ES2615362T3 - Adhesinas de meningococos - Google Patents

Abstract

Una proteína que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 2 o 5; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene sobre su longitud completa una identidad de secuencia de al menos 95 % con la SEQ ID NO: 2; (c) una secuencia de aminoácidos que tiene sobre su longitud completa una identidad de secuencia de al menos 95 % con la SEQ ID NO: 5; o (d) un fragmento de 200 o más aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 2 o 5. que carece del péptido líder N terminal de SEQ ID NO: 2 o 5; y que carece del anclaje de la membrana C-terminal de SEQ ID NO: 2 o 5.

Description

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La figura 13 muestra el análisis de PCR de la expresión de NadA en diferentes cepas de N. meningitidis. La figura 14 muestra el análisis de inmunotransferencia de la expresión de NadA en diferentes cepas de N. meningitidis.

La figura 15 muestra la variación de la expresión NadA con el tiempo de cultivo. La figura 16 muestra el análisis FACAS de NadA de células de N. meningitidis isogénicas encapsuladas y no encapsuladas. La figura 17 muestra los resultados de inmunofluorescencia obtenidos utilizando células anti-NadA contra las células de Chang (17A a 17C) o células HeLa (17D). La figura 18 muestra los resultados de inmunofluorescencia obtenidos utilizando células anti-NadA contra las células de Chang después de incubación a (A) 37 ºC o (B) 4 ºC. La figura 19 muestra los resultados de inmunofluorescencia para las células de Chang tratadas con saponina. La figura 20 muestra los resultados de inmunofluorescencia obtenidos utilizando monocitos. La figura 21 muestra los resultados de inmunofluorescencia obtenidos utilizando macrófagos. La figura 22 muestra la secreción de IL-α por los monocitos en respuesta al tratamiento con NadA. La figura 23 muestra el efecto de anti-CD 14 sobre la secreción de IL-α por los monocitos. La figura 24 muestra los resultados de inmunofluorescencia obtenidos utilizando anti-NadA contra E coli transformada para expresar NadA. La figura 25 muestra la tinción de E coli transformada usando (A) anti-Nada (B) anti-E coli o (C) ambos. La figura 26 es una representación esquemática de las características de App. Se indican el péptido líder en Nterminal, el dominio pasajero y el β-dominio en C-terminal. Se muestran las posiciones del sitio activo para la serina proteasa, el sitio de unión a ATP /GTP, los dos sitios ricos en arginina y la región rica en prolina. En BOX 1, se muestran los sitios de escisión. En BOX 2 se muestra una comparación de los sitios proteolíticos conocidos de diferentes autotransportadores y se obtiene una firma consenso. Las flechas identifican las escisiones; X = cualquier aminoácido; hid = restos hidrófobos; (A, S) = alanina o serina La figura 27 es una representación esquemática de las construcciones utilizadas para el estudio de App. La figura 28 muestra una transferencia Western de la membrana externa y las proteínas extracelulares en E coli. La figura 29 muestra el análisis FACS de la membrana externa y las proteínas extracelulares en E coli. La figura 30 muestra la inmunofluorescencia de la membrana externa y las proteínas extracelulares en E coli. La figura 31 muestra las proteínas totales de E. coli analizadas mediante SDS-PAGE. La figura 32 muestra una inmunotransferencia de sobrenadantes de cultivo precipitado en bruto utilizando antisuero de ratón contra APP-his. La figura 33 muestra los datos de adhesión de FACS utilizando antisuero de conejo contra E coli. Los porcentajes de células positivas a la adhesión se muestran cerca de los perfiles de fluorescencia. La figura 34 muestra datos de microscopia de inmunofluorescencia que muestran adhesión y agregación bacteriana. La figura 35 muestra la unión dependiente de la concentración de App-His (◆), Appα-His (■) y NMB2132 (▲) expresada como la intensidad de fluorescencia media (IFM) neta. La figura 36 muestra el efecto sobre la unión de App-His (100 μg /ml) de preincubación con pronasa (columnas de la izquierda) o de fosfolipasa A2 (columnas de la derecha) con concentraciones crecientes de la enzima. La pronasa se analizó a 0, 250, 500, 1000 µg/ml; la fosfolipasa A2 se analizó a 0, 50, 200, 800 µg/ml. La figura 37 es una comparación de la especificidad de la unión celular de la proteína App-His a 100, 25 o de 6,25 µg/ml contra varias células diferentes. La figura 38 muestra la asociación de bacterias N. meningitidis MC58 de tipo silvestre o defectuosas en App. La figura 39 muestra un análisis de transferencia Western de lisados totales de Meningitidis MC58 cosechados a 0,5 o 0,8 DO620nm. Las calles 1 y 3 muestran MC58 de tipo silvestre y las calles 2 y 4 muestran las defectuosas en App. La figura 40 muestra un análisis de transferencia Western de sobrenadantes en paralelo a la figura 39.

Ejemplos

Homología de NadA

NadA muestra homología con (a) YadA de Yersinia enteropatógena, una adhesina no asociada a pilus implicada en la virulencia [Cornelis (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:1315–1352.] y (b) UspA2 de Moraxella catarrhalis, una proteína implicada en la resistencia al suero y un antígeno protector [Chen y col., (1999) Infect. Immun. 67:1310– 1316.]. La similitud de secuencia se agrupa principalmente en la región carboxilo terminal (56-63 % de identidad en los últimos 70 aminoácidos). Fuera de esta región el nivel de identidad desciende a 23–25 %.

YadA y UspA2 se han identificado como adhesinas [Hoiczyk y col., (2000) EMBO J 19:5989–5999]. Ambas proteínas forman oligómeros de alto peso molecular (150 a 200 kDa) estables y difíciles de disociar anclados a la membrana externa. También se ha descubierto que NadA forma agregados de alto peso molecular muy estables en la membrana externa de meningococo.

