ES2602782T3 - OB-FOLD usado como estructura para diseño por ingeniería de nuevos agentes de unión específicos - Google Patents

Abstract

Un método para obtener una variante de una proteína OB-fold de partida que se une a una diana y que presenta una afinidad nanomolar o mejor con dicha diana, en el que dicha diana es una proteína o un péptido y en el que dicha afinidad se mide por resonancia de plasmón superficial de competición, que comprende las etapas de a) proporcionar una biblioteca combinatoria de variantes de dicha proteína OB-fold de partida en que de 5 a 32 restos implicados en la unión de dicha proteína OB-fold de partida con su ligando nativo se han aleatorizado, y opcionalmente en el que dichas variantes comprenden adicionalmente una inserción de 1 a 15 restos de aminoácido aleatorios en el bucle 3 y/o una inserción de 1 a 15 restos de aminoácido aleatorios en el bucle 4 y/o una inserción de 1 a 20 restos de aminoácido aleatorios en el bucle 1, y opcionalmente en el que de 1 a 4 restos de dicha proteína OB-fold de partida se han delecionado, b) expresar dichas variantes de dicha biblioteca por presentación en ribosoma c) exponer dichas variantes expresadas obtenidas en la etapa b. a dicha diana inmovilizada, en el que dicha diana es una proteína o un péptido d) seleccionar dichas variantes que se unen a dicha diana inmovilizada e) eluir y recuperar el ARNm de dichas variantes seleccionadas en la etapa d. f) traducir de forma inversa y amplificar dicho ARNm recuperado para obtener una sub-biblioteca de variantes seleccionadas de dicha proteína OB-fold de partida g) realizar de nuevo las etapas b. a f. desde cero hasta tres rondas h) expresar dichas variantes de dicha sub-biblioteca después de la etapa g. por presentación en ribosoma i) exponer dichas variantes expresadas obtenidas en la etapa h. a dicha diana que está biotinilada j) incubar esta composición que comprende dichas variantes expresadas y dicha diana de interés de la etapa i. k) capturar complejos ternarios (ARNm-ribosoma-agente de unión) unidos a diana biotinilada con perlas recubiertas con estreptavidina magnéticas l) lavar dichas perlas y aislar el ARNm m) traducir de forma inversa y amplificar dicho ARNm recuperado para obtener una sub-biblioteca de variantes seleccionadas de dicha proteína OB-fold de partida n) seleccionar un elemento de dicha sub-biblioteca de la etapa m., en el que dicho elemento codifica una variante de dicha proteína OB-fold de partida que comprende de 5 a 32 restos mutados en la superficie de contacto de unión con el ligando nativo de dicha proteína OB-fold de partida y que se une a dicha diana, y en el que la afinidad de dicha variante por dicha diana es una afinidad nanomolar o mejor.

Description

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Figura 9: Análisis de expresión y purificación de ocho agentes de unión seleccionados. Las proteínas se cargaron en un SDS-PAGE al 15% teñido con azul brillante de Coomassie. a) Extracto crudo de E. coli después de expresión a 30ºC. Las células se recogieron después de 19 horas de incubación con IPTG 0,5 mM y se lisaron en tampón de carga. b) Fracciones solubles de extractos crudos antes de purificación de los agentes de unión. c) Agentes de unión purificados después de purificación por IMAC (cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados) de una etapa de la fracción soluble del extracto crudo de E. coli. Todas las muestras cargadas fueron equivalentes a 13 µl de cultivo líquido.

Figura 10: Determinación de afinidad del clon 6 usando análisis SPR (resonancia de plasmón superficial). a) Se realizó la cinética de unión usando un BIAcore. Se inmovilizó PulD-N biotinilado (250 UR) en un chip de estreptavidina y se inyectó el clon 6 a 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM, 3,13 nM y 1,56 nM. Se usó una celda de flujo sin PulD-N inmovilizado para controlar que no sucedía unión específica y se sustrajo la señal de la celda a la obtenida de la celda de medición. Se usó el software BIAevaluation para analizar los datos con un procedimiento de ajuste global. b) También se midió la afinidad en equilibrio usando BIAcore de competición. Los parámetros determinados a partir de ambos enfoques se presentan en la Tabla 3.

Figura 11: Estabilidades térmicas de proteínas recombinantes Sac7d de tipo silvestre y variantes determinadas por calorimetría de exploración diferencial. La absorción de calor en exceso de wt Sac7d, clon 40, clon 33, y clon 6, se presentan a 1ºC/min a una concentración de proteína de 200 µg/ml en tampón MES 50 mM pH 5,6 con NaCl 300 mM. Para cada muestra de proteína, la curva de capacidad calorífica en exceso experimental (línea gruesa) se ajustó mejor a un modelo no de dos estados (línea delgada) por regresión no lineal. Los parámetros termodinámicos resultantes se dan en la Tabla 4.

Figura 12: a) Transferencia de Western para la detección de PulD-N mezclado con extracto crudo de E. coli usando la fusión clon 6-fosfatasa alcalina. b) Purificación de una etapa de PulD-N con clon 6 inmovilizado en una columna. La fracción soluble de un extracto de E. coli que contenía PulD-N se inyectó en la columna equilibrada con tampón HBS pH 7,0. Después del lavado, el pH se disminuyó hasta 2,5 con un tampón glicina-HCl. Las fracciones se analizaron en un SDS-PAGE al 15% y se tiñeron con azul brillante de Coomassie. CE: extracto celular; PulD-N: proteína pura usada como marcador; Fracciones: fracciones eluidas de la columna después de cambio a pH ácido; FT: flujo continuo.

