ES2614510T3

ES2614510T3 - Método y composiciones para la reparación del cartílago usando un biorreactor in vivo

Info

Publication number: ES2614510T3
Application number: ES07763383.2T
Authority: ES
Inventors: Lionel C. Sevrain; Sylvie Y. Verdier-Sevrain
Original assignee: Spinalcyte LLC
Current assignee: Spinalcyte LLC
Priority date: 2006-02-07
Filing date: 2007-02-05
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2027-02-05
Also published as: CN102389344B; CN101500512B; EP3146939A1; US20100285093A1; JP6151006B2; US9320776B2; AU2007212085A1; CA2925550C; EP3146939B1; US20100216210A1; EP1989289A2; CA2641170C; US8728495B2; US10052410B2; US8298560B2; US7850983B2; JP2015131155A; CA2641170A1; US20180318466A1; US10806824B2

Abstract

Un método ex vivo de preparación de una composición de células/armazón, en el que las células son condrocitos o células de tipo condrocito, comprendiendo el método: fijar las células capaces de diferenciarse en una célula de tipo condrocito a un armazón; encapsular las células por medio de dos membranas biopoliméricas biodegradables en forma de globo expandibles; y someter las células a tensión mecánica.

Description

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DESCRIPCION

Metodo y composiciones para la reparacion del cartflago usando un biorreactor in vivo

La presente invencion se refiere en general al menos a los campos de la medicina, cirugfa, anatomfa, biologfa, biologfa celular y/o biologfa molecular. En aspectos particulares, la presente invencion se refiere a los campos de la reparacion del cartflago, tales como la reparacion del cartflago articular. Mas particularmente, el campo de la invencion se refiere a dispositivos de encapsulacion de matriz celular para el cultivo, proliferacion y/o diferenciacion de las celulas en celulas de tipo condrocito bajo estres mecanico.

Normalmente, el cartflago articular es un tejido que no se regenera de manera natural una vez danado. Recientemente, se han hecho esfuerzos para reconstruir los tejidos biologicos danados mediante la regeneracion de una parte de los tejidos danados en el laboratorio. Este enfoque, que se define como “ingenierfa de tejidos” ha suscitado una enorme atencion.

La ingenierfa de tejidos implica el desarrollo de materiales biocompatibles capaces de interactuar especfficamente con tejidos biologicos para producir equivalentes de tejidos funcionales. La ingenierfa de tejidos tiene como concepto basico recoger un tejido deseado de un paciente, aislar celulas de la muestra de tejido, proliferar las celulas, sembrar las celulas proliferadas en un armazon polimerico biodegradable, cultivar las celulas durante un perfodo predeterminado in vitro y trasplantar de nuevo la construccion celula/polfmero en el paciente. Despues del trasplante, las celulas en el armazon trasplantado usan oxfgeno y nutrientes obtenidos por difusion de los fluidos corporales para proliferar y diferenciarse para formar un tejido nuevo a medida que el armazon se disuelve.

El armazon usado para la regeneracion de tejido biologico normalmente se compone de un material que sirve de matriz para permitir que las celulas se unan a la superficie del material y formen un tejido tridimensional. Este material debe ser no toxico, biocompatible y biodegradable. Los polfmeros biodegradables mas ampliamente usados, que cumplan los requisitos ffsicos antes mencionados, incluyen polfmeros organicos tales como acido poliglicolico (PGA), acido polilactico-co-glicolico (PLGA), poli-£-caprolactona (PCL), poliaminoacidos, polianhfdridos, poliortoesteres; hidrogeles naturales tales como colageno, acido hialuronico, alginato, agarosa, quitosano; hidrogeles sinteticos tales como poli(oxido de etileno) (PEO), poli(alcohol vinflico) (PVA), poli(acido acrflico) (PAA), poli(propileno fumarato-co-etilenglicol) [P(PF-co-EG) y copolfmeros de los mismos.

Los polfmeros mencionados anteriormente han sido investigados para fabricar un armazon poroso. Sin embargo, las tecnicas de fabricacion convencionales generalmente tienen como resultado armazones con porosidades bajas que no soportan adecuadamente el crecimiento celular. Los poros en la superficie del armazon estan a menudo bloqueados, los nutrientes no se suministran suficientemente a las celulas y las celulas tienen dificultades para crecer en el armazon. Recientemente, la aplicacion de la tecnologfa de microfabricacion en el campo de la ingenierfa de tejidos ha hecho posible el desarrollo de un andamiaje complejo con resolucion a escala micrometrica. Estos armazones, denominados “armazones microflufdicos” presentan una red de micro-canales que permite el flujo de fluido dentro del armazon. Esta red de microcanales ayuda a proporcionar nutrientes y factores solubles a las distintas secciones del armazon.

El armazon tambien puede estar encapsulado con una membrana semipermeable. La publicacion de patente de los Estados Unidos N.° 2006/0147486 se refiere a un armazon poroso envuelto con una membrana semipermeable. Esta membrana semipermeable introduce selectivamente nutrientes en el armazon desde el exterior del armazon, asf como la excrecion de desechos metabolicos generados por las celulas de tejido al exterior del armazon. La publicacion describe el metodo para cultivar las celulas dentro de este armazon in vitro para la regeneracion de un tejido biologico.

La patente US-6.627.422 describe un dispositivo que contiene celulas en una matriz de hilo encapsulada en una membrana semipermeable. En este caso, la membrana semipermeable permite que las celulas implantadas reciban nutrientes, pero tambien permite que las moleculas terapeuticas producidas por las celulas implantadas se difundan a las celulas del hospedador. Este dispositivo se utiliza para la terapia de celulas: las celulas encapsuladas secretan protefnas endogenas al hospedador. Este dispositivo funciona como un organo bioartificial (por ejemplo, como pancreas artificial mediante la secrecion de insulina).

A pesar de tales avances en la ingenierfa de los armazones con una mejor difusion de nutrientes, el armazon, una vez trasplantado al paciente dispone de una cantidad limitada de nutrientes. De hecho, in vivo, los nutrientes y el oxfgeno son suministrados a las celulas del disco a traves de los vasos sangufneos en las placas terminales de las vertebras adyacentes al disco. En la enfermedad degenerativa del disco, las placas terminales vertebrales de las vertebras no funcionan bien y no permiten la difusion suficiente de nutricion al armazon de celulas implantado.

Se pueden utilizar diferentes tipos de celulas para disenar el cartflago articular. Se pueden usar celulas diferenciadas primarias de cartflago articular (es decir, condrocitos) de biopsias de cartflago existente. Estas celulas a menudo se obtienen de una fuente autologa ya que la obtencion de celulas heterologas o celulas de cadaveres conlleva el riesgo inherente de la transferencia de patogenos. Las celulas madre mesenquimales (CMM), que son celulas

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embrionarias como las que se encuentran en la medula osea, son capaces de diferenciacion en diferentes tipos de tejidos mesenquimales y tejidos especialmente cartilaginosos; por lo tanto, son otra fuente de celulas para la ingenierfa del cartflago.

Sin embargo, estas fuentes de celulas plantean muchas cuestiones. Los condrocitos del disco intervertebral son diffciles de cosechar, ya que las celulas autologas se obtienen a partir del disco del paciente y por lo tanto se requiere un procedimiento invasivo (cirugfa de la espalda) para realizar una biopsia. Si las celulas se cosechan a partir de un disco sano, se pone en peligro el funcionamiento del disco sano. Si las celulas son cosechadas a partir de un disco danado durante la discectomfa, se proporcionan celulas anormales de un tejido degenerado. Por otra parte, los condrocitos son diffciles de expandir en cultivo, ya que se desdiferencian. Con respecto a los condrocitos de otros cartflagos, el cartflago elastico del ofdo es facil de cosechar, pero produce solamente cartflago hialino y no cartflago fibroso, como en el disco. Las CMM tambien tienen algunas desventajas, ya que requiere una biopsia de la medula osea. Si bien se necesita una gran cantidad de celulas para la ingenierfa de tejidos, es diffcil obtener una gran cantidad de celulas madre adultas.

Numerosos trabajos han descrito las condiciones de cultivo que estimulan la condrogenesis de las celulas madre mesenquimales o la desdiferenciacion de los condrocitos. Estas condiciones son las siguientes: cultivo de micromasa de alta densidad; hipoxia; suplementacion con factores de crecimiento, tales como protefnas morfogeneticas oseas (BMP) en particular BMP-2, BMP-4, BMP-6 y BMP-7, factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) y/o factor de crecimiento de insulina uno (IGF-I); suplementacion con acido ascorbico; cultivo en una matriz especffica, tal como alginato; cultivo bajo tension mecanica como presion hidrostatica intermitente (PHI) (Watt, 1988; Dozin et al., 1992; Sullivan et al., 1994; Denker et al., 1999; Zur Nieden et al., 2005; Zhou et al., 2004; Majumdar et al., 2001; Barry et al,. 2001; Elder et al., 2005; Mow et al., 1992; Domm et al., 2000).

Pocos estudios han informado de la conversion de fibroblastos dermicos humanos (HDF) en celulas de tipo condrocito. La patente US-6.489.165 se refiere a la conversion de HDF en celulas de tipo condrocito en cultivo de micromasa de alta densidad e hipoxia. French MM et al. (2004) describieron la conversion de HDF en condrocitos cuando las celulas se cultivan en el proteoglicano, agrecano y se suplementan con el factor de crecimiento de insulina uno (IGF-I).

El documento US2002/0106625 divulga biorreactores in vitro e in vivo para la produccion de celulas cartilaginosas. Enfermedad degenerativa del disco

La enfermedad degenerativa del disco (DDD) requiere la realizacion de 700.000 procedimientos al ano, realizados por 4.500 cirujanos de columna, y la mayorfa de los trastornos del disco se producen en pacientes jovenes. Por lo tanto, es fundamental desarrollar estrategias eficaces y seguras para el tratamiento de esta enfermedad.

Un disco intervertebral (DIV) es una estructura compleja que comprende tres tejidos distintivos: el anillo, el nucleo y las placas terminales de cartflago. El anillo es una estructura bien organizada, de varias capas de fibras de colageno. El nucleo se compone principalmente de glicosaminoglicano (polfmero hidrofilo). Las placas terminales cartilaginosas suministran nutrientes. La combinacion anterior permite que el disco normal realice dos funciones contradictorias: estabilidad y flexibilidad.

El disco intervertebral absorbe los golpes, mantiene el movimiento y mantiene la estabilidad. De forma similar a otros cartflagos, la capacidad de reparacion innata del disco intervertebral (que actua como una union entre dos vertebras) es baja, debido a que es avascular y esta nutricionalmente soportado unicamente por difusion pasiva en las placas terminales. En consecuencia, una vez que se activa el proceso degenerativo, se considera que en ultima instancia es una condicion irreversible. Una vez danado, el disco degenerado puede sobresalir o extrudirse, y por lo tanto tiene que ser eliminado.

En la actualidad, el tratamiento quirurgico comun para los pacientes con dolor lumbar cronico debido a la enfermedad degenerativa del disco es o discectomfa o fusion vertebral. La discectomfa es un procedimiento adecuado y se lleva a cabo rutinariamente para eliminar el nucleo degenerado a traves de una fenestracion dentro del anillo: permite la eliminacion tanto del nucleo extruido (herniectomfa) como de los fragmentos de nucleo intervertebrales restantes degenerados. Aunque este procedimiento es ideal para descomprimir y aliviar el sistema nervioso (rafz o cola de caballo), no es una operacion adecuada para la columna vertebral, ya que crea una condicion potencialmente incapacitante que conduce a una cascada degenerativa que puede requerir un procedimiento quirurgico invasivo adicional, como la fusion o la artroplastia, por ejemplo. La discectomfa proporciona un buen efecto a corto plazo en el alivio del dolor radicular, pero provoca la reduccion de la altura del disco con estenosis neuroforaminal, inestabilidad del nivel tratado, resultado insatisfactorio en cuanto al dolor de espalda y/o complicaciones, como la estenosis vertebral o dolor de facetas, por ejemplo.

La fusion vertebral es el tratamiento mas eficaz para el dolor lumbar. Es un procedimiento quirurgico en el cual se elimina un disco entero y las dos vertebras adyacentes se unen entre sf (“fusionan”) con la interposicion de un injerto (jaulas, injertos oseos y/o dispositivos de fijacion, por ejemplo). Esta indicado para pacientes con degeneracion

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avanzada del disco. Solo en los Estados Unidos se realizan cada ano mas de 200.000 fusiones vertebrales, pero al eliminar el movimiento, la fusion vertebral altera las propiedades biomecanicas del disco intervertebral y aumenta el estres y la tension en los discos que estan adyacentes al disco fusionado. De hecho, tanto la discectomfa como la fusion empeoran la condicion del disco afectado, los discos adyacentes y los tejidos circundantes (tales como articulaciones de la faceta), lo que conduce a una mayor degeneracion.

El fracaso de estos procedimientos ha dado lugar a una busqueda del desarrollo de tecnologfas de no fusion, tales como protesis de disco o nucleo de disco, por ejemplo. La artroplastia de disco con un disco artificial es un tratamiento emergente para los pacientes con degeneracion del disco. Sus ventajas son que mantiene el movimiento, disminuye la incidencia de la degeneracion del segmento adyacente, evita las complicaciones relacionadas con la fusion y permite el retorno temprano a la funcion. En la actualidad, se comercializan dos tipos de dispositivos: el reemplazo total de disco y la sustitucion nuclear, pero ambos tienen grandes inconvenientes. El reemplazo de disco total es una protesis metalica voluminosa disenada para reemplazar la totalidad del disco: anillo, nucleo y placas terminales. Estas protesis utilizan un abordaje anterior invasivo (trans- o retro-peritoneal) que requiere la presencia de un cirujano vascular. Se han descrito desplazamientos, presencia de partfculas residuales por desgaste, degeneracion de los discos intervertebrales adyacentes, artrosis articular facetaria y hundimiento de este tipo de protesis. El sustituto del nucleo artificial conserva los tejidos restantes de disco y sus funciones. Su diseno permite su implantacion mediante abordaje posterior, pero la principal limitacion de tales protesis de nucleo es que solo se pueden usar en pacientes en los que la degeneracion del disco esta en una fase inicial o intermedia, ya que requiere la presencia de un anillo natural competente. La extrusion del implante sigue siendo una preocupacion primordial. Al ser un dispositivo a base de hidrogel, es fragil, por lo que no resiste las limitaciones biomecanicas extraordinarias de la columna lumbar (fuerzas de cizallamiento). Al ser materiales inertes, pueden perder sus propiedades mecanicas a lo largo del tiempo y se han descrito desgarres y roturas. Sustituir solamente el nucleo y dejar en su lugar un anillo danado genera las condiciones para la extrusion del implante o la reincidencia de la hernia discal.

La ingenierfa de tejidos y medicina regenerativa representan una nueva opcion para el tratamiento de la DDD. Se utilizan diversos enfoques para regenerar los tejidos. Estos enfoques se pueden clasificar en tres grupos: 1) biomateriales, sin celulas adicionales, que se utilizan para enviar senales para atraer a las celulas y promover la regeneracion; 2) se pueden usar solo celulas para formar un tejido y 3) se pueden usar celulas con un armazon de biomaterial que actua como un marco para el desarrollo de tejidos. Mientras que el trasplante de condrocitos autologos (ACT) ha sido utilizado durante algunos anos para reparar el cartflago articular, la ingenierfa de tejidos para la reparacion del disco sigue en su infancia. Actualmente se estan realizando numerosas investigaciones y los estudios en animales han demostrado la viabilidad de disco intervertebral mediante ingenierfa tisular. Mas interesante aun, recientes estudios clfnicos piloto han demostrado que el ACT es un tratamiento eficaz de la hernia de disco. La principal desventaja del ACT para la reparacion del disco es que requiere una biopsia de disco. Por lo tanto, hay una necesidad de un metodo mejorado para restaurar la anatomfa del disco y mejorar su funcionamiento y por lo tanto sigue habiendo una necesidad de un metodo mejorado de reparacion del cartflago. La presente invencion busca satisfacer estos y otros objetos y proporciona una solucion a una necesidad existente desde hace mucho tiempo en la tecnica.