Se analizó la secuencia de aminoácidos de NadA [Nielsen y col., (1997) Protein Engineering 10:1–6; Levin y Garner (1988) Biochim. Biophys. Acta 955:283–295; Berger y col., (1995) PNAS USA 92:8259–8263; Bornberg–Bauer y col., (1998) Nucleic Acids Res. 26:2740–2746]. El análisis de la estructura secundaria se muestra en la Figura 11. Se indican el extremo N globular y el extremo C antipático terminal y C-terminal anfipáticos, así como las posiciones del

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productos de la PCR se analizaron en gel de agarosa al 1 % y los tamaños se determinaron utilizando un marcador de peso molecular 1Kb Plus DNA Ladder (GIBCO). Los fragmentos amplificados se purificaron en una columna Qiaquick (Qiagen) y después secuenciaron en ciclos automáticos (Applied Biosystems modelo 377) mediante paseo cromosómico en ambas hebras en del fragmento amplificado.

Para la transferencia de puntos, la sonda utilizada fue el gen nadA completo, tal como se amplificó a partir de la cepa 2996 y se marcó con digoxigenina utilizando el kit de detección y marcaje de ADN DIG-High Prime de Roche. Se llevó a ebullición un alícuota de 10 µl de suspensión celular de cada cepa durante 10 minutos y se pasaron puntos sobre la membrana de nylon (Boehringer). Las membranas se sometieron a reticulación de ADN mediante exposición en 2' a luz UV y otros procedimientos estándar para la preparación y la detección de señales como indica el fabricante.

El gen nadA estaba ausente en N. gonorrhoeae y en las especies comensales N. lactamica y N. cinerea. No obstante, en N. meningtidis, el 47 % de los aislamientos fueron positivos para su presencia.

La PCR generó (Figura 13) un producto de 1.800 pb de cepas MC58 NadA+ (calle 1), 90/18311 (calle 2) y 2996 (calle 3). Proporcionó un producto de 400 pb en la cepa Z2491 NadA– y NG3 /88 (calle 5). Algunas cepas (por ejemplo, 93/4286, C4678, 2022, ISS1113) dieron un producto de PCR de 2.500 pb (calle 4: L93/4286).

La presencia /ausencia de NadA en N. meningitidis se correlacionó con el linaje de la cepa. Las cepas aisladas de una enfermedad meningocócica invasiva se han clasificado mediante electroforesis de enzimas multilocus (MLEE) en un pequeño número de linajes hipervirulentos: tipos electroforéticos ET37, ET5, clúster A4, linaje III, subgrupos I, III y IV–1 [Achtman (1995) Global epidemiology of meningococcal disease. En la enfermedad meningocócica (Cartwight, ed). John Wiley and Sons, Chichester, Inglaterra. 159–175; Caugant (1998) APMIS 106:505–25]. Recientemente, se ha introducido una clasificación basada en la secuencia, tipificación multilocus de secuencias (MLST), que clasifica las cepas anteriores en los tipos de secuencia ST11, ST32, ST8, ST41, ST1, ST5, ST4, respectivamente [Maiden y col., (1998) PNAS USA 95:3140-3145]. Las cepas aisladas de portadores sanos entran en muchos tipos diferentes de ET y ST.

El gen nadA estaba presente en 51 de las 53 cepas (96 %) de los linajes hipervirulentos ET-5, ET-37 y el clúster A4, mientras que estaba ausente en todas las cepas de linaje III analizadas. Siete de las 25 cepas portadoras fueron positivas. La mayoría de las cepas del serogrupo C analizadas fueron positivas, incluso si no pertenecían a linajes hipervirulentos. Lo mismo puede decirse para las cepas del serogrupo B con serotipo 2a y 2b. Para el serogrupo A, una cepa que pertenece al subgrupo III fue positiva, mientras que las otras dos cepas pertenecientes al subgrupo IV1 fueron negativas.

El linaje III se ha introducido recientemente en Europa y EE.UU. y la segregación geográfica en Nueva Zelanda durante muchos años podría haber mermado su capacidad de adquirir nuevos genes. Por ejemplo, pueden haberse producido mutaciones en las regiones cromosómicas circundantes, lo que evita que se produzcan acontecimientos de recombinación en el linaje III. Otra posible explicación es que las cepas ET-5, ET-37 y clúster A4 necesitan que nadA alcance la idoneidad del pico, mientras que los aislados de linaje III no pueden obtener ningún beneficio significativo de la inserción de nadA, de modo que experimenta una selección negativa.

Por tanto, NadA está sobrerepresentado en tres linajes de N. meningitidis hipervirulentos. Parece que hay un gen extraño presente en una subpoblación de cepas hipervirulentas.

Alelos de NadA

Dado que los productos de la PCR eran de tamaño diferente (Figura 13) y la mayoría de las cepas NadA+ pudieron agruparse en tres tamaños diferentes, los genes se secuenciaron para 36 cepas representativas de cada tamaño: 26 cepas positivas, 4 cepas con un producto de PCR largo y 6 cepas NadA-.

En las cepas negativas, se encontró una secuencia de 16 pb que era idéntica a la secuencia presente en el la secuencia del genoma de serogrupo A publicada.

El análisis de la secuencia de las cuatro cepas de productos PCR largos reveló una interrupción por una sola copia de IS1301, que interrumpía la proteína después de 162 aminoácidos con un codón de terminación. El sitio de inserción era idéntico en las cuatro cepas, pero la orientación de IS1301 difería, lo que era indicativo de acontecimientos independientes. El consenso objetivo para IS1301, 5'–AYTAG–3', se encontró en el gen de NadA en el nucleótido 472, generado por una mutación A–>G y se acompañó de una duplicación de TA.

En las cepas nadA+, el tamaño del gen osciló de 1086 a 1215 pb, con la consiguiente variación de las secuencias de aminoácidos de las proteínas codificadas de 362 a 405 aminoácidos. Fue posible agrupar 22 de los 26 genes de NadA en tres alelos bien definidos (Figuras 9 y 10; Tabla I). La secuencia del gen dentro de cada alelo es idéntica y la identidad global entre los alelos varía de 96 % a 99 %. Este nivel de conservación es sorprendente y sugiere presión selectiva débil y /o una adquisición muy reciente del gen nadA. Esta última posibilidad es coherente con el bajo contenido de G + C del genoma en esta región (véase anteriormente).

