ES2794628T3

ES2794628T3 - Composiciones y métodos para la reactivación de cromosomas XI

Info

Publication number: ES2794628T3
Application number: ES16780874T
Authority: ES
Inventors: Michael Green; Sanchita Bhatnagar
Original assignee: University of Massachusetts UMass
Current assignee: University of Massachusetts UMass
Priority date: 2015-04-15
Filing date: 2016-04-15
Publication date: 2020-11-18
Anticipated expiration: 2036-04-15
Also published as: US20180087110A1; EP3283127A1; US10718022B2; EP3708680A1; EP3708680B8; US20210317529A9; WO2016168658A1; US11268150B2; US20220259654A1; EP3708680B1; CA3019311A1; US20200377952A1; EP3283127A4; EP3283127B1

Abstract

Un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad dominante ligada a X, comprendiendo el método: administrar al sujeto un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) en una cantidad eficaz para inducir la expresión de un gen diana ligado a X, en donde el inhibidor de XCIF inhibe selectivamente la actividad de la cinasa 1/2 de suero y glucocorticoide (SGK1/2).

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para la reactivación de cromosomas XI

CAMPO DE LA DIVULGACIÓN

La invención se refiere a métodos de reactivación de cromosomas X inactivos de mamífero mediante medios genéticos y farmacológicos.

ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN

La inactivación de cromosomas X (XCI), el silenciamiento transcripcional aleatorio de un cromosoma X en células somáticas de mamíferos hembra, es un mecanismo que garantiza la expresión igual de genes ligados a X en ambos sexos. XCI se inicia por Xist, un ARN no codificante de 17 kb cuya expresión durante la embriogénesis temprana es tanto necesaria como suficiente para el silenciamiento. Xist reprime la transcripción en cis recubriendo solo el cromosoma X a partir del cual se produce. Una vez Xist se ha regulado por incremento durante el desarrollo o diferenciación temprano, continúa expresándose a partir de X inactivo (Xi) incluso en células somáticas completamente diferenciadas. Antes del inicio de XCI, Tsix, un represor antisentido de Xist, bloquea la regulación por incremento de Xist en el futuro cromosoma X activo (Xa).

Un entendimiento de los factores y mecanismos implicados en XCI es directamente relevante para ciertas enfermedades humanas (por ejemplo, enfermedades dominantes ligadas a X). Por ejemplo, las mutaciones de pérdida de función en el gen de la proteína 2 de unión a metil-CpG (MECP2) ligado a X conducen al trastorno neuroconductual síndrome de Rett (RTT). La mayoría de los pacientes con RTT son mujeres que son heterocigóticas para la deficiencia de MECP2 debido a XCI aleatorio. Siguen estando limitadas las opciones terapéuticas para el tratamiento de enfermedades dominantes ligadas a X, tales como el síndrome de Rett. Por consiguiente, existe una necesidad de nuevas composiciones y métodos de tratamiento para enfermedades dominantes ligadas a X.

Bhatnagar et al. 2014 realizaron un cribado a gran escala de interferencia por ARN para identificar factores XCI que actúan en trans (XCIFs). Mediante este cribado, se identificaron 13 XCIFs (Bhatnagar et al: PNAS 111(35), 18 de agosto de 2014, páginas 12591-12598).

SUMARIO DE LA DIVULGACIÓN

La presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para la reactivación de cromosomas X inactivos (Xi). En algunos aspectos, los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades dominantes ligadas a X, tales como el síndrome de Rett. La divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de que la inhibición de los factores inactivantes de cromosomas X (XCIFs) puede mediar en la reactivación de cromosomas X inactivos, re-expresión de genes ligados a Xi y/o reducción de la expresión o actividad de Xist.

Por consiguiente, en algunos aspectos, la divulgación proporciona un método de inducción de la expresión de un gen ligado a X en una célula que tiene un cromosoma X inactivo, comprendiendo el método suministrar a la célula un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) en una cantidad eficaz para inducir la expresión del gen ligado a X.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad dominante ligada a X, comprendiendo el método administrar al sujeto un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) en una cantidad eficaz para inducir la expresión de un gen ligado a X diana. En algunas realizaciones, la enfermedad dominante ligada a X resulta de un alelo mutado del gen ligado a X, y en donde el inhibidor se administra en una cantidad eficaz para inducir la expresión de un alelo no mutante del gen ligado a X. En algunas realizaciones, la célula es de un sujeto que tiene una enfermedad dominante ligada a X resultante de un alelo mutado del gen ligado a X. En algunas realizaciones, el gen ligado a X es MECP2. En algunas realizaciones, el gen ligado a X es MECP2 y la enfermedad ligada a X es síndrome de Rett.

En algunas realizaciones, la enfermedad dominante ligada a X se selecciona del grupo que consiste en: hipofosfatemia ligada a X, incontinencia pigmentaria de tipo 2, síndrome de Aicardi, síndrome del CDK5L, hipoplasia dérmica focal, síndrome de CHILD, síndrome de Lujan-Fryns, síndrome orofaciodigital 1, nefritis hereditaria (síndrome de Alport), síndrome de Giuffre-Tsukahara, síndrome de Goltz, síndrome X frágil, síndrome de Bazex-Dupre-Christol, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, condrodisplasia punctata, protoporfiria eritropoyética, miopatía escapuloperoneal y displasia craneofrontonasal.

En algunas realizaciones, el inhibidor de XCIF inhibe selectivamente la actividad de un factor de inactivación de cromosomas X seleccionado del grupo que consiste en: ACVR1, AURKA, DNMT1, FBXO8, LAYN, NF1, PDPK1, PYGO1, RNF165, SGK1/2, SOX5, s Tc 1, ZNF426 y C17orf98. En algunas realizaciones, el factor de inactivación de cromosomas X es PI3K y el inhibidor de XCIF es GNE-317 o LY29400. En algunas realizaciones, el factor de inactivación de cromosomas X es PDPK1 y el inhibidor de XCIF es OSU-03012 o BX912. En algunas realizaciones, el factor de inactivación de cromosomas X es AURKA y el inhibidor de XCIF es VX680, CD532 o MLN8237. En algunas realizaciones, el factor de inactivación de cromosomas X es SGK1/2 y el inhibidor de XCIF es GSK650394. En algunas realizaciones, el factor de inactivación de cromosomas X es ACVR1 y el inhibidor de XCIF es dorsomorfina, K02288 o LDN193189.

En algunas realizaciones, el inhibidor de XCIF inhibe selectivamente la actividad de la diana de mamífero de rapamicina (mTOR). En algunas realizaciones, el inhibidor de XCIF es rapamicina, KU-0063794 o everolimus.

En algunas realizaciones, el inhibidor de XCIF es un oligonucleótido inhibidor que tiene una región de complementariedad que es complementaria con al menos 8 nucleótidos de un ARNm codificado por un gen XCIF. En algunas realizaciones, el oligonucleótido inhibidor se selecciona del grupo que consiste en: oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNhp y miARN. En algunas realizaciones, el oligonucleótido inhibidor es un oligonucleótido inhibidor modificado. En algunas realizaciones, el oligonucleótido inhibidor modificado comprende un nucleótido puenteado (por ejemplo, un ácido nucleico bloqueado (LNA)), esqueleto de fosforotioato y/o una modificación de 2'-OMe.

En algunas realizaciones, el método comprende además determinar que la célula tiene un alelo mutante del gen ligado a X. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar que la administración del inhibidor de XCIF a la célula da como resultado la expresión inducida del gen ligado a X. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar que la administración del inhibidor a la célula da como resultado la expresión inducida de un alelo no mutante del gen ligado a X. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar que la administración del inhibidor de XCIF a la célula da como resultado la reactivación de un cromosoma X. En algunas realizaciones, el método comprende además determinar que la administración del inhibidor de XCIF a la célula da como resultado la disminución de la expresión o actividad de XIST. En algunas realizaciones, la célula es in vitro. En algunas realizaciones, la célula está en un sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Las FIGS. 1A-1C muestran la identificación de factores implicados en XCI de mamífero. La FIG. 1A muestra un resumen esquemático del cribado de ARNhp. Xi se designa como tal debido a la deleción de Xist en Xa. La FIG. 1B muestra células H4SV que expresan un ARNhp contra uno de los 13 candidatos o, como control, un ARNhp no de silenciamiento (NS) fue clasificado por FACS y aislado de células GFP-positivas. Para cada línea celular KD, el porcentaje de células GFP-positivas se expresó como el aumento en veces con respecto al obtenido con ARNhp NS, que se estableció en 1. La FIG. 1C muestra FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de G6pdx y Lamp2 (izquierda) y Pgk1 y Mecp2 (derecha) en cada una de las 13 líneas celulares XCIF KD BMSL2. La tinción con DAPI se muestra en azul. El experimento se realizó al menos dos veces, y se muestran imágenes representativas (arriba) y los resultados cuantificados (abajo) de un experimento.

Las FIGS. 2A-2D muestran que XCIFs participan en el inicio de XCI en células madre embrionarias de ratón. La FIG. 2A muestra FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de G6pdx y Lamp2 (izquierda) y Pgk1 y Mecp2 (derecha) en las 13 líneas celulares XCIF KD ES tras la diferenciación. También se muestra la tinción con DAPI. Se muestran imágenes representativas (arriba) y los resultados cuantificados (abajo). La FIG. 2B muestra el porcentaje de células individuales fosfatasa alcalina-negativas en las 13 líneas celulares XCIF KD ES antes (arriba, no diferenciadas) y después (abajo, diferenciadas) del tratamiento con RA. La FIG. 2C muestra el análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de Oct4 en las 13 líneas celulares XCIF KD ES tras el tratamiento con RA. Como control, se muestra la expresión de Oct4 en células ES no diferenciadas y se establece a 1. Las barras de error indican la DE. La FIG. 2D muestra el análisis por qRT-PCR de XCIFs en células ES de ratón no diferenciadas y diferenciadas. La expresión en células ES diferenciadas se normalizó a la observada en células no diferenciadas, que se establece a 1. Las barras de error indican la DE.

Las FIGS. 3A-3I muestran la función de XCIFs que promueve la expresión y/o localización de Xist, y DNMT1 es un activador transcripcional de Xist en Xi. La FIG. 3A muestra el análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de Xist en las 13 líneas celulares XCIF KD ES tras la diferenciación. La expresión en células ES diferenciadas se normalizó a la obtenida con el ARNhp NS, que se establece a 1. Las barras de error indicar el EE. La FIG. 3B muestra FISH de ARN que monitoriza la localización de Xist en las 13 líneas celulares XCIF KD ES tras la diferenciación. Se clasificaron las células por tener una nube de Xist típica u "otro" patrón, que incluye o la ausencia de una señal detectable de Xist o la presencia de dos señales pequeñas de Xist, como en células ES no diferenciadas. La FIG. 3C muestra FISH de ARN que monitoriza la expresión de Xist (arriba) y Mecp2 (abajo) en células BMSL2 tratadas con un oligonucleótido antisentido bloqueado por ácido nucleico de Xist (LNA ASO) o un LNA ASO de control. La FIG. 3D muestra el análisis de ChIP que monitoriza la unión de DNMT1 y POL2 al promotor de Xist y el exón 2 en células BMSL2 que expresan un ARNhp NS o Dnmt1. Las barras de error indican la DE. La FIG. 3E muestra el ensayo de transcripción nuclear iniciada que monitoriza la transcripción de Xist, Hprt y Tbp en células BMSL2 que expresan un ARNhp NS o DNMT1. La FIG. 3F muestra el análisis por qRT-PCR que monitoriza los niveles de Xist en células BMSL2 que expresan un ARNhp NS o Dnmt1 tras el tratamiento con actinomicina D. Se usó ARNm de actina como control de normalización. Las barras de error indican la DE. La FIG. 3G muestra el análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de Xist en MEFs aislados de embriones hembra Dnmt1 /+ y Dnmt1-/-. Se analizaron cuatro camadas diferentes (total de n=4 ratones por genotipo) y se promediaron los resultados. La expresión se normalizó a la observada en MEFs Dnmtl /+, que se establece a 1. Las barras de error indican la DE.*P<0,001 (prueba de la t de Student). La FIG. 3H muestra qRT-PCR que monitoriza la niveles de Xist y Tsix en células H4SV que expresan un ARNhp NS o DNMT1. La expresión se normalizó a la obtenida con el ARNhp NS, que se establece a 1. Las barras de error indican la DE. La FIG 3I muestra el análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de Hprt y Xist en células BMSL2 tratadas en ausencia o presencia de 5-AZA. La expresión se normalizó a la observada en ausencia de 5-AZA, que se establece a 1. Las barras de error indican la DE.

