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ES2789849T3 - Composiciones y procedimientos para el tratamiento y diagnóstico de trastornos oculares - Google Patents

Composiciones y procedimientos para el tratamiento y diagnóstico de trastornos oculares Download PDF

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ES2789849T3 ES15792756T ES15792756T ES2789849T3 ES 2789849 T3 ES2789849 T3 ES 2789849T3 ES 15792756 T ES15792756 T ES 15792756T ES 15792756 T ES15792756 T ES 15792756T ES 2789849 T3 ES2789849 T3 ES 2789849T3
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Abstract

Una composición para uso en el tratamiento de una enfermedad ocular diabética, que comprende una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula I: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde: cada uno de R1 y R2 es independientemente H o un C1-C6 alquilo y R3 es H o un C1-C6 alquilo, y el compuesto se administrará oftálmicamente en una cantidad eficaz a un sujeto que lo necesite.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para el tratamiento y diagnóstico de trastornos oculares
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere, en parte, a compuestos para uso y composiciones que son útiles para el diagnóstico, tratamiento o prevención de un trastorno ocular, incluyendo el descubrimiento de agentes, incluyendo agentes inmunomoduladores, que son eficaces contra estos trastornos.
ANTECEDENTES
Trastornos oculares, que pueden reducir o eliminar la visión de personas, entre otros efectos, son una preocupación médica importante.
Por ejemplo, la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa principal de la disfunción ocular, incluyendo la ceguera irreversible, especialmente en pacientes con más de 50 años de edad. Todos los pacientes comienzan con principios de la denominada AMD "seca". Esta se caracteriza por depósitos que se pueden ver clínicamente en el polo posterior del ojo conocido como mácula. La AMD avanzada puede tomar dos formas - tardía "húmeda" o tardía "seca". La opción farmacéutica primaria en AMD "húmeda" avanzada son inyecciones intraoculares regulares de fármacos antiangiogénicos. Estas inyecciones se administran después nuevos vasos sanguíneos patológicos crecen por debajo de o en la retina central, donde se filtran, sangran o causan daño a los tejidos y cicatrización. En contraste, no existen tratamientos para la degeneración macular seca tardía o temprana. La AMD tardía seca se caracteriza por la muerte o la atrofia de los fotorreceptores y sus células-nodrizas, el epitelio pigmentario de la retina (RPE). Los parches de pérdida de tejido se conocen como "atrofia geográfica" GA.
WO 2013/163758 A1 describe el uso de bindarit para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad. WO 2008/061671 A2 describe el uso de bindarit en la reducción de triglicéridos, colesterol y niveles de glucosa en la sangre. WO 2009/109613 A2 describe el uso de bindarit en el tratamiento de una variedad de enfermedades.
Por consiguiente, existe actualmente una escasez de agentes satisfactorios para el tratamiento efectivo de los trastornos oculares. Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de terapias que sean útiles para tratar estos trastornos. Además, existe una necesidad de un diagnóstico efectivo de estos trastornos y la identificación de poblaciones de pacientes que responderán a los tratamientos de estos trastornos.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a una composición que comprende un compuesto de Fórmula I para uso en el tratamiento de una enfermedad diabética del ojo (por ejemplo, retinopatía diabética y DME), incluyendo, sin limitación, un compuesto de Fórmula I tal como bindarit. En algunas realizaciones, se proporciona un compuesto de Fórmula I tal como bindarit para su uso en el tratamiento de la retinopatía diabética en un paciente en necesidad del mismo.
Los detalles de la invención se exponen en la descripción adjunta a continuación. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta invención, en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen procedimientos y materiales ilustrativos. Otras características, objetivos y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción y a partir de las reivindicaciones. En la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares también incluyen el plural, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que se entiende habitualmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. El alcance de la invención se define por las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las figuras 1A-D muestran que el diagnóstico por imágenes de FAF in vivo posteriores a la inyección de NaIO3 identifica áreas geográficas de daño que desarrollan un patrón reticular. La angiografía con ICG identifica permeabilidad coriorretiniana transitoria.
La figura 1A muestra un curso de tiempo de cambio temprano de FAF alrededor de la cabeza del nervio óptico. Una línea o borde hiperfluorescente formado 2-3 días después de la inyección de NaIO3. El borde puede rodear o no completamente la cabeza del nervio óptico y no es contiguo a ella. Un patrón de fluorescencia de encaje o reticular apareció entre los días 3 y 7, y quedó periférico a esta línea. En el día 7, este patrón era inconfundible.
La figura 1B muestra imágenes compuestas que incluyen la cabeza del nervio óptico y la retina periférica media e ilustran que los bordes hiperfluorescentes definen áreas de hiperfluorescencia reticular o de encaje en el futuro. En este ejemplo, los bordes vistos en el Día 3 post-NaIO3 definen una isla en la retina inferior. En el día 7, el borde ya no era visible y, en su lugar, emergieron patrones reticulares profundos. Cabe señalar que en la imagen que muestra dos islas totalmente diferenciadas en los Días 3 y 7, estas proceden de diferentes animales y demuestran la consistencia con la que se observan los patrones. Pequeñas islas tales como estas se vieron en aproximadamente el 7 % de los ojos.
La figura 1C muestra que el patrón de FAF es claramente diferente de los patrones de vasculatura de la retina y coroidea que se observan en la fluoresceína (imagen izquierda y media de la retina interna y media, respectivamente) o en la angiografía con ICG (imagen derecha) de la coroides.
La figura 1D muestra un aumento transitorio en la permeabilidad transepitelial que ocurrió alrededor del día 2 antes de la progresión del patrón y es evidente por una descarga significativa durante la angiografía con ICG (790 nm, aproximadamente 6 minutos después de la inyección de colorante). Esta descarga de ICG no se detectó en el Día 1 posterior a la inyección de toxina, apareció brevemente, y se ve raramente en el siguiente momento temporal ensayado sistemáticamente, en el Día 3 o 4.
Las figuras 2A-D muestran maduración de cambio de FAF después de inyección de NaIO3 en grandes anillos de 360°.
La figura 2A muestra grandes imágenes de FAF compuestas que abarcan gran parte del polo posterior e identifican un anillo de daños de 360° definido por un borde de retina tanto peri-papilar como periférico. Imágenes de FAF tomadas 7 días después del NaIO3 identificaron múltiples áreas discretas y contiguas de hiperfluorescencia curvilínea que forman patrones ovales, redondos, festoneados, en rosetón o en forma de huella de pata de animal. Habitualmente, estos emergieron entre los días 7 y 14. Se proporcionan detalles en la imagen ampliada superior. Estos complejos patrones de FAF surgen en el interior de los bordes hiperfluorescentes más tempranos y confluyen con el tiempo.
La figura 2B muestra que para el día 14 la mayoría de los animales muestran un patrón casi contiguo de hiperfluorescencia reticular en todo el anillo de 360°. El detalle se proporciona en el cuadro del medio.
La figura 2C muestra que a los 28 días después de la exposición a NaIO3, el patrón tomó un aspecto más granular. Las áreas pequeñas en las que el patrón es menos evidente se ven como áreas grises más oscuras.
La figura 2D muestra una imagen clínica del patrón de "goteo difuso" de FAF para comparación. La presente invención, inter alia, recapitula muchas de las características, incluidos los óvalos reticulares, lobulares o festoneados de hipofluorescencia gris asociada con hiperfluorescencia periférica.
Las figuras 3A-C muestran que un patrón curvilíneo, reticular de la deformación de la retina externa se desarrolla en las semanas posteriores a la inyección de NaIO3.
La figura 3A muestra que este patrón se corresponde con la distribución de las células autofluorescentes. Son mostradas imágenes con luz blanca de baja potencia (1x, columna izquierda; 5x, columna derecha) de preparaciones completas de retina extirpada tomadas antes de la inyección de NaIO3 (referencia), y en los días 4 y 7 post-inyección. Se observa un sutil patrón curvilíneo 3-4 días después, en comparación con la referencia, y es evidente en el día 7.
La figura 3B muestra que para el día 14 post-NaIO3, este patrón reticular es pronunciado y se corresponde con la deformación bruta de la retina externa. Esta tenía aspecto de muescas o pliegues en las secciones transversales vistas en el punto de las incisiones relajantes (ampliado en el cuadro).
La figura 3C muestra que la microscopía epifluorescente en el canal de 488 nm, sin tinción celular, mostró la presencia de células autofluorescentes que se encuentran dentro de los surcos reticulares. Esto resultó evidente tanto usando emisión de luz de banda ancha (columna izquierda) como excitación y emisión de luz de banda estrecha (columna derecha) y corresponde a la longitud de onda usada durante el diagnóstico por imágenes mediante FAF. Los pliegues en la retina se asociaron con la presencia de pequeños puntos fluorescentes en el día 7. Una ampliación adicional mostró claramente la distribución de pequeñas células fluorescentes, con vacíos para sus núcleos. El tejido de control positivo tras inyección sistémica de fluoresceína-dextrano (como para angiografía) confirmó la capacidad de detectar fluorescencia a 488 nm en retina extirpada o copa ocular (similar en longitud de onda a la usada para FAF en el diagnóstico por imágenes mediante HRAII) sin procesamiento ni tinción del tejido.
El control negativo en la referencia muestra ausencia de células autofluorescentes.
Las figuras 4A-C muestran ilustraciones interpretativas que muestran cómo hallazgos de tejido histológicamente determinado pueden justificar el diagnóstico por imágenes en vivo después de la pérdida de RPE inducida por NaIO3.
La figura 4A muestra imágenes clínicas de un paciente con AMD precoz y muestra pseudodrusas reticulares y las llamadas lesiones "diana" en el canal NIR (parte superior). Inmediatamente debajo, hay dos superposiciones esquemáticas que enfatizan las manchas hipofluorescentes (las habitualmente definidas como depósitos drusenoides), primero en negro para destacarlas y, a continuación, con un fondo brillante para destacar la señal brillante implicada. Las dos imágenes de la parte inferior destacan múltiples lesiones diana pequeñas de RPD (en el interior de los círculos), mientras que la esquemática más en la parte inferior ilustra la presencia de un posible halo y una lesión diana formada por pliegues concéntricos de tejido.
La figura 4B muestra representaciones esquemáticas que indican una relación directa entre la histología de la ONL (Capa Nuclear Externa) de preparación completa tridimensional y las imágenes FAF clínicas en face bidimensionales. En el día 14 después de la exposición a NaIO3, la retina externa muestra pliegues complejos de la ONL media (que se muestra a bajo aumento relativo [original 40x] y ampliada digitalmente). El aumento digital muestra anillos concéntricos de pliegues de tejido. Esta misma área ilustrada en blanco y negro muestra cómo esto podría tener el aspecto de una región circular u oval con un vacío central en FAF. La representación en blanco y negro invertida (una imagen «negativa») muestra que esta disposición de la distorsión de la ONL parecería tener una diana brillante central.
La figura 4C muestra imágenes de OCT de retina de rata 14 días después de inyección de NaIO3 que muestra claramente "picos" brillantes a través de la retina externa. Estos se describen clínicamente. Secciones histológicas similares tomadas a lo largo de la retina externa demuestran pliegues de la ONL con células inflamatorias subyacentes en el espacio subretiniano ampliado que forman estrechas columnas de células. Para la comparación con imágenes in vivo, éstas se representan en blanco y negro. En la imagen en blanco y negro invertida (una imagen pseudonegativa que coincide con las imágenes de OCT), se ve que la ONL desaparece mientras que las densidades subretinianas tienen un aspecto brillante.
Las figuras 5A-H muestran que la fluorescencia NIR moteada se detecta mediante imágenes cSLO de 795/810 nm, pero no se pueden detectar sin una inyección previa de ICG, es decir, esta fluorescencia solo se puede detectar con los filtros de excitación/emisión en posición, pero no coincide con o en el período de tránsito después de la inyección de colorante (es decir, utilizando el procedimiento DNIRA). Las figuras 5A-F muestra oftalmoscopia láser de barrido confocal (cSLO) normal representativa e imágenes angiográficas de ratas SD de tipo salvaje obtenidas usando:
figura 5A: luz aneritra.
figura 5B: reflectancia infrarroja (830 nm).
figura 5C: 488/500 nm autofluorescencia (FAF).
figura 5D: 795/810 nm fluorescencia NIR.
Las figuras 5E-F ilustran la vasculatura normal de la retina y la coroides utilizando fluoresceína dextrano y colorante ICG, respectivamente. Estas y otras imágenes similares sirvieron como control para todos los experimentos. Tal diagnóstico por imágenes se usó para alinear adecuadamente la profundidad de foco dentro y entre la retina y las capas de RPE.
La figura 5G muestra un curso de tiempo de DNIRA en un animal representativo que recibió una inyección única de colorante ICG de 5 mg/kg en t=0. No se ve ninguna señal detectable antes de la inyección del colorante (obsérvese la imagen homogéneamente oscura, fila superior). Durante la angiografía (segunda fila), se visualizaron los vasos sanguíneos de la retina y el fondo no fue detectable, teniendo en cuenta que se redujo la ganancia (sensibilidad) de la cSLO para impedir la saturación durante la fase de tránsito. En los días posteriores a la angiografía (filas 3-5), hay un aumento de fluorescencia de fondo moteada o punteada en comparación con la referencia. La fluorescencia NIR retardada es bloqueada recubriendo los vasos sanguíneos y está ausente en la cabeza del nervio óptico, pero a diferencia de FAF (figura 5H ) forma un arco o anillo brillante alrededor de la cabeza del nervio. La señal permanece fuerte y distribuida a lo largo del fondo del ojo más de 28 días después de la inyección con la concentración usada (5 mg/kg). El segmento ligeramente más oscuro de la fila inferior probablemente refleja la presencia de una vena del vórtex coroideo.
La figura 5H muestra, en contraste con el curso temporal de DNIRA, la señal de autofluorescencia de 488/500 nm que vuelve a la intensidad previa a la inyección (fila superior) cuando se observa a los 3, 8 y 28 días después de la angiografía con fluoresceína (filas inferiores). El segmento ligeramente más oscuro de la fila inferior probablemente refleja la presencia de una vena del vórtex coroideo.
Las figuras 6A-D muestran que la intensidad de la señal NIR fluorescente se correlaciona con la dosis de ICG usando DNIRA.
La figura 6A muestra imágenes cSLO de control que ilustran la ausencia de una señal fluorescente de 795/810 nm cuando no se ha administrado una inyección de colorante ICG. Los animales de control que no recibieron ICG mantuvieron el mismo nivel de fluorescencia de fondo con una señal poco significativa a lo largo del periodo de 21 días evaluado.
La figura 6B muestran que usando la misma ganancia, la fluorescencia NIR retrasada era fácilmente detectable 48 horas después de la inyección de ICG cuando se administraba a la dosis baja de 0,35 mg/kg. Sin embargo, con el tiempo, DNIRA muestra un desvanecimiento gradual a partir de las 48 horas y hasta los 21 días después de la inyección.
La figura 6C muestra que el uso de la misma ganancia, la angiografía ICG con 5 mg/kg resultó en fluorescencia NIR retardada más brillante (mayor intensidad) a las 48 horas que la dosis más baja (figura 6B). Esta fluorescencia persistió en gran parte invariable hasta después de 21 días.
La figura 6D muestra que, por el contrario, el canal de reflectancia NIR de 830 nm no muestra un cambio similar. Las figuras 7A-B muestran que el yodato de sodio causa la pérdida irregular de la fluorescencia NIR retardada a través de la cual se desarrolla una visión clara de la vasculatura coroidea.
La figura 7A muestra DNIRA realizado 3 días después de ICG y de la inyección de NaIO3. Se verificó la pérdida de fluorescencia moteada en parches o áreas claramente definidas del polo posterior. Estas áreas tenían un aspecto oscuro, o hipofluorescente, con bordes claramente definidos.
La figura 7B muestra que, dentro de estas áreas, si se aumenta la ganancia (sensibilidad) de la cSLO, los vasos sanguíneos coroidales son fácilmente evidentes. El cuadro (ampliado) identifica algunos de los vasos coroideos prominentes que viajan en direcciones totalmente diferenciadas de la vasculatura de la retina, que corre radialmente desde el nervio óptico (flechas). La fluorescencia DNIRA moteada oculta la vista de la coroides en la parte superior derecha de la imagen.
Las figuras 8A-C muestran que el patrón FAF reticular madura in vivo y en la retina extirpada, y evita el área adyacente al nervio óptico.
La figura 8A muestra que a pesar de la pérdida significativa de la retina externa 3 meses después de la administración de NaIO3, la ONL se conservó en el área inmediatamente adyacente a la cabeza del nervio óptico (ONH). Un aumento más alto (parte inferior) confirmó que los núcleos fotorreceptores son preservados y que la retina externa no es plegada. Imágenes FAF de un ojo representativo del Día 7 post-inyección en animal con NaIO3, confirmó que el patrón reticular no se ve. La línea de puntos fina (círculo interior) representa la ubicación de la ONH, mientras que la línea de puntos gruesa (círculo exterior) define la extensión aproximada del FAF normal, no reticular.
La figura 8B muestra la tinción H&E que demostró clara deformación de la retina externa después de la administración de NaIO3. Antes de la administración de NaIO3 (BL), la ONL apareció como una banda lineal oscura que se extendía desde la ONH (Cabeza del Nervio Óptico) hasta la periferia de la retina. A los 7 días, la retina externa se plegaba, pero la ONL permanecía totalmente intacta. Esto se ve en la figura ampliada en la columna derecha. Sin embargo, en el día 14 post-NaIO3, la ONL mostraba áreas de pérdida inconfundibles, con la retina interna yaciendo directamente contra la membrana de Bruch (BM), la membrana basal especializada del RPE. Esto se ve en la figura ampliada (flecha negra).
La figura 8C muestra microscopía confocal a través de la imagen de la ONL obtenida con la tinción nuclear TO-PRO-3 (una tinción de ácido nucleico de monómero de carbocianina con fluorescencia en el rojo lejano solamente, Invitrogen). En la referencia, esta capa era plana, sin características distinguibles. Al aumentar el tiempo después de la administración de NaIO3, la ONL se tornó progresivamente más perturbada. Se identificaron ranuras lineales, formas curvilíneas, anillos concéntricos y pequeños óvalos o círculos aislados en los días 3, 6 y 14.
Las figuras 9A-C demuestran que células Iba1+ contribuyen al patrón FAF reticular en ausencia de RPE temprano y tardío en la enfermedad.
La figura 9A muestra una ampliación menor (fila superior) y mayor (fila interior) de ambas imágenes in vivo y ex vivo que muestran la comparación entre el patrón reticular visto en FAF e IHC tempranos y tardíos en la progresión de la enfermedad. El patrón de FAF identificado in vivo se recapitula mediante inmunohistoquímica fluorescente utilizando anticuerpos anti-Iba. En comparación con la preparación completa de retina, extirpada inmediatamente después del diagnóstico por imágenes mediante HRAII en el Día 7, se vio el mismo patrón reticular usando anticuerpos contra Iba-1, un marcador de microglía y macrófagos (parte superior). La tinción nuclear con TO-PRO-3 mostró células densamente empaquetadas de la capa nuclear externa (la capa de fotorreceptores) que aparecen, en dos dimensiones, para formar patrones curvilíneos, ovales o lobulares. La fusión de las dos confirmó que la tinción con Iba-1 se encuentra entrelazada entre la tinción nuclear. La ampliación del patrón reticular de la etapa tardía confirmó que las células Iba-1 se mantuvieron en las ranuras entre los núcleos fotorreceptores plegados (abajo).
La figura 9B muestra que la señal FAF se puede detectar incluso en ausencia de RPE. Izquierda: la copa ocular posterior, teñida con RPE65 (verde), muestra pérdida de esta monocapa en la retina central y media (permanece un anillo de RPE periférico). Las imágenes restantes utilizaron dos marcadores del RPE diferentes (MiTF; factor de transcripción microftálmico) y la tinción nuclear doble característica, y confirman la pérdida de la capa de RPE en la copa ocular media y central, en áreas que se ha visto que tienen un patrón complejo de autofluorescencia del fondo del ojo. Por el contrario, en la periferia de la copa ocular, el RPE permanece normal o casi normal.
La figura 9C muestra una tinción nuclear que indica la desaparición de células de RPE en la parte central de una preparación completa de retina, como lo demuestra la ausencia de núcleos dobles que denotan células del RPE. El RPE era todavía visible en el tejido periférico de la retina. Esto es lo contrario de lo que sucedía en el control de referencia, donde las células del RPE estaban presentes tanto en el tejido central de la retina como en el periférico.
Las figuras 10A-C muestran microscopía confocal en serie a través de la retina externa, que muestra una compleja deformación tridimensional con la distribución entrelazada correspondiente de células fagocíticas Iba-1 y CD68+.
La figura 10A muestra cambios morfológicos de la retina externa seccionada ópticamente en cuatro capas que se extienden desde la capa plexiforme interna (IPL) hasta el espacio subretiniano. La ONL se divide en capas internas y externas. Rojo = Iba-1, Verde = CD68, Azul = núcleos. Un aumento en el número de células fagocíticas fue observado en las capas de la retina en el Día 4 después de la administración de NaIO3 en comparación con la referencia, momento en el cual las células Iba-1 se encuentran principalmente en la retina interna. Esto fue en ausencia de controles negativos de anticuerpos para ambos marcadores celulares.
La figura 10B muestra que para el día 14 después de la administración de NaIO3, patrones circulares y ovales eran evidentes en la ONL y en la medida internamente como la OPL (identificados por la presencia de vasos sanguíneos). Este patrón era curvilíneo en la ONL interna y aún más en la ONL externa, donde la capa fuertemente plegada de núcleos es mucho más densa, con áreas más pequeñas de vacíos curvilíneos. En la ONL externa, había un acoplamiento significativo entre pliegues. Estos vacíos nucleares contenían células Iba-1 y CD68+.
La figura 10C muestra una imagen ampliada en la ONL más externa o espacio subretiniano expandido (que normalmente es un espacio hipotético) muestra un patrón reticular de células Iba-1+ y CD68+ entrelazado entre los núcleos fotorreceptores.
Las figuras 11A-B muestran la reconstrucción tridimensional de la preparación completa de tejido de la retina extirpada que confirmó que las células fagocíticas se encuentran dentro de la capa deformada de fotorreceptores formando un patrón reticular.
La figura 11A muestra que la serie Z confocal a través de la retina externa se utilizó para generar una reconstrucción tridimensional de la ONL y células Iba1+. La tinción nuclear (roja) de la capa de núcleos fotorreceptores mostró que está plegada. Combinado con tinción Iba-1 (verde), fue evidente que las células inflamatorias se encuentran entre o dentro de los pliegues definidos por la deformación de la retina. La reconstrucción de células Iba-1 positivas por sí solas demostró el patrón reticular.
La figura 11B muestra la reconstrucción en serie Z de segmentos de la pila total de imágenes de la retina externa 28 días después de la administración de NaIO3 ilustra la complejidad de los pliegues, que son más estrechos en sus picos (interior), y más amplios y entrelazados en sus bases (medio, exterior). Para comparar con las imágenes de secciones transversales, y para representar mejor la naturaleza 3D de estos resultados, se muestra también una perspectiva oblicua (paneles medios). La posición del asterisco en las imágenes en face (izquierda) correspondieron con la ubicación del asterisco en las imágenes oblicuas. Las ampliaciones digitales (derecha) mostraron una ranura entre la capa de fotorreceptores (roja), que es curvilínea y contigua en la retina externa, pero que está rota en al menos tres óvalos más pequeños en la ONL interna. Las células Iba1 (verdes) fueron localizadas en gran medida dentro de, por ejemplo, externas a la capa fotorreceptora. La reconstrucción de control de la retina externa mostró que no había ni células Iba-1 positivas ni deformación de la ONL (fila inferior). Se usó el software Bitplane (Imaris) para generar estas imágenes.
Las figuras 12A-D muestran que la deformación progresiva de la retina externa inducida con NaIO3 fue identificada por imágenes OCT in vivo y comparada a resultados clínicos (abreviaciones: NFL = capa de fibra nerviosa; GCL = capa de células ganglionares; IPL = capa plexiforme interna; INL = capa nuclear interna; OPL = capa plexiforme externa; nuclear externa; IS+OS capa de segmento interno & segmento externo; RPE = epitelio pigmentario de la retina; BM = Membrana de Bruch).
La figura 12A muestra OCT in vivo y se ilustran los primeros cambios que se produjeron en la retina inferior, pero no en la retina superior, se observaron en los tres primeros días siguientes a la administración de NaIO3. La imagen de referencia indicaba las capas de retina visibles en la OCT. La imagen en face de la retina en el día 3 ilustró la posición de las dos secciones ópticas, con las porciones superior e inferior mostradas. La porción superior permanecíó sin cambios con respecto a la referencia. Por el contrario, la inferior mostró pequeñas ondulaciones de los segmentos interno y externo del fotorreceptor, así como pérdida de la fina capa de RPE.
La figura 12B muestra que para el día 14 después de la administración de NaIO3, la retina externa mostró cambios marcados incluyendo la formación de pliegues con múltiples curvas, triángulos con la base hacia abajo y picos ocasionales de señal brillante que se encuentran externa (inferior) a la capa nuclear externa oscura.
La figura 12C muestra un triángulo con la base hacia abajo bien formado que se indica en una imagen del día 14 de la retina de un roedor.
La figura 12D muestra la imagen OCT de un paciente con pseudodrusa reticular que muestra un triángulo con la base hacia abajo similar al que se ve en el modelo de roedor.
Las figuras 13A-B muestran que los cambios subretinianos contribuyeron a estructuras 3D complejas en el eje Y y el eje Zin vivo.
La figura 13A muestra imágenes OCT consecutivas adyacentes que confirman que los cambios subretinianos contribuyen a estructuras 3D complejas en el eje Y. Las cúpulas o formas piramidales subretinianas pequeñas son abundantes y, tal y como se muestra en el centro, también tomaban una forma similar a una "Y" al revés o "espoleta". En comparación con la reconstrucción volumétrica de imágenes en serie, esta imagen coincide con secciones ópticas a través de una estructura que parece circular cuando se ve en face. Las imágenes que muestran la posición de las secciones de OCT en serie a lo largo de la estructura circular corresponden a las de las secciones transversales ópticas adyacentes. Las dos principales señales subretinianas de estas secciones transversales (flechas) se ven muy juntas en las extremidades superiores e inferiores del círculo, y más separadas en el centro. Se proporcionan las distancias entre picos. La evaluación de las estructuras situadas inmediatamente a la izquierda del círculo muestra una contribución de estructuras subretinianas similar a las estructuras con forma de lazo más pequeñas.
La figura 13B muestra reconstrucciones volumétricas de pilas segmentarias de secciones Z en serie a través de la ONL interna, media y externa confirman la apariencia diferente en face de la señal debajo de la retina externa deformada. Secciones de OCT a lo largo del mismo plano de tejido. (Fila superior) Imágenes reconstruidas volumétricamente formadas dentro de los tres planos delimitados por las líneas verdes paralelas que se muestran en la fila superior. Tal reconstrucción de segmentos a lo largo de la ONL interna, media y externa, demuestra tres patrones totalmente diferenciados. (C. Fila inferior) Conjunto regular de manchas punteadas en la ONL interna. (C. inferior izquierda) Patrón más curvilíneo en la ONL media. (C. medio) ONL más exterior, en gran parte en el interior del espacio subretiniano expandido, muestra complejas estructuras curvilíneas, en lazo, con un acoplamiento significativo entre ellas. Estas imágenes se correlacionan con los resultados de microscopía confocal reconstruidos en 3D (C, Inferior derecha).
Las figuras 14A-B demuestran que el gadolinio, que reduce los monocitos circulantes y macrófagos residentes, altera el patrón de FAF del daño en la retina externa inducido por NaIO3.
