA), lipasa de Rhizomucor miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato isomerasa de A. oryzae o acetamidasa de A. nidulans. Se prefieren los promotores de TAKA-amilasa y gluA. Los promotores adecuados se mencionan en, por ejemplo, los documentos EP 238023 y EP 383779.

Las secuencias de ADN que codifican los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion tambien pueden, si es necesario, estar conectado operativamente a un terminador adecuado, tal como el terminador de la hormona del crecimiento humano (Palmiter y col., Science 222, 1983, pag.

809-814) o los terminadores TPI1 (Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Gen. 1, 1982, pag. 419-434) o ADH3 (McKnight y col., The EMBO J. 4, 1985, pp. 2093-2099). Los vectores de expresion tambien pueden contener un conjunto de sitios de corte y empalme de ARN ubicados corriente abajo del promotor y corriente arriba del sitio de insercion para la propia secuencia de FAP. Los sitios de corte y empalme de ARN preferidos se pueden obtener a partir de genes de adenovirus y/o inmunoglobulina. Tambien esta contenida en los vectores de expresion una senal de poliadenilacion ubicada aguas abajo del sitio de insercion. Las senales de poliadenilacion particularmente preferidas incluyen la senal de poliadenilacion temprana o tardfa de SV40 (Kaufman y Sharp, ibid.), la senal de poliadenilacion de la region Elb del adenovirus 5, el terminador del gen de la hormona del crecimiento humana (DeNoto y col., Nucl. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) o la senal de poliadenilacion del gen de FAP humana o el gen de FAP bovina. Los vectores de expresion tambien pueden incluir una secuencia lfder viral no codificante, tal como la secuencia lfder tripartita de adenovirus 2, ubicada entre el promotor y los sitios de corte y empalme del ARN; y secuencias potenciadoras, tal como el potenciador de SV40.

Para dirigir los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de la presente invencion hacia la ruta secretora de las celulas huesped, en el vector recombinante se puede proporcionar una secuencia senal secretora (tambien conocida como secuencia lfder, secuencia prepro o secuencia pre). La secuencia senal secretora se une a las secuencias de ADN que codifican los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion en el marco de lectura correcto. Normalmente, las secuencias senal secretoras estan colocadas en 5' de la secuencia de ADN que codifica el peptido. La secuencia senal secretora puede ser que, normalmente asociada a la protema o puede proceder de un gen que codifica otra protema secretada.

Para la secrecion de celulas de levadura, la secuencia senal secretora puede codificar cualquier peptido senal, que asegura la direccion eficiente de los polipeptidos asociados a ficolina humana expresados y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion en la ruta secretora de la celula. El peptido senal puede ser un peptido senal de origen natural, o una parte funcional del mismo, o puede ser un peptido sintetico. Se ha descubierto que los peptidos senal adecuados son el peptido senal del factor alfa (vease el documento US 4.870.008), el peptido senal de la amilasa salival de raton (vease O. Hagenbuchle y col., Nature 289, 1981, pag. 643-646), un peptido senal de carboxipeptidasa modificado (vease, L. A. Valls y col., Cell 48, 1987, pag. 887-897), el peptido senal de levadura BAR1 (vease el documento WO 87/02670), o el peptido senal de proteasa aspartica 3 de levadura (YAP3) (vease M. Egel-Mitani y col., Yeast 6, 1990, pags. 127-137).

Para una eficaz secrecion en levaduras, una secuencia que codifica un peptido lfder tambien puede insertarse aguas abajo de la secuencia senal y aguas arriba de la secuencia de ADN que codifica los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion. La funcion del peptido lfder es permitir que el peptido expresado se dirija desde el retmulo endoplasmico al aparato de Golgi y mas alla a una vesmula secretora para la secrecion al medio de cultivo (es decir, la exportacion de los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de acuerdo con La presente invencion a traves de la pared celular o al menos a traves de la membrana celular en el espacio periplasmico de la celula de levadura). El peptido lfder puede ser el lfder del factor alfa de la levadura (cuyo uso se describe, por ejemplo, en los documentos US 4.546.082, US 4.870.008, EP 16201, EP 123 294, EP 123544 y EP 163529). Como alternativa, el peptido Ifder puede ser un peptido Ifder sintetico, es decir, un peptido Kder no descubierto en la naturaleza. Los peptidos lfder sinteticos pueden, por ejemplo, construirse como se describe en los documentos WO 89/02463 o WO 92/11378.

Para su uso en hongos filamentosos, el peptido senal puede derivar, convenientemente, de un gen que codifica una amilasa o glucoamilasa de Aspergillus sp, un gen que codifica una lipasa o proteasa de Rhizomucor miehei o una lipasa de Humicola lanuginosa. El peptido senal deriva, preferentemente, de un gen que codifica amilasa TAKA de A. oryzae, alfa-amilasa neutra de A. niger, amilasa estable al acido de A. niger o glucoamilasa de A. niger. Los peptidos senal adecuados se desvelan en, por ejemplo, los documentos EP 238023 y EP 215594.

Para su uso en celulas de insecto, el peptido senal puede derivar convenientemente de un gen de insecto (vease el documento WO 90/05783), tal como el peptido senal precursor de la hormona adipocinetica del lepidoptero Manduca sexta (vease el documento US 5.023.328).

Los procedimientos utilizados para ligar las secuencias de ADN que codifican los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion, el promotor y, opcionalmente, el terminador y/o la secuencia senal secretora, respectivamente, y para insertarlos en vectores adecuados que contengan la informacion necesaria para la replicacion, son bien conocidos por los expertos en la tecnica (vease, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989).

Los procedimientos para transfectar celulas de mairnfero y expresar secuencias de ADN introducidas en las celulas se describen en, por ejemplo, Kaufman y Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601 - 621; Southern y Berg, J. Mol. Appl. Genet. 1 (1982), 327 - 341; Loyter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982), 422 - 426; (Wigler y col., Cell 14(1978), 725; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7 (1981), 603, Graham y van der Eb, Virology 52 (1973), 456; y Neumann y col., EMBO J. 1 (1982), 841 - 845.

Las secuencias de ADN clonadas se introducen en celulas de marnfferos cultivadas mediante, por ejemplo, transfeccion mediada por fosfato calcico (Wigler y col., Cell 14:725-732, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603-616, 1981; Graham y Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973) o electroporacion (Neumann y col., EMBO J. 1:841-845, 1982). Para identificar y seleccionar las celulas que expresan el ADN exogeno, un gen que confiere un fenotipo seleccionable (un marcador seleccionable) generalmente se introduce en las celulas junto con el gen o ADNc de interes. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen genes que confieren resistencia a farmacos como neomicina, higromicina y metotrexato. El marcador seleccionable puede ser un marcador seleccionable amplificable. Un marcador seleccionable amplificable preferido es una secuencia de dihidrofolato reductasa (DHFR). Los marcadores seleccionables son revisados por Thilly (Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA, incorporado en el presente documento por referencia). El experto en la materia podra elegir facilmente marcadores seleccionables adecuados.

Los marcadores seleccionables pueden introducirse en la celula en un plasmido separado al mismo tiempo que el gen de interes, o pueden introducirse en el mismo plasmido. Si en el mismo plasmido, el marcador seleccionable y el gen de interes pueden estar bajo el control de diferentes promotores o del mismo promotor, esta ultima disposicion produce un mensaje dicistronico. Las construcciones de este tipo son conocidas en la tecnica (por ejemplo, Levinson y Simonsen, documento US 4.713.339). Tambien puede ser ventajoso anadir ADN adicional, conocido como "ADN portador" a la mezcla que se introduce en las celulas.

Despues de que las celulas han captado el ADN, se cultivan en un medio de crecimiento apropiado, normalmente 1­ 2 dfas, para comenzar a expresar el gen de interes. Como se usa en el presente documento, el termino "medio de crecimiento apropiado" significa un medio que contiene nutrientes y otros componentes requeridos para el crecimiento de celulas y la expresion del polipeptido de interes asociado a ficolina humana. Los medios generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrogeno, aminoacidos esenciales, azucares esenciales, vitaminas, sales, fosfolfpidos, protemas y factores de crecimiento. Despues se aplica la seleccion del farmaco para seleccionar el crecimiento de celulas que estan expresando el marcador seleccionable de un modo estable. Para las celulas que se han transfectado con un marcador seleccionable amplificable, la concentracion del farmaco se puede aumentar para seleccionar un numero de copias mayor de las secuencias clonadas, por lo tanto niveles de expresion crecientes. Los clones de celulas transfectadas de manera estable se seleccionan despues para determinar la expresion del polipeptido de interes asociado a ficolina humana.

La celula huesped en la que se introducen las secuencias de ADN que codifican los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion puede ser cualquier celula, que es capaz de producir los polipeptidos humanos modificados postraduccionales e incluye celulas de levadura, hongos y eucariotas superiores.

Los ejemplos de lmeas celulares de mamfferos para su uso en la presente invencion son las lmeas celulares COS-1 (ATCC CRL 1650), de rinon de hamster neonato(BHK) y 293 (A^t C^c CRL 1573; Graham y col., J. Gen. Virol. 36: 59­ 72, 1977). Una lmea celular BHK preferida es la lmea celular tk- ts13 BHK (Waechter y Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982, incorporada en el presente documento por referencia), en lo sucesivo denominadas celulas BHK 570. La lmea celular BHK 570 se ha depositado en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852, con el numero de acceso ATCC CRL 10314. Tambien esta disponible una lmea celular tk- ts13 BHK de la ATCC con el numero de acceso CRL 1632. Ademas, se pueden usar varias otras lmeas celulares dentro de la presente invencion, incluyendo Hep I de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), Hep II de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de pulmon humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1), CHO (ATCC CCL 61) y DUKX (Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980).

Los ejemplos de celulas de levadura adecuadas incluyen celulas de Saccharomyces spp. o Schizosaccharomyces spp., en particular cepas de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces kluyveri. A continuacion se describen procedimientos para transformar celulas de levadura con ADN heterologo y producir polipeptidos heterologos, por ejemplo, en los documentos US 4.599.311, US 4.931.373, US 4.870.008, 5.037.743 y US 4.845.075, todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. Las celulas transformadas se seleccionan segun un fenotipo determinado por un marcador seleccionable, habitualmente la resistencia a farmacos o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente particular, por ejemplo, leucina. Un vector preferido para su uso en levadura es el vector POT1 desvelado en el documento US 4.931.373. Las secuencias de ADN que codifican los polipeptidos asociados a ficolina humana y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion pueden estar precedidas por una secuencia senal y, opcionalmente, una secuencia lfder, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Otros ejemplos de celulas de levadura adecuadas son las cepas de Kluyveromyces, tales como K. lactis, Hansenula, H. polymorpha o Pichia, por ejemplo, P. pastoris (vease Gleeson y col., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, paginas. 3459­ 3465; documento US 4.882.279).

Los ejemplos de otras celulas fungicas son celulas de hongos filamentosos, por ejemplo, Aspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. o Trichoderma spp., en particular cepas de A. oryzae, A. nidulans o A. niger. El uso de Aspergillus spp. para la expresion de protemas se describe en, por ejemplo, los documentos EP 272277, EP 238 023, E^p 184 438. La transformacion de F. oxysporum puede, por ejemplo, llevarse a cabo segun lo descrito por Malardier y col., 1989, Gene 78: 147-156. La transformacion de Trichoderma spp. puede realizarse, por ejemplo, como se describe en el documento EP 244234.

Cuando un hongo filamentoso se utiliza como la celula huesped, se puede transformar con la construccion de ADN de la invencion, convenientemente integrando la construccion de ADN en el cromosoma huesped para obtener una celula huesped recombinante. Esta integracion generalmente se considera una ventaja, ya que es mas probable que la secuencia de ADN se mantenga estable en la celula. La integracion de las construcciones de ADN en el cromosoma huesped se puede realizar de acuerdo con procedimientos convencionales, por ejemplo, mediante recombinacion homologa o heterologa.

La transformacion de celulas de insecto y la produccion de polipeptidos heterologos en las mismas se pueden realizar como se describe en los documentos US 4,745,051; US 4,879,236; US 5,155,037; 5,162,222; EP 397,485), todos los cuales se incorporan en el presente documento por referencia. La lmea celular de insecto utilizada como huesped puede ser adecuadamente una lmea celular de lepidopteros, tal como celulas de Spodoptera frugiperda o celulas de Trichoplusia ni (vease el documento US 5.077.214). Las condiciones de cultivo pueden ser, adecuadamente, como se describe en, por ejemplo, los documentos WO 89/01029 o WO 89/01028, o cualquiera de las referencias mencionadas anteriormente.

La celula huesped transformada o transfectada descrita anteriormente se cultiva despues en un medio nutriente adecuado en condiciones que permiten la expresion del polipeptido asociado a ficolina humana, despues de lo cual todo o parte del peptido resultante puede recuperarse del cultivo. El medio utilizado para cultivar las celulas puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las celulas huesped, tales como medios mmimos o complejos que contienen suplementos apropiados. Los medios adecuados estan disponibles en proveedores comerciales o se pueden preparar de acuerdo con las recetas publicadas (por ejemplo, en los catalogos de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo). El polipeptido asociado a ficolina humana producido por las celulas puede luego recuperarse despues del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales, incluyendo la separacion de las celulas huesped del medio por centrifugacion o filtracion, precipitando los componentes proteinaceos del sobrenadante o filtrado por medio de una sal, por ejemplo, sulfato de amonio, purificacion mediante diversos procedimientos cromatograficos, por ejemplo, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de filtracion en gel, cromatograffa de afinidad, o similares, dependiendo del tipo de polipeptido en cuestion.

Se puede emplear tecnologfa de animales transgenicos para producir los polipeptidos asociados a ficolina y otros polipeptidos de la invencion. Se prefiere producir las protemas dentro de las glandulas mamarias de un mairnfero hembra huesped. La expresion en la glandula mamaria y la posterior secrecion de la protema de interes en la leche supera muchas dificultades encontradas en el aislamiento de protemas de otras fuentes. La leche se recoge facilmente, disponible en grandes cantidades, y bien caracterizado bioqmmicamente. Ademas, las principales protemas de la leche estan presentes en la leche en altas concentraciones (ffpicamente de aproximadamente 1 a 15 g/l).

Desde un punto de vista comercial, es claramente preferible utilizar como huesped una especie que tenga un alto rendimiento de leche. Si bien se pueden usar animales mas pequenos, como ratones y ratas (y se prefieren en la etapa de prueba de principio), es preferible utilizar mairnferos de ganado incluyendo, pero sin limitacion, cerdos, cabras, ovejas y ganado vacuno. Las ovejas son particularmente preferidas debido a factores tales como la historia previa de la transgenesis en esta especie, la produccion de leche, el coste y la disponibilidad de equipos para la recoleccion de leche de oveja (vease, por ejemplo, el documento WO 88/00239 para una comparacion de los factores que influyen en la eleccion de las especies huesped). En general, es deseable seleccionar una raza de animal huesped que haya sido criada para su uso lacteo, tal como oveja East Friesland, o para introducir la reserva de lacteos mediante la cna de la lmea transgenica en una fecha posterior. En cualquier caso, deben usarse animales de estado de salud bueno conocido.

Para obtener expresion en la glandula mamaria, se utiliza un promotor de transcripcion de un gen de protema de la leche. Los genes de la protema de la leche incluyen los genes que codifican casemas (vease el documento U.S.5.304.489), beta lactoglobulina, una lactoalbumina y protema acida del suero de la leche. Se prefiere el promotor de beta lactoglobulina (BLG). En el caso del gen de la beta lactoglobulina ovina, generalmente se utilizara una region de al menos las 406 pb proximales de la secuencia flanqueante en 5' del gen, aunque se prefieren porciones mayores de la secuencia flanqueante en 5', hasta aproximadamente 5 kpb, tal como un segmento de ADN de -4,25 kpb que abarca el promotor flanqueante en 5' y la porcion no codificante del gen de la beta-lactoglobulina (vease Whitelaw y col., Biochem. J. 286: 3139 (1992)). Fragmentos similares de ADN promotor de otras especies tambien son adecuados.

Otras regiones del gen de la beta lactoglobulina tambien pueden incorporarse en construcciones, como tambien las regiones genomicas del gen que se va a expresar. Es generalmente aceptado en la tecnica que las construcciones que carecen de intrones, por ejemplo, expresan poco en comparacion con las que contienen dichas secuencias de A^d N (vease Brinster y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 836840 (1988); Palmiter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 478482 (1991); Whitelaw y col., Transgenic Res. 1: 313 (199l); documento W^o 89/01343; y documento WO 91/02318, cada uno de los cuales se incorpora en el presente documento por referencia). En este sentido, generalmente es preferente, cuando sea posible, usar secuencias genomicas que contienen todos o algunos de los intrones nativos de un gen que codifica la protema o polipeptido de interes, por lo tanto, es preferente la inclusion adicional de al menos algunos intrones de, por ejemplo, el gen de la beta lactoglobulina. Una de esas regiones es un segmento de ADN que proporciona el corte y empalme de intrones y la poliadenilacion del ARN de la region no codificante en 3' del gen de beta lactoglobulina. Cuando se sustituye por las secuencias no codificantes naturales en 3' de un gen, este segmento de beta lactoglobulina ovina puede mejorar y estabilizar los niveles de expresion de la protema o polipeptido de interes. En otras realizaciones, la region que rodea el ATG de iniciacion de la secuencia FAP se reemplaza con las secuencias correspondientes de un gen de protema espedfica de la leche. Dicha sustitucion proporciona un entorno de iniciacion espedfico del tejido putativo para mejorar la expresion. Es conveniente reemplazar la totalidad de las secuencias no codificantes de FPA pre pro y 5' con las de, por ejemplo, el gen de BLG, aunque se pueden reemplazar las regiones mas pequenas.

