ES2694284T3 - Métodos y usos de los ácidos nucleicos para el análisis de la metilación y la expresión de genes, en particular de NFATC3, asociados con trastornos proliferativos de células de la próstata - Google Patents

Abstract

Un método para detectar trastornos proliferativos de células de próstata en un sujeto que comprende determinar la metilación CpG de NFATC3 en una muestra biológica aislada de dicho sujeto en el que la metilación de CpG es indicativa de la presencia de dichos trastornos.

Description

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DESCRIPCION

Metodos y usos de los acidos nucleicos para el analisis de la metilacion y la expresion de genes, en particular de NFATC3, asociados con trastornos proliferativos de celulas de la prostata.

Campo de la invencion

La presente invencion se relaciona con secuencias de ADN genomico que exhiben patrones de expresion alterados en estados de enfermedad con relacion a la normalidad. Realizaciones particulares proveen metodos, acidos nucleicos, arreglo de acidos nucleicos y kits utiles para la deteccion de, o para el diagnostico de carcinoma de prostata.

Tecnica anterior

El cancer de prostata es el cancer mas comun y la tercera causa principal de muerte en los hombres estadounidenses (Jemal et al., Cancer statistics, 2006. CA Cancer J Clin. 2006;56(2): l06-30). Las tasas de incidencia y mortalidad de esta enfermedad se incrementan considerablemente con la edad, con mas del 65% de todos los casos de cancer de prostata diagnosticados en hombres mayores de 65 anos (Jemal et al., 2006; supra). La etapa de la enfermedad al momento del diagnostico tambien afecta a las tasas globales de supervivencia. Debido al uso generalizado de la prueba de deteccion del antfgeno prostatico espedfico (PSA), casi el 90% de los nuevos pacientes son diagnosticados con enfermedad local o regional (Jemal et al, 2006; supra). Los pacientes con enfermedad local o regional, cuando son diagnosticados tienen una tasa de supervivencia relativa a cinco anos que se aproxima al 100% (Jemal et al, 2006; supra).

Las grnas actuales para la deteccion del cancer de prostata, de acuerdo con la American Cancer Society, aconsejan las pruebas de PSA elevado y el tacto rectal anualmente a partir de los 50 anos. Para hombres con alto riesgo de desarrollar cancer de prostata (hombres afroamericanos y hombres con uno o mas familiares en primer grado diagnosticados a una edad temprana), el cribado debe comenzar a los 45 anos. Los resultados positivos en cualquiera de estos examenes son confirmados mediante una biopsia de prostata. El advenimiento del cribado de PSA ha cambiado el panorama del diagnostico de cancer de prostata. Las tasas de incidencia de cancer de prostata se han incrementado dramaticamente en los ultimos 20 anos, mientras que el diagnostico en los hombres mayores de 65 anos se ha estabilizado. La prueba de PSA adolece de dos desventajas. El primero es su baja especificidad puesto que el PSA es elevado en un numero de condiciones benignas, ademas de en cancer de prostata. Esto da como resultado un gran numero de biopsias de prostata que son conducidas en hombres que no tienen cancer de prostata. La segunda desventaja es que a pesar de la relativamente alta sensibilidad del PSA, hay hombres que albergan el cancer de prostata en ausencia de PSA elevado (> 4 ng/ml) (Thompson et al., Prevalence of prostate cancer among men with a prostatespecific antigen level < or =4.0 ng per milliliter. N Engl J Med. 2004 May 27;350(22):2239-46. Erratum in: N Engl J Med. 2004 30;351(14): 1470).). Tambien se ha estimado que hasta el l0% de las biopsias de prostata bajo las guias actuales son falsos negativos, lo que da como resultado la disminucion de la sensibilidad incluso con biopsia (Djavan et al., Optimal predictors of prostate cancer on repeat prostate biopsy: a prospective study of 1,051 men. J Urol. 2000; 163(4): 1144-8; discussion 1148-9.; Mian et al., Predictors of cancer in repeat extended multisite prostate Biopsiain men with previous negative extended multisite biopsy. Urology. 2002;60(5):836-40; Gupta et al., Transrectal ultrasound guided Biopsiafor detecting early prostate cancer: An Indian experience., Indian J Cancer. 2005;42(3): 151-4; Hanley et al., ADN integrity assay: a plasma-based screening tool for the detection of prostate cancer. Clin Cancer Res. 20061;12(15):4569-74). Son claramente necesarias pruebas mejoradas con una especificidad y sensibilidad incrementadas. Pong et al. (PNAS, vol. 104, no. 5, p. 1655-1660, 2007) divulga que el virus XMRV, que ha sido aislado del tejido del cancer de prostata, se integra en el genoma humano en tres posiciones diferentes, una de las cuales es 1816 pb corriente abajo del inicio de la transcripcion del gen NFATC3. Glud (Blood, vol. 106, no. 10, p. 3546-3552, 2005) divulga que en los linfomas de celulas T en los que se ha integrado un provirus, la expresion de NFATC3 se reprime. El documento WO 2005/054517 A divulga un metodo de diagnostico para detectar una neoplasia, en la que se determina la expresion de un factor de transcripcion NF-AT.

