ES2784774T3

ES2784774T3 - Composiciones alimenticias de harina de microalgas ricas en lípidos

Info

Publication number: ES2784774T3
Application number: ES11769630T
Authority: ES
Inventors: John Piechocki; Dana Zdanis; Leslie Norris; Walt Rakitsky; Beata Klamczynska
Original assignee: Corbion Biotech Inc
Current assignee: Corbion Biotech Inc
Priority date: 2010-04-14
Filing date: 2011-04-14
Publication date: 2020-09-30
Anticipated expiration: 2031-04-14
Also published as: MX347228B; CA2796395A1; WO2011130578A3; KR101914694B1; KR20180039763A; JP2016041082A; CA2796395C; EP2557937A4; KR20130055597A; JP2013523188A; US20170119005A1; EP2557937B1; WO2011130578A2; KR101849367B1; US20110256282A1; BR112012026241A2; JP5865894B2; US20200015490A1; MX2012011827A; EP2557937A2

Abstract

Una composición alimenticia congelada que comprende: (a) harina de algas producida heterotróficamente, que es un homogeneizado en polvo de biomasa de microalgas que contiene células lisadas mecánicamente en las que más del 50% de las células han sido alteradas de manera que los componentes intracelulares de la célula ya no están completamente encerrados dentro de la membrana celular, dicha harina de algas comprendiendo menos de 200 ppm de clorofila y más del 20% de aceite de triglicéridos en peso seco, en donde menos del 5% en peso del aceite es ácido docosahexaenoico (DHA); (b) por lo menos un ingrediente comestible adicional; y (c) gas; en donde la composición alimenticia congelada comprende una fase continua y una fase gaseosa discontinua, y en donde el porcentaje del volumen de los alimentos aportados por el gas está entre el 1% y el 50%.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones alimenticias de harina de microalgas ricas en lípidos

REFERENCIA A UN LISTADO DE SECUENCIAS

La presente solicitud incluye un Listado de Secuencias, adjunto al final de la Descripción Detallada de la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La invención radica en el área de la preparación de alimentos y la nutrición animal y humana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Conforme la población humana sigue en aumento, hay una necesidad cada vez mayor de fuentes alimenticias adicionales, en particular de fuentes alimenticias que no sean costosas de producir, pero que sean nutritivas. Además, la dependencia actual de la carne como el alimento principal en muchas dietas, al menos en los países más desarrollados, contribuye de manera significativa a la liberación de gases de efecto invernadero, y existe la necesidad de nuevos alimentos que sean igual de sabrosos y nutritivos, cuya producción sea menos dañina para el medio ambiente.

Al requerir solo "agua y luz solar" para crecer, hace tiempo que las algas se ven como una fuente alimenticia potencial. Si bien determinados tipos de algas, principalmente las algas marinas, proporcionan alimentos importantes para el consumo humano, la promesa de las algas como alimento no se ha concretado. Los polvos de algas elaborados con algas que crecen fotosintéticamente en lagunas al aire libre o fotobiorreactores se encuentran disponibles comercialmente, pero tienen un color verde oscuro (por la clorofila) y un gusto fuerte y desagradable. Cuando se formulan en productos alimenticios o como suplementos nutricionales, estos polvos de algas le dan un color verde poco atractivo visualmente al producto alimenticio o suplemento nutricional y tienen un sabor a pescado o a planta marina desagradable.

Hoy en día existen varias especies de algas que se utilizan en alimentos, las que más se utilizan son las macroalgas como el quelpo, el laver púrpura (Porphyra, utilizada en el nori), dulse (Palmaria palmate) y la lechuga de mar (Ulva lactuca). Las microalgas, tales como la espirulina (Arthrospira platensis), se cultivan comercialmente en lagos al aire libre (fotosintéticamente) para utilizarlas como suplemento nutricional o para incorporarlas en pequeñas cantidades en licuados o jugos (normalmente menos de 0.5 % p/p). Otras microalgas, incluidas algunas especias de Chlorella, son populares en países asiáticos como suplemento nutricional.

Además de estos productos, el aceite de algas con alto contenido de ácido docosahexaenoico (ADH) se utiliza como un ingrediente en fórmulas infantiles para lactantes. El ADH es un aceite altamente poliinsaturado. El ADH tiene propiedades antiinflamatorias y es un suplemento bien conocido, así como también un aditivo utilizado en la preparación de alimentos. Sin embargo, el ADH no es adecuado para los alimentos cocidos porque se oxida con el calor. Además, el ADH es inestable cuando se expone al oxígeno, incluso a temperatura ambiente en presencia de antioxidantes. La oxidación del ADH produce un gusto a pescado y un olor desagradable. La Solicitud de Patente de Estados Unidos 2003/0138477 y la Patente de Estados Unidos 5.567.732 divulgan la preparación de harina de algas que comprende aceite de triglicéridos para aplicaciones alimenticias.

Sigue existiendo una necesidad de métodos para producir alimentos a partir de las algas de manera económica y eficiente, a gran escala, en particular alimentos que sean sabrosos y nutritivos. La presente invención satisface esta y otras necesidades.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En un primer aspecto, la presente invención se dirige a una composición alimenticia congelada como se define en la reivindicación 1. En algunos casos, el volumen de alimentos aportados por el gas está entre el 10% y el 60%. En algunos casos, el gas es aire. En algunos casos, el porcentaje del volumen de alimentos aportados por el gas está entre el 10 y el 50%. En algunos casos, la fase continua comprende del 0 al 30% de azúcar u otro agente edulcorante natural o artificial, en peso.

En algunas realizaciones, la harina de algas tiene entre 5% y 70% de carbohidratos en peso en seco. En algunos casos, la harina de algas tiene entre 25% y 40% de carbohidratos en peso en seco. En algunos casos, el componente de carbohidratos de la biomasa es de entre alrededor de 25% y 70%, opcionalmente 25% y 35% de fibra alimentaria y alrededor de 2% a 10%, opcionalmente de 2% a 8% de azúcar libre, que incluye sacarosa, en peso en seco. En algunas realizaciones, la composición de monosacáridos del componente de fibra alimentaria de la biomasa es (a) de 3 a 17% de arabinosa, (b) de 7 a 43% de manosa, (c) de 18 a 77% de galactosa y (d) de 11 a 60% de glucosa. En algunas realizaciones, la composición de monosacáridos del componente de fibra alimentaria de la biomasa es (a) de 0.1 a 4% de arabinosa, (b) de 5 a 15% de manosa, (c) de 15 a 35% de galactosa y (d) de 50 a 70% de glucosa. En algunos casos, la harina de algas tiene entre 0 y 115 pg de carotenoides totales por gramo de harina de algas, que incluye de 20 a 70 pg de luteína por gramo de harina de algas. En algunos casos, el aceite dentro de la harina de algas tiene de 1 a 8 mg de tocoferoles totales por 100 gramos de harina de algas, que incluye de 2 a 6 mg de alfa tocoferol por 100 gramos de harina de algas. En algunos casos, la harina de algas tiene de 0.05 a 0.30 mg de tocotrienoles totales por gramo de harina de algas, que incluye de 0.10 a 0.25 mg de alfa tocotrienol por gramo de harina de algas.

En algunas realizaciones, la biomasa deriva de un alga que es una especie del género Chlorella. En algunos casos, el alga es Chlorella protothecoides. En algunas realizaciones, la biomasa deriva de un alga con una mutación del color de pigmentación del color reducida en comparación con la variedad de la cual derivó.

En algunas realizaciones, la biomasa de algas y la harina de algas derivan de algas cultivadas y procesadas en condiciones de buena práctica de fabricación (GMP).

En algunos casos, al menos un ingrediente comestible adicional se selecciona del grupo que consiste en azúcar, agua, leche, crema, jugo de frutas, concentrado de jugo de frutas, huevos enteros, claras de huevo, granos y grasa animal u otra grasa. En algunos casos, la composición se selecciona del grupo que consiste en helado, gelato, sorbete, mousse, flan, natillas, merengue, paté, productos de panadería y confitería, mousse, cobertura de lácteos batidos, yogur congelado, rellenos batidos y salsa.

En un segundo aspecto, la presente invención está dirigida a un método de elaborar un alimento aireado como se define en la reivindicación 5. La harina de algas puede comprender del 0,5% al 5%, del 0,5% al 2,5% o del 0,5% al 1% de la dispersión.

En un tercer aspecto, la presente invención está dirigida a un producto cárnico como se define en la reivindicación 6.

En algunas realizaciones, la carne contiene como máximo 10% de grasa animal, o como máximo 30% de grasa animal. En algunos casos, la carne contiene como máximo 7% de grasa animal. En algunos casos, la carne contiene como máximo 3% de grasa animal, o como máximo 1% de grasa animal. En algunas realizaciones, el producto cárnico contiene alrededor de 0.5% a alrededor de 2.5% p/p de harina de algas, o de alrededor de 0.5% a alrededor de 10% p/p de harina de algas. En algunos casos, la harina de algas contiene de alrededor de 20 a 60% o de 25% a 70% de aceite de algas en peso en seco. En algunos casos, la harina de algas está hecha a partir de microalgas del género Chlorella. En algunos casos, la harina de algas está hecha a partir de microalgas de la especie Chlorella protothecoides. En algunas realizaciones, el producto cárnico es una carne triturada. En algunos casos, el producto cárnico es una carne procesada. En algunas realizaciones, la harina de algas no tiene color verde o amarillo visible. En algunos casos, la harina de algas tiene menos de 500 ppm de clorofila. En algunas realizaciones, la carne se selecciona del grupo que consiste en carne de vaca, bisonte, cordero, ovino, oveja, venado, pescado, pollo, cerdo, jamón y pavo.

En un cuarto aspecto, la presente invención está dirigida a una composición alimenticia láctea como se define en la reivindicación 6, opcionalmente en donde entre 20% y 90%, entre 25% y 85%, entre 30% y 80%, más de 25%, más de 30%, más de 35%, más de 40%, más de 45%, más de 50%, aproximadamente 10%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, y aproximadamente 100% de la grasa en los alimentos es proporcionada por la harina de algas. En algunos casos, la composición alimenticia láctea se selecciona del grupo que consiste en queso, leche, suero de la manteca, crema, manteca, producto untable y yogur.

Las características preferidas de las invenciones reivindicadas se definen en las reivindicaciones dependientes.

Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se describen en los dibujos adjuntos, de los cuales sigue inmediatamente una breve descripción, y en la descripción detallada de la invención a continuación, y se ilustran en los ejemplos más adelante. Todas las características tratadas anteriormente y a lo largo de la solicitud pueden combinarse en varias realizaciones de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente descripción detallada de la invención se divide en secciones y subsecciones para la conveniencia del lector. La Sección I proporciona definiciones para varios términos utilizados en la presente. La Sección II, en las partes A-E, describe métodos para preparar biomasa de microalgas, lo que incluye organismos adecuados (A), métodos para generar una variedad de microalgas que no tenga o que tenga una pigmentación reducida de manera significativa (B), condiciones de cultivo (C), condiciones de concentración (D), y composición química de la biomasa producida según la invención (E). La Sección III describe métodos para procesar la biomasa de microalgas en harina de algas y harina de algas desgrasada de la invención. La Sección IV describe varios alimentos de la invención y métodos para combinar biomasa de microalgas con otros ingredientes alimenticios.

Todos los procesos descritos en la presente pueden ser llevados a cabo según GMP o normas equivalentes. En los Estados Unidos, las normas GMP para la elaboración, embalaje o manejo de alimentos humanos se codifican en 21 C.F.R. 110. Estas disposiciones, así como las disposiciones secundarias a las que se hace referencia en la presente, se incorporan a la presente como referencia en su totalidad para todos los fines. Las condiciones GMP en los Estados Unidos, y condiciones equivalentes en otras jurisdicciones, se aplican al determinar si un alimento es adulterado (el alimento ha sido elaborado en condiciones que no son adecuadas para un alimento) o ha sido preparado, envasado o mantenido en condiciones insalubres de manera que se haya contaminado o sea de otra manera perjudicial para la salud. Las condiciones de GMP pueden incluir adherir a normas que rijan: el control de enfermedades; la higiene y capacitación del personal; el mantenimiento y operación sanitaria de edificios e instalaciones; suministro de instalaciones y alojamientos sanitarios adecuados; diseño, construcción, mantenimiento e higiene de equipos y utensilios; suministro de procedimientos de control de calidad adecuados para asegurar que se tomen todas las precauciones razonables en el recibimiento, la inspección, el trasporte, la segregación, la preparación, la elaboración, el envasado y el almacenamiento de productos alimenticios según principios de sanidad adecuados para prevenir la contaminación producida por cualquier fuente; y el almacenamiento y transporte de comida terminada en condiciones que protejan la comida de la contaminación física, química o indeseada de microbios, así como también del deterioro de la comida y el envase.

I. DEFINICIONES

A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente invención. Las definiciones generales de muchos de los términos utilizados en la presente pueden encontrarse en Singleton et ál., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a edición 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a edición, R. Rieger et ál. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991).

"Porcentaje de área" se refiere a la determinación del porcentaje de área de picos cromatográficos, espectroscópicos u otros picos generados durante la experimentación. La determinación del área bajo la curva de un pico y el porcentaje de área de un pico en particular lo logra rutinariamente un experto en la técnica. Por ejemplo, en métodos de detección FAME GC/FID, en los que las moléculas de ácido graso en la muestra son convertidas en éster metílico de ácido graso (FAME), se observó un pico separado para un ácido graso de 14 átomos de carbono sin insaturación (C14:0) en comparación con cualquier otro ácido graso tal como C14:1. El área pico para cada clase de FAME es directamente proporcional al porcentaje de su composición en la mezcla y se calcula en función de la suma de todos los picos presentes en la muestra (es decir, [área bajo pico específico/ área total de todos los picos medidos] X 100). Cuando se hace referencia a perfiles lipídicos de aceites y células de la invención, "al menos 4% C8-C14" significa que al menos un 4% de los ácidos grases totales en la célula o en la composición glicerolipídica extraída posee una longitud de cadena que incluye 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono.

"Alimento aireado" significa cualquier producto alimenticio compuesto por una fase continua y discontinua, donde la fase continua es típicamente una solución acuosa y la fase discontinua es típicamente un gas (aire). La fase continua del alimento aireado tiene una propiedad estabilizadora, lo que permite la formación estable de burbujas de gas (aire) en el alimento. Los ejemplos no taxativos de alimentos aireados incluyen mousses, helado y sorbetes.

"Axénico" significa un cultivo de un organismo que no está contaminado por otros organismos vivos.

"Producto de panadería" significa un producto alimenticio, que típicamente se encuentra en una panadería, que se prepara mediante el uso de un horno y normalmente contiene un agente de fermentación. Los productos de panadería y confitería incluyen, de modo no taxativo, brownies, galletitas, tartas, pasteles y bollos.

"Material celulósico" se refiere a los productos de la digestión de la celulosa, en particular glucosa y xilosa. La digestión de la celulosa produce típicamente compuestos adicionales tales como disacáridos, oligosacáridos, lignina, furfurales y otros compuestos. Las fuentes de material celulósico incluyen, por ejemplo, de modo no taxativo, bagazo de caña de azúcar, pulpa de remolacha azucarera, rastrojo de maíz, astillas de madera, aserrín y pasto aguja.

"Cocultivo" y variantes de este, tales como "cocultivar" y "cofermentar" significan que dos o más tipos de células están presentes en el mismo biorreactor en condiciones de cultivo. Los dos o más tipos de células típicamente son, a efectos de la presente invención, ambos microorganismos, ambos microalgas, pero en algunos casos pueden incluir un tipo de célula que no sea de microalga. Las condiciones de cultivo adecuadas para el cocultivo incluye, en algunos casos, las que fomentan el crecimiento y/o la propagación de los dos o más tipos de células y, en otros casos, las que facilitan el crecimiento y/o la proliferación de solo uno, o solo un subgrupo de las dos o más células mientras mantiene el crecimiento celular para el resto.

"Carne triturada" significa un producto cárnico que se forma reduciendo el tamaño de los trozos de carne, lo que fomenta la extracción de proteínas solubles en sales que permiten que la carne triturada se una. La trituración también da como resultado una distribución uniforme de grasa, músculo y tejido conjuntivo. Los ejemplos no taxativos de carne triturada incluyen, medallones de carne, salchichas y perros calientes.

"Carne procesada" se refiere a carne triturada y tiene la apariencia de un corte, tajada o porción de la carne que ha sido desintegrada y se forma "dándole vueltas" a la carne molida, con o sin la adición de carne finamente triturada, donde las proteínas solubles de la carne molida unen los trozos de carne. Los nuggets de pollo son un ejemplo no taxativo de carne procesada.

"Citólisis" significa la lisis de células en un entorno hipotónico. La citólisis es producida por la ósmosis, o movimiento de agua hacia el interior de una célula hasta alcanzar un estado de hiperhidratación, de forma que la célula no puede soportar la presión osmótica del agua en el interior y entonces explota.

"Fibra alimentaria" se refiere a carbohidratos no almidonados que se encuentran en las plantas y otros organismos que contienen paredes celulares, incluidas las microalgas. La fibra alimentaria puede ser soluble (disolverse en agua) o insoluble (no ser capaz de disolverse en agua). La fibra soluble e insoluble constituyen el total de la fibra alimentaria.

"Dispersión" significa una mezcla en la cual las partículas finas de al menos una sustancia se encuentran esparcidas en otra sustancia. Si bien una dispersión puede implicar cualquier partícula que se encuentre esparcida en la fase continua de una composición diferente, el término "dispersión", como se utiliza en la presente, se refiere a un sólido fino de una sustancia que se encuentra esparcida o dispersa en otra sustancia, normalmente un líquido. Una emulsión es un tipo especial de dispersión que abarca una mezcla de dos o más líquidos no miscibles.

"Ingrediente comestible" significa cualquier sustancia o composición que es adecuada para el consumo. Los "ingredientes comestibles" incluyen, de modo no taxativo, granos, frutas, vegetales, proteínas, hierbas, especias, carbohidratos, azúcar y grasas.

El término "ingrediente", como se usa en la presente, significa ingredientes usados en alimentos y/o composiciones alimenticias. "Ingrediente" incluye, de modo no taxativo, conservantes, saborizantes, aditivos alimenticios, colorantes alimenticios, sustitutos del azúcar y otros ingredientes encontrados en varios alimentos.

"Proporcionado de manera exógena" significa una molécula proporcionada a una célula (lo que incluye las moléculas proporcionadas a los medios de una célula cultivada).

"Fibra" se refiere a carbohidratos no almidonados en la forma de polisacárido. La fibra puede ser soluble en agua o insoluble en agua. Muchas microalgas producen tanto fibra soluble como fibra insoluble, que típicamente se encuentra en la pared celular.

"Producto alimenticio terminado" e "ingrediente alimenticio terminado" significa una composición alimenticia que está lista para su envasado, uso o consumo. Por ejemplo, un "producto alimenticio terminado" puede haber sido cocinado o los ingredientes que comprenden el "producto alimenticio terminado" puede haber sido mezclados o integrados de otra manera los unos con los otros. Un "ingrediente alimenticio terminado" se utiliza típicamente en combinación con otros ingredientes para formar un producto alimenticio.

"Alimento", "composición alimenticia" y "producto alimenticio" se refieren a cualquier composición destinada o que se espera que sea ingerida por seres humanos como una fuente de nutrición y/o calorías. Las composiciones alimenticias están compuestas principalmente por carbohidratos, grasas, agua y/o proteínas y conforman de manera sustancial todo el consumo calórico diario de una persona. Una "composición alimenticia" puede tener un peso mínimo que es al menos diez veces el peso de un típico comprimido o cápsula (los rangos de peso de un típico comprimido/cápsula son menores o iguales a 100 mg hasta 1500 mg). Una "composición alimenticia" no está encapsulada ni en forma de comprimido.

"Perfil glicerolípido" se refiere a la distribución de diferentes longitudes de cadena de carbonos y niveles de saturación de glicerolípidos en una muestra en particular de biomasa o aceite. Por ejemplo, una muestra puede tener un perfil glicerolípido en el cual aproximadamente 60% del glicerolípido es C18:1,20% es C18:0, 15% es C16:0 y 5% es C14:0. Cuando se hace referencia a una longitud de carbono de manera genérica, como "C:18", tal referencia puede incluir cualquier cantidad de saturación; por ejemplo, biomasa de microalgas que contiene 20% (en peso/masa) de lípido como C:18 puede incluir C18:0, C18:1, C18:2 y similares, en cantidades equivalentes o diferentes, la suma de lo cual constituye un 20% de la biomasa. La referencia a porcentajes de un determinado tipo de saturación, sal como "al menos 50% monoinsaturado en una forma glicerolípida 18:1" significa que las cadenas laterales alifáticas de los glicerolípidos son al menos 50% 18:1, pero no significa necesariamente que al menos 50% de los triglicéridos sean trioleína (tres cadenas 18:1 unidas a una única estructura principal de glicerol); tal perfil puede incluir glicerolípidos con una mezcla 18:1 y otras cadenas laterales, siempre que al menos un 50% de las cadenas laterales totales sean 18:1.

"Buenas prácticas de fabricación" y "GMP" se refieren a las condiciones establecidas por normas dispuestas en 21 C.F.R. 110 (para la alimentación humana) y 111 (para los suplementos nutricionales), o marcos normativos comparables establecidos en ubicaciones fuera de los Estados Unidos. Las normas estadounidenses son promulgadas por la Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos bajo la autoridad de la Ley Federal de Alimentación, Fármacos y Cosméticos que rige a los fabricantes, procesadores y envasadores de productos alimenticios y suplementos nutricionales para el consumo humano.

"Homogeneizado" significa biomasa que ha sido físicamente desintegrada. La homogeneización es un proceso mecánico y fluido que implica la subdivisión de partículas o aglomerados en tamaños más pequeños y más uniformes, formando una dispersión que puede estar sujeta a un procesamiento adicional. La homogeneización se utiliza en el tratamiento de varios alimentos y productos lácteos para mejorar la estabilidad, la vida útil, la digestión y el sabor.

"Lípido" significa cualquiera de una clase de moléculas que son solubles en solventes no polares (como el éter y el hexano) y relativa o completamente insolubles en agua. Las moléculas lipídicas poseen estas propiedades porque se encuentran compuestas en gran medida por colas de hidrocarburo largas que son hidrofóbicas por naturaleza. Los ejemplos de lípidos incluyen ácidos grasos (saturados e insaturados); glicéridos o glicerolípidos (como los monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos o grasa neutrales y fosfoglicéridos o glicerofosfolípidos); y no glicéridos (esfingolípidos, tocoferoles, tocotrienoles, lípidos esteroles, que incluyen el colesterol y hormonas esteroides, lípidos prenoles, que incluyen los terpenoides, alcoholes grasos, ceras y policétidos).

"Microalgas" se refiere a un organismo microbiano eucariota que contiene cloroplastos, y que pueden tener la capacidad o no de llevar a cabo la fotosíntesis. Las microalgas incluyen fotótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente de carbono fija como energía, así como también heterótrofos, que pueden vivir solo de una fuente de carbono fija, que incluye heterótrofos obligados, que no pueden llevar a cabo la fotosíntesis. Las microalgas incluyen organismos unicelulares que se separan de células hermanas inmediatamente después de la división celular, como las Chlamydomonas, así como también microbios como, por ejemplo, Volvox, el cual es un microbio fotosintético multicelular simple de dos tipos celulares distintos. "Microalgas" también incluye células como Chlorella, Parachlorella y Dunaliella.

"Biomasa de microalgas", "biomasa de algas" y "biomasa" se refieren al material producido por el crecimiento y/o la propagación de células de microalgas. La biomasa puede contener células y/o contenido intracelular, así como también material extracelular. El material extracelular incluye, de modo no taxativo, compuestos segregados por una célula.

"Aceite de microalgas" y "aceite de alga" significan cualquiera de los componentes lipídicos producido por células de microalgas, incluyendo a los triacigliceroles.

"Micronizado" significa biomasa en la cual las células han sido desintegradas. Por ejemplo, las células pueden desintegrarse mediante métodos bien conocidos que incluyen procesos a alta presión, mecánicos, de cizallamiento, ultrasonidos (o equivalentes), de manera que al menos un 50% del tamaño de las partículas (tamaño medio de partícula) no sea de más de 10 pm en su mayor dimensión o diámetro de una esfera de volumen equivalente. Típicamente, al menos 50% a 90% o más de tales partículas son menores a 5 pm en su dimensión o diámetro mayor de una esfera de volumen equivalente. En todo caso, el promedio de tamaño de partícula de biomasa micronizada es menor que la célula de microalgas intacta. Los tamaños de partículas a los que se hace referencia son los que resultan de la homogeneización y son medidos preferentemente inmediatamente después de que ha ocurrido la homogeneización y antes de secar para evitar posibles deformaciones causadas por el agrupamiento de partículas durante el secado. Algunas técnicas de medir el tamaño de las partículas, como la difracción láser, detectan el tamaño de las partículas grupadas más que el de las partículas individuales y pueden mostrar un tamaño de partícula aparente mayor (por ejemplo, un promedio de tamaño de partículas de 1-100 pm) luego del secado. Debido a que las partículas son típicamente aproximadamente esféricas en forma, el diámetro de una esfera de volumen equivalente y la dimensión más larga de una partícula son aproximadamente los mismos.

"Aceite" significa cualquier aceite de triacilglicéridos (o triglicéridos), producido por organismos, que incluye microalgas, otras plantas y/o animales. "Aceite", diferenciado de "grasa", se refiere, al menos que se indique lo contrario, a lípidos que son por lo general líquidos a temperatura ambiente y presiones normales. Sin embargo, el aceite de coco es típicamente sólido a temperatura ambiente, como lo son algunos aceites de palma y aceites de palmiste. Por ejemplo, "aceite" incluye aceites vegetales o de semilla derivados de plantas, que incluyen, de modo no taxativo, un aceite derivado de la soja, colza, canola, palma, palmiste, coco, maíz, oliva, girasol, algodón, cuphea, maní, camelina sativa, semilla de mostaza, castaña de cajú, avena, lupina, kenaf, caléndula, cáñamo, café, linaza, avellana, euforbia, semilla de calabaza, cilantro, camelina, sésamo, cártamo, arroz, árbol de aceite de tung, cacao, copra, amapola de opio, porotos de ricino, nuez, jojoba, jatropha, macadamia, nueces brasileras y avocado, así como combinaciones de estos.

"Polisacárido" y "glicano" se refieren a cualquier carbohidrato hecho a partir de monosacáridos unidos los unos a los otros mediante enlaces glucosídicos. La celulosa es un ejemplo de un polisacárido que compone determinadas paredes celulares vegetales.

"Predominantemente encapsulado" significa que más de un 50% y típicamente más de un 75% a 90% de un componente referido, por ejemplo, aceite de algas, está secuestrado en un recipiente al que se hace referencia, que puede incluir, por ejemplo, una célula de microalgas.

"Células predominantemente intactas" y "biomasa predominantemente intacta" significan una población de células que comprende más de 50, y con frecuencia, más de 75, 90 y 98% de células intactas. "Intacto", en este contexto, significa que la continuidad física de la membrana celular y/o la pared celular que encierra a los componentes intracelulares de la célula no ha sido desintegrada de una manera que pueda liberar los componentes intracelulares de la célula en la medida en que exceda la permeabilidad de la membrana celular en cultivo.

"Predominantemente lisado" significa una población de células en las cuales más del 50% y típicamente más del 75 al 90% de las células ha sido desintegrado de manera tal que los componentes intracelulares de la célula no se encuentran más completamente encerrados dentro de la membrana de la célula.

"Especies de furfural" significa 2-furancarboxaldehído y los derivados de este que conservan las mismas características estructurales básicas.

"Rastrojo" significa los tallos y hojas secas de un cultivo, que quedan luego de que un grano de ese cultivo se ha cosechado.

"Adecuado para el consumo humano" significa que una composición puede ser consumida por seres humanos como ingestión nutricional sin efectos perjudiciales para la salud y puede proporcionar una ingestión calórica significativa debido a la absorción de material digerido en el tracto gastrointestinal.

"Producto no cocinado" se refiere a una composición que no ha sido sometida a calentamiento pero puede incluir uno o más componentes previamente sometidos a calentamiento.

II. MÉTODOS PARA PREPARAR BIOMASA DE MICROALGAS

Se divulgan biomasa de algas adecuada para el consumo humano, que es rica en nutrientes, incluyendo constituyentes lipídicos y/o proteínas, métodos para combinarlos con ingredientes comestibles y composiciones alimenticias que los contienen. La invención surge en parte de los descubrimientos de que la biomasa de algas puede prepararse con un alto contenido de aceite y/o con excelente funcionalidad y la biomasa resultante incorporada en productos alimenticios. De manera adicional, la biomasa de algas desgrasada (en forma de harina de algas desgrasada) puede proporcionar una única y sorprendente funcionalidad y puede ser incorporada en productos alimenticios. La biomasa también proporciona varios micronutrientes beneficiosos además del aceite y/o proteína, como fibras alimentarias derivadas de algas (tanto carbohidratos solubles como insolubles), fosfolípidos, glicoproteína, fitoesteroles, tocoferoles, tocotrienoles y selenio. La biomasa de algas comprende las células de algas que crecieron, se cultivaron o se propagaron como se describe en la presente o en condiciones conocidas por los expertos en la técnica.

