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ES2704069T3 - Vacuna basada en toxinas de Clostridium difficile - Google Patents

Vacuna basada en toxinas de Clostridium difficile Download PDF

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ES2704069T3
ES2704069T3 ES12826538T ES12826538T ES2704069T3 ES 2704069 T3 ES2704069 T3 ES 2704069T3 ES 12826538 T ES12826538 T ES 12826538T ES 12826538 T ES12826538 T ES 12826538T ES 2704069 T3 ES2704069 T3 ES 2704069T3
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Mariagrazia Pizza
Rosanna Leuzzi
Maria Arico
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GlaxoSmithKline Biologicals SA
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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende una combinación de antígenos de Clostridium difficile, comprendiendo dicha combinación a) un antígeno ToxB-GT que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60; y/o b) que es un fragmento de al menos 50 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60 o de un polipéptido que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60 y que comprende un epítopo de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60; en la que el antígeno ToxB-GT está detoxificado y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 17, 102, 139, 269, 270, 273, 284, 286, 288, 384, 449, 444, 445, 448, 449, 450, 451, 452, 455, 461, 463, 472, 515, 518 y 520, en relación con la secuencia del antígeno 10 ToxB-GT de tipo silvestre de SEQ ID NO: 18 y en la que las dos sustituciones de aminoácidos no se encuentran en posiciones correspondientes a los aminoácidos 102 y 278 de la SEQ ID NO: 18 o a las posiciones 102 y 288 de la SEQ ID NO: 18; y b) un antígeno ToxA-P5-6 que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 % o 15 más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 11.

Description

DESCRIPCIÓN
Vacuna basada en toxinas de Clostridium difficile
Campo técnico
La presente invención pertenece al campo de las vacunas basadas en toxinas contra Clostridium difficile.
Antecedentes de la técnica
C. difficile es una bacteria anaeróbica gramnegativa formadora de esporas que puede residir de manera asintomática en el tracto intestinal de los seres humanos. La eliminación de otra flora intestinal, por ejemplo, mediante tratamiento antibiótico y quimioterapéutico, crea un nicho ecológico que permite la germinación de las esporas de C. difficile en el colon, lo que provoca una grave enfermedad intestinal [1]. Por lo tanto, el tratamiento con antibióticos puede transformar este microorganismo normalmente inofensivo en el agente causante de un espectro de enfermedades intestinales, un resultado que es particularmente prevalente en pacientes hospitalizados.
C. difficile es el patógeno predominante de las infecciones intestinales nosocomiales [2,3] y provoca aproximadamente un 20 % de los casos de diarrea asociada con antibióticos, hasta un 75 % de los casos de colitis asociada con antibióticos y prácticamente la totalidad de los casos de colitis pseudomembranosa [4]. Los factores del hospedador, tales como la edad avanzada, enfermedades graves preexistentes y defensas inmunitarias debilitadas predisponen a los individuos a una infección sintomática [1]. Dicha enfermedad asociada con C. difficile (EACD) se produce normalmente en unidades de cuidados intensivos, afectando en particular a pacientes de más de 60 años.
El tratamiento de la EACD implica normalmente la interrupción del tratamiento con el antibiótico lesivo, el comienzo del tratamiento con metronidazol o vancomicina oral y rehidratación. Sin embargo, la aparición de enteropatógenos resistentes a los antibióticos ha generado preocupación acerca del uso de antibióticos para tratar la EACD. Además, hasta un 20 % de los pacientes sufre una recaída 1-2 semanas después de completar un ciclo de antibióticos y el riesgo de recaída aumenta notablemente con cada recaída adicional [5,6]. También se ha informado de que más de un 50 % de los casos de recaída se deben a una reinfección con una cepa distinta de C. difficile, en lugar de una recidiva de la infección primaria [7]. Las medidas preventivas se basan en el aislamiento del paciente, la implementación de medidas de higiene de manos y precauciones de contacto, que han tenido un efecto variable y frecuentemente limitado.
En la actualidad, no hay una vacuna eficaz contra la EACD. Un objeto de la invención es proporcionar composiciones que sean eficaces para generar respuestas inmunitarias contra C. difficile para su uso en el desarrollo de vacunas para prevenir y/o tratar enfermedades asociadas con C. difficile.
Divulgación de la invención
Por lo tanto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende una combinación de antígenos de Clostridium difficile, comprendiendo dicha combinación
a) un antígeno ToxB-GT que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60; y/o b) que es un fragmento de al menos 50 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60 o de un polipéptido que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60 y que comprende un epítopo de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60; en la que el antígeno ToxB-GT está detoxificado y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 17, 102, 139, 269, 270, 273, 284, 286, 288, 384, 449, 444, 445, 448, 449, 450, 451, 452, 455, 461, 463, 472, 515, 518 y 520, en relación con la secuencia del antígeno ToxB-GT de tipo silvestre de SEQ ID NO: 18 y en la que las dos sustituciones de aminoácidos no se encuentran en posiciones correspondientes a los aminoácidos 102 y 278 de la SEQ ID NO: 18 o a las posiciones 102 y 288 de la SEQ ID NO: 18;
y
b) un antígeno ToxA-P5-6 que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 11.
Por lo tanto, la invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden una combinación de antígenos de Clostridium difficile, comprendiendo dicha combinación a) un antígeno ToxB-GT y un antígeno TcdA, como se define en las reivindicaciones adjuntas. Preferentemente, el antígeno ToxB-GT está detoxificado.
De acuerdo con la divulgación, el antígeno ToxB-GT es un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60; y/o b) que es un fragmento de al menos 50 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60 o de un polipéptido que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60 y que comprende un epítopo de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60, en la que el antígeno ToxB-GT está detoxificado y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 17, 102, 139, 269, 270, 273, 284, 286, 288, 384, 449, 444, 445, 448, 449, 450, 451, 452, 455, 461, 463, 472, 515, 518 y 520, en relación con la secuencia del antígeno ToxB-GT de tipo silvestre de SEQ ID NO: 18 y en la que las dos sustituciones de aminoácidos no se encuentran en posiciones correspondientes a los aminoácidos 102 y 278 de la SEQ ID NO: 18 o a las posiciones 102 y 288 de la s Eq ID NO: 18.
La divulgación también describe un antígeno ToxA-GT que es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 56; y/o b) que es un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 56 o un polipéptido que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 56 y que comprende un epítopo de la SEQ ID NO: 4 o la SEQ ID NO: 56; el antígeno TcdA es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 1; y/o b) que es un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1 o de un polipéptido que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 1 y que comprende un epítopo de la SEQ ID NO: 1; y el antígeno TcdB es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 2; y/o b) que es un fragmento de al menos 7 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2 o de un polipéptido que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 2 y que comprende un epítopo de la SeQ iD NO: 2.
La composición inmunogénica puede comprender un antígeno ToxB-GT y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más antígenos TcdA, seleccionados opcionalmente entre (1) un antígeno ToxA-ED (SEQ ID NO: 3), (2) un antígeno ToxA-GT (SEQ ID NO: 4), (3) un antígeno ToxA-CP (SEQ ID NO: 5), (4) un antígeno ToxA-T (SeQ iD NO: 6) , (5) un antígeno ToxA-T4 (SEQ iD NO: 7), (6) un antígeno ToxA-B (SEQ ID NO: 8), (7) un antígeno ToxA-PTA2 (SEQ ID NO: 9), (8) un antígeno ToxA-P5-7 (SEQ ID NO: 10), (9) un antígeno ToxA-P5-6 (SEQ ID NO: 11), (10) un antígeno ToxA-P9-10 (SEQ ID NO: 12), (11) un antígeno ToxA-B2 (SEQ ID NO: 13), (12) un antígeno ToxA-B3 (SEQ ID NO: 14), (13) un antígeno ToxA-B5 (SeQ ID NO: 15), (14) un antígeno ToxA-B6 (SEQ ID NO: 16) o un antígeno TcdA de longitud completa (SEQ ID NO: 1). La composición inmunogénica comprende además opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más antígenos TcdB adicionales, seleccionados opcionalmente entre (1) un antígeno ToxB-ED (SEQ ID NO: 17), (2) un antígeno ToxB-GT (SEQ ID NO: 18), (3) un antígeno ToxB-CP (SEQ ID NO: 19) (4) un antígeno ToxB-T (SEQ ID NO: 20), (5) un antígeno ToxB-B (SEQ iD NO: 21), (6) un antígeno ToxB-B2 (SEQ ID NO: 22) (7) ToxB-B7 (SEQ ID NO: 23) u (8) un antígeno TcdB de longitud completa (SEQ ID NO: 2).
La composición inmunogénica puede comprender un antígeno ToxA-GT y 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o más antígenos TcdB, seleccionados opcionalmente entre (1) un antígeno ToxB-ED (SEQ ID NO: 17), (2) un antígeno ToxB-GT (SEQ ID NO: 18), (3) un antígeno ToxB-CP (SEQ ID NO: 19) (4) un antígeno ToxB-T (SEQ ID NO: 20), (5) un antígeno ToxB-B (SEQ ID NO: 21), (6) un antígeno ToxB-B2 (SEQ ID NO: 22) (7) ToxB-B7 (SEQ ID NO: 23) u (8) un antígeno TcdB de longitud completa (SEQ ID NO: 2). La composición inmunogénica comprende además opcionalmente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más antígenos TcdA adicionales, seleccionados opcionalmente entre (1) un antígeno ToxA-ED (SEQ ID NO: 3), (2) un antígeno ToxA-GT (SEQ ID NO: 4), (3) un antígeno ToxA-CP (SeQ ID NO: 5), (4) un antígeno ToxA-T (SEQ iD NO: 6), (5) un antígeno ToxA-T4 (SEQ iD NO: 7) , (6) un antígeno ToxA-B (SEQ ID n O: 8), (7) un antígeno ToxA-PTA2 (SEQ iD NO: 9), (8) un antígeno ToxA-P5-7 (SEQ ID NO: 10), (9) un antígeno ToxA-P5-6 (SEQ ID NO: 11), (10) un antígeno ToxA-P9-10 (SEQ ID NO: 12), (11) un antígeno ToxA-B2 (SEQ ID NO: 13), (12) un antígeno ToxA-B3 (SeQ ID NO: 14), (13) un antígeno ToxA-B5 (SEQ ID NO: 15), (14) un antígeno ToxA-B6 (SEQ ID NO: 16) o un antígeno TcdA de longitud completa (SEQ ID NO: 1). La composición inmunogénica puede comprender i) un antígeno ToxB-GT; y ii) al menos un antígeno TcdA seleccionado entre ToxA-B, ToxA-PTA2, ToxA-P5-7, ToxA-P5-6, ToxA-P9-10, ToxA-B2, ToxA-B3, ToxA-B5 y/o ToxA-B6; y al menos un antígeno TcdB seleccionado entre ToxB-B, antígeno ToxB-B2 y/o ToxA-B7.
La composición inmunogénica puede comprender i) un antígeno ToxA-GT y un antígeno ToxB-GT; y ii) al menos un antígeno TcdA seleccionado entre ToxA-B, ToxA-PTA2, ToxA-P5-7, ToxA-P5-6, ToxA-P9-10, ToxA-B2, ToxA-B3, ToxA-B5 y/o ToxA-B6; y al menos un antígeno TcdB seleccionado entre ToxB-B, antígeno ToxB-B2 y/o ToxA-B7. La composición inmunogénica puede comprender un antígeno ToxB-GT, un antígeno TcdA y un antígeno TcdB adicional, opcionalmente en la que dicha composición comprende (a) ToxB-GT ToxA-B2 ToxB-B o (b) ToxB-GT ToxB-B ToxA-P5-6. En una realización, la composición comprende un antígeno ToxB-GT, un antígeno ToxA-GT, un antígeno TcdA adicional y un antígeno TcdB adicional, opcionalmente en la que dicha combinación comprende ToxB-GT ToxA-GT ToxA-B2 ToxB-B.
Al menos dos de los antígenos en la composición pueden encontrarse en forma de un polipéptido híbrido. En otra realización, ninguno de los antígenos se encuentra en forma de un polipéptido híbrido.
La composición inmunogénica puede inducir títulos de neutralización contra la toxina A y la toxina B de C. difficile. La composición inmunogénica puede comprender al menos un antígeno de C. difficile adicional, opcionalmente, en la que dicho antígeno adicional de C. difficile es un antígeno de sacárido.
En algunas realizaciones, la composición inmunogénica es una composición de vacuna. En algunas realizaciones, la composición de vacuna comprende además un adyuvante. En algunas realizaciones, la composición de vacuna se usa como producto farmacéutico. En algunas realizaciones, la composición de vacuna es para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un mamífero, preferentemente un ser humano. En algunas realizaciones, la composición de vacuna es para su uso en el tratamiento o la prevención de la enfermedad asociada con C. difficile.
Todas las cepas patógenas de C. difficile expresan una o dos exotoxinas grandes (TcdA y TcdB, también citadas en el presente documento como ToxA y ToxB y como Toxina A y toxina B). TcdA y TcdB pertenecen a la gran familia de citotoxinas clostridiales (LCD) y muestran un 49 % de identidad de aminoácidos. Estas son exotoxinas polipeptídicas monocatenarias de alto peso molecular (308 y 270 kDa, respectivamente) que se organizan en estructuras multidominio [8,9]. Los genes que codifican TcdA y TcdB, tcdA y tcdB, están ubicados en el locus de patogenicidad de 19,6 kb de C. difficile [10]. Al igual que otros miembros de la familia de LCD, TcdA y TcdB están organizados en forma de dominios modulares, llevando a cabo cada dominio una función distinta [11]. Las estructuras de dominios de TcdA y TcdB se ilustran en la figura 1.
En la referencia 11 se proporciona una descripción general del mecanismo de acción de TcdA/B. En resumen, el extremo C-terminal de TcdA/B (anotado como "B" en la figura 1) es responsable de la unión de la toxina a la superficie de células epiteliales. La región C-terminal de ambas toxinas está formada por repeticiones de restos conocidas como oligopéptidos repetitivos clostridiales o dominios de unión a la pared celular debido a su homología respecto de las repeticiones de LytA de Streptococcus pneumoniae y es responsable del reconocimiento de la superficie celular y la endocitosis [12]. Recientemente, se ha resuelto la estructura cristalina de un fragmento C-terminal de TcdA, revelando una estructura de tipo solenoide, que consiste en 32 repeticiones cortas con 15-21 restos y siete repeticiones largas con 30 restos (referencia 13). Las regiones de repetición C-terminal de TcdA y TcdB son similares y pueden identificarse de manera rutinaria.
La unión de TcdA/B a las células epiteliales induce endocitosis mediada por receptor, facilitando su entrada en el citoplasma. Una vez internalizadas, las toxinas necesitan un endosoma ácido para su transporte al citosol. Se cree que una reducción en el pH del endosoma induce un cambio conformacional que da como resultado la exposición del dominio de translocación hidrófobo (anotado como "T" en la figura 1) y la inserción del extremo N-terminal enzimático (que comprende un dominio de glucosiltransferasa y un dominio de cisteína proteasa, anotados como "GT" y "CP" en la figura 1, respectivamente), que permite la entrada en el endosoma mediante formación de poros [13]. Recientemente, las referencias 14 y 15 demostraron que el hexaquisfosfato de inositol de la célula hospedadora induce la escisión autocatalítica de la región N-terminal del sitio de cisteína proteasa ("CP"), liberando de este modo el dominio de glucosil transferasa ("GT") N-terminal en el citosol (se cree que el resto de la toxina permanece en el endosoma). Tras la escisión, se cree que el dominio GT es capaz de transferir restos de glucosa de UDP-glucosa a las Rho-GTPasas, inactivando de este modo la señalización celular [16]. La inhibición de las Rho-GTPasas provoca una serie de efectos en cascada, que incluyen la desregulación del citoesqueleto de actina y de la integridad de las uniones estrechas que, de manera colectiva, provocan un aumento de la permeabilidad de la membrana y una pérdida de la función de barrera [17], diarrea, inflamación y un flujo de entrada de neutrófilos y otros miembros de la respuesta inmunitaria innata [18].
Las exotoxinas TcdA y TcdB son, por tanto, las proteínas principalmente responsables de los síntomas clínicos causados por C. difficile [19, 20, 21] y los intentos de desarrollar vacunas para tratar y prevenir la EACD se han centrado en ellas. La referencia 19 descubrió que los anticuerpos contra TcdA recombinante son suficientes para prevenir la diarrea si se administran antes de la exposición. Las respuestas inmunitarias frente a TcdB también pueden desempeñar un papel en la expresión y/o inmunidad contra la enfermedad, según se desprende de numerosos casos de diarrea y colitis pseudomembranosa asociada con cepas de C. difficile TcdA negativas y TcdB positivas [22, 23, 24,25].
Estudios preclínicos que usan una mezcla de TcdA y TcdB inactivados con formaldehído han sugerido que tanto TcdA como TcdB pueden estar implicados en la patogénesis de la diarrea asociada con C. difficile y en la generación de inmunidad protectora [26]. TcdA y TcdB pueden además purificarse de cultivos, pero los procedimientos de inactivación representan una gran limitación en la preparación a base de toxoides. La inactivación de toxinas se logra normalmente mediante tratamiento con formaldehído, que reticula los aminoácidos en el polipéptido de la toxina. El problema de la inactivación con formaldehído es que las toxinas se someten potencialmente a una modificación química desconocida y/o a inactivación parcial. De hecho, se ha demostrado que las moléculas inactivadas con formalina tienen capacidades de unión deterioradas y una inmunogenicidad reducida [27]. También existe una serie de problemas de seguridad en lo relativo al uso en vacunas de toxoides procedentes de toxinas de C. difficile purificadas de cultivo celular.
Como se analiza en la referencia 28, se considera que TcdA es el principal responsable de los síntomas clínicos de la EACD. Los experimentos con toxoides purificados han indicado que TcdA solo es capaz de provocar los síntomas de la EACD, pero TcdB es incapaz de hacerlo a menos que se mezcle con TcdA o que haya un daño previo en la mucosa intestinal [29]. Las evidencias clínicas obtenidas de modelos animales indican que el dominio de unión de TcdA puede generar anticuerpos séricos que neutralizan los efectos citotóxicos y letales de TcdA (30, 31, 32, 33). Asimismo, se ha demostrado que un péptido no tóxico recombinante que contiene estas unidades repetitivas genera anticuerpos neutralizantes que pueden proteger a los animales de laboratorio frente a la exposición tanto a TcdA como a C. difficile (34, 35, 36, 33). De forma interesante, sin embargo, un estudio reciente demostró que la toxina B es esencial para la virulencia de C. difficile y que una cepa que solo produce TcdA era avirulenta (29, 37) por lo que el modelo de virulencia actual de C. difficile permanece sin determinar. Por lo tanto, no está claro en la actualidad qué componentes de TcdA y TcdB pueden usarse para inducir una respuesta inmunitaria para tratar o prevenir la EACD. Sin embargo, en la actualidad hay consenso acerca de que una inmunización eficaz contra la EACD probablemente requiera péptido que comprendan los dominios de unión de TcdA y TcdB (38, 39) y que los anticuerpos dirigidos contra los dominios de unión confieren protección frente a la patología por toxinas.
La referencia 40 desvela proteínas quiméricas que conservan todos los dominios funcionales presentes en las toxinas de tipo silvestre (es decir, los dominios GT, CP, T y B), pero en las que el dominio de unión de ToxA se han reemplazado por el dominio de ToxB y viceversa. En línea con el consenso actual, se ha sugerido que el dominio de unión es el dominio clave para la inmunogenicidad. Además, los autores indicaron que era esencial la naturaleza quimérica de sus construcciones de holotoxina que conservaban todos los dominios funcionales de las toxinas nativas.
Una serie de referencias distintas también desvelan composiciones inmunogénicas que comprenden ToxA y/o ToxB de C.difficile, tales como los documentos WO2010/017833, WO 98/59053, WO2008/152429 y US 6.290.960 (así como los documentos con derecho de prioridad, WO2012/046061 y WO2012/143902).
Sorprendentemente, sin embargo, los inventores han descubierto que la estructura nativa de la toxina no es necesaria para la inmunogenicidad y que los fragmentos que contienen el dominio GT de TcdA o TcdB son particularmente adecuados para generar una respuesta inmune, a condición de que se combinen con fragmento de TcdB cuando se usa el dominio GT de TcdA o con fragmento de TcdA cuando se usa el dominio GT de TcdA. Normalmente, los dominios GT empleados en dichas combinaciones están detoxificados. Dichas combinaciones generan la producción de títulos de neutralización contra TcdA y TcdB y son más eficaces a la hora de proporcionar una respuesta protectora contra la EACD en modelos animales que las combinaciones que comprenden fragmentos del dominio de unión. Por lo tanto, estas combinaciones proporcionan una vacuna mejorada contra la EACD. Además, el uso de fragmentos de polipéptido recombinante también evita los problemas de seguridad relacionados con el uso en vacunas de toxoides procedentes de toxinas de C. difficile purificadas de cultivos celulares.
Antígenos ToxB-GT
El antígeno TcdB de longitud completa (también citado en el presente documento como ToxB y Toxina B) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 (codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 31). En el presente documento, el antígeno TcdB detoxificado se denomina Toxoide B.
La abreviatura "ToxB-GT" se refiere al dominio de glucosil transferasa de TcdB, que está ubicado dentro de la región N-terminal del dominio enzimático (ED). El dominio ToxB-GT (SEQ ID NO: 18, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 47) es un fragmento de TcdB que corresponde a los aminoácidos 1-543 de la SEQ ID NO: 2.
El antígeno ToxB-GT incluido en las composiciones de la invención es un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad (por ejemplo, un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 18; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 18 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18, en el que "n" es 50 o más (por ejemplo, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 540 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 18. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 18 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 18. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-GT pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500 o hasta 540, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 18.
El antígeno ToxB-GT incluido en las composiciones de la invención puede estar detoxificado. La detoxificación puede lograrse mutando la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante del antígeno ToxB-GT de tipo silvestre usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido. Preferentemente, el antígeno ToxB-GT comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más mutaciones), en relación con la secuencia de tipo silvestre del antígeno ToxB-GT de SEQ ID NO: 18. Por ejemplo, el antígeno ToxB-GT comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más mutaciones), por ejemplo, en las posiciones de aminoácido 17, 102, 139, 269, 270, 273, 284, 286, 288, 384, 449, 444, 445, 448, 449, 450, 451,452, 455, 461, 463, 472, 515, 518 y/o 520, en relación con la secuencia de tipo silvestre del antígeno ToxB-GT de SEQ ID NO: 18. Por ejemplo, el antígeno ToxB-GT puede comprender sustituciones en 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones correspondientes a los aminoácidos 270, 273, 284, 286 y/o 288 de la secuencia del antígeno ToxB-GT de SEQ ID NO: 18. En particular, pueden sustituirse 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 270, 273, 284, 286 y/o 288 de la secuencia del antígeno ToxB-GT de SEQ ID NO: 18, preferentemente, por restos de alanina. En los casos en los que se sustituyan los aminoácidos 270, 273, 284, 286 y/o 288 de la SeQ ID NO: 18, la sustituciones son preferentemente D270A, R273A, Y284A, D286A y/o D288A, más preferentemente, D270A, R273A, Y284A, D286A y D288A. Estas sustituciones corresponden a las sustituciones D270A, R273A, Y284A, D286A y D288A de la s Eq ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de un antígeno ToxB-GT detoxificado que tiene sustituciones de alanina en estas posiciones se proporciona en la SEQ ID NO: 60.
En los casos en los que ToxB-GT comprende dos sustituciones de aminoácidos, las sustituciones preferentemente no son en las posiciones de aminoácidos 102 y 278 o las posiciones de aminoácidos 102 y 288, de la secuencia del antígeno ToxB-GT de SEQ ID NO: 18. El antígeno ToxB-GT detoxificado incluido en las composiciones de la invención puede ser, por lo tanto, un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad (por ejemplo, un 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 60; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 60 o de un polipéptido que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 60, en el que "n" es 50 o más (por ejemplo, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 540 o más). Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-GT detoxificado pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500 o hasta 540, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 60. Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 60. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 60 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 60.
La abreviatura "ToxB-ED" se refiere al dominio enzimático de TcdB. El dominio ToxB-ED (SEQ ID NO: 17, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 46) es un fragmento de TcdB que corresponde a los aminoácidos 1-767 de la SEQ ID NO: 2. Por lo tanto, el dominio ToxB-ED de TcdB comprende el dominio ToxB-GT. El antígeno ToxB-GT incluido en la composición de la invención puede ser, por lo tanto, un antígeno ToxB-ED.
El antígeno ToxB-ED incluido en las composiciones de la invención es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 17; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 17 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 17, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 17. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 17 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 17.
Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-ED pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 650, hasta 700 o hasta 750 restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 17.
El antígeno ToxB-ED incluido en las composiciones de la invención puede estar detoxificado. La detoxificación puede lograrse mutando la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante del antígeno ToxB-ED de tipo silvestre usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido. Preferentemente, el antígeno ToxB-ED comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más mutaciones), en relación con la secuencia de tipo silvestre del antígeno ToxB-ED de SEQ ID NO: 17. Por ejemplo, el antígeno ToxB-ED comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más mutaciones), por ejemplo, en las posiciones de aminoácido 17, 102, 139, 269, 270, 273, 284, 286, 288, 384, 449, 444, 445, 448, 449, 450, 451, 452, 455, 461, 463, 472, 515, 518 y/o 520, en relación con la secuencia de tipo silvestre del antígeno ToxB-ED de SEQ ID NO: 17. Por ejemplo, el antígeno ToxB-ED puede comprender sustituciones en 1, 2, 3, 4 o 5 posiciones correspondientes a los aminoácidos 270, 273, 284, 286 y/o 288 de la secuencia del antígeno ToxB-ED de SEQ ID NO: 17. En particular, pueden sustituirse 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 270, 273, 284, 286 y/o 288 de la secuencia del antígeno ToxB-ED de SEQ ID NO: 17, preferentemente, por restos de alanina. El antígeno ToxB-ED también puede comprender sustituciones en 1, 2 o 3 posiciones correspondientes a los aminoácidos 587, 653 y/o 698 de la secuencia del antígeno ToxB-ED de SEQ ID NO: 17. En particular, pueden sustituirse 1, 2 o 3 aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 587, 653 y/o 698 de la secuencia del antígeno ToxB-ED de SEQ ID NO: 17, preferentemente, por restos de alanina o asparagina. En los casos en los que se sustituyan los aminoácidos 587, 653 y/o 698 de la SeQ ID NO: 17, la sustituciones son preferentemente D587N, H653a y/o C698A, más preferentemente, D587N, H653A y C698A. Estas sustituciones corresponden a las sustituciones D587N, H653A y C698A de la SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de un antígeno ToxB-ED que tiene sustituciones en las posiciones 270, 273, 284, 286, 288, 587, 657 y 698 (en relación con la SEQ ID NO: 2) se proporciona en la SEQ ID NO: 58.
En los casos en los que ToxB-ED comprende dos sustituciones de aminoácidos, las sustituciones preferentemente no son en las posiciones de aminoácidos 102 y 278 o las posiciones de aminoácidos 102 y 288, de la secuencia del antígeno ToxB-ED de SEQ ID NO: 17.