La figura 14A muestra cómo, en comparación con las no tratadas (panel inferior), las lesiones tratadas con GAD tienen bordes menos bien delimitados en el Día 3 (arriba, izquierda) y patrones mucho menos delimitados de FAF dentro de la isla representativa de daños en el día (arriba, derecha).
La figura 14B muestra cómo la reducción de los macrófagos conduce a áreas de daño más pequeñas. Izquierda: Imagen FAF muestra pequeño crecimiento de patrón reticular 7 días después de NaIO3 y reducción con GAD simultánea de los macrófagos. Derecha: En relación con toda la retina extirpada, el área de daño es claramente más pequeña de lo que se ve típicamente.
Las figuras 15A-C muestran ilustraciones interpretativas de cómo, sin pretender imponer ninguna teoría, los hallazgos tisulares determinados histológicamente pueden explicar las imágenes in vivo después de la pérdida de RPE inducida por NaIO3.
La figura 15A muestra imágenes clínicas de un paciente con AMD precoz mostrando pseudodrusas reticulares y las llamadas lesiones "diana" en el canal NIR (parte superior). Inmediatamente debajo, hay dos superposiciones esquemáticas que enfatizan las manchas hipofluorescentes (las habitualmente definidas como depósitos drusenoides), primero en negro para destacarlas y, a continuación, con un fondo brillante para destacar la señal brillante implicada. Las dos imágenes de la parte inferior destacan múltiples lesiones diana pequeñas de RPD (en el interior de los círculos), mientras que la esquemática más en la parte inferior ilustra la presencia de un posible halo y una lesión diana formada por pliegues concéntricos de tejido.
La figura 15B muestra representaciones esquemáticas que sugieren una relación directa entre la histología de la ONL de preparación completa tridimensional y las imágenes FAF clínicas en face bidimensionales. En el día 14 después de la administración de NaIO3, la retina externa muestra pliegues complejos de la ONL media (que se muestra a bajo aumento relativo [original 40x] y ampliada digitalmente). El aumento digital muestra anillos concéntricos de pliegues de tejido. Esta misma área ilustrada en blanco y negro muestra cómo esto podría tener el aspecto de una región circular u oval con un vacío central en FAF. La representación en blanco y negro invertida (es decir,una imagen "negativa") muestra que esta disposición de la distorsión de la ONL parecería tener una diana brillante central.
La figura 15C muestra imágenes de OCT de retina de rata 14 días después de la administración de NaIO3 que muestra claramente "picos" brillantes a través de la retina externa. Estos se describen clínicamente. Secciones histológicas similares tomadas a lo largo de la retina externa demuestran pliegues de la ONL con células inflamatorias subyacentes en el espacio subretiniano ampliado que forman estrechas columnas de células. Para la comparación con imágenes in vivo, éstas se representan en blanco y negro. En la imagen en blanco y negro invertida (es decir,una imagen pseudonegativa que coincide con las imágenes de OCT), se ve que la ONL desaparece mientras que las densidades subretinianas tienen un aspecto brillante.
Las figuras 16A-F muestran que, cuando se evalúa en el tiempo utilizando Autofluorescencia de Fondo de Ojo (FAF), bindarit intravitreal reduce el desarrollo de patrones complejos de FAF hiperfluorescente.
La figura 16A es una muestra de control negativo que recibió solución salina y desarrolló cambio progresivo evaluado utilizando FAF.
La figura 16B muestra que a dosis alta (20 g por ojo) de bindarit, el FAF permanece normal.
La figura16C muestra que FAF anormal se desarrolla en presencia de una pequeña molécula comparadora. La figura 16D muestra que FAF (fila superior), combinado con imágenes DNIRA (fila inferior), confirma la preservación de la capa de RPE. Los animales de control (izquierda) desarrollar patrones FAF complejos y señal de DNIRA oscuro (RPE ausente). A altas dosis de TMi-018 (20 ug por ojo), el Fa F es normal y la señal de DNIRA es preservada. En dosis medias (10 ug por ojo), hay pequeños parches de pérdida anormal de FAF y RPE. La figura 16E muestra que bindarit intravitreal dependiente de la dosis reduce el tamaño del parche. Se utilizan varias dosis: 20 ug/ml, 10 ug/ml, 1 ug/ml, y controles (vehículo solamente y toxina solamente).
La figura 16F muestra imágenes representativas DNIRA (izquierda) y FAF (derecha) de un pequeño parche de daño que se produce con alta dosis de toxina NaIO3 en presencia de 1 mg/ml (2 ug) de bindarit, dado intravitrealmente.
Las figuras 17A-C muestran que bindarit dependiente de dosis protege la función de la retina (electrofisiología), y demuestra una dosis mínimamente efectiva.
La figura 17A muestra análisis de electrorretinograma que demuestra protección dependiente de dosis de la función de la retina. Estas son cantidades de bindarit: 40 ug, 2 ug, y 0,2 ug. La dosis mínimamente efectiva (MED), debajo de la cual el efecto de bindarit se pierde se confirmó que era 0,1 mg/ml, o 200 ng por ojo.
La figura 17B muestra trazas de electrorretinograma. Una amplitud de onda b de destello brillante se conserva a dosis altas y se extingue a dosis bajas y en presencia de control de solución salina.
La figura 18A-C muestra que bindarit protege contra daño del tejido, la pérdida de RPE y la interrupción de la retina externa.
La figura 18A muestra que bindarit dependiente de dosis protege contra el daño tisular, evaluado mediante microscopía de epifluorescencia autofluorescente a 488/512 nm. Células cuboidales RPE pequeñas se ven en brazos de bindarit tanto en dosis muy altas (10 mg/kg) como en dosis altas (50 mg/kg) (Izquierda y centro). Restos celulares y células de RPE hiperfluorescentes agrandadas se ven en el control de solución salina (derecha).
La figura 18B muestra que bindarit intravitreal protege contra la pérdida de células de RPE. En la presencia de solución salina intravitreal (vehículo), células de RPE son perdidas y confirmadas por inmunohistoquímica fluorescente (izquierda). En la presencia de bindarit intravitreal, las células de RPE son conservadas. Verde = RPE65; rojo = Iba1; azul = núcleos
La figura 18C muestra la histología H&E que confirma la preservación de la capa de RPE y la retina externa en presencia de bindarit (dos imágenes de la izquierda). Estas capas se dañan o se pierden en presencia de solución salina (vehículo).
Las figuras 19A-H muestran que bindarit reduce la expresión de la Proteína Quimioatrayente de Monocitos (MCP)-1 y reduce la respuesta de los macrófagos M1, inclinando la balanza a favor de M2.
La figura 19A muestra inmunohistoquímica fluorescente. En el modelo de AMD/RPD descrito en esta invención, el daño inducido por toxinas al RPE lleva a una secuencia de cambio en la polarización del sistema inmune innato. La inmunohistoquímica confirma que en la referencia, los marcadores de la respuesta M2 (por ejemplo, CD163 y otros) son predominantes. Después de la inducción del daño, hay un gran aumento en la expresión génica M1 que vuelve a la referencia después de la evolución y la maduración dar paso a la senescencia de la enfermedad. Rojo = iNOS (M1), Verde = CD163 (M2), azul = núcleos, Aumento original: 100x.
La figura 19B muestra PCR cuantitativa que confirma la disminución en la expresión génica M1 (mRNA) con poco cambio en la expresión de M2. La expresión de veces de transcritos de mRNA se calcula respecto a los niveles de referencia (pre-daño). Los números 1-5 en en eje x representan el curso en el tiempo de los cambios de la siguiente manera: 1 = inducción, 2 = evolución temprana, 3 = evolución tardía, 4 = maduración y 5 = senescencia. Marcadores específicos de M1son evaluados en esta figura.
La figura 19C muestra PCR cuantitativa que confirma la disminución en la expresión génica M1 (mRNA) con poco cambio en la expresión de M2. La expresión de veces de transcritos de mRNA se calcula respecto a los niveles de referencia (pre-daño). Los números 1-5 en en eje x representan el curso en el tiempo de los cambios de la siguiente manera: 1 = inducción, 2 = evolución temprana, 3 = evolución tardía, 4 = maduración y 5 = senescencia. Marcadores específicos de M2 son evaluados en esta figura.
La figura 19D muestra IHC epifluorescente que demuestra cualitativamente una reducción dependiente de dosis en la expresión de la proteína de MCP-1 en el espacio subretiniano siguiente a la administración de bindarit intravitreal. MCP-1 (rojo) & CD163 (verde); núcleos azules. Aumento original, 10x. Panel superior izquierdo es solución salina (control negativo); panel superior derecho es baja dosis de bindarit (1 mg/kg); panel inferior izquierdo es alta dosis de bindarit (10 mg/kg); y el panel inferior derecho es normal (sin toxina).
La figura 19E muestra que la IHC epifluorescente demuestra cualitativamente una reducción dependiente de dosis en la expresión de las proteínas TNF-a y CD68 en el espacio subretiniano después de bindarit intravitreal. TNF a (rojo) & CD68 (verde); núcleos azules. Aumento original, 10x. Panel superior izquierdo es solución salina (control negativo); panel superior derecho es baja dosis de bindarit (1 mg/kg); panel inferior izquierdo es alta dosis de bindarit (10 mg/kg); y el panel inferior derecho es normal (sin toxina).
La figura 19F muestra que bindarit intravitreal reduce la transcripción del mRNA relacionada con M1. En comparación contra la referencia, la inducción y la evolución temprana de daños del RPE está altamente asociada con la expresión de la citoquina M1; esto disminuye durante la evolución tardía y maduración. Por el contrario, M2 mRNA se eleva más tarde en la enfermedad a medida que se reducen los niveles de M1. Un cambio de "1" no representa ningún cambio respecto a la referencia, en algunos casos puede decirse que existen cambios biológicamente significativos cuando el cambio de veces excede 2 o 3. Observaciones similares son hechas con respecto a los factores de de transcripción relacionados con M1 y M2. Transcritos de M1 predominan durante la enfermedad, con pocos cambios en M2. En el panel izquierdo (mRNA de citoquina), para cada punto en el tiempo las muestras de M1 son la barra izquierda y las muestras de M2 son la barra derecha. En el panel derecho (mRNA de factor de transcripción), para cada punto en el tiempo las muestras de M1 son la barra derecha y las muestras de M2 son la barra izquierda.
La figura 19G es un esquema del cambio de la expresión génica M1 vs M2. Después del daño inducido por toxina, la expresión génica se desplaza hacia M1; en presencia de bindarit (TMi-018), la expresión génica de desplaza de vuelta a la posición neutral (es decir, hacia M2). Los transcritos génicos RPE65 disminuyeron significativamente durante la enfermedad, consistente con la pérdida de células observada. En comparación, bindarit reduce esta pérdida.
La figura 19H muestra que bindarit (TMi-018) no reduce significativamente la respuesta M2 en ausencia de daño al RPE inducido por toxinas, a nivel de proteína. La inmunohistoquímica fluorescente muestra que, a pesar de bindarit intravitreal en altas dosis, los niveles de proteína de MCP-1, una diana clave, existe poco intercambio entre la solución salina y los ojos tratados con fármaco. Estos datos muestran que ese bindarit regula diferencialmente la referencia o los niveles "normales" de la expresión de MCP-1, y puede actuar para reducir diferencialmente la transcripción "asociada a la inflamación". Tal actividad diferencial es consistente con el efecto de bindarit de usar diferencialmente la actividad promotora y potenciadora aguas arriba 5' en el complejo génico de MCP. MCP-1 = rojo, Núcleos = azul.
Las figuras 20A-C muestran que bindarit reduce la expansión del parche (en contraposición a la prevención del parche). Además de impedir la formación de GA, bindarit trata la GA pre-existente, reduciendo el crecimiento de estos parches de RPE y la pérdida de la retina externa. El objetivo de este tratamiento es reducir el tamaño del "punto ciego" que el paciente observa en su campo de visión central.
La figura 20A muestra un tratamiento de control negativo (solución salina) de un parche existente, que se expande.
La figura 20B muestra el tratamiento con bindarit de un parche existente, que no se expande.
La figura 20C resume datos para la expansión de parches ( "éxito" en este contexto es la expansión del parche). Un impacto es un reto con una toxina. Los datos muestran que el modelo experimental puede provocar la expansión de parches con toxinas y con solución salina, pero dicha expansión es impedida con bindarit ("TMi"). "IVT" significa intravitreal.
La figura 21 muestra, en los paneles A y B, que hTERT, una línea inmortalizada de células de RPE humanas (deficiente de telomerasa), se confirmó que expresaban marcadores de diferenciación de RPE. En el panel C, se muestra que TMi-018 reduce la expresión de NFkB la translocación de NFkb al núcleo, y reduce MCP-1 en hTERT. El panel D muestra que TMi-018 aumenta directamente la supervivencia de RPE contra la exposición a la toxina in vitro.
La figura 22 muestra, en el panel A, que las especies de mRNA de los componentes en cascada del complemento cambian después del daño al RPE inducido por toxina y, en el panel B, bindarit altera la expresión de mRNA del complemento. Para cada conjunto de histogramas, se evalúan los siguientes genes (de izquierda a derecha): C1qb, C1qtnf5, C2, C3, C4b, C5, c 6, C7, C8a, C9, Cfb, Cfd, Cfh y Cfi. Expresión de veces menor que 2 se considera no significativa. Los niveles de proteína no se analizaron.
La figura 23 muestra la angiografía ICG de un paciente con AMD "seca". El panel de la izquierda muestra la angiografía ICG de la etapa inicial (fase de tránsito) de un paciente con AMD seca e identifica los grandes vasos sanguíneos normales de la coroides (la cama ricamente vascular externa [profunda] a la retina). El panel central muestra la angiografía ICG de la etapa media del mismo paciente e identifica pequeñas áreas centrales que bloquean sutilmente la fluorescencia subyacente. Estos corresponden a regiones de pigmentación anormal que se observa en la fotografía en colores (datos no mostrados). El panel derecho muestra la angiografía de la etapa tardía y demuestra una descarga tenue generalizada del tejido coroidal a medida que la ICG se escapa de los vasos sanguíneos hacia el tejido. Aparte del bloqueo que recubre la señal central (apenas detectable) se observó poca anormalidad.
La figura 24, por contraste con la figura 23, muestra la imagen DNIRA del mismo paciente con AMD seca tomada dos días después de la inyección sistémica de colorante ICG, sin ninguna otra inyección en el panel izquierdo, imagen DNIRA de referencia del paciente en la figura 23 y muestra una señal despreciable con los filtros de excitación/emisión de ICG en posición, pero antes de la inyección de ICG. El panel derecho muestra una imagen DNIRA del día 2 del mismo paciente e identifica áreas de hipofluorescencia marcada en la mácula central. Las imágenes se obtuvieron con filtros ex/em en posición, pero sin más inyecciones de colorante (desde la referencia varios días antes). Además, fue observado un patrón de tipo leopardo o de encaje en la mácula periférica que no ha sido identificado por ninguna técnica de imágenes hasta la fecha.
La figura 25 muestra imágenes DNIRA en comparación contra FAF e infrarrojo (IR). En la imagen Infrarroja del panel izquierdo del fondo de ojo de un paciente con AMD seca muestra áreas de ligeramente hiper- e hipo-
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fluorescencia. Las áreas brillantes reflejan la presencia de depósitos cristalinos presuntivos (observado por examen clínico). El panel central muestra una imagen de Autoflorescencia de Fondo de Ojo del mismo paciente y muestra una apariencia normal de vidrio deslustrado a lo largo de la mácula que está bloqueada por los vasos sanguíneos superpuestos, está ausente en el nervio óptico (extrema derecha de la imagen) y muestra una reducción gradual hacia el centro. El panel derecho muestra imágenes DNIRA del mismo paciente y contrasta claramente con la imagen FAF e IR . Es de destacar que una región de hipofluorescencia profunda (oscura) es observada de forma centralizada. Parches más pequeños son observados en el margen de la lesión central y en la proximidad de la cabeza del nervio óptico.
La figura 26 muestra que las imágenes DNIRA compuestas identifican nuevos cambios en la mácula media y periférica. Imágenes compuestas del mismo paciente muestran un patrón de encaje, de tipo leopardo o reticular de DNIRA hiper- e hipo-fluorescente que se alternan y que no se ve en otras modalidades de imagen, y no se ha descrito previamente (panel superior).
La figura 27 muestra imágenes repetidas del mismo paciente con el tiempo e indica que el patrón DNIRA también cambia, lo que indica que DNIRA es un nuevo marcador de progresión de la enfermedad. El panel izquierdo muestra imágenes DNIRA de este paciente con AMD seca tardía en el tiempo 0 y muestran regiones de hipofluorescencia (e hiperfluorescencia). El panel derecho muestra imágenes DNIRA repetidas del mismo paciente, seis meses más tarde, y muestra que las regiones de señal DNIRA hipofluroescente se han ampliado.
La figura 28 muestra imagen DNIRA de un paciente con AMD seca e identifica manchas puntiformes brillantes discretas de hiperfluorescencia. Puntos discretos de DNIRA hiperfluorescente se identifican dispersos por toda la mácula de los pacientes con AMD. Algunos están en proximidad a la cabeza del nervio óptico, y otros inmediatamente adyacentes a regiones de atrofia geográfica, tanto en la frontera como en la llamada zona de unión. El panel derecho es una vista ampliada de una parte del panel izquierdo.
La figura 29 muestra imágenes DNIRA de un paciente humano con RPD. La fila superior de las imágenes muestra imágenes infrarrojas y muestra figuras hiper-reflectantes en el centro, con "bandas y puntos" superiores que caracterizan RPD. La fila del medio de las imágenes muestra FAF y demuestra hipofluorescencia foveal normal, con regiones de hipoFAF nasalmente, más aún en el ojo derecho (imagen izquierda, fila del medio); RPD superiores se observan como hiper/hipoFAF que se alternan con una configuración de bandas y puntos. La fila inferior de imágenes muestra imágenes DNIRA y demuestra múltiples regiones de hipoFAF no vistas en ninguna otra modalidad (incluyendo otras modalidades que no se muestran aquí). Estas regiones se distribuyen a lo largo de la mácula. Los patrones tipo leopardo o de encaje se ven de nuevo en la periferia macular.
La figura 30 muestra un gradiente de señal hipofluorescente e hiperfluorescente en un paciente humano con RPD. Se muestra imagen DNIRA de otro paciente con RPD. La flecha inferior muestra región inferior de señal DNIRA hipofluorescente discreta (negra) inmediatamente superior a la mácula central. Superior a esto, hay una acumulación cada vez mayor de puntos hiperfluorescentes vistos usando DNIRA.
La figura 31 muestra una correspondencia entre señal FAF hiperfluorescente y señal DNIRA hiperfluorescente en un ojo de conejo. La imagen de la izquierda es un FAF de un fondo de ojo de conejo después de la inyección con toxina. Pequeños puntos hiperfluorescentes se observan en FAF azul. Mediante el uso de DNIRA, aparecen estos puntos y muchos otros más brillantes (imagen central). Microscopía epirfluorescente autofluorescente ex vivo en el canal azul identifica células nucleadas en el espacio subretiniano que corresponden a los puntos hiperfluorescentes vistos en FAF. Microscopia NIR no está disponible. La Inmunohistoquímica confirma la identidad de estas células como macrófagos (señalado anteriormente en la rata, panel derecho).
La figura 32 muestra puntos DNIRA hiperfluorescentes, es decir macrófagos presuntivos, que cambian de posición en el tiempo. La fila superior de imágenes muestra imágenes DNIRA después de la inyección de toxina sistémica en una rata y muestra manchas hiperfluorescentes punteadas que rodean la cabeza del nervio óptico. Con el tiempo, estos puntos parecen migrar de forma centrífuga. La fila inferior muestra imágenes DNIRA en un ojo de conejo con una migración aparente similar de puntos marcados individualmente que, por inmunohistoquímica, se tiñen positivamente para marcadores de macrófagos. En ambas filas, la imagen más a la izquierda es DNIRA de referencia (es decir, inyección pre-ICG con filtros ICG en posición).
La figura 33 muestra pequeños puntos DNIRA-positivos marcados brillantemente que se observan en la proximidad de la cabeza del nervio óptico en imágenes de rata (superior), de conejo (medio) y humanas (inferior). La comparación de la cabeza del nervio óptico de rata, conejo y humano demuestra la acumulación de manchas hiperfluorescentes puntiformes. Las diferencias en la ampliación reflejan las diferencias en el tamaño de los ojos, visualizados utilizando el mismo sistema CSLO clínico. Estos datos sugieren por primera vez, sin pretender imponer ninguna teoría, que los macrófagos pueden ser evaluados en el ojo vivo a través de múltiples especies, incluida la humana. Además, sugieren, sin pretender imponer ninguna teoría, que los pacientes con puntos hiperfluroescentes vistos por DNIRA pueden beneficiarse de los tratamientos dirigidos contra la actividad de macrófagos no deseados.
La figura 34 muestra que bindarit reduce mediadores inflamatorios conocidos por estar implicados en la retinopatía diabética. mRNA plegado cambia cuando comparado con las condiciones de referencia (normales), en las siguientes condiciones: 1. Solución salina intravitreal (vehículo), 2. Dosis alta de bindarit, 2 pg/pl, (sin toxina), 3. Toxina dosis baja 2 pg/pl de bindarit, 4. Toxina alta dosis 20 pg/pl de bindarit NaIÜ3 y 5. La toxina sola.
La figura 35 muestra que bindarit disminuye significativamente las interleucinas inflamatorias IL-1 b y IL-6 y tiene un pequeño efecto regulador negativo sobre el Factor Derivado Epitelial Pigmentario (PEDF). mRNA plegado cambia cuando comparado con las condiciones de referencia (normales), en las siguientes condiciones: 1. Solución salina intravitreal (vehículo), 2. Dosis alta de bindarit, 2 pg/pl, (sin toxina), 3. Toxina dosis baja 2 pg/pl de bindarit, 4. Toxina alta dosis 20 pg/pl de bindarit NaIÜ3 y 5. La toxina sola.
La figura 36 muestra que bindarit, en este contexto, no tuvo un efecto significativo sobre otras interleucinas IL-10 y IL-3 o factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y ccl5 (MCP-3). mRNA plegado cambia cuando comparado con las condiciones de referencia (normales), en las siguientes condiciones: 1. Solución salina intravitreal (vehículo), 2. Dosis alta de bindarit, 2 pg/pl, (sin toxina), 3. Toxina dosis baja 2 pg/pl de bindarit, 4. Toxina alta dosis 20 pg/pl de bindarit NaIÜ3 y 5. La toxina sola.
La figura 37 muestra que bindarit no tuvo ningún efecto significativo en el factor de crecimiento vascular endotelial A (VEGF-A) mRNA. mRNA plegado cambia cuando comparado con las condiciones de referencia (normales), en las siguientes condiciones: 1. Solución salina intravitreal (vehículo), 2. Dosis alta de bindarit, 2 pg/pl, (sin toxina), 3. Toxina dosis baja 2 pg/pl de bindarit, 4. Toxina alta dosis 20 pg/pl de bindarit NaIÜ3 y 5. La toxina sola. Sin embargo, en este paradigma, VEGF-A no fue elevado (datos no mostrados).
La figura 38 muestra que, en una línea celular RPE humana inmortalizada, bindarit reduce la translocación de NFkb al núcleo.
La figura 39 muestra que bindarit normaliza el estrés celular en células hTERT incubadas con glucosa alta. Solo Célula: Solo medio (contiene 17,5mM D-Glucosa); D-Glucosa Media-Alta: 30mM D-Glucosa (17,5mM D-Glucosa en medio 12,5mM suplemento de D-Glucosa); D-glucosa Alta: 50mM D-Glucosa (17,5mM D-Glucosa en medio 32,5mM suplemento de D-Glucosa); L-Glucosa ctrl: 50mM Glucosa (D+L) (17,5mM D-Glucosa en medio 32,5mM suplemento de L-Glucosa); D-Glucosa Media-Alta con TMi-018: 30mM D-Glucosa con 150mM TMi-018; D-glucosa Alta con TMi-018: 50mM D-Glucosa con 150mM TMi-018; y Solo TMi-018: 150mM TMi-018.
La figura 40 muestra etapas de cambio en el modelo de toxicidad RPE a que se hace referencia en esta invención, tal como se evaluó con FAF. Específicamente, son mostradas imágenes representativas del curso en el tiempo y etapas de imágenes FAF de ojos de rata después de inyección con NaIÜ3.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere, en parte, al resultado sorprendente de que bindarit tiene efectos inmunomoduladores, específicamente en la polarización de macrófagos M1/M2, que hace que sea un agente efectivo para los trastornos oculares.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un agente para uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno ocular. El agente es un compuesto de Fórmula I como se muestra en esta invención, a modo de ejemplo no limitativo, el compuesto bindarit.
El trastorno ocular es una enfermedad ocular diabética (por ejemplo, retinopatía diabética y DME)
En algunas realizaciones, el sujeto no está en tratamiento y/o se beneficiarían de la terapia y/o no responde a una o más de un anticuerpo D anti-factor (por ejemplo, lampalizumab (Genentech)), un anticuerpo anti-p-amyloid (anti-Ap) (por ejemplo, GSK933776 (GSK)), un corticosteroide (por ejemplo fluocinolona acetonida), MC-1101 (MacuCLEAR), una terapia con células madre CD34+, un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, Ranibizumab), brimonidina (Alphagan), un anticuerpo de complemento anti-C5 (por ejemplo, LFG316 (Novartis), doxiciclina (ORACEA), emixustat clorhidrato, sirolimus (RAPAMUNE), y glatiramer acetato (COXAPONE). En algunas realizaciones, el sujeto tiene evidencia de AMD como se confirma por la presencia de al menos 1 drusa mayor que aproximadamente 125 pm de diámetro. En algunas realizaciones, el sujeto puede o puede no tener evidencia de la neovascularización coroidea activa anterior o concurrente (CNV). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una o más lesiones GA bien demarcadas de un área total de aproximadamente 2 a aproximadamente 20 mm2 en uno o más ojos y/o 0,5 a 10 áreas de disco (por ejemplo, 0,5 a 7, o aproximadamente 0,5, o aproximadamente 1, o aproximadamente 2, o aproximadamente 3, o aproximadamente 4, o aproximadamente 5, o aproximadamente 6, o aproximadamente 7, o aproximadamente 8 o aproximadamente 9, o aproximadamente 10 áreas de disco). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una puntuación de mejor agudeza visual corregida de más de aproximadamente 35 letras o un equivalente de Snellen VA de alrededor 20/200 o mejor.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además administrar un agente terapéutico adicional. El agente terapéutico adicional puede ser, en diversas realizaciones, un anticuerpo D anti-factor (por ejemplo, lampalizumab (Genentech)), un anticuerpo anti-P-amyloid (anti-AP) (porejemplo, GSK933776 (GSK)), un corticosteroide (porejemplo fluocinolona acetonida), MC-1101 (MacuCLEAR), una terapia con células madre CD34+, un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo, Ranibizumab), brimonidina (Alphagan), un anticuerpo de complemento anti-C5 (por ejemplo, LFG316 (Novartis), doxiciclina (OrACEA), emixustat clorhidrato, sirolimus (RAPAMUNE), y glatiramer acetato (Co Xa PONE). El agente terapéutico adicional también puede ser, en diversas realizaciones, un agente del factor de crecimiento endotelial anti-vascular (VEGF), un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ECA), un agonista gamma del receptor activado por proliferador de, peroxisoma (PPAR), un inhibidor de renina, un esteroide y un agente que modula la autofagia. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un modulador de la cascada del complemento (porejemplo, un modulador de C3, C5, factor D del complemento, o factor B del complemento).
En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es un inhibidor de transcriptasa inversa de nucleósido (NRTI), a modo de ejemplo no limitativo zidovudina, didanosina, zalcitabina, estavudina, lamivudina, abacavir, emtricitabina, y entecavir. En algunas realizaciones, el agente terapéutico adicional es aciclovir.