Esta sección primero estudia los tipos de microalgas adecuados para su uso en los métodos de la invención (parte A), métodos para generar una variedad de microalgas que carece de pigmentación o esta se encuentra reducida de manera significativa (parte B), luego las condiciones de cultivo (parte C) que se utilizan para propagar la biomasa, luego las etapas de concentración que se utilizan para preparar la biomasa para un procesamiento adicional (parte D) y concluye con una descripción de la composición química de la biomasa preparada según los métodos de la invención (parte E).

A. Microalgas para uso en los métodos de la invención

Una variedad de especies de microalgas que producen aceites y/o lípidos adecuados y/o proteína puede ser utilizada según los métodos de la presente invención, aunque se prefieren las microalgas que producen naturalmente altos niveles de aceites y/o lípidos y/o proteína adecuados. Las consideraciones que afectan la selección de microalgas para su uso en la invención incluyen , además de la producción de aceites, lípidos o proteínas adecuadas para la producción de productos alimenticios: (1) alto contenido de lípidos (o proteínas) como porcentaje en el peso celular; (2) facilidad de crecimiento; (3) facilidad de propagación; (4)facilidad de procesamiento de biomasa; (5) perfil glicerolipídico; y (6) ausencia o casi ausencia de toxinas de algas (el ejemplo 4 más adelante demuestra que la biomasa de microalgas seca y los aceites o lípidos extraídos de la biomasa carecen de toxinas de algas detectables).

En algunas realizaciones, la pared celular de las microalgas deben ser desintegradas durante el procesamiento de los alimentos (por ejemplo, la cocción) para liberar los componentes funcionales y, en estas realizaciones, se prefieren las especies de microalgas con paredes celulares susceptibles de ser digeridas en el tracto gastrointestinal de un animal, por ejemplo, un ser humano u otro monogástrico, especialmente si la biomasa de algas va a usarse en productos alimenticios no cocinados.

La digestibilidad se ve por lo general disminuida en las especies de microalgas que tienen un alto contenido de celulosa/hemicelulosa en las paredes celulares. La digestibilidad puede ser evaluada mediante el uso de ensayos estándares conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, en ensayo de digestibilidad de la pepsina.

En realizaciones particulares, las microalgas comprenden células que contienen al menos un 10% o más de aceite en peso en seco. En otras realizaciones, las microalgas contienen al menos del 25 al 35% o más de aceite en peso en seco. Por lo general, en estas realizaciones, cuanto más aceite contiene la microalga, más nutritiva es la biomasa, por lo tanto, se prefieren especialmente las microalgas que pueden cultivarse para que contengan al menos un 40%, al menos 50%, 75% o más de aceite en peso en seco. Las microalgas preferidas para su uso en los métodos de la invención pueden cultivarse heterotróficamente (en azúcares en ausencia de luz) o son heterótrofos obligados. No todos los tipos de lípidos son deseables para usarse en alimentos y/o nutracéuticos, y que pueden tener un sabor u olor desagradable, así como exhibir una estabilidad pobre o una pobre sensación en la boca, y estas consideración también incluyen en la selección de microalgas que se usarán en los métodos de la invención.

Las microalgas del género Chlorella son por lo general útiles en los métodos de la invención. Chlorella es un género de algas verdes de una sola célula, que pertenece al filo Chlorophyta. Las células de Chlorella son por lo general de forma esférica, de alrededor de 2 a 10 gm de diámetro, y carecen de flagelos. Algunas especies de Chlorella son heterotróficas por naturaleza. En realizaciones preferidas, las microalgas utilizadas en los métodos de la invención son Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella minutissima, Chlorella zofinienesi, Chlorella luteoviridis, Chlorella kessleri, Chlorella sorokiniana, Chlorella fusca var. vacuolata Chlorella sp., Chlorella cf. minutissima o Chlorella emersonii. Chlorella, en particular Chlorella protothecoides, es un microorganismo cuyo uso se prefiere en los métodos de la invención por su alta composición de lípidos. Las especies particularmente preferidas de Chlorella protothecoides para usarse en los métodos de la invención incluyen las ilustradas en los ejemplos más adelante.

Otras especies de Chlorella cuyo uso es adecuado en los métodos de la invención incluyen las especies seleccionadas del grupo que consiste en anitrata, Antarctica, aureoviridis, candida, capsulate, desiccate, ellipsoidea (incluyendo la variedad CCAP 211/42), emersonii, fusca (incluyendo var. vacuolata), glucotropha, infusionum (incluyendo var. actophila y var. auxenophila), kessleri (incluyendo cualquiera de las variedades UTEX 397,2229,398), lobophora (incluyendo la variedad Sa G 37.88), luteoviridis (incluyendo la variedad SAG 2203 y var. aureoviridis y lutescens), miniata, cf. minutissima, minutissima (incluyendo la variedad UTEX 2341), mutabilis, nocturna, ovalis, parva, photophila, pringsheimii, protothecoides (incluyendo cualquiera de las variedades UTEX 1806, 411, 264, 256, 255, 250, 249, 31, 29, 25 o CCAP 211/8D, o CCAP 211/17 y var. acidicola), regularis (incluyendo var. minima y umbricata), reisiglii (incluyendo la variedad CCP 11/8), saccharophila (incluyendo la variedad CCAP 211/31, CCAP 211/32 y var. ellipsoidea), salina, simplex, sorokiniana (incluyendo la variedad SAG 211.40B), sp. (incluyendo la variedad UTEX 2068 y CCAP 211/92), sphaerica, stigmatophora, trebouxioides, vanniellii, vulgaris (incluyendo las variedades CCAP 211/11K, CCAP 211/80 y f. tertia y var. autotrophica, viridis, vulgaris, vulgaris f. tertia, vulgaris f. viridis), xanthella y zofingiensis.

Las especies de Chlorella (y especies de otros géneros de microalgas) que se pueden usar en la invención pueden identificarse mediante la comparación de determinadas regiones diana de su genoma con las mismas regiones de especies identificadas en la presente; las especies preferidas son las que exhiben identidad o al menos un nivel muy alto de homología con las especies identificadas en la presente. Por ejemplo, la identificación de una especie o variedad de Chlorella específica puede lograrse mediante la amplificación y secuenciación de ADN nuclear y/o de cloroplasto usando cebadores y metodología que utilicen regiones adecuadas del genoma, por ejemplo, mediante el uso de los métodos descritos en Wu et ál., Bot. Bull. Acad. Sin. 42:115-121 (2001), Identification of Chlorella spp. isolates using ribosomal DNA sequences. Los métodos bien establecidos de análisis filogenético, tal como la amplificación y secuenciación del espaciador transcrito interno ribosómico (ITS1 y ITS2 ADNr), ARN 23S, ARNr 18S, y otras regiones genómicas conservadas pueden ser usadas por los expertos en la técnica para identificar especies no solo de Chlorella, sino también otras microalgas que producen aceite y lípidos cuyo uso es adecuado en los métodos descritos en la presente. Para ejemplos de métodos de identificación y clasificación de algas, véase Genetics, 170(4):1601 -10 (2005) y RNA, 11 (4):361 -4 (2005).

Por lo tanto, la comparación de ADN genómico puede utilizarse para identificar especies adecuadas de microalgas para utilizarse en la presente invención. Las regiones de ADN genómico conservado, tales como, de modo no taxativo, ADN que codifica ARNr 23S, pueden amplificarse a partir de especies de microalgas que pueden estar, por ejemplo, taxonómicamente relacionadas con las microalgas preferidas utilizadas en la presente invención y comparadas con las regiones correspondiente de esas especies preferidas. Las especies que exhiben un alto nivel de similitud luego se seleccionan para utilizarse en los métodos de la invención. Más adelante se presentan ejemplos ilustrativos de la comparación de secuencias de ADN entre las especies dentro del género Chlorella. En algunos casos, las microalgas que se prefieren para utilizarse en la presente invención tienen secuencias de ADN genómico que codifican ARNr 23S que posee al menos 65% de identidad de nucleótidos con respecto a al menos una de las secuencias enumeradas en las SEQ ID NO: 1-23 y 26-27. En otros casos, las microalgas que se prefieren para utilizarse en la presente invención tienen secuencias de ADN genómico que codifican ARNr 23S que posee al menos 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de identidad de nucleótidos con respecto a al menos una o más de las secuencias enumeradas en las SEQ ID NO: 1-23 y 26-27. La genotipificación de una composición alimenticia y/o de biomasa de algas antes de que se combine con otros ingredientes para formular una composición alimenticia es también un método confiable para determinar si la biomasa de algas es de más de una variedad sola de microalgas.

Para la comparación de secuencias y determinación del porcentaje de identidad de nucleótidos o aminoácidos, típicamente una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la cual se comparan las secuencias experimentales. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias experimentales y de referencia se ingresan en una computadora, se designan las coordenadas de subsecuencias, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos. El algoritmo de comparación de secuencias luego calcula la identidad de secuencia de porcentaje para las secuencias de prueba en relación con la secuencia de referencia, en base a los parámetros del programa designados. El alineamiento óptimo de las secuencias para la comparación se pueden llevar a cabo, por ej., mediante el algoritmo de homología local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981) mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.

48:443 (1970); mediante el método de búsqueda de similitudes de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), mediante las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA ben el paquete de software de Wisconsin Genetics, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), o mediante la inspección visual (véase en general Ausubel et ál., supra). Otro ejemplo de algoritmo que es adecuado para determinar la identidad de secuencia porcentual y la similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul et ál., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). El software para la realización de los análisis con BLAST se encuentra públicamente disponible a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (en el sitio Web www.ncbi.nlm.nih.gov).

Además de Chlorella, también pueden utilizarse otros géneros de microalgas en los métodos de la presente invención. En realizaciones preferidas, las microalgas son una especie se selecciona del grupo que consiste en Parachlorella kessleri, Parachlorella beijerinckii, Neochloris oleabundans, Bracteacoccus, incluyendo B. grandis, B. cinnabarinas y B. aerius, Bracteococcus sp. o Scenedesmus rebescens. Otros ejemplos no taxativos de especies de microalgas incluyen las especias del grupo de especies y géneros que consiste en Achnanthes orientalis; Agmenellum; Amphiprora hyaline; Amphora, que incluye A. coffeiformis que incluye A.c. linea, A.c. punctata, A.c. taylori, A.c. tenuis, A.c. delicatissima, A.c. delicatissima capitata; Anabaena; Ankistrodesmus, que incluye A. falcatus; Boekelovia hooglandii; Borodinella; Botryococcus braunii, que incluye B. sudeticus; Bracteoccocus, que incluye B. aerius, B.grandis, B.cinnabarinas, B.minor, y B.medionucleatus; Cartería; Chaetoceros, que incluye C. gracilis, C. muelleri, y C. muelleri subsalsum; Chlorococcum, que incluye C. infusionum; Chlorogonium; Chroomonas; Chrysosphaera; Cricosphaera; Crypthecodinium cohnii; Cryptomonas; Cyclotella, que incluye C. cryptica y C. meneghiniana; Dunaliella, que incluye D. bardawil, D. bioculata, D. granulate, D. maritime, D. minuta, D. parva, D. peircei, D. primolecta, D. salina, D. terricola, D. tertiolecta y D. viridis; Eremosphaera, que incluye E. viridis; Ellipsoidon; Euglena; Franceia; Fragilaria, que incluye F. crotonensis; Gleocapsa; Gloeothamnion; Hymenomonas; Isochrysis, que incluye I. aff. galbana y I. galbana; Lepocinclis; Micractinium (que incluye UTEX LB 2614); Monoraphidium, que incluye M. minutum; Monoraphidium; Nannochloris; Nannochloropsis, que incluye N. salina; Navicula, incluyendo N. acceptata, N. biskanterae, N. pseudotenelloides, N. peliculosa, y N. saprophila; Neochloris oleabundans; Nephrochloris; Nephroselmis; Nitschia communis; Nitzschia, que incluye N. alexandrina, N. communis, N. dissipata, N. frustulum, N. hantzschiana, N. inconspicua, N. intermedia, N. microcephala, N. pusilla, N. pusilla elliptica, N. pusilla monoensis y N. quadrangular; Ochromonas; Oocystis, que incluye O. parva y O. pusilla; Oscillatoria, que incluye O. limnetica y O. subbrevis; Parachlorella, que incluye P. beijerinckii (que incluye la variedad SAG 2046) y P. kessleri (que incluye cualquiera de las variedades SAG 11.80, 14.82, 21.11H9); Pascheria, que incluye P. acidophila; Pavlova; Phagus; Phormidium; Platymonas; Pleurochrysis, que incluye P. carterae y P. dentate; Prototheca, que incluye P. stagnora (que incluye UTEX 327), P. portoricensis y P. moriformis (que incluye las variedades UTEX 1441,1435, 1436, 1437, 1439); Pseudochlorella aquatica; Pyramimonas; Pyrobotrys; Rhodococcus opacus; Sarcinoid chrysophyte; Scenedesmus, que incluye S. armatus y S. rubescens; Schizochytrium; Spirogyra; Spirulina platensis; Stichococcus; Synechococcus; Tetraedron; Tetraselmis, que incluye T. suecica; Thalassiosira weissflogii; y Viridiella fridericiana.

Todos los procesos de fermentación están sujetos a la contaminación de otros microbios. La biomasa y la harina de algas de la presente invención se cultivan y procesan en condiciones para minimizar la contaminación. Sin embargo, la contaminación nunca puede evitarse en su totalidad. La contaminación puede ocurrir durante todas las fases de la operación, lo que incluye el cultivo y la propagación, la cosecha de las microalgas, la preparación de la harina de algas y el transporte y almacenamiento de la harina de algas y la biomasa de algas. Las especies de microbios contaminantes pueden o no identificarse.

La harina de algas puede comprender microbios contaminantes menores o iguales que 10,000 unidades formadoras de colonias (CFU) por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menores o iguales que 7,500 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menores o iguales que 5,000 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas o menores o iguales que 2,500 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas.

La harina de algas puede comprender microbios contaminantes, donde el microbio contaminante se selecciona del grupo que consiste en levadura contaminante menor o igual que 200 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menores o iguales que 150 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menores o iguales que 100 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas o menores o iguales que 50 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas. La harina de algas puede comprender microbios contaminantes, donde el microbio contaminante se selecciona del grupo que consiste en moho contaminante menor o igual que 200 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menores o iguales que 150 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menores o iguales que 100 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas o menores o iguales que 50 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas. La harina de algas puede comprender microbios contaminantes, donde el microbio contaminante se selecciona del grupo que consiste en bacterias coliformes contaminante menores o iguales que 10 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, bacterias coliformes menores o iguales que 8 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, bacterias coliformes menores o iguales que 5 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas. La harina de algas puede comprender microbios contaminantes, donde el microbio contaminante se selecciona del grupo que consiste en Escherichia coli contaminante menor o igual que 10 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menor o igual que 8 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menor o igual que 6 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas o menor o igual que 4 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas. La harina de algas puede comprender microbios contaminantes, donde el microbio contaminante se selecciona del grupo que consiste en Staphylococci contaminante menor o igual que 20 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menor o igual que 15 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas, menor o igual que 10 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas o menor o igual que 5 CFU por gramo de biomasa de algas o harina de algas. La harina de algas puede comprender microbios contaminantes, donde la Salmonella, Pseudomonas aeruginosa o Listeria contaminante es indetectable en 50 gramos de biomasa de algas o harina de algas, indetectable en 25 gramos de biomasa de algas o harina de algas, indetectable en 20 gramos de biomasa de algas o harina de algas, indetectable en 15 gramos de algas o harina de algas, indetectable en 10 gramos de harina de algas.

La cantidad de microbios contaminantes puede medirse mediante pruebas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, el conteo de placas aeróbicas totales, los coliformes y E. coli, Salmonella, y la contaminación de Listeria pueden determinarse mediante AOAC 966.23, 966.24, 2004.03 y 999.06 respectivamente. La contaminación de levadura y moho puede medirse mediante los métodos descritos en FDA-BAM, 7a edición; y Staphylococci y Pseudomonas aeruginosa mediante USP31, NF26, 2008; y similares.

En algunas realizaciones, las composiciones alimenticias e ingredientes alimenticios tales como harina de algas o biomasa de algas derivan de algas que poseen al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% de ARNr 23S de identidad de secuencia genómica con respecto a una o más secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26 y SEQ ID NO:27.

B. Métodos de generar una variedad de microalgas que carecen de o que poseen una pigmentación significativamente reducida

Las microalgas, tales como Chlorella, pueden ser capaces de experimentar un crecimiento fotosintético o heterotrófico. Cuando se cultiva en condiciones heterotróficas donde la fuente de carbono es una fuente de carbono fija en ausencia de luz, las microalgas normalmente de color verde tienen un color amarillo, carecen de pigmentación o esta se encuentra reducida de manera significativa. Las microalgas con pigmentación verde reducida (o carentes de ella) pueden ofrecer ventajas como ingredientes alimenticios. Una ventaja de las microalgas de pigmentación verde reducida (o carentes de ella) es que poseen un sabor a clorofila reducido. Otra ventaja de las microalgas de pigmentación verde reducida (o carentes de ella) es que, como ingredientes alimenticios, la adición de las microalgas a alimentos no produce un color verde que pueda ser desagradable para el consumidor. La pigmentación verde reducida de las microalgas cultivas en condiciones heterotróficas es transitoria. Cuando se vuelve al cultivo fototrófico, las microalgas capaces del cultivo fototrófico y heterotrófico recobrará la pigmentación verde. De manera adicional, incluso con pigmentos verdes reducidos, las microalgas cultivadas de forma heterotrófica son de color amarillo y esto puede no ser adecuado para algunas aplicaciones alimenticias en las que el consumidor espera que el color del alimento sea blanco o de color claro. Por lo tanto, es ventajoso generar una variedad de microalgas que pueda ser cultivada de forma heterotrófica (de manera que su pigmentación verde sea reducida o inexistente) y que si pigmentación amarilla sea también reducida (que sea de un color neutro para las aplicaciones alimenticias).

Un método para generar dicha variedad de microalgas que tiene una pigmentación reducida de manera significativa o carece de ella se realiza a través de la mutagénesis y luego el examen para detectar el fenotipo deseado. Se conocen y practican varios métodos de mutagénesis en la técnica. Por ejemplo, Urano et ál., (Urano et ál., J Bioscience Bioengineering (2000) v. 90(5): págs. 567-569) describe las mutaciones de color amarillas y blancas de Chlorella ellipsoidea generadas mediante el uso de radiación ultravioleta. Kamiya (Kamiya, Plant Cell Physiol. (1989) v. 30(4): 513-521) describe una variedad incolora de Chlorella vulgaris, 11h (M125).

Además de la mutagénesis por radiación ultravioleta, puede también emplearse la mutagénesis química con el fin de generar microalgas con pigmentación reducida o carentes de ella. Se ha demostrado que los mutágenos químicos como metanosulfonato de etilo (EMS) o N-metil-N’nitro-N-nitroguanidina (NTG) son mutágenos químicos eficaces en una variedad de microbios que incluyen la levadura, hongos, micobacterias y microalgas. La mutagénesis puede también llevarse a cabo en varios rondas, donde las microalgas se exponen al mutágeno (ya sea ultravioleta o química o ambas) y luego son examinadas para detectar el fenotipo de pigmentación reducida. Las colonias con el fenotipo deseado son luego colocadas rápidamente en placas y se vuelve a aislar para asegurarse de que la mutación es estable de una generación a la próxima y que la colonia es pura y no de una población mixta.

En un ejemplo en particular, se utilizó Chlorella protothecoides para generar variedades que poseían pigmentación reducida o que carecían de ella mediante el uso de una combinación de mutagénesis ultravioleta y química. Chlorella protothecoides se expuso a una ronda de mutagénesis química con NTG y se examinaron colonias para detectar las mutaciones de colores. Las colonias que no exhibían mutaciones de colores se sometieron luego a una ronda de radiación ultravioleta y luego se volvieron a examinar para detectar las mutaciones de colores. En una realización, una variedad de Chlorella protothecoides que carece de pigmentación se aisló y es Chlorella protothecoides 33-55, depositada el 13 de octubre de 2009 en la American Type Culture Collection en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, según el Tratado de Budapest, con una designación del depósito de patente de PTA-10397. En otra realización, una variedad de Chlorella protothecoides de pigmentación reducida se aisló y es Chlorella protothecoides 25-32, depositada el 13 de octubre de 2009 en la American Type Culture Collection en 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, según el Tratado de Budapest, con una designación del depósito de patente de PTA-10396.

C. Condiciones de los medios y de cultivo para las microalgas

Las microalgas se cultivan en medios líquidos para propagar la biomasa según los métodos de la invención. En los métodos de la invención, las especies de microalgas se cultivan en un medio que contiene una fuente fija de carbono y/o nitrógeno en ausencia de luz. Dicho cultivo se conoce como cultivo heterotrófico. Para algunas especies de microalgas, por ejemplo, el cultivo heterotrófico para los períodos extendidos de tiempo como 10 a 15 o más días en condiciones de nitrógeno limitadas dio como resultado una acumulación de un alto contenido de lípidos en las células.

Los medios de cultivos de microalgas típicamente contienen componentes tales como una fuente de carbono fijada (mencionadas más adelante), una fuente de nitrógeno fija (tal como proteína, harina de soja, extracto de levadura, licor de maíz fermentado, amoníaco (puro o en forma de sal), nitrato (o sal de nitrato), oligoelementos (por ejemplo, cinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno en, por ejemplo, las formas respectivas de ZnCl², H³BO³, CoCl²-6H²Ü, CuCl²-2H²Ü, MnCl²-4H²Ü y (NH⁴)⁶Mo⁷O²⁴-4H²O), opcionalmente un amortiguador para mantener el pH, y fosfato (una fuente de fósforo; se pueden utilizar otras sales de fosfato). Otros componentes incluyen sales tales como cloruro de sodio, en particular para las microalgas de agua marina.

En un ejemplo en particular, un medio adecuado para cultivar Chlorella protothecoides comprende Medio de Proteosa. Este medio es adecuado para cultivos axénicos, y puede prepararse 1L de volumen del medio (pH ~6.8) mediante la adición de 1 g de peptona de proteosa a 1 litro de Medio Bristol. El medio Bristol comprende NaNO³2.94 mM, CaCl²-2H²O 0.17 mM, MgSO⁴-7H²O 0.3 mM, 0.43 mM, KH²PO⁴1.29 mM y NaCl 1.43 mM en una solución acuosa. Para 1.5% de medio de agar, se pueden agregar 15 g de agar a 1 L de la solución. La solución se cubre y se trata en una autoclave, y luego se almacena a una temperatura de refrigeración antes del uso. Otros métodos para el cultivo y la propagación de Chlorella protothecoides para altos niveles de aceite como una porcentaje del peso en seco se han descrito (véase, por ejemplo, Miao and Wu, J. Biotechnology, 2004, 11:85-93 y Miao y Wu, Biosource Technology (2006) 97:841 -846 (demostrando los métodos de fermentación para obtener 55% de aceite en peso en seco de células)). Las algas con alto contenido de aceite pueden ser típicamente generadas mediante el aumento de la duración de una fermentación mientras se proporciona un exceso de fuente de carbono en condiciones de nitrógeno limitadas.

Los medios de cultivo sólidos y líquidos se encuentran por lo general disponibles en una amplia variedad de fuentes, y las instrucciones para la preparación de medios particulares que son adecuadas para una amplia variedad de variedades de microorganismos puede encontrarse, por ejemplo, en línea en http://www.utex.org/, un sitio mantenido en la universidad de Texas en Asutin por su colección de cultivos de algas (UTEX). Por ejemplo, varios medios de agua fresca incluyen medio 1/2, 1/3, 1/5, 1X, 2/3, 2X CHEV de diatomea; medio 1:1 DYIII/PEA Gr+; Ag de diatomea; Medio Allen; Medio BG11-1; Medio Bold 1NV y 3N; Medio de Botryococcus; Medio Bristol; Medio de Chu; Medio CR1, CR1-S y CR1+ de Diatomea; Medio de Cianidio; Medio de Cianofícea; Medio de Désmido; Medio DYIII ; Medio de Euglena; Medio HEPES; Medio J; Medio de Malta; Medio MES; Medio Bold 3N Modificado; Medio COMBO Modificado; Medio N/20; Medio de Ochromonas; Medio P49; Medio de Polytomella; Medio de Proteosa; Medios de Algas de la Nieve; Medio de extracto de Tierra; Agua de Tierra: Medio BAR, GR-, GR-/NH4, GR+, GR+/NH4, PEA, Peat y VT; Medio de Espirulina; Medio Tap; Medio de Trebouxia; Medio de Volvocaceae; Medio de Volvocaceae-3N; Medio de Volvox; Medio de Volvox-Dextrosa; Medio de Waris; y Medio de Waris+Extracto de Tierra. Varios medios de agua salada incluyen: 1%, 5% y 1X Medio F/2; 1/2, 1X y 2X de Medio de Erdschreiber; 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1X, 5/3 y 2X de Medio de Tierra+Agua Marina; 1/4 ERD; 2/3 de Medio de Agua Marina Enriquecida; 20% de Allen 80 % Er D; Medio de Agua Marina Artificial; Medio de BG11-1 .36% NaCl ; Medio de BG11-1 1% NaCl; Medio Bold 1NV:Erdshreiber (1:1) y (4:1); Medio Bristol-NaCl; Medio de Agua Marina de Dasycladales; 1/2 y 1X de Medio de Agua Marina Enriquecida, incluyendo ES/10, ES/2 y ES/4; F/2+NH4; Medio LDM; 1X y 2X CHEV modificado; 2 X CHEV Tierra modificado; Medio de Agua Marina Artificial Modificado; Medio de Porfiridio; y Medio de Diatomea SS.

Otros medios adecuados para utilizarse con los métodos divulgados se pueden identificar fácilmente consultando las URL identificadas anteriormente, o consultando otras organizaciones que mantienen cultivos de microorganismos, tales como SAG, CCAP o CCALA. SAG se refiere a la Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de Gottingen (Gottingen, Alemania), CCAP se refiere a la colección de cultivos de algas y protozoos manejada por la Asociación Escocesa De Ciencia Marina (Escocia, Reino Unido), y CCALA se refiere a la colección de cultivos del laboratorio de algas en el Instituto de Botánica (Treboñ, República Checa).

Los microorganismos útiles según los métodos divulgados se encuentran en varios lugares y entornos en todo el mundo. Como consecuencia del aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, el medio de cultivo en particular para el cultivo y la generación óptimas de aceite y/o lípidos y/o proteínas de cualquier especie en particular de microbios puede ser difícil o imposible de predecir, pero los expertos en la técnica podrán encontrar fácilmente medios adecuados mediante ensayos de rutina a la luz de la descripción de la presente. En algunos casos, determinadas variedades de microorganismos pueden no ser capaces de crecer en un medio de cultivo en particular debido a la presencia de algún componente inhibidor o a la ausencia de algunos requerimientos nutricionales esenciales que necesita la variedad particular de microorganismo. Los ejemplos más adelante proporcionan ejemplos de métodos de cultivar varias especies de microalgas para acumular altos niveles de lípidos como un porcentaje del peso de la célula en seco.

La fuente de carbono fija es un componente clave en el medio. Las fuentes de carbono fijas adecuadas para los fines de la presente invención incluyen, por ejemplo, glucosa, fructosa, sacarosa, galactosa, xilosa, manosa, ramnosa, arabinosa, N-acetilglucosamina, glicerol, floridosida, ácido glucurónico, y/o acetato. Otras fuentes de carbono fijas para cultivar microalgas según la presente invención incluyen mezclas, tales como mezclas de glicerol y glucosa, mezclas de glucosa y xilosa, mezclas de fructosa y glucosa y mezclas de sacarosa y pulpa de remolacha azucarera despolimerizada. Otras fuentes de carbono para utilizarse en el cultivo de microalgas incluyen, licor negro, almidón de maíz, material celulósico despolimerizado (derivado de, por ejemplo, rastrojo de maíz, pulpa de remolacha azucarera y pasto aguja, por ejemplo), lactosa, suero de leche, melaza, papa, arroz, sorgo, sacarosa, remolacha azucarera, caña de azúcar y trigo. La una o más fuentes de carbono pueden suministrarse con una concentración de al menos alrededor de 50 pM, al menos alrededor de 100 pM, al menos alrededor de 500 pM, al menos alrededor de 5 mM, al menos alrededor de 50 mM y al menos alrededor de 500 mM.

Por lo tanto, en varias realizaciones, la fuente de energía de carbono fija utilizada en el medio de cultivo comprende glicerol y/o azúcares de 5 y/o 6 carbonos, tales como la glucosa, fructosa y/o xilosa, que puede derivar de la sacarosa y/o material celulósico, incluyendo material celulósico despolimerizado. Las múltiples especies de Chlorella y múltiples variedades dentro de una especie pueden cultivarse en presencia de sacarosa, material celulósico despolimerizado y glicerol, como se describe en las Publicaciones de Solicitud de Patente Estadounidense N.° 20090035842, 20090011480, 20090148918, respectivamente, y véase también, la Publicación de Solicitud de Patente PCT N.° 2008/151149, cada una de las cuales se incorpora a la presente mediante esta referencia.

