ES2798326T3 - Nuevas proteínas de hemaglutinina 5 (H5) para tratamiento y prevención de infecciones gripales - Google Patents

Abstract

Una vacuna que comprende a) proteína H5 del virus gripal, en el que la proteína H5 consiste en o comprende una cualquiera de las secuencias expresadas en SEQ ID NOs: 2 a 12, o 35 o 36 o 40; b) un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevas proteínas de hemaglutinina 5 (H5) para tratamiento y prevención de infecciones gripales

Campo de la invención

La presente descripción se refiere al campo de la medicina, preferiblemente al campo de las enfermedades infecciosas. En particular, la presente descripción se refiere a las proteínas gripales, a las moléculas de ácido nucleico y vectores que codifican estas proteínas y a las vacunas. Muy particularmente, la presente descripción se refiere al uso de cualquiera de dichas proteínas, moléculas de ácido nucleico, vectores o vacunas para tratamiento y prevención de las infecciones gripales, preferiblemente de las infecciones por H5N1 de origen norteafricano y además para la prevención de la transmisión intra- o inter-especies del virus gripal.

Antecedentes de la invención

La infección gripal sigue siendo una infección importante en los animales y en los seres humanos. La gripe está causada por virus que sufren continuos cambios/modificaciones antigénicos y que tienen un reservorio animal. Por lo tanto, en el futuro pueden aparecer nuevas epidemias y pandemias, y la erradicación de la enfermedad será difícil de conseguir. Los virus gripales son bien conocidos en la técnica y están descritos con más detalle por ejemplo en P. Palese, Nature Medicine, vol. 10, no. 12, págs. S82 a S86 de Diciembre de 2004, con referencias adicionales. Dicho en pocas palabras, el genoma del virus gripal A consiste en ocho segmentos de cadena sencilla y las partículas virales tienen dos glicoproteínas principales en su superficie: la hemaglutinina (H) y la neuraminidasa (N). Con al menos 16 subtipos diferentes de hemaglutinina (H1 a H16) y 9 subtipos diferentes de neuraminidasa (N1 a N9) hay una variación antigénica considerable entre los virus gripales.

Se ha demostrado que el virus gripal de tipo virus de la peste aviar H5N1 infecta a las aves de corral, a los cerdos y a los seres humanos. Los virus se pueden transmitir también directamente de las especies avícolas a los seres humanos (Claas et al., Lancet 1998, 351:472; Suarez et al., J. Virol. 1998, 72: 6678; Subbarao et al., Science 1998, 279: 393; Shortridge, Vaccine 1999, 17 (Supl. 1): S26-S29). La mortalidad en los casos clínicos humanos conocidos alcanza aproximadamente el 50%.

Durante el último siglo, los cerdos han sido un importante vector para las pandemias de gripe. Los cerdos, los camellos y las focas, preferiblemente los cerdos, pueden servir como una "cámara de mezcla" para los virus gripales aviares y, por lo tanto, representan un factor de riesgo potencial para superar las barreras entre especies desde las aves de corral, reservorio natural de los virus gripales, hasta los mamíferos. Esto tiene lugar normalmente por infecciones dobles de los animales susceptibles, por ejemplo cerdos, tanto con un virus establecido de mamífero (porcino) como con un virus gripal aviar. Esta doble infección puede crear nuevos virus recombinantes que pueden ser la causa de pandemias humanas o porcinas. Pruebas recientes, sin embargo, indican que una recombinación de las cepas H5 aviares comunes con los virus gripales de mamíferos no producirá recombinantes muy virulentos. Por otra parte, el virus gripal aviar puede infectar a los cerdos y, mediante mutaciones espontáneas, se puede adaptar a los cerdos. La barrera crítica se superará tan pronto como el virus pueda producir infecciones horizontales en una población de cerdos (u otro mamífero).

Además, una parte importante de los cerdos del sudeste asiático han sido infectados con cepas de virus gripal aviar (H5) originadas en explotaciones vecinas de aves de corral. Como estas infecciones han sido hasta ahora sub­ clínicas, solo pueden ser diagnosticadas mediante métodos de laboratorio y, por lo tanto, frecuentemente no se tienen en cuenta. Hay un riesgo elevado de que estos cerdos infectados subclínicamente sirvan como una oportunidad para que el virus se adapte al sistema de los mamíferos, se extienda dentro de la población porcina e infecte también a los seres humanos.

Las vacunas gripales actuales incluyen una vacuna de subunidades (Babai et al., Vaccine 1999, 17 (9-10): 1223­ 1238; Crawford et al, Vaccine 1999, 17(18): 2265-2274; Johansson et al, Vaccine 1999, 17(15-16): 2073-2080), una vacuna atenuada (Horimoto et al., Vaccine 2004, 22 (17-18): 2244-2247), una vacuna de DNA (Watabe et al., Vaccine 2001, 19 (31): 4434-4444) y una vacuna de gripe inactivada (Cao et al., Vaccine 1992, 10 (4): 238-242), siendo esta última la más ampliamente usada a escala comercial (Lipatov et al., J Virol 2004, 78 (17): 8951-8959). WO2012047941 A2 describe varias secuencias de polipéptidos de la H^a H5.

Las vacunas de subunidades, la hemaglutinina y la neuraminidasa recombinantes (Babai et al., Vaccine 1999, 17 (9-10)-.1223-1238; Crawford et al, Vaccine 1999, 17 (18): 2265-2274; Johansson et al, Vaccine 1999, 17 (15-16): 2073-2080) pueden ser una alternativa atractiva a la vacuna inactivada, aunque actualmente no hay ninguna en uso como vacuna comercial. La preparación de tales vacunas es obviamente más segura que la de una vacuna inactivada. Además, las vacunas de subunidades no generan respuestas de los anticuerpos frente a las proteínas internas del virus gripal y, por lo tanto, permiten distinguir entre los animales vacunados y los animales infectados. (Crawford et al., Vaccine 1999, 17 (18): 2265-2274).

La proteína hemaglutinina es la glicoproteína de fusión a la membrana y unión al receptor del virus gripal y la diana para los anticuerpos que neutralizan la capacidad de infectar. La proteína hemaglutinina (HA) completa del H5N1 está compuesta por 568 aminoácidos, con un peso molecular de 56 kDa. La molécula de HA consiste en las subunidades HA1 y HA2, siendo la subunidad HA1 la que posibilita el contacto inicial con la membrana celular y siendo la subunidad HA2 la responsable de la fusión a la membrana (Chizmadzhev, Bioelectrochemistry 2004, 63 (1-2):129-136).

Los sistemas baculovirus/células de insecto han sido usados para expresar los genes de la hemaglutinina aislados de los subtipos de gripe aviar (Babai et al., Vaccine 1999, 17 (9-10): 1223-1238; Crawford et al., Vaccine 1999, 17 (18): 2265-2274; Johansson et al., Vaccine 1999, 17 (15-16): 2073-2080); Nwe et al., BMC Microbiology 2006, 6 (16): DOI: 10.1186/1471-2180-6-16). Sin embargo, las proteínas recombinantes parece que no son protectoras en ningún caso, o son solamente poco eficaces al menos para algunas especies (Treanor et al., Vaccine 2001, 19: 1732-1737).

Además, desde 2006, el H5N1 se ha extendido desde Asia hasta el norte de África, y se han desarrollado cepas particulares de H5N1 en países del norte de África, como Egipto y Sudán, a las que se hace referencia en este documento como "H5N1 de origen norteafricano". La infección causada por cualquiera de estas cepas H5N1 de origen norteafricano no puede tratarse ni prevenirse adecuadamente con los medicamentos ni las vacunas convencionales contra H5N1. Por lo tanto, existe una necesidad particular de proteínas, moléculas de ácido nucleico, vectores y vacunas para tratar y prevenir específicamente las infecciones gripales causadas por cepas H5N1 de origen norteafricano.

Además, es necesario aumentar la disponibilidad de vacunas mejoradas y nuevas formas de vacunación, en particular en los países del norte de África, para proporcionar mejores formas de controlar las infecciones gripales y tener un impacto positivo en la carga de la enfermedad.

Compendio y descripción de la invención

Antes de recitar las realizaciones de la presente invención, hay que indicar que, como se usan en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular "un", "una" y "el", "la", incluyen la referencia al plural, a no ser que en el contexto se indique claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "una preparación" incluye una pluralidad de estas preparaciones; la referencia al "vehículo" es una referencia a uno o más vehículos y sus equivalentes conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente. A no ser que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen los mismos significados que entiende generalmente un especialista habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Todos los intervalos y valores dados pueden variar de 1 a 5% a menos que se indique otra cosa o que la persona experta en la técnica conozca de otro modo, por ello, el término "aproximadamente" se ha omitido de la memoria descriptiva. Aunque algunos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden usar en la práctica o en los ensayos de la presente invención, se describen ahora los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Nada en este documento debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a anteceder dicha divulgación en virtud de la invención anterior.

La solución al problema técnico anterior se consigue por la descripción y las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

El virus H5N1 de la gripe aviar altamente patógeno (HPAI) está muy extendido en el norte de África, en particular en Egipto, en diferentes compartimentos de la industria avícola. En el trabajo que sustenta la descripción, solamente se han detectado virus que pertenecen al Clado 2.2.1. Estos virus se pueden dividir sorprendentemente en dos subpoblaciones (Subclados A y B) que son genéticamente y antigénicamente distintas. Los subclados A y B circulan conjuntamente en aves de corral de crianza intensiva y continúan evolucionando. Ambos subclados parecen evolucionar rápidamente y es posible la aparición de variantes antigénicas.

Se realizaron análisis de secuenciación, y todas las secuencias de HA (hemaglutinina) de los virus analizados estaban agrupadas en el clado 2.2.1. El análisis de los datos indica que los virus 2.2.1 que circulan en el norte de África son genéticamente y antigénicamente heterogéneos. Se pudieron identificar dos grupos genéticos principales dentro del clado 2.2.1 en el norte de África, denominados subclado A y subclado B.

Sin embargo, en comparación con el subclado A, los virus del subclado B son los más frecuentes en las muestras examinadas. De hecho, de 67 secuencias examinadas, 50 (75%) estaban en el subclado B y 17 (2,5%) en el subclado A. El subclado A es heterogéneo e incluye los virus aislados en el norte de África. Este grupo de virus, denominado aquí A1, está evolucionando y parece que llegará a ser el grupo dominante dentro del clado A. El subclado B es un grupo monofilético de virus en evolución continua y divergente. Dentro de este subclado se pueden identificar ramas separadas. Actualmente, el subclado B presenta características genéticas distintas y se puede clasificar como un nuevo clado emergente distinto, según la nomenclatura de la Organización Mundial de la Salud (OMS).

El análisis preliminar basado en los virus del subclado B indicó que en este subclado han tenido lugar varias mutaciones adicionales de AA (de aminoácidos) (13 a 23). Los ensayos de laboratorio basados en la inhibición de la hemaglutinina (HI) cruzada dan a entender que el subclado B es antigénicamente diferente del subclado A, lo que justifica los datos genéticos.

De hecho, el análisis de secuencia realizado en dos cepas prototipo que circulan, el ciado A y el ciado B, reveló doce diferencias de aminoácidos en la molécula HA. Diez de las doce se localizaron en el sitio de unión al receptor (RBS) con un impacto en la antigenicidad (como lo revela el ensayo de (HI)) y sobre la afinidad de unión al receptor del huésped.

La descripción se basa en el sorprendente hallazgo de que proteínas particulares, moléculas de ácido nucleico, y vectores basados en dicha información recibida, pueden servir como vacunas eficaces para el tratamiento y prevención de las infecciones gripales causadas por el virus H5N1 de origen norteafricano.

Proteínas gripales y moléculas de ácido nucleico que las codifican

La presente invención proporciona una vacuna que comprende

a) proteína H5 del virus gripal, en donde la proteína H5 consiste en o comprende una cualquiera de las secuencias representadas en las SEQ ID NO: 2 a 12, o 35 o 36 o 40;

b) un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona además la vacuna como se describe en el presente documento para uso en un método de tratamiento o prevención de infecciones con el virus de H5N1 Subclado A de origen norteafricano.

En un aspecto, la presente descripción se refiere a una proteína H5 del virus gripal, donde la proteína H5 tiene (a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, en donde el término “145(-)”, o modificación 145(-), respectivamente, significa que se ha perdido la posición del aminoácido 145 de H5, o

(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201 E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o

(c) los aminoácidos 145L, 172T, 254V, y

donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido o posiciones de aminoácidos, respectivamente, como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO: 1. En el contexto de la descripción, la proteína H5 según (a) es una proteína del subclado A, y la proteína H5 según (b) o (c) es una proteína del subclado B.

Dentro del contexto de la descripción, se entiende que el término “aminoácido” se refiere en particular a un resto de aminoácido o, respectivamente, a un aminoácido que se ha unido covalentemente mediante enlaces peptídicos a dos aminoácidos adicionales o, si el aminoácido está localizado en el extremo N o C de la secuencia peptídica, a otro aminoácido adicional.

La presente descripción se refiere también a una proteína H5, que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias que se indican en las SEQ ID NOs: 2 a 40. Preferiblemente, la proteína H5 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias que se indican en las SEQ ID NOs: 8, 13 o 40, y donde tales proteínas H5 que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 13 son más preferidas.

Según la descripción, las proteínas que comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 40 son preferidas, puesto que debido a la combinación de las características de ambos subclados A y B, pueden servir por tanto como una vacuna universal eficaz frente a las infecciones de gripe causadas por el virus H5N1 de origen norteafricano.

En un aspecto preferido, la proteína H5 según la descripción tiene el aminoácido 239N. El término “239N” dado como ejemplo, significa que el aminoácido en la posición 239 - numerando según las posiciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 - codificará el aminoácido asparagina (N). En otras palabras, si se hace referencia a una "proteína H5 que tiene el aminoácido 239N", significa que en una molécula de aminoácido H5 que normalmente codifica la serina en la posición del aminoácido 239 - numerando según las posiciones de aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO: 1, este aminoácido debe estar sustituido por una asparagina (N).

En un aspecto preferido particular, la proteína H5 según la descripción no comprende la secuencia señal de hemaglutinina del H5N1 de la gripe A, donde dicha secuencia señal de hemaglutinina H5N1 de la gripe A de la proteína H5 comprende preferiblemente o consiste preferiblemente en los 16 primeros aminoácidos con N-terminal (código de una letra) MEKIVLLLAIVSLVKS (SEQ ID NO:44) o M1 E2 K3 I4 V5 L6 L7 L8 A9 I10 V11 S12 L13 V14 K15 S16, respectivamente, donde la numeración de las posiciones de los 16 primeros aminoácidos del extremo Nl se refiere a las posiciones de los aminoácidos 1 a 16 como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO 1, especialmente en referencia a la secuencia (código de tres letras) Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser como se indica en la SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto preferido, la proteína H5 según la descripción comprende o consiste por tanto en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 40, donde dichas secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 40 empiezan con el aminoácido D17, y donde la numeración de la posición de dicho primer aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición del aminoácido 17 como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO 1.

La Tabla B proporciona las secuencias respectivas SEQ ID NO: 55 a 92 que corresponden a las variantes de las secuencias representadas en SEQ ID NO: 2 a 39, en donde las SEQ ID NO: 55 a 92 comienzan con el aminoácido respectivo D17 de SEQ ID NOs: 2 a 39, como se menciona aquí, y la Tabla D proporciona la variante respectiva de secuencia SEQ ID NO: 40, es decir, SEQ ID NO: 131, donde la secuencia variante comienza con el aminoácido D17, como se menciona aquí.

Por tanto, en un ejemplo, la proteína H5 según la descripción preferiblemente comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con la secuencia polipeptídica

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCNLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSY IVEKINPTNDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSDHEASGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLTKKNNAYP TIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKSN DAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGDCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGL RNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQF EAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEF YHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMV (SEQ ID NO:45), en donde esta secuencia corresponde a una variante de SEQ ID NO: 8, en donde la variante comienza con el aminoácido D17 de SEQ ID NO: 8, donde la numeración de la posición del aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición del aminoácido 17 como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO 1.

En otro ejemplo, la proteína H5 según la descripción preferiblemente comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con la secuencia polipeptídica

DQ IC IG YHANNSTEQ VDTIM EKNVTVTHAQ DILEKTHNGKLCDLG GVKPLILRDCSVAGW LLG

N PM C D EFP N V S E W S YIV E KIN P A N D LC Y P G N FN N Y EE LK H LLS R IN R FE K IQ IIP KS SWPDHE

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GLRNSPGGEGRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEGGSGYAADKESTQKAIDGV

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DSNVRNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEIS

G V K LE S IG T Y Q ILS IY S T V A S S LA LA IM V A G LF LW M C S N G S LQ C R IC I, (SEQ ID NO: 46)

en donde la secuencia corresponde a SEQ ID NO: 13 que comienza con el aminoácido D17, y en donde la numeración de la primera posición de aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición de aminoácido 17 como se da a modo de ejemplo en SEQ ID NO: 1.