Para la expresion de polipeptidos asociados a ficolina y otros polipeptidos de acuerdo con la presente invencion en animales transgenicos, un segmento de ADN que codifica FAP esta unido operativamente a segmentos de ADN adicionales requeridos para que su expresion produzca unidades de expresion. Tales segmentos adicionales incluyen el promotor mencionado anteriormente, asf como las secuencias que proporcionan la terminacion de la transcripcion y la poliadenilacion del ARNm. Las unidades de expresion incluiran ademas un segmento de ADN que codifica una secuencia senal secretora unida operativamente al segmento que codifica la FAP modificada. La secuencia senal secretora puede ser una secuencia senal secretora de FAP nativa o puede ser la de otra protema, tal como una protema de la leche (vease, por ejemplo, von Heijne, Nucl. Acids Res. 14: 46834690 (1986); y Meade y col., documento U.S. 4.873.316, que se incorporan en el presente documento como referencia).

La construccion de unidades de expresion para su uso en animales transgenicos se lleva a cabo convenientemente insertando una secuencia de FAP en un plasmido o vector fago que contiene los segmentos de ADN adicionales, aunque la unidad de expresion puede construirse esencialmente con cualquier secuencia de ligaduras. Es particularmente conveniente proporcionar un vector que contiene un segmento de ADN que codifique una protema de la leche y reemplazar la secuencia de codificacion de la protema de la leche con la de una variante de FAP; creando de este modo una fusion de genes que incluye las secuencias de control de la expresion del gen de la protema de la leche. En cualquier caso, la clonacion de las unidades de expresion en plasmidos u otros vectores facilita la amplificacion de la secuencia de FAP. La amplificacion se lleva a cabo convenientemente en celulas huesped bacterianas (por ejemplo, E. coli), por lo tanto, los vectores incluiran tfpicamente un origen de replicacion y un marcador seleccionable funcional en celulas huesped bacterianas. La unidad de expresion se introduce luego en los huevos fertilizados (incluidos los embriones en etapa temprana) de la especie huesped elegida. La introduccion de ADN heterologo se puede lograr mediante una de varias rutas, incluyendo microinyeccion (por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 4.873.191), infeccion por retrovirus (Jaenisch, Science 240: 1468 1474 (1988)) o integracion dirigido al sitio usando celulas madre (ES) embrionarias (revisado por Bradley y col., Bio/Technology 10: 534 539 (1992)). A continuacion, los huevos se implantan en los oviductos o uteros de hembras seudoprenadas y se dejan desarrollar hasta el final. Los descendientes que llevan el ADN introducido en su lmea germinal pueden pasar el ADN a su progenie del modo mendeliano normal, lo que permite el desarrollo de rebanos transgenicos. Los procedimientos generales para producir animales transgenicos son conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Hogan y col., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1986; Simons y col., Bio/Technology 6: 179183 (1988); Wall y col., Biol. Reprod. 32: 645651 (1985); Buhler y col., Bio/Technology 8: 140 143 (1990); Ebert y col., Bio/Technology 9: 835 838 (1991); Krimpenfort y col., Bio/Technology 9: 844 847 (1991); Wall y col., J. Cell. Biochem. 49: 113 120 (1992); documento U.S. 4.873.191; documento U.S. 4.873.316; documento WO 88/00239, documento WO 90/05188, documento WO 92/11757; y documento GB 87/00458). Las tecnicas para introducir secuencias de ADN extrano en los mairnferos y sus celulas germinales se desarrollaron originalmente en raton (vease, por ejemplo, Gordon y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 73807384 (1980); Gordon y Ruddle, Science 214, 12441246 (1981); Palmiter y Brinster, Cell 41:343345 (1985); Brinster y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 44384442 (1985); y Hogan y col., (ibid.)). Estas tecnicas se adaptaron posteriormente para su uso con animales mas grandes, incluyendo especies de ganado (vease, por ejemplo, los documentos WO 88/00239, WO 90/05188 y WO 92/11757; y Simons y col., Bio/Technology 6: 179 183 (1988)). Para resumir, en la ruta mas eficiente utilizada hasta la fecha en la generacion de ratones transgenicos o ganado, se inyectan varios cientos de moleculas lineales del ADN de interes en uno de los pronucleos de un huevo fertilizado de acuerdo con tecnicas establecidas. Tambien se puede emplear la inyeccion de ADN en el citoplasma de un cigoto.

Tambien se puede emplear la produccion en plantas transgenicas. La expresion puede ser generalizada o dirigida a un organo particular, tal como un tuberculo (vease, Hiatt, Nature 344:469479 (1990); Edelbaum y col., J. Interferon Res. 12:449453 (1992); Sijmons y col., Bio/Technology 8:217221 (1990); y documento EP 0255378).

Purificacion de FAP

Los polipeptidos asociados a ficolina y otros polipeptidos de la invencion se pueden recuperar del medio de cultivo celular o de la leche. Los polipeptidos asociados a ficolina y otros polipeptidos de la presente invencion pueden purificarse mediante diversos procedimientos conocidos en la tecnica que incluyen, pero sin limitacion, cromatograffa (por ejemplo, de intercambio ionico, de afinidad, hidrofoba, cromatoenfoque y de exclusion por tamano), procedimientos electroforeticos (por ejemplo, enfoque isoelectrico preparativo (IEF), solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitacion con sulfato de amonio), o extraccion (vease, por ejemplo, Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers, Nueva York, 1989). Preferentemente, pueden purificarse mediante cromatograffa de afinidad en una columna de anticuerpo anti-FAP. La purificacion adicional se puede lograr por medios convencionales de purificacion qmmica, tal como la cromatograffa lfquida de alto rendimiento. Otros procedimientos de purificacion, incluyendo precipitacion con citrato de bario, son conocidos en la tecnica y se pueden aplicar a la purificacion de los nuevos polipeptidos asociados a ficolina y otros polipeptidos descritos en el presente documento (vease, por ejemplo, Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982).

Para fines terapeuticos, se prefiere que los polipeptidos asociados a ficolina y otros polipeptidos de la invencion sean sustancialmente puros. Por tanto, en una realizacion preferida de la invencion, el y otros polipeptidos de la invencion se purifican hasta una homogeneidad de al menos aproximadamente 90 a 95 %, preferentemente a al menos aproximadamente una homogeneidad del 98 %. La pureza se puede evaluar, por ejemplo, mediante electroforesis en gel y secuenciacion de aminoacidos amino-terminal.

El termino "polipeptido aislado" se refiere a un polipeptido de la presente invencion que (1) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de los polinucleotidos, lfpidos, carbohidratos u otros materiales (es decir, contaminantes) con los que esta naturalmente asociado. Preferentemente, el polipeptido aislado esta sustancialmente libre de otros polipeptidos contaminantes u otros contaminantes que se encuentran en su ambiente natural, que interferina con su uso terapeutico, diagnostico, profilactico o de investigacion.

El termino "microorganismo" como se usa en el presente documento se refiere a bacterias, hongos, arqueas, protistas; plantas y animales microscopicos (como algas verdes o plancton), planaria y ameba. Incluidos dentro de esta definicion estan los microorganismos patogenos.

Ensayos

Un procedimiento general para SDS-PAGE y transferencia Western:

la electroforesis se realizo en geles de poliacrilamida Bis-Tris al 10 % o al 4-12 % (p/v) con tampones discontinuas utilizando el sistema NuPAGE® (Invitrogen) segun lo recomendado por el fabricante. La transferencia de tipo Western se realizo utilizando membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF-HyBond, GE-healthcare, Hilleroed, Dinamarca, n.° cat. RPN303F), 2 pg/ml de anticuerpo monoclonal primario marcado con biotina y visualizacion secundaria por estreptavidina conjugada con HRP (P0397, Dako, Glostrup, Dinamarca) diluido a 1:1500 en PBS, Tween20 al 0,05 %. Las membranas se desarrollaron con 0,04 % de 3-amino-9-etilcarbazol (Sigma-aldrich, Broenby, Dinamarca, n.° cat. A5754-100G) en acetona y 0,015 % de H2O2 en tampon de acetato sodico 50 mM a pH 5.

Coinmunoprecipitacion:

Inmunoprecipitacion de complejos sericos de lectina de union a manosa (MBL): se diluyo 1 ml de suero humano normal en una proporcion 1:1 en TBS (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, a pH 7,5) y se incubo de extremo a extremo durante 1 hora a 4 °C con 5 pg del anticuerpo monoclonal de raton espedfico de MBL Hyb 131-11 (Bioporto, Gentofte, Dinamarca).

Inmunoprecipitacion de complejos sericos de ficolina-2: se diluyo 0,5 ml de suero humano normal en una proporcion 1:1 en TBS (Tris 10 mM, NaCI 140 mM, pH 7,5) y se incubo de extremo a extremo durante 1 hora a 4 °C con 5 |jg del anticuerpo monoclonal de raton espedfico de ficolina 2 Hyb 219 (Munthe-Fog L, y col.,.) Inmunoprecipitacion de complejos sericos de ficolina-3: se diluyo 0,2 ml de suero humano normal en una proporcion 1:1 en T^bs (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, pH 7,5) y se incubo de extremo a extremo durante 1 hora a 4 °C con 5 jg del anticuerpo monoclonal de raton espedfico de ficolina 3 Hyb 334 (Munthe-Fog L, y col.,.)

La precipitacion del complejo inmune se llevo a cabo con perlas dynal magneticas conjugadas con IgG anti-raton de oveja (Dynal-Invitrogen, n.° de cat. 112.02D): Despues de la incubacion con anticuerpos sericos y primarios (como anteriormente), se anadieron 5x107 de perlas dynal magneticas conjugadas anti-raton de oveja y se incubaron durante 30 minutos a 4 °C. Las perlas se separaron magneticamente y se lavaron tres veces con TBS-tween-Ca2+ (Tris 10 mM, NaCl 140 mM, Tween al 0,05 %, CaCl25 mM, pH 7,5) y finalmente se llevo a ebullicion en tampon de carga de SDS y se analizo mediante SDS-PAGE y transferencia de tipo Western con el anticuerpo monoclonal marcado con biotina mAb-8B3 (que reacciona con un epttopo en la cadena pesada/cadena A compartida por MASP-1 y -3).

Purificacion por inmunoafinidad de FAP: 10 mg de mAb-8B3 (que reacciona con un epftopo en la cadena pesada/cadena A compartida por FAP, MASP-1 y -3) o 10 mg de anticuerpos policlonales de conejo anti-FAP se conjugaron con sefarosa activada con CNBr segun lo recomendado por el fabricante (GE-healthcare, Hilleroed, Dinamarca, n.° de cat. 17-0430-01) y empaquetado en una columna.

Purificacion en suero: se diluyeron 150 ml de un conjunto de suero humano normal en una proporcion de 1:1 con TBS NaCl 0,5 M EDTA 10 mM (Tris 10 mM, NaCl 640 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5) y se cargaron en las columnas descritas anteriormente. Las columnas se lavaron con 1 l de TBS NaCl 0,5 M EDTA 10 mM y las fracciones de 1 ml se eluyeron con glicina-HCl 1M, pH 2,5 y se analizo mediante SDS-PAGE y transferencia de tipo Western con anticuerpo monoclonal marcado con biotina mAb-8B3.

Purificacion de FAP recombinante: 2-3 l de sobrenadante de cultivo (de medio libre de suero CHO/Gibco-Invitrogen, n.° cat. 12651-014) de celulas de ovario de hamster chino (celulas CHO) que expresan FAP recombinante (rFAP) se cargaron en las columnas de anticuerpos descritas anteriormente. Las columnas se lavaron con 1,5 l de TBS NaCl 0,5 M EDTA 10 mM y se eluyeron fracciones de 1 ml con glicina-HCl 1 M, a pH 2,5. Las fracciones eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE y tincion con coomassie.

Se solicito la expresion recombinante de ADNc de FAP de longitud completa insertado en el vector pcDNA5/FRT (Invitrogen, n.° de cat. V6010-20) a Genscript (Genscript, New Jersey, EE. UU.) y se cotransfecto con el vector pOG44 (Invitrogen, n.° de cat. V6005-20) en la lmea celular CHO Flp-In (Invitrogen, n.° de cat R758-07) y se selecciono y se clono segun lo recomendado por el fabricante (Invitrogen). Las celulas se cultivaron en medio libre de suero Freestyle CHO (Invitrogen, n.° de cat. 12651-014) y los sobrenadantes de cultivo se recogieron y analizaron.

La produccion de anticuerpos monoclonales y policlonales: una construccion peptfdica (solicitada en Genscript, New Jersey, EE. UU.) de los 17 residuos en C-terminal espedficos de FAP se acoplaron a la forma de toxoide del tetanos y la difteria utilizando el procedimiento de acoplamiento de cistema con ester de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida como recomienda el fabricante (Thermo Fisher Scientific/Pierce, Illinois, EE.UU.).

Se inmunizaron seis ratones y dos conejos tres veces (con intervalos de 14 dfas) con 25 jg de antfgeno adsorbido en Al(OH)3 y adyuvante incompleto de Freund. Los tttulos de anticuerpos policlonales se evaluaron mediante ELISA con los diferentes peptidos FAP acoplados a un portador de protemas. El antisuero policlonal de conejo (10 ml) se recogio 14 dfas despues de la primera, segunda y tercera inmunizacion.

Se utilizaron dos ratones para la produccion de anticuerpos monoclonales. Cuatro dfas antes de la fusion, los ratones recibieron una inyeccion intravenosa de 25 jg de antfgeno. La fusion se realizo como se describe en otro lugar (Kohler, G. y C. Milstein. 1975. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495-497).

Los clones se seleccionaron mediante deteccion selectiva ELISA diferencial contra peptidos acoplados a diferentes portadores de protemas.

Ensayos de complemento funcional: se utilizaron los sueros homocigotos defectivos en ficolina-3 y MBL para investigar la funcion de la FAP.

Ensayo de ficolina-3: se recubrieron placas Maxisorp (NUNC, Roskilde, Dinamarca, n.° de cat. 439454) con seroalbumina bovina acetilada a 5 jg/ml durante 12 horas a 4 °C en tampon de recubrimiento (Na2CO3 15 mM, NaHCO335 mM, a pH 9,5). Despues de bloquear/lavar cuatro veces en tampon de barbital/tween (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCl22 mM, MgCh 1 mM, pH 7,4 Tween al 0,05 %), se anadio ficolina-3 humana recombinante a 500 ng/ml de tampon barbital/tween y se incubo durante 1,5 horas a 20 °C con agitacion. Despues de lavar las placas dos veces en tampon de barbital/tween, se anadieron FAP recombinante, MASP-1, -2 o -3 humana como sobrenadantes de cultivo en medio sin suero en diluciones en serie en la primera dimension en placas separadas y se incubaron durante 1 hora a 20 °C con agitacion. Despues de lavar las placas dos veces en tampon de barbital/tween, se anadio suero deficiente en ficolina-3 o MASP-2 en diluciones en serie en la segunda dimension en las placas y se incubo durante 30 minutos a 37 °C. Despues de lavar las placas cuatro veces en tampon barbital/tween, se midio la deposicion del factor de complemento C4 mediante incubacion durante 1 hora a 20 °C con anticuerpos policlonales de conejo contra C4c humano (Dako, Glostrup, Dinamarca, n.° de cat Q0369) diluido a 1:2000, seguido de cuatro etapas de lavado e incubacion con anticuerpos anti conejo de cerdo conjugados con peroxidasa de rabano picante (Dako, Glostrup, Dinamarca n.° de cat. P0399) durante 45 minutos a 20 °C. La senal que se obtuvo mediante las placas se desarrollo con 100 pl/pocillo de orto-fenilendiamina (OPD) (0,4 mg/ml) disuelto en tampon citrato (acido cftrico 35 mM, Na2PO465 mM, pH 5) con 0,12 % (v/v) de H2O2. La reaccion enzimatica se detuvo con H2SO4 1 M y los niveles de densidad optica (DO) se midieron a 490 nm-650 nm utilizando un lector cinetico de V-max (Molecular Devices).

Ensayo de lectina de union a manosa: placas Maxisorp (NUNC, Roskilde, Dinamarca, 439454) se recubrieron con manano (Sigma-Aldrich, Broenby, Dinamarca, n.° de cat. M7504-1G) a 10 pg/ml durante 12 horas a 4 °C en tampon de recubrimiento (Na2CO315 mM, NaHCO335 mM, a pH 9,5). Despues de bloquear/lavar cuatro veces en tampon de barbital/tween (barbital 4 mM, NaCl 145 mM, CaCl22 mM, MgCl2 1 mM, pH 7,4 Tween al 0,05 %) se anadio lectina de union a manosa humana recombinante a 0,5 pg/ml de tampon barbital/tween y se incubo durante 1,5 horas a 20 °C con agitacion. Despues de lavar las placas dos veces en tampon de barbital/tween, se anadieron FAP recombinante, MASP-1, -2 o -3 humana como sobrenadantes de cultivo en medio sin suero en diluciones en serie en la primera dimension en placas separadas y se incubaron durante 1 hora a 20 °C con agitacion. Despues de lavar las placas dos veces en tampon de barbital/tween, se anadio suero deficiente en MBL o MASP-2 en diluciones en serie en la segunda dimension en las placas y se incubo durante 45 minutos a 37 °C. Despues de lavar las placas cuatro veces en tampon barbital/tween, se midio la deposicion del factor de complemento C4 mediante incubacion durante 1 hora a 20 °C con anticuerpos policlonales de conejo contra C4c humano (Dako, Glostrup, Dinamarca, n.° de cat Q0369) diluido a 1:2000, seguido de cuatro etapas de lavado e incubacion con anticuerpos anti conejo de cerdo conjugados con peroxidasa de rabano picante (Dako, Glostrup, Dinamarca n.° de cat. P0399) durante 45 minutos a 20 °C. La senal que se obtuvo mediante las placas se desarrollo con 100 pl/pocillo de orto-fenilendiamina (OPD) (0,4 mg/ml) disuelto en tampon citrato (acido cftrico 35 mM, Na2PO465 mM, pH 5) con 0,12 % (v/v) de H2O2. La reaccion enzimatica se detuvo con H2SO41 M y los niveles de densidad optica (DO) se midieron a 490 nm-650 nm utilizando un lector cinetico de V-max (Molecular Devices).