El antígeno ToxB-ED detoxificado incluido en las composiciones de la invención puede ser, por lo tanto, un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 58; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 58 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 58, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550, 600, 650, 700, 750 o más). Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-ED detoxificado pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 650, hasta 700 o hasta 750 restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 58.
Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 58. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 58 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 58.
Los antígenos ToxB-GT y ToxB-ED incluidos en las composiciones de la invención también pueden incluir los dominios ToxB-CP y/o ToxB-T definidos más adelante, que están presentes en el antígeno TcdB de longitud completa. Los antígenos ToxB-GT y ToxB-ED pueden comprender, por ejemplo, n aminoácidos de la región N-terminal del dominio ToxB-T descrito más adelante, en la que n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1025, 1050, 1051, 1052, 1053, 1054, 1055, 1056, 1057, 1058, 1059, 1060, 1061, 1062, 1063, 1064 o 1065.
Los antígenos ToxB-GT y ToxB-ED incluidos en las composiciones de la invención no comprenden, preferentemente, el dominio de unión de TcdB. En particular, ToxB-GT y ToxB-ED no comprenden, preferentemente, el dominio ToxB-B descrito con más detalle más adelante o fragmentos de este dominio, por ejemplo, los dominios ToxB-B2 y/o ToxB-B7 descritos con más detalle más adelante.
Antígenos ToxA-GT
El antígeno TcdA de longitud completa (también citado en el presente documento como ToxA y Toxina A) comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 (codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 30). En el presente documento, el antígeno TcdA detoxificado se denomina Toxoide A.
La abreviatura "ToxA-GT" se refiere al dominio de glucosil transferasa de TcdA, que está ubicado dentro de la región N-terminal del dominio enzimático (ED). El dominio ToxA-GT (SEQ ID NO: 4, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 33) es un fragmento de TcdA que corresponde a los aminoácidos 1-541 de la SEQ ID NO: 1.
El antígeno ToxA-GT incluido en las composiciones de la invención es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 4; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 4 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 4, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 540 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 4. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 4 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 4.
Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-GT pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500 o hasta 540, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 4.
El antígeno ToxA-GT incluido en las composiciones de la invención puede estar detoxificado. La detoxificación puede lograrse mutando la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante del antígeno ToxA-GT de tipo silvestre usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido. Preferentemente, el antígeno ToxA-GT comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más mutaciones), en relación con la secuencia de tipo silvestre del antígeno ToxA-GT de SEQ ID NO: 4. Por ejemplo, El antígeno ToxA-GT puede comprender sustituciones en 1, 2 o 3 posiciones correspondientes a los aminoácidos 283, 285 y 287 de la secuencia del antígeno ToxA-GT de SEQ ID NO: 4. En particular, pueden sustituirse 1, 2 o 3 aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 283, 285 y 287 de la secuencia del antígeno ToxA-GT de SEQ ID NO: 4, preferentemente, por restos de alanina (es decir, Y283A, D285A, D287A). Estas mutaciones corresponden a las posiciones 283, 285 y 287 de la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de un antígeno ToxA-GT detoxificado que tiene sustituciones de alanina en estas posiciones se proporciona en la SEQ ID NO: 56.
En los casos en los que el antígeno ToxA-GT comprende una sustitución de aminoácidos, la sustitución no se encuentra, preferentemente, en la posición de aminoácido 278 de la secuencia de antígeno ToxA-GT de SEQ ID NO: 4. En los casos en los que el antígeno ToxA-GT comprende dos sustituciones de aminoácidos, las sustituciones preferentemente no son en las posiciones de aminoácidos 101 y 278, de la secuencia del antígeno ToxA-GT de SEQ ID NO: 4. En los casos en los que el antígeno ToxA-GT comprende tres sustituciones de aminoácidos, las sustituciones preferentemente no son en las posiciones de aminoácidos 101, 278 y 519 o las posiciones de aminoácidos 101,287 y 519, de la secuencia del antígeno ToxA-GT de SEQ ID NO: 4.
El antígeno ToxA-GT detoxificado incluido en las composiciones de la invención puede ser, por lo tanto, un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 56; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 56 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 56, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 540 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 56. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 56 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 56. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-GT detoxificado pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500 o hasta 540, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 56.
La abreviatura "ToxA-ED" se refiere al dominio enzimático de TcdA. El dominio ToxA-ED (SEQ ID NO: 3, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 32) es un fragmento de TcdA que corresponde a los aminoácidos 1-769 de la SEQ ID NO: 1. Por lo tanto, el dominio ToxA-ED de TcdA comprende el dominio ToxA-GT. El antígeno ToxA-GT incluido en la composición de la invención puede ser, por lo tanto, un antígeno ToxA-ED.
El antígeno ToxA-ED incluido en las composiciones de la invención es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 3; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 3 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 3, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 3. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 3 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 3.
Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-ED pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 650, hasta 700 o hasta 750, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 3.
El antígeno ToxA-ED incluido en las composiciones de la invención puede estar detoxificado. La detoxificación puede lograrse mutando la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante del antígeno ToxA-ED de tipo silvestre usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido. Preferentemente, el antígeno ToxA-ED comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más mutaciones), en relación con la secuencia de tipo silvestre del antígeno ToxA-ED de SEQ ID NO: 3. Por ejemplo, El antígeno ToxA-ED puede comprender sustituciones en 1, 2 o 3 posiciones correspondientes a los aminoácidos 283, 285 y 287 de la secuencia del antígeno ToxA-ED de SEQ ID NO: 3. En particular, pueden sustituirse 1, 2 o 3 aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 283, 285 y 287 de la secuencia del antígeno ToxA-ED de SEQ ID NO: 3, preferentemente, por restos de alanina. La secuencia de aminoácidos de un antígeno ToxA-ED detoxificado que tiene sustituciones de alanina en estas posiciones se proporciona en la SEQ ID NO: 54.
El antígeno ToxA-ED también puede comprender sustituciones en 1, 2 o 3 posiciones correspondientes a los aminoácidos 589, 655 y/o 700 de la secuencia del antígeno ToxA-ED de SEQ ID NO: 3. En particular, pueden sustituirse 1, 2 o 3 aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 589, 655 y/o 700 de la secuencia del antígeno ToxA-ED de SEQ ID NO: 3, preferentemente, por restos de alanina o asparagina. En los casos en los que se sustituyan los aminoácidos 589, 655 y/o 700, la sustituciones son preferentemente D589N, H655A y/o C700A, más preferentemente, D589N, H655A y C700A.
En los casos en los que el antígeno ToxA-ED comprende una sustitución de aminoácidos, la sustitución no se encuentra, preferentemente, en la posición de aminoácido 278 de la secuencia de antígeno ToxA-ED de SEQ ID NO: 3. En los casos en los que el antígeno ToxA-ED comprende dos sustituciones de aminoácidos, las sustituciones preferentemente no son en las posiciones de aminoácidos 101 y 278, de la secuencia del antígeno ToxA-ED de SEQ ID NO: 3. En los casos en los que el antígeno ToxA-ED comprende tres sustituciones de aminoácidos, las sustituciones preferentemente no son en las posiciones de aminoácidos 101, 278 y 519 o las posiciones de aminoácidos 101,287 y 519, de la secuencia del antígeno ToxA-ED de SEQ ID NO: 3.
El antígeno ToxA-ED detoxificado incluido en las composiciones de la invención puede ser, por lo tanto, un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 54; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 54 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 54, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 54. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 54 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 54. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-ED detoxificado pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 650, hasta 700 o hasta 750, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 54. Los antígenos ToxA-GT y ToxA-ED incluidos en las composiciones de la invención también pueden incluir los dominios ToxA-CP y/o ToxA-T definidos más adelante, que están presentes en el antígeno TcdA de longitud completa. Los antígenos ToxA-GT y ToxA-ED pueden comprender, por ejemplo, n aminoácidos de la región N-terminal del dominio ToxA-T descrito más adelante, en la que n = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1025, 1050, 1051, 1052, 1053, 1054, 1055, 1056, 1057, 1058, 1059, 1060, 1061, 1062, 1063, 1064 o 1065.
Los antígenos ToxA-GT y ToxA-ED incluidos en las composiciones de la invención no comprenden, preferentemente, el dominio de unión de TcdA. En particular, ToxA-GT y ToxA-ED no comprenden, preferentemente, el dominio ToxA-B descrito con más detalle más adelante o fragmentos de este dominio, por ejemplo, los dominios ToxA-PTA2, ToxA-P5-7, ToxA-P5-6, ToxA-P9-10, ToxA-B2, ToxA-B3, ToxA-B5 y/o ToxA-B6 descritos con más detalle más adelante.
Antígenos TcdA
Las composiciones de acuerdo con la divulgación comprenden un antígeno TcdA. El antígeno TcdA incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 1; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 1, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2500 o más). Los fragmentos de aminoácidos de TcdA pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 650, hasta 700, hasta 750, hasta 1000, hasta 1250, hasta 1500, hasta 1750, hasta 2000, hasta 2250 o hasta 2500 restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 1. Los fragmentos preferidos de TcdA comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 1. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 1 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 1. Otros fragmentos de TcdA omiten uno o más dominios de proteína. Los dominios de proteína que pueden omitirse pueden incluir dominios de proteína funcionales, tales como los dominios "B", "T", "GT", "CP", "ToxA-ED", "ToxA-GT", "ToxA-CP", "ToxA-T", "ToxA-T4", "ToxA-PTA2", "ToxA-P5-7", "ToxA-P5-6", "ToxA-P9-10", "ToxA-B2", "ToxA-B3", "ToxA-B5" y "ToxA-B6" descritos en el presente documento.
Los fragmentos del antígeno TcdA que pueden incluirse en las composiciones de la invención se seleccionan preferentemente entre el grupo que consiste en: "ToxA-ED", "ToxA-GT", "ToxA-CP", "ToxA-T", "ToxA-T4", "ToxA-PTA2", "ToxA-P5-7", "ToxA-P5-6", "ToxA-P9-10", "ToxA-B2", "ToxA-B3", "ToxA-B5" y "ToxA-B6". Este conjunto de fragmentos se cita en el presente documento como el "grupo del antígeno TcdA".
Por lo tanto, las composiciones de acuerdo con la presente divulgación pueden comprender uno o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15) antígenos TcdA seleccionados entre el grupo que consiste en: (1) un antígeno ToxA-ED, (2) un antígeno ToxA-GT, (3) un antígeno ToxA-CP, (4) un antígeno ToxA-T, (5) un antígeno ToxA-T4, (6) un antígeno ToxA-B, (7) un antígeno ToxA-PTA2, (8) un antígeno ToxA-P5-7, (9) un antígeno ToxA-P5-6, (10) un antígeno ToxA-P9-10, (11) un antígeno ToxA-B2, (12) un antígeno ToxA-B3, (13) un antígeno ToxA-B5, (14) un antígeno ToxA-B6 y (15) un antígeno TcdA de longitud completa. En los casos en los que las composiciones de la invención comprenden un fragmento de TcdA, el fragmento de TcdA no es, preferentemente, un solo antígeno ToxA-CP.
El (1) antígeno ToxA-GT, el (2) antígeno ToxA-ED y el (15) antígeno TcdA de longitud completa se han definido anteriormente. Los demás antígenos se definen con más detalle más adelante.
(3) Antígeno ToxA-CP
El dominio ToxA-CP (SEQ ID NO: 5, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 34) corresponde a los aminoácidos 542-769 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-CP" se refiere al dominio de cisteína proteasa de TcdA, que está ubicado dentro de la región C-terminal del dominio enzimático.
El antígeno ToxA-CP incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 5; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 5 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 5, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 225 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 5. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la s Eq ID NO: 5 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 5. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-CP pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200 o hasta 225, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 5.
El antígeno ToxA-CP incluido en las composiciones puede estar detoxificado. La detoxificación puede lograrse mutando la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante del antígeno ToxA-CP de tipo silvestre usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido. Preferentemente, el antígeno ToxA-CP comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más mutaciones), en relación con la secuencia de tipo silvestre del antígeno ToxA-CP de SEQ ID NO: 5. Por ejemplo, El antígeno ToxA-CP puede comprender sustituciones en 1, 2 o 3 posiciones correspondientes a los aminoácidos 48, 114 y 159 de la secuencia del antígeno ToxA-CP de SEQ ID NO: 5. En particular, pueden sustituirse 1, 2 o 3 aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 48, 114 y 159 de la secuencia del antígeno ToxA-CP de SEQ ID NO: 5, preferentemente, por restos de alanina o asparagina. En los casos en los que se sustituyan los aminoácidos 48, 114 y/o 159 de la SeQ ID NO: 5, la sustituciones son preferentemente D48N, H114A y/o A159A, más preferentemente, D48N, H114A y A159A. Estas sustituciones corresponden a las sustituciones D589n , H655A y C700A de la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de un antígeno ToxA-CP detoxificado que tiene sustituciones de alanina o asparagina en estas posiciones se proporciona en la SEQ ID NO: 62.
Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-CP detoxificado pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200 o hasta 225, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 62.
En los casos en los que las composiciones de la invención contienen solo un antígeno TcdA, el antígeno TcdA no es, preferentemente, un solo ToxA-CP. En los casos en los que las composiciones de la invención comprenden un antígeno ToxA-CP, el antígeno puede ser un antígeno ToxA-ED.
(4) Antígeno ToxA-T
El dominio ToxA-T (SEQ ID NO: 6, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 35) corresponde a los aminoácidos 770-1808 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-T" se refiere al dominio de translocación de TcdA.
El antígeno ToxA-T incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 6; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 6, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 6. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 6 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 6. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-T pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 700, hasta 800, hasta 900 o hasta 1000, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 6.
(5) ToxA-T4
El dominio ToxA-T4 (SEQ ID NO: 7, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 36) corresponde a los aminoácidos 1510-1775 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-T4" se refiere a una región dentro de TcdA. Se ha observado que la región ToxA-T4 es insoluble.
El antígeno ToxA-T4 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 7; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 7 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 7, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 7. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la s Eq ID NO: 7 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 7. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-T4 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250 o hasta 260, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 7.
(6) Antígeno ToxA-B
El dominio ToxA-B (SEQ ID NO: 8, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 37) corresponde a los aminoácidos 1809-2710 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-B" se refiere a un fragmento del dominio de unión de TcdA. El dominio de unión de TcdA (anotado como "B" en la figura 1) es responsable de la unión de la toxina a la superficie de células epiteliales. Los inventores han descubierto que los fragmentos del dominio de unión son eficaces en combinación con antígenos GT a la hora de provocar una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, las composiciones de la invención emplean fragmentos del dominio de unión (por ejemplo, ToxA-B, ToxA-PTA2, ToxA-P5-7, ToxA-P5-6, ToxA-P9-10, ToxA-B2, ToxA-B3, ToxA-B5 y/o ToxA-B6).
El antígeno ToxA-B incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 8; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 8 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 8, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550, 600, 700, 800, 900 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 8. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 8 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 8. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-B pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 700, hasta 800 o hasta 900, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 8.
(7) ToxA-PTA2
El dominio ToxA-PTA2 (SEQ ID NO: 9, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 38) corresponde a los aminoácidos 1995-2198 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-PTA2" se refiere a una región dentro del dominio de unión de TcdA y se ha observado que es insoluble. Como se describe en el documento WO98/59053, el fragmento ToxA-PTA2 comprende 8 secuencias de repetición en tándem del interior de la región de repetición C-terminal de la Toxina A.
El antígeno ToxA-PTA2 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 9; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 9 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 9, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 9. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la s Eq ID NO: 9 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 9. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-PTA2 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175 o hasta 200, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 9.
(8) Antígeno ToxA-P5-7
El antígeno ToxA-P5-7 (SEQ ID NO: 10, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 39) corresponde a los aminoácidos 2249-2706 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-P5-7" se refiere a una región dentro del dominio de unión de TcdA. Como se describe en el documento WO98/59053, el fragmento ToxA-P5-7 comprende 20 secuencias de repetición en tándem del interior de la región de repetición C-terminal de la Toxina A. El antígeno ToxA-P5-7 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 10; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 10 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 10, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 450 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 10 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-P5-7 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400 o hasta 450, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 10.
(9) Antígeno ToxA-P5-6
El dominio ToxA-P5-6 (también citado como "P5-6") (SEQ ID NO: 11, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 40) corresponde a los aminoácidos 2387-2706 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-P5-6" se refiere a una región dentro del dominio de unión de TcdA. Como se describe en el documento WO98/59053, el fragmento ToxA-P5-6 comprende 14 secuencias de repetición en tándem del interior de la región de repetición C-terminal de la Toxina A.
El antígeno ToxA-P5-6 incluido en las composiciones de la invención es un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad (por ejemplo, un 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 11. El antígeno ToxA-P5-6 puede comprender una mutación en al menos un aminoácido (por ejemplo, 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) en relación con la SEQ ID NO: 11. Una mutación implica preferentemente un solo aminoácido y es preferentemente una mutación puntual. Cada una de las mutaciones puede ser de manera independiente una eliminación, una inserción o una sustitución. Por ejemplo, un antígeno ToxA-P5-6 mutado puede incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) eliminaciones de aminoácidos individuales en relación con la secuencia de ToxA-P5-6 de SEQ ID NO: 11. A modo de ejemplo adicional, un antígeno ToxA-P5-6 mutado puede incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con la secuencia de ToxA-P5-6 de SEQ ID NO: 11. Las eliminaciones, sustituciones o inserciones pueden encontrarse en el extremo N-terminal y/o C-terminal o pueden encontrarse entre los dos extremos. Por lo tanto, un truncamiento es un ejemplo de una eliminación. Los truncamientos pueden implicar la eliminación de hasta 40 (o más) aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal. Las inserciones particulares incluyen la adición de dos aminoácidos en el extremo C-terminal, por ejemplo, leucina (L) y ácido glutámico (E), como se muestra en la SEQ ID NO: 84.
Las mutaciones preferidas son sustituciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser de un aminoácido a uno cualquiera de los otros diecinueve aminoácidos de origen natural. Normalmente, una sustitución conservativa se define como una sustitución que introduce un aminoácido que tiene propiedades químicas lo suficientemente similares, por ejemplo, que tiene una cadena lateral relacionada (por ejemplo, se puede reemplazar un aminoácido básico, cargado positivamente por otro aminoácido básico, cargado positivamente), a fin de preservar la estructura y la función biológica de la molécula. Los aminoácidos codificados genéticamente pueden dividirse en cinco familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; (4) cargados, es decir, ácido aspártico, ácido glutámico, arginina, lisina, histidina y (5) polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican en ocasiones conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante en la actividad biológica. En particular, pueden efectuarse sustituciones en las posiciones 41 y/o 42 del antígeno ToxA-P5-6 numerado de acuerdo con la SEQ ID NO: 11. En particular, puede sustituirse la histidina (H) en la posición 41 por ácido aspártico (D), como se muestra en la SEQ ID NO: 101 (una sustitución denominada H41D). En particular, puede sustituirse la asparagina (N) en la posición 42 por alanina (A), como se muestra en la SEQ ID NO: 102 (una sustitución denominada N42A). Aún más particularmente, el antígeno ToxA-P5-6 puede comprender ambas de estas dos mutaciones, H41D y N42A, como se ilustra en la SEQ ID NO: 103.
El antígeno ToxA-P5-6 puede formar parte de un polipéptido híbrido de fórmula: A-Bp5-6-C en la que:
A es una secuencia de aminoácidos N-terminal adicional opcional. La secuencia de aminoácidos adicional puede o bien proceder de secuencias del vector, de MCS o la secuencia puede ser de polipéptidos exógenos que ayudan a la hiperexpresión de las proteínas. Los aminoácidos adicionales podrían usarse para la purificación por afinidad o para la detección con anticuerpos. Dicha secuencia de aminoácidos adicional puede ser cualquiera conocida en la técnica, tal como un marcador GST, marcador His, marcador T7, marcador Trx, marcador MBP, marcador His-GM, etc. En particular, la secuencia de aminoácidos adicional comprende la secuencia MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSSRITR (SEQ ID NO: 104)
B es el antígeno ToxA-P5-6 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 102 y SEQ ID NO: 103.
C es una secuencia de aminoácidos C-terminal que tiene la siguiente secuencia, TESTCRXQA (SEQ ID NO: 105) en la que X es uno de los veinte aminoácidos de origen natural.
Se muestran ejemplos de polipéptidos híbridos que comprenden el antígeno ToxA-P5-6 en las SEQ ID NO: 106, 107, 108, 109, 110 y 111. La s Eq ID NO. 111 está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 112. Los antígenos ToxA-P5-6 preferidos para su uso en las combinaciones de la invención incluyen la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 111.
(10) Antígeno ToxA-P9-10
El dominio ToxA-P9-10 (SEQ ID NO: 12, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 41) corresponde a los aminoácidos 1843-2706 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-P9-10" se refiere a una región dentro del dominio de unión de TcdA. Como se describe en el documento WO98/59053, el fragmento ToxA-P9-10 comprende las 36 secuencias de repetición en tándem del interior de la región de repetición C-terminal de la Toxina A.
El antígeno ToxA-P9-10 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 12; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 12 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 12, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550, 600, 700, 800, 850 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 12. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 12 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 12. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-P9-10 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 700, hasta 800 o hasta 850, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 12.
(11) Antígeno ToxA-B2
El dominio ToxA-B2 (SEQ ID NO: 13, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 42) corresponde a los aminoácidos 2303-2706 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-B2" se refiere a una región dentro del dominio de unión de TcdA. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdA se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E). Se diseñó ToxA-B2 para que incluya 6 de las 13 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión (véase la figura 2).
El antígeno ToxA-B2 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 13; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 13 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 13, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 13. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 13 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 13. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-B2 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 13.
(12) Antígeno ToxA-B3
El dominio ToxA-B3 (SEQ ID NO: 14, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 43) corresponde a los aminoácidos 1839-2710 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-B3" se refiere a una región dentro del dominio de unión de TcdA. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdA se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E). Se diseñó ToxA-B3 para que incluya 12 de las 13 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión (véase la figura 3).
El antígeno ToxA-B3 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 14; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 14 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 14, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550, 600, 700, 800, 850 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 14. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 14 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 14. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-B3 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 700, hasta 800 o hasta 850, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 14.
(13) Antígeno ToxA-B5
El dominio ToxA-B5 (SEQ ID NO: 15, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 44) corresponde a los aminoácidos 1964-2706 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-B5" se refiere a una región dentro del dominio de unión de TcdA. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdA se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E). Se diseñó ToxA-B5 para que incluya 10,5 de las 13 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión (véase la figura 4).
El antígeno ToxA-B5 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 15; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 15 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 15, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550, 600, 700, 740 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 15. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 15 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 15. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-B5 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 700 o hasta 740, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 15.
(14) Antígeno ToxA-B6
El dominio ToxA-B6 (SEQ ID NO: 16, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 45) corresponde a los aminoácidos 1890-2706 de la SEQ ID NO: 1. La abreviatura "ToxA-B6" se refiere a una región dentro del dominio de unión de TcdA. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdA se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E). Se diseñó ToxA-B6 para que incluya 11,5 de las 13 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión (véase la figura 5).
El antígeno ToxA-B6 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 16; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 16 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 16, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550, 600, 700, 800 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 16. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 16 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 16. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxA-B6 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 700, hasta 800 o hasta 850, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 16.
Los antígenos TcdB
Las composiciones de la invención pueden comprender un antígeno TcdB. El antígeno TcdB incluido es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 2; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 2, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 500, 750, 1000, 1250, 1500, 1750, 2000, 2250, 2400 o más). Los fragmentos de aminoácidos de TcdB pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 350, hasta 400, hasta 450, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 650, hasta 700, hasta 750, hasta 1000, hasta 1250, hasta 1500, hasta 1750, hasta 2000, hasta 2250 o hasta 2400 restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 2. Los fragmentos preferidos de TcdB comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 2. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 2 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 2. Otros fragmentos de TcdB omiten uno o más dominios de proteína. Los dominios de proteína que pueden omitirse pueden incluir dominios de proteína funcionales, tales como los dominios "B", "T", "Gt ", "CP", ""ToxB-ED", "ToxB-GT', "ToxB-CP", "ToxB-T", "ToxB-B", "ToxB-B2" y "ToxB-B7" descritos en el presente documento.
Los fragmentos de TcdB que pueden incluirse en la composición se seleccionan preferentemente entre el grupo que consiste en: "ToxB-ED", "ToxB-GT", "ToxB-CP", "ToxB-T", "ToxB-B", "ToxB-B2" y "ToxB-B7". Este conjunto de antígenos se cita en el presente documento como el "grupo del antígeno TcdB".
Por lo tanto, las composiciones pueden comprender uno o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o los 8) antígenos TcdB seleccionados entre el grupo que consiste en: (1) un antígeno ToxB-ED, (2) un antígeno ToxB-GT, (3) un antígeno ToxB-CP, (4) un antígeno ToxB-T, (5) un antígeno ToxB-B, (6) un antígeno ToxB-B2, (7) un antígeno ToxB-B7 y (8) un antígeno TcdB de longitud completa. En los casos en los que las composiciones de la invención comprenden solo un fragmento de TcdB, el fragmento de TcdB no es, preferentemente, solo ToxB-CP.
El (1) antígeno ToxB-GT el (2) antígeno ToxB-ED y el (8) antígeno TcdB de longitud completa se han definido anteriormente. Los demás antígenos se definen con más detalle más adelante.
(3) Antígeno ToxB-CP
El dominio ToxB-CP (SEQ ID NO: 19, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 48) corresponde a los aminoácidos 544-767 de la SEQ ID NO: 2. La abreviatura "ToxB-CP" se refiere al dominio de cisteína proteasa de TcdB, que está ubicado dentro de la región C-terminal del dominio enzimático.
El antígeno ToxB-CP incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 19; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 19 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 19, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 230 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 19. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-CP pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200 o hasta 230, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 19. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 19 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 19.
El antígeno ToxB-CP incluido en las composiciones puede estar detoxificado. La detoxificación puede lograrse mutando la secuencia de aminoácidos o la secuencia de ácido nucleico codificante del antígeno ToxB-CP de tipo silvestre usando cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, mutagénesis de sitio dirigido. Preferentemente, el antígeno ToxB-CP comprende una o más sustituciones de aminoácidos (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 o más mutaciones), en relación con la secuencia de tipo silvestre del antígeno ToxB-CP de SEQ ID NO: 19. Por ejemplo, El antígeno ToxB-CP puede comprender sustituciones en 1, 2 o 3 posiciones correspondientes a los aminoácidos 44, 110 y 155 de la secuencia del antígeno ToxB-CP de SEQ ID NO: 19. En particular, pueden sustituirse 1, 2 o 3 aminoácidos en las posiciones correspondientes a los aminoácidos 44, 110 y 155 de la secuencia del antígeno ToxB-CP de SEQ ID NO: 19, preferentemente, por restos de alanina o asparagina. En los casos en los que se sustituyan los aminoácidos 44, 110 y/o 155 de la SeQ ID NO: 19, la sustituciones son preferentemente D44N, H110A y/o C155A, más preferentemente, D44N, H110A y/o C155A. La secuencia de aminoácidos de un antígeno ToxB-CP detoxificado que tiene sustituciones de alanina o asparagina en estas posiciones se proporciona en la SEQ ID NO: 64. Estas sustituciones corresponden a las sustituciones D587N, H653A y C698A de la SEQ ID NO: 2. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-CP detoxificado pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200 o hasta 225, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 64.