Por lo tanto, se entiende que el término "variantes de SEQ ID NO: 2 a 40" también se dirige preferiblemente a las secuencias de variantes que comienzan con el aminoácido D17 de SEQ ID NO: 2 a 40, y en donde las secuencias variantes de SEQ ID Los NO 2 a 39 que comienzan con el aminoácido D17 se dan en la Tabla B y corresponden a SEQ ID NO: 55 a 92, y en donde la secuencia de SEQ ID NO: 40 que comienza con el aminoácido D17 tiene la secuencia

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NPMCDEFPNVSEWSYIVEKINPANDLCYPGNFNNYEELKHLLSRINRFEKIQIIPKSSWPDHE

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GVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI ^{(SEQ ID NO: 47).}

En un aspecto adicional preferido la proteína H5 según la descripción comprende una secuencia C-terminal de longitud completa, donde la secuencia C-terminal de longitud completa corresponde preferiblemente a los aminoácidos 527 a 568, donde la numeración de las posiciones de dichos aminoácidos se refiere a las posiciones de los aminoácidos 527 a 568 que se dan como ejemplo en la SEQ ID NO 40. La secuencia C-terminal de longitud completa es, por lo tanto, preferiblemente la secuencia IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 48), donde en un aspecto preferido adicional el resto de fenilalanina (F) es un resto de serina (S) o donde en otro aspecto preferido la secuencia IMVA (SEQ ID NO: 49) está sustituida por la secuencia IMMA (SEQ ID NO: 50). La secuencia C-terminal de longitud completa es por tanto preferiblemente la secuencia IGTYQILSIYS-TVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 51) o la secuencia IGTYQILSIYSTVASSLALAIMVA-GLSLWMCSNGSLQCRICI (SEQ ID NO: 52) o la secuencia IGTYQILSIYSTVASSLALAIMMAGLSLWMCSNGSLQ-CRICI (SEQ ID NO: 53).

Por lo tanto, en otro aspecto preferido adicional, la proteína H5 según la descripción consiste en o comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, aún más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% homóloga con cualquiera de las secuencias representadase en SEQ ID NO: 2 a 40, secuencias representadas en SEQ ID NO: 47, 93-130 que corresponden a variantes de SEQ ID NO: 2 a 40 que comienzan con el aminoácido D17 y además comprenden una secuencia C-terminal de longitud completa, en donde la numeración de la primera posición de aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición de aminoácido 17 que se proporciona a modo de ejemplo en la SEQ ID NO: 1, y en donde la secuencia C-terminal de longitud completa corresponde a los aminoácidos 527 a 568, en donde la numeración de estas posiciones de aminoácidos se refiere a las posiciones de aminoácidos 527 a 568 que se proporcionan a modo de ejemplo en la SEQ ID NO 40.

La Tabla C presenta las secuencias respectivas SEQ ID NOs 93 a 130, donde dichas secuencias empiezan con el aminoácido D17 y comprenden una secuencia C-terminal de longitud completa, como se menciona aquí, y la Tabla D presenta la secuencia respectiva SEQ ID NO: 131, donde dicha secuencia empieza con el aminoácido D17 de SEQ ID NO: 40 y comprende una secuencia C-terminal de longitud completa, como se menciona aquí.

Así, en un ejemplo, la proteína H5 según la descripción preferiblemente comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con la secuencia polipeptídica

DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCNLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFLNVPEWSY IVEKINPTNDLCYPGNFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKNSWSDHEASGVSSACPYQGRSSFFRNVVWLTKKNNAYP TIKKSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTRLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPKIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKSN DAINFESNGNFIAPENAYKIVKKGDSTIMKSELEYGDCNTKCQTPIGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGL RNSPQGERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQF EAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEF YHRCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGTYQILSIYSTVASSLALAIMVAGLFLWMCSNGSLQC RICI (SEQ ID NO:45), donde dicha secuencia corresponde a la SEQ ID NO: 8 que comienza con el aminoácido D17 y que adicionalmente comprende una secuencia C-terminal de longitud completa, donde la numeración de la posición de dicho primer aminoácido N-terminal (D17) se refiere a la posición 17 de los aminoácidos como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO 1, y donde la secuencia C-terminal de longitud completa corresponde a los aminoácidos 527 a 568, más particularmente a los aminoácidos 534 a 568, donde la numeración de las posiciones de dichos aminoácidos se refiere a las posiciones 527 a 568, o más particularmente a las posiciones de los aminoácidos 534 a 568, como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO 40. El término “SEQ ID NO: 8” según la invención, se refiere por tanto en particular preferiblemente también a la última secuencia. Aquí, esta secuencia, SEQ ID NO: 45, y las secuencias que tienen diferentes secuencias C-terminales pueden ser designadas como una "variante de SeQ ID NO: 8".

Por lo tanto se debe entender también, que el término "SEQ ID NOs 2 a 40" se refiere también preferiblemente a las secuencias SEQ ID NOs: 2 a 40 que comienzan con el aminoácido D17 y que tienen la secuencia C-terminal de longitud completa, y donde dichas secuencias SEQ ID No 2 a 39 que comienzan con el aminoácido D17 y que tienen la secuencia C-terminal de longitud completa se dan en la Tabla C, y dicha secuencia SEQ ID NO: 40 que comienza con el aminoácido D17 y que tiene la secuencia C-terminal de longitud completa se da en la Tabla D.

Los términos "secuencias de variantes representadas en las SEQ ID NOs: 2 a 40” o “secuencias de variantes de SEQ ID NOs: 2 a 40”, como se usa aquí, se refiere preferiblemente también a las secuencias indicadas en la Tabla B o Tabla C, respectivamente, y, adicionalmente, a la secuencia representada en la Tabla D, respectivamente.

Se entiende en particular que el término “100% de homología con” como se menciona aquí, es equivalente al término “idéntico a”.

Preferiblemente, dicha proteína H5 y cualquier otra proteína H5 es una proteína H5 aislada. Se ha encontrado sorprendentemente que las proteínas H5 que tienen las modificaciones descritas anteriormente son muy antigénicas en comparación con las proteínas H5 que no tienen los aminoácidos correspondientes.

El término “hemaglutinina 5 (H5)” o “virus H5 de la gripe aviar” o "proteína H5” como se usa en esta memoria significa, pero sin limitarse a ellas, cualquier proteína H5 existente de forma natural y cualquier forma modificada de la proteína H5, incluyendo cualquier mutante por deleción, sustitución y/o inserción de la proteína H5, donde estas proteínas H5 tienen

(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, en donde el término “145(-)” significa que se ha perdido la posición del aminoácido 145 de H5, o

(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o

(c) los aminoácidos 145L, 172T, 254V,

o, más preferiblemente, tienen

(d) los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, o

(e) los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o (f) los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H, 254V.

La numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 como se usa en la presente memoria, se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la secuencia SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 1 representa la secuencia amino de la hemaglutinina de la cepa 1709-6, que es un viejo prototipo oficial de cepa egipcia para la evaluación de vacunas. En otras palabras, si se hace referencia al aminoácido en la posición 113 (aminoácido 113), significa que el resto aminoácido corresponde al aminoácido 113 en la secuencia SEQ ID NO: 1. Sin embargo, esto no significa que las proteínas H5 según la presente descripción tengan la secuencia de aminoácidos idéntica a SEQ ID NO: 1. Solo indica que los aminoácidos correspondientes de las proteínas H5 según la descripción codifican el resto aminoácido que se menciona explícitamente. En este caso, el aminoácido 113 sería la asparagina (N). El término “113D” dado como ejemplo significa que el aminoácido en la posición 113 - numerando según las posiciones de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 - codificará el aminoácido ácido aspártico (D). En otras palabras, si se hace referencia a una "proteína H5 que tiene el aminoácido 113D”, significa que en una molécula de aminoácido de H5 que normalmente codifica la asparagina en la posición del aminoácido 113 - numerando según las posiciones de aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO: 1 - este aminoácido debe estar sustituido por un ácido aspártico (D). El término “145(-)” o “modificación 145(-)” significa, que en la posición del aminoácido 145 de la proteína H5 - numerando según las posiciones de aminoácidos de la secuencia SEQ ID NO: 1 -, el aminoácido en dicha posición, que es un resto de serina en la secuencia SEQ ID NO: 1, se ha perdido o está ausente, respectivamente. Sin embargo, la mayor parte de las secuencias conocidas de H5 codifican la serina en la posición del aminoácido 145. En cualquiera de tales casos, la modificación del término 145(-) significa, que los restos que habitualmente flanquean dicha posición (por ejemplo, Serina144 y Glicina146 en la SEQ ID NO: 1) están directamente enlazados (por ejemplo, Serina144 y Glicina145). Tomando a modo de ejemplo la SEQ ID NO: 1, la secuencia modificada comprendería entonces la secuencia Alanina-Serina-Glicina-Valina (ASGV) (SEQ ID NO. 54). Además, el término "hemaglutinina 5 (H5)" o "virus H5 de la gripe aviar" o "proteína H5" como se usa en esta memoria significa, pero sin limitarse a ellas, cualquier proteína H5 existente de forma natural y cualquier forma modificada de la proteína H5, incluido cualquier mutante de la proteína H5 con deleción, sustitución y/o inserción, donde estas proteínas H5 comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 40. Preferiblemente, la proteína H5 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 8, 13 o 40, y donde tales proteínas H5 que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 13 son en particular las más preferidas.

Por tanto, la presente descripción se refiere a la proteína H5 y a cualquier forma modificada de la proteína H5, incluyendo cualquier mutante de la proteína H5 con deleción, sustitución y/o inserción, donde estas proteínas H5 tienen

(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, en donde el término "145(-)" significa que se ha perdido la posición del aminoácido 145 de H5, o

(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o

(c) los aminoácidos 145L, 172T, 254V,

en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO: 1; o

(d) donde estas proteínas H5 comprenden o consisten en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 40.

Preferiblemente, la proteína H5 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 8, 13 o 40, y donde tales proteínas H5 que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 13 son en particular más preferidas.

Se explica por sí mismo, que cualquiera de las proteínas H5 que se proporcionan con la presente memoria es antigénica, lo que significa que presenta propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina para los virus gripales.

Según otro aspecto, la presente descripción se refiere también a cualquier parte de la proteína H5, lo que significa cualquier fragmento peptídico que presenta propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina, que tiene al menos

(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, en donde el término "145(-)" significa que se ha perdido la posición del aminoácido 145 de H5, o

(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o

(c) los aminoácidos 145L, 172T, 254V,

en donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO: 1.

Una proteína H5 presenta propiedades antigénicas si inhibe la hemaglutinación en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina. Normalmente dicha parte antigénica de la proteína H5 comprende 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 o lo más preferiblemente 105 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos que codifica la proteína H5 como se ha mencionado antes, modificada o no modificada, que presenta propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina. Un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina por ejemplo está descrito también en Stephenson et al., Virus Research vol. 103, pp. 91-95 (2004) con referencias adicionales. Sin embargo, se debe entender que el ensayo HI como se describe a continuación, es el ensayo de referencia pertinente relacionado con todos los aspectos de la descripción como se describe en la presente memoria.

En pocas palabras, se realiza un ensayo HI para detectar la presencia de anticuerpos específicos para la HA. Se utiliza un H5N1 heterólogo a una concentración de cuatro unidades de hemaglutinación [4 unidades HA] en el ensayo HI. En placas de microtitulación con fondo en U se mezclan posteriormente diluciones en serie al doble en PBS con volúmenes iguales (25 pL) que contienen 4 unidades HA de virus, y se incuban a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C) durante 30 minutos. Se añaden glóbulos rojos de pollo a una concentración de 0,5% en PBS a los pocillos que contienen el virus en suero y se incuban durante 40 minutos a temperatura ambiente. Los títulos HI se determinan como la inversa de las diluciones más altas de suero en las que se observó inhibición de la hemaglutinación.

Hay que señalar que Haesebrouck and Pensaert (1986) encontraron que "puede existir una correlación entre los títulos de HI frente al virus de ataque y la protección del ataque". Haesebrouck and Pensaert (1986) determinaron también que los cerdos con títulos de HI >40 fueron "completamente resistentes al ataque y no se produjo ninguna replicación del virus en el tracto respiratorio durante el ataque". Por lo tanto, el desarrollo de títulos HI >40 en el ganado porcino vacunado deben estar correlacionados con la protección. (F. Haesebrouck and M.B. Pensaert, 1986). "Effect of intratracheal challenge of fattening pigs previously immunized with an inactivated influenza H1N1 vaccine” (Veterinary Microbiology, 11 (1986) 239-249). Se debe suponer que los títulos HI de la H5 equivalentes o al menos casi equivalentes también producirán una protección inmune completa del ganado porcino frente al virus gripal aviar. Los títulos más bajos producen al menos una seroconversión de los animales vacunados y dan lugar a una protección inmune parcial de estos animales, lo cual también puede reducir de forma importante el riesgo de una pandemia.

Además, una parte antígénica de la proteína H5 según la descripción incluye, pero sin limitarse a ellos, los mutantes de la proteína H5 con deleción que comprenden:

i) una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs:2 a 40;

ii) cualquier péptido que tiene al menos el 85%, preferiblemente 95%, aún más preferiblemente 96%, aún más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, aún más preferiblemente 99%, lo más preferiblemente 100% de homología de secuencia con el polipéptido de i) y que comprende la inhibición de la hemaglutinina en un ensayo convencional de inhibición de hemaglutinina; o

iii) cualquier parte de los polipéptidos de i) o ii) que comprende al menos 334 aminoácidos contiguos de cualquiera de dichos péptidos de i) o ii) y en donde cualquiera de dichos péptidos comprende la inhibición de la hemaglutinina en un ensayo convencional de inhibición de hemaglutinina.

Preferiblemente, la parte antigénica de la proteína H5 según la descripción comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 8, 13 o 40, y donde tales proteínas H5 que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 13 son en particular las más preferidas.

El término "modificación" en el contexto de la descripción, se refiere también en particular a las sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, el término "113D" en el contexto de la SEQ ID NO: 1 se refiere a la sustitución del aminoácido N113D, esto es el aminoácido asparagina (N) en la posición 113 ha sido sustituido por el aminoácido ácido aspártico (D).

"Homología de secuencia", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un método para determinar el grado de relación de dos secuencias. Para determinar la homología de secuencia, se alinean de forma óptima dos o más secuencias y, si es necesario, se introducen huecos. En contraposición con la identidad de la secuencia, las sustituciones conservadoras de aminoácidos se cuentan como un emparejamiento cuando se determina la homología de secuencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido o polinucleótido que tiene 95% de homología de secuencia con una secuencia de referencia, 85%, preferiblemente 90%, incluso más preferiblemente 95% de los restos de aminoácidos o nucleótidos en la secuencia de referencia deben aparearse o comprender una sustitución conservadora con otro aminoácido o nucleótido, o un cierto número de aminoácidos o nucleótidos hasta 15%, preferiblemente hasta 10%, incluso más preferiblemente hasta 5% del total de restos de aminoácidos o nucleótidos, sin incluir las sustituciones conservadoras, en la secuencia de referencia pueden estar insertados en la secuencia de referencia. Preferiblemente, la secuencia homóloga comprende al menos un tramo de 50, incluso más preferiblemente de 100, incluso más preferiblemente de 250, incluso más preferiblemente de 500 nucleótidos. Tras dicha alineación, la homología de secuencia se constata sobre una base de posición-por-posición, por ejemplo las secuencias son "homólogas" en una posición particular si en esa posición los restos nucleotídicos o de aminoácidos son idénticos. El número total de dichas identidades de posición se divide entonces por el número total de restos de nucleótidos o de aminoácidos en la secuencia de referencia para dar el% de homología de secuencia. La homología de secuencia se puede calcular fácilmente por métodos conocidos, que incluyen, pero sin limitarse a ellos, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., comp., Oxford University Press, Nueva York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M. and Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J , eds., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo, H, and Lipman, D, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Se han diseñado métodos preferidos para determinar la homología de secuencia para obtener el mayor emparejamiento entre las secuencias sometidas a ensayo. Los métodos para determinar la homología de secuencia se codifican en programas de ordenador disponibles públicamente que determinan la identidad de secuencia entre secuencias dadas. Ejemplos de este tipo de programas incluyen, pero sin limitarse a ellos, el paquete de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)). El programa ^b L^a STX está públicamente disponible de NCBI y de otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. et al., Nc VI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403-410 (1990). Estos programas alinean de forma óptima las secuencias utilizando pesos de huecos por defecto con el fin de producir el nivel más alto de homología de secuencia entre la secuencia dada y la de referencia.

Otro aspecto preferible según la descripción es el uso de una proteína H5 que tiene los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, o preferiblemente que tiene los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145 (-), 156R, 160F, 167T, y 181N, en un método para tratar o prevenir las infecciones con un virus H5N1 de subclado A de origen norteafricano, donde la modificación 145(-) significa que la posición del aminoácido 145 de H5 se ha perdido y donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido dada como ejemplo en la SEQ ID NO: 1, y donde dicha proteína H5 se administra a un sujeto que lo necesita.

A este respecto, especialmente para tratar o prevenir particularmente infecciones con un virus H5N1 de subclado A de origen norteafricano, se prefiere que la proteína H5 usada comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene al menos 95%, preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, aún más preferiblemente al menos 98%, todavía más preferiblemente al menos 99%, o en particular preferiblemente 100% de homología o identidad con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 12, o 35 o 36. Asimismo, una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de tales proteínas H5, por ejemplo la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 41, o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, como se menciona más adelante, se usan en un método para tratar o prevenir las infecciones con un virus H5N1 de subclado A administrando dicha molécula o vector a un sujeto que lo necesita.

En el contexto de la descripción, el término "virus H5N1 de subclado A de origen norteafricano" o "virus de subclado A", respectivamente, se refiere en particular a cualquier virus gripal H5N1 que comprende una proteína H5 que tiene los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, o preferiblemente que tiene los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, donde la modificación 145(-) significa que se ha perdido la posición del aminoácido 145 de H5 y donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido dada como ejemplo en la SEQ ID NO: 1.

