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ES2791249T3 - Agentes de enlace CD123 y sus utilizaciones - Google Patents

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ES2791249T3
ES2791249T3 ES15766973T ES15766973T ES2791249T3 ES 2791249 T3 ES2791249 T3 ES 2791249T3 ES 15766973 T ES15766973 T ES 15766973T ES 15766973 T ES15766973 T ES 15766973T ES 2791249 T3 ES2791249 T3 ES 2791249T3
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Francois Gaudet
Ricardo Attar
Benjamin C Harman
Yingzhe Li
Jinquan Luo
Ronan Mcdaid
Steven C Pomerantz
Susan H Tam
Alexey Teplyakov
John Wheeler
Sheng-Jiun Wu
Jennifer F Nemeth
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Janssen Pharmaceutica NV
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Janssen Pharmaceutica NV
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Abstract

Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tiene: a. una cadena pesada CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 012, una cadena pesada CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 013, una cadena pesada CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 014, una cadena ligera CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 015, una cadena ligera CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 016, y una cadena ligera CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 017; o b. una cadena pesada CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 051, una cadena pesada CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 052, una cadena pesada CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 053, una cadena ligera CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 024, una cadena ligera CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 025, y una cadena ligera CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 054.

Description

DESCRIPCIÓN
Agentes de enlace CD123 y sus utilizaciones
CAMPO TÉCNICO
[0001] La descripción proporcionada en este documento se refiere a anticuerpos monoclonales que se unen inmunoespecíficamente al determinante de agrupación 123 (CD123; también conocido como IL-3Ra), anticuerpos multiespecíficos que se unen inmunoespecíficamente a CD123 y al determinante de agrupación 3 (CD3), y métodos de producción y utilizando los anticuerpos descritos.
ANTECEDENTES
[0002] Aproximadamente cada tres minutos, se realiza un nuevo diagnóstico de cáncer de sangre. Los cánceres de sangre más comunes son leucemia, linfoma y mieloma, que representarán a 156,420 personas nuevas que serán diagnosticadas en los Estados Unidos en 2014. Aproximadamente cada 10 minutos, alguien en los Estados Unidos muere de un cáncer de sangre. Cánceres de sangre Son enfermedades que pueden afectar la médula ósea, las células sanguíneas, los ganglios linfáticos y otras partes del sistema linfático. Estos cánceres se dirigen desproporcionadamente a los jóvenes, siendo la leucemia el tipo de cáncer más común en niños y adolescentes menores de 20 años.
[0003] Un tipo de célula de cáncer de sangre expresa un marcador celular conocido como CD123 (IL-3Ra). Los ejemplos de células de cáncer de sangre que expresan CD123 incluyen blastos y células madre de leucemia. Las enfermedades asociadas con la expresión de CD123 incluyen leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD; riesgo bajo y alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, todos los subtipos), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) y neoplasia de células dendríticas plasmacitoides blásticas (DPDCN).
[0004] El documento EP2426148 (A1) describe un anticuerpo contra la cadena IL-3R± humana, que no inhibe la señalización de IL-3 y se une al dominio B de la cadena IL-3R± humana, pero no se une al dominio C de la cadena IL-3R± humana.
[0005] Actualmente, los tratamientos para estas enfermedades incluyen más de 50 fármacos individuales con otros en estudio y en ensayos clínicos. La radioterapia (RT) también se usa comúnmente para tratar el cáncer de sangre y, a veces, se administra junto con la farmacoterapia. También se utilizan inmunoterapia, terapia génica y medicina personalizada. Sin embargo, estas terapias pueden tener efectos secundarios significativos y reacciones adversas. Por lo tanto, existe la necesidad de tratamientos nuevos y mejorados para los cánceres de sangre que expresan CD123 (IL-3Ra).
RESUMEN
[0006] En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tiene:
a. una cadena pesada CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 012, una cadena pesada CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 013, una cadena pesada CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 014, una cadena ligera CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 015, una cadena ligera CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 016, y una cadena ligera CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 017; o
b. una cadena pesada CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 051, una cadena pesada CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 052, una cadena pesada CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 053, una cadena ligera CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 024, una cadena ligera CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 025, y una cadena ligera CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 054.
[0007] En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico aislado CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión a antígeno que comprende una primera cadena pesada (HC1), una segunda cadena pesada (HC2), una primera cadena ligera (LC1) y una segunda cadena ligera (LC2), de modo que e1HC1 y el LC1 se unan para formar un primer sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD123 (IL3-Ra), y el par HC2 y LC2 para formar un segundo sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3, o un fragmento de unión biespecífico de CD123 (IL3-Ra) x CD3 del mismo, en donde:
i) HC1 y LC1 comprenden de los siguientes pares:
a. SEQ ID NO: 203 y SEQ ID NO: 204, o
b. SEQ ID NO: 205 y SEQ ID NO: 206, respectivamente; y
ii) HC2 y LC2 comprenden cualquiera de los siguientes pares:
a. SEQ ID NO: 193 : 194,
b. SEQ ID NO: 195 : 196,
c. SEQ ID NO: 197 : 198,
d. SEQ ID NO: 199 : 200, o
e. SEQ ID NO: 201
Figure imgf000003_0001
: 202, respectivamente.
[0008] En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico aislado CD123 (IL3-Ra) x CD3 o un fragmento biespecífico de unión CD123 (IL3-Ra) x CD3 que comprende: a) una primera cadena pesada (HC1); b) una segunda cadena pesada (HC2); c) una primera cadena ligera (LC1); y d) una segunda cadena ligera (LC2), en donde el HC1 y el LC1 se emparejan para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD123 (IL3-Ra), y el HC2 y el LC2 se unen para formar un segundo sitio de unión de antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3, en donde
a. en la cadena pesada y ligera emparejada que se une inmunoespecíficamente a CD3, dicha cadena pesada (HC2) comprende SEQ ID NO: 184 y dicha cadena ligera (LC2) comprende SEQ ID NO: 190, y b. en la cadena pesada y ligera emparejada que se une inmunoespecíficamente a CD123,
i. dicha cadena pesada (HC1) comprende SEQ ID NO: 120 y dicha cadena ligera (LC1) comprende SEQ ID NO: 165, o
ii. dicha cadena pesada (HC1) comprende SEQ ID NO: 136 y dicha LC1 cadena ligera) comprende la SEQ ID NO: 168.
[0009] En un aspecto, la invención se refiere a una célula aislada que expresa un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
[0010] En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención para uso en un método de tratamiento de cáncer.
[0011] En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífico para uso en un método para inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas, en donde el método comprende: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífico para inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas.
[0012] En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífico para uso en un método para redirigir una célula T a una célula de cáncer de expresión de CD123, donde el método comprende: administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífico para redirigir una célula T a un cáncer.
[0013] En un aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífica y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
[0014] En un aspecto, la invención se refiere a un polinucleótido sintético aislado que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo.
[0015] En un aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la presente invención, y el embalaje para el mismo.
[0016] En el presente documento se proporcionan anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a CD123 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. También se describen polinucleótidos relacionados capaces de codificar los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno específicos de CD123 proporcionados, células que expresan los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno proporcionados, así como vectores asociados y anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno marcados de forma detectable. Además, se describen métodos para usar los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno proporcionados. Por ejemplo, los anticuerpos específicos de CD123 y los fragmentos de unión a antígeno pueden usarse para diagnosticar o controlar la progresión, regresión o estabilidad del cáncer que expresa CD123; para determinar si un paciente debe ser tratado por cáncer o no; o para determinar si un sujeto está o no afectado con cáncer que expresa CD123 y, por lo tanto, puede ser susceptible de tratamiento con un agente terapéutico anticancerígeno específico de CD123, tal como los anticuerpos multiespecíficos contra CD123 y CD3 descritos aquí.
[0017] Además se proporcionan en el presente documento anticuerpos multiespecíficos que se unen inmunoespecíficamente a CD123 y CD3 y fragmentos de unión a antígeno de los mismos multiespecíficos. También se describen polinucleótidos relacionados capaces de codificar los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 proporcionados, las células que expresan los anticuerpos proporcionados, así como los vectores asociados y los anticuerpos multiespecíficos marcados de forma detectable. Además, se describen métodos para usar los anticuerpos multiespecíficos proporcionados. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 pueden usarse para diagnosticar o controlar la progresión, regresión o estabilidad del cáncer que expresa CD123; para determinar si un paciente debe ser tratado por cáncer o no; o para determinar si un sujeto está o no afectado con cáncer que expresa CD123 y, por lo tanto, puede ser susceptible de tratamiento con un tratamiento anticancerígeno específico de CD123, tal como los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos aquí.
Anticuerpos específicos a CD123
[0018] Descritos en este documento son anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno específicos para CD123. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de CD123 y los fragmentos de unión a antígeno se unen a CD123 humano SP1 (SEQ ID NO: 1). En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de CD123 y los fragmentos de unión a antígeno se unen a CD123 humano SP2 (SEQ ID NO: 2). En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de CD123 y los fragmentos de unión a antígeno se unen a CD123 humano SP1 y SP2. En algunas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno específicos de CD123 se unen a CD123 SP1 humano y CD123 de mono cynomolgus (SEQ ID NO: 3). En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos de CD123 y los fragmentos de unión a antígeno se unen a un epítopo que incluye uno o más residuos de (i) el segmento del dominio extracelular (ECD) CD123 SP2 que comprende los residuos 195 - 202 (RARERVYE (SeQ ID NO: 234)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 156-161 (RKFRYE (SEQ iD NO: 232)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 173-178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)) o (ii) el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 164-175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 184-189 (LLNPGT (SEQ ID nO: 229)). Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x0-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos.
[0019] En algunas realizaciones, el anticuerpo específico a CD123 o fragmento de unión a antígeno compite para la unión a CD123 con un anticuerpo específico a CD123 o fragmento de unión a antígeno que se une a un epítopo que incluye uno o más residuos de (i) el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 195-202 (RARERVYE (SeQ ID NO: 234)) o (ii) el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 164-175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)). Los anticuerpos o fragmentos que se unen a al menos un residuo en estos epítopos también pueden unirse a residuos adicionales en el ECD de CD123 que incluyen uno o más residuos de (i) el segmento de ECD de CD123 SP2 que comprende los residuos 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 173-178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)) o ii) uno o más residuos forman el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 184-189 (LLNPgT (SEQ ID NO: 229)). Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos.
[0020] En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 y fragmentos de unión a antígeno, tales como los discutidos en los dos párrafos anteriores, son anticuerpos neutralizantes. Un anticuerpo neutralizante específico de CD123 o un fragmento de unión a antígeno incluye aquellos que son capaces de inhibir la unión de IL-3 a CD123 según se determina midiendo la disminución de la fosforilación de STAT5 tras la estimulación de células TF-1 con rhIL-3.
[0021] En algunas realizaciones, los anticuerpos específcos a CD3123 y fragmentos de unión a antígeno pueden prevenir la IL-3 de unión al receptor CD123 (IL3Ra)/CD131 (IL3Rb). En otras realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno pueden evitar la asociación de las cadenas a y p del receptor IL3R (CD123 (IL3Ra)/CD131 (IL3Rb)). Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno incluye aquellos que son capaces de inhibir la unión de IL3 y/o de inhibir la heteromerización de CD123/CD133 según se determina midiendo la disminución en la asociación entre CD123 y CD131 y midiendo la pérdida de heteromerización con el aumento de la concentración de anticuerpos. La Tabla 1 proporciona un resumen de ejemplos de algunos anticuerpos específicos a CD123 descritos en este documento:
Tabla 1. Secuencias de CDR de mABs generados de lavado de fagos contra CD123 humano (SEQ ID NO:)
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(Continuación)
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[0022] En algunas realizaciones se proporcionan un anticuerpo específico a CD123, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada que comprende una CDR1, una CDR2, y una CDR3 de cualquiera de los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 descritos en la Tabla 1. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo específico para CD123, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cualquiera de los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 descritos en la Tabla 1 y una cadena ligera que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cualquiera de los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 descritos en la Tabla 1. En algunas realizaciones descritas aquí, el anticuerpo específico a CD123 o fragmento de unión a antígeno del mismo compite por unirse a CD123 con un anticuerpo o unión a antígeno que comprende una cadena pesada que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cualquiera de los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 descritos en la Tabla 1 y una cadena ligera que comprende una CDR1, una CDR2, y una CDR3 de una cualquiera de los anticuerpos I3RB2 y I3RB18 descritos en la Tabla 1.
[0023] La clase IgG se divide en cuatro isotipos: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en seres humanos. Comparten más del 95% de homología en las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc, pero muestran diferencias importantes en la composición y estructura de aminoácidos de la región bisagra. La región Fc media en funciones efectoras, como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En ADCC, la región Fc de un anticuerpo se une a los receptores Fc (FcgR) en la superficie de las células efectoras inmunes, como los matadores y los macrófagos naturales, lo que conduce a la fagocitosis o la lisis de las células diana. En los CDC, los anticuerpos matan las células diana activando la cascada del complemento en la superficie celular. Los anticuerpos descritos en el presente documento incluyen anticuerpos con las características descritas de los dominios variables en combinación con cualquiera de los isotipos de IgG, incluidas las versiones modificadas en las que la secuencia Fc se ha modificado para efectuar diferentes funciones efectoras.
[0024] Para muchas aplicaciones de anticuerpos terapéuticos, las funciones efectoras mediadas por Fc no son parte del mecanismo de acción. Estas funciones efectoras mediadas por Fc pueden ser perjudiciales y potencialmente representan un riesgo de seguridad al causar toxicidad fuera del mecanismo. La modificación de las funciones efectoras se puede lograr mediante la ingeniería de las regiones Fc para reducir su unión a FcgR o los factores del complemento. La unión de IgG a los FcgR activadores (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa y FcgRIIIb) e inhibidores (FcgRIIb) o al primer componente del complemento (C1 q) depende de los residuos ubicados en la región de la bisagra y el dominio CH2. Se han introducido mutaciones en IgG1, IgG2 e IgG4 para reducir o silenciar las funcionalidades de Fc. Los anticuerpos descritos en este documento pueden incluir estas modificaciones.
[0025] En una realización, el anticuerpo comprende una región Fc con una o más de las siguientes propiedades: (a) reducción de la función efectora en comparación con el padre Fc; (b) afinidad reducida a Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb y/o Fcg RIIIa, (c) afinidad reducida a FcgRI (d) afinidad reducida a FcgRIIa (e) afinidad reducida a FcgRIIb, (f) afinidad reducida a Fcg RIIIb o (g) afinidad reducida a cgRIIIa.
[0026] En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno son IgG, o sus derivados, por ejemplo, isotipos IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. En algunas realizaciones en las que el anticuerpo tiene un isotipo IgG 1, el anticuerpo contiene L234A, L235A y/o sustituciones de K409R en su región Fc. En algunas realizaciones en las que el anticuerpo tiene un isotipo IgG4, el anticuerpo contiene sustituciones S228P, L234A y L235A en su región Fc. Los anticuerpos descritos en este documento pueden incluir estas modificaciones.
[0027] En algunas realizaciones, los anticuerpos descritos son capaces de unirse a CD123 con una constante de disociación de 5 nM o menos, medido por resonancia de plasmón superficial (SPR). En algunas realizaciones, los anticuerpos comprenden las CDR de los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 presentados en la Tabla 1 anterior. Los ensayos para medir la afinidad por SPR incluyen ensayos realizados con una máquina BIAcore 3000 o Biacore T200, donde el ensayo se realiza a temperatura ambiente (p. ej. a o cerca de 25°C), en donde el anticuerpo capaz de unirse a CD123 se captura en el chip sensor BIAcore por un anticuerpo anti-Fc (p. ej, anticuerpo específico de IgG Fc anti-humano de cabra Jackson ImmunoResearch Laboratories Prod n° 109-005-098) a un nivel de alrededor de 75RU, seguido de la recopilación de datos de asociación y disociación a una velocidad de flujo de 40 pl/min.
[0028] Además de los anticuerpos específicos a CD123 descritos y fragmentos de unión a antígeno, también se proporcionan secuencias de polinucleótidos capaces de codificar los anticuerpos descritos y fragmentos de unión a antígeno. También se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos descritos, al igual que las células que expresan los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno proporcionados aquí. También se describen células capaces de expresar los vectores descritos. Estas células pueden ser células de mamíferos (como células 293F, células CHO), células de insectos (como células Sf7), células de levadura, células vegetales o células bacterianas (como E. coli). Los anticuerpos descritos también pueden ser producidos por células de hibridoma.
Métodos de uso de anticuerpos específicos a CD123
[0029] También se describen métodos para usar los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos. Los anticuerpos particulares para uso en los métodos discutidos en esta sección incluyen aquellos con el conjunto de CDR descritos para los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 en la Tabla 1 anterior o anticuerpos que compiten por unirse al CD123 con uno de los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 en la Tabla 1. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno de la invención pueden ser útiles en un método para tratar el cáncer, inhibiendo un efecto biológico de IL-3 evitando que IL-3 se una a IL-3R o cuando el anticuerpo se conjuga con una toxina, por lo que dirigir la toxina al cáncer que expresa CD123. Además, estos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden ser útiles para detectar la presencia de CD123 en una muestra biológica, tal como sangre o suero; para cuantificar la cantidad de CD123 en una muestra biológica, como sangre o suero; para uso en un método de diagnóstico de cáncer que expresa CD123; determinar un método para tratar a un sujeto afectado por cáncer; o monitorear la progresión del cáncer que expresa CD123 en un sujeto. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa CD123 puede ser un cáncer hematológico, como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma de células B grandes difusas (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN). Los métodos descritos pueden llevarse a cabo antes de que el sujeto reciba tratamiento para el cáncer que expresa CD123, como el tratamiento con un anticuerpo multiespecífico contra CD123 y CD3. Además, los métodos descritos pueden llevarse a cabo después de que el sujeto recibe tratamiento para el cáncer que expresa CD123, tal como el tratamiento con un anticuerpo multiespecífico contra CD123 y CD3 descrito en este documento.
[0030] Los métodos de detección de CD123 descritos en una muestra biológica incluyen la exposición de la muestra biológica para uno o más de los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno aquí descritos.
[0031] Los métodos descritos de diagnóstico de cáncer de expresión de CD123 en un sujeto también implican la exposición de la muestra biológica a uno o más de los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento; sin embargo, los métodos también incluyen cuantificar la cantidad de CD123 presente en la muestra; comparar la cantidad de CD123 presente en la muestra con un estándar conocido o muestra de referencia; y determinar si los niveles de CD123 del sujeto caen dentro de los niveles de CD123 asociados con el cáncer.
[0032] También se describen en la presente memoria los métodos de seguimiento de cáncer de expresión de 123 en un sujeto. Los métodos descritos incluyen exponer la muestra biológica a uno o más de los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos aquí; cuantificar la cantidad de CD123 presente en la muestra que está unida por el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo; comparar la cantidad de CD123 presente en la muestra con un estándar conocido o muestra de referencia o la cantidad de CD123 en una muestra similar obtenida previamente del sujeto; y determinar si los niveles de CD123 de los sujetos son indicativos de progresión del cáncer, regresión o enfermedad estable en función de la diferencia en la cantidad de CD123 en las muestras comparadas.
[0033] Las muestras obtenidas o derivadas de los sujetos son muestras biológicas tales como orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, las células tumorales circulantes, células que no son tejido asociado, tejidos, tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, muestras de aspiración con aguja fina o preparaciones histológicas.
[0034] Los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos pueden estar marcados para su uso con los métodos descritos, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos descritos en este documento, o sus fragmentos de unión a antígeno, pueden marcarse con un radiomarcador, una etiqueta fluorescente, una etiqueta de epítopo, biotina, una etiqueta de cromóforo, una etiqueta de ECL, una enzima, rutenio, 111In-DOTA, ácido 111In-dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa, o poli-histidina o etiquetas similares conocidas en la técnica.
Kits de anticuerpos específicos a CD123
[0035] Se describen aquí kits que incluyen los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos de los mismos. Los kits descritos pueden usarse para llevar a cabo los métodos de uso de los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno proporcionados en este documento, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, los kits descritos pueden incluir los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos aquí y reactivos para su uso en la detección de la presencia de CD123 en una muestra biológica. Por consiguiente, los kits descritos pueden incluir uno o más de los anticuerpos, o uno o más fragmentos de unión a antígeno de los mismos, descritos en este documento y un recipiente para contener el anticuerpo o fragmento cuando no está en uso, instrucciones para el uso del anticuerpo o fragmento, el anticuerpo o fragmento fijado a un soporte sólido, y/o formas marcadas de forma detectable del anticuerpo o fragmento, como se describe en el presente documento.
Anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3
[0036] Se describen aquí anticuerpos multiespecíficos aislados que se unen CD123 y CD3 (“anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3") y fragmentos de unión a antígeno de los mismos multiespecíficos. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a CD123 SP2 (IL3-Ra) y CD123 SP1 (IL3-Ra).
[0037] En algunas realizaciones, el brazo específico a CD123 del anticuerpo multiespecífico se une el CD123 humano y/o CD123 de mono cynomolgus. En algunas realizaciones, el brazo específico de CD123 de los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 o fragmentos de unión a antígeno se une al fragmento SP1 y/o SP2 del CD123 humano. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 o fragmento de unión a antígeno es un anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, un anticuerpo biespecífico aislado CD123 (IL3-Ra) x CD3 que comprende: a) una primera cadena pesada (HC1); b) una segunda cadena pesada (HC2); c) una primera cadena ligera (LC1); y d) una segunda cadena ligera (LC2), en donde e1HC1 y el LC1 se emparejan para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD123 (IL3-Ra), y e1HC2 y el LC2 se unen para formar un segundo sitio de antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3, o se proporciona un fragmento de unión biespecífico del mismo CD123 (IL3-Ra) x CD3. En otra realización, se proporciona una célula aislada que expresa el anticuerpo o fragmento de unión biespecífico. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD123 (o "brazo específico de CD123") del anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 se deriva de un anticuerpo CD123 descrito en el presente documento (por ejemplo, de un anticuerpo I3RB2 o I3RB18 que tiene las secuencias CDR enumeradas en la Tabla 1).
[0038] En algunas realizaciones, el brazo específico a CD123 de los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 o fragmentos de unión a antígeno son IgG, o derivados de los mismos. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos son capaces de unirse a CD123 con una constante de disociación de 5 nM o menos medida por resonancia de plasmón superficial o MSD-CAT.
[0039] En algunas realizaciones, el brazo CD3 vinculante (o "brazo específico a CD3") de los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 se deriva del anticuerpo monoclonal SP34 de ratón, un isotipo IgG3/lambda de ratón. (Pessano, S., et al., 1995. EMBO J. 4, 337-344). En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 del anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 comprende un dominio VH y un dominio VL seleccionado de la Tabla 2. La Tabla 2 proporciona un resumen de ejemplos de algunas cadenas pesadas y cadenas ligeras de los anticuerpos específicos de CD3 y fragmentos de unión a antígeno.
Tabla 2. Cadenas pesadas y cadenas ligeras de los anticuerpos específicos de CD3 y fragmentos de unión a antígeno.
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[0040] En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD3 y fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada de la Tabla 3 y una cadena ligera de la Tabla 3. La Tabla 3 proporciona un resumen de la matriz de las cadenas pesadas y cadenas ligeras de los anticuerpos específicos de CD3 y fragmentos de unión a antígeno.
Tabla 3. Los anticuerpos creados mediante la combinación de las cadenas pesada y ligera.
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[0041] La clase IgG se divide en cuatro isotipos: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 en seres humanos. Comparten más del 95% de homología en las secuencias de aminoácidos de las regiones Fc, pero muestran diferencias importantes en la composición y estructura de aminoácidos de la región bisagra. La región Fc media en funciones efectoras, como la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). En ADCC, la región Fc de un anticuerpo se une a los receptores Fc (FcgR) en la superficie de las células efectoras inmunes, como los matadores y los macrófagos naturales, lo que conduce a la fagocitosis o la lisis de las células diana. En los CDC, los anticuerpos matan las células diana activando la cascada del complemento en la superficie celular.
[0042] Para muchas aplicaciones de anticuerpos terapéuticos, las funciones efectoras mediadas por Fc no son parte del mecanismo de acción. Estas funciones efectoras mediadas por Fc pueden ser perjudiciales y potencialmente representan un riesgo de seguridad al causar toxicidad fuera del mecanismo. La modificación de las funciones efectoras se puede lograr mediante la ingeniería de las regiones Fc para reducir su unión a FcgR o los factores del complemento. La unión de IgG a los FcgR activadores (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa y FcgRIIIb) e inhibidores (FcgRIIb) o al primer componente del complemento (C1 q) depende de los residuos ubicados en la región de la bisagra y el dominio CH2. Se han introducido mutaciones en IgG1, IgG2 e IgG4 para reducir o silenciar las funcionalidades de Fc. Las mutaciones silenciadoras pueden incluir, entre otras, IgG 1 AA (F234A, L235A) o IgG4 PAA (S228P, F234A, L235A), o IgG2 AA (V234A, G237A) o IgG1 FEA (L234F, L235E, D265A), o IgG1 FES (L234F/L235E/P331S).
[0043] En una realización, el anticuerpo comprende una región Fc con una o más de las siguientes propiedades: (a) reducción de la función efectora en comparación con el padre Fc; (b) afinidad reducida a Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb y/o Fcg RIIIa, (c) afinidad reducida a FcgRI (d) afinidad reducida a FcgRIIa (e) afinidad reducida a FcgRIIb, (f) afinidad reducida a Fcg RIIIb o (g) afinidad reducida a FcgRIIIa.
[0044] En algunas realizaciones, el anticuerpo específico a CD3 o fragmento de unión al antígeno del que se deriva el brazo específico a CD3 del anticuerpo multiespecífico es IgG, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o fragmento de unión a antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico es IgG1, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, por ejemplo, la región Fc del anticuerpo IgG 1 específico de CD3 del que se deriva el brazo de unión a CD3 comprende sustituciones L234A, L235A y F405L en su región Fc. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o el fragmento de unión a antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico es IgG4, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, por ejemplo, la región Fc del anticuerpo IgG4 específico de CD3 del que se deriva el brazo de unión a CD3 comprende sustituciones S228P, L234A, L235A, F405L y R409K en su región Fc. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o el fragmento de unión a antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico es IgG-AA Fc. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o el fragmento de unión a antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico es IgG-AA Fc-L234A, L235A y F405L (donde L234A, L235A y F405L son mutaciones). En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o el fragmento de unión a antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico se une a CD3s en células T humanas primarias y/o células T de cynomolgus primario. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de CD3 o el fragmento de unión a antígeno del que se deriva el brazo específico de CD3 del anticuerpo multiespecífico activa las células T CD4+ humanas primarias y/o las células T CD4+ cynomolgus primarias. En algunas realizaciones, los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos son capaces de unirse a CD3 en células T de mono humano o cynomolgus con una constante de disociación de menos de 500, o menos de 100 o menos de 20 nM según lo determinado por la unión competitiva con un anticuerpo anti-CD3 marcado con afinidad conocida.
[0045] Además de los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos, también se proporcionan secuencias de polinucleótidos capaces de codificar anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos. En algunas realizaciones, se proporciona un polinucleótido sintético aislado que codifica el HC1, e1 HC2, el LC1 o el LC2 del anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífico. También se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos descritos, al igual que las células que expresan los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 proporcionados aquí. También se describen células capaces de expresar los vectores descritos. Estas células pueden ser células de mamíferos (como células 293F, células CHO), células de insectos (como células Sf7), células de levadura, células vegetales o células bacterianas (como E. coli). Los anticuerpos descritos también pueden ser producidos por células de hibridoma. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos para generar el anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o el fragmento de unión biespecífico mediante el cultivo de células.
[0046] Además se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos multiespecíficos CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmentos de unión a antígeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Métodos para usar anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3
[0047] También se describen métodos para usar los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos y sus fragmentos de unión a antígeno multiespecíficos. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 y sus fragmentos de unión a antígeno multiespecíficos pueden ser útiles en el tratamiento de un cáncer que expresa CD123 en un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa CD123 es un cáncer hematológico, como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), células B grandes difusas linfoma (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DP-DCN).
[0048] Los métodos descritos para el tratamiento de cáncer de expresión de CD123 en un sujeto en necesidad del mismo incluyen administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 descrito o fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano. En realizaciones preferidas se proporcionan métodos para tratar a un sujeto que tiene cáncer mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión a antígeno biespecífico a un paciente que lo necesite durante un tiempo suficiente para tratar el cáncer.
[0049] Además se proporcionan en este documento procedimientos para inhibir el crecimiento o proliferación de células de cáncer mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífico para inhibir el crecimiento o proliferación de células cancerosas.
[0050] También se proporcionan en este documento métodos de reorientación de una célula T a una célula de cáncer de expresión de CD123 mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífico para redirigir una célula T a una cáncer.
Kits de anticuerpos específicos a CD123 x CD3
[0051] Se describen aquí kits que incluyen los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos. Los kits descritos pueden usarse para llevar a cabo los métodos de uso de los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 proporcionados en este documento, u otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, los kits descritos pueden incluir los anticuerpos descritos en este documento y reactivos para su uso en el tratamiento de un cáncer que expresa CD123. En consecuencia, los kits descritos pueden incluir uno o más de los anticuerpos multiespecíficos, o uno o varios fragmentos de unión a antígenos multiespecíficos, descritos aquí y un recipiente para contener el anticuerpo o fragmento cuando no está en uso, y/o instrucciones para el uso del anticuerpo o fragmento, el anticuerpo o fragmento fijado a un soporte sólido, y/o formas marcadas de forma detectable del anticuerpo o fragmento, como se describe en el presente documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0052]
Figura 1. La Figura 1 muestra el vector pDisplay utilizado para la clonación de dominios extracelulares CD123. Figura 2. La Figura 2 (Figura 2A, Figura 2B y Figura 2C) muestra un ensayo de unión celular que demostró el potencial de unión de los ligantes positivos del panel de fagos a las células que expresan CD123.
Figura 3. La Figura 3 muestra un ELISA de competencia entre el panel de anticuerpos y el anticuerpo anti-CD 1237G3.
Figura 4. La Figura 4 (Figura 4A y Figura 4B) muestra un ensayo funcional STAT5 basado en células CD123. La Figura 4C muestra un ensayo funcional STAT5 basado en células CD123 dependiente de la dosis para anticuerpos I3RB18 y 7G3.
Figura 5. La Figura 5 (Figura 5A, Figura 5B y Figura 5C) muestra la unión de Mabs I3RB2, I3RB18 y 7G3 a CD123 endógeno expresado en la línea celular AML, OCI-AML5.
Figura 6. La Figura 6 (Figura 6A y Figura 6B) muestra un ensayo de unión competitiva entre los mAb I3RB2 e I3RB18 marcados y otros Abs anti-CD 123 identificados en la pantalla.
Figura 7. La Figura 7 (Figura 7A (SEQ ID NO: 232) y Figura 7B (SEQ ID NO: 232)) muestra los resultados de los estudios de mapeo de epítopos por espectrometría de masas de intercambio de hidrógeno/deuterio (HDX-MS) que muestran diferencias en niveles de deuterio para CD123 SP2 en presencia o ausencia de Fab. Figura 8. La Figura 8 muestra los residuos de anticuerpos implicados en la unión de CD123 sp2 observados en la estructura de cocristal del scFv derivado de I3RB18 y eCd de CD123 SP2. Numeración: CD123 sp2 en óvalos; CDR de I3RB18 en cuadrados.
Figura 9. La Figura 9A muestra la estructura de cocristales de CD123 sp2: I3RB18 (B18 etiquetada) y la Figura 9B muestra la estructura de cocristales de CD123 spl: CSL362 Fab, una forma humanizada de mAb 7G3 de la entrada PDB 4JZJ.
Figura 10. La Figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos de SP34 con numeración secuencial. Las CDR en la definición de AbM (KR Abhinandan y AC Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839) están subrayadas. Ser230 es el último residuo de HC presente en Fab escindido con papaína. Los residuos 231-455 son de IGHG3_MOUSE (IgG3 de ratón, isoforma 2).
Figura 11. La Figura 11 muestra el dominio variable de SP34 con residuos clave en la interfaz VL/VH que se muestra. Los residuos 38, 48 y 51 en VL (etiquetados) están en contacto con CDR-H3.
Figura 12. La Figura 12 muestra las variantes de Adaptación del Marco Humano ("HFA") para Vh (SEQ ID NOS 5 y 184-187, respectivamente, en orden de aparición) y Vl (SEQ ID NOS 4 y 188-190, respectivamente, en orden de aparicion). La numeración es secuencial; CDR en la definición de AbM están subrayados; los residuos que difieren de SP34 se resaltan en negrita; Las mutaciones posteriores en las variantes de HFA están en negrita y subrayadas.
