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ES2748570T3 - Anticuerpos específicos para el FcRn - Google Patents

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ES2748570T3 ES14800000T ES14800000T ES2748570T3 ES 2748570 T3 ES2748570 T3 ES 2748570T3 ES 14800000 T ES14800000 T ES 14800000T ES 14800000 T ES14800000 T ES 14800000T ES 2748570 T3 ES2748570 T3 ES 2748570T3
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Thomas Allen Ceska
Helene Margaret Finney
Lara Kevorkian
Kaushik Sarkar
Bryan John Smith
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Abstract

Un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo que comprende (i) una cadena pesada o un fragmento de la cadena pesada que tiene una región variable que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25 y (ii) una cadena ligera o un fragmento de la cadena ligera que tiene una región variable que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 16.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos específicos para el FcRn
La divulgación se refiere a anticuerpos específicos para el FcRn, a formulaciones que comprenden a los mismos, al uso de cada uno en terapia, a procedimientos para expresar y, opcionalmente, formular dicho anticuerpo, a ADN que codifica los anticuerpos y hospedadores que comprenden dicho ADN.
El FcRn es un complejo no covalente de la cadena a de la proteína de membrana FcRn y la microglobulina p2 (p2M). En mamíferos adultos, el FcRn desempeña un papel clave en el mantenimiento de los niveles séricos de anticuerpos mediante la actuación como un receptor que se une y recupera anticuerpos del isotipo IgG. Las moléculas de IgG son endocitadas por las células endoteliales y, si se unen al FcRn, se reciclan y experimentan transcitosis, por ejemplo, a la circulación. Por el contrario, las moléculas de IgG que no se unen a FcRn entran en las células y se dirigen a la vía lisosomal donde se degradan. Una IgG1 variante en la que His435 se muta a alanina da como resultado la pérdida selectiva de la unión de FcRn y una semivida en suero significativamente reducida (Firan et al. 2001, International Immunology 13:993).
Se plantea la hipótesis de que FcRn es una posible diana terapéutica para determinados trastornos autoinmunitarios provocados, al menos en parte, por autoanticuerpos. El tratamiento actual para determinados de tales trastornos incluye la plasmaféresis. Para el tratamiento a largo plazo de la enfermedad en ocasiones se emplea plasmaféresis junto con terapia inmunosupresora. El intercambio de plasma ofrece la respuesta a corto plazo más rápida para eliminar los autoanticuerpos dañinos. Sin embargo, también puede ser conveniente suprimir la producción de autoanticuerpos por porte del sistema inmunitario, por ejemplo mediante el uso de medicamentos tales como la prednisona, ciclofosfamida, ciclosporina, micofenolato de mofetilo, rituximab o una mezcla de estos.
Los ejemplos de enfermedades que se pueden tratar con plasmaféresis incluyen: síndrome de Guillain-Barre; polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica; síndrome de Goodpasture; síndromes de hiperviscosidad; crioglobulinemia; paraproteinemia; macroglobulinemia de Waldenstrom; miastenia grave; púrpura trombocitopénica trombótica (TTP)/síndrome urémico hemolítico; granulomatosis de Wegener; síndrome de Lambert-Eaton; síndrome de anticuerpos antifosfolípidos (SAA o SAAF); poliangiitis microscópica; glomerulosclerosis focal y segmentaria recurrente en el riñón trasplantado; síndrome de HELLP; síndrome de PANDAS; enfermedad de Refsum; síndrome de Behcet; neuropatía relacionada con el VIH; enfermedad de Graves en lactantes y neonatos; pénfigo vulgar; esclerosis múltiple, rabdomiolisis y enfermedades aloimunitarias.
La plasmaféresis se usa en ocasiones como terapia de rescate para la eliminación de terapias que contienen Fc, por ejemplo, en urgencias, para reducir los efectos secundarios graves.
Aunque la plasmaféresis es útil en determinadas afecciones médicas, existen posibles riesgos y complicaciones asociados con la terapia. La inserción de un catéter intravenoso bastante grande puede provocar sangrado, punción pulmonar (dependiendo del lugar de inserción del catéter) y, si se deja el catéter demasiado tiempo, puede provocar una infección y/o daño en las venas, lo que brinda una oportunidad limitada para repetir el procedimiento.
El procedimiento tiene complicaciones adicionales asociadas a él, por ejemplo, cuando la sangre de un paciente se encuentra fuera del cuerpo y pasa a través del instrumento de plasmaféresis, la sangre tiene tendencia a coagularse. Para reducir esta tendencia, en un protocolo común, se infunde citrato mientras la sangre corre por el circuito. El citrato se une al calcio en la sangre, siendo el calcio esencial para que la sangre se coagule. El citrato es muy eficaz para prevenir la coagulación de la sangre; sin embargo, su uso puede conducir a bajos niveles de calcio que son potencialmente mortales. Esto se puede detectar utilizando el signo de Chvostek o el signo de Trousseau. Para evitar esta complicación, el calcio se infunde por vía intravenosa mientras el paciente se está sometiendo a la plasmaféresis; además, también se pueden proporcionar suplementos de calcio por vía oral.
Otras complicaciones del procedimiento incluyen: hipotensión; posible exposición a hemoderivados, con riesgo de reacciones a la transfusión o enfermedades transmitidas por la transfusión, supresión del sistema inmunitario del paciente y hemorragia o hematoma por la colocación de la aguja.
Adicionalmente, las instalaciones que proporcionan plasmaféresis son limitadas y el procedimiento es muy costoso.
Una alternativa a la plasmaféresis es la inmunoglobulina intravenosa (IVIG, forma siglada de intravenous immunoglobulin, inmunoglobulina intravenosa), que es un producto hematológico que contiene IgG policlonal combinada extraída del plasma de más de mil donantes de sangre. La terapia se administra por vía intravenosa y dura entre 2 semanas y 3 meses.
Las complicaciones del tratamiento con IVIG incluyen cefalea, dermatitis, infección vírica por contaminación del producto terapéutico, por ejemplo, VIH o hepatitis, edema pulmonar, reacciones alérgicas, insuficiencia renal aguda, trombosis venosa y meningitis aséptica.
Por lo tanto, existe una importante necesidad no satisfecha de terapias para trastornos autoinmunitarios que sean menos invasivas y que expongan a los pacientes a menos complicaciones médicas.
Por lo tanto, existe una importante necesidad no satisfecha de terapias para trastornos inmunitarios y/o enfermedades autoinmunitarias que sean menos invasivas y que expongan a los pacientes a menos complicaciones médicas.
Por consiguiente, los agentes que bloquean o reducen la unión de IgG al FcRn pueden ser útiles en el tratamiento o prevención de tales enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias. Los anticuerpos anti FcRn se han descrito previamente en los documentos WO2009/131702, WO2007/087289, WO2006/118772 y US 2007/092507. El documento US 2007/092507 describe anticuerpos contra la cadena pesada del FcRn humano, que funcionan como inhibidores no competitivos de la unión de IgG al FcRn. Se dice que los anticuerpos son útiles para reducir la concentración de IgG patógenas en individuos y, por lo tanto, son útiles como una herramienta terapéutica en afecciones autoinmunitarias y aloinmunitarias.
Sin embargo, sigue existiendo una necesidad de anticuerpos anti FcRn mejorados.
Sumario de la divulgación
Por lo tanto, en un aspecto de la invención, se proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo que comprende (i) una cadena pesada o fragmento de la cadena pesada que tiene una región variable que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25 y (ii) una cadena ligera o fragmento de la cadena ligera que tiene una región variable que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 16.
Los anticuerpos de la invención bloquean la unión de la IgG a FcRn y se piensa que son útiles para reducir una o más funciones biológicas de FcRn, entre ellas la reducción de la semivida de los anticuerpos circulantes. Esto puede ser beneficioso porque permite al paciente eliminar más rápidamente anticuerpos, tales como los autoanticuerpos. Por consiguiente, los anticuerpos de la invención reducen la unión de la IgG a FcRn.
Es importante destacar que los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a FcRn humano, por ejemplo, tanto a pH 6 como a pH 7,4, con afinidad de unión comparable y alta. De manera ventajosa, por lo tanto, los anticuerpos son capaces de seguir uniéndose a FcRn incluso dentro del endosoma, maximizando de este modo el bloqueo de la unión de FcRn a la IgG.
Los anticuerpos o fragmentos de unión de acuerdo con la presente invención comprenden secuencias de CDR seleccionadas de las SEQ ID NO: 1 a 7, en donde CDR H1 es la SEQ ID NO: 1, CDR H2 es la SEQ ID NO: 2, CDR H3 es la SEQ ID NO: 3, CDR L1 es la SEQ ID NO: 4, CDR L2 es la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 7, y CDR L3 es la SEQ ID NO: 6.
Además, se divulga un anticuerpo o fragmento de unión que se une al mismo epítopo que un anticuerpo o fragmento de unión divulgado de forma explícita en el presente documento. Por consiguiente, se proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, que se une a un epítopo de FcRn humano, que comprende uno, dos, tres o cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos E115, W131, P132 y E133 del dominio extracelular de FcRn humano (SEQ ID NO: 48) y en donde el anticuerpo anti FcRn o fragmento de unión del mismo se une adicionalmente a uno o más (tal como todos) restos seleccionados del grupo que consiste en A81, G83, G84, K85, G86, P87, N113, L135, A136 y Q139, y opcionalmente se une además a uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en L82, Y88, L112 y D130.
Se divulga un anticuerpo o fragmento de unión que bloquea de forma cruzada a un anticuerpo o fragmento de unión divulgado de forma explícita en el presente documento para FcRn humano, o al que dicho anticuerpo le bloquea de forma cruzada la unión a FcRn humano.
En una realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión de la presente invención bloquean la unión de la IgG humana al FcRn humano.
En una realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión de la presente divulgación no se unen a la microglobulina p2.
En una realización, los anticuerpos y los fragmentos de unión de la presente divulgación no se unen a la microglobulina p2 humana.
En un ejemplo, los anticuerpos y los fragmentos de unión de la presente divulgación no reducen los niveles de albúmina circulante en más del 50 %, preferentemente, en no más del 25 %.
En un ejemplo, los anticuerpos y los fragmentos de unión de la presente divulgación no reducen los niveles de albúmina circulante.
La invención también se extiende a un polinucleótido, tal como ADN, que codifica un anticuerpo o fragmento como se describe en el presente documento, por ejemplo, cuando el ADN se incorpora a un vector.
Además se proporciona una célula hospedadora que comprende dicho polinucleótido.
Los métodos para expresar un anticuerpo o fragmento se proporcionan en el presente documento, ya que son métodos para conjugar un anticuerpo o fragmento con un polímero, tal como PEG.
La presente invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos y fragmentos.
La presente invención también se extiende a un anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la presente invención para su uso en un tratamiento, particularmente en el tratamiento de un trastorno inmunitario y/o autoinmunitario.
La presente invención también se extiende a un anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario, tal como miastenia grave, pénfigo vulgar, neuromielitis óptica, síndrome de Guillain-Barré, lupus, púrpura trombocitopénica idiopática y púrpura trombocitopénica trombótica.
La presente invención también se extiende a un anticuerpo, fragmento o composición de acuerdo con la presente invención para su uso en el tratamiento de la PDIC, polineuropatía paraproteinémica, epilepsia refractaria, anemia hemolítica, síndrome de Goodpasture, incompatibilidad ABO, nefritis lúpica, vasculitis renal, esclerodermia, alveolitis fibrosante, miocardiopatía dilatada, enfermedad de Graves, diabetes de tipo 1, diabetes autoinmunitaria, pénfigo, vasculitis asociadas con anticuerpos ANCA, dermatomiositis, enfermedad de Sjogren o artritis reumatoide.
Por lo tanto, la presente divulgación proporciona anticuerpos, fragmentos de los mismos y métodos para la eliminación de IgG patógena, lo que se logra mediante la aceleración del mecanismo natural del cuerpo para catabolizar la IgG.
En esencia, los anticuerpos y fragmentos de acuerdo con la divulgación bloquean el sistema que recicla la IgG en el cuerpo.
Es probable que la presente terapia proporcione un reemplazo o un complemento para determinadas enfermedades en que la plasmaféresis es una terapia o, la terapia de IVIg, que sea ventajoso para los pacientes.
Breve descripción de las figuras
Figura 1 Muestra el % de hIgG en ratones transgénicos determinado por LC-MS/MS
Figura 1a muestra el efecto del formato de IgG4P 1638 sobre la concentración de IVIg humana en suero de ratones transgénicos para FcRn humana.
Figura 1b muestra el efecto de los formatos de FabFv y Fab'PEG 1638 sobre la concentración de IVIg humana en suero de ratones transgénicos para FcRn humana
Figura 1c muestra la farmacocinética del formato de IgG4P 1638 en ratones transgénicos para FcRn humana.
Figura 1d muestra la farmacocinética de los formatos de FabFv y Fab'PEG 1638 en ratones transgénicos para FcRn humana
Figura 1e El efecto de los formatos de FabFv y Fab'PEG 1638 sobre la concentración de la seroalbúmina en suero de ratones transgénicos para FcRn humano.
Figura 1f El efecto del formato de IgG4P 1638 sobre la concentración de la seroalbúmina en ratones transgénicos para FcRn humana.
Figura 2 muestra curvas de unión representativas para la IgG4 CA170_1638.g49. Los valores medios de Kd (n = 3) fueron de 0,20 nM en tampón neutro, y de 0,22 nM en tampón ácido, respectivamente Figura 3 muestra que IgG4 CA170_1638.g49 inhibe el reciclado de IgG en células MDCK II clon 15 Figura 4 muestra que IgG4 CA170_1638.g49 inhibe la transcitosis de IgG en células MDCK II clon 15.
Figura 5 muestra que FabFv CA170_1638.g49 inhibe la transcitosis de IgG en células MDCK II clon 15.
Figura 6 muestra curvas de unión representativas para la IgG4 CA170_1638.g49. Los valores medios de KD (n = 3) fueron de 0,3 en tampón neutro y de 0,43 en tampón ácido, respectivamente (véase la Tabla 2).
Figura 7 muestra las secuencias de CDR de CA170_1638
Figura 8 Las secuencias de anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación
Figura 9a Humanización del anticuerpo 1638.g49
Figura 9b Humanización del anticuerpo 1638.g49
Detalles de la divulgación
FcRn, como se emplea en el presente documento, se refiere al complejo no covalente entre la cadena alfa del receptor de IgG humano, también conocido como el receptor de Fc neonatal, cuya secuencia de aminoácidos está en UniProt con el número P55899, cuyo dominio extracelular se proporciona en la Figura 8 (SEQ ID NO: 48) y la microglobulina p2 humana (p2M), cuya secuencia de aminoácidos está en UniProt con el número P61769 (proporcionado en el presente documento con el péptido señal (SEQ ID NO: 50), sin péptido señal (SEQ ID NO: 72)).
La molécula de anticuerpo como se emplea en el presente documento se refiere a un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere generalmente a anticuerpos intactos (completos), es decir, que comprenden los elementos de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. El anticuerpo puede comprender dominios de unión adicionales, por ejemplo, según la molécula DVD-Ig divulgada en el documento WO 2007/024715, o el denominado (FabFv)2 Fc descrito en el documento WO2011/030107. Por lo tanto, el anticuerpo como se emplea en el presente documento incluye anticuerpos bi, tri o tetravalente de longitud completa.
Los fragmentos de unión de los anticuerpos incluyen anticuerpos monocatenarios (es decir, una cadena pesada y una cadena ligera de longitud completa); Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, VH o VL, o VHH), scFv, dsscFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, BisscFv, diacuerpos, tricuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores (véase, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - En línea 2(3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). El formato Fab-Fv se divulgó por primera vez en el documento WO2009/040562 y las versiones estabilizadas con disulfuro del mismo, el Fab-dsFv, se divulgaron por primera vez en el documento WO2010/035012. Otros fragmentos de anticuerpo para su uso en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab', descritos en las solicitudes de patente internacional WO2005/003169, WO2005/003170 y WO2005/003171. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades, por ejemplo, ser biespecífico, o puede ser monoespecífico (véase, por ejemplo, los documentos WO92/22583 y WO05/113605). Un ejemplo de esto último es un Tri-Fab (o Tf M) como se describe en el documento WO92/22583.
En una realización, se proporciona un fragmento Fab.
En una realización, se proporciona un fragmento Fab'.
Una molécula Fab' típica comprende una pareja de cadenas pesada y ligera en las que la cadena pesada comprende una región variable Vh, un dominio constante Ch1 y una región bisagra natural o modificada, y la cadena ligera comprende una región variable Vl y un dominio constante Cl.
En una realización, se proporciona un dímero de un Fab' de acuerdo con la presente divulgación, para crear un F(ab')2, por ejemplo, la dimerización puede ser a través de la bisagra.
En una realización, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo comprende un dominio de unión. Un dominio de unión generalmente comprenderá 6 CDR, tres de una cadena pesada y tres de una cadena ligera. En una realización, las CDR están en un armazón y juntas forman una región variable. Por lo tanto, en una realización, un anticuerpo o fragmento de unión comprende un dominio de unión específico para un antígeno que comprende una región variable de la cadena ligera y una región variable de la cadena pesada.
Se apreciará que pueden hacerse una o más (por ejemplo 1, 2, 3 o 4) sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos a las CDR u otras secuencias (por ejemplo, dominios variables) proporcionadas por la presente divulgación, sin modificar significativamente la capacidad del anticuerpo para unirse a FcRn. Un experto en la materia puede analizar fácilmente el efecto de cualquier sustitución, adición y/o deleción de aminoácidos, por ejemplo, mediante la utilización de los métodos descritos en el presente documento, en particular en los Ejemplos, para determinar la unión/bloqueo de FcRn.
Se pueden realizar una o más (por ejemplo 1, 2, 3 o 4) sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en la región marco conservada empleada en el anticuerpo o fragmento proporcionado por la presente divulgación, y en donde se conserva o aumenta la afinidad de unión a FcRn.
Los restos en los dominios variables de los anticuerpos se numeran convencionalmente de acuerdo con un sistema ideado por Kabat et al. Este sistema se expone en Kabat et al., 1987, en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, Estados Unidos (en lo sucesivo denominado en el presente documento "Kabat et al. (citado anteriormente)". Este sistema de numeración se utiliza en la presente memoria descriptiva, a menos que se indique otra cosa.
Las designaciones de restos de Kabat no siempre se corresponden directamente con la numeración lineal de los restos de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que en la numeración de Kabat estricta, lo que corresponde a un acortamiento de, o inserción en, un componente estructural, ya sea un armazón o una región determinante de complementariedad (CDR), de la estructura del dominio variable básico. La numeración correcta de Kabat de los restos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante alineamiento de los restos de homología en la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de Kabat "patrón".
Las CDR del dominio variable de la cadena pesada están ubicadas en los restos 31-35 (CDR-H1), los restos 50-65 (CDR-H2) y los restos 95-102 (CDR-H3), de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, de acuerdo con Chothia (Chothia, C. y Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), el bucle equivalente a CDR-H1 se extiende desde el resto 26 hasta el resto 32. Por lo tanto, a menos que se indique otra cosa, "CDR-H1", como se emplea en el presente documento, pretende referirse a los restos 26 a 35, como se describe por una combinación del sistema de numeración de Kabat y la definición del bucle topológico de Chothia.
Las CDR del dominio variable de la cadena ligera están ubicadas en los restos 24-34 (CDR-L1), los restos 50-56 (CDR-L2) y los restos 89-97 (CDR-L3), de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.
Los anticuerpos y fragmentos de la presente divulgación bloquean a FcRn y, de este modo, pueden impedir que funcione en el reciclado de IgG. El bloqueo, como se emplea en el presente documento, se refiere a un bloqueo físico, tal como la oclusión del receptor, pero también incluirá cuando se unen el anticuerpo o fragmentos a un epítopo, lo que provoca, por ejemplo, un cambio conformacional que significa que ya no se une el ligando natural al receptor. Las moléculas de anticuerpo de la presente invención se unen al FcRn y, de este modo, disminuyen o impiden (por ejemplo, inhiben) la unión del FcRn a una región constante de IgG. En una realización, el anticuerpo o fragmento del mismo se une al FcRn de forma competitiva con respecto a IgG.
En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo funciona como un inhibidor competitivo de la unión del FcRn humano a la IgG humana. En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo se une al sitio de unión a IgG en el FcRn. En un ejemplo, el anticuerpo bloquea el sitio de unión a IgG. En un ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión del mismo no se une a p2M.
Los anticuerpos para su uso en la presente divulgación pueden obtenerse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Pueden usarse el polipéptido/proteína FcRn, incluyendo proteínas de fusión, las células (recombinantes o naturales) que expresan el polipéptido (tal como los linfocitos T activados), para producir anticuerpos que reconocen específicamente al FcRn, solo o en combinación con la p2M. El polipéptido puede ser el polipéptido "maduro" o un fragmento biológicamente activo o derivado del mismo. La proteína humana está registrada en Swiss-Prot con el número P55899. El dominio extracelular de la cadena alfa del FcRn humano se proporciona en la SEQ ID NO: 48. La secuencia de la p2M humana madura se proporciona en la SEQ ID NO: 72.