Ensayo de genotipado: Se pueden realizar diferentes ensayos de genotipado cuando el genotipo se determina en individuos que usan ensayos biologicos. Se podnan utilizar diferentes tipos de ensayos, tales como:

• procedimientos basados en hibridacion

◦ Hibridacion dinamica espedfica de alelo

◦ Balizas moleculares

◦ Micromatrices de SNP

• procedimientos basados en enzimas

◦ Polimorfismo de longitud de fragmento de restriccion

◦ procedimientos basados en PCR

◦ Flap endonucleasa

◦ Extension del cebador

◦ 5'-nucleasa

◦ Ensayo de oligonucleotido ligasa

• Otros procedimientos de postamplificacion basados en las propiedades ffsicas del ADN

◦ Polimorfismo de conformacion monocatenaria

◦ Electroforesis en gel con gradiente de temperatura

◦ Desnaturalizacion de cromatograffa ftquida de alto rendimiento

◦ Fusion de alta resolucion de todo el amplicon

◦ SNPlex

• Secuenciacion

Administracion y composiciones farmaceuticas

Trntamientos combinados

El polipeptido asociado a ficolina como se define en la presente memoria descriptiva puede administrarse simultanea o secuencialmente con una o mas protemas seleccionadas de ficolina-1,2, 3 y lectina de union a manosa (MBL). Los factores pueden suministrarse en forma de dosificacion unica en la que la forma de dosificacion unica contiene ambos compuestos, o en forma de un kit de partes que comprende una preparacion de un polipeptido asociado a ficolina como una primera forma de dosificacion unitaria y una preparacion de el uno o mas otros compuestos como una segunda forma de dosificacion unitaria. Cada vez que una primera o segunda o tercera, etc., dosis unitaria se menciona en esta memoria descriptiva, esto no indica el orden de administracion preferido, pero se hace simplemente con fines de conveniencia.

Por dosificacion "simultanea" de una preparacion de un polipeptido asociado a ficolina y una preparacion de uno o mas compuestos distintos se entiende la administracion de los compuestos en una forma de dosificacion unica o la administracion de un primer agente seguido de la administracion de un segundo agente con una separacion de tiempo de no mas de 15 minutos, preferentemente 10, mas preferente 5, mas preferente 2 minutos. Cualquiera de los dos factores puede administrarse primero.

Por dosificacion "secuencial" se entiende la administracion de un primer agente seguido de la administracion de un segundo agente con un tiempo de separacion de mas de 15 minutos. Cualquiera de las dos formas de dosificacion unitaria puede administrarse primero. Preferentemente, ambos productos se inyectan a traves del mismo acceso intravenoso.

Otro objeto de la presente invencion es proporcionar una formulacion farmaceutica que comprende un polipeptido asociado a ficolina que esta presente en una concentracion de suero/plasma de 0 mg/ml a 1 mg/ml, y en la que la formulacion tiene un pH de 2,0 a 10,0. La formulacion puede comprender ademas un sistema tampon, conservante(s), agente(s) de tonicidad, agente(s) quelante)s), estabilizantes y tensioactivos. En algunas realizaciones de la invencion, la formulacion farmaceutica es una formulacion acuosa, es decir, una formulacion que comprende agua. Normalmente, dicha formulacion es una solucion o una suspension. En una realizacion adicional de la invencion, la formulacion farmaceutica es una solucion acuosa. La expresion "formulacion acuosa" se define como una formulacion que comprende al menos 50 % p/p de agua. Igualmente, la expresion "solucion acuosa" se define como una solucion que comprende al menos el 50 % p/p de agua, y el termino "suspension acuosa" se define como una suspension que comprende al menos el 50 % p/p de agua.

En otras realizaciones, la formulacion farmaceutica es una formulacion liofilizada, a la cual el medico o el paciente anaden disolventes y/o diluyentes antes de su uso.

En otras realizaciones, la formulacion farmaceutica es una formulacion desecada (por ejemplo, liofilizada o secada por pulverizacion) lista para su uso sin ninguna disolucion previa.

En un aspecto adicional, la invencion se refiere a una formulacion farmaceutica que comprende una solucion acuosa de un polipeptido asociado a ficolina, y un tampon, en la que el polipeptido asociado a ficolina esta presente en una concentracion de suero/plasma de 0-1 mg/ml o superior, y en la que la formulacion tiene un pH de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 10,0.

En otras realizaciones de la invencion, el pH de la formulacion se selecciona de la lista que consiste en 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6, 9,7, 9,8, 9,9 y 10,0.

En una realizacion adicional de la invencion, el tampon se selecciona del grupo que consiste en acetato de sodio, carbonato de sodio, citrato, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, dihidrogeno fosfato de sodio, hidrogenofosfato disodico, fosfato de sodio y tris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, acido malico, succinato, acido maleico, acido fumarico, acido tartarico, acido aspartico o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tampones espedficos constituye una realizacion alternativa de la invencion.

En una realizacion adicional de la invencion, la formulacion comprende ademas un conservante farmaceuticamente aceptable. En una realizacion adicional de la invencion, el conservante se selecciona del grupo que consiste en fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, p-hidroxibenzoato de metilo, p-hidroxibenzoato de propilo, 2-fenoxietanol, phidroxibenzoato de butilo, 2-feniletanol, alcohol bendlico, clorobutanol y tiomerosal, bronopol, acido benzoico, imidurea, clorohexidina, deshidroacetato sodico, clorocresol, p-hidroxibenzoato de etilo, cloruro de bencetonio, clorfenesina (3p-clorfenoxipropano-1,2-diol) o mezclas de los mismos. En una realizacion adicional de la invencion, el conservante a una concentracion de 0,1 mg/ml a 20 mg/ml. En una realizacion adicional de la invencion, el conservante a una concentracion de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. En una realizacion adicional de la invencion, el conservante a una concentracion de 5 mg/ml a 10 mg/ml. En una realizacion adicional de la invencion, el conservante a una concentracion de 10 mg/ml a 20 mg/ml. Cada uno de estos conservantes espedficos constituye una realizacion alternativa de la invencion. El uso de un conservante en composiciones farmaceuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edicion, 1995.

En una realizacion adicional de la invencion, la formulacion comprende ademas un agente isotonico. En una realizacion adicional de la invencion, el agente isotonico se selecciona del grupo que consiste en una sal (por ejemplo, cloruro de sodio), un azucar o alcohol de azucar, un aminoacido (por ejemplo, L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina, acido aspartico, triptofano, treonina), un alditol (por ejemplo, glicerol (glicerina), 1,2-propanodiol (propilenglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenglicol (por ejemplo, PEG400) o mezclas de los mismos. Se puede usar cualquier azucar, tal como monosacaridos, disacaridos o polisacaridos, o glucanos solubles en agua, incluyendo, por ejemplo, fructosa, glucosa, manosa, sorbosa, xilosa, maltosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, dextrano, pululano, dextrina, ciclodextrina, almidon soluble, hidroxietilalmidon y carboximetilcelulosa-Na. En algunas realizaciones, el aditivo de azucar es sacarosa. El alcohol de azucar se define como un hidrocarburo C4-C8 que tiene al menos un grupo -OH e incluye, por ejemplo, manitol, sorbitol, inositol, galactitol, dulcitol, xilitol y arabitol. En algunas realizaciones, el aditivo de alcohol de azucar es manitol. Los azucares o alcoholes de azucar mencionados anteriormente se pueden usar de forma individual o en combinacion. No hay lfmite fijo a la cantidad utilizada, Siempre que el azucar o el alcohol de azucar sea soluble en la preparacion lfquida y no afecte de forma adversa a los efectos estabilizadores logrados usando los procedimientos de la invencion. En algunas realizaciones, la concentracion de azucar o alcohol de azucar esta entre aproximadamente 1 mg/ml y aproximadamente 150 mg/ml. En una realizacion adicional de la invencion, el agente isotonico esta presente a una concentracion de 1 mg/ml a 50 mg/ml. En una realizacion adicional de la invencion, el agente isotonico esta presente a una concentracion de 1 mg/ml a 7 mg/ml. En una realizacion adicional de la invencion, el agente isotonico esta presente a una concentracion de 8 mg/ml a 24 mg/ml. En una realizacion adicional de la invencion, el agente isotonico esta presente a una concentracion de 25 mg/ml a 50 mg/ml. Cada uno de estos agentes isotonicos espedficos constituye una realizacion alternativa de la invencion. El uso de un agente isotonico en composiciones farmaceuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edicion, 1995.

En una realizacion adicional de la invencion, la formulacion comprende ademas un agente quelante. En una realizacion adicional de la invencion, el agente quelante se selecciona de sales de acido etilendiaminotetraacetico (EDTA), acido dtrico y acido aspartico, y mezclas de los mismos. En una realizacion adicional de la invencion, el agente quelante esta presente a una concentracion de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. En una realizacion adicional de la invencion, el agente quelante esta presente a una concentracion de 0,1 mg/ml a 2 mg/ml. En una realizacion adicional de la invencion, el agente quelante esta presente a una concentracion de 2 mg/ml a 5 mg/ml. Cada uno de estos agentes quelantes espedficos constituye una realizacion alternativa de la invencion. El uso de un agente quelante en composiciones farmaceuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edicion, 1995.

En una realizacion adicional de la invencion, la formulacion comprende ademas un estabilizante. El uso de un estabilizante en composiciones farmaceuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edicion, 1995.

Mas particularmente, las composiciones de la invencion son composiciones farmaceuticas lfquidas estabilizadas cuyos componentes terapeuticamente activos incluyen un polipeptido que posiblemente muestra formacion de agregados durante el almacenamiento en formulaciones farmaceuticas lfquidas. Por "formacion de agregados" se entiende una interaccion ffsica entre las moleculas polipeptfdicas que produce la formacion de oligomeros, que pueden permanecer solubles o grandes agregados visibles que precipitan de la solucion. Por "durante el almacenamiento" se entiende una composicion o formulacion farmaceutica lfquida una vez preparada, que no se administra inmediatamente a un sujeto. En su lugar, tras la preparacion, se envasa para su almacenamiento, ya sea en forma lfquida, en estado congelado, o en forma seca para su posterior reconstitucion en una forma lfquida u otra forma adecuada para la administracion a un sujeto. Por "forma seca" se entiende la composicion farmaceutica lfquida o la formulacion se seca mediante liofilizacion (es decir, liofilizacion; vease, por ejemplo, Williams y Polli (1984) J. Parenteral Sci. Technol. 38: 48-59), secado por pulverizacion (vease Masters (1991) en Spray-Drying Handbook (5a ed; Longman Scientific and Technical, Essez, Reino Unido), pag. 491-676; Broadhead y col., (1992) Drug Devel. Ind. Pharm. 18:1169-1206; y Mumenthaler y col., (1994) Pharm. Res. 11: 12-20), o secado al aire (Carpenter y Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; y Roser (1991) Biopharm. 4:47-53). La formacion de agregados por un polipeptido durante el almacenamiento de una composicion farmaceutica lfquida puede afectar de forma adversa a la actividad biologica de ese polipeptido, dando como resultado la perdida de eficacia terapeutica de la composicion farmaceutica. Ademas, la formacion de agregados puede causar otros problemas, como el bloqueo de tubos, membranas, o bombas cuando la composicion farmaceutica que contiene el polipeptido se administra utilizando un sistema de infusion.

La composiciones farmaceuticas de la invencion pueden ademas comprender una cantidad de una base de aminoacidos suficiente para disminuir la formacion de agregados por el polipeptido durante el almacenamiento de la composicion. Por "base de aminoacidos" se entiende un aminoacido o una combinacion de aminoacidos, donde cualquier aminoacido dado esta presente en su forma de base libre o en su forma de sal. Cuando se usa una combinacion de aminoacidos, todos los aminoacidos pueden estar presentes en sus formas de base libre, todos pueden estar presentes en sus formas de sal, o algunos pueden estar presentes en sus formas de base libre, mientras que otros estan presentes en sus formas de sal. En algunas realizaciones, los aminoacidos para usar en la preparacion de las composiciones de la invencion son aquellos que llevan una cadena lateral cargada, tales como arginina, lisina, acido aspartico y acido glutamico. Cualquier estereoisomero (es decir, isomero L, D, o una mezcla de los mismos) de un aminoacido concreto (por ejemplo, metionina, histidina, imidazol, arginina, lisina, isoleucina, acido aspartico, triptofano, treonina y mezclas de los mismos) o combinaciones de estos estereoisomeros, puede estar presente en las composiciones farmaceuticas de la invencion siempre que el aminoacido concreto este presente en su forma de base libre o en su forma de sal. En algunas realizaciones, se usa el estereoisomero L. Las composiciones de la invencion tambien se pueden formular con analogos de estos aminoacidos. Por “analogo de aminoacido” se pretende decir un derivado del aminoacido natural que conlleva el efecto deseado de disminuir la formacion de agregados por el polipeptido durante el almacenamiento de las composiciones farmaceuticas Kquidas de la invencion. Los analogos de arginina adecuados incluyen, por ejemplo, aminoguanidina, ornitina y N-monoetil L-arginina, los analogos de metionina adecuados incluyen etionina y butionina y los analogos de cistema adecuados incluyen S-metil-L cistema. Al igual que con los otros aminoacidos, los analogos de aminoacidos se incorporan a las composiciones en su forma de base libre o en su forma de sal. En una realizacion adicional de la invencion, los aminoacidos o analogos de aminoacidos se usan en una concentracion, que es suficiente para prevenir o retrasar la agregacion de la protema.

En una realizacion adicional de la invencion se puede anadir metionina (u otro aminoacido sulfurico o analogo de aminoacido) para inhibir la oxidacion de los residuos de metionina en sulfoxido de metionina cuando el polipeptido que actua como agente terapeutico es un polipeptido que comprende al menos un residuo de metionina susceptible a dicha oxidacion. Por “inhibe” se quiere decir la acumulacion minima de especies de metionina oxidada con el tiempo. La inhibicion de la oxidacion de metionina tiene como resultado una mayor conservacion del polipeptido en su forma molecular adecuada. Se puede usar cualquier estereoisomero de metionina (isomero L, D o DL) o combinaciones de los mismos. La cantidad a anadir debera ser una cantidad suficiente para inhibir la oxidacion de los residuos de metionina de modo que la cantidad de sulfoxido de metionina es aceptable para las agencias reguladoras. Normalmente, esto significa que la composicion no contiene mas de aproximadamente 10 % a aproximadamente 30 % de sulfoxido de metionina. En general, esto se puede lograr anadiendo metionina de manera tal que la proporcion de metionina anadida a los residuos de metionina vane de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 1000:1, tal como de 10:1 a aproximadamente 100:1.

En una realizacion adicional de la invencion, la formulacion comprende ademas un estabilizante seleccionado del grupo de polfmeros de peso molecular alto o compuestos de peso molecular bajo. En una realizacion adicional de la invencion, el estabilizador se selecciona de polietilenglicol (por ejemplo, PEG 3350), alcohol polivimlico (PVA), polivinilpirrolidona, carboxi/hidroxi celulosa o derivados de la misma (por ejemplo, HPC, HPC-SL, HPC-L y HPMC), ciclodextrinas, sustancias que contienen azufre como monotioglicerol, acido tioglicolico y 2-metiltioetanol, y diferentes sales (por ejemplo, cloruro de sodio). Cada uno de estos estabilizantes espedficos constituye una realizacion alternativa de la invencion.

Las composiciones farmaceuticas tambien pueden comprender agentes estabilizantes adicionales, que potencian adicionalmente la estabilidad de un polipeptido terapeuticamente activo en su interior. Agentes estabilizantes de particular interes para la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, metionina y EDTA, que protegen el polipeptido contra la oxidacion de metionina, y un tensioactivo no ionico, que protege el polipeptido contra la agregacion asociada con la congelacion-descongelacion o el cizallamiento mecanico.