La invencion se define en las reivindicaciones.

La presente invencion se refiere a metodos y composiciones para la reparacion biologica de cualquier tipo de cartflago, incluyendo el cartflago intervertebral y articular, por ejemplo. Mas especfficamente, pero no exclusivamente, la presente invencion se refiere a metodos y composiciones para la reparacion biologica del cartflago utilizando un dispositivo implantable que es una combinacion de una estructura inerte que actua como biorreactor in vivo y una estructura viva comprendida por condrocitos o celulas de tipo condrocito, por ejemplo, tales como celulas derivadas de la ejemplar fibroblastos dermicos humanos (HDF), en realizaciones especfficas. Mas particularmente, pero no exclusivamente, la presente invencion se refiere a una construccion hfbrida que combina tanto una estructura inerte como un nucleo viviente. La estructura inerte actua no solo como un sistema de suministro para alimentar y hacer crecer un componente basico vivo, sino que tambien actua como un inductor de la diferenciacion celular, en ciertos aspectos. En realizaciones de la invencion, esta estructura inerte comprende dos biopolfmeros de globo expandibles, concretamente, una membrana interna (como un globo) que esta encerrada dentro de una membrana externa (tambien denominada globo). Por lo tanto, la estructura inerte comprende dos membranas inflables generalmente concentricos. Las dos membranas pueden definirse ademas como una primera membrana cerrada que esta estructuralmente dentro de una segunda membrana adjunta. En realizaciones especfficas, las formas pueden ser considerados generalmente esfericas, generalmente elfpticas, generalmente redondeadas, generalmente globosas, por lo general discoides, generalmente esferoideas, generalmente globulares, de tipo globo, etcetera. En realizaciones especfficas adicionales, la forma es especffica del individuo y se ajusta a la forma y tamano de la cavidad que queda en la region de la articulacion o del disco intervertebral.

En ciertos aspectos, la invencion genera tejido natural in vitro, tal como de celulas madre, condrocitos, etcetera. Mas particularmente, pero no exclusivamente, la presente invencion se refiere a un metodo para el cultivo y la diferenciacion de fibroblastos humanos en celulas de tipo condrocito, por ejemplo. Las celulas, que son autologas en ciertas realizaciones, se ponen en una matriz de armazon hecha de uno o mas biopolfmeros, de tal manera que

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imitan una matriz natural. El armazon puede ser sembrado in vitro y en ciertos aspectos se proporcionan factores de crecimiento a las celulas, la matriz, o ambos. El armazon se pone en un biorreactor, que es un sistema para la perfusion de medio y permite la aplicacion de la fuerza mecanica al armazon. Tras la aplicacion de la fuerza, las celulas son asistidas en la diferenciacion, especialmente para la generacion de cartflago.

En realizaciones especfficas, la invencion emplea la diferenciacion de ciertas celulas en celulas de tipo condrocito. En realizaciones especfficas, los HDF, por ejemplo, se diferencian en celulas de tipo condrocito en condiciones de cultivo particulares, tales como la hipoxia (Nicoll et al., 2001), el cultivo de micromasa de alta densidad y el cultivo en una matriz especffica, tales como agrecano (Frances et al., 2004). En realizaciones especfficas, los factores que imitan el entorno in vivo de condrocitos intervertebrales son potentes estfmulos para la diferenciacion condrogenica de los HDF, por ejemplo; dichos factores incluyen los siguientes: 1) tridimensionalidad; 2) baja tension de oxfgeno (<5 %); 3) tension mecanica y 4) la presion hidrostatica intermitente. En realizaciones especfficas se determina la viabilidad celular y la diferenciacion condrogenica de HDF sembrados en cultivos tridimensionales de perlas de alginato. En otra realizacion, se caracterizan los efectos de la tension de oxfgeno sobre la diferenciacion de HDF cultivados en perlas de alginato. En una realizacion especffica adicional, se caracterizan los efectos de la compresion hidrostatica sobre la diferenciacion de HDF cultivados en perlas de alginato.

La diferenciacion de las celulas en condrocitos o celulas de tipo condrocito se puede producir de cualquier manera adecuada, incluyendo la diferenciacion in vitro antes de la implantacion del dispositivo en un individuo o la diferenciacion in vitro antes de la implantacion del dispositivo en un individuo y tambien in vivo despues de la implantacion.

En realizaciones especfficas, el dispositivo de la invencion proporciona un metodo para la regeneracion in vivo de una articulacion, como por ejemplo un disco intervertebral, codo, rodilla, hombro, cadera, articulacion temporomandibular, etcetera. En ciertos aspectos de la invencion, un compartimiento vivo comprende la construccion de matriz celular de las celulas de tipo condrocito, tal como la derivada de HDF, sembrados en un biomaterial. El cultivo y la diferenciacion del compartimiento vivo puede ser iniciado in vitro, en ciertas realizaciones. El nucleo vivo se siembra en el biomaterial inerte y se implanta y las celulas continuan proliferando y diferenciandose in vivo.

En ciertas realizaciones, el cartflago que es el foco de aplicacion de la invencion es el cartflago del disco intervertebral. En aspectos particulares de la invencion, las celulas utilizadas en la invencion son sometidas a tension mecanica para la diferenciacion condrogenica. Por lo tanto, las realizaciones de la invencion proporcionan una estructura inerte inter-vertebral que actua como un biorreactor in vivo para inducir el crecimiento y la diferenciacion de un nucleo vivo. En realizaciones adicionales, la invencion proporciona una construccion hfbrida que combina tanto una estructura inerte como el nucleo vivo para la implantacion en el espacio inter-somatico utilizando una cirugfa mfnimamente invasiva.

Es un objeto ilustrativo de la presente invencion proporcionar un metodo destinado a reparar un disco intervertebral degenerado, por ejemplo, restablecer la anatomfa del disco intervertebral y mejorar su funcionamiento. En aspectos particulares de la invencion, se proporciona un metodo para reparar el disco danado utilizando una estructura hfbrida compuesta de un dispositivo inerte destinado a alimentar y diferenciar un nucleo vivo interno. Por consiguiente, la estructura inerte actua como un sistema de administracion de nutrientes y factores de crecimiento y como un biorreactor capaz de diferenciar los fibroblastos dermicos autologos en celulas de tipo condrocito. Bajo estres mecanico (como la presion hidrostatica intermitente y/o la tension de cizallamiento de fluido), las celulas adquiriran las caracterfsticas de las celulas del nucleo en la parte central y de las celulas del anillo en la periferia. Como ejemplo de celulas de tipo condrocito derivadas de fibroblastos pueden ser las cosechadas de la piel, tal como mediante una biopsia y despues sembradas en un armazon de polfmero tridimensional para el uso de la reparacion del disco. Esto eliminarfa la necesidad de una tecnica invasiva para la cosecha de condrocitos autologos, en aspectos particulares. Una ventaja de algunos aspectos de la construccion hfbrida de la invencion que combina a la vez un biomaterial inerte que actua como un sistema de administracion de nutrientes y celulas vivas facilmente cosechadas de la piel, por ejemplo, es que es capaz de automantenerse o remodelarse y puede restaurar la funcion del disco utilizando, por ejemplo, un enfoque quirurgico posterior mfnimamente invasivo.

En ciertos aspectos de la invencion, el cartflago danado del espacio de la articulacion o del espacio intervertebral se elimina y la estructura hfbrida se instala dentro del espacio proporcionado por la eliminacion anterior. En algunas realizaciones de la invencion, el dispositivo se implanta utilizando un procedimiento quirurgico mfnimamente invasivo. En realizaciones especfficas, se emplea una tecnica quirurgica ilustrativa. En realizaciones generales de los discos intervertebrales, cuando un disco intervertebral se debe quitar de entre dos vertebras adyacentes, p.ej. en la columna lumbar, es menos invasivo un abordaje quirurgico posterior del paciente. Este procedimiento mfnimamente invasivo permite continuar con el legrado del espacio inter-somatico a traves de una pequena abertura dentro del anillo (anulotomfa) para retirar los fragmentos degenerados del nucleo del disco. Usando esta pequena abertura anular, la presente invencion emplea un novedoso paquete de reparacion intervertebral que se puede deslizar a traves de la incision antes mencionada y despues expandirse en el area generada por la extraccion del nucleo dentro del espacio inter-somatica, por ejemplo. En realizaciones especfficas, la eliminacion del disco danado y la instalacion de la construccion del tejido de ingenierfa se llevan a cabo en la misma operacion posterior, reduciendo asf al mfnimo los riesgos, las posibilidades de complicaciones quirurgicas y reintervenciones, asf como el

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tiempo de cirugfa.

En una realizacion de la invencion, hay un dispositivo implantable que comprende una composicion de celulas/armazon y un dispositivo de encapsulacion, en el que el dispositivo de encapsulacion comprende una primera membrana generalmente concentrica; una segunda membrana generalmente concentrica que es concentricamente externa a la primera membrana generalmente concentrica; un primer volumen dentro de la primera membrana generalmente concentrica; un segundo volumen que es externo a la primera membrana generalmente concentrica y que es interno a la segunda membrana generalmente concentrica y una estructura para la extraccion de material desde el segundo volumen, en el que la primera membrana generalmente concentrica es semipermeable y alberga la composicion de celulas/armazon. Una membrana puede ser considerada generalmente concentrica en comparacion con otra si los centros de cada una de las membranas estan sustancialmente cerca.

En ciertos aspectos de la invencion, se proporciona a un individuo otro tratamiento, ademas del dispositivo implantable de la invencion. Por ejemplo, antes, durante y/o despues de la implantacion del dispositivo, el individuo puede recibir uno o mas antibioticos. Ejemplos de terapias postoperatorias incluyen antiinflamatorios no esteroideos (AINE), analgesicos simples y/o relajantes musculares segun sea necesario y que pueden ser seguidos por una rehabilitacion funcional despues de la operacion, como por ejemplo despues de la primera, segunda, tercera o mas semanas despues de la operacion.

En algunas realizaciones, existe una estructura hfbrida para la reparacion del cartflago que comprende un dispositivo de encapsulacion comprendido por material inerte y un nucleo vivo comprendido por celulas de tipo condrocito. Este dispositivo de encapsulacion actua como un biorreactor in vivo para la ingenierfa de cartflago. Permite in vivo el crecimiento y la diferenciacion de las celulas del cartflago, proporcionando factores de crecimiento y nutrientes y la transmision de un regimen de carga fisiologica.

En una realizacion de la invencion, existe un dispositivo implantable, que comprende una composicion de celulas/armazon y un dispositivo de encapsulacion que comprende: una primera membrana que tiene un interior y un exterior; una segunda membrana que tiene un interior y un exterior, en la que la primera membrana esta encapsulada dentro de la segunda membrana; un primer volumen dispuesto dentro de la primera membrana; un segundo volumen que esta dispuesto fuera de la primera membrana y que esta dispuesto dentro de la segunda membrana; y una estructura para la adicion de fluido al segundo volumen, que extrae lfquido del segundo volumen, o ambos, en el que la composicion de celulas/armazon esta dispuesta dentro de la primera membrana y la primera membrana tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas: semipermeable, biocompatible, biodegradable y reabsorbible, en el que la segunda membrana tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas: biocompatible, hermetica a los lfquidos, permeable al oxfgeno, reabsorbible, biodegradable y ampliable.

En una realizacion especffica, el armazon esta compuesto de un polfmero sintetico, un hidrogel natural o un hidrogel sintetico. En una realizacion especffica adicional, el polfmero sintetico es acido poliglicolico, acido polilactico, acido polilactico-co-glicolico, poli-£-caprolactona o poli(glicerol-sebacato) (PGS). En otra realizacion especffica, el polfmero sintetico es un polifosfaceno, un polianhfdrido o un poli(ortoester). En realizaciones particulares, el hidrogel natural comprende colageno, acido hialuronico, alginato, agarosa, quitosano, fibrina, gelatina o un copolfmero del mismo. En una realizacion adicional, el hidrogel sintetico comprende poli(oxido de etileno), poli(alcohol vinflico), poli(acido acrflico), poli(propileno fumarato-co-etilenglicol) o un copolfmero del mismo.

En ciertos aspectos de la invencion, las celulas en el dispositivo son celulas condrocitos o celulas de tipo condrocito, tales como en las que las celulas condrocitos o las celulas de tipo condrocito secretan una molecula seleccionada del grupo que consiste en agrecano, colageno tipo II, protefna Sox-9, protefna de union al cartflago y perlecan. En casos particulares, las celulas se diferencian a partir de celulas fibroblastos y/o celulas madre. Ejemplos de celulas fibroblastos son fibroblastos dermicos, fibroblastos de los tendones, fibroblastos de ligamentos, fibroblastos sinoviales, fibroblastos de prepucio o una mezcla de los mismos.

En aspectos particulares, la primera membrana esta comprendida por un polfmero biodegradable, biocompatible y reabsorbible. En aspectos adicionales, la primera membrana esta comprendida por un poliacrilato, un polivinilideno, un copolfmero de poli(cloruro de vinilo), un poliuretano, un poliestireno, una poliamida, un acetato de celulosa, un nitrato de celulosa, una polisulfona, un polifosfaceno, un poliacrilonitrilo, un poli(cloruro de acrilonitrilo/covinilo) o un derivado, copolfmero o mezcla de los mismos. En aspectos especfficos, la primera membrana es generada por la formacion de complejos de polielectrolito. En aspectos especfficos, la segunda membrana esta comprendida por acido poliglicolico (PGA), acido polilactico (PLA), acido polilactico-co-glicolico (PLGA), poli-£-caprolactona (PCL), poliuretano (PU), polidioxanona (PDO), un polietileno, poli (sebacato de glicerol) (PGS) o un derivado, copolfmero, o mezcla de los mismos. En realizaciones adicionales, la tasa de reabsorcion de la segunda membrana es mas lenta que la tasa de reabsorcion de la primera membrana.

En realizaciones particulares, el dispositivo implantable comprende uno o mas nutrientes, factores de crecimiento y/o medicamentos. En algunos casos, el dispositivo implantable se puede definir ademas como aquel que comprende un medio de cultivo de celulas basales que comprende el uno o mas nutrientes, factores de crecimiento y/o medicamentos. En realizaciones especfficas, el medio se complementa con suero bovino fetal (FBS), acido

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ascorbico, y/o dexametasona. Los nutrientes, factores de crecimiento y/o medicamentos pueden estar presentes en el armazon, el primer volumen, el segundo volumen, o una combinacion de los mismos, en ciertos casos. El factor de crecimiento se selecciona del grupo que consiste en protefna morfogenetica osea 2 (BMP-2), BMP-4, BMP-6, BMP-7, protefna morfogenetica derivada de cartflago (CDMP), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p) , factor de crecimiento de insulina uno (IGF-I), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF), FGF-2, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y una mezcla de los mismos, en realizaciones especfficas y el medicamento puede definirse adicionalmente como uno o mas de un antibiotico, agente antifungico o un agente antiviral.

En ciertos aspectos de la invencion, la estructura comprende uno o mas tubos y/o comprende uno o mas cateteres y/o uno o mas depositos. En casos particulares, la estructura se define ademas como que comprende uno o mas de un primer tubo; un segundo tubo; opcionalmente, un primer deposito; y, opcionalmente, un segundo deposito. En una realizacion especffica, el primer y segundo tubos comprenden respectivamente primeros extremos posicionados dentro del segundo volumen, en el que los tubos primero y segundo comprenden, respectivamente, segundos extremos conectados al primer y segundo depositos, o ambos. El primer y/o segundo tubos estan comprendidos, en un caso a modo de ejemplo, por el mismo material que la segunda membrana y el primero y/o segundo tubos estan comprendidos, en un caso a modo de ejemplo, por caucho de silicona.