Figura 13: Unión de Sac7*40, Sac7*33, y Sac7*6 a envueltas celulares aisladas y a dodecámeros de PulD (PulDD) y monómeros de PulD (PulDM). (A) Se incubaron cantidades crecientes de envuelta celular de la cepa PAP105 que producía PulD y PulS o PulD-CS y PulS con Sac7*40-GFP, y después se analizó la fracción de membrana por SDS e inmunotransferencia con anticuerpos contra GFP. (B) Transferencia de Far-Western de las cantidades indicadas de proteínas de envuelta celular de las mismas cepas usando las tres quimeras Sac7*-PhoA y anticuerpos contra PhoA.

Figura 14: Producción de quimeras Sac7-PhoA con y sin inducción por IPTG y sus efectos sobre la secreción y multimerización de PulD en cepa PAP5198 deficiente en proteasa de envuelta que porta pCHAP231. (A) Niveles de Sac7-PhoA detectados por inmunotransferencia (con anticuerpo contra PhoA) de la misma cantidad de extracto celular. (B) Niveles de secreción (%) y presencia de dodecámeros de PulD (PulDD) y monómeros de PulD (PulDM) detectados por inmunotransferencia de extractos celulares tratados con fenol y no tratados con anticuerpos contra PulD. Las flechas indican PulDM detectado sin tratamiento con fenol. S indica Sac7d-PhoA. (C) Como en B, pero sin inducción con IPTG.

Figura 15: PCR realizada sobre ADNc obtenido de ARNm, eluidos durante el ciclo nº 4 (véase la Figura 19, fase RT-PCR).

Figura 16: Radioinmunoensayos competitivos realizados después de cinco ciclos de selección anti-PKnG y antilisozima.

Figura 17: Selección por ELISA de clones anti-lisozima (A), anti-PKnG (B) y anti-GarA (C) obtenidos después de 5 ciclos de selección.

Figura 18: Secuencias del clon anti-lisozima obtenidas después de cinco ciclos de selección.

Figura 19: Alineación de un agente de unión a GarA con Sac7d.

Figura 20: ELISA de competición después de la 4ª ronda de selección frente al fragmento Fc.

Figura 21: Representación esquemática de una ronda de selección por presentación en ribosoma.

Ejemplos

Los siguientes datos experimentales se han obtenido usando el material y los métodos descritos a continuación.

Materiales y métodos

Biología molecular general

Las enzimas y tampones fueron de New England Biolabs (EEUU) o Fermentas (Lituania). Los oligonucleótidos fueron de MWG Biotech (Alemania). Todas las PCR (reacciones en cadena de la polimerasa) se realizaron usando polimerasa Vent si no se indica en el texto. El vector de clonación y expresión para Sac7d de tipo silvestre y mutantes seleccionados fue pQE30 de Qiagen (Alemania).

Síntesis del ADN que codifica Sac7d de tipo silvestre

La secuencia de ADN de Sac7d de tipo silvestre se generó por PCR de ensamblaje usando los siguientes seis oligonucleótidos: SC1 (SEC ID Nº 9: GAAACTCCTAGGTATTGTGCTGACGACCCCGATCGCGATCTCTAGCTTTGC GGTGAAAGTGAAATT), SC2 (SEC ID Nº 10: GATCTTGCTGGTGTCCACTTCTTTTTCTTCGCGCAAAGCTAG), SC3 (SEC ID Nº 11: GAAGTGGACACCAGCAAGATCAAGAAAGTTTGGCGTGTGGGCAAAATGGTGAGCTTTACCT ACGACGACAACGGCAAG), SC4 (SEC ID Nº 12: CTCTTTCGGGGCATCTTTCTCGCTCACGGCGCCACGGCCGGT CTTGCCGTTGTCGTCGTA), SC5 (SEC ID Nº 13: GAGAAAGATGCCCCGAAAGAGTTATTAGATATGTTAGCGCGT GCGGAAAGCTTCAACCA), SC6 (SEC ID Nº 14: TGGTGGTTGAAGCTTTCCGCACG). El producto purificado de PCR sirvió como molde para una segunda amplificación por PCR usando los dos siguientes cebadores: SC07 (SEC ID Nº 15: ATTAATGGTACCGGATCCGTGAAAGTGAAATTTAAATATAAAG) y SC08 (SEC ID Nº 16 ATAATTGAGCTCTAAGCTTTTTTTCACGTTCCGCACGCGCTAACATATC). El producto de PCR se clonó en el vector de expresión pQe30 usando los sitios de restricción BamHI y Hindlll. Se usó un clon con la secuencia esperada para posteriores expresiones.