En una realizacion adicional de la invencion, la formulacion comprende ademas un tensioactivo. En una realizacion adicional de la invencion, el tensioactivo se selecciona de un detergente, aceite de ricino etoxilado, gliceridos poliglicolizados, monogliceridos acetilados, esteres de acidos grasos de sorbitan, polfmeros de bloques de polioxipropileno-polioxietileno (por ejemplo, poloxameros como Pluronic® F68, poloxamero 188 y 407, Triton X-100), esteres de acidos grasos de polioxietilen sorbitan, derivados de polioxietileno y polietileno, tales como derivados alquilados y alcoxilados (tweens, por ejemplo, Tween-20, Tween-40, Tween-80 y Brij-35), monogliceridos o derivados etoxilados de los mismos, digliceridos o derivados de polioxietileno de los mismos, alcoholes, glicerol, lectinas y fosfolfpidos (por ejemplo, fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, difosfatidilglicerol y esfingomielina), derivados de fosfolfpidos (por ejemplo, acido dipalmitoil fosfatfdico) y lisofosfolfpidos (por ejemplo, palmitoil lisofosfatidil-L-serina y 1-acil-sn-glicero-3-fosfato-esteres de etanolamina, colina, serina o treonina) y derivados alquilo, alcoxilo (ester alqmlico), alcoxi (eter alqmlico) de lisofosfatidilo y fosfatidilcolinas, por ejemplo, derivados de lauroflo y miristoMo de lisofosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, y modificaciones del grupo de la cabeza polar, es decir, colinas, etanolaminas, acido fosfatfdico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, y el DODAC cargado positivamente, DOTMA, DCP, BISHOP, lisofosfatidilserina y lisofosfatidiltreonina, y glicerofosfolfpidos (por ejemplo, cefalinas), gliceroglicolfpidos (por ejemplo, galactopiranosido), esfingoglicolfpidos (por ejemplo, ceramidas, gangliosidos), dodecilfosfocolina, lisolecitina de huevo de gallina, derivados de acido fusfdico (por ejemplo, tauro-dihidrofusidato de sodio, etc.), acidos grasos de cadena larga y sales de los mismos C6-C12 (por ejemplo, acido oleico y acido capnlico), acilcarnitinas y derivados, derivados Na-acilados de lisina, arginina o histidina, o derivados acilados de cadena lateral de lisina o arginina, derivados Na-acilados de dipeptidos que comprenden cualquier combinacion de lisina, arginina o histidina y un aminoacido neutro o acido, derivado acilado en Na de un tripeptido que comprende cualquier combinacion de un aminoacido neutro y dos aminoacidos cargados, DSS (docusato sodico, n.° de registro ^cA^s [577-11-7]), docusato calcico, n.° de registro CAS [128-49-4]), docusato de potasio, n.° de registro CAS [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de sodio o laurilsulfato de sodio), caprilato de sodio, acido colico o sus derivados, acidos biliares y sales de los mismos y conjugados de glicina o taurina, acido ursodesoxicolico, colato de sodio, desoxicolato de sodio, taurocolato sodico, glicocolato de sodio, N-hexadecil-N, N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato, tensioactivos monovalentes anionicos (alquil-aril-sulfonatos), tensioactivos zwitterionicos (por ejemplo, N-alquil-N, N-dimetilamonio-1-propanosulfonatos, 3-cholamido-1-propildimetilamonio-1-propanosulfonato, tensioactivos cationicos (bases de amonio cuaternario) (por ejemplo, bromuro de cetil-trimetilamonio, cloruro de cetilpiridinio), tensioactivos no ionicos (por ejemplo, Dodecyl p-D-glucopiranosido), poloxaminas (por ejemplo, Tetronic's), que son copolfmeros de bloques tetrafuncionales derivados de la adicion secuencial de oxido de propileno y oxido de etileno a etilendiamina, o el tensioactivo puede seleccionarse del grupo de derivados de imidazolina, o mezclas de los mismos. Cada uno de estos tensioactivos espedficos constituye una realizacion alternativa de la invencion.

El uso de un tensioactivo en composiciones farmaceuticas es bien conocido para el experto. Por conveniencia, se hace referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edicion, 1995.

Es posible que otros ingredientes puedan estar presentes en la formulacion farmaceutica peptidica de la presente invencion. Tales ingredientes adicionales pueden incluir agentes humectantes, emulsionantes, antioxidantes, agentes de carga, modificadores de la tonicidad, agentes quelantes, iones metalicos, vedculos oleaginosos, protemas (por ejemplo, seroalbumina humana, gelatina o protemas) y un zwitterion (por ejemplo, un aminoacido, tal como betama, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Tales ingredientes adicionales, por supuesto, no debenan afectar de forma adversa a la estabilidad general de la formulacion farmaceutica de la presente invencion.

Las composiciones farmaceuticas que contienen un polipeptido asociado a ficolina de acuerdo con la presente invencion pueden administrarse a un paciente que necesite tal tratamiento en varios sitios, por ejemplo, en sitios topicos, por ejemplo, sitios de la piel y la mucosa, en sitios que evitan la absorcion, por ejemplo, administracion en una arteria, en una vena, en el corazon, y en sitios que implican absorcion, por ejemplo, administracion en la piel, bajo la piel, en un musculo o en el abdomen.

La administracion topica puede ser una ventaja particular en el tratamiento de afecciones asociadas con inflamacion local, tal como en el tratamiento de la inflamacion asociada con quemaduras u otras afecciones asociadas con la piel. En consecuencia, en algunas realizaciones la administracion es por administracion topica.

En algunas realizaciones particulares, se pueden gotas oculares en afecciones asociadas con el ojo, tal como queratitis, tal como queratitis lamelar difusa (DLK).

La administracion de composiciones farmaceuticas de acuerdo con la invencion puede ser a traves de varias vfas de administracion, por ejemplo, lingual, sublingual, bucal, en la boca, oral, en el estomago y el intestino, nasal, pulmonar, por ejemplo, a traves de los bronquiolos y alveolos o una combinacion de los mismos, epidermica, dermica, transdermica, vaginal, rectal, ocular, por ejemplo a traves de la conjuntiva, uretral, y parenteral para pacientes que necesitan tal tratamiento.

Las composiciones de la presente invencion pueden administrarse en varias formas de dosificacion, por ejemplo, como soluciones, suspensiones, emulsiones, microemulsiones, emulsion multiple, espumas, pomadas, pastas, yesos, unguentos, comprimidos, tabletas recubiertas, enjuagues, capsulas, por ejemplo, capsulas de gelatina dura y capsulas de gelatina blanda, supositorios, capsulas rectales, pastillas, geles, pulverizadores, polvo, aerosoles, inhaladores, gotas oculares, unguentos oftalmicos, enjuagues oftalmicos, pesarios vaginales, anillos vaginales, unguentos vaginales, solucion inyectable, soluciones de transformacion in situ, por ejemplo, gelificacion in situ, ajuste in situ, precipitacion in situ, cristalizacion in situ, solucion de infusion, e implantes.

Las composiciones de la invencion pueden ademas ser compuestas en, o unirse a, por ejemplo, a traves de interacciones covalentes, hidrofobicas y electrostaticas, un vedculo farmacologico, sistema de administracion de medicamentos y sistema avanzado de administracion de medicamentos para mejorar aun mas la estabilidad del polipeptido asociado a la ficolina, aumentar la biodisponibilidad, aumentar la solubilidad, disminuir los efectos adversos, lograr cronoterapia bien conocido por los expertos en la tecnica, y aumentar el cumplimiento del paciente o cualquier combinacion de los mismos. Los ejemplos de vedculos, los sistemas de administracion de medicamentos y los sistemas avanzados de administracion de medicamentos incluyen, pero sin limitacion, polfmeros, por ejemplo celulosa y derivados, polisacaridos, por ejemplo dextrano y derivados, almidon y derivados, alcohol de polivinilo), polfmeros de acrilato y metacrilato, acidos polilacticos y poliglicolicos y sus copolfmeros de bloques, polietilenglicoles, protemas transportadoras, por ejemplo, albumina, geles, por ejemplo, sistemas de termogelificacion, por ejemplo, sistemas de copolfmeros de bloques bien conocidos por los expertos en la tecnica, micelas, liposomas, microesferas, nanopartmulas, cristales lfquidos y sus dispersiones, fase L2 y sus dispersiones, bien conocidos por los expertos en la tecnica del comportamiento de fases en sistemas de lfpidos en agua, micelas polimericas, emulsiones multiples, autoemulsionante, auto-microemulsificante, ciclodextrinas y derivados de las mismas, y dendnmeros.

Las composiciones de la presente invencion son utiles en la formulacion de solidos, semisolidos, polvo y soluciones para la administracion pulmonar del polipeptido asociado a ficolina, usando, por ejemplo, un inhalador de dosis medida, inhalador de polvo seco y un nebulizador, siendo todos ellos dispositivos bien conocidos por los expertos en la tecnica.

Las composiciones de la presente invencion son espedficamente utiles en la formulacion de sistemas de administracion de farmacos de liberacion controlada, sostenida, prolongada, retardada y lenta. Mas espedficamente, pero sin limitacion, las composiciones son utiles en la formulacion de sistemas de liberacion controlada parenteral y liberacion sostenida (ambos sistemas conducen a una reduccion multiple en el numero de administraciones), bien conocidos por los expertos en la tecnica. Incluso mas preferentemente, los sistemas de liberacion controlada y de liberacion sostenida se administran por via subcutanea. Sin limitar el alcance de la invencion, los ejemplos de sistemas y composiciones de liberacion controlada utiles son hidrogeles, geles oleaginosos, cristales lfquidos, micelas polimericas, microesferas, nanopartmulas.

Los procedimientos para producir sistemas de liberacion controlada utiles para las composiciones de la presente invencion incluyen, pero sin limitacion, cristalizacion, condensacion, cocristalizacion, precipitacion, coprecipitacion, emulsificacion, dispersion, homogeneizacion a alta presion, encapsulacion, secado por pulverizacion, microencapsulacion, coacervacion, separacion de fases, evaporacion del disolvente para producir microesferas, procedimientos de extrusion y fluidos supercffticos. Se hace referencia general al Handbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000) y Drug and the Pharmaceutical Sciences vol.

99: Protein Formulation and Delivery (MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, Nueva York, 2000).

La administracion parenteral se puede realizar por via subcutanea, intramuscular, inyeccion intraperitoneal o intravenosa mediante jeringa, opcionalmente una jeringa similar a una pluma. Como alternativa, la administracion parenteral se puede realizar mediante una bomba de infusion. Una opcion adicional es una composicion que puede ser una solucion o suspension para la administracion del polipeptido asociado a ficolina en forma de un aerosol nasal o pulmonar. Como todavfa una opcion adicional, las composiciones farmaceuticas que contienen el polipeptido asociado a ficolina de la invencion tambien pueden adaptarse a la administracion transdermica, por ejemplo, por inyeccion sin aguja o por un parche, opcionalmente un parche iontoforetico, o administracion transmucosa, por ejemplo, bucal.

La expresion "formulacion estabilizada" se refiere a una formulacion con mayor estabilidad ffsica, mayor estabilidad qrnmica o mayor estabilidad ffsica y qrnmica.

La expresion "estabilidad ffsica" de la formulacion de protemas como se usa en el presente documento se refiere a la tendencia de la protema a formar agregados biologicamente inactivos y/o insolubles de la protema como resultado de la exposicion de la protema a esfuerzos termomecanicos y/o interaccion con interfaces y superficies desestabilizadoras, tales como superficies e interfaces hidrofobas. La estabilidad ffsica de las formulaciones de protema acuosa se evalua por medio de inspeccion visual y/o mediciones de la turbidez despues de exponer la formulacion cargada en recipientes adecuados (por ejemplo, cartuchos o viales) a tension mecanica/ffsica (por ejemplo, agitacion) a diferentes temperaturas durante varios periodos de tiempo. La inspeccion visual de las formulaciones se realiza en una luz focalizada mtida con un fondo oscuro. La turbidez de la formulacion se caracteriza por una puntuacion visual que clasifica el grado de turbidez en, por ejemplo, una escala de 0 a 3 (una formulacion que nuestra ausencia de turbidez corresponde a una puntuacion visual de 0 y una formulacion que muestra turbidez visual con luz diurna corresponde a una puntuacion visual de 3). Una formulacion se clasifica como ffsicamente inestable con respecto a la agregacion de protemas, cuando muestra turbidez visual a la luz del dfa. Como alternativa, la turbidez de la formulacion puede evaluarse mediante simples mediciones de turbidez bien conocidas por los expertos. La estabilidad ffsica de las formulaciones de protema acuosas tambien se puede evaluar usando un agente o sonda espectroscopico del estado conformacional de la protema. Preferentemente, la sonda es una molecula pequena que preferentemente se une a un conformador no nativo de la protema. Un ejemplo de una sonda espectroscopica molecular pequena de la estructura proteica es tioflavina T. La tioflavina T es un pigmento fluorescente que se ha usado ampliamente para la deteccion de fibrillas de amiloide. En presencia de fibrillas, y quizas tambien de otras configuraciones de protemas, la tioflavina T da lugar a un nuevo maximo de excitacion a aproximadamente 450 nm y una emision mejorada a aproximadamente 482 nm cuando se une a una forma de protema de fibrilla. La tioflavina T no unida es esencialmente no fluorescente en las longitudes de onda.

Se pueden usar moleculas pequenas como sondas de los cambios de la estructura proteica desde estados nativos a no nativos. Por ejemplo, las sondas de “parche hidrofobo” se unen, preferentemente, a parches hidrofobos expuestos de una protema. Los parches hidrofobos generalmente estan enterrados dentro de la estructura terciaria de una protema en su estado nativo, pero se exponen a medida que una protema comienza a desplegarse o desnaturalizarse. Los ejemplos de estas pequenas sondas moleculares espectroscopicas son colorantes aromaticos, hidrofobicos, tales como antraceno, acridina, fenantrolina o similares. Otras sondas espectroscopicas son complejos de metal-aminoacidos, tales como complejos metalicos de cobalto de aminoacidos hidrofobos, tales como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina y valina, o similares.

La expresion “estabilidad qrnmica” de la formulacion proteica, como se usa en el presente documento, se refiere a cambios covalentes qmmicos en la estructura de la protema que conducen a la formacion de productos de degradacion qrnmica con una potencial disminucion de la potencia biologica y/o un potencial incremento de las propiedades inmunogenicas en comparacion con la estructura nativa de la protema. Se pueden formar varios productos de la degradacion qrnmica segun el tipo y la naturaleza de la protema nativa y el entorno al que se expone la protema. Lo mas probable es que la eliminacion de la degradacion qrnmica no se pueda evitar por completo y, a menudo, se observan cantidades cada vez mayores de productos de degradacion qrnmica durante el almacenamiento y el uso de la formulacion de protemas, bien conocida por los expertos en la materia. La mayoffa de las protemas son propensas a la desamidacion, un procedimiento en el que el grupo amida de la cadena lateral en los residuos glutaminilo o asparaginilo se hidroliza para formar un acido carboxflico libre. Otras vfas de degradacion implican la formacion de productos de transformacion de alto peso molecular donde dos o mas moleculas de protemas se unen covalentemente entre sf a traves de la transamidacion y/o las interacciones de disulfuro que conducen a la formacion de un dfmero unido covalentemente, productos de degradacion de oligomeros y poffmeros (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). La oxidacion (de, por ejemplo, residuos metionina) se puede mencionar como otra variante de la degradacion qrnmica. La estabilidad qrnmica de la formulacion de protemas puede evaluarse midiendo la cantidad de productos de degradacion qrnmica en diversos puntos temporales despues de la exposicion a diferentes condiciones ambientales (la formacion de productos de degradacion a menudo puede acelerarse, por ejemplo, aumentando la temperature). La cantidad de cada producto de degradacion individual a menudo se determina mediante la separacion de los productos de degradacion, dependiendo del tamano molecular y/o de la carga usando varias tecnicas ctromatograficas (por ejemplo,, SEC-HPLC y/o RP-HPLC).

Por lo tanto, como se ha indicado anteriormente, una "formulacion estabilizada" se refiere a una formulacion con mayor estabilidad ffsica, mayor estabilidad qmmica o mayor estabilidad ffsica y qmmica. En general, una formulacion debe ser estable durante el uso y almacenamiento (en cumplimiento de las condiciones de uso y almacenamiento recomendadas) hasta que llegue la fecha de caducidad.

En algunas realizaciones de la invencion, la formulacion farmaceutica que comprende el polipeptido asociado a ficolina es estable durante mas de 6 semanas de uso y durante mas de 3 anos de almacenamiento. En otras realizaciones de la invencion, la formulacion farmaceutica que comprende el polipeptido asociado a ficolina es estable durante mas de 4 semanas de uso y durante mas de 3 anos de almacenamiento. En una realizacion adicional de la invencion, la formulacion farmaceutica que comprende el polipeptido asociado a ficolina es estable durante mas de 4 semanas de uso y durante mas de dos anos de almacenamiento. En una realizacion aun mas de la invencion, la formulacion farmaceutica que comprende el polipeptido asociado a ficolina es estable durante mas de 2 semanas de uso y durante mas de dos anos de almacenamiento.

Realizaciones espedficas de la invencion

Como se ha descrito anteriormente, la presente invencion se refiere a polipeptidos asociados a ficolina aislados que tiene en su extremo C-terminal la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, en el que el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos 20-380 de la SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de la misma que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion es sustancialmente puro.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion es capaz de asociarse con lectina de union a manosa (MBL).

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion es capaz de asociarse con cualquiera de ficolina-1, ficolina-2 o ficolina-3.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion es capaz de asociarse con uno cualquiera de C1q, protemas surfactantes de pulmon SP-A y/o SP-D, y moleculas de defensa de tipo colageno intracelular, tal como CLL-11.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion es capaz de asociarse con una proterna aceptora espedfica, tal como un receptor espedfico.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion comprende la secuencia de aminoacidos 20-297 de la SEQ ID NO: 3, o una variante funcional de la misma.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion comprende la secuencia de aminoacidos 20-380 de la SEQ ID NO:1 o una variante funcional de la misma.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion comprende la secuencia de aminoacidos 16-296 de la SEQ ID NO: 9 o una variante funcional de la misma.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion tiene una masa molecular de aproximadamente 40 kDa en condiciones no reductoras en una SDS-PAGE.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion esta glicosilado en N en uno o dos aminoacidos correspondientes a una posicion seleccionada entre 49 y 178 de la SEQ ID NO:1.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion es una proterna recombinante.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion esta en forma de homodfmero.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion consiste en la secuencia de aminoacidos 20-380 de la SEQ ID No 1.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4 o variantes o fragmentos inmunologicos de la misma.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion consiste en la SEQ ID NO:4, o variantes o fragmentos inmunologicos de la misma.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion participa en la fagocitosis de las celulas moribundas o muertas, tales como celulas apoptoticas y/o residuos celulares.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion participa en la fagocitosis de un microorganismo.

En algunas realizaciones, los anticuerpos que se unen espedficamente a un polipeptido de acuerdo con la presente invencion es un anticuerpo monoclonal.

En algunas realizaciones, los anticuerpos que se unen espedficamente a un polipeptido de acuerdo con la presente invencion son anticuerpos policlonales.

En algunas realizaciones, el polipeptido de acuerdo con la presente invencion tiene una actividad similar a otras protemas con homologfa de secuencia, tales como la protema adaptadora de envolvimiento (GULP). En algunas realizaciones, la molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido de acuerdo con la presente invencion comprende una secuencia de nucleotidos que es al menos un 70 % identica a la secuencia de SEQ NO: 2.