Figura 13. La Figura 13 muestra la unión de variantes de SPFA HFA a células T humanas primarias.
Figura 14. La Figura 14 muestra la unión de las variantes de SPFA HFA a las células T primarias de Cynomolgus. Figura 15. La Figura 15 muestra que las variantes SP34 HFA activan las células T humanas primarias in vitro. Los controles negativos se muestran en blanco y los controles positivos se muestran en negro.
Figura 16. La Figura 16 muestra que las variantes SP34 HFA activan las células T primarias de cynomolgus in vitro. Los controles negativos se muestran en blanco y los controles positivos se muestran en negro. Figura 17. La Figura 17 muestra la correlación de la unión y la activación por las variantes de SP34 HFA. La unión promedio y los valores de intensidad de fluorescencia media de CD69 ("MFI") para humanos (Figura 17A) y cynomolgus (Figura 17B) se representaron entre sí.
Figura 18. La Figura 18 muestra un ensayo de citotoxicidad mediada por células T para el donante M6587 (Figura 18A) y el donante M7020 (Figura 18B) con la línea celular MV4-11.
Figura 19. La Figura 19 muestra un ensayo de citotoxicidad mediada por células T para el donante M6587 (Figura 19A) y el donante M7020 (Figura 19B) con la línea celular OCI-M2.
Figura 20. La Figura 20 muestra un ensayo de citotoxicidad mediada por células T para el donante M6587 (Figura 20A) y el donante M7020 (Figura 20B) con la línea celular OCI-AML.
Figura 21. La Figura 21 muestra la eficacia de I3RB186 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1.
Figura 22. La Figura 22 muestra la eficacia de I3RB186 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 mediante análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de sangre periférica el día 30 en CD45 (Figura 22A) y CD8 /CD4 (Figura 22B).
Figura 23. La Figura 23 muestra la eficacia de I3RB186 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 mediante análisis FACS de sangre periférica en el día 53 después de la implantación del tumor en CD45 (Figura 23A) y CD8 /CD4 (Figura 23B).
Figura 24. La Figura 24 muestra la eficacia de I3RB186 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 al mostrar el cambio de peso corporal con el tratamiento.
Figura 25. La Figura 25 muestra la eficacia de CD123 x CD3 biespecífico Ab I3RB186 con el control nulo biespecífico Abs I3RB191 e I3RB192 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1.
Figura 26. La Figura 26 muestra la eficacia de CD123 x CD3 biespecífico Ab I3RB186 con control nulo biespecífico Abs I3RB191 e I3RB192 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 mediante análisis FACS en el día 36 después de la implantación del tumor en CD45 (Figura 26A) y CD8 /CD4 (Figura 26B).
Figura 27. La Figura 27 muestra la eficacia de CD123 x CD3 biespecífico Ab I3RB186 con control nulo biespecífico Abs I3RB191 e I3RB192 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 mediante análisis FACS en el día 63 después de la implantación del tumor en CD45 (Figura 27A) y CD8 /CD4 (Figura 27B).
Figura 28. La Figura 28 muestra la eficacia de CD123 x CD3 Ab I3RB186 biespecífico con Abs biespecífico de brazo nulo I3RB191 e I3RB192 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 al mostrar el cambio de peso corporal con el tratamiento.
Figura 29. La Figura 29 muestra que las curvas de unión de saturación utilizadas determinan la afinidad de unión celular (Kd) para SP34-2 en células T humanas primarias (Figura 29A) y células T de mono cynomolgus (Figura 29B).
Figura 30. La Figura 30 muestra experimentos de unión competitiva en células T humanas primarias (Figura 30A) y células T de mono cynomolgus (Figura 30B) usando anticuerpos marcados. Alexa FluorR 488B146 y concentraciones crecientes de anticuerpos CD123 x CD3 sin marcar.
Figura 31. La Figura 31 muestra el ensayo de citotoxicidad mediada por células T para el donante M6948 (Figura 31A) y el donante M6521 (Figura 31B) con la línea celular OCI-AML.
Figura 32. La Figura 32 muestra el ensayo de citotoxicidad mediada por células T para el donante M6948 (Figura 32A) y el donante M6521 (Figura 32B) con la línea celular KG-1.
Figura 33. La Figura 33 muestra el ensayo de citotoxicidad mediada por células T para el donante M6948 (Figura 33A) y el donante M6521 (Figura 33B) con la línea celular JIM3.
Figura 34. Las Figuras 34A, B, C y D muestran el efecto de los anticuerpos CD123 x CD3 en la heteromerización inducida por IL-3 de CD123 y CD131 para I3RB218 (Figura 34A), 8747 (Figura 34B), I3RB217 (Figura 34C) y 7959 (Figura 34D).
Figura 35. La Figura 35 muestra la eficacia de CD123 x CD3 Ab 7959 y Ab 9958 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 en comparación con el volumen tumoral medio.
Figura 36. La Figura 36 muestra la eficacia de CD123 x CD3 Ab 3978 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 en comparación con el volumen tumoral medio.
Figura 37. La Figura 37 muestra la eficacia de CD123 x CD3 Ab 8747 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 en comparación con el volumen tumoral medio.
Figura 38. La Figura 38 muestra la eficacia de CD123 x CD3 Ab 8876 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 en comparación con el volumen tumoral medio.
Figura 39. La Figura 39 muestra la eficacia de CD123 x CD3 Ab 7959 y Ab 9958 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 en comparación del cambio de peso corporal con el tratamiento.
Figura 40. La Figura 40 muestra la eficacia de CD123 x CD3 Ab 3978 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 en comparación del cambio de peso corporal con el tratamiento.
Figura 41. La Figura 41 muestra la eficacia de CD123 x CD3 Ab 8747 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 en comparación con el cambio de peso corporal con el tratamiento.
Figura 42. La Figura 42 muestra la eficacia de CD123 x CD3 Ab 8876 en el modelo de xenoinjerto tumoral KG-1 en comparación del cambio de peso corporal con el tratamiento.
Figura 43. La Fig. 43 muestra la PK de ratón in vivo de los anticuerpos biespecíficos CD123 x CD3 3978, 7955, 7959, 9958
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS
Definiciones
[0053] Se usan varios términos relacionados con aspectos de la descripción a lo largo de la memoria descriptiva y las reivindicaciones. Dichos términos deben tener su significado ordinario en la técnica a menos que se indique lo contrario. Otros términos específicamente definidos se deben interpretar de manera consistente con las definiciones proporcionadas en este documento.
[0054] Como se usa en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un”, “una”, “el” y “ella” incluyen plurales referentes a menos que el contenido dicte claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula" incluye una combinación de dos o más celdas, y similares.
[0055] El término "aproximadamente" tal como se usa en el presente documento cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, se entiende que abarca las variaciones de hasta ± 10% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos divulgados. A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades tales como peso molecular, condiciones de reacción, etc., utilizados en la especificación y las reivindicaciones deben entenderse modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la siguiente especificación y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención. Como mínimo, y no como un intento de limitar la aplicación de la doctrina de los equivalentes al alcance de las reivindicaciones, cada parámetro numérico debe al menos interpretarse a la luz del número de dígitos significativos reportados y mediante la aplicación de técnicas de redondeo ordinarias.
[0056] A pesar de que los intervalos y parámetros numéricos que exponen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, se informan los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene de manera inherente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.
[0057] "Aislado" significa que un componente biológico (tal como un ácido nucleico, péptido o proteína) ha sido sustancialmente separado, producido aparte de, o purificado de otros componentes biológicos del organismo en donde se produce naturalmente el componente, es decir, otra ADN y ARN cromosómico y extracromosómico, y proteínas. Los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas que han sido "aislados", por lo tanto, incluyen ácidos nucleicos y proteínas purificadas por métodos de purificación estándar. Los ácidos nucleicos, péptidos y proteínas "aisladas" pueden formar parte de una composición y aún así aislarse si dicha composición no forma parte del entorno nativo del ácido nucleico, péptido o proteína. El término también abarca ácidos nucleicos, péptidos y proteínas preparadas por expresión recombinante en una célula huésped, así como ácidos nucleicos sintetizados químicamente. Un anticuerpo "aislado" o fragmento de unión a antígeno, como se usa en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que está sustancialmente libre de otros anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que específicamente se une a CD123 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CD123). Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de CD123 puede tener reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, por ejemplo de otras especies (como los homólogos de especies de CD123).
[0058] "Polinucleótido" se refiere como sinónimos como "molécula de ácido nucleico", "nucleótidos" o "ácidos nucleicos" se refiere a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, ARN monocatenario y bicatenario y ARN que es una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios o una mezcla de regiones monocatenarias y bicatenarias. Además, "polinucleótido" se refiere a regiones de triple cadena que comprenden ARN o ADN o ambos, ARN y ADN. El término polinucleótido también incluye ADN o ARN que contienen una o más bases modificadas y ADN o ARN con esqueletos modificados por estabilidad o por otras razones. Las bases "modificadas" incluyen, por ejemplo, bases tritiladas y bases inusuales tales como inosina. Se pueden hacer una variedad de modificaciones en el ADN y el ARN; así, el "polinucleótido" abarca formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente como se encuentran típicamente en la naturaleza, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. El "polinucleótido" también abarca cadenas de ácido nucleico relativamente cortas, a menudo denominadas oligonucleótidos.
[0059] El significado de "sustancialmente igual" puede variar dependiendo del contexto en donde se utiliza el término. Debido a la variación de secuencia natural que probablemente exista entre las cadenas pesadas y ligeras y los genes que las codifican, se esperaría encontrar algún nivel de variación dentro de las secuencias de aminoácidos o los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento, con poco o ningún impacto en sus propiedades de unión únicas (p. ej., especificidad y afinidad). Tal expectativa se debe en parte a la degeneración del código genético, así como al éxito evolutivo de las variaciones conservativas de la secuencia de aminoácidos, que no alteran apreciablemente la naturaleza de la proteína codificada. Por consiguiente, en el contexto de secuencias de ácido nucleico, "sustancialmente igual" significa al menos un 65% de identidad entre dos o más secuencias. Preferiblemente, el término se refiere a al menos 70% de identidad entre dos o más secuencias, más preferiblemente al menos 75% de identidad, más preferiblemente al menos 80% de identidad, más preferiblemente al menos 85% de identidad, más preferiblemente al menos 90% de identidad, más preferiblemente al menos 91% de identidad, más preferiblemente al menos 92% de identidad, más preferiblemente al menos 93% de identidad, más preferiblemente al menos 94% de identidad, más preferiblemente al menos 95% de identidad, más preferiblemente al menos 96% de identidad, más preferiblemente al menos 97% de identidad, más preferiblemente al menos 98% de identidad, y más preferiblemente al menos 99% o más de identidad. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que debe introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos puede determinarse, por ejemplo, usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988) que se ha incorporado al programa ALIGN (versión 2,0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se pueden determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970).
[0060] El grado de variación que puede ocurrir dentro de la secuencia de aminoácidos de una proteína sin tener un efecto sustancial sobre la función de la proteína es mucho menor que el de una secuencia de ácido nucleico, ya que los mismos principios de degeneración no se aplican a secuencias de aminoácidos. Por consiguiente, en el contexto de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno, "sustancialmente igual" significa anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que tienen 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos. Otras realizaciones incluyen anticuerpos específicos a CD123, o fragmentos de unión a antígeno, que tienen marco, andamio u otras regiones no vinculantes que no comparten identidad significativa con los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento, pero incorporan una o más CDR u otras secuencias necesarias para conferir unión que son 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a las secuencias descritas aquí. Un "vector" es un replicón, como un plásmido, fago, cósmido o virus en donde otro segmento de ácido nucleico puede insertarse operativamente para provocar la replicación o expresión del segmento.
[0061] Un "clon" es una población de células derivadas de una única célula o ancestro común por mitosis. Una "línea celular" es un clon de una célula primaria que es capaz de un crecimiento estable in vitro durante muchas generaciones. En algunos ejemplos proporcionados aquí, las células se transforman transfectando las células con ADN.
[0062] Los términos "expresar" y "producir" se utilizan como sinónimos en este documento, y se refieren a la biosíntesis de un gen producto. Estos términos abarcan la transcripción de un gen en ARN. Estos términos también abarcan la traducción de ARN a uno o más polipéptidos, y abarcan además todas las modificaciones post-transcripcionales y post-traduccionales que ocurren naturalmente. La expresión o producción de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo puede estar dentro del citoplasma de la célula, o en el medio extracelular tal como el medio de crecimiento de un cultivo celular.
[0063] Los términos "tratar" o "tratamiento" se refieren a cualquier éxito o indicio de éxito en la atenuación o mejora de una lesión, patología o condición, incluyendo cualquier parámetro objetivo o subjetivo tal como reducción, remisión, disminución de los síntomas o la toma de la afección más tolerable para el paciente, ralentizando la tasa de degeneración o declive, haciendo que el punto final de la degeneración sea menos debilitante, mejorando el bienestar físico o mental de un sujeto o prolongando la duración de la supervivencia. El tratamiento puede evaluarse por parámetros objetivos o subjetivos; incluidos los resultados de un examen físico, examen neurológico o evaluaciones psiquiátricas.
[0064] Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo CD123 x CD3 puede variar según factores como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también aquella en donde los efectos terapéuticamente beneficiosos compensan los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo o la porción de anticuerpo.
[0065] "Anticuerpo" se refiere a todos los isotipos de inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD e IgY) que incluyen diversas formas monoméricas, poliméricas y quiméricas, a menos que se especifique lo contrario. El término "anticuerpo" abarca específicamente los anticuerpos policlonales, los anticuerpos monoclonales (mAbs) y los polipéptidos de tipo anticuerpo, tales como anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados.
[0066] Los fragmentos de unión a antígeno son cualquier estructura proteinácea que puede exhibir afinidad de unión por un particular antígeno. Los fragmentos de unión a antígeno incluyen los proporcionados por cualquier técnica conocida, tal como escisión enzimática, síntesis de péptidos y técnicas recombinantes. Algunos fragmentos de unión a antígeno están compuestos por porciones de anticuerpos intactos que retienen la especificidad de unión a antígeno de la molécula de anticuerpo parental. Por ejemplo, los fragmentos de unión a antígeno pueden comprender al menos una región variable (ya sea una región variable de cadena pesada o ligera) o una o más CDR de un anticuerpo que se sabe que se une a un antígeno particular. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno adecuados incluyen, sin limitación, diacuerpos y moléculas de cadena sencilla, así como moléculas Fab, F(ab’)2, Fc, Fabc y Fv, anticuerpos de cadena sencilla (Sc), cadenas ligeras de anticuerpos individuales, cadenas pesadas de anticuerpos individuales, fusiones quiméricas entre cadenas de anticuerpos o CDR y otras proteínas, andamios de proteínas, monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros que consisten en una cadena pesada y una cadena ligera, un fragmento monovalente que consiste en VL, VH, Dominios CL y CH1, o un anticuerpo monovalente como se describe en el documento WO2007059782, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de la bisagra, un fragmento Fd que consiste esencialmente en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste esencialmente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341,544-546 (1989)), que consiste esencialmente en un dominio VH y también llamado anticuerpos de dominio (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov.; 21 (11): 484-90); camélidos o nanocuerpos (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 enero; 5 (1): 111-24); una región determinante de complementariedad aislada (CDR) y similares. Todos los isotipos de anticuerpos pueden usarse para producir fragmentos de unión a antígeno. Además, los fragmentos de unión a antígeno pueden incluir marcos proteicos no proteicos que pueden incorporar con éxito segmentos de polipéptidos en una orientación que confiere afinidad por un antígeno de interés dado, como andamios de proteínas. Los fragmentos de unión a antígeno pueden ser producidos de manera recombinante o producidos por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. La frase "un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo" puede usarse para denotar que un fragmento de unión a antígeno dado incorpora uno o más segmentos de aminoácidos del anticuerpo mencionado en la frase. Cuando se usa en el presente documento en el contexto de dos o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, el término "compite con" o "compite de modo cruzado con" indica que los dos o más anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno compiten por la unión a CD123, por ejemplo, compiten por la unión a CD123 en el ensayo descrito en el Ejemplo 9 Para algunos pares de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno, la competencia o el bloqueo en el ensayo de los Ejemplos solo se observa cuando un anticuerpo está recubierto en la placa y el otro se usa para competir, y no al revés. A menos que el contexto defina o niegue lo contrario, los términos "compite con" o "compite de modo cruzado con" cuando se usan en el presente documento también pretenden cubrir dichos pares de anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno.
[0067] El término "epítopo" significa una proteína determinante capaz de unirse a un anticuerpo específico. Los epítopos generalmente consisten en agrupaciones superficiales de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopos conformacionales y no conformacionales se distinguen porque la unión al primero pero no al segundo se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes. El epítopo puede comprender residuos de aminoácidos directamente implicados en la unión y otros residuos de aminoácidos, que no están directamente implicados en la unión, tales como residuos de aminoácidos que están efectivamente bloqueados o cubiertos por el péptido de unión a antígeno específico (en otras palabras, el el residuo de aminoácido está dentro de la huella del péptido de unión al antígeno específico).
[0068] La "unión específica" o la "unión inmunoespecífica" o derivados de los mismos cuando se usan en el contexto de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos, representan la unión a través de dominios codificados por genes de inmunoglobulina o fragmentos de genes de inmunoglobulina a uno o más epítopos de una proteína de interés, sin unir preferentemente otras moléculas en una muestra que contiene una población mixta de moléculas. Típicamente, se une un anticuerpo a un antígeno relacionado con una Kd de menos de aproximadamente 1x10-8 M, como se mide mediante un ensayo de resonancia de plasmón de superficie o un ensayo de unión celular. Las frases como el anticuerpo "[antígeno] específico" (p. ej., anticuerpo específico de CD123) pretenden transmitir que el anticuerpo recitado se une específicamente al antígeno recitado.
[0069] El término "kd " (seg -1), como se usa aquí, se refiere a la constante de velocidad de disociación de una interacción particular de antígeno-anticuerpo. Dicho valor también se conoce como el valor koff.
[0070] El término "ka" (M-1 seg-1), como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de velocidad de asociación de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.
[0071] El término "Kd" (M), como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación de equilibrio de una interacción de anticuerpo-antígeno particular.
[0072] El término "Ka" (M1), como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de asociación de equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno particular y se obtiene dividiendo la ka por el kd.
[0073] El término "sujeto" se refiere a animales humanos y no humanos, incluyendo todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ratones, conejos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios y reptiles. En muchas realizaciones de los métodos descritos, el sujeto es un ser humano.
[0074] El término "muestra" tal como se utiliza aquí se refiere a una colección de similares fluidos, células, o tejidos (por ejemplo, tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluyendo aspiración con aguja fina), aislada de un sujeto, así como fluidos, células, o tejidos presentes dentro de un sujeto. En algunas realizaciones, la muestra es un fluido biológico. Los fluidos biológicos son típicamente líquidos a temperaturas fisiológicas y pueden incluir fluidos naturales presentes en, extraídos, expresados o extraídos de un sujeto o fuente biológica. Ciertos fluidos biológicos derivan de tejidos, órganos o regiones localizadas particulares y ciertos otros fluidos biológicos pueden estar situados de manera más global o sistémica en un sujeto o fuente biológica. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen sangre, suero y fluidos serosos, plasma, linfa, orina, saliva, fluido quístico, gotas de lágrimas, heces, esputo, secreciones mucosas de los tejidos y órganos secretores, secreciones vaginales, fluidos ascíticos como los asociados con tumores no sólidos, fluidos de las cavidades pleurales, pericárdicas, peritoneales, abdominales y otras cavidades corporales, fluidos recogidos por lavado bronquial y similares. Los fluidos biológicos también pueden incluir soluciones líquidas en contacto con un sujeto o fuente biológica, por ejemplo, medio de cultivo de células y órganos, incluido medio acondicionado de células u órganos, fluidos de lavado y similares. El término "muestra", como se usa en el presente documento, abarca materiales eliminados de un sujeto o materiales presentes en un sujeto.
[0075] Un "estándar conocido" puede ser una solución con una cantidad o concentración de CD123, en donde la solución conocida puede ser una solución de origen natural, tal como una muestra de un paciente que se sabe que tiene cáncer temprano, moderado, tardío, progresivo, o estático, o la solución puede ser una solución sintética tal como agua tamponada que tiene una cantidad conocida de CD123 diluida en ella. Los estándares conocidos, descritos aquí pueden incluir CD123 aislado de un sujeto, proteína CD123 recombinante o purificada, o un valor de concentración de CD123 asociado con una enfermedad.
[0076] El término "CD3" se refiere al complejo de múltiples subunidades de proteína CD3 humana. El complejo de múltiples subunidades de la proteína CD3 está compuesta por 6 cadenas polipeptídicas distintivas. Estas incluyen una cadena CD3y (SwissProt P09693), una cadena CD35 (SwissProt P04234), dos cadenas CD3s (SwissProt P07766) y un homodímero de cadena CD3Z (SwissProt 20963), y que está asociado con el receptor de células T cadena a y p. El término "CD3" incluye cualquier variante de CD3, homólogo de isoformas y especies que las células expresan naturalmente (incluidas las células T) o pueden expresarse en células transfectadas con genes o ADNc que codifican esos polipéptidos, a menos que se indique lo contrario.
[0077] Como se usa en este documento, los términos "subunidad alfa del receptor de IL-3", "IL3Ra", "CD123", "cadena IL3Ra" y "subunidad IL3Ra" se refieren indistintamente a un determinante antigénico detectable en células precursoras de leucemia que se unen a la interleucina-3 (IL3). En una realización específica, el CD123 es el CD123 humano. En una realización específica, el CD123 es el CD123 de mono cynolmolgus. En una realización específica, el CD123 es CD123 SP1. En una realización específica, el CD123 es CD123 SP2. El término "CD123" incluye cualquier variante de CD123, isoforma y homólogo de especies, a menos que se indique lo contrario.
[0078] Un "anticuerpo CD123 x CD3" es un anticuerpo multiespecífico, opcionalmente, un anticuerpo biespecífico, que comprende dos regiones de unión a antígeno diferentes, uno de los cuales se une específicamente al antígeno CD123 y uno de los cuales se une específicamente a CD3. Un anticuerpo multiespecífico puede ser un anticuerpo biespecífico, un diacuerpo o una molécula similar (ver, por ejemplo, PNAS USA 90 (14), 6444-8 (1993) para una descripción de los cuerpos diabólicos). Los anticuerpos biespecíficos, los diacuerpos y similares, proporcionados en el presente documento pueden unirse a cualquier diana adecuada además de una porción de CD123. El término "anticuerpo biespecífico" debe entenderse como un anticuerpo que tiene dos regiones de unión a antígeno diferentes definidas por diferentes secuencias de anticuerpos. Esto puede entenderse como una unión a una diana diferente, pero también incluye la unión a diferentes epítopos en una diana.
[0079] Una "muestra de referencia" es una muestra que puede ser comparada contra otra muestra, tal como una muestra de prueba, para permitir la caracterización de la muestra en comparación. La muestra de referencia tendrá alguna propiedad caracterizada que sirve como base para la comparación con la muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de referencia puede usarse como punto de referencia para los niveles de CD123 que son indicativos de un sujeto que tiene cáncer. La muestra de referencia no necesariamente tiene que analizarse en paralelo con la muestra de prueba, por lo tanto, en algunos casos, la muestra de referencia puede ser un valor numérico o rango previamente determinado para caracterizar una condición dada, como los niveles de CD123 que son indicativos de cáncer en un sujeto. El término también incluye muestras utilizadas con fines comparativos que se sabe que están asociadas con un estado fisiológico o una enfermedad, como el cáncer que expresa CD123, pero que tienen una cantidad desconocida de CD123.
[0080] El término "progresión", como se usa en el contexto de la progresión de cáncer que expresa CD 123, incluye el cambio de un cáncer de un estado menos severo a uno más grave. Esto puede incluir un aumento en el número o la gravedad de los tumores, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer crece o se propaga, y similares. Por ejemplo, "la progresión del cáncer de colon" incluye la progresión de dicho cáncer de un estado menos severo a un estado más severo, tal como la progresión de la etapa I a la etapa II, de la etapa II a la etapa III, etc.
[0081] El término "regresión", como se usa en el contexto de la regresión del cáncer que expresa CD123, incluye el cambio de un cáncer de un estado más severo a uno menos severo. Esto podría incluir una disminución en el número o la gravedad de los tumores, el grado de metástasis, la velocidad con la que el cáncer crece o se propaga, y similares. Por ejemplo, "la regresión del cáncer de colon" incluye la regresión de dicho cáncer de un estado más severo a uno menos severo, tal como la progresión de la etapa III a la etapa II, de la etapa II a la etapa I, etc.
[0082] El término "estable", como se usa en el contexto del cáncer que expresa CD123 estable, tiene la intención de describir una enfermedad que no ha cambiado de manera suficientemente significativa durante un período clínicamente relevante como para considerarse un cáncer progresivo o un cáncer que regresa.
[0083] Las realizaciones descritas en el presente documento no se limitan a métodos particulares, reactivos, compuestos, composiciones o sistemas biológicos, que pueden, por supuesto, variar.
Anticuerpos específicos a CD123 y fragmentos de unión a antígeno
[0084] Se describen aquí anticuerpos monoclonales aislados o fragmentos de unión a antígeno que se unen específicamente a CD123. La estructura general de una molécula de anticuerpo comprende un dominio de unión a antígeno, que incluye cadenas pesadas y ligeras, y el dominio Fc, que cumple una variedad de funciones, incluida la fijación del complemento y la unión de receptores de anticuerpos.
[0085] Los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos incluye todos los isotipos, IgA, IgD, IgE, IgG y IgM, y multímeros sintéticos de la estructura de inmunoglobulina de cuatro cadenas. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos también incluyen el isotipo IgY que generalmente se encuentra en suero de gallina o pavo y yema de huevo de gallina o pavo.
[0086] Los anticuerpos específicos a CD123 y fragmentos de unión a antígeno pueden derivarse de cualquier especie por medios recombinantes. Por ejemplo, los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno pueden ser ratones, ratas, cabras, caballos, cerdos, bovinos, pollos, conejos, camélidos, burros, humanos o quiméricos. Para su uso en la administración a humanos, los anticuerpos no humanos derivados o fragmentos de unión a antígeno pueden ser alterados genética o estructuralmente para que sean menos antigénicos tras la administración a un paciente humano.
[0087] En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno son quiméricos. Como se usa en el presente documento, el término "quimérico" se refiere a un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que tiene al menos alguna porción de al menos un dominio variable derivado de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de un mamífero no humano, un roedor, o un reptil, mientras que las porciones restantes del anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se derivan de un humano.
[0088] En algunas realizaciones, los anticuerpos son anticuerpos humanizados. Los anticuerpos humanizados pueden ser inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 u otras subsecuencias de anticuerpos que se unen a antígenos) que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor se reemplazan por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede incluir al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana.
[0089] Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno aquí descritos pueden ocurrir en una variedad de formas, pero incluirán uno o más de los CDR de anticuerpos I3RB2 o I3RB18 mostrados en la Tabla 1.
[0090] Se describen en el presente documento anticuerpos aislados y fragmentos de unión a antígeno que se unen inmunoespecíficamente a CD123. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno específicos a CD123 son IgG humana, o derivados de los mismos. Mientras que los anticuerpos específicos a CD123 0 los fragmentos de unión a antígeno ejemplificados aquí son humanos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno ejemplificados pueden ser quimerizados.
[0091] En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo específico a CD123, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada que comprende una CDR1, una CDR2, y una CDR3 de una cualquiera de los anticuerpos I3RB2 y I3RB18 descritos en la Tabla 1. En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo específico para CD123, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada que comprende una CDR1, una CDR2 y una CDR3 de cualquiera de los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 descritos en la Tabla 1 y una cadena ligera que comprende una CDR1, una CDR2, y una CDR3 de una cualquiera de los anticuerpos I3RB2 y I3RB18 descritos en la Tabla 1.
[0092] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno CD123 específicos comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 006, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 007, y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 008. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 006, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 007, una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 008, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 009, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 010 y una cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 011. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 119. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 119 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 164. El dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0093] En algunas realizaciones, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno CD123 específicos comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 012, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 013, y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 014. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 012, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 013, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 014, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 015, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 016 y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 017. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 120. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 120 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 165. El dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera de los anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0094] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno CD123 específicos comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 018, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 019, y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 020. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 018, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 019, una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 020, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 009, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 010, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 011. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprenden secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 121. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 121 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 164. El dominio variable de cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0095] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno CD123 específicos comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 021, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 022, y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 023. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 021, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 022, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 023, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 024, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 025, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 026. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 122. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 122 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 166. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0096] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno CD123 específicos comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 027, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 028, y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 029. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 027, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 028, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 029, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 123. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 123 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0097] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno CD123 específicos comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 035. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 035, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 124. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 124 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0098] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 036. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprende una cadena pesada CDR1 que comprende la s Eq ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 036, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 032. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 125. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 125 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0099] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno CD123 específicos comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 037. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 037, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 126. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 126 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0100] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 038. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 038, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 030, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 032. Este fragmento de anticuerpo específico de CD123 o de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 127. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 127 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0101] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 040 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 041. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 040, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 041, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 128. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 128 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0102] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno específicos a CD123 comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 042. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 042, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 032. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprenden secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 129. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 129 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera de los anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0103] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 043. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la s Eq ID NO: 034, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 043, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 130. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 130 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0104] En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 044 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 045. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno específicos a CD123 comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 044, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 045, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 015, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 016, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 017. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 131. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 131 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 165. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0105] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 046 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 047. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la s Eq ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 046, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 047, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 032. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 132. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 132 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para la inclusión en constructos biespecíficos en los que un brazo es un brazo 123 anti-CD.
[0106] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 048. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno específicos a CD123 comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 048, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 133. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 133 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0107] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 049. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la s Eq ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 049, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 134. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 134 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0108] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 050. En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 050, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 135. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 135 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0109] En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 051, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 052 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 053. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 051, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 052, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 053, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 024, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 025, y una cadena ligera c Dr 3 que comprende SEQ ID NO: 054. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 136. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual que, o idéntico a, SEQ ID NO: 136 y un dominio variable de cadena ligera sustancialmente el mismo que, o idéntico a, SEQ ID NO: 168. el dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutido en este párrafo es adecuado para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0110] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 055, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 056 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 057. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión al antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 055, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 056, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 057, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 058, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 059, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 032. Este fragmento de anticuerpo específico de CD123 o de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 137. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 137 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 169. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0111] En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 060. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 060, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 138. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 138 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a gSEQ ID NO: 167. El dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera de los anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0112] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 061. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 061, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 062, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 063 y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 064. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 139. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 139 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 170. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0113] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 065. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 065, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 066, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 067, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 068. Este fragmento de anticuerpo específico de CD123 o de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual que, o idénticos a, SEQ ID NO: 140. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno CD123 específicos comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 140 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 171. El dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera de los anticuerpos discutidos en este párrafo es adecuado para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0114] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 069. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 069, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 030, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 070. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 141 En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y Los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 141 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 172. El dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera de los anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD123.