Por lo tanto, en una realización de la presente invención, los microorganismos se cultivan mediante el uso de biomasa celulósica despolimerizada como materia prima. Contrario a otras materias primas, tales como almidón de maíz o sacarosa de caña de azúcar o remolachas azucareras, la biomasa celulósica (despolimerizada u otra) no es adecuada para el consumo humano y potencialmente podría encontrarse a un bajo costo, lo que la hace especialmente ventajosa para los fines de la presente invención. Las microalgas pueden proliferar en material celulósico despolimerizado. Los materiales celulósicos por lo general incluyen celulosa al 40-60% en peso en seco; hemicelulosa al 20-40% en peso en seco; y lignina al 10-30% en peso en seco. Los materiales celulósicos adecuados incluyen residuos de cultivos de energía leñosos y herbáceos, así como también cultivos agrícolas, es decir, las partes de las plantas, principalmente los tallos y las hojas, que no han sido retirados de los campos con los productos fibrosos o alimenticios primarios. Los ejemplos incluyen residuos agrícolas tales como bagazo de caña de azúcar, cáscara de arroz, fibra de maíz (incluyendo tallos, hojas, cáscaras y mazorcas), paja de trigo, paja de arroz, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítrico, cáscara de cítrico; residuos de ingeniería forestal como aclareos de maderas duras y maderas blandas, y maderas duras y blandas de operaciones forestales; residuos de madera como residuos de aserradero (viruta, aserrín) y residuos de pulpa de madera; residuos urbanos como fracciones de papel de residuo sólido municipal, residuos de madera urbanos y residuos verdes urbanos como cortes municipales de hierba; y residuos de construcciones con madera. Los materiales celulósicos adicionales dedicados a cultivos celulósicos como pasto de aguja, madera de álamo híbrida y miscanthus, caña fibrosa y sorgo fibroso. Los azúcares de cinco carbonos que se producen a partir de dichos materiales incluyen xilosa. Chlorella protothecoides, por ejemplo, puede cultivarse de manera exitosa en condiciones heterotróficas usando azúcares derivados de celulósicos de rastrojo de maíz y pulpa de remolacha azucarera.

Algunos microbios tienen la capacidad de procesar material celulósico y utilizar directamente materiales celulósicos como fuente de carbono. Sin embargo, el material celulósico típicamente necesita ser tratado para aumentar el área de superficie accesible o para que la celulosa primero se descomponga como una preparación para la utilización microbiana como una fuente de carbono. Las maneras de preparar o pre-tratar el material celulósico para la digestión enzimática son bien conocidas en la técnica. Los métodos se dividen en dos categorías principales: (1) romper el material celulósico en partículas más pequeñas para aumentar el área de superficie accesible; y (2) tratar químicamente el material celulósico para crear un sustrato utilizable para la digestión enzimática.

Los métodos para aumentar el área de superficie accesible incluyen la explosión de vapor, que implica el uso de vapor a altas temperaturas para romper el material celulósico. Debido a que este proceso requiere altas temperaturas, algunos de los azúcares en el material celulósico pueden perderse y, por lo tanto, reducir la fuente de carbono disponible para la digestión enzimática (véase, por ejemplo, Chahal, D.S. et ál., Proceedings of the 2nd World Congress of Chemical Engineering; (1981) and Kaar et ál., Biomass and Bioenergy (1998) 14(3): 277-87). La explosión de amoníaco permite la explosión de material celulósico a una temperatura más baja, pero es más costosa de llevar a cabo, y el amoníaco podría interferir con los procesos de digestión enzimática posteriores (véase, por ejemplo, Dale, B.E. et ál., Biotechnology and Bioengineering (1982); 12: 31-43). Otra técnica de explosión implica el uso de explosión de dióxido de carbono supercrítica para romper el material celulósico en fragmentos más pequeños (véase, por ejemplo, Zheng et ál., Biotechnology Letters (1995); 17(8): 845-850).

Los métodos para tratar químicamente el material celulósico para crear sustratos utilizables para la digestión enzimática son también conocidos en la técnica. La Patente Estadounidense No. 7,413,882 describe el uso de microbios genéticamente modificados que segregan beta-glucosidasa en el caldo de fermentación y el tratamiento del material celulósico con el caldo de fermentación para mejorar la hidrólisis del material celulósico en la glucosa. El material celulósico puede también tratarse con ácidos fuertes y bases para facilitar la digestión enzimática posterior. La Patente Estadounidense No. 3,617,431 describe el uso de digestión alcalina para descomponer los materiales celulósicos.

Chlorella puede proliferar en medios que contienen combinaciones de xilosa y glucosa, tales como material celulósico despolimerizado, y sorprendentemente, algunas especies incluso exhiben niveles superiores de productividad cuando se cultivan en una combinación de glucosa y xilosa que cuando se cultivan en glucosa o xilosa sola. Por lo tanto, determinadas microalgas pueden utilizar materia prima no comestible de otra manera, tal como material celulósico (o material celulósico pre-tratado) o glicerol, como una fuente de carbono y producir aceites comestibles. Esto permite la conversión de celulosa no comestible y glicerol, que normalmente no son parte de la cadena alimenticia humana (a diferencia de la glucosa de maíz y la sacarosa de la caña de azúcar y la remolacha azucarera) en aceites comestibles, altamente nutritivos, que pueden proporcionar nutrientes y calorías como parte de la dieta diaria del ser humano. Por lo tanto, la invención proporciona métodos para transformar materia prima no comestible en aceites comestibles, productos alimenticios y composiciones alimenticias altamente nutritivos.

Las microalgas cocultivadas con un organismo que expresa una invertasa de sacarosa segregable o cultivada en medios que contienen una invertasa de sacarosa o que expresan un gen de invertasa de sacarosa exógena (donde la invertasa es segregada o el organismo también expresa un transportador de sacarosa) pueden proliferar en melaza residual de la caña de azúcar u otras fuentes de sacarosa. El uso de tales productos residuales de bajo valor, que contienen sacarosa, pueden proporcionar ahorros en los costos en la producción de aceites comestibles. Por lo tanto, los métodos de cultivar microalgas en una materia prima de sacarosa y formular composiciones alimenticias y suplementos nutricionales, como se describe en la presente, proporcionan un medio para convertir sacarosa de baja nutrición en aceites altamente nutritivos (ácido oleico, DHA, ARA, etc.) y biomasa que contiene dichos aceites.

Como se detalla en las publicaciones de patente mencionadas anteriormente, las múltiples especies distintas de Chlorella y variedades proliferan muy bien no solo en glicerol de grado reactivo, sino también en subproductos de glicerol acidulados y no acidulados de transesterificación de biodiésel. Sorprendentemente, algunas variedades de Chlorella experimentan la división celular más rápido en presencia de glicerol que en presencia de glucosa. Los procesos de cultivo de dos etapas, en los cuales a las células primero se les proporciona glicerol para aumentar rápidamente la densidad celular y luego se les proporciona glucosa para acumular lípidos, pueden mejorar la eficacia con la cual los lípidos son producidos.

Otro método para aumentar los lípidos como porcentaje del peso celular en seco implica el uso de acetato como la materia prima para las microalgas. El acetato se proporciona directamente en el punto de metabolismo que inicia la síntesis de ácidos grasos (es decir, acetil-CoA); por lo tanto, suministrar acetato al cultivo puede aumentar la producción de ácidos grasos. En general, el microbio es cultivado en presencia de una cantidad suficiente de acetato como para aumentar la producción de lípidos y/o ácido grasos microbianos específicamente, en comparación con la producción en ausencia de acetato. El suministro de acetato es un componente útil de los métodos proporcionados en la presente para generar biomasa de microalgas que tiene un alto porcentaje en el peso celular en seco como lípido.

En otra realización, la producción de lípidos se ve aumentada mediante el cultivo de microalgas que producen lípidos en presencia de uno o más cofactores para una enzima de vía lipídica (por ejemplo, una enzima sintética de ácidos grasos). En general, la concentración del cofactor es suficiente como para aumentar la producción de lípidos microbianos (por ejemplo, ácido graso) sobre la producción de lípidos microbianos en ausencia de cofactor. En realizaciones particulares, el cofactor se suministra al cultivo mediante la inclusión en el cultivo de un microbio que segrega los cofactores o mediante la adición de los cofactores al medio de cultivo. De manera alternativa, las microalgas pueden modificarse genéticamente para que expresen un gen exógeno que codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor. En determinadas realizaciones, cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la vía de lípidos, tal como, por ejemplo, biotina o pantotenato.

La biomasa con alto contenido lipídico de las microalgas es un material favorable para incluirse en productos alimenticios en comparación con la biomasa de bajo contenido lipídico, porque permite la adición de menos biomasa de microalgas para incorporar la misma cantidad de lípidos en una composición alimenticia. Esto es ventajoso, ya que pueden añadirse aceites saludables de microalgas de alto contenido lipídico a productos alimenticios sin alterar otros tributos, tales como la textura y el sabor, en comparación con la biomasa de bajo contenido lipídico. La biomasa rica en lípidos proporcionada por los métodos de la invención típicamente posee al menos 25% de lípidos en el peso celular en seco. Las condiciones del proceso pueden ajustarse para aumentar el porcentaje en peso de las células que es lípidos. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se cultiva una microalga en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, tales como, por ejemplo, nitrógeno, fósforo azufre, mientras que se proporciona un exceso de una fuente de carbono fija, tal como glucosa. La limitación del nitrógeno tiende a aumentar la producción de lípidos microbianos en un cultivo en el cual el nitrógeno se proporciona en exceso. En realizaciones particulares, el aumento en la producción de lípidos es de al menos alrededor de 10%, 50%, 100%, 200%, o 500%. El microbio puede ser cultivado en presencia de una cantidad limitante de un nutriente durante una parte del período total de cultivo o durante el período entero. En algunas realizaciones, la concentración de nutrientes varía entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el período de cultivo total.

En un estado de crecimiento estable, las células acumulan aceite pero no experimentan la división celular. En una realización de la invención, el estado de crecimiento se mantiene al seguir proporcionando todos los componentes de los medios de cultivo originales a las células con la excepción de una fuente de nitrógeno fija. El cultivo de células de microalgas suministrando todos los nutrientes que se proporcionaron originalmente a las células con la excepción de una fuente de nitrógeno fija, como a través del suministro a las células durante un período prolongado de tiempo, da como resultado un porcentaje mayor de lípidos en el peso celular en seco.

En otras realizaciones, la biomasa con alto contenido de lípidos es generada mediante el suministro de una fuente de carbono fija a las células luego de que se han consumido todo el nitrógeno fijo durante períodos de tiempo prolongados, tal como al menos una o dos semanas. En algunas realizaciones, se deja que las células acumulen aceite en presencia de una fuente de carbono fija y en ausencia de una fuente de nitrógeno fija durante más de 20 días. Las microalgas cultivadas mediante el uso de condiciones descritas en la presente o conocidas en la técnica pueden comprender al menos alrededor de 20% de lípidos en peso en seco, y con frecuencia comprenden 35%, 45%, 55%, 65% e incluso 75% o más de lípidos en peso en seco. El porcentaje de lípidos en peso celular en seco en la producción de lípidos microbiana puede, por lo tanto, mejorarse al mantener las células en un estado de crecimiento heterotrófico en el cual consumen carbono y acumular aceite pero no experimentan la división celular.

La biomasa con alto contenido de proteínas de las algas es otro material favorable para incluirse en los productos alimenticios. Los métodos de la invención pueden también proporcionar biomasa que tiene al menos 30% de su peso celular en seco como proteínas. Las condiciones de cultivo pueden ajustarse para aumentar el porcentaje en peso de las células que es proteínas. En una realización preferida, una microalga se cultiva en un entorno rico en nitrógeno y un exceso de energía de carbono fija, tal como glucosa o cualquier otra de las fuentes de carbono mencionadas anteriormente. Las condiciones en las que el nitrógeno se encuentra en exceso tienden a aumentar la producción de proteínas microbiana sobre la producción de proteínas microbiana en un cultivo en el que el nitrógeno no se suministró en exceso. Para una máxima producción de proteínas, el microbio se cultiva preferentemente en presencia de nitrógeno en exceso durante el período total de cultivo. Las fuentes de nitrógeno adecuadas para las microalgas pueden proceder de fuentes de nitrógeno orgánicas y/o fuentes de nitrógeno inorgánicas. El contenido lipídico de la biomasa de alto contenido de proteínas es menor de 30%, menor de 20% o menor de 10% de lípidos en peso.

Las fuentes de nitrógeno orgánicos se han usado en cultivos microbianos desde principios del siglo XX. El uso de fuentes de nitrógeno orgánicas, tales como el licor de maíz fermentado se popularizó con la producción de penicilina a partir del moho. Los investigadores hallaron que la inclusión de licor de maíz fermentado en el medio de cultivo aumentaba el crecimiento de los microorganismos y daba como resultado una producción aumentada de productos (tales como la penicilina). Un análisis del licor de maíz fermentado determinó que era una fuente rica en nitrógeno y también en vitaminas tales como las vitaminas del complejo B, ácido pantoténico de riboflavina, niacina, inositol y minerales de nutrientes tales como el calcio, hierro, magnesio, fosfato y potasio (Ligget y Koffler, Bacteriological Reviews (1948);12(4): 297-311). Las fuentes de nitrógeno orgánicas, tales como el licor de maíz fermentado se han utilizado en medios de fermentación para levaduras, bacterias, hongos y otros microorganismos. Los ejemplos no taxativos de fuentes de nitrógeno orgánicas son extracto de levadura, peptona, licor de maíz fermentado y polvo de maíz fermentado. Los ejemplos no taxativos de fuentes de nitrógeno inorgánicas preferidas incluyen, por ejemplo, y de modo no taxativo, (NH4)2SO4 y NH⁴OH. En una realización, los medios de cultivo para llevar a cabo la invención contienen solo fuentes de nitrógeno inorgánicas. En otra realización, los medios de cultivo para llevar a cabo la invención contienen solo fuentes de nitrógeno orgánicas. En aun otra realización, los medios de cultivo para llevar a cabo la invención contienen una mezcla de fuentes de nitrógeno orgánicas e inorgánicas.

Se usa un biorreactor o fermentador para cultivar células de microalgas a través de varias fases de su ciclo fisiológico. Como ejemplo, se introduce un inóculo de células de microalgas que producen lípidos en el medio; hay un lapso de tiempo (fase de lapso) antes de que las células comiencen a propagarse. Luego del lapso de tiempo, el índice de propagación aumenta a un ritmo constante y entra en la fase logarítmica o exponencial. La fase exponencial a su vez está seguida de un enlentecimiento de la propagación debido a disminuciones de los nutrientes como el nitrógeno, aumentos de sustancias tóxicas y mecanismos de detección de quórum. Luego de este enlentecimiento, la propagación se detiene y las células ingresan en una fase estacionaria o estado de crecimiento constante, dependiendo del entorno en particular proporcionado a las células. Para obtener biomasa rica en proteínas, el cultivo se cosecha típicamente durante o inmediatamente después del final de la fase exponencial. Para obtener biomasa rica en lípidos, el cultivo se cosecha típicamente luego de la finalización de la fase exponencial, lo que puede terminarse antes dejando que el nitrógeno u otro nutriente clave (que no sea carbono) se reduzca, forzando a las células a convertir las fuentes de carbono, presentes en exceso, en lípidos. Los parámetros para las condiciones de cultivo pueden manipularse para optimizar la producción total de aceite, la combinación de especies de lípidos producida, y/o la producción de un aceite específico.

Los biorreactores ofrecen muchas ventajas para utilizarse en el cultivo heterotrófico y métodos de propagación. Como se apreciará, las previsiones realizadas para poner la luz a disposición de las células en métodos de cultivo fotosintéticos no son necesarias cuando se utiliza una fuente de carbono fija en el cultivo heterotrófico y métodos de propagación descritos en la presente. Con el fin de producir biomasa para utilizarse en alimentos, las microalgas preferentemente se fermentan en grandes cantidades en líquido, tal como en cultivos de suspensión como ejemplo. Los biorreactores tales como fermentadores de acero (5000 litros, 10,000 litros, 40,000 litros y más se utilizan en varias realizaciones de la invención) pueden contener volúmenes de cultivo muy grandes. Los biorreactores típicamente permiten el control de las condiciones de cultivo tales como la temperatura, el pH, la tensión de oxígeno y los niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, los biorreactores son típicamente configurables, por ejemplo, usando puertos unidos a tuberías, para permitir que los componentes gaseosos, como el oxígeno y el nitrógeno, se burbujeen a través de un cultivo líquido.

Los biorreactores pueden configurarse para que hagan fluir los medios de cultivo a través del biorreactor durante todo el período de tiempo en el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número. En algunas realizaciones, por ejemplo, los medios pueden infundirse en el biorreactor luego de la inoculación pero antes de que las células alcancen una densidad deseada. En otros casos, un biorreactor se llena con medios de cultivo al comienzo de un cultivo, y no se infunden más medios de cultivo luego de que el cultivo es inoculado. En otras palabras, la biomasa de microalgas se cultiva en un medio acuoso durante un período de tiempo en el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número; sin embargo, las cantidades de medio de cultivo acuoso no se hacen fluir a través del biorreactor a lo largo del período de tiempo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el medio de cultivo acuoso no se hace fluir a través del biorreactor luego de la inoculación.

Los biorreactores equipados con dispositivos tales como hojas rotatorias e impulsores, mecanismos oscilantes, barras agotadoras, medios para la infusión de gas presurizado pueden utilizarse para someter a los cultivos de microalgas al mezclado. El mezclado puede ser continuo o intermitente. Por ejemplo, en algunas realizaciones, un régimen de flujo turbulento de entrada de gas y entradas de medios no se mantiene para la reproducción de microalgas hasta que no se ha alcanzado un aumento deseado en el número de dichas microalgas.

Los biorreactores se equipan a menudo con varios puertos que, por ejemplo, permiten que el contenido de gas del cultivo de microalgas sea manipulado. Para ejemplificar, parte del volumen de un biorreactor puede ser de gas antes que de líquido, y las entradas de gas del biorreactor permiten el bombeo de gas hacia el interior del biorreactor. Los gases que pueden bombearse de manera beneficiosa hacia el interior del biorreactor incluyen aire, mezclas de aire/CO2, gases nobles, tales como el argón, y otros gases. Los biorreactores se encuentran típicamente equipados para permitirle al usuario que controle la velocidad de entrada de un gas hacia el interior del biorreactor. Como se mencionó anteriormente, aumentar el flujo de gas en un biorreactor puede utilizarse para aumentar el mezclado del cultivo.

Asimismo, un flujo aumentado de gas afecta la turbidez del cultivo. La turbulencia puede lograrse colocando un puerto de entrada de gas debajo del nivel de los medios de cultivo acuosos de manera que el gas que ingrese en el biorreactor burbujee hasta la superficie del biorreactor. Uno o más puertos de salida le permiten al gas que salga, lo que evita la acumulación de presión en el biorreactor. Preferentemente, un puerto de salida del gas conduce a una válvula "de un sentido" que evita que ingresen microorganismos contaminantes en el biorreactor.

Los ejemplos específicos de biorreactores, condiciones de cultivo y cultivo heterotrófico y métodos de propagación descritos en la presente pueden combinarse de cualquier forma adecuada para mejorar la eficacia del cultivo microbiano y la producción de lípidos y/o proteínas.

D. Concentración de las Microalgas Después de la Fermentación

Los cultivos de microalgas generados de acuerdo con los métodos descritos anteriormente proporcionan biomasa de microalgas en el medio de fermentación. Para preparar la biomasa para su uso como composición alimenticia, la biomasa se concentra, o se cosecha, a partir del medio de fermentación. En el momento de cosechar la biomasa de microalgas del medio de fermentación, la biomasa comprende de manera predominante células intactas suspendidas en un medio de cultivo acuoso. Se lleva a cabo una etapa de deshidratación del concentrado de biomasa. La deshidratación o concentración se refiere a la separación de la biomasa del caldo de fermentación u otro medio líquido y entonces es una separación de sólidos y líquidos. Por lo tanto, durante la deshidratación, el medio de cultivo se retira de la biomasa (por ejemplo, mediante el drenaje del caldo de fermentación a través de un filtro que retiene la biomasa) o la biomasa se retira de otra manera del medio de cultivo. Los procesos comunes de deshidratación incluyen la centrifugación, filtración y el uso de presión mecánica. Estos procesos pueden utilizarse de manera individual o en cualquier combinación.

La centrifugación de biomasa y caldo de cultivo u otra solución acuosa forma una pasta concentrada que comprende células de microalgas. La centrifugación no elimina cantidades significativas de agua intracelular. De hecho, después de la centrifugación, todavía puede quedar una cantidad sustancial de humedad superficial o libre en la biomasa (por ejemplo, hasta un 70%), por lo que la centrifugación no se considera un paso de secado.

La filtración también puede usarse para la deshidratación. Un ejemplo de filtración que es adecuado para la presente invención es la filtración de flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) también conocida como filtración de flujo cruzado. La filtración de flujo tangencial es una técnica de separación que utiliza sistemas de membrana y fuerza de flujo para separar los sólidos de los líquidos. Para conocer un método de filtración adecuado, véase Geresh, Carb. Polym. 50; 183-189 (2002), el cual describe el uso de un filtro de 0.45 uM de fibras huecas de MaxCell A/G Technologies. Véanse, por ejemplo, los dispositivos Pellicon® de Millipore, utilizados con membranas de 100 kD, 300 kD, 1000 kD (número de catálogo P2C01MC01), 0.1 uM (número de catálogo P2VVPPV01), 0.22 uM (número de catálogo P2GVPPV01) y 0.45 uM (número de catálogo P2HVMPV01). El filtrado preferentemente no pasa a través del filtro en un nivel significativo y el producto en el filtrado preferentemente no se adhiere al material del filtro. La TFF se puede llevar a cabo también utilizando sistemas de filtración de fibra hueca. Los filtros con un tamaño de poro de al menos alrededor de 0.1 micrómetros, por ejemplo alrededor de 0.12, 0.14, 0.16, 0.18, 0.2, 0.22, 0.45 o al menos alrededor de 0.65 micrómetros, son adecuados. Los tamaños de poro preferidos para TFF permiten que pasen los solutos y desechos del caldo de fermentación pero no las células microbianas.

La deshidratación se puede llevar a cabo también mediante presión mecánica, la cual se aplica directamente a la biomasa para separar el caldo de fermentación líquido de la biomasa microbiana, y es suficiente como para deshidratar la biomasa pero que no causará la lisis predominante de las células. La presión mecánica para deshidratar la biomasa microbiana puede aplicarse mediante, por ejemplo, un filtro prensa de bandas. Un filtro prensa de bandas es un dispositivo de deshidratación que aplica presión mecánica a una suspensión (por ejemplo, una biomasa microbiana tomada directamente del fermentador o biorreactor) que se pasa entre las dos bandas tensadas a través de una forma de S de rodillos de diámetros decrecientes. El filtro prensa de bandas puede dividirse de hecho en tres zonas: la zona de gravedad, donde el agua/fluido de drenaje libre es drenada/o por la gravedad a través de una banda porosa; una zona de cuña, donde los sólidos se separan mediante la aplicación de presión; y una zona de presión, donde se aplica una presión ajustable a los sólidos drenados por gravedad.

Después de la concentración, la biomasa de microalgas puede procesarse, como se describe más adelante, para producir una torta envasada al vacío, copos de algas, homogeneizado de algas, polvo de algas, harina de algas o aceite de algas.

E. Composición Química de la Biomasa de Microalgas

La biomasa de microalgas generada mediante los métodos de cultivo descritos en la presente comprenden aceite y/o proteína de microalgas, así como otros constituyentes generados mediante los microorganismos o incorporados por los microorganismos del medio de cultivo durante la fermentación.

La biomasa de microalgas con un alto porcentaje de acumulación de aceite/lípidos en peso en seco se ha generado utilizando diferentes métodos de cultivo, incluidos los métodos conocidos en la técnica. La biomasa de microalgas con un alto porcentaje de aceite/lípidos acumulados es útil de acuerdo con la presente invención. Se han descrito cultivos de Chlorella vulgaris con hasta un 56.6% de lípidos en peso celular seco (DCW, por sus siglas en inglés) en cultivos estacionarios realizados en condicionas autotróficas utilizando concentraciones de hierro (Fe) altas (Li et ál., Bioresource Technology 99(11):4717-22 (2008). También se han descrito cultivos de Nanochloropsis sp. y Chaetoceros calcitrans con 60% de lípidos en DCW y 39.8% de lípidos en DCW, respectivamente, realizados en un fotobiorreactor en condiciones de privación de nitrógeno (Rodolfi et ál., Biotechnology & Bioengineering (2008)). Se han descrito cultivos de Parietochloris incise con aproximadamente un 30% lípidos en DCW, al cultivarse fototróficamente y en condiciones de bajo contenido de nitrógeno (Solovchenko et ál., Journal of Applied Phycology 20:245-251 (2008). Chlorella protothecoides pueden producir hasta 55% de lípidos en DCW cuando se cultivan bajo determinadas condiciones heterotróficas con privación de nitrógeno (Miao y Wu, Bioresource Technology 97:841-846 (2006)). Se han descrito otras especies de Chlorella, incluidas Chlorella emersonii, Chlorella sorokiniana y Chlorella minutissima que tienen una acumulación de aceite de hasta un 63% en DCW cuando se cultivan en biorreactores de tanque de agitación en condiciones de medio con bajo contenido de nitrógeno (Illman et ál., Enzyme and Microbial Technology 27:631-635 (2000). Se han constatado porcentajes incluso más altos de lípidos en DCW, incluyendo 70% de lípidos en cultivos de Dumaliella tertiolecta realizados en condiciones de NaCl aumentado (Takagi et ál., Journal of Bioscience and Bioengineering 101(3): 223-226 (2006)) y un 75% de lípidos en cultivos de Botryococcus braunii (Banerjee et ál., Critical Reviews in Biotechnology 22(3): 245-279 (2002)).

El cultivo heterotrófico da como resultado un contenido de clorofila bajo (cuando se compara con los sistemas fototróficos tal como estanques abiertos o sistemas de fotobiorreactores cerrados). El contenido reducido de clorofila generalmente mejora las propiedades organolépticas de las microalgas y por lo tanto permite la incorporación de más biomasa de algas (o aceite preparado a partir de esta) en un producto alimenticio. El bajo contenido de clorofila que se encuentra en microalgas cultivadas heterotróficamente (por ejemplo, Chlorella) también reduce el color verde de la biomasa cuando se compara con las microalgas cultivadas fototróficamente. Por lo tanto, el contenido reducido de clorofila evita una coloración verde a veces no deseada, asociada a los productos que contienen microalgas cultivadas fototróficamente y permite la incorporación o una incorporación aumentada de biomasa de algas en un producto alimenticio. En al menos una realización, el producto alimenticio contiene microalgas cultivadas heterotróficamente con bajo contenido de clorofila comparadas con las microalgas cultivadas fototróficamente. En algunas realizaciones el contenido de clorofila de la harina de microalgas o de la biomasa de algas es menos de 500 ppm, menos de 400 ppm, menos de 300 ppm, menos de 200 ppm, menos de 100 ppm, menos de 50 ppm, menos de 10 ppm, menos de 2 ppm o menos de 1 ppm.

La biomasa de microalgas y la harina de algas ricas en aceite generadas mediante los métodos de cultivo descritos en la presente son útiles para los presentes métodos y contienen al menos un 10% de aceite de microalgas en DCW. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas o la harina de algas comprenden al menos 5%, 25-35%, 30-50%, 50-55%, 50-65%, 54-62%, 56-60%, al menos 75% o al menos 90% de aceite de microalgas en dCw .

El aceite de microalgas de la biomasa descrito en la presente (o extraído de la biomasa o harina de algas) puede comprender glicerolípidos con una o más cadenas laterales de éster de ácido graso. Los glicerolípidos están compuestos por una molécula de glicerol esterificada con una, dos o tres moléculas de ácido graso, los cuales pueden ser de varias longitudes y tener varios grados de saturación. Se pueden preparar mezclas específicas de aceite de algas ya sea dentro de una sola especie de algas o mediante la mezcla de biomasa (o aceite de algas) de dos o más especies de microalgas.

Por lo tanto, la composición de aceite, es decir, las propiedades y proporciones de los constituyentes de ácidos grasos de los glicerolípidos, pueden ser manipuladas mediante la combinación de biomasa (o aceite) de al menos dos especies de microalgas distintas. En algunas realizaciones, al menos dos especies distintas de microalgas tienen perfiles de glicerolípidos diferentes. Las especies distintas de microalgas se pueden cultivar juntas o separadas como se describe en la presente, preferentemente en condiciones heterotróficas, para generar los aceites respectivos. Distintas especies de microalgas pueden contener porcentajes diferentes de constituyentes de ácidos grasos diferentes en las células de glicerolípidos.