En los casos en los que las composiciones de la invención contienen solo un antígeno TcdB, el antígeno TcdB no es, preferentemente, solo ToxB-CP. En los casos en los que las composiciones de la invención comprenden un antígeno ToxB-CP, el antígeno puede ser un antígeno ToxB-ED.
(4) Antígeno ToxB-T
El dominio ToxB-T (SEQ ID NO: 20, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 49) corresponde a los aminoácidos 768-1833 de la SEQ ID NO: 2. La abreviatura "ToxB-T" se refiere al dominio de translocación de TcdB.
El antígeno ToxB-T incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 20; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 20 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 20, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1050 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 20. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 20 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 20. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-T pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400, hasta 500, hasta 550, hasta 600, hasta 700, hasta 800, 900, 1000 o hasta 1050, restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 20.
(5) Antígeno ToxB-B
El dominio ToxB-B (SEQ ID NO: 21, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 50) corresponde a los aminoácidos 1853-2366 de la SEQ ID NO: 2. La abreviatura "ToxB-B" se refiere a un fragmento del dominio de unión de TcdB. Los inventores han descubierto que los fragmentos del dominio de unión son eficaces en combinación con antígenos GT a la hora de provocar una respuesta inmunitaria. Por lo tanto, las composiciones de la invención emplean fragmentos del dominio de unión (por ejemplo, ToxB-B, antígeno ToxB-B2 y/o ToxA-B7).
El antígeno ToxB-B incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 21; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 21 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 21, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 250, 300, 400, 500 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 21. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 21 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 21. Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-B pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250, hasta 300, hasta 400, hasta 450 o hasta 500 restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 21.
(6) Antígeno ToxB-B2
El dominio ToxB-B2 (SEQ ID NO: 22, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 51) corresponde a los aminoácidos 2157-2366 de la SEQ ID NO: 2. La abreviatura "ToxB-B2" se refiere a la región C-terminal del dominio de unión de TcdB. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdB se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E). Se diseñó ToxB-B2 para que incluya 4 de las 9 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión (véase la figura 6).
El antígeno ToxB-B2 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 22; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 22 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 22, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 175, 200 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 22. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 22 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 22.
Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-B2 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175 o hasta 200 restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 22.
(7) Antígeno ToxB-B7
El dominio ToxB-B7 (SEQ ID NO: 23, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 52) corresponde a los aminoácidos 2056-2366 de la SEQ ID NO: 2.
El antígeno ToxB-B7 incluido en las composiciones es un polipéptido que comprende o que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 98,5 %, 99 %, 99,5 %, 99,8 %, 99,9 % o más) respecto de la SEQ ID NO: 23; y/o (b) que es un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 23 o de un polipéptido que tiene un 50 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 23, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300 o más). Los fragmentos preferidos comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 23. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C-terminal y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 23 a la vez que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 23.
Por lo tanto, los fragmentos de aminoácidos de ToxB-B7 pueden comprender una secuencia de aminoácidos de, por ejemplo, hasta 30, hasta 40, hasta 50, hasta 60, hasta 70, hasta 80, hasta 90, hasta 100, hasta 125, hasta 150, hasta 175, hasta 200, hasta 250 o hasta 300 restos de aminoácido consecutivos de la SEQ ID NO: 23.
Combinaciones de antígenos
Las composiciones de la invención pueden comprender un antígeno ToxB-GT y uno o más antígenos TcdA (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 antígenos TcdA seleccionados entre (1) un antígeno ToxA-ED, (2) un antígeno ToxA-GT, (3) un antígeno ToxA-CP, (4) un antígeno ToxA-T, (5) un antígeno ToxA-T4, (6) un antígeno ToxA-B, (7) un antígeno ToxA-PTA2, (8) un antígeno ToxA-P5-7, (9) un antígeno ToxA-P5-6, (10) un antígeno ToxA-P9-10, (11) un antígeno ToxA-B2, (12) un antígeno ToxA-B3, (13) un antígeno ToxA-B5, (14) un antígeno ToxA-B6 y (15) un antígeno TcdA de longitud completa, como se ha descrito anteriormente). Dichas composiciones pueden comprender además uno o más antígenos TcdB adicionales (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 antígenos TcdB seleccionados entre el grupo que consiste en: (1) un antígeno ToxB-ED, (2) un antígeno ToxB-GT, (3) un antígeno ToxB-CP, (4) un antígeno ToxB-T, (5) un antígeno ToxB-B, (6) un antígeno ToxB-B2, (7) un antígeno ToxB-B7 y (8) un antígeno TcdB de longitud completa, como se ha descrito TcdB anteriormente).
Como alternativa, las composiciones de la invención pueden comprender un antígeno ToxA-GT y uno o más antígenos TcdB (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 antígenos TcdB seleccionados entre el grupo que consiste en: (1) un antígeno ToxB-ED, (2) un antígeno ToxB-GT, (3) un antígeno ToxB-CP, (4) un antígeno ToxB-T, (5) un antígeno ToxB-B, (6) un antígeno ToxB-B2, (7) un antígeno ToxB-B7 y (8) un antígeno TcdB de longitud completa, como se ha descrito TcdB anteriormente). Dichas composiciones pueden comprender además uno o más antígenos TcdA (por ejemplo,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 antígenos TcdA seleccionados entre (1) un antígeno ToxA-ED, (2) un antígeno ToxA-GT, (3) un antígeno ToxA-CP, (4) un antígeno ToxA-T, (5) un antígeno ToxA-T4, (6) un antígeno ToxA-B, (7) un antígeno ToxA-PTA2, (8) un antígeno ToxA-P5-7, (9) un antígeno ToxA-P5-6, (10) un antígeno ToxA-P9-10, (11) un antígeno ToxA-B2, (12) un antígeno ToxA-B3, (13) un antígeno ToxA-B5, (14) un antígeno ToxA-B6 y (15) un antígeno TcdA de longitud completa, como se ha descrito anteriormente).
Los ejemplos específicos de combinaciones de antígenos que pueden incluirse en las composiciones de la invención se exponen más adelante.
En algunas realizaciones, la composición inmunogénica comprende una combinación de i) un antígeno ToxB-GT y un antígeno TcdA o ii) un antígeno ToxA-GT y un antígeno TcdB.
En algunas realizaciones, la composición comprende ToxA-GT y un antígeno del grupo de antígenos de TcdB, por ejemplo, ToxA-GT ToxB-ED, ToxA-GT ToxB-GT, ToxA-GT ToxB-CP, ToxA-GT ToxB-T, ToxA-GT ToxB-B, ToxA-GT ToxB-B2, ToxA-ED ToxB-B7, ToxA-ED ToxB-ED, ToxA-ED ToxB-GT, ToxA-ED ToxB-CP, ToxA-ED ToxB-T, ToxA-ED ToxB-B, ToxA-ED ToxB-B2 y ToxA-ED ToxB-B7.
En algunas realizaciones, la composición comprende ToxB-GT y un antígeno del grupo de antígenos de TcdA, por ejemplo, ToxB-GT ToxA-ED, ToxB-GT ToxA-GT, ToxB-GT ToxA-CP, ToxB-GT ToxA-T, ToxB-GT ToxA-T4, ToxB-GT ToxA-PTA2, ToxB-GT ToxA-P5-7, ToxB-GT ToxA-P5-6, ToxB-GT ToxA-P9-10, ToxB-GT ToxA-B2, ToxB-GT ToxA-B3, ToxB-GT ToxA-B5, ToxB-GT ToxA-B6, ToxB-ED ToxA-ED, ToxB-ED ToxA-GT, ToxB-ED ToxA-CP, ToxB-ED ToxA-T, ToxB-ED ToxA-T4, ToxB-ED ToxA-PTA2, ToxB-ED ToxA-P5-7, ToxB-ED ToxA-P5-6, ToxB-ED ToxA-P9-10, ToxB-ED ToxA-B2, ToxB-ED ToxA-B3, ToxB-ED ToxA-B5 y ToxB-ED ToxA-B6. Preferentemente, la composición comprende (a) ToxB-GT ToxA-P5-6, (b) ToxB-GT ToxA-B2, (c) ToxB-GT ToxB-B ToxA-B2 o (d) ToxB-GT ToxB-B ToxA-P5-6.
En otra realización, la composición inmunogénica comprende 3 antígenos. Dicha composición inmunogénica puede comprender una combinación de i) un antígeno ToxB-GT y dos antígenos TcdA; ii) un antígeno ToxA-GT y dos antígenos TcdB; o iii) un antígeno ToxB-GT, un antígeno ToxA-GT y un antígeno TcdA o TcdB adicional, por ejemplo, ToxB-GT ToxA-B2 ToxB-B, ToxB-GT ToxB-B ToxA-P5-6.
La composición inmunogénica puede comprender cuatro antígenos. Por ejemplo, la composición puede comprender un antígeno ToxB-GT, un antígeno ToxA-GT y dos antígenos adicionales de los grupos de antígenos TcdA y/o TcdB, por ejemplo, ToxB-GT ToxB-B ToxA-GT ToxA-B2.
Se ha descubierto que las combinaciones que comprenden el antígeno ToxB-GT son sorprendentemente eficaces cuando se combinan con fragmentos procedentes de los dominios de unión tanto de TcdA como de TcdB. En particular, la composición puede comprender, por lo tanto, una combinación de i) un antígeno ToxA-GT o un antígeno ToxB-GT y (ii) al menos un antígeno TcdA seleccionado entre ToxA-B, ToxA-PTA2, ToxA-P5-7, ToxA-P5-6, ToxA-P9-10, ToxA-B2, ToxA-B3, ToxA-B5 y/o ToxA-B6; y al menos un antígeno TcdB seleccionado entre ToxB-B, antígeno ToxB-B2 y/o ToxA-B7. la composición también puede comprender una combinación de i) un antígeno ToxA-GT y un antígeno ToxB-GT y (ii) al menos un antígeno TcdA seleccionado entre ToxA-B, ToxA-PTA2, ToxA-P5-7, ToxA-P5-6, ToxA-P9-10, ToxA-B2, ToxA-B3, ToxA-B5 y/o ToxA-B6; y al menos un antígeno TcdB seleccionado entre ToxB-B, antígeno ToxB-B2 y/o ToxA-B7.
La composición puede comprender además, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más fragmentos adicionales. Dichos fragmentos adicionales se seleccionan preferentemente entre el grupo de antígenos de TcdA y/o entre el grupo de antígenos de TcdB.
Polipéptidos híbridos
Los antígenos en la composición pueden estar presentes en forma de polipéptidos separados individuales y/o de polipéptidos "híbridos". En algunas realizaciones, ninguno de los antígenos se encuentra en forma de polipéptidos híbridos. En algunas realizaciones, ninguno de los antígenos se encuentra en forma de polipéptidos híbridos. Los polipéptidos híbridos (también citados en el presente documento como quimeras o proteínas quiméricas) se describen con más detalle más adelante.
Los antígenos pueden estar presentes en las composiciones de la invención en forma de polipéptidos individuales separados (es decir, mezclados entre sí). Como alternativa, las composiciones de la invención comprenden un polipéptido "híbrido", en el que al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) antígenos se expresan en forma de una sola cadena polipeptídica. Las composiciones de la invención también pueden comprender al menos un antígeno polipeptídico individual separado y al menos un polipéptido híbrido. Los polipéptidos híbridos ofrecen dos ventajas principales: en primer lugar, puede complementare un polipéptido que pueda ser inestable o que se exprese mal solo añadiendo un compañero híbrido adecuado que solvente el problema; en segundo lugar, la fabricación comercial se simplifica, ya que solo es necesario usar una expresión y purificación para producir dos polipéptidos que sean antigénicamente útiles.
Los polipéptidos híbridos pueden comprender un antígeno ToxB-GT y uno o más antígenos TcdA. El polipéptido híbrido comprende, por lo tanto, dos o más antígenos que no son iguales. Por lo tanto, el polipéptido híbrido puede comprender secuencias de aminoácidos de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más antígenos diferentes y puede comprender múltiples copias de cada antígeno, es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más copias.
Los polipéptidos híbridos pueden comprender un antígeno ToxA-GT y uno o más antígenos TcdB. El polipéptido híbrido comprende, por lo tanto, dos o más antígenos que no son iguales. Por lo tanto, el polipéptido híbrido puede comprender secuencias de aminoácidos de, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más antígenos diferentes y puede comprender múltiples copias de cada tipo de fragmento, es decir, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más copias.
Los antígenos TcdA se seleccionan preferentemente entre el grupo de antígenos de TcdA, por ejemplo, el polipéptido híbrido puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 de los antígenos en el grupo de antígenos de TcdA. Los antígenos TcdB se seleccionan preferentemente entre el grupo de antígenos de TcdB, por ejemplo, el polipéptido híbrido puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de los antígenos en el grupo de antígenos de TcdB.
Pueden mezclarse entre sí diferentes polipéptidos híbridos en una sola formulación. Los híbridos pueden combinarse con antígenos no híbridos. En dichas combinaciones, puede estar presente un antígeno TcdA/TcdB en más de un polipéptido híbrido y/o en forma de un polipéptido no híbrido. Preferentemente, un antígeno TcdA/TcdB está presente en forma de un híbrido o en forma de un no híbrido, pero no como ambos.
Los polipéptidos híbridos también pueden combinarse con conjugados o antígenos no procedentes de C. difficile. Los polipéptidos híbridos pueden representarse por la fórmula NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH, en la que: X es una secuencia de aminoácidos de un fragmento de toxina, preferentemente un fragmento de toxoide, como se ha descrito anteriormente; L es una secuencia de aminoácidos de enlazador opcional; A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional; n es un número entero de 2 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, etc.). Normalmente, n es 2 o 3.
En caso de que un resto -X- tena una secuencia de polipéptido líder en su forma de tipo silvestre, esta puede incluirse u omitirse en la proteína híbrida. En algunas realizaciones, se eliminarán los polipéptidos líder, salvo para los del resto -X- ubicado en el extremo N-terminal de la proteína híbrida, es decir, se conservará el polipéptido líder de X1, pero se omitirán los polipéptidos líder de X2 ... Xn. Esto equivale a eliminar todos los polipéptidos híbridos y usar el polipéptido líder de X1 como resto -A-.
Para cada n apariciones de {-X-L-}, la secuencia de aminoácidos enlazadora -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n=2 el híbrido puede ser NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, etc. Las secuencias de aminoácidos enlazadoras -L- normalmente serán cortas (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos, es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias de polipéptido cortas que facilitan la clonación, enlazadores de poliglicina (es decir, que comprenden Glyn en la que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) y marcadores de histidina (es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Resultarán evidentes para un experto en la materia otras secuencias de aminoácidos enlazadoras adecuadas. Un enlazador útil es GSGGGG (s Eq ID NO: 25) o GSGSGGGG (SEQ ID NO: 26), formándose el dipéptido de Gly-Ser a partir de un sitio de restricción de BamHI, ayudando de este modo a la clonación y la manipulación y siendo el tetrapéptido (Gly)4 un enlazador de poliglicina típico. Otros enlazadores adecuados, en particular, para su uso como el Ln son un dipéptido de Leu-Gly de SEQ ID NO: 27.
-A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Esta será normalmente corta (por ejemplo, 40 aminoácidos o menos, es decir, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas o secuencias polipeptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, marcadores de histidina, es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Resultarán evidentes para un experto en la materia otras secuencias de aminoácidos N-terminales adecuadas. En caso de que X1 carezca de su propia metionina N-terminal, -A- es preferentemente un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina N-terminal, por ejemplo, Met-Ala-Ser o un solo resto de Met.
-B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional. Esta será normalmente corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias de polipéptido cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden marcadores de histidina, es decir, Hisn donde n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) o secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas. Resultarán evidentes para un experto en la materia otras secuencias de C-terminales adecuadas.
Por ejemplo, la invención proporciona un polipéptido híbrido ("híbrido B4") que consiste en ToxB-GT (SEQ ID NO: 18) fusionado a ToxA-P5-6 (SEQ ID NO: 11) a través de un enlazador peptídico (SEQ ID NO: 25). En la figura 7 se proporciona una representación esquemática del híbrido B4 (SEQ ID NO: 24, codificado por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 53).
Los polipéptidos híbridos de la invención normalmente no son holotoxinas, es decir, no comprenden todos los dominios funcionales (GT, CP, T y B) presentes en una toxina u holotoxina natural. Por ejemplo, en los casos en los que un polipéptido híbrido que comprende un antígeno ToxB-GT también comprenda un fragmento de dominio de unión de TcdB (por ejemplo, ToxB-B, ToxB-B2 y/o ToxB-B7), el híbrido no comprende los dominios C y T de TcdB en el orden en el que se encuentran en una toxina B natural. De manera similar, en los casos en los que un polipéptido híbrido que comprende un antígeno ToxA-GT también comprenda un fragmento de dominio de unión de TcdA (por ejemplo, ToxA-B, ToxA-PTA2, ToxA-P5-7, ToxA-P5-6, ToxA-P9-10, ToxA-B2, ToxA-B3, ToxA-B5 y/o ToxA-B6), el híbrido no comprende los dominios CP y T de TcdA en el orden en el que se encuentran en una toxina A natural. En algunas realizaciones, los dominios funcionales en un polipéptido híbrido se encuentran en un orden diferente desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal respecto del orden de los dominios funcionales encontrados en la toxina natural, por ejemplo, el dominio T puede encontrarse en N-terminal respecto del dominio GT.
De forma similar, los fragmentos TcdA y TcdB pueden encontrarse en cualquier orden. Por ejemplo, en los casos donde un polipéptido híbrido comprende dos antígenos TcdA y un antígeno TcdB, pueden estar en el orden A-A-B, A-B-A, B-A-A desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal o en los casos donde un polipéptido híbrido comprende dos antígenos TcdB y un antígeno TcdA, pueden estar en el orden B-B-A, B-A-B, A-B-B desde el extremo N-terminal al extremo C-terminal. En general, los antígenos TcdA y TcdB pueden alternarse, por ejemplo, A-B-A o B-A-B.
En particular, el polipéptido híbrido no comprende, preferentemente, los dominios ToxB-ED y ToxB-T de TcdB fusionados al dominio ToxA-B de TcdA, en el que el dominio B de TcdA está fusionado al extremo C-terminal del dominio T de TcdB, ya sea directamente o a través de un enlazador (por ejemplo, un TcdB de longitud completa modificado, en el que el dominio B de TcdB se sustituye por el dominio B de TcdA). El polipéptido híbrido no comprende, preferentemente, el dominio GT de TcdB fusionado a los dominios CP, T y B (en dirección N-C) de TcdA, en el que el dominio GT de TcdB está fusionado al extremo C-terminal del dominio CP de TcdA, ya sea directamente o a través de un enlazador (por ejemplo, un TcdA de longitud completa modificado, en el que el dominio GT de TcdA se sustituye por el dominio GT de TcdB). El polipéptido híbrido no comprende preferentemente el dominio B de TcdA fusionado a los dominios GT, CP y T (en dirección N-C) de TcdB, en el que el dominio B de TcdA está fusionado al extremo C-terminal del dominio GT de TcdB, ya sea directamente o a través de un enlazador.
Preparación de composiciones de la invención
La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar una composición de la invención que comprende una etapa de mezclar antígenos de cualquiera de las combinaciones de antígenos definidas anteriormente. Por ejemplo, la divulgación proporciona un procedimiento que comprende una etapa de mezclar (i) un antígeno ToxA-GT y (ii) uno o más (es decir, 1, 2, 3 o 4) antígenos TcdB y opcionalmente, (iii) uno o más (es decir, 1, 2, 3 o 4) antígenos TcdA adicionales. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender una etapa de mezclar un antígeno ToxA-GT y uno o más antígenos seleccionados entre el grupo de antígenos TcdB y opcionalmente, uno o más antígenos seleccionados entre el grupo de antígenos de TcdA.
La divulgación también proporciona un procedimiento que comprende una etapa de mezclar (i) un antígeno ToxB-GT y (ii) uno o más (es decir, 1, 2, 3 o 4) antígenos TcdA y opcionalmente, (iii) uno o más (es decir, 1, 2, 3, o 4) antígenos TcdB. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender una etapa de mezclar un polipéptido que comprende un antígeno ToxB-GT y uno o más antígenos seleccionados entre el grupo de antígenos de TcdA y opcionalmente, uno o más antígenos seleccionados entre el grupo de antígenos de TcdB.
Un procedimiento de acuerdo con la divulgación para preparar una mezcla de antígenos TcdA y TcdB puede comprender una etapa adicional de formular la mezcla de una combinación de antígenos TcdA y TcdB de la invención como medicamento, por ejemplo, en forma de una vacuna. Dichos procedimientos pueden comprender además una etapa de envasar la formulación para su almacenamiento o distribución como un medicamento, por ejemplo, en forma de una vacuna.
Polipéptidos usados con la invención
Los polipéptidos usados con la invención pueden adoptar varias formas (por ejemplo, negativa, fusiones, glucosilados, no glucosilados, lipidados, no lipidados, fosforilados, no fosforilados, miristoilados, no miristoilados, monoméricos, multiméricos, en partículas, desnaturalizados, etc.).
Los polipéptidos usados con la invención pueden prepararse de diversas formas (por ejemplo, expresión recombinante, purificación de cultivo celular, síntesis química, etc.). Se prefieren las proteínas expresadas de manera recombinante, en particular, para polipéptidos híbridos.
Los polipéptidos usados con la invención se proporcionan preferentemente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libres de otros polipéptidos (por ejemplo, libres de polipéptidos de origen natural), en particular, de otros polipéptidos de C. difficile o del hospedador y generalmente son al menos aproximadamente un 50 % puros (en peso) y normalmente, al menos un 90 % puros, es decir, menos de aproximadamente un 50 % y más preferentemente, menos de aproximadamente un 10 % (por ejemplo, un 5 %) de una composición está formada por otros polipéptidos expresados. Por lo tanto, los antígenos en las composiciones se separan del organismo completo con el que se expresa la molécula.
Los polipéptidos usados con la invención son, preferentemente, polipéptidos de C. difficile.
Los polipéptidos usados con la invención se encuentran, preferentemente, aislados o purificados.
El término "polipéptido" se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de manera natural o por medio de la invención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de mareaje. También se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden producirse en forma de cadenas individuales o de cadenas asociadas.
La invención proporciona polipéptidos que comprenden una secuencia -P-Q- o -Q-P-, en la que: -P- es una secuencia de aminoácidos, como se ha definido anteriormente y -Q- no es una secuencia como se ha definido anteriormente, es decir, la invención proporciona proteínas de fusión. En los casos en los que el codón del extremo N-terminal de -P- no es ATG, pero este codón no está presente en el extremo N-terminal de un polipéptido, puede traducirse como el aminoácido estándar para ese codón en lugar de como Met. En los casos en los que este codón se encuentre en el extremo N-terminal de un polipéptido, sin embargo, se traducirá como Met. Los ejemplos de restos -Q- incluyen, pero sin limitación, marcadores de histidina (es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), proteína de unión a maltosa o glutatión S-transferasa (GST).
La invención también proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención, que comprende la etapa de cultivar una célula hospedadora transformada con ácido nucleico de la invención en condiciones que inducen la expresión del polipéptido.
Aunque la expresión de los polipéptidos de la invención puede producirse en una C. difficile, la invención usará normalmente un hospedador heterólogo para la expresión (expresión recombinante). El hospedador heterólogo puede ser procariota (por ejemplo, una bacteria) o eucariota. Puede ser E. coli, pero otros hospedadores adecuados incluyen Brevibacillus chosinensis, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, M.tuberculosis), levaduras, etc. En comparación con los genes de tipo silvestre de C. difficile que codifican los polipéptidos de la invención, es útil cambiar codones para optimizar la eficacia de la expresión en dichos hospedadores sin afectar a los aminoácidos codificados.
La invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención, que comprende la etapa de sintetizar al menos parte del polipéptido por medios químicos.
Ácidos nucleicos
La divulgación también proporciona composiciones que comprenden ácidos nucleicos (por ejemplo, combinaciones de ácidos nucleicos, vectores o combinaciones de vectores) que codifican las combinaciones de polipéptidos o polipéptidos híbridos de la invención descritos anteriormente.
Se conocen secuencias de nucleótidos que codifican combinaciones de antígenos de la invención o pueden diseñarse de acuerdo con el código genético. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, dicha secuencia de nucleótidos puede codificar una o más de las secuencias de polipéptido divulgadas en el presente documento o pueden codificar una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 50 % o más de identidad (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más, por ejemplo, un 90 % de identidad o más o un 95 % de identidad o más o un 99 % de identidad o más, respecto de cualquiera de dichos polipéptidos; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de cualquiera de dichos polipéptidos: 1, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más; por ejemplo, 20 o más; o por ejemplo, 50 o más; o por ejemplo, 80 o más).
Las secuencias de nucleótidos naturales de los ácidos nucleicos que codifican todos los antígenos de TcdA y TcdB descritas anteriormente se proporcionan en el listado de secuencias y se resumen en la tabla del listado de secuencias. Las secuencias de nucleótidos que codifican algunos de estos antígenos se han optimizado usando un procedimiento de optimización de codones y en algunos casos, también se muestran secuencias de nucleótidos optimizadas. Los ejemplos de secuencias con codones optimizados incluyen secuencias de ácido nucleico que comprenden las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO: 55, 57, 59, 61, 63 y 65-69). La invención incluye composiciones que comprenden ácidos nucleicos identificado en la tabla del listado de secuencias que codifican las combinaciones de antígenos descritas anteriormente. La invención también proporciona ácidos nucleicos que pueden hibridar con estos ácidos nucleicos. Las reacciones de hibridación pueden llevarse a cabo en condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación se conocen ampliamente y se han publicado en la técnica (por ejemplo, la página 7.52 de [42]). Los ejemplos de condiciones relevantes incluyen (en orden de rigurosidad creciente): temperaturas de incubación de 25 °C, 37 °C, 50 °C, 55 °C y 68 °C; concentraciones de tampón de 10 x SSC, 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC (siendo SSC NaCl 0,15 M y tampón citrato 15 mM) y sus equivalentes usando otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida del 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2 o más etapas de lavado; tiempos de incubación de lavado de 1, 2 o 15 minutos; y soluciones de lavado de 6 x SSC, 1 x SSC, 0,1 x SSC o agua desionizada. Las técnicas de hibridación y su optimización se conocen bien en la técnica [43, 44, 42, 45, etc.].
Un ácido nucleico puede hibridar con una diana en condiciones de baja rigurosidad; en otras realizaciones, hibrida en condiciones de rigurosidad intermedia; en realizaciones preferidas, hibrida en condiciones de rigurosidad elevada. Un conjunto ilustrativo de condiciones de hibridación de baja rigurosidad es 50 °C y 10 x SSC. Un conjunto ilustrativo de condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia es 55 °C y 1 x SSC. Un conjunto ilustrativo de condiciones de hibridación de rigurosidad elevada es 68 °C y 0,1 x SSC.
La divulgación incluye secuencias de ácido nucleico complementarias a estas secuencias (por ejemplo, para antisentido o sondado o para su uso como cebadores).
Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden adoptar varias formas (por ejemplo, monocatenarios, bicatenarios, vectores, cebadores, sondas, marcados, etc.). Los ácidos nucleicos de la invención pueden ser circulares o ramificados, pero en general, serán lineales. A menos que se especifique o requiera otra cosa, cualquier realización de la invención que utiliza un ácido nucleico puede utilizar tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas complementarias monocatenarias que conforman la forma bicatenaria. Los cebadores y las sondas son por lo general monocatenarios, al igual que los ácidos nucleicos antisentido.
Los ácidos nucleicos que codifican antígenos descritos en el presente documento se proporcionan preferentemente en una forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libres de otros ácidos nucleicos (por ejemplo, libres de ácidos nucleicos de origen natural), en particular, de otros ácidos nucleicos de C. difficile o de la célula hospedadora, siendo en general al menos aproximadamente un 50 % puros (en peso) y normalmente, al menos aproximadamente un 90 % puros. Los ácidos nucleicos de la invención son preferentemente ácidos nucleicos de C. difficile.
Los ácidos nucleicos que codifican antígenos descritos en el presente documento pueden prepararse de varias maneras, por ejemplo, mediante síntesis química (por ejemplo, síntesis de ADN de fosforamidita) en su totalidad o en parte, mediante digestión de ácidos nucleicos más largos usando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), mediante unión de ácidos nucleicos o nucleótidos más cortos (por ejemplo, usando ligasas o polimerasas), procedentes de bibliotecas genómicas o de ADNc, etc.
Los ácidos nucleicos pueden unirse a un soporte sólido (por ejemplo, una perla, placa, filtro, película, portaobjetos, soporte de micromatriz, resina, etc.). Los ácidos nucleicos pueden marcarse, por ejemplo, con un marcador radiactivo o fluorescente o con un marcador de biotina. Esto es particularmente útil en los casos en los que se vaya a usar el ácido nucleico en técnicas de detección, por ejemplo, en los casos en los que el ácido nucleico sea un cebador o una sonda.
La expresión "ácido nucleico" incluye, en general, una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, que contiene desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Incluye ADN, ARN, híbrido de ADN/ARN. También incluye análogos de ADN o ARN, tales como aquellos que contienen cadenas principales modificadas (por ejemplo, ácidos polipéptido nucleicos (PNA) o fosforotioatos) o bases modificadas. Por lo tanto, la invención incluye ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etc. EN los casos en los que el ácido nucleico de la invención adopta la forma de ARN, puede tener o no un remate 5'.
Los ácidos nucleicos que codifican antígenos descritos en el presente documento pueden formar parte de un vector, es decir, parte de una construcción de ácido nucleico diseñada para la transducción/transfección de uno o más tipos de células. Los vectores pueden ser, por ejemplo, "vectores de clonación", que están diseñados para el aislamiento, la propagación y la replicación de los nucleótidos insertados, "vectores de expresión", que están diseñados para la expresión de una secuencia de nucleótidos en una célula hospedadora, "vectores víricos", que están diseñados para dar como resultado la producción de un virus recombinante o una partícula pseudovírica o "vectores lanzadera", que comprenden los atributos de más de un tipo de vector. Los vectores preferidos son plásmidos. Una "célula hospedadora" incluye una célula individual o un cultivo celular, que puede ser o ha sido el receptor de ácido nucleico exógeno. Las células hospedadoras incluyen la descendencia de una sola célula hospedadora y la descendencia puede no ser necesariamente completamente idéntica (en cuanto a su morfología o en el complemento de ADN total) respecto de la célula progenitora original a causa de mutaciones y/o cambios naturales, accidentales o deliberados. Las células hospedadoras incluyen células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con el ácido nucleico de la invención.
El término "complemento" o "complementario", cuando se usa en relación con ácidos nucleicos, se refiere al emparejamiento de bases de Watson-Crick. Por lo tanto, el complemento de C es G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U) y el complemento de T (o U) es A. También es posible usar bases tales como I (la purina, inosina), por ejemplo, para complementar a las pirimidinas (C o T).
Los ácidos nucleicos que codifican antígenos descritos en el presente documento pueden usarse, por ejemplo: para producir polipéptidos; como sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos en muestras biológicas; para generar copias adicionales de los ácidos nucleicos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; como cebadores o sondas de ADN monocatenario; o como oligonucleótidos formadores de hebras triples.
La divulgación proporciona un procedimiento para producir ácidos nucleicos que codifican antígenos descritos en el presente documento, sintetizándose el ácido nucleico en su totalidad o en parte usando medios químicos.
La divulgación proporciona vectores que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican antígenos descritos en el presente documento (por ejemplo, vectores de clonación o expresión) y células hospedadoras transformadas con dichos vectores. En ocasiones, los ácidos nucleicos tienen preferentemente al menos 7 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 nucleótidos o más).
En ocasiones, los ácidos nucleicos comprenden preferentemente como máximo 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32,31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleótidos o menos).
Cepas y variantes
Los antígenos se han definido anteriormente por referencia a ToxA y ToxB de C. difficile procedentes de la cepa 630 de C. difficile. La secuencia de referencia básica para ToxA y ToxB puede encontrarse fácilmente en bases de datos de genes públicas. Por ejemplo, el número de referencia de GenBank AM180355 es la secuencia del genoma completo de C. difficile y las secuencias individuales de ToxA y ToxB se proporcionan como entradas de "locus_tag" en la sección "features" de la secuencia del genoma. En las bases de datos también se proporcionan anotaciones funcionales.
Las composiciones inmunogénicas de la invención son útiles para la inmunización contra la EACD provocada por múltiples cepas diferentes de C. difficile. La invención no se limita a composiciones que comprenden fragmentos únicamente de la cepa 630. Hay disponibles secuencias de varias cepas de C. difficile, incluyendo aquellas de C. difficile cepa R20291(SM), C. difficile cepa 196, C. difficile cepa BI1, C. difficile cepa BI/NAP1/027 (ribotipo 027), C. difficile cepa M120 y C. difficile cepa M68, cepa 855, cepa QCD-63q42, cepa ATCC43255. Pueden usarse técnicas de búsqueda y alineamiento convencionales para identificar en cualquier secuencia de genoma adicional el homólogo de cualquier secuencia de toxina particular procedente de la cepa 630 de C. difficile. Por ejemplo, en la cepa ATCC43255, cepa CIP107932, cepa QCD-23m63, cepa QCD-32g58, cepa QCD-37x79, cepa QCD-63q42, cepa QCD-66c26, cepa QCD-76w55, cepa QCD-97b34, cepa CD196, cepa CDBI1, cepa CDCF5, cepa CDSM, cepa CDM68, cepa CDM120 o cepa R20291. Además, las secuencias disponibles de la cepa 630 de C. difficile pueden usarse para diseñar cebadores para la amplificación de secuencias homólogas de otras cepas. Por lo tanto, la invención no se limita a polipéptidos de esta cepa, sino que abarca variantes y homólogos de otras cepas de C. difficile, así como variantes no naturales. En general, las variantes adecuadas de una SEQ ID NO particular incluye sus variantes alélicas, sus formas polimórficas, sus homólogos, sus ortólogos, sus parálogos, sus mutantes, etc.
Por lo tanto, por ejemplo, los polipéptidos usados con la invención pueden incluir, en comparación con la secuencia de referencia de la cepa 630, una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas (es decir, sustituciones de un aminoácido por otro aminoácido que tenga una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos codificados genéticamente se dividen generalmente en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican en ocasiones conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante en la actividad biológica. Los polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) eliminaciones de aminoácidos individuales en relación con las secuencias de la cepa 630. Los polipéptidos también pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1,2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con las secuencias de TcdA y/o TcdB.
De forma similar, un polipéptido usado con la invención puede comprender una secuencia de aminoácidos que:
(a) es idéntica (es decir, un 100 % idéntica) a una secuencia desvelada en el listado de secuencias;
(b) comparte identidad de secuencia (por ejemplo, un 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con una secuencia desvelada en el listado de secuencias;
(c) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones de aminoácidos individuales (eliminaciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación con las secuencias de (a) o (b); y
(d) cuando se alinea con una secuencia particular del listado de secuencias usando un algoritmo de alineamiento por pares, cada ventana en movimiento de x aminoácidos del extremo N-terminal al extremo C-terminal (de tal forma que para un alineamiento que se extiende hasta p aminoácidos, siendo p>x, hay p-x+1 ventanas de este tipo) tiene al menos xy aminoácidos idénticos alineados, donde: x se selecciona entre 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona entre 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si x y no es un número entero, se redondea al alza al número entero más próximo. El algoritmo de alineamiento por pares preferido es el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch [46], usando parámetros por defecto (por ejemplo con una penalización por apertura de hueco = 10,0, y con una penalización por extensión de hueco = 0,5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [47].
En general, cuando un polipéptido de la invención comprende una secuencia que no es idéntica a una secuencia completa de C. difficile del listado de secuencia (por ejemplo, cuando comprende un listado de secuencia con <100 % de identidad de secuencia con la misma o cuando comprende un fragmento de la misma) se prefiere en cada caso individual que el polipéptido pueda generar un anticuerpo que reconozca su toxina respectiva (ya sea TcdA o TcdB), preferentemente, la secuencia de C. difficile proporcionada en el listado de secuencias.
En los casos en los que se usan polipéptidos híbridos, los antígenos individuales dentro del híbrido (es decir, restos -X- individuales) pueden ser de una o más cepas. Cuando n=2, por ejemplo, X2 puede ser de la misma cepa que X1 o de una cepa diferente. Cuando n=3, las cepas pueden ser (i) X1=X2=X3 (ii) X1=X2^X3 (iii) X#X2=X3 (iv) X#X2^X3 o (v) X1=X3*X2, etc.
Dentro del grupo (c), las eliminaciones o sustituciones pueden encontrarse en el extremo N-terminal y/o el extremo C-terminal o puede encontrarse entre los dos extremos. Por lo tanto, un truncamiento es un ejemplo de una eliminación. Los truncamientos pueden implicar la eliminación de hasta 40 (o más) aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal.
Composiciones inmunogénicas y medicamentos
El término "inmunogénico", en el contexto de un antígeno descrito en el presente documento, se usa para indicar que el antígeno es capaz de desencadenar una respuesta inmunitaria, tal como una respuesta mediada por células y/o de anticuerpos, contra la proteína de C. difficile de tipo silvestre de la que procede, por ejemplo, cuando se usa para inmunizar a un sujeto (preferentemente, un mamífero, más preferentemente, un ser humano o un ratón).
Una composición inmunogénica de la invención comprende un antígeno de acuerdo con la invención. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser o bien profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas. La expresión "protegido contra la infección" significa que el sistema inmunitario de un sujeto se ha cebado (por ejemplo, mediante vacunación) para desencadenar una respuesta inmunitaria y repeler la infección. Por lo tanto, un sujeto vacunado puede infectarse, pero tiene una mayor capacidad para repeler la infección que un sujeto de control.
Por lo tanto, las composiciones pueden ser farmacéuticamente aceptables. Normalmente incluirán componentes además de los antígenos, por ejemplo, incluirán típicamente uno o más vehículos o excipientes farmacéuticos. Hay disponible una descripción exhaustiva de dichos componentes en [48].
Las composiciones se administrarán generalmente a un mamífero en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, la composiciones puede haberse encontrado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se fabrican en forma acuosa, después se rellenan y se distribuyen y administran también en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento de uso. Por lo tanto, una composición de la invención puede estar seca, tal como una formulación liofilizada.
La composición puede incluir conservantes, tales como timerosal o 2-fenoxietanol. Se prefiere, sin embargo, que la vacuna se encuentre sustancialmente libre (es decir, que tenga menos de 5 pg/ml) de material mercurial, por ejemplo, libre de timerosal. Se prefieren especialmente las vacunas que no contienen mercurio. Se prefieren particularmente las vacunas sin conservantes.
Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector frente a la temperatura. Se proporcionan detalles adicionales de dichos agentes más adelante.
Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente a entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 10+2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, fosfato disódico deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.
Las composiciones tendrán generalmente una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente, entre 240-360 mOsm/kg y más preferentemente, se encontrará en el intervalo de 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón fosfato; un tampón Tris; un tampón borato; un tampón succinato; un tampón de histidina (en particular, con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón citrato. Los tampones se incluirán normalmente en el intervalo de 5-20 mM. El pH de una composición será por lo general de entre 5,0 y 8,1 y más típicamente, de entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, entre 6,5 y 7,5 o entre 7,0 y 7,8.
La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente apirógena que contiene, por ejemplo, <1 UE (unidad de endotoxina, una medida estándar) por dosis y preferentemente, <0,1 UE por dosis. La composición está preferentemente libre de gluten.
La composición puede incluir material para una sola inmunización o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un kit "multidosis"). En las disposiciones multidosis, se prefiere la inclusión de un conservante. Como alternativa (o además) de incluir un conservante en las composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tenga un adaptador aséptico para la extracción de material.
Las vacunas para humanos se administran normalmente en un volumen de dosis de aproximadamente 0,5 ml, aunque puede administrarse media dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) a niños.
Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, descrito con más detalle más adelante.
Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación:
• sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio, incluyendo hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) y sulfatos, etc. [por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la ref. 49];
• emulsiones de aceite en agua, tales como emulsiones de escualeno-agua, incluyendo MF59 (escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 %, formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador) [Capítulo 10 de la ref. 49, véanse también las ref. 50-53, el capítulo 10 de la ref. 54 y el capítulo 12 de la ref. 55], adyuvante completo de Freund (CFA) y adyuvante incompleto de Freund (IFA);
• formulaciones de saponina [capítulo 22 de la ref. 49], tales como QS21 [56] e ISCOM [capítulo 23 de la ref. 49];
• virosomas y partículas pseudovíricas (VLP) [57-63];
• derivados bacterianos o microbianos, tales como derivados no tóxicos del lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados de Lípido A [64, 65], oligonucleótidos inmunoestimuladores [66-71], tales como IC-31 ™ [72] (desoxinucleótido que comprende la secuencia de 26-mero 5’-(IC) 13 -3' (SEQ ID NO: 28) y polímero de polipéptido policatiónico que comprende la secuencia de aminoácidos de 11-mero KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO: 29)) y toxinas ribosilantes de ADP y derivados detoxificados de las mismas [73 - 82];
• inmunomoduladores humanos, incluyendo citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [83, 84], interferones (por ejemplo, interferón-Y), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral;
• bioadhesivos y mucoadhesivos, tales como quitosano y derivados de los mismos, microesferas de ácido hialurónico esterificado [85] o mucoadhesivos, tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa [86];
• micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 pm de diámetro, más preferentemente, de ~200 nm a ~30 pm de diámetro y lo más preferentemente, de ~500 nm a ~10 pm de diámetro) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.);
• liposomas [capítulos 13 y 14 de [49, 87-89];
• éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [90];
• formulaciones de PCPP [91 y 92];
• polipéptidos de muramilo, incluyendo N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-1-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil-1-alanil-d-isoglutaminil-1-alanina-2-(1’-2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE); y
• compuestos de imidazoquinolona, incluyendo Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M") [93 y 94].
Las composiciones inmunogénicas y las vacunas de la invención también pueden comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, pueden usarse las siguientes composiciones adyuvantes en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [95]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) y un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) [96]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IL-12 (opcionalmente un esterol) [97]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [98]; (6) SAF, que contiene escualano al 10 %, Tween 80™ al 0,4 %, polímero de bloque pluronic L121 al 5 % y thr-MDP, ya esté microfluidizado en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula. (7) sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y estructura de pared celular (CWS), preferentemente MPL CWS (Detox™); y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).
Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se desvelan en el capítulo 7 de [49].
Se prefiere particularmente el uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio y los antígenos normalmente se adsorben a estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones adyuvantes preferidas incluyen combinaciones de los adyuvantes Th1 y Th2, tales como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Puede usarse una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL (se ha comunicado que esta es eficaz en la inmunización neumocócica [99]).
Las composiciones de la invención pueden desencadenar una respuesta inmunitaria mediada por células, así como una respuesta inmunitaria humoral. Preferentemente, esta respuesta inmunitaria inducirá anticuerpos de larga duración (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada por células que puede responder rápidamente tras la exposición a C. difficile.
Se cree que generalmente son necesarios dos tipos de linfocitos T, células CD4 y CD8, para iniciar y/o potenciar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Los linfocitos T CD8 pueden expresar un correceptor de CD8 y se citan comúnmente como linfocitos T citotóxicos (CTL). Los linfocitos T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos presentados en moléculas de la clase I del MHC.
Los linfocitos T CD4 pueden expresar un correceptor de CD4 y se citan comúnmente como linfocitos T colaboradores. Los linfocitos T CD4 son capaces de reconocer polipéptidos antigénicos unidos a moléculas de la clase II del MHC. Tras la interacción con una molécula de clase II del MHC, las células CD4 pueden secretar factores, tales como citocinas. Estas citocinas secretadas pueden activar a linfocitos B, linfocitos T citotóxicos, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T colaboradores o las células CD4+ pueden dividirse adicionalmente en dos subconjuntos funcionalmente distintos: los fenotipos TH1 y TH2, que difieren en su función efectora y de citocinas.
Las células TH1 activadas potencian la inmunidad celular (incluyendo un aumento en la producción de CTL específicos de antígeno) y por lo tanto, son particularmente valiosos en la respuesta a infecciones intracelulares. Las células TH1 pueden secretar uno o más de IL-2, IFN-y y TNF-p. Una respuesta inmunitaria TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales mediante la activación de macrófagos, células NK (citolíticas naturales) y linfocitos T citotóxicos CD8 (CTL). Una respuesta inmunitaria TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria mediante la estimulación del crecimiento de linfocitos B y T con IL-12. Los linfocitos B estimulados por TH1 pueden secretar IgG2a.
Las células TH2 activadas potencian la producción de anticuerpos y por lo tanto, son valiosos para responder a infecciones extracelulares. Las células t H2 pueden secretar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10. Una respuesta inmunitaria TH2 puede dar como resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para la protección futura.
Una respuesta inmunitaria potenciada puede incluir uno o más de una respuesta inmunitaria TH1 potenciada y una respuesta inmunitaria TH2.
Una respuesta inmunitaria TH1 puede incluir uno o más de un aumento en los CTL, un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH1 (tal como IL-2, IFN-y y TNF-p), un aumento en los macrófagos activados, un aumento en la actividad de NK o un aumento en la producción de IgG2a. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH1 potenciada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.
Puede desencadenarse una respuesta inmunitaria TH1 usando un adyuvante de TH1. Por lo general, un adyuvante de TH1 provocará niveles aumentados de producción de IgG2a en relación con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH1 adecuados para su uso en la invención pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de saponina, virosomas y partículas pseudovíricas, derivados no tóxicos del lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), oligonucleótidos inmunoestimulantes. Son adyuvantes de TH1 preferidos para su uso en la invención los oligonucleótidos inmunoestimulantes, tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG. Una respuesta inmunitaria TH2 puede incluir uno o más de un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH2 (tales como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10) o un aumento en la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH2 potenciada incluirá un aumento en la producción de IgG1.
Puede desencadenarse una respuesta inmunitaria TH2 usando un adyuvante de TH2. Por lo general, un adyuvante de TH2 provocará niveles aumentados de producción de IgG1 en relación con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite y toxinas ribosilantes de ADP y derivados detoxificados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales, tales como sales de aluminio, son adyuvantes de TH2 preferidos para su uso en la invención.
Preferentemente, la invención incluye una composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y un adyuvante de TH2. Preferentemente, dicha composición desencadena una respuesta TH1 y una respuesta TH2 potenciadas, es decir, un aumento en la producción tanto de IgG1 como de IgG2a en relación con la inmunización sin un adyuvante. Aún más preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y de TH2 provoca una respuesta inmunitaria de TH1 aumentada y/o una respuesta inmunitaria de TH2 aumentada en relación con la inmunización con un solo adyuvante (es decir, en relación con la inmunización solo con un adyuvante de TH1 o la inmunización solo con un adyuvante de TH2).
La respuesta inmunitaria puede ser uno o ambos de una respuesta inmunitaria TH1 y una respuesta TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria posibilita una o ambas de una respuesta TH1 mejorada y una respuesta TH2 mejorada.
La respuesta inmunitaria mejorada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y una mucosal. Preferentemente, la respuesta inmunitaria posibilita una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica mejorada y una mucosal mejorada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mucosal es una respuesta inmunitaria TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mucosal incluye un aumento en la producción de IgA.
Las composiciones de la invención pueden prepararse en varias formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada por pulverización). La composición puede prepararse para administración tópica, por ejemplo, en forma de pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para administración oral, por ejemplo, como un comprimido o una cápsula, una pulverización o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, en forma de un inhalador, usando un polvo fino o un spray. La composición puede prepararse en forma de un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para administración nasal, aural u ocular, por ejemplo, en forma de gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñada de tal forma que se reconstituye una composición combinada justo antes de su administración a un paciente. Dichos kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.
En los casos en los que se vaya a preparar una composición de manera extemporánea antes de su uso (por ejemplo, cuando se presenta un componente en forma liofilizada) y se presenta en forma de kit, el kit puede comprender dos viales o puede comprender una jeringuilla precargada y un vial, usándose los contenidos de la jeringuilla para reactivar el contenido del vial antes de la inyección.
Las composiciones inmunogénicas usadas como vacuna comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno o antígenos, así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz" se entiende que la administración de esta cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo del estado de salud y físico del individuo que se vaya a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo que se vaya a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del médico tratante y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre dentro de un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos rutinarios. En los casos en los que se incluye más de un antígeno en una composición, pueden estar presentes dos antígenos a dosis iguales entre sí o a diferentes dosis.
Como se ha mencionado anteriormente, una composición puede incluir un agente protector frente a la temperatura y este componente puede ser particularmente útil en las composiciones adyuvadas (en particular, aquellas que contienen un adyuvante mineral, tal como una sal de aluminio). Como se describe en la referencia 100, puede añadirse un agente protector contra la temperatura líquido a una composición de vacuna acuosa para reducir su punto de congelación, por ejemplo, para reducir el punto de congelación por debajo de 0 °C. Por lo tanto, la composición puede almacenarse a menos de 0 °C, pero por encima de su punto de congelación, para inhibir la desintegración térmica. El agente protector contra la temperatura también permite congelar la composición a la vez que impide la aglomeración de los adyuvantes de sales minerales tras la congelación y descongelación y también pueden proteger a la composición a temperaturas elevadas, por ejemplo, por encima de 40 °C. Pueden mezclarse una vacuna acuosa de partida y el agente protector contra la temperatura líquido de tal forma que el agente protector contra la temperatura líquido forma un 1-80 % en volumen de la mezcla final. Los agentes protectores contra la temperatura adecuados han de ser seguros para su administración a seres humanos, fácilmente miscibles/solubles en agua y no han de dañar otros componentes (por ejemplo, antígeno y adyuvante) en la composición. Los ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol y/o polietilenglicol (PEG). Los PEG adecuados pueden tener un peso molecular medio en el intervalo de 200-20.000 Da. En una realización preferida, el polietilenglicol puede tener un peso molecular medio de aproximadamente 300 Da ("PEG-300").
Las composiciones de la invención pueden formarse mezclando (i) una composición acuosa que comprende dos o más (por ejemplo, 2, 3 o 4) antígenos de las combinaciones de antígenos de la invención con (ii) un agente protector contra la temperatura. Después, puede almacenarse la mezcla, por ejemplo, a menos de 0 °C, a 0-20 °C, a 20­ 35 °C, a 35-55 °C o más. Puede almacenarse en forma líquida o congelada. La mezcla puede estar liofilizada. Como alternativa, la composición puede formarse mezclando (i) una composición desecada que comprende dos o más (por ejemplo, 2, 3 o 4) antígenos de las combinaciones de antígenos de la invención, con (ii) una composición líquida que comprende el agente protector contra la temperatura. Por lo tanto, puede usarse el componente (ii) para reconstituir el componente (i).
Procedimientos de tratamiento y administración de la vacuna
La divulgación también proporciona un procedimiento para provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición de la divulgación.
La divulgación también proporciona una composición inmunogénica que comprende una combinación de antígenos de Clostridium difficile, comprendiendo dicha combinación a) un antígeno ToxB-GT y un antígeno TcdA (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más fragmentos polipeptídicos de TcdA); y/o b) antígeno ToxA-GT y un antígeno TcdB (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más fragmentos polipeptídicos de TcdB) para su uso como medicamento, por ejemplo, para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un mamífero. Las composiciones inmunogénicas particulares comprenden una combinación de antígenos de Clostridium difficile, comprendiendo dicha combinación (i) antígeno ToxB-GT y antígeno ToxA-P5-6 o (ii) antígeno ToxB-GT y antígeno ToxA-B2 para su uso como medicamento, por ejemplo, para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un mamífero.
La divulgación también proporciona una composición inmunogénica que comprende una combinación de antígenos de Clostridium difficile, comprendiendo dicha combinación a) un antígeno ToxB-GT y un antígeno TcdA (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más fragmentos polipeptídicos de TcdA); y/o b) un antígeno ToxA-GT y un antígeno TcdB (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más fragmentos polipeptídicos de TcdB) en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Las composiciones inmunogénicas particulares comprenden una combinación de antígenos de Clostridium difficile, comprendiendo dicha combinación (i) antígeno ToxB-GT y antígeno ToxA-P5-6 o (ii) antígeno ToxB-GT y antígeno ToxA-B2 en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero.
La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferentemente, implica inmunidad mediada por anticuerpos y/o células. El procedimiento puede generar una respuesta reforzadora.
Al generar una respuesta inmunitaria en el mamífero mediante estos usos y procedimientos, puede protegerse al mamífero contra la infección por C. difficile. Más particularmente, puede protegerse al mamífero contra la EACD, incluyendo uno o más de diarrea, diarrea asociada con antibióticos (DAA), dolor abdominal, fiebre, leucocitosis, colitis pseudomembranosa o megacolon tóxico. Las composiciones de la divulgación son eficaces contra C. difficile de diversos serotipos diferentes. Las composiciones de la divulgación pueden ser útiles para proteger contra la EACD causada por las cepas de C. difficile 630, B1, B1/NAP1/027 (ribotipo 027), R20291(SM), 196, BI1, M120 M68, 855, QCD-63q42, ATCC43255, CIP107932, QCD-23m63, QCD-32g58, QCD-37x79, QCD-63q42, QCD-66c26, QCD-76w55, QCD-97b34, CD196, CDBI1, CDCF5, CDSM, CDM68, CDM120 o R20291 etc.
La divulgación también proporciona un kit que comprende un primer componente y un segundo componente, en la que ni el primer componente ni el segundo componente es una composición de la divulgación como se ha descrito anteriormente, pero en la que el primer componente y el segundo componente pueden combinarse para proporcionar una composición de la divulgación como se ha descrito anteriormente. El kit puede incluir adicionalmente un tercer componente que comprende uno o más de lo siguiente: instrucciones, jeringuilla u otro dispositivo de suministro, adyuvante o solución de formulación farmacéuticamente aceptable.
La divulgación también proporciona un dispositivo de suministro precargado con una composición inmunogénica de la divulgación.