Más particularmente, el término "virus H5N1 de subclado A de origen norteafricano" o "virus de subclado A", respectivamente, se refiere a cualquier virus gripal H5N1 que comprende una proteína H5 con al menos 95%, preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, aún más preferiblemente al menos 98%, todavía más preferiblemente al menos 99%, o en particular preferiblemente 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 12, o 35 o 36.

Otro aspecto preferible según la descripción es el uso de una proteína H5 que tiene los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o preferiblemente que tiene los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G, o el uso de una proteína H5 que tiene los aminoácidos 145L, 172T, 254V o preferiblemente que tiene los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156^g , 160Y, 172T, 181H, 254V, en un método para tratar o prevenir infecciones con un virus H5N1 de subclado B de origen norteafricano, donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido dado como ejemplo en la SEQ Id NO: 1, y donde dicha proteína H5 se administra a un sujeto que lo necesita.

A este respecto, especialmente para tratar o prevenir particularmente infecciones con un virus H5N1 de subclado B de origen norteafricano, se prefiere que la proteína H5 usada comprenda o consista en una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene al menos 95%, preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, aún más preferiblemente al menos 98%, todavía más preferiblemente al menos 99%, o en particular preferiblemente 100% de homología o identidad con una cualquiera de las secuencias indicadas en la SEQ ID NOs: 13 a 34, o 37 a 39. Asimismo, a este respecto, una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de tales proteínas H5, por ejemplo la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 42, o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, como se menciona más adelante, se usan en un método para tratar o prevenir las infecciones con un virus H5N1 de subclado B administrando dicha molécula o vector a un sujeto que lo necesita.

En el contexto de la descripción, el término "virus H5N1 de subclado B de origen norteafricano" o "virus de subclado B", respectivamente, se refiere en particular a cualquier virus gripal H5N1 que comprende una proteína H5 que tiene los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o preferiblemente que tiene los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, y 341G, o que comprende una proteína H5 que tiene los aminoácidos 145L, 172T, 254V o preferiblemente que tiene los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H, y 254V, donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido dado como un ejemplo en la SEQ ID NO: 1.

Más particularmente, el término "virus H5N1 de subclado B de origen norteafricano" o "virus de subclado B", respectivamente, se refiere a cualquier virus gripal H5N1 que comprende una proteína H5 con al menos 95%, preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, aún más preferiblemente al menos 98%, todavía más preferiblemente al menos 99%, o en particular preferiblemente 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 13 a 34, o 37 a 39.

Un aspecto particular preferido según la descripción es el uso de una proteína H5 que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos contiguos que tiene al menos 95%, preferiblemente al menos 96%, más preferiblemente al menos 97%, aún más preferiblemente al menos 98%, todavía más preferiblemente al menos 99%, o en particular preferiblemente 100% de homología o identidad con la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 40 en un método para tratar o prevenir infecciones con un virus H5N1 de subclado A de origen norteafricano y/o con un virus H5N1 de subclado B de origen norteafricano, y donde dicha proteína H5 se administra a un sujeto que lo necesita.

Asimismo, a este respecto, una molécula de ácido nucleico que codifica cualquiera de tales proteínas H5, tal como la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 43, o un vector que comprende dicha molécula de ácido nucleico, como se menciona más adelante, se usan en un método para tratar o prevenir las infecciones con un virus H5N1 de subclado A y/o un virus de subclado B administrando dicha molécula o vector a un sujeto que lo necesita.

Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere también a moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de las proteínas H5 como se han descrito anteriormente. Preferiblemente, estas moléculas de ácido nucleico son moléculas de RNA, DNA o (c)DNA. Por lo tanto, la presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de cDNA que codifica una proteína H5 o cualquiera de las formas modificadas de la proteína H5, incluyendo cualquier mutante por deleción, sustitución y/o inserción de la proteína H5, donde estas proteínas H5 tienen

(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, en donde el término "145(-)" significa que se ha perdido la posición del aminoácido 145 de H5, o

(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o

(c) los aminoácidos 145L, 172T, 254V,

o, más preferiblemente, que tienen

(d) los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, 181N, o

(e) los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160

421K, o (f) los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H, 254V,

y donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido dada como ejemplo en la SEQ ID NO: 1.

Además, la presente descripción se refiere a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de cDNA que codifica una proteína H5 o cualquiera de las formas modificadas de la proteína H5, incluyendo cualquier mutante por deleción, sustitución y/o inserción de la proteína H5, donde la proteína H5 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 40. Preferiblemente, la proteína H5 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 8, 13 o 40, y donde tales proteínas H5 que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 13 son en particular más preferidas.

Según otro aspecto, la presente descripción se refiere también a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de cDNA que codifica cualquier parte de la proteína H5, lo que significa cualquier fragmento peptídico que presenta propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina como se ha descrito anteriormente, y que tiene

(a) los aminoácidos 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, en donde el término "145(-)" significa que se ha perdido la posición del aminoácido 145 de H5, o

(b) los aminoácidos 87P, 145L, 172T, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o

(c) los aminoácidos 145L, 172T, 254V,

o, más preferiblemente, que tiene

(d) los aminoácidos 87L, 113D, 126H, 145(-), 156R, 160F, 167T, y 181N, o

(e) los aminoácidos 87P, 113N, 126R, 145L, 160Y, 172T, 181H, 201E, 206I, 208K, 254T, 341G y 421K, o (f) los aminoácidos 87L, 113N, 126R, 145L, 156G, 160Y, 172T, 181H, 254V,

y donde la numeración de las posiciones de aminoácidos de la proteína H5 se refiere a la posición de aminoácido dada como ejemplo en la SEQ ID NO: 1. Normalmente, dichas moléculas de ácido nucleico que codifican una parte antigénica de la proteína H5 comprenden 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360, 330 o más preferiblemente 315 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína H5 como se ha mencionado anteriormente, modificada o no modificada, y que presenta propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina como se describe en la presente memoria.

Según otro aspecto, la presente descripción se refiere también a una molécula de ácido nucleico, preferiblemente una molécula de cDNA que codifica cualquier parte de la proteína H5, lo que significa que codifica cualquier fragmento peptídico que presenta propiedades antigénicas en un ensayo convencional de inhibición de la hemaglutinina como se ha descrito antes, donde la proteína H5 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 40. Preferiblemente, la proteína H5 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de homología con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 8, 13 o 40, y donde tales proteínas H5 que comprenden o consisten en la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO: 13 son en particular más preferidas.

Otros aspectos de las partes antigénicas de la proteína H5 se describen en la parte precedente. La construcción de cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de cDNA, que codifican la parte antigénica de la proteína H5 como se ha descrito anteriormente, es de conocimiento general de un experto en la técnica. Esto incluye también, pero sin limitarse a ella, la construcción de moléculas de ácido nucleico, preferiblemente de moléculas de cDNA, que codifican partes antigénicas de la proteína H5 como se ha mencionado antes.

Preferiblemente y a modo de ejemplo, la molécula de ácido nucleico mencionada antes comprende o consiste en una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico indicadas en las SEQ ID NOs: 41 a 43.

Los métodos para introducir cualquiera de las modificaciones mencionadas anteriormente dentro de la secuencia de nucleótidos, incluyendo la secuencia que codifica la proteína H5 de un virus gripal, son bien conocidos en la técnica. La secuencia genómica completa del virus gripal se pueden modificar según la descripción, por ejemplo según los métodos descritos en el documento US 6.951.754, con referencias adicionales.

Además, se pueden emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y de DNA recombinante conocidas por el experto en la técnica para modificar una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un antígeno como se ha descrito en la presente memoria. Dichas técnicas están completamente explicadas en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994).

Según un aspecto adicional, la presente invención se refiere también a un vector que comprende cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico como se han descrito anteriormente. En otras palabras, la presente descripción se refiere a un vector que incluye la secuencia que codifica cualquiera de dichas proteínas H5, o una de sus partes, como se han descrito anteriormente. Preferiblemente, dicho vector es un vector de expresión que permite la expresión de cualquiera de dichas proteínas H5 o una de sus partes como se han descrito anteriormente. Los vectores según la descripción son aquellos que son adecuados para la transfección o infección de células bacterianas, de levaduras o animales, in vitro o in vivo.

Los vectores y los métodos para hacer y/o usar vectores (o recombinantes) para la expresión pueden ser los descritos, o análogos a los descritos en: las patentes estadounidenses N° 4.603.112, 4.769.330, 5.174.993, 5.505.941, 5.338.683, 5.494.807, 4.722.848, 5.942.235, 5.364.773, 5.762.938, 5.770.212, 5.942.235 y 382.425, las publicaciones PCT WO 94/16716, WO 96/39491 y WO 95/30018, Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, Octubre de1996, Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, Octubre de 1996, Smith et al., patente estadounidense N° 4.745.051, (baculovirus recombinante), Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.), Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, Dic., 1983, Vol. 3, N° 12, p. 2156-2165; Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology Mar. 1984, Vol. 4, N° 3, p.

399-406; EPA0 370 573, solicitud de patente estadounidense N° 920,197, presentada el 16 de Octubre de 1986, publicación de patente EP N° 265785, patente estadounidense N° 4.769.331 (virus del herpes recombinante), Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, Octubre de 1996, Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex virus to the treatment of experimental brain tumors," pNa S USA 93: 11313-11318, Octubre de1996, Robertson et al. "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, Octubre 1996, Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, Octubre 1996, Kitson et al., J. Virol. 65,3068-3075,1991; las patentes de Estados Unidos números. 5.591.439, 5.552.143, WO 98/00166, las solicitudes de Estados Unidos concedidas con números de serie 08/675.556, y 08/675.566 presentadas ambas el 3 de julio de 1996 (adenovirus recombinante), Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993, Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65,Graham, Tibtech 8,85-87, Abril, 1990, Prevec et al., J. Gen Virol. 70,42434, PCT WO 91/11525, Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269,2550-2561, Science, 259: 1745-49,1993 y McClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996, y las patentes estadounidenses N° 5.591.639, 5.589.466 y 5.580.859, así como los documentos WO 90/11092, WO93/19183, WO94/21797, WO95/11307, WO95/20660, Tang et al., Nature y Furth et al. Analytical Biochemistry, relacionados con los vectores de expresión del DNA, entre otros. Véanse también los documentos WO 98/33510; Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739,1998 (sistema de expresión lentiviral); Sanford et al., patente estadounidense N° 4.945.050; Fischbach et al. (Intracel), WO 90/01543; Robinson et al., seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems); Szoka et al., patente estadounidense N° (método para insertar DNA en células vivas); McCormick et al., patente estadounidense N° 5.677.178 (uso de virus citopáticos); y la patente estadounidense N° 5.928.913 (vectores para la administración de genes), así como otros documentos citados en la presente memoria.

En la práctica de la descripción se usa ventajosamente un vector viral, por ejemplo, elegido entre los virus de herpes de cerdo, tal como el virus de la enfermedad de Aujeszky, adenovirus porcino, virus de la viruela, especialmente virus vaccinia, virus de la viruela aviar, virus de la viruela de los canarios y virus de la viruela porcina, así como vectores de DNA (plásmidos de DNA).

Métodos para producir las proteínas H5 según la presente descripción

Según otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para producir y/o recuperar cantidades elevadas de proteína H5 recombinante, por medio de: i) permitir la infección de células susceptibles cultivadas con un vector viral recombinante que contiene secuencias codificadoras de DNA de la H5, donde la proteína H5 es expresada por el vector viral recombinante, y ii) recuperar a continuación la proteína H5 del cultivo celular. Cantidades elevadas de proteína H5 significan, pero sin estar limitadas a ellas, más de aproximadamente 20 pg/mL de cultivo celular, preferiblemente más de aproximadamente 25 pg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 30 pg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 40 pg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 50 pg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 60 pg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 80 pg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 100 pg/mL, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 150 pg/mL y lo más preferiblemente más de aproximadamente 190 pg/mL.

Según un aspecto preferido, la proteína H5 se recupera recogiendo las células SF+ completas (es decir, intactas) que expresan la proteína H5.

Las células preferidas son aquellas susceptibles de infección con un vector viral recombinante apropiado que contiene un DNA de H5 y que expresa la proteína H5. Preferiblemente, las células son células de insectos y, más preferiblemente, incluyen las células de insectos vendidas bajo la marca registrada de células de insectos SF+ (Protein Sciences Corporation, Meriden, CT). Los cultivos de células preferidos tienen un recuento celular entre aproximadamente 0,3 - 2,0 x 106 células/mL, más preferiblemente de aproximadamente 0,35 - 1,9 x 106 células/mL, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,4 - 1,8 x 106 células/mL, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,45 - 1,7 x 106 células/mL, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 - 1,5 x 106 células/mL.

Los vectores virales preferidos incluyen baculovirus, tal como BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), en particular con la condición de que las células de producción sean células de insectos. A pesar de que se prefiere el sistema de expresión de baculovirus, se entiende por los expertos en la técnica que otros sistemas de expresión pueden servir para los fines de la presente descripción, principalmente la expresión de la H5 en el sobrenadante de un cultivo celular. Estos otros sistemas de expresión pueden requerir el uso de una secuencia señal con el fin de producir la expresión de H5 en los medios.

Los medios de crecimiento apropiados también podrán ser determinados por los expertos en la técnica, siendo un medio de crecimiento preferido el medio de células de insecto libre de suero, tal como Excell 420 (JRH Biosciences, Inc., Lenexa, KS) y similares.

El vector viral recombinante que contiene las secuencias de DNA de la H5 tiene una multiplicidad de infección (conocida generalmente como MOI por sus siglas en inglés: multiplicity of /nfection) preferida de aproximadamente 0,03 - 1,5, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 - 1,3, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,09 - 1,1 y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1 - 1,0, cuando se utiliza para la infección de las células susceptibles. Preferiblemente, los valores de MOI mencionados antes se refieren a un mL de fluido del cultivo celular. Preferiblemente, el método descrito en la presente memoria comprende la infección de 0,35 - 1,9 x 106 células/mL, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,4 - 1,8 x 106 células/mL, incluso más preferiblemente de aproximadamente 0,45 - 1,7 x 106 células/mL, y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,5 - 1,5 x 106 células/mL, con un vector viral recombinante que contiene un DNA de la H5 y que expresa la proteína H5 con una MOI (multiplicidad de infección) de aproximadamente 0,03 - 1,5, más preferiblemente de aproximadamente 0,05 - 1,3, todavía más preferiblemente de aproximadamente 0,09 - 1,1 y lo más preferiblemente de aproximadamente 0,1 - 1,0.

Las células infectadas se incuban luego a lo largo de un periodo de hasta diez días, más preferiblemente de aproximadamente dos días a aproximadamente diez días, todavía más preferiblemente de aproximadamente cuatro días a aproximadamente nueve días, y lo más preferiblemente de aproximadamente cinco días a aproximadamente ocho días. Las condiciones de incubación preferidas incluyen una temperatura de aproximadamente 22 - 32 °C, más preferiblemente de aproximadamente 24 - 30 °C, todavía más preferiblemente de aproximadamente 25 - 29 °C, incluso más preferiblemente de aproximadamente 26 - 28 °C, y lo más preferiblemente aproximadamente 27 °C. Preferiblemente, las células SF+ se observan después de la inoculación en cuanto a cambios característicos inducidos por baculovirus. Una observación de este tipo puede incluir la vigilancia de las tendencias de densidad celular y la disminución en la viabilidad durante el periodo post - infección. Se encontró que el pico del título viral se observa 3 - 5 días después de la infección y el pico de la expresión de la proteína H5 en las células se obtiene entre los días 5 y 8 y/o cuando la viabilidad de las células desciende a menos del 10%.

Por lo tanto, un aspecto de la presente descripción proporciona un método para producir y/o recuperar proteína H5 recombinante, preferiblemente en las cantidades descritas anteriormente, por medio de i) permitir la infección de un cierto número de células susceptibles (véase anteriormente) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI como se ha definido anteriormente, ii) expresar la proteína H5 mediante el vector viral recombinante, y iii) recuperar a continuación la proteína H5 de las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad de las células desciende a menos del 10%. Preferiblemente, el vector viral recombinante es un baculovirus recombinante que contiene secuencias codificadoras de DNA de la H5 y las células son células SF+. Adicionalmente, se prefiere que el cultivo se examine periódicamente en cuanto a signos macroscópicos y microscópicos de contaminación o en cuanto a cambios atípicos en la morfología de la célula durante el periodo post-infección. Se debe desechar cualquier cultivo que presente alguna contaminación.

Para la recuperación de la proteína H5 que se utilizará en una composición inmunogénica o inmunológica, tal como una vacuna, se prefiere la inclusión de una etapa de inactivación con el fin de inactivar el vector viral.

Una "composición inmunogénica o inmunológica" se refiere a una composición de sustancia que comprende al menos un antígeno que induce una respuesta inmunológica en el hospedante de una respuesta inmune celular y/o mediada por anticuerpos a la composición o vacuna de interés. Habitualmente, una "respuesta inmunológica" incluye, pero sin limitarse a ellos, uno o más de los siguientes efectos: la producción o activación de anticuerpos, células B, células T auxiliares, células T supresoras y/o células T citotóxicas y/o células T gamma-delta, dirigidas específicamente a un antígeno o antígenos incluidos en la composición o vacuna de interés. Preferiblemente, el hospedante presentará una respuesta inmunológica terapéutica o protectora, de modo que la resistencia a una nueva infección resultará reforzada y/o la gravedad clínica de la enfermedad quedará reducida. Una protección de este tipo se demostrará por una reducción o carencia de los síntomas presentados normalmente por un hospedante infectado, un tiempo de recuperación más rápido y/o una disminución del título vírico en el hospedante infectado.