En algunas realizaciones, el aceite de microalgas está compuesto principalmente de aceite monosaturado como aceite al 18:1 (oleico), particularmente en la forma de triglicérido. En algunos casos, el aceite de algas es un aceite monosaturado al menos un 20% en peso. En varias realizaciones, el aceite de algas es un aceite monosaturado al menos un 25%, 50%, 75% o más tal como al 18:1 en peso o en volumen. En algunas realizaciones, el aceite monosaturado está al 18:1, 16:1, 14:1 o 12:1. En algunos casos, el aceite de algas es un aceite un 60-75%, 64-70% o 65-69% al 18:1. En algunas realizaciones, el aceite de microalgas comprende al menos 10%, 20%, 25% o 50% o más de ácido oleico esterificado o ácido alfa-linolénico esterificado en peso o en volumen (particularmente en forma de triglicérido). En al menos una realización, el aceite de algas comprende menos del 10%, menos del 5%, menos del 3%, menos del 2% o menos del 1% en peso o en volumen, o está sustancialmente libre de, ácido docosahexanoico esterificado (DHA) (22:6) (particularmente en forma de triglicérido). Para conocer ejemplos de la producción de microalgas con altos contenidos de DHA; tal como Crypthecodinium cohnii, véanse las patentes de los Estados Unidos N° 7,252,979, 6,812,009 y 6,372,460. En algunas realizaciones, el perfil de lípidos del aceite extraído o del aceite en harina de microalgas o biomasa de algas es menos de 2% 14:0; 13-16% 16:0; 1-4% 18:0; 64-70% 18:1; 10-16% 18:2; 0.5-2.5% 18:3; y menos de 2% de aceite de una longitud de cadena de carbono de 20 o más.

La biomasa de microalgas (y el aceite extraído de esta), también puede incluir otros constituyentes producidos por las microalgas o incorporados en la biomasa a partir del medio de cultivo. Estos otros constituyentes pueden estar presentes en varias cantidades dependiendo de las condiciones de cultivo utilizadas y de las especies de microalgas (y, si corresponde, del método de extracción utilizado para obtener el aceite de microalgas de la biomasa). En general, el contenido de clorofila en la biomasa de microalgas con alto contenido de proteínas es más alto que el contenido de clorofila en la biomasa de microalgas con alto contenido de lípidos. En algunas realizaciones, el contenido de clorofila de la biomasa de microalgas es menos de 200 ppm o menos de 100 ppm. Los otros constituyentes pueden incluir, de modo no taxativo, fosfolípidos (por ejemplo lecitina de algas), carbohidratos, fibra soluble o insoluble, glicoproteínas, fitosteroles (por ejemplo p-sitosterol, campesterol, estigmasterol, ergosterol y brassicasterol), tocoferoles, tocotrienoles, carotenoides (por ejemplo un-caroteno, p-caroteno y licopeno), xantófilos (por ejemplo luteína, zeaxantina, a-criptoxantina y p-criptoxantina), proteínas, polisacáridos (por ejemplo arabinosa, manosa, galactosa, 6-metil galactosa y glucosa) y varios compuestos orgánicos o inorgánicos (por ejemplo selenio).

En algunos casos, la biomasa o harina de algas comprende al menos 10 ppm de selenio. En algunos casos, la biomasa o harina de algas comprende al menos 25% p/p de polisacárido de algas. En algunos casos, la biomasa o harina de algas comprende al menos 15% p/p de glicoproteína de algas. En algunos casos, la biomasa, harina de algas o aceite derivado de biomasa comprende un total de entre 0-200, 0-115 o 50-115 mcg de carotenoides totales por gramo de biomasa de algas o harina de algas, y en realizaciones específicas 20-70 o 50-60 mcg del contenido total de carotenoides es luteína. En algunos casos, la biomasa o harina de algas comprende al menos 0.5% de fosfolípidos de algas o un total de alrededor de 0.25% a alrededor de 1.5% de fosfolípidos por gramo de harina de algas o biomasa de algas. En algunos casos, la biomasa, harina de algas o aceite derivado de biomasa de algas contiene un total de al menos 0.10, 0.02-0.5 o 0.05-0.3 mg/g de tocotrienoles, y en realizaciones específicas 0.05-0.25 mg/g es alfa tocotrienol. En algunos casos, la biomasa, harina de algas o aceite derivado de biomasa de algas contiene un total de entre 0.125 mg/g a 0.35 mg/g de tocotrienoles. En algunos casos, la harina de algas o aceite derivado de biomasa de algas contiene un total de al menos 5.0, 1-8, 2-6 o 3-5 mg/100g de tocoferoles, y en realizaciones específicas, 2-6 mg/100g es alfa tocoferol. En algunos casos, la harina de algas o aceite derivado de biomasa de algas contiene entre 5.0mg/100g a 10mg/100g de tocoferoles.

En algunos casos la composición de otros componentes de biomasa de algas es diferente para la biomasa con alto contenido de proteínas cuando se compara con la biomasa con alto contenido de lípidos. En realizaciones específicas, la biomasa con alto contenido de proteínas, la harina de algas o el aceite contiene un total de entre 0.18-0.79 mg/100g y en realizaciones específicas, la biomasa con alto contenido de proteínas, la harina de algas o el aceite contiene alrededor de 0.01-0.03 mg/g de tocotrienoles. En algunos casos, el alto contenido de proteínas, la harina de algas o el aceite de biomasa también contiene un total de entre 1-3g/100g de esteroles, y en realizaciones específicas, un total de 1.299-2.46g/100g de esteroles. Los ejemplos, más adelante, incluyen descripciones detalladas de composiciones de tocotrienoles y tocoferoles en Chlorella protothecoides.

En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas o la harina de algas comprenden 20-45% de carbohidratos en peso en seco. En otras realizaciones, la biomasa o la harina de algas comprende 25-40% o 30-35% de carbohidratos en peso en seco. El carbohidrato puede ser fibra alimentaria, tal como azúcares libres, tales como sacarosa y glucosa. En algunas realizaciones el azúcar libre de la biomasa de microalgas comprende 1-10%, 2-8% o 3-6% en peso en seco. En determinadas realizaciones el componente de azúcar libre comprende sacarosa.

En algunos casos, la biomasa de microalgas o la harina de algas comprenden al menos 5% de fibra soluble. En otras realizaciones, la biomasa de microalgas o la harina de algas comprenden al menos 10% de fibra soluble o al menos 20% o 35% de fibra soluble. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas o la harina de algas comprenden al menos 5% de fibra insoluble. En otras realizaciones, la biomasa de microalgas o la harina de algas comprende de al menos 5% a al menos 10%, o de al menos 10% a 25%, o de al menos 25% a 50% de fibra insoluble. El total de fibra alimentaria es la suma de la fibra soluble y la fibra insoluble. En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas o la harina de algas comprende un total de al menos 20% de fibra alimentaria. En otras realizaciones, la biomasa de microalgas o la harina de algas comprende un total de al menos 25%, 50%, 55%, 60%, 75% de fibra alimentaria.

En una realización, el contenido de monosacárido de la fibra total (total de carbohidrato menos azúcares libres) es 1-20% arabinosa; 5-50% mañosa; 15-80% galactosa; y 10-70% glucosa. En otras realizaciones, el contenido de monosacárido de la fibra total es alrededor de 1-2% arabinosa; alrededor de 10-15% mañosa; alrededor de 20-30% galactosa; y alrededor de 55-65% glucosa.

III. PROCESADO DE BIOMASA DE MICROALGAS EN HARINA DE ALGAS E INGREDIENTES ALIMENTICIOS TERMINADOS

La biomasa de microalgas concentrada producida de acuerdo con los métodos divulgados es en sí misma un ingrediente alimenticio terminado y puede usarse en alimentos sin modificaciones adicionales o con modificaciones mínimas. Por ejemplo, la torta puede ser envasada al vacío o congelada. Alternativamente, la biomasa puede secarse mediante liofilización. Sin embargo, una variedad de ingredientes alimenticios terminados derivados de microalgas con propiedades mejoradas pueden ser el resultado de los métodos de procesamiento divulgados en la presente que pueden aplicarse a la biomasa de microalgas concentrada. La harina de algas comprende las células de algas que crecieron, se cultivaron o se propagaron como se divulga en la presente o en condiciones conocidas por los expertos en la técnica y procesadas para producir harina de algas como se divulga en la presente.

El secado de la biomasa de microalgas, ya sea predominantemente intacta o como homogeneizado, es ventajoso para facilitar el procesamiento adicional o para el uso de la biomasa en los métodos y composiciones descritos en la presente. El secado se refiere a la eliminación de humedad/agua libre o superficial de biomasa predominantemente intacta o la eliminación de agua superficial de una suspensión de biomasa homogeneizada (por ejemplo, mediante micronización). Pueden impartirse distintas texturas y sabores a los productos alimenticios dependiendo de si la biomasa de algas fue secada, y si fue así, del método de secado. El secado de la biomasa generada mediante e cultivo de microalgas descrito en la presente elimina el agua que puede ser un componente no deseado en los productos o ingredientes alimenticios terminados. En algunos casos, el secado de la biomasa puede facilitar un proceso de extracción de aceite de microalgas más eficiente.

En una realización, la biomasa de microalgas concentrada primero se desarma y luego se seca por aspersión o por secado ultrarrápido (es decir, se somete a un proceso de secado neumático) para formar un polvo que contiene predominantemente células lisadas para producir harina de algas. En otra realización, prácticamente todo el aceite contenido en la harina de algas se extrae, dando como resultado la harina de algas desgrasada que está hecha predominantemente de carbohidratos (incluso en la forma de fibra alimentaria), proteínas y aceite o lípido residual.

En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas o la harina de algas contiene 15% o menos, 10% o menos, 5% o menos, 2-6% o 3-5% de humedad en peso después del secado.

A. Harina de algas

La harina de algas se prepara a partir de biomasa de microalgas concentrada que fue lisada y homogeneizada mecánicamente y el homogeneizado fue secado por aspersión o por secado ultrarrápido para producir una forma de polvo (o secado utilizando otro sistema de secado neumático). La producción se harina de algas requiere que las células estén lisadas para liberar el aceite y que la pared celular y los componentes intracelulares estén micronizados o que al menos tengan un tamaño de partículas reducido. El tamaño de partículas promedio medido inmediatamente después de la homogeneización o tan pronto como sea posible luego de esta es preferentemente no más de 10, no más de 25 o no más de 100 gm. En algunas realizaciones, el tamaño de partículas promedio es de 1-10, 1-15, 10-100 o 1-40 gm. En algunas realizaciones, el tamaño de partículas promedio es mayor que 10 gm y de hasta 100 gm. En algunas realizaciones, el tamaño de partículas promedio es de 0.1-100 gm.

El tamaño promedio de una célula de Chioreila protothecoides es de alrededor de 5 a 15 gm. Durante la preparación de la harina de algas como se describe en la presente, el tamaño de partículas promedio es menor que 10 gm. Como se muestra en el Ejemplo 8, la variación de las condiciones de homogeneización da como resultado diferentes tamaños de partículas. El experto en la técnica reconocerá que las condiciones de homogeneización pueden variarse para obtener diferentes tamaños de partículas.

Las células individuales que comprenden la biomasa (partículas de biomasa de algas) o las partículas de la harina de algas se aglomeran en diferentes grados. En una realización, las partículas de harina de algas aglomeradas o las partículas de biomasa de algas aglomeradas tienen un tamaño de partícula de menos de alrededor de 1,000 gm, menos de 750 gm, menos de 500 gm, menos de 250 gm o menos de 100 gm.

Como se indicó en la descripción de la micronización, y particularmente si se mide mediante una técnica tal como difracción láser, que mide grupos en vez de partículas individuales, el tamaño promedio de partículas se mide preferentemente inmediatamente después de que se llevó a cabo la homogeneización o tan pronto como sea posible después de esta (por ejemplo, en un período de dos semanas) para evitar o minimizar las posibles distorsiones en la medición del tamaño de partículas debido al agrupamiento. En la práctica, las emulsiones que resultan de la homogeneización pueden almacenarse usualmente durante al menos dos semanas en un refrigerador sin cambios materiales en el tamaño de partículas. Algunas técnicas para medir el tamaño de partículas, tal como difracción láser, miden el tamaño de grupos de partículas en vez de partículas individuales. Los grupos de partículas medidos tienen un tamaño promedio mayor que las partículas individuales (por ejemplo, 1-100 micrones). La microscopía óptica de harina de microalgas dispersada en agua muestra las partículas individuales y los grupos de partículas. En la dispersión de harina de algas en agua con suficiente mezclado (por ejemplo, con un mezclador manual) pero sin repetir la homogeneización original, los grupos pueden desarmarse y la difracción láser puede usualmente volver a detectar un tamaño de partículas promedio de no más de 10 pm. El software para realizar análisis de tamaño de partículas automáticos de micrográficas de electrones está disponible comercialmente y puede utilizarse para medir tamaños de partículas. Aquí y en otras partes, el tamaño de partículas promedio puede referir a cualquier medida reconocida en la técnica de un promedio, tal como la media, media geométrica, mediana o modo. El tamaño de partículas puede medirse mediante cualquier método de medida reconocido en la técnica incluyendo la dimensión más grande de una partícula o el diámetro de una partícula de volumen equivalente. Dado que las partículas son comúnmente de forma aproximadamente esférica, dichas medidas pueden ser esencialmente iguales.

Después de la homogeneización, el aceite resultante, el agua y las partículas micronizadas se emulsifican, de modo que el aceite no se separe de la dispersión antes del secado. Por ejemplo, puede utilizarse un disruptor de presión para bombear una solución que contiene células a través de una válvula de orificio restringido para lisar las células. Se aplica alta presión (hasta 1500 bar), seguida de una expansión instantánea a través de una boquilla de salida. La disrupción celular se logra mediante tres mecanismos diferentes: incidencia de la válvula, alto cizallamiento de líquido en el orificio y reducción súbita de la presión en la descarga, lo cual causa la explosión de la célula. El método libera moléculas intracelulares. Un homogeneizador Niro (Niro Soavi GEA) (o cualquier otro homogeneizador de alta presión) puede utilizarse para procesar las células y obtener partículas predominantemente de 0.2 a 5 micrones de tamaño. El procesamiento de la biomasa de algas bajo alta presión (aproximadamente 1000 bar) comúnmente lisa más del 90% de las células y reduce el tamaño de partículas a menos de 5 micrones.

De manera alternativa, puede utilizarse un molino de bolas. En un molino de bolas, las células se agitan en suspensión con partículas abrasivas pequeñas, tal como perlas. Las células se rompen debido a las fuerzas de cizallamiento, se muelen entre las perlas y colisionan con las perlas. Las perlas desintegran las células para liberar el contenido celular. En una realización, la biomasa de algas se desintegra y forma una emulsión estable utilizando un molino de bolas Dyno-mill ECM Ultra (CB Mills). Las células también pueden desintegrarse mediante las fuerzas de cizallamiento, tal como mediante el uso de mezclado (tal como con una mezcladora de alta velocidad o una mezcladora Waring, por ejemplo), una prensa francesa o incluso centrifugación en el caso de paredes celulares débiles, para desintegrar las células. Un molino de bolas adecuado que incluye las especificaciones de tamaño de bolas y cuchillas es el que se describe en la patente estadounidense N° 5,330,913.

El producto intermedio de la homogeneización es una suspensión de partículas de tamaño menor que las células originales que se suspende en aceite y agua. Las partículas representan desechos celulares. El aceite y el agua son liberados por las células. Puede agregarse agua adicional mediante medio acuoso que contiene las células antes de la homogeneización. Las partículas están preferentemente en la forma de un homogeneizado micronizado. Si se dejan en reposo, algunas de las partículas más pequeñas pueden fusionarse. Sin embargo, puede preservarse una dispersión pareja de partículas pequeñas mediante la alimentación con un estabilizador microcristalino, tal como celulosa microcristalina.

Para formar la harina de algas, la suspensión se seca por aspersión o por secado ultrarrápido y se obtiene un material similar a polvo seco que contiene desechos celulares y aceite. Aunque el contenido de aceite de la harina (es decir, las células desintegradas como material similar al polvo) puede ser de al menos 10, 25 o 50% en peso del polvo seco, el polvo puede ser seco en vez de grasoso al tacto o tener una apariencia seca en vez de grasosa (por ejemplo, no tener aceite visible) y puede fluir libremente cuando se agita. Pueden agregarse varios agentes de flujo (incluidos los productos derivados de sílice tales como sílice precipitada, sílice ahumada, silicato de calcio y silicatos de aluminio y sodio). La aplicación de estos materiales a polvos con alto contenido graso, higroscópicos o pegajosos evita la aglutinación después del secado y durante el empaquetado, potencia el flujo libre de los polvos secos y puede reducir la adhesión, acumulación y oxidación de los materiales en las superficies del secador. Todos fueron aprobados para su uso en alimentos en los niveles máximos designados por la FDA. Después del secado, el contenido de agua o humedad del polvo es comúnmente menos de 10%, 5%, 3% o 1% en peso. Otros secadores, tales como secadores neumáticos o secadores de combustión de pulsos, pueden ser utilizados para producir la harina de algas.

El contenido de aceite de la harina de algas puede variar dependiendo del porcentaje de aceite de la biomasa de algas. La harina de algas se puede producir a partir de biomasas de algas con contenidos de aceite variados. En determinadas realizaciones, la harina de algas se produce a partir de biomasas de algas con el mismo contenido de aceite. En otras realizaciones, la harina de algas se produce a partir de biomasas de algas con diferente contenido de aceite. En el último caso, la biomasas de algas de contenidos de aceite variados pueden combinarse y luego realizarse el paso de homogeneización. En otras realizaciones, harinas de algas de contenidos de aceite variados se producen primero y luego se mezclan juntas en varias proporciones para lograr un producto de harina de algas con el contenido de aceite final deseado. En una realización adicional, biomasas de algas de perfiles de lípidos diferentes se pueden combinar y luego homogeneizar para producir harina de algas. En otra realización, harinas de algas de perfiles de lípidos diferentes se producen primero y luego se mezclan juntas en varias proporciones para lograr un producto de harina de algas con el perfil de lípidos final deseado.

La harina de algas o biomasa de algas de la invención es útil en un amplio rango de preparaciones alimenticias. Debido al contenido de aceite, contenido de fibra y a las partículas micronizadas, la harina de algas o biomasa de algas es un ingrediente alimenticio multifuncional.

B. Harina de Algas Desgrasada

En algunos casos, la harina de algas (o cualquier biomasa de algas desintegrada) puede ser sometida a un proceso de extracción de aceite para producir una harina de algas o biomasa de algas desgrasada. Los aceites de microalgas pueden extraerse utilizando la licuefacción (véase por ejemplo Sawayama et él, Biomass and Bioenergy 17:33-39 (1999) e Inoue et él., Biomass Bioenergy 6(4):269-274 (1993)) licuefacción de aceite (véase por ejemplo Minowa et él., Fuel 74(12):1735-1738 (1995)); o extracción de CO2 supercrítico (véase por ejemplo Mendes et él., Inorgánica Chimica Acta 356:328-334 (2003)). La harina de algas desgrasada, de la cual se ha extraído sustancialmente todo el aceite utilizando extracción de CO2 supercrítico, usualmente contendrá fosfolípidos en función del proceso de extracción. Otros métodos de extracción que incluyen el uso de solventes polares y no polares no solo extraerá sustancialmente todo el aceite de la harina de microalgas, sino que también extraerá los fosfolípidos. La harina de algas desgrasada todavía mantiene las proteínas y carbohidratos de la harina de algas antes de la extracción. Los carbohidratos contenidos en la harina de algas desgrasada incluyen carbohidratos en forma de fibra alimentaria (tanto fibra insoluble como soluble).

La harina de algas o biomasa de algas desgrasada, con o sin fosfolípidos, son útiles como ingrediente alimenticio funcional. La harina de algas o biomasa de algas desgrasada que contienen fosfolípidos tienen una alta capacidad de emulsificación. La harina de algas o biomasa de algas desgrasada con sin fosfolípidos tienen una mayor capacidad de retención de agua y por consiguiente son útiles en una variedad de aplicaciones alimenticias. La harina de algas o biomasa de algas desgrasada puede ser una buena fuente de fibra alimentaria ya que contiene carbohidratos en forma de fibra tanto insoluble como soluble.

IV. COMBINACIÓN DE BIOMASA DE ALGAS U OTROS MATERIALES DERIVADOS DE ESTA CON OTROS INGREDIENTES ALIMENTICIOS

En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición alimenticia que comprende al menos 0.1% p/p de biomasa de algas y uno o más ingredientes adicionales, incluyendo uno o más ingredientes comestibles, donde la biomasa de algas comprende al menos 10% de aceite en peso en seco, opcionalmente donde al menos 90% del aceite es glicerolípido. En algunas realizaciones, la biomasa de algas contiene al menos 25%, 40%, 50% o 60% de aceite en peso en seco. En algunos casos, la biomasa de algas contiene 10-90%, 25-75%, 40-75% o 50-70% de aceite en peso en seco, opcionalmente donde al menos 90% del aceite es glicerolípido. En al menos una realización, al menos 50% en peso del aceite es aceite glicerolípido monosaturado. En algunos casos, al menos 50% en peso del aceite es un lípido 18:1 en forma de glicerolípido. En algunos casos, menos del 5% en peso del aceite es ácido docosahexanoico (DHA) (22:6). En al menos una realización, menos del 1% en peso del aceite es DHA. Se prefiere un contenido de algas con bajos niveles de ácidos grasos polisaturados (PUFA) para asegurar la estabilidad química de la biomasa. En realizaciones preferidas, la biomasa de algas se cultiva en condiciones heterotróficas y tiene una pigmentación verde reducida. En otras realizaciones, las microalgas tienen una mutación de color y carecen de o tienen una pigmentación reducida. En otra realización, la composición alimenticia comprende al menos 0.1% p/p de biomasa de algas y uno o más ingredientes comestibles adicionales, y, opcionalmente, uno o más ingredientes.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición alimenticia que comprende al menos 0.1% p/p de biomasa de algas y uno o más ingredientes adicionales, incluyendo uno o más ingredientes comestibles, donde la biomasa de algas comprende al menos 30% de proteína en peso en seco, al menos 40% de proteína en peso en seco, al menos 45% de proteína en peso en seco, al menos 50% de proteína en peso en seco, al menos 55% de proteína en peso en seco, el menos 60% de proteína en peso en seco o al menos 75% de proteína en peso en seco. En algunos casos, la biomasa de algas contiene 30-75% o 40-60% de proteína en peso en seco. En algunas realizaciones, al menos 40% de la proteína en bruto es digerible, al menos 50% de la proteína en bruto es digerible, al menos 60% de la proteína en bruto es digerible, al menos 70% de la proteína en bruto es digerible, al menos 80% de la proteína en bruto es digerible o al menos 90% de la proteína en bruto es digerible. En algunos casos, la biomasa de algas se cultiva en condiciones heterotróficas. En al menos una realización, la biomasa de algas se cultiva en condiciones de contenido abundante de nitrógeno. En otras realizaciones, las microalgas tienen una mutación de color y carecen de o tienen una pigmentación reducida. En otra realización, la composición alimenticia comprende al menos 0.1% p/p de biomasa de algas y uno o más ingredientes comestibles adicionales, y, opcionalmente, uno o más ingredientes.

En algunos casos, la biomasa de algas comprende predominantemente células intactas. En algunas realizaciones, la composición alimenticia comprende aceite que está predominantemente o completamente encapsulado dentro de las células de la biomasa. En algunos casos, la composición alimenticia comprende predominantemente células de microalgas intactas. En algunos casos, el aceite de algas está predominantemente encapsulado en las células de la biomasa. En otros casos, la biomasa comprende predominantemente células lisadas (es decir, un homogeneizado). Como se describe anteriormente, dicho homogeneizado puede proporcionarse como una solución, copos, polvo o harina.

En algunas realizaciones de la composición alimenticia, la biomasa de algas comprende adicionalmente al menos 10 ppm de selenio. En algunos casos, la biomasa comprende adicionalmente al menos 15% p/p de polisacárido de algas. En algunos casos, la biomasa o harina de algas comprende adicionalmente al menos 5% p/p de glicoproteína de algas. En algunos casos, la biomasa comprende un total de entre 0 y 115 mcg de carotenoides por gramo de biomasa. En algunos casos, la biomasa comprende al menos 0.5% p/p de fosfolípidos de algas. En todos los casos, como se describe anteriormente, estos componentes son verdaderos componentes celulares y no extracelulares.

En algunos casos, la biomasa de algas de la composición alimenticia contiene componentes que tienen cualidades antioxidantes. Las cualidades de antioxidante fuertes puede atribuirse a los múltiples antioxidantes presentes en la biomasa de algas, los cuales incluyen, de modo no taxativo, carotenoides, minerales esenciales tales como cinc, cobre, magnesio, calcio y manganeso. Se demostró también que la biomasa de algas contiene otros antioxidantes tales como tocotrienoles y tocoferoles. Estos miembros de la familia de la vitamina E son antioxidantes importantes y tienen otros beneficios sobre la salud, tales como efectos protectores contra lesiones causadas por apoplejía, reversión de la obstrucción arterial, inhibición del crecimiento de células de cáncer de próstata y mama, reducción de los niveles de colesterol, reducción del riesgo de padecer diabetes tipo II y efectos protectores contra daño glaucomatoso. Las fuentes naturales de tocotrienoles y tocoferoles pueden encontrarse en aceites producidos a partir de aceite de palma, girasol, maíz, soja y oliva, sin embargo, las composiciones que se proporcionan en la presente tienen niveles significativamente mayores de tocotrienoles que los materiales conocidos hasta el momento.

En algunos casos, las composiciones alimenticias de la presente invención contienen aceite de algas que comprende un total de al menos 5mg/100g, al menos 7mg/100g o al menos 8mg/100g de tocoferol. En algunos casos, las composiciones alimenticias de la presente invención contienen aceite de algas que comprende un total de al menos 0.15mg/g, al menos 0.20mg/g o al menos 0.25mg/g de tocotrienol.

En determinadas realizaciones de las composiciones y/o métodos descritos anteriormente, las microalgas puede producir carotenoides. En algunas realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas se pueden extraer junto con los lípidos o el aceite producido por las microalgas (es decir, el aceite o lípido contendrá los carotenoides). En algunas realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas son xantófilos. En algunas realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas son carotenos. En algunas realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas son una mezcla de carotenos y xantófilos. En varias realizaciones, los carotenoides producidos por las microalgas comprenden al menos un carotenoide seleccionado del grupo que consiste en astaxantina, luteína, zeaxantina, alfa-caroteno, trans-beta caroteno, cis-beta caroteno, licopeno y cualquier combinación de estos. Un ejemplo no limitante de un perfil de carotenoide de un aceite de Chlorella protothecoides se incluye más adelante en los Ejemplos.

En algunas realizaciones de la composición alimenticia, la biomasa de algas es derivada de algas cultivadas y secadas en condiciones de buenas prácticas de fabricación (GMP). En algunos casos, la biomasa de algas se combina con uno o más ingredientes comestibles adicionales, incluyendo, de modo no taxativo, ingredientes de granos, fruta, verduras, proteínas, lípidos, hierbas y/o especias. En algunos casos, la composición alimenticia es un aderezo de ensalada, producto derivado de huevos, producto de panadería y confitería, pan, barra, pasta, salsa, sopa bebible, bebida, postre congelado, manteca o producto untable. En realizaciones particulares, la composición alimenticia no es una píldora o polvo. En algunos casos, la composición alimenticia, de conformidad con la presente invención, pesa al menos 50g o al menos 100g.

La biomasa se puede combinar con uno o más ingredientes comestibles adicionales para hacer un producto alimenticio. La biomasa puede ser de una única fuente de algas (por ejemplo variedad) o una biomasa de algas de fuentes múltiples (por ejemplo de variedades diferentes). La biomasa puede ser también de una única especie de algas, pero con un perfil de composición diferente. Por ejemplo, un fabricante puede mezclar microalgas que tienen un alto contenido de aceite con microalgas que tienen un alto contenido de proteínas para alcanzar el nivel exacto de aceite y proteína deseado en el producto alimenticio terminado. La combinación la puede llevar a cabo un fabricante de alimentos para hacer un producto terminado para la venta por menos o su uso en servicios de alimentación. De manera alternativa, un fabricante puede vender la biomasa de algas como producto y el consumidor puede agregar la biomasa de algas al producto alimenticio, por ejemplo, mediante la modificación de una receta convencional. En cada caso, la biomasa de algas se usa comúnmente para reemplazar la totalidad o parte del aceite, grasas o huevos, o similares, utilizados en muchos productos alimenticios tradicionales.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición alimenticia que comprende al menos 0.1% p/p de biomasa de algas y uno o más ingredientes comestibles adicionales, donde la biomasa de algas se formula mediante la mezcla de biomasa de algas que contiene al menos 40% de proteína en peso en seco con biomasa de algas que contiene al menos 40% de lípido en peso en seco, para obtener una mezcla con el porcentaje deseado de proteína y lípidos en peso en seco. En algunas realizaciones, la biomasa es de la misma variedad de algas. De manera alternativa, la biomasa de algas que contiene al menos 40% de lípidos en peso en seco, que contiene menos de 1% de lípidos en la forma de DHA, se mezcla con biomasa de algas que contiene al menos 20% de lípidos en peso en seco, que contiene al menos 5% de lípidos en la forma de DHA, para obtener una mezcla de biomasa seca que contiene en conjunto al menos 10% de lípidos y 1% de DHA en peso en seco.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para preparar una biomasa de algas mediante el secado de un cultivo de algas para proporcionar una biomasa de algas que comprende al menos 15% de aceite en peso en seco en condiciones de GMP, en el cual el aceite de algas es más de 50% lípido monoinsaturado.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una biomasa de algas que contiene al menos 15% de aceite en peso en seco, fabricada en condiciones de GMP, en el cual el aceite de algas es más de 50% lípidos 18:1. En un aspecto, la presente invención se refiere a una biomasa de algas que contiene al menos 40% de aceite en peso en seco fabricada en condiciones GMP. En un aspecto, la presente invención se refiere a una biomasa de algas que contiene al menos 55% de aceite en peso en seco fabricada en condiciones GMP. En algunos casos, la biomasa de algas se empaqueta en forma de tableta para la administración de una unitaria de biomasa. En algunos casos, la biomasa de algas se empaqueta con o contiene de otra manera una etiqueta que proporciona indicaciones para combinar la biomasa de algas con otros ingredientes comestibles.