El agente es un compuesto de Fórmula I:
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde cada uno de R1 y R2 es independientemente H o un C1-C6 alquilo y R3 es H o un C1-C6 alquilo. En algunas realizaciones, el agente es un compuesto de la estructura:
Figure imgf000013_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En algunas realizaciones, el paciente tiene diabetes de tipo 1 o de tipo 2. En diversas realizaciones, el paciente tiene un nivel de glucosa en sangre que excede lo normal (aproximadamente 70-130 miligramos por decilitro o mg/dL antes de las comidas, y menos de 180 mg/dL una a dos horas después de una comida).
En otras realizaciones, la presente invención se refiere a un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para uso en el tratamiento de una catarata o glaucoma, que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo, donde R1, R2 y R3 se ha definido anteriormente. En una realización, el compuesto de Fórmula I es bindarit.
En algunas realizaciones, el procedimiento comprende además administrar un agente terapéutico adicional. En diversas realizaciones, el agente terapéutico adicional es uno o más de un factor de crecimiento endotelial anti­ vascular (VEGF).
En otras realizaciones, el sujeto es un ser humano. En otras realizaciones más, la administración se efectúa oralmente, o intravascularmente, o intraocularmente, o periocularmente, o a la superficie ocular.
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Definiciones
Las siguientes definiciones se usan en relación con la invención descrita en este documento. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en esta invención tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece esta invención.
Una "cantidad eficaz", cuando se usa en conexión con un compuesto de prueba y/o compuesto candidato es una cantidad que es eficaz para proporcionar un tratamiento, prevención o reducción medible de la tasa de la patogénesis de un trastorno ocular tal como, por ejemplo, una enfermedad diabética del ojo (por ejemplo, retinopatía diabética y DME), enfermedad de Vogt-Kayanagi-Harada (VKH); uveítis sarcoide; histoplasmosis ocular y/o síndrome de histoplasmosis ocular presumido; uveítis autoinmune; uveítis asociada con enfermedades sistémicas, por ejemplo, lupus, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide y otras enfermedades de origen inmunológico conocido; uvieits posterior (incluida la que todavía no puede ser diagnosticada); uveítis anterior (por ejemplo, iritis); enfermedad de Bechet; poliarteritis nodosa y granulomatosis de Wegener, AMD y/o RPD.
Una "cantidad eficaz", cuando se usa en conexión con un compuesto fluorescente es una cantidad que permite la detección óptica.
Una "cantidad eficaz", cuando se usa en conexión con un agente eficaz para el tratamiento de un trastorno ocular, un compuesto de Fórmula I, metotrexato, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, es una cantidad que es eficaz para tratar o impedir un trastorno ocular tal como, por ejemplo, una enfermedad diabética del ojo (por ejemplo, retinopatía diabética y DME).
Una "cantidad efectiva", cuando se usa en conexión con otro agente terapéutico, es una cantidad que es efectiva para tratar o impedir un trastorno ocular como, por ejemplo, una enfermedad ocular diabética (por ejemplo, retinopatía diabética y EMD) sola o en combinación con un compuesto de Fórmula I, metotrexato, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. "En combinación con" incluye la administración dentro de la misma composición y mediante composiciones separadas; en el último caso, el otro agente terapéutico es efectivo para tratar o impedir una afección durante un tiempo en que el agente, un compuesto de Fórmula I, metotrexato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, ejerce su efecto profiláctico o terapéutico, o viceversa.
Una "cantidad efectiva", cuando se usa en relación con una toxina, por ejemplo, yodato de sodio, es una cantidad que es efectiva para inducir una atrofia medible del tejido ocular como se describe en esta invención.
Un agente es "útil para el tratamiento de un trastorno ocular" si el agente proporciona un tratamiento, prevención o reducción medible en la tasa de patogénesis de un trastorno ocular.
El término "trastorno ocular" se refiere a una de varias enfermedades oftálmicas e incluye enfermedades del ojo y los anexos oculares. El término "trastorno ocular" incluye, por ejemplo, trastornos descritos en esta invención (por ejemplo, a modo de ejemplo no limitante, un trastorno ocular, tal como, por ejemplo, una enfermedad diabética del ojo (por ejemplo, retinopatía diabética y DME), enfermedad de Vogt-Kayanagi-Harada (VKH); uveítis sarcoide; histoplasmosis ocular y/o síndrome de histoplasmosis ocular presumido; uveítis autoinmune; uveítis asociada con enfermedades sistémicas, por ejemplo, lupus, enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, y otras enfermedades de origen inmunológico conocido; uvieits posterior (incluida la que todavía no puede ser diagnosticada); uveítis anterior (por ejemplo, iritis); enfermedad de Bechet; poliarteritis nodosa; y granulomatosis de Wegener, AMD húmeda, AMD seca, RPD, síndromes de puntos blancos (por ejemplo, coriorretinopatía serpiginosa, retinopatía serpiginosa, epiteliopatía pigmentaria placoide posterior multifocal aguda (EPPMPA), síndrome de múltiples puntos blancos evanescente (MEWDS), retinopatía aguda zonal oculta externa (AZOOR), coroidopatía punctata interna (PIC), fibrosis subretiniana difusa (DSF)), LORDs y retinopatía serosa central (CSR).
El término "neovascularización" se refiere a la formación de nuevos vasos sanguíneos en tejido anormal o en posiciones anormales.
El término "VEGF" se refiere a un factor de crecimiento endotelial vascular que induce angiogénesis o un procedimiento angiogénico, que incluye, pero no se limita a, permeabilidad aumentada. Como se usa en esta invención, el término "VEGF" incluye los diversos subtipos de VEGF (también conocido como factor de permeabilidad vascular (VPF) y VEGF-A) que surgen por, por ejemplo, unión alternativa del gen VEGF-A/VPF incluyendo VEGF121, VEGF165 y VEGF189. Además, como se usa en esta invención, el término "VEGF" incluye factores angiogénicos relacionados con VEGF tales como PIGF (factor de crecimiento placentario), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D y VEGF-E, que actúan a través de un receptor de VEFG análogo (es decir, VEGFR) para inducir angiogénesis o un procedimiento angiogénico. El término «VEGF» incluye cualquier miembro de la clase de los factores del crecimiento que se unen a un receptor de VEGF tal como VEGFR-1 (Flt-1), VEGFR-2 (KDR/Flk-1) o VEGFR-3 (FLT-4). El término «VEGF» se puede usar para referirse a un polipéptido de «VEGF» o a un gen o ácido nucleico que codifica «VEGF».
El término "agente anti-VEGF" se refiere a un agente que reduce o inhibe, parcial o totalmente, la actividad o producción de un VEGF. Un agente anti-VEGF puede reducir o inhibir directa o indirectamente la actividad o producción de un VEGF específico tal como VEGF165. Asimismo, «agentes anti-VEGF» incluye agentes que actúan sobre un ligando de VEGF o su sobre su receptor análogo para reducir o inhibir una señal del receptor asociado a VEGF. Ejemplos no limitantes de «agentes anti-VEGF» incluyen moléculas antisentido, ribozimas o RNAi que se dirigen a un ácido nucleico de VEGF; aptámeros anti-VEGF, anticuerpos anti-VEGF contra el mismo VEGF o su receptor, o señuelos del receptor de VEGF soluble que impiden la unión de un VEGF a su receptor análogo; moléculas antisentido, ribozimas o RNAi que se dirige a un ácido nucleico del receptor de VEGF análogo (VEGFR); aptámeros anti-VEGFR o anticuerpos anti-VEGFR que se unen a un receptor de VEGf análogo; e inhibidores de tirosina quinasa VEGFR.
El término "agente anti-RAS" o "agente del sistema de angiotensina anti-renina" se refiere a un agente que reduce, o inhibe, parcial o totalmente, la actividad o producción de una molécula del sistema de angiotensina renina (RAS). Ejemplos no limitantes de moléculas «anti-RAS» o «sistema anti-renina angiotensina» son uno o más de entre un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), un bloqueador del receptor de angiotensina y un inhibidor de renina.
El término "esteroide" se refiere a compuestos que pertenecen o están relacionados con las siguientes familias ilustrativas de compuestos: corticosteroides, mineralicosteroides y esteroides sexuales (que incluyen, por ejemplo, moléculas potencialmente androgénicas o estrogénicas o antiandogénicas y antiestrogénicas). Incluidos entre estos están, por ejemplo, prednisona, prednisolona, metilprednisolona, triamcinolona, fluocinolona, aldosterona, espironolactona, danazol (también conocido como OPTINA) y otros.
Los términos "agente gamma del receptor activado por proliferador de, peroxisoma" o "agente PPAR-y" o "agente PPARG" o "agente gamma PPAR" se refieren a agentes que actúan directa o indirectamente sobre el receptor activado por proliferador de, peroxisoma. Este agente también puede influir en la actividad del PPAR-alfa, «PPARA».
El término "un agente que modula la autofagia" se refiere a un modulador de supervivencia celular, muerte celular, supervivencia, autofagia, proliferación, regeneración y similares.
El término "proteína quimiotáctica de monocitos" o "MCP" se refiere a la familia o un miembro de la familia de genes pequeños inducibles (SIG) que desempeña un papel en el reclutamiento de monocitos a sitios de lesión e infección. Estos términos también pueden referirse a moléculas de quimioquinas motif C-C, cuya actividad incluye, por ejemplo, el reclutamiento, y/o la proliferación y/o activación de macrófagos.
El término "alquilo", como se usa en esta invención, a menos que se defina lo contrario, se refiere a un grupo saturado lineal o ramificado derivado de la eliminación de un átomo de hidrógeno de un alcano. Los grupos alquilo de cadena lineal representativos incluyen, pero no se limitan a, -metilo, -etilo, -n-propilo, -n-butilo, -n-pentilo y n-hexilo. Grupos alquilo ramificados representativos incluyen, pero no se limitan a, isopropilo, -sec-butilo, -isobutilo, -terc-butilo, -isopentilo, -neopentilo, 1 -metilbutilo, 2-metilbutilo, 3-metilbutilo, 1, 1 -dimetilpropilo y 1,2-dimetilpropilo.
Como se usa en esta invención, "un", "una", o "el/la" puede significar uno o más de uno. Además, el término «aproximadamente», cuando se usa en relación con una indicación numérica mencionada, significa la indicación numérica mencionada más/menos hasta un 10 % de esa indicación numérica mencionada. Por ejemplo, la expresión «aproximadamente 50» cubre el intervalo de 45 a 55.
Como se menciona en esta invención, todos los porcentajes de composición son en peso de la composición total, a menos que se especifique lo contrario. Tal y como se usa en esta invención, la palabra «incluir» y todas sus variantes, no pretende ser limitante, de tal forma que la mención de elementos en una lista no excluye otros elementos similares que también pueden ser útiles en los materiales, las composiciones, los dispositivos y los procedimientos de esta tecnología. De forma similar, el término «puede» y sus variantes no pretende ser limitante, de tal forma que la mención a que una realización puede comprender ciertos elementos o ciertas características no excluye otras realizaciones de la presente tecnología que no contienen esos elementos o esas características.
Aunque el término abierto "comprendiendo", como sinónimo de términos tales como incluyendo, conteniendo o teniendo, se usa en esta invención para describir y reivindicar la invención, la presente invención, o realizaciones de la misma, pueden describirse alternativamente usando términos alternativos tales como como "que consiste en" o "que consiste esencialmente en".
DNIRA
En diversas realizaciones, la presente invención implica la obtención de imágenes ópticas, utilizando varias técnicas
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que son conocidas en la técnica. Por ejemplo, tales técnicas incluyen, pero no se limitan a, cSLO, FAF, angiografía, OCT, incluyendo tres reconstrucciones tridimensionales de tales. En diversas realizaciones de la invención, la exposición de un ojo a la luz comprende la realización de cSLO, FAF, DNIRA, angiografía u OCT. En diversas realizaciones, el diagnóstico por imágenes es DNRIA. En diversas realizaciones, se pueden usar combinaciones de cualquiera de las técnicas anteriores.
El inventor ha demostrado previamente que, tras la administración sistémica de yodato de sodio, no se observan parches de FAF hipofluorescente en vivo en áreas de pérdida de RPE (en el entorno no clínico, es decir, ojo no humano) como se predijo a partir de la investigación clínica (datos no mostrados). Sin embargo, mediante premarcación del r Pe con un colorante fluorescente, tal como en colorante infrarrojo cercano (NIR) verde de indocianina (ICG), una técnica llamada Análisis Retardado en el Infrarrojo Cercano (DNIRA), el RPE se hace visible mediante imágenes cSLO. Una vez marcadas, las áreas de pérdida de RPE se hacen evidentes como parches cuantificables de hipofluorescencia similares a los observados clínicamente. En diversas realizaciones, NaIO3, FAF y DNIRA se pueden utilizar juntos para mostrar, a modo de ejemplo, la relación entre la pérdida de RPE, los macrófagos, la polarización de los macrófagos, y la regulación de la respuesta M1.
Para DNIRA, un compuesto adecuado para la detección de fluorescencia que incluye un colorante en el infrarrojo cercano (NIR), como ICG cuando se administra a dosis no tóxicas, puede marcar el r Pe y, por lo tanto, hacerlo visible cuando se ve usando los filtros de excitación/emisión ICG en los días o semanas posteriores. Es importante que esta visualización en los días y las semanas posteriores pueda hacerse sin readministración de colorante. Por consiguiente, en algunos aspectos, un componente principal de la técnica DNIRA es su tiempo. Esto es totalmente distinto del uso actual de ICG u otros colorantes angiográficos que se visualizan inmediatamente después de la inyección, durante la fase de tránsito, o en los siguientes minutos a horas posteriores a la inyección, para determinar la localización intravascular del colorante y su extravasación inmediata.
En algunas realizaciones, DNIRA se utiliza en un animal de laboratorio. En una realización, DNIRA puede implicar la administración de un compuesto adecuado para la detección de fluorescencia, a modo de ejemplo no limitativo, ICG (y, opcionalmente, la angiografía) en alrededor de uno o más días antes de la administración con una toxina u otro agente que causa áreas geográficas irregulares de pérdida de RPE (por ejemplo, NaIO3) y opcionalmente seguido por, en aproximadamente 1 o más días (o aproximadamente una semana, o aproximadamente un mes, o aproximadamente tres meses), una cantidad adicional de NaIO3 u otro agente que provoca la expansión de las áreas de pérdida de RPE irregular. Por ejemplo, el otro desafío que causa la expansión de la atrofia geográfica (por ejemplo, como una administración inicial, segunda, tercera o cuarta) puede ser un modulador de la supervivencia celular, muerte celular, supervivencia, autofagia, proliferación, regeneración y similares.
En diversas realizaciones, la técnica DNIRA se utiliza en un paciente humano. Por ejemplo, DNIRA en un paciente humano puede no comprender el uso de una toxina. DNIRA en un paciente humano puede comprender la evaluación de la normalidad o cambios en el ojo asociados con la enfermedad, el uso de un colorante fluorescente, con los filtros de excitación/emisión en posición, pero sin angiografía.
La expansión de la atrofia geográfica es un resultado primario aprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) para el diseño de ensayos clínicos y, en consecuencia, esta invención hace posible la observación de la atrofia geográfica, en particular la expansión de la atrofia geográfica, en un modelo animal, lo que permite correlación entre modelos de enfermedad preclínica y diseño de ensayos clínicos. La incapacidad de identificar con claridad la atrofia geográfica, o la expansión de la atrofia geográfica, en un ojo de un animal antes de la presente invención ha impedido la correlación directa entre los estudios preclínicos y la observación clínica. Además, en algunas realizaciones, la presente invención permite la evaluación clínica de la atrofia geográfica, incluyendo la expansión de la atrofia geográfica, en un paciente humano.
En algunas realizaciones, el compuesto adecuado para la detección de fluorescencia es adecuado para formar imágenes con diversas longitudes de onda de fluorescencia. En algunas realizaciones, estas longitudes de onda varían desde la luz visible hasta el infrarrojo, por ejemplo, desde 390 nm hasta 1 mm, incluyendo, por ejemplo, la luz azul, la luz blanca y el infrarrojo cercano. En algunas realizaciones, el colorante es un colorante en el infrarrojo cercano. En algunas realizaciones, colorante es ICG.
En algunas realizaciones, se realiza DNIRA (y/o se observa fluorescencia retardada en el infrarrojo cercano (DNIRF)) en aproximadamente 1 día, o aproximadamente 2 días, o aproximadamente 3 días, o aproximadamente 4 días, o aproximadamente 5 días, o aproximadamente 6 días, o aproximadamente 7 días, o aproximadamente 10 días, o aproximadamente 14 días, o aproximadamente 21 días después de la administración. En algunas realizaciones, el DNIRA se realiza al menos 1 día después de la administración, o al menos 2 días, o al menos 3 días, o al menos 4 días, o al menos 5 días, o al menos 6 días, o al menos 7 días, o al menos 10 días, o al menos 14 días, o al menos 21 días después de la administración. En otras realizaciones, el DNIRA se realiza al menos aproximadamente 24 horas, o al menos aproximadamente 7 días, o al menos aproximadamente 30 días, o al menos 60 días, o al menos 90 días
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después de la administración. En otras realizaciones, el DNIRA se realiza al menos aproximadamente 2 meses, o aproximadamente 3 meses, o aproximadamente 4 meses, o aproximadamente 5 meses, o como máximo aproximadamente 6 meses después de la administración. En algunas realizaciones, el DNIRA no se realiza durante la etapa de tránsito (es decir, el primer paso de colorante a medida que fluye a través de los vasos sanguíneos oculares y hacia el tejido ocular) o minutos después.
En algunas realizaciones, la visualización se efectúa usando un cSLO. En algunas realizaciones, la visualización se efectúa usando luz blanca y filtros apropiados. En algunas realizaciones, los filtros de excitación/emisión de ICG son filtros de 795 nm (excitación)/810 nm (emisión).
El RPE es una monocapa epitelial crítica que cumple una función de "célula nodriza" para los fotorreceptores especializados de un ojo, los bastoncillos y los conos. Las enfermedades oculares que causan ceguera, tales como, por ejemplo, AMD y RPD, están, sin pretender imponer ninguna teoría, ligadas causalmente en parte a anomalías del RPE.
DNIRA permite identificar claramente la capa de RPE in vivo en un ojo de un animal. Además, la técnica principal utilizada para detectar el RPE en el ojo humano, FAF, es ineficaz o poco efectiva en el ojo de un roedor (a modo de ejemplo no limitativo), posiblemente debido a una escasez relativa de fluoróforos como la lipofuscina. La imagen FAF en el ojo humano se realiza utilizando el espectro azul de luz no coherente en presencia de filtros de estimulación/emisión, o luz azul coherente, y puede identificar áreas de ausencia de RPE (por ejemplo, señal hipofluorescente) o RPE anormal (por ejemplo, señal hiper-fluorescente). La incapacidad para identificar claramente el RPE en un ojo de un animal, en ausencia de DNIRA, ha impedido la correlación directa entre los estudios preclínicos y la observación clínica.
Por consiguiente, en diversos aspectos de la presente invención, se proporcionan procedimientos para hacer visible la capa de RPE, tal como, por ejemplo, DNIRA, en un ojo de un animal para la investigación preclínica de trastornos oculares.
Además, como se describe en esta invención, DNIRA, o variaciones del mismo, permiten la visualización de células inmunes fluorescentes en los ojos de un animal. En algunas realizaciones, el DNIRA puede, opcionalmente, no comprender la administración de toxina. En algunas realizaciones, DNIRA se realiza en un paciente humano y no se aplica una toxina.
Además, como se describe en esta invención, DNIRA, o variaciones del mismo, permiten la visualización de células inmunes fluorescentes en los ojos de un sujeto humano. En algunas realizaciones con un sujeto humano, el DNIRA puede no comprender la administración de toxina.
En algunas realizaciones, DNIRA se utiliza en la identificación de un agente que es eficaz para tratar un trastorno ocular.
En algunas realizaciones, DNIRA se utiliza como un procedimiento para evaluar un paciente que tiene, o puede tener, un trastorno ocular (incluyendo, sin limitación AMD y RPD). En algunas realizaciones, DNIRA es un biomarcador sustituto para el diagnóstico y/o pronóstico y/o la progresión de un trastorno ocular (incluyendo, sin limitación AMD y RPD). Por ejemplo, DNIRA puede usarse para identificar patrones, incluyendo patrones de encaje, reticular o tipo leopardo de DNIRA hiper- e hipo-fluorescente que se alternan que no se ven en otras modalidades de imagen, que son indicativos de un estado de enfermedad ocular (sin limitación AMD y RPD). DNIRA también puede ser usado para identificar y cuantificar las áreas de DNIRA hiper e hipo-fluroescente.
En diversas realizaciones, DNIRA se utiliza para identificar características hipofluorescentes de un ojo. Por ejemplo, estas áreas aparecen en negro cuando son visualizadas y, por lo tanto, permiten una fácil cuantificación (en contraste a las imágenes de ICG, o en contraste con la señal hiperfluroescente, que está en una escala de grises y no blanco/negro). La detección de DNIRA hipofluroescente, en algunas realizaciones, es predictiva de RPE dañado o muerto. Por ejemplo, DNIRA hipofluroescente puede indicar uno o más de una ausencia de RPE, RPE anormal/no saludable (que es incapaz de absorción de colorante ICG), RPE que no está en contacto con la membrana de Bruch (y por lo tanto ya no están en una posición para tomar colorante ICG de la vasculatura coroidea), y la presencia de lípidos que podrían estar situados ya sea entre el RPE y la BM (bloqueando de este modo la captación de ICG), o podrían ser internos al RPE (bloqueando de este modo la señal de RPE).
En diversas realizaciones, DNIRA se utiliza para identificar características hiperfluorescentes de un ojo. Por ejemplo, estas áreas aparecen iluminadas cuando visualizadas y, por tanto, permiten una fácil cuantificación. La detección de DNIRA hiperfluroescente, en algunas realizaciones, es predictiva de macrófagos, incluyendo macrófagos M1 y/o M2.
En diversas realizaciones, DNIRA es un biomarcador utilizado para el diagnóstico de un estado de enfermedad ocular
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(sin limitación AMD y RPD) e indica más evaluación y/o tratamiento con uno de más agentes, incluyendo sin limitación los descritos en esta invención.
En diversas realizaciones, DNIRA se usa como un biomarcador para el pronóstico de un estado de enfermedad ocular (sin limitación AMD y RPD) e indica una evaluación y/o tratam iento adicional con uno o más agentes, incluidos, sin limitación, los descritos en esta invención.
En diversas realizaciones, DNIRA se utiliza para mejorar la identificación de pacientes adecuados para reclutamiento para el estudio y para evaluar la progresión de la enfermedad. En diversas realizaciones, DNIRA se utiliza para controlar la progresión de la enfermedad.
En diversas realizaciones, DNIRA se utiliza como diagnóstico complementario para cualquiera de los agentes descritos en esta invención. En diversas realizaciones, DNIRA se utiliza para evaluar la respuesta del paciente a cualquiera de los agentes descritos en esta invención (incluyendo la evaluación de la eficacia de cualquiera de los agentes descritos en esta invención y/o la probabilidad de respuesta a cualquiera de los agentes descritos en esta invención). En diversos aspectos, la presente invención se refiere además al uso de DNIRA como criterio de entrada, inclusión o exclusión, o análisis de punto final para el diseño de ensayos clínicos.
Trastornos Oculares
En diversas realizaciones, se evalúa y/o identifica un trastorno ocular usando DNIRA o una técnica conocida en la materia. Las técnicas ilustrativas incluyen: cSLO, FAF, OCT (incluso con visualización transversal, tridimensional y en face), SD-OCT (con visualización transversal, tridimensional y en face), angiografía u otras modalidades de imagen que incluyen otras longitudes de onda de fluorescencia. En algunas realizaciones, estas longitudes de onda varían desde el azul hasta el infrarrojo, por ejemplo, desde 390 nm hasta 1 mm, incluyendo, por ejemplo, luz azul, luz blanca, luz aneritra, infrarrojo cercano, infrarrojo.
En diversas realizaciones, un trastorno ocular se evalúa y/o identifica por patrones de FAF dentro de parches de daño o pérdida de RPE o pérdida de la retina externa. En algunas realizaciones, los patrones son una o más de lesiones curvilíneas, en forma de banda, reticulares, ovales, circulares, festoneadas, en forma de halo y similares a dianas.
En diversas realizaciones, un trastorno ocular evaluado y/o identificable por patrones de FAF dentro de un borde de parches de daño o pérdida de RPE o pérdida de la retina externa. En algunas realizaciones, los patrones son una o más de lesiones curvilíneas, en forma de banda, reticulares, ovales, circulares, festoneadas, en forma de halo y similares a dianas.
En otras diversas realizaciones, se evalúa y/o identifica un trastorno ocular mediante patrones en sección transversal o patrones transversales. En algunas realizaciones, los patrones se observan mediante OCT. En algunas realizaciones, los patrones son RPE y/o pérdida de la retina externa o montículos, triángulos, picos o puntas que se encuentran en el espacio sub-retiniano.
En otras realizaciones, se evalúa y/o identifica un trastorno ocular por la presencia de áreas de FAF hiperfluorescente en un ojo del sujeto y/o la presencia de una o más áreas de FAF anormalmente fluorescente en un ojo del sujeto y/o por cambios en una o más imágenes de fondo de ojo de espectro azul, imágenes de fondo de ojo de luz blanca, imágenes de fondo de ojo con luz aneritra y OCT en un ojo del sujeto y/o por un aumento (por ejemplo, un aumento transitorio) en la permeabilidad a través de la barrera epitelial del sujeto entre una coroides y una retina en relación con un estado no enfermo y/o por una deformación de la retina externa, y/o deformación de la vasculatura de la retina media a través de la barrera epitelial del sujeto entre una coroides y una retina en relación con un estado no enfermo y/o por la presencia de células inmunes fagocíticas a través del RPE del sujeto en relación con un estado no enfermo. Los cambios ilustrativos incluyen diferencias de un patrón de imágenes en el mismo o diferentes sujetos y/o animales en dos momentos y/o condiciones experimentales o clínicas distintos. Por ejemplo, los cambios pueden abarcar cambios de los datos de diagnóstico por imágenes entre dos evaluaciones del mismo sujeto y/o animal y/o cambios de los datos de diagnóstico por imágenes entre un primer sujeto y/o animal y los datos de diagnóstico por imágenes de un segundo sujeto y/o animal.
En otras realizaciones más, se evalúa y/o identifica un trastorno ocular por la presencia de una o más áreas de patrones distintos de imágenes de la retina en el ojo de un sujeto, donde las imágenes de la retina son una o más con luz blanca, luz aneritra, luz azul, FAF, infrarrojo cercano (NIR), infrarrojo (IR), angiografía y DNIRA y/o la presencia de una o más áreas de FAF anormalmente fluorescente en el ojo de un sujeto y/o un aumento (por ejemplo, un aumento transitorio) en la permeabilidad a través de la barrera epitelial del sujeto entre una coroides y una retina en relación con un estado no enfermo y/o la presencia de células inmunes fagocíticas en el RPE del sujeto en relación con un estado no enfermo.
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El trastorno ocular es una enfermedad ocular diabética, a modo de ejemplo no limitativo, retinopatía diabética y DME. En algunas realizaciones, la enfermedad ocular diabética se encuentra en un paciente con diabetes tipo 1 o tipo 2. En diversas realizaciones, un paciente con enfermedad ocular diabética a tratar puede tener un nivel de glucosa en sangre que excede lo normal (aproximadamente 70-130 miligramos por decilitro o mg/dL antes de las comidas, y menos de 180 mg/dL una o dos horas después de una comida).