Las FIGS. 4A-4I muestran la reactivación del gen Mecp2 ligado a Xi por inhibidores de XCIF de molécula pequeña. Las FIGs. 4A-4B muestran FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de Xist y Mecp2 en células ES diferenciadas de ratón tratadas con DMSO (control o -), OSU-03012 o LY294002 (FⁱG. 4A), y en células BMSL2 tratadas con DMSO o GNE-317 (FIG. 4B). Se muestran imágenes representativas (arriba) usando las concentraciones más altas de los inhibidores, y los resultados cuantificados (abajo). Las puntas de flecha amarillas indican la localización conjunta de señales Xist y Mecp2; puntas de flecha blancas indican señales de Mecp2 que no se localizan conjuntamente con Xist. La FIG. 4C muestra FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de Xist y Mecp2 en neuronas corticales de ratón tratadas con DMSO (control o -), OSU-03012, BX912 o LY294002. Se muestran imágenes representativas (arriba) y los resultados cuantificados (abajo). Las puntas de flecha indican señales de Mecp2. La FIG. 4D muestra FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de Xist y Mecp2 en fibroblastos BMSL2 de ratón tratados con DMSO (control o -) o GSK650394. Se muestran imágenes representativas (arriba) y los resultados cuantificados (abajo). Las puntas de flecha indican señales de Mecp2. La FIG. 4E muestra qRT-PCR que monitoriza la expresión de Xist (izquierda) y Mecp2 (derecha) en células BMSL2 tratadas con DMSO o concentraciones crecientes de GSK650394 (2,5, 5 o 10 pM). La FIG. 4F muestra FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de Xist y Mecp2 en células BMSL2 tratadas con DMSO o K02288. Se muestran imágenes representativas (arriba) y los resultados cuantificados (abajo). Las puntas de flecha indican señales de Mecp2. La FIG. 4G muestra qRT-PCR que monitoriza la expresión de Xist (izquierda) y Mecp2 (derecha) en células BMSL2 tratadas con DMSO, K02288 (0,5 pM) o LDN193189 (0,5 pM). La FIG. 4H muestra FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de Xist y Mecp2 en células BMSL2 tratadas con DMSO (control o -), LY294002 u OSU-03012, y al menos 6 días tras la retirada del inhibidor. Se muestran imágenes representativas (arriba) y los resultados cuantificados (abajo). Las puntas de flecha indican señales de Mecp2. La FIG. 4I muestra qRT-PCR que monitoriza la expresión de MECP2 no mutante ligado a Xi en fibroblastos de RTT humana tratados con DMSO (-), 5-azacitidina (5-AZA), BX912, OSU-03012 o VX680. Como control, se monitorizó la expresión de MECP2 no mutante ligado a Xa en otra línea celular clonal de fibroblastos derivada del mismo paciente con RTT (carril 1). La punta de flecha indica el producto de qRT-PCR de MECP2 no mutante. Se monitorizó GAPDHcomo control de carga. Abajo, esquema de alelos no mutantes (wt) y mutantes (mut) de MECP2.

Las FIGS. 5A-5B muestran XCI defectuoso en MEFs Stc1-/- femeninos. La FIG. 5A muestra FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de G6pdx y Lamp2 (arriba) y Pgk1 y Mecp2 (abajo) en MEFs Stc1+/+ y Stc1-/- femeninos, y como control MEFs Stc1-/- masculinos. Se muestran imágenes representativas (arriba) y los resultados cuantificados (abajo). La FIG. 5B muestra el análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de Xist en MEFs aislados de embriones Stc1+/+ y Stc1-/- femeninos. Se analizaron cuatro camadas diferentes (total de n=4 ratones por genotipo) y se promediaron los resultados. La expresión se normalizó a la del gen ribosómico RPL4, y se establece a 1 la expresión de Xist en MEFs Stc1+/+. Las barras de error indican la DE. *P<0,001 (prueba de la t de Student).

Las FIGS. 6A-6G muestran que XCI defectuoso en ratones Stc1-/- hembra no está acompañado por la elevada expresión génica ligada a X. La FIG. 6A muestra un esquema del canal de análisis de RNA-Seq. La FIG. 6B muestra la distribución de la relación transformada por log2 de la expresión génica ligada a X en MEFs de embriones Stc1-/-(KO) y Stc1+/+ femeninos (WT) (n=3 por genotipo). La FIG. 6C muestra un diagrama de caja de la expresión génica ligada a X (FPKM transformados por log2) en MEFs de embriones Stc1-/- y Stc1+/+ femeninos (n=3 por genotipo). Las áreas recuadradas abarcan del primer al tercer cuartil. Los bigotes representan los centiles 15 y 85. La FIG. 6D muestra el análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de Mecp2 y Hprt en MEFs de 2 camadas diferentes de embriones Stc1-/- y Stc1+/+ femeninos (total de n=2 ratones por genotipo). Los resultados se normalizaron a los obtenidos en MEFs Stc1+/+, que se establece a 1. Las barras de error indicar el EE. La FIG. 6E muestra una inmunotransferencia que muestra los niveles de MECP2 y STC1 en MEFs Stc1+/+ y Stc1-/- femeninos (izquierda) o tejido cerebral de ratones P1 hembra Stc1+/+ y Stc1-/-(derecha) (n=3 por genotipo). Se monitorizó a-tubulina (TUBA) como control de carga. La FIG.

6F muestra el análisis por qRT-PCR de la expresión de Stc1, Xist, Mecp2 y Hprt en células BMSL2 que expresan un ARNhp NS o STC1. Los resultados se normalizaron a los obtenidos con el ARNhp NS, que se establece a 1. Las barras de error indicar el EE. La FIG. 6G muestra una inmunotransferencia que muestra niveles de MECP2 y STC1 en células BMSL2 que expresan un ARNhp NS o Stc1.

Las FIGS. 7A-7D muestran que ARNhps que se dirigen a XCIF reactivan el gen Hprt ligado a Xi y disminuyen los niveles de ARNm del gen diana. La FIG. 7A muestra imágenes de campo brillante que muestran el crecimiento de las 13 líneas celulares XCIF KD H4SV tras la selección en medio HAT. La FiG. 7B muestra el análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de genes dianas en las 13 líneas celulares XCIF KD H4SV que expresan el ARNhp identificado en el cribado primario. Para cada gen, se determinó la eficiencia de atenuación con respecto al nivel de expresión de genes diana en la línea celular de control que expresa un ARNhp no de silenciamiento (NS), que se establece a 1. Las barras de error indican la DE. La FIG. 7C muestra imágenes de campo brillante que muestran el crecimiento de las 13 líneas celulares XCIF KD H4SV, que expresa un segundo ARNhp no relacionado con el mostrado en la FIG. 7A, tras la selección en medio HAT. La FIG. 7D muestra el análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de genes diana en las 13 líneas celulares XCIF KD H4SV que expresan un segundo ARNhp no relacionado con el mostrado en la FIG. 7B. Las barras de error indican la DE.

Las FIGS. 8A-8D muestran imágenes de FISH de ARN adicionales y experimentos de control relacionados con las FIGS. 1A-1C. La FIG. 8A muestra imágenes representativas de FISH de ARN bicolor que muestran la expresión de G6pdx y Lamp2 (arriba) y Pgk1 y Mecp2 (abajo) en cada una de las 13 líneas celulares XCIF KD BMSL2. También se muestra la tinción con DAPI. La FIG. 8B muestra que en células BMSL2 Xi y Xa codifican dos alelos Pgk1 distinguibles, Pgkla y Pgklb, respectivamente, que se diferencian por un polimorfismo de un solo nucleótido dentro del ARNm. Se analizó la expresión específica de alelo de los genes Pgk1 ligados a Xi y Xa en cada una de las 13 líneas celulares XCIF KD BMSL2 usando un ensayo de extensión de cebadores en un único nucleótido (SNuPE). Se calculó la relación de la expresión Pgk1a:Pgk1b y se normalizó a la obtenida con el ARNhp NS, que se establece a 1. Los resultados muestran que en cada una de las 13 líneas celulares XCIF KD BMSL2 aumentó la relación entre Pgk1a y Pgk1b, que indica que la atenuación de cada uno de los 13 XCIFs reactivaron el gen Pgk-1a ligado a Xi. La FIG. 8C muestra que en células BMSL2 Xi y Xa codifican dos alelos Pgk1 distinguibles, Pgk1a y Pgk1b, respectivamente, que se diferencian por un polimorfismo de un solo nucleótido dentro del ARNm. Se analizó la expresión específica de alelo de los genes Pgk1 ligados a Xi y Xa en seis líneas celulares XCIF KD BMSL2 representativas usando un ensayo de extensión de cebadores en un único nucleótido (SNuPE). Los datos se representan como la función de ARn para cada muestra, que representa la fluorescencia indicadora para cada alelo (VIC/FAM) normalizada al colorante pasivo. Los resultados muestran que en cada una de las seis líneas celulares XCIF KD BMSL2 se reactivó el gen Pgk1a ligado a Xi. La FIG. 7D muestra los experimentos de pintado de cromosomas X en las 13 líneas celulares XCIF KD BMSL2. Los resultados muestran que el contenido de cromosomas X de las líneas celulares XCIF KD BMSL2 fue similar al de la línea celular de control BMSL2 que expresa un ARNhp NS. Así, no se puede explicar la expresión bialélica sustancialmente elevada de genes ligados a X observada por ARN FISH en las líneas celulares XCIF KD por diferencias en el número de cromosomas X.

Las FIGS. 9A-9C muestran imágenes de FISH de ARN adicionales y experimentos de control relacionados con las FIGS. 2A-2D. La FIG. 9A muestra imágenes de FISH de ARN bicolor representativas que monitorizan la expresión de G6pdx y Lamp2 (arriba) y Pgk1 y Mecp2 (abajo) en las 13 líneas celulares XCIF KD ES tras la diferenciación. También se muestra la tinción con DAPI. La FIG. 9B muestra los experimentos de pintado de cromosomas X en las 13 líneas celulares XCIF KD ES tras la diferenciación. La FIG. 9C muestra análisis por qRT-PCR que monitorizan la expresión de Eomes, Tcf7l2y Cdx2en las 13 líneas celulares XCIF KD ES tras el tratamiento con RA. Como control, se muestra la expresión de cada gen en células ES no diferenciadas y se establece a 1. Las barras de error indican la DE.

Las FIGS. 10A-10C muestran imágenes de FISH de ARN y experimentos de control relacionados con las FIGS.

3A-3I. La FIG. 10A muestra imágenes de FISH de ARN. En cada una de las 13 líneas celulares XCIF KD ES tras la diferenciación, la mayoría de las células que perdieron el patrón de localización típico de Xist carecieron de una señal de Xist detectable (véase FIG. 3B). Sin embargo, algunas células que habían perdido el patrón de localización típico de Xist contuvieron dos señales de Xist pequeñas, reminiscentes de células ES no diferenciadas. Los ejemplos de este último patrón de localización se muestran aquí. Las señales nucleares se indican en rojo y se indican por puntas de flecha; también se muestra la tinción con DAPI. La FIG. 10B muestra análisis por qRT-PCR que monitorizan la expresión de Xist (izquierda), Tsix (centro) y Dnmt1 (derecha) en células H4SV que expresan un NS o uno de dos ARNhp Dnmt1 (Dnmt1 -1 o Dnmt1 -2). Para la expresión de Xist y Tsix, un segundo ARNhp Dnmtl no relacionado con el usado en la FIG. 3H. La expresión se normalizó a la obtenida con el ARNhp NS de control, que se establece a 1. Las barras de error indican la DE. La FIG. 10C muestra análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de Xist (izquierda), Tsix (centro) y Dnmt1 (derecha) en células ES diferenciadas que expresan un ARNhp NS o uno de dos ARNhp Dnmt1 (Dnmt1-1 o Dnmt1-2). La expresión se normalizó a la obtenida con el ARNhp NS de control, que se establece a 1. Las barras de error indican la DE.

Las FIGS. 11A-11C muestran imágenes de FISH de ARN adicionales relacionados con FIGS. 4A-4E. La FIG.

11A y FIG. 11B muestran FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de Xist y Mecp2 en células ES diferenciadas tratadas con DMSO (control), OSU-03012 (4 pM) o LY294002 (10 pM) (FIG. 11A), y en células BMSL2 tratadas con DMSO o GNE-317 (5 pM) (FIG. 11B). Los recuadros amarillos indican células con señales de Xist y Mecp2 que se localizan conjuntamente; los recuadros blancos indican células con expresión bialélica de Mecp2 y pérdida completa de la señal de Xist. La FIG. 11C muestra FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de Xist y Mecp2 en células BMSL2 tratadas con DMSO (control), OSU-03012 (2,5 pM) o LY294002 (8 pM), y al menos 6 días tras la retirada del inhibidor. Los recuadros blancos indican células con expresión bialélica de Mecp2.

Las FIGS. 12A-12B muestran un experimento de control e imágenes de FISH de ARN relacionadas con la FIG.

5. La FIG. 12A muestra los experimentos de pintado de cromosomas X en MEFs Stc1+/+ y Stc1-/- femeninos. Los resultados muestran que el contenido de cromosoma X de MEFs Stc1-/- fue similar al de MEFs Stc1+/+. Así, la expresión bialélica sustancialmente elevada de genes ligados a X observada por FISH de ARN en los MEFs Stc1-/- no se puede explicar por diferencias en el número de cromosomas X. La FIG. 12B muestra XCI defectuoso en neuronas corticales de secciones cerebrales de ratones Stc1-/- hembra. FISH de ARN bicolor que monitoriza la expresión de Xist y Mecp2 o G6pdx en neuronas corticales de secciones cerebrales adyacentes de 5 gm de ratones Stc1-/- y Stc1+/+ hembra (n=3 por genotipo, etapa P1). Las regiones recuadradas indican células con dos señales de Mecp2 o G6pdx; los recuadros amarillos indican células con señales de Xist y Mecp2/G6pdx de localización conjunta. Todas las células en las regiones mostradas representan neuronas que, basándose en puntos de referencia anatómicos, están presentes en secciones poshibridadas.

Las FIGS. 13A-13E muestran experimentos adicionales y análisis de datos relacionados con las FIGS. 6A-6G. La FIG. 13A muestra un gráfico de volcán que muestra la distribución de la relación transformada por log2 de la expresión génica ligada a X en MEFs aislados de embriones Stc1-/-(KO) y Stc1+/+ (WT) (n=3 por genotipo). Los genes se representan frente al valor del log de P transformado negativo. Los círculos rojos representan genes con un cambio de >2 veces en la expresión y P <0,01. Los resultados muestran que la similitud de la expresión génica ligada a X entre MEFs Stc1+/+ y Stc1-/- femeninos fue estadísticamente significativa. La FIG.