Enfoque multifactorial. El diagnostico del cancer se ha basado tradicionalmente en la deteccion de marcadores moleculares individuales (por ejemplo, mutaciones geneticas, niveles elevados de PSA). Desafortunadamente, el cancer es un estado de enfermedad en el que los marcadores individuales han fallado tfpicamente para detectar o diferenciar muchas formas de la enfermedad. Por lo tanto, los ensayos que reconocen solamente un unico marcador han demostrado ser de valor predictivo limitado. Un aspecto fundamental de esta invencion es que el diagnostico de cancer basado en metilacion y la deteccion, el diagnostico y el seguimiento terapeutico de este tipo de enfermedades proveera mejoras significativas sobre el estado de la tecnica que utiliza analisis con marcadores individuales mediante el uso de una seleccion de marcadores multiples. El enfoque analttico multiple es particularmente adecuado para el diagnostico del cancer ya que el cancer no es una enfermedad simple, este enfoque de "panel" multifactorial es consistente con la naturaleza heterogenea del cancer, tanto citologica como clmicamente.

La clave para la implementacion exitosa de un enfoque de panel para las pruebas de diagnostico basadas en metilacion es el diseno y desarrollo de paneles optimizados de marcadores que pueden caracterizar y distinguir estados de enfermedad. La presente invencion describe una pluralidad de paneles particularmente eficientes y unicos de genes, el analisis de metilacion de uno o una combinacion de los miembros del panel que permite la deteccion de

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trastornos proliferativos de celulas de prostata con particularmente una alta sensibilidad, especificidad y/o valor predictivo.

Desarrollo de las pruebas medicas. Dos medidas evaluativas clave de cualquier deteccion medica o prueba de diagnostico son su sensibilidad y especificidad, que miden que tan bien se desempena la prueba para detectar con precision a todos los individuos afectados sin excepcion, y sin incluir falsamente individuos que no tienen la enfermedad objetivo (valor predictivo). Historicamente, se han criticado muchas pruebas de diagnostico debido a la escasa sensibilidad y especificidad.

Un resultado positivo verdadero (TP) es cuando la prueba es positiva y esta presente la condicion. Un resultado falso positivo (FP) es cuando la prueba es positiva, pero no esta presente la condicion. Un resultado verdadero negativo (TN) es cuando la prueba es negativa y no esta presente la condicion. Un resultado falso negativo (FN) es cuando la prueba es negativa pero no esta presente la condicion. En este contexto: Sensibilidad = TP/(TP + FN); Especificidad = TN/(FP + TN); y Valor predictivo = TP/(TP + FP).