En una realizacion de la invencion, existe un metodo de reparacion del cartflago danado en una articulacion (tal como un disco intervertebral) de un individuo, que comprende la administracion de un dispositivo de acuerdo con la invencion a la respectiva articulacion (como disco intervertebral) del individuo. En un aspecto especffico, el metodo comprende ademas la preparacion de la composicion de celulas/armazon en condiciones ex vivo adecuadas. En otra realizacion especffica, la preparacion de la composicion de celulas/armazon se define como someter una o mas celulas a un armazon en condiciones adecuadas. La preparacion de la composicion de celulas/armazon puede ocurrir durante no menos de aproximadamente dos a tres dfas, en ciertos aspectos de la invencion. En una realizacion especffica, las condiciones adecuadas permiten la proliferacion de las celulas, tales como, por ejemplo, permitir la estimulacion de la diferenciacion condrogenica. Las condiciones adecuadas pueden definirse ademas en ejemplos de realizacion por ser en cultivo en micromasa de alta densidad, presencia de baja tension de oxfgeno (entre aproximadamente 1,0 % -7,5 %), presencia de tension mecanica y/o alimentacion por un medio suplementado con factores de crecimiento, acido ascorbico y/o dexametasona.

En realizaciones particulares, la composicion de celulas/armazon se somete a tension mecanica, la cual puede ser presion hidrostatica, tension de cizallamiento de fluido o una combinacion de las mismas, por ejemplo. En una realizacion especffica, la tension mecanica es intermitente. En casos particulares, la tension mecanica es la tension de cizallamiento del fluido y el armazon es un armazon microflufdico.

En otras realizaciones particulares, la etapa de administracion se define como la implantacion del dispositivo usando cirugfa mfnimamente invasiva. En un caso ilustrativo, despues de la implantacion del dispositivo en el individuo, la segunda membrana se infla para llenar un vacfo en la articulacion, tal como un disco intervertebral. En otro caso ilustrativo, antes de la implantacion del dispositivo en un disco intervertebral del individuo, al menos parte de un disco intervertebral endogeno se elimina del individuo. En realizaciones especfficas, la articulacion relacionada con la invencion puede ser un disco intervertebral, una rodilla, un hombro, un codo, una cadera, o una articulacion temporo-mandibular.

En ciertos aspectos de la invencion, la estructura del dispositivo comprende: un primer tubo que tiene un primer y segundo extremos, estando dicho primer extremo del primer tubo dispuesto dentro del segundo volumen; un segundo tubo que tiene un primer y segundo extremos, estando dicho primer extremo del segundo tubo dispuesto dentro del segundo volumen; un primer deposito; y un segundo deposito, en el que despues de la implantacion del dispositivo en un disco intervertebral en el individuo y despues del inflado de la segunda membrana, los segundos extremos del primer y segundo tubo estan conectados respectivamente al primer y segundo depositos. En una realizacion especffica, el primer y segundo depositos estan colocados subcutaneamente en el individuo. Los metodos de la invencion pueden comprender ademas el sellado de la primera membrana, el sellado de la segunda membrana, o ambos. En un aspecto especffico, al menos parte del segundo volumen se intercambia. En una realizacion ilustrativa, el metodo de la invencion comprende ademas retirar al menos parte del segundo volumen a traves del primer deposito. En otro aspecto especffico, el metodo comprende la eliminacion de fluido del primer o segundo deposito, suministrando un fluido al respectivo segundo o primer deposito, o de forma concomitante eliminando el fluido del primer o segundo deposito y suministrando un fluido al respectivo segundo o primer deposito.

En ciertos casos, la composicion de celulas/armazon se inserta en la primera membrana antes de la implantacion del dispositivo en el individuo o la composicion de celulas/armazon se inserta en la primera membrana posterior despues de la implantacion del dispositivo en el individuo. En una realizacion especffica, la primera membrana se inserta en la segunda membrana antes de la implantacion del dispositivo en el individuo o la primera membrana se inserta en la segunda membrana despues de la implantacion del dispositivo en el individuo.

En una realizacion de la invencion, se proporciona un metodo de preparacion de una composicion de celulas/armazon, en el que las celulas son condrocitos o celulas de tipo condrocito, que comprende: someter las

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celulas capaces de diferenciarse en una celula de tipo condrocito al armazon; someter las celulas a tension mecanica y, opcionalmente, someter las celulas a uno o mas factores de crecimiento adecuados para la diferenciacion en un condrocito o en una celula de tipo condrocito. En una realizacion especffica, la tension mecanica es intermitente.

En una realizacion adicional, se proporciona un kit que comprende el dispositivo de la invencion, en el que el dispositivo se encuentra en uno o mas recipientes adecuados. En realizaciones especfficas, el kit comprende ademas celulas que son celulas condrocitos, celulas de tipo condrocito o celulas que son capaces de diferenciarse en celulas condrocitos o celulas de tipo condrocito.

En una realizacion adicional, se proporciona un dispositivo implantable, que comprende: una composicion de celulas/armazon encapsulada dentro de una membrana, teniendo dicha membrana un interior y un exterior; y una estructura para el intercambio de al menos parte del fluido que esta dentro de la membrana, en el que la membrana tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas: semipermeable, biocompatible, biodegradable; y reabsorbible.

En otra realizacion, se proporciona una estructura hfbrida para la reparacion del cartflago, que comprende: un dispositivo de encapsulacion que comprende un material inerte y un nucleo vivo que comprende celulas de tipo condrocito, en el que dicho dispositivo de encapsulacion encapsula el nucleo vivo.

En una realizacion adicional, se proporciona un biorreactor in vivo para la ingenierfa del cartflago, que comprende una membrana biodegradable que encapsula las celulas, en el que dichas celulas son capaces de diferenciarse a condrocitos o celulas de tipo condrocito, en el que la encapsulacion de dichas celulas proporciona las condiciones adecuadas para el crecimiento y diferenciacion in vivo de dichas celulas, en el que dichas condiciones comprenden proporcionar un regimen de carga fisiologica en dichas celulas. En una realizacion especffica, el regimen de carga fisiologica comprende forzar la columna vertebral de un individuo.

Lo anterior resume en lfneas generales y no detalladamente las caracterfsticas y ventajas tecnicas de la presente invencion con el fin de que la descripcion detallada de la invencion que sigue pueda entenderse mejor. Las caracterfsticas y ventajas adicionales de la invencion se describiran a continuacion y forman el objeto de las reivindicaciones de la invencion. Los expertos en la tecnica apreciaran que la concepcion y la realizacion especffica divulgadas pueden utilizarse facilmente como base para modificar o disenar otras estructuras para llevar a cabo los mismos fines de la presente invencion. Tambien debe tenerse en cuenta por los expertos en la tecnica que tales construcciones equivalentes no se apartan del alcance de la invencion como se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las nuevas caracterfsticas que se cree que son caracterfsticas de la invencion, tanto en cuanto a su organizacion como metodo de funcionamiento, junto con otros objetos y ventajas se comprenderan mejor a partir de la siguiente descripcion si se consideran en conexion con las figuras adjuntas. Se ha de entender expresamente, sin embargo, que cada una de las figuras se proporciona con el proposito de ilustracion y descripcion solamente y no pretende ser una definicion de los lfmites de la presente invencion.

Para una comprension mas completa de la presente invencion, se hace referencia ahora a las siguientes descripciones tomadas conjuntamente con los dibujos adjuntos.

La FIG. 1 ilustra un ejemplo de una seccion transversal del espacio intervertebral L4-L5.

La FIG. 2 muestra un abordaje posterior a un espacio intervertebral, incluyendo un ejemplo de tejido herniado y tejido discal degenerado.

La FIG. 3 ilustra un ejemplo de realizacion de la ubicacion del defecto del anillo para la eliminacion del disco.

La FIG. 4 muestra la seccion transversal abdominal y el sistema de drenaje en las realizaciones de la invencion, incluyendo un ejemplo de incision en la lfnea media y un ejemplo de depositos de Holter-Rickham (Codman Shurtleff y, Inc.; Raynham, MA)

Tal como se usa en la presente memoria, la especificacion, “un” o “una” puede significar uno o mas. Tal como se usa en la presente memoria en la(s) reivindicacion(es), cuando se utiliza junto con la palabra “comprende”, las palabras “un” o “una” pueden significar uno o mas de uno. Tal como se usa en la presente memoria “otro” puede significar al menos un segundo o mas. En realizaciones especfficas, los aspectos de la invencion pueden “consistir esencialmente en” o “consistir en” una o mas secuencias de la invencion, por ejemplo. Algunas realizaciones de la invencion pueden consistir en o consistir esencialmente en uno o mas elementos, etapas de un metodo y/o metodos de la invencion. Se contempla que cualquier metodo o composicion descritos en la presente memoria se pueda implementar en relacion con cualquier otro metodo o composicion descritos en la presente memoria.

I. Definiciones

El termino “biorreactor” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un sistema en el que se efectua una conversion biologica. Las celulas se cultivan de una manera controlada y se convierten por medio de reacciones especfficas, en realizaciones especfficas. En algunos aspectos de la invencion, un biorreactor es capaz de regular uno o mas de los siguientes parametros: temperatura, pH del medio, intercambio de gases, estfmulos mecanicos, pO2, PCO2 y humedad. Un sistema de perfusion esta presente en el biorreactor (perfusion-biorreactor), en

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realizaciones especfficas, para proporcionar un suministro constante de nutrientes y para eliminar de manera eficiente los productos de desecho. Las tensiones mecanicas son un factor importante de la funcion de los condrocitos. Las combinaciones de las tensiones mecanicas se desarrollan simultaneamente durante el movimiento de la articulacion de forma intermitente, lo que incluye la deformacion de celulas y tejidos, las fuerzas de compresion y de cizallamiento, el flujo de fluido y los cambios en la presion hidrostatica, por ejemplo. Estas condiciones se reproducen con el biorreactor, en ciertos aspectos.

El termino “cateter” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un tubo hueco, que puede ser flexible o rfgido, que se emplea para drenar el lfquido desde una zona en el cuerpo.

La expresion “celulas de tipo condrocito” como se utiliza en la presente memoria se refiere a celulas que no son condrocitos primarios pero se derivan de las celulas madre (tales como celulas madre mesenquimales) o celulas de otros linajes (tales como los fibroblastos). Estas celulas de tipo condrocito tienen un fenotipo de condrocitos (celulas del cartflago). Esto significa que no solo tienen una forma de condrocitos (celulas poligonales y/o romboidales, por ejemplo), sino que tambien son capaces de agregar y producir componentes de la matriz del cartflago, como proteoglicano sulfatado y colageno tipo II, por ejemplo. Por lo tanto, los ejemplos de marcadores de celulas de tipo condrocito incluyen, por ejemplo, uno o mas de agrecano, que es un condroitfn sulfato y proteoglicano queratan sulfato, colageno de tipo II, protefna Sox-9, protefna de union al cartflago y perlecan, que es un proteoglicano de heparan sulfato.

El termino “copolfmero”, tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un polfmero que comprende dos o mas monomeros diferentes (polfmero: un compuesto de origen natural o sintetico que comprende moleculas grandes compuestas por una serie conectada de monomeros simples repetidos).

El termino “desdiferenciacion” tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a la regresion de una celula o tejido especializado a una forma mas simple, mas embrionaria, no especializada. Cuando se cultivan condrocitos ex vivo en monocapas, estos carecen de su entorno in vivo (y sobre todo de la tridimensionalidad y el estres mecanico) y se someten a cambios morfologicos y moleculares llamados desdiferenciacion. Este proceso implica un cambio en la morfologfa y un cambio de la expresion de genes especfficos de condrocitos a la de genes que normalmente se expresan en fibroblastos.

El termino “discectomfa” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a un procedimiento para eliminar parte o la totalidad de un nucleo degenerado a traves de una fenestracion dentro del anillo. Se realiza a traves de un metodo mfnimamente invasivo utilizando un microscopio operatorio. El procedimiento libera las rafces mediante la eliminacion del nucleo de compresion herniado (extruido). Permite la eliminacion de los restantes nucleos degenerados a traves de una tenotomfa (apertura) dentro del anillo. En particular, una discectomfa es en realidad un herniectomfa con la eliminacion de los fragmentos de nucleo degenerado.

El termino “encapsulado” o “encapsulacion” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que esta encerrado dentro de un lfmite, tal como en un saco membranoso.

La expresion “tension de cizallamiento del fluido” se refiere al movimiento de los fluidos sobre una superficie, lo que tiene como resultado la generacion de la tension de cizallamiento. La tension de cizallamiento es un estado de estres en el que el estres es paralelo a una superficie. El armazon microflufdico permite el flujo de fluido en los microcanales. Este flujo de fluido induce tension de cizallamiento del fluido en las celulas sembradas en el armazon.

El termino “hermetico” tal como se usa en la presente memoria se refiere a que es estanco a los lfquidos, tal como mediante fusion o sellado, por ejemplo. En particular, una membrana hermetica no permite que el lfquido en su interior salga de la membrana, aunque se permite que el oxfgeno y el dioxido de carbono atraviesen la membrana (como la entrada de oxfgeno a traves de la membrana y la salida de dioxido de carbono de la membrana).

La expresion “presion hidrostatica” se refiere a la presion ejercida o transmitida (por ejemplo, agua) en reposo. El disco intervertebral esta expuesto a amplias gamas de presion hidrostatica intradiscal durante diferentes ejercicios de carga y estan en su mfnimo (aproximadamente 0,25 Mpa) durante la posicion de acostado o relajado y en su maximo (aproximadamente 2,5 a 5 MPa) durante el levantamiento de pesos con una vuelta en cfrculo. Estas diferentes magnitudes de carga influyen en el disco intervertebral por la alteracion de recambio de la matriz del disco, dependiendo de sus magnitudes. Se han realizado numerosos estudios para determinar el mejor regimen para aplicar la presion hidrostatica intermitente (IHP) in vitro a las celulas para inducir la diferenciacion condrogenica de las celulas in vitro. Se han probado diferentes regfmenes. En estos estudios, la IHP aplicada esta dentro de los rangos de amplitud desde 0,5 MPa hasta aproximadamente 5 MPa y un intervalo de frecuencia de 0,01 Hz a 1 Hz. En realizaciones especfficas, el dispositivo de encapsulacion esta disenado para transmitir presion hidrostatica in vivo a la construccion de celula-matriz. La envoltura externa llena de lfquido (medio) se comprime durante diferentes ejercicios de carga; bajo esta compresion parte del medio lfquido se difunde a traves de la membrana interna semipermeable, lo que permite la perfusion de la construccion de celula-matriz y genera la presion hidrostatica dentro de la construccion celula-matriz. En este sistema, se aplica la presion hidrostatica fisiologica apropiada a la construccion de celula-matriz, lo que es util para la diferenciacion condrogenica de las celulas.

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El termino “hipoxia” tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una deficiencia en oxfgeno. En aspectos especfficos, se refiere a la tension de oxfgeno que es menor que aproximadamente 20 %.

El termino “articulacion”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una region en el cuerpo en la que se unen dos huesos de un esqueleto.

El termino “membrana” tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una capa flexible de material que separa los diferentes tipos y/o areas de material biologico. Puede estar comprendida por material natural y/o sintetico y puede ser permeable, por ejemplo, a las sustancias en solucion.

La expresion “armazon microflufdico” tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un material que comprende un sistema de microcanales.

La expresion “cirugfa mfnimamente invasiva”, tal como se usa en la presente memoria se refiere a los procedimientos realizados a traves de una o mas incisiones pequenas en un individuo. Por ejemplo, en ciertos aspectos, la cirugfa mfnimamente invasiva utiliza tecnicas especializadas, camaras en miniatura con microscopios, linternas diminutas de fibra optica y/o monitores de alta definicion. Para el individuo, la cirugfa mfnimamente invasiva significa menos traumatismo en el cuerpo, menos perdida de sangre, cicatriz o cicatrices quirurgicas mas pequenas y menor necesidad de medicacion para el dolor, en comparacion con la cirugfa abierta convencional. Los individuos pueden abandonar el centro medico mas pronto despues de la cirugfa mfnimamente invasiva y volver a sus actividades normales mas rapidamente que con la cirugfa abierta convencional.