Por lo tanto, la presente descripción se refiere también a un método para producir y/o recuperar la proteína H5 recombinante, preferiblemente en las cantidades descritas anteriormente, por medio de i) permitir la infección de un cierto número de células susceptibles (véase anteriormente) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI como se ha definido anteriormente, ii) expresar la proteína H5 mediante el vector viral recombinante, iii) recuperar la proteína H5 expresada en las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad de las células desciende a menos del 10%, y iv) inactivar el vector viral recombinante.

Preferiblemente, esta inactivación se hace o bien justo antes o bien justo después de la etapa de filtración, siendo después de la etapa de filtración el tiempo preferido para la inactivación. Para los fines de la presente descripción se puede utilizar cualquier método de inactivación convencional. Así, la inactivación se puede efectuar mediante tratamientos químicos y/o físicos. En formas preferidas, se determina el volumen de los fluidos recolectados y la temperatura se lleva a un intervalo entre aproximadamente 32 - 42 °C, más preferiblemente entre aproximadamente 34 - 40 °C, y lo más preferiblemente entre aproximadamente 35 - 39 °C. Los métodos de inactivación preferidos incluyen la adición de etilenimina binaria (abreviada generalmente como BEI por sus iniciales en inglés: binary ethylenimine) ciclada, preferiblemente en una concentración de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM, más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 mM, todavía más preferiblemente de aproximadamente 3 a aproximadamente 7 mM y lo más preferiblemente de aproximadamente 5 mM. Por ejemplo, la inactivación incluye la adición a los fluidos de una solución de hidrobromuro de 2 - bromoetilenamina, preferiblemente aproximadamente 0,4 M, que ha sido ciclada a etilenimina binaria (BEI) 0,2 M en NaOH 0,3 N, para dar una concentración final de BEI aproximadamente 5 mM. Preferiblemente, los fluidos se agitan entonces continuamente durante 72 - 96 horas y los fluidos recolectados inactivados se pueden almacenar congelados a - 40 °C o por debajo o entre aproximadamente 1 - 7 °C. Después de haberse completado la inactivación, se añade una solución de tiosulfato de sodio, preferiblemente con una concentración 1,0 M para neutralizar cualquier BEI residual. Preferiblemente, el tiosulfato de sodio se añade en una cantidad equivalente comparada con la BEI añadida antes para la inactivación. Por ejemplo, en el caso de añadir BEI hasta una concentración final 5 mM, se añade una solución de tiosulfato de sodio 1,0 M para dar una concentración mínima final 5 mM para neutralizar toda la BEI residual.

Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente descripción se refiere a un método para producir y/o recuperar la proteína H5 recombinante, preferiblemente en las cantidades descritas anteriormente, por medio de i) permitir la infección de un cierto número de células susceptibles (véase anteriormente) en cultivo con un vector viral recombinante con una MOI como se ha definido anteriormente, ii) expresar la proteína H5 mediante el vector viral recombinante, iii) recuperar la proteína H5 expresada en las células obtenidas entre los días 5 y 8 después de la infección y/o cuando la viabilidad de las células desciende a menos del 10%, y iv) inactivar el vector viral recombinante. Preferiblemente, el vector viral recombinante es un baculovirus que contiene secuencias codificadoras de DNA de la H5 y las células son células SF+. Las etapas de inactivación preferidas son las descritas anteriormente. Preferiblemente, la inactivación se efectúa entre aproximadamente 35-39 °C y en presencia de BEI 2 a 8 mM, todavía más preferiblemente en presencia de BEI aproximadamente 5 mM.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente descripción, el método descrito anteriormente incluye también una etapa de neutralización después de la etapa iv). Esta etapa v) comprende añadir una cantidad equivalente de un agente que neutraliza el agente de inactivación en la solución. Preferiblemente, si el agente de inactivación es la BEI, se prefiere la adición de tiosulfato de sodio en una cantidad equivalente. Por lo tanto, según un aspecto adicional, la etapa v) comprende añadir una solución de tiosulfato de sodio hasta una concentración final desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 20 mM, preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 10 mM, todavía más preferiblemente desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8 mM, todavía más preferiblemente desde aproximadamente 3 hasta aproximadamente 7 mM y lo más preferiblemente de aproximadamente 5 mM, cuando el agente de inactivación es la BEI.

En formas preferidas y, especialmente, en formas que utilizarán la proteína H5 recombinante en una composición inmunogénica, tal como una vacuna, en cada lote de proteína H5 recolectada se analizará la inactivación mediante pases en células de insecto dependientes del anclaje susceptibles al baculovirus, tales como las células Sf9. En una forma preferida de este ensayo, se inoculan 150 cm2 de monocapa de cultivo celular apropiado con 1,0 mL de fluidos de H5 inactivados y se mantienen a 25-29 °C durante 14 días con al menos dos pases. Al final del periodo de mantenimiento, se determina en las monocapas celulares el efecto citopatogénico (abreviado generalmente como CPE por sus iniciales en inglés) típico de baculovirus de H5. Preferiblemente, también se utilizan controles positivos de virus. Este tipo de controles pueden consistir en un cultivo de células Sf9 inoculadas con un baculovirus de H5 de referencia no inactivado y un matraz de células Sf9 que permanecen sin inocular. Después de la incubación y de los pases, la ausencia de células infectadas con virus en los fluidos virales tratados con BEI constituiría una prueba de inactivación satisfactoria. Las células de control inoculadas con el virus de referencia deberían presentar un CPE típico de baculovirus de H5 y el matraz no inoculado no debería mostrar evidencia alguna de CPE de baculovirus de H5. Alternativamente, al final del periodo de mantenimiento, las muestras de sobrenadante se podrían recoger e inocular en una placa de 96 pocillos con Sf9, que haya sido cargada con células Sf9, y luego se podrían mantener a 25-29 °C durante 5-6 días. La placa se fija entonces y se tiñe con anticuerpo anti-H5 conjugado con FITC o cualquier anticuerpo marcado dirigido a las proteínas específicas de baculovirus (por ejemplo gp64). La ausencia de CPE, expresión de la H5 o expresión de las proteínas específicas de baculovirus (por ejemplo gp64) en los fluidos virales tratados con BEI constituye una prueba de inactivación satisfactoria. Las células de control inoculadas con el virus de referencia deberían presentar un CPE y actividad IFA y el matraz no inoculado no debería mostrar evidencia alguna de CPE de baculovirus de H5 ni contener actividad iFa .

Por lo tanto, un aspecto adicional descrito en la presente memoria se refiere a un ensayo de inactivación para determinar la eficacia de la inactivación del vector viral de recombinación que expresa la proteína H5, que comprende las etapas de: i) poner en contacto al menos una porción del fluido de cultivo que contiene el vector viral recombinante con un agente inactivante, preferiblemente como se ha descrito anteriormente, ii) añadir un agente de neutralización para neutralizar el agente de inactivación, preferiblemente según se ha descrito anteriormente, y iii) determinar la infectividad residual mediante los ensayos que se han descrito anteriormente.

Después de la inactivación, la cantidad relativa de proteína H5 recombinante en una muestra se puede determinar por varías vías. Los métodos preferidos de cuantificación incluyen densitometría por SDS-PAGE, ELISA y estudios de vacunación en animales que se correlacionan con cantidades conocidas de vacuna con resultados clínicos (serología, etc.). Cuando se usa SDS-PAGE para la cuantificación, el material de la muestra que contiene una cantidad desconocida de proteína H5 recombinante se deposita sobre un gel junto con muestras que contienen diferentes cantidades conocidas de proteína H5 recombinante. Entonces se puede producir una curva patrón basada en las muestras conocidas y se puede determinar la cantidad de H5 recombinante en la muestra desconocida por comparación con esta curva patrón. Como los análisis por ELISA se reconocen generalmente como el patrón industrial para la cuantificación de antígenos, se prefieren para la cuantificación.

Vacunas que comprenden proteínas H5 o moléculas de ácido nucleico o vectores que las codifican

Según un aspecto adicional, la presente descripción se refiere a vacunas o composiciones farmacéuticas en general, que comprenden:

i. una o más de las proteínas H5 como se han descrito en la presente memoria;

ii. una o más de las moléculas de ácido nucleico como se han descrito en la presente memoria, que codifican cualquiera de tales proteínas H5; y/o

iii. uno o más de los vectores como se han descrito en la presente memoria, que incluyen cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico y que codifican cualquiera de tales proteínas H5 como se han descrito en la presente memoria; y

iv. un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

El término "composición farmacéutica" o "composición farmacéutica/vacuna" como se ha descrito en la presente memoria incluye, pero sin limitarse a ellas, vacunas para la reducción o prevención de una infección o una composición de sustancia para el tratamiento y la disminución de una infección.

La preparación de vacunas basadas en ácidos nucleicos, preferiblemente vacunas de cDNA, que codifican la hemaglutinina de la gripe se describen por ejemplo en Deck et al, Vaccine 1997; 15 (1): 71-78; Ulmer et al., Science 1993; 259: 1745-1749; Ulmer et al., Vaccine 1994; 12 (16):1541-1544. Cualquiera de estos métodos se puede usar para la producción de vacunas basadas en ácidos nucleicos, preferiblemente vacunas de cDNA, que codifican la proteína H5 de la gripe como se describe en la presente memoria.

Además, una vacuna que comprende una proteína H5 o partes de la misma, como se describe en la presente memoria, se puede producir mediante métodos convencionales, por ejemplo mediante técnicas de expresión recombinante o mediante técnicas bioquímicas de purificación y separación. Los métodos de expresión recombinante, incluyendo la expresión en células de insectos son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; DNA Cloning: A Practica! Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed.

1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R. I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1994). Ejemplos adicionales de sistemas de expresión recombinante bien establecidos son los sistemas de expresión bacteriana, tales como E. coli o B. subtilis, sistemas de expresión basados en levaduras, tales como S. cerevisiae o S. pombe, o sistemas de expresión de células de mamíferos, tales como los sistemas de expresión basados en BHK, CHO y/o NS0. Tales sistemas son bien conocidos en la técnica y generalmente están disponibles, por ejemplo comercialmente a través de Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Palo Alto, California 94303-4607, uSa . Otras estrategias de expresión están descritas por ejemplo en Lüschow et al., Vaccine no. 19 (2001), pp. 4249-4259, o Veit et al., PNAS vol. 103 (2006), pp. 8197-8202. Además, los sistemas víricos adeno-asociados están bien establecidos y se describen por ejemplo en los documentos US 5.436.146 o WO200203872 con referencias adicionales. Además, los sistemas de expresión basados en virus de vaccinia (viruela), por ejemplo como se describen en el documento US 6.265.183 con referencias adicionales, también están bien establecidos y son adecuados para producir antígeno o antígenos recombinantes, composiciones antigénicas y para ser usados según la presente descripción. Sistemas de expresión adecuados adicionales utilizan virus de popova recombinantes, tales como SV40, virus de viruela de las aves de corral, virus de la pseudorrabia y retrovirus.

Las composiciones farmacéuticas/vacunas relevantes descritas en la presente memoria pueden comprender también virus inactivados que comprenden una proteína H5 como se ha descrito en la presente memoria, una versión apatogénica de un virus vivo que comprende una proteína H5 como se ha descrito en la presente memoria, una preparación y/o fragmentos de un virus, donde dicha preparación y/o fragmento comprende una proteína H5 como se ha descrito en la presente memoria.

Los expertos conocen componentes adicionales que pueden formar parte de dichas composiciones/vacunas junto con el antígeno (véase, por ejemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences. (1990). 18a ed. Mack Publ., Easton). Los expertos pueden utilizar soluciones estériles inyectables conocidas, fisiológicamente aceptables. Para preparar una solución lista para su uso hay soluciones isotónicas acuosas fácilmente disponibles, tales como, por ejemplo, solución salina o soluciones correspondientes de proteínas en plasma. La composición farmacéutica/vacuna puede estar presente en forma de liofilizados o preparaciones secas, las cuales se pueden reconstituir con una solución inyectable conocida directamente antes del uso en condiciones estériles, por ejemplo en forma de un kit en partes. Además, las composiciones farmacéuticas/vacunas de la presente descripción pueden incluir uno o más vehículos aceptables desde el punto de vista veterinario. Tal como se emplea en la presente memoria, "un vehículo aceptable desde el punto de vista veterinario" incluye, pero sin limitarse a ellos, disolventes, medios dispersantes, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizantes, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos, agentes que retrasan la adsorción y similares.

Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiaminotetracético, entre otros.

Un conservante, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un agente activo anti-microbiológico tal como, por ejemplo, gentamicina, mertiolato y similares. En particular, la adición de un conservante es lo más preferido para la preparación de una composición en multi-dosis. Esos agentes activos anti-microbiológicos se añaden en concentraciones eficaces para prevenir cualquier contaminación microbiológica de la composición de interés o para la inhibición de cualquier crecimiento microbiológico en la composición de interés.

Los "adyuvantes" como se usan aquí, pueden incluir hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio, saponinas por ejemplo, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsión agua-en-aceite, emulsión aceite-en-agua, emulsión agua-en-aceite-en-agua, en donde un adyuvante basado en Emulsigen es particularmente preferido según la descripción.

La emulsión se puede basar, en particular, en aceite de parafina líquido ligero (tipo de la Farmacopea Europea); aceite isoprenoide, tal como escalano o escaleno; aceite resultante de la oligomerización de alquenos, en particular de isobuteno o deceno; ásteres de ácidos o de alcoholes que contienen un grupo alquilo lineal, más particularmente aceites vegetales, oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenglicol, tri-(caprilato/caprato) de glicerilo o dioleato de propilenglicol; ésteres de ácidos grasos o alcoholes ramificados, en particular ésteres de ácido isoesteárico. El aceite se utiliza en combinación con emulsionantes para formar la emulsión. Los emulsionantes son preferiblemente tensioactivos no iónicos, en particular ésteres de sorbitán, de manida (por ejemplo, oleato de anhidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenglicol y de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico o hidroxiesteárico, que están opcionalmente etoxilados, y copolímeros de bloques de polioxipropileno-polioxietileno, en particular los productos Pluronic, especialmente L121. Véase Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D.E.S.), John Wiley and Sons, NY, págs. 51-94 (1995) y Todd et al., Vaccine15: 564-570 (1997). Ejemplos de emulsiones adecuadas de aceite-en-agua son los adyuvantes basados en Emulsigen, tales como EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75® (MVP Laboratories, Inc. Omaha, NE, Estados Unidos). Sorprendentemente, se ha encontrado que las composiciones farmacéuticas/vacunas que comprenden una proteína H5, preferiblemente una proteína H5 recombinante como se ha descrito en la presente memoria, se han preparado de forma eficaz con emulsiones de aceite-en-agua como adyuvantes, preferiblemente con tales adyuvantes basados en Emulsigen, más preferiblemente con EMULSIGEN® y EMULSIGeN-D®.

Además, es posible utilizar la emulsión SPT descrita en la página 147 de " Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" editada por M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995, y la emulsión MF59 descrita en la página 183 de este mismo libro.

Un ejemplo adicional de un adyuvante es un compuesto elegido entre los polímeros de ácido acrílico o metacrílico y los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo. Compuestos adyuvantes ventajosos son los polímeros de ácido acrílico o metacrílico que están reticulados, especialmente con polialquenil-éteres de azúcares o polialcoholes. Estos compuestos se conocen con el nombre de carbómeros (Pharmeuropa, vol. 8, n° 2, junio de 1996). Los expertos en la técnica pueden consultar también la patente de Estados Unidos n° 2.909.462 que describe polímeros acrílicos de este tipo, reticulados con un compuesto polihidroxilado que tiene al menos 3 grupos hidroxilo, preferiblemente no más de 8, estando reemplazados los átomos de hidrógeno de al menos tres hidroxilos por radicales alifáticos insaturados que tienen al menos 2 átomos de carbono. Los radicales preferidos son los que contienen de 2 a 4 átomos de carbono, por ejemplo, vinilos, alilos y otros grupos edénicamente insaturados. Los propios radicales insaturados pueden contener también otros sustituyentes, tales como metilo. Los productos vendidos con el nombre de Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, Estados Unidos) son particularmente apropiados. Están reticulados con una alilsacarosa o con alilpentaeritritol. Entre ellos, se pueden mencionar Carbopol 974P, 934P y 971P. El más preferido es el uso de Carbopol 971P. Entre los copolímeros de anhídrido maleico y derivado de alquenilo, los copolímeros EMA (Monsanto) que son copolímeros de anhídrido maleico y etileno. La disolución de estos polímeros en agua produce una solución ácida que será neutralizada, preferiblemente hasta un pH fisiológico, con el fin de obtener la solución de adyuvante en la que se incorporará la propia composición inmunógena, inmunológica o vacuna.

Adyuvantes adecuados adicionales incluyen, pero sin estar limitados a ellos, el sistema adyuvante RIBI (Ribi Inc.), co-polímero de bloques (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), monofosforil-lípido A, adyuvante de lípido-amina Avridina, enterotoxina térmicamente lábil procedente de E. coli (recombinante o de otro modo), toxina del cólera o dipéptido muramilo, entre muchos otros.

Preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad desde aproximadamente 100 gg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad desde aproximadamente 100 gg hasta aproximadamente 10 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad desde aproximadamente 500 gg hasta aproximadamente 5 mg por dosis. Incluso más preferiblemente, el adyuvante se añade en una cantidad desde aproximadamente 750 gg hasta aproximadamente 2,5 mg por dosis. Lo más preferido, el adyuvante se añade en una cantidad de aproximadamente 1 mg por dosis.

Las composiciones farmacéuticas/vacunas pueden incluir además uno o más de otros agentes inmunomoduladores, tales como por ejemplo, interleucinas, interferones u otras citocinas. Las composiciones farmacéuticas/vacunas también pueden incluir gentamicina y mertiolato. Aunque las cantidades y concentraciones de los adyuvantes y aditivos útiles en el contexto de la presente descripción pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la técnica, la presente descripción contempla composiciones que comprenden de aproximadamente 50 gg a aproximadamente 2000 gg de adyuvante y preferiblemente aproximadamente 250 gg/mL de dosis de la composición de vacuna. En otra realización preferida, la presente descripción contempla composiciones de vacuna que comprenden desde aproximadamente 1 gg/mL hasta aproximadamente 60 gg/mL de antibióticos, y más preferiblemente menos de aproximadamente 30 gg/mL de antibióticos.

Por lo tanto, según un aspecto adicional, la presente descripción se refiere también a una composición farmacéutica/vacuna que comprende:

I) una cantidad terapéuticamente eficaz de una cualquiera de las proteínas H5 del virus gripal como se ha descrito anteriormente,

II) y adyuvantes farmacéuticamente aceptables como se han descrito anteriormente.

Preferiblemente, el adyuvante se elige entre el grupo que consiste en:

a) EMULSIGEN®, una emulsión de aceite-en-agua (abreviada generalmente como o/w);

b) EMULSIGEN-D®, una emulsión de aceite-en-agua (o/w) con bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA); c) un Poligen, un copolímero;

d) EMULSIGEN-P®, una emulsión de aceite-en-agua (o/w) con un inmunoestimulante patentado

e) Carbigen, un polímero reticulado

f) EMULSIGEN-75®, un adyuvante doble que comprende una emulsión de aceite-en-agua (o/w) con un polímero reticulado

g) ISA 70, una emulsión de agua-en-aceite (w/o)

Más preferiblemente, el adyuvante es una emulsión de aceite-en-agua tal como un adyuvante basado en un emulsigen elegido entre el grupo que consiste en EMULSIGEN®, EMULSIGEN-D®, EMULSIGEN-P®, EMULSIGEN-75®, EMULSIGEN® y EMULSIGEN-P®. Más preferiblemente, se usan EMULSIGEN® y EMULSIGEN-P® en la formulación de la presente descripción.

Según un aspecto adicional, las composiciones farmacéuticas/vacunas como se proporcionan en la presente memoria comprenden uno o más antígenos. Preferiblemente, este antígeno adicional es un antígeno de un patógeno de ave de corral o de mamífero. Según aspecto adicional, este antígeno adicional es un antígeno de gripe adicional, tal como hemaglutinina H3, H7, H9 o cualquier otra hemaglutinina del virus gripal. El antígeno o antígenos adicionales se pueden añadir en una forma purificada, como parte de una preparación antigénica, en forma de un microorganismo muerto o en forma de un microorganismo vivo modificado.

El término "antígeno", como se usa en la presente memoria, significa, pero sin limitarse a ellos, péptidos, polipéptidos, glicopéptidos o polisacáridos que son capaces de interactuar específicamente con una molécula del sistema inmune de reconocimiento de un antígeno, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor antigénico de células T con el fin de inducir, activar o estimular una respuesta inmunitaria dirigida a dicho antígeno en un hospedante al que se le administra dicho antígeno. El término "antígeno" se refiere también a moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de DNA o RNA, cada una de las cuales codifica y expresa un péptido, polipéptido o glicopéptido que es capaz de interactuar específicamente con una molécula de reconocimiento de un antígeno del sistema inmune, tal como una inmunoglobulina (anticuerpo) o receptor antigénico de células T con el fin de inducir, activar o estimular una respuesta inmune frente al antígeno que es codificado por la molécula de ácido nucleico. El antígeno usado para la preparación de la composición farmacéutica que se usa según la descripción es un microorganismo o una parte y/o preparación antigénica de dicho microorganismo. En este sentido, el término "inmunización", como se usa en la presente memoria, significa, pero sin estar limitado a ello, cualquier causa o aumento de una respuesta inmune. El término "respuesta inmune" ya ha sido descrito anteriormente.

Las estrategias de administración de las vacunas de la gripe son bien conocidas en la técnica. Se contemplan estrategias de vacunación por vía mucosal para las vacunas de virus inactivados y atenuados. Aunque la mucosa puede ser el objetivo para la administración local de una vacuna, se han empleado diferentes estrategias para la administración de proteínas inmunogénicas a la mucosa.

En un aspecto específico, la vacuna se puede administrar mezclada o como un conjugado o proteína de fusión quimérica con toxina del cólera, tal como toxina B del cólera o una toxina quimérica A/B del cólera (Hajishengallis, J Immunol., 154: 4322-32, 1995; Jobling y Holmes, Infecí Immun., 60: 4915-24, 1992). Se han descrito vacunas para vía mucosal basadas en el uso de la subunidad B de la toxina del cólera (Lebens and Holmgren, Dev Biol Stand 82: 215-27, 1994). En otro aspecto, se puede preparar una mezcla con una enterotoxina térmicamente lábil (LT) para la vacunación por vía mucosal.

Otras estrategias de inmunización por vía mucosal incluyen encapsular el virus en microcápsulas (véanse los documentos US 5.075.109, US 5.820.883 y US 5.853.763) y usar un vehículo membranoso inmunopotenciador (véase el documento WO 98/0558). La inmunogenicidad de los inmunógenos administrados oralmente puede ser mejorada usando glóbulos rojos sanguíneos (rbc) o rbc fantasmas (véase el documento US 5.643.577) o usando un antígeno de la enfermedad de la lengua azul (véase el documento US 5.690.938).

Según otro aspecto, la presente descripción se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica/vacuna como se ha descrito anteriormente, preferiblemente un método para producir una vacuna que comprende una proteína H5 recombinante expresada en baculovirus, como se ha descrito anteriormente. Generalmente, este método incluye las etapas de transfectar un constructo en un virus, donde el constructo comprende i) cDNA de H5 recombinante como se ha descrito en la presente memoria, ii) infectar las células en medios de crecimiento con el virus transfectado, iii) hacer que el virus exprese la proteína H5 recombinante como se ha descrito en la presente memoria, iv) recuperar la proteína H5 expresada a partir del cultivo, y v) preparar la composición por mezcla de la proteína H5 expresada con un adyuvante adecuado y/u otro vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los adyuvantes preferidos son los descritos anteriormente. Por lo tanto, según un aspecto adicional, el método para preparar una composición antigénica tal como, por ejemplo, una vacuna, para producir una respuesta inmune frente a las infecciones de gripe comprende i) preparar y recuperar una proteína H5, y ii) mezclar ésta con un adyuvante adecuado.

Además, las composiciones para vacuna de la presente descripción pueden incluir también diluyentes, agentes isotónicos, estabilizantes y/o conservantes. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Los agentes isotónicos pueden incluir sales inorgánicas u orgánicas, por ejemplo cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa, sacáridos, trehalosa, manitol y sacarosa, entre otros. Los estabilizantes incluyen albúmina y sales alcalinas de ácido etilendiaminotetracético, entre otros. Los adyuvantes adecuados son los descritos anteriormente.

Uso medicinal de cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico, vectores y vacunas

Las proteínas H5 como se proporcionan en la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, y cualquier composición farmacéutica/vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico o vectores, se pueden usar como un medicamento, preferiblemente para el tratamiento y la profilaxis de infecciones producidas por el virus gripal, más preferiblemente por el virus gripal A. Las proteínas H5 como se proporcionan en la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, y cualquier composición farmacéutica/vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico o vectores, como se han descrito en la presente memoria, se pueden usar para el tratamiento o la profilaxis de seres humanos, así como en medicina veterinaria. Cuando se usan en medicina veterinaria, se prefiere el tratamiento de aves de corral, preferiblemente pájaros, pollos, patos, pavos y similares, así como de mamíferos, preferiblemente cerdos, ganado vacuno, caballos, focas, camellos, perros, gatos, hámster, ratones y similares.

Por lo tanto, según otro aspecto, la presente descripción se refiere al uso de las proteínas H5 como se proporcionan en la presente memoria, de las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, de los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, y de cualquier composición farmacéutica/vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico o vectores, como se han descrito en la presente memoria, que se pueden usar como un medicamento, preferiblemente para seres humanos y/o como medicina veterinaria.

Además, las proteínas H5 como se proporcionan en la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, se pueden usar en la preparación de una composición farmacéutica, como se ha descrito en la presente memoria, para la profilaxis o el tratamiento de infecciones causadas por la gripe viral. Como se ha mencionado anteriormente, estas composiciones farmacéuticas/vacunas se pueden usar para el tratamiento y/o la profilaxis de seres humanos así como para el tratamiento y/o la profilaxis de animales, tales como aves de corral, preferiblemente pájaros, pollos, patos, pavos y similares, así como mamíferos, preferiblemente cerdos, ganado vacuno, caballos, focas, camellos, perros, gatos, hámster, ratones y similares.

Según la descripción, se prefiere el uso de la proteína H5 como se describe aquí para la preparación de una composición farmacéutica para la profilaxis o tratamiento de infecciones causadas por la gripe viral, preferiblemente debidas a infecciones con H5N1 de origen norteafricano, en particular debidas a infecciones con un virus que comprende una proteína H5 con al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de identidad de secuencia, con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 40, preferiblemente con las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 8, 13 o 40. El uso de las proteínas H5 codificadas por las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 8, 13 o 40 es particularmente preferido.

Se entiende por tanto que el término "H5N1 de origen norteafricano" según la descripción se dirige en particular a un virus H5N1 que comprende la proteína H5 con al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs:2 a 40. Preferiblemente el término "H5N1 de origen norteafricano" según la descripción se dirige en particular a un virus H5N1 que comprende la proteína H5 con al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 8, 13 o 40. Según otra realización preferida, el término "H5N1 de origen norteafricano" según la invención se dirige en particular a un virus H5N1 que comprende una proteína H5 con al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 13. Según otra realización preferida, el término "H5N1 de origen norteafricano" según la invención se dirige en particular a un virus H5N1 que comprende una proteína H5 con al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99% o en particular preferiblemente 100% de identidad de secuencia con la secuencia indicada en la SEQ ID NO: 8.

Por consiguiente, la frase "infección o infecciones con H5N1 de origen norteafricano" como se describe en esta memoria, se refiere en particular a una infección con dicho virus.

La descripción se dirige además al uso de la molécula de ácido nucleico según la descripción, tal como una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en una cualquiera de las secuencias de ácido nucleico indicadas en las SEQ ID NOs: 41 a 43, para la preparación de una composición farmacéutica para la profilaxis o tratamiento de infecciones causadas por la gripe viral, preferiblemente causadas por H5N1 de origen norteafricano, en particular causadas por un virus que comprende la proteína H5 con al menos 95%, preferiblemente 96%, más preferiblemente 97%, aún más preferiblemente 98%, todavía más preferiblemente 99%% o en particular preferiblemente 100% de identidad de secuencia con una cualquiera de las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 40, donde las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 8, 13 y 40 son particularmente preferidas.

Asimismo, la descripción comprende el uso del vector según la descripción para la preparación de una composición farmacéutica para la profilaxis o tratamiento de infecciones causadas por la gripe viral, preferiblemente causadas por H5N1 de origen norteafricano. En particular el vector codifica alguna proteína H5 como se ha descrito.

Las proteínas H5 como se proporcionan en la presente memoria, las moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, los vectores que comprenden cualquiera de dichas moléculas de ácido nucleico que codifican cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, se pueden usar para la preparación de una composición farmacéutica, como se ha descrito en la presente memoria, y son adecuadas para el tratamiento y la profilaxis de infecciones de gripe viral, que preferiblemente están causadas por el virus de la gripe aviar, porcina o humana, o cualquiera de sus combinaciones o híbridos.

Según un aspecto adicional, la presente descripción se refiere también a un método para el tratamiento o la profilaxis de infecciones del virus gripal, donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína H5, como se ha descrito en la presente memoria, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. Además, la presente descripción se refiere también a un método para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones por el virus gripal, donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier molécula de ácido nucleico o vector de la H5, como se han descrito en la presente memoria, que codifica cualquier proteína H5, como se ha descrito en la presente memoria, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. Además, la presente descripción se refiere también a un método para el tratamiento y/o la profilaxis de infecciones del virus gripal, donde el método comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna que comprende cualquier proteína H5, molécula de ácido nucleico o vector, como se han descrito en la presente memoria, a un sujeto que necesita dicho tratamiento. El sujeto que lo necesita puede ser un ser humano así como un animal, preferiblemente ave de corral, incluso más preferiblemente un pájaro, pollo, pato o pavo, o un mamífero, preferiblemente cerdo, ganado vacuno, caballo, foca, camello, perro, gato, hámster, ratón y similares.

Preferiblemente, cuando se vacunan pollos, la proteína H5, como se describe en la presente memoria, se puede usar para la vacunación a la edad de 1 día o más tarde, por ejemplo en el décimo día, o entre el día 1 y el 10, o en el décimo día o más tarde.

Preferiblemente, la infección de la gripe que se puede tratar mediante la administración de cualquier proteína H5, de la molécula de ácido nucleico o del vector que codifica cualquiera de dichas proteínas H5, o de cualquier composición farmacéutica/vacuna, como se ha descrito en la presente memoria, está causada por un virus gripal aviar, porcina o humana o cualquiera de sus combinaciones o híbridos.

Según otro aspecto, la presente descripción se refiere a un kit en partes que comprende i) cualquiera de dichas proteínas H5, como se han descrito en la presente memoria, la molécula de ácido nucleico o el vector que codifica cualquiera de dichas proteínas H5, o cualquier composición farmacéutica/vacuna que comprende cualquiera de dichas proteínas H5, moléculas de ácido nucleico o vectores como se han descrito en la presente memoria, y ii) un prospecto que indica el uso de dicha proteína H5, molécula de ácido nucleico, vector o vacuna para el tratamiento o la profilaxis de infecciones causadas por el virus gripal. Cuando se vacunan pollos, la proteína H5 como se describe en la presente memoria se puede usar para la vacunación con 1 día de edad o más tarde.

Según un aspecto adicional, este kit en partes comprende al menos un antígeno adicional de un patógeno de ave de corral o de mamífero y la información que indica el uso medicinal, humano o veterinario, de dicho antígeno adicional.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos indican los materiales y procedimientos preferidos de acuerdo con la presente invención. Se debe entender, sin embargo, que estos ejemplos se proporcionan solamente a modo de ilustración, y nada en ellos se debe considerar una limitación del alcance global de la invención.

Ejemplo 1

A. Información molecular sobre aislados egipcios

Esta información se basa en el esquema de clasificación propuesto por Dn G. Cattoli. Se ha notificado hace tiempo la presencia del subclado 2.2.1 del AIV H5N1 HP en el área del norte de África. Actualmente, la variación genética ha dado un salto a los sublinajes A y B, que estaban circulando en Egipto durante 2010. La clasificación mencionada antes sigue las recomendaciones internacionales disponibles en: http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/nomenclature/en/

a) Homología entre los aislados del norte de África.

Considerando las secuencias del gen de hemaglutinina H5 en muestras positivas de 2010, las distancias de los nucleótidos en parejas dentro de cada linaje están en el intervalo de 0,5 a 1,4, que es menor del 1,5% (las secuencias tienen una similitud superior al 98,5%).

Los valores anteriores, siguen el criterio definido para clasificar nuevos aislados como posibles sublinajes, según las guías de la OMS/FAO/OIE.

El porcentaje de similitud entre secuencias del sublinaje A y del sublinaje B, del subclado 2.2.1 que circulaban en el norte de África en 2010, está entre 96-98%.

b) Diferencias entre aislados de H5N1 egipcios frente a otros H5N1.

En la siguiente tabla se encuentran los porcentajes de similitud de secuencias representativas de los sublinajes A y B del H5N1 de la gripe aviar altamente patógeno (HPAI) de 2010, que circula actualmente en el norte de África, en comparación con las correspondientes secuencias de las cepas prototipo de1H5N1.

c) Secuencias de aminoácidos;

Las 38 secuencias proporcionadas por IZSVe (Istituto Zooprofilattico Sperimentale delle Venezie) se encuentran a continuación y en el listado de secuencias.

B. Criterios de identificación para la selección de cepas de vacuna, motivos relevantes en la secuencia Criterio 1

Distancias genéticas relacionadas con el análisis filogenético. La separación de taxones en un árbol filogenético es el soporte para deducir los aislados relacionados más distantes según la secuencia HA H5. Se seleccionaron los aislados más distantes.

Criterio 2

Frecuencia de cada sublinaje en el muestreo de 2010. No está relacionada con la medida en que las muestras representan la circulación de campo del virus H5N1 HPAI. La prevalencia de cada sublinaje en el conjunto de datos de 2010 fue la base para recoger los aislados y proponerlos como nuevas cepas de ataque.

Además, se utilizó el análisis basado en las secuencias para confirmar los hallazgos filogenéticos. Asimismo, los cambios en la secuencia HA de H5 dentro o alrededor del sitio de unión al receptor (RBS) se consideraron importantes para definir nuevas cepas de vacuna. En la imagen que sigue (FIG. 1, explicación bajo C.), se muestra la variación de la secuencia del antígeno.