[0115] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 071. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 071, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 142. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 142 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0116] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 072 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 073. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 072, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 073, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 030, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 032. Este fragmento de anticuerpo específico de CD123 o de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 143. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 143 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0117] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 074. En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 074, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 075, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 076, y una cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 077. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico a CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, tal como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 144. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 144 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 173. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0118] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 078. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 078, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 079, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 063, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 080. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 145. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 145 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 174. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0119] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 081. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 081, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 146. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 146 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0120] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 082. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 082, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 083, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 084. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 147. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 147 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 175. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0121] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 085 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 086. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 085, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 086, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 087, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 067 y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 088. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 148. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 148 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 176. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0122] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 089 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 090. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 089, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 090, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 091, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 076, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 092. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 149. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 149 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 177. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0123] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 093. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la s Eq ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 093, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 032. Este fragmento de anticuerpo específico de CD123 o de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 150. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 150 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0124] En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 094. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la s Eq ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 094, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 095, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 076, y una cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 096. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 151. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 151 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 178. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0125] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno específicos a CD123 comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 097. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 097, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 098, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 067, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 099. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 152. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 152 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 179. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0126] En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 100. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la s Eq ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 100, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 101. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 153 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 180. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0127] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 102. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 102, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 154. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 154 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0128] En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 103. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 103, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 104, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 105. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 155. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 155 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 181. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0129] En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 106. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 039, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 106, una cadena ligera c DR1 que comprende SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 032. Este anticuerpo específico de CD123 o unión a antígeno El fragmento puede comprender secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 156. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 156 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0130] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 107. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 107, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 108, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 109, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 110. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 157 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a SEQ ID NO: 182. La cadena pesada el dominio variable y el dominio variable de la cadena ligera de los anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0131] En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 111. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 111, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 112, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 076, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 113. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 158. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 158 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 183. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0132] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 114, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 022 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 115. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno específicos a CD123 comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 114, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 022, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 115, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 024, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 025, y una cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 026. Este fragmento de unión a antígeno o anticuerpo específico de CD123 puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 159. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 159 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 166. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0133] En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 114, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 022, y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 116. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 114, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 022, una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 116, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 015, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 016, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 017. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprenden secuencias marco humanas. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 160. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 160 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 165. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0134] En algunas realizaciones de la descripción, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 117, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 013 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 118. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 117, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 013, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 118, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 015, una cadena ligera c DR2 que comprende SEQ ID NO: 016, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 017. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 161. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 161 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 165. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0135] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende SEQ ID NO: 051, una cadena pesada CDR2 que comprende SEQ ID NO: 052, y una cadena pesada CDR3 que comprende SEQ ID NO: 053. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 051, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 052, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 053, una CDR1 de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera CDR3 que comprende SEQ ID NO: 032. Este fragmento de anticuerpo específico de CD123 o de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1 x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1 x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 162. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 162 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. El dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0136] En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034 y una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 042. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden una cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 033, una cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 034, una cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 042, una CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 030, una cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 031, y una cadena ligera Cd R3 que comprende la SEQ ID NO: 032. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede comprender secuencias del marco humano. Este anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno puede unirse a CD123 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 163. En algunas realizaciones de la divulgación, los anticuerpos específicos a CD123 y los fragmentos de unión a antígeno comprenden un dominio variable de la cadena pesada sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 163 y un dominio variable de la cadena ligera sustancialmente igual o idéntico a la SEQ ID NO: 167. La variable de la cadena pesada el dominio y el dominio variable de la cadena ligera de anticuerpos discutidos en este párrafo son adecuados para su inclusión en construcciones biespecíficas en las que un brazo es un brazo anti-CD 123.
[0137] Los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno proporcionados por la invención anti-CD123 también incluyen anticuerpos que compiten por la unión con los anticuerpos descritos anteriormente. La competencia por la unión se puede determinar usando un ELISA de unión por competición, en línea con la técnica descrita a continuación en el Ejemplo 5. La unión competitiva se puede determinar detectando al menos el 20% de inhibición de la unión de un primer anticuerpo por un segundo anticuerpo, independientemente del orden en donde los anticuerpos se unen a CD123 (es decir, cuando el anticuerpo A se une a CD123 antes que el anticuerpo B, solo se observa un 10% de inhibición, pero cuando el anticuerpo B se une a CD123 antes del anticuerpo A, se observa un 30% de inhibición, entonces porque se ha observado una inhibición superior al 20% en uno de los experimentos, se puede concluir la unión competitiva).
[0138] En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno son IgG, o derivados de los mismos, por ejemplo, isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunas realizaciones en las que el anticuerpo tiene un isotipo IgG1, el anticuerpo contiene las sustituciones L234A, L235A y K409R en su región Fc. En algunas realizaciones en las que el anticuerpo tiene un isotipo IgG4, el anticuerpo contiene sustituciones S228P, L234A y L235A en su región Fc. Los anticuerpos específicos definidos por CDR y/o secuencia de dominio variable discutidos en los párrafos anteriores pueden incluir estas modificaciones.
[0139] También se describen polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno que se unen inmunoespecíficamente a CD123. Los polinucleótidos aislados capaces de codificar los segmentos de dominio variable proporcionados en el presente documento pueden incluirse en el mismo o diferentes vectores para producir anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno.
[0140] Los polinucleótidos que codifican proteínas de unión a antígeno recombinantes también están dentro del alcance de la divulgación. En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos (y los péptidos que codifican) incluyen una secuencia líder. Se puede emplear cualquier secuencia líder conocida en la técnica. La secuencia líder puede incluir, entre otros, un sitio de restricción o un sitio de inicio de traducción.
[0141] Los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento incluyen variantes que tienen sustituciones individuales o múltiples de aminoácidos, deleciones o adiciones que retienen las propiedades biológicas (por ejemplo, afinidad de unión o actividad efectora inmune) de los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos. En el contexto de la presente invención, las siguientes notaciones se usan, a menos que se indique lo contrario, para describir una mutación; i) la sustitución de un aminoácido en una posición dada se escribe, por ejemplo, K409R, lo que significa una sustitución de una lisina en la posición 409 con una arginina; y ii) para variantes específicas se utilizan los códigos específicos de tres o una letra, incluidos los códigos Xaa y X para indicar cualquier residuo de aminoácido. Así, la sustitución de Arginina por Lisina en la posición 409 se designa como: K409R, o la sustitución de cualquier residuo de aminoácido por Lisina en la posición 409 se designa como K409X. En caso de eliminación de lisina en la posición 409, se indica mediante K409*. El experto puede producir variantes que tengan sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos simples o múltiples.
[0142] Estas variantes pueden incluir: (a) variantes en las que uno o más residuos de aminoácidos se sustituyen con aminoácidos conservativos o no conservativos, (b) variantes en las que se añaden o eliminan uno o más aminoácidos del polipéptido, (c) variantes en las que uno o más aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, y (d) variantes en las que el polipéptido se fusiona con otro péptido o polipéptido, como un compañero de fusión, una etiqueta de proteína u otro resto químico, que puede conferir propiedades útiles al polipéptido, tal como, por ejemplo, un epítopo para un anticuerpo, una secuencia de polihistidina, un resto de biotina y similares. Los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento pueden incluir variantes en las que los residuos de aminoácidos de una especie se sustituyen por el residuo correspondiente en otra especie, ya sea en las posiciones conservadas o no conservadas. En otras realizaciones, los residuos de aminoácidos en posiciones no conservadas se sustituyen con residuos conservativos o no conservativos. Las técnicas para obtener estas variantes, incluidas las técnicas genéticas (deleciones, mutaciones, etc.), químicas y enzimáticas, son conocidas por las personas que tienen habilidades ordinarias en la técnica.
[0143] Los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno aquí descritos pueden incorporar varios anticuerpos isotipos, tales como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. En algunas realizaciones, el isotipo de anticuerpo es el isotipo IgG 1, IgG2, IgG3 o IgG4, preferiblemente el isotipo IgG1 o IgG4. La especificidad del anticuerpo o del fragmento de unión al antígeno del mismo está determinada en gran medida por la secuencia de aminoácidos y la disposición de las CDR. Por lo tanto, las CDR de un isotipo pueden transferirse a otro isotipo sin alterar la especificidad del antígeno. Alternativamente, se han establecido técnicas para hacer que los hibridomas pasen de producir un isotipo de anticuerpo a otro (cambio de isotipo) sin alterar la especificidad del antígeno. Por consiguiente, dichos isotipos de anticuerpos están dentro del alcance de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos.
[0144] Los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento tienen afinidades de unión para CD123 SP1 que incluyen una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 5x10-7 M, preferiblemente menos de aproximadamente 5x10-8 M. En algunas realizaciones, los anticuerpos específicos a CD123 o los fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento tienen afinidades de unión para CD123 SP2 que incluyen una constante de disociación (Kd) de menos de aproximadamente 5x10-7 M, preferiblemente menos de aproximadamente 5x10-8 M. La afinidad de los anticuerpos específicos a CD123 descritos, o fragmentos de unión a antígeno, pueden determinarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, tales como resonancia de plasmón superficial o métodos basados en ELISA. Los ensayos para medir la afinidad por SPR incluyen ensayos realizados usando una máquina BIAcore 3000, donde el ensayo se realiza a temperatura ambiente (por ejemplo, a o cerca de 25°C), en donde el anticuerpo capaz de unirse a CD123 es capturado en el chip del sensor BIAcore por un anticuerpo anti-Fc (p. ej., anticuerpo específico a IgG Fc anti-humano de cabra de Jackson ImmunoResearch Laboratories Prod n° 109-005-098) a un nivel de alrededor de 75RU, seguido de la recopilación de datos de asociación y disociación a un caudal de 40 pl/min.
[0145] También se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos descritos en el presente documento. Los vectores pueden ser vectores de expresión. Los vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia que codifica un polipéptido de interés se contemplan así dentro del alcance de esta descripción. El vector de expresión puede contener una o más secuencias adicionales tales como, entre otras, secuencias reguladoras (p. ej., promotor, potenciador), un marcador de selección y una señal de poliadenilación. Los vectores para transformar una amplia variedad de células huésped son bien conocidos e incluyen, entre otros, plásmidos, fagémidos, cósmidos, baculovirus, bácmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC), cromosomas artificiales de levadura (YAC), así como otras bacterias, levadura y vectores virales.
[0146] Los vectores de expresión recombinantes dentro del alcance de la descripción incluyen fragmentos de ácido nucleico sintético, genómico, o derivados de ADNc que codifican al menos una proteína recombinante que puede estar unida operativamente a elementos reguladores adecuados. Dichos elementos reguladores pueden incluir un promotor transcripcional, secuencias que codifican sitios de unión a ribosomas de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. Los vectores de expresión, especialmente los vectores de expresión de mamíferos, también pueden incluir uno o más elementos no transcritos, tales como un origen de replicación, un promotor y potenciador adecuado ligado al gen que se va a expresar, otras secuencias flanqueantes 5’ o 3' no transcritas, secuencias no traducidas 5’ o 3’ (como los sitios de unión a ribosomas necesarios), un sitio de poliadenilación, sitios donadores y aceptores de empalme, o secuencias de terminación transcripcional. También se puede incorporar un origen de replicación que confiera la capacidad de replicarse en un huésped.
[0147] Las secuencias de control transcripcional y traduccional en los vectores de expresión para uso en la transformación de células de vertebrados pueden ser proporcionadas por fuentes virales. Se pueden construir vectores ejemplares como se describe por Okayama y Berg, 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983).
[0148] En algunas realizaciones, la secuencia de codificación de fragmentos de unión a antígeno o anticuerpo se coloca bajo el control de un potente promotor constitutivo, como los promotores de los siguientes genes: hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato quinasa, beta-actina, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana y otros. Además, muchos promotores virales funcionan constitutivamente en células eucariotas y son adecuados para su uso con las realizaciones descritas. Dichos promotores virales incluyen, entre otros, el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), los promotores temprano y tardío de SV40, el promotor del virus del tumor mamario de ratón (MMTV), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Maloney, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)), El virus de Epstein Barr (EBV), el virus del sarcoma de Rous (RSV) y otros retrovirus, y el promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple. En una realización, el anticuerpo específico de CD123 o el fragmento de unión al antígeno de la secuencia de codificación se coloca bajo el control de un promotor inducible tal como el promotor de metalotioneína, el promotor inducible por tetraciclina, el promotor inducible por doxiciclina, los promotores que contienen uno o más estimulados por interferón. elementos de respuesta (ISRE) tales como la proteína quinasa R 2’,5'-oligoadenilato sintetasas, genes Mx, ADAR1 y similares.
[0149] Los vectores descritos en este documento pueden contener uno o más sitios de entrada de ribosomas internos (IRES). La inclusión de una secuencia IRES en los vectores de fusión puede ser beneficiosa para mejorar la expresión de algunas proteínas. En algunas realizaciones, el sistema del vector incluirá uno o más sitios de poliadenilación (por ejemplo, SV40), que pueden estar corriente arriba o corriente abajo de cualquiera de las secuencias de ácido nucleico mencionadas anteriormente. Los componentes del vector se pueden unir contiguamente, o disponer de una manera que proporcione un espacio óptimo para expresar los productos génicos (es decir, mediante la introducción de nucleótidos "espaciadores" entre los ORF), o posicionarse de otra manera. Los elementos reguladores, como el motivo IRES, también se pueden organizar para proporcionar un espacio óptimo para la expresión.
[0150] Los vectores pueden comprender marcadores de selección, que son bien conocidos en la técnica. Los marcadores de selección incluyen marcadores de selección positivos y negativos, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos (p. ej., gen de resistencia a la neomicina, un gen de resistencia a la higromicina, un gen de resistencia a la kanamicina, un gen de resistencia a la tetraciclina, un gen de resistencia a la penicilina), genes de glutamato sintasa, HSV-TK, derivados de HSV-TK para la selección de ganciclovir, o el gen bacteriano de purina nucleósido fosforilasa para la selección de 6-metilpurina (Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Una secuencia de ácido nucleico que codifica un marcador de selección o el sitio de clonación puede estar corriente arriba o corriente abajo de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de interés o sitio de clonación.
[0151] Los vectores descritos en el presente documento se pueden usar para transformar diversas células con los genes que codifican los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos. Por ejemplo, los vectores pueden usarse para generar anticuerpos específicos para CD123 o células productoras de fragmentos de unión a antígeno. Por lo tanto, otro aspecto presenta células huésped transformadas con vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a CD123, tal como los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos y ejemplificados aquí.
[0152] Se conocen numerosas técnicas en la técnica para la introducción de genes extraños en células y pueden ser usados para construir las células recombinantes para los propósitos de llevar a cabo los métodos descritos, de acuerdo con las diversas realizaciones descritas y ejemplificadas en este documento. La técnica utilizada debe proporcionar la transferencia estable de la secuencia del gen heterólogo a la célula huésped, de modo que la secuencia del gen heterólogo sea heredable y expresable por la progenie celular, y para que el desarrollo necesario y las funciones fisiológicas de las células receptoras no se vean interrumpidas. Las técnicas que se pueden utilizar incluyen, entre otras, la transferencia de cromosomas (p. ej., fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por micro células), métodos físicos (p. ej., transfección, fusión de esferoplastos, microinyección, electroporación, portador de liposomas), transferencia de vectores virales (por ejemplo, virus de ADN recombinante, virus de ARN recombinante) y similares (descritos en Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). La precipitación con fosfato de calcio y la fusión inducida por polietilenglicol (PEG) de protoplastos bacterianos con células de mamífero también se pueden usar para transformar células.
[0153] Las células adecuadas para su uso en la expresión de los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento son preferiblemente células eucariotas, más preferiblemente células de origen vegetal, roedor o humano, por ejemplo, pero sin limitación, NSO, CHO, CHOK1, perC,6, células Tkts13, BHK, HEK293, Co S-7, T98G, CV-1/EBNA, células L, C127, 3T3, HeLa, NS1, células de mieloma Sp2/0 y líneas celulares BHK, entre otras. Además, la expresión de anticuerpos se puede lograr usando células de hibridoma. Los métodos para producir hibridomas están bien establecidos en la técnica.
[0154] Las células transformadas con los vectores de expresión descritos en el presente documento pueden seleccionarse o cribarse para la expresión recombinante de los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno descritos en el presente documento. Las células recombinantes positivas se expanden y se seleccionan para detectar subclones que exhiben un fenotipo deseado, como expresión de alto nivel, propiedades de crecimiento mejoradas o la capacidad de producir proteínas con características bioquímicas deseadas, por ejemplo, debido a la modificación de proteínas o modificaciones postraduccionales alteradas. Estos fenotipos pueden deberse a propiedades inherentes de un subclón dado o a una mutación. Las mutaciones pueden efectuarse mediante el uso de productos químicos, luz de longitud de onda UV, radiación, virus, mutágenos de inserción, inhibición de la reparación del desajuste de ADN o una combinación de tales métodos.
Métodos para usar anticuerpos específicos a CD123 para el tratamiento
[0155] En este documento se proporcionan anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos para uso en terapia. En particular, estos anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden ser útiles en el tratamiento del cáncer, como el cáncer que expresa CD123. Por consiguiente, la invención proporciona anticuerpos CD123 o fragmentos de unión a antígeno para su uso en un método de tratamiento del cáncer que comprende administrar un anticuerpo como se describe en la invención, tal como anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno. Por ejemplo, el uso puede ser mediante la inhibición de un efecto biológico de IL-3 al evitar que IL-3 se una a IL-3R o cuando el anticuerpo se conjuga con una toxina, dirigiendo la toxina al cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa CD123 incluye cáncer hematológico, tal como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN). Los anticuerpos para uso en estos métodos incluyen los descritos anteriormente en el presente documento, por ejemplo, un anticuerpo específico de CD123 o un fragmento de unión a antígeno que se une a un epítopo que incluye uno o más residuos del segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 195 - 202 (Ra RErVy E (SEQ ID NO: 234)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 156-161 (RKFRYE (SEQ iD NO: 232)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 173-178 (TEQVRD (SEQ ID NO: 233)). También son útiles para usar en estos métodos los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 con las características establecidas en la Tabla 1, por ejemplo, las CDR o secuencias de dominio variable, y en la discusión adicional de estos anticuerpos.
[0156] En algunas realizaciones descritas en el presente documento, las propiedades efectoras inmunes de los anticuerpos específicos a CD123 pueden potenciarse o silenciarse mediante modificaciones de Fc mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las funciones efectoras de Fc como la unión a Clq, la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP), la disminución de la regulación de los receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de células B (BCR), etc. puede proporcionarse y/o controlarse modificando los residuos en el Fc responsable de estas actividades.
[0157] "Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una reacción mediada por células en donde las células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcR) (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula diana y posteriormente causa lisis de la célula diana.
[0158] La capacidad de los anticuerpos monoclonales para inducir ADCC se puede mejorar mediante la ingeniería de su componente oligosacárido. La IgG 1 o IgG3 humana están N-glicosiladas en Asn297 con la mayoría de los glicanos en las formas biantenarias bien conocidas G0, G0F, G1, G1F, G2 o G2F. Los anticuerpos producidos por células CHO no modificadas tienen típicamente un contenido de glucano fucosa de aproximadamente al menos el 85%. La eliminación de la fucosa central de los oligosacáridos de tipo complejo biantenario unidos a las regiones Fc mejora la ADCC de los anticuerpos a través de la unión mejorada de Fc.gamma.RIIIa sin alterar la unión al antígeno o la actividad de los CDC. Dichos mAbs se pueden lograr utilizando diferentes métodos informados que conducen a la expresión exitosa de anticuerpos defucosilados relativamente altos que portan los oligosacáridos Fc de tipo complejo biantenario, como el control de la osmolalidad del cultivo (Konno et al., Cytotechnology 64: 249-65, 2012), aplicación de una línea CHO variante Lecl3 como línea celular huésped (Shields et al., J Biol Chem 277: 26733-26740, 2002), aplicación de una línea CHO variante EB66 como línea celular huésped (Olivier et al., MAbs; 2 (4), 2010; Epub antes de la impresión; PMID: 20562582), aplicación de una línea celular de hibridoma de rata YB2/0 como la línea celular huésped (Shinkawa et al., J Biol Chem 278: 3466-3473, 2003), introducción de ARN interferente pequeño específicamente contra el a. Gen 1,6-fucosiltrasferasa (FUT8 ) (Mori et al., Biotechnol Bioeng 88 : 901-908, 2004), o coexpresión de p-1,4-N-acetilglucosaminiltransferasa III y Golgi.alfa.-manosidasa II o un potente inhibidor de alfa-manosidasa I, kifunensina (Ferrara et al., J Biol Chem 281: 5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93: 851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99: 652-65, 2008).
[0159] En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la ADCC provocada por los anticuerpos CD123 también puede potenciarse mediante ciertas sustituciones en el anticuerpo Fc. Las sustituciones ejemplares son, por ejemplo, sustituciones en las posiciones de aminoácidos 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 o 430 (numeración de residuos según el índice de la UE) como se describe en la patente de EE.UU. N° 6.737,056.
Métodos para detectar CD123
[0160] En este documento se proporcionan métodos para detectar CD123 en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, descrito aquí. Como se describe en el presente documento, la muestra puede derivarse de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej, tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares. En algunas realizaciones, los métodos descritos incluyen detectar CD123 en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra con cualquiera de los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos descritos aquí.
[0161] En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con más de uno de los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno descritos en este documento. Por ejemplo, una muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo específico de CD123, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, y luego ponerse en contacto con un segundo anticuerpo específico de CD123, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno y el segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno no es el mismo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, puede fijarse a una superficie, tal como una placa de múltiples pocillos, chip o sustrato similar antes de poner en contacto la muestra. En otras realizaciones, el primer anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, no puede fijarse o unirse a nada antes de contactar la muestra.
[0162] Los anticuerpos específicos a CD123 descritos y los fragmentos de unión a antígeno pueden marcarse de forma detectable. En algunas realizaciones, los anticuerpos marcados y los fragmentos de unión a antígeno pueden facilitar la detección de CD123 mediante los métodos descritos en este documento. Muchas de estas etiquetas son fácilmente conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, las etiquetas adecuadas incluyen, pero no deben considerarse limitadas a, radiomarcadores, etiquetas fluorescentes, etiquetas de epítopo, biotina, etiquetas de cromóforo, etiquetas de ECL o enzimas. Más específicamente, las etiquetas descritas incluyen rutenio, 111In-DOTA, ácido 111In-dietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y betagalactosidasa, poli-histidina (etiqueta HIS), tintes de acridina, tintes de cianina, tintes de fluorona, tintes de oxazina, tintes de fenantridina, tintes de rodamina, tintes de Alexa Fluor® y similares.
[0163] Los anticuerpos específicos a CD123 y fragmentos de unión a antígeno descritos se pueden usar en una variedad de ensayos para detectar CD123 en una muestra biológica. Algunos ensayos adecuados incluyen, entre otros, análisis de transferencia Western, radioinmunoensayo, resonancia de plasmones de superficie, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
[0164] En algunas realizaciones descritas en el presente documento, los anticuerpos CD123 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención pueden usarse en un método de detección de células cancerosas que expresan CD123 en un sujeto para determinar que el sujeto puede ser tratado con un agente terapéutico dirigido contra CD123.
[0165] El CD123 está presente a niveles detectables en muestras de sangre y suero. Por lo tanto, en este documento se proporcionan métodos para detectar CD123 en una muestra derivada de sangre, tal como una muestra de suero, poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD123. La muestra de sangre, o un derivado de la misma, puede diluirse, fraccionarse o procesarse de otro modo para producir una muestra sobre la cual se puede realizar el método descrito. En algunas realizaciones, se puede detectar CD123 en una muestra de sangre, o un derivado de la misma, mediante cualquier número de ensayos conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitación, análisis de transferencia Western, radioinmunoensayo, resonancia de plasmones de superficie, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
Métodos para diagnosticar cáncer
[0166] En este documento se proporcionan anticuerpos CD123 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención para usar en métodos para diagnosticar cáncer que expresa CD123 en un sujeto. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa CD123 incluye cánceres hematológicos, tales como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN). En algunas realizaciones, como se describió anteriormente, la detección de CD123 en una muestra biológica, tal como una muestra de sangre o una muestra de suero, proporciona la capacidad de diagnosticar cáncer en el sujeto del que se obtuvo la muestra. Alternativamente, en algunas realizaciones, otras muestras, tales como una muestra histológica, una muestra de aspiración con aguja fina, tejido tumoral resecado, células circulantes, células tumorales circulantes y similares, también pueden usarse para evaluar si el sujeto del que se obtuvo la muestra tiene cáncer. En algunas realizaciones, puede que ya se sepa que el sujeto del que se obtuvo la muestra tiene cáncer, pero el tipo de cáncer que afecta al sujeto aún no se ha diagnosticado o un diagnóstico preliminar puede no estar claro, detectando así CD123 en una muestra biológica obtenida del sujeto puede permitir o aclarar el diagnóstico del cáncer. Por ejemplo, un sujeto puede ser conocido por tener cáncer, pero puede no ser conocido, o puede ser claro, si el cáncer del sujeto expresa CD123.
[0167] En algunas realizaciones, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece cáncer que expresa CD123 determinando la cantidad de CD123 que está presente en una muestra biológica derivada del sujeto; y comparar la cantidad observada de CD123 con la cantidad de CD123 en una muestra de control o referencia, en donde una diferencia entre la cantidad de CD123 en la muestra derivada del sujeto y la cantidad de CD123 en el control o referencia, muestra es una indicación de que el sujeto está afectado por un cáncer que expresa CD123. En otra realización, la cantidad de CD123 observada en una muestra biológica obtenida de un sujeto puede compararse con los niveles de CD123 que se sabe que están asociados con ciertas formas o etapas de cáncer, para determinar la forma o etapa del cáncer del sujeto. En algunas realizaciones, la cantidad de CD123 en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une inmunoespecíficamente a CD123, tal como los anticuerpos específicos a CD123 descritos aquí. La muestra evaluada para la presencia de CD123 puede derivarse de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa CD123 incluye cáncer hematológico, tal como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN). En algunas realizaciones, el sujeto es un humano.
[0168] En algunas realizaciones, el método para diagnosticar un cáncer que expresa CD123 implicará: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico de CD123, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (como los derivados de los anticuerpos I3RB2 e I3RB18 y fragmentos proporcionados en la Tabla 1), cuantificando la cantidad de CD123 presente en la muestra que está unida por el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, comparando la cantidad de CD123 presente en la muestra con un estándar conocido o muestra de referencia; y determinar si los niveles de CD123 del sujeto caen dentro de los niveles de CD123 asociados con el cáncer. En una realización adicional, el método de diagnóstico puede seguirse con un paso adicional de administrar o prescribir un tratamiento específico para el cáncer. En otra realización, el método de diagnóstico puede seguirse con un paso adicional de transmitir los resultados de la determinación para facilitar el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento específico para el cáncer puede dirigirse contra cánceres que expresan CD123, tales como los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos aquí.
[0169] En algunas realizaciones, los métodos descritos implican evaluar si un sujeto padece cáncer que expresa CD123 determinando la cantidad de CD123 presente en una muestra de sangre o suero obtenida del sujeto; y comparar la cantidad observada de CD123 con la cantidad de CD123 en una muestra de control o referencia, en donde una diferencia entre la cantidad de CD123 en la muestra derivada del sujeto y la cantidad de CD123 en la muestra de control o referencia es una indicación de que el sujeto está afectado por un cáncer que expresa CD123.
[0170] En algunas realizaciones, la muestra de control o referencia puede derivarse de un sujeto que no está afectado por cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones, la muestra de control o referencia puede derivarse de un sujeto que padece cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones donde el control, o referencia, la muestra se deriva de un sujeto que no está afectado por el cáncer que expresa CD123, se observa un aumento en la cantidad de CD123 presente en la muestra de prueba, en relación con el observado para el control o muestra de referencia, es una indicación de que el sujeto que está siendo evaluado está afectado por un cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones donde la muestra de control se deriva de un sujeto que no está afectado por cáncer que expresa CD123, se observa una disminución o similitud observada en la cantidad de CD123 presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra de control o referencia, es una indicación de que el sujeto que está siendo evaluado no está afectado por el cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones en las que la muestra de control o de referencia se deriva de un sujeto que padece cáncer que expresa CD123, una similitud observada en la cantidad de CD123 presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra de control o referencia, es una indicación de que el sujeto que se está evaluando está afectado por un cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones en las que la muestra de control o de referencia se deriva de un sujeto que padece cáncer que expresa CD123, una disminución observada en la cantidad de CD123 presente en la muestra de prueba, en relación con la observada para la muestra de control o referencia, es un indicación de que el sujeto que se evalúa no está afectado por el cáncer que expresa CD123.
[0171] En algunas realizaciones, la cantidad de CD123 en la muestra derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD123, tal como los anticuerpos descritos aquí. La muestra evaluada para la presencia de CD123 puede derivarse de una muestra de sangre, una muestra de suero, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (por ejemplo, tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares.
[0172] En diversos aspectos, la cantidad de CD123 se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD123. En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con más de un tipo de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD123. En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD123 y luego ponerse en contacto con un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD123. Los anticuerpos específicos a CD123 o fragmentos de unión a antígeno tales como los descritos en este documento pueden usarse en esta capacidad.
[0173] Pueden usarse diversas combinaciones de los anticuerpos específicos a CD123 y fragmentos de unión a antígeno para proporcionar un "primer" y "segundo" anticuerpo o fragmento de unión a antígeno para llevar a cabo los métodos de diagnóstico descritos. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa CD123 incluye un cáncer hematológico, tal como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN).
[0174] En ciertas realizaciones, la cantidad de CD123 se determina mediante análisis de transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
[0175] En diversas realizaciones de los métodos de diagnóstico descritos se usa una muestra de control o de referencia. Esta muestra puede ser un control de análisis positivo o negativo que garantiza que el análisis utilizado funcione correctamente; por ejemplo, un control de ensayo de esta naturaleza podría usarse comúnmente para ensayos de inmunohistoquímica. Alternativamente, la muestra puede ser una referencia estandarizada para la cantidad de CD123 en una muestra biológica de un sujeto sano. En algunas realizaciones, los niveles de CD123 observados del sujeto probado pueden compararse con los niveles de CD123 observados en muestras de sujetos que se sabe que tienen cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones, el sujeto de control puede estar afectado por un cáncer particular de interés. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto de control tiene cáncer en etapa temprana, que puede o no ser cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto de control tiene cáncer en etapa intermedia, que puede o no ser cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones, se sabe que el sujeto de control tiene una etapa tardía, que puede o no ser cáncer que expresa CD123.
Métodos para monitorizar el cáncer
[0176] En este documento se proporcionan métodos para monitorizar el cáncer que expresa CD123 en un sujeto. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa CD123 incluye un cáncer hematológico, tal como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN). En algunas realizaciones, los métodos descritos implican evaluar si el cáncer que expresa CD123 está progresando, retrocediendo o permaneciendo estable determinando la cantidad de CD123 que está presente en una muestra de prueba derivada del sujeto; y comparar la cantidad observada de CD123 con la cantidad de CD123 en una muestra biológica obtenida, de manera similar, del sujeto en un punto anterior en el tiempo, en donde una diferencia entre la cantidad de CD123 en la muestra de prueba y la muestra anterior proporciona Una indicación de si el cáncer está progresando, retrocediendo o permaneciendo estable. A este respecto, una muestra de prueba con una mayor cantidad de CD123, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la progresión de un cáncer que expresa CD123. Por el contrario, una muestra de prueba con una cantidad disminuida de CD123, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la regresión de un cáncer que expresa CD123.
[0177] En consecuencia, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en la cantidad de CD123, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar un estado de enfermedad estable para un cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones, la cantidad de CD123 en una muestra biológica derivada del sujeto se evalúa poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que se une específicamente a CD123, tal como los anticuerpos descritos aquí. La muestra evaluada para la presencia de CD123 puede derivarse de orina, sangre, suero, plasma, saliva, ascitis, células circulantes, células tumorales circulantes, células que no están asociadas a tejidos (es decir, células libres), tejidos (p. ej., tejido tumoral resecado quirúrgicamente, biopsias, incluida la aspiración con aguja fina), preparaciones histológicas y similares. En algunas realizaciones, el sujeto es un humano.
[0178] En algunas realizaciones, los métodos para monitorizar un cáncer que expresa CD123 implicarán: poner en contacto una muestra biológica de un sujeto con un anticuerpo específico de CD123, o un fragmento de unión a antígeno del mismo (como los derivados de los anticuerpos y fragmentos proporcionados en Tabla 1), cuantificando la cantidad de CD123 presente en la muestra, comparando la cantidad de CD123 presente en la muestra con la cantidad de CD123 determinada en una muestra biológica obtenida, de manera similar, del mismo sujeto en un momento anterior; y determinar si el nivel de CD123 del sujeto ha cambiado con el tiempo. Una muestra de prueba con una mayor cantidad de CD123, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la progresión del cáncer. Por el contrario, una muestra de prueba con una cantidad disminuida de CD123, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar la regresión de un cáncer que expresa CD123. En consecuencia, una muestra de prueba con una diferencia insignificante en la cantidad de CD123, en relación con la cantidad observada para la muestra anterior, puede indicar un estado de enfermedad estable para un cáncer que expresa CD123. En algunas realizaciones, los niveles de CD123 de la muestra pueden compararse con un estándar conocido o una muestra de referencia, solo o además de los niveles de CD123 observados para una muestra evaluada en un momento anterior. En una realización adicional, el método de diagnóstico puede seguirse con una etapa adicional de administrar un tratamiento específico para el cáncer. En algunas realizaciones, el tratamiento específico para el cáncer puede dirigirse contra cánceres que expresan CD123, tales como los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos aquí.