En un aspecto, la presente invención se refiere a métodos para combinar la biomasa de algas y/o materiales derivados de esta, como se describe anteriormente, con al menos un ingrediente alimenticio terminado adicional, como se describe más adelante, para formar una composición alimenticia o alimento terminado. En varias realizaciones, la composición alimenticia formada mediante los métodos de la invención comprende un producto derivado de huevos (en polvo o líquido), un producto de pasta, un producto de aderezo, un producto de mayonesa, un producto de torta, un producto de pan, una barra energizante, un producto de leche, un producto de jugo, un producto untable o un licuado de frutas. En algunos casos, la composición alimenticia no es una píldora o polvo. En varias realizaciones, la composición alimenticia pesa al menos 10 g, al menos 25 g, al menos 50 g, al menos 100 g, al menos 250 g o al menos 500 g o más. En algunas realizaciones, la composición alimenticia formada a partir de la combinación de biomasa de microalgas y/o el producto derivado de esta es un producto no cocido. En otros casos, la composición alimenticia es un producto cocido.

En otros casos, la composición alimenticia es un producto cocido. En algunos casos, la composición alimenticia contiene menos de 25% de aceite o grasa en peso que excluye el aceite aportado por la biomasa de algas. La grasa, en forma de triglicéridos saturados (TAG o grasas trans), se fabrica mediante la hidrogenación de aceites vegetales, tal cual se lleva a la práctica cuando se preparan productos untables tales como margarinas. La grasa que contiene la biomasa de algas no contiene grasas trans. En algunos casos, la composición alimenticia contiene menos de 10% de aceite o grasa en peso que excluye el aceite aportado por la biomasa. En al menos una realización, la composición alimenticia no contiene aceite o grasa excluyendo el aceite aportado por la biomasa. En algunos casos, la composición alimenticia no contiene aceite excepto por el aceite aportado por la biomasa. En algunos casos, la composición alimenticia no contiene huevos o productos derivados de huevos.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método para elaborar una composición alimenticia en la cual la grasa o aceite en un producto alimenticio convencional están total o parcialmente sustituidos con biomasa de algas que contiene al menos 10% en peso de aceite. En una realización, el método comprende determinar una cantidad de biomasa de algas para la sustitución utilizando la proporción de aceite de algas en la biomasa y la cantidad de aceite o grasa en el producto alimenticio convencional, y combinar la biomasa de algas con al menos un ingrediente comestible adicional y menos de la cantidad de aceite o grasa contenida en el producto alimenticio convencional para formar una composición alimenticia. En algunos casos, la cantidad de biomasa de algas combinada con al menos un ingrediente adicional es 1-4 veces la masa o volumen de aceite y/o grasa del producto alimenticio convencional.

En algunas realizaciones, el método descrito anteriormente incluye adicionalmente proporcionar una receta para un producto alimenticio convencional que contiene el al menos un ingrediente alimenticio adicional combinado con un aceite o grasa, y combinar 1-4 veces la masa o volumen de la biomasa de algas con el al menos un ingrediente comestible adicional como la masa o volumen de grasa o aceite en el producto alimenticio convencional. En algunos casos, el método incluye adicionalmente preparar la biomasa de algas en condiciones GMP.

En algunos casos, la composición alimenticia formada mediante la combinación de biomasa de microalgas y/o producto derivado de esta comprende al menos 0.1%, al menos 0.5%, al menos 1%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 25%, o al menos 50% p/p o v/v de biomasa de microalgas o aceite de microalgas. En algunas realizaciones, las composiciones alimenticias formadas como se describe en la presente comprenden 2%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 25%, al menos 50%, al menos 75%, al menos 90%, o al menos 95% p/p de biomasa de microalgas o producto derivado de esta. En algunos casos, la composición alimenticia comprende 5-50%, 10-40%, o 15-35% de biomasa de algas o producto derivado de esta en peso o en volumen.

Como se describe anteriormente, la biomasa de microalgas puede estar sustituida por otros componentes que pueden estar de otra manera incluidos convencionalmente en un producto alimenticio. En algunas realizaciones, la composición alimenticia contiene menos de 50%, menos de 40%, o menos de 30% aceite o grasa en peso excluyendo el aceite de microalgas aportado por la biomasa o de fuentes de microalgas. En algunos casos, la composición alimenticia contiene menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10% o menos de 5% aceite o grasa en peso excluyendo el aceite de microalgas aportado por la biomasa o de fuentes de microalgas. En al menos una realización, la composición alimenticia no contiene aceite o grasa excluyendo el aceite de microalgas aportado por la biomasa o de fuentes de microalgas. En algunos casos, la composición alimenticia no contiene huevos, manteca u otras grasas/aceites o al menos otro ingrediente que pudiera incluirse comúnmente en un producto alimenticio convencional comparable. Algunos productos alimenticios no contienen productos lácteos (por ejemplo, manteca, crema y/o queso).

La cantidad de biomasa de algas utilizada para preparar una composición alimenticia depende de la cantidad de aceite no derivado de microalgas, grasa, huevos o similares a ser reemplazados en un producto alimenticio convencional y el porcentaje de aceite en la biomasa de algas. Por lo tanto, en al menos una realización, los métodos de la invención incluyen determinar una cantidad de biomasa de algas para combinarla con al menos un ingrediente comestible de una proporción de aceite en la biomasa y una proporción de aceite y/o grasa que se combina comúnmente con el al menos un ingrediente comestible en un producto alimenticio convencional. Por ejemplo, si la biomasa de algas contiene 50% p/p de aceite de microalgas, y se desea una sustitución de aceite o grasa en una receta convencional, entonces el aceite puede, por ejemplo, reemplazarse en una tasa de 2:1. La tasa puede medirse en masa, pero por fines prácticos, es usualmente más fácil medirla en volumen utilizando una tasa o cuchara de medida, y la sustitución puede ser en volumen. En un caso general, el volumen o masa de aceite o grasa a ser sustituido se reemplaza por una volumen o masa de microalgas (100/100-X), donde X es el porcentaje de aceite de microalgas en la biomasa. En general, el aceite y la grasa a ser reemplazado en recetas convencionales puede reemplazarse en su totalidad por biomasa de algas, aunque un reemplazo total no es necesario y puede conservarse cualquier proporción deseada de aceite y/o grasas y el resto puede sustituirse de acuerdo con las necesidades de sabor y nutricionales. Dado que la biomasa de algas contiene proteínas y fosfolípidos, los cuales funcionan como emulsionantes, los productos como el huevo pueden reemplazarse en su totalidad o parcialmente por biomasa de algas. Si se reemplaza un huevo en su totalidad por biomasa o harina de algas, a veces es conveniente o necesario aumentar los agentes emulsionantes en la composición alimenticia con uno o más agentes emulsionantes adicionales y/o agregar agua u otro/s líquido/s adicional/es para compensar la pérdida de estos componentes que de otro modo serían aportados por el huevo. En algunas realizaciones, puede ser necesario agregar agentes emulsionantes adicionales. De manera alternativa, dependiendo de la composición alimenticia, puede no ser necesario agregar agentes emulsionantes adicionales.

Para simplificar, las tasas de sustitución pueden proporcionarse en términos de masa o volumen de aceite, grasa y/o huevos que serán reemplazados por una masa o volumen de biomasa o harina de algas. En algunos métodos, la masa o volumen de aceite, grasa y/o huevos en una receta convencional se reemplaza por 5-150%, 25-100% o 25-75% de la masa o volumen de aceite, grasa y/o huevos. La tasa de sustitución depende de factores como el producto alimenticio, el perfil nutricional deseado del producto alimenticio, la textura y apariencia general del producto alimenticio y el contenido de aceite de la biomasa o de la harina de algas.

En alimentos cocidos, la determinación de los porcentajes (es decir, peso o volumen) puede realizarse antes o después de la cocción. El porcentaje de biomasa de algas o de la harina de algas puede aumentar durante el proceso de cocción debido a la pérdida de líquidos. Debido a que algunas células de biomasa de algas se pueden lisar durante el transcurso del proceso de cocción, puede ser difícil medir el contenido de biomasa de algas directamente en un producto cocido. Sin embargo, el contenido se puede determinar indirectamente a partir de la masa o volumen de biomasa que se incluyó en el producto crudo como un porcentaje del peso o volumen del producto terminado (con una base de sólidos secos de biomasa), así como mediante métodos de análisis de componentes que son únicos de la biomasa tales como secuencias genómicas o compuestos que son aportados únicamente por la biomasa de algas, tales como determinados carotenoides.

En algunos casos, puede ser conveniente combinar la biomasa de algas o la harina de algas con el al menos un ingrediente comestible adicional en una cantidad que exceda la cantidad proporcional de aceite, grasa, huevos o similares, que está presente en un producto alimenticio convencional. Por ejemplo, se puede reemplazar la masa o volumen de aceite y/o grasa en un producto alimenticio convencional por 0.25, 0.5, 0.75, 1, 2, 3, 4 o más veces la cantidad de biomasa de algas o de harina de algas. Algunas realizaciones de los métodos de la invención incluyen proporcionar una receta para un producto alimenticio convencional que contiene el al menos un ingrediente alimenticio combinado con un aceite o grasa, y combinar 0.25-4 veces la masa o volumen de la biomasa de algas o de la harina de algas con el al menos un ingrediente comestible adicional como la masa o volumen de grasa o aceite en el producto alimenticio convencional.

La biomasa de algas o harina de algas (predominantemente intacta u homogeneizada o micronizada) y/o el aceite de algas se combinan con el al menos un ingrediente comestible adicional para formar un producto alimenticio. En algunos productos alimenticios, la biomasa de algas y/o el aceite de algas se combinan con 1-20, 2 10, o 4-8 ingredientes comestibles adicionales. Los ingredientes comestibles se pueden seleccionar de todos los grupos alimenticios principales, incluyendo de modo no taxativo, frutas, verduras, legumbres, carnes, pescado, granos (por ejemplo trigo, arroz, avena, harina de maíz, cebada), hierbas, especias, agua, caldo vegetal, jugo, vino y vinagre. En algunas composiciones alimenticias, al menos 2, 3, 4, o 5 grupos alimenticios están representados así como la biomasa de algas o aceite de algas.

Pueden combinarse aceites, grasas, huevos y similares en las composiciones alimenticias, pero, como se describe anteriormente, usualmente están presentes en cantidades reducidas (por ejemplo, menos de 50%, 25% o 10% de la masa o volumen de aceite, grasa o huevos cuando se compara con productos alimenticios convencionales. Algunos productos alimenticios de la invención no contienen aceite excepto el aportado por la biomasa de algas y/o aceite de algas. Algunos productos alimenticios no contienen aceite excepto el aportado por la biomasa de algas. Algunos productos alimenticios no contienen grasas excepto las aportadas por la biomasa de algas o aceite de algas. Algunos productos alimenticios no contienen grasas excepto las aportadas por la biomasa de algas. Algunos productos alimenticios no contienen aceite ni grasas excepto los aportados por la biomasa de algas o aceite de algas. Algunos productos alimenticios no contienen aceite ni grasas excepto los aportados por la biomasa de algas. Algunos productos alimenticios no contienen huevos. En algunas realizaciones, los aceites producidos por las microalgas pueden diseñares mediante las condiciones de cultivo o la selección de la variedad para contener componentes o niveles particulares de ácidos grasos.

En algunos casos, la biomasa de algas o la harina de algas utilizada en la preparación de la composición alimenticia comprende una mezcla de al menos dos especies distintas de microalgas. En algunos casos, al menos dos de las especies distintas de microalgas fueron cultivadas por separado. En al menos una realización, al menos dos de las especies distintas de microalgas tienen perfiles de glicerolípidos diferentes. En algunos casos, el método descrito anteriormente comprende adicionalmente cultivar las algas en condiciones heterotróficas y preparar la biomasa a partir de las algas. En algunos casos, la totalidad de las al menos dos especies de microalgas distintas contienen al menos 10% o al menos 15% de aceite en peso en seco. En algunos casos, una composición alimenticia contiene una mezcla de dos preparaciones de biomasa distintas de la misma especie, donde una de las preparaciones contiene al menos 30% de aceite en peso en seco y la segunda contiene menos de 15% de aceite en peso en seco. En algunos casos, una composición alimenticia contiene una mezcla de dos preparaciones de biomasa distintas de la misma especie, donde una de las preparaciones contiene al menos 50% de aceite en peso en seco y la segunda contiene menos de 15% de aceite en peso en seco y adicionalmente donde la especie es Chlorella protothecoides.

Además del uso de la biomasa de algas o harina de algas como sustituto de aceite, grasa o huevos en alimentos convencionales, la biomasa de algas o harina de algas se puede utilizar como un suplemento en alimentos que no contendrían normalmente aceite, tal como un licuado de frutas. La combinación del aceite con productos que son principalmente carbohidratos puede tener beneficios asociados al aceite y de la combinación de aceite y carbohidratos mediante la reducción del índice glucémico de los carbohidratos. La provisión de aceite encapsulado en la biomasa es ventajosa para proteger el aceite de la oxidación y también mejora el gusto y la textura del licuado de frutas.

El aceite extraído de la biomasa de algas o de la harina de algas puede utilizarse de la misma manera que la biomasa en sí, es decir, como sustituto del aceite, grasa, huevos o similares en recetas convencionales. El aceite puede utilizarse para sustituir el aceite y/o la grasa convencionales en una base 1:1 peso/peso o volumen/volumen. El aceite puede utilizarse para reemplazar huevos mediante la sustitución de alrededor de 1 cucharadita de aceite de algas por huevo opcionalmente en combinación con agua adicional y/o un emulsionante (un huevo promedio de 58 g contiene alrededor de 11.2% grasa, el aceite de algas tiene una densidad de 0.915 g/ml y una cucharadita tiene un volumen de alrededor de 5 ml = 1.2 cucharaditas de aceite de algas/huevo). El aceite puede incorporarse también a aderezos, salsas, sopas, margarinas, leche en polvo, materias grasas y similares. El aceite es particularmente útil para los productos alimenticios en los que la combinación del aceite con otros ingredientes alimenticios es necesaria para obtener un sabor, textura y/o apariencia deseados. El contenido de aceite en peso o volumen en productos alimenticios puede ser de al menos 5, 10, 25, 40 o 50%.

En al menos una realización, el aceite extraído de la biomasa de algas o harina de algas puede utilizarse también como aceite de cocina por los fabricantes de alimentos, restaurantes y/o consumidores. En dichos casos, el aceite de algas sustituye los aceites de cocina convencionales como aceite de cártamo, aceite de canola, aceite de oliva, aceite de semilla de uva, aceite de maíz, aceite de girasol, aceite de coco, aceite de palma y otros aceites utilizados convencionalmente en la cocina. El aceite obtenido de la biomasa de algas o de la harina de algas, al igual que otros tipos de aceites, puede someterse a refinación adicional para aumentar su aptitud para la cocina (por ejemplo, aumentar su punto de humo). El aceite se puede neutralizar con soda cáustica para retirar los ácidos grasos libres. Los ácidos grasos libres pueden retirarse para hacer jabón. Se le puede quitar el color al aceite mediante decoloración con químicos tales como negro de carbón y tierra decolorante. Los químicos y la tierra decolorantes pueden separarse del aceite mediante filtración. El aceite puede también decolorarse mediante un tratamiento con vapor.

Puede combinarse la biomasa predominantemente intacta, homogeneizada o micronizada (como una suspensión, copos, polvo o harina) y el aceite de algas purificado con otros ingredientes alimenticios para formar productos alimenticios. Todos son fuentes de aceite con un perfil nutricional favorable (contenido monoinsaturado relativamente alto). La biomasa predominantemente intacta, homogeneizada y micronizada también proporciona una alta cantidad de proteína (composición balanceada de aminoácido), carbohidratos, fibra y otros nutrientes como se describe anteriormente. Los alimentos que incorporan cualquiera de estos productos pueden ser veganos o vegetarianos. Otra ventaja del uso de la biomasa de microalgas o harina de algas (ya sea predominantemente intacta u homogeneizada (o micronizada) o ambas) como fuente de proteína es que es una fuente de proteína vegana/vegetariana que no proviene de una fuente principal de alérgenos, tales como soja, huevos o lácteos.

Otros ingredientes comestibles que pueden combinarse con la biomasa de algas o harina de algas y/o aceite de algas en concordancia con la presente invención incluyen, de modo no taxativo, granos, frutas, verduras, proteínas, carnes, hierbas, especias, carbohidratos y grasas. Los otros ingredientes comestibles que pueden combinarse con la biomasa de algas o harina de algas y/o aceite de algas para formar composiciones alimenticias dependen del producto alimenticio que va a ser producido y del sabor, textura y otras propiedades deseadas del producto alimenticio.

Aunque en general cualquiera de estas fuentes de aceite de algas puede usarse en cualquier producto alimenticio, la fuente preferida depende en parte de si el aceite está presente de manera principal para fines nutricionales o calóricos en vez de estar presente por la textura, apariencia o gusto del alimento, o, de manera alternativa, si el aceite en combinación con otros ingredientes alimenticios tiene como fin aportar un sabor, textura o apariencia deseados al alimento, así como o en vez de mejorar su perfil nutricional o calórico.

Los productos alimenticios se pueden cocinar mediantes procesos convencionales, según se desee. Dependiendo de la duración y temperatura, el proceso de cocción puede romper algunas paredes celulares, liberando el aceite de modo que este se combina con los otros ingredientes en la mezcla. Sin embargo, al menos algunas de las células de algas usualmente sobreviven a la cocción intactas. De manera alternativa, los productos alimenticios pueden utilizarse sin cocción. En este caso, la pared de algas permanece intacta, protegiendo al aceite de la oxidación.

La biomasa de algas o harina de algas, si se proporciona en una forma con células predominantemente intactas, o como un polvo homogeneizado, difiere del aceite, grasa o huevos en que puede proporcionarse como ingrediente seco, facilitando la mezcla con otros ingredientes secos, tal como harina. En una realización, la biomasa de algas o harina de algas se proporciona como un homogeneizado seco que contiene entre 25 y 40% de aceite en peso en seco. Un homogeneizado de biomasa se puede proporcionar también como una suspensión. Después de la mezcla de los ingredientes secos (y la suspensión homogeneizada de biomasa, si se la utiliza), pueden agregarse líquidos tales como agua. En algunos productos alimenticios, la cantidad de líquido necesaria es de cierta manera mayor que en un producto alimenticio convencional debido al componente que no es aceite de la biomasa y/o porque los otros ingredientes no aportan agua, tal como huevos. Sin embargo, la cantidad de agua puede determinarse fácilmente igual que en la cocción convencional.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una composición de ingrediente alimenticio que comprende al menos 0.5% p/p de biomasa de algas que contiene al menos 10% de aceite de algas en peso y al menos un ingrediente comestible adicional, en el cual el ingrediente alimenticio puede reconstituirse convenientemente como un producto alimenticio mediante la adición de un líquido a la composición de ingrediente alimenticio. En una realización, el líquido es agua.

La biomasa de alto contenido de aceite homogeneizada o micronizada es particularmente ventajosa en productos alimenticios líquidos y/o emulsificados (emulsiones de agua en aceite y aceite en agua), tales como salsas, sopas, bebidas, aderezos de ensaladas, mantecas, productos untables y similares en los cuales el aceite aportado por la biomasa forma una emulsión con otros líquidos. Los productos que se benefician de una reología mejorada, tales como los aderezos, salsas y productos untables se describen más adelante en los Ejemplos. Utilizando biomasa homogeneizada se puede formar una emulsión con la textura (por ejemplo, sensación en la boca), sabor y apariencia (por ejemplo, opacidad) deseados con un contenido de aceite menor (en peso o volumen del producto total) que la formada en productos convencionales utilizando aceites convencionales, por lo tanto se puede utilizar como diluyente de grasas. Esto es útil para productos con bajas calorías (es decir, dietéticos). El aceite de algas purificado es también ventajoso para tales productos líquidos y/o emulsionados. Tanto la biomasa de alto contenido de aceite homogeneizada o micronizada como el aceite de algas purificado se combinan bien con otros ingredientes comestibles en productos de panadería y confitería, logrando un sabor, apariencia y textura similares o mejores que los productos similares hechos con aceites, grasas y/o huevos convencionales, pero con un perfil nutricional mejorado (es decir, mayor contenido de aceite monosaturado, y/o mayor contenido o calidad de proteína, y/o mayor contenido de fibra y/o de otros nutrientes).

La biomasa predominantemente intacta es particularmente útil en situaciones en la que es deseable cambiar o aumentar el perfil nutricional de un alimento (por ejemplo, mayor contenido de aceite, contenido de aceite diferente (por ejemplo, un aceite más monoinsaturado), contenido más alto de proteína, contenido más alto de calorías, contenido más alto de otros nutrientes). Dichos alimentos pueden ser útiles, por ejemplo, para atletas o pacientes que sufren de trastornos degenerativos. La biomasa predominantemente intacta puede utilizarse también como un agente volumétrico. Los agentes volumétricos pueden utilizarse, por ejemplo, para aumentar la cantidad de un alimento más caro (por ejemplo, un suplemento de carne y similares) o en alimentos simulados o de imitación, como los sustitutos vegetarianos de carne. Los alimentos simulados o de imitación difieren de los alimentos naturales en que el sabor y la consistencia están provistos usualmente por fuentes diferentes. Por ejemplo, los sabores de los alimentos naturales, tal como la carne, se pueden impartir mediante un agente volumétrico que tenga ese sabor. La biomasa predominantemente intacta puede utilizarse también como un agente volumétrico en dichos alimentos. La biomasa predominantemente intacta también es particularmente útil en alimentos secos, tal como pasta, porque tiene buenas propiedades de unión con el agua y puede por consiguiente facilitar la rehidratación de dichas comidas. La biomasa predominantemente intacta es también útil como conservante, por ejemplo, en productos de panadería y confitería. La biomasa predominantemente intacta puede mejorar la retención de agua y por consiguiente la vida útil.

La biomasa de algas o harina de algas desintegrada o micronizada es también útil como agente de unión, agente volumétrico o para cambiar o aumentar el perfil nutricional de un producto alimenticio. La biomasa de algas o harina de algas desintegrada puede combinarse con otra fuente de proteínas tal como carne, proteína de soja, proteína de suero de leche, proteína de trigo, proteína de porotos, proteína de arroz, proteína de arvejas, proteína de leche, etc., donde la biomasa de algas o harina de algas funciona como un agente de unión y/o volumétrico. La biomasa de algas o harina de algas que ha sido desintegrada o micronizada puede también mejorar la retención de agua y por consiguiente la vida útil. La retención de humedad aumentada es especialmente deseable en productos libres de gluten, tal como productos de panadería y confitería libres de gluten. Una descripción detallada de la formulación de una galleta libre de gluten utilizando biomasa de algas o harina de algas desintegrada y el subsiguiente estudio de la vida útil se describe en los Ejemplos más adelante.

En algunos casos, la biomasa de algas o harina de algas puede utilizarse en preparaciones con huevo. En algunas realizaciones, la biomasa de algas o harina de algas (por ejemplo, harina de algas) se agrega a una preparación de huevos en polvo seco convencional para hacer huevos revueltos que son más cremosos, tienen más humedad y una mejor textura que los huevos en polvo seco preparados sin la biomasa de algas o harina de algas. En otras realizaciones, la biomasa de algas o harina de algas se agrega a huevos completamente líquidos para mejorar la textura y humedad generales de los huevos que se separan y entonces se mantienen en una mesa de vapor. Los ejemplos de las preparaciones antemencionadas se describen en los Ejemplos más adelante.

La biomasa de algas o harina de algas (predominantemente intacta y/u homogeneizada o micronizada) y/o el aceite de algas pueden incorporarse en prácticamente cualquier composición alimenticia. Algunos ejemplos incluyen productos de panadería y confitería, tales como tortas, brownies, bizcochuelo, pan incluido el brioche, galletas incluidas las galletas de azúcar, bollos y pasteles. Otros ejemplos incluyen productos que se proporcionan usualmente en forma seca, tales como pastas o aderezos en polvo, leche en polvo, carne triturada y sustitutos de carne. La incorporación de biomasa predominantemente intacta en dichos productos como agente de unión y/o volumétrico puede mejorar la hidratación y aumentar el rendimiento debido a la capacidad de unirse al agua de la biomasa predominantemente intacta. Los alimentos rehidratados, tales como los huevos revueltos hechos con huevos en polvo seco, pueden también mejorar su perfil de textura y nutricional. Otros ejemplos incluyen producto alimenticios líquidos, tales como salsas, sopas, aderezos (prontos para comer), leche en polvo, bebidas de leche, bebidas de jugo, licuados de frutas, leche en polvo. Otros productos alimenticios líquidos incluyen bebidas nutricionales que sirven como reemplazo de comidas o leche de algas. Otros productos alimenticios incluyen mantecas y quesos y similares, incluyendo materia grasa, margarina/productos untables, mantecas de nuez y productos de queso, tal como salsa para nachos. Otros productos alimenticios incluyen barras energizantes, sustitutos de lecitina en productos de chocolate, barras que sustituyen comidas, productos tipo barra de granola. Otro tipo de productos alimenticios son los rebozadores y las coberturas. Cuando se rodea un alimento con una capa de aceite, la biomasa predominantemente intacta o un homogeneizado evita que el aceite adicional de un medio de cocción penetre en un alimento. Por lo tanto, el alimento puede mantener los beneficios de un contenido alto de aceite monoinsaturado de cobertura sin absorber aceites menos deseables (por ejemplo, grasas trans, grasas saturadas y subproductos del aceite de cocción). La cobertura de biomasa puede también proporcionar una textura deseable (por ejemplo, crocante) al alimento y un sabor más limpio debido a la menor absorción del aceite de cocción y sus subproductos.

En los alimentos no cocidos, la mayoría de las células de la biomasa permanecen intactas. Esto tiene la ventaja de proteger el aceite de algas de la oxidación, lo cual le confiere una vida útil larga y minimiza la interacción negativa con otros ingredientes. Dependiendo de la naturaleza de los productos alimenticios, la protección conferida por las células puede reducir o evitar la necesidad de refrigeración, envasado al vacío o similares. Mantener las células intactas también evita el contacto directo entre el aceite y la boca del consumidor, lo cual reduce la sensación aceitosa o grasosa que puede resultar no deseable. En los productos alimenticios en los que el aceite se usa más como un suplemento nutricional, esto puede ser una ventaja al mejorar las propiedades organolépticas del producto. Por lo tanto, la biomasa predominantemente intacta es adecuada para su uso en tales productos. Sin embargo, en los productos no cocidos, tales como aderezo de ensaladas, en los cuales el aceite imparte una sensación deseada en la boca (por ejemplo, como una emulsión con una solución acuosa tal como vinagre), se prefiere el uso de aceite de algas purificado o de biomasa micronizada. En los alimentos cocidos, algunas células de la biomasa original intacta pueden lisarse pero otras células de algas pueden permanecer intactas. La relación entre células intactas y células lisadas depende de la temperatura y la duración del proceso de cocción. En los alimentos cocidos en los cuales se desea una dispersión de aceite en una forma uniforme con otros ingredientes por motivos de sabor, textura y/o apariencia (por ejemplo, productos de panadería y confitería), se prefiere el uso de biomasa micronizada o de aceite de algas purificado. En los alimentos cocidos, en los cuales la biomasa de algas o la harina de algas se utiliza para proporcionar aceite y/o proteína y otros nutrientes, principalmente por su valor nutricional o calórico en lugar de su textura.

La biomasa de algas o la harina de algas también puede ser útil para aumentar el índice de saciedad de un producto alimenticio (por ejemplo, una bebida o licuado de frutas sustituto de comidas) en relación a un producto convencional similar hecho sin la biomasa de algas o harina de algas. El índice de saciedad es una medida del grado en que el mismo número de calorías de diferentes alimentos satisfacen el apetito. Dicho índice puede medirse mediante la proporción de un alimento bajo análisis y medir el apetito por otros alimentos en un intervalo de tiempo fijo luego de este. Cuanto menos apetito por otros alimentos luego de este, mayor el índice de saciedad. Los valores del índice de saciedad se pueden expresar en una escala en la cual el pan blanco tiene asignado un valor de 100. Las comidas con un índice de saciedad mayor son útiles para hacer dieta. Aunque no depende de la comprensión de un mecanismo, se cree que la biomasa de algas o la harina de algas aumenta el índice de saciedad de un alimento mediante el aumento del contenido de proteína y/o fibra del alimento para una cantidad de calorías dada.