Generación de bibliotecas combinatorias

El protocolo fue el mismo para la generación de las tres bibliotecas 11, 13, 14 en un formato compatible con la presentación en ribosoma. Las bibliotecas se construyeron principalmente por etapas de síntesis génica y ensamblaje por PCR. Con una PCR de una etapa usando una combinación de cuatro oligonucleótidos convencionales y tres degenerados que codifican tripletes NNS (donde N=A, C, T o G, y S=C o G), se obtuvo un producto de ADN que incluía la región 5'-flanqueante necesaria para la presentación en ribosoma y el gen aleatorizado de Sac7d. Para la biblioteca 14, se usaron los siguientes oligonucleótidos: T7C (SEC ID Nº 17: ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC), SDA_MRGS (SEC ID Nº 18: AGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATATCCATGAGAGGATCG), SClib1 (SEC ID Nº 19: GGAGATATATCCATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCCGTCAAGGTGAA ATTC), SClib2 (SEC ID Nº 20: GGATCCGTCAAGGTGAAATTCNNSNNSNNSGGCGAAGAAAAAGAAGTGGACACT AGTAAGATC), SClib3 (SEC ID Nº 21: CTTGCCGTTGTCGTCGTASNNAAASNNCACSNNTTTGCCSNNACGSNNAA CSNNSNNGATCTTACTAGTGTCCACTTC), SClib4 (SEC ID Nº 22: TAATAACTCTTTCGGGGCATCTTTCTCSNNC ACSNNGCCSNNGCCSNNCTTGCCGTTGTCGTCGTA), SClib5 (SEC ID Nº 23: CCATATAAAGCTTTTTCTCGCGTT CCGCACGCGCTAACATATCTAATAACTCTTTCGGGGCATC). Se usaron cebadores que codifican tripletes de tipo silvestre en lugar de tripletes NNS en las posiciones correspondientes a los restos 21, 22 y 40, o al resto 40 en Sac7d para la construcción de las bibliotecas 11 y 13, respectivamente.

Con el propósito de que la proteína presentada en el ribosoma sea accesible a ligandos potenciales, la proteína tiene que fusionarse a un enlazador. La secuencia del enlazador, correspondiente a una parte de la proteína de E. coli TolA, codificada en el vector pRDV plasmídico (Binz et al., 2004a), se amplificó por PCR usando los cebadores SClink (SEC ID Nº 24: GCGGAACGCGAGAAAAAGCTTTATATGGCCTCGGGGGCC) y tolAk (SEC ID Nº 25: CGGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCT) (codificando el último la región 3'-flanqueante necesaria para la presentación en ribosoma). Finalmente la biblioteca se ensambló con el enlazador tolA mediante ensamblaje por PCR usando los cebadores tolAk y T7B (SEC ID Nº 25: ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGG AGACCACAACGG). El producto de ensamblaje final correspondía a una biblioteca de Sac7d con todas las regiones 5' y 3' necesarias para su uso para selecciones de presentación en ribosoma como se ha descrito previamente (Hanes et al., 1998; Schaffitzeletal., 1999).

Rondas de selección de presentación en ribosoma

Para experimentos de selección, se usaron proteínas diana biotiniladas. La biotinilación se realizó por incubación de una solución 10 M de DnaK, GarA o PulD-N con un exceso molar de 20 veces de sulfosuccinimidil-6-(biotinamido) hexanoato (Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina, Pierce) en PBS en hielo durante 1 h. A las proteínas biotiniladas se les intercambió el tampón usando columnas de centrifugación de desalación de proteínas de Pierce equilibradas en TBS. El grado de biotinilación se determinó usando el ensayo HABA (Sigma) de 2 a 3 moléculas de biotina por molécula de proteína. Las proteínas diana biotiniladas se unieron a neutravidina inmovilizada en una placa Maxisorp (Nunc) y se realizaron selecciones por presentación en ribosoma a 4ºC esencialmente como se ha descrito (Binz et al., 2004b) con algunas modificaciones. En resumen, después de cada ronda de selección se transcribió de forma

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Secreción

La cepa PAP7232 (Hardie et al., 1996) se transformó con el vector vacío o con plásmidos que codificaban quimeras Sac7-PhoA. Los transformantes se cultivaron en medio que contenía maltosa al 0,4% (para inducir producción de pululanasa y sus sistema de secreción, incluyendo PulD) e IPTG 1 mM para inducir producción de Sac7-PhoA. Los niveles de secreción se midieron como se describe en (d'Enfert et al., 1989) y se expresan como la cantidad de actividad enzimática detectada en células completas en comparación con la detectada en células lisadas (100%). Los extractos celulares también se examinaron por inmunotransferencia con anticuerpos contra PulD y PhoA.

Para analizar los efectos de las quimeras Sac7-PhoA a niveles superiores (codificados por plásmido) de producción de PulD, se amplificó un gen de resistencia a zeocina con sitios Pstl flanqueantes y se insertaron en el sitio Pstl único en el gen blaM de los plásmidos correspondientes. Los plásmidos recombinantes después se transformaron junto con pCHAP231 (d'Enfert et al., 1987) en la cepa deficiente en proteasa de envuelta PAP5198 (degP, ompT, ptr). Se analizaron la secreción de pululanasa y los niveles de PulD (con o sin tratamiento previo con fenol) como anteriormente con o sin inducción por IPTG.

Resultados

Ejemplo 1: Diseño de la biblioteca de primera generación (biblioteca 11)

La primera etapa crítica para investigar la posibilidad de usar Sac7d como estructura para obtener agentes de unión para diversos ligados fue diseñar una biblioteca por aleatorización del área de unión potencial, manteniendo al mismo tiempo la estabilidad y la solubilidad de la proteína Sac7d precursora.