[0179] En diversos aspectos, la cantidad de CD123 se determina poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD123. En algunas realizaciones, la muestra puede contactarse por más de un tipo de anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente CD123. En algunas realizaciones, la muestra puede ponerse en contacto con un primer anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD123 y luego ponerse en contacto con un segundo anticuerpo, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD123. Los anticuerpos como los descritos en este documento pueden usarse en esta capacidad.
[0180] Se pueden usar diversas combinaciones de los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno descritos en la Tabla 1 para proporcionar un "primer" y "segundo" anticuerpo o fragmento de unión al antígeno para llevar a cabo los métodos de monitorización descritos. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa CD123 incluye un cáncer hematológico, tal como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN).
[0181] En ciertas realizaciones, la cantidad de CD123 se determina mediante análisis de transferencia Western, radioinmunoensayo, inmunofluorimetría, inmunoprecipitación, diálisis de equilibrio, inmunodifusión, inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECL), inmunohistoquímica, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o ensayo ELISA.
Kits para detectar CD123
[0182] En este documento se proporcionan kits para detectar CD123 en una muestra biológica. Estos kits incluyen uno o más de los anticuerpos específicos para CD123 descritos en este documento, o un fragmento de unión a antígeno de los mismos, e instrucciones para el uso del kit.
[0183] El anticuerpo específico de CD123 proporcionado, o fragmento de unión a antígeno, puede estar en solución; liofilizado; pegado a un sustrato, soporte o placa; o detectablemente marcado.
[0184] Los kits descritos también pueden incluir componentes adicionales útiles para realizar los métodos descritos en este documento. A modo de ejemplo, los kits pueden comprender medios para obtener una muestra de un sujeto, una muestra de control o de referencia, por ejemplo, una muestra de un sujeto que tiene cáncer que progresa lentamente y/o un sujeto que no tiene cáncer, uno o más compartimentos de muestra, y/o material de instrucción que describe el rendimiento de un método de la invención y controles o estándares específicos de tejido.
[0185] Los medios para determinar el nivel de CD123 pueden incluir además, por ejemplo, tampones u otros reactivos para su uso en un ensayo para determinar el nivel de CD 23. Las instrucciones pueden ser, por ejemplo, instrucciones impresas para realizar el ensayo y/o instrucciones para evaluar el nivel de expresión de CD123.
[0186] Los kits descritos también pueden incluir medios para aislar una muestra de un sujeto. Estos medios pueden comprender uno o más elementos de equipo o reactivos que pueden usarse para obtener un fluido o tejido de un sujeto. Los medios para obtener una muestra de un sujeto también pueden comprender medios para aislar componentes sanguíneos, tales como suero, de una muestra de sangre. Preferiblemente, el kit está diseñado para su uso con un sujeto humano.
Anticuerpos multiespecíficos
[0187] Los dominios de unión de los anticuerpos anti-CD 123 descritos en este documento reconocen las células que expresan CD123 en su superficie como se señaló anteriormente, la expresión de CD123 puede ser indicativa de una célula cancerosa. Se puede lograr una orientación más específica a subconjuntos particulares de células haciendo moléculas biespecíficas, como anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, que se unen a CD123 y a otra diana. Ejemplos de tales dianas adicionales incluyen CD3 y CD33. Esto se logra haciendo una molécula que comprende una primera región que se une al CD123 y una segunda región que se une al antígeno adicional. Las regiones de unión a antígeno pueden tomar cualquier forma que permita el reconocimiento específico de la diana, por ejemplo, la región de unión puede ser o puede incluir un dominio variable de cadena pesada o un Fv (combinación de un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera). Por consiguiente, se proporcionan moléculas biespecíficas que comprenden dos regiones de unión a antígeno diferentes que se unen a CD123 y otro antígeno, respectivamente.
[0188] Algunos de los anticuerpos multiespecíficos descritos en el presente documento comprenden dos regiones de unión a antígeno diferentes que se unen a CD123 y CD3, respectivamente. En realizaciones preferidas, se proporcionan anticuerpos multiespecíficos que se unen a CD123 y CD3 (CD123 x CD3-anticuerpos multiespecíficos) y fragmentos de unión a antígeno multiespecíficos de los mismos. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 comprende una primera cadena pesada (HCl) y una primera cadena ligera (LC1) que se emparejan para formar un primer sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD123 y una segunda cadena pesada (HC2) y una segunda cadena ligera (LC2) que se empareja para formar un segundo sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 es un anticuerpo biespecífico que comprende un brazo específico de CD123 que comprende una primera cadena pesada (HC1) y una primera cadena ligera (LC1) que se emparejan para formar un primer sitio de unión a antígeno que une inmunoespecíficamente CD123 y un brazo específico de CD3 que comprende una segunda cadena pesada (HC2) y una segunda cadena ligera (LC2) que se emparejan para formar un segundo sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD3. En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos de la invención incluyen anticuerpos que tienen una estructura de anticuerpos de longitud completa. "Anticuerpo de longitud completa" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas de anticuerpos de longitud completa y dos cadenas ligeras de anticuerpos de longitud completa. Una cadena pesada de anticuerpo de longitud completa (HC) incluye dominios variables y constantes de cadena pesada VH, CHI, CH2 y CH3. Una cadena ligera de anticuerpos (LC) de longitud completa incluye dominios variables y constantes de cadena ligera VL y CL. El anticuerpo de longitud completa puede carecer de lisina C-terminal (K) en una o ambas cadenas pesadas. El término "brazo Fab " o "media molécula" se refiere a un par de cadena pesada-cadena ligera que se une específicamente a un antígeno.
[0189] El brazo de unión a CD123 de los anticuerpos multiespecíficos proporcionados en el presente documento puede derivarse de cualquiera de los anticuerpos específicos a CD123 descritos anteriormente. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD123 se une a un epítopo que incluye uno o más residuos de (i) el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 195 - 202 (RAr ErVYE (SEQ ID NO: 234)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 173-178 (TEQVRDR (SEQ ID nO: 233) o (ii) el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 164-175 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 184­ 189 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)). En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD123 compite para unirse a CD123 con un anticuerpo específico de CD123 o fragmento de unión a antígeno que se une a un epítopo que incluye uno o más residuos de (i) el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 195 - 202 (RARERVYE (SEQ ID NO: 234)) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 156-161 (RKFRYE (SEQ ID NO: 232 y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 173-178 (T EQVRDR (SEQ iD NO: 233)) o (ii) el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 164-175 (Iq KrMQPVITeQ (SEQ ID NO: 228 )) y/o el segmento de CD123 ECD SP2 que comprende los residuos 184-189 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)). Los brazos de unión a CD123 que se unen a al menos un residuo en estos epítopos también pueden unirse a residuos adicionales en el ECD de CD123. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD123 es neutralizante. Un brazo neutralizador de unión a CD123 incluye aquellos que son capaces de inhibir la unión de IL-3 a CD123 según se determina midiendo la disminución de la fosforilación de STAT5 tras la estimulación de células TF-1 con rhIL-3. En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a CD123 se une a CD123 humano SP1, preferiblemente el dominio extracelular del mismo.
[0190] En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a CD123 SP1, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende una cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 derivada de un clon de anticuerpo I3RB2 o I3RB18 como se describe en la Tabla 1. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a CD123 SP1, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 derivadas de un clon de anticuerpo I3RB2 o I3RB18 como se describe en la Tabla 1. En algunas realizaciones ejemplares de la divulgación de tales brazos de unión a CD123 SP1, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 del clon I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40, o I3RB47. En algunas realizaciones ejemplares de la divulgación de tales brazos de unión a CD123 SP1, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende cadena pesada CDR1, CDR2 y CDR3 y cadena ligera CDR1, CDR2 y CDR3 del clon I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12,13RB16,13RB17,13RB18,13RB19,13RB20,13RB21,13RB22,13RB24,13RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40, o I3RB47. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a CD123 SP1, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende un dominio variable de cadena pesada derivado de un clon de anticuerpo I3RB2 o I3RB18 como se describe en la Tabla 1. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión CD123 SP1, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende dominio variable de cadena pesada y dominio variable de cadena ligera derivados de un clon de anticuerpo I3RB2 o I3RB18 como se describe en la Tabla 1. En algunas realizaciones ejemplares de la divulgación de tales brazos de unión a CD123 SP1, la primera región de unión a antígeno que une CD123 comprende el dominio variable de cadena pesada del clon I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40, o I3RB47. En algunas realizaciones ejemplares de la divulgación de tales brazos de unión a CD123 SP1, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera del clon I3RB1, I3RB2, I3RB5, I3RB6, I3RB7, I3RB8, I3RB9, I3RB11, I3RB12, I3RB16, I3RB17, I3RB18, I3RB19, I3RB20, I3RB21, I3RB22, I3RB24, I3RB28, I3RB29, I3RB30, I3RB32, I3RB33, I3RB34, I3RB35, I3RB36, I3RB37, I3RB38, I3RB40, o I3RB47.
[0191] En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a CD123 se une a CD123 SP2 humano, preferiblemente el dominio extracelular del mismo. En realizaciones preferidas de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a CD123 se une a CD123 SP1 humano y CD2 SP2 humano, y más preferiblemente a los dominios extracelulares de los mismos. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a CD123 SP2, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende CDR1, CDR2 y cadena pesada CDR3 del clon I3RB2 o I3RB18. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a CD123 SP2, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende CDR1, CDR2 y cadena pesada CDR3 y CDR1, CDR2 y cadena ligera CDR3 del clon I3RB2 o I3RB18. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a CD123 SP2, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende el dominio variable de la cadena pesada del clon I3RB2 o I3RB18. En algunas realizaciones ejemplares de tales brazos de unión a CD123 SP2, la primera región de unión a antígeno que se une a CD123 comprende el dominio variable de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera del clon I3RB2 o I3RB18.
[0192] En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a CD123 también se une al CD12 de cynomolgus, preferiblemente el dominio extracelular del mismo.
[0193] En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a CD123 se deriva de un anticuerpo específico de CD123 que compite por unirse a CD123 con el clon de anticuerpo I3RB2, I3RB60, I3RB70, I3RB79 o I3RB118. En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a CD123 se deriva de un anticuerpo específico de CD123 que compite por unirse a CD123 con el clon de anticuerpo I3RB18, I3RB49 o I3RB55. La competencia por la unión se puede determinar usando un ELISA de unión por competición, en línea con la técnica descrita a continuación en el Ejemplo 5. La unión competitiva se puede determinar detectando al menos el 20% de inhibición de la unión de un primer anticuerpo por un segundo anticuerpo, independientemente del orden en donde los anticuerpos se unen a CD123 (es decir, cuando el anticuerpo A se une a CD123 antes que el anticuerpo B, solo se observa un 10% de inhibición, pero cuando el anticuerpo B se une a CD123 antes del anticuerpo A, se observa un 30% de inhibición, entonces porque se ha observado una inhibición superior al 20% en uno de los experimentos, se puede concluir la unión competitiva).
[0194] En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD123 del anticuerpo multiespecífico es IgG, o un derivado del mismo, por ejemplo, isotipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunas realizaciones en las que el brazo de unión a CD123 tiene un isotipo IgG1, contiene las sustituciones L234A, L235A y K409R en su región Fc. En algunas realizaciones en las que el brazo de unión a CD123 tiene un isotipo IgG4, contiene las sustituciones S228P, L234A y L235A en su región Fc.
[0195] En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el segundo brazo de unión a antígeno se une a CD3 humano. En algunas realizaciones preferidas, el brazo específico de CD3 del anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 se deriva de un anticuerpo específico de CD3 que se une y activa las células T primarias humanas y/o las células T primarias de mono cynomolgus. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 se une a un epítopo en el extremo N de CD3s. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 contacta con un epítopo que incluye los seis aminoácidos N-terminales de CD3e. En algunas realizaciones, el brazo de unión específico de CD3 del anticuerpo biespecífico se deriva del anticuerpo monoclonal de ratón SP34, un isotipo IgG3/lambda de ratón. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 comprende las CDR del anticuerpo SP34. Dichos brazos de unión a CD3 pueden unirse a CD3 con una afinidad de 5x10-7 M o menos, como 1x10-7 M o menos, 5x10-8 M o menos, 1x10-8 M o menos, 5x10-9 M o menos, o 1x10-9 M o menos. El brazo de unión específico de CD3 puede ser una versión humanizada de un brazo de anticuerpo monoclonal de ratón SP34. La adaptación del marco humano (HFA) puede usarse para humanizar el anticuerpo anti-CD3 del que se deriva el brazo específico de CD3. En algunas realizaciones de los anticuerpos biespecíficos, el brazo de unión a CD3 comprende un par de cadena pesada y cadena ligera seleccionados de la Tabla 2. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 del anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 se deriva de la Tabla 3.
[0196] En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 es IgG, o un derivado del mismo. En algunas realizaciones, el brazo de unión a CD3 es IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. En algunas realizaciones en las que el brazo de unión a CD3 tiene un isotipo IgG1, contiene las sustituciones L234A, L235A y F405L en su región Fc. En algunas realizaciones en las que el brazo de unión a CD3 tiene un isotipo IgG4, contiene las sustituciones S228P, L234A, L235A, F405L y R409K en su región Fc. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno son IgG-AA Fc. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno son IgG-AA Fc-L234A, L235A y F405L. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno se unen a CD3 en las células T humanas primarias. En algunas realizaciones, los anticuerpos o los fragmentos de unión a antígeno se unen a CD3e en las células T del cynomolgus primario. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno se unen a CD3s en células T primarias humanas y de cynomolgus. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno activan las células T CD4+ humanas primarias. En algunas realizaciones, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno activan las células T CD4+ cynomolgus primarias.
[0197] En algunas realizaciones, se proporciona un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 que tiene un brazo de unión a CD123 que comprende una cadena pesada del clon de anticuerpo I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB181, I3RB181, I3RB181, I3RB18, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435 o Ab 5466. En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 que tiene un brazo de unión a CD123 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera del clon de anticuerpo I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435 o Ab 5466. En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 que tiene un brazo de unión a CD3 que comprende una cadena pesada del clon de anticuerpo I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab 3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435 o Ab 5466. En algunas realizaciones se proporcionan un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 que tiene un brazo de unión a CD3 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera del clon de anticuerpo I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab 3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435, o Ab 5466. En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 que tiene un brazo de unión a CD123 que comprende una cadena pesada del clon de anticuerpo I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB189, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188, I3RB188 CD3B191, mAB 7959, Ab 3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435 o Ab 5466 y un brazo de unión a CD3 que comprende una cadena pesada del clon de anticuerpo I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, AbB 7959, Ab3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435 o Ab 5466. En algunas realizaciones se proporciona un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 que tiene un brazo de unión CD123 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera del clon de anticuerpos I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB 189, CD3B191, Ab 7959, Ab 3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435 o Ab 5466 y un brazo de unión a CD3 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera del clon de anticuerpo I3RB179, I3RB180, I3RB181, I3RB182, I3RB183, I3RB186, I3RB187, I3RB188, I3RB189, CD3B191, Ab 7959, Ab 3978, Ab 7955, Ab 9958, Ab 8747, Ab 8876, Ab 4435 o Ab 5466.
[0198] Los anticuerpos biespecíficos preferidos CD123 x CD3 se proporcionan en las Tablas 13 y 17.
[0199] Diferentes formatos de anticuerpos biespecíficos se han descrito y han sido recientemente revisados por Chames y Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276.
[0200] En algunas realizaciones, el anticuerpo biespecífico de la presente invención es un diacuerpo, un cuerpo cruzado o un anticuerpo biespecífico obtenido mediante un intercambio de brazo Fab controlado como los descritos en la presente invención.
[0201] En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos incluyen moléculas similares a IgG con dominios CH3 complementarios para forzar la heterodimerización; moléculas de doble diana similares a IgG recombinantes, en las que los dos lados de la molécula contienen cada uno el fragmento Fab o parte del fragmento Fab de al menos dos anticuerpos diferentes; moléculas de fusión de IgG, en las que los anticuerpos IgG de longitud completa se fusionan con un fragmento Fab adicional o partes del fragmento Fab; moléculas de fusión de Fc, en donde las moléculas de Fv de cadena sencilla o los cuerpos estabilizados se fusionan con dominios constantes de cadena pesada, regiones de Fc o partes de los mismos; moléculas de fusión Fab, en donde diferentes fragmentos Fab se fusionan entre sí; anticuerpos ScFv y de cadena pesada y basados en diacuerpo (p. ej., anticuerpos de dominio, nanocuerpos) en donde diferentes moléculas Fv de cadena sencilla o diferentes diacuerpos o anticuerpos de cadena pesada diferentes (p. ej., anticuerpos de dominio, nanocuerpos) se fusionan entre sí o con otra proteína o molécula portadora.
[0202] En algunas realizaciones, las moléculas similares a IgG con moléculas de dominios CH3 complementarios incluyen Triomab/Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), Knobs-into-Holes (Genentech), CrossMAbs (Roche) y electrostáticamente emparejados (Amgen), el LUZ-Y (Genentech), el cuerpo de dominio diseñado por Strand Exchange (SEED-body) (Em D Serono), el Biclonic (Merus) y el DuoBody (Genmab A/S).
[0203] En algunas realizaciones, las moléculas de doble diana similares a IgG recombinantes incluyen la doble diana (DT)-Ig (GSK/Domantis), el anticuerpo dos en uno (Genentech), los Mabs reticulados (Karmanos Cancer Center), mAb2 (F-Star) y CovX-body (CovX/Pfizer).
[0204] En algunas realizaciones, las moléculas de fusión de IgG incluyen dominio variable dual (DVD)-Ig (Abbott), biespecífico similar a IgG (InnClone/Eli Lilly), Ts2Ab (MedImmune/AZ) y BsAb (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) y TvAb (Roche).
[0205] En algunas realizaciones, las moléculas de fusión de Fc incluyen Fusiones ScFv/Fc (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), Tecnología de retardo de afinidad dual (Fc-DART) (MacroGenics) y Dual(ScFv)2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China).
[0206] En algunas realizaciones, los anticuerpos biespecíficos de fusión Fab incluyen F(ab)2 (Medarex/AMGEN), Dual-Action o BisFab (Genentech), Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics), Bivalent Bispecific (Biotecnol) y Fab-Fv (UCB-Celltech). Los anticuerpos ScFv, basados en diacuerpo y de dominio incluyen, pero no se limitan a, potenciador de células T biespecífico (BITE) (Micromet), Diacuerpo en tándem (Tandab) (Affimed), Tecnología de retardo de afinidad dual (DART) (MacroGenics), Diacuerpo de cadena simple (Académico), Anticuerpos tipo TCR (AIT, ReceptorLogics), Albúmina de suero humano ScFv Fusion (Merrimack) y COMBODY (Epigen Biotech), nanocuerpos de doble diana (Ablynx), anticuerpos de dominio de cadena pesada solo de doble diana.
[0207] Anticuerpos biespecíficos de longitud completa de la invención pueden ser generados por ejemplo usando el intercambio de brazo Fab (o el intercambio de media molécula) entre dos anticuerpos bivalentes mono específicos mediante la introducción de sustituciones en la cadena pesada interfaz CH3 en cada media molécula para favorecer la formación de heterodímeros de dos medias moléculas de anticuerpo que tienen una especificidad distinta in vitro en un entorno libre de células o que usan la coexpresión. La reacción de intercambio del brazo Fab es el resultado de una reacción de isomerización de disulfuro de unión y asociación de disociación de dominios CH3. Se reducen los enlaces disulfuro de la cadena pesada en las regiones de bisagra de los anticuerpos mono específicos específicos. Las cisteínas libres resultantes de uno de los anticuerpos monoespecíficos parentales forman un enlace disulfuro de cadena pesada entre los residuos de cisteína de una segunda molécula de anticuerpo monoespecífico parental y simultáneamente los dominios CH3 de los anticuerpos parentales se liberan y reforman por asociación de disociación. Los dominios CH3 de los brazos Fab pueden diseñarse para favorecer la heterodimerización sobre la homodimerización. El producto resultante es un anticuerpo biespecífico que tiene dos brazos Fab o medias moléculas que se unen cada uno a un epítopo distinto, es decir, un epítopo en CD123 (IL3-Ra) y un epítopo en CD3.
[0208] "Homodimerización" como se usa en el presente documento se refiere a una interacción de dos cadenas pesadas que tienen secuencias de aminoácidos CH3 idénticas. "Homodímero" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas con secuencias de aminoácidos CH3 idénticas.
[0209] "Heterodimerización" como se usa en el presente documento se refiere a una interacción de dos cadenas pesadas que tienen secuencias de aminoácidos CH3 no idénticas. "Heterodímero", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo que tiene dos cadenas pesadas con secuencias de aminoácidos CH3 no idénticas.
[0210] La estrategia de "perilla en el agujero" (véase, por ejemplo, Publ. Int. PCT N° WO 2006/028936) puede usarse para generar anticuerpos biespecíficos de longitud completa. Brevemente, los aminoácidos seleccionados que forman la interfaz de los dominios CH3 en la IgG humana pueden mutarse en posiciones que afectan las interacciones del dominio CH3 para promover la formación de heterodímeros. Un aminoácido con una pequeña cadena lateral (agujero) se introduce en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un primer antígeno y un aminoácido con una cadena lateral grande (botón) se introduce en una cadena pesada de un anticuerpo que se une específicamente a un segundo antígeno. Después de la coexpresión de los dos anticuerpos, se forma un heterodímero como resultado de la interacción preferencial de la cadena pesada con un "agujero" con la cadena pesada con un "botón". Los ejemplos de pares de sustitución CH3 que forman un botón y un agujero son (expresados como posición modificada en el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S y T366W/T366S_L368A_Y407V.
[0211] Se pueden usar otras estrategias tales como promover la heterodimerización de la cadena pesada usando interacciones electrostáticas mediante la sustitución de residuos cargados positivamente en una superficie CH3 y residuos cargados negativamente en una segunda superficie CH3, como se describe en la Pat. Publ. de EE.UU. N° US2010/0015133; Pat. Publ. N2 US2009/0182127; Pat. Publ. N2 US2010/028637 o la Pat. Publ. de EE.UU. N2 US2011/0123532. En otras estrategias, la heterodimerización puede promoverse mediante las siguientes sustituciones (expresadas como posición modificada en el primer dominio CH3 de la primera cadena pesada/posición modificada en el segundo dominio CH3 de la segunda cadena pesada): L351Y _ f405AY407V/T394W, T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, or T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W como se ha descrito en Pat. Publ. de EE.UU. N° US2012/0149876 o Pat. Publ. de EE.UU. N° US2013/0195849.
[0212] Además de los métodos descritos anteriormente, los anticuerpos biespecíficos de la invención pueden generarse in vitro en un entorno libre de células introduciendo mutaciones asimétricas en las regiones CH3 de dos anticuerpos homodiméricos monoespecíficos y formando el anticuerpo heterodimérico biespecífico a partir de dos monoespecíficos parentales anticuerpos homodiméricos en condiciones reductoras para permitir la isomerización del enlace disulfuro de acuerdo con los métodos descritos en Pat. Int. Publ. N° WO2011/131746. En los métodos, el primer anticuerpo bivalente monoespecífico (p. ej., anticuerpo anti-CD123 (IL3-Ra)) y el segundo anticuerpo bivalente monoespecífico (p. ej., anticuerpo anti-CD3) están diseñados para tener ciertas sustituciones en el dominio CH3 que promueve la estabilidad de heterodímero; los anticuerpos se incuban juntos en condiciones reductoras suficientes para permitir que las cisteínas en la región bisagra experimenten isomerización del enlace disulfuro; generando de ese modo el anticuerpo biespecífico por intercambio de brazo Fab. Las condiciones de incubación pueden restaurarse óptimamente a condiciones no reductoras. Ejemplos de agentes reductores que pueden usarse son 2-mercaptoetilamina (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutatión, tris (2-carboxietil)fosfina (TCEP), L-cisteína y beta-mercaptoetanol, preferiblemente un agente reductor seleccionado del grupo que consiste en: 2 -mercaptoetilamina, ditiotreitol y tris (2-carboxietil)fosfina. Por ejemplo, incubación durante al menos 90 minutos a una temperatura de al menos 20 °C en presencia de al menos 2 mEA 25 mM o en presencia de ditiotreitol se puede usar al menos 0,5 mM a un pH de 5-8, por ejemplo a un pH de 7,0 o un pH de 7,4.
[0213] Además de los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos, también se proporcionan secuencias polinucleotídicas capaces de codificar los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 descritos. También se proporcionan vectores que comprenden los polinucleótidos descritos, al igual que las células que expresan los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 proporcionados aquí. También se describen células capaces de expresar los vectores descritos. Estas células pueden ser células de mamíferos (como células 293F, células CHO), células de insectos (como células Sf7), células de levadura, células vegetales o células bacterianas (como E. coli). Los anticuerpos descritos también pueden ser producidos por células de hibridoma.
Composición terapéutica y métodos de tratamiento usando anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de unión a antígeno multiespecíficos de los mismos.
[0214] Los anticuerpos biespecíficos CD123 discutidos anteriormente, por ejemplo los anticuerpos biespecíficos CD123 x CD3 discutidos anteriormente, son útiles en la terapia. En particular, los anticuerpos biespecíficos CD123 son útiles en el tratamiento del cáncer. También se proporcionan en el presente documento composiciones terapéuticas para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno multiespecífico descrito en este documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico CD123 x CD3 del mismo. En una realización, dicha composición farmacéutica es para el tratamiento de un cáncer que expresa CD123, que incluye (pero no se limita a) lo siguiente: cánceres hematológicos que expresan CD123, tales como leucemia mieloide aguda (AML), síndrome mielodisplásico (SMD, bajo o alto riesgo), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma difuso de células grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN); y otros cánceres aún por determinar en los que se expresa CD123. Los anticuerpos biespecíficos particulares que se pueden usar para tratar el cáncer, como el cáncer hematológico, incluidos los cánceres específicos discutidos anteriormente, incluyen los anticuerpos 7959, 3978, 7955, 9958, 8747, 4435 y 5466. Un ejemplo de un anticuerpo biespecífico útil para tratar el cáncer, como el cáncer hematológico, que incluye estos cánceres específicos es el anticuerpo 9958. Otro ejemplo de un anticuerpo biespecífico útil para tratar el cáncer, como el cáncer hematológico, que incluye estos cánceres específicos es el anticuerpo 3978. Otro ejemplo de un anticuerpo biespecífico útil para tratar el cáncer, como cáncer hematológico, que incluye estos cánceres específicos es el anticuerpo 8747. Otro ejemplo de un anticuerpo biespecífico útil para tratar el cáncer, como el cáncer hematológico, que incluye estos cánceres específicos es el anticuerpo 7959.
[0215] Las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento comprenden: a) una cantidad efectiva de un anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo de la presente invención, y b) un portador farmacéuticamente aceptable, que puede ser inerte o fisiológicamente activo. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 como se describe en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno biespecífico CD123 x CD3 del mismo. Como se usa en el presente documento, el término "vehículos farmacéuticamente aceptables" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como cualquier combinación de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, como azúcares, polialcoholes o cloruro de sodio en la composición. En particular, los ejemplos relevantes de vehículo adecuado incluyen: (1) solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, pH aproximadamente 7,4, que contiene o no contiene aproximadamente 1 mg/ml a 25 mg/ml de albúmina de suero humano, (2) solución salina al 0,9% (0,9% p/v de cloruro de sodio (NaCl)) y (3) 5% (p/v) de dextrosa; y también puede contener un antioxidante como la triptamina y un agente estabilizante como Tween 20 ®.
[0216] Las composiciones de la presente memoria también pueden contener un agente terapéutico adicional, según sea necesario para el trastorno particular que se está tratando. Preferiblemente, el anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo y el compuesto activo suplementario tendrán actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es citarabina, una antraciclina, diclorhidrato de histamina o interleucina 2. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico.
[0217] Las composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, pero la forma preferida depende del modo de administración previsto y la aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infusibles. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, intramuscular, intraperinoneal, subcutáneo). En una realización preferida, las composiciones de la invención se administran por vía intravenosa como un bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo. En otra realización preferida, se inyectan por vía intramuscular, subcutánea, intraarticular, intrasinovial, intratumoral, peritumoral, intralesional o perilesional, para ejercer efectos terapéuticos tanto locales como sistémicos.
[0218] Las composiciones estériles para administración parenteral se pueden preparar incorporando el anticuerpo, fragmento de anticuerpo o conjugado de anticuerpo de la presente invención en la cantidad requerida en el disolvente apropiado, seguido de esterilización por microfiltración. Como disolvente o vehículo, se puede usar agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como una combinación de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, como azúcares, polialcoholes o cloruro de sodio en la composición. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, en particular agentes humectantes, isotonizantes, emulsionantes, dispersantes y estabilizantes. Las composiciones estériles para administración parenteral también pueden prepararse en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse en el momento del uso en agua estéril o cualquier otro medio estéril inyectable.
[0219] El anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo también puede administrarse por vía oral. Como composiciones sólidas para administración oral, se pueden usar tabletas, píldoras, polvos (cápsulas de gelatina, bolsitas) o gránulos. En estas composiciones, el ingrediente activo de acuerdo con la invención se mezcla con uno o más diluyentes inertes, tales como almidón, celulosa, sacarosa, lactosa o sílice, bajo una corriente de argón. Estas composiciones también pueden comprender sustancias diferentes a los diluyentes, por ejemplo uno o más lubricantes tales como estearato de magnesio o talco, un colorante, un recubrimiento (tableta recubierta de azúcar) o un esmalte.
[0220] Como composiciones líquidas para administración oral, se pueden usar soluciones farmacéuticamente aceptables, suspensiones, emulsiones, jarabes y elixires que contienen diluyentes inertes tales como agua, etanol, glicerol, aceites vegetales o aceite de parafina. Estas composiciones pueden comprender sustancias distintas de diluyentes, por ejemplo, productos humectantes, edulcorantes, espesantes, aromatizantes o estabilizantes.
[0221] Las dosis dependen del efecto deseado, la duración del tratamiento y la vía de administración utilizada; generalmente son entre 5 mg y 1000 mg por día por vía oral para un adulto con dosis unitarias que varían de 1 mg a 250 mg de sustancia activa. En general, el médico determinará la dosis adecuada en función de la edad, el peso y cualquier otro factor específico del sujeto a tratar.
[0222] También se proporcionan en el presente documento métodos para matar una célula CD123 administrando a un paciente que lo necesita un anticuerpo multiespecífico que se une a dicho CD123 y es capaz de reclutar células T para matar dicha célula CD123 (es decir, redirección de células T). Cualquiera de los anticuerpos multiespecíficos o fragmentos de anticuerpos de la invención puede usarse terapéuticamente. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento biespecífico de unión a antígeno CD123 x CD3 del mismo.
[0223] En una realización preferida, los anticuerpos multiespecíficos o fragmentos de anticuerpos de la invención se usan para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En una realización más preferida, una de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente, y que contiene un anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo de la invención, se usa para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo en un mamífero. En una realización, el trastorno es un cáncer. En particular, el cáncer es un cáncer que expresa CD123, que incluye (pero no se limita a) lo siguiente: cánceres hematológicos que expresan CD123, como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN); y otros cánceres aún por determinar en los que se expresa CD123. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 como se describe en el presente documento, o un fragmento multiespecífico de unión al antígeno, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento biespecífico de unión a antígeno CD123 x CD3 del mismo.
[0224] Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas de la invención son útiles en el tratamiento o prevención de una variedad de cánceres, que incluyen (pero no se limitan a) lo siguiente: un cáncer que expresa CD123, que incluye (pero no se limita a) lo siguiente: cánceres hematológicos que expresan CD123, como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMD, riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC), o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN); y otros cánceres aún por determinar en los que se expresa CD123.
[0225] De forma similar, se describe adicionalmente en el presente documento un método para inhibir el crecimiento de poblaciones de células seleccionadas que comprende poner en contacto células diana que expresan CD123, o tejido que contiene tales células diana, con una cantidad eficaz de un anticuerpo multiespecífico o fragmento de anticuerpo de la presente invención, ya sea solo o en combinación con otros agentes citotóxicos o terapéuticos, en presencia de una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento biespecífico de unión a antígeno CD123 x CD3 del mismo. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es citarabina, una antraciclina, diclorhidrato de histamina o interleucina 2. En una realización preferida, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico. El método para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas se puede practicar in vitro, in vivo o ex vivo.