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NadA también se encontró en cinco cepas portadoras (NGE28, 65/96, 149/96, 16269, 16282) que no pertenecen a un clúster hipervirulento. Estas cinco cepas compartían una secuencia (SEQ ID de 13 y 14) que no se encontró en las cepas aisladas de pacientes. Este alelo se denomina "alelo C” (portador).

Una alineación del alelo C con los alelos 1 a 3 se muestra en la Figura 9C. La alteración de los segmentos de hélice superenrollada de la proteína es evidente.

A diferencia de los alelos 1 a 3, la proteína del alelo C no forma fácilmente un agregado de alto peso molecular cuando se expresa en E coli. Al igual que los alelos 1 a 3, sin embargo, el alelo C está expuesto en la superficie de

N. meningitidis, porque es un objetivo de los anticuerpos bactericidas producidos contra sí mismo. Sin embargo, estos anticuerpos no son bactericidas contra las cepas portadoras de los alelos 1 a 3; de manera similar, los anticuerpos generados contra los alelos 1 a 3 no son bactericidas contra las cepas del alelo C.

Oligómeros de NadA sobre la superficie celular

En el documento WO01/64922 se indica que NadA forma estructuras oligoméricas. Para estudiar los oligómeros de NadA con más detalle, los lisados de células enteras de N. meningitidis se sondaron mediante transferencia Western.

Las colonias bacterianas [cepas MC58 (alelo 1), 90/18311 (alelo 2), 2996 (alelo 3), L93 /4286 (inserción IS1301) y NG3 /88 (nadA–)] se cultivaron hasta la fase estacionaria en caldo GC suplementado con 0,3 % de glucosa. Se tomaron muestras en diferentes momentos, se sedimentaron mediante centrifugación a 3000 x g durante 10 minutos y se resuspendieron en PBS y se descongelaron /congelado hasta la lisis bacteriana. Cantidades iguales de proteínas se sometieron a SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 12,5 % y se electrotransfirieron a membranas de nitrocelulosa.

Para preparar suero policlonal anti-NadA, el NadA recombinante se expresó y purificó. Las secuencias que codifican los tres alelos de nadA (alelo 1: aa 24–362; alelo 2: aa 24-343; alelo 3: aa 24–350), se amplificaron mediante PCR sobre el ADN cromosómico y se clonaron en el vector pET21b+ (Novagen). Los plásmidos se transformaron en E coli BL21 (DE3) para expresar las proteínas como fusiones de histidina en C-terminal. La expresión de proteínas se indujo a 30 ºC mediante la adición de IPTG 1 mM a una DO600nm de 0,3 y el crecimiento de las bacterias durante un período adicional de 3 horas; la expresión se evaluó mediante SDS-PAGE. Las proteínas de fusión recombinantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad en resina Sepharose 4B de flujo alto quelante conjugada a Ni2+. Se usaron 20 µg de proteína purificada para inmunizar ratones CD1 hembra de seis semanas de edad (de 4 a 6 por grupo). Las proteínas se administraron por vía intraperitoneal, con adyuvante completo de Freund (ACF) para la primera dosis y adyuvante incompleto de Freund (AIF) para la segunda (día 21) y la tercera (día 35) dosis de refuerzo. Se tomaron muestras de sangre el día 49 y se utilizaron para el análisis serológico.

Las transferencias mostraron una banda reactiva de alto peso molecular en las cepas MC58 (Figura 14, calle 1), 90/18311 (calle 2) y 2996 (calle 3). La banda estaba ausente en la cepa NG3 /88 (calle 5). La ebullición del tampón de muestra hasta 40 minutos no cambió el patrón. El tamaño diferente de las proteínas fue consistente con el tamaño de los alelos. Dado el tamaño esperado de 35 a 40 kDa de las proteínas monoméricas, el alto PM de la banda observada podría explicarse por la presencia de una forma oligomérica de NadA. Esta posibilidad está avalada por el hecho de que en una cepa que contiene la inserción IS1301, que codifica una proteína más corta de 162 aminoácidos y carece de la mayor parte de la región de hélice superenrollada, la banda reactiva de PM alto estaba ausente y sustituida por una banda de 14,5 kDa (Figura 14, calle 4), consistente con el peso molecular predicho de la proteína monomérica procesada.

Aunque la proteína oligomérica se encontró en todas las cepas que contenían un gen funcional, los niveles de expresión variaron de una cepa a otra (Tabla 1). Por otra parte, la cantidad de proteína NadA variaba dentro de la misma cepa durante el crecimiento.

Se siguió el crecimiento de cuatro cepas diferentes (MC58, 2996, C11, F6124), elegidas como representativas de diversos niveles de expresión de NadA, hasta la fase estacionaria. La Figura 15 muestra el crecimiento de dos de las cepas analizadas (15A: MC58, con baja expresión de NadA; 15B: 2996, con alta expresión de NadA), mostrando la curva una DO600. Las transferencias Western de las muestras tomadas en cada punto de la curva de crecimiento a DO600 mostraron que la banda de NadA era apenas visible al comienzo del crecimiento y se hizo más intensa durante el crecimiento, hasta su máximo, en fase estacionaria. Todas las cepas analizadas mostraron el mismo comportamiento dependiente de la fase de crecimiento.

También se observó NadA de PM alto en transferencias Western de vesículas de membrana externa, de acuerdo con que la NadA está anclada a la membrana externa.

Del mismo modo, el análisis FACS en bacterias vivas durante el crecimiento en fase logarítmica mostró que NadA estaba disponible para la unión del anticuerpo en la superficie de las bacterias. La intensidad de FACS en una cepa con una cápsula polisacárida (cepa nmb) se redujo 1 log en comparación con una cepa mutante no encapsulada isogénica (M7), pero la proteína se expuso en la superficie y estaba disponible para la unión en ambas cepas (Figura 16).