Se conocen varias estructuras tridimensionales de complejos Sac7d-ADN (Agback et al., 1998; Edmondson y Shriver, 2001; Gao et al., 1998; McAfee et al., 1995; McCrary et al., 1996; Robinson et al, 1998; Su et al., 2000) (figura 1a). De acuerdo con estas estructuras, la unión de Sac7d al surco menor del ADN implica un área superficial de unión que concuerda de forma remarcable (formas y cargas) con el ADN. Esta área de unión está compuesta por dieciséis restos (K7, Y8, K9, K21, K22, W24, V26, K28, M29, S31, T33, K39, T40, R42, A44, S46) (figura 1b). Una inspección visual de esta área de unión muestra que está girada y que comprende dos tipos de geometrías: una ligeramente cóncava (K7, Y8, K9, W24, V26, K28, M29, S31, T33, R42, A44, S46) y la otra esencialmente plana (K21, K22, W24, T33, K39, T40, R42). Los restos W24, T33, y R42 están compartidos por estas dos superficies. Aproximadamente un cuarto de la secuencia de Sac7d está dedicado a la unión del ADN. Aunque todos estos restos están expuestos en la superficie, una mutagénesis aleatoria masiva del 25% de la secuencia de Sac7d podría ser drástica para el plegamiento y la estabilidad de los mutantes obtenidos. En una primera etapa, los inventores decidieron excluir K28 y K39 del esquema de mutagénesis, ya que estos dos restos no están completamente orientados hacia la superficie de unión. La segunda razón para excluirlos fue que la generación de bibliotecas por una PCR de una etapa como se describe a continuación habría sido imposible debido a solapamientos reducidos disponibles para los cebadores que hibridan (véase a continuación). También se postuló que la geometría del lado cóncavo del área de unión podría concordar bien con la forma esférica de proteínas globulares o, al menos, que podría acomodar la unión de sus bucles expuestos. Por tanto, la estrategia de sustitución se centró en los once restos de esta región de Sac7d (K7, Y8, K9, W24, V26, M29, S31, T33, R42, A44, S46).

El gen que codifica Sac7d es bastante corto (aproximadamente 200 pares de bases). Por tanto, la biblioteca correspondiente de sustituciones aleatorias de los once restos podría obtenerse por una PCR de una etapa. Esto se hizo usando una mezcla de tres oligonucleótidos degenerados (esquema NNS) y tres oligonucleótidos convencionales. Los codones de las posiciones aleatorizadas estaban codificados por tripletes NNS que permiten la representación de todos los aminoácidos. Con esta estrategia de mutagénesis, la diversidad teórica es de aproximadamente 3,2 1016 (3211), que excede aproximadamente cuatro órdenes de magnitud la diversidad conseguida de forma experimental de nuestra biblioteca. De hecho, de acuerdo con la cantidad de producto de ensamblaje de PCR usada para generar la construcción de presentación en ribosoma, la estimación superior de la biblioteca fue de aproximadamente 3,0 1012 variantes. La secuenciación de cuarenta clones aleatorios confirmó que la frecuencia observada de restos fue similar a la predicha (datos no mostrados). Se descubrió que el porcentaje de clones correctos, sin ningún desplazamiento de fase o deleción, era de aproximadamente el 50%. Por tanto, la diversidad "funcional" se consideró satisfactoria y la biblioteca se usó para las selecciones.

Ejemplo 2: Selecciones de presentación en ribosoma usando la biblioteca 11

Se eligieron tres proteínas como dianas: DnaK, GarA (tanto de Mycobacterium tuberculosis como el dominio Nterminal de PulD (de Klebsiella oxytoca)). PulD es una proteína de membrana externa que no puede mantenerse en solución sin detergentes iónicos. Por lo tanto, se usó un fragmento monomérico soluble. Este fragmento, llamado PulD-N, corresponde a la región N-terminal de PulD. Estas dianas se eligieron porque agentes de unión específicos y ávidos podrían ser herramientas útiles para estudiar DnaK, GarA y PulD. Además, estas proteínas son difíciles de cristalizar para estudios estructurales. Los agentes de unión que reconocen estas proteínas podrían usarse para ensayos de co-cristalización del mismo modo que fragmentos de anticuerpo (Ostermeier et al., 1995).

Se usaron placas ELISA recubiertas con neutravidina para inmovilizar proteínas biotiniladas y para realizar selecciones. Después de cuatro rondas de selección, se observó enriquecimiento con agentes de unión específicos para las tres dianas (figura 6a). En todos los casos, más del 50% de la unión de combinaciones se inhibió con 10 M de dianas libres, de acuerdo con RIA.