En una realización, el antígeno es una forma mutante del FcRn que está técnicamente diseñada para presentar FcRn en la superficie de una célula, de manera que hay poco o ningún procesamiento dinámico en que el FcRn se internalice en la célula, por ejemplo, esto se puede lograr produciendo una mutación en la cola citoplasmática de la cadena alfa de FcRn, en donde la dileucina se muta a dialanina, como se describe en Ober et al., 2001 Int. Immunol. 13, 1551­ 1559.
Los polipéptidos para su uso para inmunizar un hospedador pueden prepararse mediante procedimientos bien conocidos en la técnica a partir de células hospedadoras modificadas por ingeniería genética que comprenden sistemas de expresión o pueden recuperarse de fuentes biológicas naturales. En la presente solicitud, el término "polipéptido" incluye péptidos, polipéptidos y proteínas. Estos se usan indistintamente, a menos que se especifique otra cosa. El polipéptido FcRn puede ser, en algunos casos, parte de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión, por ejemplo, fusionado con una etiqueta de afinidad o similar.
Los anticuerpos generados contra el polipéptido FcRn pueden obtenerse, cuando sea necesaria la inmunización de un animal, mediante la administración de los polipéptidos a un animal, preferentemente un animal no humano, usando protocolos bien conocidos y rutinarios, véase, por ejemplo, Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol. 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, Inglaterra, 1986). Pueden inmunizarse muchos animales de sangre caliente, tales como conejos, ratones, ratas, ovejas, vacas, camellos o cerdos. Sin embargo, en general son muy adecuados los ratones, los conejos, los cerdos y las ratas.
Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante cualquier método conocido en la técnica, tal como la técnica de hibridoma (Kohler y Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), y la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de linfocitos B humanos (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y la técnica de hibridoma de EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pág. 77-96, Alan R Liss, Inc., 1985).
Los anticuerpos para su uso en la invención también pueden generarse usando métodos de anticuerpos de linfocitos individuales mediante la clonación y expresión de ADNc de la región variable de inmunoglobulina generados a partir de linfocitos individuales seleccionados para la producción de anticuerpos específicos mediante, por ejemplo, los métodos descritos por Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481; el documento WO92/02551; el documento WO2004/051268 y la solicitud de patente internacional número WO2004/106377.
La exploración de anticuerpos se puede realizar utilizando ensayos para medir la unión al FcRn humano y/o ensayos para medir la capacidad de bloquear la unión de IgG al receptor. Un ejemplo de un ensayo de unión es un ELISA, en particular, que utilice una proteína de fusión de FcRn humano y Fc humano, que se inmoviliza en placas, y que emplee un anticuerpo secundario para detectar el anticuerpo anti FcRn unido a la proteína de fusión. A continuación en el presente documento se describen ejemplos de ensayos antagonistas y de bloqueo adecuados.
Específico, como se emplea en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo que solo reconoce el antígeno para el que es específico o a un anticuerpo que tiene una afinidad de unión significativamente mayor para el antígeno para el que es específico, en comparación con la unión a antígenos para los que no es específico, por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10 veces mayor afinidad de unión. La afinidad de unión puede medirse mediante técnicas tales como BIAcore, como se describe en el presente documento a continuación. En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención no se une a la microglobulina p2 (p2M). En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención se une al FcRn de cynomolgus. En un ejemplo, el anticuerpo de la presente invención no se une al FcRn de rata o ratón.
Se proporcionan y forman un aspecto de la invención las secuencias de aminoácidos y las secuencias de polinucleótido de determinados anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación.
En una realización, los anticuerpos o fragmentos de unión de acuerdo con la presente divulgación son completamente humanos, por ejemplo, se preparan a partir de una biblioteca de fagos o similar.
En un ejemplo, los anticuerpos son de roedor, tal como procedentes de rata, y comprenden la secuencia del dominio variable de la cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 8 y la secuencia del dominio variable de la cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 12.
En una realización, el anticuerpo o fragmentos de acuerdo con la divulgación están humanizados.
Los anticuerpos humanizados (que incluyen anticuerpos injertados con CDR) son moléculas de anticuerpo que tienen una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una especie no humana y una región marco conservada de una molécula de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, documento US 5.585.089; documento WO91/09967). Se apreciará que solo puede ser necesario transferir los restos que determinas la especificidad de las CDR en lugar de la CDR completa (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). Los anticuerpos humanizados pueden opcionalmente comprender adicionalmente uno o más restos del armazón procedentes de la especie no humana de la que procedían las CDR. Estos últimos se denominan a menudo restos de donante.
Por lo tanto, en una realización como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula de anticuerpo en donde la cadena pesada y/o ligera contiene una o más c Dr (incluyendo, si se desea, una o más CDR modificadas) de un anticuerpo donante (por ejemplo, un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo monoclonal murino) injertadas en un armazón de la región variable de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo aceptor (por ejemplo, un anticuerpo humano), que opcionalmente comprende adicionalmente uno o más restos de armazón procedentes de la especie no humana de la que proceden las CDR (restos de donante). Para una revisión, véase Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. En una realización, en lugar de transferirse la CDR completa, se transfieren al armazón del anticuerpo humano solo uno o más de los restos que determinan la especificidad de una cualquiera de las CDR descritas anteriormente en el presente documento (véase, por ejemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). En una realización, se transfieren al armazón del anticuerpo humano solo los restos que determinan la especificidad de una o más de las CDR descritas anteriormente en el presente documento. En otra realización, se transfieren al armazón del anticuerpo humano solo los restos que determinan la especificidad de cada una de las CDR descritas anteriormente en el presente documento.
Cuando se injertan las CDR o los restos que determinan la especificidad, se puede usar cualquier secuencia de armazón de la región variable aceptora apropiada teniendo en cuenta la clase/tipo del anticuerpo donante del que proceden las CDR, incluyendo las regiones marco de ratón, primate y ser humano.
De manera adecuada, el anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención tiene un dominio variable que comprende regiones marco conservadas aceptoras humanas, así como una o más de las CDR proporcionadas específicamente en el presente documento. Por lo tanto, en una realización se proporciona un anticuerpo humanizado bloqueante que se une al FcRn humano, en donde el dominio variable comprende regiones marco conservadas aceptoras humanas y las CDR de donante no humano.
Los ejemplos de armazones humanos que se pueden usar en la presente divulgación son KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY y POM (Kabat et al., citado anteriormente). Por ejemplo, KOL y NEWM se pueden usar para la cadena pesada, REI se puede usar para la cadena ligera y EU, LAY y POM se pueden usar tanto para la cadena pesada como para la cadena ligera. Como alternativa, pueden usarse secuencias de la línea germinal humana; estas están disponibles en http://www.imgt.org/.
En un anticuerpo humanizado de la presente divulgación, las cadenas pesada y ligera aceptoras no precisan necesariamente proceder del mismo anticuerpo y pueden, si se desea, comprender cadenas compuestas que tienen regiones marco conservadas procedentes de distintas cadenas.
Una de tales regiones marco conservadas adecuadas para la cadena pesada del anticuerpo humanizado de la presente invención procede de la secuencia IGHV3-7 del subgrupo VH3 humano junto con JH3 (SEQ ID NO: 46 y 47). Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 3 para CDRH3, en donde la región marco conservada de la cadena pesada procede de la secuencia IGHV3-7 del subgrupo VH3 humano junto con JH3.
La secuencia de JH3 humano es la siguiente: (DAFDV)WGQGTMVTVS (SEQ ID NO: 69). El motivo DAFDV (SEQ ID NO: 70) es parte de CDR-H3 y no es parte del armazón 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591).
En un ejemplo, el dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25 o 59, tal como la 25.
El dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo de la invención comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25.
Una región marco conservada adecuada para la cadena ligera del anticuerpo humanizado de la presente invención procede de la secuencia IGKV1-27 del subgrupo VK1 humano junto con JK4 (SEQ ID NO: 44 y 45).
Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona un anticuerpo humanizado que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 4 para Cd R-L1, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 para CDR-L2 y la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 6 para CDRL3, en donde la región marco conservada de la cadena ligera procede de la secuencia IGKV1-27 del subgrupo VK1 humano junto con JK4.
La secuencia de JK4 es la siguiente: (LT)FGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 71). El motivo LT es parte de CDR-L3 y no es parte del armazón 4 (Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522).
En un ejemplo, el dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 16 o 51, tal como la 16.
El dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo de la invención comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 16.
En un anticuerpo humanizado de la presente invención, las regiones marco conservadas no necesitan tener exactamente la misma secuencia que las del anticuerpo aceptor. Por ejemplo, los restos inusuales se pueden cambiar a restos de aparición más frecuente para esa clase o tipo de cadena aceptora. Como alternativa, los restos seleccionados en las regiones marco conservadas aceptoras pueden cambiarse, de manera que correspondan al resto encontrado en la misma posición en el anticuerpo donante (véase Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). Dichos cambios se deben mantener al mínimo necesario para recuperar la afinidad del anticuerpo donante. En el documento WO91/09967 se expone un protocolo para seleccionar restos en las regiones marco conservadas aceptoras que puede ser necesario cambiar.
Por lo tanto, en una realización, 1, 2, 3, 4 o 5 restos en el armazón se reemplazan por un resto de aminoácido alternativo.
Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona un anticuerpo humanizado, en donde al menos los restos en cada una de las posiciones 48 y 78 del dominio variable de la cadena pesada (numeración de Kabat) son restos de donante, véase, por ejemplo, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25.
En una realización, el resto 48 del dominio variable de la cadena pesada se reemplaza por un aminoácido alternativo, por ejemplo, valina.
En una realización, el resto 78 del dominio variable de la cadena pesada se reemplaza por un aminoácido alternativo, por ejemplo, leucina.
En una realización, el resto 48 es valina y el resto 78 es leucina en la región variable de la cadena pesada humanizada de acuerdo con la presente divulgación.
Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona un anticuerpo humanizado, en donde al menos los restos en cada una de las posiciones 70 y 71 del dominio variable de la cadena ligera (numeración de Kabat) son restos de donante, véase, por ejemplo, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 16.
En una realización, el resto 70 del dominio variable de la cadena ligera se reemplaza por un aminoácido alternativo, por ejemplo, ácido aspártico.
En una realización, el resto 71 del dominio variable de la cadena ligera se reemplaza por un aminoácido alternativo, por ejemplo, fenilalanina.
En una realización, el resto 70 es ácido aspártico y el resto 71 es fenilalanina en la región variable de la cadena ligera humanizada de acuerdo con la presente divulgación.
En una realización, la divulgación proporciona una secuencia de anticuerpo que es el 80 % similar o idéntica a una secuencia divulgada en el presente documento, por ejemplo, el 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % a lo largo de parte o de la totalidad de la secuencia en cuestión, por ejemplo, una secuencia de dominio variable, una secuencia de CDR o una secuencia de dominio variable, excluyendo las CDR. En una realización, la secuencia en cuestión es la SEQ ID NO: 16 o 51. En una realización, la secuencia en cuestión es la SEQ ID NO: 25 o 59.
En una realización, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo que se une al FcRn humano, que comprende una cadena pesada, en donde el dominio variable de la cadena pesada comprende una secuencia que tiene al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad o similitud con una secuencia en el presente documento, por ejemplo, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25 o 59, tal como la 25.
En una realización, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo que se une al FcRn humano que comprende una cadena ligera, en donde el dominio variable de la cadena ligera comprende una secuencia que tiene al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad o similitud con la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 16 o 51, tal como la 16.
En una realización, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo que se une al FcRn humano, en donde el anticuerpo tiene un dominio variable de la cadena pesada que es al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similar o idéntico a una secuencia proporcionada en el presente documento, por ejemplo, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25, pero en donde la molécula de anticuerpo tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 2 para CDR-H2 y la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3.
En una realización, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo que se une al FcRn humano, en donde el anticuerpo tiene un dominio variable de la cadena ligera que es al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similar o idéntico a una secuencia proporcionada en el presente documento, por ejemplo, la secuencia en la SEQ ID NO: 16, pero en donde la molécula de anticuerpo tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 para CDR-L2 y la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
En una realización, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo que se une al FcRn humano, en donde el anticuerpo tiene un dominio variable de la cadena pesada que es al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similar o idéntico a una secuencia proporcionada en el presente documento, por ejemplo, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25 y un dominio variable de la cadena ligera que es al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % similar o idéntico a una secuencia proporcionada en el presente documento, por ejemplo, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 16, pero en donde la molécula de anticuerpo tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 1 para CDR-H1, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 2 para CDR-H2, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 3 para CDR-H3, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 4 para CDR-L1, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 7 para CDR-L2 y la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 6 para CDR-L3.
"Identidad", como se usa en el presente documento, indica que en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el resto de aminoácido es idéntico entre las secuencias. "Similitud", como se usa en el presente documento, indica que, en cualquier posición particular en las secuencias alineadas, el resto de aminoácido es de un tipo similar entre las secuencias. Por ejemplo, la leucina puede sustituirse por isoleucina o valina. Otros aminoácidos que a menudo se pueden sustituir entre sí incluyen, pero sin limitación:
- fenilalanina, tirosina y triptófano (aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas);
- lisina, arginina e histidina (aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas);
- aspartato y glutamato (aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas);
- asparagina y glutamina (aminoácidos que tienen cadenas laterales de amida); y
- cisteína y metionina (aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre). Los grados de identidad y similitud se pueden calcular fácilmente (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991, el programa informático BLAST™ disponible del NCBI (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. y States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. y Madden, T.L. 1997, Genome Res. 7:649-656,).
Las moléculas de anticuerpo de la presente invención pueden comprender una molécula de anticuerpo completa que tiene cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, o un fragmento de las mismas y puede ser, pero sin limitación, un Fab, Fab modificado, Fab', Fab' modificado, F(ab')2, Fv, anticuerpos de dominio único (por ejemplo, VH o VL, o VHH), scFv, dsscFv, anticuerpos bi, tri o tetravalentes, Bis-scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores (véase, por ejemplo, Holliger y Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair y Lawson, 2005, Drug Design Reviews - En línea 2(3), 209-217). Los métodos para crear y fabricar estos fragmentos de anticuerpo son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Otros fragmentos de anticuerpo para su uso en la presente invención incluyen los fragmentos Fab y Fab', descritos en las solicitudes de patente internacional WO2005/003169, W02005/003170 y WO2005/003171. Los anticuerpos multivalentes pueden comprender múltiples especificidades, por ejemplo, biespecífico o pueden ser monoespecífico (véase, por ejemplo, los documentos WO 92/22853, WO05/113605, WO2009/040562 y WO2010/035012).
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento de anticuerpo Fab que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 16 y 25, por ejemplo, para la cadena ligera y pesada, respectivamente. En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20 y una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 29.
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación es un fragmento de anticuerpo Fab que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 51 y 59, por ejemplo, para la cadena ligera y pesada, respectivamente.
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento de anticuerpo Fab o Fab' que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 16 y 25, por ejemplo, para la cadena ligera y pesada, respectivamente. En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20 y una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 29 (Fab) o SEQ ID NO: 33 (Fab').
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación es un fragmento de anticuerpo Fab' que comprende las regiones variables mostradas en las s Eq ID NO: 51 y 59, por ejemplo, para la cadena ligera y pesada, respectivamente. En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 55 y una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 63.
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo IgG1 de longitud completa que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 16 y 25, por ejemplo, para la cadena ligera y pesada, respectivamente. En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20 y una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 73.
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación es una IgG1 de longitud completa que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 51 y 59.
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un formato de IgG4 de longitud completa que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 16 y 25, por ejemplo, para la cadena ligera y pesada, respectivamente. En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20 y una cadena pesada que comprende la secuencia de región variable proporcionada en la SEQ ID NO: 25.
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación es un formato de IgG4 de longitud completa que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 51 y 59, por ejemplo, para la cadena ligera y pesada, respectivamente. En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 55 y una cadena pesada que comprende la secuencia de región variable proporcionada en la SEQ ID NO: 59.
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un formato de IgG4P de longitud completa que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 16 y 25, por ejemplo, para la cadena ligera y pesada, respectivamente. En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20 y una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 37 o en la SEQ ID NO: 39.
En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente divulgación es un formato de IgG4P de longitud completa que comprende las regiones variables mostradas en las SEQ ID NO: 51 y 59, por ejemplo, para la cadena ligera y pesada, respectivamente. En una realización, la molécula de anticuerpo tiene una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 55 y una cadena pesada que comprende la secuencia de región variable proporcionada en la SEQ ID NO: 59.
IgG4P, como se emplea en el presente documento, es una mutación del isotipo IgG4 de tipo silvestre, donde el aminoácido 241 se reemplaza por prolina, véase, por ejemplo, donde la serina en la posición 241 se ha cambiado a prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108.
En una realización, el anticuerpo de acuerdo con la presente invención se proporciona como una proteína de fusión de anticuerpo de unión al FcRn que comprende una fracción de inmunoglobulina, por ejemplo, un fragmento Fab o Fab', y uno o dos anticuerpos de dominio único (dAc) unidos directa o indirectamente a la misma mismo, por ejemplo, como se describe en los documentos WO2009/040562, WO2010035012, WO2011/030107, WO2011/061492 y WO2011/086091.
En una realización, la proteína de fusión comprende dos dominios de anticuerpo, por ejemplo, como un emparejamiento de variable de cadena pesada (VH) y variable de cadena ligera (VL), opcionalmente unidos por un enlace disulfuro.
En una realización, el elemento Fab o Fab' de la proteína de fusión tiene la misma o similar especificidad que el anticuerpo o anticuerpos de dominio único. En una realización, el Fab o Fab' tiene una especificidad distinta al anticuerpo o anticuerpos de dominio único, es decir, la proteína de fusión es multivalente. En una realización, una proteína de fusión multivalente de acuerdo con la presente divulgación tiene un sitio de unión a albúmina, por ejemplo, una pareja VH/VL en el mismo proporciona un sitio de unión a albúmina. En una de tales realizaciones, la cadena pesada comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 42 y la cadena ligera comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 40.
En una realización, el Fab o Fab' de acuerdo con la presente invención se conjuga con una molécula PEG o seroalbúmina humana.
CA170_01638g49 y 1638.g49 se emplean de manera indistinta en el presente documento y se usan para referirse a una pareja específica de regiones variables de anticuerpos que se pueden usar en varios formatos distintos. Estas regiones variables son la secuencia de la cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 25 y la secuencia de la cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 16.
CA170_01638g28 y 1638.g28 se emplean de manera indistinta en el presente documento y se usan para referirse a una pareja específica de regiones variables de anticuerpos que se pueden usar en varios formatos distintos. Estas regiones variables son la secuencia de la cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 59 y la secuencia de la cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 51.
Los dominios de región constante de la molécula de anticuerpo de la presente invención, si están presentes, pueden seleccionarse teniendo en cuenta la función propuesta de la molécula de anticuerpo, y en particular las funciones efectoras que pueden ser necesarias. Por ejemplo, los dominios de la región constante pueden ser dominios de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM humana. En particular, se pueden usar dominios de la región constante de IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3 cuando la molécula de anticuerpo está destinada a usos terapéuticos y se precisan funciones efectoras de anticuerpos. Como alternativa, los isotipos IgG2 e IgG4 pueden usarse cuando la molécula de anticuerpo está destinada a fines terapéuticos y no se precisan funciones efectoras de anticuerpos. Se apreciará que también se pueden usar variantes de secuencia de estos dominios de región constante. Por ejemplo, pueden usarse las moléculas de IgG4 en las que la serina en la posición 241 se ha cambiado a prolina como se describe en Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. Un experto en la materia también entenderá que los anticuerpos pueden sufrir una diversidad de modificaciones postraduccionales. El tipo y el alcance de estas modificaciones a menudo dependen de la línea celular hospedadora utilizada para expresar el anticuerpo, así como de las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en la glucosilación, oxidación de metioninas, formación de dicetopiperazina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida de un resto básico carboxilo terminal (tal como lisina o arginina) debido a la acción de las carboxipeptidasas (como se describe en Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995). Por consiguiente, la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo puede estar ausente.
En una realización, la cadena pesada del anticuerpo comprende un dominio CH1 y la cadena ligera del anticuerpo comprende un dominio CL, ya sea kappa o lambda.
En una realización, la cadena ligera tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20 y la cadena pesada tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 29.
En una realización, la cadena ligera tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20 y la cadena pesada tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 33.
En una realización, la cadena ligera tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20 y la cadena pesada tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 37.
En una realización, la cadena ligera tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20 y la cadena pesada tiene la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 74.
En una realización, un aminoácido C-terminal de la molécula de anticuerpo se escinde durante las modificaciones postraduccionales.
En una realización, un aminoácido N-terminal de la molécula de anticuerpo se escinde durante las modificaciones postraduccionales.
La presente divulgación también proporciona una región específica o epítopo del FcRn humano al que se une un anticuerpo proporcionado por la presente invención, en particular, un anticuerpo que comprende la secuencia de la cadena pesada gH33 (SEQ ID NO: 25) y/o la secuencia de la cadena ligera gL7 (SEQ ID NO: 16). Se divulga una región o epítopo específico del FcRn humano al que se une un anticuerpo que comprende la secuencia de cadena pesada gH2 (Se Q ID NO: 59) y la secuencia de cadena ligera gL2 (SEQ ID NO: 51).