[0226] Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de médula ósea autóloga antes de su trasplante en el mismo paciente para matar células enfermas o malignas; tratamientos de médula ósea antes de su trasplante para matar células T competentes y prevenir la enfermedad de injerto contra huésped (EICH); tratamientos de cultivos celulares para matar todas las células excepto las variantes deseadas que no expresan el antígeno diana; o para matar variantes que expresan antígeno no deseado. Las condiciones de uso in vitro no clínico se determinan fácilmente por un experto en la materia.
[0227] Ejemplos de uso clínico ex vivo son la eliminación de células tumorales de la médula ósea antes del trasplante autólogo en el tratamiento del cáncer. El tratamiento puede llevarse a cabo de la siguiente manera. La médula ósea se cosecha del paciente u otro individuo y luego se incuba en un medio que contiene suero al que se agrega el agente citotóxico de la invención. Las concentraciones varían de aproximadamente 10 uM a 1 uM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37°C. Un experto en la materia determina fácilmente las condiciones exactas de concentración y el tiempo de incubación, es decir, la dosis. Después de la incubación, las células de la médula ósea se lavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente mediante infusión intravenosa de acuerdo con métodos conocidos. En circunstancias en las que el paciente recibe otro tratamiento, como un ciclo de quimioterapia ablativa o irradiación total del cuerpo entre el momento de la recogida de la médula y la reinfusión de las células tratadas, las células de la médula tratada se almacenan congeladas en nitrógeno líquido utilizando equipo médico estándar.
[0228] Para uso clínico in vivo, se administra una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno a un sujeto que lo necesita. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos CD123 x CD3 y sus fragmentos de unión a antígeno multiespecíficos pueden ser útiles en el tratamiento de un cáncer que expresa CD123 en un sujeto que lo necesite. En algunas realizaciones, el cáncer que expresa CD123 es un cáncer hematológico, como leucemia mieloide aguda (LMA), síndrome mielodisplásico (SMd , riesgo bajo o alto), leucemia linfocítica aguda (LLA, incluidos todos los subtipos), células B grandes difusas linfoma (DLBCL), leucemia mieloide crónica (LMC) o neoplasia de células dendríticas plasmocitoides blásticas (DPDCN). En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento biespecífico de unión a antígeno CD123 x CD3 del mismo. En algunas realizaciones, el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano. En algunas realizaciones, el anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno se administrará como una solución que se ha probado para esterilidad.
[0229] Los regímenes de dosificación en los métodos de tratamiento y usos anteriores se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar un solo bolo, se pueden administrar varias dosis divididas con el tiempo o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Las composiciones parenterales se pueden formular en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y la uniformidad de la dosificación.
[0230] Las dosis eficientes y los regímenes de dosificación para los anticuerpos y fragmentos multiespecíficos dependen de la enfermedad o afección a tratar y puede ser determinada por un experto en la materia. Un intervalo no limitativo ejemplar para una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la presente invención es de aproximadamente 0,001-10 mg/kg, tal como aproximadamente 0,001-5 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0,001­ 2 mg/kg, tal como aproximadamente 0 ,001 -1 mg/kg, por ejemplo aproximadamente 0 ,001 , aproximadamente 0 ,01 , aproximadamente 0 ,1 , aproximadamente 1 o aproximadamente 10 mg/kg.
[0231] Un médico o veterinario con experiencia ordinaria en la técnica puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad efectiva de la composición farmacéutica requerida. Por ejemplo, el médico o el veterinario podrían comenzar las dosis del anticuerpo o fragmento multiespecífico empleado en la composición farmacéutica a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapéutico deseado y aumentar gradualmente la dosis hasta que se logre el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de un anticuerpo biespecífico de la presente invención será la cantidad del compuesto que sea la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. La administración puede ser, por ejemplo, parenteral, como intravenosa, intramuscular o subcutánea. En una realización, el anticuerpo multiespecífico o fragmento se pueden administrar por infusión en una dosis semanal calculada por mg/m2. Dichas dosis pueden, por ejemplo, basarse en las dosis de mg/kg proporcionadas anteriormente de acuerdo con lo siguiente: dosis (mg/kg) x70: 1,8. Dicha administración puede repetirse, por ejemplo, 1 a 8 veces, tal como 3 a 5 veces. La administración puede realizarse por infusión continua durante un período de 2 a 24 h, tal como de 2 a 12 h. En una realización, el anticuerpo o fragmento multiespecífico se puede administrar mediante infusión continua lenta durante un período prolongado, tal como más de 24 horas, para reducir los efectos secundarios tóxicos.
[0232] En una realización, el anticuerpo o fragmento multiespecífico se puede administrar en una dosis semanal calculada como una dosis fija hasta ocho veces, tal como de cuatro a seis veces cuando se administra una vez a la semana. Dicho régimen puede repetirse una o más veces según sea necesario, por ejemplo, después de seis meses o doce meses. Tales dosis fijas pueden, por ejemplo, basarse en las dosis de mg/kg proporcionadas anteriormente, con una estimación de peso corporal de 70 kg. La dosificación se puede determinar o ajustar midiendo la cantidad de anticuerpo biespecífico de la presente invención en la sangre tras la administración, por ejemplo, tomando una muestra biológica y usando anticuerpos antiidiotípicos que se dirigen a la región de unión al antígeno CD123 de los anticuerpos multiespecíficos de presente invención.
[0233] En una realización, el anticuerpo o fragmento multiespecífico puede administrarse mediante terapia de mantenimiento, tal como, por ejemplo, una vez a la semana durante un período de seis meses o más.
[0234] Un anticuerpo o fragmento multiespecífico también se puede administrar profilácticamente para reducir el riesgo de desarrollar cáncer, retrasar la aparición de un evento en la progresión del cáncer y/o reducir el riesgo de recurrencia cuando un cáncer está en remisión.
[0235] Los anticuerpos multiespecíficos y sus fragmentos como se describe en el presente documento también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes terapéuticos relevantes para la enfermedad o afección a tratar. Por consiguiente, en una realización, el medicamento que contiene anticuerpos es para combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tales como un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el otro agente terapéutico es citarabina, una antraciclina, diclorhidrato de histamina o interleucina 2. Dicha administración combinada puede ser simultánea, separada o secuencial, en cualquier orden. Para la administración simultánea, los agentes pueden administrarse como una composición o como composiciones separadas, según sea apropiado.
[0236] En una realización, un método para tratar un trastorno que implica células que expresan CD123 en un sujeto, método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento multiespecífico, tal como un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 descrito aquí, y radioterapia a un sujeto que lo necesite se proporciona. En una realización, se proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer, método que comprende la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento multiespecífico, tal como un anticuerpo CD123 x CD3 descrito en este documento, y radioterapia a un sujeto que lo necesite. La radioterapia puede comprender radiación o se proporciona administración asociada de radiofármacos a un paciente. La fuente de radiación puede ser externa o interna al paciente que está siendo tratado (el tratamiento de radiación puede ser, por ejemplo, en forma de radioterapia de haz externo (EBRT) o braquiterapia (BT)). Los elementos radiactivos que pueden usarse en la práctica de tales métodos incluyen, por ejemplo, radio, cesio-137, iridio-192, americio-241, oro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnecio-99, yoduro-123, yoduro- 131, e indio-Ill.
Kits
[0237] También se proporcionan en el presente documento incluyen kits, por ejemplo, que comprenden un anticuerpo multiespecífico descrito o fragmento de unión a antígeno del mismo e instrucciones para el uso del anticuerpo o fragemto para matar tipos de células particulares. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 como se describe en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 como se describe en el presente documento, o un fragmento biespecífico de unión a antígeno CD123 x CD3 del mismo. Las instrucciones pueden incluir instrucciones para usar el anticuerpo multiespecífico o el fragmento de unión a antígeno del mismo in vitro, in vivo o ex vivo.
[0238] Típicamente, el kit tendrá un compartimento que contiene el anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo. El anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo puede estar en forma liofilizada, en forma líquida u otra forma enmendable para ser incluida en un kit. El kit también puede contener elementos adicionales necesarios para practicar el método descrito en las instrucciones del kit, como una solución esterilizada para reconstituir un polvo liofilizado, agentes adicionales para combinar con el anticuerpo multiespecífico o un fragmento de unión al antígeno del mismo antes de administrarlo a un paciente y herramientas que ayudan a administrar el anticuerpo multiespecífico o fragmento de unión a antígeno del mismo a un paciente.
Usos de diagnóstico
[0239] Los anticuerpos y fragmentos multiespecíficos descritos en el presente documento también pueden usarse con fines de diagnóstico. Por lo tanto, también se proporcionan composiciones de diagnóstico que comprenden un anticuerpo o fragmentos multiespecíficos como se define en el presente documento, y para su uso. En realizaciones preferidas, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo multiespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento de unión a antígeno multiespecífico del mismo, y más preferiblemente un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 como se describe aquí, o un fragmento biespecífico de unión a antígeno CD123 x CD3 del mismo. En una realización, la presente invención proporciona un kit para el diagnóstico de cáncer que comprende un recipiente que comprende un anticuerpo biespecífico CD123 x CD3 y uno o más reactivos para detectar la unión del anticuerpo a CD123. Los reactivos pueden incluir, por ejemplo, etiquetas fluorescentes, etiquetas enzimáticas u otras etiquetas detectables. Los reactivos también pueden incluir anticuerpos secundarios o terciarios o reactivos para reacciones enzimáticas, en donde las reacciones enzimáticas producen un producto que puede visualizarse. Por ejemplo, los anticuerpos multiespecíficos descritos en el presente documento, o sus fragmentos de unión a antígeno, pueden marcarse con una etiqueta de radio, una etiqueta fluorescente, una etiqueta de epítopo, biotina, una etiqueta de cromóforo, una etiqueta de ECL, una enzima, rutenio, 111In- DOTA, ácido 111Indietilentriaminopentaacético (DTPA), peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y beta-galactosidasa, o poli-histidina o etiquetas similares conocidas en la técnica.
[0240] Los siguientes ejemplos se proporcionan para complementar la divulgación previa y para proporcionar una mejor comprensión del tema descrito aquí. No se debe considerar que estos ejemplos limitan el tema descrito. Se entiende que los ejemplos y realizaciones descritas en este documento son solo para fines ilustrativos y que diversas modificaciones o cambios a la luz de los mismos serán evidentes para los expertos en la materia.
Ejemplo 1: Materiales
Generación de líneas celulares CD123
[0241] Un conjunto de vectores pDisplay™ que presentan CD123 ECD SP1 humano (aminoácidos 20 - 305) (SEQ ID NO: 1), CD123 ECD SP2 humano (aminoácidos 19 - 227 de SEQ. ID NO: 2), y cyno CD123 ECD (aminoácido 19-305 de SEQ ID NO: 3) se generaron para usar como herramientas de detección para evaluar los cables anti-CD123. Se usó un vector de expresión de mamífero que permite la visualización de proteínas en la superficie celular, pDisplay (Invitrogen) (Figura 1). Las proteínas expresadas por pDisplay™ se fusionan en el extremo N a la secuencia líder de la cadena Ig k murina, que dirige la proteína a la vía secretora, y en el extremo C al dominio transmembrana del receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR), que ancla la proteína a la membrana plasmática, mostrándola en el lado extracelular. Las proteínas recombinantes expresadas en pDisplay™ contienen los epítopos de hemaglutinina A y myc para la detección por inmunotluorescencia o transferencia de Western. El promotor CMV impulsa la expresión.
[0242] Los vectores se transfectaron transitoriamente en células HEK293T usando métodos estándar. Las células adherentes 293F transfectadas se seleccionaron para una integración estable de plásmidos, luego se clasificaron las células individuales y la expresión del receptor de superficie CD123 se cuantificó mediante FACS usando el kit BangsLabs Quantum FITC-5 (Catálogo n° 855, Bangs Laboratories, Inc). Se seleccionó un conjunto de 10 clones de células individuales para cada línea celular para el cribado, y se cuantificó para la expresión de ECD de CD123. Las líneas celulares utilizadas para el examen de impacto posterior tuvieron una expresión superficial de aproximadamente 500.000 copias de ECD de CD123 por célula.
Generación de proteína CD123 ECD soluble
[0243] Se obtuvo proteína de etiqueta de His CD123 SP1 ECD humana recombinante (Lote n° LV081110A), correspondiente al aminoácido 20 a 305 de CD123 SP1 (SEQ ID NO: 1) de R&D Systems (n° 301- R3/CF) para su uso en la selección de fagos y la detección de resultados. La proteína se probó para endotoxina antes de su uso y se biotiniló para estudios de cribado de fagos. Este material también se utilizó para mediciones de unión y afinidad.
[0244] La proteína recombinante humana CD123 ECD SP2 correspondiente a los aminoácidos 18-225 de CD123 SP2 humano (SEQ ID NO: 2) se purificó para su uso en la unión y mediciones de afinidad. El ADNc se preparó usando técnicas de síntesis génica (Patente de Estados Unidos N° 6,670,127; Patente de Estados Unidos N° 6,521,427). Los plásmidos para la expresión del CD123 ECD SP2 soluble sintético se prepararon usando técnicas estándar de biología molecular. El fragmento del gen CD123 ECD SP2 con una secuencia señal gp67 N-terminal y una etiqueta 6 -His cterminal se clonó en los sitios Eco RI y Not I de pFastbac1 (Invitrogen) y se expresó con el sistema Bac a Bac (Invitrogen) en High Five Cells (Invitrogen). La proteína secretada (SEQ ID NO: 226) se purificó a través de columnas HisTrap (GE) y Superdex 75 (GE). Este material se utilizó para mediciones de unión y afinidad y mapeo de epítopos.
[0245] Las proteínas CD123 ECD solubles se biotinilaron usando el kit SureLink Biotinylation (KPL n° 86-00-01) según las instrucciones del fabricante. Las proteínas se corrieron en SDS/PAGE para confirmar el estado monomérico.
Anticuerpo anti-CD3 para cristalografía de rayos X
[0246] El mAb SP34, el isotipo IgG3/lambda de ratón, se adquirió de BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA), cat. N° 556611 y que comprende las cadenas ligera y pesada mostradas en las SEQ ID NO: 4 y 5, respectivamente.
Ejemplo 2: Identificación de mAbs anti-CD123 humanos
[0247] Análisis de la solución de las bibliotecas Humanas Fab-pIX de novo [Shi, L., y col. J Mol Biol, 2010. 397 (2): p.
385-396. WO 2009/085462], que consta de bibliotecas de cadenas pesadas VH1-69, 3-23 y 5-51 emparejadas con bibliotecas de cadenas ligeras Vkl-39, 3-11,3-20 y 4-1, se realizó usando un antígeno biotinilado. método de captura de perlas de estreptavidina magnética como se describe (Rothe y col., J. Mol. Biol. 376: 1182-1200, 2008; Steidl y col., Mol. Immunol. 46: 135-144, 2008) en cuatro rondas posteriores.
[0248] El gen pIX se escindió del ADN del fagémido después de la cuarta ronda de barrido para generar regiones de codificación de Fab etiquetado por his solubles. Los Fabs se expresaron en E. coli y se seleccionaron para la unión a la proteína humana de etiqueta His CD123 SP1 ECD recombinante en un ELISA. Brevemente, las placas Nunc Maxisorp de 96 pocillos (Nunc n° 437111) se revistieron con Fd antihumano de oveja (sitio de unión n° PC075) en PBS a 1 pg/ml durante la noche a 4°C. Las colonias bacterianas que contenían el vector de expresión Fab se cultivaron en 450 pl de 2xYT (Carbenecilina) en placas de cultivo de pocillos profundos hasta turbidez (OD600 = 0,6). La expresión de Fab fue inducida por la adición de IPTG a una concentración de 1 mM. Los cultivos se cultivaron durante la noche a 30°C y luego se clarificaron por centrifugación. Las placas Maxisorp recubiertas con anti-Fd se lavaron una vez con TBS, Tween-20 al 0,5% (Sigma n° 79039-10PAK) y se bloquearon con 200 pl de PBS-Tween (0,5%) leche descremada (3%) por pocillo durante una hora a temperatura ambiente. En este paso y todos los pasos posteriores, las placas se lavan tres veces con TBS, Tween-20 al 0,5% (Sigma n° 79039-10PAK). Cada pozo recibió 50 pl de sobrenadante Fab seguido de una hora de incubación a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadieron 50 ul de CD123 biotinilado y se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se añadieron 50 pl de estreptavidina: HRP (Pierce n° 21130) a una dilución 1:5000 y las placas se incubaron durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron y se añadieron 50 pl de sustrato quimioluminiscente, PoD (Roche n° 121-5829500001) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se leyeron las placas para la luminiscencia en un lector de placas EnVision (Perkin Elmer). Los pozos que muestran una señal >5 veces sobre el fondo se consideraron aciertos.
[0249] Los clones que demostraron la unión a la proteína de etiqueta His CD123 ECD SP1 humana recombinante se secuenciaron en las regiones variables de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC). Se identificó un total de 52 secuencias Fab únicas a través de la selección de fagos y 45 finalmente se convirtieron al isotipo IgG1 mediante clonación por fusión. (Tabla 1) La clonación en fusión se realizó mediante amplificación por PCR usando el kit PCR SuperMix High Fidelity (Life Technologies n° 10790-020), de las regiones variables HC y LC y clonación en sitios Esp3I en vDR149 para HC y vDR157 para LC usando el kit In-Fusion® HD Cloning Plus (Clontech n° 638909). VH y VL de los aciertos se muestran a continuación en la Tabla 4.
Tabla 1. Secuencias CDR de mAbs generadas de selección de fagos contra proteína humana de etiqueta His CD123 SP1 ECD (SEQ ID Nos correspondientes están enumeradas en paréntesis)
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(Continuación)
ID H-CDRl H-CDR2 H-CDR3 L-CDRl L-CDR2 L-CDR3
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Tabla 4: Secuencias V h y V l de mAbs generados a partir de la selección de fagos contra CD123
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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Ejemplo 3: Unión de células MSD a hCD123 SP1, hCD123 SP2 y cynoCD123 SP1
[0250] La unión de anticuerpos CD123 a células pDisplay diseñadas se evaluó usando un ensayo de unión celular MSD (Meso Scale). El objetivo del ensayo de detección fue identificar los anticuerpos que se unen a las células que expresan hCD123 SP1 y SP2, así como la reactividad cruzada con las células que expresan cynoCD123 SP1.
[0251] Las células se inmovilizaron y los fagos se ensayaron por triplicado. Brevemente, los sobrenadantes de expresión o los anticuerpos CD123 purificados se normalizaron a 10 pg/ml. Se sembraron en placa 5000 células por pocillo en una placa de 384 pocillos (MA6000, cat. L21XB, MSD) y se dejó adherir durante 2 horas. Las células fueron bloqueadas con 20% de FBS en PBS (Gibco) durante 15 minutos. Los sobrenadantes de anticuerpos se añadieron luego y se dejaron a TA durante 1 hora. Las células se lavaron 3 veces con PBS y luego se añadió un anticuerpo secundario marcado con rutenio (Jackson Immuno Research) a 1 pg/ml y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se aplicó una etapa de lavado adicional y se añadieron 35 pl por pocillo de tampón de lectura MSD T (sin tensioactivo) y se incubaron durante 30 minutos para su detección. Luego se leyeron las placas usando Sector Imager 2400 (MSD). Los datos se normalizaron a los controles y se graficaron utilizando GraphPad Prism Versión 5. Se determinó que un aglutinante positivo era un éxito con una señal 3 veces mayor que el fondo (Figura 2A, B y C). Se repitió el ensayo para determinar la consistencia de los datos y se seleccionaron los aglutinantes superiores para un mayor desarrollo. Los siguientes éxitos fueron positivos para la unión a las tres líneas celulares: I3RB2, 13RB5, 13RB8, 13RB18, 13RB20, 13RB21 e I3RB35.
Ejemplo 4: Mediciones de afinidad por SPR.
Mediciones de afinidad de proteína
[0252] Las afinidades de 29 candidatos anti-CD 123 a CD123 ECD SP1 humano y CD123 ECD SP2 recombinante se midieron por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un sistema de matriz de interacción de proteína ProteOn XPR36 (BioRad).
[0253] Las tasas de asociación y disociación CD123 ECD SP1 o CD123 ECD SP2 se midieron para cada variante. La superficie del biosensor se preparó mediante acoplamiento covalente de IgG antihumano de cabra (Fc) a la superficie de un chip GLC (BioRad) usando las instrucciones del fabricante para la química del acoplamiento de amina. Aproximadamente 8800 RU (unidades de respuesta) del anticuerpo de cabra anti-IgG humana (Fc) (Jackson ImmunoResearch laboratories Prod n° 109-005-098) se inmovilizaron. El RU inmovilizado también incluyó un anticuerpo Fc anti-ratón de cabra que se agregó para capturar otros anticuerpos no incluidos en los que se informan aquí. Como la mezcla era 1:1, se espera que aproximadamente el 50% de estas RU inmovilizadas sean Fc antihumanos de cabra. Los experimentos cinéticos se realizaron a 25°C en tampón (PBS pH 7,4, 0,005% de P20, EDTA 3 mM). Se prepararon diluciones en serie de 4 veces (1:3) de CD123 ECD SP1 y CD123 Ec D SP2 humanos, comenzando a 400 nM en tampón en funcionamiento. Se capturó un promedio de 300 RU de mAb (174-600) en cada canal del chip sensor. Los puntos de referencia (superficie modificada de cabra anti-IgG humana (Fc)) que no contenían candidatos capturados se usaron como superficie de referencia. La captura de mAb fue seguida por una inyección de 3 minutos (fase de asociación) de antígeno a 40 pl/min, seguido de 10 minutos de flujo de tampón (fase de disociación). La superficie del chip se regeneró mediante inyección de ácido fosfórico al 0,85% a 100 pl/min. Los datos se procesaron en el software del instrumento. La sustracción de referencia doble de los datos se realizó restando las curvas generadas por inyección de tampón de las curvas sustraídas de referencia para inyecciones de analito. Análisis cinético de los datos se realizó utilizando el modelo de unión Langmuir 1:1 con ajuste grupal. El resultado para cada mAb se informó en el formato de Ka (kon u on-rate), Kd (koff o off-rate), Kd (constante de disociación de equilibrio) (Tabla 5).
[0254] Los resultados indicaron que los 29 anticuerpos monoclonales unidos a CD123 ECD SP1, pero sólo seis de ellos mostraron unión a CD123 ECD SP2. Para acceder a la reproducibilidad de los datos, cuatro de los anticuerpos se ejecutaron al menos por duplicado. En general, los resultados indicaron una buena reproducibilidad entre las réplicas, a excepción de I3RB1 que tiene tasas de encendido lentas.
Tabla 5. Evaluación de afinidad para resultados de panel 1 de fagos por SPR
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(Continuación)
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1NBO = No se observa unión
Mediciones de afinidad Biacore.
[0255] La afinidad de varios anticuerpos para el CD123 ECD SP1 y el CD123 ECD SP2 también se midió por resonancia de plasmón superficial (SPR) en formato mAb y Fab usando un instrumento Biacore. Los estudios cinéticos se realizaron a 25°C utilizando un BIAcore 3000 (BIAcore, Inc., ahora parte de GE Healthcare). El anticuerpo específico de cabra anti-IgG humana (Fc) (Jackson ImmunoResearch laboratories Prod n° 109-005-098) se unió covalentemente a dos células de flujo (normalmente 1 y 2) de las superficies de oro recubiertas de carboximatil dextrano (CM-5 Chip, Biacore). El anticuerpo específico de Fd anti-humano de oveja (El sitio de unión Prod n° PC075) se unió covalentemente a dos células de flujo (normalmente 3 y 4) de las superficies doradas recubiertas con carboximatil dextrano (Chip CM-5, Biacore). Los grupos carboximatilo de dextrano se activaron con N-Etil-N’-(3-Dimetilaminopropilo)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). Los anticuerpos se acoplaron a pH 4,5 en acetato de sodio 10 mM. Cualquier sitio reactivo restante en la superficie fue bloqueado por reacción con etanolamina. Para las mediciones de unión cinética, los anticuerpos anti-CD 123 se capturaron en el anticuerpo específico Fcy anti­ humano, mientras que los Fab se capturaron en el anticuerpo específico anti-Fd inyectando las moléculas anti-CD 123 a un caudal de 5 o 6 ql/min. Se capturaron aproximadamente 75 RU de anticuerpo y aproximadamente 50 RU de Fab, respectivamente. La captura de Ab y Fab fue seguida por la inyección de CD123 SP1 humano o CD123 SP2 humano a concentraciones entre 1,6 nM y 400 nM a 40 ql/min. Los datos de asociación se recogieron durante 2 minutos seguidos de 10 minutos de disociación. La superficie se regeneró con 30 ql de H3PO4 100 mM 100 ql/min. Todas las muestras se prepararon en D-PBS que contenía EDTA 3 mM y 0,005% de tensioactivo P20. Los datos informados son la diferencia en la señal SPR entre la célula de flujo que contiene el anticuerpo capturado o Fab y una célula de referencia sin anticuerpo capturado o Fab. Contribuciones instrumentales adicionales a la señal fueron eliminadas por sustracción de los datos de la inyección en blanco de la señal sustraída de referencia. Los datos se realizaron por triplicado y se analizaron por asociación de ajuste y fases de disociación en todas las concentraciones (ajuste global) con un modelo de unión 1:1 utilizando el software de evaluación BIA (BIAcore, Inc.). Se realizaron experimentos duplicados y estuvieron de acuerdo. Los datos presentados son un promedio.
[0256] Los resultados mostraron que la afinidad de CD123 ECD SP1 y CD123 ECD SP2 unión a mAb (I3RB2, I3RB18, I3RB35, I3RB37) están de acuerdo con su Fab (I3RB120, I3RB119, I3RB121, I3RB122) (Tabla 6.) correspondiente. Los resultados para todos los anti-CD123 analizados también mostraron que el rango de afinidad para la unión de Fab a CD123 ECD SP1 y CD123 ECD SP2 es 1,8-46,9 nM y 0,4-12,5 nM, respectivamente; mientras que el rango de afinidad para la unión de mAb es 1,2-52 nM y 0,3-11,7 nM, respectivamente.
Tabla 6. Afinidad y valores de tasa encendido/apagado para resultados de fago 1 anti-CD123 obtenidos por SPR (Biacore).
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**Respuesta de ensayo es más baja que se había esperado
ND: unión aparente, pero señal fuera de criterios de aceptación; (< 5 RU y mala calidad de los datos o sensograma irregular)
Ejemplo 5: Competición con 7G3
Ensayo competitivo CD123 por ELISA
[0257] El panel de anticuerpos CD123 se cribó en un ELISA de competición de unión a 7G3. 7G3 es un anticuerpo monoclonal neutralizante, cuyo epítopo se ha localizado dentro de los primeros 50 aminoácidos del antígeno CD123 SP1 (US6177078B1). El mAb 7G3 se adquirió de BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA, cat. N° 554526) y se marcó con MSD Sulfo-Tag™ NHS-ester de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery).
[0258] Para el ELISA competitivo de CD123, se trataron placas maxisorb transparentes de 96 pocillos con 100 pl/pocillo de histidina anti-6x 2 pg/ml (R&D Systems Cat #: MAB050) preparada en tampón de bicarbonato, pH 9,4 (Pierce N°: 28382) y se incubaron a 4°C durante la noche. Luego se lavaron las placas tres veces con tampón de lavado ELISA (PBS, Tween-20 al 0,01%) y luego se bloquearon con 300 pl/pocillo de StartingBlock que contenía Tween-20, Pb St , (Thermo Scientific N°: 37539). Todos los pocillos se trataron con 1 ng de huCD123 ECD SP1 recombinante y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. El huCD123 ECD SP1 no unido se lavó con tampón de lavado ELISA. Se preparó 7G3 o IgG2A de ratón (mIgG2A) en medios de expresión (medios de expresión FreeStyle™. Gibco N°: 12338-018) a 20 pg/ml y se añadieron por duplicado a la placa a 50 pl/pocillo a sus respectivos pocillos mientras que se añadieron los mAbs anti-CD 123 de prueba a 50 pl/pocillo de 2 pg/ml o puro a los pocilios restantes y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación moderada. Luego se añadió 7G3 biotinilado a una concentración final de 100 ng/ml a todos los pocillos y las placas se incubaron durante 1 hora adicional. Las placas se lavaron tres veces con tampón de lavado ELISA y se detectó 7G3 biotinilado unido usando conjugado SA-HRP a una densidad óptica de 450 nm.
[0259] Los mAbs anti-CD 123 que inhibían la unión de 7G3:CD123 se definieron con una inhibición del 20% de la actividad. Es decir, se consideraba que un anticuerpo era un inhibidor si era capaz de inhibir la unión del 7G3 biotinilado al ECD de CD123 humano en al menos un 20%. En base a este criterio de selección, se identificaron tres inhibidores: 13RB18, 13RB34 y 13RB44 (Figura 3).
Ejemplo 6: Ensayo funcional de pSTAT5
[0260] Para evaluar la actividad agonista o antagonista de los anticuerpos, el panel se cribó en un ensayo basado en células de fosforilación de STAT5 inducida por IL-3 usando células TF-1 (donde se compraron). La presencia del inhibidor de mAb anti-CD 123 provoca una disminución en la fosforilación de STAT5 tras la estimulación con rhIL-3. Se usó un criterio de inhibición del 20% en el ensayo funcional STAT5 (inhibición del 20% de la actividad de rhIL-3).
[0261] Aproximadamente se sembraron 50.000 células TF-1 (eritroleucemia humana) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos en 60 pl de RPMI que contiene 10% de FBS y se incubaron a 37°C con 5% incubadora de CO2 durante la noche. Todas las muestras se prepararon en medios de expresión (medios de expresión FreeStyleTM. Gibco N°: 12338-018). Las muestras de control recibieron 70 pl/pocillo de 20 pg/ml de 7G3 o control de isotipo mIgG2A. A los pocillos restantes, se añadieron 70 pl/pocillo de 2 pg/ml o muestras de mAb antihumano CD123 puro. Todas las muestras se incubaron durante 1 hora a 37°C con 5% de CO2 incubadora. Las células se trataron luego con IL-3 humana recombinante, rhIL-3 (número de catálogo PeproTech: 200-03) a una concentración final de 10 ng/ml en RPMI que contenía FBS al 10% con la excepción de cero-, 7G3-, o células tratadas solo con isotipo. Las muestras se incubaron a continuación durante 15 minutos adicionales a 37°C con 5% de CO2 incubadora. Las células se lisaron con 46,7 pl de tampón de lisis completo helado por pocillo y las muestras se incubaron en hielo durante 30 minutos. Los lisados se mezclaron pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. El STAT5 fosforilado (pSTAT5a, b) se determinó luego usando el kit Phospho (TyR694)/Total STAT5a,b de Meso Scale Discovery (MSD N°: K15163D-2) y siguiendo las instrucciones del fabricante.
[0262] Los mAbs anti-CD 123 que inhibieron la fosforilación de STAT5 por rhIL-3 se definieron con una inhibición del 20% de la actividad. Es decir, se consideró que un anticuerpo era un inhibidor si podía inhibir la fosforilación de STAT5 por rhIL-3 en al menos un 20%.
[0263] Cinco mAb demostraron capacidad para bloquear la estimulación de IL-3 de STAT5 (Figura 4A). Estos cinco incluyeron 13RB18 y 13RB19, 13RB30, 13RB34 y 13RB44. Sin embargo, cuando se probó a 1 pg/ml, solo un anticuerpo, 13RB18, bloqueó la estimulación de IL-3 de la fosforilación de STAT5 en las células TF-1 (Figura 4B). Además, 13RB18 (B18) mostró dependencia de la dosis en este ensayo (Figura 4C). A partir de estos datos, se concluyó que I3RB18 es el único anticuerpo antagonista.
Ejemplo 7: Confirmación de la afinidad monovalente en hCD123
[0264] Se analizó por duplicado la unión Fab de los dos resultados anti-CD123 (I3RB120 (I3RB2 Fab), I3RB119 (I3RB18 Fab) al CD123 SP1 humano o cyno expresado en la superficie celular por MSD-Cell Affinity Technology para obtener una medida de la unión monovalente al CD123 de la superficie celular.