Para evaluar combinaciones de agentes de unión adicionalmente por ELISA para la selección con PulD-N, se clonaron los productos de RT-PCR de combinaciones seleccionadas en el vector pQE30 (Qiagen) usando sitios de restricción BamHI y Hindlll. Los ligamientos resultantes se usaron para transformar la cepa DH5 de E. coli. Se picaron 96 clones aleatoriamente de la placa Petri para inocular una placa de pocillo profundo que contenía 1,5 ml de medio LB por pocillo (100 g/ml de ampicilina, glucosa al 1%). Después de cultivo durante una noche a 37ºC con agitación a 250 rpm, se usaron 0,2 ml de cada pocillo de esta placa maestra para inocular otra placa de pocillo profundo que contenía 1,3 ml de medio 2YT (100 g/ml de ampicilina) por pocillo. La placa después se incubó a 37ºC durante 1 h con agitación (250 rpm). La expresión se indujo con la adición de IPTG 0,5 mM e incubación a 30ºC durante 4 h con agitación (250 rpm). Las células se sedimentaron con una etapa de centrifugación (2250 g) y los sobrenadantes se desecharon. Las proteínas se extrajeron con 50 l de BugBuster (Novagen) por pocillo con agitación a 250 rpm durante 30 min, después se añadieron 250 l de TBS pH 7,4 (Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM). Los desechos celulares se sedimentaron con una etapa de centrifugación (2500 g). Para selección ELISA, se usaron 100 l de cada sobrenadante para ensayar la unión en PulD-N o BSA recubierto en una placa Maxisorp. La detección se realizó usando un conjugado de anticuerpo RGS His con HRP (Qiagen) que detecta solamente la marca RGS-(His)6 de agentes de unión y no la marca (His)6 de proteínas diana y sustrato BM-BIue de Roche. Todas las etapas de incubación se realizaron en TBS pH 7,4 con Tween 20 al 0,1%. Para todos los clones se midió la DO a 340 nm para la unión de PulD-N y BSA. Se calculó la proporción del valor obtenido para la unión de BSA sobre el valor para PulD-N para cada clon. Se observó una proporción de señal a ruido superior a 10 para aproximadamente el 92% de los clones desde la ronda 4 (figura 6b). Se ensayó la unión de 6 clones purificados de la selección PulD-N (ronda 4) para DnaK, GarA, PulD-N y BSA por ELISA. Como se muestra en la figura 6c, la unión fue específica para PulD-N. La secuenciación de 28 clones de la ronda 4 reveló una elevada diversidad de secuencias; de hecho ninguna secuencia se encontró más de una vez, lo que indica que podría haberse usado una presión de selección mayor. Además, no pudo encontrarse ningún resto de tipo silvestre en ningunas de las once posiciones aleatorizadas (datos no mostrados). El rendimiento promedio de la expresión estimada después de purificación por IMAC (cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados) de nueve clones fue de aproximadamente 70 mg/litro de cultivo en matraz (4 h de inducción a 30ºC). Los agentes de unión podían concentrarse al menos hasta 45 mg/ml. En conjunto, estas observaciones sugirieron que el área de unión de Sac7d es muy tolerante a sustitución y que las variantes seleccionadas retenían propiedades biofísicas satisfactorias. Sin embargo, un análisis más detallado por RIA mostró que la afinidad promedio para agentes de unión en la combinación de la ronda 4 era de aproximadamente 100 nM y una quinta ronda realizada con una selección de disociación más suave (2 h) o más rigurosa (17 h) no logró aumentar la afinidad promedio de la combinación anti PulD-N (figura 7). Dicha baja afinidad podría ser limitante para aplicaciones donde se requieren bajas constantes de disociación nanomolares. Por tanto, los inventores decidieron explorar otros enfoques para obtener mayor afinidad.

Ejemplo 3: Diseño de las bibliotecas de segunda generación (biblioteca 13 y 14)

Un modo intuitivo de mejorar la afinidad es ampliar el área de unión y por tanto aumentar la cantidad potencial de interacciones entre los agentes de unión y sus ligandos. El área de unión potencial correspondiente a la aleatorización de 11 restos tenía una superficie accesible a disolvente de 890 Å2. Siendo Sac7d muy tolerante a 11 sustituciones, se decidió aleatorizar dos o tres posiciones adicionales: K21 y K22 (biblioteca 13) o K21, K22 y T40(biblioteca 14) que corresponden a 1130 Å2 y 1200 Å2, respectivamente. Otra explicación podría ser que el área de unión cóncava no es muy adecuada para unirse a proteína y, por lo tanto, el uso de una superficie más plana podría mejorar las afinidades finales. Estas dos nuevas bibliotecas (cada una de 3,0 1012 variantes) se construyeron del mismo modo que la biblioteca once. La secuenciación de setenta clones aleatorios de la biblioteca 14 confirmó que la frecuencia observada de restos era similar a la predicha, con una ligera sub-representación de restos aminoacídicos S, L, y R, mientras que los restos aminoacídicos P, N, Q, y H estaban un poco sobre-representados (datos no mostrados). Se descubrió que el porcentaje de clones correctos, sin ningún desplazamiento de fase o deleción, era de aproximadamente el 65%. Por tanto, la diversidad "funcional" se consideró satisfactoria y la biblioteca se usó para selecciones.

Ejemplo 4: Selecciones de presentación en ribosoma con PulD-N como proteína diana, usando la biblioteca 13 y 14

Se realizaron cuatro rondas de selecciones usando estas bibliotecas y PulD-N como proteína diana. Se realizó una quinta ronda en paralelo con las bibliotecas 11, 13, 14 con una selección de disociación suave durante dos horas para enriquecer las combinaciones para agentes de unión con disociaciones más lentas. Un radioinmunoensayo para las combinaciones después de la quinta ronda (figura 7) indicó un enriquecimiento para agentes de unión a PulD-N específicos con las dos nuevas bibliotecas. La unión no pudo detectarse en BSA o neutravidina inmovilizada. Además, este RIA mostró que 10 nM de PulD-N libre fue suficiente para inhibir aproximadamente el 50% de la señal de unión con la biblioteca 13 en comparación con 100 nM de PulD-N para el mismo nivel de inhibición con la

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en presencia del sustrato cromogénico de precipitación (NBT/BCIP) en cantidades tan bajas como 1,5-3 ng (figura 12a) sin reactividad cruzada. Esto apoyó la doble funcionalidad de las fusiones observada con ELISA (figura 12a). La detección de bajas cantidades de PulD-N se hizo mientras estaban presentes cantidades mucho mayores de proteínas endógenas, lo que demuestra que los agentes de unión 6, 33, y 40 eran capaces de discriminar PuID-N entre miles de proteínas y por lo tanto eran altamente específicos.

Para evaluar la especificidad adicionalmente, el agente de unión 6 se inmovilizó covalentemente mediante una reacción de acoplamiento de amina en una columna activada de NHS-agarosa de un mililitro. La fracción soluble de un extracto crudo de E. coli correspondiente a 40 ml de un cultivo que produce PulD-N se inyectó después en la columna. Las fracciones se recogieron durante las etapas de carga, lavado y elución (cambio a pH ácido). El análisis por SDS-PAGE de estas fracciones demostró que la columna era capaz de atrapar el PulD-N presente en el extracto crudo y que esto se hacía con alta especificidad, ya que la única banda visible en el gel SDS-PAGE teñido correspondía a PulD-N (figura 12b). Por tanto, se confirmó de nuevo la capacidad de los agentes de unión de discriminar PulD-N entre miles de proteínas.