Esta región o epítopo específico del polipéptido FcRn humano se puede identificar mediante cualquier método de mapeo de epítopos adecuado conocido en la técnica, en combinación con uno cualquiera de los anticuerpos proporcionados por la presente invención. Los ejemplos de tales métodos incluyen péptidos de exploración de longitudes variables procedentes del FcRn para la unión al anticuerpo de la presente invención, conteniendo el fragmento más pequeño que se puede unir de forma específica al anticuerpo la secuencia del epítopo reconocido por el anticuerpo. Los péptidos de FcRn pueden producirse sintéticamente o mediante digestión proteolítica del polipéptido FcRn. Los péptidos que se unen al anticuerpo se pueden identificar mediante, por ejemplo, análisis por espectrometría de masas. En otro ejemplo, se puede usar la espectroscopía de RMN o la cristalografía de rayos X para identificar el epítopo al que se une un anticuerpo de la presente invención. En un ejemplo en que se usa cristalografía de rayos X, el epítopo se determina como los restos en el polipéptido FcRn que están a menos de 4 A del anticuerpo. En un ejemplo, el epítopo se determina como los restos en el polipéptido FcRn que están a menos de 5 A del anticuerpo. Una vez identificado, el fragmento epitópico que se une a un anticuerpo de la presente invención se puede usar, si se precisa, como un inmunógeno, para obtener anticuerpos adicionales que se unan al mismo epítopo.
En una realización, el anticuerpo de la presente divulgación se une a la secuencia extracelular de la cadena alfa del FcRn humano que se muestra a continuación:
AESHLSLLYHLTAVSSPAPG TPAFWVSGWL GPQQYLSYNS LRGEAEPCGA WVWENQVSWY WEKETTDLRI
KEKLFLEAFK AÍ.GGKGPVTL QGLLGCELGPDNTSVPTAKFAJ.NGEEFMNFDLKQGTWGGDWPEALAISQR
WQQQDKAANK ELTFLLFSCP HRLREHLERG RGNLEWKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQL RFLRNGLAAG
TGQGDFGPNSDGSFHASSSLTVKSGDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELESPAKSS (SEQ ID NO: 48).
Los restos subrayados son los que se sabe que son críticos para la interacción del FcRn humano con la región Fc de la IgG humana. Los que están en negrita son restos del polipéptido FcRn humano implicados en la unión al anticuerpo que comprende la secuencia de la cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 25 y la secuencia de la cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 16, es decir, están a menos de 4 A del anticuerpo según lo determinado por cristalografía de rayos X. Los restos en cursiva son los implicados en la unión del mismo anticuerpo a 5 A.
En un aspecto de la divulgación, se proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, que se une a un epítopo del FcRn humano, que comprende uno, dos, tres o cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos E115, W131, P132 y E133 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48) y en donde el anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo se une adicionalmente a uno o más restos, tal como dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez restos seleccionados del grupo que consiste en A81, G83, G84, K85, G86, P87, N113, L135, A136 y Q139, y opcionalmente se une además a uno o más restos seleccionados del grupo que consiste en L82, Y88, L112 y D130.
Por consiguiente, en un ejemplo se proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, que se une a un epítopo del FcRn humano, que comprende uno, dos, tres o cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos E115, W131, P132 y E133, y al menos un resto, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 restos seleccionados del grupo que consiste en A81, G83, G84, K85, g 86, P87, N113, L135, A136 y Q139, y en donde dicho anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, de forma opcional, se une adicionalmente a uno o más restos, por ejemplo, al menos 2, 3 o 4 restos seleccionados del grupo que consiste en L82, Y88, L112 y D130 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48).
En un ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con este aspecto de la divulgación no se une a V105, P106, T107, A108 y K109 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48).
En un ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con este aspecto de la divulgación no se une a E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128 y G129 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48).
En un ejemplo, un anticuerpo de acuerdo con este aspecto de la divulgación no se une a V105, P106, T107, A108, K109, E116, F117, M118, N119, F120, D121, L122, K123, Q124, G128 y G129 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48).
En un ejemplo, se proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, que se une a un epítopo del FcRn humano, que comprende uno, dos, tres o cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos E115, W131, P132 y E133, y al menos un resto, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 restos seleccionados del grupo que consiste en A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87 y Y88 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48).
En un ejemplo, se proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, que se une a un epítopo del FcRn humano, que comprende uno, dos, tres o cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos E115, W131, P132 y E133, y al menos un resto, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5 o 6 restos seleccionados del grupo que consiste en L112, N113, D130, L135, A136 y Q139 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48)
En un ejemplo, se proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, que se une a un epítopo del FcRn humano, que comprende uno, dos, tres o cuatro aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en los restos E115, W131, P132 y E133, y al menos un resto seleccionado del grupo que consiste en a 81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, D130, L135, A136 y Q139 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48).
En un ejemplo, se proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, que se une a un epítopo del FcRn humano, que comprende los restos E115, W131, P132 y E133, y al menos un resto seleccionado del grupo que consiste en A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, D130, L135, A136 y Q139 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48).
En un ejemplo, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, que se une a un epítopo de FcRn humano, que comprende o consiste en los restos A81, G83, G84, K85, G86, P87, N113, E115, W131, P132, E133, L135, A136 y Q139 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48).
En un ejemplo, la presente divulgación proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, que se une a un epítopo de FcRn humano, que comprende o consiste en los restos A81, L82, G83, G84, K85, G86, P87, Y88, L112, N113, E115, D130, W131, P132, E133, L135, A136 y Q139 del dominio extracelular del FcRn humano (SEQ ID NO: 48).
En una realización, los anticuerpos que se unen al epítopo descrito anteriormente en el presente documento proporcionados por la presente divulgación son completamente humanos. En una realización, están humanizados. En un ejemplo, tienen una afinidad por el FcRn humano de 150 pM o menos, normalmente de 130 pM o menos.
Los anticuerpos que bloquean de manera cruzada la unión de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención, en particular, una molécula de anticuerpo que comprende la secuencia de la cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 25 y la secuencia de la cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 16 pueden ser igualmente útiles en el bloqueo de la actividad del FcRn. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona una molécula de anticuerpo anti FcRn, que bloquea de manera cruzada la unión de una cualquiera de las moléculas de anticuerpo descritas anteriormente en el presente documento al FcRn humano y/o está bloqueada de manera cruzada para unirse al FcRn humano por uno cualquiera de esos anticuerpos. En una realización, tal anticuerpo se une al mismo epítopo que un anticuerpo descrito anteriormente en el presente documento. En otra realización, el anticuerpo neutralizante de bloqueo cruzado se une a un epítopo que bordea y/o se solapa con el epítopo al que se une un anticuerpo descrito anteriormente en el presente documento.
Los anticuerpos de bloqueo cruzado se pueden identificar utilizando cualquier método adecuado en la técnica, por ejemplo, mediante la utilización de ensayos BIAcore o ELISA de competición, en que la unión del anticuerpo de bloqueo cruzado al FcRn humano impide la unión de un anticuerpo de la presente invención o viceversa. Dichos ensayos de bloqueo cruzado pueden usar FcRn natural o recombinante aislado o una proteína/polipéptido de fusión adecuado. En un ejemplo, la unión y el bloqueo cruzado se miden utilizando el dominio extracelular del FcRn humano recombinante (SEQ ID NO: 48). En un ejemplo, el dominio extracelular de la cadena alfa del FcRn humano recombinante se usa en un complejo con la microglobulina p2 (p2M) (SEQ ID NO: 72).
En una realización, se proporciona una molécula de anticuerpo anti FcRn que bloquea la unión del FcRn a IgG, y que bloquea de manera cruzada la unión a FcRn humano de un anticuerpo cuya cadena pesada comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25 y cuya cadena ligera comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 16. En una realización, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente invención inhiben la unión de un anticuerpo que comprende la secuencia de la cadena pesada proporcionada en la SEQ ID NO: 25 y la secuencia de la cadena ligera proporcionada en la SEQ ID NO: 16 en más del 80 %, por ejemplo, en más del 85 %, tal como en más del 90 %, en particular, en más del 95 % de inhibición.
En una realización, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente divulgación son completamente humanos. En una realización, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente divulgación están humanizados. En una realización, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente divulgación tienen una afinidad por el FcRn humano de 150 pM o menos, 130 pM o menos, o 100 pM o menos. En una realización, los anticuerpos de bloqueo cruzado proporcionados por la presente divulgación tienen una afinidad por el FcRn humano de 50 pM o menos. La afinidad se puede medir utilizando los métodos descritos en el presente documento a continuación.
Las moléculas biológicas, tales como los anticuerpos o fragmentos, contienen grupos funcionales ácidos y/o básicos, lo que le da a la molécula una carga neta positiva o negativa. La cantidad de carga "observada" global dependerá de la secuencia de aminoácidos absoluta de la entidad, del entorno local de los grupos cargados en la estructura 3D y de las condiciones del entorno de la molécula. El punto isoeléctrico (pI) es el pH al que una molécula particular o una superficie accesible al disolvente de la misma no tiene carga eléctrica neta. En un ejemplo, el anticuerpo y fragmentos de la divulgación para FcRn pueden diseñarse técnicamente para tener un punto isoeléctrico apropiado. Esto puede conducir a anticuerpos y/o fragmentos con propiedades más consistentes, en particular perfiles adecuados de solubilidad y/o estabilidad, y/o características mejoradas de purificación.
Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo para FcRn humanizado técnicamente diseñado para tener un punto isoeléctrico distinto al del anticuerpo identificado originalmente. El anticuerpo puede, por ejemplo, diseñarse técnicamente mediante el reemplazo de un resto de aminoácido, tal como el remplazo de un resto de aminoácido ácido por uno o más restos de aminoácidos básicos. Como alternativa, pueden introducirse restos de aminoácidos básicos o pueden eliminarse restos de aminoácidos ácidos. Como alternativa, si la molécula tiene un valor de pI inaceptablemente alto, se pueden introducir restos ácidos para reducir el pI, según sea necesario. Es importante que cuando se manipula el pI se debe tener cuidado para conservar la actividad conveniente del anticuerpo o fragmento. Por lo tanto, en una realización, el anticuerpo o fragmento diseñado técnicamente tiene la misma o sustancialmente la misma actividad que el anticuerpo o fragmento "no modificado".
Para predecir el punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento se pueden usar programas tales como ** ExPASY http://www.expasy.ch/tools/pi tool.html y http://www.iut-arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d abim/compo-p.html. Como alternativa o adicionalmente, el pI se puede medir utilizando cualquier técnica de laboratorio convencional adecuada.
Las moléculas de anticuerpo de la presente invención tienen, adecuadamente, una alta afinidad de unión, en particular, en el intervalo nanomolar. La afinidad puede medirse utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica, entre ellos BIAcore, como se describe en los Ejemplos en el presente documento, utilizando FcRn natural o recombinante aislado o una proteína/polipéptido de fusión adecuado. En un ejemplo, la afinidad se mide utilizando el dominio extracelular del FcRn humano recombinante como se describe en los Ejemplos en el presente documento (SEQ ID NO: 48). En un ejemplo, la afinidad se mide utilizando el dominio extracelular de la cadena alfa del FcRn humano recombinante (SEQ ID NO: 48) en asociación con la microglobulina p2 (p2M) (SEQ ID NO: 72). Adecuadamente, las moléculas de anticuerpo de la presente invención tienen una afinidad de unión por el FcRn humano aislado de aproximadamente 1 nM o inferior. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 500 pM o inferior (es decir, una afinidad más alta). En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 250 pM o inferior. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 200 pM o inferior. En una realización, la molécula de anticuerpo de la presente invención tiene una afinidad de unión de aproximadamente 150 pM o inferior. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti FcRn con una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o inferior. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti FcRn humanizado con una afinidad de unión de aproximadamente 100 pM o inferior. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti FcRn con una afinidad de unión de 50 pM o inferior.
En una realización, los anticuerpos de la presente invención pueden unirse al FcRn humano tanto a pH 6 o un pH más bajo (en particular pH 6) como a pH 7,4 o un pH más alto (en particular pH 7,4) con una afinidad de unión comparable.
De manera ventajosa, por lo tanto, los anticuerpos son capaces de seguir uniéndose a FcRn incluso dentro del endosoma, maximizando de este modo el bloqueo de la unión de FcRn a la IgG.
En una realización, los anticuerpos de la presente invención pueden unirse al FcRn humano con una afinidad de unión de 150 pM o inferior, cuando se mide a pH 6 y pH 7,4. En una realización, los anticuerpos de la presente invención pueden unirse al FcRn humano con una afinidad de unión de 130 pM o inferior, cuando se mide a pH 6 y pH 7,4. En una realización, los anticuerpos de la presente invención pueden unirse al FcRn humano con una afinidad de unión de 130 pM o inferior, cuando se mide a pH 6, y una afinidad de unión de 50 pM o inferior, cuando se mide a pH 7,4.
Un experto en la materia puede determinar la afinidad de un anticuerpo o fragmento de unión de la presente invención, así como el grado en que un agente de unión (tal como un anticuerpo) inhibe la unión, usando técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)) o por resonancia de plasmón superficial (SPR, de sus siglas en inglés: surface plasmon resonance) utilizando sistemas tales como BIAcore. Para la resonancia de plasmón superficial, las moléculas diana se inmovilizan en una fase sólida y se exponen a ligandos en una fase móvil que corre a lo largo de una celda de flujo. Si se produce la unión del ligando a la diana inmovilizada, el índice de refracción local cambia, lo que lleva a un cambio en el ángulo de la SPR, que se puede controlar en tiempo real mediante la detección de cambios en la intensidad de la luz reflejada. Las velocidades de cambio de la señal de la SPR se pueden analizar para producir constantes de velocidad aparentes para las fases de asociación y disociación de la reacción de unión. La relación de estos valores proporciona la constante de equilibrio aparente (afinidad) (véase, por ejemplo, Wolff et al., Cancer Res. 53:2560-65 (1993)).
En la presente invención, la afinidad de la molécula de anticuerpo de prueba se determina normalmente usando SPR de la siguiente manera. La molécula de anticuerpo de prueba se captura en la fase sólida y el dominio extracelular de la cadena alfa del FcRn humano en un complejo no covalente con p2M se corre sobre el anticuerpo capturado en la fase móvil, y se determina la afinidad de la molécula de anticuerpo de prueba por FcRn humano. La molécula de anticuerpo de prueba puede capturarse en la superficie del chip en fase sólida utilizando cualquier método apropiado, por ejemplo, utilizando un agente de captura específico anti Fc o anti Fab'. En un ejemplo, la afinidad se determina a pH 6. En un ejemplo, la afinidad se determina a pH 7,4.
Se apreciará que la afinidad de anticuerpos proporcionada por la presente invención puede modificarse usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. La presente divulgación, por lo tanto, también se refiere a variantes de las moléculas de anticuerpo de la presente divulgación, que tienen una afinidad mejorada por FcRn. Dichas variantes se pueden obtener mediante una serie de protocolos de maduración de la afinidad, que incluyen la mutación de las CDR (Yang et al., J. Mol. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), la redistribución de cadenas (Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), el uso de cepas mutadoras de E. coli (Low et al., J. Mol. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), la redistribución de ADN (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), la presentación en fagos (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) y la PCR sexual (Crameri et al., Nature, 391,288-291, 1998). Vaughan et al. (citado anteriormente) discute estos métodos de maduración de afinidad.
En una realización, las moléculas de anticuerpo de la presente invención bloquean la actividad del FcRn humano. Los ensayos adecuados para determinar la capacidad de un anticuerpo para bloquear FcRn se describen en los Ejemplos en el presente documento. A continuación se describe, en el presente documento, un ensayo adecuado para determinar la capacidad de una molécula de anticuerpo para bloquear el reciclado de IgG in vitro.
Si se desea, puede conjugarse un anticuerpo para su uso en la presente invención con una o más moléculas efectoras. Se apreciará que la molécula efectora puede comprender una única molécula efectora o dos o más de tales moléculas unidas de manera que formen una única fracción que se puede unir a los anticuerpos de la presente invención. Cuando se desee obtener un fragmento de anticuerpo unido a una molécula efectora, este puede prepararse mediante procedimientos químicos convencionales o de ADN recombinante, en los que el fragmento de anticuerpo se une a la molécula efectora directamente o a través de un agente de acoplamiento. Las técnicas para conjugar tales moléculas efectoras con anticuerpos son bien conocidas en la técnica (véase, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2a Ed., Robinson et al., eds., 1987, pág. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 y Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Los procedimientos químicos particulares incluyen, por ejemplo, los descritos en los documentos WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 y WO 03/031581. Como alternativa, cuando la molécula efectora es una proteína o polipéptido, el enlace se puede lograr utilizando procedimientos de ADN recombinante, por ejemplo, como se describe en los documentos WO 86/01533 y EP0392745.
La expresión molécula efectora como se usa en el presente documento incluye, por ejemplo, agentes antineoplásicos, fármacos, toxinas, proteínas biológicamente activas, por ejemplo, enzimas, otro anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, polímeros sintéticos o de origen natural, ácidos nucleicos y fragmentos de los mismos, por ejemplo, ADN, ARN o fragmentos del mismo, radionúclidos, en particular, radioyoduro, radioisótopos, metales quelados, nanopartículas y grupos indicadores tales como compuestos fluorescentes o compuestos que pueden detectarse mediante espectroscopía de RMN o ESR.
Los ejemplos de moléculas efectoras pueden incluir citotoxinas o agentes citotóxicos que incluyen cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, que destruya) las células. Los ejemplos incluyen combrestatinas, dolastatinas, epotilonas, estaurosporina, maitansinoides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanolol y puromicina, y análogos u homólogos de los mismos.
Las moléculas efectoras también incluyen, pero sin limitación, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, antramicina (AMC), caliqueamicinas o duocarmicinas) y agentes antimitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina).
Otras moléculas efectoras pueden incluir radionúclidos quelados, tales como 111In y 90Y, Lu177, Bismuto213, Californio252, Iridio192 y Tungsteno188/Renio188; o fármacos tales como, pero sin limitación, alquilfosfocolinas, inhibidores de topoisomerasa I, taxoides y suramina.
Otras moléculas efectoras incluyen proteínas, péptidos y enzimas. Las enzimas de interés incluyen, pero sin limitación, enzimas proteolíticas, hidrolasas, liasas, isomerasas, transferasas. Las proteínas, polipéptidos y péptidos de interés incluyen, pero sin limitación, inmunoglobulinas, toxinas tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas o toxina diftérica, una proteína tal como insulina, factor de necrosis tumoral, a-interferón, p-interferón, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas o activador del plasminógeno tisular, un agente trombótico o un agente antiangiogénico, por ejemplo, angiostatina o endostatina, o, un modificador de la respuesta biológica tal como una linfocina, interleucina 1 (IL-1), interleucina 2 (IL-2), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor de crecimiento nervioso (NGF) u otro factor de crecimiento e inmunoglobulinas.
Otras moléculas efectoras pueden incluir sustancias detectables útiles, por ejemplo, en diagnóstico. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, núclidos radioactivos, metales emisores de positrones (para su uso en tomografía de emisión de positrones) e iones metálicos paramagnéticos no radioactivos. Véase, en general, la Patente de Estados Unidos N.° 4.741.900 para iones metálicos que se pueden conjugar con anticuerpos para su uso como técnica diagnóstica. Las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o acetilcolinesterasa; los grupos protésicos adecuados incluyen estreptavidina, avidina y biotina; los materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo y ficoeritrina; los materiales luminiscentes adecuados incluyen luminol; los materiales bioluminiscentes adecuados incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina; y los núclidos radioactivos adecuados incluyen 125I, 131I, 111In y 99Tc.
En otro ejemplo, la molécula efectora puede aumentar la semivida del anticuerpo in vivo, y/o reducir la inmunogenicidad del anticuerpo y/o potenciar la administración de un anticuerpo a través de una barrera epitelial para sistema inmunitario. Los ejemplos de moléculas efectoras adecuadas de este tipo incluyen polímeros, albúmina, proteínas de unión a albúmina o compuestos de unión a albúmina, tales como los descritos en el documento WO05/117984.
En una realización, es ventajosa una semivida proporcionada por una molécula efectora que es independiente del FcRn.
Cuando la molécula efectora es un polímero, puede, en general, ser un polímero sintético o de origen natural, por ejemplo un polialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, un polímero de polialquenileno o polioxialquileno, o un polisacárido ramificado o no ramificado, por ejemplo, un homo- o heteropolisacárido.
Los sustituyentes opcionales específicos que pueden estar presentes en los polímeros sintéticos mencionados anteriormente incluyen uno o más grupos hidroxi, metilo o metoxi.
Los ejemplos específicos de polímeros sintéticos incluyen poli(etilenglicol) de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituido, poli(propilenglicol) poli(alcohol vinílico) o derivados del mismo, especialmente poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido, tal como metoxipoli(etilenglicol) o derivados del mismo.
Los polímeros de origen natural específicos incluyen lactosa, amilosa, dextrano, glucógeno o derivados de los mismos.
En una realización, el polímero es albúmina o un fragmento de la misma, tal como seroalbúmina humana o un fragmento de la misma.
"Derivados", como se usa en el presente documento, pretende incluir derivados reactivos, por ejemplo, grupos reactivos selectivos para tiol tales como maleimidas y similares. El grupo reactivo puede estar unido al polímero directamente o a través de un segmento enlazador. Se apreciará que el resto de tal grupo en algunos casos formará parte del producto como el grupo enlazador entre el fragmento de anticuerpo y el polímero.