El mamífero es preferentemente un ser humano, un animal veterinario grande (por ejemplo, caballos, ganado bovino, ciervos, cabras, cerdos) y/o una mascota doméstica (por ejemplo, perros, gatos, gerbos, hámsteres, cobayas, chinchillas). Más preferentemente, el mamífero es preferentemente un ser humano. Las composiciones inmunogénicas de acuerdo con la divulgación pueden usarse para tratar tanto a niños como a adultos. Por lo tanto, un paciente humano puede ser menor de 1 año, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad o al menos 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, >50 años de edad, >60 años de edad y preferentemente, >65 años), los jóvenes (por ejemplo, <5 años de edad), pacientes hospitalizados, los trabajadores de la salud, servicio armado y personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicos o pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos y pueden usarse de manera más general en una población.
Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica monitorizar la infección por C. difficile tras la administración de las composiciones de la divulgación. Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica monitorizar las respuestas inmunitarias, por vía sistémica (tal como monitorizando el nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y/o por vía mucosa (tal como monitorizando el nivel de producción de IgA), contra los antígenos en las composiciones de la divulgación tras la administración de la composición. Normalmente, las respuestas séricas de anticuerpos específicos de antígeno se determinan después de la inmunización pero antes de la exposición, mientras que las respuestas mucosales específicas de antígeno se determinan después de la inmunización y después de la exposición.
Otra forma de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente divulgación es expresar las proteínas de manera recombinante para la exploración de los sueros o las secreciones mucosas de pacientes mediante inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha desarrollado una respuesta inmunitaria contra la proteína en cuestión. Este procedimiento también puede usarse para identificar antígenos inmunodeficientes y/o epítopos dentro de los antígenos.
También puede determinarse la eficacia de las composiciones de vacuna in vivo exponiendo a modelos animales a la infección por C. difficile, por ejemplo, hámsteres, cobayas o ratones, con las composiciones de vacuna. En el presente documento se describe un modelo de este tipo.
Normalmente, las composiciones de la divulgación se administrarán directamente a un paciente. Puede lograrse el suministro directo mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o al espacio intersticial de un tejido) o por vía mucosa, tal como mediante administración rectal, oral (por ejemplo, en comprimido o spray), vaginal, tópica o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración mucosa.
La divulgación puede usarse para generar inmunidad sistémica y/o mucosal, preferentemente, para desencadenar una inmunidad sistémica y/o mucosal mejorada.
Preferentemente, la inmunidad sistémica y/o mucosal mejorada se refleja por una respuesta inmunitaria TH1 y/o TH2 mejorada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mejorada incluye un aumento en la producción de IgG1 y/o IgG2a y/o IgA.
La dosificación puede ser una pauta en una sola dosis o una pauta en múltiples dosis. Pueden usarse múltiples dosis en una pauta de inmunización primaria y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. En una pauta multidosis, las diversas dosis pueden administrarse por vías iguales o diferentes, por ejemplo, un cebado parenteral y un refuerzo mucosal, un cebado mucosal y un refuerzo parenteral, etc. Normalmente se administrarán múltiples dosis espaciadas por 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).
Las vacunas producidas mediante la divulgación pueden administrarse a pacientes sustancialmente al mismo tiempo (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional sanitario o centro de vacunación) que otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna para la neumonía, una vacuna contra el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la rubéola, una vacuna contra MMR, una vacuna contra la varicela, una vacuna contra MMRV, una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tétanos, una vacuna contra la tosferina, una vacuna contra DTP, una vacuna conjugada contra H.influenzae de tipo b, una vacuna contra poliovirus inactivada, una vacuna contra el virus de la hepatitis B, una vacuna conjugada meningocócica (tal como una vacuna tetravalente A-C-W135-Y), una vacuna contra el virus sincitial respiratorio, etc.
Inmunización mucosal
La invención proporciona una composición inmunogénica que comprende (i) un polipéptido que comprende ToxB-GT y uno o más fragmentos polipeptídicos de TcdA (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o más fragmentos polipeptídicos de TcdA) y/o un polipéptido que comprende ToxA-GT y uno o más fragmentos polipeptídicos de TcdB (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más fragmentos polipeptídicos de TcdB) y (ii) una toxina ADP ribosilante bacteriana y/o un derivado detoxificado de la misma. La invención también proporciona un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de dicha composición inmunogénica al mamífero.
Componentes antigénicos adicionales de las composiciones de la invención
La invención también proporciona composiciones que comprenden además un antígeno de C. difficile adicional. Los antígenos de C. difficile adicionales incluyen, por ejemplo, antígenos sacáridos. Los antígenos sacáridos pueden conjugarse con péptidos de la invención usando técnicas de conjugación convencionales conocidas en la técnica. Un antígeno sacárido preferido para su uso en composiciones de la invención es el polisacárido II de la pared celular (citado en el presente documento como "PS-N"), que se cree que es un antígeno de superficie conservado de C. difficile. La estructura de la unidad de repetición de PS-II se describe en [101]:
[^6)-p-D-Glcp-(1^3)-p-D-GalpNAc-(1^ 4)-a-D-Glcp-(1^ 4)-[p-D-Glcp-(1^3]-p-D-GalpNAc-(1^ 3)-a-D-Manp-(1^P] Por ejemplo, puede conjugarse químicamente un polipéptido descrito anteriormente (tal como ToxB-GT) a, por ejemplo, PS-II.
La invención también proporciona composiciones que comprenden además un antígeno que no es un antígeno de C. difficile.
En particular, la invención también proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención y uno o más de los siguientes antígenos adicionales:
- un antígeno sacárido de N.meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y (preferentemente los cuatro).
- un antígeno sacárido y/o polipeptídico de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, 102, 103, 104].
- un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 105, 106].
- un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o core [por ejemplo, 106, 107]. - un antígeno de difteria, tal como un toxoide diftérico [por ejemplo, el capítulo 3 de la ref. 108] o el mutante CRM197 [por ejemplo, 109].
- un antígeno del tétanos, tal como un toxoide tetánico [por ejemplo, capítulo 4 de la ref. 108].
- un antígeno de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina de tosferínica (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo. las ref. 110 y 111].
- un antígeno sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, 112].
- antígenos de la polio [por ejemplo, 113, 114], tal como IPV.
- antígenos del sarampión, las paperas y/o la rubéola [por ejemplo, capítulos 9, 10 y 11 de la ref. 108].
- antígenos de la gripe [por ejemplo, capítulo 19 de la ref. 108], tales como las proteínas de superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa.
- un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 115].
- un antígeno proteico de Streptococcus agalactiae (grupo B de Streptococcus) [por ejemplo, 116, 117].
- un antígeno sacárido de Streptococcus agalactiae (grupo B de Streptococcus).
- un antígeno de Streptococcus pyogenes (grupo A de Streptococcus) [por ejemplo, 117, 118, 119].
- un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 120].
La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales.
Los antígenos de proteínas tóxicas pueden detoxificarse en caso necesario (por ejemplo, detoxificación de toxina tosferínica por medios químicos y/o genéticos [111]).
En los casos en los que se incluye un antígeno de difteria en la composición, se prefiere incluir también un antígeno del tétanos y antígenos de la tos ferina. De forma similar, en los casos en los que se incluye un antígeno del tétanos, se prefiere incluir también antígenos de tos ferina. De forma similar, en los casos en los que se incluye un antígeno de tos ferina, se prefiere incluir también antígenos de difteria y tétanos. Por lo tanto, se prefieren las combinaciones de DTP.
Los antígenos sacáridos se encuentran preferentemente en forma de conjugados. Las proteínas transportadoras para los conjugados incluyen toxina diftérica, toxina tetánica, la proteína de membrana externa de N.meningitidis [121], polipéptidos sintéticos [122, 123], proteínas de choque térmico [124, 125], proteínas de tos ferina [126, 127], proteína D de H.influenzae [128], citocinas [129], linfocinas [129], proteínas estreptocócicas, hormonas [129], factores de crecimiento [129], toxina A o B de C.difficile [130], proteínas de captación de hierro [131], etc. Una proteína transportadora preferida es el mutante CRM197 de la toxina diftérica [132].
Los antígenos en la composición estarán normalmente presentes a una concentración de al menos 1 pg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para generar una respuesta inmunitaria contra ese antígeno.
Como alternativa al uso de proteínas antigénicas en las composiciones inmunogénicas de la invención, puede usarse ácido nucleico (preferentemente, ADN, por ejemplo, en forma de un plásmido) que codifica el antígeno. Los antígenos se adsorben preferentemente a una sal de aluminio.
Anticuerpos
Pueden usarse anticuerpos contra TcdA y TcdB de C. difficile para inmunización pasiva [por ejemplo, 133, 134, 135, 136, 137, 138 y 139]. Por lo tanto, la invención proporciona combinaciones de anticuerpos correspondientes a y específicos para, las combinaciones de antígenos de la invención como se desvela en el presente documento. Preferentemente, la composición comprende un anticuerpo que es específico para un antígeno ToxB-GT y/o un epítopo del mismo y un anticuerpo que es específico para un antígeno TcdA y/o un epítopo del mismo; y/o un anticuerpo que es específico para un antígeno ToxA-GT y/o un epítopo del mismo y un anticuerpo que es específico para un antígeno TcdB y/o un epítopo del mismo. Se proporcionan combinaciones de anticuerpos de acuerdo con la invención para su administración simultánea, por separado o secuencial. La invención también proporciona composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos. En el presente documento, en el contexto de la invención, el término "anticuerpo" o "anticuerpos" comprende las combinaciones de anticuerpos dela invención. La invención también proporciona composiciones que comprenden combinaciones de anticuerpos de la invención.
La divulgación también proporciona el uso de anticuerpos de la invención en medicina y en terapia, por ejemplo, para inmunización pasiva contra la EACD. La divulgación también proporciona un procedimiento para tratar a un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de dicha composición. Como se ha descrito anteriormente para composiciones inmunogénicas, estos procedimientos y usos permiten que un mamífero esté protegido contra la EACD. En particular, los anticuerpos de la divulgación pueden usarse en procedimientos para tratar o prevenir infecciones por C. difficile, que comprenden la etapa de administrar al mamífero una cantidad eficaz de una combinación de anticuerpos como se describe en el presente documento o una composición que comprende dicha combinación. En estos procedimientos, lo al menos dos (por ejemplo, 2, 3 o 4) anticuerpos de la invención pueden administrarse de manera simultánea, por separado o secuencial.
El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como fragmentos de las mismas que son capaces de unirse a un antígeno. Estas incluyen moléculas de anticuerpo híbridas (quiméricas) [140, 141]; fragmentos F(ab')2 y F(ab) y moléculas Fv; heterodímeros no covalentes [142, 143]; moléculas de Fv monocatenarias (sFv) [144]; construcciones de fragmentos de anticuerpo diméricas y triméricas; minibodies [145, 146]; moléculas de anticuerpo humanizadas [147-149]; y cualquier fragmento funcional obtenido de dichas moléculas, así como anticuerpos obtenidos mediante procedimientos no convencionales, tales como presentación en fagos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los procedimientos para obtener anticuerpos monoclonales se conocen bien en la técnica. Se prefieren anticuerpos humanizados o completamente humanos. Los anticuerpos y las combinaciones de anticuerpos de la invención pueden estar purificadas o aisladas.
La divulgación también proporciona un procedimiento para preparar una mezcla de una combinación de anticuerpos de la divulgación, comprendiendo dicho procedimiento una etapa de mezclar anticuerpos de cualquiera de las combinaciones de anticuerpos como se han definido anteriormente. Por ejemplo, la invención proporciona un procedimiento que comprende una etapa de mezclar al menos dos (es decir, 2, 3 o 4) anticuerpos seleccionados entre: (a) un anticuerpo que reconoce un antígeno ToxA-GT y/o un epítopo del mismo y un anticuerpo que reconoce un antígeno TcdB y/o un epítopo del mismo. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender una etapa de mezclar un anticuerpo que reconoce un antígeno ToxA-GT y/o un epítopo del mismo y un anticuerpo que reconoce un antígeno TcdB y/o un epítopo del mismo.
La divulgación también proporciona un procedimiento que comprende una etapa de mezclar al menos dos (es decir, 2, 3 o 4) anticuerpos seleccionados entre: (a) un anticuerpo que reconoce un antígeno ToxB-GT y/o un epítopo del mismo y un anticuerpo que reconoce un antígeno TcdA y/o un epítopo del mismo. Por ejemplo, el procedimiento puede comprender una etapa de mezclar un anticuerpo que reconoce un antígeno ToxB-GT y/o un epítopo del mismo y un anticuerpo que reconoce un antígeno TcdA y/o un epítopo del mismo. Un procedimiento de acuerdo con la divulgación para preparar una mezcla de anticuerpos puede comprender una etapa adicional de formular la mezcla como un medicamento. Dichos procedimientos pueden comprender además una etapa de envasar la formulación para su almacenamiento o distribución como un medicamento.
General
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de las capacidades de la técnica. Dichas técnicas se explican detalladamente en las referencias. Véanse, por ejemplo, [150-157, etc.].
En los casos en los que la invención se refiera a un "epítopo", este epítopo puede ser un epítopo de linfocitos B y/o un epítopo de linfocitos T. Dichos epítopos pueden identificarse empíricamente (por ejemplo, usando PEPSCAn [158, 159] o procedimientos similares) o pueden predecirse (por ejemplo, usando el índice antigénico de Jameson-Wolf [160], estrategias basadas en matriz [161], MAPITOPE [162], TEPITOPE [163, 164], redes neurales [165], OptiMer y EpiMer [166, 167], ADEPT [168], Tsites [169], hidrofilia [170], índice antigénico [171] o los procedimientos desvelados en [172-176, etc.]. Los epítopos son partes de un antígeno que son reconocidos por y se unen a los sitios de unión a antígeno de anticuerpos o receptores de linfocito T y también pueden citarse como "determinantes antigénicos".
El término "antígeno" y la expresión "secuencia de aminoácidos", en el sentido en que se usan en el presente documento, deben interpretarse como inclusivos de la referencia a cada una de las secuencias anteriores, así como a sus fragmentos, homólogos, derivados y variantes. El término "toxina" se refiere a una sustancia venenosa, especialmente una proteína, que se produce por células u organismos vivos y es capaz de provocar una enfermedad cuando se introduce en los tejidos de un sujeto y normalmente es capaz de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes o antitoxinas en un sujeto. El término "toxoide" se refiere a una toxina o un fragmento de la misma que se ha sometido a "detoxificación" o a "toxoidación" (por ejemplo, por medios recombinantes, mediante modificación química, etc.) pero ha conservado su capacidad para combinarse con o inducir la producción de anticuerpos anti­ toxina, por ejemplo, cuando se administra a un sujeto. La expresión "título neutralizante" se refiere a una composición que comprende "péptidos neutralizantes" o "anticuerpos neutralizantes" que inhiben o neutralizan el efecto biológico de un cuerpo infeccioso (por ejemplo, una toxina).
En los casos en los que se omita un "dominio" del antígeno, esto puede implicar la omisión de un polipéptido de señal, de un dominio citoplasmático, de un dominio transmembrana, de un dominio extracelular, etc.
La expresión "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
La expresión "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".
La expresión "que consiste esencialmente en" significa que la composición, el procedimiento o la estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, el procedimiento o la estructura reivindicada.
El término "aproximadamente", en relación con un valor numérico x, significa, por ejemplo, x±10 %.
Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, el porcentaje de aminoácidos que son iguales al comparar las dos secuencias. Pueden determinarse este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia usando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. 177. Se determina un alineamiento preferido mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de hueco afín con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se desvela en la ref. 178.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Representación esquemática de los fragmentos de toxina recombinantes usados en este estudio. Todos los polipéptidos se expresaron en Escherichia coli, salvo ToxA_GT, que se expresó en Brevibacillus choshinensis. ED = dominio enzimático; GT = dominio de glucosil transferasa; CP = dominio de cisteína proteasa; T = dominio de translocación; B = dominio de unión. Todos los dominios son solubles, salvo los dominios T4 y PTA2 de TcdA, que son insolubles.
Figura 2. Se diseñó ToxA-B2 para que incluya 6 de las 13 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdA se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E).
Figura 3. Se diseñó ToxA-B3 para que incluya 12 de las 13 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdA se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E).
Figura 4. Se diseñó ToxA-B5 para que incluya 10,5 de las 13 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdA se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E).
Figura 5. Se diseñó ToxA-B6 para que incluya 11,5 de las 13 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdA se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E).
Figura 6. Se diseñó ToxB-B2 para que incluya 4 de las 9 supuestas unidades estructurales que forman el dominio de unión. La estructura tridimensional del dominio de unión de TcdB se ha predicho mediante modelado informático usando como molde la estructura cristalina del fragmento C-terminal (véase la referencia 41, código de PDB 2F6E).
Figura 7. Representación esquemática del híbrido B4. ToxB_GT (SEQ ID NO: 18) se fusiona a ToxA-P5-6 (SEQ ID NO: 11) mediante un enlazador peptídico (SEQ ID NO: 25).
Figura 8. Diagrama de flujo que resume la estrategia experimental usada para la identificación de fragmentos candidatos.
Figura 9. Media geométrica de títulos (GMT) de anticuerpos dirigidos contra subdominios de TcdA (A) y TcdB (B), determinada mediante ELISA.
Figura 10. Ejemplo de un experimento de neutralización in vitro que muestra el redondeado celular inducido por TcdA/B y la neutralización mediante suero contra ToxA_B2+ToxB-GT.
Figura 11. Representación esquemática de los fragmentos de dominios de toxina usados en estudios en hámsteres. ED = dominio enzimático; GT = dominio de glucosil transferasa; CP = dominio de cisteína proteasa; T = dominio de translocación; B = dominio de unión.
Figura 12. Toxoide A Toxoide B. Diseminación bacteriana media en heces. Expuestos a B1.
Figura 13. Toxoide A Toxoide B - Análisis después de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal -ubicación de las bacterias (el eje x es la ubicación: "Col" = colon; "Cae" = ciego; "LA" = asociado al lumen; "TA" = asociado a tejidos. el eje Y es el número de C. difficile (UFC/ml)).
Figura 14. ToxB_B P5_6 - Análisis después de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal -ubicación de las bacterias (el eje x es la ubicación: "Col" = colon; "Cae" = ciego; "LA" = asociado al lumen; "TA" = asociado a tejidos. el eje Y es el número de C. difficile (UFC/ml)).
Figura 15. Representación gráfica de los datos proporcionados en la figura 29.
Figura 16. Desprendimiento bacteriano de esporas de C. difficile en 100 mg de heces de hámsteres inmunizados con P5_6 ToxB_B o controles. Expuestos a la cepa B1.
Figura 17. P5_6 ToxB_B o controles. Expuestos a la cepa B1. Análisis después de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal - ubicación de las bacterias (el eje x es la ubicación: "Col" = colon; "Cae" = ciego; "LA" = asociado al lumen; "TA" = asociado a tejidos. el eje Y es el número de C. difficile (UFC/ml)).
Figura 18. Inmunización con ToxB_GT P5+6. Colonización en heces de animales vacunados (por hámster (panel superior) y de media (panel inferior)). Expuestos a la cepa 630.
Figura 19. ToxB_GT P5_6. Resultados de colonización terminal. Expuestos a la cepa 630.
Figura 20. ToxB_GT P5_6. Colonización en heces de animales vacunados con el paso del tiempo (días). Expuestos a la cepa B1.
Figura 21. ToxB_GT P5_6. Análisis de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal - ubicación de las bacterias (el eje x es la ubicación: "Col" = colon; "Cae" = ciego; "LA" = asociado al lumen; "TA" = asociado a tejidos. el eje Y es el número de C. difficile (UFC/ml)). Expuestos a la cepa B1.
Figura 22. ToxA-P5-6 ToxB_GT (dosis reducida). Colonización en heces de animales vacunados con el paso del tiempo (días). Expuestos a la cepa B1.
Figura 23. ToxA-P5-6 ToxB_GT (dosis reducida). Análisis de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal - ubicación de las bacterias (el eje x es la ubicación: "Col" = colon; "Cae" = ciego; "LA" = asociado al lumen; "TA" = asociado a tejidos. el eje Y es el número de C. difficile (UFC/ml)). Expuestos a la cepa B1.
Figura 24. Inmunización con ToxB_GT (PSII) P5_6. Colonización en heces de animales vacunados con el paso del tiempo (días). Expuestos a la cepa 630. Faltan algunos animales en puntos de tiempo específicos, por ejemplo, en los casos en los que el animal no produjo heces en el día de recogida (especialmente tras periodos de diarrea) o tenía diarrea en un punto de tiempo específico.
Figura 25. Número medio de C. difficile que se diseminan en heces de animales vacunados supervivientes (ToxB_GT(PSII) P5_6 (H1-H6) o ToxB_GT P5_6 (H7-8)).
Figura 26 (a y b). Resultados de ToxB_GT(PSII) P5_6 - Análisis de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal - ubicación de las bacterias (el eje x es la ubicación: "Col" = colon; "Cae" = ciego; "LA" = asociado al lumen; "TA" = asociado a tejidos. el eje Y es el número de C. difficile (UFC/ml)).
Figura 27. ToxB_GT ToxA_B2. Colonización en heces de animales vacunados con el paso del tiempo (días). Expuestos a la cepa B1.
Figura 28 (a y b). ToxB_GT ToxA_B2. Análisis de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal -ubicación de las bacterias (el eje x es la ubicación: "Col" = colon; "Cae" = ciego; "LA" = asociado al lumen; "TA" = asociado a tejidos. el eje Y es el número de C. difficile (UFC/ml)). Expuestos a la cepa B1.
Figura 29. ToxB_GT ToxB_B P5_6. Colonización media en heces de animales vacunados.
Figura 30. ToxB_GT ToxB_B P5_6. Expuestos a B1. Análisis después de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal - ubicación de las bacterias (el eje x es la ubicación: "Col" = colon; "Cae" = ciego; "LA" = asociado al lumen; "TA" = asociado a tejidos. el eje Y es el número de C. difficile (UFC/ml)).
Figura 31. ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 - Desprendimiento bacteriano medio de esporas de C. difficile en 100 mg de heces. Expuestos a B1.
Figura 32. ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 - colonización en el sacrificio. Expuestos a B1.
Figura 33. ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 (dosis más baja) - Desprendimiento bacteriano medio de esporas de C. difficile en 100 mg de heces. Expuestos a B1.
Figura 34. ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 (dosis más baja) - Análisis de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal - ubicación de las bacterias (el eje x es la ubicación: "Col" = colon; "Cae" = ciego; "LA" = asociado al lumen; "TA" = asociado a tejidos. el eje Y es el número de C. difficile (UFC/ml)). Expuestos a B1.
Figura 35. Cambios en la microflora tras el tratamiento con clindamicina.
Figura 36. Modificación de la microbiota en animales vacunado.
Figura 37. Gel de SDS-PAGE de fragmentos recombinantes purificados.
Figura 38. Títulos de IgG anti-ToxA (A) y ToxB (B) (UE/ml), adyuvada con alumbre o MF59. Respuesta de IgG tras la inmunización de ratones con fragmentos de ToxA (A) y ToxB (B). Se midieron los títulos de IgG anti-toxina A y toxina B mediante ELISA en sueros de ratones inmunizados por vía i.p. con cada fragmento con adyuvante de Al(OH)3 (columna de la izquierda en el par) o MF59 (columna de la derecha en el par). Los resultados se muestran como media geométrica ± DT en al menos tres experimentos.
Figura 39: Anticuerpos IgG contra toxina A (A) y toxina B (B) en muestras de ciego de hámsteres vacunados con ToxA-P5-6 ToxB-GT. Se llevaron a cabo transferencias por puntos en muestras de ciego filtradas tomadas de animales vacunados en la fase aguda de la infección (48 horas después de la exposición) (hámsteres 1 -2) y en el punto final experimental (14 días después de la exposición) (hámsteres 3-8). Se trató a los animales de control con solo adyuvante e infectados en las mismas condiciones experimentales (hámsteres 9-10).
Figura 40: Niveles de toxina A y B en hámsteres vacunados con la combinación ToxA-P5-6 ToxB-GT. Los valores son el múltiplo de dilución necesario para que se produzca redondeado celular. Se tomaron muestras de ciego filtradas en animales vacunados en la fase aguda de la infección (48 horas después de la exposición) y en el punto final experimental (14 días después de la exposición). Se trató a los animales de control con solo adyuvante e infectados en las mismas condiciones experimentales.
MODOS PARA LLEVAR A CABO LA INVENCIÓN
Los inventores identificaron fragmentos recombinantes de TcdA y TcdB que pueden usarse como inmunógenos para su uso en una vacuna para prevenir la EACD.
Fragmentos
En la figura 8 se proporciona una representación esquemática de la estrategia experimental. Los inventores diseñaron un panel de fragmentos basados en toxinas de TcdA y TcdB (11 fragmentos de TcdA y 6 fragmentos de TcdB). Los fragmentos basados en toxinas usados en este estudio se describen en la figura 1. Se seleccionaron estos fragmentos para abarcar en la medida de lo posible las longitudes completas de TcdA y TcdB y se determinaron los límites de estos fragmentos basándose en sus estructuras cristalinas. En el caso de dominios de unión a células de ToxA y ToxB (véase la figura 1 para un resumen), se emplearon modelos informáticos. Mediante el uso de técnicas recombinantes, es posible usar un sistema de expresión, por ejemplo, E. coli, Brevibacillus choshinensis, etc., para generar fragmentos de polipéptido y que sean más estables y resistentes a la degradación que los toxoides inactivados, así como también evitar muchos de los problemas de seguridad relativos al uso de toxoides inactivados. Los fragmentos usados en los ejemplos que comprendían ToxA-GT y ToxB-GT estaban detoxificados. En la figura 37 se muestra un gel de SDS-PAGE con tinción de Coomassie de los péptidos usados para la inmunización.
Clonación, expresión y purificación de los fragmentos de toxina recombinante
Se clonaron las secuencias en el vector pet15b+ (marcador HIS-N-terminal) usando el procedimiento de extensión de cebador incompleto de la polimerasa (PIPE). La PCR normal genera mezclas de productos de extensión incompletos. Usando un diseño de cebador simple, se introdujeron secuencias solapantes cortas en los extremos de estas mezclas de extensión incompletas que permiten la hibridación de las hebras complementarias y la producción de combinaciones de vector híbrido/inserto. Todos los híbridos se transformaron directamente en células receptoras E. coli HK100. Se seleccionaron las colonias individuales resistentes a ampicilina y se comprobó la presencia del plásmido recombinante mediante PCR de colonias. Se transformaron células E. coli BL21(DE3) competentes con los plásmidos purificados de clones positivos (ToxA_GT se expresó en Brevibacillus choshinensis). El antígeno ToxA-p5-6 se expresó en forma de un polipéptido híbrido que comprendía la secuencia de aminoácidos N-terminal de SEQ ID NO: 104 y la secuencia de aminoácidos C-terminal de SEQ ID NO: 105. La secuencia de aminoácidos de este polipéptido híbrido se muestra en la SEQ ID NO: 111. SEQ ID NO: 111 está codificada por la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 112.
Se empleó el procedimiento PIPE para generar mutantes de ToxA-GT (Y283A, D285A, D287A), TcdA-CP (D589A, H655A y C700A, numeradas en relación con la SEQ ID NO: 1), ToxB-GT (D270A, R273A, Y284A, D286A y D288A) y ToxB-CP (D587A, H653A y C698A) con su actividad enzimática suprimida.