13B muestra diagramas de caja que presentan cambios en la expresión génica autosómica (FPKM transformados por log2) en MEFs Stc1-/- y Stc1+/+. Las áreas recuadradas abarcan del primer al tercer cuartil. Los bigotes representan los centiles 15 y 85; las muestras que quedan fuera de estos centiles se muestran como círculos. La FIG. 13C muestra XCIFs que no son, en general, requeridos para la represión de genes sellados. Se transdujeron fibroblastos embrionarias primarios de ratones hembra de la cepa C57BL/6 (CAST7), que contienen el cromosoma 7 de Mus castaneus (Cast) con ARNhps contra cada uno de los XCIFs y se analizaron para la expresión específica de alelo de cuatro genes localizados en el cromosoma 7 que son o paternalmente expresados (Kcnq1ot1 y Peg3) o maternalmente expresados (Ascl2 y Zim1). La expresión de los dos alelos se puede distinguir por digestión por enzima de restricción específica de alelo tras la RT-PCR específica de gen. Se indican los tamaños de las bandas sin digerir y digeridas, y se muestran los tamaños de los fragmentos digeridos predichos en la tabla (abajo). Si la atenuación de un XCIF da como resultado la reactivación del alelo normalmente silenciado, se observaría una mezcla de los patrones de digestión específicos de alelo materno y paterno. Los resultados muestran que en las 13 líneas celulares XCIF KD, los cuatro genes presentaron solo el patrón de expresión específico de alelo esperado, que indica que los XCIFs no son, en general, requeridos para la represión de los genes sellados. La FIG. 13D muestra la participación de las subunidades de Polycomb EZH2 y BMI1 para la represión del gen Hprt ligado a X. (Izquierda) Análisis por qRT-PCR que monitoriza la expresión de Hprt en células BMSL2 que expresan un ARNhp de Ezh2 o Bmi1 o, como control, un ARNhps NS. (Derecha) Análisis por qRT-PCR que confirma la atenuación de genes diana en células ES de ratón que expresan un ARNhp de Ezh2 (izquierda) o Bmi1 (derecha). Las barras de error indican la DE. La FIG. 13E muestra el análisis de conjuntos de datos disponibles de Yildirim et al. 2013 que muestran la distribución de la relación transformada por log2 de la expresión génica ligada a X en células hematopoyéticas de ratones mutantes Xist heterocigóticos (HET) hembra y ratones no mutantes (WT). Los datos se descargaron de Gene Expression Omnibus (GSE43961), se normalizaron por RMA y se filtraron por detección por encima del fondo (DABG) (valor de P de corte <0,0001) usando Package xps de Bioconductor. Se muestra que el porcentaje de genes ligados a X se reguló por incremento >1,5 veces.

La FIG. 14 muestra un diagrama esquemático de dianas aguas abajo de la proteína cinasa-1 dependiente de 3-fosfoinositida (PDPK1).

La FIG. 15 muestra que el tratamiento de fibroblastos de ratón con un inhibidor de mTOR reactiva el gen Mecp2 ligado a Xi. Se midió la expresión relativa de Xist y Mecp2 en fibroblastos de ratón después del tratamiento con rapamicina, KU-0063794 o everolimus (izquierda). Se midió ARN de Mecp2 por hibridación fluorescente in situ (FISH) y se cuantificó el porcentaje de núcleos teñidos (derecha).

La FIG. 16 muestra que el tratamiento de fibroblastos de ratón con un inhibidor de mTOR (rapamicina, KU-0063794, everolimus) reactiva el gen Hprt ligado a Xi, como se mide por un ensayo de selección con hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT).

La FIG. 17 muestra que la inhibición de Aurora cinasa A (AURKA) reactiva genes ligados a Xi. Se midió la expresión relativa de Xist y Mecp2 en fibroblastos de ratón después del tratamiento con CD532 y MLN8237. Se midió ARN de Mecp2 por hibridación fluorescente in situ (FISH) y se cuantificó el porcentaje de núcleos teñidos (derecha). Los resultados se confirmaron usando un ensayo de selección con HAT.

La FIG. 18 muestra que el tratamiento de fibroblastos de ratón con el receptor de activina de tipo 1 (ACVR1) reactiva los genes ligados a Xi. Se midió la expresión relativa de Xist y Mecp2 en fibroblastos de ratón después del tratamiento con K02288, dorsomorfina o LDN193189. Se midió a Rn de Mecp2 por hibridación fluorescente in situ (FISH) y se cuantificó el porcentaje de núcleos teñidos (derecha). Los resultados se confirmaron usando un ensayo de selección con HAT.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Los aspectos de la divulgación se refieren a la inhibición biológica y farmacológica o inversión de la inactivación de cromosomas X. La divulgación se basa, en parte, en el descubrimiento de que la inhibición de los factores de inactivación de cromosomas X (XCIFs) puede mediar en la reactivación de cromosomas X inactivos, re-expresión de genes ligados a X y/o reducción de la expresión o actividad de Xist.

En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un método de inducción de la expresión de un gen ligado a X en una célula que tiene un cromosoma X inactivo, comprendiendo el método suministrar a la célula un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) en una cantidad eficaz para inducir la expresión del gen ligado a X. Como se usa en el presente documento, el término "factor de inactivación de cromosomas X" se refiere a un gen o producto génico (por ejemplo, una proteína) que se requiere para o implicado en el mantenimiento o establecimiento de la inactivación de cromosomas X. En algunas realizaciones, la inhibición de la expresión y/o actividad de XCIF conduce a la reactivación de un cromosoma X inactivado o uno o más genes que residen en él (genes ligados a Xi). Se han identificado trece factores de inactivación de cromosomas X (XCIFs) en el presente documento (Tabla 1), y se indica que están implicados en diversos procesos que incluyen la señalización de células (ACVR1, AURKA, NF1, LAYN y PDPK1), metabolismo celular (STC1), regulación dependiente de ubiquitina (FBXO8 y RNF165) y transcripción (PYGO1, SOX5 y ZNF426), por ejemplo, como se desvela en Bhatnagar et al., 2014, Proc Natl Acad Sci USA 111:12591-12598.

Inhibidores de XCIF

La divulgación se refiere en parte a un descubrimiento de inhibidores de XCIFs que pueden reactivar la expresión de los genes ligados a Xi. Los inhibidores de XCIFs pueden ser péptidos, proteínas, anticuerpos, moléculas pequeñas o ácidos nucleicos. En algunas realizaciones, un inhibidor de XCIF inhibe selectivamente la actividad de un factor de inactivación de cromosomas X seleccionado del grupo que consiste en: ACVR1, AURKA, DNMT1, FBXO8, LAYN, NF1, PIK3, PDPK1, PYGO1, RNF165, SOX5, STC1, ZNF426 y C17orf98.

Los aspectos de la divulgación se refieren a la inhibición del receptor de activina de tipo 1 (ACVR1), un XCIF que codifica un receptor serina-treonina cinasa (también conocido como ALK2) que media en la señalización por proteínas morfogénicas óseas (BMPs). Las mutaciones de pérdida de función en ACVR1 dan como resultado la enfermedad dominante autosómica fibrodisplasia osificante progresiva (FOP) y se han encontrado en el tumor maligno infantil glioma pontino intrínseco difuso (DIPG). Están disponibles varios inhibidores de ACVR1 de molécula pequeña, que incluyen K02288 y LDN193189. K02288 es un inhibidor potente y selectivo de la señalización de receptores de BMP de tipo 1; que inhibe fuertemente ACVR1/ALK2, ALK1 y ALK6, y que inhibe débilmente los otros ALKs y ActRIIA. LDN 193189 es un inhibidor selectivo de la señalización de BMP que inhibe la actividad transcripcional de los receptores de tipo I de BMP ACVR1/ALK2 y ALK3; también presenta una selectividad de 200 veces por BMP frente a TGF-p. Ejemplos adicionales de inhibidores de ACVR1 incluyen LDN19318, DMH-1, ML-347, BML-275, dorsomorfina y LDN-212854.

Los aspectos de la divulgación se refieren a la inhibición de Aurora cinasa A (AURKA). En algunas realizaciones, los inhibidores de AURKA son moléculas pequeñas. Los ejemplos de inhibidores de AURKA incluyen, pero no se limitan a, VX-680, MLN8237, TAS-119, MLN8054, PF-03814735, SNS-314, BI 811283, AMG 900, AZD1152, AS703569, R763, PHA-739358, CD532 y MK-0457. En algunas realizaciones, el factor de inactivación de cromosomas X es AURKA y el inhibidor de XCIF es VX680. En algunas realizaciones, el factor de inactivación de cromosomas X es AURKA y el inhibidor de XCIF es CD532 o MLN8237.

Los aspectos de la divulgación se refieren a la inhibición de ADN (citosina-5)-metiltransferasa 1 (DNMT1). En algunas realizaciones, los inhibidores de DNMT1 son moléculas pequeñas. Los ejemplos de inhibidores de DNMT1 incluyen, pero no se limitan a, azacitadina, fazarabina, decitabina, sinefungina, psammaplina A, disulfiram, zebularina y SGI-1027.

Los aspectos de la divulgación se refieren a la inhibición de la señalización de PI3K/Akt para reactivar genes ligados a Xi. En algunas realizaciones, los inhibidores de PI3K son moléculas pequeñas. Los ejemplos de inhibidores de PI3K incluyen, pero no se limitan a, GNE317, LY294002, Wortmannin, demetoxiviridina, BEZ235, BGT226, BKM120, BIL719, XL765, XL147, GDC-0941, SF1126, GSK1059615, PX-866, CAL-101, BAY80-6946, GDC-0032, IPI-145, VS-5584, ZSTK474, SAR245409 y RP6530. En algunas realizaciones, el XCIF es PI3K y el inhibidor de XCIF es GNE-317 o LY29400.

Los aspectos de la divulgación se refieren a la inhibición de la proteína cinasa 1 dependiente de 3-fosfoinositida (PDPK1). En algunas realizaciones, los inhibidores de PDPK1 son moléculas pequeñas. Los ejemplos de inhibidores de PDPK1 incluyen, pero no se limitan a, OSU-03012, BAG-956, BX-795, GSK-2334470, BX-912 y PHT-427. En algunas realizaciones, el XCIF es PDPK1 y el inhibidor de XCIF es OSU-03012 o BX912.

La familia de cinasas del suero y glucocorticoide (SGK) de serina/treonina cinasas incluye tres isoformas distintas, pero altamente homólogas (SGK1, SGK2, y SGK3), que comparten una estructura de dominio similar. Las tres se activan por PDPK1 y participan en una amplia variedad de procesos celulares y se han desarrollado inhibidores de molécula pequeña con selectividad por SGKs con respecto a AKTs. Los ejemplos de inhibidores de SGK1/2 incluyen GSK-650394 y EMD638683.

En algunas realizaciones, un inhibidor de XCIF se dirige a un sustrato aguas abajo de PDPK1. Los ejemplos de los sustratos aguas abajo a PDPK1 incluyen, pero no se limitan a, AKT (también conocido como la proteína cinasa B), proteína ribosómica S6 cinasa beta-1 (S6K1), proteína cinasa C (PKC), cinasa ribosómica s6 (por ejemplo, p70rsk, S6 cinasa), proteína cinasa 1 asociada a rho que contiene superenrollamiento (ROCK1) y diana de mamífero de rapamicina (mTOR). En algunas realizaciones, un inhibidor de XCIF se dirige a mTOR. En algunas realizaciones, un inhibidor de mTOR es una molécula pequeña. Los ejemplos de inhibidores de mTOR incluyen, pero no se limitan a, rapamicina, everolimus, sirolimus, temsirolimus, deforolimus y KU-0063794.

En algunas realizaciones, el término "molécula pequeña" se refiere a un compuesto químico sintético o que existe de forma natural, por ejemplo, un péptido u oligonucleótido que se puede derivatizar opcionalmente, producto natural o cualquier otro compuesto orgánico, bioinorgánico o inorgánico de bajo peso molecular (frecuentemente inferior a aproximadamente 5 kDáltones), de origen o natural o sintético. Dichas moléculas pequeñas pueden ser una sustancia terapéuticamente suministrable o pueden ser adicionalmente derivatizadas para facilitar la administración.

Como se usa en el presente documento, el término "inhibidor" o "represor" se refiere a cualquier agente que inhibe, suprime, reprime o disminuye una actividad específica, tal como la actividad de un factor de inactivación de cromosomas X.

En algunas realizaciones, un inhibidor de XCIF cuando se suministra a una célula reactiva un cromosoma X inactivo o uno o más genes que residen en él. En algunas realizaciones, la administración de un inhibidor de XCIF a una célula da como resultado un aumento en el nivel de expresión de un gen ligado a Xi (un gen que reside en el cromosoma X inactivo) de al menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 % o 500 % en comparación con el nivel de expresión del gen en una célula de control que no se ha suministrado con un inhibidor de XCIF. En algunas realizaciones, la administración de un inhibidor de XCIF a una célula da como resultado un aumento en el nivel de expresión de un gen ligado a Xi (un gen que reside en el cromosoma X inactivo) en un intervalo de 10 % a 50 %, 10 % a 100 %, 10 % a 200 %, 50 % a 500 % o más en comparación con el nivel de expresión del gen en una célula de control que no se ha suministrado con un inhibidor de XCIF.

Oligonucleótidos inhibidores

En algunas realizaciones, el inhibidor de XCIF es un oligonucleótido inhibidor. Los oligonucleótidos inhibidores pueden interferir con la expresión génica, transcripción y/o traducción. En general, los oligonucleótidos inhibidores se unen a un polinucleótido diana mediante una región de complementariedad. Por ejemplo, la unión del oligonucleótido inhibidor a un polinucleótido diana puede desencadenar la degradación mediada por la vía de iARN del polinucleótido diana (en el caso de ARNbc, ARNip, ARNhp, etc.), o puede bloquear la maquinaria traduccional (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido). En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inhibidores tienen una región de complementariedad que es complementaria con al menos 8 nucleótidos de un ARNm codificado por un gen XCIF. Los oligonucleótidos inhibidores pueden ser monocatenarios o bicatenarios. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inhibidores son ADN o ARN. En algunas realizaciones, el oligonucleótido inhibidor se selecciona del grupo que consiste en: oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNhp y miARN. En algunas realizaciones, los oligonucleótidos inhibidores son ácidos nucleicos modificados.