El tamaño del polímero puede variar según se desee, pero generalmente estará en un intervalo de peso molecular promedio de 500 Da a 50000 Da, por ejemplo de 5000 a 40000 Da, tal como de 20000 a 40000 Da. En particular, el tamaño del polímero puede seleccionarse en función del uso previsto del producto, por ejemplo, la capacidad de emplazarse en determinados tejidos, tales como tumores, o de extender la semivida en circulación (para una revisión, véase Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Por lo tanto, por ejemplo, cuando se pretende que el producto salga de la circulación y penetre en el tejido, por ejemplo, para su uso en el tratamiento de un tumor, puede ser ventajoso usar un polímero de peso molecular pequeño, por ejemplo, con un peso molecular de alrededor de 5000 Da. Para aplicaciones en que el producto permanece en la circulación, puede ser ventajoso usar un polímero de mayor peso molecular, por ejemplo, que tenga un peso molecular en el intervalo de 20000 Da a 40000 Da.
Los polímeros adecuados incluyen un polímero de polialquileno, tal como un poli(etilenglicol) o, en especial, un metoxipoli(etilenglicol) o un derivado del mismo, y especialmente con un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 15000 Da a aproximadamente 40000 Da.
En un ejemplo, los anticuerpos para su uso en la presente invención se unen a fracciones de poli(etilenglicol) (PEG). En un ejemplo particular, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo y las moléculas de PEG pueden unirse a través de cualquier cadena lateral de aminoácido o grupo funcional terminal de aminoácido disponible ubicado en el fragmento de anticuerpo, por ejemplo cualquier grupo amino, imino, tiol, hidroxilo o carboxilo libre. Dichos aminoácidos pueden estar presentes naturalmente en el fragmento de anticuerpo o pueden modificarse técnicamente en el fragmento usando métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, los documentos US 5.219.996; US 5.667.425; WO98/25971, WO2008/038024). En un ejemplo, la molécula de anticuerpo de la presente invención es un fragmento Fab modificado en donde la modificación es la adición al extremo C-terminal de su cadena pesada, de uno o más aminoácidos para permitir la unión de una molécula efectora. De manera adecuada, los aminoácidos adicionales forman una región bisagra modificada que contiene uno o más restos de cisteína a los que se puede unir la molécula efectora. Se pueden usar múltiples sitios para unir dos o más moléculas de PEG.
De manera adecuada, las moléculas de PEG están unidas covalentemente a través de un grupo tiol de al menos un resto de cisteína ubicado en el fragmento de anticuerpo. Cada molécula de polímero unida al fragmento de anticuerpo modificado puede unirse covalentemente al átomo de azufre de un resto de cisteína ubicado en el fragmento. Generalmente, el enlace covalente será un enlace disulfuro o, en particular, un enlace azufre-carbono. Cuando se usa un grupo tiol como punto de unión de las moléculas efectoras activadas adecuadamente, se pueden usar, por ejemplo, derivados selectivos de tiol tales como maleimidas y derivados de cisteína. Como material de partida en la preparación de fragmentos de anticuerpo modificados con polímeros como se describe anteriormente se puede usar un polímero activado. El polímero activado puede ser cualquier polímero que contenga un grupo reactivo con tiol, tal como un ácido o éster a-halocarboxílico, por ejemplo, yodoacetamida, una imida, por ejemplo, maleimida, una vinil sulfona o un disulfuro. Dichos materiales de partida pueden obtenerse comercialmente (por ejemplo, de Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, EE.UU.) o pueden prepararse a partir de materiales de partida disponibles en el mercado, utilizando procedimientos químicos convencionales. Las moléculas de PEG particulares incluyen metoxi-PEG-amina 20K (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; y SunBio) y M-PEG-SPA (obtenible de Nektar, anteriormente Shearwater).
En una realización, el anticuerpo es un fragmento Fab modificado, fragmento Fab' o diFab que está PEGilado, es decir, tiene PEG (poli(etilenglicol)) unido covalentemente al mismo, por ejemplo, de acuerdo con el método divulgado en los documentos EP 0948544 o EP1090037 [véase también "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, Nueva York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris y S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC y "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam y A. Dent, Grove Publishers, Nueva York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. En un ejemplo, el PEG está unido a una cisteína en la región bisagra. En un ejemplo, un fragmento Fab modificado con PEG tiene un grupo maleimida unido covalentemente a un solo grupo tiol en una región bisagra modificada. Un resto de lisina puede unirse covalentemente al grupo maleimida y a cada uno de los grupos amina en el resto de lisina puede unirse un polímero de metoxipoli(etilenglicol) que tiene un peso molecular de aproximadamente 20.000 Da. El peso molecular total del PEG unido al fragmento Fab puede, por lo tanto, ser de aproximadamente 40.000 Da.
Las moléculas de PEG particulares incluyen 2-[3-(N-maleimido)propionamido]etil amida de N,N'-bis(metoxipoli(etilenglicol) (PM 20.000) lisina modificada, también conocida como PEG2MAL40K (que se puede obtener de Nektar, anteriormente Shearwater).
Las fuentes alternativas de enlazadores de PEG incluyen a NOF, que suministra GL2-400MA3 (en donde m en la estructura inferior es 5) y GL2-400MA (donde m es 2) y n es aproximadamente 450:
Figure imgf000018_0001
Es decir, cada
Figure imgf000018_0002
Por lo tanto, en una realización, el PEG es 2,3-Bis(metilpolioxietileno-oxi)-1-([3-(6-maleimido-1-oxohexil)amino]propiloxi} hexano (el PEG ramificado de 2 brazos, -CH2)3NHCO(CH2)5-MAL, PM 40.000, conocido como SUNBRIGHT GL2-400MA3.
Otras moléculas efectoras de PEG alternativas del siguiente tipo:
Figure imgf000018_0003
están disponibles de Dr Reddy, NOF y Jenkem.
En una realización, se proporciona un anticuerpo que está PEGilado (por ejemplo, con un PEG descrito en el presente documento), unido a través de un resto de aminoácido cisteína en o alrededor del aminoácido 232 en la cadena, por ejemplo, el aminoácido 232 de la cadena pesada (por secuenciación secuencial), por ejemplo, el aminoácido 232 de la SEQ ID NO: 33.
En una realización, la presente invención proporciona una molécula de Fab'PEG que comprende uno o más polímeros de PEG, por ejemplo, 1 o 2 polímeros, tales como un polímero o polímeros de 40 kDa.
Las moléculas de Fab'-PEG de acuerdo con la presente invención pueden ser particularmente ventajosas porque tienen una semivida independiente del fragmento Fc. En un ejemplo, la presente invención proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo como se define en el presente documento, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad mejorada mediante el bloqueo del FcRn humano, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo, en donde el anticuerpo o un fragmento de unión del mismo tiene una semivida que es independiente de la unión del Fc al FcRn.
En una realización, se proporciona un Fab' conjugado a un polímero, tal como una molécula de PEG, una molécula de almidón o una molécula de albúmina.
En una realización, se proporciona un scFv conjugado con un polímero, tal como una molécula de PEG, una molécula de almidón o una molécula de albúmina.
En una realización, el anticuerpo o fragmento se conjuga con una molécula de almidón, por ejemplo para aumentar la semivida. Los métodos de conjugación de almidón con una proteína se describen en el documento Us 8.017.739. En una realización, se proporciona una molécula de unión anti FcRn (es decir, un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo) que:
• Provoca una reducción del 50-85 %, tal como una reducción del 70 % de la concentración plasmática de IgG, • Con no más del 25 % o 20 % de reducción de la concentración de la albúmina en plasma, y/o
• Con la posibilidad de repetir la dosificación para lograr un mantenimiento de larga duración de una baja concentración de IgG en plasma.
La presente invención también proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena(s) pesada(s) y/o ligera(s) de una molécula de anticuerpo de la presente invención. De manera adecuada, la secuencia de ADN codifica la cadena pesada o ligera de una molécula de anticuerpo de la presente invención. La secuencia de ADN de la presente invención puede comprender ADN sintético, por ejemplo, producido mediante procesamiento químico, ADNc, ADN genómico o cualquier combinación de los mismos.
Las secuencias de ADN que codifican una molécula de anticuerpo de la presente invención se pueden obtener mediante métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, las secuencias de ADN que codifican parte o la totalidad de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se pueden sintetizar, según se desee, a partir de las secuencias de ADN determinadas o sobre la base de las secuencias de aminoácidos correspondientes.
El ADN que codifica las secuencias de armazón aceptoras está ampliamente disponible para los expertos en la materia y se puede sintetizar fácilmente sobre la base de sus secuencias de aminoácidos conocidas.
Se pueden usar técnicas convencionales de biología molecular para preparar secuencias de ADN que codifiquen la molécula de anticuerpo de la presente invención. Las secuencias de ADN deseadas se pueden sintetizar completamente o en parte usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos. Se pueden usar, según sea apropiado, las técnicas de mutagénesis dirigida y de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En el presente documento se proporcionan ejemplos de secuencias de ADN adecuadas.
Ejemplos de secuencias de ADN adecuadas que codifican la región variable de cadena ligera de 1638.g49 se proporcionan en la SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 21.
Ejemplos de secuencias de ADN adecuadas que codifican la región variable de la cadena ligera de 1638.g28 se proporcionan en la SEQ ID NO: 52 y la SEQ ID NO: 54.
Ejemplos de secuencias de ADN adecuadas que codifican la región variable de la cadena pesada de 1638.g49 se proporcionan en la SEQ ID NO: 26 y la SEQ ID NO: 28.
Ejemplos de secuencias de ADN adecuadas que codifican la región variable de la cadena pesada de 1638.g28 se proporcionan en la SEQ ID NO: 60 y 62.
Ejemplos de secuencias de ADN adecuadas que codifican la cadena ligera (variable y constante) de 1638.g49 se proporcionan en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 24, y para la cadena ligera de 1638.g28 la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, y la cadena pesada de 1638.g28, la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 66.
Ejemplos de secuencias de ADN adecuadas que codifican la cadena pesada (variable y constante, dependiendo del formato) de 1638.g49 se proporcionan en las SEQ ID NO: 30 (Fab), SEQ ID NO: 34 o 36 (Fab'), s Eq ID NO: 38 (IgG4P), SEQ ID NO: 43 (FabFv) y SEQ ID NO:74 (IgG1).
Por consiguiente, en un ejemplo, la presente invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada de un fragmento Fab o Fab' de anticuerpo de la presente invención que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 30, 32, 34, 36, 64 o 66. Además, se proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena ligera de un fragmento Fab o Fab' de anticuerpo de la presente invención, que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 21,22 o 56.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo IgG4(P) de la presente invención, en la que el ADN que codifica la cadena pesada comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 38 y el ADN que codifica la cadena ligera comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 22.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo IgG1 de la presente invención, en la que el ADN que codifica la cadena pesada comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 74 y el ADN que codifica la cadena ligera comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 22.
En un ejemplo, la presente invención proporciona una secuencia de ADN aislada que codifica la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo Fab-dsFv de la presente invención, en la que el a Dn que codifica la cadena pesada comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 43 y el ADN que codifica la cadena ligera comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 41.
La presente invención también se refiere a un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN de la presente invención. Por consiguiente, se proporciona un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. De manera adecuada, el vector de clonación o expresión comprende dos secuencias de ADN, que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de la molécula de anticuerpo de la presente invención, respectivamente, y las secuencias señal adecuadas. En un ejemplo, el vector comprende una secuencia intergénica entre las cadenas pesada y ligera (véase el documento WO03/048208).
Los métodos generales mediante los cuales se pueden construir los vectores, los métodos de transfección y los métodos de cultivo son bien conocidos por los expertos en la materia. A este respecto, se hace referencia a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, Nueva York, y el Manual Maniatis producido por Cold Spring Harbor Publishing.
Además, se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de clonación o expresión que comprenden una o más secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una célula hospedadora para la expresión de un anticuerpo de acuerdo con la invención, que comprende:
i) una secuencia de ADN que codifica la cadena pesada de dicho anticuerpo, y
ii) una secuencia de ADN que codifica la cadena ligera de dicho anticuerpo
en donde las secuencias de ADN se proporcionan en uno o más vectores de clonación o expresión.
Se puede usar cualquier sistema de vector/célula hospedadora adecuado para la expresión de las secuencias de ADN que codifican la molécula de anticuerpo de la presente invención. Pueden usarse sistemas bacterianos, por ejemplo, de E. coli, y otros sistemas microbianos (especialmente para expresar fragmentos de anticuerpo o sistemas de expresión en células hospedadoras eucariotas, por ejemplo de mamífero (especialmente para expresar anticuerpos de longitud completa). Las células hospedadoras de mamífero adecuadas incluyen CHO, células de mieloma o hibridoma.
Los tipos adecuados de células de ovario de hámster chino (células CHO) para su uso en la presente invención pueden incluir células CHO y CHO-K1, entre ellas células dhfr-CHO, tales como las células CHO-DG44 y las células CHO-DXB11, que pueden usarse con un marcador de selección DHFR, o las células CHOK1-SV, que pueden usarse con un marcador de selección glutamina sintasa. Otros tipos de células de uso en la expresión de anticuerpos incluyen líneas celulares linfocíticas, por ejemplo, células de mieloma NSO y células SP2, células COS.
La presente invención también proporciona un procedimiento para la producción de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención, que comprende cultivar una célula hospedadora que contiene un vector o vectores de la presente invención en condiciones adecuadas para conducir a la expresión de proteína a partir de ADN que codifica la molécula de anticuerpo de la presente invención, y aislar la molécula de anticuerpo.
La molécula de anticuerpo puede comprender solo un polipéptido de cadena pesada o ligera, en cuyo caso, para transfectar las células hospedadoras solo se necesita usar una secuencia codificante del polipéptido de cadena pesada o cadena ligera. Para la producción de productos que comprenden tanto cadenas pesadas como ligeras, la línea celular puede transfectarse con dos vectores, un primer vector que codifica un polipéptido de cadena ligera y un segundo vector que codifica un polipéptido de cadena pesada. Como alternativa, se puede usar un único vector, incluyendo el vector secuencias que codifican polipéptidos de cadena ligera y cadena pesada.
Los anticuerpos y fragmentos de acuerdo con la presente divulgación se expresan a buenos niveles en las células hospedadoras. Por lo tanto, las propiedades de los anticuerpos y/o fragmentos son propicias para el procesamiento comercial.
Por lo tanto, se proporciona un procedimiento para cultivar una célula hospedadora y expresar un anticuerpo o un fragmento del mismo, aislar este último y, opcionalmente, purificarlo para proporcionar un anticuerpo o un fragmento aislado. En una realización, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de conjugar una molécula efectora con el anticuerpo o un fragmento aislado, por ejemplo, conjugar con un polímero de PEG en particular, como se describe en el presente documento.
En una realización, se proporciona un procedimiento para purificar un anticuerpo (en particular, un anticuerpo o un fragmento de acuerdo con la invención) que comprende las etapas: de realizar una cromatografía de intercambio aniónico en modo sin unión, de modo que las impurezas se retengan en la columna y el anticuerpo eluya.
En una realización, la purificación emplea captura por afinidad en una columna de FcRn.
En una realización, la purificación emplea azul de cibacrón o similar para la purificación de moléculas de fusión o conjugado con albúmina.
Las resinas de intercambio iónico adecuadas para su uso en el procedimiento incluyen la resina Q.FF (suministrada por GE-Healthcare). La etapa puede, por ejemplo, realizarse a un pH de aproximadamente 8.
El procedimiento puede comprender adicionalmente una etapa inicial de captura que emplee cromatografía de intercambio catiónico, realizada, por ejemplo, a un pH de aproximadamente 4 a 5, tal como la 4,5. La cromatografía de intercambio catiónico puede, por ejemplo, emplear una resina tal como la resina CaptoS o SP sefarosa FF (suministrada por GE-Healthcare). Después, el anticuerpo o fragmento se puede eluir de la resina empleando una solución salina iónica, tal como cloruro de sodio, por ejemplo, a una concentración de 200 mM.
Por lo tanto, la etapa o etapas de cromatografía pueden incluir una o más etapas de lavado, según fuese apropiado.
El procedimiento de purificación también puede comprender una o más etapas de filtración, tal como una etapa de diafiltración.
Por lo tanto, en una realización, se proporciona un anticuerpo o un fragmento anti FcRn purificado, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento humanizado, en particular, un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención, sustancialmente purificado a partir, en particular, libre o sustancialmente exento, de endotoxinas y/o proteína o ADN de la célula hospedadora.
Forma purificada, como se utiliza de la forma anteriormente citada, pretende referirse a una pureza de al menos el 90 %, tal como el 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % p/p o más puro.
Sustancialmente exento de endotoxinas se refiere, en general, a un contenido de endotoxinas de 1 UE por mg de producto de anticuerpo o menos, tal como 0,5 o 0,1 UE por mg de producto.
Sustancialmente exento de proteína o ADN de la célula hospedadora generalmente se refiere a un contenido de proteína y/o ADN de la célula hospedadora de 400 |jg por mg de producto de anticuerpo o menos, tal como 100 |jg por mg o menos, en particular, 20 jg por mg, según fuese apropiado.
Las moléculas de anticuerpo de la presente invención también pueden usars en diagnóstico, por ejemplo, en diagnóstico in vivo y en la obtención de imágenes de patologías que implican al FcRn.
Como los anticuerpos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o la profilaxis de una afección patológica, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende una molécula de anticuerpo de la presente invención en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable. Por consiguiente, se proporciona el uso de una molécula de anticuerpo de la invención para la fabricación de un medicamento. Habitualmente, la composición se suministrará como parte de una composición farmacéutica estéril que, normalmente, incluirá un transportador farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica de la presente invención puede comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica o de diagnóstico que comprende añadir y mezclar la molécula de anticuerpo de la presente invención junto con uno o más de un excipiente, diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.
La molécula de anticuerpo puede ser el único principio activo en la composición farmacéutica o de diagnóstico, o puede ir acompañada de otros principios activos que incluyen otros ingredientes de anticuerpo o ingredientes que no son anticuerpos, tales como los esteroides u otras moléculas farmacológicas, en particular moléculas farmacológicas cuya semivida es independiente de la unión al FcRn.
Las composiciones farmacéuticas comprenden adecuadamente una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo de la invención. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a una cantidad de un agente terapéutico necesaria para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección que se tiene como objetivo, o para presentar un efecto terapéutico o preventivo detectable. Para cualquier anticuerpo, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede estimar de forma inicial ya sea en ensayos de cultivo celular o en modelos animales, generalmente en roedores, conejos, perros, cerdos o primates. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Dicha información se puede usar después para determinar las dosis útiles y las vías de administración en seres humanos.
La cantidad terapéuticamente eficaz precisa para un sujeto humano dependerá de la gravedad del estado de la patología, de la salud general del sujeto, la edad, el peso y el género del sujeto, la dieta, el momento y la frecuencia de la administración, la combinación o combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción y la tolerancia/respuesta a la terapia. Esta cantidad se puede determinar mediante la experimentación de rutina y está dentro del criterio del médico. En general, una cantidad terapéuticamente eficaz será de 0,01 mg/kg a 500 mg/kg, por ejemplo, de 0,1 mg/kg a 200 mg/kg, tal como 100 mg/kg.
Las composiciones farmacéuticas pueden presentarse convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un agente activo de la invención por dosis.
Las dosis terapéuticas de los anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación no muestran efectos toxicológicos aparentes in vivo.
En una realización de un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención, una dosis única puede proporcionar hasta un 70 % de reducción en los niveles de IgG circulante. En un ejemplo de un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención, una dosis única puede proporcionar hasta un 80 % de reducción en los niveles de IgG circulante. En un ejemplo de un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la invención, una dosis única puede proporcionar más del 80 % de reducción en los niveles de IgG circulante.
La reducción terapéutica máxima en la IgG circulante se puede observar aproximadamente 1 semana después de la administración de la dosis terapéutica en cuestión. Los niveles de IgG pueden recuperarse durante las semanas siguientes a la dosificación, si no se suministran dosis terapéuticas adicionales. La recuperación, como se emplea en el presente documento, se refiere a niveles que vuelven a niveles similares a los observados antes de que comience la dosificación inicial.
De manera ventajosa, los niveles de IgG in vivo pueden mantenerse a un nivel apropiadamente bajo mediante la administración de dosis secuenciales del anticuerpo o fragmentos de acuerdo con la divulgación.
Las composiciones pueden administrarse individualmente a un paciente o pueden administrarse en combinación (por ejemplo, de manera simultánea, secuencial o por separado) con otros agentes, fármacos u hormonas.
Agentes, como se emplea en el presente documento, se refiere a una entidad que, cuando se administra, tiene un efecto fisiológico.
Fármaco, como se emplea en el presente documento, se refiere a una entidad química que, a una dosis terapéutica, tiene un efecto fisiológico apropiado.
En una realización, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la presente divulgación se emplean con una terapia inmunosupresora, tal como un esteroide, en particular prednisona.
En una realización, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la presente divulgación se emplean con Rituximab u otras terapias de linfocitos B.