La expresión de proteína se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM (p-D-1-tiogalactopiranósido de isopropilo) al cultivo durante la fase de crecimiento exponencial, seguido de incubación durante 4 horas a 25 °C. Los extractos celulares se cargaron en geles de SDS-PAGE para comprobar la expresión de proteína (datos no mostrados).
Para ToxA_GT, se clonó el dominio catalítico (restos 1-541) de la toxina A de TS de C. difficile en el vector pNI-His (Takara Bio). Se llevó a cabo mutagénesis de sitio dirigido para obtener el mutante de ToxA-GT (Y283A D285A, D287A). El plásmido se electroporó en B. choshinensis, cepa HPD31-SP3 (Takara Bio). Las células de expresión de B. choshinensis se cultivaron en TMNm a 25 °C, 1600 rpm durante 48 horas. La proteína se purificó mediante cromatografía IMAC y después, se intercambió el tampón en PBS usando una columna de desalado PD-10 (GE). La cuantificación de la proteína se llevó a cabo mediante ensayo BCA.
Para algunos experimentos, se conjugó PSII a dos diferentes proteínas transportadoras (proteínas recombinantes de C. difficile: ToxA_B2 y ToxB_GT) después de la modificación química del azúcar de manosa de la unidad de repetición en el extremo reductor. La primera etapa fue la reducción del azúcar de manosa con NaBH4 50 mM (Sigma) en tampón NaPi 10 mM, pH 9,0 a temperatura ambiente durante 2 horas; la PSII reducida se purificó mediante cromatografía Sephadex G25 (G&E Healthcare) en agua y después se oxidó con 15 equivalentes de NaIO4 (Sigma) en tampón NaPi 10 mM, pH 7,2 a temperatura ambiente durante 2 horas en la oscuridad. Después, se purificó la PSII oxidada mediante cromatografía Sephadex G25 (G&E Healthcare) en agua. La PSII oxidada (10 mg/ml) se conjugó posteriormente a proteínas transportadoras usando una estequiometría de 4:1 (peso de PSII por peso de proteína) en tampón de NaPi 200 mM/NaCl 1M, pH 8,0 y en presencia de NaBH3CN (2:1, peso de PSII por peso de NaBH3CN). La mezcla se incubó durante 48-72 horas a 37 °C, mezclando muy cuidadosamente con un agitador magnético. Los conjugados se purificaron del exceso de PSII no conjugada usando cromatografía de exclusión por tamaños Superdex 75 (G&E Healthcare) en tampón NaPi 10 mM/NaCl 10 mM, pH 7,2. Los conjugados se caracterizaron mediante SDS-PAGE usando geles de Tris-acetato al 7 % (NuPAGE, de Invitrogen) en tampón de ejecución de SDS NuPAGE de Tris-acetato (20x, Invitrogen). Se determinó la concentración de proteína mediante el kit de ensayo de proteínas MicroBCA (Thermo Scientific). La concentración total de sacárido se determinó mediante análisis HPAEC-PAD. El sacárido no conjugado se separó mediante una columna de interacción hidrófoba SPE C4 (0,5 ml de resina, Bioselect, Grace Vydac) y posteriormente se estimó mediante análisis HPAEC-PAD.
Purificación e inactivación de toxoide A y toxoide B
Se inocularon soluciones madre de esporas de C. difficile cepa VPI 10463 en placas de BHIS (infusión de cerebro y corazón, complementada con extracto de levadura [5 mg/ml] y L-cisteína [0,1 %]) y se incubaron a 36 °C durante 2 días. Se añadieron colonias de la placa preparada al medio de triptona-extracto de levadura-manitol (TYM) y se incubaron durante 16 horas a 35 °C en una cámara anaerobia. Se añadieron 200 pl de glicerol al 90 % junto con 800 pl del cultivo de C. difficile (1 DO a 590 nm) al vial criogénico de 1 ml. El vial se colocó inmediatamente en un congelador a -80 °C para su almacenamiento. Se añadieron 100 pl de solución madre de glicerol a 10 ml de medio TYM y se incubó durante 16 horas a 35 °C en una cámara anaerobia. Se inoculó cada 1 litro de medio de triptonaextracto de levadura (TY) con cultivo de siembra (dilución 1/100). El cultivo se incubó a 35 °C durante 5 días en una cámara anaerobia. Después, se centrifugaron las muestras a 3000 g durante 15 minutos a 4 °C y se filtraron a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 pm. Después, se concentró el sobrenadante mediante filtración de flujo tangencial.
Fracción I: AS50
Se añadieron 80,03 g de sulfato de amonio a sobrenadante de cultivo concentrado 6 x de la cepa VPI 10463 en medio de triptona-extracto de levadura (265 ml) a lo largo de 2 h a 0 °C (saturación del 50 %). Se continuó agitando durante 3 h a 0 °C, después se sedimentó el precipitado por centrifugación a 10000 rpm, durante 30 minutos a 4 °C. El sedimento se resuspendió en tampón A y se dializó a 4 °C frente a dos cargas de tampón (A: Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM; B: Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 1 M) (2 x 11) proporcionando un volumen final de 27 ml (Fracción I) conc. de 6,118 mg/ml, mini BCA.
Fracción II: HiTrap Q HP, pH 7,5
Se separaron ToxA y ToxB mediante cromatografía en columnas HiTrap Q HP de 2 x 5 ml, conectadas en serie. Se aplicó un gradiente lineal de B al 0-100 % con 30 VC, 2 ml/min. ToxA eluye con aproximadamente un 20 % de B, ToxB con aproximadamente un 50 % de B (datos no mostrados). Se analizaron 20 pl de las fracciones I, 4, 14-44 en geles de pAa al 7 % en tampón de Tris-acetato (datos no mostrados).
Fracción IIIb: HiTrap Q HP, pH 5,0
Se purificó adicionalmente ToxB (Fracción IIb) mediante cromatografía en HiTrap Q HP a pH 5,0. El tampón incluía C: piperazina-HCl 20 mM, pH 5,0, NaCl 50 mM; D, piperazina-HCl 20 mM, pH 5,0, NaCl 1 M. Se aplicó un gradiente segmentado, 30-60 % de D, 15 VC. ToxB eluye con un 40 % de D (datos no mostrados). Se analizaron 10 pl de cada fracción en un gel de PAA al 7 % en tampón de Tris-acetato (datos no mostrados).
Fracción IlIb: HiTrap Q HP, pH 7,5
Se aplicó B con 30 VC, 2 ml/min a un gradiente segmentado del 2-20 %. ToxA eluye con aproximadamente un 15 % de B. Se analizaron 20 pl de cada fracción en un gel de PAA al 7 % en tampón de Tris-acetato (datos no mostrados). El grupo se dializó contra Tris-HCl 2150 mM, NaCl 50 mM, 4 °C durante una noche. Volumen final: 52 ml (Fracción Illa).
Se llevó a cabo un control de calidad final.
Para las transferencias de Western, se cargaron las preparaciones en un gen de SDS-PAA de Tris-acetato al 7 % y se transfirieron a nitrocelulosa usando la máquina I-Blot (12 min de transferencia). Las membranas se lavaron 3 x en TBST y se bloquearon durante una noche con BSA al 1 % (Promega) en TBST. Se añadieron anticuerpos primarios a 1:5000 durante 1 h en TBST. Las membranas se lavaron 3 veces en TBST durante 5 min. Se añadió anticuerpo secundario (conjugado de anti-conejo AP de Promega) a 1:8000 en TBST durante 45 min. La transferencia se lavó tres veces en TBST y dos veces durante 5 min en agua MilliQ. Se revelaron las transferencias durante 20 s en sustrato AP estabilizado (Promega) (datos no mostrados).
Se comprobó que las preparaciones de ToxA y ToxB se encontraban completamente libres de contaminación cruzada.
Para almacenamiento permanente, se llevó a cabo una diálisis. El tampón de diálisis comprendía Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM y glicerol al 10 %. Las muestras se dializaron contra 2 cargas de 500 ml de tampón. Las muestras se cuantificaron después de la diálisis (datos no mostrados).
Detoxificación de los toxoides
Las preparaciones se dializaron contra PBS. Tris puede reaccionar con formaldehído. Partiendo de 1,5 mg de cada proteína (ToxA: 1,5 mg correspondía a 9,375 ml (9,7 ml) y ToxB: 1,5 mg correspondía a 4,411 ml (4,5 ml)). Las muestras se dializaron cada una contra 1 l de PBS, 40 h, 4 °C. ToxA se dializó durante 4 h contra PEG 20.000 al 20 % en PBS. El volumen se redujo a 3,7 ml.
Formilación de ToxA y ToxB
El PM de ToxA y B: es de aproximadamente 300 kDa. Las preparaciones incluyeron 0,25 mg/ml de ToxA y 0,35 mg/ml de ToxB. La solución madre de lisina comprendía lisina HCl 1 M en PBS. Los resúmenes se incluyen en la tabla 1 (a y b) a continuación:
Figure imgf000036_0001
Tabla 1(a). Resumen de la formulación de Toxoide A
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Tabla 1(b). Resumen de la formulación de Toxoide B
Tras 120 h a 37 °C en un agitador orbital, se extrajo 1 ml de cada uno y se dializó contra 2 x 500 ml de PBS durante 2 x 24 h. Se confirmó que las muestras estaban activadas usando un ensayo de toxicidad basado en células (datos no mostrados).
Inmunización de ratones
Después, se usaron los fragmentos para inmunizar ratones, para determinar si los fragmentos eran inmunogénicos. Para cada antígeno, se usaron dos grupos de 8 ratones CD1 hembra. Cada grupo se inmunizó con 10 ug de antígeno, formulados en adyuvante de alumbre (grupo 1) o adyuvante de Freund. Las inmunizaciones se llevaron a cabo por vía intraperitoneal en los días 0, 21 y 35. La exanguinación y el sacrificio final se llevaron a cabo en el día 49. Después, se determinó la respuesta total de anticuerpos con fragmentos de toxina mediante ELISA. Se recubrieron placas de microtitulación con TcdA y TcdB y se incubaron con anticuerpos contra los fragmentos, seguido de anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina. Tras la adición del sustrato, (fosfato de pnitrofenilo o pNPP), se analizaron las placas mediante un lector de placas a una longitud de onda dual de 405/620-650 nm. Los títulos de anticuerpo se cuantificaron mediante interpolación frente a una curva patrón de referencia.
Los estudios de ELISA que muestran las respuestas de anticuerpo totales de los ratones inmunizados con fragmentos de toxina se muestran en la figura 9. De forma interesante, el fragmento ToxB-GT fue igual de inmunogénico que el dominio TcdB-ED de longitud completa. Con la excepción de ToxA-CP, todos los fragmentos de toxina son inmunogénicos. Las respuestas de IgG (adyuvadas con alumbre o MF59.) se muestran en la figura 38.
Ensayo de neutralización del redondeado celular in vitro
El ensayo de neutralización in vitro se basa en la evidencia de que las toxinas de C. difficile desestabilizan el citoesqueleto de actina, provocando un efecto citopático con un redondeado celular típico. Los anticuerpos anti­ toxina pueden neutralizar la citotoxicidad, previniendo de este modo el redondeado celular. Por lo tanto, se usaron antisueros para evaluar la capacidad de los fragmentos para neutralizar los efectos tóxicos de TcdA y TcdB in vitro. Se cultivaron fibroblastos humanos (IMR-90) hasta un 80-90 % de confluencia. Cada línea celular tiene una sensibilidad a las toxinas diferente y por tanto, se determinaron las dosis mínimas de TcdA y TcdB necesarias para provocar un 100 % de redondeado celular en 24 horas (CTU100). Se determinó que la CTU100 era de 20 ng/ml para TcdA y de 10 pg/ml para TcdB. Se preincubaron diluciones de factor dos de sueros de 1:8 a 1:32.000 con 1 CTU100 de cada toxina durante 90 min a 37 °C. Después, se añadieron mezclas de suero más toxinas a las células, seguido de observación tras 16-18 horas. Los títulos de punto final representan la recíproca de la dilución máxima capaz de inhibir el redondeado celular. Los controles positivos fueron sueros a-toxoide A y B y los controles negativos fueron sueros preinmunes y los sueros de ratones tratados solo con adyuvante.
Resultados
Los títulos de neutralización se resumen en las tablas 2 y 3 y en la figura 10 se muestran los resultados de un experimento de neutralización típico. Se observó que los fragmentos solubles del dominio de unión de ToxA inducían anticuerpos neutralizantes fuertes, independientemente de si estaban adyuvadas con MF59 o alumbre. Los fragmentos insolubles, ToxA-PTA2, ToxA-CP y ToxA-T4 no indujeron anticuerpos neutralizantes. ToxA-CP (que no se identificó como inmunogénico) tampoco indujo anticuerpos neutralizantes. Los sueros generados contra ToxA no neutralizaron ToxB de manera cruzada (tabla 2).
Figure imgf000037_0001
Tabla 2. Títulos de neutralización de sueros generados contra subdominios de TcdA (las diferencias en repeticiones experimentales se anotan mediante "/").
Figure imgf000037_0002
Figure imgf000038_0001
Tabla 3. Títulos de neutralización de sueros generados contra subdominios de TcdB. * indica un 50 % de neutralización (las diferencias en repeticiones experimentales se anotan mediante "/").
ToxB-B, ToxB-ED y ToxB-GT indujeron una débil respuesta de anticuerpos neutralizantes, que eran similares cuando se adyuvaron con MF59 o alumbre. Por el contrario, Tox-B2, ToxB-B7, ToxB-CP no indujeron anticuerpos neutralizantes. Los sueros generados contra ToxB no neutralizaron ToxA de manera cruzada (tabla 3).
Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos contra TcdA no son capaces de neutralizar TcdB de manera cruzada y viceversa.
Los estudios de inmunización de ratones (anteriores) y los resultados obtenidos del ensayo de redondeado celular in vitro sugieren de manera colectiva que la región N-terminal del ED de TcdA y/o TcdB (es decir, el dominio GT) es inmunogénico e importante para generar anticuerpos neutralizantes contra su respectiva toxina. Además, la respuesta de anticuerpos neutralizantes inducida mediante el fragmento ToxB-GT (y también el fragmento ToxB-ED, que comprende la secuencia de ToxB-GT) fue igual, o incluso mejor, que la respuesta de anticuerpos neutralizantes obtenida usando la mayoría del dominio de unión de TcdB (es decir, el fragmento ToxB-B).
La prueba de toxicidad también se llevó a cabo para confirmar si las mutaciones D270A, Y284A, D286A y D288A en ToxB-GT produjeron una reducción de la toxicidad, en comparación con la toxina B nativa de longitud completa. Se probó un intervalo de 10 concentraciones que variaban de 20 ng/ml a 40 ug/ml usando el protocolo de ensayo indicado anteriormente. Los fibroblastos incubados con ToxB-GT mutado no mostraron alteraciones morfológicas a las concentraciones ensayadas, mientras que la toxina B nativa de longitud completa provocó redondeado celular a 10 pg/ml en las mismas condiciones experimentales (datos no mostrados). Por lo tanto, las mutaciones D270A, Y284A, D286A y D288A produjeron una pérdida de toxicidad en las condiciones experimentales ensayadas.
Combinaciones de fragmentos
Para determinar si es posible obtener sueros capaces de inducir una neutralización concomitante tanto de la toxina A como de la toxina B, los inventores combinaron los fragmentos de toxina más prometedores. Los títulos de neutralización de los sueros contra las combinaciones de toxinas se resumen en la tabla 4.
Tabla 4. Títulos de neutralización de sueros generados contra combinaciones de subdominios individuales de TcdA y TcdB. (las diferencias en repeticiones experimentales se anotan mediante "/").
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Los inventores descubrieron que los anticuerpos dirigidos contra varias de las combinaciones ensayadas son capaces de neutralizar de manera cruzada TcdB y viceversa. Por el contrario, las combinaciones de P5_6 ToxB-B2, ToxA_B2 ToxB-B7, ToxA_B3 ToxB_B2 y ToxA_B6 ToxB-B7 no presentaron neutralización cruzada. ToxA-P5_6+ToxB-B y ToxA-B2+ToxB-GT surgieron como las combinaciones de fragmentos más prometedoras, destacando adicionalmente la capacidad de ToxB-GT para sustituir funcionalmente la región ToxB-GT.
De forma interesante, todas las combinaciones que comprendían ToxB-GT fueron capaces de inducir títulos de neutralización contra la Toxina A y la Toxina B y sus combinaciones así como las combinaciones equivalentes que comprendían la mayoría del dominio de unión de TcdB (es decir, ToxB-B).
Proteínas quiméricas
Los inventores diseñaron proteínas quiméricas que combinan diferentes dominios de TcdA y TcdB en un solo polipéptido (resumidas en la tabla 5). En "B1", ToxB-ED se encuentra en N-terminal de ToxA-P5-6; en "B1 pequeña", ToxB-CP se encuentra en N-terminal de ToxA-P5-6; y en "B4", ToxB-GT se encuentra en N-terminal de ToxA-P5-6. Se llevaron a cabo estudios de neutralización in vitro usando estas quimeras en las mismas condiciones experimentales que para los fragmentos. Los resultados se resumen en la tabla 5. Tres proteínas quiméricas que contenían el fragmento p5_6 fusionado a los dominios enzimáticos de TcdB inducen sueros capaces de neutralizar TcdA pero no TcdB. De forma interesante, la actividad neutralizante de ToxA inducida por p5_6 es variable entre las tres quimeras de p5_6. Esto se debe probablemente a cambios en el plegamiento y/o la inmunogenicidad. De forma similar, la quimera B4, que contiene fragmentos de dominios de unión de TcdA y TcdB indujeron anticuerpos con una actividad neutralizante eficaz contra TcdA pero no contra TcdB (tabla 5).
Tabla 5. Títulos de neutralización de sueros generados contra proteínas quiméricas.
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Estos datos sugieren que las composiciones que comprenden una combinación de a) un polipéptido que comprende ToxB-GT y uno o más fragmentos de polipéptido de TcdA o b) un polipéptido que comprende ToxA-GT y uno o más fragmentos de polipéptido de TcdB tienen un mejor rendimiento que los polipéptidos quiméricos que comprenden secuencias de ToxA y ToxB.
Pruebas de eficacia en hámsteres
Los estudios de inmunización en hámsteres normalmente implican 10 hámsteres sirios dorados. Dentro de cada grupo, se inmunizó a 6 hámsteres por vía intraperitoneal (i.p.) con cuatro dosis de antígeno (50 ug de cada antígeno formulado en adyuvante MF59) en los días 1, 14, 28 y 36. Siempre se incluyeron dos animales no tratados y dos vacunados con solo adyuvante MF59 como controles negativos. En el día 60, se trató a todos los hámsteres con clindamicina (30 mg/kg de peso corporal del hámster) para retirar la flora comensal intestinal. Después de 12 horas, se expuso a los ratones por sonda oral a aproximadamente 250 esporas de C. difficile. Se monitorizó la temperatura corporal y la presencia de síntomas clínicos, tales como diarrea, durante 14 días tras la exposición. Una caída de temperatura corporal por debajo de 35 °C se consideró como el punto humano final del experimento, momento en el cual, se sacrificó al animal. La temperatura corporal se midió telemétricamente usando un chip insertado en la cavidad corporal de los animales 3 semanas antes de la infección. La tabla 6 muestra el tiempo tras la infección con la cepa B1 o 630 antes de que la temperatura corporal cayese 2 °C (se evaluaron 5 hámsteres por cepa de C. difficile).
Tabla 6. Tiempo desde la infección con la cepa B1 o la cepa 630 hasta una pérdida de temperatura corporal de 2 °C.
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Los análisis después de la infección implicaron la confirmación de que los hámsteres se habían infectado específicamente con la cepa de la infección (usando análisis de repetición en tándem variable de múltiples locus (MVLA), basándose en los patrones de bandas de 7 regiones repetidas), así como en los recuentos bacterianos en las heces y el intestino.
Se observó que la infección no interfería con la respuesta inmunitaria anti-toxina, ya que una muestra de suero de animales vacunados con mutantes de ToxA-B2 ToxA-GT ToxB-B3 ToxB-GT, recogida antes de la exposición, mostró títulos de neutralización comparables con los medidos después de la exposición (datos no mostrados). También se llevaron análisis de colonización terminal en los hámsteres vacunados y de control. Los animales de control se sacrificaron en el día 2 (después de la exposición) cuando se alcanzó el punto final de temperatura corporal de 35 °C. Se sacrificó a los animales vacunados en el día 15 (después de la exposición, al final del experimento). Se extrajeron los intestinos y se determinaron los recuentos bacterianos en las bacterias recuperadas. Para enumerar la carga bacteriana total (esporas y células vegetativas), se abrió longitudinalmente cada sección y se retiraron los contenidos mediante un lavado suave en dos cargas de 10 ml de PBS. Los tejidos se homogeneizaron en 5 ml de PBS durante 1 min usando un Stomacher y se determinaron para los homogeneizados los recuentos viables. Se colocaron diluciones seriadas de factor 10 en placas CCFA de sangre-agar que contenían 20 g/ml de anfotericina B para suprimir el crecimiento de levaduras. Para estimar los números de esporas presentes en las muestras, se calentaron las muestras durante 10 min a 56 °C y se determinaron los números de esporas presentes mediante el procedimiento de recuento de viables como se ha descrito anteriormente. Los organismos no asociados íntimamente con la mucosa se describen en el presente documento como "asociados al lumen" (LA). Los organismos más íntimamente asociados (es decir, no retirados por un simple lavado) se describen en el presente documento como "asociados a tejido" (TA).
También se llevaron a cabo evaluaciones del contenido de toxina en el intestino. Los lavados intestinales se filtraron a través de un filtro de 0,22 pm para retirar las células bacterianas. Después, se colocaron los lavados filtrados en células Vero confluentes a concentraciones decrecientes de factor 10 (de factor 5 para el colon) durante 24 horas. Después de la incubación, se lavaron las células, se fijaron y después se colorearon con tinción de Giemsa. En caso de haber toxina presente, el redondeado celular provocó desprendimiento y ausencia de color. Los datos de contenido de toxinas representan las diluciones a las que las células permanecieron unidas (teñidas).
Después, se probó una serie de fragmentos de dominio de toxina en un modelo de hámster. Los detalles de los fragmentos ensayados se proporcionan en la figura 11. Los detalles de combinaciones de antígenos y un resumen de los resultados obtenidos se proporcionan en la tabla 7. Se describen con más detalle más adelante los resultados de cada ensayo.
Tabla 7. Resumen de los experimentos de vacunación de hámsteres. 1 = debido a problemas técnicos, hubo un volumen aumentado y un mayor número de esporas medido.
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Se usaron dos cepas diferentes de C. difficile en estos estudios, a saber, la cepa 630 (la secuencia genómica se encuentra disponible al público en el NCBI) y la cepa B1. Se sabe que la cepa 630 provoca una infección prolongada, con una patología menos severa y cantidades reducidas de toxina in vivo. Se sabe que la cepa B1 provoca una patología grave en hámsteres (G. Douce, comunicación personal), con una infección aguda y un alto grao de daños.
Toxoide A Toxoide B
Como control positivo, se usó una combinación de toxoide A y toxoide B inactivado de longitud completa. Se puede considerar que esta combinación representa un "patrón de oro" contra el que pueden compararse las combinaciones de la invención (véanse las referencias 179 y 180). Los toxoides se produjeron usando fermentación, después se purificaron y finalmente se inactivaron.
6 animales recibieron 5 pg de cada toxoide (adyuvado con MF59). 2 recibieron solo adyuvante y dos se dejaron sin tratar. La cantidad a administrar se seleccionó basándose en las referencias bibliográficas. El principal problema con el uso de toxoides inactivados (por ejemplo, usando formaldehído) es que la inactivación podría estar incompleta, lo que representa un potencial riesgo para la salud cuando se aplica a un sujeto.
Se expuso a los animales a la cepa B1. Todos los animales de control murieron y un animal vacunado (H1) murió poco después del último animal de control, mostrando perfiles de temperatura corporal similares a los controles (datos no mostrados). Todos los demás hámsteres vacunados sobrevivieron hasta el final del experimento (tabla 8).
Tabla 8. Resultados para la exposición a Toxoide A Toxoide B inactivado de longitud completa con B1.
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Los hámsteres H2, H3 y H4 mostraron un breve episodio de diarrea durante la recuperación y H5 mostró un periodo de diarrea y letargia más largo. A H5 se le administró terapia de rehidratación (administración subcutánea de suero salino) que provocó otro episodio de diarrea, seguido de recuperación. Por lo tanto, se observó que la inmunización con toxoides de longitud completa protegía a un 83 % de los hámsteres contra la cepa B1.
Un análisis del desprendimiento bacteriano reveló que se desprenden UFC de los animales vacunados durante varios días (5, 9 y 11) tras la exposición, incluso habiendo desaparecido los síntomas (diarrea). H5 se encontraba deshidratado, por lo que fue difícil detectar heces en el día 5, por lo que el desprendimiento se analizó únicamente tras los días 9 y 11. H4 no tenía C. difficile detectable en las heces tras 11 días (figura 12), aunque este animal seguía colonizado en el intestino al final del experimento. En la figura 13 se proporciona un análisis de la colonización en el sacrificio.
La evaluación del contenido de toxina B en el intestino reveló que hay menos toxina B presente en el intestino de los hámsteres supervivientes después de 15 días, en comparación con los controles, que murieron tras 2 días (tabla 9). Este resultado también se confirmó en el colon (tabla 10). H1 es el hámster vacunado que murió durante la fase aguda de la infección y tiene un alto nivel de toxina B presente, que es equivalente al nivel de toxina B presente en los animales de control, que murieron.
Tabla 9. Toxoide A Toxoide B - contenido de toxina en el intestino cecal. Expuestos a B1. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas.
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Tabla 10. Toxoide A Toxoide B - contenido de toxina en el colon. Expuestos a B1. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas.
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En general, la vacunación con 5 pg de toxoide A de longitud completa y toxoide B de longitud completa dio como resultado protección en 5 de 6 animales contra la enfermedad grave. Sin embargo, la vacunación no protegió frente a la diarrea, en el caso de H5, tuvo una duración relativamente prolongada. Al final del experimento, fueron detectables menores cantidades de esporas en los animales vacunados y tres animales también mostraron niveles más bajos de colonización. Asimismo, se detectaron cantidades muy bajas de toxina B en los animales vacunados al final del experimento, aunque seguían colonizados. Esto se pudo explicar, por ejemplo, por la unión de anticuerpos a las toxinas y/o una reducción en la expresión de toxina bacteriana.