Ejemplo 6: Unión de agentes de unión a PulD-N a PulD dodecamérico

A continuación, los inventores investigaron si los tres derivados seleccionados de Sac7d con las mayores afinidades por PulD-N (agentes de unión 6, 33 y 40) eran capaces de reconocer la proteína PulD de longitud completa integrada en la membrana externa de E. coli. PulD de longitud completa forma dodecámeros en la membrana (mientras que PulD-N es monomérico) (Chami et al., 2005) y no podía excluirse que el epítopo reconocido por cada uno de esos agentes de unión estuviera afectado por la multimerización de PulD, evitando de este modo su unión a PulD nativo. Cuando se mezclaron cantidades crecientes de membranas que contenían PulD de E. coli PAP105 (pCHAP3671 pCHAP580) con cantidades saturantes de agentes de unión 40 o 33 marcados con GFP, la cantidad de agente de unión que permanecía en los sedimentos después de centrifugación estaba correspondientemente aumentada (Fig. 13A). Los agentes de unión marcados con GFP no se sedimentaron con las membranas de PAP 105 (pCHAP3711 pCHAP580) que contenían una variante de PulD que carecía del dominio N (Guilvout et al., 2006) (Fig. 13A). Por tanto, la unión de estas quimeras GFP-agente de unión a las membranas es específica de PulD-N, y se unen al complejo nativo dodecamérico de secretina a pesar de la presencia de la marca GFP. El agente de unión 6 se unión solamente de forma muy débil a las membranas que contenían PulD (datos no mostrados).

Se usó una inmunotransferencia de Far-Western para validar la unión de los derivados de Sac7d a dodecámeros de PulD. Las tres quimeras Sac7*- PhoA se unieron específicamente a PulD tanto monomérico como dodecamérico pero no a PulD-CS (Fig. 13B). Aunque estas tres quimeras se unieron igual de bien a PulD disociado en fenol (monomérico; véase (Hardie et al., 1996)) (datos no mostrados), mostraron de forma coherente diferentes afinidades aparentes por PulD dodecamérico, que variaban de alta (agente de unión 40), a baja (agente de unión 6).

Ejemplo 7: Agentes de unión a PulD-N inhiben la secreción de pululanasa y evitan la multimerización de PulD

Las quimeras Sac7*-PhoA, en las que Sac7d o sus derivados están emparedados entre el péptido señal PhoA y la parte catalítica de PhoA, se exportaron de forma eficaz al periplasma, controlado por la elevada actividad PhoA y la liberación tras choque periplásmico. Se transformaron plásmidos que codificaban las quimeras Sac7*-PhoA en la cepa PAP7232 de E. coli, en los que los genes pul están integrados en el cromosoma. Las tres quimeras se produjeron en cantidades similares después de inducción con IPTG e inhibieron la secreción de pululanasa completamente, mientras que Sac7d-PhoA exportada no tuvo efecto. Además, no se detectaron ni dodecámeros ni monómeros de PulD en las cepas que producían alguna de las quimeras Sac7*-PhoA (datos no mostrados). Para obtener información más precisa sobre estos fenómenos y para estudiar el destino de PulD en cepas que producen las quimeras, se produjeron en la cepa deficiente en proteasa de envuelta PAP5198 que porta pCHAP231 (para aumentar la producción de T2SS; véase Guilvout et al., 2006). Los niveles inducidos por IPTG de producción de Sac7*-PhoA inhibieron la secreción de pululanasa en >90% (Fig. 14A). PulD dodecamérico fue mucho menos abundante, y los monómeros de PulD eran correspondientemente más abundantes (flechas en la Fig. 14B) que en controles sin quimeras o con Sac7d-PhoA, lo que demuestra que las quimeras evitan la multimerización de PulD y causan degradación de monómero PulD por proteasas de la envuelta. Se obtuvieron resultados similares con niveles no inducidos de Sac7*33-PhoA y Sac7*40-PhoA, pero sucedió secreción sustancial de pululanasa (>50%) y multimerización de PulD cuando Sac7*6-PhoA estaba presente a niveles no inducidos (Fig. 14C).

Ejemplo 8: Selección de variantes de Sac7d que se unen a otras dianas

Se usó la mejor biblioteca (biblioteca 14) para obtener agentes de unión específicos para otras dianas, usando la misma tecnología que la descrita anteriormente.

Se realizaron selecciones por presentación en ribosoma anti-proteína centrada en las siguientes proteínas: PulDN1 (26,8 kDa), NGF (13 kDa), PknG (81,6 kDa), GarA (12 kDa) y lisozima (14,3kDa) hasta el ciclo Nº 5. Durante el cuarto ciclo, el proceso de selección se realizó en paralelo, con y sin la diana. La Figura 15 muestra que, después de 4 ciclos de selección, se obtiene un producto de PCR solamente cuando está presente la diana (carriles marcados como "+"). Esto sugiere que las combinaciones de selección estaban enriquecidas con clones específicos para cada una de las dianas ensayadas.