En una realización, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la presente divulgación se emplean con cualquier agente modulador de linfocitos B o linfocitos T, o inmunomodulador. Los ejemplos incluyen metotrexato, micofenolato y azatioprina.
La dosis a la que se administra la molécula de anticuerpo de la presente invención depende de la naturaleza de la afección a tratar, del grado de inflamación presente y de si la molécula de anticuerpo se está utilizando de forma profiláctica o para tratar una afección existente.
La frecuencia de la dosificación dependerá de la semivida del anticuerpo, de su disposición mediada por la diana, de la duración de su efecto y de la presencia de anticuerpos anti fármaco. Si el anticuerpo tiene una semivida corta (unas pocas horas) o una actividad limitada, y/o si es conveniente suministrar pequeños volúmenes de fármaco (por ejemplo, para inyección subcutánea), puede ser necesario dosificar con frecuencia, tan frecuentemente como una vez o más al día. Como alternativa, si el anticuerpo tiene una semivida larga, tiene una larga duración de actividad o puede dosificarse en grandes volúmenes (tal como por infusión), la dosificación puede ser poco frecuente, una vez al día, o cada pocos días, semanas o meses. En una realización, se deja suficiente tiempo entre dosis para permitir que disminuyan los niveles de anticuerpos anti fármaco.
Semivida, como se emplea en el presente documento, pretende referirse a la duración de la molécula en circulación, por ejemplo, en suero/plasma.
Farmacodinámica, como se emplea en el presente documento, se refiere al perfil y, en particular, a la duración de la acción biológica de la molécula de acuerdo con la presente divulgación.
El transportador farmacéuticamente aceptable no debe inducir la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que recibe la composición y no debe ser tóxico. Los transportadores adecuados pueden ser macromoléculas grandes, que se metabolizan lentamente, tales como proteínas, polipéptidos, liposomas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y partículas de virus inactivas. Se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos y sulfatos, o sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos y benzoatos.
Los transportador farmacéuticamente aceptables en composiciones terapéuticas pueden contener adicionalmente líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. Adicionalmente, en tales composiciones pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes o sustancias tamponantes del pH. Dichos transportador permiten que las composiciones farmacéuticas se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas y suspensiones, para la ingestión por parte del paciente.
Las formas adecuadas para la administración incluyen formas adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección o infusión, por ejemplo, mediante inyección embolada o infusión continua. Cuando el producto es para inyección o infusión, puede tomar la forma de una suspensión, solución o emulsión en un vehículo oleoso o acuoso, y puede contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, conservantes, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, la molécula de anticuerpo puede estar en forma seca, para reconstituirse antes del uso con un líquido estéril apropiado.
Una vez formuladas, las composiciones de la invención se pueden administrar directamente al sujeto. Los sujetos a tratar pueden ser animales. Sin embargo, en una o más realizaciones, las composiciones están adaptadas para la administración a sujetos humanos.
De forma adecuada, en las formulaciones de acuerdo con la presente divulgación, el pH de la formulación final no es similar al valor del punto isoeléctrico del anticuerpo o fragmento, por ejemplo, si el pI de la proteína está en el intervalo de 8-9 o superior, entonces un pH de formulación de 7 puede ser apropiado. Si bien no se desea estar limitados por la teoría, se piensa que esto puede proporcionar en última instancia una formulación final con estabilidad mejorada, por ejemplo, el anticuerpo o fragmento permanece en solución.
En un ejemplo, la formulación farmacéutica a un pH en el intervalo de 4,0 a 7,0 comprende: de 1 a 200 mg/ml de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente divulgación, de 1 a 100 mM de un tampón, del 0,001 al 1 % de un tensioactivo, a) de 10 a 500 mM de un estabilizante, b) de 10 a 500 mM de un estabilizante y de 5 a 500 mM de un agente de tonicidad, o c) de 5 a 500 mM de un estabilizante.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden administrarse mediante cualquier número de vías, que incluyen, pero sin limitación, las vías oral, intravenosa, intramuscular, intrarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdérmica, transcutánea (por ejemplo, véase el documento WO98/20734), subcutánea, intraperitoneal, intranasal, entérica, tópica, sublingual, intravaginal o rectal. Además, pueden usarse hipopulverizadores para administrar las composiciones farmacéuticas de la invención. Normalmente, las composiciones terapéuticas se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. Además, pueden prepararse formas sólidas adecuadas para la solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección.
El suministro directo de las composiciones generalmente se llevará a cabo mediante inyección, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa o intramuscular, o se suministrará al espacio intersticial de un tejido. Las composiciones también se pueden administrar en una lesión. El tratamiento de dosificación puede ser un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples.
Se apreciará que el principio activo de la composición será una molécula de anticuerpo. Por tanto, será susceptible a la degradación en el tubo gastrointestinal. Por lo tanto, si la composición se va a administrar por una vía que utiliza el tubo gastrointestinal, la composición deberá contener agentes que protejan al anticuerpo de la degradación, pero que liberen el anticuerpo una vez que se haya absorbido del tubo gastrointestinal.
Una discusión exhaustiva de los transportadores farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
En una realización, la formulación se proporciona como una formulación para administraciones tópicas que incluye la inhalación.
Las preparaciones inhalables adecuadas incluyen polvos inhalables, aerosoles dosificadores que contienen gases propulsores o soluciones inhalables exentas de gases propulsores. Los polvos inhalables de acuerdo con la divulgación que contiene la sustancia activa, pueden consistir únicamente en las sustancias activas mencionadas anteriormente o en una mezcla de las sustancias activas mencionadas anteriormente con excipiente fisiológicamente aceptable.
Estos polvos inhalables pueden incluir monosacáridos (por ejemplo, glucosa o arabinosa), disacáridos (por ejemplo, lactosa, sacarosa, maltosa), oligo- y polisacáridos (por ejemplo, dextranos), polialcoholes (por ejemplo, sorbitol, manitol, xilitol), sales (por ejemplo, cloruro de sodio, carbonato de calcio) o mezclas de estos entre sí. Se usan adecuadamente mono- o disacáridos, el uso de lactosa o glucosa, particularmente, pero no exclusivamente, en forma de sus hidratos.
Las partículas para la deposición en el pulmón precisan un tamaño de partícula inferior a 10 micrómetros, tal como 1­ 9 micrómetros, por ejemplo, de 1 a 5 |jm. El tamaño de partícula del principio activo (tal como el anticuerpo o fragmento) es de primordial importancia.
Los gases propulsores que se pueden usar para preparar los aerosoles inhalables son conocidos en la técnica. Los gases propulsores adecuados se seleccionan de hidrocarburos tales como n-propano, n-butano o isobutano, y halohidrocarburos tales como derivados clorados y/o fluorados de metano, etano, propano, butano, ciclopropano o ciclobutano. Los gases propulsores mencionados anteriormente se pueden usar solos o en mezclas de los mismos.
Los gases propulsores particularmente adecuados son los derivados de alcanos halogenados seleccionados de TG 11, TG 12, t G 134a y TG227. De los hidrocarburos halogenados mencionados anteriormente, TG134a (1,1,1,2-tetrafluoroetano) y TG227 (1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano) y mezclas de los mismos son particularmente adecuados.
Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor también pueden contener otros ingredientes como codisolventes, estabilizantes, agentes tensioactivos (tensioactivos), antioxidantes, lubricantes y medios para ajustar el pH. Todos estos ingredientes son conocidos en la técnica.
Los aerosoles inhalables que contienen gas propulsor de acuerdo con la divulgación pueden contener hasta un 5 % en peso de sustancia activa. Los aerosoles de acuerdo con la invención contienen, por ejemplo, del 0,002 al 5 % en peso, del 0,01 al 3 % en peso, del 0,015 al 2 % en peso, del 0,1 al 2 % en peso, del 0,5 al 2 % en peso o del 0,5 al 1 % en peso de principio activo.
Como alternativa, las administraciones tópicas al pulmón también pueden ser mediante la administración de una solución líquida o una formulación en suspensión, por ejemplo, empleando un dispositivo tal como un nebulizador, por ejemplo, un nebulizador conectado a un compresor (por ejemplo, el nebulizador Pari LC-Jet Plus(R) conectado a un compresor Pari Master(R) fabricado por Pari Respiratory Equipment, Inc., Richmond, Va.).
El anticuerpo de la invención se puede suministrar disperso en un disolvente, por ejemplo, en forma de una solución o una suspensión. Puede suspenderse en una solución fisiológica adecuada, por ejemplo, solución salina u otro disolvente farmacológicamente aceptable o una solución tamponada. Los ejemplos de soluciones tamponadas conocidas en la técnica pueden contener de 0,05 mg a 0,15 mg de edetato disódico, de 8,0 mg a 9,0 mg de NaCl, de 0,15 mg a 0,25 mg de polisorbato, de 0,25 mg a 0,30 mg de ácido cítrico anhidro y de 0,45 mg a 0,55 mg de citrato de sodio por 1 ml de agua, para conseguir un pH de aproximadamente de 4,0 a 5,0. Una suspensión puede emplear, por ejemplo, un anticuerpo liofilizado.
Las suspensiones o formulaciones en solución terapéuticas también pueden contener uno o más excipientes. Los excipientes son bien conocidos en la técnica e incluyen tampones (por ejemplo, tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato), aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico, fosfolípidos, proteínas (por ejemplo, seroalbúmina), EDTA, cloruro de sodio, liposomas, manitol, sorbitol y glicerol. Las soluciones o suspensiones se pueden encapsular en liposomas o microesferas biodegradables. Generalmente, la formulación se proporcionará en una forma sustancialmente estéril empleando procesos de fabricación estériles.
Esto puede incluir la producción y la esterilización mediante filtración del disolvente/solución tamponada utilizada para la formulación, la suspensión aséptica del anticuerpo en la solución del disolvente tamponada estéril y la distribución de la formulación en recipientes estériles mediante métodos familiares para los expertos en la materia.
La formulación nebulizable de acuerdo con la presente divulgación puede proporcionarse, por ejemplo, como unidades de dosis única (por ejemplo, recipientes o viales de plástico sellados) envasados en sobres de papel de aluminio. Cada vial contiene una dosis unitaria en un volumen, por ejemplo, 2 ml, de disolvente/solución tamponada.
Los anticuerpos divulgados en el presente documento pueden ser adecuados para el suministro mediante nebulización.
También se prevé que el anticuerpo de la presente invención se pueda administrar mediante el uso de terapia génica. Con el fin de lograr esto, las secuencias de ADN que codifican las cadenas pesada y ligera de la molécula de anticuerpo bajo el control de componentes de ADN apropiados, se introducen en un paciente de tal forma que las cadenas de anticuerpo se expresen a partir de las secuencias de ADN y se ensamblen in situ.
La presente invención también proporciona una molécula de anticuerpo (o composiciones que la comprenden) para su uso en el control de enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, encefalomielitis aguda diseminada (EAD), leucoencefalitis hemorrágica necrotizante aguda, enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, alopecia areata, amiloidosis, vasculitis asociada a ANCA, espondilitis anquilosante, nefritis anti GBM/anti TBM, síndrome antifosfolípido (SAF), angioedema autoinmunitario, anemia aplásica autoinmunitaria, disautonomía autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, hiperlipidemia autoinmunitaria, inmunodeficiencia autoinmunitaria, enfermedad autoinmunitaria del oído interno (EAOI), miocarditis autoinmunitaria, pancreatitis autoinmunitaria, retinopatía autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (PTA), enfermedad tiroidea autoinmunitaria, urticaria autoinmunitaria, neuropatías axonales, enfermedad de Balo, enfermedad de Behget, penfigoide ampolloso, miocardiopatía, enfermedad de Castleman, enfermedad celíaca, enfermedad de Chagas, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PSIC), ostomielitis multifocal recurrente crónica (OMRC), síndrome de Churg-Strauss, pénfigo cicatricial/pénfigo mucoso benigno, enfermedad de Crohn, síndrome de Cogan, enfermedad de la crioaglutinina, bloqueo auriculoventricular congénito, miocarditis por coxsackie, enfermedad de CRST, crioglobulinemia mixta esencial, neuropatías desmielinazantes, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, enfermedad de Devic (neuromielitis óptica), miocardiopatía dilatada, lupus discoide, síndrome de Dressler, endometriosis, fibrosis angiocéntrica eosinófila, fascitis eosinófila, eritema nudoso, encefalomielitis alérgica experimental, síndrome de Evans, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, granulomatosis con poliangitis (GPA), véase la de Wegener, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, Encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, hipogammaglobulinemia, nefritis tubulointersticial hipocomplementémica idiopática, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía por IgA, enfermedad relacionada con IgG4, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, lipoproteínas inmunorreguladoras, aneurisma aórtico inflamatorio, pseudotumor inflamatorio, miositis por cuerpos de inclusión, diabetes insulinodependiente (tipo 1), cistitis intersticial, artritis juvenil, diabetes juvenil, síndrome de Kawasaki, tumor de Kuttner, síndrome de Lambert-Eaton, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis leñosa, enfermedad por IgA lineal (EAL), lupus (LES), enfermedad de Lyme, crónica, fibrosis del mediastino, enfermedad de Meniere, poliangeítis microscópica, síndrome de Mikulicz, enfermedad del tejido conectivo mixto (ETCM), úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, fibroesclerosis multifocal, esclerosis múltiple, miastenia grave, miositis, narcolepsia, neuromielitis óptica (de Devic), neutropenia, penfigoide cicatricial ocular, neuritis óptica, enfermedad de Ormond (fibrosis retroperitoneal), reumatismo palindrómico, PANDAS (forma siglada de: pediatric autoinmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infections, trastornos neuropsiquiátricos autoinmunitarios pediátricos asociados a infecciones estreptocócicas), degeneración cerebelosa paraneoplásica, polineuropatías paraproteinémicas, hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, Pars planitis (uveítis periférica), pénfigo vulgar, periaortitis, periarteritis, neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, anemia perniciosa, síndrome de POEMS, poliarteritis nodosa, síndromes poliglandulares autoinmunitarios de tipo I, II, y III, polimialgia reumática, polimiositis, síndrome de postinfarto de miocardio, síndrome postpericardiotomía, dermatitis de progesterona, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fibrosis pulmonar idiopática, piodermia gangrenosa, aplasia pura de la serie roja, fenómeno de Raynaud, distrofia simpática refleja, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, síndrome de las piernas inquietas, fibrosis retroperitoneal (enfermedad de Ormond), fiebre reumática, artritis reumatoide, tiroiditis de Riedel, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, escleritis, esclerodermia, síndrome de Sjogren, autoinmunidad testicular y de esperma, síndrome del hombre rígido, endocarditis bacteriana subaguda (EBS), síndrome de Susac, oftalmía simpática, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis gigantocelular, púrpura trombocitopénica trombótica (PTT), síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversa, colitis ulcerosa, enfermedad indiferenciada del tejido conjuntivo (EITC), uveítis, vasculitis, dermatosis vesiculoampollosa, vitíligo, macroglobulinemia de Waldenstrom, anemia hemolítica idiopática cálida y granulomatosis de Wegener (ahora denominada granulomatosis con poliangiitis (GPA).
Las indicaciones adicionales también pueden incluir síndromes de hiperviscosidad; crioglobulinemia; glomerulosclerosis focal y segmentaria recurrente en el riñón trasplantado; síndrome de HELLP; enfermedad de Refsum; neuropatía relacionada con el VIH; rabdomiolisis y enfermedades aloimunitarias.
En una realización, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la divulgación se emplean en el tratamiento o profilaxis de epilepsia o convulsiones.
En una realización, los anticuerpos o fragmentos de acuerdo con la divulgación se emplean en el tratamiento o profilaxis de la esclerosis múltiple.
En la realización, los anticuerpos y fragmentos de la divulgación se emplean en enfermedades/indicaciones aloinmunitarias, que incluyen:
• incompatibilidad del donante de trasplante debido a los anticuerpos anti HLA
• Trombocitopenia aloinmunitaria fetal y neonatal, TAFN (o trombocitopenia aloinmunitaria neonatal, TPAIN o TAIN o TAN, o trombocitopenia aloinmunitaria fetomaterna, TPAIFM o TAIFM).
Las indicaciones adicionales incluyen: eliminación rápida de fármacos biofarmacéuticos que contienen Fc de pacientes humanos y combinación de terapia anti FcRn con otras terapias - IVIg, Rituxan, plasmaféresis. Por ejemplo, la terapia anti FcRn puede emplearse después de la terapia con Rituxan. Además, la terapia anti FcRn puede usarse para eliminar rápidamente agentes para la obtención de imágenes, tales como los anticuerpos radiomarcados utilizados en el diagnóstico de tumores por imágenes.
En una realización, los anticuerpos y fragmentos de la divulgación se emplean en un trastorno neurológico tal como:
• polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (PDIC)
• síndrome de Guillain-Barré
• polineuropatías paraproteinémicas
• neuromielitis óptica (NMO, trastornos del espectro NMO o enfermedades del espectro NMO), y
• miastenia grave.
En una realización, los anticuerpos y fragmentos de la divulgación se emplean en un trastorno dermatológico tal como:
• penfigoide ampolloso
• pénfigo vulgar
• vasculitis asociada a ANCA
• miocardiopatía dilatada
En una realización, los anticuerpos y fragmentos de la divulgación se emplean en un trastorno hematológico inmunológico tal como:
púrpura trombocitopénica idiopática (PTI)
púrpura trombocitopénica trombótica (PTT)
anemia hemolítica idiopática cálida
síndrome de Goodpasture
incompatibilidad del donante de trasplante debido a los anticuerpos anti HLA
En una realización, el trastorno se selecciona de miastenia grave, neuromielitis óptica, PDIC, síndrome de Guillain-Barré, polineuropatía paraproteinémica, epilepsia refractaria, PTI/PTT, anemia hemolítica, síndrome de Goodpasture, incompatibilidad ABO, nefritis lúpica, vasculitis renal, esclerodermia, alveolitis fibrosante, miocardiopatía dilatada, enfermedad de Graves, diabetes de tipo 1, diabetes autoinmunitaria, pénfigo, esclerodermia, lupus, vasculitis asociadas con anticuerpos ANCA, dermatomiositis, enfermedad de Sjogren y artritis reumatoide.
En una realización, el trastorno se selecciona de síndrome poliendocrino autoinmunitario de tipo 1 (SPEA) o síndrome de Whitaker) y 2 (síndrome de Schmidt); alopecia universalis; crisis miasténica; crisis tiroidea; enfermedad ocular asociada a la tiroides; oftalmopatía tiroidea; diabetes autoinmunitaria; autoanticuerpos asociados con encefalitis y/o encefalopatía; pénfigo filiar; epidermolisis ampollosa; dermatitis herpetiforme; corea de Sydenham; neuropatía axonal motora aguda (NAMA); síndrome de Miller-Fisher; neuropatía motora multifocal (NMM); opsoclono; miopatía inflamatoria; síndrome de Isaac (neuromiotonía autoinmunitaria), síndromes paraneoplásicos y encefalitis límbica.
Los anticuerpos y fragmentos de acuerdo con la presente divulgación pueden emplearse en tratamiento o profilaxis.
La presente invención también proporciona un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo descrito en el presente documento, para su uso en un método para reducir la concentración de anticuerpos no deseados en un individuo que comprende las etapas de administrar a un individuo una dosis terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo descrito en el presente documento.
La presente divulgación proporciona adicionalmente el uso de una molécula de anticuerpo de acuerdo con la presente invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la profilaxis de un trastorno patológico descrito en el presente documento, tal como una enfermedad autoinmunitaria.
En una realización, la presente divulgación comprende el uso de anticuerpos o fragmentos de los mismos como reactivo para diagnóstico, por ejemplo, conjugado con una molécula indicadora. Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la divulgación que está marcado. En un aspecto, se proporciona una columna que comprende un anticuerpo o fragmento de acuerdo con la divulgación.
Por lo tanto, se proporciona un anticuerpo anti FcRn o fragmento de unión para su uso como reactivo para usos tales como:
1) purificación de la proteína FcRn (o fragmentos de la misma) - estando conjugado con una matriz, y usada como una columna de afinidad, o (como una forma modificada del anti FcRn) como agente precipitante (por ejemplo, como una forma modificada con un dominio reconocido por otra molécula, que puede modificarse mediante la adición de un Fc (o producirse como IgG de longitud completa), que se precipita opcionalmente mediante un reactivo anti Fc)
2) detección y/o cuantificación del FcRn sobre células o dentro de células, vivas o fijas (células in vitro o in vivo en cortes de tejido o de células). Los usos para esto pueden incluir la cuantificación de FcRn como biomarcador, para seguir el efecto del tratamiento anti FcRn. Para estos fines, el candidato podría usarse en una forma modificada (por ejemplo, mediante la adición de un dominio Fc, como en una IgG de longitud completa, o alguna otra fracción, como una proteína de fusión genética o un conjugado químico, tal como la adición de una etiqueta fluorescente utilizada con fines de detección).
3) purificación o clasificación de las células portadoras de FcRn marcadas mediante la unión al candidato modificado de las maneras ejemplificadas en (1) y (2).
La presente divulgación también proporciona un ensayo adecuado para evaluar la capacidad de una molécula de prueba, tal como una molécula de anticuerpo, para bloquear la actividad del FcRn y, en particular, la capacidad de las células para reciclar IgG. Dicho ensayo puede ser útil para identificar inhibidores de la actividad del FcRn, tales como moléculas de anticuerpo o moléculas pequeñas y, como tal, también puede ser útil como ensayo para la aprobación de lotes en la producción de tal inhibidor.