En algunas realizaciones, la celula huesped de acuerdo con la presente invencion es una celula eucariota.

En algunas realizaciones, la celula huesped de acuerdo con la presente invencion es de origen mairnfero.

En algunas realizaciones, la celula huesped de acuerdo con la presente invencion se selecciona del grupo que consiste en celulas CHO, celulas HEK y celulas BHK.

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al tratamiento de cualquier indicacion asociada con inflamacion, apoptosis y/o autoinmunidad.

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al tratamiento de cualquier afeccion autoinmune, tal como la enfermedad de Addison, anemia hemolttica autoinmunitaria, tiroiditis autoinmune, enfermedad de Crohn, enfermedad de Graves, smdrome de Guillain-Barre, lupus eritematoso sistemico (LES), nefritis lupica, esclerosis multiple, miastenia gravis, psoriasis, cirrosis biliar primaria, artritis reumatoide y uveitis, asma, aterosclerosis, diabetes de tipo I, psoriasis, varias alergias.

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al tratamiento de cualquier trastorno inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en apendicitis, ulcera peptica, ulcera gastrica, ulcera duodenal, peritonitis, pancreatitis, colitis ulcerosa, colitis seudomembranosa, colitis aguda, colitis isquemica, diverticulitis, epiglotitis, acalasia, colangitis, colecistitis, hepatitis, enfermedad de Crohn, enteritis, enfermedad de Whipple, alergia, enfermedad del complejo inmune, isquemia de organos, lesion por reperfusion, necrosis de organos, fiebre del heno, sepsis, septicemia, choque endotoxico, caquexia, hiperpirexia, granuloma eosinofflico, granulomatosis, sarcoidosis, aborto septico, epididimitis, vaginitis, prostatitis, uretritis, bronquitis, enfisema, rinitis, neumonitis, neumotransmicroscopicsilicovolcanoconiosis, alvealitis, bronquiolitis, faringitis, pleuresfa, sinusitis, gripe, infeccion por virus sincitial respiratorio, infeccion por VIH, infeccion por el virus de la hepatitis B, infeccion por el virus de la hepatitis C, bacteriemia diseminada, dengue, candidiasis, malaria, filariasis, amebiasis, quistes hidatfdicos, quemaduras, dermatitis, dermatomiositis, quemaduras solares, urticaria, verrugas, habones, vasulitis, angiitis, endocarditis, arteritis, aterosclerosis, tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, isquemia miocardica, periarteritis nodosa, fiebre reumatica, enfermedad del Alzheimer, enfermedad celfaca, insuficiencia cardfaca congestiva, smdrome de dificultad respiratoria del adulto, meningitis, encefalitis, esclerosis multiple, infarto cerebral, embolia cerebral, smdrome de Guillame-Barre, neuritis, neuralgia, lesion de la medula espinal, paralisis, uveftis, artritis, artralgias, osteomielitis, fascitis, enfermedad de Paget, gota, enfermedad periodontal, artritis reumatoide, sinovitis, miastenia gravis, tiroiditis, lupus sistemico eritematoso, smdrome de Goodpasture, smdrome de Behcet, rechazo de aloinjertos, enfermedad del injerto contra el huesped, diabetes de tipo I, espondilitis anquilosante, enfermedad de Berger, smdrome de Reiter y enfermedad de Hodgkin, queratitis, diabetes de tipo 2, fibrosis qrnstica, infarto de miocardio, lesion por reperfusion, apoplejfa, dermatomiositis, smdrome metabolico, smdrome de respuesta inflamatoria sistemica, sepsis, insuficiencia de multiples organos, coagulacion intravascular diseminada, choque anafilactico. Complicacion vascular y nefropatfa asociada con diabetes de tipo 1 y/o diabetes de tipo 2, meningitis, septicemia bacteriana, paludismo complicado, smdrome uremico hemolttico atfpico, smdrome uremico hemolftico, degeneracion macular relacionada con la edad, hemoglobinuria paroxfstica nocturna, mordedura del veneno de serpiente, lesiones por quemaduras y complicaciones en trasplantes de organos.

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al tratamiento de cualquier trastorno inflamatorio seleccionado del grupo que consiste en isquemia de organos, lesion por reperfusion, necrosis de organos, vasulitis, endocarditis, aterosclerosis, tromboflebitis, pericarditis, miocarditis, isquemia miocardica, periarteritis nodosa, fiebre reumatica, insuficiencia cardfaca congestiva, smdrome de dificultad respiratoria del adulto, infarto cerebral, embolia cerebral. Complicaciones vasculares y nefropatfa asociada con diabetes de tipo 1 y/o de tipo 2.

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al tratamiento de cualquier indicacion asociada con la coagulacion, enfermedades tromboticas o coagulopaticas relacionadas.

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al tratamiento de una indicacion asociada con la coagulacion, enfermedades o trastornos tromboticos o coagulopaticos, incluida la respuesta inflamatoria y enfermedades o trastornos tromboembolicos cronicos asociados con la formacion de fibrina, incluidos trastornos vasculares, tales como trombosis, tales como trombosis venosa profunda, trombosis arterial, trombosis posquirurgica, injerto de derivacion de la arteria coronaria (CABG), angioplastia coronaria transdermica percutanea (ACTP), ictus por deposicion de plaquetas, crecimiento tumoral, metastasis tumoral, angiogenesis, trombolisis, aterosclerosis, reestenosis, tales como arteriosclerosis y/o reestenosis despues de angioplastia, indicaciones agudas y cronicas, tales como inflamacion, sepsis, choque septico, septicemia, hipotension, smdrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), smdrome de respuesta inflamatoria sistemica (SIRS), coagulacion intravascular diseminada (CID), embolia pulmonar, deposicion patologica de plaquetas, infarto de miocardio, o el tratamiento profilactico de mairnferos con vasos ateroscleroticos con riesgo de trombosis, enfermedad venooclusiva despues del trasplante de celulas progenitoras de sangre periferica (PBPC), smdrome uremico hemolttico (SHU) y purpura trombocitopenica trombotica (PTT) y fiebre reumatica. Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al tratamiento de una indicacion asociada con la coagulacion, enfermedades o trastornos tromboticos o coagulopaticos, incluida la respuesta inflamatoria y enfermedades o trastornos tromboembolicos cronicos asociados con la formacion de fibrina, incluidos trastornos vasculares, tales como trombosis, tales como trombosis venosa profunda, trombosis arterial, trombosis posquirurgica, injerto de derivacion de la arteria coronaria (CABG), angioplastia coronaria transdermica percutanea (ACTP), ictus por deposicion de plaquetas, crecimiento tumoral, metastasis tumoral, angiogenesis, trombolisis, aterosclerosis, reestenosis, tales como arteriosclerosis y/o reestenosis despues de angioplastia, indicaciones agudas y cronicas, tales como inflamacion, deposicion patologica de plaquetas, infarto de miocardio, o el tratamiento profilactico de mamfferos con vasos ateroscleroticos con riesgo de trombosis, enfermedad venooclusiva despues del trasplante de celulas progenitoras de sangre periferica (PBPC), smdrome uremico hemolftico (SHU) y purpura trombocitopenica trombotica (PTT) y fiebre reumatica.

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren a prevenir la aparicion de complicaciones tromboembolicas en pacientes identificados de alto riesgo, tales como los que se someten a cirugfa o aquellos con insuficiencia cardfaca congestiva.

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al tratamiento de una afeccion medica asociada con el corazon.

Las realizaciones descritas en el presente documento se refieren al tratamiento de una afeccion medica asociada con una deficiencia en un polipeptido asociado a ficolina.

Ejemplo 1

Deteccion de transcripcion alternativa del gen MASP1

Procedimientos: Para detectar las tres variantes de transcripcion de MASP1: MASP1, MASP3 y FAP, se disenaron cebadores espedficos para cada variante. Se configuro la PCR con un cebador directo comun en el exon 6 (5'-gcacccagagccacagtg-3 ') y cebadores inversos espedficos: MASP1 en el exon 12 (5'-gccttccagtgtgtgggc-3 ’), MASP3 en el exon 11 (5-gccttccagagtgtggtca-3 ’) y FAP en el exon 8a (5'-cgatctggagagcgaactc-3’) (figura 1). Las amplificaciones en PCR se llevaron a cabo en volumenes de 20 pl que conteman: 50 ng de ADNc de hngado (Clontech), 0,25 pM de cada cebador, MgCh 2,5 mM, dNTP 0,2 mM, KCI 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,4 y 0,4 unidades de platino Taq ADN polimerasa (Invitrogen). Las reacciones de PCR se realizaron a los siguientes parametros de ciclado: 10 min a 94 °C, 30 o 40 ciclos (30 s a 94 °C, 50 s a 58 °C, 90 s a 72 °C), 10 min a 72 °C. Las muestras se analizaron en geles de agarosa al 2 %.

Resultados: Se detecto una transcripcion alternativa del gen MASP1 en el ADNc de hngado. Los transcritos de MASP1, MASP3 y FAP se amplificaron utilizando un cebador directo comun ubicado en el exon 6 y los cebadores inversos espedficos ubicados en el exon 12 (MASP1), el exon 11 (MASP3) y el exon 8a (FAP). MASP1 genera un fragmento de 500 pb, MASP3 genera un fragmento de 506 pb y FAP genera un fragmento de 309 pb.

Expresion tisular del fragmento FAP

Procedimientos: Se investigaron paneles de ADNc de tejido humano disponible comercialmente (Clontech) para la expresion de MASP1, MASP3, y FAP con los mismos ensayos de PCR como se ha descrito anteriormente. Las muestras se analizaron en geles de agarosa al 2 %.

Resultados: Las distribuciones tisulares de los genes MASP1, MASP3 y FAP se investigaron en paneles de ADNc de Clontech (figura 2). Los transcritos de MASP1, MASP3 y FAP se amplificaron utilizando un cebador directo comun y cebadores inversos espedficos. Se uso GADPH como gen de referencia. Los tres genes estaban altamente expresfados en el hngado y, ademas, el de FAP se expresaron fuertemente en tejido cardfaco (marcado con flechas negras). Se detecto una expresion menor del gen de FAP en el cerebro, colon, prostata, musculo esqueletico e intestino delgado (marcado con flechas blancas).

Secuenciacion de ADN del FAPexon8a de 100 individuos.

Procedimientos: La secuenciacion directa del exon 8a que incluye el lfmite intron-exon del gen MASP1/MASP3/FAP que se extiende desde la posicion 44,083 a 44,431 en relacion con el sitio de inicio de la traduccion ATG, se realizo en moldes de ADN genomico de 100 individuos caucasicos sanos. El fragmento se amplifico utilizando un solo conjunto de cebadores (directo: 5’-ctgttcttcacactggctg-3’, inverso: 5’-ctgctgagatcatgttgttc-3’), donde los cebadores directos conteman una secuencia 5'-T7 (5'-ttatacgactcacta-3 ’). Las amplificaciones en PCR se llevaron a cabo en volumenes de 20 pl que conteman: 50 ng de ADN genomico, 0,25 pM de cada cebador, MgCl22,5 mM, dNTP 0,2 mM, KCI 50 mM, Tris HCl 10 mM, pH 8,4 y 0,4 unidades de platino Taq ADN polimerasa (Invitrogen). Las reacciones de PCR se realizaron a los siguientes parametros de ciclado: 2 min a 94 °C, 15 ciclos (30 s a 94 °C, 60 s a 64 °C, 60 s a 72 °C), 15 ciclos (30 s a 94 °C, 60 s a 58 °C, 60 s a 72 °C), 5 min a 72 °C y se secuenciaron hacia adelante utilizando el kit de terminacion de secuenciacion de ciclo ABI BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con el protocolo que utiliza cebadores de secuencia biotinilados en 5'. Las reacciones de secuencia se purificaron en la estacion de trabajo de preparacion al vado PyroMark (Biotage) usando cuentas de estreptavidina (GenoVision). El analisis de secuencia se realizo en un analizador genetico ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Las secuencias de ADN resultantes se alinearon utilizando el software BioEdit, y los polimorfismos de ADN se confirmaron visualmente a partir de electroferogramas de secuencia.

Resultados: Todas las secuencias se alinearon utilizando el software BioEdit. No se observaron variaciones geneticas en los 100 individuos sanos en el exon 8a o las regiones exon-intron.

Ejemplo 2

Inmunoprecipitacion.

La inmunoprecipitacion espedfica de MAP-1 del suero se realizo con el mAb 20C4 espedfico de MAP-1 (generado contra el peptido C-terminal espedfico de MAP-1 17) o el mAb 8B3, un anticuerpo monoclonal que reacciona contra la cadena pesada comun de MASP-1/3 utilizado como anticuerpo de precipitacion de control. Se permitio que un total de 10 |jg de anticuerpo anti MAP-1 o MASP-1/3 se unieran a Dynabeads de IgG de raton o conejo de oveja (M-280, n.° de cat. 112.02D/112.04D, Dynal/Invitrogen). Despues de una etapa de lavado, las perlas se aplicaron a un conjunto de suero humano normal (diluido a 1:1 en TBS) y se incubaron de extremo a extremo durante 1 hora a 4 °C. Despues de las etapas de lavado finales y la separacion magnetica, las perlas se hirvieron en tampon de carga de SDS y se sometieron a SDS-PAGE y se analizo la transferencia de tipo Western con anticuerpos contra MAP-1, MBL y ficolina-3.

El mismo procedimiento de precipitacion que se ha descrito anteriormente se realizo con mAb frente a MBL (Hyb 131-11, Bioporto, Dinamarca), ficolina-2 (FCN219) y ficolina-3 (FCN334). Para compensar las diferencias en las concentraciones sericas de MBL, ficolina-2 y -3 se precipitaron a partir de 1 ml, 300 j l y 100 j l de suero, respectivamente. Las muestras se analizaron por SDS-PAGE y la transferencia de tipo Western se sondo con pAb contra MAP-1.

Inmunohistoqmmica.

Las celulas CHO que expresan rMAP-1 se cultivaron en matraces de cultivo en RPMI 10 %. Las celulas se recolectaron a una confluencia del 80-90 %, las celulas se recolectaron y se fijaron durante 24 horas en formaldelddo-PBS al 4 % y posteriormente se incluyeron en parafina. Seis tejidos hepaticos humanos diferentes y muestras de dos tejidos miocardicos diferentes, dos tejidos de musculo esqueletico y dos muestras obtenidas de aorta humana tambien se fijaron y se incluyeron en parafina como se ha descrito anteriormente. Se obtuvieron secciones de rebanadas de 5 jm con un microtomo Leitz Wetzlar y se colocaron en portaobjetos de vidrio y se almacenaron a 4 °C hasta que se analizaron. Los pretratamientos y analisis se realizaron como se ha descrito anteriormente. Los anticuerpos primarios fueron anticuerpos monoclonales espedficos de MAP-1 mAb 12B11 o purificados por afinidad, anti-MAP-1 de conejo monoespedfico diluido a 5 jg/ml. Se aplicaron controles de anticuerpos de isotipo a los tejidos a la misma concentracion. El anticuerpo secundario fue el anticuerpo EnVision ™ (HRP-anti raton o HRP-anti conejo, Dako, Glostrup, Dinamarca). El analisis de los patrones de tincion se realizo bajo un microscopio Leica DMLB2.

SDS-PAGE y transferencia de tipo Western.

La electroforesis se realizo en geles de poliacrilamida Bis-Tris al 10 % o al 4-12 % (p/v) con soluciones tampon discontinuas utilizando el sistema NuPAGE® (Invitrogen) esencialmente como lo describe el fabricante. La transferencia de tipo Western se realizo utilizando membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF-HyBond, Amersham Bioscience), visualizacion de 2 jg/ml de mAb primarios y secundarios por HRP conjugada con estreptavidina (P0397, Dako) diluida a 1:1500 o IgG anti-raton HRP-conejo (PO260, Dako) diluida a 1:1000 en PSB, Tween20 al 0,05 %. Las membranas se desarrollaron con 3-amino-9-etilcarbazol (Sigma) (0,04 % en acetona) y 0,015 % de H2O2 en un tampon de acetato de sodio 50 mM, pH 5.

Ensayo de activacion del complemento.

La influencia de MAP-1 en la deposicion de factor de complemento C4 mediada por MBL y ficolina-3 se evaluo esencialmente como se ha descrito anteriormente. En resumen, el manano (ligando MBL) (Sigma-Aldrich M7504) o la seroalbumina bovina acetilada (ligando de ficolina-3) se inmovilizo en placas ELISA de Maxisorp (Nunc, Dinamarca) a 10 jg/ml. Despues de lavar con se anadio rMBL o rficolina-3 (0,4 jg/ml) y se incubo durante 1,5 horas. Se aplico rMAP-1 o rMASP-2 durante 1 hora en dos diluciones en serie en la primera dimension, seguido de incubacion durante 45 min a 37 °C con diluciones en serie del suero deficiente de MBL o ficolina-3 en la segunda dimension. La deposicion de C4 se midio utilizando un pAb a C4c (Q0369, Dako, Glostrup/Dinamarca).

Ademas, se evaluo el desplazamiento de MASP-2 con MAP-1 utilizando un sistema puro. La rMASP-2 se preincubo durante 45 minutos a 20 ° C en diluciones seriadas en la primera dimension en una matriz rMBL/manano como se ha descrito anteriormente, seguido de incubacion con diluciones de rMAP-1 en la segunda dimension durante 45 minutos a 20 °C. El C4 purificado (de Quidel, CA, EE.UU.) se anadio a una concentracion de 1 pg/ml y se incubo durante 45 minutos a 37 °C. La deteccion se realizo como anteriormente.

Resultados.