Se espera que la secuencia de consenso combine las propiedades de todas las secuencias disponibles. Esto es, en el caso en que la secuencia de consenso no exista en la naturaleza por razones desconocidas, la plataforma de expresión utilizada para la vacuna, ofrece la oportunidad de expresar una proteína que podría proporcionar características antigénicas únicas.

Tabla 1. Posición de las diferencias de AA entre el subclado A (1709-1) y el subclado B (1709-6) en su emergencia

Tabla 2. Posición de las diferencias de AA en el subclado B entre la cepa prototipo de 2008 (1709-6) y algunos aislados del subclado B (1556) recientes (2010)

C. Criterios de identificación para la selección de cepas de ataque, motivos relevantes en la secuencia

Los criterios para la selección de las cepas de ataque fueron esencialmente los mismos criterios de las cepas de vacuna mencionadas anteriormente.

Criterio 1.

Distancias genéticas relacionadas con el análisis filogenético. La separación de taxones en un árbol filogenético es el soporte para deducir los aislados relacionados más distantes según la secuencia HA H5. Se seleccionaron los aislados más distantes.

Criterio 2.

Frecuencia de cada sublinaje en el muestreo de 2010. No está relacionada con la medida en que las muestras representan la circulación de campo del virus H5N1 HPAI. La prevalencia de cada sublinaje en el conjunto de datos de 2010 fue la base para recoger los aislados y proponerlos como nuevas cepas de ataque.

Además, se utilizó el análisis basado en las secuencias para confirmar los hallazgos filogenéticos. Asimismo, los cambios en la secuencia HA de H5 dentro o alrededor del sitio de unión al receptor (RBS) se consideraron importantes para definir nuevas cepas de vacuna o de ataque. En la figura que sigue se muestra la variación de la secuencia.

La Tabla 1 representa la posición de las diferencias de AA (aminoácidos) entre el subclado A (1709-1) y el subclado B (1709-6) en su emergencia, y la Tabla 2 representa la posición de las diferencias de AA en el subclado B entre la cepa prototipo de 2008 (1709-6) y algunos aislados del subclado B (1553) recientes (2010).

D. Construcción de un baculovirus recombinante que codifica y expresa antígenos de la H5 HA

El baculovirus recombinante que contiene el antígeno de la HA H5 se genera como sigue: las secuencias codificadoras de la HA H5 (SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 40) se sintetizan químicamente y se subclonan en el vector de transferencia pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Los plásmidos pVL1392 que contienen los genes que codifican cada antígeno HA H5 son entonces co-transfectados con DNA de baculovirus DiamondBac® (Sigma) a células de insectos Sf9 (BD Biosciences Pharmingen) para generar el baculovirus recombinante que contiene los genes HA H5. Los baculovirus recombinantes que contienen los genes que codifican HA H5 se purifican en placas y los Virus de Siembra Master (MSVs) se propagan sobre la línea celular SF+, se dividen en alícuotas, y se conservan a -70 °C. Las células de insectos infectadas con baculovirus HA H5 como se ha descrito antes para generar MSV o Virus de Siembra de Trabajo expresan el antígeno HA H5 como se detecta mediante anticuerpos séricos monoclonales o policlonales en un ensayo indirecto de anticuerpos fluorescentes o de transferencia Western.

Después de sembrar con las cantidades apropiadas de baculovirus recombinantes (HA H5 para cada secuencia de antígeno, respectivamente), se incuban entonces los matraces giratorios que contienen las células SF+ (Protein Sciences, Inc., Meriden, CT) a 27 ± 2 °C durante 7 días y con agitación a 100 rpm durante este tiempo. Los matraces utilizaron tapones ventilados para permitir el flujo de aire. Se recogen de cada cultivo, el cultivo celular completo crudo que contiene las células SF+ infectadas por baculovirus y los sobrenadantes del cultivo celular. E. Datos sobre la HI, respuesta serológica de los aislados egipcios frente a la vacuna H5 BEST (por sus iniciales en inglés, Baculovirus Expression System Technology) (construcción actual)

En la siguiente tabla, se encuentran los valores de los títulos HI y los correspondientes GMT (títulos como media geométrica), para grupos de pollos vacunados con la vacuna A i BEST KV ND (Tecnología de sistema de expresión de baculovirus y enfermedad de Newcastle, virus muertos) a los 3 meses de edad. Los mismos grupos experimentales se enfrentaron con las cepas egipcias H5N1 HPAI mencionadas y se incluye el nivel de protección para confirmar que el nivel de anticuerpos está correlacionado con un alto grado de protección.

La siguiente tabla representa: Prototipos de vacuna que contienen el antígeno HA H5 que producen una buena respuesta inmunitaria. Títulos HI, como medida de los niveles de anticuerpos, procedentes de pollos vacunados a los 10 días de edad presentaron valores por encima del logaritmo en base 2 de 4. En la tabla, se muestran los datos originales de cada animal vacunado y el correspondiente GMT por grupo. Se confirmó el nivel de anticuerpos para los dos grupos que confirió protección antes del enfrentamiento utilizando las cepas que se muestran en la parte inferior. Las cepas incluían un aislado de campo reciente de 2010 del AIV H5N1 HP ("1553-2"), y de la cepa oficial ("1709-6") que el gobierno egipcio utiliza para evaluar los lotes de vacuna.

Ejemplo 2

Preparación de composiciones farmacéuticas (vacunas) que comprenden diferentes antígenos HA H5

Se recoge la proteína HA H5 cruda de células completas expresada en células de insectos mediante un sistema de expresión basado en baculovirus. Se inactivan los baculovirus en presencia de etilenimina binaria ciclada (BEI) 10 mM (concentración final) entre aproximadamente 32 y 39 °C durante 72 a 96 horas. Una vez completada la inactivación se añade una solución 0,3 M de tiosulfato de sodio hasta una concentración final 10 mM para neutralizar la BEI residual. Después de la neutralización se añaden varios adyuvantes y se generan las siguientes composiciones farmacéuticas/vacunas.

VACUNAS

La Serie 501 a 507 corresponde al mismo antígeno HA H5 ciado A formulado utilizando siete adyuvantes diferentes. La Serie 508-514 es la serie que corresponde al antígeno HA H5 ciado B. La Serie 515-521 es la serie que corresponde al antígeno HA H5 clado de consenso. La Serie 522-528 es la serie que corresponde al antígeno HA H5 clado de la OMS.

Ejemplo 3

Vacunación de aves contra la gripe aviar

Introducción

El propósito de este estudio es determinar la capacidad de las vacunas experimentales que contienen un extracto crudo de antígeno de la hemaglutinina H5 recombinante para inducir los títulos de inhibición de la hemaglutinación (HI) en los pollos y proporcionar protección frente al ataque con el virus gripal aviar (AIV) H5N1 altamente patógeno (HP). En adición, se utiliza como control una vacuna convencional inactivada Volvac® AI (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Mexico).

Diseño del estudio:

Se vacunan aves SPF (15-25) independientemente con diferentes vacunas experimentales a la edad de 1 o 10 días por vía subcutánea con 0,2 o 0,5 mL en la parte posterior del cuello; todas las aves se mantienen en aisladores durante el experimento. Se les proporciona alimento y agua ad libitum. El ataque se realiza 21 días después de la vacunación con una cepa de gripe aviar H5N1 altamente patógena.

Se obtienen muestras de suero mediante sangrado de las aves por la vena yugular los días 7, 14, y 21 después de la vacunación. Los sueros obtenidos se conservan a 4 °C hasta la realización del ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HI), como se ha descrito antes, para obtener los títulos de anticuerpos.

Vacunas y virus de ataque:

Se evalúan independientemente cuatro formulaciones diferentes:

i. HA H5 clado A: El antígeno HA H5 se formula en una emulsión oleosa basada en los procedimientos de Boehringer Ingelheim Vetmedica.

ii. HA H5 clado B: El antígeno HA H5 se formula en una emulsión oleosa basada en los procedimientos de Boehringer Ingelheim Vetmedica.

iii. HA H5 clado de consenso: El antígeno HA H5 se formula en una emulsión oleosa basada en los procedimientos de Boehringer Ingelheim Vetmedica.

iv. HA H5 clado de la OMS: El antígeno HA H5 se formula en una emulsión oleosa basada en los procedimientos de Boehringer Ingelheim Vetmedica.

Se usa como control, una vacuna contra la gripe aviar, en emulsión oleosa, de Boehringer Ingelheim Vetmedica, Volvac® AI (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Mexico).

Los ataques se realizan en pollos vacunados y no vacunados mediante inoculación por vía intranasal con 0,2 mL que contienen 1060 EID-50/mL del virus de ataque H5N1 por ave. Después del ataque, se registran los síntomas y la mortalidad. Diez días después de la inoculación todos los pollos supervivientes se sacrifican siguiendo los protocolos de los laboratorios de animales.

Ejemplo del diseño experimental de los prototipos, formulación y estudios clínicos

Se prepara una emulsión agua/aceite que incluye 500 HAU / dosis (HAU= Unidades de Hemaglutinación) para cada construcción egipcia-BEST (Tecnología de sistema de expresión de baculovirus). Se prevén tres construcciones, basadas en estudios recientes. Se vacunaron pollos SPF (libres de patógenos específicos) una vez el décimo día de edad utilizando 0,5 mL de cada prototipo de vacuna por ave, por vía subcutánea en la parte posterior del cuello. El control positivo de la protección se vacuna administrando 0,5 mL de VOLVAC® AI ND KV (Boehringer Ingelheim Vetmedica, Mexico) por vía subcutánea en la parte posterior del cuello.

Cada ave se enfrenta con 10 a 6 EID50/0,1 mL de dosis viral oronasalmente. La infección experimental utiliza la cepa de ataque de Egipto (A/chicken/Egypt/1063/2010).

Resultados:

Se considera un título positivo de suero log²4 de acuerdo con los estándares de la OIE. Basándose en este criterio, los resultados serológicos son positivos. Los mejores títulos serológicos se observan con la vacuna formulada con los antígenos HA H5, tanto en las aves vacunadas el día 1 de edad como a los 10 días de edad. Los títulos serológicos más bajos se observan con la vacuna Volvac®. En el estudio de enfrentamiento se observa que todos los prototipos de vacunas confieren protección completa. La protección más baja en el estudio de enfrentamiento se observa con la vacuna Volvac®, cuando se administra, tanto a la edad de 1 día como a la edad de 10 días.

En el listado de secuencias (SEQ ID NOs: 1 a 43):

SEQ ID NO: 1 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "1709-6",

SEQ ID NO: 2 corresponde a la secuencia H5

e H5N1 "1553-1/A1",

SEQ ID NO: 3 corresponde a la secuencia H5

e H5N1 "1553-15/A1",

SEQ ID NO: 4 corresponde a la secuencia H5

e H5N1 "2095-50/A1",

SEQ ID NO: 5 corresponde a la secuencia H5

e H5N1 "3982-2/A1",

SEQ ID NO: 6 corresponde a la secuencia H5

e H5N1 "3982-5/A1",

SEQ ID NO: 7 corresponde a la secuencia H5

e H5N1 "3982-7/A1",

SEQ ID NO: 8 corresponde a la secuencia H5

e H5N1 "3982-8/A1",

SEQ ID NO: 9 corresponde a la secuencia H5

e H5N1 "3982-9/A1",

SEQ ID NO: 10 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "3982-12/A1",

SEQ ID NO: 11 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "3982-20/A1",

SEQ ID NO: 12 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "3982-44/A1",

SEQ ID NO: 13 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "1553-2/B1",

SEQ ID NO: 14 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "1553-6/B1",

SEQ ID NO: 15 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "1553-13/B2",

SEQ ID NO: 16 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "1553-26/B2",

SEQ ID NO: 17 corresponde a la secuencia H5 de H5N1 "1553-28/B1",

SEQ ID NO: 18 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''2095-39/B2'

SEQ ID NO: 19 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 "2095-46/B1'

SEQ ID NO: 20 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 "2095-49/B1'

SEQ ID NO: 21 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 "2095-65/B1'

SEQ ID NO: 22 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 "2095-68/B2'

SEQ ID NO: 23 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''2095-70/B2'

SEQ ID NO: 24 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''2095-73/B2'

SEQ ID NO: 25 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''2095-75/B2'

SEQ ID NO: 26 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''3982-3/B1'',

SEQ ID NO: 27 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''3982-4/B1'',

SEQ ID NO: 28 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 '3982-13/B1'

SEQ ID NO: 29 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''3982-14/B2'

SEQ ID NO: 30 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''3982-19/B3'

SEQ ID NO: 31 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 '3982-21/B2'

SEQ ID NO: 32 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''3982-43/B1'

SEQ ID NO: 33 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 '3982-50/B1'

SEQ ID NO: 34 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 '3982-52/B1'

SEQ ID NO: 35 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 '3982-55/A1'

SEQ ID NO: 36 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 '3982-56/A1'

SEQ ID NO: 37 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''3982-78/B2"

SEQ ID NO: 38 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 ''4794-17/B

SEQ ID NO: 39 corresponde a a secuencia H5 de H5N1 '4794-18/B',

SEQ ID NO: 40 corresponde a la secuencia H5 traducida de la SEQ ID NO: 43.

SEQ ID NO: 41 codifica una secuencia H5 de H5N1 ''3982-8/A1'' (SEQ ID NO: 8),

SEQ ID NO: 42 codifica una secuencia H5 de H5N1 ''1553-2/B1'' (SEQ ID NO: 13),

SEQ ID NO: 43 corresponde a la secuencia de consenso obtenida después del análisis de las 38 secuencias del gen HA H5 que codifica las SEQ ID NOs: 2 a 39.

Tabla A: La siguiente lista (Tabla A) es una alineación de las secuencias indicadas en las SEQ ID Nos: 2 a 39, en las que se usa el código de una letra para los aminoácidos:

5 15 25 35 45 55 1553 -1 /A 1 MEKIMLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 1553 -15 /A 1 MEKIVLLLAI VSIVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 2095 -50 /A 1 MEKIVLLLAI VSLVKGDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982 -2 /A 1 ---- XLLAI VSIVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982 - 5 /A l --------- — XVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982 -7 /A 1 --------- — XVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982 -8 /A 1 --------XI VSIVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982 -9 /A 1 --------- — XVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982 -12 /A 1 --------- XSIVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982 - 20 /A l --------XI VSIVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982 -4 4 /A l --------- --XVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 1553 -2 /B 1 MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 1553 -6 /B 1 MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 1553 -13 /B 2 MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 1553 -26 /B 2 MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 1553 -28 /B 1 MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095 -39 /B 2 MEKIVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095 -46 /B 1 ---- XLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095 -49 /B l --- VLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095 -65 /B l -- XVLLLAI ISLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095 -68 /B 2 -- IVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095 -70 /B 2 ------LLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095 -73 /B 2 -- IVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095 -75 /B 2 -- IVLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982 -3 /B 1 --- XLLLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSÍTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982 -4 /B 1 --------- — XVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982 -13 /B 1 --------- XSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982 -14 /B 2 --------- KGDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3 982 -19 /B 3 --------- -----------— XHANNSTE QVDTIMEKNI TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3 982 -21 /B 2 --------- -XLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3 982 -43 /B 1 --------- KSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3 982 -50 /B 1 --------- — XVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3 982 -52 /B 1 --------- -XLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3 982 - 55 /A l --------- — XVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3 982 -56 /A 1 --------- -----------— XHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3 982 -78 /B 2 ----------- HANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 4 794 -17 /B ----- LLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 4 794 -18 /B ----- XLAI VSLVKSDQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL"

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1S53-2&/B1 SSLAl a ?MVA GLSLWPtCSNG S LQ C R IC I♦

2G9&-.39/B2 5SLALA IMPLA GLFLWX--------2095 -96 ^ 1 )1 SSLALAIMVA GLSLWMCSX-2 G 96 -49 /U í SLALMMVA G L S W K jW S L Q C A lC l-2Ü95-6t>Bl SSLALa j h VA G L S L M M -- - -2093-GB/H2 5SLALAIMMA GLFLWHC&KG K

20 95 - 70 / B2 GSLALAIMMA GLFLWMCSNG SLQ-----------20 95 -73 /B 2 SSLALAIMVX ------------------ ----------------209 5 -75 /B 2 GSLALAIMVX------------------ -------------------39 82 - 3 /B l SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQ-----------398 2 -4 /B 1 SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQCRX-----398 2 -13 /B 1 SSLALAIMVA X---------------- ----------------398 2 -14 /B 2 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI*

398 2 -19 /B 3

398 2 -21 /B 2 SSLALAIM-3982 -43/B1 SSLALAIM-3982 -50 /B 1 SSLALAIM-3982 -52 /B 1

39 82 - 55 /A l

3982-56 /A 1

3982 -78 /B 2 SSLALAX------------------------------479 4 -17 /B SSLALAI------------------------------479 4 -18 /B SSLALAIMMA GLFLWMCSNG

Tabla B: La siguiente lista (Tabla B) presenta las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs:2 a 39 que comienzan con el aminoácido con N-terminal D17, donde la numeración de la posición de dicho primer aminoácido con N-terminal (D17) se refiere a la posición 17 de aminoácidos como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO 1:

5 15 25 35 45 55

15 53 - l /A l (SEQ ID NO : 55) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

15 53 - 15 /Al (SEQ ID NO : 56) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

2095-50/A1 (SEQ ID NO: 57) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

398 2 -2 /Al (SEQ ID NO: 58) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