El termino “deposito” tal como se usa en la presente memoria se refiere a un dispositivo que actua como una camara de inyeccion. En realizaciones especfficas, el tipo de deposito puede ser uno que se utiliza rutinariamente en la tecnica para administrar farmacos (antibioticos, por ejemplo, en caso de meningitis o ventriculitis), en el sistema ventricular cerebral (de ahf el termino de “ventriculostomfa”), en una vena (quimioterapia oncologica), o en el espacio subaracnoideo medular (morfina para el alivio del dolor), por ejemplo. En aspectos particulares, puede ser considerado como un tipo de sistema de administracion de farmacos. Se compone de varias partes: 1) una parte superior de material (denominado “silastico”) a base de silicona que permite pinchazos repetidos sin perder sus caracterfsticas de impermeabilidad; 2) una base de acero inoxidable que evita las lesiones de los tejidos subyacentes por la aguja y 3) un extremo silastico que se conecta a un cateter. El cateter tambien puede estar hecho de silastico. Su extremo distal puede ser llevado al sitio y cortarse al tamano adecuado, mientras que su extremo proximal esta conectado al extremo del deposito. El sistema del ejemplo define una camara de 1 a 2 cm3, de ahf su nombre de “deposito” (tanque).

El termino “armazon” tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a una construccion de polfmero biodegradable poroso que soporta, por ejemplo, el crecimiento celular y/o la migracion.

El termino “siembra” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la implantacion de celulas en un armazon. Las celulas se adheriran al armazon y luego creceran y se diferenciaran en el armazon.

II. Realizaciones generales de la invencion

En realizaciones generales de la invencion, se proporciona un dispositivo y metodos de su uso, en el que el dispositivo comprende una construccion de celulas-matriz de celulas de tipo condrocito encapsuladas en una membrana de varias capas. Aunque se puede reparar cualquier tejido al menos en parte mediante los metodos de la invencion, incluyendo cualquier tejido de cartflago, en un ejemplo de realizacion concreto, se repara el cartflago del disco intervertebral o el cartflago de la articulacion. Los metodos de ejemplo de la invencion utilizan una combinacion de un nucleo vivo y un nucleo inerte o estructura, proporcionando asf una estructura hfbrida. En aspectos particulares de la invencion, el nucleo vivo comprende una construccion de celula-matriz de las celulas de tipo condrocito, como se derivan de los HDF y la estructura inerte comprende el nucleo vivo y se implanta en un paciente utilizando, por ejemplo, un procedimiento quirurgico mfnimamente invasivo.

La presente invencion proporciona un metodo para la reparacion biologica del cartflago utilizando fibroblastos dermicos humanos (HDF) autologos como fuente de celulas. La presente invencion tambien proporciona un dispositivo que comprende una construccion de celulas-matriz de celulas, tales como celulas de tipo condrocito, que estan encapsuladas en una membrana de varias capas. En una realizacion particular, la invencion se refiere al crecimiento y diferenciacion de las celulas in vivo utilizando un dispositivo especial. La diferenciacion condrogenica es inducida por estres mecanico, y en aspectos particulares, por ejemplo, por presion hidrostatica intermitente (IHP) y/o la tension de cizallamiento de fluido.

Una realizacion general de la invencion es el uso de HDF como fuente de celulas para la ingenierfa de nuevo cartflago para el disco intervertebral, ya que estas celulas son faciles de cosechar y de cultivar. La idea es inducir la diferenciacion de estas celulas en celulas de tipo condrocito. Ya existe alguna evidencia de la diferenciacion condrogenica de HDF en celulas de tipo condrocito. Sin embargo, estos estudios son solamente in vitro y la tecnica para diferenciar las celulas se basa en el uso de factores de crecimiento especfficos, hipoxia o matriz especffica

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tales como agrecano.

Debido a su diseno, este dispositivo permite, por ejemplo, uno o ambos de los siguientes: 1) la difusion de nutrientes y oxfgeno a las celulas vivas y/o 2) la transferencia de la carga a las celulas. Esta fuerza mecanica y sobre todo la IHP es cntica para la diferenciacion condrogenica de fibroblastos. Se sabe que la IHP es el estimulo mas potente para la induccion y mantenimiento del fenotipo de los condrocitos. Cuando los condrocitos se cosechan a partir de cartflago para ser utilizado para disenar in vitro nuevo carfflago, estas celulas necesitan ser expandidas, pero esto hace que los condrocitos se diferencien. Se ha demostrado que la IHP pueda rediferenciar las celulas en condrocitos. Las personas que utilizan condrocitos del carfflago para disenar in vitro cartflago a menudo utilizan tensiones mecanicas y especialmente IHP como inductor de la diferenciacion. Sin embargo, no hay nada en la literatura sobre los efectos de la IHP sobre la diferenciacion condrogenica de HDF.

En realizaciones de la invencion, hay al menos dos componentes en el dispositivo: 1) construccion celula-matriz, en la que las celulas (HDF, por ejemplo) se siembran en un armazon (y las celulas que no se unen al armazon se pueden lavar); 2) dispositivo de encapsulacion. En realizaciones espedficas, el dispositivo de encapsulacion in vivo esta comprendido por dos membranas concentricas, en realizaciones espedficas: 1) una membrana interna es una membrana semipermeable que envuelve la construccion de celulas-andamiaje (esta membrana semipermeable es permeable a moleculas pequenas y por lo tanto permite la difusion de nutrientes y oxfgeno y la eliminacion de los desechos , pero es impermeable a las macromoleculas tales como colageno y glicosaminoglicanos, por ejemplo; estas macromoleculas que forman la matriz extracelular natural se retienen a continuacion en el armazon); y 2) una membrana externa es hermetico a los fluidos pero permeable al oxfgeno, y es expandible e inflable con el fin de ser implantada mediante un procedimiento quirurgico posterior mmimamente invasivo (en realizaciones espedficas, cuando se expande se ajustara a la cavidad de la discectomfa, por ejemplo, se ajustara exactamente a la cavidad). La membrana externa se llena con un medio que nutre las celulas. El fluido encerrado dentro de la envoltura forma un entorno de fluido que transfiere IHP a las celulas vivas. Aproximadamente el dfa despues de la cirugfa, cuando el individuo puede levantarse y empezar a caminar de nuevo, este aplica alguna carga sobre la columna vertebral y en especial en el nivel instrumentado. Por lo tanto, el nucleo vivo recibe el regimen de presion hidrostatica dclica adecuada bajo carga fisiologica a traves de la envoltura que se llena con medio, lo que es util para el crecimiento y la conversion de HDF. Por lo tanto, en ciertos aspectos el individuo camina aproximadamente un dfa despues de la implantacion del dispositivo, aproximadamente dos dfas, aproximadamente tres dfas, aproximadamente cuatro dfas o aproximadamente cinco o mas dfas despues de la implantacion del dispositivo.

En realizaciones espedficas, la membrana externa llena de medio esta conectada a un sistema de drenaje para cambiar regularmente el medio. La diferenciacion condrogenica de los HDF es inducida por la tension mecanica y especialmente por la presion hidrostatica (IHP) y/o la tension de cizallamiento del fluido in vitro y despues in vivo. Ejemplos de condiciones de co-cultivo son las siguientes: cultivo de micromasa de alta densidad, suplementacion con BMP-2, acido ascorbico e hipoxia, por ejemplo.

Esta invencion resuelve muchos de los problemas del campo. Los nutrientes y factores de crecimiento se proporcionan a la construccion de celula-matriz a traves del medio in situ. Se evita el problema de la difusion de nutrientes a partir del tejido natural que lo rodea (placas terminales) que suele ser deficiente debido a la degeneracion de estas estructuras. Al medio se anaden factores de crecimiento importantes para la diferenciacion condrogenica de los HDF. En aspectos espedficos, se emplean HDF, lo que evita el uso de tecnica invasiva para cosechar los condrocitos. Los HDF, o cualquier otras celulas, se pre-diferencian in vitro durante un corto penodo de tiempo y continuan creciendo y diferenciandose in vivo. El dispositivo de encapsulacion con su envoltura externa que contiene fluidos proporcionara la carga fisiologica y las fuerzas de compresion ideal para la diferenciacion condrogenica de los HDF.

III. La construccion hfbrida

La invencion emplea una construccion tubrida para la reparacion de cartflago en una articulacion, tal como un disco intervertebral. Ejemplos de realizacion de la construccion hfbrida se describen en la presente memoria y en ciertos aspectos la construccion hfbrida es un dispositivo implantable, para la implantacion en un mairnfero, tal como un ser humano, perro, gato, caballo, cerdo, oveja, cabra, etcetera. En aspectos particulares, una construccion hfbrida esta comprendida por al menos un nucleo vivo, que comprende celulas y un armazon y una estructura inerte.

A. Composicion de celulas/armazon

El nucleo vivo, al que puede referirse como la composicion de celulas/armazon, es una construccion de celula-matriz y comprende celulas sembradas en un armazon (al que puede referirse como una matriz). En una realizacion espedfica, el armazon comprende perlas de alginato; un armazon microflmdico (el armazon microflmdico podna estar hecho de cualquier biopolfmero biodegradable [polfmeros biodegradables organicos: (acido poli-L-lactico) (PLA), poli(acido glicolico) (PGA), acido poli-lactico-co-glicolico (PLGA), hidrogeles naturales (colageno, HA, alginato, agarosa, quitosano, combinacion colageno/HA, quitosano/GAG, colageno/GAG) y/o hidrogeles sinteticos (poli (oxido de etileno), (PEO), poli (alcohol vimlico) (PVA), poli(acido acnlico) (PAA), poli(propileno-co-fumarato co- etilenglicol) (P(PF-co-EG))], por ejemplo. En realizaciones especfficas, se emplean ligandos de adhesion celular

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tales como peptidos o polisacaridos. Las secuencias peptfdicas pueden ser capaces de unirse a los receptores celulares. Estos peptidos pueden comprender las secuencias de aminoacidos de ejemplo arginina-glicina-acido aspartico (RGD), arginina-acido glutamico-acido aspartico-valina (REDV), tirosina-isoleucina-glicina-serina-arginina (YIGSR) o isoleucina-lisina-valina-alanina-valina (IKVAV) y pueden estar unidos al armazon, en el que los ligandos y/o factores de crecimiento se pueden incorporar para regular el destino celular. De hecho, los factores de crecimiento se pueden incorporar en el armazon o incluirse en el medio en la membrana externa, por ejemplo. Los materiales de andamiaje pueden ser biodegradables y la velocidad de biodegradacion puede ser manipulada.

De acuerdo con la invencion y como se explico anteriormente, los HDF se diferencian en celulas de tipo condrocito bajo tension mecanica, ya sea in vitro o in vivo o ambos, in vitro seguido de in vivo, por ejemplo. Como se explico anteriormente, condiciones de co-cultivo importantes incluyen el cultivo de alta densidad celular; factores de crecimiento (BMP-2) y/o acido ascorbico, por ejemplo. Los HDF tambien se pueden diferenciar en celulas de tipo condrocito en condiciones de baja tension de oxfgeno y cultivo en agrecanos con el factor de crecimiento insulfnico uno (IGF-I). Como se ha mencionado, se utilizan biorreactores para inducir la proliferacion y diferenciacion in vitro de HDF. En aspectos particulares de la invencion, la estructura inerte de la presente invencion se utiliza para inducir la diferenciacion in vivo. En realizaciones especfficas de la invencion, los HDF en perlas de alginato o hDf sembrados en un armazon microflufdico o los HDF sembrados en cualquier otro armazon polimerico estan encapsuladas en una membrana semipermeable que es parte de una estructura inerte. Una funcion de la membrana semipermeable es encapsular la construccion de condrocitos-matriz para concentrar la produccion de protefnas de la MEC. Esta membrana permite, por ejemplo, el paso de O2, nutrientes/desechos y CO2.

En realizaciones especfficas, el armazon se refiere a una construccion de polfmero biodegradable poroso para soportar el crecimiento celular y/o la migracion. En realizaciones especfficas, este material es no toxico, biocompatible y biodegradable.

En ejemplos de realizaciones, se emplea alginato para el armazon. El alginato es un polisacarido natural aislado de algas marinas. Se trata de un polisacarido compuesto de monomeros de D-manuronato y L-guluronato. Cuando se reticula con iones de calcio, se forma un gel que es biocompatible, biodegradable. El alginato esta bien establecido como material de matriz para el tejido dentro de la medicina regenerativa. Se ha utilizado mas ampliamente que otros hidrogeles para evaluar el potencial in vivo de los armazones de hidrogel para la ingenierfa de cartflago. En esta invencion se pueden usar macroperlas de alginato (de 1-3 mm de tamano) o microperlas de alginato (250-500 pm). Se prefieren las microperlas de alginato. Estas perlas mas pequenas tienen la ventaja de tener una relacion superficie-volumen mayor, lo que permite no solo un buen transporte de nutrientes esenciales, sino que tambien son menos fragiles. El alginato es biocompatible y esta aprobado por la Administracion de Alimentos y Farmacos de los EE.UU. para el uso humano.

Los HDF se pueden sembrar en macroperlas de alginato (como se describe a continuacion) o preferentemente en microperlas de alginato. Existen diferentes tecnicas conocidas en la tecnica para generar microperlas de alginato. Se producen generalmente mediante generacion electrostatica de gotas. Por ejemplo, se pueden sembrar HDF en microperlas de alginato como sigue. Se disuelve polvo de alginato (Sigma, St Louis, MO) en agua WFI a una concentracion de 2,2 % p/p y luego se mezcla con una suspension de HDF en medio de cultivo para obtener concentraciones finales de 1,5 % p/p de alginato y 107 celulas/ml. A continuacion se producen microperlas de alginato mediante la generacion electrostatica de gotitas. En resumen, la suspension de celulas/alginato se extruye a traves de una aguja de acero inoxidable roma cargada positivamente a un caudal constante de 14,0 ml/h mediante una bomba de jeringa y las gotas resultantes se recogen en un bano de gelificacion (1,5 p/v CaCU). A medida que los iones de Na+ se intercambian con los iones de Ca2+, las gotitas de alginato se endurecen y forman microperlas insolubles con celulas atrapadas. Las microperlas se dejan durante 30 min en el bano de gelificacion con el fin de completar la gelificacion.

En realizaciones particulares tambien se emplean armazones microflufdicos. Son los armazones complejos con resolucion a escala micrometrica. Estos armazones presentan una red de micro-canales que permiten el flujo de fluido dentro del armazon. Esta red de microcanales ayuda a proporcionar nutrientes y factores solubles a las distintas secciones del armazon. Estos armazones pueden estar hechos de diferentes biopolfmeros. Pueden estar hechos de polfmeros sinteticos tales como acido poliglicolico (PGA), acido polilactico (pLa), acido polilactico-co- glicolico (PLGA); hidrogeles sinteticos tales como poli(oxido de etileno) (PEO), poli(alcohol vinflico) (PVA), poli(acido acrflico) (PAA), poli(propilenglicol fumarato-co-etilenglicol (P(PF-co-EG) o de poli(glicerol-sebacato) (PGS), que es un elastomero biodegradable. En la invencion, este armazon microflufdico se encapsula con una membrana semipermeable. Esta membrana semipermeable permite la perfusion de medio que contiene nutrientes y factores de crecimiento dentro del armazon. Al circular dentro de la red de microcanales, el medio aplicara tension de cizallamiento del fluido en las celulas sembradas en este armazon. Esta fuerza mecanica es crftica para la diferenciacion condrogenica de los HDF.

B. La estructura inerte

En la invencion, la construccion hfbrida emplea una estructura inerte, como parte de su composicion. Las funciones de la estructura inerte pueden ser biologicas (suministro de nutrientes y/o factores de crecimiento) y/o mecanicas

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(para transferir las fuerzas mecanicas, tales como en la composicion de celulas/armazon; tales fuerzas pueden incluir IHP y/o tension de cizallamiento del fluido), por ejemplo. La estructura inerte puede funcionar como un “biorreactor in vivo" mediante la transferencia de la tension mecanica y proporcionando medio (por perfusion a traves de la membrana semipermeable) a la composicion de celulas/armazon.

En ciertas realizaciones, las funciones de la estructura inerte incluyen una o mas de los siguientes: 1) encerrar hermeticamente el nucleo vivo; 2) actuar como una membrana semipermeable, permitiendo que ciertas moleculas (por ejemplo, nutrientes, factor de crecimiento, etc.) pasen a traves de ella por difusion (y ocasionalmente “difusion facilitada" especializada) en ciertas condiciones ffsico-qufmicas (por ejemplo, presion hidrostatica, concentracion osmotica, temperatura, etc.); 3) transferir la carga y compartir el estres mecanico dinamico (presion hidrostatica) al compartimiento vivo actuando como un inductor de la diferenciacion celular y/o 4) actuar como un biorreactor in vivo.