La biomasa de algas o harina de algas (predominantemente intacta y homogeneizada o micronizada) y/o el aceite de algas pueden también elaborarse como suplementos nutricionales o dietéticos. Por ejemplo, el aceite de algas puede encapsularse en cápsulas digeribles de manera similar al aceite de pescado. Dichas cápsulas pueden envasarse en una botella y tomarse diariamente (por ejemplo, 1-4 cápsulas o comprimidos por día). Una cápsula puede contener una dosis unitaria de biomasa de algas o harina de algas o aceite de algas. De manera similar, la biomasa puede comprimirse opcionalmente con excipientes farmacéuticos o de otro tipo para formar comprimidos. Los comprimidos pueden envasarse, por ejemplo, en una botella o blíster, y tomarse diariamente en una dosis de, por ejemplo, 1-4 comprimidos por día. En algunos casos, el comprimido u otra formulación de dosificación comprende una dosis unitaria de biomasa o aceite de algas. La fabricación de productos de cápsulas o comprimidos y otros suplementos se lleva a cabo preferentemente en condiciones GMP apropiadas para suplementos nutricionales como se establece en el título 21 del artículo 111 del C.F.R (Código de Regulaciones Federales) u otras regulaciones comparables establecidas en jurisdicciones extranjeras. La biomasa de algas o harina de algas puede mezclarse con otros polvos y presentarse en sachet como un material listo para mezclarse (por ejemplo, con agua, jugo, leche u otros líquidos). La biomasa de algas o harina de algas puede también mezclarse con productos tales como yogures.

Aunque la biomasa de algas o la harina de algas y/o el aceite de algas pueden incorporarse a suplementos nutricionales, los productos alimenticios funcionales mencionados anteriormente tienen distinciones con respecto a los suplementos nutricionales típicos, los cuales se encuentran en forma de píldoras, cápsulas o polvos. La porción de dichos productos alimenticios comúnmente es más grande que la de un suplemento nutricional tanto en términos del peso como en términos de las calorías aportadas. Por ejemplo, los productos alimenticios usualmente tienen un peso de más de 100g y/o proporcionan al menos 100 calorías cuando se envasan o se consumen una vez. Los productos alimenticios comúnmente contienen al menos un ingrediente que es una proteína, un carbohidrato o un líquido y a menudo contienen dos o tres de dichos otros ingredientes. La proteína o carbohidrato en un producto alimenticio usualmente proporciona al menos 30%, 50% o 60% de las calorías del producto alimenticio.

Como se describe anteriormente, la biomasa de algas o la harina de algas puede ser elaborada por un fabricante y vendida a un consumidor, tal como un restaurant o un individuo, pasa su uso en un medio comercial o en el hogar. Dicha biomasa de algas o harina de algas preferentemente es fabricada y envasada en condiciones de práctica de elaboración buenas (GMP) para productos alimenticios. La biomasa de algas o harina de algas en forma predominantemente intacta o en forma homogeneizada o micronizada como un polvo se envasa comúnmente en seco en un contendedor hermético, tal como una bolsa sellada. La biomasa homogeneizada o micronizada en forma de suspensión puede ser convenientemente envasada en un tubo entre otros contenedores. Opcionalmente, la biomasa de algas o harina de algas puede ser envasada al vacío para mejorar la vida útil. No se requiere la refrigeración de la biomasa de algas o harina de algas envasadas. La biomasa de algas o harina de algas envasada puede contener instrucciones para su uso incluyendo instrucciones respecto a qué cantidad de biomasa de algas o harina de algas debe usarse para sustituir una cantidad dada de aceite, grasa o huevos en una receta convencional, como se describe anteriormente. Para simplificar, las instrucciones pueden establecer que el aceite o grasa sea sustituido en una relación 2:1 en masa o volumen de biomasa, y los huevos en una relación de 11 g de biomasa o 1 cucharadita de aceite de alga por huevo. Como se describe anteriormente, son posibles otras relaciones, por ejemplo, utilizando una relación de 10-175% de masa o volumen de biomasa respeto a masa o volumen de aceite y/o grasa y/o huevos en una receta convencional. Al abrir un envase sellado, las instrucciones pueden indicarle al usuario a mantener la biomasa de algas o la harina de algas en un recipiente hermético, tal como los que están disponibles comercialmente (por ejemplo, Glad), con refrigeración opcional.

La biomasa de algas o harina de algas (predominantemente intacta o polvo homogeneizado o micronizado) puede ser envasada en una forma combinada con otros ingredientes secos (por ejemplo azúcar, harina, frutas secas, saborizantes) y envasado en porciones para asegurar la uniformidad del producto final. La mezcla puede entonces convertirse en un producto alimenticio por el consumidor o empresa de servicio de alimentos simplemente mediante la adición de líquido, tal como agua o leche, y mezclado opcional, y/o cocción sin el agregado de aceites o grasas. En algunos casos, el líquido se agrega para reconstituir una composición de biomasa de algas o harina de algas seca. La cocción se puede llevar a cabo opcionalmente utilizando un horno de microondas, horno de convección, horno convencional o en una hornalla. Dichas mezclas pueden utilizarse para preparar tortas, panes, panqueques, waffles, bebidas, salsas y similares. Dichas mezclas tiene ventajas de conveniencia para el consumidor así como una vida útil larga sin refrigeración. Dichas mezclas se envasan comúnmente en un recipiente sellado que porta instrucciones para el agregado del líquido para convertir la mezcla en un producto alimenticio.

El aceite de algas para utilizarse como un ingrediente alimenticio es de manera similar preferentemente fabricado y envasado en condiciones GMP para un alimento. El aceite de algas se envasa comúnmente en una botella u otro recipiente de manera similar a los utilizados convencionalmente para aceites. El recipiente puede incluir una etiqueta adherida con indicaciones para el uso del aceite como reemplazo de aceites, grasas o huevos convencionales en productos alimenticios, y como aceite de cocina. Cuando se envasa en un contenedor sellado, el aceite tiene una vida útil larga (al menos de un año) sin deterioro sustancial. Después de abierto, el aceite de algas compuesto principalmente aceites monoinsaturados no es muy sensible a la oxidación. Sin embargo, las porciones no utilizadas del aceite se pueden mantener por más tiempo y con menos oxidación si se mantienen en frío y/o sin luz solar directa (por ejemplo, dentro de un espacio cerrado, tal como una despensa). Las instrucciones incluidas con el aceite pueden contener dicha información de almacenamiento preferido.

Opcionalmente, la biomasa de algas o harina de algas y/o el aceite de algas puede contener un conservante/antioxidante aprobado para maximizar la vida útil, incluidos, de modo no taxativo, carotenoides (por ejemplo astaxantina, luteína, zeaxantina, alfa-caroteno, beta-caroteno y licopeno), fosfolípidos (por ejemplo N-acilfosfatidiletanolamina, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, fosfatidilinositol y lisofosfatidilcolina), tocoferoles (por ejemplo alfa tocoferol, beta tocoferol, gama tocoferol y delta tocoferol), tocotrienoles (por ejemplo alfa tocotrienol, beta tocotrienol, gama tocotrienol y delta tocotrienol), hidroxitolueno butilado, hidroxianisol butilado, polifenoles, ácido rosmarínico, propil galato, ácido ascórbico, ascorbato de sodio, ácido sórbico, ácido benzoico, parabenos de metilo, ácido levulínico, ácido anísico, ácido acético, ácido cítrico y bioflavonoides.

La descripción de la incorporación de biomasa predominantemente intacta, biomasa homogeneizada o micronizada (solución, copo, polvo o harina) o aceite de algas en los alimentos para la nutrición de los seres humanos es también aplicable en general para los productos alimenticios para animales no humanos.

La biomasa imparte un aceite o proteínas o ambos de alta calidad a dichos alimentos. El contenido de aceite de algas es preferentemente al menos 10 o 20% en peso y de la misma manera para el contenido de proteína de algas. Obtener al menos una parte del aceite y/o proteína de algas a partir de biomasa predominantemente intacta es a veces ventajoso para alimentos de animales de alto desempeño, tales como perros o caballos deportivos. La biomasa predominantemente intacta es útil también como conservante. La biomasa de algas o harina de algas o el aceite se combina con otros ingredientes comúnmente incluidos en alimentos de animales (por ejemplo, carnes, sabor a carne, ácidos grasos, verduras, frutas, almidón, vitaminas, minerales, antioxidantes, probióticos) y cualquier combinación de estos. Dichos alimentos también son útiles para animales de compañía, particularmente los que tienen una vida activa. Se recomienda la inclusión de taurina en la comida para gatos. Al igual que con los alimentos para animales convencionales, el alimento puede proporcionarse en partículas en bocados apropiados para el animal previsto.

La comida deslipidada es útil como materia prima para la producción de un concentrado y/o aislado de proteína de algas, especialmente la comida deslipidada de biomasa de algas o harina de algas con alto contenido de proteínas. El concentrado y/o aislado de proteínas puede producirse utilizando procesos estándar utilizados para producir concentrado/aislado de proteína de soja. Un concentrado de proteína de alga se prepararía mediante la extracción de azúcares solubles de la biomasa de algas o harina de algas o comida deslipidada. Los componentes restantes serían principalmente proteínas y polisacáridos insolubles. Mediante la extracción de azúcares solubles de la comida deslipidada, el contenido de proteína aumenta, por lo tanto se crea un concentrado de proteína de algas. Un concentrado de proteína de algas contendría al menos 45% de proteína en peso en seco. Preferentemente, un concentrado de proteína de algas contendría al menos 50%-75% de proteína en peso en seco. Un aislado de proteína de algas también se prepara utilizando procesos estándar utilizados para producir un aislado de proteína de soja. Este proceso usualmente involucra un paso de extracción de temperatura y pH básico utilizando NaOH. Después del paso de extracción, los líquidos y sólidos se separan y se precipitan las proteínas fuera de la fracción líquida utilizando HCl. La fracción sólida se puede volver a extraer y las fracciones líquidas resultantes pueden agruparse antes de la precipitación con HCl. La proteína entonces se neutraliza y se seca por aspersión para producir un aislado de proteínas. Un aislado de proteína de algas contendría comúnmente al menos 90% de proteína en peso en seco.

La comida deslipidada es útil para la alimentación de animales de granja, por ejemplo, rumiantes, aves de corral, porcinos y acuicultura. La comida deslipidada es un subproducto de la preparación de aceite de algas purificado para fines alimenticios y de otro tipo. La comida resultante aunque posee un contenido reducido de aceite aún contiene proteínas, carbohidratos, fibra, ceniza y otros nutrientes de alta calidad apropiados para la alimentación de un animal. Dado que las células están predominantemente lisadas, la comida deslipidada es digerida fácilmente por dichos animales. La comida deslipidada puede combinarse opcionalmente con otros ingredientes, tales como granos, para la alimentación de un animal. Dado que la comida deslipidada tiene una consistencia como de polvo, puede comprimirse fácilmente como gránulos utilizando una extrusora o expansores, que están disponibles comercialmente.

A. Alimentos Aireados

El término “alimento aireado” se aplica usualmente a postres, pero puede aplicarse también a alimentos que no son postres formulados con los mismos principios. Los postres aireados se refieren a postres como mousse, helado, coberturas batidas, sorbetes, etc. Los alimentos aireados se componen de dos fases: una fase continua y una fase discontinua. La fase discontinua es aire que está retenido como células de aire o burbujas de aire en el artículo alimenticio. La fase continua puede estar hecha de agua, agua con sólidos disueltos (tal como leche), sólidos coloidales, proteínas, etc. Dado que los alimentos aireados se componen de una fase de aire discontinua, la capacidad de retener el aire en células de aire dentro del alimento es crucial para el éxito de la formulación de un alimento aireado. Los emulsionantes ayudan a formar las células de aire de la fase discontinua y los estabilizantes ayudan a retener las células de aire intactas dentro del alimento. Un efecto sorprendente e inesperado de la adición de biomasa de algas o harina de algas (particularmente de harina de microalgas rica en lípidos) en la preparación de un alimento aireado es la capacidad de retener el aire de la biomasa. La biomasa de algas o harina de algas, especialmente la harina de algas rica en lípidos tiene una capacidad de retener o de estabilizar aire excelente. La harina de microalgas o biomasa de algas de la presente invención también tienen una gran capacidad emulsionante y por consiguiente es útil para su uso en alimentos aireados.

En alimentos de panadería, tales como tartas, las grasas que incluyen los lípidos aportados por la harina de microalgas o biomasa de algas rica en lípidos tienen varias funciones cruciales: (1) las grasas son parcialmente responsables de la textura liviana y aireada mediante la retención o estabilización de pequeñas burbujas de aire que se forman a partir del agente de fermentación en la torta (lo mismo es aplicable para panes); (2) las grasas crean la textura de "disolución en la boca" y otras propiedades organolépticas mediante el recubrimiento de las proteínas de la harina y evitando la formación de gluten; (3) las grasas sólidas (con alto grado de saturación) usualmente tienen una capacidad de retención o estabilización de aire más alta que las grasas líquidas, lo cual da como resultado una textura más liviana y (4) los emulsionantes (tales como mono y diglicéridos) ayudan a la distribución de la grasa en la masa, lo cual da como resultado una mejor distribución de las burbujas de aire en la masa, lo cual lleva a una textura liviana y aireada en la torta o producto horneado. Sin embargo, la harina de algas o biomasa de algas rica en lípidos contiene mono y diglicéridos, no contiene grasas saturadas (a diferencia de las grasas sólidas, tal como manteca/manteca de cerdo). Por lo tanto, es algo inesperado que la harina de algas o biomasa de algas rica en lípidos tenga una capacidad de estabilización/retención de aire tan grande y que produzca la misma textura aireada/liviana en productos de panadería y confitería cuando se utiliza únicamente harina de algas o biomasa de algas para sustituir la manteca y/o las yemas de huevo.

Otro ejemplo de un alimento aireado es el helado (o sorbetes y gelatos, etc.). El helado se puede definir como una espuma parcialmente congelada, usualmente con un contenido de aire de 20% o mayor (fase discontinua). La fase continua contiene sólidos disueltos y coloidales, es decir, azúcares, proteínas, estabilizantes y una fase grasa en una forma emulsionada. Bajo un microscopio de electrones, la estructura del helado parece hecha de células de aire que están recubiertas por glóbulos de grasa entre los cristales de hielo que conforman la fase continua. Las capacidades de emulsificación y el contenido de lípidos de la harina de algas o la biomasa de algas hacen que estas sean adecuadas para su uso en la formulación de un helado. Otros ejemplos no limitativos de alimentos aireados incluyen mousse (ya sea salado o dulce), cobertura/crema batida y merengue. La aireación es también responsable de la liviandad que se encuentra en algunas tortas (por ejemplo, torta de ángel), galletas, panes o salsas.

B. Carnes Trituradas y Procesadas

Las carnes trituradas con esencialmente un sistema de dos fases compuesto de un sólido y un líquido, donde el sólido es inmiscible. El líquido es una solución acuosa de sales y, al mismo tiempo, es un medio en el cual las proteínas insolubles (y otros componentes) de las fibras musculares, grasa y tejido conjuntivo de la carne (los sólidos) se dispersan y forman una matriz. Aunque este sistema de dos fases no sea técnicamente una emulsión, tiene componentes y los aspectos estructurales de una "emulsión" de carne. El estado estable de esta emulsión de carne es responsable de la integridad de las carnes trituradas y procesadas. La fase sólida de las carnes trituradas está formada de carnes procesadas (que contienen fibras musculares, tejido conjuntivo y grasa, entre otros componentes) que han sido trozadas y molidas hasta una consistencia como la que se encuentra en las farsas. La fase sólida entonces se incorpora con la fase líquida para formar una emulsión de carne. Los ejemplos comunes de carnes trituradas incluyen las salchichas, frankfurters, salchicha de Bolonia, medallones de carne (por ejemplo, hamburguesas) y carnes enlatadas.

Las carnes procesadas se refieren a carne que ha sido separada mecánicamente y luego moldeada en formas. Dado que la carne está "procesada", el producto cárnico puede tener como consecuencia la apariencia de un corte, tajada o porción de la carne que ha sido desintegrada y se forma "dándole vueltas" a la carne molida, con o sin la adición de carne finamente triturada, donde las proteínas solubles de la carne molida unen los trozos pequeños entre sí. La separación mecánica de la carne puede incluir el trozado, molido y otras formas de procesamiento de carne para formar partes más pequeñas, acortando de esta manera las fibras musculares. Dado que las fibras de carne originales se han roto, la formación de una emulsión de carne parcial (similar a las carnes trituradas) es necesaria para integrar el producto de carne procesada. Los ejemplos no limitativos de carne procesada son las nuggets de pollo, los fiambres envasados (por ejemplo, jamón, pavo, etc.) y los bastones de pescado.

La biomasa de algas o harina de algas de la invención puede agregarse como ingrediente en carnes trituradas y procesadas. La biomasa de algas o harina de algas puede tener un efecto multifuncional en dichos productos cárnicos. Un aspecto es que la biomasa de algas o harina de algas puede utilizarse como agente volumétrico o producto de relleno. Otro aspecto es que los lípidos, carbohidratos y proteínas de la biomasa de algas o harina de algas actúan como aglutinantes para los otros componentes de la carne triturada/procesada. Otra ventaja, que es bastante sorprendente e inesperada, es que la biomasa de algas o harina de algas (la harina de algas rica en lípidos, particularmente) puede mejorar la textura y el sabor de los productos de carne triturada y/o carne procesada, especialmente si los productos cárnicos están hechos de carnes con bajo contenido de grasas. La carne picada con bajo contenido de grasas (4% de grasa) y el pavo picado (3% de grasa) tienen una textura resistente, masticable y seca y pueden tener un sabor de carne "no característico" similar al hígado. La adición de harina de algas o biomasa de algas ricas en lípidos puede dar como resultado una mejora en la textura y el sabor de las carnes trituradas y/o procesadas con carnes con contenidos tan bajos de grasas. En dichos casos, el producto cárnico con bajo contenido de grasas tendrá una textura más húmeda y más tierna y un sabor más rico y más cárnico que cuando no se agrega la harina de algas o biomasa de algas rica en lípidos, lo cual confiere al producto cárnico con bajo contenido de grasas una textura que es similar a la carne picada (20% de grasas) o pavo picado (15% de grasas) con un mayor contenido de grasas. La adición de la biomasa de algas o harina de algas en las carnes trituradas y/o procesadas puede crear un producto más saludable (con bajo contenido de grasas), a la vez que tiene la textura y el sabor de un producto cárnico con alto contenido de grasas.

C. Imitación de Lácteos

La harina de algas o biomasa de algas se puede utilizar como una imitación de lácteos o un sustituto de lácteos (los ejemplos incluyen la utilización de la harina de algas en lugar de manteca). La harina de algas o biomasa de algas puede utilizarse también como diluyente cuando se mezcla con queso modificado con enzimas (en saborizantes de queso o salsas de queso). De manera adicional, la harina de algas o biomasa de algas puede utilizarse también para preparar bebidas tales como leche de algas. La harina de algas o biomasa de algas también puede aumentar la cremosidad de un producto alimenticio (alimentos en los cuales los productos lácteos se agregan para darle al alimento una textura cremosa), tal como macarrones con queso, leche de soja, leche de arroz, leche de almendras, yogur, helado, crema batida, etc.

La harina de algas o biomasa de algas desgrasada puede utilizarse también como una imitación de lácteos. La harina de algas o biomasa de algas desgrasada o deslipidada no contiene cantidades sustanciales de aceite después de la extracción. Dependiendo del método de procesamiento, la harina de algas o biomasa de algas desgrasada puede incluir fosfolípidos que son un componente de la biomasa de algas o harina de algas. La harina de algas o biomasa de algas desgrasada no es un lácteo y potencialmente tiene un contenido muy bajo de grasas (si se compara con los aceites hidrogenados que contienen grasas trans que se utilizan para hacer leche en polvo no láctea). Cuando se agrega al café, la harina de algas o la biomasa de algas desgrasada puede reducir el sabor amargo del café e impartir una sensación en la boca de cremosidad (plenitud). El producto es adecuado como leche en polvo para el uso en moca, chocolate caliente, frappé y otras bebidas a base de café.

Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar la invención reivindicada, pero no para limitarla.

V. EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Cultivo de microalgas para lograr un alto contenido de aceite

Se cultivaron variedades de microalgas en matraces de agitación con el objetivo de lograr más de un 20% de aceite en peso en seco. El medio de matraz utilizado fue el siguiente: K²HPO⁴: 4.2 g/L, NaH²PO⁴: 3.1 g/L, MgSO⁴-7H²O: 0.24g/L, ácido cítrico monohidrato: 0.25g/L, CaCl²2H²O: 0.025g/L, extracto de levadura: 2g/L, y glucosa al 2%. Se descongelaron células criopreservadas a temperatura ambiente y se agregaron 500 ul de células a 4.5 ml de medio y se cultivaron durante 7 días a 28°C con agitación (200 rpm) en una placa de 6 pocillos. Los pesos celulares en seco se determinaron mediante la centrifugación de 1 ml de cultivo a 14,000 rpm durante 5 min en un tubo Eppendorf pre-pesado. El sobrenadante del cultivo se descartó y el sedimento celular resultante se lavó con 1 ml de agua desionizada. El cultivo se centrifugó nuevamente, el sobrenadante se descartó y los sedimentos celulares se colocaron a -80°C hasta que se congelaron. Las muestras entonces se liofilizaron durante 24 horas y se calcularon los pesos celulares en seco. Para la determinación del total de lípidos en los cultivos, se extrajeron 3 ml de cultivo y se sometieron a un análisis utilizando un sistema Ankom (Ankom Inc., Macedon, NY), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras se sometieron a extracción de solvente con un extractor Ankom XT10 de acuerdo con el protocolo del fabricante. El total de lípidos se determinó como la diferencia en masa entre las muestras secas hidrolizadas ácidas y las muestras secas, a las que se les extrajo el solvente. Las medidas de porcentaje de peso celular en seco de aceite se muestran en la Tabla 1.

T l 1 P r n i n l l r

Las variedades adicionales de Chioreila protothecoides también se cultivaron utilizando las condiciones descritas anteriormente y el perfil de lípidos se determinó para cada una de estas variedades de Chlorella protothecoides, utilizando procedimientos estándares de cromatografía de gases (GC/FID). Un resumen del perfil de lípidos está incluido a continuación. Los valores están expresados como porcentaje de área de los lípidos totales. Los números de registro con UTEX son variedades de algas de la Colección de Algas UTEX de la Universidad de Texas, Austin (1 University Station A6700, Austin, Texas 78712-0183). Los números de registro con CCAP son variedades algas de la Colección de Cultivos de Algas y Protozoarios (SAMS Research Services, Ltd. Scottish Marine Institute, OBAN, Argull PA37 1QA, Escocia, Reino Unido). Los números de registro con SAG son variedades de alga de la Colección de Cultivos de Algas de la Universidad de Goettingen (Nikolausberger Weg 18, 37073 Gottingen, Alemania).

Colección

Número de C12:0 C14:0 C16:0 C16:1 C18:0 C18:1 C18:2 C18:3 C20:0 C20:1 Registro

UTEX 25 0.0 0.6 8.7 0.3 2.4 72.1 14.2 1.2 0.2 0.2

UTEX 249 0.0 0.0 9.7 0.0 2.3 72.4 13.7 1.9 0.0 0.0

UTEX 250 0.0 0.6 10.2 0.0 3.7 69.7 14.1 1.4 0.3 0.0

UTEX 256 0.0 0.9 10.1 0.3 5.6 64.4 17.4 1.3 0.0 0.0

UTEX 264 0.0 0.0 13.3 0.0 5.7 68.3 12.7 0.0 0.0 0.0

UTEX 411 0.0 0.5 9.6 0.2 2.8 71.3 13.5 1.5 0.2 0.2

CCAP 211/17 0.0 0.8 10.5 0.4 3.3 68.4 15.0 1.6 0.0 0.0

CCAP 221/8d 0.0 0.8 11.5 0.1 3.0 70.3 12.9 1.2 0.2 0.0

SAG 211 10d 0.0 1.4 17.9 0.1 2.4 55.3 20.2 2.7 0.0 0.0

Estos datos demuestran que pesar de que todas las variedades antemencionadas son de Chioreila protothecoides, existen diferencias en el perfil de lípidos entre algunas de las variedades.

EJEMPLO 2

Se llevaron a cabo tres procesos de fermentación con tres diferentes formulaciones de medios con el objetivo de generar biomasa de algas con un contenido alto de aceite. La primera formulación (Medio 1) se basó en el medio descrito en Wu et ál. (1994 Science in China, vol. 37, No. 3, pp. 326-335) y consistía en lo siguiente, por litro: KH²PO⁴, 0.7g; K²HPO⁴, 0.3g; MgSO⁴-7H²O, 0.3g; FeSO⁴-7H²O, 3mg; clorhidrato de tiamina, 10 pg; glucosa, 20g; glicina, 0.1g; H³BO³, 2.9mg; MnCl²-4H²O, 1.8mg; ZnSO⁴-7H²O, 220pg; CuSO⁴-5H²O, 80pg; y NaMoO⁴-2H²O, 22.9mg. El segundo medio (Medio 2) se derivó del medio de matraz descrito en el Ejemplo 1 y consistía en lo siguiente, por litro: K²HPO⁴, 4.2g; NaH²PO⁴, 3.1g; MgSO⁴-7H²O, 0.24g; ácido cítrico monohidrato, 0.25g; cloruro de calcio deshidratado, 25mg; glucosa, 20g; extracto de levadura, 2g. El tercer medio (Medio 3) era un híbrido y consistía de lo siguiente, por litro: K²HPO⁴, 4.2g; NaH²PO⁴, 3.1g; MgSO⁴-7H²O, 0.24g; ácido cítrico monohidrato, 0.25g; cloruro de calcio deshidratado, 25mg; glucosa, 20g; extracto de levadura, 2g; H³BO³, 2.9mg; MnCl²-4H²O, 1.8 mg; ZnSO⁴-7H²O, 220pg; CuSO⁴-5H²O, 80pg; y NaMoO⁴-2H²O, 22.9mg. Las tres formulaciones de medio se prepararon y se esterilizaron por autoclave en recipientes fermentadores aptos para laboratorio durante 30 minutos a 121 °C. Se agregó glucosa estéril a cada recipiente seguido de enfriamiento luego de la esterilización por autoclave.

El inóculo en cada fermentador fue Chioreiia protothecoides (UTEX 250), preparado en dos etapas de matraz utilizando las condiciones de temperatura y medio del fermentador inoculado. Cada fermentador se inoculó con 10% (v/v) de cultivo en fase logarítmica. Los tres fermentadores aptos para laboratorio se mantuvieron a 28°C durante el transcurso del experimento. Las células de microalgas cultivadas en el Medio 1 también se evaluaron a una temperatura de 23°C. En todas las evaluaciones de fermentador, se mantuvo el pH a 6,6-6,8, la agitación a 500 rpm y el flujo de aire a 1 vvm. Los cultivos de fermentación se cultivaron durante 11 días. La acumulación de biomasa se midió mediante densidad óptica a 750 nm, y peso celular en seco.

La concentración de lípidos/aceite se determinó utilizando transesterificación directa con métodos estándar de cromatografía de gases. Brevemente, se transfirieron muestras del caldo de fermentación con biomasa en papel absorbente y se transfirieron a tubos de centrifugación y se secaron en un horno de vacío a 65-70°C durante 1 hora. Cuando se secaron las muestras, se agregaron 2 mL de H²SO⁴al 5% en metanol a los tubos. Los tubos se calentaron en un bloque térmico a 65-70°C durante 3.5 horas, mientras se mezclaban por vórtice y se sonicaban de manera intermitente. Se agregaron 2 ml de heptano y los tubos se agitaron vigorosamente. Se agregaron 2 Ml de K²CO³al 6% y los tubos se agitaron vigorosamente para mezclar y entonces se centrifugaron a 800 rpm durante 2 minutos. El sobrenadante se transfirió entonces a viales GC que contenían agente de secado de Na²SO⁴y se corrieron usando métodos estándar de cromatografía de gases. El porcentaje de lípidos/aceite se basó en el peso celular en seco. Los pesos celulares en seco para las células cultivadas utilizando: Medio 1 a 23°C fue 9.4g/L; Medio 1 a 28 °C fue 1.0 g/L, Medio 2 a 28°C fue 21.2 g/L; y Medio 3 a 28 °C fue 21.5 g/L. La concentración de lípidos/aceite para las células cultivadas utilizando: Medio 1 a 23°C fue 3 g/L; Medio 1 a 28°C fue 0.4 g/L; Medio 2 a 28°C fue 18 g/L; y Medio 3 a 28°C fue 19 g/L. El porcentaje de aceite basado en el peso celular en seco para las células cultivadas utilizando: Medio 1 a 23°C fue 32%; Medio 1 a 28°C fue 40%; Medio 2 a 28°C fue 85%; y Medio 3 a 28°C fue 88%. Los perfiles de lípidos (en % de área, después de normalizar hasta el estándar interno) de la biomasa de algas generada utilizando las tres formulaciones de medio diferentes a 28 °C se resumen a continuación en la Tabla 2.

T l 2 P rfil lí i hl r ll r h i li n if r n n i i n m i

EJEMPLO 3

Preparación de biomasa para productos alimenticios

La biomasa de microalgas se generó mediante el cultivo de microalgas como se describe en cualquiera de los Ejemplos 1 a 2. La biomasa de microalgas se recogió del fermentador, matraz u otro biorreactor.