La sensibilidad es una medida de la capacidad de una prueba para detectar correctamente la enfermedad objetivo en un individuo que esta siendo probado. Una prueba que tiene poca sensibilidad produce una alta tasa de negativos falsos, es decir, las personas que tienen la enfermedad, pero se identifican falsamente como libre de dicha enfermedad. El peligro potencial de un falso negativo es que el individuo enfermo permanecera sin diagnosticar y sin tratar durante algun periodo de tiempo, durante el cual la enfermedad puede progresar a una etapa posterior en la que los tratamientos, en su caso, pueden ser menos efectivos. Un ejemplo de una prueba que tiene una baja sensibilidad es un analisis de sangre a base de protemas del VIH. Este tipo de prueba exhibe pobre sensibilidad, ya que no puede detectar la presencia del virus hasta que la enfermedad esta bien establecida y el virus ha invadido el torrente sangumeo en cantidades sustanciales. Por el contrario, un ejemplo de una prueba que tiene alta sensibilidad es la deteccion de carga viral usando la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). La alta sensibilidad se consigue porque este tipo de prueba puede detectar cantidades muy pequenas de virus. La alta sensibilidad es particularmente importante cuando las consecuencias de la falta de un diagnostico son altos.

La especificidad, por otro lado, es una medida de la capacidad de una prueba para identificar con precision pacientes que estan libres del estado de enfermedad. Una prueba que tiene poca especificidad produce una alta tasa de falsos positivos, es decir, individuos que se identifican falsamente como tener la enfermedad. Un inconveniente de falsos positivos es que obligan a los pacientes a someterse a tratamientos de innecesarios procedimientos medicos con sus riesgos inherentes, las tensiones emocionales y financieras, y que podnan tener efectos adversos sobre la salud del paciente. Una caractenstica de las enfermedades que hace que sea diffcil de desarrollar pruebas de diagnostico con alta especificidad es que los mecanismos de la enfermedad, especialmente en el cancer, frecuentemente involucran una pluralidad de genes y protemas. Adicionalmente, ciertas protemas pueden ser elevadas por razones no relacionadas con un estado de enfermedad. Un ejemplo de una prueba que tiene alta especificidad es una prueba basada en los genes que puede detectar una mutacion p53. La especificidad es importante cuando el coste o el riesgo asociado con procedimientos de diagnostico adicionales o una intervencion medica adicional son muy altos.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 provee una vision general de la metilacion media logantmica medida por medio del ensayo HM de acuerdo con el Ejemplo 1. Para cada gen analizado (segun marcado a la derecha de las figuras), se proveen dos graficas, las graficas de la parte izquierda proveen el analisis multiclase, la sensibilidad se muestra en el eje Y, la metilacion del ADN medido en (log 10 ng/ml) se muestra en el eje X. La grafica de la derecha provee una ROC en donde la sensibilidad se muestra en el eje Y y la especificidad 1 se muestra en el eje X. (A- Sangre normal, B - Prostata normal, C - Prostata NAT, D - Prostata tumoral).

La Figura 2 provee una vision general de la metilacion media logantmica medida por medio de ensayos de PCR en

tiempo real de HM de orina despues de masajes prostaticos de PCa y clase I negativa (individuos jovenes

asintomaticos) de acuerdo con el Ejemplo 1. Para cada gen analizado (segun marcado encima de cada grafica), la sensibilidad se muestra en el eje Y, la metilacion del ADN medido en (log 10 ng/ml) se muestra en el eje X.

La Figura 3 provee una vision general de la metilacion media logantmica medida por medio de ensayos de PCR en

tiempo real de HM de orina despues de masajes prostaticos de PCa y de clase II negativos (individuos jovenes

asintomaticos ademas de negativos en biopsia) de acuerdo con el Ejemplo 1. Para cada gen analizado (como la etiqueta encima de cada trama), la sensibilidad se muestra en el eje Y, la metilacion del ADN se mide en (log 10 ng/ml) se muestra en el eje X.

La Figura 4 muestra la metilacion medida logantmica medida por medio de ensayos de PCR en tiempo real de HM de plasma de PCa y clase I negativa (individuos asintomaticos jovenes). Para cada gen analizado (segun lo marcado encima de cada grafica), la sensibilidad se muestra en el eje Y, la metilacion del ADN medida en (log 10 ng/ml) se muestra en el eje X.