[0265] Las afinidades monovalentes de anti-CD123 seleccionados para hCD123 o cynoCD123 expresados en la superficie celular se realizaron usando la técnica de afinidad de células MSD (MSD-CAT). El MSD-CAT se desarrolló internamente como un método sin laboratorio para determinar la afinidad utilizando células intactas en un formato de alto rendimiento. Estos experimentos se realizaron para evaluar la afinidad de unión y la especificidad de los candidatos anti-CD123 a los humanos de superficie celular o cynomolgus (cyno) CD123 SP1. Este análisis permitió comparar las afinidades de los candidatos anti-CD123 con el antígeno humano y cyno en ausencia de cyno CD123 soluble recombinante. Las líneas celulares utilizadas fueron pDisplay CD123SP1 humano y pDisplay CD123SP1 cyno. Para medir la afinidad de estas interacciones utilizando el método MSD-CAT, una serie de mezclas con una concentración fija de anti-CD123 (1000, 200, 40 y/u 8 pM) y concentraciones variables de células (1,5 x107-0762 x 107 células/ml) y se dejaron alcanzar el equilibrio haciendo girar las placas durante 24 horas a 4°C. Estas muestras se prepararon en medio DMEM Glutamax que contenía 0,05% de azida, 1% de BSA, 3 mM de EDTA. Los números de receptor de (3,15-4,18) X 106 hCD123/célula y (4,78-9,24) 106 cyCD123/célula se convirtieron a la concentración de receptor M en la mezcla sobre la base del volumen de reacción, la densidad celular (células/L) y el número de Avogadro. Esto dio como resultado un rango de concentración de 104 nM a 5,3 pM para CD123 humano y de 12 nM a 0,6 pM para cyno CD123. Después del equilibrio, la placa se centrifugó durante 5 min ~ 1000 rpm y se detectó anti-CD3 libre en el sobrenadante. El anti-CD123 libre en la mezcla se detectó por electroquimioluminiscencia (ECL) usando el instrumento lector Mesoscale Discovery (MSD). Para la detección de anti-CD123 libre en la mezcla equilibrada por inmunoensayos de electroquimioluminisceno (ECL) se prepararon placas de detección. Para preparar placas de detección (antígeno unido a placa en placas SA-MSD), se bloquearon placas MSD Streptavidin Standard con 50 pl/pocillo de tampón de ensayo (PBS, (Life Sciences GIBCO 14190-136), Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,2%) durante 5 min. El tampón de ensayo se eliminó sin lavar y se añadieron a placas MSD 50 pl/pocillo de 0,7 pg/ml de antígeno biotinilado en tampón de ensayo y se incubaron durante la noche (~16 h a 4°C). Después de la incubación durante la noche, las placas se bloquearon añadiendo 150 pl de pocillo de tampón de ensayo sin eliminar el antígeno de recubrimiento, se incubaron durante ~1 hora a temperatura ambiente y se lavaron 5 veces con tampón de lavado (tampón de ensayo sin BSA). 50 pl/pocillo de los sobrenadantes de la placa de muestras se transfirieron a placas recubiertas con antígeno, se incubaron durante 60 minutos y luego se lavaron tres veces con tampón de lavado. Después de esto, se añadieron 50 pl por pocillo de anticuerpo de detección marcado con rutenio (H+L anti-humano) y se incubaron durante 1 hora. Después de 1 h se lavaron las placas y 150 pl de MSD tampón de lectura (preparada mediante la dilución de 1:4 de stock d. H2O) se añadieron por pocillo. Las placas se leyeron inmediatamente en el lector MSD Sector Imager 6000 para conocer los niveles de luminiscencia. La señal de ECL detectada por MSD se expresó en términos de % de anticuerpo libre en la mezcla y los datos se analizaron para determinar la afinidad utilizando una ecuación definida por el usuario (derivada de la ley de acción masiva) introducida en el software Prism. Los datos muestran que I3RB18 y su Fab (13RB119) son los aglutinantes más ajustados al CD123 SP1 de la superficie celular con afinidad pM (o afinidad aparente por el mAb) pero se une >10 veces más débil al CD123 SP1 cyno. Para I3RB18 y su Fab (13RB119) no fue posible obtener un valor de afinidad para el mAb o Fab contra las células que expresan cynoSP1. Todo lo que se puede decir es que la afinidad es >12 nM. Sin embargo, mientras I3RB120 se une con afinidad nM a ambos antígenos, se une con afinidades iguales o < 5 veces a CD123 SP1 humano y cyno. Las afinidades obtenidas por SPR para hCD123 SP1 son más débiles que las observadas en las células. Esta diferencia probablemente se deba a la presentación del antígeno en la superficie celular y la ubicación del epítopo del anticuerpo. Los resultados se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7. Valores de afinidad de Fabs a las células CD123 obtenidas por MSD-CAT
Figure imgf000059_0001
[0266] La afinidad medida por el Fab I3RB2 es consistente con los datos de mAb obtenidos a través de Proteon. Además, hay una buena unión de las células cynoCD123 con este Fab, lo que da una clara indicación de que I3RB2 es un resultado de reacción cruzada. La evaluación del mAb I3RB18 y su Fab correspondiente (I3RB119) indican que las afinidades obtenidas a través de Proteon para CD123 SP1 recombinante son más débiles que las observadas en las células; 1 nM para proteína recombinante frente a 55-300 pM para células. Es muy probable que esta diferencia se deba a la presentación del antígeno en la superficie celular y a la ubicación del epítopo del anticuerpo. No fue posible obtener un valor de afinidad para mAb o Fab (afinidad >12 nM). Esto sugeriría que el anticuerpo no es reactivo cruzado en un formato monovalente. Los datos de unión celular previos indicaron reactividad cruzada, que probablemente fue facilitada por la unión bivalente a la superficie celular.
Ejemplo 8: Unión de células endógenas
[0267] Se midió la confirmación de la unión de I3RB2 e I3RB18 a CD123 endógeno en células de AML. Las células OCI-AML5 (DSMZ), que expresan aproximadamente 75.000 copias de CD123 en la superficie celular, se usaron en un ensayo de unión a células MSD dependiente de la dosis. La unión de los anticuerpos CD123 a las células de AML se evaluó usando un ensayo de unión a células MSD (Meso Scale). Brevemente, se utilizaron sobrenadantes de expresión o anticuerpos CD123 purificados en un intervalo de dosis de 40 pg/ml a 0,039 pg/ml. Se colocaron 50.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos (placa de alta unión de Meso Scale) y se dejó adherir durante 2 horas. Luego, las células se bloquearon con 20% de FBS en PBS más bloqueador de Fc (el bloqueador de Fc es la porción de Fc purificada de un anticuerpo de anticuerpo escindido con papina (SEQ ID NO 209) durante 15 minutos. Luego se agregaron los sobrenadantes de anticuerpos y se dejaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las células se lavaron 3 veces con PBS y luego se añadió un anticuerpo secundario marcado con rutenio (Jackson Immuno Research) a 1 pg/ml y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se aplicó una etapa de lavado adicional y 150 pLul por pocillo de MSD tampón de lectura T (sin tensioactivo) luego se agregó e incubó durante 30 minutos para su detección. Las placas se leyeron con Sector Imager 2400 (MSD). Los datos se normalizaron a los controles y se graficaron con GraphPad Prism Version 5.
[0268] Los resultados mostraron que I3RB2 e I3RB18 se unen al CD123 endógeno expresado en células OCI-AML5 de una manera dependiente de la dosis (Figuras 5A y B). El control positivo, mAb 7G3, también se incluyó en este ensayo como un comparador (Figura 5C).
Ejemplo 9: Análisis de unión competitiva de CD123mAB con 13RB2 y 13RB18
[0269] Se realizó un estudio de competencia para 13RB2 y 13RB18 contra otros resultados CD123 SP1/SP2 de reacción cruzada y el control 7G3 para determinar los grupos de competencia de anticuerpos anti-CD 123 o "bins de epítopos".
[0270] Para ELISA competitivo, 5 gl (20 gg/ml) de proteína humana CD123 ECD purificada generada como se describe en el Ejemplo 1 se revistió en placa MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) por pocillo durante 2 horas a temperatura ambiente. Se añadió a cada pocillo una alícuota de 150 mL de tampón de bloqueador A MSD al 5% (Meso Scale Discovery) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con tampón HEPES 0,1 M, pH 7,4, seguido de la adición de la mezcla de mAb anti-CD123 marcado con mAbs anti-CD123 de competidores diferentes. Los anticuerpos marcados (20 nM) se incubaron 2 gm de anticuerpos competidores anti-CD123 sin marcar, y luego se añadieron a los pocillos designados en un volumen de mezcla de 25 gl. Después de una incubación de 2 horas con agitación suave a temperatura ambiente, las placas se lavaron 3 veces con tampón HEPES 0,1 M (pH 7,4). MSD Tampón de Lectura T se diluyó con agua destilada (4 veces) y se dispensó a un volumen de 150 gl/pocillo y se analizó con un SECTOR Imager 6000. Los anticuerpos se marcaron con éster NHS Sulfo-Tag™ de MSD de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Meso Scale Discovery).
[0271] Los resultados de ELISA de competición indican que I3RB2 compite con 13RB60, 13RB70, 13RB79 y 13RB118 pero no compite con otros anticuerpos, incluyendo I3RB18 (Figura 6 A). Cabe señalar que cuando se marcó I3RB2, se observó competencia con I3RB60; sin embargo, cuando se marcó I3RB60, no se observó competencia. Una posible razón para esto son algunas interacciones de unión no específicas. Cuando se evaluó I3RB18, se encontró que competía con 13RB49 y 13RB55, pero no con 13RB2 (Figura 6 B).
[0272] El análisis de la competencia binning define dos grupos de competencia para los anticuerpos de reacción cruzada CD123 SP1/SP2 (Tabla 8 ). El anticuerpo monoclonal I3RB2 no compite con I3RB18 y pertenecen a diferentes grupos de epítopos. El grupo 1 (gris oscuro) incluye mAbs 13RB2, 13RB60, I3RB70, I3RB79 e I3R118. El grupo 2 (gris claro) consta de mAbs I3RB18, I3RB49 e I3RB55. El mAb comercial 7G3 no compite con ningún anticuerpo anti-CD 123 interno.
Tabla 8. Resultados de unión de competición de I3RB2 y I3RB18 a Abs anti-CD123
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Ejemplo 10: Mapeo de epítopos de I3RB2 e I3RB18
Estudios de intercambio H/D.
[0273] Para identificar los epítopos para I3RB2 e I3RB18 en CD123 humano, se realizó una espectrometría de masa de intercambio hidrógeno/deuterio (HDX-MS) usando los Fabs correspondientes. Para el intercambio H/D, los procedimientos utilizados para analizar la perturbación Fab fueron similares a los descritos anteriormente (Hamuro et al., J. Biomol. Techniques 14: 171-182, 2003; Horn et al., Biochemistry 45: 8488-8498, 2006) con algunas modificaciones. El antígeno CD123 ECD SP2 se usó para estos estudios ya que el antígeno es menos complejo que la molécula SP1 debido a un número reducido de sitios de glicosilación. El CD123 ECD SP2 recombinante (SEQ ID NO: 226) se incubó en una solución de agua deuterada durante tiempos predeterminados dando como resultado la incorporación de deuterio en átomos de hidrógeno intercambiables. El CD123 ECD SP2 deuterado estaba en complejo con I3RB119 (Fab de I3RB18) o I3RB120 (Fab de I3RB2) en 43 gl de óxido de deuterio (D2O) a 4°C durante 30 segundos, 2 min, 10 min y 60 min. La reacción de intercambio se apagó con un pH bajo y las proteínas se digirieron con pepsina. Los niveles de deuterio en los péptidos identificados se monitorizaron desde el desplazamiento de masa en LC-MS. Como control de referencia, la muestra CD123 ECD SP2 se procesó de manera similar, excepto que no estaba en complejo con las moléculas Fab. Se infirió que las regiones unidas al Fab eran aquellos sitios relativamente protegidos del intercambio y, por lo tanto, contienen una fracción más alta de deuterio que la muestra de CD123 ECD SP2 de referencia. Alrededor del 94% de la proteína podría asignarse a péptidos específicos.
[0274] Los mapas de perturbación HDX-MS de CD123 ECD SP2 con I3RB119 e I3RB120 se muestran en las Figuras 7A y 7b , respectivamente. Un segmento, los residuos 176-184 (RARERVYEF (SEQ ID NO: 227)), correspondiente a los residuos de aminoácidos 195-202 de CD123 sp2, está fuertemente protegido por I3RB119. Dos regiones diferentes, residuos 145-156 (IQKRMQPVITEQ (SEQ ID NO: 228)) y residuos 165-170 (LLNPGT (SEQ ID NO: 229)), correspondientes a los residuos 164-175 y los residuos 184-199 de CD123 sp2 respectivamente, fueron reconocidos por I3RB120. Estos resultados HDX-MS sugieren los epítopos de nivel de péptido para I3RB119 e I3RB120. No hubo regiones de epítopo superpuestas para estos dos anticuerpos. Estos resultados están de acuerdo con los datos de unión de la competencia anteriores de que I3RB2 e I3RB18 no compiten entre sí.
Ejemplo 11: Mapeo de epítopos del anticuerpo anti-CD123 I3RB18 por estructura cristalina
[0275] El epítopo de unión del anticuerpo I3RB18 se determinó por cristalografía de rayos X.
[0276] El fragmento Fv de cadena única de anti-CD123 mAb I3RB18 se produjo de la forma: VL-(Gly4Ser)4-VH-GlyHis6 (SEQ ID NO: 230). Se expresó en células HEK293 Expi y se purificó por cromatografía de afinidad (HisTrap) e intercambio iónico (Fuente 15S y Mono S).
[0277] La isoforma sp2 del CD123 ECD humano (SEQ ID NO: 231) con una etiqueta C-terminal 8 xHis se expresó en células de insecto infectadas con baculovirus y se purificó por cromatografía de afinidad (HisTrap) y exclusión por tamaño (Superdex 75).
[0278] El complejo CD123:I3RB18 scFv se preparó mezclando 1,8 mg CD123 (1,1 mg/ml) con 2,4 mg de scFv (1,6 mg/ml) a una relación molar aproximada de 1:1,2 (exceso de scFv) y se incubaron durante la noche a 4°C. Una SEC a pequeña escala (150 gg) indicó formación compleja. La proteína se concentró a 18 mg/ml en HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM.
[0279] La cristalización se llevó a cabo mediante el método de difusión de vapor a 20°C en un formato de gota sentada en placas de cristalización de 2 pocillos MRC (Swissci). Los cristales del complejo adecuados para el experimento de rayos X se obtuvieron en condiciones: 2,0 M (NH4)2SO4, tampón MES 0,1 M, pH 6,5. Los datos de los cristales se dan en la Tabla 9. Un cristal se transfirió a las aguas madres suplementadas con glicerol al 24%, se congeló en nitrógeno líquido y se usó para la recogida de datos de difracción de rayos X. La estructura se determinó a una resolución de 3,5 A.
Tabla 9. Datos de cristal, datos de rayos X y estadísticas de refinamiento.
Datos de cristal
Grupo espacial P41212
Ejes de células unitarias (A) 111,32, 111,32, 192,19
Moléculas/unidad asimétrica 2
Vm (A3/Da) 2 ,86
Contenido de disolvente (%) 57
Datos de rayos X
Resolución (A) 50-3,56 (3,70-3,56)
N° reflexiones medidas 136,381 (5,853)
N° reflexiones únicas 13.977 (929)
Completitud (%) 93,4 (64,2)
Redundancia 9,8 (6,3)
Fusión R 0,195 (0,490)
<I/o> 10 ,8 (2,3)
Factor B (Wilson) (A2) 66,1
(Continuación)
Refinamiento
Resolución (Á) 20-3,56
N° reflexiones utilizados en refinamiento 13.128
Completitud (%) 92,1
Número de todos los átomos 6,568
Número de moléculas de agua 0
Factor R (%) 23,1
Libre de R (%) (datos al 5%) 32,3
Longitudes de enlace RMSD (Á) 0,005
Ángulos de enlace RMSD (°) 1,1
Factor B medio (Á2) 120,3
Valores para la carcasa de mayor resolución están entre paréntesis.
[0280] I3RB18 se une a CD123 sp2 en el dominio C-terminal (proximal a la superficie celular) del ECD. El epítopo es conformacional e incluye tres segmentos de la cadena CD123 sp2, residuos 156-161 (RKFRYE, (SEQ ID NO: 232)), 173-178 (TEQVRD, (SEQ ID NO: 233)) y 195-202 (RARERVy E (SeQ ID NO: 234)) correspondiente a los residuos 234 - 239, 251-256 y 273 - 280 de CD123 spl. Las interacciones anticuerpo-antígeno son predominantemente electrostáticas. El epítopo en CD123 sp2 contiene una gran cantidad de residuos básicos, mientras que las CDR de I3RB18 están pobladas con residuos ácidos. Los residuos de anticuerpos implicados en la unión de CD123 incluyen 7 residuos de la cadena ligera y 9 residuos de la cadena pesada (Fig. 8 ). Todas las CDR excepto LCDR2 están involucradas en la unión.
[0281] La unión de I3RB18 a CD123 sp2 (Figura 9A) lo diferencia de otro anticuerpo anti-CD 123, 7G3, que se une al dominio N-terminal 1 del CD123 ECD SP1 como se muestra en la estructura cristalina del Fab 7G3 humanizado, CSL362, en complejo con CD123 sp1 (Figura 9B) (pdb: 4JZJBroughton et al. Cell Rep,2014; 8 : 410-419).
Ejemplo 11: Estructura cristalina de un Fab anti-CD3
[0282] La estructura cristalina del Fab SP34 se determinó a una resolución de 2,1 Á. Reveló la secuencia de aminoácidos completa e identificó las posibles líneas germinales de ratón de las cuales se derivó el mAb SP34.
Materiales
[0283] Se adquirió mAb SP34, isotipo IgG3/lambda de ratón, de BD Biosciences Pharmingen (San Diego, CA), cat. N° 556611. Según la hoja de datos técnicos, se purificó del sobrenadante de cultivo de tejidos mediante cromatografía de afinidad y se almacenó a 4°C. El fragmento Fab se produjo por digestión con papaína de mAb (Pierce, Cat n° 44985, Thermofisher) y se separó de Fc usando una columna de Nab Protein A Plus Spin (Pierce, Cat n° 44985, Thermofisher) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El Fab se purificó adicionalmente en una columna MonoS (GE Healthcare) equilibrada con MES 20 mM, pH 6,5 (tampón A). La elución se realizó con el tampón A en un gradiente de 13-28% de NaCl 1 M en 50 volúmenes de columna. Las fracciones correspondientes al pico principal se agruparon, se concentraron a 9,2 mg/ml y se usaron para cristalización.
Cristalización
[0284] La cristalización se realizó por el método de difusión de vapor a 20°C en un formato de gota sentada en placas Corning 3550 de 96 pocillos. El cristal Fab utilizado para el análisis de rayos X se obtuvo de PEG 3350 al 12%, tartrato de 0,2 MK/Na (pH 7,4), isopropanol al 3% y dioxano al 3%. Los datos de cristal se dan en la Tabla 10.
Tabla 10 Datos de cristal, datos de rayos X y estadísticas de refinamiento
Datos de cristal
Grupo espacial
Ejes de células unitarias (Á) 55,14, 141,23, 61,29
Ángulos de células unitarias (°) 90, 99,02, 90
Moléculas/unidad asimétrica 2
Vm (Á3/Da 2,48
Contenido de solvente (%) 50
(Continuación)
Datos de cristal
Datos de rayos X
Resolución (Á) 30-2,1 (2,15-2,19)*
N° reflexiones medidas 179.4220 (11.506)
N° reflexiones únicas 53.483 (3.667)
Completitud (%) 98,9 (92,5)
Redundancia 3,4 (3,1)
Fusión R 0,038 (0,393)
<I/a> 18,7 (3,8)
Factor B (Wilson) (Á2) 45,4
Refinamiento
Resolución (Á) 15-2,1
N° reflexiones utilizados en refinamiento 52,212
Completitud (%) 96,8
Número de todos los átomos 6 ,886
Número de moléculas de agua 219
Factor R (%) 20,5
Libre de R (%) 26,2
Longitudes de enlace RMSD (Á) 0,008
Ángulos de enlace RMSD (°) 1,2
Cadena principal de factor B RMSD 2,7
Factor B medio (Á2) 53,7
* Los números entre paréntesis son para la carcasa de mayor resolución.
Recopilación de datos de rayos X y determinación de la estructura
[0285] Para la recopilación de datos de rayos X, se remojó un cristal durante unos segundos en las aguas madres suplementadas con glicerol al 20% y se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido. Los datos de difracción se recolectaron en la línea de haz IMCA de Advanced Photon Source (Argonne, IL) utilizando un detector Pilatus CCD. Estadísticas de los datos de rayos X se dan en la Tabla 10.
[0286] La estructura se resolvió por reemplazamiento molecular utilizando un modelo de Fab construido a partir de antígeno anticuerpo JAA-F11 anti-Thomsen-Friedenreich de ratón (PDB 3gnm), que es una IgG3/kappa de isotipo. Todos los cálculos cristalográficos se realizaron con el conjunto de programas CCP4 [CCP4. 1994, Acta Crystallogr. D50: 760-763.]. Los ajustes del modelo se llevaron a cabo utilizando el programa COOT [Emsley P y Cowtan K. 2004. Acta Crystallogr. D60: 2126-2132.]. Las estadísticas de refinamiento se dan en la Tabla 10.
[0287] La secuencia de SP34 se muestra en la Figura 10, con los residuos 1 - 215 de la cadena ligera y los residuos 1-230 de la cadena pesada derivados directamente del mapa de densidad electrónica, y con residuos 231 - 455 derivados de IGHG3_MOUSE (IgG3 de ratón, isoforma 2).
Ejemplo 12: Adaptación de marco humano de anticuerpo anti-CD3 SP34
[0288] El anticuerpo murino anti-CD3 SP34 se humaniza por el método de Adaptación de Marco Humano (Fransson, et al, JMB, 2010 398(2):214-31). Se combinaron cuatro cadenas pesadas diferentes con tres cadenas ligeras diferentes para producir 12 variantes humanizadas.
Selección de maduración de afinidad y humanización SP34 de líneas germinales humanas
[0289] Se seleccionó una matriz de cuatro secuencias de regiones humanas pesadas y tres v ligeras para la prueba. La selección de líneas germinales humanas se basó únicamente en la similitud de secuencia global con SP34 en la región marco (FR). Ni las secuencias CDR, ni su longitud o estructuras canónicas, se consideraron en esta selección.
[0290] Las coincidencias más cercanas para la cadena pesada son los GL humanos IGHV3-72 e IGHV3-73. Se seleccionó otro GL, IGHV3-23 debido a su alta frecuencia de aparición en el repertorio de células B humanas.
[0291] Las coincidencias más cercanas para la cadena ligera son NR lambda humana IGLV7-43 (aka 7a), IGLV7-46 (aka 7b) y IGLV1-51 (aka lb). IGLV7-46 es prácticamente idéntico a IGLV7-43, pero tiene una ventaja de Ala en la posición 2, es decir, como en SP34.
[0292] Las regiones J seleccionadas son las siguientes: IGHJ1 para la cadena pesada; IGLJ3 para la cadena ligera lambda.
Mutaciones traseras
[0293] Para preservar la conformación de CDR-H3, los residuos en varias posiciones estructurales en VL, más notablemente deben retenerse en las posiciones Val38, Gly48 y Gly51 (Figura 11). Estas “mutaciones posteriores” se agregaron al plan de humanización.
[0294] La Asn en la posición 57 de la cadena pesada no tiene buena densidad de cadena lateral en la estructura. También se encuentra en el medio de CDR-H2 y apunta lejos del sitio de unión típico. Según este análisis, puede no contribuir a la unión de manera significativa. Además, la geometría de la columna vertebral se encuentra en una región más favorable para un residuo Gly en la trama de Ramachadran. Por lo tanto, se truncó a Gly en el plan de maduración para permitir la flexibilidad necesaria y potencialmente mejorar la estabilidad (al reducir la tensión estructural local no relacionada con la glicina) sin afectar la unión.
[0295] Se hicieron varias otras consideraciones en el diseño de la humanización. Primero, los GL humanos IGLV7-46 e IGLV7-43 introducen un Trp en la posición 59 con un potencial de oxidación no deseado. Otros dos GL tienen Gly en esta posición, que corresponde a la secuencia del ratón. Por lo tanto, Gly59 se conservó en las variantes IGLV7-46 e IGLV7-43. Finalmente, Ala en la posición 49 de VH puede ser esencial. Además, el residuo en la posición 99 (Val en SP34) puede afectar la unión al antígeno. Para probar estas posiciones, se introdujeron mutaciones posteriores en algunas variantes (Figura 12).
Matriz HFA
[0296] La matriz HFA (Tabla 11) está compuesta por cuatro variantes de VH y tres variantes de VL (Figura 12). A los efectos de HFA, se utiliza la definición AbM CDR (KR Abhinandan y AC Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839).
[0297] Las variantes para VH:
CD3H141 (SEQ ID NO: 184): IGHV3-72*01 con CDR de ratón Gly49Ala
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAA
SVKGRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CD3H142 (SEQ ID NO: 185): IGHV3-23*01 con CDR de ratón Ser49Ala
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAD
SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CD3H143 (SEQ ID NO: 186): IGHV3-23*01 con CDR de ratón Ser49Ala, Ala99Val
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYAD
SVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVKHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
CD3H144 (SEQ ID NO: 187): IGHV3-73*01 con CDR de ratón Asn57Gly
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFNTYAMNWVRQASGKGLEWVGRIRSKYNGYATYYAA
SVKGRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS
[0298] Las variantes para VL:
CD3L63 (SEQ ID NO: 188): IGLV7-46*01 con CDR de ratón F38V, A48G, Y51G, W59G
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPGTPARF
SGSLLGGKAALTLSGAQPEDEAEYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL CD3L64 (SEQ ID NO: 189): IGLV1-51*01 con CDR de ratón Y38V, L48G, Y51G
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCRSSTGAVTTSNYANWVQQLPGTAPKGLIGGTNKRAPGIPDRF
SGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVL CD3L66 (SEQ ID NO: 190): IGLV7-43*01 con CDR de ratón F38V, A48G, Y51G, W59G
Tabla 11 Matriz de cadenas pesadas y ligeras de CD3
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[0299] Las secuencias de aminoácidos se tradujeron de nuevo a ADN y se preparó ADNc usando técnicas de síntesis de genes (Patente de Estados Unidos N° 6,670,127; Patente de Estados Unidos N° 6,521,427). Las regiones v de la cadena pesada (HC) se subclonaron en mutaciones de IgG1-AA Fc humano que contenían mutaciones L234A, L235A y F405L usando un vector de expresión interno con el promotor CMV usando técnicas estándar de biología molecular. Las regiones variables de la cadena ligera (LC) se subclonaron en regiones constantes Lambda (A) humanas usando un vector de expresión interno con el promotor CMV usando técnicas estándar de biología molecular. Los plásmidos resultantes se transfectaron en células Expi293F (Invitrogen) y se expresaron mAbs. La purificación se realizó mediante métodos estándar utilizando una columna de proteína A (columna HiTrap MAbSelect SuRe). Después de la elución, los grupos se dializaron en D-PBS, pH 7,2. La secuencia VH y VL de los anticuerpos se muestra en la Tabla 12.
Tabla 12. Las secuencias VH y VL de anticuerpos anti-CD3
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(Continuación)
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(Continuación)
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[0300] Se generó un anticuerpo anti-CD3 monoespecífico CD3B143 que comprende las regiones VH y VL que tienen el VH de SEQ ID NO: 184 y el VL de SEQ ID nO: 188 y una región constante de IgG1 con L234A, L235A, F405L sustitución. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B144 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 184 y la VL de SEQ ID NO: 189 y una región constante de IgG1 con sustituciones L234a , L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B146 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 184 y la VL de SEQ ID NO: 190) y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B147 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 185 y la VL de SEQ ID NO: 188) y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B148 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 185 y la Vl de SEQ ID NO: 189 y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B150 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 185 y la Vl de SEQ ID NO: 190 y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B151 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 186 y la Vl de SEQ ID NO: 188 y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B152 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 186 y la Vl de SEQ ID NO: 189 y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B154 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 186 y la Vl de SEQ ID NO: 190 y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B155 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 187 y la Vl de SEQ ID NO: 188 y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B156 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 187 y la Vl de SEQ ID NO: 189 y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B158 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 187 y la Vl de SEQ ID NO: 190 y una región constante de IgG1 con sustituciones L234A, L235A y F405L.
Ejemplo 13: Unión celular endógena de los resultados anti-CD3 humanizados a células T primarias
[0301] El panel resultante de anticuerpos anti-CD3 se probó para la unión contra CD3s de superficie celular en células T humanas primarias. Para hacer esto, se visualizó la unión de los anticuerpos de los sobrenadantes de expresión usando un anticuerpo secundario antihumano policlonal y se analizó por citometría de flujo. Brevemente, la unión de los anticuerpos anti-CD3 a CD3s de la superficie celular se evaluó mediante citometría de flujo utilizando linfocitos T humanos primarios purificados por selección negativa (Biological Specialty, Colmar, EE.UU.). Los sobrenadantes de expresión o anticuerpos purificados se normalizaron a 10 pg/ml en medio o tampón FACS (BD BioSciences), respectivamente. 2x105 células se dividen en partes alícuotas en pocillos de una placa de fondo redondo de 96 pocillos (Costar) para el etiquetado. Los anticuerpos en el sobrenadante de expresión se añadieron a las células y se incubaron durante 45 minutos a 4°C. Después de la centrifugación a 1300 rpm durante 3 minutos y la eliminación del sobrenadante, se incubaron 50 pl de anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-humano Alexa Fluor 647 (Life technologies Inc.) con las células a una concentración final de 10 pg/mL. durante 30 minutos a 4°C lejos de la luz directa. Después del lavado y la resuspensión en 30 pl de tampón FAC (BD BioSciences). La recogida de muestras se realizó en un sistema Intellicyt HTFC utilizando el software ForeCyt. Las células individuales viables se cerraron antes del análisis de unión usando los tintes vivos/muertos fijos verdes o rojos (Life Technologies Inc.) y el área de dispersión delantera/lateral y los parámetros de altura, respectivamente. Los gráficos se generaron en GraphPad Prism versión 5 utilizando valores medios de intensidad de fluorescencia.
[0302] Aunque se ejecutó una serie de titulación, se presenta una concentración intermedia en la Fig. 13 para mayor claridad. Se usaron como controles dos anticuerpos internos derivados de fagos con la misma región Fc que los anticuerpos terapéuticos: G11 (HC SEQ ID NO: 222, LC SEQ ID NO: 223), se usó un anticuerpo agonista no reactivo de reacción cruzada cínica como un control positivo y CD3B94 (HC-SEQ ID NO: 224, LC - SEQ ID NO: 225) se usó un anticuerpo no aglutinante/no agonista para evaluar la unión no específica. El anticuerpo comercial SP34 no se usó como un comparador en este ensayo ya que es un anticuerpo de ratón y el uso de un reactivo de detección secundario diferente habría prohibido la comparación directa con las variantes probadas.
[0303] Los datos demuestran una matriz de potencial de unión dentro del panel de golpes anti-CD3 humanizados, con dos anticuerpos (CD3B144, CD3B152) que muestran una pérdida completa de unión a las células T humanas. Los anticuerpos restantes mostraron un rango de potencial de unión que podría ser ampliamente dividido en aglutinantes fuertes y débiles utilizando el enlace G11 como umbral arbitrario. Usando estos parámetros, se identificaron siete ligantes fuertes y siete ligantes débiles del panel de variantes (Figura 13).
[0304] El análisis de unión de los resultados anti-CD3 a las células T CD4+ cynomolgus primarias se probó luego para evaluar la retención de reactividad cruzada. Células T CD4+ purificadas de la sangre periférica de monos cynomolgus (se utilizaron Zen Bio, Triangle Research Park, EE.UU.). Los protocolos de ensayo fueron similares a los descritos anteriormente. Dado que G11 no reacciona de forma cruzada con cynomolgus CD3s, CD3B124, se usó un anticuerpo quimérico derivado de SP34 interno que tiene el VH y VL de SP34 con marco murino y un IgG1 Fc humano como control positivo en este ensayo (Figura 14). Curiosamente, varias variantes mostraron un potencial de unión disminuido en comparación con el observado con células humanas. Esto incluía los aglutinantes fuertes CD3B150, CD3B151 y CD3B154, en los que se redujo la unión, y varios aglutinantes débiles donde la unión ya no se podía detectar en el fondo. Esta pérdida de unión no estaba relacionada con una cadena de inmunoglobulina específica, lo que sugiere que la combinación de cadenas pesadas y ligeras desempeñó un papel en la pérdida de reactividad cruzada. Juntos, estos ensayos permitieron la identificación de variantes que retuvieron la reactividad cruzada de las especies entre CD3s humano y cynomolgus.