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NadA forma oligómeros expuestos en la superficie, que son estables al calor, SDS y a la reducción con βmercaptoetanol. Dado que la forma madura carece de restos de cisteína, la formación de enlaces disulfuro no puede participar en este fenómeno; más bien esto es consistente con la estructura de hélice superenrollada predicha y la presencia de motivos de cremallera de leucina que pueden participar en las interacciones intermoleculares entre monómeros [Lupas (1996) Trends Biochem. Sci. 21:375–382; O'Shea y col., (1991) Science 254:539-544]. El tamaño de los oligómeros es de aproximadamente 170 kDa, lo que sugiere una estructura tetramérica.

Documento [WO01/64922]. Sin embargo, es probable una estructura de hélice superenrollada rígida tenga una migración anómala es SDS PAGE y, por lo tanto, la forma de 170kDa puede ser un trímero.

Inmunogenicidad protectora

El suero policlonal anti–NadA se analizó para determinar la actividad bactericida como se ha descrito anteriormente [Pizza y col., (2000); Peeters y col., (1999) Vaccine 17:2702–2712], con suero de conejo neonato combinado (CedarLane), utilizado como fuente de complemento. El título bactericida en suero se definió como la dilución de suero que da como resultado una disminución del 50 % en las unidades formadoras de colonias (UFC) por ml después de 60 minutos de incubación de las bacterias en la mezcla de reacción, en comparación con las UFC de control por ml a tiempo 0. Típicamente, las bacterias incubadas con el anticuerpo de control negativo en presencia de complemento mostraron un aumento del 150 al 200 % en las UFC /ml durante los 60 minutos de incubación.

Los resultados fueron los siguientes:

Cepa

Expresión de NadA Alelo Título bactericida

2996

+++ 3 32768

C11

+++ 3 16384

F6124

+ 3 4096

MC58

+ 1 8192

BZ232

– – <4

NGH38

– – <4

Como se muestra, el suero indujo la muerte mediada por el complemento de todas las cepas que tenían el gen nadA y estaba inactivo contra las cepas que no tenían el gen. Sin embargo, los títulos bactericidas variaron entre cepas. Los títulos fueron mayores frente a las cepas que expresaban mayores cantidades de proteína. Este resultado se confirmó cuando los títulos se determinaron en las fases temprana y tardía de crecimiento (Figura 15).

Para comprobar si las diferencias en la actividad bactericida se debían a secuencias de los alelos diferentes, se produjeron sueros inmunitarios, producidos contra los tres tipos de NadA, y se utilizaron en un ensayo bactericida cruzado. Los resultados obtenidos con los antisueros fueron similares a los que se han mostrado anteriormente, lo que sugiere que la actividad bactericida no está influida por la diversidad de los alelos sino más bien por el nivel de expresión del antígeno.

La capacidad de los sueros inmunitarios para proteger a los animales de la bacteriemia durante la infección también se analizó, utilizando el modelo de rata lactante. Los sueros utilizados se obtuvieron inmunizando cobayas con 50 µg de rNadA purificado (alelo 3). La inmunización de ratas Wistar no consanguíneas (de 5 a 7 días de edad) se realizó por vía subcutánea junto con ACF para la primera dosis y AIF para las otras tres dosis (días 28, 56, 84). Se tomaron muestras de sangre el día 105 y se utilizaron para el ensayo de protección animal.

Se realizaron dos experimentos con dos cepas de MenB diferentes (8047 y 2996). Cada cepa se ha pasado en serie tres veces en crías de rata. En el Experimento 1, grupos de cuatro ratas fueron expuestos por vía intraperitoneal a 100 µl de una mezcla de (a) bacterias de la cepa 8047 (7x103 UFC por rata) y (b) antisuero de cobaya inactivado con calor o mAb de control anti-cápsula (SEAM 3 [Van Der Ley y col., (1992) Infect. Immun. 60:3156]). En experimento 2, se trató al grupo de seis ratas con los mAb de control o con diferentes diluciones de antisuero de cobaya a tiempo 0. Dos horas más tarde, fueron expuestos a las bacterias 2996 (5,6 x 103 UFC por rata). En ambos experimentos, los cultivos de sangre se obtuvieron 18 horas después de la exposición mediante punción en el corazón con una jeringa y una aguja con aproximadamente 25 U de heparina sin conservante. El número de bacterias en los cultivos de sangre se obtuvo mediante cultivo en placas de 1, 10 y 100 µl de sangre en agar chocolate durante la noche. Para el cálculo de la media geométrica de las UFC /ml, a los animales con cultivos estériles se les asignó un valor de 1 UFC /ml.

Los resultados fueron los siguientes:

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activa; el dominio 3 es el dominio translocador en C-terminal con estructura de barril β.

En el N-terminal del dominio pasajero, His–115, Asp–158 and Ser–267 corresponden a la tríada catalítica de la serina proteasa His–98, Asp–140 y Ser–243 de Hap [Fink y col., (2001) J Biol Chem 276:39492–39500]. Los restos 285-302 son un supuesto sitio de unión a ATP /GTP (bucle P), que sugiere un mecanismo de acoplamiento de energía para la translocación de la membrana externa. Hacia el C-terminal del dominio pasajero, hay dos regiones ricas en Arg presentes. La primera (RRSRR) consiste en los restos 934-938 y la segunda (RRARR) comienza en el resto 1149. Estos motivos son una reminiscencia de las dianas conocidas para los sitios de escisión proteolítica de tipo tripsina, tales como el de la toxina de la difteria y los de aguas arriba de los sitios de autoescisión de Hap de H. influenzae, la IgA-proteasa de N. gonorrhoeae y FhaB de B. pertussis (Figura 26, recuadro 1). Aguas abajo de las regiones ricas en Arg son motivos 954NTL956 y 1176NS G1178, que son idénticos o similares a los sitios de escisión en los autotransportadores Ssp (Serratia marcescens), Prn (Bordetella bronchiseptica), Brka (Bordetella pertussis) [Jose y col., (1995) Mol. Microbiol. 18:378–380] y Hap (H. influenzae) (Figura 26, recuadro 2). En conjunto, estos motivos

and 1176NSG1178

de secuencia sugieren que los dos motivos 954NTL956 y el patrón RR(A,S,R)2RR podrían actuar como señales para la correcta localización de los sitios de procesamiento aguas abajo.