En un aspecto, se proporciona un ensayo adecuado para evaluar la capacidad de una molécula de prueba, tal como una molécula de anticuerpo, para bloquear la actividad del FcRn humano y, en particular, la capacidad del FcRn humano para reciclar IgG, en donde el método comprende las etapas de:
a) recubrir una superficie de células de mamífero no humano que expresan de forma recombinante la cadena alfa del FcRn humano y la microglobulina p2 humana (p2M),
b) poner en contacto las células en condiciones levemente ácidas, tal como aproximadamente pH 5,9, con una molécula de prueba y una IgG a ser reciclada por la célula, durante un período suficiente para permitir la unión de la molécula de prueba y la IgG al FcRn, añadiendo, opcionalmente, la molécula de prueba antes de la IgG a reciclar, e incubando durante un período suficiente para permitir la unión de la molécula de prueba al FcRn.
c) lavar con un tampón ligeramente ácido, y
d) detectar la cantidad de IgG internalizada y/o reciclada por las células.
En un aspecto, se proporciona un ensayo adecuado para evaluar la capacidad de una molécula de prueba, tal como una molécula de anticuerpo, para bloquear la actividad del FcRn humano y, en particular, la capacidad del FcRn humano para reciclar IgG, en donde el método comprende las etapas de:
a) recubrir una superficie de células de mamífero no humano que expresan de forma recombinante la cadena alfa del FcRn humano y la microglobulina p2 humana (p2M),
b) poner en contacto las células en condiciones levemente ácidas, tal como aproximadamente pH 5,9, con una molécula de anticuerpo de prueba y una IgG a ser reciclada por la célula, durante un período suficiente para permitir la unión de la molécula de anticuerpo de prueba y la IgG al FcRn, añadiendo, opcionalmente, la molécula de anticuerpo de prueba antes de la IgG a reciclar, e incubando durante un período suficiente para permitir la unión de la molécula de anticuerpo de prueba al FcRn.
c) lavar con un tampón ligeramente ácido para eliminar la IgG no unida y la molécula de anticuerpo de prueba, y d) detectar la cantidad de IgG reciclada por las células.
En un aspecto, se proporciona un ensayo adecuado para evaluar la capacidad de una molécula de prueba, tal como una molécula de anticuerpo, para bloquear la actividad del FcRn humano y, en particular, la capacidad del FcRn humano para reciclar IgG, en donde el método comprende las etapas de:
a) recubrir una superficie de células de mamífero no humano que expresan de forma recombinante la cadena alfa del FcRn humano y la microglobulina p2 humana (p2M),
b) poner en contacto las células en condiciones levemente ácidas, tal como aproximadamente pH 5,9, con una molécula de anticuerpo de prueba y una IgG a ser reciclada por la célula, durante un período suficiente para permitir la unión de la molécula de anticuerpo de prueba y de la IgG al FcRn, añadiendo, opcionalmente, la molécula de anticuerpo de prueba antes de la IgG a reciclar, e incubando durante un período suficiente para permitir la unión de la molécula de anticuerpo de prueba al FcRn.
c) lavar con un tampón ligeramente ácido para eliminar la IgG no unida y la molécula de anticuerpo de prueba, d) incubar las células en un tampón neutro, tal como a aproximadamente pH 7,2
e) detectar la cantidad de IgG reciclada por las células mediante la determinación de la cantidad de IgG liberada en el sobrenadante.
Las células adecuadas incluyen células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) II. La transfección de células MDCKII con la cadena alfa del FcRn humano y con la microglobulina p2 humana (p2M) se ha descrito previamente en Claypool et al., 2002, Journal of Biological Chemistry, 277, 31, 28038-28050. Esta publicación también describe el reciclado de IgG mediante estas células transfectadas.
Los medios para mantener las células durante las pruebas incluyen medios completos que comprenden MEM (Gibco n.° 21090-022), aminoácidos no esenciales 1 x (Gibco 11140-035), piruvato de sodio 1 x (Gibco n.° 11360-039) y L-glutamina (Gibco n.° 25030-024).
Se puede preparar un lavado ácido tomando HBSS+ (PAA n.° H15-008) y añadiendo MES 1 M hasta que se alcanza un pH de 5,9 /- 0,5. También se puede añadir BSA aproximadamente al 1 % (Sigma n.° A9647).
Se puede preparar un lavado neutro tomando HBSS+ (PAA n.° H15-008) y añadiendo Hepes 10 M hasta que se alcanza un pH 7,2 /- 0,5. También se puede añadir BSA aproximadamente al 1 % (Sigma n.° A9647).
El lavado de las células con tampón ácido elimina el anticuerpo de prueba no unido y la IgG no unida, y permite realizar análisis adicionales. Las condiciones ácidas utilizadas en la etapa (b) fomentan la unión de la IgG al FcRn y la internalización y el reciclado de la misma.
La cantidad de anticuerpo de prueba o fragmento e IgG solo en la superficie de las células puede determinarse mediante el lavado de las células con un lavado neutro y el análisis del sobrenadante/lavados para detectar la cantidad de anticuerpo de prueba o IgG. Es importante destacar que no se emplea un tampón de lisis. Para determinar la cantidad de IgG internalizada por las células, el anticuerpo se puede eliminar primero de la superficie de la célula con un lavado neutro y las células lisarse mediante un tampón de lisis, y después se analizan los contenidos internos. Para determinar la cantidad de IgG reciclada por las células, las células se incuban en condiciones neutras durante un período adecuado y el tampón circundante se analiza en cuanto al contenido de IgG. Si se requiere el contenido de anticuerpos en la superficie e internos de la célula, entonces la célula se puede lavar con un lavado ácido para mantener la presencia del anticuerpo en la superficie celular, seguido de la lisis celular y el análisis del material combinado.
Cuando se desea medir tanto la internalización como el reciclado de IgG, las muestras se procesan por duplicado, y las pruebas de internalización y reciclado se realizan por separado.
Un tampón de lisis adecuado incluye NaCl 150 mM, Tris 20 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, Triton-X 100 al 1 %, por cada 10 ml añadir inhibidores de proteasas/inhibidores de fosfato añadidos como se describe en las directrices del fabricante.
Normalmente, la IgG a reciclar está marcada, en un ejemplo, se puede usar una IgG humana biotinilada. Después, se puede detectar la IgG empleando, por ejemplo, 25 ml de anticuerpo de detección de estreptavidina sulfo-tag (tal como MSD n.° r32ad-5) a 0,2 pg/ml de tampón de inhibición de MSD. El tampón de inhibición puede comprender Tris 500 mM, pH 7,5. NaCl 1,5 M y Tween-20 al 0,2 %, y BSA al 1,5 %.
Alternativamente, la IgG se puede marcar previamente con un fluoróforo o un marcador similar.
En una realización, una superficie adecuada es una placa o pocillo de plástico, tal como una placa de 96 pocillos o similar, un portaobjetos de vidrio o una membrana. En un ejemplo, la superficie se recubre con las células a una densidad que da como resultado la formación de una monocapa.
En una realización, el ensayo descrito en el presente documento no es una medición de la transcitosis de un anticuerpo de arriba a abajo a través de una membrana con un gradiente de pH en la misma, por ejemplo, condiciones ácidas en un lado de la membrana y condiciones neutras en la parte inferior de la membrana.
En un ejemplo, el anticuerpo de prueba o fragmento y la IgG se pueden incubar con las células en la etapa (b) durante aproximadamente 1 hora, por ejemplo, a temperatura ambiente en condiciones ácidas, para permitir la unión.
En un ejemplo, el anticuerpo de prueba o fragmento se pueden incubar con las células en la etapa (b) durante aproximadamente 1 hora, por ejemplo, a temperatura ambiente en condiciones ácidas para permitir la unión antes de la adición de la IgG a reciclar. Posteriormente, la IgG a reciclar por la célula puede incubarse con las células en la etapa (b) durante aproximadamente 1 hora, por ejemplo, a temperatura ambiente en condiciones ácidas para permitir la unión.
Las condiciones neutras facilitan la liberación de IgG en el sobrenadante.
Que comprende, en el contexto de la presente memoria descriptiva, pretende indicar que incluye. Donde se pueden combinar realizaciones técnicamente apropiadas de la invención.
Las realizaciones se describen en el presente documento como que comprenden determinadas características/elementos. La divulgación también se extiende a realizaciones separadas que consisten o consisten esencialmente en dichas características/elementos. La presente invención se describe adicionalmente a modo de ilustración solo en los siguientes ejemplos, que se refieren a las Figuras adjuntas, en las que:
Figura 1 Muestra el % de hIgG en ratones transgénicos determinado por LC-MS/MS
Figura 1a muestra el efecto del formato de IgG4P 1638 sobre la concentración de IVIg humana en suero de ratones transgénicos para FcRn humana.
Figura 1b muestra el efecto de los formatos de FabFv y Fab'PEG 1638 sobre la concentración de IVIg humana en suero de ratones transgénicos para FcRn humana
Figura 1c muestra la farmacocinética del formato de IgG4P 1638 en ratones transgénicos para FcRn humana.
Figura 1d muestra la farmacocinética de los formatos de FabFv y Fab'PEG 1638 en ratones transgénicos para FcRn humana
Figura 1e El efecto de los formatos de FabFv y Fab'PEG 1638 sobre la concentración de la seroalbúmina en suero de ratones transgénicos para FcRn humano.
Figura 1f El efecto del formato de IgG4P 1638 sobre la concentración de la seroalbúmina en ratones transgénicos para FcRn humana.
Figura 2 muestra curvas de unión representativas para la IgG4 CA170_1638.g49. Los valores medios de Kd (n = 3) fueron de 0,20 nM en tampón neutro, y de 0,22 nM en tampón ácido, respectivamente Figura 3 muestra que IgG4 CA170_1638.g49 inhibe el reciclado de IgG en células MDCK II clon 15 Figura 4 muestra que IgG4 CA170_1638.g49 inhibe la transcitosis de IgG en células MDCK II clon 15.
Figura 5 muestra que FabFv CA170_1638.g49 inhibe la transcitosis de IgG en células MDCK II clon 15.
Figura 6 muestra curvas de unión representativas para la IgG4 CA170_1638.g49. Los valores medios de KD (n = 3) fueron de 0,3 en tampón neutro y de 0,43 en tampón ácido, respectivamente (véase la Tabla 2).
Figura 7 muestra las secuencias de CDR de CA170_1638
Figura 8 Las secuencias de anticuerpos de acuerdo con la presente divulgación
Figura 9a Humanización del anticuerpo 1638.g49
Figura 9b Humanización del anticuerpo 1638.g49
Ejemplos
Abreviaturas
°C temperatura, grados centígrados.
ATR FTIR (forma siglada
de attenuated total
reflectance fourier espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier de reflectancia total atenuada transform infra-red
spectroscopy)
CH2 región constante de la cadena pesada 2
IEEc isoelectroenfoque capilar
DSC calorimetría diferencial de barrido
G0F galactosil glucano biantenario fucosilado
Cadena H Cadena pesada
HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento
IgG inmunoglobulina G
cadena L Cadena ligera
nLCMS nano cromatografía liquida-espectrometría de masas
PBS tampón salino tamponado con fosfato
pI punto isoeléctrico
DT desviación típica
SEC cromatografía de exclusión por tamaño
TOF tiempo de vuelo
Tm temperatura de fusión
TCEP tris(2-carboxietil)fosfina
THP Tris(hidroxipropil)fosfina
Tris tris(hidroximetil)aminometano
Se realizaron las siguientes inmunizaciones para generar material para el cultivo de linfocitos B y la detección de anticuerpos:
se inmunizaron ratas Sprague Dawley con tres dosis de fibroblastos de ratón NIH3T3 que coexpresan FcRn humano mutante (L320A; L321A) (Ober et al., 2001 Int. Immunol. 13, 1551-1559) y p2M de ratón con una cuarta dosis de refuerzo final del dominio extracelular del FcRn humano.
Los sueros se controlaron tanto en cuanto a la unión al FcRn mutante en células HEK-293 como a su capacidad para impedir la unión de IgG humana marcada con Alexafluor 488. Ambos métodos se realizaron por citometría de flujo. Para la unión, se utilizaron reactivos secundarios específicos anti Fc de ratón o rata marcados con ficoeritrina (PE) para revelar la unión de IgG en los sueros.
Los cultivos de linfocitos B se prepararon utilizando un método similar al descrito por Zubler et al. (1985). Brevemente, se cultivaron linfocitos B a una densidad de aproximadamente 5000 células por pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con código de barras, con 200 pl/pocillo de medio RPMI 1640 (Gibco BRL) complementado con s Fb al 10 % (PAA laboratories ltd), HEPES al 2 % (Sigma Aldrich), L-Glutamina al 1 % (Gibco BRL), solución de penicilina/estreptomicina al 1 % (Gibco BRL), p-mercaptoetanol al 0,1 % (Gibco BRL), sobrenadante de cultivo de esplenocitos de conejo activado al 2-5 % y células de timoma murino EL-4-B5 irradiadas con radiación gamma (5*104/pocillo) durante siete días a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %.
La presencia de anticuerpos específicos para FcRn en los sobrenadantes de cultivo de linfocitos B se determinó utilizando un ensayo de unión homogéneo basado en fluorescencia, utilizando células HEK-293 transfectadas transitoriamente con FcRn mutante (estabilizado en la superficie) como fuente de antígeno diana. Se transfirieron 10 j l de sobrenadante de placas de cultivo de tejido de 96 pocillos con código de barras a placas de ensayo de pared negra de 384 pocillos con código de barras que contenían 5000 células HEK-293 transfectadas por pocillo, utilizando un manipulador de líquidos Matrix Platemate. La unión se reveló con un anti IgG de rata o ratón específico para Fcy de cabra conjugado a Cy-5 (Jackson). Las placas se leyeron en un sistema de detección celular Applied Biosystems 8200. De las placas de cultivo de 3800 x 96 pocillos, que representaban 38 animales inmunizados distintos, se identificaron 9800 ligantes anti FcRn humano. Se estimó que esto representaba la exploración de aproximadamente 2,5 billones de linfocitos B. Después de la exploración primaria, los sobrenadantes positivos se consolidaron en placas maestras de 96 pocillos con códigos de barras utilizando un robot de selección de positivos Aviso Onyx y linfocitos B en placas de cultivo celular congeladas a -80 °C. Después, las placas maestras se exploraron en un ensayo Biacore para identificar los pocillos que contenían anticuerpos de alta afinidad y los que inhibían la unión de IgG humana al FcRn (véase más abajo). El análisis de interacción biomolecular utilizando la tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) se realizó en un sistema BIAcore T200 (GE Healthcare). Se inmovilizó anti IgG de rata gamma Fc de cabra (Chemicon International Inc.) en NaAc 10 mM, tampón de pH 5 en un chip de sensor CM5 mediante química de acoplamiento de aminas a un nivel de captura de aprox. 19500 unidades de respuesta (UR), utilizando HBS-EP+ como tampón en ejecución. Se utilizó fosfato 50 mM, pH 6 NaCl 150 mM como tampón de ejecución para el ensayo de afinidad y bloqueo. Los sobrenadantes del cultivo de linfocitos B se diluyeron 1 en 5 en fosfato 200 mM, pH 6 NaCl 150 mM. Se usó una inyección de 600 s a 5 jl/m in de sobrenadante de linfocitos B diluidos para la captura mediante la anti Fc de IgG de rata inmovilizada. Se inyectó FcRn humano a 100 nM sobre el sobrenadante del cultivo de linfocitos B capturado durante 180 s a 30 jl/min, seguido de una disociación de 360 s. Se inyectó IgG humana (Jackson ImmunoResearch) durante 60 s con 180 s de disociación a 30 jl/min.
Los datos se analizaron utilizando el software de evaluación T200 (versión 1.0) para determinar las constantes de afinidad (Kd) de los anticuerpos, y determinar cuáles bloquean la unión de IgG.
Como ensayo alternativo, los sobrenadantes de la placa maestra también se exploraron en un ensayo de bloqueo de IgG humana basado en células. Se añadieron 25 ul de sobrenadante de cultivo de linfocitos B de las placas maestras a una placa de polipropileno de 96 pocillos con fondo en U. Después, se añadieron células HEK-293 transfectadas con hFcRn mutantes (50.000 células por pocillo en 25 ul de PBS pH6/SFB al 1 %) a cada pocillo y se incubaron durante 1 hora a 4 °C. Las células se lavaron dos veces con 150 ul de medio PBS. Después, las células se resuspendieron en 50 ul/pocillo de medio PBS/SFB que contenía IgG humana marcada con Alexafluor 488 o 649, a 7,5 ug/ml, y se incubaron 1 hora a 4 °C. Después, se lavaron las células dos veces con 150 ul de medio y se resuspendieron en 35 ul/pocillo de medio PBS/SFB que contenía formaldehído al 1 % como fijador. Después, las placas se leyeron en un citómetro de flujo FACS Canto 2.
Para permitir la recuperación de los genes de la región variable del anticuerpo a partir de una selección de pocillos de interés, se tuvo que realizar una etapa de desconvolución para permitir la identificación de los linfocitos B específicos de antígeno en un pocillo dado que contenía una población heterogénea de linfocitos B. Esto se logró utilizando el método de los focos fluorescentes. Brevemente, los linfocitos B secretores de inmunoglobulinas de un pocillo positivo se mezclaron con perlas de estreptavidina (New England Biolabs) recubiertas con FcRn humano biotinilado y una dilución final de 1:1200 de un anti rata o ratón específico de fragmento Fcy de cabra conjugado FITC (Jackson). Después de la incubación estática a 37 °C durante 1 hora, se pudieron identificar linfocitos B específicos de antígeno debido a la presencia de un halo fluorescente que rodeaba a ese linfocito B. Estos linfocitos B individuales, identificados mediante un microscopio Olympus, se seleccionaron luego con un micromanipulador Eppendorf y se depositaron en un tubo de PCR. Se generaron focos fluorescentes a partir de 268 pocillos seleccionados.
Los genes de la región variable de anticuerpo se recuperaron de células individuales mediante transcripción inversareacción en cadena de la polimerasa (RT)-PCR utilizando cebadores específicos para la región variable de la cadena pesada y ligera. Se realizaron dos rondas de PCR en un robot de manipulación de líquidos Aviso Onyx, con una 2a PCR anidada que incorporaba sitios de restricción en los extremos 3' y 5', lo que permitía la clonación de las regiones variables en un vector de expresión en mamífero de Kappa (VL) de ratón o IgG y1 (VH) de ratón. Las construcciones de la cadena pesada y ligera emparejadas se cotransfectaron en células HEK-293 utilizando Fectin 293 (Invitrogen) y se cultivaron en placas de 48 pocillos en un volumen de 1 ml. Después de 5-7 días de expresión, los sobrenadantes se recogieron y el anticuerpo se sometió a exploración adicional.
La PCR recuperó satisfactoriamente parejas afines de cadena ligera y pesada de linfocitos B individuales de 156 de los pocillos seleccionados. El análisis de secuencia de ADN de los genes clonados de la región variable identificó varias familias únicas de anticuerpos recombinantes. Después de la expresión, se investigaron los sobrenadantes transitorios tanto en ensayos de bloqueo de FACS de IgG humana (descrito anteriormente) como en de reciclado de IgG. En algunos casos, se produjo y analizó IgG y1 de ratón purificada (los datos se marcaron en consecuencia).
El ensayo de reciclado usó células MDCK II (clon como se describe a continuación en los Ejemplos 5, 6 y 7) que tienen expresión aumentada de FcRn humano y de microglobulina beta 2 sembradas en placas a 25.000 células por pocillo de una placa de 96 pocilios. Estas se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %. Las células se lavaron con HBSS+ Ca/Mg pH 7,2 BSA al 1 % y luego se incubaron con 50 j l de concentraciones variables de sobrenadante transitorio HEK-293 o anticuerpo purificado, durante 1 hora a 37 °C, CO2 al 5 %. Se eliminó el sobrenadante y se añadieron a las células 500 ng/ml de IgG humana biotinilada (Jackson) en 50 j l de HBSS+ Ca/Mg pH 5,9 BSA al 1 %, y se incubaron durante 1 hora a 37 °C, CO2 al 5 %. Después, las células se lavaron tres veces en HBSS+ Ca/Mg pH 5,9 y se añadieron a las células 100 j l de HBSS+ Ca/Mg pH 7,2, y se incubaron a 37 °C, CO2 al 5% durante 2 horas. El sobrenadante se retiró de las células y se analizó en cuanto a la IgG total utilizando un ensayo de MSD con un anticuerpo de captura anti IgG humana (Jackson) y un anticuerpo revelador de etiqueta estreptavidina-sulfo (MSD). La curva de inhibición se analizó mediante regresión no lineal para determinar los valores de CI50.
Basándose en el rendimiento en estos ensayos, se seleccionó una familia de anticuerpos que comprende las seis CDR proporcionadas en las SEQ ID NO 1 a 6. El anticuerpo CA170_01638 tuvo la mejor actividad y se seleccionó para la humanización.