Se siguieron procedimientos GMP. Cualquier persona que, por una revisión médica u observación de un supervisor, se demuestre que tenga, o parezca que tiene una enfermedad, herida abierta, incluidos forúnculos, llagas o heridas infectadas, o cualquier fuente anormal de contaminación microbiana por la cual existe una posibilidad razonable de que los alimentos, superficies que entran en contacto con los alimentos o materiales de envasado de alimentos se contaminen, deberá ser excluida de cualquier operación que se pueda esperar dé como resultado dicha contaminación hasta que la afección se haya corregido. Se instruyó al personal para reportar dichas afecciones de la salud a sus supervisores. Todas las personas que trabajan en contacto directo con la biomas de algas, superficies que entran en contacto con la biomasa y los materiales de envasado de biomasa cumplen con las prácticas de higiene mientras se encuentran en servicio en la medida necesaria para proteger la biomasa de microalgas contra la contaminación. Los métodos para mantener la limpieza incluyen, a modo no taxativo: (1) Utilizar prendas externas adecuadas para la operación de una manera que proteja la biomasa, superficies en contacto con la biomasa o materiales de envasado de la biomasa contra la contaminación. (2) Mantener una limpieza adecuada del personal. (3) Lavarse bien las manos (y desinfectarlas si es necesario para proteger de la contaminación con microorganismos indeseables) en una instalación adecuada para lavarse las manos antes de comenzar el trabajo, después de cada ausencia de la estación de trabajo y en cualquier otro momento cuando las manos puedan haberse ensuciado o contaminado. (4) Quitarse todas las joyas que no estén sujetas y todos los demás objetos que pudieran caer en la biomasa, el equipamiento o los recipientes y quitarse todas las joyas que no pudieran desinfectarse adecuadamente durante los períodos en los cuales se manipula manualmente la biomasa. Si dichas joyas de la mano no pudieran quitarse, se pueden cubrir con un material que pueda mantenerse en una condición intacta, limpia y sanitaria y que pudiera proteger efectivamente la biomasa, superficies en contacto con la biomasa o materiales de envasado de la biomasa de la contaminación por estos objetos. (5) Conservar los guantes, si se utilizan en la manipulación de la biomasa, en una condición intacta, limpia y sanitaria. Los guantes deberían ser de un material impermeable. (6) Utilizar, cuando sea adecuado, de una manera efectiva, redes para el pelo, vinchas, gorras, barbijos y otros medios efectivos de sujeción del pelo. (7) El almacenamiento de ropa u otras pertenencias debe realizarse en áreas distintas a donde se expone la biomasa o donde se laven los equipamientos o utensilios. (8) Realizar las siguientes acciones en áreas distintas a donde pueda exponerse la biomasa o donde se lavan los equipamientos o utensilios: comer biomasa, masticar chicle, tomar bebidas o utilizar tabaco. (9) Tomar cualquier precaución necesaria para proteger la biomasa, superficies en contacto con la biomasa o los materiales de envasado de la biomasa de la contaminación con microorganismos o sustancias extrañas, incluyendo, de modo no taxativo, transpiración, pelo, cosméticos, tabaco, agentes químicos y medicamentos aplicados a la piel. La biomasa de algas puede someterse opcionalmente a un procedimiento de desintegración celular para generar un lisado y/o se pueden secar opcionalmente para formar una composición de biomasa de microalgas.

EJEMPLO 4

Ausencia de toxinas de algas en biomasa de Chlorella protothecoides seca

Se cultivó una muestra de biomasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) y se preparó utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1. La biomasa seca se analizó utilizando un análisis de cromatografía líquidaespectrometría de masas/espectrometría de masas (LC-MS/MS) para detectar la presencia de toxinas de algas contaminantes y cianobacterianas. Los análisis abarcaron todos los grupos de toxinas de algas y cianobacterianas divulgadas en la bibliografía y mencionadas en las regulaciones de alimentos internacionales. Los resultados muestran que la muestra de biomasa no contenía niveles detectables de ninguna toxina de algas o cianobacteriana que fue analizada. Los resultados se resumen en la Tabla 3.

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EJEMPLO 5

Contenido de fibra alimentaria en la biomasa de Chlorella protothecoides

Se llevó a cabo un análisis proximal en muestras de biomasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) seca, cultivada y preparada utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1 de conformidad con los Métodos Oficiales de la ACOC Internacional (Método AOAC 991.43). La hidrólisis ácida para el contenido total de grasas (lípidos/aceite) se llevó a cabo en ambas muestras y el contenido de grasas de la biomasa con alto contenido de lípidos era de aproximadamente 50% y el de la biomasa de algas con alto contenido de proteína era de aproximadamente 15%. El contenido de fibra en bruto era del 2% en la biomasa con alto contenido de lípidos y con alto contenido de proteína. La humedad (que se determinó gravimétricamente) era del 5% en la biomasa con alto contenido de lípidos y con alto contenido de proteína. El contenido de cenizas, que se determinó mediante quemado en crisol y análisis de las cenizas inorgánicas, era del 2% en la biomasa de algas con alto contenido de lípidos y del 4% en la biomasa con alto contenido de proteína. La proteína en bruto, que se determinó mediante la cantidad de nitrógeno liberada por el quemado de cada biomasa, era del 5% en la biomasa de algas con alto contenido de lípidos y del 50% en la biomasa con alto contenido de proteína. El contenido de carbohidratos se calculó mediante la diferencia, tomando los valores anteriores conocidos de grasas, fibra en bruto, humedad, cenizas y proteína en bruto y restando ese total de 100. El contenido calculado de carbohidratos de la biomasa con alto contenido de lípidos era del 36% y el contenido de carbohidratos de la biomasa con alto contenido de proteínas era del 24%.

El análisis adicional del contenido de carbohidratos de ambas biomasas de algas mostró aproximadamente entre 4-8% (p/p) de azúcares libres (predominantemente sacarosa) en las muestras. Se analizaron múltiples lotes de biomasa de algas con alto contenido de lípidos para detectar azúcares libres (ensayos de fructosa, glucosa, sacarosa, maltosa y lactosa) y la cantidad de sacarosa se encontraba en el rango desde 2.83 % hasta 5.77 %; la maltosa en el rango desde indetectable hasta 0.6%; y la glucosa en el rango desde indetectable hasta 0.6%. Los otros azúcares, es decir fructosa, maltosa y lactosa, eran indetectables en cualquiera de los lotes analizados. Se analizaron múltiples lotes de biomasa de algas con alto contenido de proteína para detectar azúcares libres y solo se detectó sacarosa en cualquiera de los lotes en el rango desde 6.93% hasta 7.95%.

El análisis del contenido total de fibra alimentaria (en la fracción de carbohidrato de la biomasa de algas) de ambas biomasas de algas se llevó a cabo utilizando los métodos de conformidad con los Métodos Oficiales de la ACOC Internacional (Método AOAC 991.43). La biomasa con alto contenido de lípidos contenía 19.58% de fibra soluble y 9.86% de fibra insoluble, para un total de fibra alimentaria del 29.44%. La biomasa con alto contenido de proteína contenía 10.31% de fibra soluble y 4.28% de fibra insoluble, para un total de fibra alimentaria del 14.59%. Análisis de monosacáridos de la biomasa de algas

Se analizó una muestra de biomasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) seca con aproximadamente un 50% de lípidos en peso celular en seco, cultivada y preparada utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4, para detectar composiciones de monosacáridos(glicosilo) utilizando cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) combinadas de los derivados de per-O-trimetilsililo (TMS) de los glucósidos de metilo monosacárido producidos en la muestra por acidid methanologyis [sic]. Brevemente, los glicósidos de metilo se prepararon primero a partir de la muestra de Chlorella protothecoides seca mediante metanólisis con HCl 1M en metanol a 80 °C durante [sic] 18-22 °C, seguido de re-N-acetilación con piridina y anhidro acético en metanol (para la detección de los amino azúcares). Las muestras se sometieron a per-O-trimetilsililo mediante tratamiento con Tri-Sil (Pierce) a 80 °C durante 30 minutos. Estos procedimientos fueron descritos previamente en Merkle y Poppe (1994) Methods Enzymol. 230:1 -15 y York et ál. (1985) Methods Enzymol. 118:3-40. El análisis por GC/m S de los glucósidos de metilo de TMS se llevó a cabo en un HP 6890 GC conectado a un 5975b MSD, utilizando una columna capilar de sílice fundida All Tech EC-1 (30 m x 0.25 mm ID). Los monosacáridos se identificaron mediante sus tiempos de retención en comparación con los estándares, y el carácter carbohidrato de estos se autenticó mediante sus espectros de masa. La composición de monosacárido (glicosilo) de Chlorella protothecoides contenía: 1.2 % molar de arabinosa, 11.9 % molar de manosa, 25.2 % molar de galactosa y 61.7 % molar de glucosa. Los resultados están expresados como porcentaje molar del total de carbohidratos.

EJEMPLO 6

Perfil de aminoácidos de la biomasa de algas

Se analizó una muestra de biomasa de Chlorella protothecoides (UTEX 250) seca con aproximadamente 50% de lípidos en peso celular en seco, cultivada y preparada utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 1, para detectar el contenido de aminoácidos de conformidad con los Métodos Oficiales de la AOAC Internacional (análisis de triptófano: método AOAC 988.15; análisis de metionina y cistina: método AOAC 985.28 y los demás aminoácidos: método AOAC 994.12). El perfil de aminoácidos de la biomasa de algas seca (expresado en porcentaje del total de proteínas) se comparó con el perfil de aminoácidos de huevos enteros secos (perfil de la hoja de datos del producto de Huevo Entero, Protein Factory Inc., Nueva Jersey), y los resultados muestran que las dos fuentes tienen valores nutricionales de proteínas similares. Los resultados del perfil de aminoácidos relativo de una muestra de Chlorella protothecoides muestran que la biomasa contiene metionina (2.25%), cisteína (1.69%), lisina (4.87%), fenilalanina (4.31%), leucina (8.43%), isoleucina (3.93%), treonina (5.62%), valina (6.37%), histidina (2.06%), arginina (6.74%), glicina (5.99%), ácido aspártico (9.55%), serina (6.18%), ácido glutámico (12.73%), prolina (4.49%) hidroxiprolina (1.69%), alanina (10.11%), tirosina (1.87%) y triptófano (1.12%).

EJEMPLO 7

Composiciones de carotenoide, fosfolípido, tocotrienol y tocoferol de biomasa de Chlorella protothecoides UTEX 250, harina de algas de Chlorella protothecoides. Chlorella protothecoides con mutación de color (variedad BM1320) y aceite extraído de Chlorella protothecoides con mutación de color (variedad BM1320)

Se analizó una muestra de biomasa de algas producida utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 4 para detectar el contenido de tocotrienol y tocoferol utilizando HPLC de fase normal, Método AOCS Ce 8-89. La fracción de la biomasa que contenía el tocotrienol y el tocoferol se extrajo utilizando hexano u otro solvente no polar. Los resultados completos de la composición de tocotrienol y tocoferol se resumen en la Tabla 4.

Tabla 4. Contenido de tocotrienol tocoferol en biomasa de al as.

La fracción de la biomasa que contenía el carotenoide se aisló y se analizó para detectar carotenoides utilizando métodos de HPLC. La fracción que contenía el carotenoide se preparó mediante la mezcla de biomasa de algas liofilizada (producida utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 3) con carburo de silicio en un mortero de aluminio y se molió cuatro veces durante 1 minuto cada vez, con un mortero. La mezcla molida de biomasa y silicio se enjuagó con tetrahidrofurano (THF) y se recogió el sobrenadante. La extracción de biomasa se repitió hasta que el sobrenadante fuera incoloro y los sobrenadantes de THF de todas las extracciones se agruparon y se analizaron para detectar el contenido de carotenoide utilizando métodos de HPLC estándar. El contenido de carotenoide de la biomasa de algas que se secó utilizando una secadora de tambor también se analizó utilizando los métodos descritos anteriormente.

El contenido de carotenoide de la biomasa de algas liofilizada era: total de luteína (66.9-68.9 mcg/g: con cis-luteína en el rango de 12.4-12.7 mcg/g y trans-luteína en el rango de 54.5-56.2 mcg/g); trans-zeaxantina (31.427 33.451 mcg/g); cis-zeaxantina (1.201-1.315 mcg/g); t-alfa criptoxantina (3.092-3.773 mcg/g); t-beta criptoxantina (1.061-1.354 mcg/g); 15-cis-beta caroteno (0.625-.0675 mcg/g); 13-cis-beta caroteno (.0269-.0376 mcg/g); t-alfa caroteno (0.269-.0376 mcg/g); c-alfa caroteno (0.043-.010 mcg/g); t-beta caroteno (0.664-0.741 mcg/g); y 9-cis-beta caroteno (0.241 -0.263 mcg/g). El total de carotenoides hallado está en el rango desde 105.819 mcg/g hasta 110.815 mcg/g.

El contenido de carotenoide de la biomasa de algas secada en el tambor fue significativamente menor: total de luteína (0.709 mcg/g: donde el contenido de trans-luteína era 0.091 mcg/g y el de cis-luteína era 0.618 mcg/g); trans-zeaxantina (0.252 mcg/g); cis-zeaxantina (0.037 mcg/g); alfa-criptoxantina (0.010 mcg/g); beta-criptoxantina (0.010 mcg/g) y t-beta-caroteno (0.008 mcg/g). El total hallado de carotenoides fue de 1.03 mcg/g. Estos datos sugieren que el método utilizado para secar la biomasa de algas puede afectar significativamente el contenido de carotenoides.

También se llevó a cabo un análisis de fosfolípidos de la biomasa de algas. La fracción que contenía los fosfolípidos se extrajo utilizando el método de extracción de Folch (mezcla de cloroformo, metanol y agua) y la muestra de aceite se analizó utilizando el Método Oficial AOCS Ja 7b-91, determinación de HPLC de las lecitinas hidrolizadas (International Lecithin and Phopholipid Society 1999), y análisis por HPLC de los fosfolípidos con métodos de detección por dispersión de luz (International Lecithin and Phospholipid Society, 1995) para detectar el contenido de fosfolípidos. El total de fosfolípidos en porcentaje p/p fue del 1.18%. El perfil de fosfolípidos del aceite de algas estaba compuesto por fosfatidilcolina (62.7%), fosfatidiletanolamina (24.5%), lisofosfatidiilcolina (1.7%) y fosfatidilinositol (11%). Se llevó a cabo un análisis similar utilizando extracción de hexano a la fracción que contenía los fosfolípidos de la biomasa de algas. El total de fosfolípidos en porcentaje p/p fue del 0.5%. El perfil de fosfolípidos estaba compuesto por fosfatidiletanolamina (44%), fosfatidilcolina (42%) y fosfatidilinositol (14%).

Se analizó una muestra de harina de algas de Chioreila protothecoides para detectar el contenido de fosfolípidos como se describe anteriormente. El contenido total de fosfolípidos de esta muestra se determinó como del 0.8 % p/p. El contenido de fosfolípidos individual en una base p/p era como se describe a continuación: <0.01 % de N-acilfosfatidiletanolamina, <0.01% de ácido fosfatídico; 0.25% de fosfatidiletanolamina, 0.48% de fosfatidilcolina, 0.07% de fosfatidilinositol y <0.01% de lisofosfatidilcolina.

Se analizó una muestra de harina de algas hecha a partir de Chlorella protothecoides con mutación de color, variedad BM320, para detectar el contenido de fosfolípidos como se describe anteriormente. El contenido total de fosfolípidos de esta muestra se determinó como del 0.62% p/p. El contenido de fosfolípidos individual en una base p/p era como se describe a continuación: <0.01 % de N-acilfosfatidiletanolamina, <0.01% de ácido fosfatídico; 0.21% de fosfatidiletanolamina, 0.36% de fosfatidilcolina, 0.05% de fosfatidilinositol y <0.01% de lisofosfatidilcolina.

Se analizó el aceite que se extrajo de Chlorella protothecoides con mutación de color, variedad BM320, para detectar varios componentes. El aceite se extrajo mediante extracción con solvente (acetona y CO2 líquido). El aceite no se refinó, decoloró ni desodorizó. El aceite comprendía, en porcentaje p/p, 0.19% de monoglicéridos y 5.77% de diglicéridos. El aceite comprendía 3.24 mg de alfa tocoferol por cada 100 g de aceite y 0.95 mg de gama tocoferol cada 100 g de aceite. El aceite comprendía 191 mg de ergosterol cada 100 g de aceite, 5.70 mg campesterol cada 100 g de aceite, 10.3 mg estigmasterol cada 100 g de aceite, 5.71 mg p-sitosterol cada 100 g de aceite y 204 mg de otro esterol cada 100 g de aceite. El total de tocotrienoles de este aceite era de 0.25 mg cada 100 g de aceite (0.22 mg de alfa tocotrienol, <0.01 mg de beta tocotrienol y 0.03 mg de delta tocotrienol).

EJEMPLO 8

Producción de harina de algas (con alto contenido de lípidos)

Chlorella protothecoides con alto contenido de lípidos, cultivada con los métodos y condiciones de fermentación descritas en el Ejemplo 1 se procesó para producir harina de algas con alto contenido de lípidos. Para producir la harina de algas a partir de la biomasa de algas, la biomasa de recolectada se separó del medio de cultivo utilizando centrifugación. La biomasa concentrada resultante, que contenía más de 40% de humedad, se micronizó utilizando un homogeneizador de alta presión ((GEA modelo NS1001) funcionando a un nivel de presión de 1000 1200 bar hasta que el tamaño promedio de partículas de la biomasa fuera menor que 10 gm. El homogeneizado de algas se secó por aspersión utilizando métodos estándar. La harina de algas resultante (células de algas micronizadas que se secaron por aspersión para formar un polvo) se envasó y se almacenó hasta su uso.

Se analizó una muestra de harina de algas con alto contenido de lípidos para verificar el tamaño de partículas. Se creó una suspensión de harina de algas en agua y el tamaño de partículas de la harina de algas se determinó utilizando difracción láser con una máquina Malvern® Mastersizer 2000 utilizando un accesorio Hydro 2000S. Se creó una dispersión de control mediante mezclado suave y se crearon otras dispersiones utilizando una presión de 100 bar, 300 bar, 600 bar y 1000 bar. Los resultados mostraron que el tamaño promedio de partículas de la harina de algas es menor en la condición de presión más alta (3.039 gm en la condición de mezclado suave y 2.484 gm en la condición de 1000 bar). La distribución de los tamaños de partícula cambió en las condiciones de presión más alta, con una disminución de las partículas de tamaños más grandes (más de 10 gm) y un aumento de las partículas más pequeñas (menos de 1gm).

EJEMPLO 9

Composiciones alimenticias utilizando harina de algas con alto contenido de lípidos (rica en lípidos)

Las siguientes formulaciones alimenticias comprenden harina de algas con alto contenido de lípidos producida utilizando los métodos descritos en el Ejemplo 8 y que contenía aproximadamente 50% de lípidos.

Leche/postre helado de algas

Se produjo una formulación de leche de algas utilizando harina de algas con alto contenido de lípidos. La leche de algas contenía los siguientes ingredientes (en peso): 88.4% de Agua, 6.0% de harina de algas, 3.0% de concentrado de proteína del suero de la leche, 1.7% de azúcar, 0.6% de extracto de vainilla, 0.2% de sal y 0.1% de estabilizantes. Los ingredientes se combinaron y homogeneizaron a baja presión utilizando un homogeneizador manual. La leche de algas resultante se enfrió antes de servir. La sensación en la boca era similar a la de la leche entera y tenía una buena opacidad. La harina de algas utilizada contenía alrededor de 50% de lípidos, así que la leche de algas resultante contenía alrededor de 3% de grasas. Cuando se la comparó con leche de soja (Silk) con sabor a vainilla, la leche de algas dejaba una sensación en la boca similar y tenía una opacidad similar y no tenía el sabor a poroto de la leche de soja.

La leche de algas se combinó entonces con azúcar y extracto de vainilla adicionales y se mezclaron hasta que quedar homogénea en una mezcladora durante 2-4 minutos. La mezcla se colocó en una máquina de hacer helados pre-enfriada (Cuisinart) durante 1-2 horas hasta que se alcanzó la consistencia deseada. Se preparó una receta de helado convencional con 325 gramos de semi-crema, 220 gramos con 2% de leche y 1 yema de huevo, para comparar. La receta convencional de helado tenía una consistencia similar a un helado suave, y era un helado con un sabor rico, de textura suave. Aunque el helado hecho con leche de algas no tenía la cremosidad general ni dejaba la misma sensación en la boca que el helado de receta convencional, la consistencia y sensación en la boca era similar a leche helada con sabor rico. En general, el uso de leche de algas en una aplicación de postre helado fue exitosa: el postre helado de leche de algas producido es una alternativa baja en grasas a un helado convencional.

Panqué de harina de algas

Se produjo un panqué con harina de algas con alto contenido de lípidos como ejemplo de una formulación de un producto de panadería y confitería para demostrar la capacidad de la harina de algas o biomasa de algas para retener o estabilizar burbujas de aire (aireación) en un producto de panadería y confitería. La formulación del panqué de harina de algas era: extracto de vainilla (6.0 g); azúcar en polvo (122.0 g); huevos enteros (122.0 g); agua (16.0 g); harina común (122 g); sal (1.5 g); goma xantana (Keltrol F) (0.2 g); polvo de hornear (4 g); harina de algas con alto contenido de lípidos (45 g). Se batieron los huevos hasta que quedaron espesos, pálidos y cremosos y luego se agregó el azúcar y se incorporó bien. Se agregó el extracto de vainilla y se mezcló, seguido de la harina de algas, lo cual se incorporó a la mezcla de azúcar y huevos. Los ingredientes secos se mezclaron bien y se agregaron a la mezcla de azúcar y huevos alternativamente con el agua. La masa se mezcló hasta que quedó bien incorporada. La masa se vertió en moldes para muffins recubiertos de papel y se horneó a 325 °F durante 8-9 minutos. La bandeja se rotó y se horneó durante otros 8-10 minutos.

Las tortas tenían una textura liviana y aireada con una estructura de miga bien desarrollada, idéntica a la de panqué con manteca. Esta panqué con 10% (p/p) de harina de algas con alto contenido de lípidos en lugar de manteca demostró la capacidad de la harina de algas o biomasa de algas de retener o estabilizar la aireación dentro de un producto de panadería y confitería.

Macarrones con queso

Se produjeron macarrones con queso para examinar la capacidad de la harina de algas o biomasa de algas con alto contenido de lípidos y la harina de algas desgrasada (producida a través de extracción de CO2 de la harina de algas con alto contenido de lípidos) para aumentar el sabor de queso y la cremosidad de un producto lácteo (queso y manteca/leche modificados con enzimas (EMC)). La formulación de los macarrones con queso era (expresada en % del producto final en peso): Queso en polvo EMC (635%); agua (21.27%); sal (0.21%); harina de algas con alto contenido de lípidos (3.81%); harina de algas desgrasada (0.32%); macarrones cocidos (67.95%); y 50% ácido acético (0.10%). Los ingredientes secos (excepto los fideos) se combinaron y se agregó el agua a los ingredientes secos. La mezcla de queso se combinó con los fideos.

Los macarrones con queso producidos con harina de algas con alto contenido de lípidos y harina de algas desgrasada tenían un sabor similar a los productos de macarrones con queso preparados con polvo EMC (macarrones con queso de caja). Los macarrones con queso que contenían harina de algas con alto contenido de lípidos/desgrasada tenían una textura cremosa y dejaban una sensación en la boca similar a los macarrones con queso preparados de acuerdo con las instrucciones del envase (con leche y manteca). Este Ejemplo es una demostración exitosa de como la harina de algas o biomasa de algas con alto contenido de lípidos o harina de algas desgrasada puede impartir un sabor a queso mejorado y cremoso como sustituto de manteca y leche. El contenido de grasas de los macarrones con queso que contenían la harina de algas era menos del 2%.

Medallones de carne con bajo contenido de grasas

Se analizaron los efectos de la harina de algas o biomasa de algas con alto contenido de lípidos en medallones de carne picada en las siguientes formulaciones: 96% de carne picada libre de grasas que contenía 0, 0.5%, 1% o 2% de harina de algas con alto contenido de lípidos (como porcentaje del peso del producto final). 80% de carne picada libre de grasas que se utilizó como control positivo. Se mezcló carne picada con la harina de algas hasta que quedaron bien mezcladas y luego se formaron medallones con la mezcla. No se agregaron ingredientes adicionales. Los medallones se cocinaron en un sartén caliente hasta que estuvieron completamente cocidos. Los medallones con 94% de carne libre de grasa de control negativo estaban secos y tenían un sabor fuerte/a hígado. Los medallones con 80% de carne libre de grasa de control positivo tenían una textura húmeda y tierna y el sabor fuerte/de hígado era menos intenso. Los medallones hechos con 96% de carne picada libre de grasas con 0.5%, 1% y 2% de harina de algas con alto contenido de lípidos tenían una textura más húmeda y más tierna que los medallones de control negativo. El medallón con 2% de harina de algas con alto contenido de lípidos tenía una textura similar a la del control positivo y tenía el mismo sabor menos fuerte/de hígado.

También se analizaron medallones de pavo picado con 0, 0.5%, 1% o 2% de harina de algas con alto contenido de lípidos (como porcentaje del peso del producto final) incorporada con 99% de pavo picado libre de grasas. También se preparó un medallón de pavo con 93% de pavo picado libre de grasas como control positivo. Se mezcló pavo picado con la harina de algas hasta que quedaron bien mezcladas y luego se formaron medallones con la mezcla. Los medallones se cocinaron en un sartén caliente hasta que estuvieron completamente cocidos. El medallón con 97% de pavo libre de grasas estaba seco, duro y fibroso. El medallón con 93% de pavo libre de grasa de control positivo era más jugoso y tenía sabor a pavo asado. Los medallones que contenían 0.5%, 1% y 2% de harina de algas con alto contenido de lípidos tenían una textura más húmeda y más jugosa que los medallones de control negativo. Adicionalmente, el medallón con 2% de harina de algas con alto contenido de lípidos tenía un sabor a pavo asado similar al control positivo.

EJEMPLO 10

Genotipificación para identificar otras variedades de microalgas adecuadas para su uso en alimentos Genotipificación de algas

Se aisló ADN genómico de biomasa de algas de la siguiente forma. Se centrifugaron células (aproximadamente 200 mg) de cultivos líquidos durante 5 minutos a 14,000 x g. Las células entonces se volvieron a suspender en agua destilada estéril, se centrifugaron durante 5 minutos a 14,000 x g y se descartó el sobrenadante. Se agregó una perla de vidrio de ~2 mm de diámetro a la biomasa y los tubos se colocaron a -80 °C durante al menos 15 minutos. Las muestras se retiraron y se agregaron 150 pl de amortiguador de molido (sarcosilo al 1%, sacarosa 0.25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8.0, 0.5 ug/ul RNasa A). Los sedimentos se volvieron a suspender mediante agitación en vórtice breve, seguido de la adición de 40 ul de NaCl 5M. Las muestras se agitaron en vórtice brevemente, seguido de la adición de 66 pl de CTAB al 5% (bromuro de cetil de trietilamonio) y una breve agitación en vórtice final. Las muestras se incubaron a continuación a 65 °C durante 10 minutos luego de lo cual se centrifugaron a 14,000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 pl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12:12:1, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 14,000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contenía 0.7 volúmenes de isopropanol (~ 190 pl), se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante la noche a 4° C. Se recuperó el ADN mediante centrifugación a 14,000 x g durante 10 minutos. El sedimento resultante se lavó dos veces con etanol al 70%, seguido de un lavado final con etanol al 100%. Los sedimentos se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente, seguido por la resuspensión en 50 pl de TrisCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8.0).

Se diluyeron cinco pl de ADN de alga total, preparado como se describe anteriormente, 1:50 en Tris 10 mM, pH 8.0. Las reacciones de PCR, volumen de 20 pl, se establecieron del modo descrito a continuación: Se agregaron diez pl de 2 x mezcla maestra iProof HF (Bio-Rad) a 0.4 pl de cebador SZ02613 (5’-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3’ (SEQ ID NO:24) a una concentración original de 10 mM). Esta secuencia de cebador va desde la posición 567 a la 588 en el N° de registro Gen Bank L43357 y está altamente conservada en plantas más altas y genomas plástidos de algas. A continuación se agregaron 0.4 pl de cebador SZ02615 (5’-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3’ (SEQ ID NO:25) a una concentración original de 10 mM). Esta secuencia de cebador es complementaria a las posiciones 1112 a 1093 en el N° de registro Gen Bank L43357 y está altamente conservada en plantas más altas y genomas plástidos de algas. A continuación, se disolvieron 5 pl de ADN total y se agregaron 3.2 pl dH2O [agua destilada]. Las reacciones PCR se llevaron a cabo como se describe a continuación: 98°C, 45’’; 98°C, 8’’; 53°C, 12’’; 72°C, 20’’ durante 35 ciclos seguido por 72°C durante 1 minuto y luego se mantuvo a 25°C. Para la purificación de los productos de PCR, se agregaron 20 pl de Tris 10 mM, pH 8.0, a cada reacción, seguido por extracción con 40 pl de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 12:12:1, con agitación en vórtice y centrifugación a 14,000 x g durante 5 minutos. Se aplicaron las reacciones por PCR a columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3,000 x g. Los productos de PCR purificados se clonaron subsiguientemente por TOPO en PCR8/GW/TOPO y los clones positivos se seleccionaron en placas LB/Spec. El ADN de plásmido purificado se secuenció en ambas direcciones utilizando los cebadores M13 directos e inversos. Las alineaciones de secuencias y los árboles sin raíz se generaron utilizando el software Geneious DNA analysis. Las secuencias de las variedades 1-23 (designadas en el Ejemplo 1) están listadas como SEQ ID NOs: 1-23 en el Listado de Secuencias adjunto, respectivamente (es decir, la variedad 1 se corresponde con la SEQ ID NO:1, la variedad 2 se corresponde con la SEQ ID NO:2 y así sucesivamente).