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La Figura 5 muestra la metilacion medida logantmica medida por medio de ensayos de PCR en tiempo real de HM de plasma de PCa y clase II negativa (individuos jovenes asintomaticos mas negativos en biopsia). Para cada gen analizado (segun lo marcado encima de cada grafica), la sensibilidad se muestra en el eje Y, la metilacion del ADN medida en (log 10 ng/ml) se muestra en el eje X.

La figura 6 muestra el rendimiento de biomarcadores en la discriminacion de los pacientes con PCa de hombres asintomaticos (Ejemplo 1: Realizacion de biomarcadores para PCa vs. clase I negativa (hombres asintomaticos)). A, la Tabla compara las AUC, la sensibilidad y los valores de p de Wilcoxon de los cuatro biomarcadores para PCa versus hombres asintomaticos en ADN de orina. B, la Tabla compara las AUC, la sensibilidad y los valores de Wilcoxon de los cuatro biomarcadores para PCa versus hombres asintomaticos en ADN de plasma. C, curvas ROC para biomarcadores de PCa individuales en ADN de orina.

La Figura 7 muestra el rendimiento de biomarcadores en la discriminacion del PCa de pacientes negativos de biopsia (Ejemplo 1: Rendimiento de biomarcadores para PCa versus hombres negativos de biopsia). A, la Tabla compara valores p de AUC y Wilcoxon de los cuatro biomarcadores para PCa versus pacientes negativos de biopsia en ADN de orina. Las sensibilidades se dan para especificidades de 50%, 80%, 90% y 95%. B, la Tabla compara los valores p de AUC y de Wilcoxon de los cuatro biomarcadores para PCa versus pacientes negativos de biopsia en ADN de plasma. Las sensibilidades se dan para especificidades de 50%, 80%, 90% y 95%. C, la Tabla compara los valores p de AUC y de Wilcoxon de los biomarcadores relacionados con PSA para PCa versus pacientes negativos de biopsia. Las sensibilidades se dan para especificidades de 50%, 80%, 90% y 95%. D, curvas ROC para los biomarcadores PCa individuales en ADN de orina.

La Figura 8 muestra el rendimiento de biomarcadores CARTPT. La Figura 8A muestra el rendimiento de biomarcadores CARTPT en la discriminacion del PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida por medio de PCR cuantitativo en tiempo real (qPCR); Ejemplo 2) y la Figura 8B muestra el rendimiento de biomarcadores CARTPT en la discriminacion del PCa de la orina del paciente de biopsia negativa (izquierda de la curva ROC, derecha metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 3).

La Figura 9 muestra el rendimiento de biomarcadores CX43/GJA1. La Figura 9A muestra el rendimiento de biomarcadores CX43/GJA1 en la discriminacion de PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 2) y la Figura 9B muestra el rendimiento de biomarcadores CX43/GJA1 en la discriminacion de PCa de la orina del paciente de biopsia negativa (izquierda de la curva ROC, derecha metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 3).

La Figura 10 muestra el rendimiento de biomarcadores GPR68 en la discriminacion de tejidos de PCa de suma alta de Gleason a partir de PCa de suma baja de Gleason (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 2). 15/26 (58%) Gleason 8/9; 3/12 (25%) Gleason 5/6; AUC = 0.66; p de Wilcoxon = 0.05 Gleason 9-10 vs. 5-8 (Los numeros de 5-9 en el diagrama indican las puntuaciones de Gleason 5, 6, 7, 8, y 9).

La Figura 11 muestra el rendimiento de biomarcadores FGF 13. La Figura 11A muestra el rendimiento de biomarcadores FGF 13 en la discriminacion del PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 2) y la Figura 11B muestra el rendimiento de biomarcadores FGF 13 en la discriminacion de PCa de la orina del paciente de biopsia negativa (izquierda curva ROC, derecha metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 3).

La Figura 12 muestra el rendimiento de biomarcadores SPG20. La Figura 12A muestra el rendimiento de biomarcadores SPG20 en la discriminacion de PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real, Ejemplo 2) y la Figura 12B muestra el rendimiento de biomarcadores SPG20 de PCa de orina del paciente de biopsia negativa (izquierda curva ROC, derecha metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 3).