En algunas realizaciones, la enfermedad ocular diabética es retinopatía diabética en una o más de las siguientes etapas: Retinopatía No Proliferativa Leve (en la que pueden ocurrir microaneurismas); Retinopatía No Proliferativa Moderada (en la que algunos vasos sanguíneos que nutren la retina pueden ser bloqueados); y Retinopatía No Proliferativa Grave (en la que más vasos sanguíneos pueden ser bloqueados, privando a varias zonas de la retina de su suministro de sangre); y Retinopatía Proliferativa (en la que las señales enviadas por la retina para nutrición desencadenan el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos.
En algunas realizaciones, los presentes procedimientos para el tratamiento o prevención de una enfermedad diabética ocular (por ejemplo, retinopatía diabética y DME) comprenden además cirugía láser (por ejemplo, tratamiento con dispersión láser, tratamiento con láser focal, fotocoagulación) y/o vitrectomía (por ejemplo, en el que se extrae la sangre del centro del ojo de un paciente) y/o administración de un esteroide y/o administración de un agente anti-VEGF tal como Ranibizumb (LUCENTIS), Bevizumab (AVASTIN) o Aflibercept (EYLEA).
En algunas realizaciones, la enfermedad diabética ocular es una catarata o glaucoma (por ejemplo, glaucoma neovascular).
En algunas realizaciones, los trastornos asociados con los patrones de imágenes (FAF) tales como "goteo difuso" pueden evaluarse, tratarse o impedirse usando los procedimientos descritos en esta invención. Patrones de goteo difuso son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Schmitz-Valckenberg y col. Survey of Ophthalmology. 2009 Ene-Feb; 54(1 ):96-117; Bindewald y col. British Journal of Ophthalmology. 2005 Jul; 89(7):874-8; Holz y col. Am. J Ophthalmology. 2007 Mar; 143(3):463-72).
En algunas realizaciones, DNIRA se utiliza para identificar y/o diagnosticar cualquiera de los trastornos oculares descritos en esta invención. En algunas realizaciones, la toxicidad del RPE, la pérdida de RPE y la AMD seca son identificables usando DNIRA, por ejemplo, con yodato de sodio (NaIO3) o en la presencia de enfermedad. Áreas análogas a atrofia geográfica pueden ser detectados por, por ejemplo, análisis de tejidos (por ejemplo, mediante la observación de la pérdida de un marcador de células de RPE como RPE65 y/o la pérdida de la tinción de células binucleadas), y/o in vivo, usando DNIRA, de ojos tratados con NaIO3. En algunas realizaciones, la toxicidad del RPE, la pérdida de RPE y la AMD seca son identificables usando FAF que muestra una señal de FAF hiperfluorescente, que puede ser compleja, dentro del área de pérdida inminente de tejido y/o en sus márgenes. Esta señal de FAF hiperfluorescente compleja se desarrolla, en los días o semanas después del tratamiento con NaIO3, en un patrón de fA f , que puede ser complejo y puede incluir, pero no se limita a, hiperfluorescencia en forma de banda, curvilínea, pisciforme, festoneada, entrelazada, ramificada o reticular. Tales patrones imitan a los que se encuentran en la AMD seca clínica. Tales FAF también pueden ser hipofluorescentes.
Además, usando solamente la angiografía, o como parte de DNIRA, la angiografía realizada inmediatamente antes o coincidente con la aparición de las áreas de FAF alterado puede demostrar un aumento (incluido un aumento transitorio) en la permeabilidad a través de la barrera epitelial entre la coroides y la retina (como, por ejemplo, observado por fugas de colorantes que pueden inyectarse antes de la obtención de imágenes; tales colorantes incluyen ICG). Esta barrera normalmente incluye la coroides interna, la membrana de Bruch, las células del RPE y, posiblemente, la configuración de los fotorreceptores externos junto con el RPE y la membrana limitante externa. Sin pretender imponer ninguna teoría, una ruptura transitoria de esta barrera epitelial especializada puede subyacer a una secuencia de eventos posteriores, incluyendo el plegado, la ondulación o la deformación de la retina externa, la capa de fotorreceptores y/o el movimiento/migración de células inflamatorias desde la coroides hacia el espacio subretiniano. Sin embargo, en algunas realizaciones, esta fase puede ser transitoria y resuelta, o subclínica en su extensión.
En algunas realizaciones, uno o más de los trastornos oculares son identificables por la presencia de áreas de FAF hiperfluorescente y o anormalmente fluorescente u otras longitudes de onda de luz de 350 nm a 1.000 nm. En algunas realizaciones, uno o más de los trastornos oculares son identificables utilizando DNIRA.
En algunas realizaciones, uno o más de los trastornos oculares son identificables por, por ejemplo, cSLO, FAF, OCT (incluso con visualización transversal, tridimensional y en face), SD-OCT (con visualización transversal, tridimensional y en face) u otras modalidades de imágenes que incluyen otras longitudes de onda de fluorescencia (por ejemplo, longitudes de onda que van del azul al infrarrojo, por ejemplo, 390 nm a 1 mm, que incluyen, por ejemplo, luz azul, luz blanca, luz aneritra, infrarrojo cercano o infrarrojo).
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En algunas realizaciones, el trastorno ocular puede ser de una cierta etapa o progresión. En algunas realizaciones, el trastorno ocular puede ser incipiente, emergente, inactivo, avanzando o activo.
Agentes de la Invención
En algunas realizaciones, un compuesto de Fórmula I, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, también se administra con un agente terapéutico adicional. En diversas realizaciones, el agente terapéutico adicional se puede usar en una terapia de combinación con los agentes eficaces para el tratamiento de un trastorno ocular descrito en esta invención. En diversas realizaciones, los agentes efectivos para tratar un trastorno ocular descrito en esta invención se administran a un paciente sometido a tratamiento con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Los agentes terapéuticos adicionales incluyen, por ejemplo, uno o más de un agente anti-VEGF, un inhibidor de ACE, un agonista o agonista parcial de PPAR-gamma, un inhibidor de renina, un esteroide y un agente que modula la autofagia, así como un semapimod, un inhibidor de MIF, un inhibidor de CCR2, CKR-2B, un 2-tioimidazol, CAS 445479-97-0, CCX140, clodronato, una preparación de clodonato-liposoma o cloruro de gadolinio.
Un agente de la invención es un compuesto de Fórmula I:
Figure imgf000020_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde cada uno de R1 y R2 es independientemente H o un C1-C6 alquilo y R3 es H o un C1-C6 alquilo.
En diversas realizaciones, R1 y R2 son independientemente hidrógeno, metilo o etilo.
En diversas realizaciones, R1 y R2 son independientemente metilo o etilo.
En algunas realizaciones, R1 y R2 son metilo.
En algunas realizaciones R3 es hidrógeno, metilo o etilo.
En algunas realizaciones R3 es hidrógeno.
En algunas realizaciones, particularmente donde R3 es hidrógeno, los compuestos de Fórmula I están en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.
En algunas realizaciones, R1 y R2 son metilo y R3 es hidrógeno En tales realizaciones, el compuesto de Fórmula I es 2-((1 -bencilindazol-3-il) metoxi)-2-ácido metilpropiónico, también conocido como 2-metil-2-[[1-(fenilmetil)-1H-indazol-3il]metoxi] ácido propanoico. Tal compuesto se conoce habitualmente como bindarit y tiene la estructura siguiente:
Figure imgf000020_0002
La síntesis de bindarit se describe en detalles en la Patente U.S. No. 4,999,367.
Bindarit es un inhibidor de la producción de MCP-1 in vitro e in vivo y, sin pretender imponer ninguna teoría, sus efectos
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beneficiosos en modelos animales de inflamación pueden estar relacionados con esta actividad anti-MCP-1 (ver Mirolo, y col. Eur Cytokine Netw 2008;19:119-122). También se ha demostrado que Bindarit inhibe selectivamente la producción de MCP-2 y MCP-3 (ver Mirolo, y col. Eur Cytokine Netw 2008;19:119-122).
Compuestos Fluorescentes
En algunas realizaciones, el compuesto fluorescente es adecuado para formar imágenes con diversas longitudes de onda de fluorescencia. En algunas realizaciones, estas longitudes de onda varían desde la luz visible hasta el infrarrojo, por ejemplo, desde 390 nm hasta 1 mm, incluyendo, por ejemplo, la luz azul, la luz blanca y el infrarrojo cercano. En algunas realizaciones, el colorante es un colorante en el infrarrojo cercano. En algunas realizaciones, el colorante es ICG.
En algunas realizaciones, el compuesto fluorescente es adecuado para formar imágenes con diversas longitudes de onda de fluorescencia. En algunas realizaciones, estas longitudes de onda varían desde la luz visible hasta el infrarrojo, por ejemplo, desde aproximadamente 390 nm hasta aproximadamente1 mm, incluyendo, por ejemplo, la luz azul, la luz blanca y el infrarrojo cercano. En algunas realizaciones, la absorción es de aproximadamente 390 nm a aproximadamente 1 mm. En algunas realizaciones, la emisión es de aproximadamente 390 nm a aproximadamente 1 mm.
En algunas realizaciones, el compuesto fluorescente absorbe luz a una longitud de onda de aproximadamente 600 nm a aproximadamente 900 nm y/o emite luz a una longitud de onda de aproximadamente 750 nm a aproximadamente 950 nm.
En algunas realizaciones, el colorante es un colorante en el infrarrojo cercano. En algunas realizaciones, el colorante es ICG. En algunas realizaciones, los filtros de excitación/emisión de ICG son de 795 nm (excitación)/810 nm (emisión).
En algunas realizaciones, la dosis del compuesto fluorescente, por ejemplo, un colorante (incluyendo ICG), es una cantidad efectiva del compuesto fluorescente. En diversas realizaciones, la dosis de ICG es desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10 mg/kg de un animal. En algunas realizaciones, la dosis es aproximadamente 0,1; o aproximadamente 0,3; o aproximadamente 0,5; o aproximadamente 1,0; o aproximadamente 2,0; o aproximadamente 3,0; o aproximadamente 4,0; o aproximadamente 5,0; o aproximadamente 6,0; o aproximadamente 7,0; o aproximadamente 8,0; o aproximadamente 9,0; o aproximadamente 10,0 mg/kg de un animal.
En diversas realizaciones, los compuestos fluorescentes, o sus metabolitos, provocan una fluorescencia que se produce en las células del RPE y/o células inmunes.
En otras realizaciones, los procedimientos descritos en esta invención no comprenden administrar (i) una cantidad adicional de compuesto fluorescente al animal o (ii) un segundo compuesto fluorescente al animal.
Toxinas
En algunas realizaciones, se proporciona una toxina que se sabe que afecta el tejido ocular, que incluye, pero no se limita a, el RPE o la retina.
En algunas realizaciones, la toxina es uno o más de aluminio, aminofenoxialcanos (un ejemplo no limitante incluye, pero no se limita a, 1,4,-bis(4-aminofenoxi)-2-fenilbenceno para ratas), fármacos anfofílicos catiónicos/antidepresivos tricíclicos (ejemplos no limitantes incluyen, pero no se limitan a, amiodarona, cloroamitriptilina, clorfentermina, clomipramina, imipramina, iprindol, diversos aminoglucósidos y otros compuestos anfofílicos catiónicos), desferrioxamina, dl-(p-trifluorometilfenil) clorhidrato de isopropilamina, fluoruro (por ejemplo, fluoruro de sodo), yodato (ejemplos no limitantes incluyen, pero no se limitan a, yodato de sodio o potasio), yodoacetato, plomo, metanol y ácido fórmico, 4,4'-Metilendianilina, N-metil-N-nitrosurea, naftaleno, naftol, nitroanilina (N-3-piridilmetil-N'-pnitrofenilurea/nitroanilina/piriminil), organofosfatos (ejemplos no limitantes incluyen, pero no se limitan a, etiltiometon, fention y fenitrotion), oxalato (un ejemplo no limitante incluye,pero no se limita a,oxalato de dibutilo), fenotiazinas (ejemplos no limitantes incluyen, pero no se limitan a, piperidilclorofenotiazina, tioridazina y clorpromazina), quinolinas (un ejemplo no limitante incluye, pero no se limita a, cloroquina e hidroxicloroquina), estreptozotocina, deficiencia de taurina, uretano, deficiencia de zinc causada por quelantes metálicos y derivados y variantes de los mismos.
En algunas realizaciones, la toxina es un yodato. En algunas realizaciones, la toxina es yodato de sodio o potasio.
En algunas realizaciones, la toxina induce atrofia del tejido ocular. En diversas realizaciones, la atrofia comprende necrosis y/o apoptosis. En diversas realizaciones, la atrofia que comprende necrosis y/o apoptosis es de células del RPE. En algunas realizaciones, la toxina reduce o modifica la autofagia. En algunas realizaciones, la toxina induce atrofia geográfica y/o expansión de la atrofia geográfica. En algunas realizaciones, la toxina induce uno o más de los efectos antes mencionados.
En algunas realizaciones, la toxina se administra una vez, o dos veces, o tres veces. En algunas realizaciones, la toxina se administra una vez, o dos veces, o tres veces, o cuatro veces, o cinco veces. En algunas realizaciones, se realiza una segunda, o tercera, o cuarta, o quinta administración en un plazo de aproximadamente un día, o 1 semana, o 1 mes después de la primera.
En algunas realizaciones, la toxina administrada puede ser uno o más de los agentes descritos en esta invención. En diversas realizaciones, el segundo, o tercer, o cuarto, o quinto pulso es un modulador de autofagia, supervivencia celular, muerte celular, proliferación, regeneración y similares, tal y como se ha descrito en esta invención y se conoce en la técnica.
En otra realización, los procedimientos descritos en esta invención comprenden administrar (i) una cantidad adicional de una primera toxina al animal y/o (ii) una segunda toxina al animal. En algunas realizaciones, los procedimientos descritos en esta invención comprenden además la observación de una reducción de la velocidad de formación, crecimiento o expansión de parches de atrofia de tejido ocular o parches de pérdida de tejido.
En diversas realizaciones, las dosis de las toxinas son conocidas por los expertos en la técnica . Por ejemplo, una dosis adecuada puede estar en un intervalo de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del sujeto, por ejemplo, aproximadamente 0,1 mg/kg, aproximadamente 0,2 mg/kg, aproximadamente 0,3 mg/kg, aproximadamente 0,4 mg/kg, aproximadamente 0,5 mg/kg, aproximadamente 0,6 mg/kg, aproximadamente 0,7 mg/kg, aproximadamente 0,8 mg/kg, aproximadamente 0,9 mg/kg, aproximadamente 1 mg/kg, aproximadamente 1,1 mg/kg, aproximadamente 1,2 mg/kg, aproximadamente 1,3 mg/kg, aproximadamente 1,4 mg/kg, aproximadamente 1,5 mg/kg, aproximadamente 1,6 mg/kg, aproximadamente 1,7 mg/kg, aproximadamente 1,8 mg/kg, aproximadamente 1,9 mg/kg, aproximadamente 2 mg/kg, aproximadamente 3 mg/kg, aproximadamente 4 mg/kg, aproximadamente 5 mg/kg, aproximadamente 6 mg/kg, aproximadamente 7 mg/kg, aproximadamente 8 mg/kg, aproximadamente 9 mg/kg, aproximadamente 10 mg/kg, aproximadamente 11 mg/kg, aproximadamente 12 mg/kg, aproximadamente 13 mg/kg, aproximadamente 14 mg/kg, aproximadamente 15 mg/kg, aproximadamente 20 mg/kg, aproximadamente 25 mg/kg, aproximadamente 30 mg/kg, aproximadamente 35 mg/kg, aproximadamente 40 mg/kg, aproximadamente 45 mg/kg, aproximadamente 50 mg/kg, aproximadamente 55 mg/kg, aproximadamente 60 mg/kg, aproximadamente 65 mg/kg, aproximadamente 70 mg/kg, aproximadamente 75 mg/kg, aproximadamente 80 mg/kg, aproximadamente 85 mg/kg, aproximadamente 90 mg/kg, aproximadamente 95 mg/kg o aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, incluidos todos los valores e intervalos entre ellos.
En una realización, la toxina es NaIO3 y la dosis es aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal. En una realización, la toxina es NaIO3 y la dosis es aproximadamente 45 mg/kg de peso corporal. En una realización, la toxina es NaIO3 y la dosis es aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal.
Sales y Excipientes Farmacéuticamente Aceptables
Cualquier agente descrito en esta invención puede poseer un grupo funcional suficientemente básico, que puede reaccionar con un ácido inorgánico u orgánico, o un grupo carboxilo, que puede reaccionar con una base inorgánica u orgánica, para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable se forma a partir de un ácido farmacéuticamente aceptable, como es bien conocido en la técnica. Dichas sales incluyen las sales farmacéuticamente aceptables listadas en Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2-19 (1977) y The Handbook of Pharmaceutical Salts; Properties, Selection, and Use. P. H. Stahl and C. G. Wermuth (eds.), Verlag, Zurich (Suiza) 2002.
Sales farmacéuticamente aceptables incluyen, a modo de ejemplo no limitativo, sulfato, citrato, acetato, oxalato, cloruro, bromuro, yoduro, nitrato, bisulfato, fosfato, fosfato ácido, isonicotinato, lactato, salicilato, citrato ácido, tartrato, oleato, tanato, pantotenato, bitartrato, ascorbato, succinato, maleato, gentisinato, fumarato, gluconato, glucaronato, sacarato, formiato, benzoato, glutamato, metanosulfonato, etanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, alcanforsulfonato, pamoato, fenilacetato, trifluoroacetato, acrilato, clorobenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, metilbenzoato, o-acetoxibenzoato, naftaleno-2-benzoato, isobutirato, fenilbutirato, a-hidroxibutirato, butino-1,4-dicarboxilato, hexeno-1,4-dicarboxilato, caprato, caprilato, cinamato, glicolato, heptanoato, hipurato, malato, hidroximaleato, malonato, mandelato, mesilato, nicotinato, ftalato, teraftalato, propiolato, propionato, fenilpropionato, sebacato, suberato, p-bromobencenosulfonato, clorobencenosulfonato, etilsulfonato, 2-hidroxietilsulfonato, metilsulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, naftaleno-1,5-sulfonato, xilenosulfonato y sales de tartarato.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" también se refiere a una sal de los compuestos de la presente invención que tiene un grupo funcional ácido, tal como un grupo funcional ácido carboxílico, y una base. Bases adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hidróxidos de metales alcalinos tales como sodio, potasio y litio; hidróxidos de metales alcalinotérreos tales como calcio y magnesio; hidróxidos de otros metales tales como aluminio y zinc; amoniaco y aminas orgánicas, tales como mono-, di- o tri-alquilaminas sin sustituir o hidroxi sustituidas, diciclohexilamina; tributilamina; piridina; N-metilo, N-etilamina; dietilamina; trietilamina; mono-, bis-, o tri-(2-OH-alquilaminas inferiores), tales como mono-; bis- o tris-(2-hidroxietil)amina, 2-hidroxi-terc-butilamina o tris-(hidroximetil)metilamina, N,N-dialquilo inferior-N-(hidroxil-alquilo inferior)-aminas, tales como N,N-dimetil-N-(2-hidroxietil)amina o tri-(2-hidroxietil)amina; N-metil-D-glucamina y aminoácidos tales como arginina, lisina y similares.
En algunas realizaciones, un agente de la invención está en forma o una sal farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la sal farmacéuticamente aceptable es una sal sódica. En algunas realizaciones, particularmente donde R3 de los compuestos de Fórmula I es hidrógeno, los compuestos de Fórmula I están en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el compuesto de Fórmula I es una sal de bindarit farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, el metotrexato está en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la sal farmacéuticamente aceptable de metotrexato es metotrexato de sodio.
Además, cualquier agente descrito en esta invención puede administrarse a un sujeto como un componente de una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, tales composiciones pueden comprender una cantidad adecuada de un excipiente farmacéuticamente aceptable con el fin de darle la forma necesaria para una administración adecuada.
Los excipientes farmacéuticos pueden ser líquidos, como agua y aceites, incluidos los de petróleo, de origen animal, vegetal o sintético, como aceite de maní, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. Los excipientes farmacéuticamente aceptables pueden ser solución salina, goma acacia, gelatina, pasta de almidón, talco, queratina, sílice coloidal, urea y similares. Además, se pueden usar agentes auxiliares, estabilizantes, espesantes, lubricantes y colorantes. En una realización, los excipientes farmacéuticamente aceptables son estériles cuando se administran a un sujeto. El agua es un excipiente útil cuando cualquier agente descrito en esta invención se administra intravenosamente. También se pueden emplear como excipientes líquidos, concretamente para soluciones inyectables, soluciones salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol. Los excipientes farmacéuticamente aceptables también incluyen almidón, glucosa, lactosa, sucrosa, gelatina, malta, arroz, harina, yeso, gel de sílice, estearato sódico, monoestearato de glicerol, talco, cloruro sódico, leche desnatada en polvo, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares. Cualquier agente descrito en esta invención, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tampón del pH.
Formulaciones, Adm inistración y Dosificación
Cualquier agente descrito en esta invención puede tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsión, inyección intraocular, inyección intravítrea, gotas oftálmicas tópicas, inyección subconjuntival, inyección de subtenón, formulaciones transesclerales, comprimidos, píldoras, gránulos, cápsulas, cápsulas que contienen líquidos, polvos, formulaciones de liberación sostenida, supositorios, emulsiones, aerosoles, aerosoles, sprays, suspensiones o cualquier otra forma adecuada para uso. En una realización, la composición es adecuada para una inyección intravítrea (ver, por ejemplo, ILUVIEN o formas similares) o implantación (ver, por ejemplo, RETISERT o formas similares). En una realización, la composición tiene la forma de una cápsula (ver, por ejemplo, Patente U.S. No.
5,698,155). Otros ejemplos de excipientes farmacéuticos adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19a ed. 1995).
En una realización, cualquier agente descrito en esta invención se formula para administración oftálmica, que incluye, por ejemplo, administración intravítrea o intraocular, tópica, y/o administración intravenosa. Habitualmente, las composiciones para administración comprenden un tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, las composiciones también pueden incluir un agente solubilizante. Además, los agentes se pueden suministrar con un vehículo o dispositivo de suministro adecuado como se conoce en la técnica. Las terapias de combinación descritas en esta invención pueden ser co-suministradas en un único vehículo de suministro o dispositivo de suministro. Opcionalmente, las composiciones para administración pueden incluir un anestésico local tal como lignocaína para disminuir el dolor en el sitio de la inyección.
En una realización, cualquier agente descrito en esta invención se formula según procedimientos de rutina como una composición adaptada para administración intraocular.
En una realización, cualquier agente descrito en esta invención se formula según procedimientos de rutina como una composición adaptada para administración por vía oral a seres humanos. Las composiciones para suministro oral pueden estar, por ejemplo, en forma de comprimidos, pastillas, suspensiones acuosas o oleosas, gránulos, polvos, emulsiones, cápsulas, jarabes o elixires. Las composiciones administradas oralmente pueden comprender uno o más agentes, por ejemplo, agentes edulcorantes tales como fructosa, aspartamo o sacarina; agentes saborizantes tales como menta, aceite de gaulteria o cereza; agentes colorantes y agentes conservantes, para producir una composición
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farmacéuticamente grata al paladar. Asimismo, cuando están en forma de comprimido o píldora, las composiciones se pueden recubrir para retardar su desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal, proporcionando así una acción sostenida durante un periodo de tiempo prolongado. Las membranas selectivamente permeables que rodean un vehículo osmóticamente activo que transporta cualquier agente descrito en esta invención también son adecuadas para composiciones administradas oralmente. En estas últimas plataformas, el fluido procedente del ambiente que rodea a la cápsula es impregnado por el compuesto transportador, que se hincha para desplazar el agente o la composición del agente a través de una apertura. Estas plataformas de entrega pueden proporcionar un perfil de entrega de orden esencialmente cero, al contrario que los perfiles en punta de las formulaciones de liberación inmediata. Un material retardador, tal como monoestearato de glicerol o estearato de glicerol, también puede ser útil. Composiciones orales pueden incluir excipientes estándar tales como manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, celulosa y carbonato de magnesio. En una realización, los excipientes son de grado farmacéutico.
Los ingredientes se pueden suministrar por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como una solución premezclada, polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente cerrado, como una ampolla, una jeringa precargada, o bolsita que indica la cantidad de agente activo. Cuando se va a administrar cualquier agente descrito en esta invención mediante administración intravítrea o intraocular, se puede dispensar, por ejemplo, con una jeringa o un inyector precargados o en una ampolla para retracción en una jeringa adecuada. Cuando se va a administrar cualquier agente descrito en esta invención mediante infusión, se puede dispensar, por ejemplo, con una botella de infusión que contenga agua o solución salina estéril de grado farmacéutico. Cuando cualquier agente descrito en esta invención se va a administrar mediante inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua o solución salina estériles para inyección, de tal forma que los ingredientes se puedan mezclar antes de su administración.
Cualquier agente descrito en esta invención se puede administrar por medios de liberación controlada o liberación sostenida o por dispositivos de administración que son bien conocidos para los expertos en la técnica. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en la Patente U.S. Nos. 3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3.598.123; 4.008.719; 5.674.533; 5.059.595; 5.591.767; 5.120.548; 5.073.543; 5.639.476; 5.354.556 y 5733556. Dichas formas de dosificación pueden ser útiles para proporcionar una liberación controlada o sostenida de uno o más ingredientes activos usando, por ejemplo, hidropropilmetilcelulosa, otras matrices de polímeros, geles, membranas permeables, sistemas osmóticos, recubrimientos multicapa, micropartículas, nanopartículas, liposomas, microesferas o una combinación de los mismos para proporcionar el perfil de liberación deseado en proporciones variables. Las formulaciones de liberación controlada o sostenida adecuadas conocidas por los expertos en la materia, incluyendo las descritas en esta invención, se pueden seleccionar fácilmente para su uso con los ingredientes activos de los agentes descritos en esta invención. Por tanto, la invención proporciona formas de dosificación unitaria únicas adecuadas para administración oral tales como, pero no limitadas a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gelatina y pastillas que están adaptadas para liberación controlada o sostenida.
La liberación controlada o sostenida de un ingrediente activo puede ser estimulada por varias condiciones, que incluyen, entre otras, cambios en el pH, cambios en la temperatura, estimulación por una longitud de onda de luz apropiada, concentración o disponibilidad de enzimas, concentración o disponibilidad de agua u otras condiciones o compuestos fisiológicos.
Las composiciones pueden prepararse según procedimientos convencionales de mezcla, granulación, recubrimiento o polimerización, respectivamente, y las presentes composiciones pueden comprender, en una realización, de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 99 %; y en otra realización de aproximadamente 1 % a aproximadamente 70 % de cualquier agente descrito en esta invención en peso o volumen.
En otra realización, cualquier agente descrito en esta invención actúa sinérgicamente cuando se administra conjuntamente con otro agente y se administra a dosis que son más bajas que las dosis comúnmente empleadas cuando tales agentes se usan como monoterapia.
Por ejemplo, la dosificación de cualquier agente descrito en esta invención, así como el programa de dosificación pueden depender de varios parámetros, que incluyen, entre otros, el trastorno ocular que se está tratando, la salud general del sujeto y la discreción del médico que lo administra. Cualquier agente descrito en esta invención se puede administrar antes de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes), simultáneamente a, o después de (por ejemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 12 semanas antes) la administración de un agente terapéutico adicional a un sujeto con necesidad del mismo. En diversas realizaciones, cualquier agente descrito en esta invención se administra con un lapso de tiempo de 1 minuto, 10 minutos, 30 minutos, menos de 1 hora, 1 hora, de 1 hora a 2 horas, de 2 horas a 3 horas, de 3 horas a 4 horas, de 4 horas a 5 horas, de 5 horas a 6 horas, de 6 horas a 7 horas, de 7 horas a 8 horas, de 8 horas a 9 horas, de 9 horas a 10 horas, de 10 horas a 11 horas, de 11 horas a 12 horas, no más de 24 horas o no más de 48 horas. En una realización, un agente de la invención, que incluye compuestos de Fórmula I, metotrexato o sus sales farmacéuticamente aceptables, y uno o más agentes terapéuticos adicionales se administran en 3 horas. En otra realización, un agente de la invención, que incluye compuestos de Fórmula I, metotrexato o sus sales farmacéuticamente aceptables, y uno o más agentes terapéuticos adicionales se administran con un intervalo de 1 minuto a 24 horas.