MAP-1 co-precipita con ficolina-2, ficolina-3 y MBL

Para investigar una posible asociacion de MAP-1 con MBL y ficolina-3, precipitamos complejos de suero usando tanto mAb20C4 anti MAP-1 como un mAb contra la cadena pesada comun de MASP-1 y MASP-3 (mAb8B3). Los precipitados se analizaron posteriormente mediante transferencia de tipo Western sondada con anticuerpos contra MAP-1, MBL, y ficolina-3, respectivamente. Se observaron bandas pronunciadas de co-precipitacion con ficolina-3, pero tambien se observaron bandas mas debiles con MBL (figura 24A). Las muestras no se sondaron con anticuerpos contra ficolina-2 ya que no funcionaron en transferencia de tipo Western. A continuacion, se invirtio la inmunoprecipitacion usando mAb contra MBL, ficolina-2 y ficolina-3 para precipitar 1 ml, 300 pl y 100 pl de suero, respectivamente, que se realizo para ajustar las diferencias en la concentracion serica de MBL (2 pg/ml), ficolina-2 (5 pg/ml) y ficolina-3 (20 pg/ml), respectivamente. Las muestras se analizaron posteriormente mediante transferencia de tipo Western sondada con anticuerpos contra MAP-1. Se observaron bandas de MAP-1 distintas en los precipitados de ficolina-2 y -3 y se observo una banda mucho mas debil en el precipitado de MBL, donde inmunoprecipitado rMAP-1 y suero MAP-1 sirvieron como controles (figura 24B).

MAP-1 inhibe la actividad del complemento de la via de la lectina.

El suero deficiente de MBL y ficolina-3 en combinacion con rMBL y rficolina-3 se uso para reconstituir la actividad de activacion de C4 del complemento de MBL y ficolina-3. Mannan y BSA acetilada sirvieron como ligandos para MBL y ficolina-3, respectivamente. Tanto rMBL como rficolina-3 pudieron iniciar la deposicion de C4 en los sueros deficientes en MBL y ficolina-3, respectivamente (figura 25A y 25D). La aplicacion de rMASP-2 dio como resultado un fuerte aumento de la dosis positiva de la deposicion de C4 a traves de las vfas de activacion de ficolina-3 y MBL (figura 25B y 25E), mientras que la aplicacion de rMAP-1 dio como resultado una inhibicion pronunciada dependiente de la dosis del C4. deposicion a traves de ambas vfas (figura 25C y 25F).

Ademas, abordamos un posible desplazamiento de MASP-2 con MAP-1 utilizando un sistema de componentes puros que comprende solo rMBL, rMASP-2, rMAP-1 y C4 purificado. rMASP-2 se preincubo con complejos manano/rMBL en diluciones en serie. Posteriormente, Se anadio rMAP-1 en concentraciones variables, seguido de la adicion de C4 purificado. La aplicacion de rMAP-1 al sistema resulto claramente en una inhibicion dependiente de la dosis de la deposicion de C4 (figura 26).

Ejemplo 3

Determinacion de la concentracion serica y las propiedades de asociacion de la nueva protema asociada a MBL/Ficolina 1 (MAP-1).

Se generaron construcciones recombinantes no etiquetadas de longitud completa de MAP-1 y se expresaron de forma estable en celulas CHO-DG44. Se generaron anticuerpos monoclonales espedficos contra MAP-1. Tambien se establecio un ELISA cuantitativo para las mediciones sericas de MAP-1 y las asociaciones entre el suero MAP-1 y la ficolina-2, -3 y MBL se examino por ELISA y fraccionamiento de gradiente de densidad.

Protemas recombinantes

Las construcciones completas de MAP-1 humano no marcado se expresaron en celulas CHO-DG44 como se describe en otro lugar (Hummelshoj y col., Mol Immunol 44, 401-11,2007; Larsen y col., J Biol Chem 279:21302­ 11,2004; Ma y col., 2009 J Biol Chem, 9 de octubre; 284 (41)) con las modificaciones que el medio sin suero PowerCHO1 (Lonza, Vallensbaek/Dinamarca, www.lonza.com) se utilizo como medio de expresion. Se uso purificacion por afinidad de anticuerpos para purificar rMAP-1 como se describio anteriormente (Skjoedt y col., 2009; Immunobiology, 23 de noviembre). En resumen, 15 mg del anticuerpo anti-MAP-1 (mAb 20C4) se acoplaron covalentemente a la sefarosa activada con CNBr esencialmente como se describe por Pfeiffer y col., (Pfeiffer y col., J Immunol Methods 97, 1-9, 1987) y se utilizo como matriz de purificacion. La columna anti-MAP-1 tambien se uso para agotar MAP-1 del suero.

La generacion de anticuerpos monoclonales se realizo como se ha descrito anteriormente (Skjoedt y col., J Biol Chem 285, 8234-43, 2010).

La electroforesis se realizo en geles de poliacrilamida Bis-Tris al 10 % o al 4-12 % (p/v) con tampones discontinuos utilizando el sistema NuPAGE® (Invitrogen) como se recomienda. La transferencia de tipo Western se realizo utilizando membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF-HyBond, GE Healthcare). Las membranas se desarrollaron utilizando 2 pg/ml de mAb primarios y visualizacion secundaria por estreptavidina conjugada con HRP diluida a 1: 1500 o IgG anti-raton con HRP de conejo (P0397/PO260, Dako, Glostrup/Dinamarca, www.dako.com) con 0,04% de 3-amino-9-etilcarbazol (Sigma-Aldrich, Broendby/Dinamarca, www.sigmaaldrich.com) 0,015% H2O2 en un tampon de acetato de sodio 50 mM pH 5 como sustrato.

rMAP-1 se trato con N-glicosidasa-F/ENDO-F (kit de desglicosilacion N-glicosidasa-F, Roche, Mannheim/Alemania, www.roche.com) como se recomienda y ha descrito anteriormente (Skjoedt y col., 2009). Los productos se analizaron mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras seguidas de tincion con Coomassie o transferencia de Western.

La especificidad del mAb 20C4 anti-MAP-1 se ha demostrado previamente (Skjoedt y col., 2010). El mAb 20C4 se uso como el anticuerpo de captura en un ELISA cuantitativo MAP-1 inmovilizado a 6 pg/ml en placas ELISA de Maxisorb (NUNC ™, Roskilde/Dinamarca, www.nuncbrand.com). Se aplicaron diluciones en serie del calibrador (rMAP-1 o rMAP-1 enriquecido en suero empobrecido en MAP-1) o muestras de suero de donante en PBS Tween20 al 0,05 % suero bovino al 0,5 % y EDTA 10 mM. El anticuerpo de deteccion fue un mAb 8B3 marcado con biotina que reacciono con la cadena comun de MASP-1, -3 y MAP-1 descritos anteriormente (Skjoedt y col., 2010; Skjoedt y col., 2009) aplicaron a 3 pg/ml.

Las concentraciones sericas de ficolina-2 y -3 se determinaron segun lo descrito por Munthe-Fog y col., y Hummelshoj y col., (Hummelshoj y col., Hum Mol Genet 14, 1651-8, 2005; Munthe-Fog y col., Scand J Immunol 65, 383-92, 2007; Munthe-Fog y col., Mol Immunol 45, 2660-6, 2008) y las concentraciones sericas de MBL y MASP-3 se determinaron como se describio anteriormente (Skjoedt y col., 2009).

El desarrollo se obtuvo con orto-fenilendiamina (Dako, Glostrup/Dinamarca) y la reaccion de la enzima se detuvo con H2SO4 1M segun lo recomendado. Los niveles de densidad optica (OD490nm-650nm) se midieron utilizando un lector cinetico V-max (Molecular Devices, Sunnyvale/CA/U.S).

La asociacion relativa entre MAP-1 y MBL, ficolina-2 y -3 se evaluaron esencialmente como se describio anteriormente (Skjoedt y col., 2009) con la modificacion de que el mAb 20C4 espedfico de MAP-1 se uso como anticuerpo de captura (recubierto a 6 pg/ml). Los mAb de deteccion fueron FCN-219 marcados con biotina (espedficos de ficolina-2) o FCN-334 (espedficos de ficolina-3) (24-25), o Hyb 131-11, todos aplicados a 2 pg/ml. Se analizaron las muestras de suero de los mismos 100 donantes de sangre daneses anteriores.

El suero humano normal se sometio a separacion en gradiente de sacarosa. Se cargaron 0,75 ml de suero en columnas de centrifugacion de 40 ml que consistfan en 10-30 % de gradientes de sacarosa tamponados en Tris 10 mM, NaCl 145 mM, CaCl2 3 mM y seroalbumina humana 30 pg/ml. Las columnas cargadas se centrifugaron a 150.000 x g al vado durante 24 horas a 4 ° C en una ultracentnfuga L70 Beckmann con una cabeza de rotor SW28. Se recogieron fracciones de 1,5 ml del fondo y se analizaron mediante ELISA espedfico o inmunotransferencia para los siguientes antfgenos: MAP-1, MASP-1, mAs P-2, MASP-3, sMAP, MBL, ficolina-2 y ficolina-3. Los picos del suero IgM (19S) e IgG (7S) tambien se evaluaron indicando la relacion de superficie molecular a masa. Ademas, las fracciones se analizaron para determinar la capacidad de activacion del C4 aplicado de forma exogena. En resumen, las fracciones se aplicaron en diluciones seriadas a placas ELISA recubiertas con BSA acetilado (un ligando ficolina-3) o manano (un ligando MBL) como se ha descrito anteriormente (Skjoedt y col., 2010) seguido de incubacion durante 1 hora a 4 °C con agitacion. Las placas se lavaron y se incubaron con C4 purificado a 1 pg/ml durante 1 hora a 37 ° C. La deposicion de C4 se midio posteriormente con anticuerpos policlonales contra C4c (Q 0369, Dako, Glostrup, Dinamarca).

Analisis estadfstico

Estadfsticas (correlacion no parametrica de Spearman, prueba t de dos colas no parametrica) y los niveles sericos de MAP-1, MBL, ficolina-2 y -3 se calcularon utilizando el software Prism4 (software GraphPad, Inc., La Jolla/CA/US, www.graphpad.com

Resultados

Purificacion y caracterizacion de rMAP-1

La expresion de rMAP-1 en celulas CHO DG44 dio como resultado un alto rendimiento en presencia de metotrexato 150 nM (rendimiento: 10-20 pg/ml en medio sin suero). Despues de la purificacion, se analizo el rMAP-1 en SDS-PAGE seguido de tincion con azul brillante de Coomassie o inmunotransferencia. El analisis de tincion de SDS-PAGE/coomassie revelo una banda con una masa molecular reducida estimada de ~ 45 kDa (figura 27). La desglicosilacion de rMAP-1 con N-glicosidasa F dio lugar a un cambio en la masa molecular a ~ 40 kDa correspondiente a la masa teorica sin peptido senal. Este patron tambien se observo con inmunotransferencia utilizando anticuerpos espedficos contra mAP-1.

Niveles sericos de MAP-1

Desarrollamos un ELISA cuantitativo para determinar el nivel serico de MAP-1. El ensayo se baso en el mAb 20C4 espedfico de MAP-1 como anticuerpo de captura y un anticuerpo de deteccion (mAb 8B3) que reconoce la cadena pesada comun de MASP-1, -3 y MAP-1. Se observo un paralelismo perfecto entre el calibrador rMAP-1 purificado y el MAP-1 purificado enriquecido con suero cargado de MAP-1 a una concentracion conocida con curva estandar (figura 28A). Se analizo el nivel serico de MAP-1 en 100 donantes de sangre daneses y encontramos una media de 240 ng/ml con un rango de 115-466 ng/ml (figura 29A). Se midio el nivel serico de MASP-3 en el mismo grupo descrito anteriormente (Skjoedt y col., 2009) y representamos graficamente la concentracion de MAP-1 y MASP-3 (figura 29B). No se observo correlacion entre la concentracion serica de MAP-1 y MASP-3, aunque representan transcripciones alternativas del mismo gen.

Se evaluo la estabilidad del antfgeno y del ensayo en suero y durante los ciclos de congelacion y descongelacion (figura 29C). Se observo que la evaluacion de MAP-1 fue muy robusta independientemente de los ciclos de congelacion y descongelacion.

Asociacion entre MAP-1 y ficolina-2, -3 y MBL

Para medir las interacciones entre MAP-1 y MBL, ficolina-2 y -3, se desarrollaron tres ELISA diferentes utilizando mAb 20C4 como anticuerpo de captura y sondeo con mAb marcados con biotina: FCN-219 (espedfico de ficolina-2), FCN-334 (espedfico de ficolina-3) o Hyb 131-11 (espedfico de MBL). Se analizaron las mismas muestras de suero de 100 donantes que se usaron para las determinaciones de MAP-1 y evaluamos los niveles de asociacion de suero entre MAP-1 y ficolina-2, -3 y MBL como la D.O. relativa a 490-650 nm (figura 30A). Ademas se midio la concentracion serica de MBL, ficolina-2 y -3 como anteriormente (Skjoedt y col., 2009).

Se observo que MAP-1 existe en complejo con MBL, ficolina-2 y ficolina-3. Aparece, sin embargo, que la mayor parte de MAP-1 esta asociada a las ficolinas y especialmente a ficolina-3 (p <0,0001), un patron que tambien se ha observado anteriormente para MASP-3 (Skjoedt y col., 2009).

Se representaron las concentraciones sericas de MAP-1, MBL, ficolina-2 y -3 a los niveles de asociacion relativos y encontraron que la asociacion entre MAP-1 y MBL esta altamente correlacionada con el nivel de MBL ( r de Spearman: 0,92, p <0,0001) (figura 30B, lado superior derecho). En contraste con esto, la asociacion relativa de MAP-1 a ficolina-2 y -3 se correlaciona con el nivel serico de MAP-1 (r de Spearman: 0,45 y 0,61, respectivamente, p <0,0001, Figura 30B lado izquierdo). Aunque se observo una cierta correlacion entre la concentracion de MAP-1 y la asociacion relativa a MBL y la concentracion de ficolina-3 a, las tendencias fueron menos pronunciadas.

Fraccionamiento por gradiente de densidad

Con el fin de investigar la distribucion de MAP-1 en relacion con las moleculas asociadas y examinar cuanto parece no asociado, sometimos el suero humano normal a un fraccionamiento de densidad utilizando un gradiente de sacarosa del 10-30 % y una ultracentrifugacion. Posteriormente se analizaron las fracciones recogidas para MAP-1, MASP-3, MBL, ficolina-2 y -3 por ELISA (figura 31A) y MAP-1, MASP-1, -2 y -3, sMAP, MBL, ficolina-2 y -3 por transferencia western (figura 31B). Los resultados mostraron que el suero MAP-1 solo estaba presente en las fracciones con las ficolinas y MBL, lo que sugiere que MAP-1 no existe como una molecula no asociada. El mismo patron se observo para sMAP, MASP-1, -2 y -3. Adicionalmente los datos indican que la mayona de MAP-1, sMAP y MASP-1, -2 y -3 co-localizan en las fracciones pico de ficolina-3. Esta distribucion tambien se analizo mediante cromatograffa de exclusion por tamano en una columna sephadex-200. Se observo un patron de distribucion equivalente de las moleculas (datos no mostrados).

Finalmente, evaluamos la capacidad de las fracciones de gradiente de sacarosa para activar el C4 aplicado exogenamente. Se usaron manano de fase solida y BSA acetilada como ligandos para MBL y ficolina-3, respectivamente. Se observaron dos curvas de deposicion de C4 diferentes que reflejan los picos de los complejos de ficolina-3 y MBL separados por el gradiente de sacarosa (figura 31C).

Discusion

Para investigar los aspectos estructurales y establecer el nivel serico de la nueva protema asociada a MBL/Ficolina 1 (MAP-1), se expreso MAP-1 recombinante no marcada y se generaron anticuerpos espedficos contra la misma. El tratamiento con N-glicosidasa F y el analisis SDS-PAGE indicaron que MAP-1 esta glicosilada, lo que da como resultado una masa molecular de ~ 45 kDa con N-glicanos y ~ 40 kDa despues de la desglicosilacion equivalente a la masa molecular calculada a partir de la secuencia de aminoacidos deducida sin la peptido senal.

Se utilizo un anticuerpo monoclonal generado contra el extremo C-terminal espedfico de MAP-1 para establecer un ELISA de MAP-1 cuantitativo y para determinar el intervalo de concentracion en suero en 100 donantes de sangre daneses sanos. Se encontro una concentracion serica relativamente baja (media: 240 ng/ml, intervalo 115-466 ng/ml) en el grupo donante en comparacion con la concentracion de MASP-3 (media: 6500 ng/ml). Ademas, no hubo correlacion entre las concentraciones sericas de las dos protemas, lo que sugiere que, aunque las dos moleculas son variantes diferenciadas del mismo gen, la regulacion de la expresion es diferente. Recientemente, una diferencia significativa en la distribucion tisular de MASP-1, -3 y se describio MAP-1 (Degn y col., 2009; Skjoedt y col., 2010). El descubrimiento de una diferencia importante en la concentracion serica entre MASP-3 y MAP-1 apoya aun mas la nocion de un mecanismo regulador diferencial de las variantes de transcripcion derivadas del gen MASP1.

Se desarrollaron ensayos basados en ELISA para evaluar la asociacion relativa entre el suero MAP-1 y MBL, ficolina-2 y -3, respectivamente. Adicionalmente, se determino la concentracion serica de ficolina-2, -3 y MBL para relacionarlos con los niveles de asociacion relativos. Los resultados muestran que MAP-1 se asocia principalmente a ficolina-3 y ficolina-2 y que la asociacion relativa a MBL parece menos pronunciada. Se podna argumentar que esta distribucion refleja la diferencia en la concentracion serica media de MBL, ficolina-2 y ficolina-3. Sin embargo, aunque la asociacion de MBL-MAP-1 se correlaciona con la concentracion de MBL, la misma no es evidente para ficolina-2, donde la concentracion de suero de MAP-1 se correlaciona con el nivel de asociacion con ficolina-2. La asociacion relativa entre ficolina-3 y MAP-1 estuvo altamente correlacionada con la concentracion serica de MAP-1, mientras que una correlacion positiva con el nivel serico de ficolina-3 fue muy debil. Los hallazgos anteriores indican que la asociacion principal entre MAP-1 y ficolina-2 y -3 no se debe simplemente a la mayor concentracion general de ficolina-2 y -3. Este patron de distribucion se confirmo aun mas mediante el analisis del suero sometido a separacion de gradiente de densidad. Encontramos una clara tendencia a que no solo MAP-1, sino tambien sMAP, MASP-1, -2 y -3 colocalizadas con las fracciones pico de ficolina-3. Este es un fenomeno que hemos observado anteriormente para MASP-3 (Skjoedt y col., 2009). La separacion de las fracciones pico de ficolina-3 y MBL tambien se evaluo por la capacidad de activar el C4 agregado exogenamente en BSA acetilada (un ligando de ficolina-3) y manano (un ligando de MBL). La deposicion de C4 en las dos superficies de activacion diferentes ilustro claramente las diferentes fracciones pico que contienen complejos MBL o ficolina-3.