El término "análogo de nucleótido" o "nucleótido alterado" o "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido no estándar, que incluye ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos que no existen de forma natural. En algunas realizaciones, los análogos de nucleótido se modifican en cualquier posición para alterar ciertas propiedades químicas del nucleótido, además de retener la capacidad del análogo de nucleótido para realizar su función prevista. Los ejemplos de posiciones del nucleótido que se pueden derivatizar incluyen la posición 5, por ejemplo, 5-(2-amino)propiluridina, 5-bromouridina, 5-propineuridina, 5-propeniluridina, etc.; la posición 6, por ejemplo, 6-(2-amino)propiluridina; la posición 8 para adenosina y/o guanosinas, por ejemplo, 8-bromoguanosina, 8-cloroguanosina, 8-fluoroguanosina, etc. Los análogos de nucleótido también incluyen deazanucleótidos, por ejemplo, 7-deazaadenosina; nucleótidos modificados en O y N (por ejemplo, alquilados, por ejemplo, N6-metiladenosina, o como se conoce en la técnica de otro modo); y otros análogos de nucleótido heterocíclicamente modificados tales como los descritos en Herdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310.

Los análogos de nucleótido también pueden comprender modificaciones a la porción de azúcar de los nucleótidos. Por ejemplo, se puede sustituir el grupo 2' OH por un grupo seleccionado de H, OR, R, F, Cl, Br, I, SH, SR, NH2, NHR, NR2, COOR u OR, en donde R es alquilo C1 -C6, alquenilo, alquinilo, arilo, sustituido o sin sustituir, etc. Otras posibles modificaciones incluyen las descritas en las patentes de EE. UU. N° 5.858.988 y 6.291.438. Un ácido nucleico bloqueado (LNA), frecuentemente denominado ARN inaccesible, es un nucleótido de ARN modificado. El resto de ribosa de un nucleótido de LNA se modifica con un puente adicional que conecta el oxígeno de 2' y el carbono de 4'.

El grupo fosfato del nucleótido también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo uno o más de los oxígenos del grupo fosfato con azufre (por ejemplo, fosforotioatos), o haciendo otras sustituciones que permitan al nucleótido realizar su función prevista, tal como se describe en, por ejemplo, Eckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5): 317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr.

11 (2):77-85 y la patente de EE. UU. N° 5.684.143. Ciertas de las modificaciones anteriormente referenciadas (por ejemplo, modificaciones de grupo fosfato) disminuyen preferentemente la tasa de hidrólisis de, por ejemplo, polinucleótidos que comprenden dichos análogos in vivo o in vitro. En algunas realizaciones, el inhibidor de oligonucleótidos es un oligonucleótido inhibidor modificado. En algunas realizaciones, el oligonucleótido inhibidor modificado comprende un ácido nucleico bloqueado (LNA), esqueleto de fosforotioato y/o una modificación de 2'-OMe.

Métodos de tratamiento

La divulgación se refiere, en algunos aspectos, a métodos útiles para el tratamiento de ciertas enfermedades, tales como enfermedades dominantes ligadas a X. Por ejemplo, las mutaciones de pérdidas de función en el gen de la proteína 2 de unión a metil-CpG (MECP2) ligado a X conducen al trastorno neuroconductual síndrome de Rett (RTT).

Por consiguiente, en algunos aspectos, la divulgación proporciona un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad dominante ligada a X, comprendiendo el método administrar al sujeto un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) en una cantidad eficaz para inducir la expresión de un gen diana ligado a X. Las enfermedades dominantes ligadas a X normalmente resultan de un alelo mutado del gen ligado a X. La divulgación se refiere, en parte, a inhibidores de XCIF que son eficaces para inducir la expresión de un alelo no mutante del gen ligado a X. Los ejemplos de enfermedades ligadas a X y sus genes ligados a X asociados incluyen síndrome de Rett (MECP2), hipofosfatemia ligada a X (PHEX), incontinencia pigmentaria de tipo 2 (IKBKG), síndrome de Aicardi (mutación de novo de un gen ligado a X), síndrome del CDK5L (CDKL5), hipoplasia dérmica focal (PORCN), síndrome de CHILD (NSDHL), síndrome de Lujan-Fryns (MED12), síndrome orofaciodigital 1 (OFD1), nefritis hereditaria o síndrome de Alport (COL4A3, CO^l4^a4, COL4A5), síndrome de Giuffre-Tsukahara (Xp22,13-q21,33), síndrome de Goltz (PORCN), síndrome X frágil (FMR1), síndrome de Bazex-Dupre-Christol (Xq24-q27), enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (GJB1), condrodisplasia punctata (EBP), protoporfiria eritropoyética (ALAS2), miopatía escapuloperoneal (FLH1) y displasia craneofrontonasal (EFNB1).

Como se usa en el presente documento, un "sujeto" es intercambiable con un "sujeto en necesidad del mismo", ambos de los cuales se pueden referir a un sujeto que tiene una enfermedad dominante ligada a X, o un sujeto que tiene un riesgo elevado de desarrollar dicho trastorno con respecto a la población en general. Un sujeto en necesidad del mismo puede ser un sujeto que tiene un cromosoma X inactivo. Un sujeto puede ser un humano, primate no humano, rata, ratón, gato, perro u otro mamífero.

En algunos aspectos, la divulgación proporciona un método de inducción de la expresión de un gen ligado a X en una célula que tiene un cromosoma X inactivo, comprendiendo el método suministrar a la célula un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) en una cantidad eficaz para inducir la expresión del gen ligado a X. En algunas realizaciones, la célula es in vitro. En algunas realizaciones, la célula está en un sujeto.

Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento", "tratar" y "terapia" se refieren a tratamiento terapéutico y profiláctico o manipulaciones preventivas. Los términos incluyen además mejorar los síntomas existentes, prevenir síntomas adicionales, mejorar o prevenir las causas subyacentes de los síntomas, prevenir o revertir las causas de los síntomas, por ejemplo, síntomas asociados a una enfermedad dominante ligada a X. Así, los términos indican que se ha conferido un resultado beneficioso a un sujeto con un trastorno (por ejemplo, una enfermedad dominante ligada a X), o con el potencial de desarrollar dicho trastorno. Además, el término "tratamiento" se define como la aplicación o administración de un agente (por ejemplo, agente terapéutico o una composición terapéutica) a un sujeto, o un tejido aislado o línea celular de un sujeto, que puede tener una enfermedad, un síntoma de enfermedad o una predisposición hacia una enfermedad, con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, favorecer o afectar la enfermedad, los síntomas de la enfermedad o la predisposición hacia la enfermedad.

Los agentes terapéuticos o composiciones terapéuticas pueden incluir un compuesto en una forma farmacéuticamente aceptable que previene y/o reduce los síntomas de una enfermedad particular (por ejemplo, una enfermedad dominante ligada a X). Por ejemplo, una composición terapéutica puede ser una composición farmacéutica que previene y/o reduce los síntomas de una enfermedad dominante ligada a X. Se contempla que la composición terapéutica de la presente invención se proporcionará en cualquier forma adecuada. La forma de la composición terapéutica dependerá de varios factores, que incluyen el modo de administración como se describe en el presente documento. La composición terapéutica puede contener diluyentes, adyuvantes y excipientes, entre otros componentes como se describen en el presente documento.

Composiciones farmacéuticas

En algunos aspectos, la divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor de XCIF. En algunas realizaciones, la composición comprende un inhibidor de XCIF y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Se conoce bien en la técnica el uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas. Excepto en la medida de que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones. También se pueden incorporar compuestos activos suplementarios en las composiciones. Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar como se describe a continuación. Los principios activos se pueden mezclar o combinar con cualquier vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable convencional. Las composiciones pueden ser estériles.

Normalmente, las composiciones farmacéuticas se formulan para administrar una cantidad eficaz de un agente (por ejemplo, un inhibidor de XCIF). En general, una "cantidad eficaz" de un agente activo se refiere a una cantidad suficiente para provocar la respuesta biológica deseada (por ejemplo, la reactivación de cromosomas X inactivos o uno o más genes que residen en ellos. Una cantidad eficaz de un agente puede variar dependiendo de dichos factores, como el criterio de valoración biológico deseado, la farmacocinética del compuesto, la enfermedad que está tratándose (por ejemplo, una enfermedad dominante ligada a X), el modo de administración y el paciente.

Se dice que una composición es un "vehículo farmacéuticamente aceptable" si su administración puede ser tolerada por un paciente receptor. La solución salina tamponada con fosfato estéril es un ejemplo de un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se conocen bien en la técnica otros vehículos adecuados. Véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18a ed. (1990).

Se entenderá por los expertos en la técnica que cualquier modo de administración, vehículo o excipiente convencionalmente empleado y que es inerte con respecto al agente activo se puede utilizar para preparar y administrar las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación. Son ilustrativos de dichos métodos, vehículos y excipiente los descritos, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 4a ed. (1970). Los expertos en la técnica, que se han expuesto a los principios de la divulgación, no experimentarán dificultad en determinar vehículos, excipientes y soportes adecuados y apropiados o en combinar los principios activos con ellos para formar las composiciones farmacéuticas de la divulgación.

Una cantidad eficaz, también denominada una cantidad terapéuticamente eficaz, de un compuesto (por ejemplo, un ácido nucleico antisentido (por ejemplo, oligonucleótido) o molécula pequeña capaz de inhibir un XCIF) es una cantidad suficiente para mejorar al menos un efecto adverso asociado a la expresión, o expresión reducida, del gen en una célula o en un individuo en necesidad de tal modulación. La cantidad terapéuticamente eficaz a incluir en las composiciones farmacéuticas depende, en cada caso, de varios factores, por ejemplo, el tipo, el tamaño y la afección del paciente que se va a tratar, el modo previsto de administración, la capacidad del paciente para incorporar la forma farmacéutica prevista, etc. En general, se incluye una cantidad de agente activo en cada forma farmacéutica para proporcionar desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 250 mg/kg, y preferentemente desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 100 mg/kg. Un experto habitual en la técnica sería capaz de determinar empíricamente una cantidad terapéuticamente eficaz apropiada.

Combinado con las enseñanzas proporcionadas en el presente documento, eligiendo entre los diversos compuestos activos y sopesando factores tales como la potencia, la biodisponibilidad relativa, el peso corporal del paciente, la intensidad de los efectos secundarios adversos y el modo de administración seleccionado, se puede planear un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico eficaz que no provoque una toxicidad sustancial y también sea completamente eficaz para tratar el sujeto particular. La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que está tratándose, el agente terapéutico particular que se administra, el tamaño del sujeto o la intensidad de la enfermedad o afección. Un experto habitual en la técnica puede determinar empíricamente la cantidad eficaz de un ácido nucleico particular y/u otro agente terapéutico sin necesitar excesiva experimentación.

En algunos casos, los compuestos de la divulgación se preparan en un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. En algunas realizaciones, un sistema coloidal de la divulgación es un liposoma. Los liposomas son vasos de membrana artificial que son útiles como vector de administración in vivo o in vitro. Se ha mostrado que vesículas unilaminares grandes (LUVs), que varían en tamaño desde 0,2 - 4,0 pm, pueden encapsular grandes macromoléculas. Se pueden encapsular ARN, ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y se administran a las células en una forma biológicamente activa. Fraley et al. (1981) Trends Biochem Sci 6:77.

Se pueden dirigir liposomas a un tejido particular acoplando el liposoma a un ligando específico, tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido o proteína. Los ligandos que pueden ser útiles para dirigir un liposoma a, por ejemplo, una célula de músculo liso incluyen, pero no se limitan a: fragmentos intactos o de moléculas que interaccionan con receptores específicos de células de músculo liso y moléculas, tales como anticuerpos, que interaccionan con los marcadores de la superficie celular de células cancerosas. Dichos ligandos se pueden identificar fácilmente por ensayos de unión bien conocidos por los expertos en la técnica. En otras realizaciones más, el liposoma se puede dirigir a un tejido acoplándolo con un anticuerpo conocido en la técnica.

Están comercialmente disponibles formulaciones de lípidos para la transfección de QIAGEN, por ejemplo, como EFFECTENE™ (un lípido no liposómico con un potenciador de condensación del ADN especial) y SUPERFECT™ (una tecnología dendrímera de acción novedosa).

Los liposomas están comercialmente disponibles de Gibco BRL, por ejemplo, como LIPOFECTIN™ y LIPOFECTACE™, que se forman de lípidos catiónicos tales como cloruro de N-[1-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) y bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDAB). Se conocen bien en la técnica los métodos de preparación de liposomas y se han descrito en muchas publicaciones. Los liposomas también se han revisado por Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3:235-241.

Pueden ser ventajosos ciertos lípidos catiónicos, que incluyen en particular metil-sulfato de N-[1 -(2,3-dioleoiloxi)-propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cuando se combinan con los inhibidores de XCIF de la divulgación.

En algunos aspectos de la divulgación, también puede ser conveniente el uso de agentes de compactación. También se pueden usar agentes de compactación solos o en combinación con un vector biológico o químico/físico. Un "agentes de compactación", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente, tal como una histona, que neutraliza las cargas negativas en el ácido nucleico y así permite la compactación del ácido nucleico en un gránulo fino. La compactación del ácido nucleico facilita la captación del ácido nucleico por la célula diana. Los agentes de compactación se pueden usar solos, por ejemplo, para administrar un inhibidor de XCIF en una forma que es más eficientemente absorbida por la célula, o en combinación con uno o más de los vehículos anteriormente descritos.

Otras composiciones a modo de ejemplo que se pueden usar para facilitar la captación de un inhibidor de XCIF incluyen fosfato de calcio y otros mediadores químicos del transporte intracelular, composiciones de microinyección, electroporación y composiciones de recombinación homóloga (por ejemplo, para integrar un ácido nucleico en una localización preseleccionada dentro del cromosoma de la célula diana).

Los compuestos se pueden administrar solos (por ejemplo, en solución salina o tampón) o usando cualquier vehículo de administración conocido en la técnica. Por ejemplo, se han descrito los siguientes vehículos de administración: cocleatos; Emulsome; ISCOMs; liposomas; vectores bacterianos vivos (por ejemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guérin, Shigella, Lactobacillus); vectores virales vivos (por ejemplo, variolovacuna, adenovirus, herpes simple); microesferas; vacunas de ácido nucleico; polímeros (por ejemplo, carboximetilcelulosa, quitosano); anillos de polímero; proteosomas; fluoruro de sodio; plantas transgénicas; virosomas; y partículas de tipo virus. Las formulaciones de la divulgación se administran en disoluciones farmacéuticamente aceptables, que pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes de tamponamiento, conservantes, vehículos compatibles, adyuvantes y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.