Fragmentos individuales de ToxA-P5_6 o ToxB_B
En primer lugar, se llevaron a cabo ensayos de vacunación usando fragmentos recombinantes usando fragmentos individuales de P5_6 o ToxB_B correspondientes a porciones del dominio de unión a células de TcdA y TcdB, respectivamente (50 ug de antígeno adyuvados con MF59). En ambos casos, no se observó protección frente a la exposición con aproximadamente 100 esporas de la cepa B1 (datos no mostrados). Se tomaron muestras de sangre de todos los animales en el punto final del experimento. Todos los animales inmunizados con ToxA-P5_6 tienen altos títulos de anticuerpo contra la proteína p5-6 y la toxina A, determinados mediante ELISA (datos no mostrados), pero estos anticuerpos no fueron protectores contra la infección. No se evaluó la capacidad neutralizante de la toxina A. Todos los animales inmunizados con ToxB_B tienen altos títulos de anticuerpo contra la proteína ToxB_B, determinados mediante ELISA (datos no mostrados). No había una cantidad suficiente de toxina B purificada para evaluar la reactogenicidad de estos sueros contra Toxina B completa. Estos anticuerpos no fueron protectores contra la infección y no se evaluó la capacidad neutralizante de la toxina B. Por lo tanto, los antígenos individuales no parecen protectores, a pesar de la presencia de anticuerpos.
Mezcla de fragmentos de P5_6 y ToxB B
Después, se inmunizó a los hámsteres con una mezcla de 50 pg de P5_6 y 50 pg de ToxB:B (50 ug de cada antígeno adyuvado con MF59), seguido de la exposición a la cepa 630 (resultados mostrados en la tabla 11).
Tabla 11. Inmunización de hámsteres con P5_6 más ToxB_B. Exposición a la cepa 630. * = hámsteres que muestran diarrea intermitente con recuperación. La cepa de exposición fue 630.
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Los animales vacunados estaban totalmente protegidos frente a la muerte, pero los supervivientes mostraron diarrea leve durante la recuperación. Los análisis después de la infección se muestran en la tabla 12 y la figura 14. La tabla 12 muestra que la cantidad de C. difficile en la materia fecal de los ratones vacunados sigue siendo elevada durante hasta una semana, lo que indica que la respuesta anti-toxina no tiene impacto en la colonización.
Tabla 12. ToxB_B P5_6 - Análisis después de la infección de C. difficile recuperado en materia fecal. * = ND = no había bacterias detectables.
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Sin embargo, los recuentos bacterianos se redujeron con el paso del tiempo y pueden eliminarse completamente a los 14 días tras la infección. La figura 14 muestra la ubicación de las bacterias y muestra que, en el punto final del experimento, los controles tienen mayores niveles de bacterias asociadas a lumen y tejido que los hámsteres vacunados. Se confirmó que las bacterias recuperadas después de la infección eran de C. difficile, cepa 630 mediante MVLA (datos no mostrados).
La combinación de P5_6 y ToxB-B proporciona, por lo tanto, una fuerte protección contra la exposición a C. difficile. De forma interesante, la respuesta anti-toxina no parece tener un impacto significativo en la colonización, debido a que todos los animales mantienen una fuerte colonización, por ejemplo, a los 6 días después de la exposición. Estos datos también sugieren que es necesaria para la protección una combinación de (al menos fragmentos de) ToxA y ToxB.
P5_6 y ToxB_B
En vista de la exitosa inmunización contra la cepa 630, los inventores probaron si la inmunización con P5_6 ToxB_B protege contra la cepa más toxigénica, B1. Se inmunizó a 6 animales con 50 ug de cada antígeno (adyuvados con MF59), seguido de exposición a 103 esporas de la cepa B1. Como controles, 2 animales recibieron solo adyuvante (H7-H8) y 2 animales no recibieron vacunación (H9-H10). Después de la exposición, todos los animales de control murieron. Un animal vacunado (H1) murió poco después del último animal de control. Todos los demás animales vacunados (H2 - H6) sobrevivieron hasta el final del experimento. (Tabla 13) Esta muestra que el 83 % de los animales vacunados con P5/6 ToxB_B estaban protegidos contra la exposición a la cepa B1 (también representado por la figura 15).
Tabla 13. Resultados de P5_6 ToxB_B. Expuestos a la cepa B1.
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H10 Control
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33,64 °C
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Después, se determinó el número de colonias por 100 mg de materia fecal (figura 16). Esto reveló que los organismos se desprenden en altos números durante varios días tras la exposición, incluso habiendo desaparecido los síntomas (diarrea). De forma interesante, los números desprendidos de hecho aumentaron durante aproximadamente 5 días después de la infección, antes de reducirse. En el día 1 después de la infección, solo 1 de los 6 animales vacunados seguían desprendiendo C. difficile detectable en sus heces. En el día 3, todos los animales vacunados supervivientes desprendían números relativamente bajos de C. difficile. Estos animales desprendieron niveles elevados hasta el día 11. En el día 15, solo 3 de los 5 animales seguían desprendiendo C. difficile detectable en sus heces (límite de detección de aproximadamente 200 esporas).
También se llevó a cabo un análisis de la colonización en el sacrificio (figura 17). Los hámsteres 4 y 5 mostraron altos niveles de flora contaminante en la placa, lo que oscureció cualquier espora de C. difficile presente (estos fueron también los 2 animales en los que no se pudo recuperar C. difficile de las heces en el día 11).
La evaluación del contenido de toxina B en el intestino reveló que hay poca cantidad o nada de toxina B presente en el intestino de los hámsteres supervivientes después de 15 días, en comparación con los controles, que murieron después de 2 días (tabla 14). H1 es el hámster vacunado que murió durante la fase aguda de la infección y tiene un alto nivel de toxina presente, que es equivalente al nivel de toxina presente en los animales de control, que murieron. Hay menos toxina B presente en el colon que en el ciego en los animales, que murieron durante la fase aguda de la infección.
Tabla 14. P5_6 ToxB_B o controles. Expuestos a la cepa B1. Contenido de toxina en el intestino (ciego y colon).
Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas.
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ToxB_B + P5_6 + PSII
Se inmunizó a los animales con una mezcla de ToxB B P5_6 PSII-CRM, en la que se conjuga el polisacárido a la proteína transportadora CRM. Se llevaron a cabo estudios de protección, junto con un análisis de las heces y una evaluación del contenido de toxina en el intestino.
Toxoide A + ToxB_B
Después, los inventores comprobaron si el uso de fragmentos del dominio de unión de TcdA afectó a la protección proporcionada por el uso de Toxoide A de longitud completa. Se observó que la inmunización con una mezcla de toxoide A de longitud completa (inactivado) y ToxB-B (5 ug de toxoide A y 50 ug de ToxB_B adyuvados con MF59) protegía contra la exposición a la cepa 630 y también la cepa B1. Los animales no vacunados expuestos a la cepa 630 tuvieron una fuerte diarrea y una caída de la temperatura, punto en el cual fueron sacrificados (tabla 15). Por el contrario, los animales inmunizados sobrevivieron a la exposición con la cepa 630 y solo uno de los animales vacunados presentó una diarrea tan solo mínima. Los animales mostraron diarrea leve con recuperación.
Tabla 15. Resultados de Toxoide A Toxina B_B. Exposición a 630. Uno de los animales tuvo una diarrea muy limitada (*). Los animales no vacunados tuvieron una fuerte diarrea y caída de la temperatura.
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Los animales no vacunados expuestos a la cepa B1 también tuvieron una fuerte diarrea y una caída de la temperatura, punto en el cual también fueron sacrificados (tabla 16). Los animales inmunizados sobrevivieron a la exposición, con dos de ellos padeciendo diarrea leve durante la recuperación. Por lo tanto, la inmunización con una mezcla de Toxoide A y Toxoide B_B protegió frente a la muerte después de la exposición con la cepa B1, pero no protegió contra la diarrea (tabla 16).
Tabla 16. Resultados de Toxoide A Toxina B_B. Expuestos a B1. Recuperación leve con diarrea (*); fuerte diarrea y caída de la temperatura (**). Los animales vacunados están protegidos frente a la muerte, pero no a la caída de temperatura.
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Com binaciones adicionales
Como se ha analizado anteriormente, los inventores determinaron que los fragmentos que comprenden el dominio GT eran inmunogénicos y capaces de inducir títulos de neutralización contra su toxina respectiva. Para comprobar si los fragmentos que comprendían el dominio GT eran capaces de conferir protección contra la EACD, los inventores probaron una serie de combinaciones adicionales usando las cepas de exposición 630 y B1 (resumidas en la tabla 7).
Tox_B_GT + P5_6 (630)
En primer lugar, los inventores comprobaron si la inmunización con una mezcla de ToxB_GT y ToxA-P5_6 (adyuvada con MF59) protegía contra la exposición con la cepa 630. Se observó que ToxA-P5_6 en combinación con el fragmento ToxB-B confería un 100 % de protección contra la exposición a la cepa 630. En este experimento, ninguno de los animales vacunados mostró diarrea cuando se les expuso a 630 y no se observaron síntomas clínicos (tabla 17). Los animales no vacunados (hámster n.° 9) expuestos a la cepa 630 tuvieron una fuerte diarrea y una caída de la temperatura, punto en el cual fueron sacrificados.
Tabla 17. Resultados de ToxB_GT P5+6. Exposición a 630. Ninguno de los animales vacunados padeció diarrea.
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Después, se determinó el número de colonias por cada 100 mg de materia fecal (figura 18), lo que demuestra que los organismos se desprenden en altos números durante varios días tras la exposición, incluso habiendo desaparecido los síntomas (diarrea).
La evaluación de la colonización terminal también reveló que todos los animales vacunados mostraron un número mucho menor de UFC y una menor proporción de esporas en comparación con los controles. No hubo esporas de C. diffícile detectables en los hámsteres n.° 4 y n.° 5 (datos no mostrados) y el hámster n.° 2 mostró una reducción de diez veces en la colonización terminal, en comparación con otros hámsteres vacunados (figura 19).
La evaluación del contenido de toxina B en el intestino reveló que hay menos toxina B presente en los hámsteres vacunados tras 15 días que en los controles, que murieron después de 2 días (tabla 18). Este resultado también se confirmó en el colon (tabla 19).
Tabla 18. ToxB_GT P5_6 - contenido de toxina en el intestino cecal. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a la cepa 630.
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Tabla 19. ToxB_GT P5_6 - contenido de toxina en el colon. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a la cepa 630.
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Por lo tanto, la inmunización con una mezcla de ToxB_GT y ToxA-P5_6 proporciona una fuerte protección contra la exposición a la cepa 630, que es igual de buena que el uso del fragmento de ToxB-B en combinación con ToxA-P5_6.
Tox_B_GT + P5_6 (B1)
En vista de la exitosa inmunización contra la cepa 630, los inventores probaron si la inmunización con P5_6 ToxB_GT protege contra la cepa B1. Se inmunizó a los animales (H1-H6) con una mezcla de ToxB_GT P5_6 (50 ug de cada antígeno, adyuvada con MF59). Los controles (solo adyuvante) tuvieron una fuerte diarrea y una caída de temperatura, punto en el cual fueron sacrificados. Todos los animales inmunizados sobrevivieron frente a la exposición a la cepa B1 (6/6) (tabla 20), mostrando un solo episodio de diarrea. Esta es la primera vez que se ha obtenido este resultado con cualquier combinación de antígenos recombinantes.
Tabla 20. Resultados de ToxB_GT P5_6. Expuestos a la cepa B1.
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Después, se determinó el número de colonias por cada 100 mg de materia fecal (figura 20), lo que demuestra que los organismos se desprenden en altos números durante varios días tras la exposición, incluso habiendo desaparecido los síntomas (diarrea). Todos los animales supervivientes desprendieron altos niveles de C. difficile en sus heces. Solo un animal (H4) no tuvo esporas detectables en el día 11.
Tabla 21. ToxB_GT P5_6 - contenido de toxina en el intestino cecal. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1.
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También se llevó a cabo un análisis de la colonización en el sacrificio (figura 21). Los resultados demostraron que todos los hámsteres supervivientes, salvo H4, estaban colonizados por C. difficile en el ciego y el colon en el momento del sacrificio. Todos los hámsteres supervivientes colonizados parecen tener una mayor proporción de células vegetativas:esporas que los animales que murieron en la fase aguda de la infección.
Tabla 22. ToxB_GT P5_6 - contenido de toxina en el colon. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1.
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La evaluación del contenido de toxina B en el intestino reveló que hay una menor presencia de toxina B en el ciego de los animales vacunados (H1-H6) que en los animales que murieron en la fase aguda de la infección (H7 y H8) (tabla 21). Del grupo vacunado, H3 y H6 tuvieron mayores niveles de toxina B presentes que los otros animales vacunados. H4 no tenía toxina B presente, lo que era de esperar ya que no había C. difficile detectable en el intestino en el momento del sacrificio. Este resultado también se confirmó en el colon (tabla 22). Según se observa en los lavados intestinales del ciego, hay poca o ninguna toxina B activa presente en los hámsteres supervivientes tras 14 días, en comparación con los altos niveles en los animales de control, que murieron. Asimismo, aparentemente hay menos toxina B en el colon que en el ciego y los únicos animales que muestran una cantidad significativa de toxina B en el colon también fueron los animales que murieron a causa de la enfermedad aguda. De nuevo, esto se pudo explicar, por ejemplo, por la unión de anticuerpos a las toxinas y/o una reducción en la expresión de toxina bacteriana.
En general, la vacunación con ToxA-P5-6 ToxB_GT proporcionó una supervivencia del 100 % después de la exposición a la cepa B1. Esta combinación no protegió a los animales frente a la diarrea después de la exposición a la cepa B1, aunque los síntomas fueron relativamente limitados. Por el contrario, se observó que ToxA-P5_6 en combinación con el fragmento ToxB-B confería una protección de tan solo el 83,3 % frente a la exposición a la cepa B1 y por lo tanto, el uso del fragmento ToxB-GT en combinación con un fragmento de TcdA representa una mejora frente al uso del fragmento ToxB-B (véase también la figura 40).
ToxB_GT + P5_6 (dosis menores)
A continuación, se evaluó si una dosis menor (20 ug por antígeno) también confería protección contra la cepa B 1. Todos los animales vacunados (H1-H8) sobrevivieron a la exposición a la cepa B1 y los animales de control (H7-H8) murieron (tabla 23).
Tabla 23. Resultados de ToxA-P5-6 ToxB_GT (dosis reducida). Expuestos a la cepa B1.
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Todos los animales vacunados presentaron un solo episodio de diarrea, salvo H2, que no mostró síntomas clínicos. Los controles no vacunados murieron poco después del inicio de la diarrea y fueron sacrificados cuando su temperatura corporal cayó por debajo de 35 °C. H1 y H5 fueron sacrificados 48 h después de la exposición, a pesar del hecho de que se habían recuperado de la etapa de diarrea de la infección (y basándose en la experiencia, podrían haber sobrevivido). H1 y H5 fueron sacrificados en esta etapa para obtener información acerca de la presencia de toxina B y del daño en el intestino, en esta etapa de la infección. Después, se determinó el número de colonias por cada 100 mg de materia fecal (figura 22), lo que demuestra que los organismos se desprenden en altos números durante varios días tras la exposición, incluso habiendo desaparecido los síntomas (diarrea). Se calculó el desprendimiento medio de C. difficile por grupo de vacunación y parece ser que el desprendimiento en estos animales se reduce en comparación con cualquiera de los experimentos anteriormente mencionados, en los que B1 era la cepa de exposición.
También se llevó a cabo un análisis de la colonización en el sacrificio (figura 23). Los resultados mostraron que todos los hámsteres supervivientes estaban colonizados por C. difficile en el ciego y el colon en el momento del sacrificio. H7 y H8 no tenían esporas detectables presentes ya sea en el ciego o el colon y tenían un número menor de bacterias vegetativas que los otros animales vacunados en el momento del sacrificio, 14 días después de la exposición. H2, H3, H4 y H6 tuvieron una mayor proporción de células vegetativas a esporas en el momento del sacrificio. H6 estaba colonizado en mayor medida que H2, H3 y H4. H1 y H5 eran animales vacunados que se recuperaron de la exposición y fueron sacrificados a las 48 h después de la exposición. H1 tuvo un episodio más largo y más grave de diarrea en comparación con H5, que padeció un episodio corto y leve. Ambos animales se recuperaron de la diarrea y sus colas se encontraban secas en el momento del sacrifico, a las 48 h después de la exposición. H1 y H5 tuvieron niveles comparables de bacterias vegetativas y esporas respecto de los animales de control que murieron en la fase aguda de la infección.
La evaluación del contenido de toxina B en el intestino reveló que hay poca o ninguna toxina B activa en el ciego de los animales vacunados sacrificados 14 días después de la exposición (tabla 24).
Tabla 24. ToxA-P5-6 ToxB_GT (dosis reducida) - contenido de toxina B en el ciego. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1.
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L o s a n i m a le s v a c u n a d o s q u e f u e r o n s a c r i f i c a d o s 48 h d e s p u é s d e la e x p o s i c i ó n t e n í a n a l t o s n i v e le s d e t o x in a B p r e s e n t e e n e l c ie g o y la c a n t id a d e r a c o m p a r a b l e a lo s a n i m a le s q u e m u r i e r o n e n la f a s e a g u d a d e la in f e c c i ó n y a p r o x i m a d a m e n t e 29 h d e s p u é s d e la e x p o s ic ió n . E s t a s o b s e r v a c i o n e s t a m b ié n s e c o n f i r m a r o n e n e l c o lo n ( t a b la 25 ) .
Tabla 25. T o x A - P 5 - 6 T o x B _ G T ( d o s i s r e d u c i d a ) - c o n t e n i d o d e t o x in a B e n e l c o lo n . L o s d a t o s s e r e p r e s e n t a n c o m o d i l u c i o n e s a la s c u a l e s la s c é l u la s s ig u e n u n id a s . E x p u e s t o s a B 1.
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S e g ú n s e o b s e r v a e n lo s la v a d o s in t e s t i n a le s d e l c i e g o , h a y p o c a o n in g u n a t o x in a B a c t i v a p r e s e n t e e n lo s h á m s t e r e s s u p e r v i v i e n t e s t r a s 14 d í a s , e n c o m p a r a c ió n c o n lo s a l t o s n i v e le s e n lo s a n i m a le s d e c o n t r o l o lo s d o s a n i m a le s v a c u n a d o s s a c r i f i c a d o s a la s 48 h d e s p u é s d e la e x p o s ic ió n . A s i m i s m o , h a y m e n o s t o x in a B e n e l c o lo n q u e e n e l c ie g o y lo s ú n i c o s a n i m a le s q u e m u e s t r a n u n a c a n t id a d s ig n i f i c a t i v a d e t o x in a B e n e l in t e s t in o f u e r o n lo s a n i m a le s d e c o n t r o l , q u e m u r i e r o n a c a u s a d e la e n f e r m e d a d a g u d a . L o s a n i m a le s s a c r i f i c a d o s a la s 48 h m o s t r a r o n n i v e le s r e d u c i d o s , m ie n t r a s q u e lo s a n i m a le s s a c r i f i c a d o s a lo s 14 d í a s d e s p u é s d e la e x p o s ic ió n m o s t r a r o n n i v e le s d e t o x in a B m í n i m o s o in d e t e c t a b le s .
T a m b i é n s e e v a l u a r o n lo s n i v e le s d e c o n t e n i d o d e t o x in a A e n e l in t e s t in o . L o s la v a d o s in t e s t i n a le s s e f i l t r a r o n a t r a v é s d e u n f i l t r o d e 0 , 22 p m p a r a r e t i r a r la s c é l u la s b a c t e r ia n a s . D e s p u é s , s e c o l o c a r o n lo s l a v a d o s f i l t r a d o s e n c é l u la s H T 29 c o n f l u e n t e s a c o n c e n t r a c i o n e s d e c r e c i e n t e s d u r a n t e 24 h o r a s . D e s p u é s d e la in c u b a c ió n , s e la v a r o n la s c é lu la s , s e f i j a r o n y d e s p u é s s e c o l o r e a r o n c o n t in c i ó n d e G ie m s a . E n c a s o d e h a b e r t o x in a p r e s e n t e , e l r e d o n d e a d o c e l u la r p r o v o c ó d e s p r e n d im ie n t o y a u s e n c ia d e c o lo r . L o s d a t o s d e c o n t e n i d o d e t o x in a s r e p r e s e n t a n la s d i l u c i o n e s a la s q u e la s c é l u la s p e r m a n e c i e r o n u n i d a s ( t e ñ id a s ) . L a e v a l u a c i ó n d e l c o n t e n i d o d e t o x i n a A e n e l in t e s t in o r e v e ló q u e lo s a n i m a le s v a c u n a d o s s a c r i f i c a d o s a lo s 14 d í a s d e s p u é s d e la e x p o s ic ió n t e n í a n p o c a o n a d a d e t o x in a A p r e s e n t e . L o s a n i m a le s v a c u n a d o s H 1 y H 5 q u e f u e r o n s a c r i f i c a d o s a la s 48 h d e s p u é s d e la e x p o s ic ió n t e n í a n u n a c a n t id a d d e t o x in a A e n e l i n t e s t in o c o m p a r a b l e a la d e lo s a n i m a le s d e c o n t r o l ( H 9 y H 10 ) q u e m u r ie r o n e n la f a s e a g u d a d e la i n f e c c ió n ( t a b la 26 ) .
Tabla 26. T o x A - P 5 - 6 T o x B _ G T ( d o s i s r e d u c i d a ) - c o n t e n i d o d e t o x in a A e n e l c ie g o . L o s d a t o s s e r e p r e s e n t a n c o m o d i l u c i o n e s a la s c u a l e s la s c é l u la s s ig u e n u n id a s . E x p u e s t o s a B 1.
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E n g e n e r a l , la v a c u n a c ió n c o n p 5 / 6 t o x B - G T a 20 p g p o r a n t í g e n o y p o r d o s i s p r o t e g ió a lo s a n i m a le s f r e n t e a la muerte, pero no previno la diarrea cuando fueron expuestos a C. difficile cepa B1. Todos los animales supervivientes estaban colonizados durante el experimento y desprendieron esporas de C. difficile en sus heces. En el momento del sacrificio, todos los animales seguían colonizados por C. difficile con algunos mostrando niveles tan solo bajos de células vegetativas y otros mostrando niveles mayores de esporas y células vegetativas. Los animales que sobrevivieron hasta el final del experimento, mostraron bajos niveles de toxina (ya sea A o B) en la luz intestinal. En cambio, los animales de control sucumbieron a la infección aproximadamente 29 h después de la infección. Estos animales mostraron altos niveles tanto de células vegetativas como de esporas en el tejido intestinal extraído y un alto nivel de toxina en los extractos filtrados. De forma interesante, los 2 animales que se habían recuperado de la fase diarreica de la enfermedad, pero que fueron sacrificados a las 48 h, parecieron mostrar recuentos y niveles de toxina que se parecían más a los de los animales de control que a los vacunados, con cantidades relativamente altas de toxina presente en el lumen. Sin embargo, el hecho de que estos animales ya no mostrasen diarrea podría sugerir que los anticuerpos producidos y liberados de la circulación en respuesta al daño protegió a los animales frente a las consecuencias letales de la enfermedad.
Por lo tanto, la inmunización usando una combinación de ToxA-P5-6 ToxB_GT proporcionó una supervivencia del 100 % después de la exposición a la cepa B1, incluso cuando se usó una menor cantidad de antígeno. Incluso cuando se usaron 20 ug de cada antígeno, esta combinación tuvo un mejor rendimiento que ToxA-P5_6 en combinación con el fragmento ToxB-B, usando 50 ug de cada antígeno.
ToxA-P5-6 + ToxB-GT exposición con R20291 (SM)
En vista del alto nivel de protección contra las cepas 630 y B1 mediante la inmunización con una combinación de ToxA-P5-6 ToxB-GT, los inventores comprobaron si esta combinación también era protectora contra la exposición a la cepa R20291(SM). Por tanto, se inmunizó a los animales con una mezcla de ToxA-5-6 ToxB-B, adyuvada con MF59. Se llevaron a cabo estudios de protección, junto con un análisis de las heces y una evaluación del contenido de toxina en el intestino.
ToxB_GT-PSII + P5_6
Después, los inventores comprobaron si la inclusión de PSII podría inducir una respuesta inmunitaria capaz de reducir la colonización. Se conjugó químicamente ToxB_GT a PSII y este conjugado era capaz de inducir anticuerpos específicos contra PSII (confirmado mediante ELISA, datos no mostrados). Asimismo, no se observó que la conjugación química a PSII alterase la actividad de neutralización.
El experimento consistió en tres grupos, que fueron expuestos a la cepa 630: vacunación con ToxB_GT(PSII) P5_6 (H1-H6), vacunación con ToxB_GT P5_6 (H7-8) y tratamiento solo con adyuvante (H9-H10). Los resultados se muestran en la tabla 27. H1-H3 no presentaron episodios de diarrea, pero H4 tuvo dos episodios y fue sacrificado tras el segundo episodio. De los hámsteres H1-H6, sobrevivieron 5/6. De los hámsteres H7 y H8, sobrevivieron 2/2.
Tabla 27. Resultados de ToxB_GT(PSII) P5_6. Exposición a la cepa 630.
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Después, se determinó el número de colonias por cada 100 mg de materia fecal (figura 24), lo que demuestra que los organismos se desprenden en altos números durante varios días tras la exposición, incluso habiendo desaparecido los síntomas (diarrea). Todos los animales supervivientes desprendieron altos niveles de C. difficile en sus heces.
En la figura 25 se muestra el número medio de C. difficile que se diseminan en heces de animales vacunados supervivientes (ToxB_GT(PSII) P5_6 (H1-H6)) o ToxB_GT P5_6 (H7-8)). Esto demuestra que puede haber una ligera ventaja a la hora de incluir PS-II en la colonización.
También se llevó a cabo un análisis de la colonización en el sacrificio (figura 26(a y b)). Los resultados mostraron una colonización baja o nula de C. difficile asociada a tejido en los animales supervivientes (vacunados). Los resultados obtenidos para H4 fueron comparables a los de los controles negativos.
Por lo tanto, se observaron altos recuentos de colonias solo en los animales que no sobrevivieron.
Quimera B4
Después, los inventores comprobaron la protección obtenida usando una proteína híbrida que comprende ToxB-GT ToxA-P5-6 (la quimera "B4"). Se inmunizó a 6 animales (H1-6) con 50 ug de la quimera B4 (adyuvada con MF59). Como controles, 2 animales recibieron solo adyuvante (H7-H8) y 2 animales no recibieron vacunación (H9-H10). El antígeno se administró por vía intraperitoneal. Se expuso a los animales a la cepa 630 (se sacrificó a H1 y a H8 antes de la exposición). Todos los animales de control murieron, pero 3/5 de los animales vacunados sobrevivieron hasta el final del experimento (tabla 28). Por lo tanto, la expresión de ToxB-GT y ToxA-P5-6 en forma de quimera parece reducir la eficacia de esta combinación de antígenos, en comparación con el uso de una mezcla de antígenos individuales.
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Tabla 28. Resultados de la quimera B4. Expuestos a la cepa 630. Los animales vacunados estaban completamente protegidos contra la muerte pero no contra la diarrea. * Los animales fueron sacrificados a consecuencia de abscesos asociados con la inserción del chip.
La evaluación de la colonización de los animales se determinó mediante la toma de muestras fecales de las jaulas a intervalos tras la exposición. Se pesaron las heces, se resuspendieron en PBS estéril y después se sembraron en medio selectivo. Después, se determinó el número de colonias por cada 100 mg de materia fecal (tabla 29), lo que demuestra que los organismos se desprenden en altos números durante varios días tras la exposición (no se detectaron las bacterias en las heces de H6).