En realizaciones especfficas, la estructura inerte puede ser considerada como un dispositivo de encapsulacion. Para ciertas realizaciones, esta disenada para aplicar una tension mecanica sobre las celulas sembradas en la composicion armazon tridimensional. La membrana externa del dispositivo de encapsulacion esta llena de lfquido (medio). El fluido encerrado dentro de la envoltura forma un entorno de fluido que transfiere la presion hidrostatica cfclica a las celulas vivas. Cuando el paciente se pone de pie, por ejemplo, se aplica cierta carga en la columna vertebral que se transfiere a las celulas vivas a traves de la envoltura externa que se llena con fluido. Esta membrana proporciona la carga fisiologica y las fuerzas de compresion adecuadas para la diferenciacion condrogenica de las celulas, tales como HDF. En el caso de las celulas incrustadas en un armazon microflufdico, el medio que circula dentro de los micro-canales tambien aplica tension de cizallamiento de fluido a las celulas. Este esfuerzo de cizallamiento de fluido es otra fuerza que induce la diferenciacion condrogenica de las celulas.

En realizaciones especfficas, la membrana esta generalmente en forma de globo y en realizaciones adicionales las membranas son generalmente concentricas entre si. En otras realizaciones especfficas, la estructura inerte comprende dos biopolfmeros en forma de globo expandible, concretamente, globo interno “I", que esta encerrado dentro de un globo externo “E". Por lo tanto, la estructura inerte comprende dos envolturas concentricas capaces de ser sucesivamente infladas y que tienen actividad de inflado. En ciertos aspectos, se puede utilizar un numero X de membranas en el dispositivo, en el que X es cualquier numero entero mayor que uno. Es decir, se pueden instalar X globos de forma concentrica a modo de capas de una cebolla, definiendo cada uno de ellas un espacio con una funcion especffica (por ejemplo, para los residuos, medios, oxfgeno y/o para la conexion del injerto al tejido natural).

En una realizacion, el globo, capa o envoltura exteriores “E" comprende un material biocompatible flexible, inflable, hermetico, expansible, y/o reabsorbible (tiempo Ti, en el que Ti es el tiempo de resorcion completa de “E") que es capaz de ser sellado una vez instalado en la cavidad. En realizaciones especfficas, el globo externo “E" es capaz de tener o tiene una o mas de las siguientes actividades: 1) recibir un segundo globo o capa o envoltura internos “I" que encierra las celulas (en forma de construccion de matriz celular o solucion de celulas o injerto); 2) ser inflado con un medio (por ejemplo, lfquido) o para expandir su pared (por ejemplo, por hinchamiento) con el fin de llenar la cavidad resultante de la discectomfa y 3) cerrar el defecto del anillo para evitar que se “hernie" o que salga del espacio inter- somatico traves de la incision de tenotomfa una vez que la construccion esta sometida a una carga.

En una realizacion, el globo o capa internos “I" comprende un material biocompatible, elastico, inflable, semipermeable y/o reabsorbible (tiempo T2 <T1, en el que T2 es el tiempo de reabsorcion completa de “I") que es capaz de sellar el nucleo vivo una vez instalado en la capa externa. El globo interno (envoltura, membrana o capa) “I" es capaz de tener o tiene las siguientes actividades: 1) envolver hermeticamente el nucleo vivo; 2) actuar como una membrana semipermeable permitiendo que ciertas moleculas (por ejemplo, nutrientes, factores de crecimiento, etc.) pasen a traves de ella por difusion (y ocasionalmente “difusion facilitada" especializada) en ciertas condiciones ffsico-qufmicas (por ejemplo, presion hidrostatica, concentracion osmotica, temperatura, etc.); y 3) transferir la carga al nucleo vivo de modo que comparta la tension mecanica con el mismo, actuando asf como un inductor de la diferenciacion celular.

De acuerdo con un aspecto de la invencion, la combinacion de un medio de compartimento externo (tal como un lfquido, por ejemplo) o pared hinchada (tal como un hidrogel hidratado, por ejemplo) “E" y la envoltura semipermeable interna proporcionan un sistema de suministro de nutrientes y factores de crecimiento capaces de alimentar un nucleo vivo interior. Estas envolturas tambien transfieren las fuerzas mecanicas, incluyendo la presion hidrostatica al nucleo vivo.

La estructura inerte es un dispositivo de encapsulacion destinado a envolver, alimentar y diferenciar un nucleo vivo hecho de celulas, tales como HDF.

En una realizacion preferida, la estructura inerte comprende dos membranas biopolimericas en forma de globo expandible, concretamente, la membrana interna “I", que esta encerrada dentro de una membrana externa “E". Por lo tanto, la estructura inerte comprende dos envolturas concentricas destinadas a ser infladas sucesivamente. En la posicion de reposo, las dos envolturas “I" y “E" son planas, deformables, con forma y encajan entre sf. En realizaciones especfficas, ambas pueden ser selladas una vez implantadas. La composicion de estructura inerte puede ser determinada por la eleccion del sistema de ingenierfa de tejidos.

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La envoltura exterior “E” comprende un material que es inflable (con el fin de ser implantado plano a traves de un abordaje posterior mfnimamente invasivo, ser cargado despues con el nucleo vivo y despues inflarse con la solucion de medios); elastico (para transferir el reparto de carga sobre el nucleo vivo); expandible (para permitir su expansion y llenar la cavidad resultante de la discectomfa); permeable al O2 pero hermetico a los fluidos: la hipoxia relativa es un parametro util de conversion de los HDF, pero la tension de O2 dentro del disco natural es apropiadamente baja; biodegradable (para permitir que el injerto vuelva a conectar con el disco natural); biocompatible (para minimizar la reaccion inflamatoria); reabsorbible (tiempo T1) o una combinacion de los mismos.

En realizaciones especfficas, “E” se puede colocar en una articulacion, por ejemplo, en la cavidad resultante del curetaje de un espacio inter-somatico. Tambien puede ser mecanicamente capaz de mantener la altura del disco bajo carga. En realizaciones adicionales, “E” recibe un segundo globo interno “I” que encierra el nucleo vivo. “E” puede ser inflado con una solucion de fluido (por ejemplo, los medios) para extenderse en la camara (cavidad resultante de la discectomfa) perifericamente hasta el tejido discal restante y llenar la cavidad. “E” esta configurado de tal manera que permite cambiar los medios (eliminacion de residuos metabolicos y/o reposicion de nutrientes y/o factores de crecimiento, por ejemplo), tal como por ejemplo bajo un regimen isobarico. En ciertos aspectos, “E” actua como un biorreactor in vivo mediante la transferencia de la comparticion de carga en el nucleo vivo, por ejemplo, con la presion hidrostatica cfclica (que es util para diferenciar celulas en celulas de tipo condrocito). En realizaciones particulares, la configuracion de “E” produce hipoxia relativa debido a sus caracterfsticas (la hipoxia o agente que imita la hipoxia, como lactato, induce la conversion de los HDF en celulas de tipo condrocito). “E” tambien puede cerrar el defecto del anillo (apertura de tenotomfa) para evitar que se “hernie” o que salga del espacio inter-somatico traves de la incision de tenotomfa una vez que la construccion esta sometida a una carga.

En ciertos aspectos de la invencion, la membrana interna “I” comprende una membrana que es biocompatible; elastica; inflable (a medida que se consume el medio, el nucleo vive crece y se expande a la pared interna de la membrana externa); semipermeable sistema de liberacion controlada para nutrientes, factores de crecimiento, etc.); biodegradable (de manera que no interfiere con las propiedades a largo plazo del tejido reparado) y reabsorbible (tiempo T2 < Ti). “E” debe reabsorberse despues de “I” no solo para evitar las fugas y la perdida de los medios mientras que el nucleo vivo todavfa no esta maduro, sino tambien para mantener la “I” alejada de cualquier tension mecanica directa). En otros ciertos aspectos, “I” envuelve hermeticamente el nucleo vivo; actua como un sistema de administracion de nutrientes y factores de crecimiento capaces de alimentar un nucleo vivo interno a traves de una membrana semipermeable, permitiendo que ciertas moleculas (por ejemplo, nutrientes, factor de crecimiento etc.) pasen a traves de ella por difusion (y ocasionalmente “difusion facilitada” especializada) en ciertas condiciones ffsico-qufmicas (por ejemplo, presion hidrostatica, concentracion osmotica, temperatura, etc.)

Estas dos membranas (“E” e “I”) definen 2 volumenes Ve y Vi. Estos dos volumenes distintos pueden tener diferentes formas (esferica, cilfndrica, conica, etc.) en funcion del contorno de la cavidad intervertebral y el reparto de la carga. En realizaciones especfficas, el dispositivo se ajusta a la forma de la cavidad.

En realizaciones especfficas, el volumen Ve se define como el espacio que separa la membrana “E” de la membrana “I”. Se compone de nutrientes y factores de crecimiento (medios) que son suministrados a las celulas, tales como a traves de la membrana semipermeable “I”. Tambien actua como una estructura de soporte de carga capaz de transferir la tension mecanica, por ejemplo, el regimen de presion hidrostatica cfclica o la elevada tension de cizallamiento del fluido (debido a su alto contenido de agua) al nucleo vivo (lo que induce la diferenciacion condrogenica de las celulas, tales como los HDF).

El volumen Vi se define como el espacio que esta exteriormente limitado por la membrana semipermeable interna “I” y comprende el nucleo vivo hecho de celulas de tipo condrocito, tales como celulas derivadas de HDF.

Hasta que el nucleo vivo no se ha convertido en viable (p.ej. capaz de mantenerse por sf mismo), los medios encerrados en Ve se pueden cambiar regularmente a fin de eliminar cualesquiera residuos toxicos acumulados debido al metabolismo (radicales libres y/o acido lactico, por ejemplo), asf como cualquier otro recorte o desecho celular como resultado del crecimiento celular. Un cambio de este tipo permite la reposicion de su contenido con nutrientes y/o factores de crecimiento. En realizaciones especfficas, este procedimiento se realiza periodicamente, tal como una o mas veces por semana o mes, por ejemplo, al menos una vez a la semana, tal como dos veces a la semana. En realizaciones especfficas adicionales, se requiere dotar a “E” con una caracterfstica adicional para drenar Ve. Este sistema de drenaje puede estar hecho de uno o mas tubos y uno o mas depositos, en ciertos aspectos, y en realizaciones particulares comprende dos tubos y dos depositos. El primer tubo se puede emplear para eliminar los medios utilizados y el segundo tubo se puede emplear para inyectar los nuevos medios. Cada uno de estos tubos (o cateteres) comprende un extremo proximal que se conecta hermeticamente a VE y un extremo distal que se conecta a un deposito. Estos cateteres podrfan estar hechos del mismo material que “E” o de caucho de silicona, por ejemplo. Su longitud puede ser cualquier longitud adecuada con tal de que puedan extenderse desde el deposito hasta el dispositivo. Tambien pueden estar comprendidos entre aproximadamente 10 y 15 centfmetros y ser configurados antes de la operacion mediante la reduccion de su extremo distal a la longitud adecuada en funcion de la profundidad del lugar de la operacion y los datos anatomicos (morfologfa del paciente). Su diametro externo puede ser de cualquier longitud adecuada, pero en realizaciones especfficas son de aproximadamente 2,5 milfmetros de longitud, con el fin de ser lo suficientemente pequenos para salir por la abertura

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de tenotomfa, no comprimir o lesionar la rafz adyacente y permitir un diametro interno de 1,2 milfmetros.

Los tubos pueden implantarse en el extremo de un procedimiento de discectomfa, despues de la implantacion, inflado y sellado del biorreactor y antes del cierre de la piel. Pueden estar conectados al extremo distal de cada tubo (cateter). A continuacion, cada deposito puede estar colocado subcutaneamente de forma que pueda ser accesible por una aguja de la piel (puncion percutanea).

En una realizacion, el nucleo vivo disenado esta pre-encapsulado con “I” y luego se desliza en “E”. A medida que se van consumiendo los medios, el nucleo vivo se expande hasta la pared interior de la envoltura “E”. La envoltura “E” se reabsorbe y el injerto se vuelve a conectar con el disco restante natural.

1. La membrana semipermeable interna

La envoltura interna comprende el nucleo vivo, incluye, por ejemplo, un sistema de liberacion controlada (con el fin de permitir la alimentacion del nucleo vivo con los medios a traves de sus caracterfsticas de semipermeabilidad), es expansible (a medida que los medios se consumen, el nucleo vivo se expande hasta la pared interna de la membrana externa) y/o es biodegradable (con el fin de no interferir con las propiedades a largo plazo del tejido reparado).

En realizaciones especfficas, la membrana interna es una membrana semipermeable que envuelve la composicion de celulas-andamiaje. Esta membrana semipermeable es permeable a moleculas pequenas y por lo tanto permite la difusion de nutrientes y oxfgeno y la eliminacion de los desechos; pero esta membrana es impermeable a las macromoleculas tales como colageno y glicosaminoglicanos. Estas macromoleculas que forman la matriz extracelular natural son entonces retenidas dentro de la armazon. Esta membrana tambien afsla la construccion de celulas-matriz del entorno del hospedador y la protege de la respuesta inflamatoria e inmunologica del hospedador contra el armazon biopolimerico.

Se pueden usar varios polfmeros y mezclas de polfmeros para la fabricacion de esta membrana, incluyendo pero sin limitarse a, poliacrilatos (incluyendo copolfmeros acrflicos), polivinilidenos, copolfmeros de poli(cloruro de vinilo), poliuretanos, poliestirenos, poliamidas, acetatos de celulosa, nitratos de celulosa, polisulfonas (incluyendo polieter sulfonas), polifosfacenos, poliacrilonitrilos, poli(acrilonitrilo/co-cloruro de vinilo), PTFE, asf como derivados, copolfmeros y mezclas de los anteriores.

En una realizacion, la membrana semipermeable se genera por la formacion de complejos de polielectrolito: polianion (PA) y polication (PC) a traves de las interacciones entre los polfmeros de carga opuesta que forman el complejo polielectrolito (PEC). El componente anionico puede ser, por ejemplo, un polfmero biocompatible, tal como, pero sin limitarse a, alginato de sodio, sulfato de celulosa, carboximetilcelulosa o acido hialuronico y el componente cationico puede estar hecho de un polfmero, tal como, pero sin limitarse a, quitosano, poli(L-lisina, poli(L-ornitina), poli(metilen-co-guanidina), poli(vinilamina), poli(etilenimina), poli(DADMAC) o poli(N-vinilpirrolidona).

Para llevar a cabo la encapsulacion de la construccion de celulas-matriz con una membrana semipermeable PEC, construccion de celulas-matriz se sumerge primero en la solucion anionica y luego en la solucion cationica. Despues de un tiempo de reaccion que varfa en funcion de la naturaleza de los componentes anionicos y cationicos, se forma una membrana semipermeable mecanicamente estable. Dependiendo de las condiciones de reaccion (concentracion de polfmero, tiempo de reaccion), el armazon esta hermeticamente envuelto dentro de la membrana o separado por un espacio.

El volumen Vi, se define como el espacio que esta exteriormente limitado por la membrana semipermeable interna “I” y comprende el nucleo vivo hecho de, por ejemplo, celulas de tipo condrocito derivadas de HDF.

2. La membrana externa

La membrana externa puede ser expandible, elastica y/o hinchable con el fin de ser implantada a traves de un procedimiento quirurgico mfnimamente invasivo posterior y cuando se expande para ajustarse exactamente a la cavidad de la discectomfa. Esta membrana es hermetica a los fluidos pero permeable al oxfgeno y se llena con medio que proporciona nutrientes y factores de crecimiento a las celulas. El fluido encerrado dentro de la envoltura forma un entorno fluido que transfiere IHP a las celulas vivas. Cuando el paciente se pone de pie, se aplica cierta carga en la columna vertebral que se transfiere a las celulas vivas a traves de la membrana que esta llena de fluido. Esta membrana es mecanicamente resistente para soportar la carga.