Un análisis más detallado de la secuencia de App muestra una región rica en prolina, en la que el motivo dipeptídico PQ se repite cuatro veces comenzando en el resto 1156. Una búsqueda de homología con secuencias de proteínas conocidas revela alguna similitud con las proteínas de superficie de S. pneumonie PspA y PspC y a una región rica en prolina de la proteína pertactina de membrana externa de B. pertussis p69, en la que el motivo (PQP)5 se encuentra en un bucle que contiene el principal epítopo inmunoprotector.

Finalmente, los últimos tres aminoácidos de App (YRW) son idénticos a los de Hap, en los que se han descritos como cruciales para la localización en la membrana externa y la estabilidad proteica [Hendrixson y col., 1997].

Expresión en E. coli sin parejas de fusión

Se clonaron los genes de longitud completa ORF40, App y NadA en el vector pET21b+ y los plásmidos se transformaron e E. coli BL21(DE3) n el fin de expresar los genes bajo el control del promotor T7. La expresión se consiguió mediante la activación del promotor con IPTG o en condiciones no inducidas. La localización y la exposición en la superficie de las proteínas se analizaron mediante experimentos de fraccionamiento celular (SDS-PAGE y transferencia Western), análisis FACS e inmunotransferencia de células enteras. Como se muestra en las figuras 1 a 3, las tres proteínas se translocan a la superficie de E coli:

-ORF40 se expresa como forma monomérica y, posiblemente, también las formas multímeros (Figura 1).

-La App se exporta a la membrana externa de E coli como un precursor de aproximadamente 160 kDa, que se procesa y se secreta en el sobrenadante del cultivo (Figura 2).

-Se encuentra que NadA está presente en la fracción de membrana externa como una única banda de alto

peso molecular de aproximadamente 180 kDa. Esto probablemente corresponde a una forma oligomérica de

la proteína. Dicha banda está ausente en E. coli que expresa NadA intracelular (Figura 3).

Se estudió la expresión de App con más detalle.

El ADN genómico de la cepa 2996 de N. meningitidis se preparó como se ha descrito anteriormente [Tinsley y Nassif (1996) PNAS USA 93:11109–11114]. El ADN desprovisto de la secuencia que codifica el péptido señal (aminoácidos 1 a 42) y del codón de TERMINACIÓN se amplificó utilizando los cebadores para la PCR de las SEQ ID 18 y 19, seguido de la digestión con NheI y XhoI y la inserción en los sitios NheIlXhoI del vector de expresión pET-21b, para dar “pET–App–His” (Figura 27). Este plásmido se introdujo en E coli BL21 (DE3) y se usó para la expresión de una proteína de fusión marcada con His en C-terminal, que se purificó y se utilizó para generar anticuerpos. El gen app de longitud completa se amplificó y se clonó de una manera similar, utilizando cebadores para PCR de las SEQ ID 20 y 21, para dar el plásmido “pET–App”.

Los plásmidos se introdujeron en E coli BL21 (DE3) y la expresión se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM. La proteína expresada se detectó mediante transferencia Western (Figura 28, calle 1). Para comprobar que la proteína se exportó a la superficie de E coli, se utilizaron FACS (Figura 29) y microscopia de inmunofluorescencia (Figura 30). El análisis FACS mostró expresión en la superficie positiva en los transformantes pET-App (gen de longitud completa), pero ninguna expresión en la superficie con App-His (sin péptido señal) o con el vector vacío. Los resultados de inmunofluorescencia coincidían con los del análisis FACS. Por lo tanto, la expresión del gen app de longitud completa dio lugar a la exportación de App a la superficie de E coli, pero la deleción de los primeros 42 aminoácidos abolió la localización en la superficie.

El análisis de transferencia Western de las proteínas de membrana externa de los transformantes pET-App reveló una banda reactiva específica de ~ 160 kDa (Figura 28, calle 1), correspondiente al peso molecular predicho de la proteína de longitud completa. Una banda correspondiente faltaba en la fracción de la membrana externa de los controles no transformados (calle 3). El análisis de transferencia Western de los sobrenadantes del cultivo reveló una proteína secretada de ~ 100 kDa con pET-App (calle 2) que estaba ausente con los controles no transformados

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µg/ml) o con GNA2132 (300 µg/ml) como control negativo [véase Pizza y col., (2000)]. La unión se detectó mediante FACS utilizando antisueros policlonales contra las proteínas recombinantes individuales y un anticuerpo secundario conjugado con PE. Los cambios de la señal de FACS (Figura 5) muestran que las tres proteínas son capaces de unirse a las células epiteliales humanas, mientras que GNA2132 purificado (control negativo) no lo hace.

La Figura 6A muestra que la unión aumenta de una manera dependiente de la dosis. La unión de NadA alcanza una meseta a aproximadamente 200 μg /ml. GNA2132 no puede unirse incluso a 400 µg/ml (Figura 6B). Los datos en la figura 6 son los valores de intensidad media de fluorescencia (IMF) representados frente a la concentración de la proteína (µg/ml).

Usando FACS, la unión de NadA a las células también se observó con células Hep-2 y MOLT-4, pero no con células HeLa, A549, HEC-1B, Hep-G2, CHO o HUVEC. La adhesión a las células Chang podría anularse mediante el tratamiento de las células con pronasa, lo que indica que el receptor humano para NadA es una proteína.

También se observó adhesión de la proteína NadA purificada a las células de la conjuntiva de Chang mediante microscopia de inmunofluorescencia. La proteína (que carece de su dominio de anclaje C-terminal) se incubó con células de Chang a 37 ºC en medio de cultivo completo durante 3 horas a varias concentraciones. Después, las células se lavaron, se fijaron y se analizaron por microscopia confocal láser después de la tinción con anticuerpos policlonales anti-NadA de ratón y anticuerpos secundarios IgG anti-ratón acoplados a rojo Texas. No se observó unión a 0 nm (figura 17A), pero la unión fue evidente a 170 nm (17B) y 280 nm (17C), con la agrupación evidente a concentraciones más altas. Por el contrario, no se observó unión de NadA con células HeLa, incluso en la proteína 280 nm (17D).