La cantidad de cualquier agente descrito en esta invención que se mezcla con los materiales vehículos para producir una dosis única puede variar dependiendo del sujeto a tratar y el modo particular de administración. Ensayos in vitro o in vivo pueden emplearse para ayudar a identificar los mejores intervalos de dosificación.
En general, las dosis útiles son conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, las dosis pueden determinarse con referencia a Physicians' Desk Reference, 66a Edición, PDR Network; Edición 2012 (27 de diciembre de 2011).
La dosificación de cualquier agente descrito en esta invención puede depender de varios factores, incluida la gravedad de la afección, si la afección debe tratarse o impedirse, y la edad, el peso y la salud del sujeto a tratar. Adicionalmente, la información farmacogenómica (el efecto del genotipo sobre la farmacocinética, la farmacodinámica o el perfil de eficacia de un terapéutico) sobre un sujeto concreto puede afectar la dosificación usada. Además, las dosificaciones individuales exactas pueden ajustarse de alguna manera dependiendo de una variedad de factores, incluida la combinación específica de los agentes que se administran, el tiempo de administración, la ruta de administración, la naturaleza de la formulación, la velocidad de excreción, el trastorno ocular particular que se está tratando, la gravedad del trastorno y la ubicación anatómica del trastorno. Se pueden esperar algunas variaciones en la dosificación.
En otras realizaciones más, la administración se efectúa oralmente, o intravascularmente, o intraocularmente, o periocularmente, o a la superficie ocular.
Cuando se administra oftálmicamente a un ser humano, por ejemplo, intravítreamente, la dosis de un agente de la invención, que incluye, por ejemplo, Fórmula I, metotrexato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y/o agente terapéutico adicional es normalmente de 0,003 mg a 5,0 mg por ojo por administración, o 0,03 mg a 3,0 mg por ojo por administración, o 0,1 mg a 1,0 mg por ojo por administración. En una realización, la dosificación es 0,03 mg, 0,3 mg, 1,5 mg o 3,0 mg por ojo. En otra realización, la dosificación es 0,5 mg por ojo. La dosificación puede variar de 0,01 mL a 0,2 mL administrados por ojo, o de 0,03 mL a 0,15 mL administrados por ojo, o de 0,05 mL a 0,10 mL administrados por ojo. En una realización, la administración es de 400 pg de compuesto, mensualmente durante al menos tres meses.
Generalmente, cuando se administra por vía oral a un mamífero, la dosis de cualquier agente descrito en esta invención puede ser de 0,001 mg/kg/día a 100 mg/kg/día, 0,01 mg/kg/día a 50 mg/kg/día, o 0,1 mg/día kg/día a 10 mg/kg/día. Cuando se administra oralmente a un ser humano, la dosificación de cualquier agente descrito en esta invención es normalmente de 0,001 mg a 1000 mg al día, de 1 mg a 600 mg al día, o de 5 mg a 30 mg al día. En una realización, la dosificación oral es 600 mg al día. En una realización, la dosificación oral es de dos dosis de 300 mg al día. En otra realización, la dosificación oral es de 7,5 mg a la semana a 15 mg a la semana.
Para la administración de cualquier agente descrito en esta invención mediante inyección parenteral, la dosis es normalmente de 0,1 mg a 250 mg por día, de 1 mg a 20 mg por día, o de 3 mg a 5 mg por día. Las inyecciones se pueden poner hasta cuatro veces diariamente. Generalmente, cuando se administra oralmente o parenteralmente, la dosificación de cualquier agente descrito en esta invención es normalmente de 0,1 mg a 1500 mg al día, de 0,5 mg a 10 mg al día, o de 0,5 mg a 5 mg al día. Se puede administrar una dosificación de hasta 3000 mg al día.
En algunas realizaciones, puede ser deseable administrar al ojo uno o más de los agentes descritos en esta invención. La administración puede ser, a modo de ejemplo no limitativo, intraocular, intravítrea, tópica (que incluye, entre otros, gotas y ungüento), subconjuntival, subtenón, transescleral, supracoroidea, subretiniana y vía iontoforesis.
También se pueden utilizar otras vías de administración, tales como, por ejemplo: intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmica, rectal, por inhalación o tópica, particularmente a las orejas, nariz, ojos o piel.
El modo de administración puede dejarse a discreción del profesional y depende en parte del sitio de la afección médica. En algunos casos, la administración conlleva la liberación de cualquier agente descrito en esta invención al torrente sanguíneo.
Cualquier agente descrito en esta invención puede administrarse por vía oral. Dichos agentes también se pueden administrar por cualquier otra vía conveniente, por ejemplo, por infusión intravenosa o inyección de bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se
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pueden administrar junto con otro agente biológicamente activo. La administración puede ser sistémica o local. Se conocen varios sistemas de administración, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, cápsulas, etc., y pueden ser usados para administrar.
Otros procedimientos de administración incluyen, entre otros, intraocular, intravítreo, ocular tópico (que incluyen, entre otros, gotas, ungüentos e insertos), subconjuntival, subtenón, supracoroideo, transescleral, intradérmico, intramuscular, intraperitoneal, intravenoso, subcutáneo, intranasal, epidural, oral, sublingual, intranasal, intracerebral, intravaginal, transdérmico, rectal, por inhalación o tópicamente, particularmente en los oídos, la nariz, los ojos o la piel. En algunas realizaciones, se administra al ojo más de uno de cualquiera de los agentes descritos en esta invención. La administración puede ser, a modo de ejemplo no limitativo, intraocular, intravítrea, tópica (que incluye, entre otros, gotas y ungüento), subconjuntival, subtenón, transescleral y vía iontoforesis. El modo de administración puede dejarse a discreción del profesional y depende en parte del sitio de la afección médica. En la mayoría de los casos, la administración resulta en la liberación al torrente sanguíneo.
En realizaciones específicas, puede ser deseable administrar localmente al área que necesita tratamiento.
En otra realización, el suministro puede ser en una vesícula, en particular un liposoma (ver Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Treat y col., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989). En otra realización más, el suministro se puede hacer en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede usar un dispositivo intraocular de liberación lenta. En algunas realizaciones, este dispositivo consiste en un líquido, gel, polímero, etc., erosionable o no erosionable suministrado localmente.
En otra realización, se pueden usar materiales poliméricos (ver Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; ver también Levy y col., 1985, Science 228:190; During y col., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard y col., 1989, J. Neurosurg. 71:105). En otra realización, se puede colocar un sistema de liberación controlada cerca del área diana a tratar, por ejemplo, la retina, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (ver, por ejemplo, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Otros sistemas de liberación controlada discutidos en la revisión por Langer, 1990, Science 249:1527-1533) pueden ser usados.
La administración de cualquier agente descrito en esta invención puede, independientemente, ser de una a cuatro veces al día o de una a cuatro veces al mes o de una a seis veces al año o una vez cada dos, tres, cuatro o cinco años. La administración se puede hacer durante la duración de un día o un mes, dos meses, tres meses, seis meses, un año, dos años, tres años e incluso durante toda la vida del sujeto. La administración crónica a largo plazo será indicada en muchos casos. La dosificación se puede administrar como dosis única o dividida en múltiples dosis. En general, la dosificación deseada se debería administrar a intervalos establecidos durante un periodo prolongado, normalmente al menos a lo largo de varias semanas o varios meses, aunque pueden ser necesarios periodos de administración más largos, de varios meses o años o más.
El régimen de dosificación que utiliza cualquier agente descrito en esta invención puede seleccionarse según una variedad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del sujeto; la severidad de la condición a ser tratada; la vía de administración; la función renal o hepática del sujeto; la constitución farmacogenómica del individuo; y el compuesto específico de la invención empleado. Cualquier agente descrito en esta invención se puede administrar en una dosificación diaria única, o se puede administrar la dosificación diaria total en dosis divididas de dos, tres, o cuatro veces al día. Asimismo, cualquier agente descrito en esta invención se puede administrar de forma continua, en lugar de intermitentemente, durante todo el régimen de dosificación.
Procedimientos de Tratamiento
En diversos aspectos, la presente invención proporciona un agente de la invención para uso en un procedimiento para tratar un trastorno ocular que se describe en esta invención. En estos aspectos, el "agente de la invención" comprende compuestos útiles tanto para monoterapia como para terapia de combinación (por ejemplo, como agente terapéutico adicional).
En algunos aspectos, la invención se refiere a un agente de la invención para uso en un procedimiento para tratar un trastorno ocular en un sujeto en necesidad del mismo, donde el sujeto tiene un aumento o disminución de la expresión o actividad de uno o más de CD64, IDO, SOCS1, CXCL10 Marco, Socs3, NOS2, IL12B, Ptgs2 (Cox2), Il23a (IL23p19) e Ido1.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene un aumento o disminución de la expresión o actividad de uno o más de MRC1, TGM2, CD23, CCL22 Relma (Fizz1, Retnla), Socs2, Irf4, Chia (AMCase), Chi3l1 (Gp39, Ykl40), Chi3L2 (Ykl39), Chi3l3
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(Ym1), Cxcl13, Ccl12, Ccl24 y Klf4.
En algunas realizaciones, el sujeto tiene un aumento o disminución de la expresión o actividad de uno o más de Ccl5, CD163, Cx3Cr1, Faslg, Gfap, Csf2, Icam1, Ifng, Il10, Il12b, Il13, Il17a, Il18, Il1b, Il22, Il4, Il6, Klf4, Mrc1, Myd88, Nlrp3, Nos2, Ppary, Tgfb1, Tlr4, Tnf, Vcam1, Ccl2, Ccl5, Ccl7, Ccr2, Socs1, Socs3, Stat1, Stat3 y Stat6. En algunas realizaciones, el sujeto tiene un aumento o disminución de la expresión o actividad de uno o más de Myd88, Klf4, Nlrp3, Ccl2, Ccl5, Ccl7, Socs1, Socs3, Stat1, Stat3 y Stat6.
En algunas realizaciones, bindarit lleva a la expresión génica diferencial de cualquiera de los siguientes, directa o indirectamente, Ccl5, CD163, Cx3Cr1, Faslg, Gfap, Csf2, Icam1, Ifng, Il10, Il12b, 1113, Il17a, 1118, Il1b, 1122, 114, 116, Klf4, Mrc1, Myd88, Nlrp3, Nos2, Ppary, Tgfb1, Tlr4, Tnf, Vcam1, Ccl2, Ccl5, Ccl7, Ccr2, Socs1, Socs3, Stat1, Stat3 y Stat6, opcionalmente en macrófagos o RPE directamente. En algunas realizaciones, bindarit modula NFkB.
En algunas realizaciones, el sujeto no está en tratamiento con y/o no responde a una o más de un anticuerpo antifactor D (por ejemplo lampalizumab (Genentech)), un anticuerpo anti-p-amiloide (anti-Ap) (por ejemplo GSK933776 (GSK)), un corticosteroide (por ejemplo, acetónido de fluocinolona), m C-1101 (MacuCLEAR), una terapia con células madre CD34+, un anticuerpo anti-VEGF (por ejemplo Ranibizumab), brimonidina (Alphagan), un anticuerpo de complemento anti-C5 (por ejemplo LFG316 (Novartis), doxiciclina (ORACEA), emixustat clorhidrato, sirolimus (RAPAMUNE), y acetato de glatiramer (COPAXONE). En algunas realizaciones, el sujeto tiene evidencia de AMD como se confirma por la presencia de al menos 1 drusa mayor que aproximadamente 125 pm de diámetro. En algunas realizaciones, el sujeto no tiene evidencia de neovascularización coroidea anterior o activa (CNV). En algunas realizaciones, el sujeto tiene una o más lesiones GA bien demarcadas de un área total de aproximadamente 2 a aproximadamente 2o mm2 en uno o más ojos. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una puntuación de mejor agudeza visual corregida de más de aproximadamente 35 letras o un equivalente de Snellen VA de alrededor 20/200 o mejor.
Una evaluación de cualquiera de los tratamientos descritos en esta invención pueden comprender imágenes ópticas, incluyendo, a modo de ejemplo no limitante, cSLO, FAF, OCT (incluso con visualización transversal, tridimensional y en face), SD-OCT (con visualización transversal, tridimensional y en face) u otras modalidades de imágenes que incluyen otras longitudes de onda de fluorescencia (por ejemplo, longitudes de onda que van del azul al infrarrojo, por ejemplo, 390 nm a 1 mm, que incluyen, por ejemplo, luz azul, luz blanca, luz aneritra, infrarrojo cercano o infrarrojo).
Sujetos y/o Animales
En algunas realizaciones, el sujeto y/o animal es un mamífero, por ejemplo, un ser humano, un ratón, una rata, un conejillo de indias, un perro, un gato, un caballo, una vaca, un cerdo, un conejo, una oveja o un primate no humano, como un mono, chimpancé o babuino. En otras realizaciones, el sujeto y/o animal no es un mamífero, tal como, por ejemplo, un pez cebra. En algunas realizaciones, el sujeto y/o animal puede comprender células marcadas con fluorescencia (con, por ejemplo, GFP). En algunas realizaciones, el sujeto y/o animal es un animal transgénico que comprende una célula fluorescente, tal como, por ejemplo, una célula del RPE y/o una célula inmune. En algunas realizaciones, el sujeto y/o animal es un ser humano. En algunas realizaciones, el ser humano es un ser humano pediátrico. En otras realizaciones, el ser humano es un ser humano adulto. En otras realizaciones, el ser humano es un ser humano geriátrico. En otras realizaciones, se puede hacer referencia al ser humano como un paciente.
En ciertas realizaciones, el ser humano tiene una edad en el intervalo de aproximadamente 0 meses a aproximadamente 6 meses, de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 meses, de aproximadamente 6 a aproximadamente 18 meses, de aproximadamente 18 a aproximadamente 36 meses, de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 años, de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 años, de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 años, de aproximadamente 15 a aproximadamente 20 años, de aproximadamente 20 a aproximadamente 25 años, de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 años, de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 años, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 años, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 años, de aproximadamente 45 a aproximadamente 50 años, de aproximadamente 50 a aproximadamente 55 años, de aproximadamente 55 a aproximadamente 60 años, de aproximadamente 60 a aproximadamente 65 años, de aproximadamente 65 a aproximadamente 70 años, de aproximadamente 70 a aproximadamente 75 años, de aproximadamente 75 a aproximadamente 80 años, de aproximadamente 80 a aproximadamente 85 años, de aproximadamente 85 a aproximadamente 90 años, de aproximadamente 90 a aproximadamente 95 años o de aproximadamente 95 a aproximadamente 100 años.
En otras realizaciones, el sujeto es un animal no humano y, por lo tanto, la invención se refiere al uso veterinario. En una realización específica, el animal no humano es una mascota doméstica. En otra realización específica, el animal no humano es un animal de ganadería.
En diversas realizaciones, el ojo de un sujeto y/o animal comprende (i) un compuesto fluorescente en una cantidad
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efectiva para indicar la presencia de un trastorno ocular en el sujeto y/o animal y (ii) una toxina en una cantidad efectiva para inducir atrofia del tejido ocular. En algunas realizaciones, a este sujeto y/o animal se administra un agente de la invención o no se administra un agente de la invención.
En diversas realizaciones, el RPE y células inmunes son evaluadas y/o efectuadas. En algunas realizaciones, las células inmunes incluyen células del sistema inmune innato de un sujeto y/o animal. En algunas realizaciones, tales células incluyen, pero no se limitan a, macrófagos, monocitos y células microgliales. En diversas realizaciones, la invención posibilita la detección de una presencia, la detección de una ausencia, o la medición de una cantidad de células inmunes en el ojo de un sujeto y/o animal.
Esta invención se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos. Los ejemplos que caen fuera del alcance de las reivindicaciones se proporcionan solo con fines ilustrativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Inyección sistémica de la Toxina RPE, NaIO3 Induce Patrones Complejos de FAF Similares a los de AMD y/o RPD
La toxina RPE, yodato de sodio (NaIO3) Generó pérdida irregular de RPE y DNIRA hipofluorescente, en un ojo de rata similar a la atrofia geográfica (GA). Este modelo no solo desarrolló atrofia del RPE, sino que reprodujo fielmente patrones complejos de FAF asociados a enfermedad clínica agresiva, muy parecidos a la AMD seca avanzada, RPD y las formas de goteo difuso de la AMD seca.
Materiales: ICG (Cardiogreen), yodato de sodio, Harris hematoxilina y eosina, eran de Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canadá). La tropicamida, 0,8 %, en solución de clorhidrato de fenilefrina (Diofenil-T) al 5 % fue de Sandoz Canada Inc (Boucherville, QC, Canadá) y las gotas oculares lubricantes GenTeal fueron de Novartis Pharmaceuticals Canada Inc (Dorval, QC, Canadá). El paraformaldehído, al 32 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS), fue de Electron Microscopy Sciences (Hatfield, PA). El anticuerpo anti-rata de ratón CD68 fue de AbD Serotec (Oxford, Reino Unido), y la IgG de ratón fue de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EE.UU.). Anti-lba-1 de conejo fue de Wako Pure Chemical Industries Ltd (Osaka, Japón). El anticuerpo secundario anti-ratón de cabra fluorescente marcado con Alexa, Conjugados de Isolectina IB4 y tinción de ácido nucleico TO-PRO-3 fueron de Invitrogen (Camarillo, CA, EE.UU.). El medio de preparación fluorescente Dako fue de Dako North America (Burlington, ON, Canadá).
Procedimientos con animales: todos los procedimientos se realizaron según el Consejo Canadiense para el Cuidado de los Animales y con el cumplimiento de la Declaración ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftalmológica y de la Visión. Para todos los experimentos, las ratas Sprague Dawley (SD) de 6-10 semanas de edad se mantuvieron en un ciclo oscuro/claro de 12 horas, con comida y agua adlibitum. Para la evaluación, las ratas fueron anestesiadas con ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg / kg), y las pupilas dilatadas con Diofenil-T. Los ojos se acondicionaron usando gotas lubricantes para los ojos GenTeal. Los animales se sacrificaron con humanidad mediante inyección intracardiaca de T61 (Intervet Canada, Whitby, Canadá), bien tras una única sesión de obtención de imágenes, bien tras la obtención de imágenes en serie.
El yodato de sodio (solución al 45 %) se preparó fresco para cada conjunto de experimentos en cloruro de sodio al 0,9 % y se inyectó a una concentración final de 45 mg/kg de peso corporal. Se evaluaron 192 ojos en total.
Las imágenes de fondo de ojo se realizaron utilizando un oftalmoscopio láser de barrido confocal disponible en el mercado (cSLO, Spectralis, Heidelberg Retinal Angiography, HRA-II; Heidelberg Engineering GmbH, Alemania), y el sistema Eye Explorer Image Capture, versión 1.1.10. Las imágenes se capturaron a una longitud de onda de 488 nm de excitación con filtro barrera de 500 nm para angiografía con fluoresceína, sin filtro barrera para la obtención de imágenes con luz aneritra (RF, verde dominante), a 795/810 nm de excitación/emisión para angiografía con ICG y con un láser de 830 nm para obtención de imágenes mediante reflectancia en el infrarrojo.
Para evaluar la FAF a 488 nm, se obtuvieron imágenes cSLO en ausencia de colorante fluoresceína. No se administró fluoresceína en la referencia ni en ningún momento durante cada estudio. En los casos en que era necesario obtener una imagen simultánea de la vasculatura y proporcionar puntos de referencia para el análisis de imágenes FAF, se inyectó ICG a través de la vena caudal, a 2 mg/kg o 5 mg/kg, en un catéter de la vena caudal de calibre 23 previamente insertado. En un pequeño número de situaciones claramente indicadas, como la caracterización inicial del modelo, se proporcionó fluoresceína dextrano (200 kD) por vía intravenosa. Los resultados de estos últimos estudios usando angiografía con fluoresceína se realizaron en un subgrupo de animales y no se incluyeron en el análisis de FAF.
Las imágenes de fondo de ojo se obtuvieron rutinariamente al inicio del estudio (día 0, es decir, antes de la inyección sistémica de NaIO3), y en los días 3 o 4 (3/4), días 7 u 8 (7/8) y días 13 o 14 (13/14) después de NaIO3. Además, para la caracterización inicial del modelo, las imágenes se adquirieron a las 24 horas después de NaIO3, a los 21 a 28 días
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y a los 88 días (3 meses). Cuando fue posible, las imágenes compuestas consistieron en al menos nueve imágenes tomadas en el siguiente orden: cabeza del nervio óptico, superior derecha, derecha, inferior derecha, inferior, inferior izquierda, izquierda, superior izquierda y los campos superiores. En algunos casos, se obtuvo un segundo o tercer anillo completo o parcial de imágenes de forma más periférica, habitualmente mediante realineación del animal con respecto a la cSLO según fuera necesario. Por el contrario, en otros casos, en los que no se podían capturar las nueve imágenes completas, se generó una imagen compuesta parcial.
Se obtuvieron imágenes OCT de dominio espectral de alta resolución (Envisu R2200 VHR Animal SDOIS System, Bioptogen, USA). Los barridos se obtuvieron a una velocidad de 36.000 por segundo, con una resolución lateral de aproximadamente 2,8 pm al nivel de la retina.
Análisis de Tejidos: La histología de hematoxilina y eosina (H&E) del tejido embebido en parafina se realizó como se conoce en la técnica después de fijación con el fijador de Davidson. Las secciones embebidas en parafina se visualizaron con un microscopio vertical Nikon E800. Se siguió el procedimiento de desparafinación y rehidratación como en el procesamiento de tejido H&E.
Para la inmunohistoquímica, las secciones se bloquearon en BSA al 5 % en TBS a temperatura ambiente y se incubaron durante la noche con anticuerpo anti-CD68 a 4°C con agitación suave. Después de enjuagarlas, las muestras se incubaron con anticuerpo secundario durante 2 horas a temperatura ambiente y se volvieron a lavar. Para el control negativo se usó IgG de las mismas especies a concentraciones molares máximas equivalentes a las del anticuerpo primario. Los núcleos se contratiñeron con TO-PRO-3.
Microscopía Confocal y Fluorescente: las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio fluorescente confocal TCS SL (Leica Microsystems, GmbH, Wetzlar, Alemania), y las imágenes capturadas y analizadas con el software Leica Confocal. Un microscopio epifluorescente vertical (Olympus BX50) también se usó para ver las señales autofluorescentes de las células bajo luz de longitud de onda de 488 nm. Las reconstrucciones en 3D de secciones z en serie confocales se realizaron utilizando el software Imaris versión 7.4.2 (Bitplane).
Las imágenes FAF y angiográficas in vivo del ojo de rata Sprague Dawley normal produjeron un tenue brillo homogéneo de vidrio deslustrado interrumpido por vasos sanguíneos de la retina dispuestos radialmente que bloquean la fluorescencia del RPE y, por lo tanto, aparecen oscuros, y por un círculo hipofluorescente central en la cabeza del nervio óptico (ONH), donde RPE está ausente (figuras 1A-D). Tres días después de la inyección sistémica de NaIO3, apareció un área única de FAF iso- o ligeramente hiperfluorescente con bordes hiperfluorescentes, y tomó la forma de una isla discreta, sector o anillo de 360° (figuras 1A-D). Las islas o sectores están ubicados de manera consistente inferior a la ONH o en la hemirretina inferior (figuras 1A-D). Cuando está presente un anillo de 360°, habitualmente abarca gran parte del fondo del ojo, con un borde adyacente, que rodea a la ONH, y el otro en la periferia de media a lejana de la retina. Grandes anillos de 360° fueron la forma más comúnmente observada, ocurriendo en 102/110 (93 %) de los ojos tratados con yodato de sodio (figura 2A-D). En todos los casos, las islas, sectores o anillos se acercaron a la ONH, pero no fueron contiguos a ella (figuras 1A-D-3A-C). Estas y las siguientes observaciones se confirmaron en más de 160 ojos.
Comenzando aproximadamente 4-5 días después de la inyección de NaIO3, apareció un patrón reticular o curvilíneo marcado de FAF hiper/hipo-fluorescente alternante dentro de las islas, sectores o anillos (figuras 1A-D). Para el día 7, este patrón era pronunciado. En lesiones pequeñas, llenaba completamente la isla o el sector y emergía rápidamente. En grandes anillos de 360°, al principio se pronunció en los bordes proximales y distales y continuó emergiendo durante las próximas semanas, por lo que sus componentes curvilíneos contribuyeron a patrones de FAF con lazos parciales, óvalos, círculos, rosetones y patrones festoneados o en forma de "huella de pata de animal" (figuras 2A-D). En algunas regiones, las formas curvilíneas, redondas u ovales confluyen y parecen más oscuras que las áreas circundantes, con aspecto de parches homogéneos de color gris oscuro de FAF hipofluorescente. Con el tiempo, el patrón reticular hiperfluorescente maduró in situ, volviéndose más granular y menos suavemente curvilíneo (figuras 2A-D). Sin embargo, incluso tan tarde como a las 20 semanas, el último punto en el tiempo analizado, los bordes retenían su patrón reticular hiperfluorescente y seguían avanzando hacia la periferia de la retina.
La angiografía con fluoresceína realizada en un subconjunto de animales confirmó que el patrón reticular no se corresponde con la vasculatura de la retina o coroidea (tener en cuenta que la fluoresceína-dextrano, un colorante de 488 nm, no se administró a animales que se sometieron a imágenes FAF, a menos que sea indicado) (figuras 1A-D). Sin embargo, la angiografía ICG reveló un cambio de permeabilidad que ocurrió en la interfaz coroides-retina, a través del RPE y la BM, aproximadamente dos o tres días después del NaIO3 que coincide, tanto espacial como temporalmente, con la aparición de las islas, sectores de anillos de FAF (figuras 1A-D). Este aumento de permeabilidad fue transitorio y se resolvió en el Día 7, el siguiente momento temporal evaluado de forma rutinaria. Los vasos de la retina no presentaron fugas. En el modelo de NaIO3, La tinción con H&E confirma que se acumula fluido en el espacio subretiniano. Esto también se observó mediante OCT de ultra alta resolución in vivo.
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Para determinar el correlato patológico del patrón FAF observado in vivo, se observaron preparaciones completas de retina extirpada a bajo aumento bajo luz blanca y mediante microscopía epifluorescente a 488 nm, la misma longitud de onda utilizada para la obtención de imágenes in vivo, sin marcación IHC fluorescente. Dependiendo de los análisis de tejido posteriores, se usaron dos microscopios para este fin: un dispositivo epifluorescente con una estrecha ventana de excitación/emisión (488/520 nm), y el sistema de visualización invertido Leica DM IRE2 de un microscopio confocal con una lámpara de arco de mercurio y un filtro de paso largo (mejor que pasa-banda) que proporcionaba fluorescencia a partir de más de 515 nm tras la excitación con una banda de 450-490 nm. Bajo luz blanca, la retina normal de rata parece bastante homogénea en todas partes, con cierta deformación artificial (figura 3A). Por el contrario, un sutil patrón reticular fino blancuzco se hace evidente en las muestras obtenidas 7 días después de la inyección de NaIO3. Para el día 14, este patrón es más evidente y se ve que corresponde con pequeños pliegues de la retina externa que se ilustran mejor en el borde cortado de la retina (figura 3B). Si se visualiza bajo luz fluorescente de 488 nm, este mismo patrón curvilíneo es evidente. Aunque es evidente para el día 7 después de la inyección, el aumento de la autofluorescencia hace que este patrón sea más visible para el Día 14 (figura 3C). Utilizando microscopía epifluorescente de mayor aumento, se demostró que este patrón curvilíneo de encaje coincide con la distribución espacial de las células autofluorescentes que parecen alinearse con los surcos o pliegues de la retina externa (figuras 3A-C).