Los datos del analisis de densidad de gradiente de sacarosa tambien indicaron que la relacion de superficie a masa es mas alta para MBL que para ficolina-2 y ficolina-3, lo que respalda las observaciones de un estudio reciente que sugiere que MBL tiene una conformacion muy abierta y abierta en la estructura cuaternaria (Jensenius y col., 2009). Sin embargo, la menor relacion de superficie a masa de las ficolinas tambien podna reflejar la distribucion molecular con moleculas asociadas como mAp-1, sMAP y los MASP. En este sentido, estar mas asociado a MAP-1/sMAP/MASP dana como resultado una mayor masa y una mayor migracion a traves del gradiente de densidad. En conclusion, se demostro que MAP-1 estaba presente en concentraciones sericas bajas en comparacion con MASP-3 y que MAP-1 y circula en complejos predominantemente con las ficolinas pero tambien en cierta medida con MBL. Ademas, se pudo demostrar que ficolina-3 parece ser la principal molecula asociada a MAP-1 entre las moleculas de reconocimiento de LCP.

SEQ ID NO: 1. Las 380 secuencias de aminoacidos completas para FAP humana. (Se resaltan dos posibles sitios de glicosilacion identificados en la posicion de los aminoacidos 49 y 178).

MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKV 80

ETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEWLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY 160

IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFM VNLQFEDIFDIEDHPEV 240

PCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGW RLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYF 320

FKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKKNEIDLESELKSEQVTE SEQ ID NO: 2. Las secuencias de nucleotidos de ADNc completas para FAP humana.

atgaggtggctgcttctctattatgctctgtgcttctccctgtcaaaggcttcagcccacaccgtggagctaaacaata tgtttggccagatccagtcgcctggttatccagactcctatcccagtgattcagaggtgacttggaatatcactgtccc agatgggtttcggatcaagctttacttcatgcacttcaacttggaatcctcctacctttgtgaatatgactatgtgaag gtagaaactgaggaccaggtgctggcaaccttctgtggcagggagaccacagacacagagcagactcccggccaggagg tggtcctctcccctggctccttcatgtccatcactttccggtcagatttctccaatgaggagcgtttcacaggctttga tgcccactacatggctgtggatgtggacgagtgcaaggagagggaggacgaggagctgtcctgtgaccactactgccac aactacattggcggctactactgctcctgccgcttcggctacatcctccacacagacaacaggacctgccgagtggagt gcagtgacaacctcttcactcaaaggactggggtgatcaccagccctgacttcccaaacccttaccccaagagctctga atgcctgtataccatcgagctggaggagggtttcatggtcaacctgcagtttgaggacatatttgacattgaggaccat cctgaggtgccctgcccctatgactacatcaagatcaaagttggtccaaaagttttggggcctttctgtggagagaaag ccccagaacccatcagcacccagagccacagtgtcctgatcctgttccatagtgacaactcgggagagaaccggggctg gaggctctcatacagggctgcaggaaatgagtgcccagagctacagcctcctgtccatgggaaaatcgagccctcccaa gccaagtatttcttcaaagaccaagtgctcgtcagctgtgacacaggctacaaagtgctgaaggataatgtggagatgg acacattccagattgagtgtctgaaggatgggacgtggagtaacaagattcccacctgtaaaaaaaatgaaatcgatct ggagagcgaactcaagtcagagcaagtgacagagtga

SEQ NO: 3. Secuencia minima de un polipeptido asociado a ficolina que comprende los dominios CUB1-EGFCUB2 que incluye un peptido senal de los aminoacidos 1-19. La secuencia corresponde al exon 2 al exon 6. MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKV 80 ETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEWLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNY 160 IGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFM VNLQFEDIFDIEDHPEV 240 PCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGW RLSYRAA SEQ ID NO: 4. 17 aminoacidos terminales unicos de FAP KNEIDLESELKSEQVTE

SEQ ID NO: 5 Secuencia proteica de MASP-1 humana.

MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYL CEYDYVKVETEDQVLATFCGRETTDTEQTPGQEVVLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDEC KEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRFGYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTI ELEEGFMVNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKVLGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRG WRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNVEMDTFQIECLKDGTWSNKIP TCKIVDCRAPGELEHGLITFSTRNNLTTYKSEIKYSCQEPYYKMLNNNTGIYTCSAQGVWMNKVLGRSLPTC LPVCGLPKFSRKLMARIFNGRPAQKGTTPWIAMLSHLNGQPFCGGSLLGSSWIVTAAHCLHQSLDPEDPTLR DSDLLSPSDFKIILGKHWRLRSDENEQHLGVKHTTLHPQYDPNTFENDVALVELLESPVLNAFVMPICLPEGP QQEGAMVIVSGWGKQFLQRFPETLMEIEIPIVDHSTCQKAYAPLKKKVTRDMICAGEKEGGKDACAGDSGG PMVTLNRERGQWYLVGTVSWGDDCGKKDRYGVYSYIHHNKDWIQRVTGVRN

SEQ ID NO:6 Secuencia de ADNc de MASP-1 humana

GAAGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGAAGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGAAGACAGATTTTGT

TGTCAGGTTCCTGGGAGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAAAGCCAGAGGGAGA

GAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGGGGAAGGCGTGACCTGAATGGAGAATGCCAGCCAATTCCAG

AGACACACAGGGACCTCAGAACAAAGATAAGGCATCACGGACACCACACCGGGCACGAGCTCACAGGCAA

GTCAAGCTGGGAGGACCAAGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTGGCTGCTTCTC

TATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAAAGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAAACAATATGTTTGGCC

AGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGAATATCACTGTCCC

AGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGAATCCTCCTACCTTTGTGAATATGAC

TATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGC

AGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTC

CAATGAGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGGAGAGG

GAGGACGAGGAGCTGTCCTGTGACCACTACTGCCACAACTACATTGGCGGCTACTACTGCTCCTGCCGCT

TCGGCTACATCCTCCACACAGACAACAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAG

GACTGGGGTGATCACCAGCCCTGACTTCCCAAACCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATC

GAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGGACATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGG

TGCCCTGCCCCTATGACTACATCAAGATCAAAGTTGGTCCAAAAGTTTTGGGGCCTTTCTGTGGAGAGAA

AGCCCCAGAACCCATCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGACAACTCGGGAGAG

AACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAAATGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCCATG

GGAAAATCGAGCCCTCCCAAGCCAAGTATTTCTTCAAAGACCAAGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTA

CAAAGTGCTGAAGGATAATGTGGAGATGGACACATTCCAGATTGAGTGTCTGAAGGATGGGACGTGGAGT

AACAAGATTCCCACCTGTAAAATTGTAGACTGTAGAGCCCCAGGAGAGCTGGAACACGGGCTGATCACCT

TCTCTACAAGGAACAACCTCACCACATACAAGTCTGAGATCAAATACTCCTGTCAGGAGCCCTATTACAA

GATGCTCAACAATAACACAGGTATATATACCTGTTCTGCCCAAGGAGTCTGGATGAATAAAGTATTGGGG

AGAAGCCTACCCACCTGCCTTCCAGTGTGTGGGCTCCCCAAGTTCTCCCGGAAGCTGATGGCCAGGATCT

TCAATGGACGCCCAGCCCAGAAAGGCACCACTCCCTGGATTGCCATGCTGTCACACCTGAATGGGCAGCC

CTTCTGCGGAGGCTCCCTTCTAGGCTCCAGCTGGATCGTGACCGCCGCACACTGCCTCCACCAGTCACTC

GATCCGGAAGATCCGACCCTACGTGATTCAGACTTGCTCAGCCCTTCTGACTTCAAAATCATCCTGGGCA

AGCATTGGAGGCTCCGGTCAGATGAAAATGAACAGCATCTCGGCGTCAAACACACCACTCTCCACCCCCA

GTATGATCCCAACACATTCGAGAATGACGTGGCTCTGGTGGAGCTGTTGGAGAGCCCAGTGCTGAATGCC

TTCGTGATGCCCATCTGTCTGCCTGAGGGACCCCAGCAGGAAGGAGCCATGGTCATCGTCAGCGGCTGGG

GGAAGCAGTTCTTGCAAAGGTTCCCAGAGACCCTGATGGAGATTGAAATCCCGATTGTTGACCACAGCAC

CTGCCAGAAGGCTTATGCCCCGCTGAAGAAGAAAGTGACCAGGGACATGATCTGTGCTGGGGAGAAGGAA

GGGGGAAAGGACGCCTGTGCGGGTGACTCTGGAGGCCCCATGGTGACCCTGAATAGAGAAAGAGGCCAGT

GGTACCTGGTGGGCACTGTGTCCTGGGGTGATGACTGTGGGAAGAAGGACCGCTACGGAGTATACTCTTA

CATCCACCACAACAAGGACTGGATCCAGAGGGTCACCGGAGTGAGGAACTGAATTTGGCTCCTCAGCCCC

AGCACCACCAGCTGTGGGCAGTCAGTAGCAGAGGACGATCCTCCGATGAAAGCAGCCATTTCTCCTTTCC

TTCCTCCCATCCCCCCTCCTTCGGCCTATCCATTACTGGGCAATAGAGCAGGTATCTTCACCCCCTTTTC

ACTCTCTTTAAAGAGATGGAGCAAGAGAGTGGTCAGAACACAGGCCGAATCCAGGCTCTATCACTTACTA GTTTGCAGTGCTGGGCAGGTGACTTCATCTCTTCGAACTTCAGTTTCTTCATAAGATGGAAATGCTATAC CTTACCTACCTCGTAAAAGTCTGATGAGGAAAAGATTAACTAATAGATGCATAGCACTTAACAGAGTGCA TAGCATACACTGTTTTCAATAAATGCACCTTAGCAGAAGGTCGATGTGTCTACCAGGCAGACGAAGCTCT CTTACAAACCCCTGCCTGGGTCTTAGCATTGATCAGTGACACACCTCTCCCCTCAACCTTGACCATCTCC ATCTGCCCTTAAATGCTGTATGCTTTTTTGCCACCGTGCAACTTGCCCAACATCAATCTTCACCCTCATC CCTAAAAAAGTAAAACAGACAAGGTTCTGAGTCCTGTGGTATGTCCCCTAGCAAATGTAACTAGGAACAT GCACTAGATGACAGATTGCGGGAGGGCCTGAGAGAAGCAGGGACAGGAGGGAGCCTGGGGATTGTGGTTT GGGAAGGCAGACACCTGGTTCTAGAACTAGCTCTGCCCTTAGCCCCCTGTATGACCCTATGCAAGTCCTC CTCCCTCATCTCAAAGGGTCCTCAAAGCTCTGACGATCTAAGATACAATGAAGCCATTTTCCCCCTGATA AGAT GAGGTAAAGC CAAT GTAACCAAAAGGCAAAAATTACAAT CGGT TCAAAGGAAC TT TGAT GCAGACA AAATGCTGCTGCTGCTGCTCCTGAAATACCCACCCCTTTCCACTACGGGTGGGTTCCCAAGGACATGGGA CAGGCAAAGTGTGAGCCAAAGGATCCTTCCTTATTCCTAAGCAGAGCATCTGCTCTGGGCCCTGGCCTCC TTCCCTTCTTGGGAAACTGGGCTGCATGAGGTGGGCCCTGGTAGTTTGTACCCCAGGCCCCTATACTCTT CCTTCCTATGTCCACAGCTGACCCCAAGCAGCCGTTCCCCGACTCCTCACCCCTGAGCCTCACCCTGAAC TCCCTCATCTTGCAAGGCCATAAGTGTTTTCCAAGCAAAATGCCTCTCCCATCCTCTCTCAGGAAGCTTC TAGAGACTTTATGCCCTCCAGAGCTCCAAGATATAAGCCCTCCAAGGGATCAGAAGCTCCAAGTTCCTGT CTTCTGTTTTATAGAAATTGATCTTCCCTGGGGGACTTTAACTCTTGACCTGTATGCAGCTGTTGGAGTA ATTCCAGGTCTCTTGAAAAAAAAGAGGAAGATAATGGAGAATGAGAACATATATATATATATATTAAGCC CCAGGCTGAATACTCAGGGACAGCAATTCACAGCCTGCCTCTGGTTCTATAAACAAGTCATTCTACCTCT TTGTGCCCTGCTGTTTATTCTGTAAGGGGAAGGTGGCAATGGGACCCAGCTCCATCAGACACTTGTCAAG CTAGCAGAAACTCCATTTTCAATGCCAAAGAAGAACTGTAATGCTGTTTTGGAATCATCCCAAGGCATCC CAAGACACCATATCTTCCCATTTCAAGCACTGCCTGGGCACACCCCAACATCCCAGGCTGTGGTGGCTCC T GT G GGAACTAC C TAGAT GAAGAGAG TAT CAT T TATAC C T T C TAG GAGC T C C TAT T GGGAGACAT GAAAC ATATGTAATTGACTACCATGTAATAGAACAAACCCTGCCAAGTGCTGCTTTGGAAAGTCATGGAGGTAAA AGAAAGACCATTC

SEQ ID NO:7 Secuencia proteica de MASP-3 humana.

MRWLLLYYALCFSLSKASAHTVELNNMFGQIQSPGYPDSYPSDSEVTWNITVPDGFRIKLYFMHFNLESSYLCEYDYVKVETEDQ VLATFCGRETTDTEQTPGQEWLSPGSFMSITFRSDFSNEERFTGFDAHYMAVDVDECKEREDEELSCDHYCHNYIGGYYCSCRF GYILHTDNRTCRVECSDNLFTQRTGVITSPDFPNPYPKSSECLYTIELEEGFM VNLQFEDIFDIEDHPEVPCPYDYIKIKVGPKV LGPFCGEKAPEPISTQSHSVLILFHSDNSGENRGWRLSYRAAGNECPELQPPVHGKIEPSQAKYFFKDQVLVSCDTGYKVLKDNV EMDTFQIECLKDGTWSNKIPTCKIVDCRAPGELEHGLITFSTRNNLTTYKSEIKYSCQEPYYKMLNNNTGIYTCSAQGVWMNKVL GRSLPTCLPECGQPSRSLPSLVKRIIGGRNAEPGLFPWQALIVVEDTSRVPNDKWFGSGALLSASWILTAAHVLRSQRRDTTVIP VSKEHVTVYLGLHDVRDKSGAVNSSAARVVLHPDFNIQNYNHDIALVQLQEPVPLGPHVMPVCLPRLEPEGPAPHMLGLVAGWGI SNPNVTVDEIISSGTRTLSDVLQYVKLPVVPHAECKTSYESRSGNYSVTENMFCAGYYEGGKDTCLGDSGGAFVIFDDLSQRWW QGLVSWGGPEECGSKQVYGVYTKVSNYVDWVWEQMGLPQSVVEPQVER