Ejemplo 14: Análisis funcional de los resultados anti-CD3 humanizados en células T primarias
[0305] El análisis de unión demostró que el panel de resultados anti-CD3 humanizados mostró un rango de potencial de unión a células T humanas y cynomolgus. Para investigar la capacidad de cada variante para inducir la activación mediante la reticulación de c D3s, se cultivaron células T primarias durante la noche en presencia de anticuerpo conjugado con perlas. Al día siguiente, las células se cosecharon y se marcaron con un anticuerpo anti-CD69 para medir la activación (Figura 15). Los anticuerpos anti-CD3 humanizados se unieron a perlas magnéticas recubiertas con proteína A (SpheroTech, Lake Forest, EE.UU.) Mediante incubación durante la noche con anticuerpo a 10 gg/ml. Al día siguiente, 2x105 células T humanas primarias se sembraron en placas de cultivo celular de fondo redondo por triplicado y 2x105 se añadieron perlas recubiertas. Después del cultivo nocturno a 37°C, las células se cosecharon y se marcaron con anticuerpo antiCD69 Alexa Fluor® 488 (clon FN50; Biolegend) para evaluar la regulación positiva de este marcador de activación. La recogida de muestras y el análisis se realizaron como se describió anteriormente para la unión. Se ejecutaron varios controles negativos, incluidas las células T solas, las células T con perlas no recubiertas y las células T con perlas recubiertas con control de isotipo (CD3B94). Todos estos mostraron valores de intensidad de fluorescencia medios similares comparables a las células T sin teñir, lo que indica que el fondo fue bajo en este ensayo. Se realizaron varios controles positivos para la comparación, incluido OKT3 (US5929212) y el anticuerpo SP34-2 disponible comercialmente.
[0306] A continuación, se evaluó la capacidad de los linfocitos T CD4+ cynomolgus primarios humanizados contra CD3 humanizados (Zen Bio, Triangle Research Park, EE.UU.) en el mismo ensayo (Figura 16). El anticuerpo FN50 anti-CD69 se ha descrito como reactivo cruzado con proteínas no humanas y, por lo tanto, podría usarse para probar la activación de estas células.
[0307] Los datos de activación humanos y de cynomolgus se correlacionaron con los datos de unión en que el panel de accesos muestra un intervalo de potenciales de activación. Varios de los aglutinantes fuertes mostraron la capacidad de activar células T humanas en un grado equivalente o mayor en comparación con SP34-2 disponible comercialmente. Varias variantes mostraron un potencial de activación menor que el SP34-2, mientras que algunos aglutinantes no mostraron evidencia de estimulación de CD69. La incapacidad de activación solo se observó en las variantes que no mostraron una unión o o mostraron una unión débil y todos los ligantes fuertes mostraron cierto nivel de activación, lo que sugiere una correlación entre los potenciales de unión y activación tanto para humanos (Figura 17A) como para cynomolgus (Figura 17B).
Ejemplo 15: Preparación de los anticuerpos en un formato biespecífico en IgG1 L234A, L235A
[0308] Varios anticuerpos monoespecíficos CD123 se expresaron como IgG1, que tienen sustituciones Fc L234A, L235A y K409R (en anti-CD123) (numeración según el índice de la UE) en sus regiones Fc. Los anticuerpos monoespecíficos se expresaron en líneas celulares HEK. Los anticuerpos monoespecíficos de CD3 fueron IgG1 con sustituciones de Fc L234A, L235A y F405L.
[0309] Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD123 I3RB135-K409R que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-CD123 I3RB2 que tiene el VH de SEQ ID NO: 120 y el VL de SEQ ID NO: 165 y una región constante IgG1 con sustitución L234A, L235A y K409R.
[0310] Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD123 I3RB125-K409R que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-CD 123 I3RB18 que tiene el VH de SEQ ID NO: 136 y el VL de SEQ ID NO: 168 y una región constante de IgG1 con sustitución L234A, L235A y K409R.
[0311] Como control, se generó un anticuerpo anti-RSV monoespecífico, B21M, que comprende las regiones VH y VL que tienen el VH de SEQ ID NO: 191 y el VL de SEQ ID NO: 192 y una región constante de IgG1 con L234A, L235A y K409R o F405L se asocian como el brazo nulo con el brazo CD3 o CD123 de un anticuerpo biespecífico.
[0312] Los anticuerpos monoespecíficos se purificaron usando métodos estándar usando una columna de proteína A (columna HiTrap MabSelect SuRe). Después de la elución, los grupos se dializaron en D-PBS, pH 7,2.
[0313] Los anticuerpos monoespecíficos anti-CD123 se combinaron en matriz en un intercambio de brazo Fab in vitro para generar anticuerpos biespecíficos que posteriormente se caracterizaron adicionalmente (Tabla 13).
Tabla 13. Matriz de mAbs CD123 x CD3 para formar anticuerpos biespecíficos
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[0314] Los anticuerpos biespecíficos CD123 x CD3 se generaron combinando un mAb CD3 monoespecífico y un mAb CD123 monoespecífico en un intercambio de brazo Fab in vitro (como se describe en el documento WO2011/131746). Brevemente, a aproximadamente 1-20 mg/ml en una relación molar de 1,08:1 de anticuerpo anti-CD123/anti-CD3 en PBS, pH 7-7,4 y 2-mercaptoetanolamina 75 mM (2-MEA) se mezcló e incubó a 25-37°C durante 2-6 h, seguido de la eliminación del 2-MEA mediante diálisis, diafiltración, filtración de flujo tangencial y/o filtración de células hiladas utilizando métodos estándar. Los anticuerpos biespecíficos de control con un brazo anti-RSV-(B21 M) se generaron de manera similar.
[0315] Los anticuerpos monoespecíficos anti-CD3 y CD123 generados se mezclaron para el intercambio de brazo Fab in vitro en matriz y se caracterizaron en varios ensayos. El anticuerpo biespecífico I3RB179-Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B146-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB135-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB186-Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B146-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB125-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB180-Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B147-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB135-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB187-Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B147-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB125-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB181-Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B151-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB135-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB188-Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B155-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB125-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB182-Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B154-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB135-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB189-Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B154-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB125-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB183-Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B155-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB135-K409R. El anticuerpo biespecífico CD3B191 -Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B155-F405L y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB125-K409R.
[0316] Para los anticuerpos biespecíficos de control, el anticuerpo anti-RSV, B21M (HC SEQ ID NO: 207 - mostrado con la mutación F405L, LC SEQ ID NO: 208), se combinó con el brazo CD3 o los brazos CD123 como sigue. El anticuerpo biespecífico I3RB185-Ab comprende el brazo de unión anti-RSV del mAb B21M-F405L y el brazo de unión CD123 del mAb I3RB135-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB191-Ab comprende el brazo de unión anti-RSV del mAb B21M-F405L y el brazo de unión CD123 del mAb I3RB125-K409R. El anticuerpo biespecífico I3RB192-Ab comprende el brazo de unión anti-RSV del mAb B21M-K409R y el brazo de unión CD3 del mAb CD3B146-F405L. El anticuerpo biespecífico I3RB193-Ab comprende el brazo de unión a RSV del mAb B2M-F409R y el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B147-F405L. El anticuerpo biespecífico I3RB194-Ab comprende el brazo de unión anti-RSV del mAb B2M-F409R y el brazo de unión CD3 del mAb CD3B151-F405L. El anticuerpo biespecífico I3RB195-Ab comprende el brazo de unión anti-RSV del mAb B21M-K409R y el brazo de unión CD3 del mAb CD3B154-F405L. El anticuerpo biespecífico I3RB196-Ab comprende el brazo de unión a RSV del mAb B21M-K409R y el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B155-F405L.
[0317] Las cadenas pesada y ligera para el ABS biespecífico CD123 x CD3 se muestran a continuación en la Tabla 14.
Tabla 14. Secuencias de cadena pesada y ligera para anticuerpos IgG1 biespecíficos
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Ejemplo 16: Evaluación de anticuerpos biespecíficos en el ensayo funcional de destrucción celular
[0318] El ensayo de citotoxicidad mediada por células T es un ensayo funcional para evaluar los anticuerpos biespecíficos CD123 x CD3 para la lisis celular usando células T de donantes sanos.
[0319] Se siguió el protocolo de Laszlo, et al (Laszlo, G., et al 2014 BLOOD 123: 4, 554-561). Brevemente, las células efectoras se cosecharon, se contaron, se lavaron y se resuspendieron a 1 x 10A6 células/ml en medio celular RPMI (10% FBS). Las células diana se marcaron con CFSE (Invitrogen n° C34554) y se resuspendieron a 2x105 células/ml en RPMI (Invitrogen n° 61870-036) con FBS al 10% (Invitrogen n° 10082-147). Los efectores y las células diana marcadas con CFSE se mezclaron a E:T=5:1 en placas estériles de fondo redondo de 96 pocilios. Se añadió una alícuota de 5 pl de cada anticuerpo biespecífico a cada pocillo que contenía diversas concentraciones. Los cultivos se incubaron durante 48 horas a 37°C bajo 5% de CO2. Después de 48 horas, se añadió a las muestras The LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain buffer (life technologies Cat# L10119), y los cultivos se incubaron durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, se lavaron y se volvieron a suspender en tampón FAC de 170 pl. La citotoxicidad inducida por el fármaco se determinó utilizando el citómetro de flujo CANTO II (BD Biosciences) y se analizó con el software FlowJo o Dive (BD Biosciences). La población de interés son las células CFSE /vivas/muertas+ doblemente positivas.
[0320] Los resultados de la lisis celular mediada por células T de las líneas celulares AML MV4-11 (Figura 18A y B), OCI-AML5 (Figura 19A y B) y OCI-M2 (Figura 20A y B) después incubación de de 48 h a 37°C, se muestra 5% de CO2. El MV4-11 y el OCIAML5 son líneas celulares de expresión de CD123, y el OCI-M2 tiene una expresión significativa baja de CD123. La relación Efector/diana para este estudio fue de 5:1. Se añadió una alícuota de 2 mg/ml de bloqueador de Fc para bloquear la función de Fc.
[0321] Anticuerpos tanto I3RB2 como I3RB18, cuando se combina con un anticuerpo anti-CD3 en un formato biespecífico, son eficaces para matar específicamente CD123 células. Adicionalmente, los datos permiten una clasificación clara entre el I3RB135 (basado en I3RB2) y I3RB125 (anticuerpos biespecíficos basados en I3RB18) con los anticuerpos biespecíficos I3RB125 x CD3 que son más potentes que los anticuerpos biespecíficos I3RB135 x CD3. Dentro de cada familia, los anticuerpos biespecíficos basados en CD3B146 y CD3B155 (mAb de mayor afinidad) fueron más potentes que los anticuerpos biespecíficos basados en CD3B151 y CD3B154. Se observan bajos niveles de citotoxicidad de fondo dependiente de la dosis con la línea celular de baja expresión de CD123 OCI-M2.
Ejemplo 17: Evaluación del anticuerpo biespecífico, I3RB186 en un modelo tumoral de materiales y métodos de enfermedad
[0322] Línea celular. Para determinar la eficacia del anticuerpo biespecífico, I3RB186 in vivo, se seleccionaron líneas de células tumorales disponibles comercialmente con alta expresión de CD123 para estudios de eficacia. Las células tumorales de leucemia mielógena aguda (LMA) humana KG-1 (DSMZ, número de catálogo ACC 14) se mantuvieron in vitro en medio RPMI suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor (10% v/v) a 37°C en una atmósfera de 5% de CO2 en el aire. Las células se subcultivaron rutinariamente dos o tres veces por semana. Las células que crecen en una fase de crecimiento exponencial se cosecharon y se contaron para la inoculación de células tumorales.
[0323] Preparación de PBMC humanas para injerto. Se usaron células enriquecidas mononucleares humanas (Catálogo 213-15-04), obtenidas de Biological Specialty Corporation (Colmar, PA), para la prueba de la molécula de hIgG1-AA. PBMCs se aislaron por medio de separación en gradiente de densidad Ficoll (Ficoll-Paque™ Plus, GE Healthcare Bio-Sciences AB, catálogo 17-1440-03), y se dividió en alícuotas en 50x106 células por vial en medio de congelación (Recovery Cell Culture Freezing Medium, Gibco, Catálogo 12648-010). Los viales se almacenaron a -80°C durante aproximadamente 24 horas, y luego se transfirieron a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Viales de células mononucleares de sangre periférica congeladas aisladas (100x106 células por vial, catálogo PB009-3) obtenidas a partir de HemaCare (Van Nuys, CA) se utilizaron para las pruebas de molécula de IgG4. Para descongelar las PBMC, los viales congelados se colocaron en un baño de agua a 37°C. Las células se transfirieron a un tubo cónico que contenía medios de descongelación en frío. El tubo cónico se centrifugó y las células se resuspendieron en PBS estéril. La viabilidad celular se evaluó utilizando el método de exclusión de azul de tripano. Las células se resuspendieron a una concentración celular de 50x106 células por ml en PBS estéril para inyección.
[0324] Recogida de sangre periférica para análisis FACS. Para ello, se recogieron 50 pl de sangre de cada animal a través de seno retroorbital en tubos recubiertos con heparina de litio. Una alícuota de sangre de 25 pl de cada muestra se colocó en 175 pl de medios (RPMI con 10% FBS) en cada una de dos placas de 96 pocillos. Las placas se centrifugaron y los glóbulos rojos se lisaron usando tres tratamientos con tampón de lisis ACK. Las células restantes se consolidaron para cada muestra y se tiñeron para CD45, CD3, CD8 y CD4 para cuantificar los linfocitos T humanos circulantes (ver recogida/tinción de sangre periférica de ratón: protocolo para aislamiento de leucocitos y análisis FACS).
[0325] Protocolo para el análisis de FACS de leucocitos. Protocolo para el análisis FACS de leucocitos. Se recogió sangre periférica hasta dos veces durante el estudio para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de PBMC humanos circulantes. Se diluyó sangre completa (25 pl) en 175 pl de medio RPMI en placas de 96 pocillos. Las placas se centrifugaron a 1400 rpm durante 4 minutos y el sobrenadante se decantó. Las células se resuspendieron en 200 pl de tampón de lisado ACK y se incubaron en hielo durante 5 minutos. Después de la centrifugación a 1300 rpm durante 5 minutos, se aspiró el sobrenadante. Las células se volvieron a tratar con tampón de lisis ACK dos veces más y se lavaron una vez en 200 pl de PBS y se volvieron a centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 50 pl/pocillo de cóctel de anticuerpos en PBS que contenía tinción viva/muerta (Invitrogen, cat n° L10119, 0,25 pl/pocillo de stock. El stock es 1 vial diluido en 150 pl DMSO) y se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min. Los siguientes anticuerpos se usaron para marcar las células: CD4 (Becton Dickinson Cat. 557922, 0,5 pl/pocillo), CD8 (Invitrogen, Q010055, 0,5 pl de una dilución 1:10 en PBS/pocillo), CD3 (Becton Dickinson, cat. 558117, 0,5 pl/pocillo), CD45 (BioLegend cat. 304006, 0,5 pl/pocillo). Las células se lavaron 3X con tampón FACS (200 pl/pocillo) y se resuspendieron en 170 pl de tampón FACS. La recogida de muestras se realizó en un analizador de citometría de flujo BD LSR Fortessa. Las células individuales viables se cerraron antes del análisis usando colorante vivo/muerto de infrarrojo cercano (Life Technologies Inc.) y el área de dispersión frontal/lateral y los parámetros de altura, respectivamente. Los datos se analizaron usando el software BD FACS Diva versión 7.
[0326] Diseño in vivo. Ratones NSG hembra (NOD.Cg- PRKDCsdd ÍL2RG<m1Wi/SZJ) se inocularon ratones por vía subcutánea con KG-1 en las células (5x106 células en solución salina tamponada con fosfato en un volumen de 200 pl) en el flanco dorsal de cada animal. El día de la inoculación de las células tumorales se denotó como el día 0. Las mediciones del tumor se monitorizaron dos veces por semana, comenzando siete días después de la implantación, hasta que los volúmenes tumorales oscilaron entre 100-150 mm3 (catorce días después de la implantación), momento en donde los ratones fueron aleatorizados por volumen tumoral en grupos de tratamiento. Los ratones fueron entonces injertados por vía intravenosa (vena de la cola lateral) con células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) (10x106 células en solución salina tamponada con fosfato en un volumen de 200 pl). Inmediatamente después del injerto de PBMC, los ratones recibieron terapia intravenosa biespecífica Ab I3RB186 (biespecífica diluida en PBS y dosificada a un volumen de 100 pl). El tratamiento se produjo aproximadamente cada dos días para un total de cinco dosis (consulte la Tabla 15 para ver los días exactos de dosificación). Las medidas tumorales y los pesos corporales se registraron dos veces por semana.
[0327] Los criterios de valoración de los estudios fueron inhibición del crecimiento tumoral, la carga tumoral máxima (grupo medio mayor de 1500 mm3), y pérdida de peso corporal mayor que el peso corporal del inicio del tratamiento al 20%. El tamaño del tumor se midió dos veces por semana en dos dimensiones usando un calibrador y el volumen se expresó en mm3 usando la fórmula: V = 0,5axb2 donde a y b son los diámetros largo y corto del tumor, respectivamente. La regresión tumoral completa (RC) se define como tumores que se reducen por debajo del límite de palpación (50 mm3). La regresión tumoral parcial (RP) se define como tumores que se reducen del volumen inicial del tumor. Se requiere una duración mínima de CR o PR en tres o más mediciones tumorales sucesivas para que un CR o PR se considere duradero.
[0328] El injerto de las PBMC humanas conduce a la eventual enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) en los ratones, donde las células T del donante injertado se activan e infiltran en los tejidos del huésped, lo que conduce a la insuficiencia orgánica, pérdida extrema de peso corporal e inevitablemente muerte. Para controlar el inicio y la gravedad de la EICH en este modelo, se registró el peso corporal dos veces por semana y se expresó en gramos (g). El cambio porcentual del peso corporal se calculó utilizando la fórmula: Cambio de peso corporal = [(CI)/I]*100 donde C es el peso corporal actual e I es el peso corporal al inicio del tratamiento.
[0329] Se proporcionan estadísticas resumidas, que incluyen la media y el error estándar de la media (SEM), para el volumen tumoral de diferencia en el volumen tumoral entre cada grupo en cada punto temporal se muestran en las tablas de estudio correspondientes. El análisis estadístico de la diferencia en el volumen tumoral entre los grupos se evaluó mediante una prueba de medidas repetidas ANOVA de dos vías, seguida de una prueba posterior de Bonferroni, con GraphPad Prism versión 5,01. p <0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Eficacia de Abs. Biespecífico CD123xCD3 IgG1, F234A, L235A
[0330] Se inocularon subcutáneamente ratones NSG con células KG-1, y luego se injertaron por vía intravenosa con PBMC humanas descritas previamente y se dosificaron con Ab biespecífico CD123 x CD3, I3RB186 a dosis de 0,01, 0,1, 1 y 10 pg por animal, cuando se establecieron tumores (volumen tumoral medio = 102 /- 5,9 mm3), como se describió anteriormente. Un subconjunto de ratones portadores de tumor no se injertaron con PBMC, sino que se dosificaron, como controles para el mecanismo del biespecífico en ausencia de Abs biespecífico de control. Además, un subconjunto de ratones no portadores de tumor se injertaron con PBMC y se dosificaron, como controles para el análisis de FACS de sangre periférica (ver Tabla 15 para el diseño del estudio).
Tabla 15. Programa de dosificación para la eficacia in vivo de I3RB186
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Resultados del estudio de eficacia in vivo
[0331] La Figura 21 muestra la eficacia de CD123xCD3 IgG1-AA biespecífico, I3RB186 - IgG1, F234A, L235A, en xenoinjertos de AML humana KG-1 cuando están presentes PBMC humanos, a dos dosis, 0,1 y 1 gg por animal (p<0,001). El biespecífico a 1 gg por animal (cuadrado gris cerrado) mostró una eficacia antitumoral más inmediata que a 0,1 gg, con regresiones completas en 3/8 animales y regresiones parciales en 3/8 animales. Sin embargo, el crecimiento tumoral se observó en 6/8 ratones a partir del día 55 después de la implantación del tumor. El biespecífico a 0,1 gg por animal (diamante cerrado gris) mostró una eficacia retardada pero mejor con regresiones completas y parciales en todos los animales. Los datos demuestran la necesidad de la presencia de linfocitos T efectores para la destrucción de células diana con anticuerpos biespecíficos.
[0332] La Figura 22 muestra el análisis FACS de sangre periférica recogida de ratones en el día 30 después de la implantación tumoral. Un aumento en las células CD45+, impulsado por un aumento en los linfocitos T CD8+, fue evidente en los animales portadores de tumores tratados con 0,1 y 1 gg de anticuerpos biespecíficos. Esta expansión de los linfocitos T CD8+ solo se produjo cuando las células diana (KG-1) estaban presentes, en grupos donde se observó eficacia antitumoral. Alternativamente, 10 gg de biespecífico parecían eliminar las CD45+PBMC de la sangre periférica. Este aclaramiento de las células efectoras puede explicar la falta de eficacia observada con esta dosis.
[0333] La Figura 23 muestra el análisis FACS de sangre periférica recogida de ratones en el día 53 después de la implantación tumoral. Las células CD45+, CD8+ y CD4+ estaban a niveles similares en ratones portadores de tumor tratados con 0,1 y 1 gg de biespecífico, como en ratones no portadores de tumor tratados con PBS y 0,01 y 0,1 gg de biespecífico. Los ratones no portadores de tumor tratados con 1 y 10 gg de biespecífico tenían niveles muy bajos de células CD45+, CD8+ y CD4+; La causa de esto es actualmente desconocida.
[0334] La Figura 24 muestra el cambio de peso corporal medio de los grupos de tratamiento a lo largo del tiempo.
Como se describió anteriormente, la pérdida de peso corporal se correlaciona con el inicio y la gravedad de la EICH, que es causada por las células T activadas. Tanto en ratones portadores de tumor como no portadores de tumor, la pérdida de peso corporal fue más grave con el tratamiento con 0,1 gg de anticuerpo biespecífico. Los ratones portadores de tumor tratados con 1 gg biespecífico no experimentaron una pérdida severa de peso corporal. Los linfocitos T estuvieron presentes en el día 53 después de la implantación del tumor (por análisis FACS, Figura 23), sin embargo, la falta de pérdida de peso corporal y la aparición de EICH indica una pérdida de células T activadas, lo que puede explicar el crecimiento tumoral visto en este grupo comenzando en el día 55 después de la implantación tumoral (Figura 21).
Ejemplo 18. Evaluación de I3RB186 y Abs biespecífico de control (I3RB191 e I3RB192) in v iv o
[0335] En el segundo experimento in vivo, se añadieron controles Ab biespecíficos, I3RB191, un brazo nulo CD3 e I3RB192, un brazo nulo CD123 Ab. El protocolo fue el mismo que para el Ejemplo 16. Los xenoinjertos de tumor de LMA humana KG-1 se implantaron subcutáneamente en ratones hembra NSG. Catorce días después del implante, los ratones fueron aleatorizados por volumen tumoral a grupos de tratamiento. Las PBMC humanas se implantaron por vía intravenosa, seguidas de un tratamiento intravenoso con I3RB186, e I3RB191 e I3RB192 controlan Abs biespecífico a 1 gg por animal (véase el programa de dosificación en la Tabla 16). El tratamiento se produjo los días 14, 16, 18, 21 y 23 días después del implante tumoral. Las flechas en la figura muestran los días de administración de Ab biespecíficos.
Tabla 16 Dosificación Calendario para el 2 ° experimento in vivo
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[0336] La actividad antitumoral del Abs biespecífico se muestra como un cambio en el tamaño del tumor (mm3) con el tiempo (Figura 25). El tratamiento con 13RB186 a 1 gg inhibió significativamente el crecimiento tumoral (p<0,001) en comparación con el de PBS y el control de animales tratados con Ab biespecíficos.
[0337] El día 36 después de la implantación tumoral, se recogió sangre periférica para el análisis FACS de PBMC humanos circulantes. A diferencia del primer estudio, no hubo diferencias en la frecuencia de las CD45+ PBMC humanas (a) o las frecuencias de linfocitos T CD8+ y CD4+ (b) en animales tratados con I3RB186 en comparación con PBS e I3RB191 (Figura 26). Las células CD45+, CD8+ y CD4+ se encontraban a frecuencias más bajas en animales portadores de tumor y no portadores de tumor tratados con I3RB192, el CD123 control de brazo nulo Ab biespecífico.
[0338] El día 63 después de la implantación tumoral, se recogió sangre periférica para el análisis FACS de PBMC humanos circulantes. De los animales portadores de tumor, solo quedaron los animales tratados con I3RB186 a 1 gg (Figura 27). Hubo una elevación en la frecuencia de las PBMC humanas CD45+ (a) y los linfocitos T CD8+ (b) en animales portadores de tumor tratados con 1 pg de I3RB186, en comparación con los animales no portadores de tumor tratados con PBS o 1 pg de I3RB186 (Figura 25) Los linfocitos T CD4+ estaban en frecuencias similares en todos los grupos restantes. Los ratones no portadores de tumor tratados con PBS y 1 pg de I3RB186 tenían frecuencias muy bajas de células CD45+, CD8+ y CD4+.
[0339] La Figura 28 muestra el cambio de peso corporal medio de los grupos de tratamiento a lo largo del tiempo. Como se describió anteriormente, la pérdida de peso corporal se correlaciona con el inicio y la gravedad de la EICH, que es causada por las células T activadas. En ratones con tumor, hubo una mayor pérdida de peso corporal con el tratamiento con 1 pg de anticuerpo biespecífico, en comparación con todos los demás grupos. Esto es contradictorio con el primer estudio, donde los ratones con tumor tratados con 1 pg de biespecífico no experimentaron una pérdida de peso corporal severa. Los linfocitos T estuvieron presentes en el día 63 después de la implantación tumoral (Figura 27), sin embargo, la eficacia a la dosis de 1 pg no fue tan pronunciada como en el primer estudio (Figura 21,25).
Ejemplo 19. Preparación de los anticuerpos en un formato biespecífico en IgG4 S228P, F234A, L235A
[0340] Varios de los anticuerpos monoespecíficos CD3 y CD123 se expresaron como IgG4, que tienen sustituciones Fc S228P, F234A y L235Ax (brazo CD123) o S228P, F234A, L235A, F405L y R409K (brazo CD3) (numeración según el índice de la UE) en sus regiones Fc. Los anticuerpos monoespecíficos se expresaron en líneas celulares CHO bajo promotores de CMV.
[0341] Un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B219 fue generado que comprende las regiones VH y VL que tiene la VH de SEQ ID NO: 184 y el VL de la SEQ ID NO: 190 y una región constante de IgG4 con S228P, F234a , L235A, F405L, y sustituciones R409K. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B217 que comprende las regiones VH y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 186 y la VL de SeQ ID NO: 188 y una región constante de IgG4 con sustitución S228P, F234A, L235A, F405L y R409K. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B218 que comprende las regiones Vh y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 186 y la VL de SeQ ID NO: 190 y la región constante IgG4 con sustituciones S228P, F234A, L235A, F405L y R409K. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD3 CD3B220 que comprende las regiones Vh y VL que tienen la VH de SEQ ID NO: 187 y la VL de SEQ ID NO: 188 y la región constante de IgG4 con sustituciones S228P, F234A, L235A, F405L y R409K.
[0342] Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD123 I3RB218 que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo antiCD123 I3RB2 que tiene el VH de SEQ ID NO: 120 y el VL de SeQ ID NO: 165 y una región constante de IgG4 con sustituciones S228P, F234A y L235A. Se generó un anticuerpo monoespecífico anti-CD123 I3RB217 que comprende las regiones VH y VL de un anticuerpo anti-CD123 I3RB18 que tiene el Vh de SEQ ID NO: 136 y el VL de SEQ ID NO: 168 y una región constante de IgG4 con S228P, F234A, y sustituciones L235A.
[0343] Como control, se generó un anticuerpo anti-RSV monoespecífico, derivado de B21M, que comprende las regiones VH y VL que tienen el VH de SEQ ID NO: 191 y el VL de SEQ ID NO: 192 y una región constante de IgG4 con S228P, F234A, L235A o F234A, L235A, R409K, F405L para asociarse como el brazo nulo con el brazo CD3 o CD123 de un anticuerpo biespecífico.
[0344] Se purificaron los anticuerpos monoespecíficos, y los anticuerpos anti-CD3 y CD123 monoespecíficos generados se mezclaron para intercambio de brazo Fab in vitro en la matriz (Tabla 12) como se describe previamente en el Ejemplo 15 y se caracteriza en diversos ensayos. El anticuerpo biespecífico -Ab 7959 comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B219 -F405L, R409K y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB217 -R409. El anticuerpo biespecífico Ab 3978 comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B217 -F405L, R409K y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB217 -R409. El anticuerpo biespecífico Ab 7955 comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B218 -F405L, R409K y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB217 -R409. El anticuerpo biespecífico 9958 Ab comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B220 -F405L, R409K y el brazo de unión a Cd 123 del mAb I3RB217 -R409. El anticuerpo biespecífico Ab 8747 comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B219 -F405L, R409K y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB218 -R409. El anticuerpo biespecífico Ab 8876 comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B217 -F405L, R409K y el brazo de unión a c D123 del mAb I3RB218 -R409. El anticuerpo biespecífico Ab 4435 comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B218 -F405L, R409K y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB218 -R409. El anticuerpo biespecífico Ab 5466 comprende el brazo de unión a CD3 del mAb CD3B220 -F405L, R409K y el brazo de unión a CD123 del mAb I3RB218 -R409.
[0345] Para los anticuerpos biespecíficos de control, se generó B2M1 en el formato IgG4 PAA, se purificó y se combinó con el brazo CD3 o los brazos CD123 siguiendo la matriz en la tabla 17 a continuación.
Tabla 17 Matriz de anticuerpos biespecíficos IgG4
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[0346] Cadenas pesadas y ligeras para anticuerpos biespecíficos CD123 x CD3 se muestran en la Tabla 18.
Tabla 18. Secuencias de cadena pesada y ligera para Abs biespecíficos IgG4-PAA
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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(Continuación)
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Ejemplo 20. Afinidad monovalente CD123 de anticuerpos biespecíficos en formato IgG4-PAA usando antígeno recombinante
[0347] Se realizaron experimentos de resonancia de plasmón superficial (SPR) para determinar la cinética y afinidad por la unión de anticuerpos biespecíficos CD3XCD123 a CD123 ECD SP1 humano y CD123 ECD SP2.
[0348] Las afinidades del Abs biespecífico anti-CD123 xCD3 3978, 7955, 7959, 9958 8876, 8747, 5466 por CD123 SP1 humano recombinante y CD123 ECD SP2 humano recombinante se midieron por resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento Biacore. Los estudios cinéticos se realizaron a 25°C utilizando un Biacore T200 (Biacore, Inc., ahora parte de GE Healthcare). El anticuerpo específico de cabra anti-IgG humana (Fc) (Jackson ImmunoResearch Laboratories Prod n° 109-005-098) se unió covalentemente a las superficies doradas recubiertas de carboximatilo dextrano de un chip sensor CM-5 (GE Healthcare). Los grupos carboximatilo de dextrano se activaron con N-Etilo-N’-(3-Dimetilaminopropilo)carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS). El anticuerpo anti-Fc se acopló a pH 4,5 en acetato de sodio 10 mM. Cualquier sitio reactivo restante en la superficie fue bloqueado por reacción con etanolamina. Para las mediciones de unión cinética, los anticuerpos anti-CD123 se capturaron en el anticuerpo anti-FcY específico humano. Se capturaron 40-70 RU de anticuerpo. La captura de Ab fue seguida por la inyección de CD123 SP1 humano o CD123 s P2 humano a concentraciones entre 0,4 nM y 400 nM a 40 pl/min. Los datos de asociación se recogieron durante 2 minutos seguidos de 10 minutos de disociación. La superficie se regeneró con 30 pl de H3PO4 100 mM 100 pl/min, seguido de NaOH 50 mM. Las muestras para análisis cinético se prepararon en tampón basado en PBS (D-PBS que contiene EDTA 3 mM y 0,005% de tensioactivo P20). Los datos informados son la diferencia en la señal SPR entre la célula de flujo que contiene el anticuerpo capturado y una célula de referencia sin anticuerpo capturado. Contribuciones instrumentales adicionales a la señal fueron eliminadas por sustracción de los datos de la inyección en blanco de la señal sustraída de referencia. Los datos se analizaron por asociación de ajuste y fases de disociación en todas las concentraciones (ajuste global) con un modelo de unión 1:1 utilizando el software de evaluación BIA (BIAcore, Inc.). Las tablas 20 y 21 resumen los resultados cinéticos y de afinidad obtenidos por Biacore. Ambas tablas muestran los datos obtenidos durante tres o más experimentos independientes.