La figura 4A-C muestra una comparación de las características clínicas de RPD con los hallazgos de tejido en el modelo con NaIO3. Además de las imágenes clínicas de OCT del paciente con RPD (que muestran una estructura piramidal con la base hacia abajo en el espacio subretiniano), se obtuvieron imágenes de fondo de ojo en colores y con luz aneritra (figura 4A-C). Las imágenes aneritras mostraron pequeñas manchas oscuras que constituyen pseudodrusas individuales del RPD (figura 4A , imagen superior). Estas se identificaron usando solapamiento gris oscuro. Además, destacamos, circunscritas por círculos, la presencia de las denominadas "lesiones diana" que caracterizan el RPD. Estas tienen el aspecto de manchas oscuras con centros más claros. Paralelamente, una ilustración esquemática de la retina externa plegada de rata, tanto en face como en la sección transversal que, cuando se colorea falsamente y se presenta como imágenes en blanco y negro, tanto "positivas" como "negativas", parece correlacionarse directamente con lesiones tipo diana y halos de RPD. En conjunto, estos datos sugieren que los patrones 2D de pseudodrusas oscuras dentro de un patrón de encaje o reticular de círculos, halos y lesión en diana con centros oscuros vistos en face, en 2D, corresponden con anillos y cráteres elevados, considerados volumétricamente, en 3D. La matriz inter-pseudodrusas consiste en bandas de inflamación subretiniana persistente que, cuando se observan en secciones transversales mediante OCT tienen aspecto de pirámides o puntas. La retina externa perdida entre estas estructuras parece oscura. Esto sitúa las pseudodrusas definidas mediante OCT adyacentes a los parches oscuros de RPD. Sin pretender imponer ninguna teoría, esta correlación con la deformidad estructural de la retina explica aún más por qué el RPD se puede visualizar en varias modalidades de imagen y no se limita a una longitud de onda particular, como 488 nm, solo como ocurriría si la señal fuera dependiente de fluoróforo.
Ejemplo 2: DNIRA de un Ojo de Rata Después de Adm inistración Sistémica de ICG Identifica la Capa del Epitelio Pigmentario de la Retina (RPE) In Vivo
Está demostrado que un colorante infrarrojo cercano, ICG, puede marcar el RPE/retina externa después de inyección sistémica y así mejorar la detección del RPE y atrofia del RPE. El cambio observado en DNIRA usando filtros de excitación/emisión de ICG es útil, en lugar de FAF, en modelos de enfermedad para identificar áreas de pérdida de RPE/retina externa.
El colorante ICG, o PBS, se inyectó sistémicamente en 46 ratas Sprague Dawley a dosis de 0,35 y 5,0 mg/kg, y el fondo de ojo se evaluó in vivo usando oftalmoscopia láser de barrido confocal (cSLO), con filtros de excitación/emisión de 795/810 nm en posición, antes de la inyección, y en los días 2, 7 y 21 a partir de entonces. Se realizó electrorretinografía (ERG) para evaluar la toxicidad potencial. En un subgrupo de animales, se inyectó una toxina del RPE para inducir pérdida o daño del RPE.
Específicamente, para los estudios en animales, los animales se manejaron según las pautas de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso humano de animales en la investigación oftálmica, y según las pautas del Comité de Cuidado de Animales del Hospital St. Michael. 46 ratas Sprague Dawley (SD) de 6-10 semanas de edad, con un peso de 200-300 g se mantuvieron en un ciclo oscuro/claro de 12 horas, con comida y agua ad libitum. Los animales se anestesiaron con una combinación de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) y se dilataron sus pupilas con una sola gota de solución de tropicamida al 0,8 % en clorhidrato de fenilefrina al 5 % (Diophenyl-T, Sandoz Canada Inc.). Se aplicaron gotas oculares lubricantes GenTeal (Novartis, Canadá) a la superficie de la córnea en repetidas ocasiones durante todos los procedimientos.
CSLO: Se adquirieron imágenes in vivo utilizando un cSLO disponible comercialmente (Angiografía de la Retina de Heidelberg, HRA-2, Heidelberg Engineering, Alemania). Se obtuvieron imágenes en el canal aneritro, FAF (excitación/emisión a 488/500 nm), NIR (830 nm) y canal ICG (excitación/emisión a 795/810 nm).
Angiografía con ICG y Fluoresceína: El colorante ICG (Cardiogreen, Sigma, Cat # I2633) se preparó poco antes de la experimentación hasta una concentración de reserva final de 5,0 mg/ml. Se introdujo un catéter de calibre 23 en la vena caudal y se infundió el colorante ICG en dosis de 0,35 o 5,0 mg/kg. Se tomaron imágenes antes de la inyección (referencia), durante la circulación del colorante y a diversos intervalos hasta 20 minutos. En un subgrupo de animales, se inyectó solución de fluoresceína-dextrano (200 kD) (Sigma, Cat. # FD2000S), con una concentración de 5,0 mg/kg, de forma intravenosa a través del catéter de la vena caudal para conseguir una dosis final de 5,0 mg/kg. La angiografía con ICG y fluoresceína se realizó simultáneamente solo en un subgrupo de animales, en el resto no se inyectó fluoresceína. Se obtuvieron imágenes angiográficas en los canales de iCg y fluoresceína con filtros de excitación y emisión de 488/500 nm y 795/810 nm, respectivamente. Los animales de control recibieron PBS.
DNIRA: Las imágenes de DNIRA se obtuvieron en los días y semanas posteriores a la inyección de ICG utilizando la configuración de angiografía ICG, es decir, con filtros de excitación/emisión, pero sin reinyección de colorante a las 24 horas, 48 horas, 3 días, 7 días, 21 días y 28 días después de la angiografía. No se volvió a realizar angiografía durante el transcurso del estudio.
Administración de Toxina: En un subconjunto de animales (n=7), la toxina RPE NaIO3 (Sigma, Cat # 424064) se inyectó sistémicamente a través de un catéter 23G insertado en la vena caudal a una dosis de 45 mg/kg de peso corporal. En estos animales, la angiografía ICG a 0,3 5mg/kg se llevó a cabo inmediatamente antes de la inyección de NaIO3. DNIRA fue realizado 7 días después de ICG y de la inyección de NaIO3.
Electrorretinografía (ERG): Los animales que recibieron ICG o PBS se evaluaron utilizando el sistema ERG mini-Ganzfeld de Espion (DiagnosysLLC, EE.UU.). Después de la anestesia, los animales se colocaron en una almohadilla térmica eléctricamente silenciosa y se colocaron electrodos de bobina de oro en la superficie de la córnea tras la aplicación de gotas lubricantes GenTeal. Después de un corto tren de destellos tenues (0,01 candela s/m2, 1,0 Hz), una amplitud de onda b escotópica fue evaluada usando un único destello brillante (3 candelas s/m2) que se determinó previamente que produce consistentemente una respuesta cerca de la amplitud máxima de la onda b. Se usó la prueba t de Student para comparar las amplitudes posteriores a la inyección con la referencia (antes de la inyección).
El análisis estadístico utilizó el análisis de regresión ANCOVA.
Se muestran los resultados de cSLO de referencia representativos (pre-ICG) en el ojo de rata Sprague Dawley normal (figuras 5A-H), y se presentan junto con animales tratados con PBS (figura 6A), como controles normales para toda la experimentación. Las imágenes con luz aneritra (es decir, verde dominante) identificaron la cabeza del nervio óptico (ONH) y el vaso sanguíneo radial de la retina (figura 5A). También se observaron niveles bajos de señal endógena a longitudes de onda más largas, en el canal NIR (830 nm), y proporcionaron una imagen similar de la ONH y la vasculatura con algunas imágenes potenciales de los vasos coroideos más profundos que surgen debido a la penetración de luz más profundamente. (figura 5B). Según estudios en humanos, FAF apareció como un tenue brillo de vidrio deslustrado que carece de detalles, y está oscurecido por los vasos sanguíneos radiales de la retina y está ausente en la ONH (figura 5C). Sin embargo, este brillo difuso es muy débil.
Por el contrario, con los filtros de excitación/emisión NIR en posición, así como para la angiografía ICG, no se observó ninguna señal ni señal insignificante en el ojo antes de la inyección de ICG (figura 5D). Las líneas de barrido eran evidentes y la vasculatura era apenas detectable o no era detectable. Esto se observó en más de 60 ojos. Inmediatamente después de la inyección de ICG, los vasos de la retina y coroideos fueron identificados (figura 5F y figura 5G segundo panel) durante la fase de tránsito y fuera del punto final experimental, 20 minutos más tarde. La angiografía con fluoresceína también confirmó la vasculatura normal de la retina. (figura 5E). En los animales SD de tipo salvaje, no se vio ninguna fuga desde ningún lecho vascular usando ambos fluoróforos.
Aunque las imágenes de referencia antes de la angiografía ICG no exhibían señal bajo estimulación NIR en presencia de los filtros de excitación/emisión ICG, las imágenes obtenidas a los 3, 8, 21 y 28 días después de una inyección única de ICG en el día 0 (t=0) demostró una fluorescencia retardada y persistente (figura 5G). Esto no se observó en experimentos similares realizados después de una angiografía con colorante de fluoresceína-dextrano y analizados con los filtros de angiografía con fluoresceína en posición (figura 5H), donde el mismo nivel de fluorescencia baja pre­ inyección es visible durante el transcurso del tiempo de investigación. Esto tampoco ocurrió en ausencia de inyección previa de ICG (figura 6A). El análisis cualitativo de esta fluorescencia NIR retrasada después de ICG mostró un patrón "mosaico" de pequeñas motas en el polo posterior que, visto en face, son profundas (externas) a los vasos de la retina y oscurecen la vista de la vasculatura coroidea, lo que sugiere su ubicación entre la retina y la coroides. La ONH y el área circumpapilar no exhibieron fluorescencia. Estas características son similares a las de FAF realizado en pacientes en el espectro azul. Se determinó que el mismo plano de foco es óptimo para ambas técnicas de fluorescencia.
Las observaciones realizadas con DNIRA después de la inyección de ICG fueron dependientes de dosis (figura 6A-D). Cuanta más alta la dosificación inicial de ICG usada para la angiografía, más brillante era la señal en el NIR. La dosis alta, 5 mg/kg, requirió que la ganancia (sensibilidad) del cSLO se redujera para obtener imágenes de calidad
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adecuada, mientras que la dosis baja (0,35 mg/kg) fue menos brillante, y requirió que se aumentara la ganancia para obtener Imágenes de calidad adecuada. Imágenes comparativas (figura 6A, figura 6B y figura 6C), tomadas con la ganancia establecida en el mismo nivel, demostraron un aumento del brillo sensible a la dosis. En el mismo experimento, también se determinó que para el día 28 el patrón moteado se desvaneció en los animales que recibieron dosis bajas de ICG (figura 6B). Por el contrario, en animales que recibieron dosis altas de ICG, hubo poca diferencia apreciable entre los días 3 y 28 después de la inyección (figura 6C).
Las imágenes de reflectancia NIR a 830 nm, sin filtros de excitación/emisión de 795/810 nm necesarios para la activación de ICG, no produjeron los resultados de fluorescencia moteada, dependiente de dosis y dependiente del tiempo observados con DNIRa .
Habiendo demostrado que DNIRA identifica el complejo del RPE y/o de la retina externa, se determinó que DNIRA podría usarse para identificar anormalidades estructurales del RPE. DNIRA se utilizó en combinación con la inyección sistémica de la toxina del RPE, NaIO3. NaIO3 es directamente tóxico para las células del RPE y conduce a su pérdida; la apoptosis de los fotorreceptores suprayacentes se produce posteriormente. DNIRA en los días y semanas posteriores a la inyección de NaIO3 identificó parches geográficos (espaciales) de hipofluorescencia profunda, evidentes como grandes parches negros dentro de un fondo continuo de fluorescencia moteada. Estos parches hipofluorescentes estaban unidos mediante un borde definido. Además, con la ganancia de cSLO aumentada, una visualización más brillante a través de estos parches permitió una visualización clara del detalle coroideo (figuras 7A-B). Los vasos coroideos fueron identificados por su complejidad, tamaño variable y patrón no radial con respecto a la ONH. Por el contrario, la capa moteada ocultaba esta vista, pero permitía la visualización en curso de los vasos de la retina suprayacentes. Estos datos fueron consistentes con la noción de que DNIRA detecta la capa del RPE/retina externa marcadas con ICG.
Además, la idoneidad de DNIRA para la experimentación preclínica se demostró con estudios de toxicidad. Se realizó electrorretinografía comparando concentraciones de ICG de dosis sistémicas altas y bajas frente a PBS. Estos datos no mostraron un cambio estadísticamente significativo en la amplitud de la onda b en las tres semanas posteriores a la inyección, en comparación con los cambios observados en los animales de control, y demuestran que DNIRA, en el intervalo de dosis usado, es seguro en estudios preclínicos de enfermedad coriorretiniana. Mientras que la dosis alta es muy superior a la usada clínicamente, la dosis baja es consistente, en gramos/peso corporal, con la dosis usada para la visualización clínica con cámaras tradicionales de fondo de ojo.
Ejemplo 3: El Descubrimiento de Compuestos para el Tratamiento de Trastornos Oculares
Una vez establecido un animal que modela uno o más trastornos oculares, se administra un compuesto de prueba a dicho animal.
La presentación del trastorno ocular se determina utilizando imágenes in vivo, incluida la detección por fluorescencia. Un compuesto candidato se identifica observando fluorescencia en el ojo en o después de un tiempo suficiente para presentar las características de un trastorno ocular. El compuesto candidato se evalúa por su capacidad de reducir o eliminar las características del trastorno ocular como se describe en esta invención.
Ejemplo 4: Evaluación de la Actividad de los Compuestos para el Trastorno Ocular
Una vez desarrollado un animal que modele un trastorno ocular, se administra un compuesto candidato a dicho animal.
La presentación de la enfermedad del trastorno ocular se determina utilizando imágenes in vivo, incluida la detección por fluorescencia. La actividad de un compuesto candidato se evalúa observando fluorescencia en el ojo en o después de un tiempo suficiente para presentar las características de una enfermedad de trastorno ocular y la actividad de un compuesto candidato. El compuesto candidato puede ser evaluado por su capacidad de reducir o eliminar las características del trastorno ocular como se describe en esta invención.
Ejemplo 5: Tratamiento de AMD Seco con Bindarit
Sujetos humanos, de 56 a 100 años de edad o más, que presentan AMD seca, según diagnosticados por una o más de las siguientes pruebas clínicas: examen clínico, FAF (en cualquier longitud de onda), fotografía de infrarrojo cercano y/o con luz aneritra, angiografía con fluoresceína, que permite la identificación y localización de procesos vasculares anormales; OCT, que proporciona imágenes de alta resolución, en sección transversal o en face en medios de dispersión óptica, como la retina humana y la coroides; y microscopía de iluminación estructurada, usando una configuración de microscopio de alta resolución especialmente diseñada para resolver la distribución fluorescente de pequeñas estructuras autofluorescentes (lipofuscina granulada) en secciones de tejido del epitelio pigmentario de la retina.
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Los sujetos reciben bindarit en dos dosis orales de 300 mg (o hasta 1200 mg) una vez al día durante 12 semanas. Tras un periodo de tratamiento inicial de doce semanas, los resultados clínicos de los sujetos fueron evaluados. De forma alternativa, los pacientes recibieron inyección intravítrea de un vehículo que contenía bindarit, con o sin un vehículo de administración del fármaco.
Un primer resultado clínico se determina utilizando una prueba de agudeza visual estándar, como es bien conocido en la técnica. Los sujetos se evaluaron para la capacidad de ver claramente símbolos y objetos en un gráfico de ojo Snellen a distancia.
Un segundo resultado clínico evalúa la tasa de progresión de la atrofia geográfica. Para ello, se dilataron las pupilas de los sujetos con tropicamida al 1,0 % y fenilefrina al 2,5 % antes de la obtención de imágenes de la retina. Las imágenes se obtuvieron con un instrumento (por ejemplo, Spectralis HRA+OCT; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania) que permite la grabación simultánea de cSLO y tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) con dos espejos de barrido independientes, como se describe en Helb, y col. Acta Ophthalmol. 2010 Dic; 88(8):842-9. Se emplearon cinco modos de operación: luz blanca, luz aneritra, infrarrojo cercano, FAF y OCT.
Un tercer resultado clínico evalúa la tasa de cambio de DNIRA hipofluorescente (cuantificada por el área de hiporfluorescencia). Para ello, se dilataron las pupilas de los sujetos con filefrina al 1,0 % y 2,5 % antes de la obtención de imágenes de la retina. Las imágenes se obtienen con un instrumento (que puede utilizar metodología de barrido confocal o una cámara de fondo de ojo modificada con los filtros de excitación y emisión adecuados en el lugar, con o sin la capacidad de realizar angiografía) y se producen antes de la inyección de ICG (referencia), y de nuevo en los días después de la inyección de colorante sin más inyección de un colorante, pero con filtros de excitación/emisión en posición.
Un cuarto resultado clínico evalúa el cambio en el número y ubicación de puntos DNIRA hiperfluorescentes. Para ello, se dilataron las pupilas de los sujetos con filefrina al 1,0 % y 2,5 % antes de la obtención de imágenes de la retina. Las imágenes se obtienen con un instrumento (que puede utilizar metodología de barrido confocal o una cámara de fondo de ojo modificada con los filtros de excitación y emisión adecuados en el lugar, con o sin la capacidad de realizar angiografía) y se producen antes de la inyección de ICG (referencia), y de nuevo en los días después de la inyección de colorante sin más inyección de un colorante, pero con filtros de excitación/emisión en posición.
Las imágenes de cSLO se obtienen según un protocolo de operación estandarizado que incluye la adquisición de imágenes de reflectancia infrarroja cercana (A = 815 nm) y FAF (excitación a A = 488 nm, emisión 500-700 nm). Regiones de FAF hipofluorescente (oscuro) se miden y se comparan con mediciones similares en el tiempo. El aumento es el tamaño del FAF hipofluorescente es una medida de la tasa de progresión del GA. Alternativamente, las áreas de GA, y su cambio con el tiempo, pueden calcularse a partir de reconstrucciones en face de imágenes SD-OCT, llevadas a cabo por ejemplo con una longitud de onda de iluminación de 870 nm, una velocidad de adquisición de 40.000 A-scans, y una profundidad de barrido de 1,8 mm. Dos barridos SD-OCT, uno vertical y uno horizontal, por ojo, se realizan a través del centro foveal aproximado, o en el caso de RPD, en la proximidad de las arcadas vasculares de la mácula. Se realizó angiografía con fluoresceína (A = 488 nm, emisión 500-700 nm, 10 % de colorante fluoresceína) según necesario. Se obtuvieron fotografías en colores del fondo de ojo con una cámara de fondo de ojo (por ejemplo, FF 450 Visupac ZK5; Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Alemania).
Interpretación de datos de resultados clínicos informa una decisión para un tratamiento adicional, si corresponde.
Ejemplo 6: Tratamiento de AMD Seco con Terapia de Combinación
Sujetos humanos, de 56 a 100 años de edad o más, presentan AMD seca, según lo diagnosticado por una o más de las siguientes pruebas clínicas: examen clínico, imágenes de fondo de luz blanca, FAF en cualquier longitud de onda, fotografía en el infrarrojo cercano y/o con luz aneritra, iluminación con luz azul, y/o fluoresceína o angiografía ICG, que permite la identificación y localización de procesos vasculares anormales; o Ct , que proporciona imágenes de alta resolución, transversales, tridimensionales y en face desde dentro de medios de dispersión óptica, como la retina humana y la coroides; y microscopía de iluminación estructurada, utilizando un microscopio u oftalmoscopio de alta resolución especialmente diseñado para resolver la distribución de pequeñas estructuras autofluorescentes (lipofuscina, similares a lipofuscina u otros gránulos) en el epitelio pigmentario de la retina u otras células y capas celulares.
Los sujetos reciben bindarit, mediante un ejemplo no limitativo, en dos dosis orales de 300 mg (o hasta 1200 mg) una vez al día durante 12 semanas. También se administró a los sujetos una inyección de ranibizumab al mes (aproximadamente 28 días) en una dosis de 0,5 mg por ojo afectado. Tras un periodo de tratamiento inicial de doce semanas, los resultados clínicos de los sujetos fueron evaluados. Bindarit también se puede administrar a través de cualquiera de las vías oculares descritas en esta invención (por ejemplo, por vía intravítrea).
Alternativamente, los sujetos reciben bindarit, mediante un ejemplo no limitativo, en dos dosis orales de 300 mg (o hasta 1200 mg) una vez al día durante 12 semanas. Los sujetos también reciben una inyección de lampalizumab una vez cada 4-6 semanas en una dosis de aproximadamente 10 mg por ojo afectado. Tras un periodo de tratamiento inicial de doce semanas, los resultados clínicos de los sujetos fueron evaluados. Bindarit también se puede administrar a través de cualquiera de las vías oculares descritas en esta invención (por ejemplo, por vía intravítrea).
Un primer resultado clínico se determina utilizando una prueba de agudeza visual estándar, como es bien conocido en la técnica. Los sujetos se evaluaron para la capacidad de ver claramente símbolos y objetos en una tabla optométrica Snellen a distancia.
Un segundo resultado clínico evalúa la tasa de progresión de la atrofia geográfica. Para ello, se dilataron las pupilas de los sujetos con tropicamida al 1,0 % y fenilefrina al 2,5 % o un agente comparable antes de la obtención de imágenes de la retina. Las imágenes se obtuvieron con un instrumento (por ejemplo, Spectralis HRA+OCT; Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania) que permite la grabación simultánea de cSLO y SD-OCT, como se describe en Helb, y col. Acta Ophthalmol. 2010 Dic; 88(8):842-9. Se pueden emplear múltiples modos de operación: luz blanca, luz aneritra, luz azul, infrarrojo cercano y OCT. Se pueden realizar análisis similares con una cámara de fondo de ojo modificada.
Un tercer resultado clínico evalúa la tasa de cambio de DNIRA hipofluorescente (cuantificada por el área de hiporfluorescencia). Para ello, se dilataron las pupilas de los sujetos con filefrina al 1,0 % y 2,5 % antes de la obtención de imágenes de la retina. Las imágenes se obtienen con un instrumento (que puede utilizar metodología de barrido confocal o una cámara de fondo de ojo modificada con los filtros de excitación y emisión adecuados en el lugar, con o sin la capacidad de realizar angiografía) y se producen antes de la inyección de ICG (referencia), y de nuevo en los días después de la inyección de colorante sin más inyección de un colorante, pero con filtros de excitación/emisión en posición.
Un cuarto resultado clínico evalúa el cambio en el número y ubicación de puntos DNIRA hiperfluorescentes. Para ello, se dilataron las pupilas de los sujetos con filefrina al 1,0 % y 2,5 % antes de la obtención de imágenes de la retina. Las imágenes se obtienen con un instrumento (que puede utilizar metodología de barrido confocal o una cámara de fondo de ojo modificada con los filtros de excitación y emisión adecuados en el lugar, con o sin la capacidad de realizar angiografía) y se producen antes de la inyección de ICG (referencia), y de nuevo en los días después de la inyección de colorante sin más inyección de un colorante, pero con filtros de excitación/emisión en posición.
Las imágenes de cSLO se obtienen según protocolos conocidos en la técnica que incluyen la adquisición de imágenes de reflectancia infrarroja cercana (A = 800-1000 nm) y FAF (excitación a A = 280-550 nm, emisión 350-700 nm). Regiones de FAF hipofluorescente (oscuro) se miden y se comparan con mediciones similares en el tiempo. El aumento es el tamaño del FAF hipofluorescente es una medida de la tasa de progresión del GA. Alternativamente, las áreas de GA, y su cambio con el tiempo, pueden calcularse a partir de reconstrucciones en face de imágenes SD-OCT, llevadas a cabo por ejemplo con una longitud de onda de iluminación de 870 nm, una velocidad de adquisición de 40.000 A-scans, y una profundidad de barrido de 1,8 mm. Dos barridos SD-OCT, uno vertical y uno horizontal, por ojo, se realizan a través del centro foveal aproximado, o en el caso de RPD, en la proximidad de las arcadas vasculares de la mácula. Se realizó angiografía con fluoresceína (A = 488 nm, emisión 500-700 nm, 10 % de colorante fluoresceína) según necesario. Fotografías del fondo de ojo en colores se obtienen con una cámara de fondo de ojo (porejemplo, FF 450 Visupac ZK5; Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Alemania). Imágenes DNIRA se obtienen según los protocolos descritos aquí, que puede incluir la adquisición de imágenes de referencia de filtros de excitación/emisión de ICG en posición, pero antes de la inyección de un colorante ICG. El colorante ICG, hasta 5 mg, se inyecta por vía intravascular, y la angiografía puede ser o puede no ser realizada. Imágenes DNIRA se obtienen de nuevo con filtros de excitación/emisión de ICG en posición, pero sin más inyección de colorante. Regiones de DNIRA hipofluorescente (oscuro) se miden y se comparan con mediciones similares en el tiempo.
Interpretación de datos de resultados clínicos informa una decisión para un tratamiento adicional, si corresponde. El análisis de datos ilustrativos incluye los análisis del cubo macular y trama de 5 líneas.
Ejemplo 7: Detección y/o Predicción de de una Respuesta de un Sujeto de un Trastorno Ocular a un Agente
Utilizando imágenes multimodales en un ojo de rata, se determinó que la inyección sistémica de la toxina RPE, NaIO3, induce patrones complejos de FAF similares a los de pacientes con formas agresivas de AMD seca y/o RPD. La histología tisular y la microscopía fluorescente ilustraron que los patrones in vivo de FAF se corresponden con la distribución espacial de las células autofluorescentes del sistema inmune innato reclutado a áreas de daño o pérdida de RPE.
Imágenes Multi-modales y Angiográficas In Vivo: Las imágenes de fondo de ojo se realizaron utilizando un oftalmoscopio láser de barrido confocal disponible en el mercado (cSLO, Spectralis, Heidelberg Retinal Angiography,
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HRA-II; Heidelberg Engineering GmbH, Alemania), y el sistema Eye Explorer Image Capture, versión 1.1.10. Las imágenes se capturaron a una longitud de onda de 488 nm de excitación con filtro barrera de 500 nm para angiografía con fluoresceína, sin filtro barrera para la obtención de imágenes con luz aneritra (RF, verde dominante), a 795/810 nm de excitación/emisión para angiografía con ICG y con un láser de 830 nm para obtención de imágenes mediante reflectancia en el infrarrojo. Para evaluar la FAF a 488 nm, se obtuvieron imágenes cSLO en ausencia de colorante fluoresceína. En los casos en que era necesario obtener una imagen simultánea de la vasculatura y proporcionar puntos de referencia para el análisis de imágenes FAF, se inyectó ICG a través de la vena caudal, a 2 mg/kg o 5 mg/kg, en un catéter de la vena caudal de calibre 23 previamente insertado.
Las imágenes FAF del ojo de rata Sprague Dawley normal produjeron un tenue brillo homogéneo de vidrio deslustrado interrumpido por vasos sanguíneos de la retina dispuestos radialmente que bloquean la fluorescencia del RPE y, por lo tanto, aparecen oscuros. Tal obtención de imágenes también se caracterizó por un círculo hipofluorescente central en la cabeza del nervio óptico (ONH), donde no había RPE. Inyecciones sistémicas de NaIO3 (solución al 45 %, preparadas poco antes del uso para cada conjunto de experimentos en cloruro de sodio al 0,9 % e inyectadas a una concentración final de 45 mg/kg de peso corporal) fueron dadas a ratas experimentales. Tres días después de la inyección, apareció un área única de FAF iso- o ligeramente hiperfluorescente con bordes hiperfluorescentes, y tomó la forma de una isla discreta, sector o anillo de 360°. En todos los casos, las islas, sectores o anillos se acercaron a la ONH, pero no fueron contiguos a ella. Estas y las siguientes observaciones se confirmaron en más de 160 ojos.