La membrana externa puede estar hecha de un polfmero biocompatible, biodegradable. Para la fabricacion de esta membrana se pueden usar varios polfmeros, incluyendo, pero sin limitarse a, acido poliglicolico (PGA), acido polilactico (PLA), acido polilactico-co-glicolico (PLGA), poli-£-caprolactona (PCL), poliuretano (PU), polidioxanona (PDO), polietilenos, poli(sebacato de glicerol) (PGS), asf como derivados, copolfmeros y mezclas de los anteriores. En una realizacion la membrana esta comprendida por un poliuretano expansible, biocompatible y biodegradable.

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Esta membrana esta en contacto directo con el tejido circundante del hospedador y es biocompatible para evitar la reaccion inflamatoria del hospedador. Se pueden utilizar diferentes tecnicas para mejorar la biocompatibilidad de la membrana, pero sin limitarse a, el recubrimiento de la membrana con acido hialuronico.

IV. Celulas utilizadas en la invencion

En ciertas realizaciones de la invencion, se puede emplear cualquier celula siempre que la celula es capaz de diferenciarse en una celula condrocito o en una celula de tipo condrocito. En realizaciones especfficas, la celula es de hecho un condrocito, aunque puede ser derivada de una celula madre (por ejemplo, celula madre mesenquimal) o una celula fibroblasto, tal como un fibroblasto dermico, fibroblasto del tendon, fibroblasto de ligamento o fibroblasto sinovial. Las celulas autologas pueden utilizarse, aunque en realizaciones alternativas se emplean celulas alogenicas; en realizaciones especfficas, se han ensayado celulas alogenicas en relacion a una enfermedad y se consideran adecuadas para la transmision humana. En ciertos aspectos de la invencion, la celula o celulas son autologas, aunque en realizaciones alternativas, las celulas son alogenicas. En los casos en los que las celulas no son autologas, antes del uso en la invencion, las celulas pueden ser procesadas por medios convencionales en la tecnica para eliminar los materiales potencialmente peligrosos, patogenos, etc. En aspectos particulares, las celulas pueden ser transfectadas con uno o mas acidos nucleicos, tales como transfectadas con un factor de crecimiento, incluyendo por ejemplo, BMP-2 BMP-4, BMP-6 y/o BMP-7.

En aspectos particulares, la diferenciacion de tipo condrocitos como de fibroblastos dermicos humanos se puede facilitar mediante el empleo de uno o mas de los siguientes: siembra de celulas en alginato; siembra de celulas en protefnas de la matriz extracelular tales como, agrecano o perlecan, condiciones de hipoxia (tales como hipoxia o uno o mas agentes que imitan hipoxia, por ejemplo lactato, deferoxamina mesilato (DFX), cloruro de cobalto (COCh) o nfquel, por ejemplo); cultivo de micromasa de alta densidad; presencia de uno o mas factores de crecimiento (incluyendo, por ejemplo, protefnas morfogeneticas oseas (BMP), incluyendo al menos BMP-2; factor de crecimiento transformante beta (TGF-p); factor de crecimiento de insulina uno (IGF-I) y factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) y particularmente el factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF) y FGF-2, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), protefna morfogenetica derivada de cartflago (CDMP)]; presencia de acido ascorbico, dexametasona, protefna relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP), protefnas hedgehog: Sonic hedgehog (Shh) e Indian hedgehog (IHH)). Se puede emplear el cultivo bajo tension mecanica. El cultivo de micromasa de alta densidad es una tecnica de cultivo que imita la etapa de condensacion celular que se produce durante la aparicion de la formacion de cartflago en la extremidad en desarrollo.

En aspectos particulares de la invencion, se emplean fibroblastos dermicos humanos, al menos porque pueden ser cosechados de forma no invasiva, tal como de una biopsia en sacabocados de tan solo 3 mm diametro (en realizaciones especfficas) de piel, por ejemplo, una muestra de piel de biopsia circular. Ademas, los fibroblastos dermicos humanos se pueden expandir facilmente en cultivo y pueden diferenciarse en celulas de tipo condrocito en condiciones de cultivo particulares.

De acuerdo con la invencion, los HDF autologos se cosechan de la biopsia en sacabocados de tejido de la piel (6 mm) del paciente. En el laboratorio, se diseccionan con tijeras la grasa subcutanea y la dermis profunda. El tejido restante se trocea y se incuba durante la noche en tripsina 0,25 % a 4 °C. A continuacion, los fragmentos dermicos y epidermicos se separan mecanicamente. Los fragmentos dermicos de la biopsia se trocean y los trozos se utilizan para iniciar cultivos de explantes. Los fibroblastos cosechados de los explantes se cultivan en MEM de Dulbecco (DMEM) con suero de ternera 10 % a 37 °C en CO2 8 %. En aspectos particulares, estas celulas se expanden antes de ser diferenciadas en condrocitos.

Algunos aspectos pueden emplear HDF adquiridos comercialmente, tales como de los laboratorios (tales como Cascade Biologics). Las celulas pueden ser HDF adultos o HDF neonatales. Por ejemplo, los fibroblastos de prepucio neonatal son una fuente muy conveniente de celulas. Estas celulas se utilizan comercialmente y son de facil acceso y faciles de cultivar.

V. Crecimiento y diferenciacion de las celulas en condrocitos o celulas de tipo condrocito

El estres/tension mecanica son factores importantes para la condrogenesis. El presente metodo utiliza una o mas cepas mecanicas y, en realizaciones particulares, utiliza la presion hidrostatica intermitente (IHP) como inductor de la diferenciacion condrogenica de HDF. Se sabe que la IHP es un potente estfmulo para la induccion y mantenimiento del fenotipo de los condrocitos. Estudios recientes han demostrado que la IHP estimula la condroinduccion de fibroblastos de embriones murinos cultivados con BMP-2. La IHP tambien puede inducir la diferenciacion condrogenica de los HDF. Se sabe que los HDF pueden diferenciarse en celulas de tipo condrocito en condiciones de baja tension de oxfgeno. Por lo tanto, de acuerdo con una realizacion de la presente invencion, la tension mecanica, especialmente la IHP y la tension de cizallamiento del fluido, inducen la diferenciacion condrogenica de fibroblastos cultivados, por ejemplo, en una matriz tridimensional y con bajo nivel de oxfgeno.

La tension mecanica se puede realizar in vitro, in vivo, ex vivo, in vitro seguido por in vivo, o una combinacion de los mismos. En una realizacion, se iniciara la diferenciacion in vitro y las celulas de tipo condrocito sembradas en la

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matriz se implantaran a continuacion in vivo y seguiran creciendo y diferenciandose. En aspectos especfficos de la invencion, la estructura inerte esta destinada a proporcionar un regimen de carga fisiologico para inducir la diferenciacion in vivo de los HDF.

En aspectos especfficos de la invencion, las celulas se inducen para someterse a la diferenciacion en condrocitos o celulas de tipo condrocito. Esta diferenciacion se puede producir antes del suministro in vivo, tal como en un armazon o para el posterior suministro in vivo. En realizaciones especfficas, la celula se somete a condiciones para facilitar la diferenciacion en condrocitos. En una realizacion especffica adicional, una condicion comprende la tension mecanica. La regulacion de genes por fuerzas mecanicas se ha estudiado ampliamente para las celulas endoteliales vasculares y condrocitos que estan obviamente sometidos a cizallamiento del fluido o carga de presion elevados. En realizaciones especfficas de la invencion, la tension mecanica estimula la diferenciacion condrogenica de los HDF. Tal tension mecanica puede ser de cualquier tipo, aunque en realizaciones especfficas comprende presion hidrostatica y/o la tension de cizallamiento del fluido. En realizaciones especfficas adicionales, la tension es constante o intermitente.

En la presente invencion, la tension mecanica, especialmente la presion hidrostatica cfclica y la tension de cizalladura del fluido inducen la diferenciacion condrogenica de los fibroblastos sembrados en una matriz tridimensional. La eleccion de las condiciones de co-cultivo para estimular la diferenciacion condrogenica de los HDF se basa en los datos conocidos en la tecnica. Se conocen diferentes ejemplos de factores tales como el cultivo celular de alta densidad, el cultivo con BMP-2 y acido ascorbico, el cultivo en baja tension de oxfgeno, para estimular la condrogenesis y se utilizan unicamente como ejemplos en la invencion como cofactores, ademas de la tension mecanica.

Los condrocitos de los discos intervertebrales son diffciles de cosechar. Las celulas autologas se obtienen a partir del disco del paciente y por lo tanto requiere un procedimiento invasivo (cirugfa de la espalda) para realizar una biopsia. Si las celulas se cosechan a partir de un disco sano, se pone en peligro el funcionamiento de un disco normal. Si las celulas son cosechadas a partir de un disco danado durante la discectomfa, se obtienen celulas anormales de un tejido degenerado. Por otra parte, los condrocitos son diffciles de expandir en cultivo, ya que sufren desdiferenciacion. Los condrocitos de otros cartflagos tales como el cartflago elastico de la oreja son faciles de cosechar pero solo produce cartflago hialino y no fibro-cartflago como en el disco. Las celulas madre que se utilizan generalmente para la ingenierfa de tejidos tambien tienen algunas desventajas, ya que requieren una biopsia de medula osea. Se necesita una gran cantidad de celulas para la ingenierfa de tejidos y es diffcil obtener una cantidad suficiente de celulas madre adultas.

La justificacion del uso de HDF autologas como medio de fuente de celulas es la siguiente: 1) los HDF se pueden cosechar de forma no invasiva a partir de una biopsia en sacabocados de una muestra de piel circular de tan solo 3,0 mm, por ejemplo; 2) no existe el riesgo de contaminacion de otro donante (por ejemplo, virus de la hepatitis B, virus de inmunodeficiencia humana, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, etc.) y 3) los HDF pueden expandir facilmente en cultivo y diferenciarse en celulas de tipo condrocito en condiciones de cultivo particulares. Podrfan utilizarse otras poblaciones de fibroblastos, tales como, por ejemplo, de tendon o de ligamento. En una realizacion, se prefieren fibroblastos autologos.

La eleccion de las condiciones de cultivo para estimular la diferenciacion condrogenica de los HDF se basa en los datos conocidos en la tecnica. Diferentes factores apoyan la condrogenesis, tales como, por ejemplo, el cultivo celular de alta densidad, el cultivo con BMP-2 y acido ascorbico, y la siembra de las celulas en la matriz de alginato. El crecimiento y/o diferenciacion in vitro de las celulas en la composicion de celulas/armazon puede comprender al menos dos o mas dfas antes de su uso in vivo. En ciertos casos, las celulas pueden ser comprobadas o supervisadas para asegurar que al menos algunas de las celulas se multiplican. Las celulas que no se estan dividiendo y/o que no se fijan directa o indirectamente con el armazon pueden ser eliminadas.

En otras realizaciones, los HDF estan incrustados en hidrogel que en realizaciones especfficas es un hidrogel natural, tal como colageno, acido hialuronico (HA), una combinacion de colageno/HA, alginato, quitosano; un hidrogel sintetico, tal como poli(oxido de etileno) (PEO), poli(alcohol vinflico) (PVA), poli(acido acrflico) (PAA), poli(propileno fumarato-co-etilenglicol (P(PF-co-EG) y polipeptidos, u otros polfmeros biodegradables tales como poli(acido L-lactico) (PLA), poli(acido glicolico) (PGA), acido poli-lactico-co-glicolico (PLGA) o una combinacion de cualquiera de estos polfmeros antes mencionados. Una compresion hidrostatica cfclica se aplica a continuacion usando cualquier biorreactor in vitro de la tecnica adecuado.

VI. Metodos de reparar el cartflago danado

En ciertas realizaciones, la invencion incluye metodos de reparacion de cualquier cartflago danado, aunque en aspectos particulares el cartflago esta en un disco intervertebral o en cualquier articulacion. En general, para las realizaciones de disco cuando un disco intervertebral se debe quitar de entre dos vertebras adyacentes, por ejemplo, en la columna lumbar, es menos invasivo que la cirugfa proceda posteriormente desde la parte posterior del paciente. Este procedimiento mfnimamente invasivo permite proceder con el curetaje del espacio intersomatico a traves de una pequena abertura dentro del espacio del anillo (tenotomfa) para retirar los fragmentos degenerados

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del nucleo del disco. Dado que la fenestracion del anillo es pequena, la presente invencion proporciona una construccion intervertebral que se desliza a traves de la incision antes mencionada y despues se expande en el espacio generado por la extraccion del nucleo dentro del espacio intersomatico. La eliminacion del disco danado y la instalacion de la construccion se realizan en el mismo abordaje posterior.

Como se ha mencionado anteriormente, la estructura inerte esta hecha de dos globos expandibles “I” y “E”. En la posicion de reposo, los dos globos “I” y “E” son planos, deformables, tienen forma y encajan entre si. Una vez que el globo “I” esta el interior del globo “E”, ambos estan instalados tanto en el espacio intervertebral como a traves de la abertura del anillo y despues son sucesivamente inflados de modo que definen dos volumenes distintos (Ve > Vi) con formas (esferica, cilfndrica, conica, etc.,) dependiendo, por ejemplo, del contorno de la cavidad intervertebral y el reparto de carga.

En aspectos particulares, el primer globo que se ha de llenar es el globo interno “I” con independencia del volumen de la cavidad restante. El volumen Vi representa el nucleo de la construccion que recibe y alberga el nucleo vivo. Una vez llenado con el nucleo vivo, el globo “I” se sella hermeticamente. Es decir, una vez que la envoltura “I” se coloca en la envoltura “E”, ambas se situan en el espacio intervertebral a traves de la abertura anular y despues son infladas sucesivamente. “I” es el primero en ser equipado con la implantacion del nucleo vivo y luego se sella. Entonces, el globo externo “E” se infla con la solucion de los medios hasta que su volumen Ve consigue un contorno que se acopla con, o sigue, la superficie interior de la parte restante del disco natural despues del legrado del mismo. Esta superficie interior del disco restante puede ser o bien el resto del tejido de nucleo o la pared interna del anillo natural, dependiendo de la extension del legrado que se ha realizado.

En una segunda realizacion para instalar la construccion intervertebral, “E” se posiciona en el espacio intervertebral, a continuacion, “I” se coloca en “E” y ambos se llenan sucesivamente como se menciono anteriormente. En una tercera realizacion, “E” se posiciona en la cavidad de la discectomfa, a continuacion, el nucleo vivo pre-encapsulado se coloca en “E”, y luego “E” se llena con los medios.

El volumen de la cavidad resultante de la discectomfa se puede evaluar antes de la instalacion del globo externo “E” de tal manera que el volumen de lfquido adecuado puede seleccionarse e inyectarse. El volumen de la cavidad puede ser, por ejemplo, medido introduciendo un fluido (por ejemplo, agua) en su interior, hasta que la cavidad se llena con el mismo y despues extrayendo el lfquido de la cavidad por medio de una jeringa, de modo que se mide sustancialmente exactamente el volumen de la cavidad.

En ciertos aspectos, la composicion de la estructura inerte depende de la eleccion del sistema de ingenierfa de tejidos que se basa en el material de fabricacion, las caracterfsticas de los poros, capacidad de absorcion y las propiedades mecanicas, por ejemplo, tales como polfmeros no degradables, polfmeros degradables o hidrogeles de origen natural (por ejemplo colageno, fibrina, agarosa, alginato, etc).

El nucleo vivo o compartimento (Vi) esta hecho de celulas de tipo condrocito derivados de fibroblastos dermicos humanos (HDF) autologos, por ejemplo, como los cosechados de la piel del paciente y sembrados en un armazon (como por ejemplo perlas de alginato o armazon microflufdico o cualquier otro armazon polimerico) y alimentados desde el compartimiento de apoyo (Ve). La ventaja de esta construccion hfbrida que combina tanto un biomaterial inerte que actua como un sistema de suministro de nutrientes y celulas vivas facilmente cosechadas de la piel es que es capaz de automantenimiento o remodelacion y puede restaurar la funcion del disco usando un abordaje quirurgico posterior mfnimamente invasivo. El volumen Ve, se define como el espacio que separa la capa “E” de la capa “I” que comprende nutrientes y factores de crecimiento (medios) que se suministraran a las celulas (sistema de administracion). Este volumen puede ser el resultado de su llenado por los medios lfquidos o del hinchamiento de su pared (biomaterial hidrofilo expandible como hidrogel, por ejemplo) despues de haber sido hidratado (los medios estan compuestos por una alta proporcion de agua).