3982-5/A1 (SEQ ID NO: 59) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

3982-7/A1 (SEQ ID NO: 60) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

398 2 -8 /Al (SEQ ID NO : 61) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

3982-9/A1 (SEQ ID NO : 62) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

3982-12/A1 (SEQ ID NO: 63) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

3982-20/A1 (SEQ ID NO: 64) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

3982-4 4/A1 (SEQ ID NO: 65) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL

1553-2/B1 (SEQ ID NO: 66) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

^{I •i Q e e J J ^ - O r / /r D.1 i} (5EQ ID NO: 67) . DQIC IGYHANNSTE QV DTIME KNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

1553-13/B2 (SEQ ID NO: 68) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

1553-26/B2 (SEQ ID NO: 69) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

1553-28/B 1 (SEQ ID NO: 70) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

2095-39/B 2 (SEQ ID NO: 71) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

2095-46/B 1 (SEQ ID NO: 72) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

2095-49/B 1 (SEQ ID NO: 73) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

2095-65/B 1 (SEQ ID NO: 74) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-68/B2 (SEQ ID NO: 75) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-70/B2 (SEQ ID NO: 76) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-73/B2 (SEQ ID NO: 77) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-75/B2 (SEQ ID NO: 78) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-3/B1 (SEQ ID NO: 79) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-4/B1 (SEQ ID NO: 80) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-13/B1 (SEQ ID NO: 81) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-14/B2 (SEQ ID NO: 82) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-19/B3 (SEQ ID NO: 83) DQIC IGXHANNSTE QVDTIMEKNI TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-21/B2 (SEQ ID NO: 84) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-43/B1 (SEQ ID NO: 85) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-50/B1 (SEQ ID NO: 86) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-52/B1 (SEQ ID NO: 87) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-55/A1 (SEQ ID NO: 88) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-56/A1 (SEQ ID NO: 89) DQIC IGXHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-78/B2 (SEQ ID NO: 90) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 4794-17/B (SEQ ID NO: 91) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 4794-18/B (SEQ ID NO: 92) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

65 75 85 95 105 115

1553-1/Al DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGK FNDYEELKHL 1553-15/A1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 2095-50/A1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIY PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3982-2/Al DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLDVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3982-5/A1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNV- EWSYIVEKIN PTNDLCYPGN FNDYEELKHL 3982-7/Al DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDKFLNVP EWSYIVEKIN PTNDLCYPGN FNDYEELKHL 3982-8/Al DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PTNDLCYPGN FNDYEELKHL 3982-9/Al DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3982-12/A1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3982-20/A1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3982-44/A1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 1553-2/B1 GGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 1553-6/B1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKTN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 1553-13/B2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 1553-26/B2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 1553-28/B1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 2095-39/B2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKTN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 2095-46/B1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 2095-49/B1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 2095-65/B1 DGVKPLILRG CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 2095-68/B2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 2095-70/B2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 2095-73/B2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 2095 - 75 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 398 2 - 3 / B l DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 398 2 - 4 / B l DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3982 - 13 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3982 - 14 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3982 - 19 /B 3 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 -2 X /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 - 43 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 - 50 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKTN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3982 - 52 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 - 55 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDKFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGD FNDYEELKHL 3 982 - 56 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVL EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3 982 - 78 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 479 4 - 17 /B DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 4 794 - 18 /B DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL

------ | ------ 1 ------- 1 ------1 --------| ------ I --------| ------ 1--------| ------ I ------- | 125 135 145 155 165 175 1 55 3 - 1 / A l LSRINHFEKI QIIPRNSWSD HETS-GVSSA CQYQGRSSFF RNWWLTKKD NAYSTIKRSY 1 55 3 - 15 /A l LSRINHFEKI QIIPKGSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 2 095 - 50 / A l LSRINHFEKI QIIPKSSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKD NAYPTIKKSY 3 98 2 - 2 /A l LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HETS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN TAYPTIKKSY 3 982 - 5 /A 1 LSRINHFEKI QIIPKNYWSD HETS-GVSSA CPYQGRPSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3 982 - 7 / A l LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3 982 - 8 /A 1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3 982 - 9 /A 1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NXYPTIKKSY 39 82 - 12 /A 1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3 982 - 20 / A l LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3 982 - 4 4/A1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKD NAYPTIKRSY 1 553 - 2 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN DTYPTIKESY 1 553 - 6 / B l LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 1 553 - 13 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQRGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKKSY 1 553 - 26 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKESY 1 553 - 28 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKESY 20 95 - 39 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGRPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 20 95 - 46 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKENY 2 095 - 49 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKENY 20 95 - 65 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 20 95 - 68 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKKSY 20 95 - 70 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKXSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKESY 20 95 - 73 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQEGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKKSY 20 95 - 75 /B 2 • LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGXSFY RNWWLIKKN NTYPTIKESY 39 82 - 3 / B l LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKENY 39 82 - 4 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 398 2 - 13 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKENY 398 2 - 14 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKESY 39 82 - 19/B 3 LSRINRFEKI QIISKNSWPD HEASLGVSAA CPYQGGLSFY RNWWLIEKN NTYPLIKKNY 398 2 - 21/B2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQRGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKKSY 398 2 - 43 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN DTYPTIKESY 398 2 - 50 /B 1 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKESY 398 2 - 52 / B l LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN DTYPTIKESY 3982 - 55 /A 1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 398 2 - 56 / A l LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQRRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 398 2 - 78 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKKSY 479 4 - 17 /B LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKESY 4794 - 18 /B LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLTKKN NTYPTIKKSY

185 195 205 215 225 235

1553 - 1 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1553 - 15 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 2 095 - 50 / A l NNTNQEDLLI LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 2 / A l NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 5 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 7 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 8 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 9 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 12 / A l NNTNQEDLLV LWGIHHPNDE AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 20 / A l NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA NRSKVNGQSG 3 982 - 44 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1 553 - 2 / B l HNTNQEDLLV LWGIHHPNNE EEQKRIYKNP TTYVSVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1 553 - 6 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1 553 - 13 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1 553 - 26 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQRG 1 553 - 28 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 2 095 - 39 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISIGTST LNQRLIPKIA TRSKVNGQSG 2 095 - 46 / B l HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 2 095 - 49 / B l HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 20 95 - 65/B1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 20 95 - 68 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 20 95 - 70 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 20 95 - 73 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 20 95 - 75 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 - 3 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LTQRLVPKIA TRPKVNGQSG 3 982 - 4 / B l HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 39 82 - 13 / B l HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 39 82 - 14/B2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP NTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 398 2 - 19 /B 3 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE AEQXRLYKNS TTYISVGTST LXQRLVPKIA TRPKVNGQSG 398 2 ­ ■21/B2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 ­ ■43/B1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 ­ -50 /B l HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 ­ ■52/Bl HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYVSVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 ­ 55 /A l NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTMLYQNP TTYVSVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 ­ ■56/A1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 ­ ■18 / B2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 47 94 ­ -17/B HNINKEDLLV LWGIHHPNDE EEQIRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 4794- •18/B HNINKEDLLV LWGIHHPNDE EEQIRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG

245 255 265 275 285 295

1 553 - 1 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 1 553 - 15 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 20 95 - 5 O/Al RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 3 982 - 2 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 5 / A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 7 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGDC NTKCQTPIGA 398 2 - 8 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGDC NTKCQTPIGA 398 2 - 9 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 12 / A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 20 / A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 44 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 1 553 - 2 / B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 1 553 - 6 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPVGA 1 553 - 13 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 15 53 - 26 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 15 53 - 28 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 20 95 - 39 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 20 95 - 46 /B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 20 95 - 49 / B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 20 95 - 65 / B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 20 95 - 68 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEHGNC NTKCQTPIGA 209 5 - 70 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 20 95 - 73 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 20 95 - 75 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 3 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 398 2 - 4 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 39 82 - 13 / B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 39 82 - 14 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 39 82 - 19 /B 3 RVEFFWTILK SNDVINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSDLEYGNC STKCQTPIGA 398 2 - 21 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 43 / B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 39 82 - 50 / B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPVGA 3 982 - 52 / B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 3 982 - 55 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 3 982 - 56 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 3 982 - 78 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 4 79 4 - 17/B RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 4 794 - 18 /B RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA

305 315 325 335 345 355

1 55 3 - l / A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQEE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 1 553 -15 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 20 95 -50 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 2 / A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPHGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 -5 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 -7 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 8 / A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 -9 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 -12 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 -2 O/Al INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 -44 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 1 553 -2 /B 1 INTSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 1 553 - 6 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 1 553 - 13/B2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 15 53 -26 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 1 553 -28 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 20 95 -39/B2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW ^{^ A C} A _O/O ¹ _{I INS SMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA ibLrMNoryuL GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW} 20 95 -4 9 /B l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 20 95 -6 5 /B l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 20 95 -6 8/B2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 20 95 -70/B2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 20 95 -73 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 20 95 -75/B2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TXLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 - 3 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 - 4 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 -13 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 14/B2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQEE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 19/B3 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 21/B2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 -43/B1 INTSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 50 /B l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVXSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 - 52 / B l INTSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 - 55 /A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 -56 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 398 2 - 78 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 479 4 - 17 /B INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 479 4 - 18 /B INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW

365 375 385 395 405 415

155 3 - 1 / A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 1553 -15 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2095 - 50 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 398 2 - 2 / A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3 982 - 5 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 - 7 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 398 2 - 8 /A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 - 9 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3 982 - 12 / A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3 982 - 20 / A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3 982 -44 /A 1 ' QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 1553 - 2 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 1 553 - 6 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNXQGSGY AADRESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 1 553 - 13 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 1 553 - 26 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 1 553 - 28 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2 095 - 39 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2 095 - 46 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2 095 - 49 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2 095 - 65/B1 QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2 095 -68/B2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2 095 - 70 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2 095 - 73 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 20 95 - 75 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3 982 - 3 / B l QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3 982 - 4 / B l QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 13 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 14 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 19 /B 3 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 21 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 43 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA INGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 398 2 - 50 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADRESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 398 2 - 52 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 55 / A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 -56 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 398 2 - 78 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 47 94 - 17 /B QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 47 94 - 18 /B QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 425 435 445 455 465 475

1 553 - 1 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 1 553 - 15 /A 1 r r i e n l n k k m EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDRVRL QLRDNAKELG 2 095 - 50 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 2 / A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 5 / A l RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 7 / A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 8 / A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 9 / A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 12 / A l RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 20 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 44 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 1 553 - 2 / B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 1 553 - 6 / B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 1 553 - 13 / B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 1 553 - 26 / B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 15 53 - 28 / B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 2 095 - 39 / B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 2 095 - 46 / B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 2 095 - 49 / B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 20 95 - 65 / B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 20 95 - 68 / B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 2 09 5 - 70 / B2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 20 95 - 73 / B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 2 095 - 75 / B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 3 / B l KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 4 / B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 13 / B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 14 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 19 / B 3 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 21 / B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 43 / B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 5 0 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 52 / B l KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 3 982 - 55 / A l RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 56 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 78 / B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 4 794 - 17 / B KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 4 794 - 18 / B KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG

------ I -------- |

485 495 505 515 525 535 155 3 - 1 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 15 53 - 15/A1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 209 5 -50 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3982 - 2 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3982 - 5 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 398 2 - 7 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 398 2 - 8 / A l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 398 2 - 9 / A l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY Q IL-------------398 2 - 12 / A l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3982 - 20 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYX-----3982 - 44 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 1553 - 2 /B 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 1553 - 6 /B 1 NGCFEFYHRC DNECIESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 1553 - 13 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 1553 - 26 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 1553 - 28 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVT 2 095 - 39 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2095 - 46 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2 095 - 49 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2 095 - 65 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY ■QILSIYSTVA 2 095 -6 8 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLNREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2 095 - 70 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2 095 - 73 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2 095 - 75 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 - 3 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 - 4 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 - 13 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 - 14/B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 - 19 /B 3 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GAKLESIGTY QIX-------------39 82 - 21 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVKN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 39 82 - 43 /B 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 39 82 - 50 /B 1 NGCFEFYHRC DNECIESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 39 82 - 52 /B 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLEX-------39 82 - 55 / A l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTX Q I---------------39 82 - 56 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTX QIX-------------39 82 - 78 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QIL*IYSTVA 4 794 - 17 /B NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 47 94 - 18 /B NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA

------1 --------| ------ I ------- | ------1 --------545 555 565

15 53 - 1 /A l SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI*

155 3 -15 /A 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI*

20 95 - 50 / A l SSLALAIMVA GLFLWMCSNG X--------------

39 82 - 2 / A l SSLALAIMVX -------------------- -39 82 - 5 / A l SSLALAIM— -------------------- ----398 2 - 7 / A 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG

398 2 - 8 / A 1 SSLALAIMVX --------------------- -3 98 2 - 9 / A 1

398 2 - 12 / A 1

3 98 2 - 20 / A 1

3 98 2 - 44 / A 1 SSLALAIX—

155 3 - 2 / B 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQC RICI*

155 3 - 6 / B 1 SSLALAIIVA GLFLWMCSNG SLQC RICI*

155 3 - 13 / B 2 SSLALAIMMA GLFLWMCSNG SLQC RICI*

155 3 - 26 / B 2 SSLALAIMMA GLFLWMCSNG SLQC RICI*

155 3 - 28 / B 1 SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQC RICI*

2 09 5 - 39 / B 2 SSLALAIMMA GLFLWX------- ---------------------2 09 5 - 46 / B 1 SSLALAIMVA GLSLWMCSX- ------------------2 09 5 - 49 / B 1 SSLALAIMVA GLSLWMCSNG S L Q C R IC I-2 09 5 - 65 / B 1 SSLALAIMVA GLSLWM-----------------------------2 09 5 - 68 / B 2 SSLALAIMMA GLFLWMCSNG X----------------2 09 5 - 70 / B 2 GSLALAIMMA GLFLWMCSNG SLQ------------2 09 5 - 73 / B 2 SSLALAIMVX

2 09 5 - 75 / B 2 GSLALAIMVX

3 98 2 - 3 / B 1 SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQ------------3 98 2 - 4 / B 1 SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQCRX------3 98 2 - 13 / B 1 SSLALAIMVA X ------------------- ----------------------3 98 2 - 14 / B 2 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQC RICI*

3 98 2 - 19 /B 3

3 98 2 - 21 /B 2 SSLALAIM

3 98 2 - 4 3 /B 1

3 98 2 - 50 / B 1

3 98 2 - 52 / B 1

3 982 - 55 / A 1

3 98 2 - 56 / A l

3 98 2 - 78 / B 2 SSLALAX----- ----------------------- ----4 79 4 - 17 / B S SLA LA I----- ----------------------- ----4 79 4 - 18 / B SSLALAIMMA GLFLWMCSNG

Tabla C: La siguiente lista (Tabla C) presenta las secuencias indicadas en las SEQ ID NOs: 2 a 39 que comienzan con el aminoácido con N-terminal D17 y que tienen una secuencia C-terminal de longitud completa, donde la numeración de la posición de dicho primer aminoácido con N-terminal (D17) se refiere a la posición 17 de aminoácidos dada como ejemplo en la SEQ ID NO: 1, y donde la secuencia C-terminal de longitud completa corresponde a los aminoácidos 527 a 568, donde la numeración de las posiciones de dichos aminoácidos se refiere a las posiciones 527 a 568 de los aminoácidos como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO: 40:

5 15 25 35 45 55

15 53 - l /A l (SEQ ID NO: 93) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 155 3 -15/A1 (SEQ ID NO: 94) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 2095-50/A1 (SEQ ID NO: 95) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-2/A 1 (SEQ ID NO: 96) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-5/A1 (SEQ ID NO: 97) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-7/A 1 (SEQ ID NO: 98) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-8/A 1 (SEQ ID NO: 99) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-9/A1 (SEQ ID NO: 100) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-12/A1 (SEQ ID NO: 101) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-20/A1 (SEQ ID NO: 102) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-4 4/A1 (SEQ ID NO: 103) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 1553-2/B1 (SEQ ID NO: 104) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 1553-6/B1 (SEQ ID NO: 105) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 1553-13/B2 (SEQ ID NO: 106) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 1553-26/B2 (SEQ ID NO: 107) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 1553-28/B1 (SEQ ID NO: .108) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-39/B 2 (SEQ ID NO: 109) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-46/B 1 (SEQ ID NO: 110) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-49/B 1 (SEQ ID NO: 111) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-65/B1 (SEQ ID NO: 112) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-6 8/B2 (SEQ ID NO: 113) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-70/B 2 (SEQ ID NO: 114) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095-73/B2 (SEQ ID NO: 115) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 2095—75/B2 (SEQ ID NO: 116) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-3 /B 1 (SEQ ID NO: 117) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-4 /B 1 (SEQ ID NO: 118) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-13/B1 (SEQ ID NO: 119) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 39 82 - 14/B2 (SEQ ID NO: 120) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-19/B3 (SEQ ID NO: 121) DQIC IGXHANNSTE QVDTIMEKNI TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-21/B 2 (SEQ ID NO: 122) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 7 0 0 1 n / m