Comenzando aproximadamente de 4 a 5 días después de la inyección de NaIO3, apareció un patrón reticular o curvilíneo de FAF hiper/hipo-fluorescente alternante dentro de las islas, sectores o anillos. En el día 7, este patrón era pronunciado y siguió apareciendo durante semanas, donde sus componentes curvilíneos contribuyeron a patrones de FAF con lazos parciales, óvalos, círculos, rosetones, festoneados o con forma de "huella de pata de animal". Incluso tan tarde como a las 20 semanas, el último punto en el tiempo analizado, los bordes retenían su patrón reticular hiperfluorescente y seguían avanzando hacia la periferia de la retina.
La angiografía con fluoresceína realizada en un subconjunto de animales confirmó que el patrón reticular no se corresponde con la vasculatura retiniana o coroidea, mientras que la angiografía ICG reveló un cambio de permeabilidad que ocurrió en la interfaz coriorretiniana, a través del RPE y la BM, aproximadamente dos o tres días después del NaIO3 que coincide, tanto espacial como temporalmente, con la aparición de las islas, sectores de anillos de FAF. Este aumento de permeabilidad es transitorio y se resolvió en el día 7, el siguiente momento temporal evaluado de forma rutinaria. Los vasos de la retina no presentan fugas. La histología de hemotoxilina y eosina (H & E) del tejido embebido en parafina y la inmunohistoquímica (IHC) (conocida en la técnica; realizada después de la fijación con, por ejemplo , secciones fijas e embebidas en parafina de Davidson, vistas con un microscopio vertical Nikon E800) confirmaron que hay fluido acumulado en el espacio subretiniano. Esto también se observó mediante OCT de resolución ultra-alta in vivo (se obtuvieron imágenes OCT de dominio espectral de 160 nm de alta resolución utilizando el sistema Envisu R2200 VHR Animal SDOIS, Bioptogen, EE.UU.; los barridos se adquirieron a una velocidad de 36.000 por segundo, con una resolución lateral de aproximadamente 2,8 pm a nivel de la retina).
Análisis Autofluorescente e Inmunofluorescente de Retina Extirpada y RPE: Para determinar el correlato patológico del patrón FAF observado in vivo , se observaron preparaciones completas de retina extirpada a bajo aumento bajo luz blanca y mediante microscopía epifluorescente a 488 nm, la misma longitud de onda utilizada para la obtención de imágenes in vivo , sin marcación IHC fluorescente. Dependiendo de los análisis de tejido posteriores, se usaron dos microscopios para este fin: un dispositivo epifluorescente con una estrecha ventana de excitación/emisión (488/520 nm), y el sistema de visualización invertido Leica DM IRE2 de un microscopio confocal con una lámpara de arco de mercurio y un filtro de paso largo (mejor que pasa-banda) que proporciona fluorescencia a partir de más de 515 nm tras la excitación con una banda de 450-490 nm. Bajo luz blanca, la retina normal de rata parece bastante homogénea en todas partes, con cierta deformación artificial. Por el contrario, un sutil patrón reticular fino blancuzco se hace evidente en las muestras obtenidas 7 días después de la inyección de NaIO3. En el día 14, este patrón era más evidente y se observó que corresponde a pequeños pliegues de la retina externa, que se ilustran mejor en el borde de corte de la retina. Si se visualiza bajo luz fluorescente de 488 nm, este mismo patrón curvilíneo es evidente. Utilizando microscopía epifluorescente de mayor aumento, se demostró que este patrón curvilíneo, de encaje coincide con la distribución espacial de las células autofluorescentes que parecen alinearse con los surcos o pliegues de la retina externa.
Para determinar la identidad de las células autofluorescentes que coinciden con el patrón reticular de FAF, la retina extirpada se tiñó con marcadores del sistema inmune innato, evitando el canal de 488 nm. El Iba1 es un marcador pan-microglial/de macrófagos y, en la retina de rata, los anticuerpos contra él identifican las poblaciones de células fagocíticas principales. Usando este marcador, se descubrió que las células Iba1 están dispuestas en un patrón curvilíneo, de encaje cuando se ven en face en la preparación completa de la retina, es decir, en el plano z. Además, cuando se compara contra tinción nuclear de fotorreceptores, este patrón curvilíneo se ve que yace interpuesto entre pliegues de la ONL deformada. Este patrón de células Iba1 se corresponde con el patrón de hiperfluorescencia observado in vivo por imagen FAF, y con el patrón de células autofluorescentes en la retina extirpada. Patrones correspondientes de tinción con FAF e Iba1+ in vivo fueron observados tanto a los 7 días como a las 12 semanas después de la inyección de NaIO3. Es importante destacar que, a los 7 días después del NaIO3, todas las células del RPE están ausentes de la copa posterior del ojo, lo que confirma que estas células no pueden ser responsables del FAF observado. Además, se confirmó la identificación de las células autofluorescentes como fagocíticas mediante comparación de imágenes a preparaciones en las que se había producido reducción de monocitos/macrófagos. Tal reducción se consiguió mediante tratamiento con cloruro de gadolinio (GAD). Tras el tratamiento con GAD, se observaron patrones reticulares de FAF mucho más definidos, incluyendo una reducción de la demarcación de los bordes.
Tal identificación de células fagocíticas es indicativa de AMD seca y/o RPD y es predictiva de la respuesta de un sujeto a un agente. Específicamente, la observación de tales células fagocíticas hace que sea más probable que un sujeto responda al tratamiento con un agente.
La identificación de un aumento transitorio de la permeabilidad a través de la barrera epitelial de un sujeto entre una coroides y una retina en relación con un estado no enfermo es indicativa de AMD seca y/o RPD y es predictiva de la respuesta de un sujeto a un agente. Concretamente, la observación de un aumento transitorio de permeabilidad a través de la barrera epitelial de un sujeto entre una coroides y una retina con respecto a un estado sano hace más probable que un sujeto responda al tratamiento con un agente.
Análisis Retardado en el Infrarrojo Cercano (DNIRA) de Retina Extirpada y RPE: Además, la identificación de características anormales en comparación con el ojo normal se lleva a cabo con el Análisis Retardado en el Infrarrojo Cercano (DNIRA). Las imágenes de DNIRA se obtuvieron en los días y semanas posteriores a la inyección de colorante, tal como inyección de ICG, utilizando la configuración de angiografía ICG, es decir, con filtros de excitación/emisión, pero sin reinyección de colorante a las 24 horas, 48 horas, 3 días, 7 días, 21 días y 28 días después de la angiografía. No se volvió a realizar angiografía durante el transcurso del estudio.
Para la administración de toxinas, se inyecta sistémicamente una toxina como NaIO3 (Sigma, Cat # 424064) a través de un catéter 23G a una dosis de 45 mg/kg de peso corporal. La angiografía ICG a 0,3 5mg/kg se lleva a cabo inmediatamente antes de la inyección de NaIO3. DNIRA es realizado 7 días después de ICG y de la inyección de NaIO3.
Ejemplo 8: DNIRA de un Ojo de Rata Después de la Adm inistración Sistémica de ICG Etiqueta Células Inmunes In vivo
Para determinar el correlato patológico del patrón FAF observado in vivo , se observaron preparaciones completas de retina extirpada a bajo aumento bajo luz blanca y mediante microscopía epifluorescente a 488 nm, la misma longitud de onda utilizada para la obtención de imágenes in vivo , sin marcación IHC fluorescente. Dependiendo de los análisis de tejido posteriores, se usaron dos microscopios para este fin: un dispositivo epifluorescente con una estrecha ventana de excitación/emisión (488/520 nm), y el sistema de visualización invertido Leica DM IRE2 de un microscopio confocal con una lámpara de arco de mercurio y un filtro de paso largo (mejor que pasa-banda) que proporciona fluorescencia a partir de más de 515 nm tras la excitación con una banda de 450-490 nm. Bajo luz blanca, la retina normal de rata parece bastante homogénea en todas partes, con cierta deformación artificial (figura 3A). Por el contrario, un sutil patrón reticular fino blancuzco se hace evidente en las muestras obtenidas 7 días después de la inyección de NaIO3. Para el día 14, este patrón es más evidente y se ve que corresponde con pequeños pliegues de la retina externa que se ilustran mejor en el borde cortado de la retina (figura 3B). Si se visualiza bajo luz fluorescente de 488 nm, este mismo patrón curvilíneo es evidente. Aunque es evidente para el día 7 después de la inyección, el aumento de la autofluorescencia hace que este patrón sea más visible para el Día 14 (figura 3C). Utilizando microscopía epifluorescente de mayor aumento, se demostró por primera vez que este patrón curvilíneo, de encaje coincide con la distribución espacial de las células autofluorescentes que parecen alinearse con los surcos o pliegues de la retina externa (figura 3D).
Sin pretender imponer ninguna teoría, esto sugiere que el patrón de FAF in vivo observado corresponde con la distribución de células autofluorescentes en la retina externa. Esto contrasta con las teorías vigentes, que atribuyen los patrones clínicamente relevantes de FAF a un RPE anómalo; téngase en cuenta que no había RPE en las muestras de retina aisladas que usamos. Sin pretender imponer ninguna teoría, esto también sugiere que el patrón bidimensional de FAF observado en este modelo corresponde a la distribución de células autofluorescentes confinadas en el interior de los pliegues curvilíneos tridimensionales de la retina externa.
En consecuencia, se investigaron los cambios espaciales y temporales de la estructura de la retina externa y la identidad de los tipos celulares autofluorescentes.
Debido a la naturaleza laminar de la neuroretina, razonamos que la deformación de la retina externa podría evaluarse fácilmente observando cambios conformacionales de la capa nuclear externa normalmente plana (ONL), una capa de núcleos fotorreceptores densamente dispuestos. Por lo tanto, inmediatamente después del análisis autofluorescente de preparaciones completas de retina recién extirpada, se realizó la tinción y se evaluó el tejido mediante microscopía epifluorescente o confocal en un canal distinto del 488. También se evaluaron secciones transversales mediante H&E de ojos íntegros.
En la referencia, antes de la administración de NaIO3, la microscopía confocal con la tinción nuclear Topro3 confirma que la ONL era plana y carecía de tinción vascular. (figura 4C). Tres días después de la administración de NaIO3, se observaron ligeros surcos curvilíneos de la ONL, acompañados de pliegues lineales ocasionales poco profundos. En el Día 7, la deformación de la ONL fue más pronunciada, produciendo una serie de ranuras claramente interconectadas. En el Día 14, estos cambios eran más complejos y de mayor amplitud.
Histología H&E en sección transversal de la de la retina a 90° a las imágenes obtenidas mediante microscopía confocal, mostró que la toxicidad del RPE inducida por NaIO3 primero conduce a pequeñas ondulaciones de la ONL que acompañan el aumento de fluido subretiniano, con poca pérdida de fotorreceptores (figura 4B). Más tarde, la clara pérdida de fotorreceptores creó pliegues de mayor amplitud en los que las depresiones de la ONL son yuxtapuestas contra la membrana de Bruch (BM), la membrana base del RPE. Finalmente, la expansión lateral de estas depresiones llevaba a grandes regiones contiguas de degeneración de la retina externa, de tal forma que gran parte de la retina interna yacía yuxtapuesta contra la BM.
Para determinar la identidad de las células autofluorescentes que coinciden con el patrón reticular de FAF, la retina extirpada con marcadores del sistema inmune innato fue teñida, evitando el canal de 488 nm. El Iba1 es un marcador pan-microglial/de macrófagos y, en la retina de rata, los anticuerpos contra él identifican las poblaciones de células fagocíticas principales. Usando este marcador, se descubrió que las células Iba1+ están dispuestas en un patrón curvilíneo, de encaje cuando se ven en face en la preparación completa de la retina, es decir, en el plano z (figuras 5A-H). Además, cuando se compara contra tinción nuclear de fotorreceptores, este patrón curvilíneo se ve que yace interpuesto entre pliegues de la ONL deformada. Como se muestra en las figuras 5A-H, este patrón de células Iba1 se correspondió con el patrón de hiperfluorescencia observado in vivo mediante imágenes FAF (figuras 1A-D y 2A-D), y con el patrón de células autofluorescentes en la retina extirpada (figuras 3A-C). Patrones correspondientes de tinción con FAF e Iba1+ in vivo fueron observados tanto a los 7 días como a las 12 semanas después de la inyección de NaIO3 (figuras 5A y 5B). A los 7 días después de la administración de NaIO3, todas las células del RPE estaban ausentes de la copa posterior del ojo, lo que confirma que estas células no fueron responsables del FAF observado (figuras 5C y 5D).
Las relaciones 3-dimensionales (3D) entre las células Iba1+ y la retina externa se evaluó luego mediante microscopía confocal en serie en face de la preparación completa de la retina (es decir, en el eje z) que se mueve etapa por etapa desde la capa plexiforme interna (INL) a través de la capa plexiforme externa (OPL), hacia la ONL interna, media y externa. Se proyectaron (aplanaron) pilas cortas de imágenes confocales (segmentos) en estas tres etapas (figuras 6A-D). También se evaluó la co-distribución de macrófagos CD68+ activados del linaje de monocitos.
En la referencia, antes de la administración de NaIO3, células Iba1+ fueron vistas solo en la IPL. Ninguna célula CD68+ fue identificada (figura 6A). De tres a cuatro días después de la administración de NaIO3, las células Iba1+ aumentaron en número y aumentaron en la IPL y también en toda la retina externa, incluyendo la ONL externa (figura 6B). Dos semanas después de la administración de NaIO3, una distribución compleja de células Iba1+ y CD68+ fue vista entrelazada entre los pliegues curvilíneos de la ONL. Además, se observaron círculos u óvalos ectópicos de núcleos de fotorreceptores seccionados ópticamente bien definidos en una capa tan interna como la OPL, la capa de la retina media de los vasos sanguíneos, poniendo así en contacto la capa nuclear de fotorreceptores deformada y la capa vascular, dos compartimentos tisulares que en condiciones normales están separados. En la ONL media, las secciones transversales ovoides de la capa nuclear deformada parecían más curvilíneas o pisciformes, y se encontraron grandes células Iba1+ y CD68+ dentro de su vacío central. En el tercio más externo de la ONL, las secciones transversales ópticas seguían siendo curvilíneas y estaban considerablemente contiguas, con muchos segmentos de acoplamiento. El espacio subretiniano, normalmente solo un espacio potencial, se expandió por deformación de la retina externa y muestra células inflamatorias Iba1+ y/o CD68+ y núcleos fotorreceptores juntos inmediatamente internos a la membrana de Bruch (en el espacio donde normalmente residirían los segmentos externos fotorreceptores perdidos).
Se realizó microscopía de barrido confocal y reconstrucción tridimensional de la preparación completa de la retina extirpada (figura 7A). Estos datos mostraron que las células Iba1+ formaron un patrón reticular o de encaje que se interpone entre los núcleos fotorreceptores. Además, la proyección de la pila z, dividida en los mismos tres planos (figura 7B derecha) mostró que la ONL interna se caracteriza por secciones transversales circulares u ovales de la ONL. Por el contrario, la ONL media se caracteriza por secciones transversales curvadas en lazo de la capa nuclear y la ONL externa está formada por segmentos curvilíneos mayores con múltiples elementos de acoplamiento. Las proyecciones volumétricas oblicuas de estas capas ilustran fácilmente la configuración resultante en forma de pseudocaja de huevos de la ONL, con varios picos cónicos que se extienden desde pliegues contiguos individuales en su base (figura 7B media y derecha). Sin pretender imponer ninguna teoría, estos datos demuestran que la mayoría de las células inflamatorias no está ubicada en, o entre, las depresiones de la ONL, sino que se encuentran bajo (es decir, en el exterior de) los picos de la ONL, en el espacio subretiniano expandido.
Sin pretender imponer ninguna teoría, estas observaciones muestran que la distribución 3-dimensional de células inflamatorias autofluorescentes bajo la retina externa deformada representa el patrón 2D de imágenes FAF en vivo en estos animales.
Para correlacionar estas observaciones realizadas en el tejido extirpado con el cambio in vivo y los resultados de FAF, se realizó un análisis volumétrico 3D de la retina viva usando OCT de alta resolución in vivo. HR-OCT proporciona secciones transversales no invasivas, in vivo, de la retina previamente observadas solo en especímenes histológicos post-enucleación. La obtención de imágenes OCT depende de la señal generada en la interfaz entre capas de diferente densidad óptica y, en la retina normal de rata, confirma su estructura multilaminar. Los tres principales límites de la OCT más externos de la retina son, de internos a externos, la membrana limitante externa (ELM), la unión de los segmentos fotorreceptores interno y externo (IS/OS) y el RPE/la BM (figura 8A , izquierda). Las técnicas estándar, tanto en la clínica como en estas investigaciones, establecen arbitrariamente las capas nucleares, incluida la ONL, como oscuras (es decir, una señal vacía).
Después de la administración de NaIO3, una imagen reconstruida en face de la retina viva capturada con OCT demostró un cambio sutil que se limita a la región inferior al nervio óptico (figura 8A, medio). Comparado contra referencia base y parte superior de la retina (que aparece extremadamente normal tres días después de la administración de NaIO3) (figura 8A, medio), secciones transversales ópticas en la retina inferior mostraron ligera deformación de la unión IS/OS de fotorreceptores y ELM tal que montículos brillantes (hiper-ecoicos) de poca profundidad se hacen visibles (figura 8A, derecho). La señal se encontró en el exterior de la ONL y el interior de la BM. La línea fina y oscura representa que el RPE ya no está presente. Para el día 14, estos montículos maduraron en picos pronunciados, una parte de los cuales forman triángulos o pirámides brillantes y distintos cuyas bases parecen asentarse en la BM (figuras 8B y 8C). Otros montículos formaron puntas estrechas discretas que se extendieron desde la ELM, a lo largo de la capa de fotorreceptores, para alcanzar la retina media. Una imagen clínica de OCT de un paciente humano con RPD muestra un depósito subretiniano piramidal que es patognómico de esta enfermedad. (figura 8D).
Para probar si los montículos brillantes, los triángulos y las puntas que caracterizan el RPD y los que se ven en el presente sistema, corresponden a la distribución de las células fagocíticas autofluorescentes observadas en el espacio sub-retiniano, fueron usadas proyecciones de intensidad de volumen (VIP). Estas estaban compuestas de secciones ópticas generadas por OCT para proporcionar un medio de evaluar bloques tridimensionales de tejido vivo in vivo que se pueden reconstruir en los ejes z- y y-.
La reconstrucción de imágenes OCT adyacentes en el eje y mostró que los montículos o triángulos, dispuestos uno al lado del otro, contribuyen a estructuras complejas como círculos, óvalos, halos y lesiones similares a dianas. En el ejemplo mostrado en la figura 9A, dos montículos subretinianos forman las "cara" de un círculo y se encuentran muy juntos en su aspecto superior e inferior y se separan al máximo en el medio. Los montículos, las pirámides y las puntas sencillas contribuyen a estructuras curvilíneas más sencillas.
Para respaldar aún más este resultado, se analizaron a continuación, VIP (Proyecciones de Intensidad de Volumen) en el eje z (es decir, en segmentos cortos escalonados desde la ONL interna hasta la ONL externa). (figura 9B). Las VIP a lo largo de la capa interna de la ONL mostraron una serie de manchas moteadas, separadas regularmente a lo largo de toda la retina. Las VIP de la ONL media mostraron líneas cortas curvadas o pisciformes con una separación menos regular, algunas de ellas de acoplamiento. Las VIP de la ONL externa mostraron segmentos curvilíneos contiguos con muchos elementos de acoplamiento. Estos resultados se corresponden directamente con los datos 3D generados a partir de la preparación completa de la retina extirpada (figuras 6A-D).
Además, para confirmar que FAF hiperfluorescente o patrones anormales de FAF y DNIRA hiperfluorescente se correlacionan o se co-localizan con la distribución de células fagocíticas, la población circulante de macrófagos/monocitos se redujo utilizando cloruro de gadolinio (GAD o GdCl3), una sal de metal de tierras raras que deprime la actividad de los macrófagos. La disminución con GAD de las células inmunes condujo a una profunda alteración del patrón de FAF y DNIRA inducido por NaIO3. La disminución con GAD de las poblaciones de monocitos/macrófagos condujo a una profunda alteración del patrón de FAF inducido por NaIO3. Esto fue evidente cualitativamente tanto dentro de las áreas geográficas de daño como en su frontera. (figuras 8A-C).
Además, DNIRA, realizado de una manera repetida, un procedimiento que llamamos DNIRA Pulsado, identifica pequeños puntos hiperfluorescentes en DNIRA que parecen migrar con el tiempo (figura 32). Células del RPE que también se pueden marcar con DNIRA, no migran. Esto, junto con la co-localización anterior con FAF hiperfluorescente sugiere que los macrófagos se colocalizan y contribuyen a la progresión de la enfermedad.
Ejemplo 9: Imágenes Clínicas In vivo de RPD y AMD de Goteo Difuso:
En las figuras 10A-C, se proporcionan imágenes y diagramas interpretativos que comparan directamente las características clínicas del RPD con los resultados tisulares en el modelo NaIÜ3. Además de las imágenes clínicas de OCT de un paciente con RPD (que muestran una estructura piramidal con la base hacia abajo en el espacio subretiniano, figura 8D), se obtuvieron también imágenes de fondo de ojo en colores y con luz aneritra (figuras 10A-C). Las imágenes aneritras mostraron pequeñas manchas oscuras que constituyen pseudodrusas individuales del RPD (figura 10A, imagen superior). Estas fueron identificadas usando solapamiento gris oscuro. Esto además destaca, circunscritas por círculos, la presencia de las denominadas "lesiones diana" que caracterizan el RPD. Estas tienen el aspecto de manchas oscuras con centros más claros. Paralelamente, se presenta una ilustración esquemática de la retina externa plegada de rata, tanto en face como en sección transversal que, cuando se colorea falsamente y se presenta como imágenes en blanco y negro, tanto "positivas" como "negativas", se correlaciona directamente con dianas y halos de RPD.
Estos datos indican que los patrones 2D de pseudodrusas oscuras dentro de un patrón de encaje o reticular de círculos, halos y lesión en diana con centros oscuros vistos en face, en 2D, se corresponden con anillos y cráteres elevados, considerados volumétricamente, en 3D.
Ejemplo 10: Efectos Terapéuticos del Bindarit
Este ejemplo muestra, inter alia, que bindarit protege la retina y RPE contra daño inducido por toxina en un modelo de AMD "seca" non-exudativa y RPD y que bindarit protege contra el desarrollo de parches del epitelio pigmentario de la retina (RPE) y la pérdida de fotorreceptores conocida como Atrofia Geográfica (Ga ).
Los animales se manejaron de acuerdo con las pautas de la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) para el uso humano de los animales en la investigación oftálmica, y de acuerdo con las pautas del Consejo Canadiense para el Cuidado de los Animales. Los animales se anestesiaron con una combinación de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg) y se dilataron sus pupilas con una sola gota de solución de tropicamida al 0,8 % en clorhidrato de fenilefrina al 5 % (Diophenyl-T, Sandoz Canada Inc.). Se aplicaron gotas oculares lubricantes GenTeal (Novartis, Canadá) a la superficie de la córnea en repetidas ocasiones durante todos los procedimientos.
Imágenes in vivo fueron adquiridas utilizando un oftalmoscopio láser de barrido confocal (cSLO) disponible comercialmente (Angiografía de la Retina de Heidelberg, HRA-2, Heidelberg Engineering, Alemania). Se obtuvieron imágenes con luz aneritra, FAF (excitación/emisión a 488/500 nm), canal de reflectancia IR (830 nm) y canal de fluorescencia ICG (excitación/emisión a 795/810 nm). Los animales eran pre-examinados usando cSLO, y aquellos con defectos espontáneos eran eliminados del estudio. La superficie de la córnea se mantuvo húmeda con la aplicación repetida de gotas lubricantes GenTeal (Alcon, Mississauga, Canadá) durante todo el procedimiento de obtención de imágenes in vivo. Múltiples imágenes fueron tomadas de cada ojo a partir de la cabeza del nervio óptico (ONH), y moviéndose en anillos concéntricos hacia la periferia media y lejana donde era posible. En algunos casos, debido a las dificultades en la alineación de la cSLO con la pupila pequeña, imágenes contiguas se obtuvieron solamente en una hemi-retina, con la realineación del animal para el subsiguiente registro de imágenes de la segunda mitad. Imágenes compuestas del fondo de ojo se ensamblaron post-hoc en PowerPoint y se exportaron para análisis.
Angiografía: El colorante ICG (Cardiogreen, Sigma) se preparó inmediatamente antes de la experimentación hasta una concentración de reserva final de 5,0 mg/ml en agua estéril. Se introdujo un catéter de calibre 24 en la vena caudal y se infundió el colorante ICG en dosis de 0,35 o 5,0 mg/kg. Se tomaron imágenes antes de la inyección (referencia), durante la circulación del colorante y a diversos intervalos hasta 20 minutos.
Análisis Retardado en el Infrarrojo Cercano (DNIRA): Imágenes DNIRA se obtuvieron en los días y semanas después de la inyección de ICG usando la configuración de angiografía ICG, con filtros de excitación/emisión en posición, pero sin reinyectar el colorante después del día 0. Las imágenes fueron tomadas 2 - 120 días después de la angiografía.
Cuantificación de Imágenes FAF: Imágenes compuestas se agruparon e importaron a Image J (National Institutes of Health) para su análisis por un observador enmascarado. La comparación entre el tamaño del parche de daño, determinado a partir de diferentes imágenes a diferentes dosificaciones de la toxina, se logró mediante la normalización del tamaño de la imagen usando la imagen cSLO central (cabeza del nervio óptico), como referencia. Se hizo la suposición de que la ampliación entre las imágenes del fondo de ojo no varió significativamente entre las ratas. Las áreas con señal FAF anormal se esbozaron manualmente por un lector de enmascarado utilizando la herramienta de trazado de "polígono", y las regiones de interés se midieron en píxeles. Mediante análisis de dosisrespuesta, se comparó el tamaño de los parches frente a la media de los parches a partir de 45 mg/kg NaIO3 (asignado un valor de 100 unidades).
Electrorretinografía (ERG): Se evaluó la respuesta ERG brillo-destello en los animales utilizando el sistema mini Ganzfeld Espión (DiagnosysLLC, EE.UU.) siguiendo administración de dosis de ICG alta (5,0 mg/kg) y baja (0,35 mg/kg), o control de solución salina. Después de la anestesia, los animales se colocaron en una almohadilla térmica eléctricamente silenciosa y se colocaron electrodos de bobina de oro en el borde de la córnea tras la aplicación de gotas lubricantes GenTeal. Después de un corto tren de destellos tenues (0,01 candela s/m2, 1,0 Hz), la respuesta de onda b fotópica fue evaluada usando un único destello brillante (3 candelas s/m2) que se determinó previamente que aproxima consistentemente la amplitud máxima de la onda b.
Yodato de sodio: La toxina yodato de sodio del RPE (NaIO3, Sigma) se preparó poco antes de su uso semanalmente a una solución madre de 45 mg/ml en solución salina (Baxter, Mississauga, Canadá). Esta solución se diluyó hasta concentraciones finales de 5 mg/ml, 15 mg/ml, 30 mg/ml y 45 mg/ml, de tal manera que todos los animales recibieron el mismo volumen para lograr dosificaciones finales de 5 mg/kg a 45 mg/kg. Se inyectó NaIO3 de forma sistémica a través de un catéter de calibre 24 insertado en la vena caudal. La inyección de ICG (0,35 mg/kg) y la angiografía se realizaron en el día 0 inmediatamente antes de la inyección de NaIO3. Para probar los efectos de bindarit, se utilizó una dosis estandarizada.