La Figura 13 muestra el rendimiento de biomarcadores NKX2-6 en la discriminacion del PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida por medio de qPCR en tiempo real, Ejemplo 2).

La Figura 14 muestra el rendimiento de biomarcadores RARB en la discriminacion de PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real, Ejemplo 2).

La Figura 15 muestra el rendimiento de biomarcadores PDE4D en la discriminacion de PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida por medio de qPCR en tiempo real, Ejemplo 2).

La Figura 16 muestra el rendimiento de biomarcadores MN1. La Figura 16A muestra el rendimiento de biomarcadores MN1 en la discriminacion de PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real, Ejemplo 2) y la Figura 16B muestra el rendimiento de biomarcadores MN1 en la discriminacion de PCa de orina del paciente de biopsia negativa (izquierda curva ROC, derecha metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 3).

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La Figura 17 muestra el rendimiento de biomarcadores KLF8. La Figura 17A muestra el rendimiento de biomarcadores KLF8 en la discriminacion de PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real, Ejemplo 2) y la Figura 17B muestra el rendimiento de biomarcadores KLF8 en la discriminacion del PCa de orina del paciente de biopsia negativa (izquierda curva ROC, derecha metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 3).

La Figura 18 muestra el rendimiento de biomarcadores M0BKL2B. La Figura 18A muestra el rendimiento de biomarcadores MOBKL2B en la discriminacion del PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real, Ejemplo 2) y la Figura 18B muestra el rendimiento de biomarcadores M0BKL2B del PCa de orina del paciente de biopsia negativa (izquierda curva ROC, derecha metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 3).

La Figura 19 muestra el rendimiento de biomarcadores HIST1H2BD en la discriminacion del PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real, Ejemplo 2).

La Figura 20 muestra el rendimiento de biomarcadores NFATC3. La Figura 20A muestra el rendimiento de biomarcadores NFATC3 en la discriminacion del PCa a partir de tejidos benignos (metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real, Ejemplo 2) y la Figura 20B muestra el rendimiento de biomarcadores NFATC3 en la discriminacion del PCa de orina del paciente de biopsia negativa (izquierda curva ROC, derecha metilacion media logantmica medida mediante qPCR en tiempo real; Ejemplo 3).

Resumen de la invencion

La presente invencion provee metodos y usos para detectar trastornos proliferativos de celulas de prostata de acuerdo con las reivindicaciones adjuntas.

Preferiblemente, se analiza una pluralidad de genes (en adelante tambien denominado como un "panel de genes"). Preferiblemente se analizan 2, 3 o 4 genes. En una realizacion del metodo dicho panel comprende junto a NFATC3 al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIsTlH4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3- 1 ; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; MN1 ; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 y/o EXON 2); y/o sus promotores o regiones reguladoras. Preferiblemente, dicho grupo comprende el gen HIST1H4K.

El metodo para detectar trastornos proliferativos de celulas de la prostata comprende detectar la presencia o ausencia de metilacion de CpG dentro de NFATC3, en donde la presencia de metilacion indica la presencia de trastornos proliferativos de celulas de prostata, mas espedficamente, carcinoma de prostata.

Dicho metodo comprende las siguientes etapas: i) poner en contacto el ADN genomico aislado de una muestra biologica (preferiblemente seleccionado del grupo que consiste de la eyaculacion, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas, celulas aisladas de la sangre) obtenida del sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleotidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos uno y mas preferiblemente una pluralidad de regiones objetivo del ADN genomico, en donde la secuencia de nucleotidos de dicha region objetivo comprende al menos una secuencia de dinucleotido CpG de NFACTC3 y ii) detectar el carcinoma, al menos en parte.

Preferiblemente, se analiza una pluralidad de genes (en adelante tambien se denomina "panel de genes") como se describe anteriormente.

Preferiblemente, la region objetivo comprende, o se hibrida bajo condiciones restrictivas con una secuencia de al menos 16, 50, 100 o 500 nucleotidos contiguos de SEQ ID NO: 50 (NFATC3) y al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-49 y 51-65 para el al menos un gen adicional.