SEQ ID NO:8 Secuencia de ADNc de MASP-3 humana

GAAGTCAGCCACACAGGATAAAGGAGGGAAGGGAAGGAGCAGATCTTTTCGGTAGGAAGACAGATTTTGT

TGTCAGGTTCCTGGGAGTGCAAGAGCAAGTCAAAGGAGAGAGAGAGGAGAGAGGAAAAGCCAGAGGGAGA

GAGGGGGAGAGGGGATCTGTTGCAGGCAGGGGAAGGCGTGACCTGAATGGAGAATGCCAGCCAATTCCAG

AGACACACAGGGACCTCAGAACAAAGATAAGGCATCACGGACACCACACCGGGCACGAGCTCACAGGCAA

GTCAAGCTGGGAGGACCAAGGCCGGGCAGCCGGGAGCACCCAAGGCAGGAAAATGAGGTGGCTGCTTCTC

TATTATGCTCTGTGCTTCTCCCTGTCAAAGGCTTCAGCCCACACCGTGGAGCTAAACAATATGTTTGGCC

AGATCCAGTCGCCTGGTTATCCAGACTCCTATCCCAGTGATTCAGAGGTGACTTGGAATATCACTGTCCC

AGATGGGTTTCGGATCAAGCTTTACTTCATGCACTTCAACTTGGAATCCTCCTACCTTTGTGAATATGAC

TATGTGAAGGTAGAAACTGAGGACCAGGTGCTGGCAACCTTCTGTGGCAGGGAGACCACAGACACAGAGC

AGACTCCCGGCCAGGAGGTGGTCCTCTCCCCTGGCTCCTTCATGTCCATCACTTTCCGGTCAGATTTCTC

CAATGAGGAGCGTTTCACAGGCTTTGATGCCCACTACATGGCTGTGGATGTGGACGAGTGCAAGGAGAGG

GAGGACGAGGAGCTGTCCTGTGACCACTACTGCCACAACTACATTGGCGGCTACTACTGCTCCTGCCGCT

TCGGCTACATCCTCCACACAGACAACAGGACCTGCCGAGTGGAGTGCAGTGACAACCTCTTCACTCAAAG

GACTGGGGTGATCACCAGCCCTGACTTCCCAAACCCTTACCCCAAGAGCTCTGAATGCCTGTATACCATC

GAGCTGGAGGAGGGTTTCATGGTCAACCTGCAGTTTGAGGACATATTTGACATTGAGGACCATCCTGAGG

TGCCCTGCCCCTATGACTACATCAAGATCAAAGTTGGTCCAAAAGTTTTGGGGCCTTTCTGTGGAGAGAA

AGCCCCAGAACCCATCAGCACCCAGAGCCACAGTGTCCTGATCCTGTTCCATAGTGACAACTCGGGAGAG

AACCGGGGCTGGAGGCTCTCATACAGGGCTGCAGGAAATGAGTGCCCAGAGCTACAGCCTCCTGTCCATG

GGAAAATCGAGCCCTCCCAAGCCAAGTATTTCTTCAAAGACCAAGTGCTCGTCAGCTGTGACACAGGCTA

CAAAGTGCTGAAGGATAATGTGGAGATGGACACATTCCAGATTGAGTGTCTGAAGGATGGGACGTGGAGT

AACAAGATTCCCACCTGTAAAATTGTAGACTGTAGAGCCCCAGGAGAGCTGGAACACGGGCTGATCACCT

TCTCTACAAGGAACAACCTCACCACATACAAGTCTGAGATCAAATACTCCTGTCAGGAGCCCTATTACAA

GATGCTCAACAATAACACAGGTATATATACCTGTTCTGCCCAAGGAGTCTGGATGAATAAAGTATTGGGG

AGAAGCCTACCCACCTGCCTTCCAGAGTGTGGTCAGCCCTCCCGCTCCCTGCCAAGCCTGGTCAAGAGGA

TCATTGGGGGCCGAAATGCTGAGCCTGGCCTCTTCCCGTGGCAGGCCCTGATAGTGGTGGAGGACACTTC

GAGAGTGCCAAATGACAAGTGGTTTGGGAGTGGGGCCCTGCTCTCTGCGTCCTGGATCCTCACAGCAGCT

CATGTGCTGCGCTCCCAGCGTAGAGACACCACGGTGATACCAGTCTCCAAGGAGCATGTCACCGTCTACC

TGGGCTTGCATGATGTGCGAGACAAATCGGGGGCAGTCAACAGCTCAGCTGCCCGAGTGGTGCTCCACCC

AGACTTCAACATCCAAAACTACAACCACGATATAGCTCTGGTGCAGCTGCAGGAGCCTGTGCCCCTGGGA

CCCCACGTTATGCCTGTCTGCCTGCCAAGGCTTGAGCCTGAAGGCCCGGCCCCCCACATGCTGGGCCTGG

TGGCCGGCTGGGGCATCTCCAATCCCAATGTGACAGTGGATGAGATCATCAGCAGTGGCACACGGACCTT

GTCAGATGTCCTGCAGTATGTCAAGTTACCCGTGGTGCCTCACGCTGAGTGCAAAACTAGCTATGAGTCC

CGCTCGGGCAATTACAGCGTCACGGAGAACATGTTCTGTGCTGGCTACTACGAGGGCGGCAAAGACACGT

GCCTTGGAGATAGCGGTGGGGCCTTTGTCATCTTTGATGACTTGAGCCAGCGCTGGGTGGTGCAAGGCCT

GGTGTCCTGGGGGGGACCTGAAGAATGCGGCAGCAAGCAGGTCTATGGAGTCTACACAAAGGTCTCCAAT

TACGTGGACTGGGTGTGGGAGCAGATGGGCTTACCACAAAGTGTTGTGGAGCCCCAGGTGGAACGGTGAG

CTGACTTACTTCCTCGGGGCCTGCCTCCCCTGAGCGAAGCTACACCGCACTTCCGACAGCACACTCCACA

TTACTTATCAGACCATATGGAATGGAACACACTGACCTAGCGGTGGCTTCTCCTACCGAGACAGCCCCCA

GGACCCTGAGAGGCAGAGTGTGGTATAGGGAAAAGGCTCCAGGCAGGAGACCTGTGTTCCTGAGCTTGTC

CAAGTCTCTTTCCCTGTCTGGGCCTCACTCTACCGAGTAATACAATGCAGGAGCTCAACCAAGGCCTCTG

TGCCAATCCCAGCACTCCTTTCCAGGCCATGCTTCTTACCCCAGTGGCCTTTATTCACTCCTGACCACTT

ATCAAACCCATCGGTCCTACTGTTGGTATAACTGAGCTTGGACCTGACTATTAGAAAATGGTTTCTAACA

TTGAACTGAATGCCGCATCTGTATATTTTCCTGCTCTGCCTTCTGGGACTAGCCTTGGCCTAATCCTTCC

TCTAGGAGAAGAGCATTCAGGTTTTGGGAGATGGCTCATAGCCAAGCCCCTCTCTCTTAGTGTGATCCCT

TGGAGCACCTTCATGCCTGGGGTTTCTCTCCCAAAAGCTTCTTGCAGTCTAAGCCTTATCCCTTATGTTC

CCCATTAAAGGAATTTCAAAAGACATGGAGAAAGTTGGGAAGGTTTGTGCTGACTGCTGGGAGCAGAATA

GCCGTGGGAGGCCCACCAAGCCCTTAAATTCCCATTGTCAACTCAGAACACATTTGGGCCCATATGCCAC

CCTGGAACACCAGCTGACACCATGGGCGTCCACACCTGCTGCTCCAGACAAGCACAAAGCAATCTTTCAG

CCTTGAAATGTATTATCTGAAAGGCTACCTGAAGCCCAGGCCCGAATATGGGGACTTAGTCGATTACCTG

GAAAAAGAAAAGACCCACACTGTGTCCTGCTGTGCTTTTGGGCAGGAAAATGGAAGAAAGAGTGGGGTGG

GCACATTAGAAGTCACCCAAATCCTGCCAGGCTGCCTGGCATCCCTGGGGCATGAGCTGGGCGGAGAATC

CACCCCGCAGGATGTTCAGAGGGACCCACTCCTTCATTTTTCAGAGTCAAAGGAATCAGAGGCTCACCCA

TGGCAGGCAGTGAAAAGAGCCAGGAGTCCTGGGTTCTAGTCCCTGCTCTGCCCCCAACTGGCTGTATAAC

CTTTGAAAAATCATTTTCTTTGTCTGAGTCTCTGGTTCTCCGTCAGCAACAGGCTGGCATAAGGTCCCCT

GCAGGTTCCTTCTAGCTGGAGCACTCAGAGCTTCCCTGACTGCTAGCAGCCTCTCTGGCCCTCACAGGGC

TGATTGTTCTCCTTCTCCCTGGAGCTCTCTCTCCTGAAAATCTCCATCAGAGCAAGGCAGCCAGAGAAGC

CCCTGAGAGGGAATGATTGGGAAGTGTCCACTTTCTCAACCGGCTCATCAAACACACTCCTTTGTCTATG

AATGGCACATGTAAATGATGTTATATTTTGTATCTTTTATATCATATGCTTCACCATTCTGTAAAGGGCC

TCTGCATTGTTGCTCCCATCAGGGGTCTCAAGTGGAAATAAACCCTCGTGGATAACCAAAAAAAAAAAAA

AAAAAAA

SEQ ID NO:9 Secuencia proteica de MASP-2 humana

MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSHLCE YDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDECQVAP GEAPTCDHHCHNHLGGFYCSCRAGYVLHRNKRTCSALCSGQVFTQRSGELSSPEYPRPYPKLSSCTYSISLE EGFSVILDFVESFDVETHPETLCPYDFLKIQTDREEHGPFCGKTLPHRIETKSNTVTITFVTDESGDHTGWKI HYTSTAQPCPYPMAPPNGHVSPVQAKYILKDSFSIFCETGYELLQGHLPLKSFTAVCQKDGSWDRPMPACSI VDCGPPDDLPSGRVEYITGPGVTTYKAVIQYSCEETFYTMKVNDGKYVCEADGFWTSSKGEKSLPVCEPVC

GLSARTTGGRIYGGQKAKPGDFPWQVLILGGTTAAGALLYDNWVLTAAHAVYEQKHDASALDIRMGTLKRL SPHYTQAWSEAVFIHEGYTHDAGFDNDIALIKLNNKVVINSNITPICLPRKEAESFMRTDDIGTASGWGLTQ RGFLARNLMYVDIPIVDHQKCTAAYEKPPYPRGSVTANMLCAGLESGGKDSCRGDSGGALVFLDSETERWF VGGIVSWGSMNCGEAGQYGVYTKVINYIPWIENIISDF

SEQ ID NO:10 Secuencia de ADNc de MASP-2 humana

GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCC

CCTTGGGCCCGAAGTGGCCTGAACCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGC

CAATGACCAGGAGCGGCGCTGGACCCTGACTGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCAC

TTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAGTACGACTTCGTCAAGCTGAGCTCGGGGGCCAAGGTGCTGG

CCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGCCCCTGGCAAGGACACTTTCTACTCGCTGGG

CTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCGAGGCCTTC

TATGCAGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTGCC

ACAACCACCTGGGCGGTTTCTACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTAACAAGCGCACCTG

CTCAGCCCTGTGCTCCGGCCAGGTCTTCACCCAGAGGTCTGGGGAGCTCAGCAGCCCTGAATACCCACGG

CCGTATCCCAAACTCTCCAGTTGCACTTACAGCATCAGCCTGGAGGAGGGGTTCAGTGTCATTCTGGACT

TTGTGGAGTCCTTCGATGTGGAGACACACCCTGAAACCCTGTGTCCCTACGACTTTCTCAAGATTCAAAC

AGACAGAGAAGAACATGGCCCATTCTGTGGGAAGACATTGCCCCACAGGATTGAAACAAAAAGCAACACG

GTGACCATCACCTTTGTCACAGATGAATCAGGAGACCACACAGGCTGGAAGATCCACTACACGAGCACAG

CGCAGCCTTGCCCTTATCCGATGGCGCCACCTAATGGCCACGTTTCACCTGTGCAAGCCAAATACATCCT

GAAAGACAGCTTCTCCATCTTTTGCGAGACTGGCTATGAGCTTCTGCAAGGTCACTTGCCCCTGAAATCC

TTTACTGCAGTTTGTCAGAAAGATGGATCTTGGGACCGGCCAATGCCCGCGTGCAGCATTGTTGACTGTG

GCCCTCCTGATGATCTACCCAGTGGCCGAGTGGAGTACATCACAGGTCCTGGAGTGACCACCTACAAAGC

TGTGATTCAGTACAGCTGTGAAGAGACCTTCTACACAATGAAAGTGAATGATGGTAAATATGTGTGTGAG

GCTGATGGATTCTGGACGAGCTCCAAAGGAGAAAAATCACTCCCAGTCTGTGAGCCTGTTTGTGGACTAT

CAGCCCGCACAACAGGAGGGCGTATATATGGAGGGCAAAAGGCAAAACCTGGTGATTTTCCTTGGCAAGT

CCTGATATTAGGTGGAACCACAGCAGCAGGTGCACTTTTATATGACAACTGGGTCCTAACAGCTGCTCAT

GCCGTCTATGAGCAAAAACATGATGCATCCGCCCTGGACATTCGAATGGGCACCCTGAAAAGACTATCAC

CTCATTATACACAAGCCTGGTCTGAAGCTGTTTTTATACATGAAGGTTATACTCATGATGCTGGCTTTGA

CAATGACATAGCACTGATTAAATTGAATAACAAAGTTGTAATCAATAGCAACATCACGCCTATTTGTCTG

CCAAGAAAAGAAGCTGAATCCTTTATGAGGACAGATGACATTGGAACTGCATCTGGATGGGGATTAACCC

AAAGGGGTTTTCTTGCTAGAAATCTAATGTATGTCGACATACCGATTGTTGACCATCAAAAATGTACTGC

TGCATATGAAAAGCCACCCTATCCAAGGGGAAGTGTAACTGCTAACATGCTTTGTGCTGGCTTAGAAAGT

GGGGGCAAGGACAGCTGCAGAGGTGACAGCGGAGGGGCACTGGTGTTTCTAGATAGTGAAACAGAGAGGT

GGTTTGTGGGAGGAATAGTGTCCTGGGGTTCCATGAATTGTGGGGAAGCAGGTCAGTATGGAGTCTACAC

AAAAGTTATTAACTATATTCCCTGGATCGAGAACATAATTAGTGATTTTTAACTTGCGTGTCTGCAGTCA

AGGATTCTTCATTTTTAGAAATGCCTGTGAAGACCTTGGCAGCGACGTGGCTCGAGAAGCATTCATCATT

ACTGTGGACATGGCAGTTGTTGCTCCACCCAAAAAAACAGACTCCAGGTGAGGCTGCTGTCATTTCTCCA

CTTGCCAGTTTAATTCCAGCCTTACCCATTGACTCAAGGGGACATAAACCACGAGAGTGACAGTCATCTT

TGCCCACCCAGTGTAATGTCACTGCTCAAATTACATTTCATTACCTTAAAAAGCCAGTCTCTTTTCATAC

TGGCTGTTGGCATTTCTG TAA A CTGCCTG TCCA TG CTCTTTG TTTTTA A ACTTG TTCTTA TTG A A A AA A A

AAAAAAAAAA

SEQ ID NO:11 Secuencia proteica de sMAP (MAp19) humana

MRLLTLLGLLCGSVATPLGPKWPEPVFGRLASPGFPGEYANDQERRWTLTAPPGYRLRLYFTHFDLELSHL

CEYDFVKLSSGAKVLATLCGQESTDTERAPGKDTFYSLGSSLDITFRSDYSNEKPFTGFEAFYAAEDIDEC

QVAPGEAPTCDHHCHNHLGGFYCSCRAGYVLHRNKRTCSEQSL

SEQ ID NO: 12 secuencia de ADNc de sMAP (MAp19) humana

GGCCAGCTGGACGGGCACACCATGAGGCTGCTGACCCTCCTGGGCCTTCTGTGTGGCTCGGTGGCCACCC

CCTTGGGCCCGAAGTGGCCTGAACCTGTGTTCGGGCGCCTGGCATCCCCCGGCTTTCCAGGGGAGTATGC

CAATGACCAGGAGCGGCGCTGGACCCTGACTGCACCCCCCGGCTACCGCCTGCGCCTCTACTTCACCCAC

TTCGACCTGGAGCTCTCCCACCTCTGCGAGTACGACTTCGTCAAGCTGAGCTCGGGGGCCAAGGTGCTGG

CCACGCTGTGCGGGCAGGAGAGCACAGACACGGAGCGGGCCCCTGGCAAGGACACTTTCTACTCGCTGGG

CTCCAGCCTGGACATTACCTTCCGCTCCGACTACTCCAACGAGAAGCCGTTCACGGGGTTCGAGGCCTTC

TATGCAGCCGAGGACATTGACGAGTGCCAGGTGGCCCCGGGAGAGGCGCCCACCTGCGACCACCACTGCC

ACAACCACCTGGGCGGTTTCTACTGCTCCTGCCGCGCAGGCTACGTCCTGCACCGTAACAAGCGCACCTG

CTCAGAGCAGAGCCTCTAGCCTCCCCTGGAGCTCCGGCCTGCCCAGCAGGTCAGAAGCCAGAGCCAGCCT

GCTGGCCTCAGCTCCGGGTTGGGCTGAGATGGCTGTGCCCCAACTCCCATTCACCCACCATGGACCCAAT

AATAAACCTGGCCCCACCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAA

Cebadores de ADN:

SEQ ID NO:13: 5 '-gcacccagagccacagtg-3'

SEQ ID NO:14: 5 '-gccttccagtgtgtgggc-3'

SEQ ID NO:15: 5-gccttccagagtgtggtca-3'

SEQ ID NO:16: 5'-cgatctggagagcgaactc-3' SEQ ID NO:17: 5'-ctgttcttcacactggctg-3' SEQ ID NO:18: 5'-ctgctgagatcatgttgttc-3' SEQ ID NO:19: 5-TTATACGACTCACTA-3'

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un polipeptido aislado asociado a ficolina que tiene en su extremo C-terminal la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 4, polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos 20-380 de la SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de la misma que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1.

2. El polipeptido aislado asociado a ficolina de acuerdo con la reivindicacion 1, que tiene al menos un 80 %, tal como un 90 %, tal como 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de SEQ ID NO: 1.

3. El polipeptido de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho polipeptido es capaz de asociarse con una cualquiera de lectina de union a manosa (MBL), ficolina-1, ficolina-2, ficolina-3, C1q, protemas surfactantes de pulmon SP-A y/o SP-D, y moleculas de defensa de tipo colageno intracelular, tal como CL-L1.

4. El polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho polipeptido es una protema recombinante.

5. Un polipeptido aislado asociado a ficolina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos 20-380 de la SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de la misma que tiene al menos un 70 % de identidad de secuencia con la secuencia de la SEQ ID NO: 1.

6. El polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho polipeptido carece de un peptido senal.

7. Un anticuerpo que se une espedficamente a un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Una molecula de acido nucleico aislada que codifica un polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

9. Un vector que comprende una molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicacion 8.

10. Una celula huesped que comprende un vector de acuerdo con la reivindicacion 9.

11. Un procedimiento de produccion del polipeptido, de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, comprendiendo el procedimiento cultivar una celula de acuerdo con la reivindicacion 10, en un medio de crecimiento apropiado en condiciones que permitan la expresion de la construccion de polinucleotido y recuperar el polipeptido resultante del medio de cultivo.

12. Una composicion que comprende el polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

13. Una composicion farmaceutica que comprende el polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

14. Un procedimiento de deteccion de un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, comprendiendo dicho procedimiento:

a) obtener una muestra biologica;

b) poner en contacto dicha muestra biologica con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 7; y c) detectar complejos de dicho anticuerpo y dicho polipeptido, si los hay;

como indicacion de la presencia del polipeptido en dicha muestra.

15. Un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso como un medicamento.