El término vehículo farmacéuticamente aceptable significa uno o más, diluyentes o sustancias de encapsulación de cargas sólidas o líquidas compatibles que son adecuados para administración a un humano u otro animal vertebrado. El término vehículo indica un componente orgánico o inorgánico, natural o sintético, con el que se combina el principio activo para facilitar la administración. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de ser mezclados con los compuestos de la presente divulgación, y entre sí, de un modo tal que no exista interacción que alteraría sustancialmente la eficiencia farmacéutica deseada.

Se proveen de recubrimientos adecuados núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar. Para este fin, se pueden usar disoluciones concentradas de azúcar, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir tintes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de comprimidos recubiertos de azúcar para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Además de las formulaciones descritas en el presente documento, los compuestos también se pueden formular como una preparación de liberación prolongada. Dichas formulaciones de acción prolongada se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados moderadamente solubles, por ejemplo, como una sal moderadamente soluble.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos o excipientes en fase sólida o de gel adecuados. Los ejemplos de dichos vehículos o excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato cálcico, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles. Las formas de preparación farmacéutica líquidas o sólidas adecuadas son, por ejemplo, soluciones acuosas o salinas para inhalación, microencapsuladas, encocleadas, recubiertas sobre partículas microscópicas de oro, contenidas en liposomas, nebulizadas, aerosoles, pellas para implantación en la piel, o secadas sobre un objeto afilado para ser rascadas en la piel. Las composiciones farmacéuticas también incluyen gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos recubiertos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberación extendida de compuestos activos, en cuya preparación se usan habitualmente excipientes y aditivos y/o auxiliares tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de recubrimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes o solubilizantes, como se ha descrito anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para su uso en una variedad de sistemas de administración de fármacos. Para una breve revisión de métodos para la administración de fármacos, véase Langer R (1990) Science 249:1527-1533.

Los compuestos se pueden administrar en sí mismos (puros) o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se usa en medicina, las sales deben ser farmacéuticamente aceptables, pero se pueden usar convenientemente sales no farmacéuticamente aceptables para preparar sales farmacéuticamente aceptables de las mismas. Dichas sales incluyen, pero no se limitan a, las preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluenosulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico, naftaleno-2-sulfónico y bencenosulfónico. Por tanto, dichas sales se pueden preparar como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos, tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo ácido carboxílico.

Los agentes de tamponamiento adecuados incluyen: ácido acético y una sal (1-2 % p/v); ácido cítrico y una sal (1-3 % p/v); ácido bórico y una sal (0,5-2,5 % p/v); y ácido fosfórico y una sal (0,8-2 % p/v). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0,003-0,03 % p/v); clorobutanol (0,3-0,9 % p/v); parabenos (0,01-0,25 % p/v) y timerosal (0,004-0,02 % p/v).

Las composiciones se pueden presentar convenientemente en forma farmacéutica unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de poner los compuestos en asociación con un vehículo que constituye uno o más componentes accesorios. En general, las composiciones se preparan poniendo uniforme e íntimamente los compuestos en asociación con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y luego, si fuera necesario, moldeando el producto. Las unidades de dosis líquidas son viales o ampollas. Las unidades de dosis sólidas son comprimidos, cápsulas y supositorios.

Modos de administración

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación contienen preferentemente un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado para convertir el compuesto o mezcla en administrable por vía oral como un comprimido, cápsula o píldora, o por vía parenteral, por vía intravenosa, por vía intradérmica, por vía intramuscular o por vía subcutánea, o por vía transdérmica.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un inhibidor de XCIF y/u otros compuestos se pueden administrar por cualquier vía adecuada para administrar las medicaciones. Están disponibles una variedad de vías de administración. El modo particular seleccionado dependerá, por supuesto, del agente particular o agentes seleccionados, la afección particular que está tratándose y la dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de la presente divulgación, en términos generales, se pueden poner en práctica usando cualquier modo de administración que sea medicamente aceptable, que significa cualquier modo que produzca el efecto terapéutico sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. En el presente documento se tratan diversos modos de administración. Para su uso en terapia, se pueden administrar a un sujeto una cantidad eficaz del inhibidor de XCIF y/u otro agente terapéutico por cualquier modo que suministre el agente a la superficie deseada, por ejemplo, mucoso, sistémico.

La administración de la composición farmacéutica de la presente divulgación se puede llevar a cabo mediante cualquier medio conocido para el experto. Las vías de administración incluyen, pero no se limitan a, oral, parenteral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, sublingual, intratraqueal, inhalación, subcutánea, ocular, vaginal y rectal. Las vías sistémicas incluyen oral y parenteral. Se usan regularmente varios tipos de dispositivos para administración por inhalación. Estos tipos de dispositivos incluyen inhaladores de dosis medidas (MDI), MDI accionados por la respiración, inhalador de polvo seco (DPI), espaciador/cámaras inhaladoras en combinación con MDI y nebulizadores.

Para administración por vía oral, los compuestos se pueden formular fácilmente combinando el (los) compuesto(s) activo(s) con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que los compuestos de la divulgación se formulen como comprimidos, píldoras, comprimidos recubiertos de azúcar, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lechadas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un sujeto que se va a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener como excipiente sólido, opcionalmente triturando una mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de comprimidos recubiertos de azúcar. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como la polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Opcionalmente, las formulaciones orales también se pueden formular en solución salina o tampones para neutralizar condiciones ácidas internas, o se pueden administrar sin ningún vehículo.

Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los principios activos en mezcla con carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizadores. También se puede usar microesferas formuladas para administración por vía oral. Dichas microesferas han sido bien definidas en la técnica. Todas las formulaciones para administración por vía oral deben estar en dosificaciones adecuadas para dicha administración. Para administración por vía oral, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional.

Para administración por inhalación, los compuestos para su uso según la presente divulgación pueden ser convenientemente suministrados en forma de una presentación de espray en aerosol de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor apropiado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad dosificada. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

Los compuestos, cuando se desea para administrarlos por vía sistémica, se pueden formular para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizadores y/o dispersantes.

Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen disoluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Además, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección aceitosa apropiada. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones para inyección acuosa pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas.

Alternativamente, los compuestos activos pueden estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógenos estéril, antes de uso.

Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Otros sistemas de administración pueden incluir sistemas de administración de liberación con el tiempo, liberación retardada o de liberación sostenida. Dichos sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los compuestos, aumentando la comodidad para el sujeto y el médico. Están disponibles y son conocidos por los expertos habituales en la técnica muchos tipos de sistemas de administración por liberación. Incluyen sistemas basados en polímeros tales como poli(lactida-glicolida), copolioxalatos, policaprolactonas, poliésteramidas, poliortoésteres, poli(ácido hidroxibutírico) y polianhídridos. Las microcápsulas de los polímeros anteriores que contienen fármacos se describen en, por ejemplo, la patente de EE. UU. N° 5.075.109. Los sistemas de administración también incluyen sistemas no poliméricos que son: lípidos que incluyen esteroles tales como colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono-, di- y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogeles; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; recubrimientos de cera; comprimidos por compresión usando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fundidos; y similares. Los ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas de erosión en los que un agente de la divulgación está contenido en una forma dentro de una matriz, tales como los descritos en las patentes de EE. UU. N° 4.452.775, 4.675.189 y 5.736.152, y (b) sistemas de difusión en los que un componente activo permea a una tasa controlada de un polímero tal como se describe en las patentes de EE. UU. N° 3.854.480, 5.133.974 y 5.407.686. Además, se pueden usar sistemas de administración con herramientas basadas en bombas, algunos de los cuales están adaptados para implantación.

En algunas realizaciones, un oligonucleótido inhibidor se puede administrar a las células por un vector de expresión manipulado para expresar el oligonucleótido inhibidor. Un vector de expresión es uno en el que una secuencia deseada se puede insertar, por ejemplo, por restricción y ligación, de forma que se una operativamente a las secuencias reguladoras y se pueda expresar como un transcrito de ARN. Un vector de expresión contiene normalmente un inserto que es una secuencia codificante para una proteína o para un oligonucleótido inhibidor tal como un ARNhp, un miARN, o un miARN. Los vectores pueden contener además una o más secuencias de marcador adecuadas para su uso en la identificación de células que han o no han sido transformadas o transfectadas con el vector. Los marcadores incluyen, por ejemplo, genes que codifican proteínas que aumentan o disminuyen o la resistencia o la sensibilidad a antibióticos u otros compuestos, genes que codifican enzimas cuyas actividades son detectables por ensayos estándar o proteínas fluorescentes, etc.

Como se usa en el presente documento, se dice que una secuencia codificante (por ejemplo, secuencia codificante de proteínas, secuencia de miARN, secuencia de ARNhp) y secuencias reguladoras están "operativamente" unidas cuando están unidas covalentemente de tal forma que pongan la expresión o transcripción de la secuencia codificante bajo la influencia o el control de las secuencias reguladoras. Si se desea que las secuencias codificantes sean traducidas en una proteína funcional, se dice que dos secuencias de ADN están operativamente unidas si la inducción de un promotor en las secuencias reguladoras de 5' da como resultado la transcripción de la secuencia codificante y si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento del marco, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de las secuencias codificantes, o (3) interfiere con la capacidad del transcrito de ARN correspondiente que se va a traducir en una proteína. Así, una región promotora estaría operativamente unida a una secuencia codificante si la región promotora fuera capaz de efectuar la transcripción de esa secuencia de ADN de forma que el transcrito resultante pudiera ser traducido en la proteína deseada o polipéptido. Se apreciará que una secuencia codificante puede codificar un miARN, ARNhp o miARN.

La naturaleza precisa de las secuencias reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar entre especies o tipos de células, pero en general debe incluir, según sea necesario, secuencias no transcritas en 5' y no traducidas en 5' implicadas con el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tal como una caja TATA, secuencia de terminación, secuencia CAAT y similares. Dichas secuencias reguladoras no transcritas en 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control de la transcripción del gen operativamente unido. Las secuencias reguladoras también pueden incluir secuencias potenciadoras o secuencias activadoras en la dirección 5', según se desee. Los vectores de la divulgación pueden incluir opcionalmente secuencias conductoras en 5' o señal.

En algunas realizaciones, se selecciona un vector de virus para administrar una molécula de ácido nucleico del grupo que consiste en adenovirus, virus adenoasociados, poxvirus que incluyen virus de la variolovacuna y poxvirus atenuados, virus del bosque de Semliki, virus de la encefalitis equina venezolana, retrovirus, virus de Sindbis y partícula similar a virus Ty. Los ejemplos de virus y partículas similares a virus que se han usado para administrar ácidos nucleicos exógenos incluyen: adenovirus defectuosos en la replicación, un retrovirus modificado, un retrovirus no replicante, un virus del bosque de Semliki defectuoso en la replicación, virus de la viruela del canario y derivado de virus de la variolovacuna altamente atenuado, virus de la variolovacuna no replicativos, virus de la variolovacuna replicativos, virus de la encefalitis equina venezolana, virus de Sindbis, vectores lentivirales y partícula similar a virus Ty. Otro virus útil para ciertas aplicaciones es el virus adenoasociado. El virus adenoasociado es capaz de infectar un amplio intervalo de tipos de células y especies y se puede manipular para ser defectuoso en la replicación. Tiene además ventajas, tales como estabilidad al calor y a disolventes de lípidos, altas frecuencias de transducción en células de diversos linajes, que incluyen células hematopoyéticas, y ausencia de inhibición de la superinfección, permitiendo así múltiples series de transducciones. El virus adenoasociado se puede integrar en ADN celular humano en un modo específico de sitio, minimizando así la posibilidad de mutagénesis de inserción y la variabilidad de la expresión génica insertada. Además, se han seguido infecciones por virus adenoasociados no mutantes en cultivo de tejido durante más de 100 pases en ausencia de presión selectiva, que implica que la integración genómica del virus adenoasociado es un acontecimiento relativamente estable. El virus adenoasociado también puede funcionar en un modo extracromosómico.

En general, otros vectores virales útiles se basan en virus eucariotas no citopáticos en los que genes no esenciales se han sustituido con el gen de interés. Los virus no citopáticos incluyen ciertos retrovirus, cuyo ciclo vital implica la transcripción inversa de ARN viral genómico en ADN con la posterior integración proviral en ADN celular del hospedador. En general, los retrovirus son deficientes en la replicación (por ejemplo, capaces de dirigir la síntesis de los transcritos deseados, pero incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Dichos vectores de expresión retroviral genéticamente alterados tienen utilidad general para la transducción de alta eficiencia de genes in vivo. Los protocolos convencionales para producir retrovirus deficientes en la replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una línea celular de encapsidación con plásmido, producción de retrovirus recombinantes por la línea celular de encapsidación, recogida de partículas virales de medios de cultivo de tejido e infección de las células diana con partículas virales) se proporcionan en Kriegler, M., "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual", W.H. Freeman Co., New York (1990) y Murry, E.J. Ed. "Methods in Molecular Biology", vol. 7, Humana Press, Inc., Clifton, New Jersey (1991).

Se pueden emplear diversas técnicas para introducir moléculas de ácidos nucleicos de la divulgación en células, dependiendo de si las moléculas de ácidos nucleicos se introducen in vitro o in vivo en un hospedador. Dichas técnicas incluyen transfección de precipitados de moléculas de ácido nucleico-fosfato de calcio, transfección de moléculas de ácidos nucleicos asociadas a DEAE, transfección o infección con los virus anteriores que incluyen la molécula de ácido nucleico de interés, transfección mediada por liposomas y similares. Otros ejemplos incluyen: sistema de transfección de nanopartículas N-TER™ por Sigma-Aldrich, reactivos de transfección FECTOFLY™ para células de insecto por Polyplus Transfection, polietilenimina "Max" por Polysciences, Inc., Unique, Non-Viral Transfection Tool por Cosmo Bio Co., Ltd., reactivo de transfección LIPOFECTAMINE™ LTX por Invitrogen, reactivo de transfección SATISFECTION™ por Stratagene, reactivo de transfección LIPOFECTAMINE™ por Invitrogen, reactivo de transfección FUGENE® HD por Roche Applied Science, reactivo de transfección IN VIVO-JETPEI™ conforme a GMP por Polyplus Transfection y reactivo de transfección GENEJUICE® de insecto por Novagen.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar la divulgación. No pretenden limitar la divulgación de ningún modo.