[0349] Datos de Biacore indican que dentro de la misma familia, Abs bioespecíficos derivados de I3RB18 y Abs bioespecíficos derivados de I3RB2 se unen con afinidades similares a CD123 SP1 (Tabla 19) y con afinidades similares a CD123 SP2 (Tabla 20) Abs bioespecíficos derivados de I3RB18 al CD123 SP1 recombinante >10 veces más apretado que el Abs biespecífico derivado de I3RB2 con afinidades ~1 nM y 14 nM, respectivamente. Cuando se une a CD123 SP2 recombinante, el Abs biespecífico derivado de I3RB18 se une >5 veces más fuerte que el Abs biespecífico derivado de I3RB2 con afinidades ~0,3 nM y 1,7 nM, respectivamente. Las desviaciones estándar en las Tablas 19 y 20 indican que los datos fueron muy reproducibles.
Tabla 19 Datos cinéticos y de afinidad de Biacore para la unión de anticuerpos biespecíficos a CD123 SP1 humano recombinante.
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Tabla 20. Datos cinéticos y de afinidad de Biacore para la unión de anticuerpos biespecíficos anti-CD123 a CD123 SP2 humano recombinante
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Ejemplo 21. Afinidad monovalente CD123 de anticuerpos biespecíficos en formato IgG4-PAA al antígeno expresado en la superficie celular por MSD-CAT
[0350] Se realizaron afinidades monovalentes de los anticuerpos biespecíficos anti-CD 123 seleccionados para hCD123 SP1 y SP2 expresados en la superficie celular utilizando el método de técnica de afinidad de células MSD (MSD-CAT). El MSD-CAT se desarrolló internamente como un método sin etiquetas para determinar la afinidad utilizando células intactas en un formato de alto rendimiento. Estos experimentos se realizaron para evaluar la afinidad de unión y la especificidad de los candidatos anti-CD 123 a CD123 SP1 y CD123 SP2 humanos de superficie celular. Las líneas celulares utilizadas fueron pDisplay CD123SP1 humano y pDisplay CD123SP2. Se usó un anticuerpo de control negativo para evaluar si el andamio biespecífico de Abs se une de forma inespecífica a las células y diferenciar la unión inespecífica frente a la unión específica a CD123. Para medir la afinidad de estas interacciones utilizando el método MSD-CAT, una serie de mezclas con una concentración fija de anti-CD123 (800, 160, 32 y 6 pM) y concentraciones variables de células (20 millones a 1016 células/mL) se prepararon y se dejaron alcanzar el equilibrio haciendo girar las placas durante 24 horas a 4°C. Estas muestras se prepararon en medio DMEM Glutamax que contenía 0,05% de azida, 1% de BSA, 3 mM de EDTA. Los números de receptor de (0,29-1,08) x 106 hCD123 SP1/célula y (0,57-1,5) x 106 hCD123 SP2/se convirtieron a la concentración de receptor M en la mezcla sobre la base del volumen de reacción, la densidad celular (celdas/L) y el número de Avogadro. Esto dio como resultado concentraciones que oscilaban entre 35 nM y 0,5 M para c D123 SP1 humano; y 49nMa 0,97 pM para CD123 SP2 humano. Después del equilibrio, la placa se centrifugó durante 5 minutos < 1000 rpm y se detectó anti-CD3 libre en el sobrenadante. El anti-CD 123 libre en la mezcla se detectó por electroquimioluminiscencia (ECL) usando el instrumento de lector mesoscale discovery (MSD). Para la detección de anti-CD 123 libre en la mezcla equilibrada mediante inmunoensayos de electroquimioluminisceno (ECL) se prepararon placas de detección. Para preparar placas de detección (antígeno unido a placa en placas SA-MSD), se bloquearon placas estándar de estreptavidina MSD con 50 pl/pocillo de tampón de ensayo (PBS, (Life Sciences GlBCO 14190-136), Tween 20 al 0,05%, BSA al 0,2%) para 5 minutos. El tampón de ensayo se retiró sin lavar y se añadieron 50 pl/pocillo de 0,7 ug/ml de antígeno biotinilado en el tampón de ensayo a las placas MSD y se incubaron durante la noche (~16 horas a 4°C). Después de la incubación durante la noche, las placas se bloquearon agregando 150 pl/pocillo de tampón de ensayo sin eliminar el antígeno de recubrimiento, se incubaron durante ~1 hora a temperatura ambiente y se lavaron 5 veces con tampón de lavado (tampón de ensayo sin BSA). Se transfirieron 50 pl/pocillo de los sobrenadantes de la placa de muestras a placas recubiertas con antígeno, se incubaron durante 60 minutos y luego se lavaron 3 veces con tampón de lavado. Después de esto, se añadieron 50 pl por pocillo de anticuerpo de detección marcado con rutenio (antihumano H+L) y se incubaron durante 1 hora. Después de 1 hora, las placas se lavaron con tampón de lavado y se añadieron 150 pl de tampón de lectura MSD (tampón de lectura T 4X, R92TD-2, MSD) por pocillo. Las placas se leyeron inmediatamente en el lector MSD Sector Imager 6000a para conocer los niveles de luminiscencia. La señal de ECL detectada por MSD se expresó en términos de % de anticuerpo libre en la mezcla y los datos se analizaron para determinar la afinidad utilizando una ecuación definida por el usuario (derivada de la ley de acción masiva) introducida en el software Prism. Los resultados para experimentos MSD-CAT se muestran en la Tabla 21.
Tabla 21. Los datos de afinidad de MSD-CAT muestran la unión de moléculas anti-CD123 a CD123 SP1 humano de superficie celular y CD123 SP2 humano. Los datos se ajustaron utilizando un análisis de mínimos cuadrados no lineal con un modelo de unión 1:1.
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[0351] Afinidades MSD-CAT de Abs biespecíficos para la superficie celular CD123 SP1 son >6 veces más fuerte que los datos de SPR para CD123 SP1 recombinante; Sin embargo, las afinidades por CD123 SP2 de superficie celular son similares a CD123 SP2 recombinante (<2 veces diferentes). La diferencia en las afinidades SPR versus MSD-CAT para CD123 SP1 se debe probablemente a la presentación del antígeno en la superficie celular en comparación con el antígeno recombinante. MSD-CAT mostró que los Abs biespecíficos derivados de I3RB18 (3978, 7955, 7959, 9958) son los aglutinantes más ajustados a CD123 SP1 humano de superficie celular y CD123 SP2 humano con afinidades pM. Las afinidades derivadas de I3RB18 son aproximadamente 10 veces y aproximadamente 5 veces más estrictas que el Abs biespecífico derivado de I3RB2 para CD123 SP1 y CD123 SP2 de la superficie celular, respectivamente. Las afinidades fueron similares para Abs biespecíficos dentro de la misma familia.
[0352] En general, los análisis de interacción molecular que usan Biacore y MSD-CAT están de acuerdo en mostrar que el Abs biespecífico derivado de I3RB18 se une más fuertemente al CD123 humano recombinante y de superficie celular (SP1 y SP2) que para el Abs biespecífico derivado de I3RB2.
Ejemplo 22. Afinidad monovalente CD123 de anticuerpos biespecíficos en formato IgG4-PAA con el antígeno expresado en la superficie celular por citometría de flujo
[0353] Se usó citometría de flujo para medir valores de afinidad de varios Abs biespecíficos CD123xCD3 para CD3 en células T humanas (Biological Specialty, Colmar, EE.UU.) Y las células T de mono cynomolgus (Zen Bio, Triangle Research Park, EE.UU.). El formato implicó la unión competitiva usando una concentración fija de mAb anti-CD3 marcado de afinidad conocida y concentraciones crecientes de Abs de prueba no marcado (Ashkenazi A et al. PNAS: 88: 10535, 1991). El mAb anti-CD3 utilizado fue el anticuerpo CD3B146 hu IgG1-AlaAla F405L con un valor de afinidad similar a SP34-2. El Kd para SP34-2 se determinó usando la unión de saturación y en la Figura 29. La Figura 30 muestra la unión competitiva con B146 marcado y diversas concentraciones de anticuerpos biespecíficos CD123 x CD3 sin marcar obtenidos para células T humanas (Figura 30 A) y citomolgo (Figura 30 B). Se obtuvieron valores comparables para células T de mono humano y cynomolgus. Parece que hay tres grupos de afinidad de CD3 entre las muestras analizadas: alta (9-15 nM), media (25-50 nM) y baja (110-270 nM) que se resumen en la Tabla 22.
Tabla 22. Valores de afinidad (K d ) para anticuerpos biespecíficos CD123 x CD3 contra células T humanas o de cynomolgus: unión competitiva usando B146 marcado y concentraciones crecientes de anticuerpos no marcados
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Ejemplo 23 Evaluación de IgG4-PAA CD123 x CD3 Abs biespecífico en el ensayo funcional de destrucción celular
[0354] Se usó el ensayo de citotoxicidad mediada por células T como se describe en el Ejemplo 16 para evaluar el Abs biespecífico CD123 x CD3 para la lisis celular usando células T de dos donantes sanos. Para estos experimentos, se usaron células OCI-AML5, KG-1 y JIM3. JIM3 es una línea tumoral de mieloma y no tiene expresión de CD123 y se usó como control. Las células fueron tratadas durante 48 horas con Abs biespecífico. La relación E:T para este estudio fue de 5:1, y se agregaron 2 mg/ml de bloqueador de Fc para bloquear la función de Fc.
[0355] Se muestran los resultados de la célula T de lisis mediada por células de líneas de células de AML OCI-AML (Figura 31), KG-1 (Figura 32), y JIM3 (Figura 33) después de la incubación de 48 horas a 37°C, CO2 al 5%. El MV4-11 y el OCI-AML5 son líneas celulares de expresión de CD123, y el JIM3 tiene muy poca o ninguna expresión de CD123. La relación Efector/Objetivo para este estudio fue de 5:1. Se añadió una alícuota de 2 mg/ml de bloqueador de Fc para bloquear la función de Fc.
[0356] Los resultados son similares a los experimentos previos de destrucción celular con Abs biespecífico CD123 x CD3 en el formato IgG1-AA. Los anticuerpos tanto I3RB217 (I3RB18) como I3RB218 (I3RB2), cuando se combinan con un anticuerpo anti-CD3 en un formato biespecífico, son eficaces para matar específicamente las células CD123+. La destrucción celular es específica de las células que contienen CD123, como lo demuestra la falta de efecto sobre las células JIM3. Además, los datos permiten una clasificación clara entre los anticuerpos biespecíficos I3RB218 (basados en I3RB2) y I3RB217 (basados en I3RB18) con el Abs biespecífico I3RB217 x CD3 que es más potente que el Abs biespecífico I3RB218 x CD3, de acuerdo con los datos previos de destrucción celular.
E je m p lo 24. E va lu a c ió n d e a n t ic u e rp o s b ie s p e c í f ic o s en e l e n s a y o d e h e te r o d im e r iz a c ió n d e l r e c e p to r
[0357 ] El ensayo de dimerización del receptor DiscoveRx para IL3RA/CD131 (DiscoveRx 93-0969-C1) se usó para evaluar la capacidad de los anticuerpos CD123 para prevenir la heteromerización inducida por IL3 de II, 3Ra(CD123)/ÓRp(CD131). El CD123 y el CD131 están etiquetados con ProLink™ (PK) o Enzyme Acceptor (EA). Tras la activación inducida por IL3, las proteínas dimerizan para formar el receptor de IL3, obligando a los dos componentes p—gal a complementarse y crear una enzima activa. El p-gal activo genera una señal quimioluminiscente en presencia de sustrato. Los anticuerpos anti-CD123 o los anticuerpos biespecíficos que muestran una señal decreciente al aumentar la concentración de anticuerpos son positivos para prevenir la heterodimerización.
[0358 ] Las células se probaron para detectar aumentos en la actividad enzimática en presencia del ligando IL-3 usando reactivos de detección PathHunter® (DiscoveRx) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las líneas celulares HEK293 IL3RA-PK/CSF2RB-EA se sembraron en placas en medio de ensayo de 20 pl por cuadruplicado en placas de 384 pocillos con 5.000 células/pocillo. Las reservas de anticuerpos se diluyeron en serie en BSA/PBS al 0,1% de modo que la alta concentración de compuesto fue de 10 ug/ml. La dosis alta se diluyó en serie 1:3 con 11 dosis probadas. Se añadieron 5 pl de anticuerpo diluido a los pocillos. Las células se incubaron durante 1 hora a 37°C. Se diluyó una solución madre recombinante de IL-3 humana a 100 pg/ml de manera que se añadieron 5 pl de una dilución de 60 ng/ml de IL-3 a cada pocillo. La concentración final de IL-3 utilizada fue de 10 ng/ml. Las células se incubaron 6 horas adicionales a 37°C. El reactivo de detección instantánea PathHunter que contiene tampón de lisis y sustrato enzimático se añadió a las células, se incubó 30 minutos a temperatura ambiente y se leyó en el luminómetro Envision. Los datos se analizaron usando GraphPad Prism 6. Las curvas se ajustan usando una respuesta de dosis sigmoidal con pendiente variable (cuatro parámetros) sin restricciones; método de ajuste = mínimos cuadrados (ajuste normal).
[0359 ] Los anticuerpos biespecíficos IgG4 PAA 8747 y 7959, así como los anticuerpos parentales I3RB218 e I3RB217 se ejecutaron en el ensayo. El ensayo se realizó dos veces independientes en presencia de 10 ng/ml de IL-3 y el anticuerpo de control positivo CD123. Se usó 7G3 como comparador en el ensayo. Los anticuerpos que contenían la secuencia I3RB18 del brazo anti-CD123, I3RB217 y 7959, (Figura 34C y D) pudieron prevenir la formación de un receptor funcional de IL-3 en presencia de ligando IL-3. Los anticuerpos que contenían el brazo anti-CD 123 I3RB2, I3RB218 y 8747 (Figura 34A y B) no impidieron la formación del receptor funcional de IL-3 en este ensayo. Esto se correlaciona con datos anteriores que mostraron que I3RB18 podría inhibir la señalización corriente abajo asociada con un receptor funcional de IL-3.
E je m p lo 24. E va lu a c ió n d e v a r io s a n t ic u e rp o s b ie s p e c í f ic o s en e l m o d e lo tu m o ra l KG-1
[0360 ] Se evaluó la eficacia de varios de los Abs biespecíficos CD123 x CD3. en el modelo murino KG-1 AML como se describió previamente. El protocolo fue el mismo para este estudio como en los Ejemplos 16 y 17, excepto que los aislados congelados viales periféricos de células mononucleares de sangre (100x106 células por vial, Catálogo PB009-3) obtenidos a partir de HemaCare (Van Nuys, CA) se utilizaron para probar anticuerpos biespecíficos IgG4. Los ratones NSG se inocularon por vía subcutánea con células KG-1, y luego se injertaron por vía intravenosa con PBMC humanas cuando se establecieron los tumores (volumen tumoral medio = 135,7 /- 4,7 mm3). Ratones después se dosificaron con IgG4 PAA CD123 x CD3 Abs biespecíficos con diversas afinidades y el correspondiente control de Abs biespecífico en una gama de dosis, como se describe en. Tabla 23.
T a b la 23. P ro g ra m a d e D o s if ic a c ió n p a ra 3 er e s tu d io in v iv o
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(Continuación)
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[0361] Los resultados de los estudios in vivo de eficacia con múltiples CD123 x CD3 Abs biespecíficos se muestran en las figuras 35 - 42. Las figuras 35 - 38 muestran la eficacia de CD123 x CD3 IgG4-PAA biespecífico Abs en diversas afinidades y las dosis en xenoinjertos KG-1 de AML humana. En la Figura 35, los Abs biespecíficos con brazos de alta afinidad CD123 y CD3 tuvieron una eficacia significativa en comparación con PBS y Abs biespecíficos de control de los días 25 a 36 después de la implantación tumoral (p<0,001). El Ab 9958 biespecífico a la dosis de 1 pg tuvo una eficacia significativa en comparación con 0,1 pg, y ambas dosis de Ab 7959 biespecífico al día 36 después de la implantación del tumor (p<0,01). Esto indica que los brazos CD123 y CD3 de alta afinidad son necesarios para una eficacia pronunciada en este modelo.
[0362] En la Figura 36, Ab biespecíficos 3978 en 10 pg de dosis tuvo una eficacia significativa en comparación con PBS y controlar Abs biespecífico de día 28 (p<0,05) a través de día 36 (p<0,001) implantación post-tumor, dosis de 1 pg desde el día 32 (p<0,05) hasta el día 36 (p<0,01) después de la implantación tumoral, y la dosis de 0,1 pg desde el día 32 (p<0,01) hasta el día 36 (p<0,001) después de la implantación tumoral. Hay una respuesta dependiente de la dosis con este Ab biespecífico, lo que indica que un brazo CD123 de alta afinidad a una dosis alta puede dar como resultado eficacia en este modelo.
[0363] En la Figura 37, el Ab 8747 biespecífico a la dosis de 0,1 pg tuvo una eficacia significativa en comparación con PBS y Abs biespecífico de control de los días 32 a 36 después de la implantación tumoral (p<0,001), y en comparación con dosis de 1 y 10 pg para el día 36 después de la implantación tumoral (p<0,001). Esto indica que un brazo CD3 de alta afinidad a una dosis baja puede resultar eficaz en este modelo.
[0364] En la Figura 38, el Ab 8876 biespecífico no tenía una eficacia significativa en comparación con el PBS y el Abs biespecífico de control a ninguna dosis.
[0365] Las Figuras 39 - 42 muestran el cambio medio de peso corporal de los grupos de tratamiento a lo largo del tiempo. Como se describió anteriormente, la pérdida de peso corporal se correlaciona con el inicio y la gravedad de la EICH, que es causada por las células T activadas.
[0366] Los animales tratados con Ab biespecífico 7959 a 0,1 pg y Ab biespecífico 9958 a 1 pg tuvieron una pérdida de peso corporal más severa y de inicio más temprano que aquellos tratados con PBS, Abs biespecífico de control y las otras dosis de Ab biespecífico 7959 y Ab biespecífico 9958 (Figura 39). Esto se correlaciona con la eficacia significativa antitumoral observada a 1 pg de Ab biespecífico 9958 (Figura 35).
[0367] Los animales tratados con Ab 3978 biespecífico a la dosis de 10 pg tuvieron una pérdida de peso corporal más severa y de inicio más temprano en comparación con los tratados con PBS y Abs biespecífico de control (Figura 40). Los ratones tratados con las dosis de 1 pg y 0,1 pg siguieron la pérdida de peso corporal de una manera dependiente de la dosis. La pérdida de peso dependiente de la dosis se correlaciona con la eficacia antitumoral dependiente de la dosis observada en la Figura 36).
[0368] Los animales tratados con Ab biespecífico 8747 a la dosis de 0,1 pg tuvieron una pérdida de peso corporal similar a la del grupo tratado con PBS, sin embargo, los ratones recuperaron el peso corporal a partir del día 39 después de la implantación del tumor (Figura 41). No hubo pérdida de peso corporal con las dosis de 1 o 10 pg. La pérdida de peso observada con la dosis de 0,1 pg se correlaciona con la eficacia antitumoral observada con esta dosis (Figura 37).
[0369] Los animales tratados con Ab biespecífico 8876 no mostraron una pérdida de peso diferente de ratones tratados con PBS o biespecífico control (Figura 42), lo que corresponde a la falta de eficacia antitumoral observada con este anticuerpo biespecífico (Figura 38).
[0370] En resumen, el Abs biespecífico CD123 x CD3 muestra una eficacia constante en una línea celular de AML humana que expresa CD123, KG-1, solo en presencia de células efectoras (linfocitos T). La expansión de las células T se observó poco después del período de dosificación, solo en presencia de enfermedad (xenoinjertos KG-1). Además, la eficacia biespecífica se correlaciona con el inicio de la EICH, medida por la pérdida de peso corporal, lo que indica que hay linfocitos T activados. Juntos, estos datos indican que el biespecífico CD123 x CD3 tiene eficacia antitumoral a través del mecanismo propuesto de compromiso de las células diana y efectoras, y la muerte de las células T.
Ejemplo 24. Estudios de PK de ratón in v iv o
[0371] Los artículos de prueba Ab se formularon en solución salina tamponada con fosfato a 0,2 mg/ml. Las concentraciones se confirmaron usando el espectrofotómetro Nanodrop y luego se filtraron estérilmente con filtros de jeringa de 0,2 micras.
[0372] Los animales transgénicos utilizados en estos estudios se derivan de ratones C57BL/6. Tg32 con licencia del Laboratorio Jackson (Bar Harbor) tiene su gen FcRn a de ratón endógeno eliminado y son transgénicos con el gen FcRn a humano bajo el control del promotor del gen humano nativo. Tg32 hemi se refiere a ratones hemicigotos para el transgen FcRn, este último derivado por apareamiento de ratones transgénicos homocigotos con ratones knockout FcRn a. Se observó una correlación significativa entre la PK de anticuerpos humanos y la PK en primates con el modelo de ratón Tg32 hemi, y por lo tanto se usó en los siguientes estudios de PK para evaluar la vida media de Ab. Toda la cría de ratones se realizó en SAGE Research Labs Boyertown, PA Facility.
[0373] Para el estudio, se usaron ratones de 6 semanas de edad con 48 ratones Tg32 hemi hembra inyectados IV con Abs biespecífico hIgG4-PAA usando 5 ratones por grupo. Las hemorragias retroorbitales se tomaron en los mismos puntos de tiempo.
[0374] Después de la recogida de muestras, se realizó un análisis de suero. Las concentraciones de IgG humana en las muestras de suero se determinaron mediante un inmunoensayo electroquimioluminiscente con el formato MESO Scale Discovery (MSD). Las placas de estreptavidina MSD se revistieron con 50 pl/pocillo de 2 pg/ml biotinilado F(ab’)2 cabra anti hu IgG (H+L, lote Jackson 109-066-08) en el bloque de inicio T20 (Thermo) durante la noche, 4°C. Las placas se lavaron con tampón PBS y las muestras se diluyeron en suero de ratón al 10% (Bioreclamations, NY) en el bloque de inicio T20. Se incluyó en cada placa una curva estándar de cada artículo de prueba, comenzando a 0,1 mg/ml con diluciones en serie de 2 veces. Las placas se incubaron durante 2-3 h, RT en un agitador, se lavaron y luego se incubaron con 2 pg/ml de MSD-TAG (mAb IgG antihumano marcado con rutenio, R10Z8E9, MSD) durante 1 h, RT en un agitador. Las placas se lavaron y se agregaron 200 pl de MSD Read Buffer (MSD) y se leyeron en el MSD Sector Imager 6000.
[0375] Para determinar si las muestras de suero PK tenían títulos inmunes notables que podrían afectar la PK de las muestras de prueba, se realizó un ELISA realizado en placas Maxisorb (Nunc) recubiertas con el artículo de prueba respectivo a 10 pg/ml e incubadas durante la noche a 4°C. Las muestras de suero se diluyeron en BSA-PBS al 1% y se incubaron en las placas durante 2-3 h con agitación a temperatura ambiente. Se utilizó IgG anti-ratón de burro conjugado con peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch) para detectar el anticuerpo capturado; seguido de la adición de 3,3’,5,5'-tetrametilbencidina (Fitzgerald) para el desarrollo del sustrato. Se leyeron las placas y las lecturas del espectrofotómetro que fueron tres veces mayores que los valores de suero de tampón o control se consideraron positivas. Los títulos inmunes se expresaron como 1 /dilución de suero. No se observaron títulos inmunes (datos no mostrados).
[0376] Finalmente, se determinó la farmacocinética de las moléculas. Los cálculos de la semivida terminal (t1/2) de la fase de eliminación para los estudios de PK se determinaron utilizando el modelo de decaimiento exponencial de 1 fase ajustado por regresión lineal de la concentración logarítmica natural frente al tiempo utilizando el software Prism versión 5,01 (GraphPad Software, Inc.). Se descartaron los modelos de dos fases porque para cada artículo de prueba, el modelo de mejor ajuste fue un modelo de decaimiento exponencial de 1 fase según lo determinado por la no significación de la suma extra de la prueba de cuadrados F (p >0,05) para la mayoría de los animales. El modelo de desintegración no lineal de mínimos cuadrados fue ponderado por 1/concentración ajustada. Los cálculos de semivida de la fase de eliminación se determinaron usando la fórmula t1/2 = ln2/p donde p es la pendiente de la línea ajustada por el análisis de regresión de mínimos cuadrados que comienza después de la primera dosis.
[0377] En el estudio PK descrito aquí, el valor de la vida media terminal para un anticuerpo se determinó tomando el promedio de los valores de t1/2 calculados para cada animal dentro del grupo de prueba. Los valores atípicos en los estudios se identificaron como animales que mostraban un título de IgG antihumana de ratón mayor de 1 a 1000 aproximadamente 7 días después de la dosis o un valor sérico inicial que era más de 2 veces menor que los valores para otros ratones en el grupo, tal vez debido a no estar completamente dosificado.
[0378] Las predicciones de PK humana a partir de los datos del ratón se basaron en las diferencias de semivida observadas en ratones huFcRn transgénicos frente a humanos para un panel de ocho anticuerpos IgG humanos cuyo aclaramiento no se vio afectado significativamente por la unión al objetivo en ratones o humanos. Sobre la base de esos análisis, se estimó que la vida media terminal en humanos para el Abs biespecífico CD123 x CD3 sería 2-4 veces más larga que la observada en los ratones huFcRn transgénicos, una extrapolación que asume la influencia de la unión del objetivo en el aclaramiento comparable en ratones y humanos. La Tabla 24 resume los valores de semivida de ratón observados para las diversas variantes de anticuerpos biespecíficos y los valores humanos predichos correspondientes que reflejan esa suposición. Debido a que el método de predicción conocido de PK humano basado en el escalado alométrico entre especies no se ha validado utilizando los datos de PK del ratón, no se utilizó el escalado alométrico para las predicciones. Los resultados de PK se muestran en la Fig. 43 con la concentración sérica frente al tiempo. Los perfiles de PK muestran una disminución lineal de la concentración sérica en el transcurso de 28 días. Los valores estimados de semivida de ratón para todos los anticuerpos biespecíficos CD123 x CD3 Abs fueron similares, entre 5,2-6,6 días. Se observaron títulos inmunes mínimos (<1:40) en todos los grupos. Los datos de PK del ratón (con media /- desviación estándar) junto con el aclaramiento humano previsto y los valores de semivida humana se resumen en las Tablas 24. La predicción de semivida humana supone que la unión a diana en humanos no es mayor que en ratones.
[0379] El anticuerpo biespecífico IgG4-PAA Abs mostró valores similares entre los grupos I3RB2 e I3RB18 en ratones. Los cálculos de la vida media del ratón de la fase de eliminación se determinaron utilizando el modelo de decaimiento exponencial de 1 fase ajustado por regresión lineal de las concentraciones logarítmicas naturales frente al tiempo como se describe. Los valores de semivida calculados para los ocho anticuerpos biespecíficos Abs en ratones Tg32 hemi fueron: 3978, 6,6 /- 0,7 días; 7955, 5,2 /- 0,4 días; 7959, 6,6 /- 0,6 días; 9958, 6,4 /- 0,7 días; 8876, 4,1 /-0,7 días; 4435, 5,4 /- 1,0 días; 8747, 6,4 /- 0,4 días; 5466, 5,6 /- 0,1 días. Las predicciones de PK humana a partir de los datos del ratón se basaron en las diferencias de semivida observadas en ratones transgénicos huFcRn frente a humanos. En base a esos análisis, la vida media terminal estimada en humanos para los anticuerpos biespecíficos CD123xCD3 sería de 2 a 4 veces mayor que la observada en los ratones transgénicos huFcRn, suponiendo que la influencia de la unión a diana en el aclaramiento sea comparable en ratones y humanos. La Tabla 24 resume los valores de semivida de ratón observados para las variantes de anticuerpos biespecíficos y los valores humanos predichos correspondientes que reflejan esa suposición.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una cadena pesada y una cadena ligera que tiene:
a. una cadena pesada CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 012, una cadena pesada CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 013, una cadena pesada CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 014, una cadena ligera CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 015, una cadena ligera CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 016, y una cadena ligera CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 017; o
b. una cadena pesada CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 051, una cadena pesada CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 052, una cadena pesada CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 053, una cadena ligera CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 024, una cadena ligera CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 025, y una cadena ligera CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 054.
2. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 120, y la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165.
3. El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 1, en donde la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 136 y la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 168.
4. El fragmento de unión a antígeno o anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es el isotipo IgG1 o IgG4.
5. Un anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 aislado o fragmento de unión a antígeno que comprende una primera cadena pesada (HC1), una segunda cadena pesada (HC2), primera cadena ligera (LC1) y una segunda cadena ligera (LC2), de modo que el HC1 y el LC1 se emparejen para formar un primer sitio de unión al antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD123 (IL3-Ra), y el HC2 y el LC2 se unan para formar un segundo sitio de unión al antígeno que se una inmunoespecíficamente a CD3, o un fragmento de unión biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 del mismo, en donde:
i) HC1 y LC1 comprenden cualquiera de los siguientes pares:
a. SEQ ID NO: 203 y SEQ ID NO: 204, o
b. SEQ ID NO: 205 y SEQ ID NO: 206, respectivamente; y
ii) HC2 y LC2 comprenden cualquiera de los siguientes pares:
a. SEQ ID NO: 193 y SEQ ID NO: 194,
b. SEQ ID NO: 195 y SEQ ID NO: 196,
c. SEQ ID NO: 197 y SEQ ID NO: 198,
d. SEQ ID NO: 199 y SEQ ID NO: 200, o
e. SEQ ID NO: 201 y SEQ ID NO: 202, respectivamente.
6. El anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5 en donde HC1 comprende SEQ ID NO: 203 y LC1 comprende SEQ ID NO: 204 y HC2 comprende SEQ ID NO: 193 y LC2 comprende SEQ ID NO: 194.
7. El anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno de la reivindicación 5 en donde HC1 comprende SEQ ID NO: 205 y LC1 comprende SEQ ID NO: 206 y HC2 comprende SEQ ID NO: 193 y LC2 comprende SEQ ID NO: 194.
8. Un anticuerpo biespecífico aislado CD123 (IL3-Ra) x CD3 o un fragmento de unión biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 que comprende:
a) una primera cadena pesada (HC1);
b) una segunda cadena pesada (HC2);
c) una primera cadena ligera (LC1); y
d) una segunda cadena ligera (LC2),
en donde el HC1 y el par LC1 para formar un primer sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a CD123 (IL3-Ra), y la HC2 y el par LC2 para formar un segundo antígeno sitio de unión que se une inmunoespecíficamente a CD3, en donde
a. en la cadena pesada y ligera emparejada que se une inmunoespecíficamente a CD3, dicha cadena pesada (HC2) comprende SEQ ID NO: 184 y dicha cadena ligera (LC2) comprende SEQ ID NO: 190, y b. en la cadena pesada y ligera emparejada que se une inmunoespecíficamente a CD123,
i. dicha cadena pesada (HC1) comprende SEQ ID NO: 120 y dicha cadena ligera (LC1) comprende SEQ ID NO: 165, o
ii. dicha cadena pesada (HC1) comprende SEQ ID NO: 136 y dicha cadena ligera (LC1) comprende SEQ ID NO: 168.
9. Una célula aislada que expresa el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para uso en un método de tratamiento de cáncer.
11. Un anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o un fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para usar en un método para inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas, en donde el método comprende: administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífico para inhibir el crecimiento o la proliferación de células cancerosas.
12. Un anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o un fragmento de unión biespecífico de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 para usar en un método para redirigir una célula T a una célula cancerosa que expresa CD123, en donde el método comprende: administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o fragmento de unión biespecífico para redirigir una célula T a un cáncer.
13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo biespecífico CD123 (IL3-Ra) x CD3 o el fragmento de unión biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14. Un polinucleótido sintético aislado que codifica un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.
15. Un kit que comprende el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y envasado para el mismo.
16. El anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde dicho anticuerpo biespecífico o fragmento de unión a antígeno se une inmunoespecíficamente a CD123 SP2 (IL-3Ra) y CD123 SP1 (IL3Ra).
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