Dicho uso del al menos un gen adicional puede ser permitido por medio de cualquier analisis de la expresion del gen, por medio de analisis de la expresion de ARNm o analisis de la expresion de protemas. Sin embargo, en la realizacion mas preferida esto es permitido por medio de analisis del estado de metilacion del al menos un gen adicional seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); y/o su promotor o elementos reguladores.

Preferiblemente, se analiza una pluralidad de genes (en adelante tambien se denomina "panel de genes") como se describe anteriormente.

Preferiblemente, la fuente de la muestra de prueba se selecciona del grupo que consiste de celulas o lmeas celulares, cortes histologicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, eyaculado, orina, sangre, y combinaciones de los mismos. Mas preferiblemente, la fuente se selecciona del grupo que consiste de eyaculado,

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orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas, celulas aisladas de la sangre obtenida del sujeto.

Espedficamente, la presente invencion provee un metodo para detectar el cancer de prostata adecuado para uso en una herramienta de diagnostico, que comprende: obtener una muestra biologica que comprende acido(s) nucleico genomico; poner en contacto el acido(s) nucleico, o un fragmento del mismo, con un reactivo o una pluralidad de reactivos suficientes para distinguir entre secuencias de dinucleotidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos uno y mas preferiblemente una pluralidad de secuencias objetivo del acido nucleico del sujeto, en donde cada una de dichas secuencias objetivo comprende, o se hibrida bajo condiciones restrictivas con, una secuencia que comprende al menos 16, 50, 100 o 500 nucleotidos contiguos de una secuencia de SEQ ID NO: 50 y opcionalmente ademas una secuencia de seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-49 y 51-65, comprendiendo dicho nucleotidos contiguos al menos una secuencia de dinucleotido CpG; y determinar, basado en al menos en parte sobre dicho distintivo, el estado de metilacion de al menos uno y mas preferiblemente una pluralidad de secuencia dinucleotido CpG objetivo, o un promedio, o un valor que refleja un estado medio de metilacion promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleotidos CpG objetivo.

Preferiblemente, distinguiendo entre las secuencias de dinucleotidos CpG metilados y no metilados dentro de la secuencia objetivo comprende la conversion o no conversion dependiente del estado de metilacion de al menos una de tales secuencia de dinucleotido CpG a la secuencia de dinucleotido convertido o no convertido correspondiente dentro de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5-20; 66-181, y regiones contiguas de los mismos que corresponden a la secuencia objetivo.

Realizaciones adicionales proveen un metodo para la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata, lo mas preferiblemente, cancer de prostata que comprende: obtener una muestra biologica que tiene ADN genomico sometido; extraer el ADN genomico; tratar el ADN genomico, o un fragmento del mismo, con uno o mas reactivos para convertir bases de citosina no metiladas en posicion 5 en uracilo o en otra base que es detectable diferente a la citosina en terminos de propiedades de hibridacion; poner en contacto el ADN genomico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificacion y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleotidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones restrictivas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 92-93; 0 150-151, y complementos de los mismos, en donde el ADN tratado o el fragmento del mismo o bien se amplifica para producir un amplificado, o no se amplifica; y determinar, sobre la base de una presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado de metilacion o un promedio, o un valor que refleja un promedio del nivel de metilacion de al menos uno, pero mas preferiblemente una pluralidad de dinucleotidos CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:50.

Preferiblemente, comprende la determinacion del uso de al menos un metodo seleccionado del grupo que consiste de: i) hibridacion en al menos una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia contigua en al menos 9 nucleotidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 92-93; o 151-151, y complementos del mismo; ii) hibridar al menos una molecula de acido nucleico, unida a una fase solida, que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleotidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 92-93; o 151-151, y complementos del mismo; iii) hibridar al menos una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleotidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 92-93; o 151-151, y complementos del mismo, y que se extiende al menos una de tales moleculas de acido nucleico hibridado por al menos una base de nucleotido; y iv) la secuenciacion del amplificado.