Los aspectos de la presente divulgación se refieren a la reactivación de cromosomas X. Como se describe en el presente documento, los inhibidores de molécula pequeña de XCIFs pueden, como la atenuación por iARN, reactivar la expresión de los genes ligados a Xi, que tiene implicaciones para el tratamiento de síndrome de Rett y otras enfermedades dominantes ligadas a X. Se han identificado trece factores de inactivación de cromosomas X (XCIFs) (Tabla 1), y participan en la represión transcripcional de genes ligados a X.

Tabla 1: Resumen de factores de la inactivación de cromosomas X

Ejemplo 1: Identificación de factores implicados en XCI de mamífero

Se usó una línea celular de fibroblastos embrionarios de ratón hembra (H4SV) previamente obtenida en la que genes que codifican la proteína verde fluorescente (GFP) e hipoxantina guanina fosforibosiltransferasa (HPRT) están presentes solo en el Xi. Se espera que la atenuación de un factor implicado en XCI reactive la expresión de los genes indicadores Gfp y Hprt (FIG. 1A).

Se dividió en 10 conjuntos una biblioteca de ARNhp de ratón del genoma completo que comprende 62.400 ARNhps, que se encapsidaron en partículas de retrovirus y se usaron para transducir células H4SV. Se seleccionaron células GFP-positivas por citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS), se expandieron y se identificaron los ARNhps por análisis de secuencias. Para validar los candidatos, se transdujeron ARNhps individuales dirigidos contra cada gen candidato en células H4SV y se midió el número de células GFP-positivas medidas por análisis de FACS. Los resultados de estos experimentos identificaron 13 genes candidatos, cuya atenuación produjo un aumento del porcentaje de células GFP-positivas con respecto al obtenido con un ARNhp no de silenciamiento (NS) de control (FIG. 1B). El ensayo de viabilidad celular de la FIG. 7A muestra que la atenuación de cada candidato habilitó el crecimiento en medio HAT, que indica que se reactivó el gen Hprt ligado a Xi. Como era de esperar, disminuyeron los niveles de ARNm de los 13 genes candidatos en la línea celular KD H4SV correspondiente (FIG.

7B). Para descartar efectos inespecíficos, para los 13 candidatos se mostró que un segundo ARNhp no relacionado también reactivó el gen Hprt ligado a Xi (FIG. 7C) y disminuyó los niveles de ARNm del gen elegido como diana en la línea celular KD H4SV correspondiente (FIG. 7D). Los 13 factores de inactivación de cromosomas X (XCIFs) se enumeran en la Tabla 1 e incluyen proteínas que se sabe, o se predice, que participan en diversos procesos que incluyen la señalización de células (PDPK1, AURKA, LAYN, ACVR1 y NF1), transcripción (DNMT1, PYGO1, SOX5 y ZFP426) y regulación dependiente de ubiquitina (RNF165 y FBXO8). Significativamente, se ha mostrado previamente que DNMT1 está implicado en XCI, validando la estrategia de cribado.

Para confirmar estos resultados, se analizó la expresión de cuatro genes ligados a X, G6pdx, Lamp2, Pgk1 y Mecp2, usando hibridación fluorescente in situ (FISH) de ARN bicolor en células BMSL2, una línea celular de fibroblastos de ratón hembra no relacionada. En células BMSL2 que expresan un ARNhp NS de control, la FISH de ARN reveló, como era de esperar, una única señal nuclear para G6pdx, Lamp2, Pgk1 y Mecp2, indicativa de expresión monoalélica (FIG. 1C y FIG. 8A). La atenuación de cada uno de los 13 XCIFs aumentó sustancialmente la fracción de células que contenía dos señales nucleares de G6pdx, Lamp2, Pgk1 y Mecp2, indicativas de expresión bialélica. La reactivación de G6pdx, Pgk1, Mecp2 y Hprt en las 13 líneas celulares XCIF KD BMSL2 también se demostró por un aumento de ~ 1,5-2 veces en los niveles de ARNm como se monitorizó por qRT-PCR (FIG. 8B). También se demostró la reactivación del gen Pgk1 ligado a Xi en líneas celulares XCIF KD BMSL2 representativas usando un ensayo de extensión de cebadores en un único nucleótido (SNuPE) (FIG. 8C), que podría distinguir la expresión de los alelos Pgk1 ligados a Xi y Xa en virtud de un polimorfismo de un solo nucleótido. Los experimentos de FISH de ADN usando una sonda de pintado específica de cromosomas X indicaron que el contenido de cromosomas X de las líneas celulares XCIF KD ^bM^sL2 fue similar al de la línea celular BMSL2 de control que expresa un ARNhp NS (FIG.

8D).

Ejemplo 2: Los XCIFs participan en el inicio de XCI en células madre embrionarias de ratón

Se transdujeron células ES PGK12.1 de ratones hembra no diferenciadas con un retrovirus que expresa un ARNhp de XCIF. Entonces se trataron las células con ácido retinoico (RA), que induce predominantemente, pero no exclusivamente, diferenciación neuronal. Se monitorizó la expresión del gen ligado a X por FISH de ARN bicolor. La Figura 2A y FIG. 9A muestran que la expresión bialélica de los genes G6pdx, Lamp2, Pgk1 y Mecp2 ligados a X fue sustancialmente elevada tras la atenuación de cada XCIF. Como antes, el contenido de cromosoma X de las células XCIF KD ES fue similar al de la línea celular ES de control que expresa un ARNhp NS (FIG. 9B).

Una posible explicación para el fracaso de una o más de las 13 líneas celulares XCIF KD ES para experimentar XCI es que XCIF participa en la diferenciación. Tras el tratamiento con RA, la diferenciación de las 13 líneas celulares XCIF KD ES fue normal, como se evidencia monitorizando dos marcadores bien establecidos de células ES no diferenciadas, actividad de fosfatasa alcalina (FIG. 2B) y expresión de Oct4 (FIG. 2C). Asimismo, varios marcadores de células diferenciadas que aumentan después del tratamiento con RA (Eomes [neuronal], Tcf712 [mesodermo] y Cdx2 [epitelial]) no estuvieron afectados por la atenuación de XCIF (FIG. 9C). Finalmente, los resultados de RT-PCR en tiempo real cuantitativa (qRT-PCR) de la FIG. 2D muestran que la expresión de los 13 XCIFs se reguló por incremento tras la diferenciación, explicando, al menos en parte, la aparición selectiva de XCI tras la diferenciación.

Ejemplo 3: Función de XCIFs que promueve la expresión de Xist y/o localización en Xi

Tras la atenuación de los 13 XCIFs en células ES de ratón, se añadió RA para inducir la diferenciación y XCI, y se analizó la expresión de Xist por qRT-PCR. Los resultados de FIG. 3A muestran que los niveles de Xist se redujeron a grados variables en todas las líneas celulares XCIF KD ES. En células ES femeninas diferenciadas, Xist se detecta por FISH de ARN como una señal nuclear difusa grande denominada una "nube" que se localiza conjuntamente con Xi. La Figura 3B muestra que la atenuación de cada uno de los XCIFs redujo a grados variables el porcentaje de células con el patrón de localización de Xist característico de XCI (véase también la FIG. 10A). Tomados conjuntamente, estos resultados indican que XCIFs promueven la expresión de Xist y/o la localización de Xist al Xi.

Varios estudios previos han sugerido que se requiere Xist para el inicio, pero no el mantenimiento de XCI. Sin embargo, los resultados de FIG. 3A y B implicaron que Xist también fue necesario para el mantenimiento de XCI. Para proporcionar evidencia independiente para este modelo, se derogó la función de Xist en fibroblastos BMSL2 de ratón usando un oligonucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA) antisentido de Xist. Los resultados de la FIG. 3C muestran, de acuerdo con los resultados previos, que el oligonucleótido de LNA antisentido de Xist perturbó el patrón normal de expresión/localización de Xist. Y, lo que es más importante, el oligonucleótido de LNA antisentido de Xist aumentó sustancialmente la expresión bialélica de Mecp2 ligado a X. Así, Xist participa en tanto el inicio como el mantenimiento de XCI.

Ejemplo 4: DNMT1 es un activador transcripcional de Xist en Xi

Se encontró que DNMT1, que normalmente funciona como un represor transcripcional, estaba implicado en la expresión y/o localización de Xist al Xi. Para investigar más a fondo este hallazgo, se realizaron experimentos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en células BMSL2 en las que el Xa alberga una deleción que engloba el promotor de Xist y varios genes que incluyen Hprt. La Figura 3D muestra que DNMT1 y, como era de esperar, la ARN polimerasa II (POL2), se unieron cerca del sitio de inicio de la transcripción Xist en el Xi. El hecho de que DNMT1 estuviera implicado en la transcripción de Xist y se uniera al promotor de Xist sugirió que DNMT1 podría funcionar de activador transcripcional de Xist. De acuerdo con esta idea, tras la atenuación de DNMT1, el nivel de POL2 unido al promotor de Xist disminuyó sustancialmente (FIG. 3D). Además, en un ensayo de transcripción nuclear iniciada la atenuación de DNMT1 redujo la transcripción de Xist pero aumentó la transcripción de Hprt ligado a Xi, como era de esperar (FIG. 3E). Como control, la transcripción del gen de la proteína de unión a la caja TATA (Tbp), que no está ligado a X y se expresó constitutivamente, no estuvo afectada por la atenuación de DNMT1. Además, la atenuación de DNMT1 no afectó la semivida de ARN de Xist (FIG. 3F), que indica que la disminución de los niveles de ARN de Xist tras el agotamiento de DNMT1 fueron predominantemente transcripcionales. Finalmente, el nivel de transcritos Xist fue significativamente más bajo en Dnmt1-/- en comparación con los fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) Dnmt1+/+ (FIG. 3G). Conjuntamente, estos resultados indican que DNMT1 es un activador transcripcional de Xist en el Xi.

Se consideró la posibilidad de que DNMT1 activara indirectamente la transcripción de Xist por represión de la expresión de Tsix, que regula negativamente Xist. Sin embargo, la atenuación de DNMT1 en fibroblastos (FIG. 3H y FIG. 10B) o células ES murinas (FIG. 10C) disminuyó sustancialmente la expresión de Xist, pero no afectó los niveles de Tsix. La metilación mediada por DNMT1 en el promotor de Xist podría bloquear la unión de un represor transcripcional. De acuerdo con esta posibilidad, tras la adición de 5-azacitidina, que inhibe la actividad enzimática de DNMT1 dando como resultado la desmetilación de ADN, los niveles de Xist fueron notablemente reducidos, mientras que aumentó la expresión del gen Hprt ligado a Xi, como era de esperar (FIG. 3I). Conjuntamente, estos resultados sugieren que DNMT1 promueve la transcripción de Xist antagonizando un represor.

Ejemplo 5: Reactivación del gen Mecp2 ligado a Xi por inhibidores de XCIF de molécula pequeña

Uno de los XCIFs es PDPK1, una serina-treonina cinasa que regula la señalización de fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K)/AKT. La FIG. 4A y la FIG. 11A muestran que tras el tratamiento de células ES de ratón hembra diferenciadas con un inhibidor químico de o PDPK1 (OSU-03012) o PI3K (LY294002), hubo una pérdida dependiente de la dosis de la nube de Xist y elevada expresión bialélica de Mecp2. Se obtuvieron resultados similares en células BMSL2 usando GNE-317 (FIG. 4B y FIG. 11B), un inhibidor de PI3K específicamente diseñado para atravesar la barrera hematoencefálica. Como era de esperar, con los tres inhibidores, la mayoría de las células contuvieron dos señales de FISH de ARN de Mecp2 y carecieron de una nube de Xist detectable. En particular, sin embargo, en algunas células, una de las dos señales de FISH de ARN de Mecp2 se localizó conjuntamente con una nube de Xist, que marcó el Xi. Se obtuvieron resultados similares con neuronas corticales de ratón posmitóticas usando los inhibidores de PDPK1 OSU-03012 y BX912 o el inhibidor de PI3K LY294002 (FIG. 4C).

PDPK1 tiene varios sustratos conocidos, que son ellos mismos proteínas cinasas, tales como la familia de las cinasas inducibles por suero y glucocorticoide (SGKs). La FIG. 4D muestra que el tratamiento de células BMLS2 con el inhibidor de SGK1/2 GSK650394 produjo la pérdida de la nube de Xist y aumentó la expresión bialélica de Mecp2. De acuerdo con estos resultados, el análisis por qRT-PCR muestra que el tratamiento de células BMSL2 con GSK650394 produjo una disminución dependiente de la dosis en la expresión de Xist y aumento en la expresión de Mecp2 (FIG. 4E). Se obtuvieron resultados similares para dos inhibidores químicos de otro XCIF, ACVR1: K02288 y LDN193189 (FIG. 4F y 4G).