Ejemplo 1 Método de humanización
El anticuerpo CA170_01638 se humanizó mediante injerto de las CDR de las regiones V del anticuerpo de rata en los armazones de la región V del anticuerpo de la línea germinal humana. Para recuperar la actividad del anticuerpo, también se conservaron en la secuencia humanizada una serie de restos de armazón de las regiones V de rata. Estos restos se seleccionaron utilizando el protocolo descrito por Adair et al. (1991) (Anticuerpos humanizados, documento WO91/09967). Los alineamientos de las secuencias de la región V del anticuerpo (donante) de rata con las secuencias de la región V de la línea germinal humana (aceptora) se muestran en las Figuras 9A y B, junto con las secuencias humanizadas diseñadas. Las CDR injertadas de la secuencia donante a la aceptora son como las define por Kabat (Kabat et al., 1987), con la excepción de CDR-H1, en que se usa la definición combinada de Chothia/Kabat (véase Adair et al., 1991, Anticuerpos humanizados. Documento WO91/09967). La región V humana IGKV1-27 más la región J JK4 (http://www.imgt.org/) se eligió como el aceptor para las CDR de la cadena ligera. La región V humana IGHV3-7 más la región J JH3 (http://www.imgt.org/) se eligió como el aceptor para las CDR de la cadena pesada.
Los genes que codifican una serie de secuencias de la región V de la cadena ligera y pesada variantes se diseñaron y construyeron mediante un enfoque de síntesis automatizada por Entelechon GmbH. Se crearon variantes adicionales de ambas regiones V de cadena pesada y ligera mediante la modificación de los genes de VH y VK, mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Estos genes se clonaron en varios vectores para permitir la expresión del anticuerpo humanizado Fab o de la IgG4 1638 en E. coli y células de mamífero, respectivamente. Las cadenas variantes, y combinaciones de las mismas, se evaluaron en cuanto a su potencia con respecto al anticuerpo original, sus propiedades biofísicas y su idoneidad para el procesamiento aguas abajo, lo que condujo a la selección del injerto de cadena ligera gL7 y el injerto de cadena pesada gH33. Las secuencias de injerto gL7 y gH33 seleccionadas finales se muestran en las Figuras 9A y B, respectivamente. Este emparejamiento de la región V se denominó 1638.g49.
Los restos del armazón de la cadena ligera en el injerto gL7 proceden todos del gen de la línea germinal humana, con la excepción de los restos 70 y 71 (numeración de Kabat), en que se conservaron respectivamente los restos de donante Histidina (H70) y Tirosina (T71). La retención de estos dos restos fue importante para la potencia completa del Fab o del anticuerpo humanizado. El resto 56 en CDRL2 del injerto gL7 se mutó de un ácido aspártico (D56) a un resto de ácido glutámico (E56), eliminando así un sitio potencial de isomerización de ácido aspártico de la secuencia de gL7. Los restos del armazón de la cadena ligera en el injerto gH33 proceden todos del gen de la línea germinal humana, con la excepción de los restos 48 y 78 (numeración de Kabat), en que se conservaron respectivamente los restos de donante Leucina (L48) y Alanina (A78). La retención de estos dos restos fue esencial para la potencia completa del Fab o del anticuerpo humanizado.
Para la expresión del Fab 1638.g49 en E. coli, los genes humanizados de la región V de cadena ligera y pesada se clonaron en el vector de expresión pTTOD de UCB, que contiene ADN que codifica la región constante de C-kappa humana (alotipo K1m3) y la región CH1 de gamma-1 humana (con o sin la región bisagra) (alotipo G1m17).
Para la expresión de la IgG4 1638.g49 en células de mamífero, el gen de la región V de la cadena ligera humanizada se unió a una secuencia de ADN que codifica la región constante de C-kappa humana (alotipo K1m3), para crear un gen de la cadena ligera contiguo. El gen de la región V de la cadena pesada humanizada se unió a una secuencia de ADN que codifica la región constante de la cadena pesada de gamma-4 humana con la mutación estabilizante de la bisagra S241P (Angal et al., Mol Immunol. 1993, 30(1):105-8), para crear un gen de la cadena pesada contiguo. Los genes de la cadena ligera y pesada se clonaron en un vector de expresión de mamífero.
En el Ejemplo 8A descrito a continuación en el presente documento se usó otro injerto anterior, 1638.g28, que contenía más restos de donante en la cadena pesada (gH2) que el injerto 1638.g49 (F24, L48, K71, T73, A78 y V93). Además, la cadena ligera de este anticuerpo (gL2) contiene el CDRL2 no modificado proporcionado en la SEQ ID NO: 5 en lugar del CDRL2 modificado de la SEQ ID NO: 7 que se usa en 1638.g49. Las secuencias de ambos conjuntos de anticuerpos se proporcionan en la Figura 8. El anticuerpo 1638.g28 se expresó como un fragmento Fab' como se describió anteriormente para 1638.g49.
Ejemplo 2 Preparación del conjugado Fab' de 1638.g49-PEG
Se extrajo de las células mediante extracción por calor el Fab' expresado en el periplasma de E. coli. Se purificó el Fab' mediante purificación por afinidad con proteína G con una elución ácida. Se redujo y PEGiló Fab' con PEG de 40 kDa (SUNBRIGHT GL2-400MA3). El PEG se une covalentemente a través de un grupo maleimida a uno o más grupos tiol en el fragmento de anticuerpo. La eficacia de la PEGilación se confirmó mediante SE-HPLC. El Fab'PEG se separó de los diFab' y Fab' no PEGilados mediante cromatografía de intercambio catiónico. Las fracciones se analizaron mediante SE-HPLC y SDS-PAGE. Se llevó a cabo un agrupamiento para minimizar los niveles de impurezas. La muestra final se concentró y se diafiltró en el tampón deseado.
Ejemplo 3 Afinidad para la unión a hFcRn
Se realizó un análisis de interacción biomolecular utilizando tecnología de resonancia de plasmón superficial (SPR) en un sistema Biacore T200 (GE Healthcare) y se determinó la unión al dominio extracelular de FcRn humano. El dominio extracelular del FcRn humano se proporcionó como un complejo no covalente entre el dominio extracelular de la cadena alfa del FcRn humano (Se Q iD NO: 48) y la microglobulina p2 (p2M) (SEQ ID NO: 72). El fragmento F(ab')2 de cabra anti IgG humana, específico para el Fc Affinipure (para captura de IgG4) (Jackson ImmunoResearch Lab, Inc.) a 50 pg/ml en NaAc 10 mM, pH 5 se inmovilizó en un chip sensor CM5 a través de química de acoplamiento de aminas, a un nivel de captura de entre 5000 - 6000 unidades de respuesta (UR) utilizando HBS-EP+ (GE Healthcare) como tampón de ejecución.
Para el ensayo de afinidad y bloqueo se utilizó fosfato 50 mM, pH 6 NaCl 150 mM P20 al 0,05 % o HBS-P+, pH 7,4 (GE Healthcare) como tampón de ejecución. El anticuerpo, IgG4P 1638.g49, se diluyó a 1 pg/ml en tampón de ejecución. Se utilizó una inyección de 60 s de IgG4 a 10 pl/min para la captura mediante la anti IgG Fc humana inmovilizada. Se valoró el dominio extracelular de FcRn humano de 20 nM a 1,25 nM en el sobrenadante anticuerpo anti FcRn (IgG4) capturado, durante 300 s a 30 pl/min, seguido de una disociación de 1200 s. La superficie se regeneró con 2 x 60 s de HCl 50 mM a 10 pl/min para el tampón de ejecución a pH 6 o con 60 s de HCl 40 mM y 30 s de NaOH 10 mM para el tampón de ejecución a pH 7,4.
Los datos se analizaron utilizando el programa informático de evaluación T200 (versión 1.0), utilizando el modelo de unión 1:1 con Rmax local.
T l 1 D fini r n i hF Rn I 4P 1 . 4 H H 74
Figure imgf000032_0001
Por lo tanto, se determinó que la afinidad de IgG4 1638,49g era de 127 pM a pH 6,0 y de 29 pM a pH 7,4.
Ejemplo 4
Se analizaron en cuanto a la integridad bioquímica y la estabilidad biofísica una molécula de longitud completa IgG4P y una molécula Fab-dsFv en que se incorporó al dominio Fab de cada formato la región variable 1638.g49.
Métodos y resultados
1. Confirmación de secuencias.
i) Secuenciación de proteínas (método químico de Edman)
La secuencia de aminoácidos N-terminal de las muestras de IgG4 y Fab-dsFv se obtuvo usando el instrumento Procise 494 de Applied Biosystems. Esto se hizo funcionar según lo recomendado por el fabricante del instrumento. Aproximadamente 100 pmoles de cada muestra se aplicaron a discos de difluoruro de polivinilideno (Prosorb, utilizado según las recomendaciones del fabricante) y se sometieron a 18 ciclos que incluyeron dos ejecuciones blanco y un patrón, lo que dio como resultado, por tanto, el análisis de los primeros 15 restos de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada. El análisis se realizó utilizando SequencePro Data Analysis Application V2.0.
En cada muestra, la secuencia observada fue una mezcla de dos secuencias abundantes aproximadamente por igual, EVQLVESGGGLVQPG (SEQ ID NO: 67) y DIQMTQSPSSLSASV (SEQ ID NO: 68), concordante con las secuencias N-terminales esperadas de las secuencias del gene de la cadena pesada y ligera, respectivamente. La abundancia aproximadamente igual sugirió cantidades molares iguales de las 2 cadenas, con poco o ningún bloqueo significativo del N-terminal.
ii) Análisis por espectrometría de masas
a) Análisis de masa intacta
El análisis de espectrometría de masa intacta se realizó en dos lotes de la IgG4 y de la molécula Fab-dsFv, después de la reducción con TCEP 20 mM durante una hora. Las masas se midieron en un espectrómetro de masas Agilent 6510 equipado con una interfaz de cubo de chip y un chip C8 (columna Zorbax 300A C8 de 43 mm trampa de 43 nl). Todas las muestras se diluyeron a 0,1 mg/ml en agua al 98 %/metanol al 2 %/ácido fórmico al 0,3 % (disolvente A) antes de la inyección y se cargaron 0,3 pl en el sistema. Las proteínas se eluyeron del chip en el espectrómetro de masas usando un gradiente de acetonitrilo al 40 %/fórmico al 0,1 % a 350 nl/min. Los datos de ToF-MS se recogieron en modo de iones positivos entre 500 y 5000 m/z y se procesaron usando el programa informático Agilent MassHunter.
Las masas observadas tanto para la cadena ligera como para la cadena pesada para ambos formatos se muestran a continuación (Tabla 2).
Tabla 2. Tabla de masas observadas de dos lotes de I G4 de Fab-dsFv
Figure imgf000033_0001
El análisis de masa intacta de la IgG4 reducida con TCEP fue concordante con las secuencias esperadas con glicosilación predominantemente con G0F y lisina C-terminal recortada (aproximadamente el 90 %) en la cadena H, lo que es típico de la IgG recombinante.
De manera similar, los espectros de masa intacta de las cadenas de Fab-dsFv fueron concordantes con la masa de la secuencia y el número esperado de disulfuros. Hubo heterogeneidad en la masa observada de ambas cadenas, presumiblemente debido a la reducción parcial de los disulfuros intracadena por TCEP. b) El mapeo de disulfuros se realizó solo en IgG4.
Se trato la IgG4 (50 ug) con Rapigest al 0,15 % en Tris-HCl pH 7,5 a 50 °C durante 15 minutos y las cisteínas libres se alquilaron con yodoacetamida. Se añadió tripsina (1:25 p/p) y las proteínas se hidrolizaron durante una noche a temperatura ambiente, y luego la reacción se detuvo mediante la adición de ácido fórmico (5 % v/v), y se eliminaron los precipitados por centrifugación. Las muestras se reservaron a -20 °C y se diluyeron 1:1 con agua antes de cargarlas en el sistema de LC-MS. Se cargaron alícuotas (~ 3-5 ug) en una columna C18 de 2,1 x 150 mm (Waters BEH1.7u) equilibrada con agua, que contenía ácido fórmico al 0,2 %, y se eluyó con un gradiente de acetonitrilo/1-propanol en un espectrómetro de masas Waters Xevo operado en modo MS E de iones positivos. Los datos se analizaron con el programa informático MassLynx y BioPharmaLynx.
Los resultados indicaron que se observaron todos los péptidos unidos por disulfuro esperados, excepto la especie peptídica intercadenas HH T19-SS-T19, que solo se observó con un enlace disulfuro único y a baja intensidad. No hubo evidencias de ninguna especie de disulfuro intercambiadas o de restos de cisteína carbamidometilada.
2. Análisis bioquímico
Cromatografía de exclusión por tamaño HPLC (SEC HPLC)
La cromatografía de exclusión por tamaño permitió el análisis de material monomérico y oligomérico. Se realizó usando una columna TSK G3000SW (D.I. 7,7 mm x L 30,0 cm) conectada a un sistema Agilent 1100. Las muestras (inyección de 25 pl/25 |jg) se eluyeron de forma isocrática en fosfato de sodio 0,2 M, pH 7 a 1,0 ml/min durante 30 minutos, 30 °C. La elución se controló por la absorbancia a 280 nm.
Los perfiles de elución mostraron que IgG4 y Fab-dsFv eran homogéneos y eluían en los tiempos de retención esperados según los patrones de la SEC (BioRad 151-1901).
3. Carga Molecular.
Se realizó un isoelectroenfoque capilar (IEEc) para estimar el pI y el contenido en especies ácidas.
Para el análisis, las muestras de IgG4 y Fab-dsFv se diluyeron 1 mg/ml en agua de calidad para HPLC (condición no reducida). Las muestras también se sometieron a reducción (THP 2 mM/30 minutos) y alquilación (yodoacetamida 20 mM/80 minutos) para analizar los aductos de cisteína.
Las muestras se prepararon mezclando lo siguiente: 30 j l de muestra de proteína, metilcelulosa al 0,35 %, anfolitos de pH 3-10 al 4 % (Pharmalyte), 1 j l de cada marcador sintético de pI (4,65 y 9,77) y agua de calidad para HPLC para completar hasta 100 j l de volumen final. Después, la mezcla se analizó utilizando el analizador ICE280 IEF (Convergent Biosciences), preenfocando a 1500 V durante 1 minuto seguido de enfoque a 3000 V durante 6 minutos. Después, los electroferogramas calibrados se integraron utilizando el programa informático Empower (de Waters).
Se consideró que el pI era el de la especie principal (pico más grande).
Para el formato de IgG4, la especie principal tuvo un pI de 7,3. Se supuso que se trataba de la molécula original recortada (eliminación de la lisina C terminal, corroborado por análisis de espectro de masas), lo que no es atípico para las moléculas de IgG. La molécula recortada sería más ácida que la molécula original (pico básico a 7,4). No hubo cambios en el perfil de pI antes y después de la reducción y alquilación, lo que indicó que no hubo aductos de cisteína.
Para el formato de Fab-dsFv, se consideró que el pI era el de la especie principal (pico más grande), que era de 9,0. También fue evidente una especie más ácida (pI 8,8), que fue menos prominente después de la reducción/alquilación, lo que indicó la presencia de un aducto reducible.
Para ambos formatos, los picos menores estaban presentes siendo ácidos (a la izquierda del pico principal) o básicos (a la derecha del pico principal). Se presumió que estas especies eran derivados de las especies principales, pero no se caracterizaron adicionalmente.
4. Estabilidad térmica (Tm)
Cuando se calienta, una proteína tenderá a desplegarse, y cuanto más plegada de forma estable esté una estructura proteica, más calor se precisará para desplegarla. Por lo tanto, la estabilidad térmica (medida como temperatura de fusión, T m ) es una medida de la estabilidad de plegamiento de una proteína, o la resistencia de una molécula al despliegue (desnaturalización), lo cual puede ser un prerrequisito para la formación de agregados. En un gradiente de temperatura, en condiciones definidas, la temperatura a la que el 50 % de las moléculas están desplegada es la T m.
Las estimaciones de la T m se realizaron mediante dos métodos independientes
i) El ensayo de termofluor, medición del 50 % de despliegue mediante la unión de un colorante fluorescente (Sypro Orange) a las superficies hidrófobas expuestas que se exponen en el despliegue inducido por calor y ii) la calorimetría diferencial de barrido (DSC).
Los resultados de las dos técnicas generalmente están correlacionados, difiriendo ligeramente en valor absoluto porque los métodos empleados son distintos.
i) Ensayo de termofluor
Las muestras se prepararon de la siguiente manera: se colocaron 5 j l de sypro orange 30x en una placa con fondo en V de 96 pocillos. Después, se añadieron 45 j l de muestra de proteína a 0,1 mg/ml. Esta mezcla se pipeteó, en cuadruplicados de 10 jl, en una placa de 384 pocillos. El formato de la placa de 384 pocillos fue: muestra 1: pocillos A1, B1, A2, B2; muestra 2: pocillos C1, D1, C2, D2. Se incluyó un control interensayos, que era una IgG4 irrelevante. Este control, a 0,1 mg/ml (en PBS pH 7,4) se añadió a 5 j l de colorante concentrado 30x, se colocan 10 j l de esta mezcla maestra en el pocillos de 384 por cuadruplicado. Las placas se colocaron en un sistema de PCR en tiempo real rápida 7900HT y se calentaron de 20 °C a 99 °C usando una velocidad de rampa de 1,1 °C/min; un dispositivo CCD controla simultáneamente los cambios de fluorescencia en los pocillos. Se utiliza una plantilla XE modificada (IDBS) para procesar los datos de intensidad y tener en cuenta las transiciones múltiples. Dos transiciones de despliegue fueron evidentes para las moléculas IgG4 y Fab-dsFv. El valor T m 2 para ambas moléculas representaba el dominio de despliegue de Fab y se mostró que era ligeramente más bajo para el formato de IgG4. El valor T m1 representaba el dominio CH2 (cadena pesada constante) y el dominio dsFv de las moléculas IgG4 y Fab-dsFv, respectivamente. Se demostró que el formato de Fab-dsFv es más estable desde el punto de vista térmico que el formato IgG en PBS, pH 7,4.
Figure imgf000035_0002
ii) Método de DSC
El análisis por DSC se realizó en la molécula Fab-dsFv solo para corroborar los datos de Thermofluor y para determinar el efecto de dos tipos distintos de tampón (PBS pH 7,4 y acetato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 125 mM, pH 5,0) sobre la estabilidad térmica.
Se cargaron las muestras a 1 mg/ml en PBS pH 7,4 y acetato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 125 mM, pH 5,0 con los tampones de referencia respectivos, en el instrumento de DSC capilar MicroCal VP por triplicado. La configuración del sistema incluía una exploración de temperaturas de 20 °C a 110 °C, y una velocidad de exploración de 60 °C/h. Los termogramas finales se procesaron utilizando el programa informático Origin de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La Tm se determinó utilizando el algoritmo de detección automatizada de la T m del programa informático (para la transición principal) y el pico manualmente seleccionado para cualquier otra transición que no fuera detectada automáticamente por el programa informático.
Se pudieron observar dos transiciones distintas en los dos tampones analizados.
La transición de pliegue más baja (T m 1) representaba el dominio dsFv de la molécula Fab-dsFv y la temperatura de transición más alta (T m 2) representaba el dominio Fab.
Los datos de la DSC concordaban muy bien con los datos obtenidos del ensayo de Thermofluor. Esta técnica fue capaz de poder discriminar entre los dos dominios de despliegue más fácilmente que el ensayo de Thermofluor.
La molécula Fab-dsFv mostró un ligero aumento en la estabilidad térmica en acetato de sodio 50 mM/cloruro de sodio 125 mM, pH 5.
Figure imgf000035_0001
5. Estructura molecular: espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier de reflectancia total atenuada (ATR FTIR)
Esta técnica se utilizó para comparar el grado de interacción entre las láminas p dentro de la molécula (intraláminas p) y entre moléculas distintas (interláminas p).
El análisis se realizó utilizando el espectrómetro Bruker Tensor 27 FTIR y el accesorio de muestreo de células BIOATR II, utilizando una resolución de 4 cm-1; 120 exploraciones; ajuste de apertura de 6 mm y 20 pl de volumen de muestra a 20 °C, donde se realizó el siguiente procedimiento para el análisis de Fab-dsFv únicamente.
1. Se midieron cinco espectros de fondo de aire usando el método BIOATR 100610. xpm.
2. Se añadieron 20 pl de PBS de sigma pH 7,4 a la celda y luego se retiraron
3. Se añadieron 20 pl de PBS de sigma pH 7,4 a la celda y se tomó el espectro, se eliminó el tampón y se añadió tampón recién preparado, y se tomó un espectro (por duplicado).
4. Se añadieron 20 pl de muestra a la celda y se tomó el espectro, después, la muestra se retiró de la celda. 5. Se añadieron 20 pl de PBS de sigma pH 7,4 a la celda y se retiraron
6. Se añadieron 20 pl de muestra a la celda y se tomó el espectro, después, la muestra se retiró de la celda. (por duplicado)
7. Después, se limpió la celda siguiendo el siguiente procedimiento:
a. Se añadieron 20 pl de SDS al 1 % a la celda limpieza con Q-tip
b. Se añadieron 20 pl de SDS al 1 % a la celda y se retiraron
c. Se añadió 5 veces 20 pl de H2O a la celda y se retiraron
d. Se añadieron 20 pl de tampón a la celda y se retiraron
8. Los datos se analizaron para producir el formato de datos final de la siguiente manera.
a. El espectro de tampón 1 se sustrajo del espectro de Fab-dsFv 1 y después se repitió con el espectro de tampón 2 y el espectro de Fab-ds Fv 2.
b. Los datos se cortaron a 2200 cm-1 hasta 1000 cm-1
c. Los espectros duplicados se promediaron.
d. Después, se tomó una segunda derivada con un suavizado de 25 puntos. Este fue el formato de datos final que se muestra.