^{J Z f V t . ---- Ís3 / O X} (SEQ ID NO: 123) DQIC IGYHANNSTE QVDT IMEKN'v TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-50/B 1 (SEQ ID NO: 124) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-52/B1 (SEQ ID NO: 125) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 3982-55/A1 (SEQ ID NO: 126) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-56/A1 (SEQ ID NO: 127) DQIC IGXHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCNL 3982-78/B2 (SEQ ID NO: 128) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 4794-17 /B (SEQ ID NO: 129) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 4794-18 /B (SEQ ID NO: 130) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV •TVTHAQDILE KTHNGKLCDL 65 75 85 95 105 115 1553 -1 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGK FNDYEELKHL 1 553 -15 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 2 095 -50 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIY PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3 98 2 - 2 /A l DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLDVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3 982 - 5 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNV- EWSYIVEKIN PTNDLCYPGN FNDYEELKHL 3 982 - 7 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDKFLNVP EWSYIVEKIN PTNDLCYPGN FNDYEELKHL 3 982 - 8 / A l DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PTNDLCYPGN FNDYEELKHL 3 982 - 9 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3 982 -12 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3 982 -20 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 3 982 -44 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 1 553 - 2 / B l GGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 1 553 - 6 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKTN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 1 553 - 13 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 1 553 - 26 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 1 553 - 28 / B l DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 20 95 - 39 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKTN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 2 095 - 46 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 20 95 - 49 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 20 95 -65 /B l DGVKPLILRG CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 20 95 - 68 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 20 95 - 70 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 20 95 - 73 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 20 95 - 75 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 - 3 / B l DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 - 4 / B l DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN. PANDLCYPGN FNNYEELKHL 39 82 - 13 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 39 82 - 14 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 - 19 /B 3 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFLNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 - 21 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 - 43 / B l DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 398 2 - 50 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKTN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 39 82 - 52 /B 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 3 982 - 55 / A l DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDKFLNVP EWSYIVEKIN PANDLCYPGD FNDYEELKHL 39 82 -56 /A 1 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVL EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNDYEELKHL 398 2 - 78 /B 2 DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 47 94 - 17 /B DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL 47 94 - 18 /B DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL

------1 ------- | ------I ------- |

125 135 145 155 165 175

15 53 -1 /A 1 LSRINHFEKI QIIPRNSWSD HETS-GVSSA CQYQGRSSFF RNWWLTKKD NAYSTIKRSY 1553-15/A1 LSRINHFEKI QIIPKGSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 2095 -50 /A l LSRINHFEKI QIIPKSSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNVVWLTKKD NAYPTIKKSY 3982-2/A1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HETS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN TAYPTIKKSY 3982 -5 /A l LSRINHFEKI QIIPKNYWSD HETS-GVSSA CPYQGRPSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3982-7/A1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3982-8/A1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3982-9/A1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NXYPTIKKSY 3982-12/A1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3982-20/A1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3982-44/A1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNVVWLTKKD NAYPTIKRSY 1553-2/B1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN DTYPTIKESY 1553-6/B1 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 1553-13/B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQRGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKKSY 1553-26/B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 1553-28/B1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 2095-39/B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGRPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 2095-46/B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKENY 2095-49/B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKENY 2095-6 5/B1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 2095-6 8/B2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKKSY 2095-70 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKXSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 2095-73 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQEGPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKKSY 2095-75 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGXSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 3982-3 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKENY 3982-4 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 3982-13/B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKENY 3982-14 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 3982-19 /B 3 LSRINRFEKI QIISKNSWPD HEASLGVSAA CPYQGGLSFY RNVVWLIEKN NTYPLIKKNY 3982-21 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQRGPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKKSY 3982-43/B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNVVWLIKKN DTYPTIKESY 3982-50/B 1 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGEPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 3982-52 /B 1 LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNVVWLIKKN DTYPTIKESY 3982-55/A 1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQGRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3982-56/A 1 LSRINHFEKI QIIPKNSWSD HEAS-GVSSA CPYQRRSSFF RNWWLTKKN NAYPTIKKSY 3982-78 /B 2 LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKKSY 479 4 -17/B LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNVVWLIKKN NTYPTIKESY 4794-18 /B LSRINRFEKI KIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLTKKN NTYPTIKKSY

— i — i — i — i — i — i — i — i — i — i — i — i

185 195 205 215 225 235

1553-1 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1553-15/A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 209 5 -50 /A l NNTNQEDLLI LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3982-2 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 -S /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST l n q r l v p k i a TRSKVNGQSG 3 982 -7 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 8 / A l ' NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 9 / A l NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST l n q r l v p k i a TRSKVNGQSG 3 982 - 12 /A l NNTNQEDLLV LWGIHHPNDE AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 20 /A l NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA NRSKVNGQSG 3 982 -4 4 /A l NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1 553 - 2 / B l HNTNQEDLLV LWGIHHPNNE EEQKRIYKNP TTYVSVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1 553 - 6 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1 553 - 13/B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 1 553 - 26 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQRG 1 553 - 28 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 2 095 -39 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISIGTST LNQRLIPKIA TRSKVNGQSG 20 95 -46 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 20 95 - 49 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 20 95 -65/B1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 20 95 -68 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 20 95 -70 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 20 95 - 73 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 20 95 - 75 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISIGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 3 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LTQRLVPKIA TRPKVNGQSG 39 82 - 4 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 39 82 - 13 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRPKVNGQSG 39 82 - 14/B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP NTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 - 19 /B 3 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE AEQXRLYKNS TTYISVGTST LXQRLVPKIA TRPKVNGQSG 39 82 - 21 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 - 43 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 - 50 /B 1 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 3 982 - 52 / B l HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQKRIYKNP TTYVSVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 -55 /A 1 NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTMLYQNP TTYVSVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 - 56 /A l NNTNQEDLLV LWGIHHPNDA AEQTRLYQNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 39 82 - 78 /B 2 HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 4 794 - 17 /B HNINKEDLLV LWGIHHPNDE EEQIRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG 4 794 - 18 /B HNINKEDLLV LWGIHHPNDE EEQIRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG

245 255 265 275 285 295

15 53 -1 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 15 53 -15 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 20 95 -50 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 2 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 5 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 39 82 - 7 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGDC NTKCQTPIGA 39 82 - 8 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGDC NTKCQTPIGA 39 82 - 9 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 398 2 -12 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 398 2 - 20 /A l RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 3982 -44 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 155 3 -2 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 155 3 -6 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPVGA 155 3 -13 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 155 3 -26 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 1553 -28 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 2095 -39 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 209 5 - 46 /B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 209 5 - 49 /B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 2095 -65 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 2095 -68 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEHGNC NTKCQTPIGA 2095 -70 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 2095 -73 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 2095 -75 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 3982 -3 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 3982 -4 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 3982 -13 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPKNAY KIVKKGSSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 3982 - 14/B2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 3982 -19 /B 3 RVEFFWTILK SNDVINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSDLEYGNC STKCQTPIGA 3 982 -21 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 3 982 -43 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 3982 -50 /B 1 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPVGA 3982 - 52 /B l RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC STKCQTPIGA 398 2 -55 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 398 2 -56 /A 1 RMEFFWTILK SNDAINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 3 982 -78 /B 2 RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 4 794 - 17/B RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA 4 794 -18 /B RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA

305 315 325 335 345 355

15 53 -1 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQEE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 155 3 -15 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 20 95 -50 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 - 2 /A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPHGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 398 2 -5 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 398 2 -7 /A 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 - 8 /A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 - 9 /A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 - 12 /A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 - 20 /A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3982 - 44 /A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 1553 -2 /B 1 INTSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 1553-6 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 1553 -13 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 1553 -26 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 155 3 - 28 /B 1 ' INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 2095 -39 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 2095 -46 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 2095 -49 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 2095 -65 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 2095 -68 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 2095 -70 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 2095 -73 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 2095 -75 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TXLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 -3 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 4 /B l ' INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 -13 /B 1 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 -14 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQEE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 -19 /B 3 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 -21 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 -43 /B 1 INTSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 50 /B l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVXSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 52 /B l INTSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 55 /A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 3 982 - 56 /A l INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE RRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 39 82 -78 /B 2 INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW 4 / 94 - i i / a INb^MFFHNl HFL.11ÜEUFK XVKüNKbVLA TÜLKNSFQUE GKKKKKGLFÜ AIAGFIEGGW 4 794 -18 /B INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGW

365 375 385 395 405 415

1553-1 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 15 53 - 15 /A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 209 5-50 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 2 /A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 5 /A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 -7 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 8 /A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 39 82 - 9 /A l QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 398 2-12 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 398 2-20 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982-44 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 155 3 -2 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 155 3 -6 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNXQGSGY AADRESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 155 3 - 13 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 155 3 - 26 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 155 3 - 28 / B l QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 209 5 - 39 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 209 5 - 46 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 209 5 - 49 / B l QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2095 -6 5 /B l QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2095 -6 8/B2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 209 5 - 70 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2095 - 73 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 2095 - 75 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 -3 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 -4 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 -13 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGTGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 - 14 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 - 19 /B 3 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 - 21 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 398 2 - 43 / B1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA t NGVTNKVNS ^{tX. t X n U v l U M ’ i l M l X T ^ r Í rJ} _n ^{A U v} _\ ^{rj D í} _\ ^{r u r x M} _m ^{M T} _{u j} ¹ _i ⁷ _j 3982 -50 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADRESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3 982 - 52 /B 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3982 -55 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3 982 -56 /A 1 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 3 982 -78 /B 2 QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 4 794 - 17 /B QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE 4 794 - 18 /B QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE

425 435 445 455 465 475

1 553 - 1 /A l RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 1 553 -15 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDRVRL QLRDNAKELG 2 095 - 50 /A l RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 -2 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 -5 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 7 /A l RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 8 /A l RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 - 9 /A l RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 39 82 -12 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 398 2 -20 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 398 2 -44 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 155 3 -2 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 155 3 -6 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 155 3 -13 /B 2 KRIENLNKKM' EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 155 3 -26 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 155 3 -28 /B l- KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 209 5 - 39 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 209 5 - 46 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 209 5 - 49 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 2095 -65 /B l KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 209 5 - 68 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 209 5 - 70 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 209 5 - 73 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 2095 - 75 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 398 2 - 3 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 398 2 - 4 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 - 13 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 - 14 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 - 19 /B 3 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 - 21 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 - 43 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 - 50 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 - 52 /B 1 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VRNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 -55 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 -56 /A 1 RRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 3982 - 78 /B 2 KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 479 4 - 17/B KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG 4794 - 18 /B KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG

485 495 505 515 525 535

1553 -1 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 1553 -15 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2 095 -50 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 -2 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 - 5 /A l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 -7 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 - 8 /A l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 - 9 /A l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 39 82 -12 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 39 82 -20 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYXTVA 39 82 -44 /A l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 1 553 -2 /B 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 15 53 -6 /B 1 NGCFEFYHRC DNECIESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 15 53 -13 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 15 53 -26 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 15 53 -28 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVT 209 5 - 39 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 209 5 - 46 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 209 5 -49 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2095 -65 /B l NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2095 -68/B2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLNREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2095 - 70 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2095 -73 /B 2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 2095 -75/B2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3982 -3 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3982 -4 /B 1 NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 398 2 - 13 /B l NGCFEFYHKC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 398 2 - 14/B2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 398 2 - 19/B3 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GAKLESIGTY QIXSIYSTVA 3 982 - 21/B2 NGCFEFYHRC DNECMESVKN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3 982 -43 /B l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSK EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3982 - 50 /B l NGCFEFYHRC DNECIESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 3982 -52 /B 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLEXIGTY QILSIYSTVA 3 982 -55 /A 1 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTX QILSIYSTVA 3 982 - 56 /A l NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTX QIXSIYSTVA 3 982 -78/B2 NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QIL*IYSTVA 4794 - 17/B NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA 4 794 - 18/B NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA

545 555 565

1 553 -1 /A 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

1 553 -15 /A 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

2 095 - 50 /A l SSLALAIMVA GLFLWMCSNG XLQCRICI

39 82 -2 /A 1 SSLALAIMVX GLFLWMCSNG SLQCRICI

3 982 - 5 /A l SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3 982 - 7 /A l SSLALAIMVA GLFLWMCSNG XLQCRICI

3 982 - 8 /A l SSLALAIMVX GLFLWMCSNG SLQCRICI

3 982 - 9 /A l SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3 982 - 12 /A l SSLALAIXVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3 982 - 20 /A l SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

39 82 -44 /A l SSLALAIXVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

15 53 -2 /B 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

15 53 -6 /B 1 SSLALAIIVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

1 553 -13 /B 2 SSLALAIMMA GLFLWMCSNG SLQCRICI

1 553 -26 /B 2 SSLALAIMMA GLFLWMCSNG SLQCRICI

15 53 -28 /B 1 - SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQCRICI

20 95 -39 /B 2 SSLALAIMMA GLFLWXCSNG SLQCRICI

20 95 - 46 /B l SSLALAIMVA GLSLWMCSXG SLQCRICI

209 5 -49 /B 1 SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQCRICI

20 95 - 65 /B l SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQCRICI

209 5 -68 /B 2 SSLALAIMMA GLFLWMCSNG XLQCRICI

209 5 -70 /B 2 GSLALAIMMA GLFLWMCSNG SLQCRICI

2 095 - 73 / B2 SSLALAIMVX GLFLWMCSNG SLQCRICI

20 95 - 75 /B 2 GSLALAIMVX GLFLWMCSNG SLQCRICI

39 82 - 3 / B I SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQCRICI

398 2 - 4 /B 1 SSLALAIMVA GLSLWMCSNG SLQCRXCI

39 82 - 13 /B 1 SSLALAIMVA XLFLWMCSNG SLQCRICI

39 82 - 14 /B 2 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

39 82 - 19 /B 3 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3982 - 21 /B 2 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3982 - 43 /B 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3982 - 50 /B 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3982 - 52 /B 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3982 - 55 /A 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3982 - 56 /A 1 SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

3982 - 78 /B 2 SSLALAXMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

4794 - 17 /B SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

4794 - 18 /B SSLALAIMMA GLFLWMCSNG XLQCRICI

Tabla D: Se representa la secuencia SEQ ID NO: 131, que corresponde a la secuencia de la variante expresada en SEQ ID NO: 40 que comienza con el aminoácido de N-terminal D17, donde la numeración de la posición de dicho primer aminoácido con N-terminal (D17) se refiere a la posición del aminoácido 17 como se da a modo de ejemplo en la SEQ ID NO 1:

10 20 30 40 50 60

(SEQ ID NO: 47) DQIC IGYHANNSTE QVDTIMEKNV TVTHAQDILE KTHNGKLCDL

70 80 90 100 110 120

DGVKPLILRD CSVAGWLLGN PMCDEFPNVS EWSYIVEKIN PANDLCYPGN FNNYEELKHL

130 140 150 160 170 180

LSRINRFEKI QIIPKSSWPD HEASLGVSSA CPYQGGPSFY RNWWLIKKN NTYPTIKESY

190 200 210 220 230 240

HNTNQEDLLV LWGIHHPNDE EEQTRIYKNP TTYISVGTST LNQRLVPKIA TRSKVNGQSG

250 260 270 280 290 300

RVEFFWTILK SNDTINFESN GNFIAPENAY KIVKKGDSTI MKSELEYGNC NTKCQTPIGA

310 320 330 340 350 360

INSSMPFHNI HPLTIGECPK YVKSNRLVLA TGLRNSPQGE GRRKKRGLFG AIAGFIEGGM

370 380 390 400 410 420

QGMVDGWYGY HHSNEQGSGY AADKESTQKA IDGVTNKVNS IIDKMNTQFE AVGREFNNLE

430 440 450 460 470 480

KRIENLNKKM EDGFLDVWTY NAELLVLMEN ERTLDFHDSN VKNLYDKVRL QLRDNAKELG

490 500 510 520 530 540

NGCFEFYHRC DNECMESVRN GTYDYPQYSE EARLKREEIS GVKLESIGTY QILSIYSTVA

550 560

SSLALAIMVA GLFLWMCSNG SLQCRICI

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una vacuna que comprende

a) proteína H5 del virus gripal, en el que la proteína H5 consiste en o comprende una cualquiera de las secuencias expresadas en ^s E^q ID NOs: 2 a 12, o 35 o 36 o 40;

b) un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

2. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína H5 consiste en o comprende la secuencia expresada en SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 40.

3. La vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la proteína H5 no comprende la secuencia señal de hemaglutinina del virus gripal A H5N1.

4. La vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la secuencia de dicha proteína H5 comienza con el aminoácido N-terminal D17, en donde dicha numeración D17 corresponde a la SEQ ID NO: 1.

5. La vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína H5 tiene el aminoácido 239N.

6. La vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el excipiente es uno o más adyuvantes, y en donde el adyuvante es un adyuvante basado en Emulsigen.

7. Un método para producir la vacuna que comprende una proteína H5 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho método comprende los etapas de:

a. aislar o amplificar el ácido nucleico que codifica dicha proteína H5;

b. clonar el ácido nucleico que codifica H5 en un vector de expresión; y

c. expresar la proteína H5,

y en donde el vector de expresión es en particular un baculovirus recombinante y/o en donde la proteína H5 se expresa en particular en células de insecto.

8. Un método para producir la vacuna que comprende una proteína H5 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho método comprende las etapas de:

a. obtener una proteína H5 como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y

b. mezclar la proteína H5 de la etapa a) con un vehículo y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.

9. La vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un método de tratamiento o prevención de infecciones con el virus Subclado A H5N1 de origen norteafricano.

10. Un kit, que comprende

a. la vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6; y

b. un prospecto que indica el uso de dicha proteína H5, vector o vacuna de a) para el tratamiento o la profilaxis de infecciones causadas por el virus gripal,

y en donde dicho kit comprende preferiblemente al menos un antígeno adicional de patógeno de aves de corral o mamífero.