Los factores de crecimiento pueden ser administrados a traves de la membrana semipermeable interna “I”. Ejemplos de factores de crecimiento incluyen, por ejemplo, la protefna morfogenetica derivada de cartflago (CDMP), protefnas morfogeneticas oseas (BMP), factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), factor de crecimiento de insulina uno (IGF-I), factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).

La deformacion mecanica, tal el alto cizallamiento del fluido y/o carga de presion, se transfiere sobre la capa interna “I”, y por lo tanto en Vi a traves de la capa externa “E” y el area externa Ve. Esta tension mecanica induce la diferenciacion condrogenica de las celulas dentro de la capa interna.

A continuacion, se instala el sistema de drenaje, en el que cada cateter que sale del espacio intervertebral a traves de la abertura de tenotomfa se mantiene cuidadosamente lejos de la rafz adyacente o al menos se situa a lo largo de la rafz sin ningun conflicto perjudicial.

Se abre una ruta transmuscular usando un introductor desde el lugar operativo hasta una ubicacion subcutanea distante de la abertura de la piel. Cada tubo esta “tunelizado” en la ruta muscular mencionada anteriormente y despues se conecta al deposito correspondiente. Los dos depositos estan distantes de la incision cutanea media,

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posicionados a 2 o 3 cm de la linea media, colocados subcutaneamente de manera que sean facilmente palpables e identificables. Cada incision de la piel esta cerrada.

Como es habitual para proceder despues de tal abordaje posterior mfnimamente invasivo, se le pide al paciente que se ponga de pie ya el dfa despues de la cirugfa, pudiendo comenzar a caminar de nuevo. Por lo tanto, el implante recibe el regimen de presion hidrostatica cfclica adecuado en presencia de carga fisiologica, lo que es fundamental para el crecimiento y la conversion de los HDF.

Periodicamente, tal como una o mas veces por semana o por mes, los medios pueden ser cambiados El sistema de drenaje nos permite proporcionar el volumen Ve con la cantidad apropiada de los nuevos medios con el fin no solo de seguir suministrando al nucleo vivo, sino tambien para mantener el volumen adecuado y por lo tanto el regimen de presion correcta. El individuo se encuentra boca abajo. Cada deposito se perfora simultaneamente con una aguja. Se acopla una jeringa a cada una de estas agujas y los nuevos medios se inyectan lentamente empujando hacia abajo el piston a la vez que se retira simultaneamente la misma cantidad de fluido de la otra jeringa tirando hacia arriba, de modo que la presion interna se mantiene casi igual y evita que el volumen Ve colapse o, por el contrario, ejerza una presion demasiado alta al volumen Vi, lo que podrfa causar danos irreversibles al nucleo vivo. El procedimiento se detiene cuando el color y el aspecto del fluido que sale son identicos al fluido que entra, por ejemplo. Se pueden tomar muestras de los medios utilizados extrafdos para fines bacteriologicos, qufmicos y patologicos.

Cuando el nucleo vivo es capaz de automantenerse y ha llenado el espacio de la discectomfa, se pueden quitar ambos tubos y depositos. Como alternativa, solo uno o ambos depositos se pueden quitar con anestesia local mientras que los tubos estan unidos en su extremo distal. En otra realizacion alternativa, ambos se pueden dejar en su lugar.

En realizaciones especfficas, se realiza una RM de seguimiento, por ejemplo, en cuestion de semanas o meses despues de la cirugfa (por ejemplo, aproximadamente 6 semanas despues de la cirugfa) para evaluar el crecimiento del injerto y para documentar la curacion del disco.

En otra realizacion, el nucleo vivo disenado es pre-encapsulado y liberado como se ha mencionado anteriormente.

Estas funciones anteriores se proporcionan por la estructura inerte de la invencion que se basa en dos membranas concentricas con dos capacidades diferentes. La envoltura externa es mecanicamente capaz de mantener la altura del disco en presencia de carga; es inflable (con el fin de ser implantado mediante un abordaje posterior mfnimamente invasivo y recibir la solucion de medios); es elastica (para transferir la carga compartida en el injerto); es expansible (para permitir su hinchamiento y llenar la cavidad resultante de la discectomfa); es hermetica (para evitar cualquier fuga de los medios, extrusion de tejidos de la cicatriz en el canal vertebral o la reincidencia de la hernia a traves del defecto del anillo, tenotomfa); es biodegradable (la envoltura se reabsorbe para permitir que el injerto se vuelva a conectar con el disco restante natural) y es biocompatible (para minimizar la reaccion inflamatoria). Puede ser drenada con uno o varios cateteres conectados a uno o varios depositos de Rickham subcutaneos insertados al final del procedimiento quirurgico, por ejemplo.

Estos depositos estan destinados a eliminar cualquier desecho toxico acumulado con el metabolismo (radicales libres o acido lactico, por ejemplo), asf como cualquier otros recortes celulares asociados al crecimiento. Tambien permiten proporcionar el volumen Ve con la cantidad apropiada de los nuevos medios con el fin no solo de seguir suministrando al nucleo vivo, sino tambien para mantener el volumen adecuado y por lo tanto el regimen de presion correcta. Estos se quitan cuando el nucleo vivo es capaz de automantenerse y ha llenado el espacio de la discectomfa.

Cabe senalar que los diversos componentes y caracterfsticas de la estructura hfbrida, asf como el metodo de reparacion del cartflago danado y el metodo para el cultivo de HDF en celulas de tipo condrocito descritos anteriormente, se pueden combinar en una variedad de formas a fin de proporcionar otras realizaciones dentro del alcance de la invencion.

VII. Forma de realizacion alternativa de la invencion

En otra realizacion, en lugar de tener dos envolturas concentricas generalmente esfericas (por ejemplo), el dispositivo podrfa estar hecho de una unica envoltura externa “E” con las mismas caracterfsticas anteriormente mencionadas (en especial la capacidad de expansion y/o propiedades inflables) y recibir un nucleo vivo no envuelto (no encapsulada, ni envuelto con una membrana). En realidad, en esta realizacion, este nucleo vivo es una construccion de celulas-matriz y se coloca directamente en “E”. A continuacion, el volumen Ve se expande con la solucion lfquida de los medios hasta que se acomoda en la cavidad.

Por lo tanto, en otra realizacion, en lugar de tener dos globos “concentricos”, el dispositivo se compone de un unico globo “E” externo, con las mismas caracterfsticas anteriormente mencionadas (en especial la capacidad de expansion y/o propiedades inflables) para alojar el nucleo vivo disenado. Una vez que el nucleo vivo se libera dentro

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de la membrana “E”, el volumen Ve se expande con la solucion liquida de los medios hasta que la membrana “E” alcanza los lfmites de la cavidad. Ni la barrera ni la membrana envuelven mas el injerto. A medida que se consumen los medios, el nucleo vivo se expande hasta la pared interior del globo/capa/membrana “E”. La envoltura se reabsorbe y el injerto se vuelve a conectar con el disco natural.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invencion. Se debe apreciar por los expertos en la tecnica que las tecnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan tecnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la practica de la invencion, y por lo tanto pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la tecnica deberfan, a la luz de la presente divulgacion, apreciar que pueden hacerse muchos cambios en las realizaciones especfficas que se divulgan y todavfa obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espfritu y alcance de la invencion.

EJEMPLO 1

EJEMPLOS DE MATERIALES Y METODOS

Ejemplos de realizacion de materiales y metodos para su uso en la invencion se describen en este Ejemplo.

Cultivo de celulas

Aunque los HDF autologos recogidos del paciente se utilizan para construir el implante, los estudios preliminares se realizan usando fibroblastos de prepucio neonatal, ya que son fuentes convenientes de celulas con fines experimentales, por ejemplo. Se llevan a cabo otros estudios utilizando celulas autologas recogidas del paciente para demostrar que el procedimiento funciona con estas celulas.

Los HDF de prepucio neonatal se obtienen a partir de Cascade Biologics (Portland, Oregon) y se expanden in vitro con DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), que contiene FBS 10 % (Invitrogen) y antibioticos. Las suspensiones de HDF se siembran en alginato o en cultivo en monocapa, como se describe a continuacion.

Para generar cultivos de gel de alginato, las celulas se suspenden a alta densidad (107 celulas/ml) en alginato de viscosidad media p/vol 2 % (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 25 ml de gotitas se reticulan en CaCh 100 mM, solucion de NaCl 0,9 %. Las perlas de alginato resultantes se lavaron extensamente en DMEM que contenfa FBS 10 % y antibioticos. Las perlas de alginato se sumergen en DMEM que contiene FBS 10 % y antibioticos suplementado Protefna Morfogenica Osea humana 2 (BMP-2) recombinante 100 ng/ml y 50 mg de acido ascorbico. Se han elegido como condiciones una elevada densidad celular y cultivo con BMP-2 y acido ascorbico porque son conocidos por estimular la condroinduccion (Watt, 1988; Dozin et al., 1992; Sullivan et al., 1994; Denker et al., 1999; Zur Nieden et al., 2005; Zhou et al., 2004).

Para generar cultivos en monocapa, los HDF se siembran en matraces de plastico con un nivel de oxfgeno de 20 % en DMEM que contiene FBS 10 % sin BMP-2 y sin acido ascorbico. Estas celulas sirven como control.

Cultivo en O2 5 % y 20 %

Las perlas de alginato embebidas en celulas se mantienen bajo una atmosfera de O2 5 %, CO2 5 % y N2 90 % en una incubadora regulada por O2-/CO2- (baja tension de oxfgeno) o en O2 20 %, CO2 5 % y N2 75 % en una incubadora regulada por CO2 (tension atmosferica de oxfgeno) y se cultivaron durante 3 semanas. A continuacion, se realiza la evaluacion de la diferenciacion condrogenica (vease el Ejemplo 3).

Compresion hidrostatica

Las perlas de alginato embebidas en celulas se dividen en grupos presurizado y control y de cada grupo se colocaron en bolsas de polietileno/nylon flexibles separadas permeables al oxfgeno y dioxido de carbono. Las bolsas se llenaron con 15 ml de medio y son termoselladas para excluir todo el aire.

Las bolsas en el grupo presurizado se colocan dentro de un dispositivo recientemente desarrollado disenado para la aplicacion de la compresion hidrostatica cfclica (Elder et al., 2005). Este dispositivo permite la comparacion de los regfmenes de carga en un amplio rango fisiologico bajo condiciones de cultivo tridimensional iguales. Se compone de una gran base de acero inoxidable cilfndrica conectada a una tapa por medio de pernos que comprimen una junta torica intervininente. Un cilindro hidraulico esta soldado a la tapa de manera que su interior es continuo con el de la camara. El cilindro y la camara estan completamente llenos de agua, de modo que se consigue una rapida compresion hidrostatica mediante una fuerza (generada por una maquina de ensayo servohidraulico MTS) aplicada al piston del cilindro. Se mantiene una temperatura estable de 37 °C sumergiendo la camara en un bano de agua circulante de temperatura regulada. Las bolsas en el grupo de control se colocan en una camara de acero inoxidable separada, llena de agua en el mismo bano de agua.

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La magnitud y la frecuencia de la presion aplicada se eligen para que esten dentro de los rangos fisiologicos (Mow et al., 1992), los cuales se ha demostrado previamente que estimulan la diferenciacion condrogenica de celulas mesenquimales multipotenciales (Elder et al., 2005) y la re-diferenciacion de los condrocitos desdiferenciadas (Domm et al., 2000). Se ensaya la presurizacion de corta y larga duracion y se determina un modelo de presurizacion hidrostatica condroinductiva adecuado entre la presurizacion hidrostatica de corta y larga duracion mediante la evaluacion cuantitativa y cualitativa de la condrogenesis.

Un ejemplo de regimen comprende lo siguiente:

Forma de onda sinusoidal de la compresion hidrostatica a 1,0 Hz con una presion aplicada minima de 0,3 Mpa y maxima de 5,0 MPa. Para la presurizacion de corta duracion, las celulas se presurizan 1 h/dfa durante 7 dias. Para la presurizacion de larga duracion, las celulas se presurizan 4h/dia durante 7 dias. Cada dfa, inmediatamente despues de la finalizacion de la carga, los cultivos se retiran del recipiente a presion y devuelven a un bano de agua dentro de la incubadora de cultivo de tejidos.

La viabilidad celular y la diferenciacion condrogenica de los HDF bajo compresion cfclica hidrostatica y cultivados en condiciones especfficas (tales como hipoxia, medio condrogenico, alta densidad de celulas) se evaluan utilizando tecnicas estandar en la tecnica.

En otra realizacion, la conversion de celulas fibroblastos en condrocitos es inducida por presion hidrostatica cfclica y la tension de cizallamiento. En este caso, las celulas se siembran en un armazon microflufdico.

Se lleva a cabo la evaluacion de la diferenciacion condrogenica (vease el Ejemplo 3, por ejemplo).

EJEMPLO 2

EVALUACION DE LA VIABILIDAD CELULAR DE HDFS EN PERLAS DE ALGINATO

La viabilidad de los HDF en perlas de alginato cultivados en medio condrogenico se ensaya por microscopfa optica y/o mediante una prueba de viabilidad, en aspectos especfficos de la invencion. La microscopfa optica se emplea para estudiar la morfologfa y la proliferacion de los hDf. En una prueba de viabilidad de ejemplo, las perlas de alginato se disuelven en la disolucion de tampon (citrato de Na 0,55 M, NaCl 1,5 M y EDTA 0,5 M), las celulas se centrifugan y el sedimento se trata con colagenasa durante 1 h. Las celulas se resuspenden en DMEM y la viabilidad se determina utilizando, por ejemplo, una camara de Neubauer y el metodo de exclusion con azul de tripano.

EJEMPLO 3

EVALUACION DE LA DIFERENCIACION CONDROGENICA

En realizaciones especfficas, los HDF se caracterizan por la produccion de colageno de tipo I, III y V, mientras que los condrocitos se caracterizan por la produccion de colageno de tipo II, IX, XI y la produccion de proteoglicanos sulfatados.

La diferenciacion condrogenica se evalua mediante la medicion del contenido de glicosaminoglicano sulfatado (sGAG) y la produccion de colageno I y II por transferencia Western. La tasa de sfntesis de colageno se mide por la incorporacion de [3H]-prolina.

ADN total y contenido de sGAG

Las celulas en perlas de alginato se recuperan del alginato citrato de sodio 55 mM, solucion de NaCl 0,9 %. A continuacion, las celulas se lisan en 300 pl de tampon Nonidet P-40 0,5 % v/v (Tris-Cl 50 mM, NaCl 100 mM, MgCb 5 mM). El lisado se transfiere a tubos de microcentrffuga, se centrifuga y el ADN se mide en una alfcuota de sobrenadante de 100 pl usando el metodo de tincion de Hoescht (DNA Quantification Kit, Sigma, St. Louis, MO) con ADN de timo de ternera como patron. El tampon de lisis restante se elimina y el sGAG digiere en 100 pl de papafna 2 % v/v, acetato de sodio 20 mM (pH 6) durante la noche a 60 °C. El contenido total de sGAG se mide a continuacion por el metodo de precipitacion con azul de dimetilmetileno (Blyscan Glycoaminoglycan Assay, Biocolor, Ltd.) usando condroitfn 4-sulfato purificado a partir de la traquea bovina como patron. Para cada muestra, el contenido de sGAG se normaliza al contenido de ADN.