Para evaluar adicionalmente el éxito del proceso de selección, se realizó un radioinmunoensayo (RIA) competitivo usando las proteínas diana a diversas concentraciones inhibidoras. Estos RIA muestran claramente que existe un marcado enriquecimiento para selecciones anti-PknG, anti-lisozima y anti-PulDN1 mientras que en el caso de NGF y GarA, los resultados sugieren que la selección no ha convergido aún suficientemente. La Figura 16 muestra que la afinidad anticipada promedio para las variantes anti-PknG y anti-lisozima es del orden de 1 a 10 nM.

Las combinaciones de selección anti-lisozima, anti-PknG y anti-GarA usadas en el ciclo Nº 5 se seleccionaron de acuerdo con el método ELISA preparando micro-cultivos de 96 pocillos y usando sobrenadantes de lisis bacteriana después de inducir expresión del clon con IPTG durante 4 horas a 30ºC. Los resultados presentados en la Figura 17 muestran claramente que hay clones específicos para cada una de las dianas. Aunque el RIA para GarA no fue alentador, no obstante se detectó una proporción significativa de clones positivos con el método ELISA. Se aisló y secuenció un clon particular que se une a GarA. La Figura 19 muestra la alineación de la secuencia de este agente de unión (GSVKVKFLYLGEEKEVDTSKIWFVMRAGKrTVYFQYDDNGKYGIGWVREKDAPKELLDMLARAEREKKL, SEC ID Nº 47) con Sac7d.

Respecto a PknG, una proporción significativa de clones pareció unirse a BSA, lo que sugiere que se requiere un ciclo adicional para eliminarlos. Se realizaron selecciones anti-PulDN1 y anti-NGF.

Los clones anti-lisozima positivos se seleccionaron y clasificaron por Biacore para las mejores afinidades anticipadas (tiempo de disociación de complejo largo (koff)), preparando microcultivos de 96 pocillos. Los 24 mejores clones seleccionados después se secuenciaron (Figura 18). Es claramente evidente una secuencia preferente, tal como la del clon Lys_B11, ya que está representada varias veces (aunque codificada para ciertas posiciones por diferentes codones para el mismo aminoácido). La selección del ciclo Nº 4 reveló una mayor diversidad (no mostrado).

Se produjeron tres clones de diferentes secuencias (Lys_B3, Lys_H4 y Lys_H8) en E. coli, se purificaron a gran escala por IMAC y después se pasaron a través de un tamiz molecular. Los niveles de producción obtenidos fueron aproximadamente 120, 40 y 25 mg/l de cultivo, respectivamente. Las afinidades determinadas por Biacore se están obteniendo y procesando. Los datos actuales (preliminares) indican afinidades del orden de 15 nM, 3 nM y 25 nM (Lys_B3, Lys_H4 y Lys_H8, respectivamente).

Los tres clones anti-Iisozima (Lys_B3, Lys_H4 y Lys_H8) se están caracterizando actualmente por microcalorimetría para determinar sus termoestabilidades y afinidades en solución.

Los clones obtenidos de otras selecciones también se seleccionarán por Biacore y se secuenciarán, y se determinarán las afinidades de ciertos clones de forma más precisa por Biacore.

Ejemplo 9: Selección de variantes de Sac7d que se unen a un fragmento Fc de IgG humana

9.1. Selección de agentes de unión a Fc

Se biotiniló químicamente un fragmento Fc de IgG humana (PM = 50 kDa) proporcionado por Bio-Rad usando sulfosuccinimidil-6-(biotinamido) hexanoato. El grado de biotinilación, determinado por un ensayo HABA, fue de aproximadamente 2 a 3 moléculas de biotina por molécula de proteína. El Fc biotinilado se unió a neutravidina o estreptavidina inmovilizada en una placa Maxisorp (Nunc) y las secciones por presentación en ribosoma se realizaron a 4ºC usando la biblioteca derivada de Sac7d (como se ha descrito anteriormente). Se realizaron cuatro rondas de selección para aislar agentes de unión. Se usaron neutravidina y estreptavidina alternativamente de una ronda a otra para evitar agentes de unión no específicos.

9.2. Evaluación de la combinación de secuencias seleccionadas

Después de una ronda de selección, se obtuvo una combinación de secuencias (supuestamente agentes de unión) que portan una marca RGS-His6. Esta combinación se tradujo in vitro usando un extracto de E. coli S30, y se ensayó su actividad de unión por ELISA usando un conjugado anti-RGS-marca His6-HRP. Se detectó una actividad de unión en la combinación de selección frente al fragmento Fc inmovilizado de forma pasiva, y no se observó señal de unión frente a BSA, Neutravidina y Estreptavidina (no mostrado). Este resultado sugiere que la combinación de agentes de unión es probablemente específica del fragmento Fc y que no hay contribución significativa de Neutravidina o Estreptavidina a la actividad de unión.

También se realizó un ELISA de competición con esta combinación traducida para evaluar de forma aproximada la afinidad promedio de los agentes de unión seleccionados. En este experimento, la traducción se pre-incubó con varias concentraciones de fragmento Fc antes de la incubación en la placa ELISA en la que estaba inmovilizado el fragmento Fc. Como se muestra en la figura 20, pudo inhibirse el 20% y el 70% de la señal con 10 nM y 100 nM de

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una proteína estructural sin la necesidad de una etapa de maduración de afinidad (para una revisión, véase (Hosse et al., 2006) y referencias en el mismo). Las cinéticas de las uniones también fueron remarcables, con tasas de

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asociación de aproximadamente 2 107.s que clasifican los agentes de unión para PulD-N en el intervalo superior de tasas de asociación limitadas por difusión para interacciones proteína-proteína (Gabdoulline y Wade, 1997). Las tasas de asociación no parecen estar electrostáticamente asistidas. Por tanto, las elevadas tasas de asociación podrían explicarse por la forma "preformada" del agente de unión que concuerda geométricamente con la diana sin la necesidad de cambios conformacionales.