La unión fue mucho más evidente a 37 ºC (figura 18A) que a 4 ºC (figura 18B). Las estructuras en forma de puntos observadas a 4 ºC, en comparación con los clústeres a 37 ºC, sugieren que las interacciones laterales entre monómeros de NadA son dependientes de la temperatura (influido por la fluidez de la membrana).

Para distinguir la proteína de superficie y la endocitada, se añadió detergente saponina durante el procedimiento de tinción. Los clústeres intracelulares que tienen el tamaño de los endosomas fueron más evidentes (flecha) cuando se utilizó saponina, pero una alta proporción de proteína se mantuvo en la superficie celular (figura 19).

La inmunofluorescencia reveló también que NadA se une a monocitos (Figura 20A). NadA solo (sin anticuerpo de tinción; 20B) y NadA teñida con suero preinmune (20C) no eran visibles. A gran aumento, se observaron signos de absorción en vesículas (ya sea endosomas o fagosomas).

La figura 21 muestra que los macrófagos murinos (raw 264,7) se unen a NadA y lo endocitan (125 nM, 3 horas, 37 ºC; células cultivadas en DMEM).

El calentamiento de NadA a 95 ºC durante 15 minutos antes de la incubación eliminó su capacidad de unirse a los monocitos, medido mediante la secreción de IL-α por las células (figura 22). Por tanto, la actividad estimuladora de las preparaciones de NadA es termolábil. La actividad estimulante también se bloqueó mediante el uso de anti-CD14 (figura 23) o mediante la eliminación de NadA de las preparaciones usando anti-NadA inmovilizado en perlas.

También se usó microscopia de inmunofluorescencia para detectar la unión de E coli que expresa NadA. E. coli transformada se unió fuertemente (figura 24A), mientras que las bacterias no transformadas no (24B). La liberación de IL-α por los monocitos era más de 1,5 veces más alto usando E coli transformada que las bacterias no transformadas con una relación de bacterias /monocitos de 40:1.

Las E coli transformada se unieron a cubreobjetos de vidrio, se fijaron y se sometieron a tinción doble con anti–NadA (figura 25A) y anticuerpos anti-E coli (25B). Cuando se utilizaron ambas, los parches de anti-NadA fueron visibles, lo que sugiere que NadA tiende a formar agregados en la superficie bacteriana, que dificultan la interacción de los anticuerpos con otros antígenos de superficie.

En cuanto a APP, las cepas de E coli recombinante se incubaron con monocapas de células epiteliales de la conjuntiva de Chang (derivado de Wong-Kilbourne, clon 1-5 C-4 [conjuntiva humana], ATCC CCL 20.2), y se analizó la adhesión mediante FACS. Las células obtenidas a partir de monocapas confluentes se sembraron a 105 células por pocillo en placas de cultivo tisular de 12 pocillos y se incubaron durante 24 horas. Los cultivos de bacterias después de la inducción con IPTG se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en DMEM + 1 % de FBS a una concentración de 5x108 bacterias por ml. Se añadieron alícuotas de 1 ml de cada cepa a cultivos en monocapa de células de Chang y se incubaron durante 3 horas a 37 ºC en 5 % de CO2. Las bacterias no adherentes se eliminaron lavando tres veces con PBS, y se añadieron 300 µl de solución de disociación celular (Sigma) a cada pocillo de microtitulación. La incubación continuó a 37 ºC durante 10 minutos. Se recogieron las células y después se incubaron durante 1 hora a 4 ºC con antisuero anti–E. coli policlonal de conejo (DAKO). Las células se lavaron dos veces en PBS + 5 % de FBS y se incubaron durante 30 minutos a 4 ºC con IgG anti-conejo conjugada con ficoeritrina (Jackson ImmunoRescarch Laboratories). Después, las células se lavaron en PBS + 5 % de FBS y se resuspendieron en 100 µl de PBS. Se midió la fluorescencia con citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson). Para cada uno del perfil de fluorescencia, se analizaron 10.000 células.

imagen10

que toda la subclonación se hubo completado, la cepa MC58 de N. meningitidis competente naturalmente se transformó mediante la selección de unas colonias cultivadas durante la noche en placas de agar GC y se mezclaron con 20 µl de Tris HCl 10 mM a pH 8,5 que contiene 1 µg de ADN plasmídico. La mezcla se pasó a una placa de agar GC, se incubó durante 6 horas a 37 ºC, 5 % de CO2, a continuación se diluyó en PBS y se extendió en placas de

5 agar GC que contenían 5 µg /ml de eritromicina. El gen app de deleción en el genoma de MC58 se confirmó mediante PCR. La falta de expresión de App se confirmó mediante análisis de transferencia Western.

La adhesión de MC58 de tipo silvestre y la cepa mutante MC58Δapp isogénica se evaluó en las células de Chang. Se produjo una reducción ~ 10 veces (que varía de 3 a 27 veces en diferentes experimentos) de la asociación de los mutantes defectivos en comparación con la cepa de tipo silvestre (Figura 38). No se observaron diferencias entre el

10 mutante app– y la cepa parental con las líneas celulares Hep2 y 16HBE14o y con las células endoteliales HUVEC, confirmando que App no participa en la adhesión a estas células.

No se han notificado anteriormente adhesinas sin pilus que contribuyen a la adhesión de N. meningitidis en un fondo encapsulado.

Se estudió la expresión de App con N. meningitidis MC58. Las colonias de las placas cultivadas durante la noche se

15 diluyeron en caldo GC y se incubaron a 37º C con 5 % de CO2. Se tomaron muestras cuando DO620nm = 0,5 (fase log media) y 0,8 (fase estacionaria) y se analizaron mediante transferencia Western. Dos bandas con pesos moleculares aparentes ~ 160 y ~140 kDa se detectaron en lisados de células enteras de bacterias en fase log (Figura 39, calle 1), mientras que las bacterias en fase estacionaria mostraron solamente una banda débil en ~140 kDa (calle 3). Como era de esperar, no se observó App en el mutante ΔApp (calles 2 y 4).