Se trataron las células BMSL2 con el inhibidor de PDPK1 OSU-03012 o inhibidor de PI3K LY294002 dando como resultado la expresión bialélica del gen Mecp2 ligado a Xi (FIG. 4H y FIG. 11C). Tras la retirada del fármaco durante al menos seis días, se restauró ampliamente la expresión y localización normal de Xist, y la expresión monoalélica de Mecp2, que indica que es reversible la reactivación mediada por moléculas pequeñas de genes ligados a Xi. En una línea celular clonal de fibroblastos de un paciente con RTT, el alelo de MECP2 mutante ligado a Xa contiene una deleción de 32 pb, que permite la detección selectiva de ARNm de MECP2 no mutante ligado a Xi en un ensayo de RT-PCR usando un cebador dentro de la región delecionada. Otra línea celular clonal de fibroblastos derivada del mismo paciente con RTT en la que el alelo de MECP2 no mutante está en el Xa proporcionó un control para el producto correcto de RT-PCR (FIG. 4I, carril 1). Los resultados muestran, como era de esperar, que no se expresó el alelo de MECP2 no mutante ligado a Xi (carril 2), pero se podría reactivar mediante la adición del inhibidor de metiltransferasa de ADN 5-azacitidina (carril 3). Significativamente, la adición de los inhibidores de PDPK1 BX912 y OSU-03012 (carriles 4,5), o VX680 (carril 6), un inhibidor de AURKA, otro XCIF (Tabla 1), reactivaron el alelo de MECP2 no mutante ligado a Xi. Así, los inhibidores químicos de XCIF pueden reactivar el gen Mecp2/MECP2 ligado a Xi en fibroblastos murinos, células ES y neuronas corticales, así como fibroblastos RTT humanos.

Ejemplo 6: XCI defectuoso en ratones S^ícI-I- hembra

Uno de los XCIFs aislados en el cribado, STC1, es una glucoproteína encontrada en tanto el citoplasma como el núcleo. Los ratones Stc1-/- no tienen fenotipo obvio y las camadas tienen las relaciones mendelianas y hombre:mujer esperadas. Para determinar si STC1 participa en XCI en el ratón, se fecundaron de forma cruzada ratones Stc1+/- y se analizaron los MEFs de la progenie resultante por FISH de ARN bicolor para la expresión de G6pdx, Lamp2, Pgk1 y Mecp2. Como era de esperar, MEFs Stc1+/+ femeninos y como control MEFs Stc1-/-masculinos presentaron expresión monoalélica de G6pdx, Lamp2, Pgk1 y Mecp2 (FIG. 5A). Por el contrario, los MEFs Stc1-/- femeninos presentaron predominantemente expresión bialélica de los cuatro genes, indicativo de un defecto de XCI. El análisis por qRT-PCR reveló los reducidos niveles de Xist en MEFs Stc1-/- femeninos en comparación con MEFs Stc1+/+ femeninos (FIG. 5B). En particular, fue comparable el contenido de cromosoma X de MEFs Stc1-/- y Stc1+/+ femeninos (FIG. 12A).

Para validar más estos hallazgos, se analizaron Xist y Mecp2, o Xist y G6pdx, en neuronas corticales de secciones cerebrales de ratones hembra posnatales Stc1-/- y Stc1+/+. En ratones hembra Stc1-/-, la expresión bialélica de Mecp2 y G6pdx fue claramente evidente en algunas neuronas corticales (FIG. 12B). Otra vez, se observó en algunas células la colocalización de señales de Mecp2 y Xist, o G6pdx y Xist, indicativo de la reactivación de los genes Mecp2 y G6pdx ligados a Xi.

Ejemplo 7: XCI defectuoso en ratones S^íc1-I- hembra no va acompañado de elevada expresión génica ligada a X

Se realizaron experimentos de perfilado del transcriptoma (RNA-Seq) para determinar si los niveles de expresión de genes codificados por X fueron elevados en MEFs Stc1-/- femeninos. En estos experimentos, se preparó ARN a partir de tres cultivos independientes de MEFs Stc1+/+ o Stc1-/- femeninos. Se procesaron muestras de ARN y se amplificaron, seguido por secuenciación de alto rendimiento (Illumina Hiseq 2000) (FIG. 6A). Las secuencias se alinearon con el genoma de referencia y se realizó análisis bioinformático de la expresión relativa de genes ligados a X. Los resultados de la FIG. 6B muestran que los niveles de expresión totales de la gran mayoría (98 %) de genes ligados a X fueron indistinguibles en MEFs Stc1+/+ y Stc1-/-. La similitud de la expresión de genes ligados a X entre MEFs Stc1+/+ y Stc1-/- fue estadísticamente significativa (FIG. 6C y FIG. 13A). Además, la gran mayoría (99 %) de los genes autosómicos también se expresaron a niveles estadísticamente comparables en MEFs Stc1+/+ y Stc1-/-femeninos (FIG. 13B).

Para reforzar estos resultados basados en RNA-Seq, se analizaron por qRT-PCR los niveles de genes ligados a X Mecp2 y Hprt. La Figura 6D muestra que los niveles de ARNm de Mecp2 y Hprt fueron equivalentes en MEFs Stc1+/+ y Stc1-/- femeninos, a pesar de XCI deficiente. Además, los resultados de inmunotransferencia de la FIG. 6E muestran que el nivel de la proteína MECP2 en MEFs Stc1+/+ femeninos (izquierda) y lisados cerebrales (derecha) fue comparable a aquél en ratones Stc1-/-.

Los experimentos descritos anteriormente se realizaron en ratones Stc1-/- en los que hubo una alteración estable a largo plazo de XCI. Se mostró que el agotamiento condicional a largo plazo de Xist en células hematopoyéticas de ratón no iba acompañado por un aumento general en la expresión de genes ligados a X. Para determinar si la expresión de genes ligados a X aumentó inmediatamente tras la abolición de XCI, se analizó la expresión de Mecp2 y Hprt en fibroblastos BMSL2 de ratón tras la atenuación mediada por ARNhp de STC1. En células STC1 KD BMSL2 hubo un aumento aproximado de dos veces en la expresión de Mecp2 y Hprt, que fue evidente a tanto el nivel de ARNm (FIG. 6F y véase la FIG. 8B) como de proteína (FIG. 6G). Conjuntamente, estos resultados sugieren la existencia de un mecanismo(s) que pueden compensar una deficiencia persistente de XCI para regular la expresión de genes ligados a X.

Ejemplo 8: Reactivación del gen Mecp2 ligado a Xi por inhibición de moléculas pequeñas de dianas aguas abajo de PDPK1.

Uno de los XCIFs es PDPK1, una serina-treonina cinasa que regula la señalización de fosfatidilinositol-3-cinasa (PI3K)/AKT. PDPK1 tiene varios sustratos conocidos, que son ellos mismos proteínas cinasas, tales como diana de mamífero de rapamicina (mTOR), Aurora cinasa A (AURKA) y receptor de activina de tipo 1 (ACVR1), como se muestra en la FIG. 14. Este ejemplo describe que el tratamiento con inhibidores de sustratos en la dirección 3' de PDPK1 da como resultado la reactivación de genes ligados a Xi (por ejemplo, Mecp2).

mTOR es una proteína serina-treonina cinasa que es un componente aguas abajo en las vías de señalización de PI3K. Se trataron fibroblastos de ratón con tres inhibidores de mTOR (rapamicina, KU-0063794 o everolimus) y se midieron niveles relativos de expresión de Xist y Mecp2. El tratamiento con cada inhibidor de mTOR produjo una disminución en la expresión relativa de Xist y un aumento en la expresión relativa de Mecp2, que indica la reactivación del gen Mecp2 ligado a Xi (FIG. 15). Se midieron CI50 de rapamicina, KU-0063794, o everolimus, a 0,1 nm, 10 nm y 2,4 nm, respectivamente. La expresión de Mecp2 también se analizó por FISH en células BMSL2. Se observaron dos señales de Mcep2 en células tratadas con el inhibidor de mTOR, que indica la expresión bialélica de Mcep2. Así, el tratamiento con cada uno de los inhibidores de mTOR reactiva Mecp2 ligado a Xi (FIG. 15).

Para confirmar estos resultados, se realizó un ensayo de selección con hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT). El ensayo de HAT es un ensayo de selección doble que requiere la activación del gen Hprt ligado a Xi por un inhibidor con citotoxicidad suficientemente baja para permitir la proliferación y supervivencia celular. Se trataron células que contenían Hprt ligado a Xi con o DMSO (control negativo), rapamicina, KU-0063794, o everolimus, y se midió el crecimiento celular. El tratamiento con cada inhibidor de mTOR pero no DMSO produjo el crecimiento celular, que indica que los inhibidores de mTOR reactivan el gen Hprt ligado a Xi (FIG. 16).

La Aurora cinasa A (AURKA) es una serina-treonina cinasa que está asociada con la regulación de la división celular en las fases G2-M y es un sustrato aguas abajo de PDPK1. La familia de Aurora cinasa humana comprende tres miembros, Aurora cinasa A (AURKA), B (AURKB) y C (AURKC). Aquí, se describe la reactivación de genes ligados a Xi usando inhibidores de AURKA (por ejemplo, VX680, CD532 y MLN8237).

Se trataron fibroblastos de ratón con CD532 o MLN8237 (que tienen mayor selectividad por AURKA que VX680) y se midieron niveles relativos de expresión de Xist y Mecp2. El tratamiento con cada inhibidor de AURKA produjo una disminución en la expresión relativa de Xist y un aumento en la expresión relativa de Mecp2, que indica la reactivación del gen Mecp2 ligado a Xi (FIG. 17). La CI50 de CD532 y MLN8237 fueron 45 nm y 1,2 nm, respectivamente. La expresión de Mecp2 también se analizó por FISH en células BMSL2. Se observaron dos señales de Mcep2en células tratadas con los inhibidores de AURKA, que indica la expresión bialélica de Mcep2. Los resultados se confirmaron usando el ensayo de selección con HAT. Así, el tratamiento con cada uno de los inhibidores de AURKA reactiva Mecp2 ligado a Xi (FIG. 17).

El receptor de activina de tipo 1 (ACVR1, también conocido como ALK2) es una serina-treonina cinasa de receptor que media en la señalización por proteínas morfogénicas óseas. ACVR1 es un sustrato aguas abajo de PDPK1. Aquí, se describe la reactivación de genes ligados a Xi usando inhibidores de ACVR1 (por ejemplo, K02288, dorsomorfina y LDN193189).

Se trataron fibroblastos de ratón con K02288, dorsomorfina o LDN193189 y se midieron los niveles relativos de expresión de Xist y Mecp2. El tratamiento con cada inhibidor de ACVR1 produjo una disminución en la expresión relativa de Xist y un aumento en la expresión relativa de Mecp2, que indica la reactivación del gen Mecp2 ligado a Xi (FIG. 18). La CI50 de K02288, dorsomorfina y LDN193189 fueron 1 nm, 200 nm y 5 nm, respectivamente. También se analizó la expresión de Mecp2 por FISH en células BMSL2. Se observaron dos señales de Mcep2 en células tratadas con los inhibidores de ACVR1, que indica la expresión bialélica de Mcep2. Los resultados se confirmaron usando el ensayo de selección con HAT. Así, el tratamiento con cada uno de los inhibidores de ACVR1 reactiva Mecp2 ligado a Xi (FIG. 18).

Ejemplo 9: Cribados basado en CRISPR/Cas9 para identificar nuevos XCIFs

Se ha realizado un cribado basado en CRISPR/Cas9 para identificar nuevos XCIFs. Primero, se infectaron células BMSL2, fibroblastos de ratón hembra que expresan establemente Cas9 y seleccionados para resistencia a blasticidina, con una biblioteca GeCKO v2 CRISPR de ratón (que incluía 100.000 ARNs guía) y luego seleccionando para resistencia a puromicina. A continuación, los clones se sometieron a selección con HAT durante una semana. La reactivación de cromosomas X se provoca por inactivación mediada por CRISPR de un XCIF. El crecimiento en medio HAT resulta de la expresión de HPRT funcional de un cromosoma X reactivado. Se identificaron ARNs guía y se validaron a partir de clones positivos.

Ejemplo 10: Materiales y métodos

Cultivo celular

Se cultivaron células H4SV, células BMSL2 (HOBMSL2) y fibroblastos de RTT humana como se recomendó por el proveedor. Se cultivaron células PGK12.1 como se describió previamente y se diferenciaron volviendo a sembrar en placa, en placas de plástico gelatinizadas, en presencia de ácido alfa-retinoico 100 nM (Sigma) y ausencia de factor inhibidor de leucemia durante al menos una semana.

Aislamiento de MEFs, tejido cerebral y neuronas corticales

Se aislaron MEFs de embriones E8.5 (ratones Dnmt1; Jackson Laboratories) o E14.5 (ratones Stc1, proporcionados por D. Sheikh-Hamad) y se genotipificaron por PCR usando cebadores específicos de gen y SRY (Tabla 2). Se incorporaron cabezas de crías P1 Stc1+/+ y Stc1-/- en el compuesto O.C.T. (Tissue-Tek) y se congelaron en nitrógeno líquido. Se montaron criosecciones de tejido cerebral (5 pm de espesor), se fijaron y se hibridaron con sondas de FISH como se ha descrito. Se aislaron neuronas de las cortezas cerebrales de embriones E19.5 C57BL/6 y se cultivaron como se ha descrito.

Cribado y validación de ARNhp a gran escala

Se obtuvo la biblioteca shRNAmir de ratón (edición 2.16; Open Biosystems/Thermo Scientific). Se transdujeron células H4SV (1,1x106) a una multiplicidad de infección de 0,2 con los conjuntos retrovirales, generados como se ha descrito previamente, y se seleccionaron para resistencia a puromicina durante 7 días. Se clasificaron las células por FACS y se seleccionaron células GFP-positivas. Se identificaron ARNhps candidatos como se ha descrito previamente. Para validar los candidatos, se transdujeron 3x105 células H4SV o BMSL2 con ARNhps individuales y se seleccionaron con puromicina durante 4 días. Para la selección con HAT, se sembraron 3x105 células en placas de 6 pocillos y se seleccionaron en medio que contenía 1X HAT (GIBCO) durante 1 semana, seguido por obtención de imágenes de células vivas usando un microscopio Zeiss Axiovert 200.

FISH de ARN

Se realizaron experimentos de FISH de ARN (véase la Tabla 2 para fuentes de molde de ADNc para sondas). Se visualizaron células en un microscopio confocal Leica DM IRE2. Para la cuantificación, se contaron 100-500 células totales de al menos 10 campos diferentes y se puntuaron; solo se incluyeron en el análisis células con una señal de FISH de ARN detectable, con la excepción del experimento en la FIG. 3A. Se ajustaron coherentemente las imágenes para contraste y brillo usando el software AxioVision (Zeiss). Todos los experimentos de FISH de ARN se realizaron al menos dos veces, y se muestran imágenes representativas y la cuantificación de un experimento. Ensayo de fosfatasa alcalina

Se trataron células ES en presencia o ausencia de ácido retinoico (véase anteriormente) y se analizaron usando un kit de tinción con fosfatasa alcalina (Stemgent).