Las altas afinidades obtenidas están asociadas con una especificidad muy elevada. Los inventores han demostrado que cualquiera que sea el contexto (extracto crudo o membranas de E. coli) y el enfoque (inmunotransferencia o cromatografía de afinidad), todos los agentes de unión ensayados fueron capaces de discriminar la diana entre miles de proteínas diferentes. Esta rigurosa especificidad podría estar relacionada con la rigidez de la estructura que evita ligeras adaptaciones a diferentes dianas. Además, las docenas de agentes de unión seleccionados demostraron ser específicos de diana en ensayos ELISA, lo que indica que la presión de selección aplicada era suficiente para deshacerse de las moléculas adhesivas.

Los rendimientos de proteínas recombinante para las variantes (hasta 200 mg/l de cultivo de E. coli) fueron mucho mayores que los presentados para Sac7d (aproximadamente 10-15 mg/l). Esta diferencia puede explicarse por la lisis que sucede pocas horas después de la inducción de la expresión del gen sac7d de tipo silvestre. Esta toxicidad se debe probablemente a perturbaciones de las vías de regulación inducidas por la unión de Sac7d al genoma de E. coli, ya que Sac7d es una proteína de unión a ADN general. Esta limitación no se observa para variantes, lo que sugiere que las variantes habían perdido de hecho su propiedad de unión a ADN.

La estabilidad termodinámica observada para tres variantes es muy similares a otras varias proteínas de termófilos (Kahsai et al., 2005) y la estabilidad térmica de los agentes de unión permaneció cercana a la de Sac7d de tipo silvestre. El clon 6, el clon menos estable analizado, siguió siendo una proteína termoestable con una Tm de aproximadamente 68ºC a pH 5,6, una Tm en 8ºC inferior en comparación con la de pH 7,0. Por tanto, parece que a pesar de los valores variables de Tm observados de un clon a otro, globalmente el diseño de biblioteca descrito anteriormente, combinado con el uso de una proteína de un origen extremófilo, condujo a la generación de proteínas muy estables con las propiedades deseadas de reconocimiento.

Unión in vivo e inhibición intracelular de secreción de pululanasa

Las tres quimeras Sac7*-PhoA que se ensayaron se unieron a PulD de longitud completa monomérico. Sac7*40-PhoA y Sac7*33-PhoA se unieron bien a PulD dodecamérico, lo que indica que sus epítopos permanecen accesibles. En contraste, Sac7*6-PhoA se unión sólo débilmente a dodecámeros de PulD pero tenía la mayor afinidad por PulD-N in vitro, lo que indica que su epítopo está parcialmente enmascarado tras la multimerización y es diferente de los reconocidos por Sac7*40 y Sac7*33. Los experimentos de competición ITC indicaron que los epítopos reconocidos por Sac7*6 y Sac7*40 son idénticos o solapan (datos no mostrados). Las diferencias en los efectos in vivo de estos dos agentes de unión, cuando están fusionados a PhoA, sugieren que su epítopos se solapan.

Las tres variantes Sac7*-PhoA evitaron la multimerización de PulD y abordaron monómeros de PulD para la degradación por proteasas de la envuelta, bloqueando de este modo la secreción de pululanasa. Evidencias previas indicaron que el dominio N no influye en la multimerización de PulD (Guilvout et al., 2006). La dimerización de PhoA en Sac7*-PhoA podría causar impedancia estérica y consecuente mal posicionamiento de los monómeros de PulD. Los niveles de secreción en las cepas que producen Sac7*-PhoA permanecieron muy bajos cuando el nivel de PulD producido se aumentaba y se inactivaban las proteasas de la envuelta (Fig. 14B). La baja secreción podría deberse a la presencia de solamente unos pocos dodecámeros de PulD, oclusión de los canales, o enmascaramiento de un sitio esencial de interacción con el sustrato (Shevchik et al., 1997) u otro componente de secreción (Possot et al., 2000) por las quimeras unidas.

La reducción del nivel de Sac7*33 o Sac7*40 (eliminando la inducción por IPTG) no disminuyó su efecto sobre la secreción o multimerización de PulD, pero Sac7*6-PhoA estaba casi sin efecto en estas condiciones (Fig. 14C), aunque era al menos tan abundante como las otras quimeras (Fig. 14A). Dos diferentes escenarios podrían explicar esta observación. Primero, el Sac7*6-PhoA altamente abundante se une a casi todos los monómeros de PulD y evita su multimerización. Sin embargo, cuando los niveles de Sac7*6-PhoA son inferiores, no puede competir de forma eficaz con las interacciones monómero-monómero de PulD, y suficientes multímeros se ensamblan para permitir una secreción eficaz. La afinidad aparentemente inferior de Sac7*6-PhoA por PulD dodecamérico es insuficiente para evitar la secreción. Segundo, la unión de la chaperona PulS a monómeros de PulD, un pre-requisito para su correcto direccionamiento a la membrana externa (Guilvout et al., 2006; Hardie et al., 1996), evita la unión de Sac7*6-PhoA y permite la correcta multimerización. Es este escenario, el resultado depende de la proteína que se una primero a PulD, PulS o Sac7*6-PhoA. Ambos escenarios están en acuerdo con el hecho de que el epítopo reconocido por Sac7*6 está fuertemente enmascarado tras la multimerización de PulD, lo que sugiere que está en una interfaz entre dos monómeros.

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