20 En marcado contraste, las muestras de sobrenadante de MC58 tipo silvestre mostraron una banda a ~140 kDa y su importe fue superior en fase estacionaria que en la fase log (Figura 40, calles 3 y 1). La muestra de la fase estacionaria también mostró una banda reactiva a ~ 100 kDa.

Debe entenderse que la invención se ha descrito anteriormente únicamente a modo de ejemplo y que se pueden realizar modificaciones permaneciendo dentro del alcance de las reivindicaciones.

25 TABLA I – Características de 26 cepas de N. meningitidis y su alelo del gen nadA

Cepa

Tipo de serogrupo: subtipo Grupo clonal Alelo de nadA Repeticiones (TAAA) Expresión de NadA

64/69

NG:15:P1,7,16 ET–5 1 4 +

BZ83

B:15 ET–5 1 5 +++

CU385

B:4:P1,15 ET–5 1 6 ++

MC58

B:15:P1,7,16b ET–5 1 9 +

BZ169

B:15:P1,16 ET–5 1 12 ++

95330*

B:4:P1,15 ET–5 1 9 nr

ISS1104

B:15:P1,7,16 nr 1 4 +

ISS1071

B:15:P1,7,16 nr 1 5 +++

ISS832

B:15:P1,7 nr 1 5 ++

NM119

B.4.P1,15 nr 1 6 nr

NM066

B:15:P1,7,16 nr 1 12 nr

90/18311

C:NT:P1,5 ET–37 2 9 ++

NGP165

B:NT:P1,2 ET–37 2 9 ++

FAM18

C:2a:P1,5,2 ET–37 2 9 nr

M986

B:2a:P1,5,2 ET–37 2 12 ++

(continuación)

Cepa

Tipo de serogrupo: subtipo Grupo clonal Alelo de nadA Repeticiones (TAAA) Expresión de NadA

ISS1024*

C:2b:P1,5 nr 2 9 ++

ISS838

C:2a:P1,5,2 nr 2 6 ++

PMC8

C: nr 2 10 ++++

961–5945

B:2b:P1,21,16 A4 2 12 +++

ISS759*

C:2b:P1,2 nr 3 8 ++++

F6124

A Subgrupo III 3 9 +

nmb

B:2b:P1,5,2 nr 3 12 ++

8047

B:2b:P1,2 nr 3 12 +++

2996

B:2b:P1,5–1,2 nr 3 12 +++

C11

C:NT:P1,1 nr 3 12 +++

973–1720*

C:2b:P1,2 A4 3 12 +++

* Indica que la cepa transporta una variante menor del alelo relevante nr = no realizado

TABLA II – Características de las cepas de N. meningitidis analizadas para determinar la expresión de NadA

ST

ET Cepa Año Tipo de País Enfermedad Gen NadA

serogrupo:subtipo

74

ET5 MC58 1985 B:15:P1,7,16b Reino Unido caso +

32

ET5 H44/76 1976 B:15:P1,7,16 Noruega caso +

32

ET5 BZ169 1985 D:15:P1,16 Países Bajos caso +

32

ET5 30/00 2000 B:15:P1,7,16 Noruega caso +

33

ET5 N44/89 1989 B:4,7:P1,19,15 Brasil caso +

34

ET5 BZ83 1984 B:15 Países Bajos caso +

–

ET5 72/00 2000 B:15:P1,7.13 Noruega caso +

–

ET5 39/99 1999 C:15:P1,7.16 Noruega caso +

–

ET5 M4102 1996 B:ND EE.UU. caso +

–

ET5 95330 1995 B:4:P1,15 Canadá caso +

–

ET5 2201731 1993 NG:4:P1,15 Islandia vehículo +

–

ET5 64/96 1996 NG:15:P1,7,16 Noruega vehículo +

–

ET5 CU385 1980 B:4:P1,15 Cuba caso +

–

ET5 8680 1981 B Chile caso +

–

ET5 204/92 1992 B Cuba caso +

–

ET5 EG329 1985 B Alemania caso +

–

ET5 NG080 1981 B Noruega caso +

–

ET5 NG144/82 z2 B Noruega caso +

–

ET5 NG PB24 1985 B Noruega caso +

–

ET5 196/87 1987 C Noruega caso +

–

ET5 Mk521/99 1999 B Costa de Marfil caso +

–

ET5 GR 4/00 2000 Grecia caso +

11

ET37 FAM18 1983 C:2a:P1,5,2 EE.UU. caso +

11

ET37 L93/4286 1993 C Reino Unido caso +

–

ET37 NGP165 1974 B:NT:P1,2 Noruega +

–

ET37 M986 1963 B:2a:P1,5,2 EE.UU. caso +

–

ET37 C4678 1998 C:2a:P1,5,2 Alemania caso +

–

ET37 95N477 1995 B:2a:P1,2 Australia caso

–

imagen11

(continuación)