Tabla 29. Desprendimiento bacteriano de esporas de C. difficile en 100 mg de heces de hámsteres inmunizados con quimera B4 o controles. Expuestos a la cepa 630. *ND = no había bacterias detectables.
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ToxB_GT ToxA_B2
Después, los inventores comprobaron si la inmunización con ToxB-GT en combinación con un fragmento diferente de TcdA era capaz de conferir el mismo alto nivel de protección que para ToxB-GT ToxA-P5/6. Por lo tanto, se inmunizó a los animales con una mezcla de ToxB-GT ToxA_B2 y se les expuso a la cepa B1. Se inmunizó a los animales (H1-H6) con una mezcla de ToxB_GT ToxA_B2 (adyuvada con MF59). Los controles (solo adyuvante (H7 y H8) y sin adyuvante (H9 y H10)) tuvieron una fuerte diarrea y una caída de la temperatura, punto en el cual fueron sacrificados. Todos los animales inmunizados sobrevivieron frente a la exposición a la cepa B1 (6/6) (tabla 30).
Tabla 30. Resultados de ToxB_GT ToxA_B2. Expuestos a la cepa B1.
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Todos los animales inmunizados presentaron un solo episodio de diarrea, aparte de H3, que no mostró diarrea (H1 mostró la diarrea más grave de este lote y se le monitorizó estrechamente). Todos los animales que mostraron síntomas clínicos tuvieron brotes más breves de diarrea que los observados en cualquiera de los experimentos anteriormente mencionados, cuando se les expuso a la cepa B1.
Después, se determinó el número de colonias por cada 100 mg de materia fecal (figura 27), lo que demuestra que los organismos se desprenden en altos números durante varios días tras la exposición, incluso habiendo desaparecido los síntomas (diarrea). Todos los animales supervivientes desprendieron altos niveles de C. difficile en sus heces. En el día 14, cuatro hámsteres inmunizados (H2, H3, H4 y H6) no tuvieron esporas detectables de C. difficile en sus heces.
También se llevó a cabo un análisis de la colonización en el sacrificio (figura 28(a-b)). Los resultados mostraron que todos los hámsteres supervivientes estaban colonizados por C. difficile en el ciego y el colon en el momento del sacrificio, aunque los recuentos bacterianos fueron muy bajos y se aproximaban al extremo inferior del límite de detección. H2 y H6 parecían no tener bacterias detectables asociadas con el tejido. Todos los hámsteres supervivientes colonizados parecen tener una mayor proporción de células vegetativas:esporas que los animales que murieron en la fase aguda de la infección.
La evaluación del contenido de toxina B en el intestino reveló que hay poca (H5) o nada de toxina B activa en el ciego de los animales vacunados (H5 tuvo el mayor número de bacterias en el intestino en el momento del sacrificio entre todos los animales vacunados) (tabla 31). Este resultado también se confirmó en el colon (tabla 32).
Tabla 31. B_GT ToxA_B2 - contenido de toxina en el intestino cecal. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1.
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Tabla 32. B_GT ToxA_B2 - contenido de toxina en el colon. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1.
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Según se observa en los lavados intestinales del ciego, hay poca o ninguna toxina B activa presente en los hámsteres supervivientes tras 14 días, en comparación con los altos niveles en los animales de control, que murieron. Asimismo, aparentemente hay menos toxina B en el colon que en el ciego y los únicos animales que muestran una cantidad significativa de toxina B en el colon también fueron los animales que murieron a causa de la enfermedad aguda.
En general, la vacunación con ToxA-B2 ToxB_GT proporcionó una supervivencia del 100 % después de la exposición a la cepa B1, superando por tanto el nivel de protección logrado usando toxoides inactivados de longitud completa e igualando el alto nivel de protección logrado usando ToxB-GT ToxA-P5-6. Esta combinación no protegió a los animales frente a la diarrea después de la exposición a la cepa B1. Sin embargo, los síntomas fueron relativamente limitados y fueron incluso menos graves que con cualquiera de las combinaciones probadas anteriormente mencionadas, después de la exposición a la cepa B1. Todos los animales supervivientes estaban colonizados durante el experimento, aunque 3/6 de los animales vacunados no mostraron esporas detectables de C. difficile en las heces a los 14 días después de la infección (aunque se pudieron cultivar números detectables de C. difficile directamente del intestino en ese momento). Asimismo, los animales vacunados mostraron niveles relativamente bajos de toxina B en el intestino al final del experimento. De nuevo, esto se pudo explicar, por ejemplo, por la unión de anticuerpos a las toxinas y/o una reducción en la expresión de toxina bacteriana.
ToxA_B2 + ToxB_B + ToxB_GT
Después, los inventores comprobaron si la vacunación con ToxB-GT ToxB-B ToxA-B2, tiene algún efecto en la protección contra la EACD. Se inmunizó a los animales con una mezcla de ToxA-B2 ToxB_B ToxB-GT. Se llevaron a cabo estudios de protección, junto con un análisis de las heces y una evaluación del contenido de toxina en el intestino.
ToxB_B + ToxA-P5_6 + ToxB_GT
Después, los inventores comprobaron si la vacunación con ToxB-GT ToxA-P5-6 en combinación con el fragmento ToxB-B, tiene algún efecto adicional en la protección contra la EACD. Por lo tanto, se inmunizó a los animales con una mezcla de ToxB_B P5_6 ToxB_GT (adyuvada con MF59). Los controles no vacunados tuvieron una fuerte diarrea y una caída de la temperatura, punto en el cual fueron sacrificados. 5 de los 6 hámsteres vacunados (83 %) sobrevivió a la exposición a la cepa B1 (tabla 33).
Tabla 33. ToxB_GT ToxB_B P5_6 en adyuvante MF59. Expuestos a B1. 5 de los 6 animales vacunados sobrevivieron. H1 y H4 mostraron un solo episodio de diarrea, que duró aproximadamente una hora.
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Los hámsteres H1 y H4 mostraron un solo episodio de diarrea que duró aproximadamente 20 horas y los hámsteres H3, H5 y H6 no tuvieron episodios de diarrea. Un análisis de las heces (figura 29) muestra que se desprenden altos números de organismos de C. difficile durante varios días después de la exposición, incluso habiendo desaparecido los síntomas (diarrea). En la figura 30 se proporciona un resumen de la colonización terminal.
La evaluación del contenido de toxina B en el intestino reveló que hay menos toxina B presente en 5 de los 6 hámsteres vacunados tras 15 días que en los controles, que murieron después de 2 días (tabla 34).
Tabla 34. ToxB_B P5_6 ToxB_GT. Contenido de toxina en el intestino cecal. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a la cepa B1.
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Este resultado también se confirmó en el colon (tabla 35). H2 murió a las 50 h 54 min y tuvo una cantidad de toxina B en el intestino similar a la de los animales de control, que murieron.
Tabla 35. ToxB_B P5_6 ToxB_GT. Contenido de toxina en el colon. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a la cepa B1.
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Por lo tanto, la inmunización con una mezcla de ToxB_B P5_6 ToxB_GT proporciona una fuerte protección contra la exposición a la cepa 630, pero no parece conferir ventaja alguna frente a ToxB-GT ToxA-P5-6.
ToxA_GT + ToxB_GT + ToxB_B + ToxA_B2
Después, los inventores comprobaron el nivel de protección conferido mediante la inmunización con una combinación de antígenos que comprendían ToxA-GT. Por tanto, se inmunizó a los animales con una mezcla de ToxA-GT ToxB-GT ToxB-B ToxA-B2. 6 animales recibieron 50 pg de cada antígeno (adyuvado con MF59), (H1-H6). 1 animal recibió solo adyuvante (H7), 2 quedaron sin tratar (H8-H9) y uno no fue expuesto (H10). La cepa de exposición usada en este experimento fue la cepa B1. Todos los animales de control murieron tras la exposición, mostrando diarrea poco antes de una bajada en la temperatura corporal hasta el punto final clínico. Otro animal vacunado (H1) mostró síntomas de la enfermedad y deshidratación y murió poco después del último animal de control, mostrando un perfil de temperatura corporal similar al de los controles (datos no mostrados). Todos los demás animales vacunados sobrevivieron hasta el final del experimento (tabla 36). H2-H6 mostraron un solo episodio breve de diarrea durante la recuperación. Por lo tanto, un 83 % de los sujetos vacunados estaban protegidos frente a la muerte cuando se les expuso a la cepa B1.
Tabla 36. Resultados de ToxA_GT ToxB_GT ToxB_B ToxA_B2. Exposición a la cepa B1.
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Un análisis del desprendimiento de bacterias (figura 31) reveló una reducción en las esporas de C. difficile en las heces con el paso del tiempo (reduciéndose considerablemente tras el día 7) y esta tendencia es comparable con los datos obtenidos usando toxoides de longitud completa. No hay datos disponibles para H4 en el día 3 y H3 y H5 no tuvieron esporas detectables en el día 14. Todos los hámsteres supervivientes tuvieron una mayor proporción de células vegetativas:esporas que los animales que murieron en la fase aguda de la infección. En la figura 32 se proporciona un análisis de la colonización en el sacrificio.
Para los hámsteres que sobrevivieron a la exposición con la cepa B1, se analizó el contenido de toxina B en el día 14 (tabla 37).
Tabla 37. ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 - contenido de toxina en el intestino cecal. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1.
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Los animales vacunados mostraron bajos niveles de toxina B en el intestino, a pesar de estar colonizados por las bacterias (aparte de H2, que tenía más toxina B detectable y que se encontraba más fuertemente colonizado en el momento del sacrificio). El hámster vacunado, H1, que murió en la fase aguda de la infección, tenía una cantidad equivalente de toxina B en el intestino en relación con los controles no vacunados y los de solo adyuvante, que murieron a las 28 h después de la infección. Estas observaciones se confirmaron en el colon (tabla 38). Aparentemente, hay menos toxina B en el colon que en el ciego y los únicos animales que muestran una cantidad significativa de toxina B en el colon también fueron los animales que murieron a causa de la enfermedad aguda.
Tabla 38. ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 - contenido de toxina en el colon. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1.
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En general, la vacunación con ToxA_GT ToxB_GT ToxB_B ToxA_B2 protegió a 5 de los 6 animales frente a la muerte cuando se les expuso a la cepa B1, pero no les protegió contra la diarrea. El nivel de protección obtenido al incluir ToxA-GT en la combinación fue comparable al nivel de protección logrado cundo se inmuniza con los toxoides inactivados de longitud completa. Todos los animales supervivientes estaban colonizados durante el experimento y desprendieron niveles equivalentes de esporas de C. difficile en las heces. En el momento del sacrificio, todos los animales seguían colonizados por C. difficile. Los animales supervivientes mostraron una mayor proporción de células vegetativas:esporas en el intestino, en comparación con los controles. Salvo por una excepción (H2), los animales supervivientes mostraron bajos niveles de actividad de la toxina B en el intestino. De nuevo, esto se pudo explicar, por ejemplo, por la unión de anticuerpos a las toxinas y/o una reducción en la expresión de toxina bacteriana. En general, esta combinación mostró una eficacia comparable a la obtenida usando el patrón de oro de inmunización con toxoides.
ToxA_B2 + ToxB_GT + ToxB_GT + ToxB_B + ToxA_GT dosis menores
Después, los inventores evaluaron si el uso de una menor dosis de antígeno de ToxA_GT ToxB_GT ToxB_B ToxA_B2 (20 ug de cada antígeno) también confería un alto nivel de protección contra la cepa B1.
Todos los animales vacunados (H1-H8) sobrevivieron a la exposición a la cepa B1 y los animales de control (H7-H8) fueron sacrificados cuando su temperatura corporal se redujo a menos de 35 °C (tabla 39). Obsérvese que se sacrificó un animal vacunado (H2) a los 9 días después de la exposición debido a la pérdida de condiciones físicas y no por una caída del peso corporal (el animal no ganó peso, se encontraba deshidratado y no había recuperado una función intestinal normal, según se evidenció por la ausencia de materia fecal formada).
Tabla 39. Resultados de ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 (dosis menor). Expuestos a B1.
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Después, se determinó el número de colonias por cada 100 mg de materia fecal (figura 33), lo que demuestra que los organismos se desprenden en altos números durante varios días tras la exposición, incluso habiendo desaparecido los síntomas (diarrea). Se observo que el nivel de las esporas en las heces se había reducido considerablemente tras el día 8.
También se llevó a cabo un análisis de la colonización en el sacrificio (figura 34). Los resultados mostraron que todos los hámsteres supervivientes estaban colonizados por C. difficile en el intestino en el momento del sacrificio. H2, que fue sacrificado a los 9 días tras la exposición, tenía cantidades comparables de células vegetativas y esporas respecto de los animales de control (H8, H9 y H10), que murieron en la fase aguda de la infección. H1, H3 y H4 tuvieron altos niveles de C. difficile, pero tuvieron menores niveles de esporas que en los animales que murieron en la fase aguda de la infección. H5, H6 y H7 tuvieron menores niveles de C. difficile y menores niveles de esporas. H6 no tuvo esporas detectables asociadas con el tejido en el ciego o el colon.
La evaluación del contenido de toxina B en el ciego reveló que hay poca o ninguna toxina activa en el ciego de los animales vacunados sacrificados 14 días después de la exposición (tabla 40). De forma interesante, el animal de control, H8, tenía poca cantidad o nada de toxina activa presente, lo cual es inesperado, ya que este animal murió durante la fase aguda de la infección. H2, que fue sacrificado a los 9 días tras la exposición, tenía una cantidad comparable de toxina presente en el intestino a los animales de control (H9 y H10), que murió durante la fase aguda de la infección. H1 y H3 tuvieron presencia de toxina activa, mientras que H4 y h6 tuvieron menos presencia de toxina activa. H5 y H7 no tuvieron presencia de toxina activa, lo que se correlacionó con el bajo número de bacterias presentes.
Tabla 40. ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 (dosis menor). Contenido de toxina B en el ciego. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1. Expuestos a B1.
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Se observaron resultados de toxinas similares en el colon (tabla 41), pareciendo que H8 no tenía toxina activa presente en el intestino. H9 y H10, que murieron durante la fase aguda de la infección, tenían altos niveles de toxina presente en el colon. H2, que fue sacrificado a los 9 días tras la exposición, tenían toxina activa presente en el colon, mientras que los animales que fueron sacrificados a los 14 días después de la exposición tenían poca cantidad o nada de toxina activa presente.
Tabla 41. ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 (dosis menor). Contenido de toxina B en el colon. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1.
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También se evaluaron los niveles de contenido de toxina A en el ciego, usando la metodología expuesta anteriormente. La evaluación del contenido de toxina A en el intestino reveló que H9 y H10 tenían altos niveles de toxina A presente. H8, que también murió en la fase aguda de la infección, tenía poca cantidad de toxina activa presente, aunque este resultado concuerda con a medida anterior de toxina B. H2, que fue sacrificado a los 9 días tras la exposición, tenía un nivel mayor de toxina A presente en el ciego en comparación con los animales que fueron sacrificados a los 14 días después de la exposición, que tenían poca cantidad o nada de toxina activa presente (tabla 42).
Tabla 42. ToxB_GT ToxA_GT ToxB_B ToxA_B2 (dosis menor). Contenido de toxina A en el ciego. Los datos se representan como diluciones a las cuales las células siguen unidas. Expuestos a B1.
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En general, la inmunización con una dosis menor de ToxA-B2 ToxA_GT ToxB_GT ToxB_B (20 |jg por antígeno por dosis) también protegió a los animales frente a la muerte, pero no contra la diarrea. Todos los animales que sobrevivieron a la exposición inicial recuperaron una función intestinal normal, salvo uno (H2). Por lo tanto, la inmunización con una dosis menor de ToxA-B2 ToxA_GT ToxB_GT ToxB_B parece proporcionar un nivel de protección similar o mejor en comparación con el patrón de oro, que usa toxoides.
Títulos de neutralización de hámsteres vacunados
Los sueros de los animales vacunados se analizaron mediante un ensayo de neutralización in vitro. Los resultados se muestran en la tabla 43.
Tabla 43. Títulos de neutralización in vitro de hámsteres vacunados. (las diferencias en repeticiones experimentales se anotan mediante "/"). Títulos de neutralización seleccionados mostrados por comparación. La dosis de antígeno reducida es de 20 jg por antígeno.
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Todos los animales inmunizados con una mezcla de fragmentos que comprendía al menos un fragmento de ToxA y al menos un fragmento de ToxB, así como toxina A y toxina B de longitud completa, generaron títulos de neutralización contra ambas toxinas. De las combinaciones ensayadas, solo ToxA-B2 ToxB-B ToxB_GT no generó títulos de neutralización contra ambas toxinas y no se observó que fuera protector contra la cepa 630. Asimismo, los animales inmunizados con un solo fragmento generaron títulos de neutralización solo contra su proteína respectiva y no se observó que fueran protectores. Estos datos sugieren que la protección contra C. difficile requiere la producción de títulos de neutralización contra ambas toxinas.
Análisis de la microbiota
Los animales vacunados expuestos a C. difficile que se recuperaron de un solo episodio de diarrea, continúan desprendiendo organismos en las heces durante al menos 3 semanas. Para analizar el impacto de la infección por C. difficile en el microbioma, se monitorizaron los cambios mediante amplificación de 16S de la materia fecal, antes y después de la infección.
En primer lugar, los inventores evaluaron los cambios en la microflora tras el tratamiento con clindamicina (figura 35). Se obtuvo una media de 3000 secuencias de 454 secuenciaciones por muestra y se asignaron los filos. En los hámsteres normales no tratados, el filo más abundante es Bacteroidetes (59 %). El tratamiento con clindamicina da como resultado una dramática reducción de los Bacteroidetes, una expansión secuencial de las Proteobacteria (84 %) una pérdida de la diversidad microbiana general. Se observó una recuperación aumentada de Fusobacteria a partir del día 2. Se observó una recuperación de la diversidad a partir del día 5, aunque llegado el día 15, aún no se había recuperado totalmente la riqueza de filos microbianos.
Después, los inventores evaluaron los cambios en la microflora en los animales vacunados. La vacunación protege a los hámsteres frente a la exposición letal con C. difficile 630 toxinogénica, a pesar del crecimiento bacteriano y la producción de toxinas. Como se muestra en la figura 36, los animales supervivientes muestran cambios en la microbiota que son coherentes con los observados en los animales tratados con clindamicina. En el día 14, estos filos se redujeron pero siguieron siendo más elevados que en los otros regímenes de infección. La diversidad microbiana se redujo hasta SDI 1,3 en el día 4, pero después aumentó a niveles similares a los previos a la clindamicina (SDI 1,7).
En general, los inventores observaron que la vacunación con fragmentos de toxina que incluyen el dominio enzimático de la toxina B proporcionan el mayor nivel de protección contra la infección por C. difficile. La administración del antibiótico de amplio espectro, clindamicina, dio como resultado una complejidad microbiana reducida. Aunque la diversidad de la microbiota aumentó con el paso del tiempo, nunca volvió a los niveles previos a la clindamicina. Estos datos, junto con los datos clínicos, sugieren que el daño asociado con la toxina de C. difficile podría potenciar la disbiosis de la microbiota provocada por los antibióticos y esto puede revelar por qué los pacientes siguen siendo susceptibles a las recaídas.
Investigación de IgG específicas para toxinas en la luz intestinal
Se investigó la presencia de IgG específicas para toxinas en la luz intestinal de los animales vacunados con ToxA-P5-6+ToxB-GT. Aunque la respuesta a ToxA fue mayor en la fase aguda de la infección, se pudieron detectar cantidades crecientes de anticuerpos anti-ToxB en el punto final (figura 39).
Para evaluar adicionalmente los efectos de la vacunación con ToxA-P5-6+ToxB-GT, se monitorizaron los niveles de toxinas producidas in vivo y se llevó a cabo una histología intestinal.
Se detectaron altos niveles de toxina 48 horas después de la infección en los hámsteres tanto de control como vacunados (figura 40), mientras que la inflamación grave del intestino acompañada de necrosis epitelial y flujo de entrada de polimorfonucleares (PMN) se observó únicamente en los animales de control. El tejido de animales vacunados mostró menos daño epitelial y un infiltrado de PMN limitado. Se observó hiperplasia asociada con la aparición de células productoras de mucina y aumento de la longitud de cripta a punta, particularmente en el colon inferior.
Los animales protegidos mostraron niveles más bajos de toxina dentro de la luz intestinal 14 días después de la infección, a pesar de la presencia de altos números de colonias de C. difficile asociadas con el tejido intestinal. El epitelio intestinal pareció volver a la normalidad, con ausencia de flujo de entrada de polimorfonucleares. De forma interesante, aunque no hubo evidencias de alteraciones en el ciego, seguía habiendo cierto grado de hiperplasia en el colon terminal de estos animales.
Conclusión
Los inventores han descubierto que la administración de combinaciones de antígenos de Clostridium difficile que comprenden ToxB-GT y fragmentos de TcdA son capaces de proporcionar altos niveles de protección contra la EACD, comparables o incluso mejores que usando fragmentos basados en el dominio de unión para la inmunización.
Los experimentos de vacunación en hámsteres permitieron identificar combinaciones de fragmentos que eran capaces de proteger a los animales frente al resultado letal normalmente observado en ausencia de vacunación, incluso después de la exposición a la cepa B1.
Sorprendentemente, los inventores también descubrieron que la inmunización con combinaciones de la invención en forma de polipéptidos individuales separados (es decir, mezclados entre sí), confiere una protección mucho más fuerte contra la EACD, que el uso de polipéptidos híbridos. Esto se ilustra por la "quimera b4", que mostró un nivel de protección tan solo mejorado contra la cepa 630 más leve.
Las combinaciones de la invención redujeron en gran medida los síntomas clínicos de la EACD, tales como deshidratación y diarrea. Además, el nivel de protección logrado mediante la combinaciones de la invención igualó o superó a la protección proporcionada mediante el uso de toxoides inactivados. Mediante el uso de polipéptidos recombinantes, los inventores fueron capaces de superar la gran cantidad de problemas asociados con la vacunación usando toxoides inactivados.
Por lo tanto, los inventores han proporcionado candidatos de vacuna multi-cepa contra la EACD, que son más seguros y más fáciles de producir que usando toxoides inactivados y que ofrecen un alternativa a la inmunización basada en dominios de unión contra C. difficile.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunogénica que comprende una combinación de antígenos de Clostridium difficile, comprendiendo dicha combinación
a) un antígeno ToxB-GT que consiste en una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60; y/o b) que es un fragmento de al menos 50 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60 o de un polipéptido que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60 y que comprende un epítopo de la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 60; en la que el antígeno ToxB-GT está detoxificado y comprende una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones de aminoácidos 17, 102, 139, 269, 270, 273, 284, 286, 288, 384, 449, 444, 445, 448, 449, 450, 451, 452, 455, 461, 463, 472, 515, 518 y 520, en relación con la secuencia del antígeno ToxB-GT de tipo silvestre de SEQ ID NO: 18 y en la que las dos sustituciones de aminoácidos no se encuentran en posiciones correspondientes a los aminoácidos 102 y 278 de la SEQ ID NO: 18 o a las posiciones 102 y 288 de la SEQ ID NO: 18;
y
b) un antígeno ToxA-P5-6 que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80 % o más de identidad respecto de la SEQ ID NO: 11.
2. La composición inmunogénica de la reivindicación 1, en la que las una o más sustituciones de aminoácidos se seleccionan entre el grupo que consiste en D270A, R273A, Y284a , D286A y D288A.
3. La composición inmunogénica de la reivindicación 1 o 2, en la que el antígeno ToxA-P5-6 comprende una mutación en al menos un aminoácido en relación con la SEQ ID NO: 11.
4. La composición inmunogénica de la reivindicación 3, en la que la mutación comprende: (a) una eliminación de hasta 40 aminoácidos en el extremo N-terminal y/o C-terminal; o (b) la adición de dos aminoácidos en el extremo C-terminal, por ejemplo, leucina (L) y ácido glutámico (E), como se muestra en la SEQ ID NO: 84; o (c) una sustitución en las posiciones 41 y/o 42 del antígeno ToxA-P5-6 numerado de acuerdo con la SEQ ID NO: 11.
5. La composición inmunogénica de la reivindicación 4, en la que la mutación es una sustitución en la posición 41 y/o 42 seleccionada entre el grupo que consiste en H41D y N42A.
6. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior, que además comprende 1 o más antígenos adicionales seleccionados entre el grupo que consiste en (1) un antígeno ToxB-ED (SEQ ID NO: 17), (2) un antígeno ToxB-CP (SEQ ID NO: 19) (3) un antígeno ToxB-T (SEQ ID NO: 20), (4) un antígeno ToxB-B (SEQ ID NO: 21), (5) un antígeno ToxB-B2 (SEQ iD NO: 22) (6) ToxB-B7 (SEQ ID NO: 23), (7) un antígeno TcdB de longitud completa (SEQ ID NO: 2), (8) un antígeno ToxA-ED (SEQ ID NO: 3), (9) un antígeno ToxA-GT (SEQ ID NO: 4), (10) un antígeno ToxA-Cp (SEQ ID NO: 5), (11) un antígeno ToxA-T (s Eq ID NO: 6), (12) un antígeno ToxA-T4 (SeQ ID NO: 7), (13) un antígeno ToxA-B (SEQ ID NO: 8), (14) un antígeno ToxA-PTA2 (SEQ ID NO: 9), (15) un antígeno ToxA-P5-7 (SEQ ID NO: 10), (16) un antígeno ToxA-P9-10 (SEQ ID NO: 12), (17) un antígeno ToxA-B2 (SEQ ID NO: 13), (18) un antígeno ToxA-B3 (SEQ ID NO: 14), (19) un antígeno ToxA-B5 (SEQ ID NO: 15), (20) un antígeno ToxA-B6 (SeQ ID NO: 16) o (21) un antígeno TcdA de longitud completa (SEQ ID NO: 1).
7. La composición inmunogénica de cualquier reivindicación anterior, en la que al menos dos de los antígenos en la composición se encuentran en forma de un polipéptido híbrido.
8. La composición inmunogénica de la reivindicación 7, en la que el polipéptido híbrido comprende (i) un antígeno ToxB-GT (SEQ ID NO: 18) fusionado a un antígeno ToxA-P5-6 (SEQ ID NO: 11) a través de un enlazador peptídico, opcionalmente en la que el enlazador peptídico comprende la SEQ ID NO: 25 para producir el híbrido B4 de SEQ ID NO: 24; o (ii) SEQ ID NO: 106; o (iii) SEQ ID NO: 107; o (iv) SEQ ID NO: 108; o (v) SEQ ID NO: 109; o (vi) SEQ ID NO: 110; o (vii) SEQ ID NO: 111.
9. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición induce títulos de neutralización contra la toxina A y la toxina B de C. difficile.
10. La composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende al menos un antígeno de C. difficile adicional, opcionalmente, en la que dicho antígeno de C. difficile adicional es un antígeno de sacárido, en particular, un antígeno de polisacárido II de la pared celular.
11. Una vacuna que comprende la composición inmunogénica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que opcionalmente comprende un adyuvante.
12. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 para su uso como producto farmacéutico.
13. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 11 o 12, para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad asociada con C. difficile en un mamífero, en particular, un ser humano.
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