Transferencia Western para el colageno tipo I y tipo II

Cinco perlas de cada muestra se disuelven en 400 ml de tampon (citrato de sodio 55 mM, NaCl 150 mM). Para la solubilizacion del colageno, se anaden 100 pl de acido acetico 0,25 M y 100 pl de solucion de pepsina (acido acetico 1 mg/ml 50 mM: P-6887, Sigma) y la mezcla se mantiene a 4 °C durante 24 h. A continuacion, se anaden 100 pl de una solucion madre 10x de TBS (Tris 1 M, NaCl 2M y CaCl2 50 mM, pH 8) y 100 ml de elastasa pancreatica (1 mg/ml TBS; Sigma E-6883) y las muestras se incuban durante 30 min a 37 °C. Las muestras se centrifugan durante

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10 min a 9000xg. Se recoge el sobrenadante. Se mezclan 25 pi de colageno bovino tipo I, colageno bovino tipo II (Sigma) o muestra (conteniendo cada uno 5 mg de protefna total; cuantificacion con ensayo de protefnas Bio-Rad) con 6 pl de tampon de muestra, se desnaturaliza durante 5 min a 95 °C y se carga en un gel de acrilamida 7 %. La electroforesis se lleva a cabo. El gel se transfiere a la membrana de transferencia. La membrana se bloquea durante la noche en tampon de bloqueo (leche en polvo 10 % en tampon TBST) y despues se incuba con un anticuerpo monoclonal de raton anti-colageno tipo I (COL-1, ab 6308, Abcam Inc) o un anticuerpo monoclonal de raton anti- colageno tipo II (5B2.5, ab3092, Abcam Inc) durante la noche a 4 °C. La membrana se lava con tampon de TBST. Se anade anticuerpo secundario conjugado con biotina anti-raton de cabra (1:500) durante 1 h, seguido por estreptavidina-HRP en dilucion 1:1000 durante 1 h. La transferencia de puntos se desarrolla utilizando ECL de Amersham.

Medida de la incorporacion de ^Hj-prolina

En perlas de alginato en las que se determina la tasa de produccion de colageno el medio se retira y se sustituye con DMEM suplementado con FBS 10 %, antibioticos, 25 mg de acido ascorbico, [3H]-prolina a 10 pCi/ml y p-amino- propionitrilo (p-APN) 100 mg/ml para inhibir la formacion de colageno reticulado. Despues de un perfodo de incubacion de 24 h, se mide la incorporacion de [3H] prolina en el colageno. Las perlas se digieren a 65 °C durante la noche en 1 ml de solucion de papafna [0,125 mg/ml (2.125 unidades/ml, Sigma), Na2HPO4 0,1 M, EDTA 0,01 M, pH 6,5]. Se anaden 200 ml de cada muestra a 2 ml de lfquido de centelleo y se mide utilizando un contador de centelleo.

Se mezclan 500 pl de cada muestra con 500 pl de PBS y se usan para determinar el contenido de ADN. Las muestras y los blancos (que contienen 1 ml de PBS) se tratan con un haz de ultrasonidos durante 15 segundos. Se anaden 0,5 ml de ARNasa y 0,5 ml de pronasa y se incuba a 37 °C durante 30 min. A continuacion, se anaden 0,5 ml de bromuro de etidio, las muestras se incuban durante 30 min y se miden con un fluorometro.

La incorporacion de [3H]-prolina se normaliza con el contenido total de ADN.

EJEMPLO 4

EJEMPLOS DE DISENO DE ESTUDIOS

En aspectos especfficos de la invencion, la viabilidad celular y la diferenciacion condrogenica de los HDF sembrados se determinan en cultivos tridimensionales de perlas de alginato. En particular, la viabilidad celular y la diferenciacion condrogenica de los HDF sembrados en perlas de alginato y cultivados en un medio condrogenico (medio suplementado con BMP-2 y acido ascorbico) en presencia de O2 20 % se comparan con las de los HDF en cultivos de monocapa en DMEM con FBS 10 % en presencia de O2 20 % usando el metodo del ejemplo descrito anteriormente.

En otro aspecto de la invencion, se determinan los efectos de la tension de oxfgeno sobre la diferenciacion de HDF cultivados en perlas de alginato. Los HDF sembrados en perlas de alginato en el medio condrogenico se cultivan durante 3 semanas en 2 tensiones de oxfgeno diferentes: 1) tension de oxfgeno baja de O2 5 %, CO2 5 % y N2 90 % en un incubador regulado por O2-/CO2-, y 2) tension atmosferica de oxfgeno de O2 20 %, CO2 5 % y N2 75 % en un incubador regulado por CO2-.

La diferenciacion condrogenica se compara con el metodo de ejemplo descrito anteriormente.

En una realizacion adicional de la invencion, se determinan los efectos de la compresion hidrostatica sobre la diferenciacion de HDF cultivados en perlas de alginato. Los HDF sembrados en perlas de alginato en el medio condrogenico se someten a diferentes estfmulos: 1) 1 h/dfa durante 7 dfas a presion hidrostatica (compresion hidrostatica sinusoidal 1,0 Hz min 0,3 MPa max 5,0 Mpa) y O2 20 %; 2) 4 h/dfa durante 7 dfas a presion hidrostatica (compresion hidrostatica sinusoidal 1,0 Hz min 0,3 MPa max 5,0 Mpa) y O2 20 %; 3) 1 h/dfa durante 7 dfas a presion hidrostatica (compresion hidrostatica sinusoidal 1,0 Hz min 0,3 MPa max 5,0 Mpa) y O2 5 %; 4 h/dfa durante 7 dfas a presion hidrostatica (compresion hidrostatica sinusoidal 1,0 Hz min 0,3 MPa max 5,0 Mpa) y O2 5 %.

La diferenciacion condrogenica se puede evaluar mediante el metodo de ejemplo descrito anteriormente.

Las patentes y publicaciones de AU mencionadas en la memoria son indicativas del nivel de los expertos en la tecnica a la que pertenece la invencion.

PATENTES

Patente US-6.489.165 Patente US-6.627.422

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PUBLICACIONES

Barry F, Boyton RE, Liu B et al. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp Cell Res 2001 (268): 189-200.

Carter DR, Orr TE, Fyhrie DP, Schurman DJ. Influences of mechanical stress on prenatal and postnatal skeletal development. Clin Orthop 1987(219):237-250.

Cui, L., Yin, S., Deng, CL., Yang, GH., Chen, FG., Liu, W., Liu, DL., Cao, YL. Cartilage-derived morphogenetic protein 1 initiates chondrogenic differentiation of human dermal fibroblasts in vitro. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2 ago 2004;84(15): 1304-1309.

Denker AE, Haas AR, Nicoll SB, Tuan RS. Chondrogenic differentiation of murine C3H10T1/2 multipotential mesenchymal cells: I. Stimulation by bone morphogenic protein-2 in high-density micromass cultures Differentiation 1999;64:67-76

Domm C, Fay J, Schunke M, Kurz B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure Orthopade Feb 2000; 29(2):91-99

Dozin, R. Quarto, G. Campanile & R. Cancedda: In vitro differentiation of mouse embryo chondrocytes: requirement for ascorbic acid. Eur J Cell Biol 1992;58, 390-4

Elder SH, Fulzele KS, McCulley WR. Cyclic hydrostatic compression stimulates chondroinduction of C3H/10T1/2 cells. Biomechan Model Mechanobiol 2005(3): 141-146

French MM, Rose S, Canseco J and Athanasiou KA. Chondrogenic differentiation of adult dermal fibroblasts. Annals of Biomedical Engineering 2004; 32 (1):50-56.

Hauselmann HJ, Aydelotte MB, Schumacher BL, Kuettner KE, Gitelis SH, Thonar EJ. Synthesis and turnover of proteoglycans by human and bovine adult articular chondrocyte cultured in alginate beads. Matrix 1992(12):116-129.

Kessler, D., Dethlefsen, S., Haase, I., Plomann, M., Hirche, F., Krieg, T., Eckes, B. Fibroblasts in mechanically stressed collagen lattices assume a "synthetic" phenotype. J. Biol. Chem. Sept 2001; 276(39):36575-36585.

Majumdar MK, Wang E and Morris EA. BMP-2 and BMP-9 promotes chondrogenic differentiation of human multipotential mesenchymal cells and overcomes the inhibitory effect of IL-1. J. Cell. Physiol. 2001(189):275-284.

Meisel, HJ., Alasevic, O., Hutton, W., Ganey, T. Disc repair with autologous chondrocytes: A pilot clinical study. European Cells and Materials. Vol. 10 Supl. 3, 2005 (page 39) Watt FM. Effect of seeding density on stability of the dedifferentiated phenotype of pig articular chondrocytes in culture. J Cell Sci 1988; 89:373-378.

Mizuno H, Roy AK, Vacanti CA, Kojima K, Ueda M, and Bonassar LJ. Tissue-engineered composites of annulus fibrosus and nucleus pulposus for intervertebral disc replacement. Spine 2004 (29):1290-1298.

Mow VC, Ratcliffe A, Poole AR. Cartilage and diarthrodial joints as paradigms for hierarchical materials and structures. Biomaterials 1992; 13(2):67-97.

Nicoll SB., Wedrychowska, A., Smith, NR., Bhatnagar, RS. Modulation of proteoglycan and collagen profiles in human dermal fibroblasts by high density micromass culture and treatment with lactic acid suggests change to a chondrogenic phenotype. Connect. Tissue Res. 2001;42(1):59-69.

T.A. Sullivan, B. Uschmann, R. Hough & P.S. Leboy: Ascorbate modulation of chondrocyte gene expression is independent of its role in collagen secretion. J Biol Chem 1994; 36, 22500-6

Watt FM. Effect of seeding density on stability of the dedifferentiated phenotype of pig articular chondrocytes in culture. J Cell Sci 1988; 89:373-378

Zhou S, Glowacki J, and Yates KE. Comparison of TGF-b/BMP pathways signaled by demineralized bone powder and BMP-2 in human dermal fibroblasts. J Bone Miner Res 2004; 19:1732-1741.

Zur Nieden NI, Kempka G, Rancourt DE, Ahr HJ. Induction of chondro-, osteo- and adipogenesis in embryonic stem cells by bone morphogenic protein-2: effect of cofactors on differentiating lineages. BMC Dev Biol, 2005; 26 ene (5): 1-15.

Aunque la presente invencion y sus ventajas se han descrito en detalle, debe entenderse que se pueden hacer diversos cambios, sustituciones y alteraciones en la presente memoria sin apartarse del alcance de la invencion

como se define por las reivindicaciones adjuntas. Ademas, el alcance de la presente solicitud no pretende limitar las realizaciones particulares del proceso, maquina, fabricacion, composicion de materia, medios, metodos y etapas descritos en la memoria. Aquel con experiencia ordinaria en la tecnica apreciara facilmente a partir de la divulgacion de la presente invencion, que los procesos, maquinas, fabricacion, composiciones qufmicas, medios, metodos, o 5 etapa, existentes actualmente o desarrollados posteriormente que realizan sustancialmente la misma funcion o logran sustancialmente el mismo resultado que las realizaciones correspondientes descritas en la presente memoria, pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invencion. En consecuencia, las reivindicaciones adjuntas pretenden incluir dentro de su alcance tales procesos, maquinas, fabricacion, composiciones qufmicas, medios, metodos o etapas.

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Claims

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REIVINDICACIONES

1. Un metodo ex vivo de preparacion de una composicion de celulas/armazon, en el que las celulas son condrocitos o celulas de tipo condrocito, comprendiendo el metodo:

fijar las celulas capaces de diferenciarse en una celula de tipo condrocito a un armazon;

encapsular las celulas por medio de dos membranas biopolimericas biodegradables en forma de globo expandibles; y

someter las celulas a tension mecanica.
2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas someter las celulas a uno o mas factores de crecimiento adecuados para la diferenciacion en un condrocito o en una celula de tipo condrocito.
3. El metodo de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la tension mecanica es intermitente.
4. Un dispositivo implantable que comprende:

un biorreactor in vivo para el diseno de cartflago, que comprende un dispositivo que encapsula celulas;

un nucleo vivo que comprende celulas que son capaces de diferenciarse en condrocitos o en celulas de tipo

condrocito;

en el que dicho dispositivo que encapsula las celulas encapsula dicho nucleo vivo;

en el que la encapsulacion de dichas celulas en dicho nucleo vivo ofrece condiciones adecuadas para el crecimiento y la diferenciacion in vivo de dichas celulas, en el que dichas condiciones comprenden proporcionar un regimen de carga fisiologica en dichas celulas, y caracterizado por que

dicho dispositivo que encapsula las celulas comprende dos membranas biopolimericas biodegradables en forma de globo expandibles.
5. El dispositivo implantable de la reivindicacion 4, en el que dichas celulas comprenden una composicion de celulas/armazon;

en el que una primera dicha membrana biodegradable que encapsula las celulas comprende una primera membrana que tiene un interior y un exterior; y comprendiendo ademas dicho biorreactor:

una estructura para el intercambio de al menos parte del fluido que esta dentro de la primera membrana, en el que la primera membrana tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas:

semi-permeable; biocompatible; y reabsorbible.
6. El dispositivo implantable de la reivindicacion 4, en el que dichas celulas comprenden una composicion de celulas/armazon; y en el que una primera dicha membrana biodegradable que encapsula las celulas comprende una primera membrana que tiene un interior y un exterior;

en el que una segunda dicha membrana tiene un interior y un exterior, en el que la primera membrana esta encapsulada dentro de la segunda membrana; comprendiendo ademas dicho dispositivo: un primer volumen dispuesto dentro de la primera membrana;

un segundo volumen que esta dispuesto fuera de la primera membrana y que esta dispuesto dentro de la segunda membrana; y

una estructura para la adicion de fluido al segundo volumen, extrayendo fluido del segundo volumen, o ambos,

en el que la composicion de celulas/armazon esta dispuesta dentro de la primera membrana y la primera membrana tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas:

semi-permeable; biocompatible; y reabsorbible,

en el que la segunda membrana tiene una o mas de las siguientes caracterfsticas:

biocompatible; hermetica a los fluidos; permeable al oxfgeno; reabsorbible; biodegradable; y

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expandible.
7. El dispositivo implantable de la reivindicacion 6, en el que el armazon esta comprendido por un polfmero sintetico, un hidrogel natural o un hidrogel sintetico.
8. El dispositivo implantable de la reivindicacion 7, en el que se aplica uno de los siguientes casos:

(a) el polfmero sintetico es acido poliglicolico, acido polilactico, acido polilactico-co-glicolico, poli-£-caprolactona o poli(glicerol-sebacato) (PGS); o

(b) el polfmero sintetico es un polifosfaceno, un polianhfdrido o un poli(ortoester); o

(c) el hidrogel natural comprende colageno, acido hialuronico, alginato, agarosa, quitosano, fibrina, gelatina o un copolfmero de los mismos; o

(d) el hidrogel sintetico comprende poli(oxido de etileno), poli(alcohol vinflico), poli(acido acrflico), poli(propileno fumarato-co-etilenglicol) o un copolfmero de los mismos.
9. El dispositivo implantable de la reivindicacion 6, en el que las celulas condrocitos o las celulas de tipo condrocito secretan una molecula seleccionada del grupo que consiste en agrecano, colageno tipo II, protefna Sox-9, protefna de union al cartflago y perlecan.
10. El dispositivo implantable de la reivindicacion 6, en el que las celulas se diferencian a partir de celulas fibroblastos y/o celulas madre.
11. El dispositivo implantable de la reivindicacion 10, en el que las celulas fibroblastos son fibroblastos dermicos, fibroblastos de tendon, fibroblastos de ligamento, fibroblastos sinoviales, fibroblastos de prepucio o una mezcla de los mismos.
12. El dispositivo implantable de la reivindicacion 6, en el que la tasa de reabsorcion de la segunda membrana es mas lenta que la tasa de reabsorcion de la primera membrana.
13. El dispositivo implantable de la reivindicacion 6, en el que la estructura se define ademas como que comprende uno o mas de:

un primer tubo; un segundo tubo;

opcionalmente, un primer deposito; y opcionalmente, un segundo deposito.
14. El dispositivo implantable de la reivindicacion 13, en el que el primer y segundo tubos comprenden, respectivamente, primeros extremos posicionados dentro del segundo volumen, en el que el primer y segundo tubos comprenden, respectivamente, segundos extremos conectados al primer y segundo depositos, o ambos.
15. El dispositivo implantable de la reivindicacion 13,

en el que el primer y/o segundo tubos estan comprendidos por el mismo material que la segunda membrana; o en el que el primer y/o segundo tubos estan comprendidos por caucho de silicona.