ST

ET Cepa Año Tipo de País Enfermedad Gen NadA

serogrupo:subtipo

35

otro SWZ107 1986 B:4:P1,2 Suiza caso –

36

otro MGH38 1988 B:NT:P1,3 Noruega vehículo –

38

otro BZ232 1964 B:NT:P1,2 Países Bajos caso –

39

otro E26 1988 X Noruega vehículo –

43

otro NGH15 1988 B:8:P1,15 Noruega vehículo –

47

otro NGH36 1988 B:8:P1,2 Noruega vehículo –

48

otro BZ147 1963 B:NT Países Bajos caso –

49

otro 297–0 1987 B:4:P1,15 Chile vehículo –

540

otro 2996 1975 B:2b:P1,5–1,2 Reino Unido caso +

1034

otro 96/1101 1996 C:14:P.1,1,7 Bélgica caso –

–

otro 15 1990 B:14,19:P1,9,15 Eslovenia caso

–

–

otro M1090 1996 B:4 Israel caso

–

–

otro M1096 1996 C:NT:P1,5 Israel caso

–

–

otro B3937 1995 B:22:P1,16 Alemania caso +

–

otro 31 1993 B:4 Finlandia caso

–

–

otro 95074 1995 B:NT:P1,13 Canadá caso +

–

otro 660/94 1994 B:4:P1,6 Algeria caso

–

–

otro 30/93 1993 B:14:P1,14 Argentina caso

–

–

otro 24370 1996 B:ND Sudáfrica caso

–

–

otro 2411751 1993 NG:21:P1,16 Islandia vehículo

–

–

otro 1712741 1993 NG:15:– Islandia vehículo

–

–

otro 65/96 1996 B:4:P1,14 Noruega vehículo +

–

otro 66/96 1996 B:17:P1,15 Noruega vehículo

–

–

otro 149/96 1996 B:1,19:P1,5,2 Bélgica vehículo +

–

otro 16060 1991 B:4:P1,14 Bélgica vehículo

–

–

otro 16489 1991 NG:21:P.1,1 Noruega vehículo

–

–

otro 16990 1991 NG:14:P1,5.2,6 Noruega vehículo

–

–

otro 2022 1991 NG:4:P1,10 Noruega vehículo +

–

otro M136 1968 B:11:P1,15 EE.UU. caso

–

–

otro 860060 1988 X Holanda caso

–

–

otro NG H41 1986 B Noruega vehículo

–

–

otro NG G40 1988 B Noruega vehículo

–

–

otro NG4/88 1988 B Noruega caso

–

–

otro EG 327 1985 B DDR caso

–

–

otro EG 328 1985 B DDR caso

–

–

otro 3906 1977 B China caso

–

–

otro NG E30 1988 B Noruega vehículo

–

–

otro 71/94 1994 Y Noruega caso

–

–

otro DK24 1940 B Dinamarca caso

–

–

–

C11 1965 C :16 :P1,7a,1 Alemania – +

–

–

pmc8 – C – – +

–

–

nmb 1968 B:2b:P1,5,2 EE.UU. caso +

–

–

8047 1978 B:26:P1,2 EE.UU. caso +

–

–

S3446 1972 B:14:P1,23,14 EE.UU. caso

–

–

–

ISS 749 1996 B:14:P1,13 Italia caso

–

–

–

ISS 759 1996 C:2b:P1,2 Italia caso +

–

–

ISS 832 1997 B:15:P1,7 Italia caso +

–

–

ISS 838 1997 C:2a:P1,5,2 Italia caso +

–

–

ISS1001 1999 B:14:P1,13 Italia caso

–

–

–

ISS1024 2000 C:2b:P1,5 Italia caso +

–

–

ISS1026 2000 B:4:P1,13 Italia caso

–

–

–

ISS1071 2000 B:15:P1,7,16 Italia caso +

–

–

ISS1102 2000 B:15:P1,4 Italia caso

–

–

–

ISS1104 2000 B:15:P1,7,16 Italia caso +

–

–

ISS1106 2000 B:4:P1,4 Italia caso

–

–

–

ISS1113 2000 C:2a:P1,5 Italia caso +

–

–

N1002/90 – – Brasil – +

–

–

IMC2135 – – Brasil – +

–

–

NM001 – B:4:P1,4 Reino Unido caso

–

–

–

NM002 – B:NT:P1,16 Reino Unido caso

–

–

–

NM004 – B:NT:P1,14 Reino Unido caso

–

–

–

NM008 – B:4:P1,4 Reino Unido caso

–

(continuación)

ST

ET Cepa Año Tipo de País Enfermedad Gen NadA

serogrupo:subtipo

–

–

NM009/10 – B:4:P1,3,6 Reino Unido caso

–

–

–

NM021 – B:4:P1,16 Reino Unido caso

–

–

–

NM036 – C:2a:P1,10 Reino Unido caso +

–

–

NM037 – B:2b:P1,10 Reino Unido caso +

–

–

NM050 – B:NT:P1,9 Reino Unido caso

–

–

–

NM058 – B:NT:NST Reino Unido caso

–

–

–

NM066 – B:15:P1,7,16 Reino Unido caso +

–

–

NM067 – C:2a:NST Reino Unido caso +

–

–

NM069 – B:15:P1,7,16 Reino Unido caso +

–

–

NM081 – C:2a:P1,5,2 Reino Unido caso +

–

–

NM088 – C:2a;P1,5.2 Reino Unido caso +

–

–

NM092 – B:4:P1,4 Reino Unido caso

–

–

–

NM106 – B:NT:P1,4 Reino Unido caso

–

–

–

NM107/8 – B:4:P1,4 Reino Unido caso

–

–

–

NM117 – B:21:P1,9 Reino Unido caso

–

–

–

NM119 – B:4:P1,15 Reino Unido caso +

–

–

NM131 – B Reino Unido caso

–

–

–

NM145 – C Reino Unido caso +

–

–

NM154 – C:NT:P1,5.2 Reino Unido caso +

–

–

NM156 – B:15:P1,16 Reino Unido caso +

–

–

NM167 – B Reino Unido caso

–

–

–

NM184 – B:NT:P1,5,2 Reino Unido caso

–

–

–

NM186 – B Reino Unido caso

–

–

–

NM188 – B Reino Unido caso +

–

–

NM200 – B:4:P1,4 Reino Unido caso

–

TABLA III – LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ ID NO:

DESCRIPCIÓN

1

alelo 1 de 961

2

alelo 2 de 961

3

alelo 3 de 961

4

alelo 1 de 961 (primer –ATG de iniciación)

5

alelo 2 de 961 (primer –ATG de iniciación)

6

alelo 3 de 961 (primer –ATG de iniciación)

7

Alelo variante 2 de 961 en la cepa ISS1024

8

Alelo variante 2 de 961 (primer ATG de iniciación) en la cepa ISS1024

9

Alelo variante 3 de 961 en las cepas 973–1720 e ISS759

10

Alelo variante 3 de 961 (primer ATG de iniciación) en las cepas 973–1720 e ISS759

11

Quimera ½ del alelo 961 (cepa 95330)

12

Quimera ½ del alelo 961 (cepa 95330) (primer ATG de iniciación)

13

Alelo C de 961

14

alelo c de 961 (primer –ATG de iniciación)

15

Secuencia de codificación para la SEQ ID 13

16–31

Cebadores de PCR

32

SEQ ID 650 del documento WO99/24578

33–39

Derivados del dominio de la SEQ ID 32

Claims (1)

1. imagen1