Análisis de ADN genómico de ARNr 23S de 9 variedades de Chlorella protothecoides

Se aisló ADN genómico de 8 variedades de Chlorella protothecoides (UTEX 25, UTEX 249, UTEX 250, UTEX 256, UTEX 264, UTEX 411, SAG 211 10d, CCAP 211/17 y CCAP 211/8d) y se llevó a cabo un análisis del ADN genómico de ARNr 23S de conformidad con los métodos descritos anteriormente. Todas las variedades de Chlorella protothecoides analizadas tenían secuencias idénticas, excepto la UTEX 25. Las secuencias de las ocho variedades están listadas como SEQ ID NO: 26 y 27 en el Listado de Secuencias adjunto.

Análisis de genotipificación de muestras de Chlorella adquiridas comercialmente

Se realizó la genotipificación de tres muestras de Chlorella adquiridas comercialmente, Chlorella regularis (New Chapter, 390 mg/cápsula de gelatina), Chioreila con pared celular rota de Whole Foods (Whole Foods, 500 mg/comprimido) y Chlorella CGF de NutriBiotic (NutriBiotic, 500 mg/comprimido), utilizando los métodos descritos anteriormente. Se volvieron a suspender aproximadamente 200 mg de cada muestra de Chioreila adquirida comercialmente y agua destilada estéril para el aislamiento de ADN genómico.

Los productos de PCR resultantes se aislaron y clonaron en vectores y secuencias utilizando los cebadores M13 directos e inversos. Las secuencias se compararon con secuencias conocidas utilizando una búsqueda BLAST.

La comparación de las secuencias de ADN y ARNr 23s reveló que dos de las tres muestras de Chioreila adquiridas comercialmente tenían secuencias de a Dn que concordaban con la presencia de Lyngbya aestuarii (Chioreila con pared celular rota de Whole Foods y CGF de NutriBiotic). Lyngbya aestuarii es una especie de cinobacteria marina. Estos resultados demuestran Chioreila disponible comercialmente contiene otras especies de microorganismos contaminantes, incluidos organismos de géneros tales como Lyngbya que se sabe que producen toxinas (véase por ejemplo Teneva et ál., Environmental Toxicology, 18(1)1, págs. 9 - 20 (2003); Matthew et ál., J Nat Prod., 71 (6):págs. 1113-6 (2008); y Carmichael et ál., Appl Environ Microbiol, 63(8): págs. 3104-3110 (1997). EJEMPLO 11

Mutaciones de color de biomasa de microalgas adecuadas para su uso como alimentos

Mutagénesis química para generar mutaciones de color

Se cultivó Chioreila protothecoides (UTEX 250) de conformidad con los métodos y condiciones descritos en el Ejemplo 1. Se llevó a cabo la mutagénesis química a la variedad de algas utilizando N-metil-N’-nitro-N-nitroguanidina (NTG). El cultivo de algas se sometió al mutágeno (NTG) y entonces se seleccionó a través de rondas de reaislamiento en placas de glucosa agar al 2.0%. Las colonias se analizaron para verificar la presencia de mutaciones de color. Chioreiia protothecoides (de tipo salvaje) presenta un color dorado cuando se cultiva heterotróficamente. El análisis produjo una variedad que presentaba un color blanco en la placa de agar. Esta mutación de color se nombró 33-55 (se depositó el 13 de octubre de 2009 de conformidad con el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 con la Designación de Depósito de Patente PTA-10397). Se aisló también otra colonia y se sometió a tres rondas de reaislamiento para confirmar que esta mutación era estable. Esta mutación presentaba un color amarillo en la placa de agar y se nombró 25-32 (se depositó el 13 de octubre de 2009 de conformidad con el Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo, en 10801 University Boulevard, Manassas, VA, 20110-2209 con la Designación de Depósito de Patente PTA-10396).

Perfil de lípidos de Chioreiia protothecoides 33-55

Chioreiia protothecoides 33-55 y la Chioreiia protothecoides original (UTEX 250) se cultivaron de conformidad con los métodos y condiciones descritos en el Ejemplo 1. El porcentaje de lípidos (en peso celular en seco) se determinó para ambas variedades: Chioreiia protothecoides 33-55 tenía una concentración del 68% de lípidos y la variedad original tenía una concentración del 62% de lípidos. Los perfiles de lípidos se determinaron para ambas variedades y eran como se muestra a continuación (expresados como % de área): Chioreiia protothecoides 33-55, C14:0 (0.81); C16:0 (10.35); C16:1 (0.20); C18:0 (4.09); C18:1 (72.16); C18:2 (10.60); C18:3 (0.10); y otras (1.69); para la variedad original, C14:0 (0.77); C16:0 (9.67); C16:1 (0.22); C18:0 (4.73); C18:1 (71.45); C18:2 (10.99); C18:3 (0.14); y otras (2.05).

EJEMPLO 12

Materias primas celulósicas para el cultivo de biomasa de microalgas adecuadas para su uso como alimento Para poder evaluar si Chioreiia protothecoides (UTEX 250) podía utilizar una fuente de carbono no alimenticia, se prepararon materiales celulósicos (rastrojo de maíz sometido a explosión) para su uso como fuente de carbono para el cultivo heterotrófico de Chioreiia protothecoides que sea adecuada para su uso en cualquiera de las aplicaciones alimenticias descritas anteriormente en los Ejemplos precedentes.

Material de rastrojo de maíz sometido a explosión húmedo fue preparado por el National Renewable Energy Laboratory [Laboratorio Nacional de Energía Renovable] (Golden, CO) mediante la cocción de rastrojo de maíz en una solución ácido sulfúrico al 1.4% y la deshidratación de la suspensión resultante. Mediante el uso de un analizador de humedad Mettler Toledo, se determinó que los sólidos secos en el rastrojo de maíz húmedo eran el 24%. Una muestra húmeda de 100 g se resuspendió en agua desionizada para obtener un volumen final de 420 ml y el pH se ajustó a 4.8 utilizando NaOH 10N. Se agregó Celluclast™ (Novozymes) (una celulasa) a una concentración final del 4% y la suspensión resultante se incubó con agitación a 50°C durante 72 horas. El pH de este material se ajustó entonces a 7.5 con NaOH (cambio de volumen insignificante), se esterilizó con filtro a través de un filtro de 0.22 um y se almacenó a -20°C. Se reservó una muestra para la determinación de la concentración de glucosa utilizando un kit basado en hexocinasa de Sigma, como se describe a continuación.

Las concentraciones de glucosa se determinaron utilizando un reactivo de ensayo de glucosa N° G3293 de Sigma. Las muestras, tratadas como se describe anteriormente, se diluyeron 400 veces y se agregaron 40 gl a la reacción. Se determinó que la preparación celulósica de rastrojo de maíz contenía aproximadamente 23 g/L de glucosa.

Después del tratamiento enzimático y de la sacarificación de celulosa para producir glucosa, xilosa y otros azúcares monosacáridos, el material preparado anteriormente se evaluó como materia prima para el cultivo de Chlorella protothecoides (UTEX 250) utilizando el medio descrito en el Ejemplo 1. Se evaluaron varias concentraciones de azúcares celulósicos con glucosa pura (0, 12.5, 25, 50 y 100% de azúcares celulósicos). Las células se incubaron en la oscuridad en las varias concentraciones de azúcares celulósicas a 28°C con agitación (300 rpm). El crecimiento se evaluó mediante la medida de la absorbancia a 750 nm en un espectrofotómetro UV. Los cultivos de Chlorella protothecoides se incubaron en el material de rastrojo de maíz con Celluclast, incluyendo las condiciones de medio en las cuales el 100% de los azúcares fermentables eran derivados celulósicos. Se llevaron a cabo experimentos similares utilizando pulpa de remolacha azucarera tratada con Accellerase como materia prima celulósica. Al igual que los resultados con material de rastrojo de maíz, todos los cultivos de Chlorella protothecoides pudieron utilizar el azúcar derivado de celulosa como fuente de carbono.

EJEMPLO 13

La harina de algas mejora la sensación en la boca y mejora la textura de las composiciones alimenticias de galletas de mantequilla

Se prepararon galletas de mantequilla que contenían harina de algas, con aproximadamente 20% de grasas, utilizando la receta que figura más adelante. Se prepararon también galletas de mantequilla que no contenían harina de algas, con aproximadamente 20% de grasas, utilizando la receta que figura más adelante (Control). Se determinó mediante un panel que las galletas hechas con harina de algas tenían más sabor a manteca y un sabor más rico que las galletas hechas sin harina de algas.

Galletas de m ante uilla

Harina común General Mills 42.11% 41.50%

Bicarbonato de sodio Al por menor 0.50% 0.50%

Polvo de hornear Al por menor 0.65% 0.65%

Sal Al por menor 0.51% 0.51%

Leche en polvo descremada 1.00% 1.00%

Clara de huevo en polvo 1.00% 1.00%

Almidón alimenticio modificado Baka Snack 2.00% 2.00%

Azúcar de repostería 23.20% 22.81%

Harina de algas 0.00% 3.00%

Agua 4.00% 4.00%

Extracto de vainilla: McCormick 1x 1.53% 1.53%

Manteca 23.50% 21.50%

TOTAL 100.00% 100.00%

Grasa de manteca 19.98% 18.28%

Grasa de harina de algas 0.00% 1.65%

Total de grasas 19.98% 19.93%

Agua de manteca 3.53% 3.23%

Agua 4.00% 4.00%

Total de agua 9.06% 8.76%

Las galletas se hornearon en un horno de convección a 325 °F durante 7 minutos.

Helado de chocolate

Se preparó helado de chocolate que contenía harina de algas, con aproximadamente 10% de grasas, utilizando la receta que figura más adelante. Se preparó también helado de chocolate que no contenía harina de algas, con aproximadamente 10% de grasas, utilizando la receta que figura más adelante (Control). Se determinó mediante un panel que el helado de chocolate hecho con harina de algas era más rico, suave y cremoso que el helado hecho sin harina de algas. El panel percibió que el helado hecho con harina de algas tenía un contenido más alto de grasas. Se agregaron trazas de ingredientes adicionales como se muestra a continuación.

Helado de chocolate con harina de al as

Leche descremada 52.90%

Azúcar granulado C&H 18.00%

Harina de algas 2.00% 1.10% Crema doble, 40% de grasas 40% de grasas 20.50% 8.2%

Cacao 11 % Gerken’s Russet Plus 2.50% 0.28% Jarabe de maíz, 36DE 36DE traza

Leche en polvo descremada de alta

temperatura, N° 33225 2.00%

Chocolate amargo 1.50% 0.75% GELSTAR®, IC 3548 (estabilizante) FMC 0.600%

Sabores traza

Total 100.00% 10.33%

Instrucciones

1. Todos los ingredientes se mezclaron en el siguiente orden. Un cortador de pasta fue utilizado para incorporar la harina de algas, el estabilizante y el azúcar. A continuación, se agregó el cacao y la mezcla se dejó a un lado.

2. Se mezclaron el jarabe de maíz, leche descremada y sólidos lácteos y se mezclaron con la mezcla seca de (1) anterior. La crema se agregó por último.

3. La mezcla se calentó hasta 180 °F en un bol de mezcla de vidrio con tapa en un horno de microondas. Cada dos minutos, se comprobó la temperatura y la mezcla se agitó. Una vez que la mezcla alcanzó los 180 °F, se apagó el horno de microondas. De manera alternativa, la mezcla se puede calentar a baño María hasta que alcance una temperatura de 150 °F.

4. A continuación, la mezcla se homogeneizó a 180/30 bar utilizando el homogeneizador Panda de GEA NiroSoavi.

5. La mezcla fue entonces refrigerada generalmente durante la noche, se agregaron sabores y se activó la máquina de helados.

Helado de chocolate sin harina de al as

Leche descremada 51.40%

Azúcar granulado C&H 18.00%

Harina de algas 0.00% 0.00% Crema industrial, 40% de grasas 40% de grasas 23,00% 9,2%

11 % de cacao Gerken’s Russet Plus 2.50% 0.28%

Jara be de maíz, 36DE 36DE traza

Leche descremada desgrasada,

de a lta temperatura, N° 33225 3.00%

Chocolate amargo 1.50% 0.75%

GEL STAR® IC 3548

(estabilizante) FMC 0.600%

sabor traza

Tota l 100.00% 10.23% Instrucciones

El helado se preparó como se describió anteriormente, sin la adición de harina de algas.

EJEMPLO 14

Interacción con las proteínas de la leche

Las proteínas que contienen la leche son la caseína y el suero. La harina de algas o biomasa de algas interactúa con la leche y las proteínas de la leche para proporcionar una sensación en la boca mejorada para ciertos alimentos.

El uso de harina de algas en combinación con suero mejoró la sensación en la boca de la bebida de algas del ejemplo 9. La bebida descrita en el Ejemplo 9 se modificó como se describe más adelante. La adición de suero a la bebida de algas mejoró la sensación en la boca de la bebida. Otras proteínas, tal como Golden Chlorella High protein (disponible comercialmente), también mostraron una mejora en la sensación en la boca. En contraste, la adición de una proteína de soja, proteína de poroto, no mejoró la sensación en la boca de la bebida de algas.

De manera similar, la interacción de la harina de algas o biomasa de algas con la leche proporciona una mejora en la sensación en la boca de composiciones alimenticias de alimentos que contienen leche, por ejemplo, sopas a base de crema, leche en polvo de café y té, bebidas basadas en lácteos, yogures, helado, leche helada, nieve, sorbete y similares.

Bebida de leche de algas

Porcentaje de ingredientes Componente________________________________________________ en peso en seco_________ Agua embotellada o de la canilla 89.381

Azúcar granulado 1.7

Sal 0.23

Harina de algas 5

Carragenano Tic 710H (estabilizante) 0.014

Estabilizante Viscarin 359 de FMC (estabilizante) 0.075

Extracto de vainilla: McCormick 1x 0.6

Eggstend 300 (proteína del suero de la leche) 3

Total 100

Instrucciones

Se agregó agua a un recipiente y los ingredientes restantes se agregaron al agua en el orden que se listó durante la mezcla. El líquido se homogeneizó en un homogeneizador por lotes a 300-400 bar durante una pasada. El líquido homogeneizado se transfirió a recipientes apropiados y se refrigeró.

EJEMPLO 15

Extensión de la vida útil de las composiciones alimenticias que contienen harina de algas

Galletas de azúcar

Se prepararon galletas de azúcar que contenían harina de algas utilizando la receta que figura más adelante. Se prepararon también galletas de azúcar que no contenían harina de algas utilizando la receta que figura más adelante. La formulación de galletas de azúcar con 3% de harina de algas se ajustó mediante la eliminación de una yema de huevo y reduciendo la manteca de una formulación de galletas convencional para proporcionar una galleta en la cual las grasas totales sean las mismas en ambas formulaciones. Las galletas se almacenaron durante un período de tiempo en embalaje de aluminio y se evaluaron mediante un panel sensorial luego de tres días y luego de tres meses. Las galletas que no contenían harina de algas estaban pasadas y pegadas luego de tres días y no estaban en un estado aceptable a los tres meses. Las galletas que contenían la harina de algas permanecían crocantes tanto a los tres días como a los tres meses y estaban en un estado aceptable en ambos períodos de tiempo.

Galletas de azúcar

Galleta sin harina Galleta con 3% harina de Fuente_______________ de algas___________ algas____________________ Componente

Porcentaje Porcentaje

Harina común General Mills 36.09% 35.00%

Bicarbonato de sodio Al por menor 0.30% 0.30%

Polvo de hornear Al por menor 0.70% 0.70%

Sal Al por menor 0.00% 0.00%

Huevos enteros 6.52% 0.00%

Claras de huevo 0.00% 0.50%

Azúcar para

repostería C&H 37.00% 35.00%

Harina de algas 0.00% 3.00%

Agua 0.00% 7.00%

Extracto de vainilla,

1X: McCormick 0.75% 0.75%

Manteca sin sal 19.00% 17.75%

TOTAL 100.36% 100.00%

Grasa de huevos 0.73% 0.00%

Grasa de manteca 16.15% 15.09%

Grasa de harina de

algas 1.65%

Total de grasas 16.88% 16.74%

Agua 0 0

Agua de huevos 4.89% 0.00%

Agua de manteca 2.85% 2.66%

Extracto de vainilla 0.75% 0.75%

Total de agua 0.00% 7.00%

Total 8.49% 10.41%

Instrucciones

1. Los ingredientes secos, harina, sal, bicarbonato de sodio y polvo de hornear se mezclaron y se dejaron a un lado.

2. La materia grasa se hizo más cremosa mediante la adición lenta de harina de algas y azúcar en una batidora de cocina con un accesorio de paleta.

3. Se agregaron agua y extracto de vainilla lentamente con la batidora a velocidad lenta (1 o 2). Una vez se agregaron el agua y el extracto de vainilla, se aumentó la velocidad de mezcla a media y se mezcló durante dos minutos.

4. A continuación se agregaron los huevos y la mezcla prosiguió a velocidad media durante dos minutos. 5. Los ingredientes secos mezclados del paso 1 se agregaron lentamente a la mezcla del paso 4, inicialmente a velocidad de mezcla lenta, luego incrementando a 6-8 durante alrededor de 2-3 minutos para formar una masa.

6. Una bandeja de hornear se roció con aceite y la masa del paso 6 se estiró con un rodillo hasta un espesor de 8 mm y se horneó a 350 °F durante 7-9 minutos.

Galletas saladas

El American Baking Institute [Instituto Estadounidense de Panadería y Confitería] preparó galletas saladas que contenían harina de algas utilizando la receta que figura más adelante. Se prepararon también galletas saladas que no contenían harina de algas utilizando la receta que figura más adelante. Al preparar las galletas saladas que contenían harina de algas, los niveles utilizados de materia grasa y harina de algas se ajustaron para proporcionar una galleta salada con alrededor de 33% o alrededor de 50% de reducción en las grasas agregadas en comparación con las grasas totales de las formulaciones de control que no contenían harina de algas. Los procedimientos de mezclado se analizaron para evaluar el impacto en las características de la masa. Retrasar la adición de la harina de algas a la masa durante el proceso de mezcla da como resultado una reducción en la cantidad total de agua que se agrega a la masa. El procedimiento se modificó para agregar todos los ingredientes excepto la harina de algas al bol de mezclado y mezclar a velocidad uno durante dos minutos para mezclar los ingredientes. La velocidad de mezcla luego se cambió a velocidad dos y se mezcló durante cuatro minutos. A continuación, se agregó la harina de algas y se mezcló durante ocho minutos adicionales.

La textura de las galletas que contenían harina de algas era la misma de una galleta que no contiene harina de algas con grasas totales. Un panel describió la galleta salada formulada con la harina de algas como "más crocante" y prefirió el sabor y la textura a los de la galleta salada formulada sin harina de algas.

Las galletas saladas se almacenaron durante un período de tiempo en embalaje de aluminio y se evaluaron mediante un panel luego de 30 días y luego de cuatro meses. Las galletas saladas que no contenían harina de algas estaban pasadas y pegadas luego de 30 días y no estaban en un estado aceptable a los cuatro meses. Las galletas saladas que contenían harina de algas permanecieron crocantes y aceptables luego de cuatro meses.

Galletas saladas

Galletas saladas con harina de algas

Galletas saladas sin harina de algas (50% de reducción de grasas) Ingrediente

Porcentaje en peso Porcentaje en peso

Harina de repostería 65.34% 65.06%

Sal 0.65% 0.65%

Bicarbonato de sodio 0.49% 0.49%

Materia grasa 7.84% 1.04%

Harina de algas 0.00% 5.21%

Azúcar granulado 5.23% 5.23%

Leche en polvo

desgrasada 0.98% 0.98%

Malta no diastásica 0.33% 0.33%

Bicarbonato de amonio 0.65% 0.65%

Levadura fresca 0.16% 0.16%

Sulfito de sodio 0.03% 0.03%

Agua 18.30% 20.17%

TOTAL 100.00% 100.00%

Instrucciones

Se mezclaron todos los ingredientes, excepto la harina de algas, en una batidora industria1Hobart con una paleta durante dos minutos a la primera velocidad para formar una masa. La velocidad de la batidora se incrementó a la segunda velocidad y se mezcló durante cuatro minutos. Se agregó entonces la harina de algas a la masa y entonces se mezcló durante 8 minutos adicionales a la segunda velocidad. La masa se horneó en un horno en una bandeja de rejilla en la zona 1 (450° en la parte superior / 430° en la parte inferior con reguladores cerrados/cerrados), zona 2 (425° en la parte superior / 400° en la parte inferior con reguladores abiertos/abiertos) o la zona 3 (415° en la parte superior / 375° en la parte inferior con reguladores abiertos/abiertos) hasta que estuvo dorada. Las galletas saladas tenían un contenido de humedad de alrededor del 3%.

EJEMPLO 16

Se prepararon un producto de manteca untable con harina de algas de acuerdo con la receta siguiente. La manteca untable se elaboró batiendo harina de algas con manteca en una batidora a alta velocidad y luego se añadió agua lentamente a la mezcla de harina de algas y manteca mientras se mezclaba a alta velocidad. A continuación se disolvió sal en agua para preparar agua salada. Posteriormente, se añadió agua salada lentamente a la mezcla de harina de algas y aceite de palma mientras se mezclaba a alta velocidad. La textura y el sabor del producto untable que contenía harina de algas era similar a los productos untables de manteca y margarina con grasas totales sin harina de algas.

Manteca untable

Componente Porcentaje en peso

Harina de algas 20%

Agua 30%

Manteca salada 50%

TOTAL 100%

EJEMPLO 17

Combinación de aceite de algas y harina de algas desgrasada

En la formulación de galletas que se muestra más adelante, en lugar de utilizar harina de algas se utilizó una cantidad equivalente de harina de algas desgrasada y aceite de algas para preparar las galletas. Las galletas hechas con harina de algas desgrasada y aceite de algas se compararon con las galletas hechas con harina de algas. Un panel evaluó las galletas. Se notó que las galletas hechas con harina de algas tenían un sabor mejor, más dulce y una textura más masticable, y se percibió que tenían un sabor más fuerte a manteca. De manera adicional, el color de las galletas hechas con harina de algas desgrasada y aceite de algas era diferente al de las galletas hechas con harina de algas. En los alimentos no homogeneizados, el uso de harina de algas desgrasada y aceite de algas dio como resultado un producto inferior cuando se lo compara con el producto con harina de algas.

Galletas de azúcar de algas: Sin huevos ni manteca (aproximadamente 3.5% de grasas totales)

Porcentaje de

ingrediente en

Componente peso Gramos

Mezcla seca 1: Harina común 38 155.6

Bicarbonato de sodio 0.3 1.19

Polvo de hornear 0.7 2.88

Sal 0.5 2.2

Mezcla seca 2: Harina de algas 7 28.8

Azúcar granulado 34 140.5 Ingredientes húmedos agua 17 70.7

Extracto de vainilla: McCormick, 1x 1.5 6.5 Eggstend 1 4

TOTAL 100 412.37

Instrucciones

1. La mezcla de harina, sal, bicarbonato de sodio, polvo de hornear y eggstend se mezcló y se dejó a un lado.

2. Se mezclaron el azúcar y la harina de algas en una batidora de cocina con un accesorio batidor durante 5 minutos.

3. Con la batidora en velocidad lenta (1-2) se agregó agua lentamente a la mezcla del paso 2 anterior.

4. Con la batidora en velocidad lenta (1-2) se agregó extracto de vainilla lentamente a la mezcla del paso 3 anterior para formar una masa.

5. La masa se refrigeró durante 1 hora. De manera alternativa, la masa se puede refrigerar por períodos más largos, incluyendo hasta 2-4 días o se puede congelar para su uso posterior.

6. La bandeja para galletas se roció con aceite.

7. Se sacó la masa con una pala y se formaron discos que se colocaron en una bandeja para galletas. Cada galleta pesaba aproximadamente 15 gramos.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición alimenticia congelada que comprende:

(a) harina de algas producida heterotróficamente, que es un homogeneizado en polvo de biomasa de microalgas que contiene células lisadas mecánicamente en las que más del 50% de las células han sido alteradas de manera que los componentes intracelulares de la célula ya no están completamente encerrados dentro de la membrana celular, dicha harina de algas comprendiendo menos de 200 ppm de clorofila y más del 20% de aceite de triglicéridos en peso seco, en donde menos del 5% en peso del aceite es ácido docosahexaenoico (DHA);

(b) por lo menos un ingrediente comestible adicional; y

(c) gas;

en donde la composición alimenticia congelada comprende una fase continua y una fase gaseosa discontinua, y en donde el porcentaje del volumen de los alimentos aportados por el gas está entre el 1% y el 50%.

2. La composición alimenticia congelada de la reivindicación 1, en donde la composición alimenticia es un alimento aireado.

3. La composición alimenticia congelada de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la composición se selecciona del grupo que consiste de helado, gelato, sorbete, mousse, flan, crema, merengue, paté, producto horneado, mousse, ingredientes lácteos batidos, yogurt congelado, rellenos batidos y salsa.

4. La composición alimenticia congelada de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición alimenticia es un helado, sorbete o gelato.

5. Un método para elaborar un alimento aireado que comprende mezclar:

(a) harina de algas producida heterotróficamente, que es un homogeneizado en polvo de biomasa de microalgas que contiene células lisadas mecánicamente en el que más del 50% de las células han sido alteradas de manera que los componentes intracelulares de la célula ya no están completamente encerrados dentro de la membrana celular, dicha harina de algas comprendiendo menos de 200 ppm de clorofila y más del 20% de aceite de triglicéridos en peso seco, en donde menos del 5% en peso del aceite es ácido docosahexaenoico (DHA);

(b) agua; y

(c) por lo menos un ingrediente comestible adicional,

para elaborar una dispersión, en donde la harina de algas comprende del 0,5 al 10% p/p de la dispersión; e incorporar gas en la dispersión para formar burbujas de fase gaseosa discontinua estables, en donde la composición alimenticia comprende una fase continua y una fase gaseosa discontinua y el porcentaje del volumen del alimento aportado por el gas está entre el 1% y el 50%.

6. Un producto cárnico que comprende una matriz de:

(a) carne molida o picada; y

(b) por lo menos un 0,5% p/p de harina de algas producida heterotróficamente, que es un homogeneizado en polvo de biomasa de microalgas que contiene células lisadas mecánicamente en las que más del 50% de las células se han alterado de manera que los componentes intracelulares de la célula ya no están completamente encerrados dentro de la membrana celular, dicha harina de algas comprende menos de 200 ppm de clorofila y por lo menos un 20% de aceite de triglicéridos en peso seco, en donde menos del 5% en peso del aceite es ácido docosahexaenoico (DHA);

en donde la carne y la harina de algas se dispersan por toda la matriz,

7. Una composición alimenticia de lácteos que comprende:

(a) por lo menos un ingrediente lácteo; y

(b) harina de algas producida heterotróficamente, que es un homogeneizado en polvo de biomasa de microalgas que contiene células lisadas mecánicamente en las que más del 50% de las células se han alterado de manera que los componentes intracelulares de la célula ya no están completamente encerrados dentro de la membrana celular, dicha harina de algas comprende menos de 200 ppm de clorofila y por lo menos un 20% de aceite de triglicéridos en peso seco, en donde menos del 5% en peso del aceite es ácido docosahexaenoico (DHA);

en donde entre el 10% y el 100% de la grasa en el alimento es proporcionada por la harina de algas.

8. La composición alimenticia congelada de la reivindicación 1, el producto cárnico de la reivindicación 6 o la composición alimenticia de lácteos de la reivindicación 7, en donde más del 75 al 90% de las células lisadas mecánicamente se han alterado de tal manera que los componentes intracelulares de la célula ya no están completamente encerrados dentro de la membrana celular.

9. La composición alimenticia congelada de la reivindicación 1, el producto cárnico de la reivindicación 6 o la composición alimenticia de lácteos de la reivindicación 7, en donde la harina de algas se obtiene de una especie del género Chlorella.

10. La composición alimenticia congelada de la reivindicación 1, el producto cárnico de la reivindicación 6 o la composición alimenticia de lácteos de la reivindicación 7, en donde la harina de algas se obtiene de Chlorella protothecoides.

11. El método de la reivindicación 5, en donde más del 75 al 90% de las células lisadas mecánicamente se han alterado de tal manera que los componentes intracelulares de la célula ya no están completamente encerrados dentro de la membrana celular.

12. El método de la reivindicación 5, en donde la harina de algas se obtiene de una especie del género Chlorella.

13. El método de la reivindicación 5, en donde la harina de algas se obtiene de Chlorella protothecoides.