RT-PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR)

Se aisló ARN total y se retrotranscribió usando la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). Se realizó qRT-PCR como se describió previamente usando los cebadores listados en la Tabla 2. Para los experimentos mostrados en la FIG. 3F y 3H y FIG. 10B y C, se realizó la síntesis de ADNc específica de cadena de ARNs de Xist y/o Tsix como se ha descrito previamente, y se normalizaron la expresión de Xist y Tsix a la de Gapdh.

Nucleofección de ácido nucleico bloqueado (LNA)

Se añadieron LNAs de Xist marcados con Cy3 y de control (mezclados) a 104 células BMSL2 a una concentración final de 1 pM en OptiMem usando Lipofectamine (Invitrogen) cada 6-8 h durante 48 h.

Ensayo de ChIP

Se realizaron ensayos de ChIP como se ha descrito previamente usando extractos preparados 7 días después de la transducción retroviral y selección con puromicina, y anticuerpos contra DNMT1 o POL2 (Abcam). Las secuencias de cebadores usadas para amplificar productos de ChIP se enumeran en la Tabla 2.

Ensayo de transcripción nuclear iniciada

Se realizaron ensayos en presencia de [P32]UTP y se aisló ARN radiactivo usando el reactivo TRIzol. Se hibridaron muestras con una membrana de nailon inmovilizada con sondas de ADNc para Xist (preparadas a partir de un plásmido que contiene los exones de Xist 1 y 6; (51)), Hprt (preparado a partir de un plásmido que contiene la región codificante de Hprt amplificada por PCR usando 5'-TCCg CcTc CTCCTCTGCT-3' directo (s Eq ID NO: 114) y 5'-GGGAATTTATTGATTTGCAT-3' inverso (SEQ ID NO: 115) (cebadores) y Tbp (preparado de partir de ADNc de Tbp clonado; Open Biosystems). Después de lavar las membranas, se expusieron los filtros a una pantalla de FosforImager y se cuantificó la señal en un sistema de obtención de imágenes Fujifilm FLA-7000 usando el software Image Gauge V4.22.

Ensayo de estabilidad de ARN de Xist

Después del tratamiento con DNasa (Ambion), se cuantificaron por qRT-PCR los niveles de ARN de Xist específico de cadena, y como control actina (véase la Tabla 2 para las secuencias de cebadores).

Tratamiento con inhibidor químico

Se trataron células ES o BMSL2 de ratón diferenciadas con sulfóxido de dimetilo (DMSO), LY294002 (Cayman Chemicals; 4 o 10 pM), OSU-03012 (Selleck Chemicals; 2,5 o 4 pM), GNE-317 (Genentech Inc., 1,25, 2,5 o 5 pM), GSK650394 (Tocris Bioscience, 5 pM), K02288 (Cayman Chemicals, 0,5 pM) o LDN192189 (Cayman Chemicals, 0,5 pM) durante 3 días antes del análisis de FISH de ARN. Para los experimentos de reversibilidad de XCI, se trataron células BMSL2 con LY294002 8 pM u OSU-030122,5 pM durante 3 días, se lavaron dos veces con PBS y luego se sustituyeron los medios con medio fresco cada día durante al menos 5 días antes del análisis de FISH de ARN.

Se trataron neuronas corticales de ratón, aisladas como se ha descrito anteriormente, con DMSO, BX912 5 pM (Axon Medchem), LY2940020,4 pM o OSU-030122,5 pM durante 4 días antes del análisis de FISH de ARN.

Se trataron fibroblastos de RTT con o DMSO, 5-azacitidina (Calbiochem; 10 pM durante 3 días), BX912 (10 pM durante 3 días), OSU-03012 (10 pM durante 2 días seguido por 5 pM durante 1 día) o VX680 (chemieTek; 10 pM durante 2 días seguido por 3 pM durante 1 día). Se analizaron los niveles de MECP2 no mutante usando los cebadores listados en la Tabla 2.

Secuenciación de ARN y análisis de datos

Se aisló ARN total de MEFs de embriones Stc1+/+ y Stc1-/-(n=3 para cada genotipo) usando el kit RNeasy Plus Mini (Qiagen) y se trató con DNasa I libre Rnasa (Qiagen). Se generaron bibliotecas de ARNm como se describe en la guía de preparación de muestras ARN TruSeq (Illumina).

Se secuenciaron bibliotecas como extremos emparejados de 50 pb usando un Illumina HiSeq 2000. Se recortaron lecturas sin procesar (que variaban desde 47-92 millones de lecturas por muestra) retirando secuencias de adaptador y se desmultiplexaron con códigos de barras. Se retiraron las lecturas con nucleótidos ambiguos y puntuaciones de calidad de Phred <46 antes del ensamblaje. Se alinearon lecturas de secuenciación de extremos emparejados usando TopHat (v2.0.6) contra el ensamblaje de genoma de ratón NCBI38/mm10 (descargado de índices preformados en bowtie-bio.sourceforge.net/) por parámetros por defecto, con la excepción de esperar una distancia interna entre pares de apareamiento de 75 pb en lugar del valor por defecto de 50 pb. Se procesaron las lecturas alineadas por TopHat por Cufflinks (v2.0.1) para ensamblar transcritos y para medir sus abundancias relativas en unidades de FPKM (fragmentos por kilobase de exón por millones de fragmentos mapeados). Se compararon transcritos ensamblados de muestras de control e inactivadas con el transcriptoma descargado de Ensembl.org y se probó para expresión diferencial usando las utilidades Cuffcompare y Cuffdiff en el paquete Cufflinks. Cuffdiff se ejecutó con normalización classic-FPKM y un umbral de tasa de falsos descubrimientos (Fd R) de 0,05. Se consideraron significativos los genes con un cambio >2 veces en la expresión entre muestras de Stc1+/+ y Stc1-/- y P <0,05 (calculado usando Cufflinks).

Se anotaron los resultados de la expresión génica medidos por Cufflinks basándose en un archivo GTF descargado de Ensembl.org usando el paquete ChIPpeakAnno de Bioconductor (55). Todas las figuras se representaron usando el software R/Bioconductor (v2.15.2). Los datos de ARN-Seq se han depositado en Gene Expression Omnibus de NCBI (56) y están accesibles para los críticos mediante el número de acceso de serie de GEO GSE47395 (ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?token=jtslncmggoemsro&acc=GSE47395).

Inmunotransferencia

Se prepararon extractos de células y se probaron las inmunotransferencias usando anticuerpos contra HPRT (Abcam), MECP2 (Abcam), STC1 (Santa Cruz Biotechnology) y a-tubulina.

Ensayo de extensión de cebadores en un único nucleótido (SNuPE)

Se llevó a cabo un ensayo de SNuPE para Pgk1 usando un ensayo de genotipificación de SNP de Taqman (Applied Biosystems) según las especificaciones del fabricante. Se usaron los siguientes cebadores e indicadores para el ensayo: 5'-CCGGCCAAAATTGATGCTTTCC-3' (SEQ ID NO: 116), 5'-CAGTCCCAAAAGCATCATTGACAT-3' (SEQ ID NO: 117), 5'-CACTGTCCAAACTAGG-3' (SEQ ID NO: 118) y 5'-CACTGTCCACACTAGG-3' (SEQ ID NO: 119). Los datos se representan como la función de ARn para cada muestra, que representa la fluorescencia del indicador para cada alelo (VIC/FAM) normalizado al colorante de referencia pasivo.

Análisis de genes sellados

Se cultivaron fibroblastos embrionarios de ratón de la cepa C57BL6 (CAST 7), proporcionados por M. Bartolomei, en DMEM complementado con 10 % de suero de ternero fetal y 10 % de NEAA. Se realizó el análisis de genes sellados usando fibroblastos embrionarios de ratón aislados de la cepa C57BL/6 (CAST7), que contiene el cromosoma 7 de la cepa Mus castaneus (Cast) en un acervo C57BL/6. Brevemente, se extrajo ARN total y se llevó a cabo la síntesis de ADNc como se ha descrito anteriormente. Para la amplificación por PCR, se añadió el ADNc a perlas de PCR Ready-To-Go (GE Life Sciences) junto con cebadores específicos de gen 0,3 pM (Tabla 2). Se analizó la expresión de los genes sellados por digestión con enzima de restricción específica de alelo (StcI para Ascl2, StuI para Kcnq1ot1, MnlI para Peg3 y FauI para Zim1) y los productos de PCR digeridos se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida.

Tabla 2. Lista de cebadores usados para qRT-PCR y análisis por RT-PCR, síntesis de ADNc, ensayos de ChIP y genotipificación de ratones; números ID de oligonucleótidos para ARNhps; y ADNcs usados para preparar sondas de FISH de ARN.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) para su uso en un método de tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad dominante ligada a X, comprendiendo el método:

administrar al sujeto un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) en una cantidad eficaz para inducir la expresión de un gen diana ligado a X, en donde el inhibidor de XCIF inhibe selectivamente la actividad de la cinasa 1/2 de suero y glucocorticoide (SGK1/2).

2. El inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) para su uso según la reivindicación 1, en donde la enfermedad dominante ligada a X resulta de un alelo mutado del gen ligado a X, y en donde el inhibidor se administra en una cantidad eficaz para inducir la expresión de un alelo no mutante del gen ligado a X.

3. El inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) para su uso según la reivindicación 1 o 2, en donde el gen ligado a X es MECP2, opcionalmente en donde el gen ligado a X es MECP2 y la enfermedad ligada a X es síndrome de Rett, o en donde la enfermedad dominante ligada a X se selecciona del grupo que consiste en: hipofosfatemia ligada a X, incontinencia pigmentaria de tipo 2, síndrome de Aicardi, síndrome del CDK5L, hipoplasia dérmica focal, síndrome de CHILD, síndrome de Lujan-Fryns, síndrome orofaciodigital 1, nefritis hereditaria (síndrome de Alport), síndrome de Giuffre-Tsukahara, síndrome de Goltz, síndrome X frágil, síndrome de Bazex-Dupre-Christol, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, condrodisplasia punctata, protoporfiria eritropoyética, miopatía escapuloperoneal y displasia craneofrontonasal.

4. El inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el inhibidor de XCIF es GSK650394 o EMD638683.

5. El inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el inhibidor de XCIF es un oligonucleótido inhibidor que tiene una región de complementariedad que es complementaria con al menos 8 nucleótidos en un ARNm codificado por un gen XCIF, opcionalmente en donde el oligonucleótido inhibidor se selecciona del grupo que consiste en: un oligonucleótido antisentido, un ARNip, ARNhp y miARN, opcionalmente en donde el oligonucleótido inhibidor comprende uno o más nucleótidos modificados, opcionalmente en donde el uno o más nucleótidos modificados es un nucleótido LNA, y opcionalmente en donde el oligonucleótido inhibidor comprende uno o más enlaces internucleosídicos modificados.

6. El inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo el método además:

(i) determinar que el sujeto tiene un alelo mutante del gen ligado a X; y/o

(ii) determinar que la administración del inhibidor de XCIF al sujeto produce:

expresión inducida del gen ligado a X;

expresión inducida de un alelo no mutante del gen ligado a X;

reactivación de un cromosoma X; y/o

disminución de la expresión de XIST.

7. Un método de inducción de la expresión de un gen ligado a X en una célula que tiene un cromosoma X inactivo, comprendiendo el método suministrar a la célula un inhibidor del factor de inactivación de cromosomas X (XCIF) en una cantidad eficaz para inducir la expresión del gen ligado a X, en donde la célula está in vitro, y en donde el inhibidor de XCIF inhibe selectivamente la actividad de la cinasa 1/2 de suero y glucocorticoide (SGK1/2).

8. El método de la reivindicación 7, en donde la célula es de un sujeto que tiene una enfermedad dominante ligada a X resultante de un alelo mutado del gen ligado a X, opcionalmente en donde el gen ligado a X es MECP2 o en donde el gen ligado a X es MECP2 y la enfermedad ligada a X es síndrome de Rett, o en donde la enfermedad dominante ligada a X se selecciona del grupo que consiste en:

hipofosfatemia ligada a X, incontinencia pigmentaria de tipo 2, síndrome de Aicardi, síndrome del CDK5L, hipoplasia dérmica focal, síndrome de CHILD, síndrome de Lujan-Fryns, síndrome orofaciodigital 1, nefritis hereditaria (síndrome de Alport), síndrome de Giuffre-Tsukahara, síndrome de Goltz, síndrome X frágil, síndrome de Bazex-Dupre-Christol, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, condrodisplasia punctata, protoporfiria eritropoyética, miopatía escapuloperoneal y displasia craneofrontonasal.

9. El método de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde el inhibidor de XCIF es GSK650394 o EMD638683.

10. El método de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde el inhibidor de XCIF es un oligonucleótido inhibidor que tiene una región de complementariedad que es complementaria con al menos 8 nucleótidos de un ARNm codificado por un gen XCIF, opcionalmente en donde el oligonucleótido inhibidor se selecciona del grupo que consiste en: oligonucleótido antisentido, ARNip, ARNhp y miARN, opcionalmente en donde el oligonucleótido inhibidor comprende uno o más nucleótidos modificados, opcionalmente en donde el uno o más nucleótidos modificados es un nucleótido LNA, y opcionalmente en donde el oligonucleótido inhibidor comprende uno o más enlaces internucleosídicos modificados.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10 que comprende además:

(i) determinar que la célula tiene un alelo mutante del gen ligado a X; y/o

(ii) determinar que la administración del inhibidor de XCIF a la célula produce:

expresión inducida del gen ligado a X;

expresión inducida de un alelo no mutante del gen ligado a X;

reactivación de un cromosoma X; y/o;

disminución de la expresión o actividad de XIST.