Inyección Intra-ocular de bindarit: La inyección intravitreal de bindarit se realizó bajo un microscopio de disección (SMZ800; Nikon Instruments, Melville, EE.UU.) con una jeringa Hamilton (Cat # 7634-01, Hamilton Company, Reno, EE.UU.). Una pequeña incisión se hizo detrás del limbo utilizando una aguja biselada de calibre 33- (BD, Mississauga, Canadá). A continuación, se insertó una aguja roma de calibre 30 en un ángulo de aproximadamente 45° respecto al eje pupilar. Se inyectaron manualmente dos (2) pL de solución de bindarit o solución de control (solución salina).
Microscopía de Fluorescencia Autofluorescente: La muestra ocular en preparación completa recién extirpada, copa de la retina o posterior sin la retina, se evaluó utilizando un microscopio epifluorescente con longitud de onda de 488 nm/512 nm.
Microscopía de Inmunofluorescencia: Fue realizada inmunohistoquímica utilizando protocolos estándar. Brevemente, las células se fijaron con PFA/PBS al 4 % durante 15 minutos, y se bloquearon con BSA al 1,25 % en TBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se usó anti-ZO-1 de conejo primario a 2,5 pg/ml en BSA/TBS al 1,25 % y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron en TBS y se incubaron con 488 anti-conejo de cabra (Invitrogen) a 5 pg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó, y se contratiñeron con To-Pro-3 (Invitrogen). Algunas monocapas de RPE se tiñeron con faloidina conjugada de 647 nm (Invitrogen) durante 20 minutos a temperatura ambiente y se contratiñeron con tinción nuclear verde Sytox (Invitrogen). Fueron montados portaobjetos con medio de preparación fluorescente (Dako) y las imágenes fueron adquiridas utilizando un microscopio confocal fluorescente Leica TCS SL (Leica Microsystems, GmbH, Wetzlar, Alemania), con software Leica Confocal V 2.61.
El tratamiento con bindarit proporciona la prevención secundaria contra la complicación con cegamiento tardío de la AMD seca y el RPD conocida como Atrofia Geográfica (GA). El propósito de la prevención secundaria es la de mantener la agudeza visual central y del campo visual central antes de la pérdida.
Los pacientes con AMD comienzan a "secar" y tienen pequeños depósitos en la mácula conocidos como drusas. Más tarde en la enfermedad, los pacientes pasan a la enfermedad avanzada que se caracteriza por la pérdida irregular de la retina externa y del RPE. Aquí se muestra en el presente modelo animal que bindarit puede impedir o retardar la progresión de la enfermedad tardía, es decir, prevención secundaria de GA. Las figuras 16A-F muestran que bindarit (TMi-018) reduce el tamaño del parche de la pérdida del RPE en el ojo de la rata. Las figuras 16A-F muestran además que, cuando se evalúa a lo largo del tiempo utilizando Autofluorescencia de Fondo de Ojo (FAF), bindarit intravítreo reduce el desarrollo de patrones complejos de FAF hiperfluorescente. Las figuras 17A-B muestran que bindarit dependiente de dosis protege la función de la retina (electrofisiología) y demuestra una dosis mínimamente efectiva. La figura 18A-Cmuestra que bindarit protege contra daño del tejido, la pérdida del RPE y la interrupción de la retina externa.
Las figuras 19A-J muestran que bindarit reduce la expresión de la Proteína Quimioatrayente de Monocitos (MCP)-1 y reduce la respuesta de los macrófagos M1, inclinando la balanza a favor de M2. Específicamente, estos datos muestran, entre otros, una reducción dependiente de dosis en la expresión de la proteína MCP-1 en el espacio subretiniano siguiente al bindarit intravitreal (ver, por ejemplo, la figura 19D). También, estos datos muestran que durante el daño inducido por toxina al RPE, un modelo para la expresión génica de la enfermedad ocular (por ejemplo, AMD seca y/o RPD) se desplaza hacia la polarización de M1. Además, la expresión génica se desplaza de vuelta hacia neutro, con disminuciones relativas en la expresión de mRNA en M1 y aumento de los niveles de expresión de M2. Sin pretender imponer ninguna teoría, estos datos sugieren que bindarit actúa de forma diferencial para reducir la transcripción "asociada a inflamación".
El bindarit no sólo puede proporcionar protección contra el desarrollo de parches, sino que también puede reducir el crecimiento (expansión) de los parches de GA preexistentes. El bindarit trata la Atrofia Geográfica preexistente (GA),
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una complicación con cegamiento tardío de la AMD seca, reduciendo el crecimiento de estos parches de RPE y la pérdida de la retina externa. El objetivo de este tratamiento es reducir el tamaño del "punto ciego" que el paciente observa en su campo de visión central. La figura 20A muestra un tratamiento de control negativo (solución salina) de un parche existente, que se expande, mientras que, por el contrario, la figura 20B muestra el tratamiento con bindarit de un parche existente, que no se expande.
Ejemplo 11: Protección del RPE con Bindarit y Modulación del Complemento
Fue informado que MCP-1 se expresa por RPE, y es una potente Proteína Molecular Asociada a Peligro (DAMP) que activa los macrófagos M1. En este ejemplo, entre otros, se investigó si bindarit podía influir directamente la expresión de MCP-1 en las células del RPE independientes de su actividad en los macrófagos. Usando la línea celular de RPE humano negativa de telomerasa inmortalizada (hTERT-RPE1) in vitro, se demuestra que bindarit influye directamente en estas células, disminuyendo mRNA en MCP-1 y el transcriptoma en M1 (figura 21). La inmunocitoquímica demuestra la disminución de MCP-1 y la proteína KFkB (figura 21). Además, cuando desafiado con NaIO3, bindarit protege la viabilidad celular de hTERT-RPE, lo que sugiere, sin pretender imponer ninguna teoría, un segundo e inesperado mecanismo de acción de gran importancia para su posible eficacia en el tratamiento de la AMD seca (figura 21). Bindarit parece tener el potencial para modular la respuesta inmune innata tanto directamente a través de su influencia en la polarización de macrófagos e indirectamente mediante la reducción del nivel de RPE señalizando que se inicia la respuesta local.
La figura 21 muestra, en los paneles A y B, que las células hTERT están confirmadas para expresar marcadores de diferenciación de RPE. En el panel C, se muestra que TMi-018 reduce la expresión de NFkb y reduce MCP-1 en RPE humano (hTERT). El panel D muestra que TMi-018 aumenta la supervivencia de RPE contra la exposición a la toxina.
Además, bindarit se muestra en esta invención como un excelente agente de combinación. La figura 22 muestra que las especies de mRNA de los componentes en cascada del complemento cambian después del daño al RPE inducido por toxina y que bindarit altera la expresión génica del complemento. Los genes estudiados incluyen: C1qb, C1qtnf5, C2, C3, C4b, C5, C6, C7, C8a, C9, Cfb, Cfd, Cfh y Cfi.
La degeneración macular relacionada con la está asociada con deficiencias en la inmunidad innata, y terapias prometedoras se dirigen a estas vías. El polimorfismo que confiere un mayor riesgo para el desarrollo de la AMD es el factor H del complemento (CFH), un componente de la cascada del complemento alternativa. CFH es un regulador negativo del complemento y su ausencia lleva a una respuesta acelerada. Miembros aguas abajo incluyen C5 y C3, ambos de los cuales han sido dianas sin éxito en ensayos clínicos. Sin embargo, un reciente estudio de fase II promisor utilizando el inhibidor del factor de complemento D (CFD), Lampilizumab, sugiere que la inhibición del CFD puede retardar el crecimiento, es decir, la expansión de la atrofia geográfica durante un período de 18 meses. Este efecto fue más robusto en pacientes con factores de complemento concurrentes polimorfismos H e I. Aquí se muestra que se producen cambios en la respuesta del complemento con el tiempo después de la administración de NaIO3. Normalizados con respecto a la referencia (pre-toxina), los niveles de mRNA de muchos genes del complemento aumentan o disminuyen en más de 2 o 3 veces (figura 22). Los principales cambios se identifican en C1, C3, C5 y C9, y notablemente, CFH y TPI ambos disminuyen. Este último resultado puede correlacionarse con el resultado de que el inhibidor de CFD, Lampilizumab, era más eficaz en pacientes con polimorfismos en estos genes. mRNA de CFD no cambió mucho, menos que 3 veces, durante gran parte del tiempo.
A continuación, el efecto de bindarit en estos genes fue explorado. Bindarit, dependiente de la dosis, aumentó o disminuyó el mRNA de múltiples genes del complemento.
En consecuencia, bindarit altera profundamente la respuesta del mRNA, y trabaja sinérgicamente con moduladores del sistema del complemento.
Ejemplo 12: Evaluación Clínica de la Eficacia del Fármaco y/o Progresión de la Enfermedad con DNIRA
Este ejemplo muestra que, entre otros, DNIRA es útil como un procedimiento de diagnóstico o pronóstico para los trastornos oculares. Por ejemplo, los datos presentes muestran que DNIRA es útil como un biomarcador para la eficacia terapéutica de un agente contra uno o más trastornos oculares y/o un diagnóstico para la aparición de uno o más trastornos oculares y/o un diagnóstico para la progresión de uno o más trastornos oculares. Es importante destacar que los datos presentan resultados en sujetos humanos aquejados de trastornos oculares.
DNIRA es un biomarcador nuevo y no descrito anteriormente para el diagnóstico, progresión de la enfermedad, y respuesta al tratamiento. Su aplicación, descripción cualitativa y cuantificación proporciona usos importantes para estos fines.
En la actualidad, los instrumentos utilizados para llevar a cabo la angiografía ICG requieren imágenes en tiempo real del colorante a medida que pasa a través de, por ejemplo, los vasos sanguíneos oculares (de la retina y de la coroides). Como tal, la visualización comienza típicamente en los segundos y minutos previos a la inyección del colorante en las venas del brazo o la mano, y se prolonga durante típicamente de 10 a 30 minutos a partir de entonces. La última fase de la angiografía se produce normalmente hasta 45 minutos más tarde. Las imágenes se adquirieron así en la fase de tránsito (a medida que el colorante pasa a través de los vasos sanguíneos) y en la fase de re-circulación (a medida que se escapa de los vasos hacia el tejido). Los dispositivos necesarios para visualizar el colorante ICG, por lo tanto, deben capturar imágenes secuenciales originalmente en forma de película, vídeo o más recientemente angiografía digital. Estos sistemas son caros y requieren de visualización sostenida. En su lugar, el presente ejemplo facilita el uso de filtros de excitación/emisión de ICG sin el uso de visualización angiográfica. Las imágenes DNIRA de referencia se obtienen con los filtros de ex/em de GIC en posición antes de la inyección sistémica de colorante ICG. En los días y semanas después de la inyección, se obtienen imágenes individuales. El uso de filtros de ICG sin angiografía no se ha descrito previamente.
La aplicación de DNIRA a la enfermedad clínica se ilustra en esta invención. En pocas palabras, todos los procedimientos fueron aprobados por el Consejo de Ética de Investigación de1Hospital St Michael y cumplen con las Buenas Prácticas Clínicas (BPC) y la Declaración de Helsinki para la investigación clínica de sujetos humanos. Después de una explicación completa de la naturaleza y la posible consecuencia de los procedimientos, y con el consentimiento informado, pacientes con un diagnóstico clínico de AMD seca fueron reclutados en serie para el estudio. La investigación de referencia incluyó agudeza visual corregida con gafas, examen oftalmológico con microscopía con lámpara de hendidura y fundoscopia, junto con imágenes cSLO que incluyen imágenes FAF y NIR con los filtros de excitación/emisión de ICG en posición, pero no infusión de colorante. La angiografía se realizó menos de una semana a partir de entonces, simultánea con la administración de una dosis única de colorante ICG (Cardiogreen, 25mg/5ml) y fluoresceína sódica. Imágenes FAF y DNIRA se llevaron a cabo dos veces en los 7 días siguientes, con un mínimo de 2 y un máximo de 4 días entre procedimientos.
DNIRA se compara con la angiografía ICG. Aparte del bloqueo que recubre la señal central (apenas detectable) se observó poca anormalidad con la angiografía ICG (figura 23). Esto está en marcado contraste con DNIRA, en el que hay áreas de marcada hiperfluorescencia en la mácula central (figura 24). Además, se observa un patrón tipo leopardo en la mácula periférica que no ha sido identificado por ninguna técnica de imagen hasta la fecha. Además, DNIRA se compara con FAF e infrarrojo (IR) como también siendo superior comparado con estas técnicas (figura 25). Imágenes DNIRa del mismo paciente como se muestra en los paneles izquierdo (IR) y del centro (FAF) de la figura 25 contrastan notablemente. Por ejemplo, sólo DNIRA revela una región de hipofluorescencia profunda (oscura) en el centro de la imagen. Parches más pequeños son observados en el margen de la lesión central y en la proximidad de la cabeza del nervio óptico. Además, las imágenes compuestas del mismo paciente muestran un patrón de encaje, reticular o tipo leopardo de DNIRA hiper e hipo-fluorescente que se alternan que no se ve en otras modalidades de imagen y no ha sido descrito anteriormente (figura 26). En comparación, un paciente sin ADM de la misma edad, que no se sabe si tiene daños en el RPE, no muestra tales patrones de encaje, reticular o tipo leopardo de DNIRA hiper- e hipofluorescente que se alternan (datos no mostrados).
Por analogía con FAF, áreas de daño coriorretiniano son vistas como señal hipofluorescente (oscuro, negro o ausente). Tales áreas son fácilmente cuantificadas debido al fuerte contraste entre el fondo normal o hiper-fluorescente. Los algoritmos para la cuantificación de FAF hipofluorescente se incluyen ahora con los dispositivos de visualización disponibles comercialmente (por ejemplo, el sistema de oftalmoscopia láser de barrido confocal, o la cámara de fondo de ojo modificada). La cuantificación de FAF hipofluorescente se ha incorporado ahora en el diseño de ensayos clínicos, tanto los criterios de inclusión como la medida de resultados. Por ejemplo, el estudio Mahalo (Genetech) requiere que los pacientes tengan una región de tamaño mínimo y máximo de FAF hipofluorescente para entrar en el estudio. El tamaño de esta área se mide en varias ocasiones durante el estudio y las tasas de crecimiento, es decir, la expansión, se compara entre los brazos de tratamiento. Este ejemplo muestra que DNIRA torna claras regiones de hipofluorescencia que no se ve en las modalidades de imagen actuales. En consecuencia, interalia, DNIRA puede ser usado para mejorar la identificación de pacientes adecuados para reclutamiento para el estudio y para evaluar la progresión de la enfermedad.
Además, mediante el análisis de pacientes individuales con el tiempo, es mostrado aquí que las imágenes DNIRA cambian con el tiempo. Esto permite la cuantificación en serie de las áreas de señal hipofluorescente o hiperfluorescente y proporciona una estrategia para el análisis de progresión de la enfermedad (por ejemplo, como un biomarcador sustituto). Por ejemplo, las imágenes DNIRA de la figura 27 muestran expansión de la hipofluorescencia en un paciente con AMD seca tardía.
Además de DNIRA hipofluorescente, descrito en esta invención está la presencia de DNIRA hiperfluorescente en el entorno clínico. Puntos o zonas punteadas claras pueden ser identificadas en el ojo de roedores en los días y semanas después de la inyección de ICG sin más inyección de colorante, pero sólo con los filtros de excitación/emisión de ICG en posición (ver, por ejemplo, Ejemplos de esta invención, como los Ejemplos 1, 2, y 8). En ojos de animales, DNIRA Pulsado (en el que se proporciona repetidamente colorante ICG por vía intravascular y se evalúa intra-ocularmente en el ojo vivo en los días después de la inyección) e ImmunoD, muestra que macrófagos pueden ser marcados in vitro y en vivo con ICG y de esta forma volverse visibles como pequeños puntos móviles, hiperfluorescentes. La figura 28 muestra que puntos discretos de DNIRA hiperfluorescente se identifican dispersos por toda la mácula de los pacientes con AMD. Algunos están en proximidad a la cabeza del nervio óptico, y otros inmediatamente adyacentes a regiones de atrofia geográfica, tanto en la frontera como en la llamada zona de unión.
Además de la aplicación de DNIRA a pacientes con AMD, el presente Ejemplo también muestra la utilidad de DNIRA para pacientes humanos con RPD (porejemplo, como una herramienta de diagnóstico y/o pronóstico). Drusas clásicas y pseudodrusas están asociados con la atrofia geográfica y/o la neovascularización coroidea subsiguientes. La figura 29 muestra el ojo de un paciente humano con RPD. Después de haber caracterizado al paciente como teniendo RPD utilizando imágenes de IR y FAF, imágenes DNIRA demuestran múltiples regiones de FAF hipofluorescente no vistas en cualquier otra modalidad (incluyendo otras modalidades que no se muestran en la figura 29). Estas regiones se distribuyen a lo largo de la mácula. Las manchas tipo leopardo se ven nuevamente en la periferia macular. Se ha demostrado que el RPD madura con el tiempo, comenzando como montículos de poca profundidad anteriores al RPE, y más tarde madurando en pirámides con la base hacia abajo o punta hacia arriba. En varios estudios, se ve que el RPD madura en una dirección centrípeta, estando lo más nuevo o más joven periféricamente (en este caso en sentido superior), y lo más viejo más centralmente (inferiormente). En consonancia con la sugerencia de DNIRA, los puntos hiperfluorescentes vistos superiormente coincidirían con la presencia de macrófagos marcados que se han infiltrado en el tejido. En las regiones centrales donde los macrófagos potencialmente han residido en el tejido más tiempo, áreas de pérdida de tejido son sugeridas por los pequeños parches de DNIRA hipofluorescente. La figura 30 muestra un gradiente de señal hipofluorescente e hiperfluorescente en un paciente con RPD diferente del anterior. La flecha inferior muestra región de FAF hipofluorescente discreto inmediatamente superior a la mácula central. Superior a esto, hay una acumulación cada vez mayor de puntos FAF hiperfluorescentes.
Para comprender mejor la fuente de la señal DNIRA, y para adaptarse a las grandes diferencias en aumento entre las imágenes de roedores y de humanos utilizando el sistema cSLO de grado clínico, se usaron ojos de conejo de tamaño intermedio para estudiar la fuente de la señal DNIRA hiperfluorescente punteada.
Una toxina del RPE fue dada sistémicamente a conejos blancos de Nueva Zelanda, y fue realizado DNIRA como se describió previamente. Las imágenes fueron tomadas en serie en los días y semanas después de la inyección de ICG, sin más inyección de colorante y con filtros de excitación/emisión filtros en posición. La enfermedad activa en seres humanos se caracteriza por FAF hiperfluorescente, pero la etiología permanece parcialmente desconocida. Se entiende que las células del RPE anormales o dañadas serán hiperfluorescentes bajo luz fluorescente azul debido a la acumulación de lipofuscina. Sin embargo, hemos sugerido anteriormente, sin pretender imponer ninguna teoría, que los macrófagos también hiperfluorescen, potencialmente debido a la fagocitosis de células del RPE fluorescentes dañadas o a la producción endógena de un material semejante a la lipofuscina (como se ha descrito in vitro). Se deduce que si los macrófagos hiperfluorescen en FAF, y se acumula colorante ICG en DNIRA, los mismos deberían co-localizarse en los dos canales. Esto es observado.
La figura 31 muestra una correspondencia entre la señal FAF hiperfluorescente y la señal DNIRA hiperfluorescente en un ojo de conejo. Para mostrar además que DNIRA marca los macrófagos, se evaluó la migración de puntos DNIRA hiperfluorescentes lo largo del tiempo. Después de la administración sistémica de toxina, se observó que una onda de puntos brillantes migra, o es marcada de forma centrífuga, desde la cabeza del nervio óptico de conejo. La figura 32 muestra puntos DNIRA hiperfluorescentes, probables macrófagos, que cambian de posición en el tiempo. La fila superior de imágenes en la figura 32 muestra imágenes DNIRA después de la inyección sistémica de toxina en una rata y muestra manchas hiperfluorescentes punteadas que rodean la cabeza del nervio óptico. Con el tiempo, estos puntos parecen migrar de forma centrífuga. La fila inferior de imágenes en la figura 32 muestra imágenes DNIRA en un ojo de conejo y muestra una migración aparente similar de puntos marcados individualmente que, por inmunohistoquímica, se tiñen positivamente para marcadores de macrófagos. En ambas filas, la imagen más a la izquierda es DNIRA de referencia (es decir, inyección pre-ICG con filtros ICG en posición). Por último, después de haber identificado puntos hiperflourescentes en el ojo de rata y conejo en la región alrededor de la cabeza del nervio óptico, la cabeza del nervio óptico humano fue evaluada para resultados similares. Las similitudes entre DNIRA de rata, conejo y humano permiten una correlación clínico-patológica y sugieren que los macrófagos explican la hiperfluorescencia en las tres especies. La figura 33 muestra pequeños puntos DNIRA-positivos marcados brillantemente que se observan en la proximidad de la cabeza del nervio óptico en imágenes de rata, de conejo y de humanos.
Ejemplo 13: Tratamiento con Bindarit de Retinopatía Diabética
Se sugiere que la inflamación desempeña un papel central en la enfermedad diabética del ojo, incluyendo tanto la retinopatía diabética como el edema macular diabético. Citocinas, quimiocinas y otras moléculas pro-inflamatorias o pro-permeabilidad son descritas en tejidos oculares humanos tales como vítreo o acuoso, y también en suero. Modelos animales confirman una respuesta inflamatoria en estudios pre-clínicos.
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Entre las más de 50 quimioquinas identificadas hasta la fecha, se ha informado que aproximadamente el 50 % se alteran en la diabetes. Entre ellas se encuentran MCP-1/ccl2 y RANTES. Factores de transcripción, tales como NFkB, también están implicados en la enfermedad ocular diabética, y pueden ser activados directamente en caso de obesidad y de exceso de ácidos grasos libres. El aumento de la fosforilación de IKKB lleva a la translocación de NFkb al núcleo y a la activación del transcriptoma inflamatorio. Además, los niveles séricos de MCP-1/ccl2 y CRP se encuentran elevados en pacientes con retinopatía diabética grave, que surge potencialmente a partir de liberación sistémica de mediadores derivados del ojo o enfermedad sistémica avanzada concurrente. Agentes que pueden reducir estos factores sistémicos, ya sea localmente o sistémicamente, podrían por tanto ser eficaces en el tratamiento de la enfermedad ocular diabética.
El presente ejemplo muestra, entre otros, que bindarit reduce los mediadores inflamatorios que, demostradamente, participan en la enfermedad ocular diabética. El yodato de sodio, a una dosis alta de 45 mg/kg, fue usado para inducir una respuesta inflamatoria que fue tratada con dosis alta (20 pg/pl, volumen 2 pl) y baja (2 pg/pl, volumen 2pl) de bindarit intravitreal. El efecto de bindarit se evaluó en el día 16 después de la inyección de toxina. Como se muestra en la figura 34, bindarit reduce los mediadores inflamatorios que se sabe están implicados en la retinopatía diabética.
La figura 36 muestra que bindarit no tiene un efecto significativo sobre otras interleucinas IL-10 y IL-3 o factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) y ccl5 (MCP-3). mRNA plegado cambia cuando comparado con las condiciones de referencia (normales), en las siguientes condiciones: 1. Solución salina intravitreal (vehículo), 2. Dosis alta de bindarit, 2 pg/pl, (sin toxina), 3. Toxina dosis baja 2 pg/pl de bindarit, 4. Toxina alta dosis 20 pg/pl de bindarit NaIÜ3 y 5. La toxina sola.
Además, bindarit no tuvo un efecto significativo sobre el ARNm del factor A de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) (figura 37). Sin embargo, en este paradigma, VEGF-A no fue elevado por el tratamiento con toxina (derecha) en cualquier momento después de la inyección. Todos los cambios son de aproximadamente 1,0 vez hacia arriba o hacia abajo. mRNA plegado cambia cuando comparado con las condiciones de referencia (normales), en las siguientes condiciones: 1. Solución salina intravitreal (vehículo), 2. Dosis alta de bindarit, 2 pg/pl, (sin toxina), 3. Toxina dosis baja 2 pg/pl de bindarit, 4. Toxina alta dosis 20 pg/pl de bindarit NaIÜ3 y 5. La toxina sola.
La figura 38 muestra que, en una línea celular RPE humana inmortalizada, bindarit reduce la translocación de NFkb al núcleo.
Por último, se abordaron los efectos de la hiperglucemia en células de RPE humanas aisladas. En presencia de hiperglucemia (es decir, glucosa en suero elevada) y en ausencia de insulina, la mayoría de las células se vuelven hipoglucémicas. Esto también es cierto para las células que no responden o son resistentes a la insulina. Sin embargo, las células del cerebro y la retina captan altos niveles de glucosa en ausencia de insulina y así se tornan hiperglucémicas. A niveles bajos, esto puede estimular la actividad celular, sin embargo, a niveles más altos de glucosa, se vuelve tóxico, incitando a la inflamación y conduciendo a la formación de productos finales glicados avanzados (AGE). La línea celular humana inmortalizada, hTERT, fue incubada con concentraciones normal, mediaalta y muy alta de D-glucosa. La actividad celular, medida en unidades de fluorescencia, fue normalizada contra concentraciones estándar de glucosa; L-glucosa sirvió como control osmótico. Las células se incubaron durante cinco días, con o sin bindarit. La figura 39 muestra que bindarit normaliza el estrés celular en células hTERT incubadas con glucosa alta. Este ejemplo, entre otros, apunta al bindarit como un agente para el tratamiento de la retinopatía diabética.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Una composición para uso en el tratamiento de una enfermedad ocular diabética, que comprende una cantidad efectiva de un compuesto de Fórmula I:
Figure imgf000045_0001
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, donde:
cada uno de R1 y R2 es independientemente H o un C1-C6 alquilo y R3 es H o un C1-C6 alquilo, y
el compuesto se administrará oftálmicamente en una cantidad eficaz a un sujeto que lo necesite.
2. La composición para uso de la reivindicación 1, donde el compuesto de Fórmula I es bindarit.
3. La composición para uso de la reivindicación 1, donde la enfermedad ocular diabética es retinopatía diabética o edema macular diabético (DME).
4. La composición para uso de la reivindicación 1, donde la enfermedad ocular diabética es una catarata o glaucoma.
5. La composición para uso de la reivindicación 1, donde el sujeto tiene diabetes tipo 1 o tipo 2.
6. La composición para uso de la reivindicación 5, donde el sujeto tiene un nivel de glucosa en sangre que es superior a los niveles normales.
7. La composición para uso de la reivindicación 1, donde el uso es reducir la translocación de NFxb al núcleo en las células del ojo del sujeto.
8. La composición para uso de la reivindicación 1, donde el uso es normalizar el estrés celular en células hiperglucémicas.
9. La composición para uso de la reivindicación 1, donde el uso es reducir la expresión en el sujeto de uno o más de Ccl2, Icam-1, y Vcam-1.
10. La composición para uso de la reivindicación 1, donde el uso es , además, comprender la administración de uno o más agentes terapéuticos adicionales.
11. La composición para uso de la reivindicación 10, donde uno o más de los agentes terapéuticos adicionales son seleccionados de entre un agente anti-VEGF, un inhibidor de ACE, un agonista o agonista parcial de PPAR-gamma, un inhibidor de renina, un esteroide y un agente que modula la autofagia, un semapimod, un inhibidor de MIF, un inhibidor de CCR2, CKR-2B, un 2-tioimidazol, CAS 445479-97-0, CCX140, clodronato, una preparación de clodonato-liposoma y cloruro de gadolinio.
12. La composición para uso de la reivindicación 1, donde la administración oftálmica es administración intravítrea o intraocular.
13. La composición para uso de la reivindicación 12, donde el compuesto se formula para liberación controlada
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o liberación sostenida.
14. La composición para uso de la reivindicación 12, donde el compuesto se administra de manera intravítrea.
4
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