Los resultados del análisis mostraron que el Fab-dsFv tenía las características de las intraláminas beta típicas de las moléculas de anticuerpos.
Ejemplo 5 Potencia basada en células
Los ensayos basados en células se realizaron utilizando células de Riñón Canino Madin-Darby (MDCK) II que se habían transfectado de forma estable con un vector de doble gen con FcRn humano y B2M humana, con un marcador de selección de Geneticina. Se seleccionó un clon celular estable que era capaz de reciclar y transcitosar IgG humana, y se usó para todos los estudios posteriores. Será referido como MDCK II clon 15.
Afinidad basada en células de IgG4 CA170_1638.g49 para FcRn humano
Se realizaron experimentos de citometría de flujo cuantitativa utilizando células MDCK II clon 15 e IgG4 CA170_1638.g49 marcada con AlexaFluor 488. Se usó la unión específica a FcRn del anticuerpo en un intervalo de concentraciones de anticuerpo para determinar la Kd. Los análisis se realizaron en tampones neutros y ácidos para determinar si un pH del entorno comparable al encontrado en el plasma sanguíneo (pH 7,4) o en los endosomas (pH 6) tenía algún efecto sobre la unión del anticuerpo.
La Figura 2 muestra las curvas de unión representativas para IgG4 CA170_1638.g49. Los valores medios de Kd (n = 3) fueron de 0,20 en tampón neutro y de 0,22 en tampón ácido, respectivamente (véase la Tabla 4).
Tabla 4 - V l r m i K nM r I 4 A17 1 . 4 n l l MD K II clon 15.
Figure imgf000036_0001
La Figura 2 muestra la unión de IgG4 CA170_1638.g49 en células MDCK II clon 15 en pH ácido y neutro.
Las células MDCK II clon 15 se incubaron en tampón Facs (PBS con BSA al 0,2 % p/v, NaN3 al 0,09 % p/v) durante 30 minutos antes de la adición de IgG4 CA170_1638.g49 marcado con Alexa-fluor 488 durante 1 hora en tampón Facs a pH 7,4 o pH 6. Las concentraciones finales de anticuerpo variaron entre 400 nM y 0,003 nM. Las células se lavaron en tampón Facs enfriado con hielo y después se analizaron mediante citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo Guava (Millipore, RU). También se produjeron conjuntos de datos de valoración para los anticuerpos de control de isotipo para cada formato de anticuerpo, para determinar la unión no específica. El número de moles de anticuerpo unido se calculó utilizando valores interpolados de una curva patrón generada a partir de perlas compuestas de distintas cantidades de colorante fluorescente. Los valores de fluorescencia medios geométricos se determinaron en los análisis por citometría de flujo de las células y las perlas. La unión no específica se restó de los valores de los anticuerpos anti FcRn y la curva de unión específica generada se analizó mediante regresión no lineal, utilizando una ecuación de unión de un sitio (Graphpad Prism®) para determinar la Kd. Los datos son representativos de 3 experimentos.
IgG4 CA170_1638.g49 puede unirse a FcRn humano expresado en células a pH ácido y neutro
Ejemplo 6 Ensayos funcionales basados en células
La expresión del FcRn es principalmente intracelular (Borvak J et al. 1998, Int. Immunol., 10 (9) 1289-98 y Cauza K et al. 2005, J. Invest. Dermatol., 124 (1), 132-139), y está asociada a membranas endosómicas y lisosómicas. La porción Fc de IgG se une al FcRn a pH ácido (<6,5), pero no a un pH fisiológico neutro (7,4) (Rhagavan M et al. 1995) y esta dependencia del pH facilita el reciclado de IgG.
Una vez que se toma mediante pinocitosis y entra en el endosoma ácido, la IgG unida al FcRn se reciclará junto con el FcRn a la superficie celular, mientras que a pH fisiológicamente neutro se liberará la IgG. (Ober RJ et al. 2004, The Journal of Immunology, 172, 2021-2029). Cualquier IgG no unida al FcRn entrará en la ruta de degradación lisosómica.
Se estableció un ensayo in vitro para examinar la capacidad de IgG4 CA170_1638.g49 para inhibir las capacidades de reciclado de IgG del FcRn. Brevemente, se incubaron células MDCK II col 15 con IgG humana biotinilada, en presencia y ausencia de IgG4 1638, en un tampón ácido (pH 5,9) para permitir la unión al FcRn. Se eliminó todo el exceso de anticuerpo y las células se incubaron en un tampón de pH neutro (pH 7,2), lo que permite la liberación en el sobrenadante de la IgG unida, expuesta en la superficie e internalizada. Se siguió la inhibición del FcRn utilizando en un ensayo de MSD para detectar la cantidad de IgG reciclada y, por lo tanto, liberada en el sobrenadante.
La Figura 3 muestra que IgG4 CA170_1638.g49 inhibe el reciclado de IgG en células MDCK II clon 15. Las células MDCK II clon 15 se sembraron en placas a 15.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 °C, CO2 al 5 %. Las células se incubaron con 1 ug/ml de IgG humana biotinilada (Jackson), en presencia y ausencia de IgG4 CA170_1638.g49 en HBSS+ (Ca/Mg) pH 5,9 BSA al 1 % durante 1 hora a 37 °C, CO2 al 5 %. Las células se lavaron con HBSS+ pH 5,9 y después se incubaron a 37 °C, CO2 al 5 % durante 2 horas en HBSS+ pH 7,2. El sobrenadante se retiró de las células y se analizó en cuanto a la IgG total utilizando un ensayo de MSD (utilizando un anticuerpo de captura anti IgG humana (Jackson) y un anticuerpo revelador de etiqueta estreptavidina-sulfo (MSD)). La curva de inhibición se analizó mediante regresión no lineal (Graphpad Prism®) para determinar la CE50. El gráfico representa datos combinados de 3 experimentos. Como se muestra en la F ig u ra 3 , IgG4 CA170_1638.g49 inhibe el reciclado de IgG de una manera dependiente de la concentración con un valor medio de CE50 (n = 3) de 0,31 nM.
Ig G 4 y F a b F v C A 170 _ 1638.g 49 inh iben la tra n s c ito s is d e IgG h u m an a
FcRn puede efectuar el tráfico de IgG a través de capas de células epiteliales polarizadas, tanto en dirección apical a basolateral como basolateral a apical y, por lo tanto, desempeña un papel importante al permitir que la IgG se mueva entre la circulación y la luz en las barreras mucosas (Claypool et al. 2004 Mol Biol Cell 15(4):1746-59). FcRn puede efectuar el tráfico de IgG a través de capas de células epiteliales polarizadas, tanto en dirección apical a basolateral como basolateral a apical y, por lo tanto, desempeña un papel importante al permitir que la IgG se mueva entre la circulación y la luz en las barreras mucosas (Claypool et al. 2004 Mol Biol Cell 15(4):1746-59). Se estableció un ensayo in vitro para examinar la capacidad de IgG4 y FabFv CA170_1638.g49 para inhibir la transcitosis de IgG dependiente de FcRn. Brevemente, las células MDCK II clon 15 se sembraron en una placa transpocillos de 24 pocillos y se dejó que formaran monocapas durante 3 días. Las células se incubaron después con IgG humana biotinilada en un tampón ácido que facilita la unión al FcRn, en el lado apical, en presencia y ausencia de IgG4 o FabFv CA170_1638.g49. La IgG humana experimenta transcitosis a través de las células del lado apical al basolateral y se libera en un tampón neutro en la cámara inferior. Los niveles de IgG en el lado basolateral se midieron después, utilizando un ensayo de MSD.
Las F ig u ras 4 y 5 muestran que IgG4 y FabFv CA170_1638.g49 inhiben la transcitosis de IgG apical a basolateral en células MDCK II clon 15. Las células MDCK II clon 15 se sembraron en una placa a 500.000 células por pocillo de una placa transpocillos de 24 pocillos y se incubaron durante 3 días a 37 °C, CO2 al 5 % hasta que se formaron monocapas. El pH del compartimiento apical se ajustó a 5,9 y el lado basolateral a 7,2 en un tampón HBSS+ (Ca/Mg) BSA al 1 %. Las células del compartimento apical se incubaron con 1 pg/ml de IgG humana biotinilada (Jackson) en presencia y ausencia de IgG4 o FabFv CA170_1638.g49 a las concentraciones indicadas durante 4 horas a 37 °C, CO2 al 5 %. Después, se recogió el medio basolateral y se midió la IgG total mediante el ensayo de MSD (utilizando un anticuerpo de captura anti-IgG humana (Jackson) y un anticuerpo revelador de marcador de estreptavidina-sulfo (MSD)). La curva de inhibición se analizó mediante regresión no lineal (Graphpad Prism®) para determinar la CE50. El gráfico representa datos combinados de 3 experimentos.
En resumen, las Figuras 4 y 5 muestran que IgG4 y FabFv CA170_1638.g49 pueden inhibir la transcitosis apical a basolateral de IgG humana de una manera dependiente de la concentración con un valor de EC50 de 2,4 y 0,42 nM, respectivamente (n = 3).
R e su m e n d e los e fe c to s in vitro d e IgG 4 y F ab F v C A 170 _ 1638.g 49
IgG4 y FabFv CA170_1638.g49 inhiben tanto el reciclado como la transcitosis de IgG. La CE50 de 0,31 nM conseguida en el ensayo de reciclado de IgG es comparable a los datos de unión por afinidad a células en los que se obtuvieron valores de Kd de 0,2 nM en tampón neutro y de 0,22 nM en tampón ácido. En el ensayo de transcitosis de IgG, se obtuvo una CE50 de 2,4 nM y de 0,42 nM para IgG4 y FabFv CA170_1638.g49, respectivamente, lo que demuestra una ligera reducción en la potencia entre IgG4 y FabFv. Sin embargo, los datos en esta sección han demostrado claramente que IgG4 y FabFv CA170_1638.g49 pueden inhibir la función del FcRn humano.
E je m p lo 7 R e ac tiv id ad c ru z a d a d e Ig G 4 C A 170 _ 1638.g 49 co n FcR n d e p rim ate no h u m an o .
Para validar el uso de IgG4 CA170_1638.g49 en un estudio de PK/PD con primates no humanos y toxicología preclínica, se examinó su afinidad relativa con el FcRn de macaco cynomolgus. Se utilizaron células MDCK II transfectadas de forma estable con FcRn y B2M de macaco cynomolgus (MDCKII Clon 40) en un ensayo basado en células, junto con las células MDCK II descritas anteriormente transfectadas de forma estable con FcRn y B2M humanos (MDCK II clon 15).
La figura 6 muestra la unión de IgG4 IgG4 CA170_1638.g49 en células MDCK II clon 40 en pH ácido y neutro. Se usó la unión específica a FcRn del anticuerpo en un intervalo de concentraciones de anticuerpo para determinar la Kd. Los análisis se realizaron en tampones neutros y ácidos para determinar si un pH del entorno comparable al encontrado en el plasma sanguíneo (pH 7,4) o en los endosomas (pH 6) tenía algún efecto sobre la unión del anticuerpo.
La Figura 6 muestra curvas de unión representativas para IgG4 CA170_1638.g49. Los valores medios de Kd (n = 3) fueron de 0,3 en tampón neutro y de 0,43 en tampón ácido, respectivamente (véase la Tabla 5).
T a b la 5 - V l r m i K n M r I 4 A 17 1 . 4 n l l M D K II c lo n 40.
Figure imgf000038_0001
E je m p lo 8 A El tra ta m ie n to co n anti FcR n p o te n c ia la e lim in a c ió n d e h Ig G in vivo en ra to n es tra n s g é n ic o s p ara hFcR n
Se determinó el efecto de las moléculas anti FcRn (Fab'PEG CA170_01519.g57 (descrito en el documento WO2014/019727) y Fab'PEG CA170_01638.g28) sobre la eliminación de IVIG humana en ratones transgénicos para FcRn humano (B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, Ratones JAX). Los ratones se infundieron por vía intravenosa con 500 mg/kg de IgG humana (IgI humana Gamunex-c al 10 %, Talecris Biotherapeutics). 24 horas más tarde, a los animales se les administró una dosis de control de vehículo (PBS) o de anti FcRn por vía intravenosa, como una dosis única (100 mg/kg). Se tomaron muestras seriadas de sangre de la punta de la cola a las -24, 8, 24, 48, 72, 96, 144 y 192 horas con respecto al tratamiento con anti FcRn. Los niveles séricos de IgG humana en ratones con hFcRn se determinaron mediante LC-MS/MS. Los datos presentados en la figura 1 son la media ± ETM con 5-6 ratones por grupo de tratamiento. El bloqueo del hFcRn por cada una de las moléculas anti FcRn analizadas dio como resultado una eliminación acelerada de hIVIG y se observaron concentraciones más bajas de IgG total en comparación con los ratones de control.
E je m p lo 8B . El tra ta m ie n to co n an ti FcR n p o te n c ia la e lim in a c ió n d e h Ig G in vivo en ra to n es tra n s g é n ic o s para hFcR n
El anticuerpo anti FcRn humano descubierto se unió a e inhibió la unión de la IgG humana al FcRn humano, pero no se unió ni inhibió el FcRn murino. En consecuencia, el efecto de las moléculas anti FcRn en formato de IgG4P (1638.g49), el formato de Fab'PEG (1638.g28) y el formato de FabFv sobre la eliminación de IVIg humana se determinaron en ratones transgénicos para FcRn humano (B6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, Ratones JAX). Los ratones se infundieron por vía intravenosa con 500 mg/kg de IgG humana (IgI humana Gamunex-c al 10 %, Talecris Biotherapeutics). 24 horas después, a los animales se les administró una dosis de control de vehículo (PBS) o de anti FcRn por vía intravenosa como una dosis única. Las dosis, los tiempos de muestreo y los duplicados fueron se indican en las Figuras 1a a 1e. Las muestras fueron muestras seriadas de sangre de la punta de la cola. Los niveles séricos de IgG humana, de albúmina de ratón endógena y de la propia molécula anti FcRn se determinaron por LC-MS/MS, con detección y cuantificación de las secuencias peptídicas exclusivas para cada uno de los analitos. Los datos presentados en las Figuras 1a a 1e son cada uno la media geométrica y el intervalo de confianza del 95 %.
El bloqueo del hFcRn por cada una de las moléculas anti FcRn analizadas dio como resultado una eliminación acelerada de hIVIG que se aceleró en comparación con la de los ratones control que se trataron solo con vehículo, o con un Fab'PEG de control (A33, no anti FcRn, conjugado a PEG de 40 kDa, como lo fue Fab'PEG 1638) - véanse las Fig, 1a y 1b. El efecto estuvo relacionado con la dosis, las dosis más grandes arrojaron períodos más prolongados durante los cuales se pudo detectar anti FcRn libre en suero (Fig. 1c y 1d), conduciendo esto a una eliminación más prolongada y más profunda de IVIg humana de los ratones. El Fab'PEG 1638 mostró una farmacocinética más corta (desapareció más rápidamente de la solución libre en suero) que el Fab'PEG A33 de control, sugiriendo que el Fab'PEG 1638 había experimentado una tendencia mediada por la diana, desapareciendo de la solución libre mediante la unión a la diana FcRn.
Aunque la IgG de ratón no se unió al FcRn humano presente en estos ratones transgénicos, la albúmina endógena de ratón se unió y fue reciclada por el FcRn humano. Aunque la unión del anti FcRn humano al FcRn humano no bloqueó la unión de la albúmina al FcRn en un ensayo in vitro, si tal inhibición se hubiese producido in vivo, podría haber conducido a una eliminación acelerada de la albúmina endógena del ratón. Los datos se muestran en la Figura 1e. Dado que la concentración de albúmina en suero fue algo variable (de 16,6 a 59,9 mg/ml en un grupo de 30 ratones, antes de la inyección del fármaco anti FcRn), para permitir una comparación más fácil de los resultados del grupo, los datos de la albúmina se normalizaron y se proporcionaron como un porcentaje de la concentración de albúmina sérica en el momento cero en la Figura 1e. Un efecto recuperable en la concentración de albúmina en plasma podría haberse producido después de la dosificación con los formatos Fab'PEG o FabFv. El análisis de la varianza (ANOVA) se realizó para mediciones repetidas, mirando las diferencias de tratamientos y las diferencias de tiempo simultáneamente. Cada medición de un animal tratado con Fab'PEG o FabFv se comparó con el control en el mismo experimento en el mismo punto de tiempo, siendo los controles una Fab'PEG irrelevante (sin unión a FcRn), o vehículo solamente, respectivamente. Estos dos formatos mostraron una reducción de las concentraciones de albúmina (a un nivel del 5 % en el análisis de datos ANOVA) alrededor de las 48 a 72 horas posinyección del fármaco, recuperándose los niveles a los niveles predosis a partir de entonces. La reducción máxima de la concentración plasmática de albúmina fue de aproximadamente el 10 % después de 100 mg/kg del formato de Fab'PEG (a las 48 horas), o de aproximadamente el 25 % después de 250 mg/kg de FabFv a las 144 horas. Se llevó a cabo un análisis ANOVA similar en los datos que muestran el efecto de IgG4P 1638 sobre los niveles de albúmina plasmática (mostrado en la Fig. If). No hubo diferencias significativas entre los animales tratados y los de control, lo que sugiere que el tratamiento con el formato de IgG4P de 1638 no afectó la concentración de albúmina plasmática.

Claims (22)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo que comprende (i) una cadena pesada o un fragmento de la cadena pesada que tiene una región variable que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 25 y (ii) una cadena ligera o un fragmento de la cadena ligera que tiene una región variable que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 16.
2. Un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento de unión es un fragmento scFv, Fv, Fab o Fab'.
3. Un fragmento Fab' de anticuerpo anti FcRn de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 33 y una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20.
4. Un fragmento Fab de anticuerpo anti FcRn de acuerdo con la reivindicación 2, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 29 y una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20.
5. Un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo o fragmento de unión se conjuga a un polímero, por ejemplo, seleccionado de almidón, albúmina y polietilenglicol.
6. Un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el polímero es PEG, por ejemplo, con un peso molecular en el intervalo de 5 a 50 kDa.
7. Un anticuerpo anti FcRn de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.
8. Un anticuerpo anti FcRn de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo de longitud completa se selecciona del grupo que consiste en una IgG1, IgG4 e IgG4 S241P.
9. Un anticuerpo anti FcRn de acuerdo con la reivindicación 1, la reivindicación 7 o la reivindicación 8, que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 37, la SEQ ID NO: 39 y la SEQ ID NO: 73, y una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 20.
10. Un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o fragmento de unión del mismo es un Fab-dsFv que tiene una cadena pesada que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 42 y una cadena ligera que comprende la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 40.
11. Un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que bloquea la unión de la IgG humana al FcRn humano.
12. Un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que no se une a la microglobulina p2 humana (SEQ ID NO: 72).
13. Una secuencia de ADN aislado que codifica la cadena (o cadenas) pesada y ligera de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
14. Un vector de clonación o expresión que comprende una o más secuencias de ADN de acuerdo con la reivindicación 13.
15. Un vector de acuerdo con la reivindicación 14, en donde el vector comprende (i) la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 30, 32, 34 o 36 y la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 21 o 24, o (ii) la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 38 y la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 22, o (iii) la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 74 y la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 22 o (iv) la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 41 y la secuencia proporcionada en la SEQ ID NO: 43.
16. Una célula hospedadora que comprende uno o más vectores de clonación o expresión de acuerdo con la reivindicación 14 o la reivindicación 15.
17. Un procedimiento para la producción de un anticuerpo que tiene especificidad de unión para el FcRn humano, que comprende cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 16 y aislar el anticuerpo.
18. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo anti FcRn o un fragmento de unión del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.
19. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende otros principios activos.
20. Un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición como se define en la reivindicación 18 o 19, para su uso en terapia.
21. Un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición como se define en la reivindicación 18 o 19, para su uso en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria, tal como miastenia grave, pénfigo vulgar, neuromielitis óptica, síndrome de Guillain-Barré, lupus, púrpura trombocitopénica idiopática y púrpura trombocitopénica trombótica.
22. Un anticuerpo o un fragmento de unión del mismo como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición como se define en la reivindicación 18 o 19, para su uso en el tratamiento de la PDIC, polineuropatía paraproteinémica, epilepsia refractaria, anemia hemolítica, síndrome de Goodpasture, incompatibilidad ABO, nefritis lúpica, vasculitis renal, esclerodermia, alveolitis fibrosante, miocardiopatía dilatada, enfermedad de Graves, diabetes de tipo 1, diabetes autoinmunitaria, pénfigo, vasculitis asociadas con anticuerpos ANCA, dermatomiositis, enfermedad de Sjogren o artritis reumatoide.
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