Se describen ademas nuevas secuencias genomicas y qmmicamente modificadas de acidos nucleicos, asf como los oligonucleotidos y/o oligomeros PNA para el analisis de los patrones de metilacion de citosina dentro de las secuencias del grupo que consiste de SEQ ID nO: 1-4; 37-65.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones:

El termino "Relacion Observado/Esperado" ( "Relacion O/E") se refiere a la frecuencia de dinucleotidos CpG dentro de una secuencia de ADN particular, y corresponde al [numero de sitios de CpG/(numero de bases C x numero de bases G)]/longitud de banda para cada fragmento.

El termino "isla CpG" se refiere a una region contigua de ADN genomico que satisface los criterios de (1) que tiene una frecuencia de dinucleotidos CpG que corresponde a un "Relacion observado/Esperado" > 0.6, y (2) que tiene un "contenido GC" > 0.5. Las islas CpG son tfpicamente, pero no siempre, entre aproximadamente 0.2 hasta aproximadamente 1 kb, o hasta aproximadamente 2 kb de longitud.

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El termino "estado de metilacion" o "estatus de metilacion" se refiere a la presencia o ausencia de 5-metilcitosina ("5- mCyt") en uno o una pluralidad de dinucleotidos CpG dentro de una secuencia de ADN. Los estados de metilacion en uno o mas sitios de metilacion CpG particulares (que tienen cada uno dos secuencias de dinucleotidos CpG) dentro de una secuencia de ADN incluyen "no metilado", "totalmente metilado" y "hemimetilado".

El termino "hemi-metilacion" o " hemimetilacion" se refiere al estado de metilacion de un ADN de doble cadena en donde solamente una de las cadenas de la misma esta metilado.

El termino "AUC como se usa aqrn es una abreviatura para el area bajo una curva. En particular, se refiere al area bajo una curva caractenstica de funcionamiento del receptor (ROC). La curva ROC es una grafica de la tasa de verdadero positivo contra la tasa de positivos falsos para los diferentes puntos de corte posibles de una prueba diagnostica. Se muestra el compromiso entre la sensibilidad y la especificidad dependiendo del punto de corte seleccionado (cualquier incremento en la sensibilidad vendra acompanado por una disminucion en la especificidad). El area bajo una curva ROC (AUC) es una medida de la exactitud de una prueba de diagnostico (cuanto mayor sea el area mejor, el optimo es 1, una prueba aleatoria tendna una curva ROC recostada sobre la diagonal con un area de 0.5; para la referencia: J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975).

El termino "hipermetilacion" se refiere al estado de metilacion promedio que corresponde a un incremento de la presencia de 5-mCyt en uno o una pluralidad de dinucleotidos CpG dentro de una secuencia de ADN de una muestra de ADN de prueba, con relacion a la cantidad de 5-mCyt encontrado en los dinucleotidos CpG correspondientes dentro de una muestra normal de ADN de control.

El termino "hipometilacion" se refiere al estado de metilacion promedio que corresponde a una presencia disminuida de 5-mCyt en uno o una pluralidad de dinucleotidos CpG dentro de una secuencia de ADN de una muestra de ADN de prueba, con relacion a la cantidad de 5-mCyt encontrada en dinucleotidos CpG correspondientes dentro de una muestra normal de ADN de control.

El termino "microarreglo" se refiere ampliamente a ambos "microarreglos de ADN," y chip(s) de ADN como se reconoce en la tecnica, abarca todos los soportes solidos reconocidos en la tecnica, y abarca todos los metodos para fijar moleculas de acido nucleico a los mismos o la smtesis de acidos nucleicos sobre los mismos.

"Los parametros geneticos" son mutaciones y polimorfismos de genes y secuencias requeridos adicionalmente para su regulacion. Para ser designado como mutaciones son, en particular, inserciones, supresiones, mutaciones puntuales, inversiones y polimorfismos y, particularmente preferidos, los SNP (polimorfismos de un solo nucleotido).

"Parametros epigeneticos" son, en particular, metilacion de citosina. Parametros epigeneticos adicionales incluyen, por ejemplo, la acetilacion de histonas que, sin embargo, no se puede analizar directamente usando el procedimiento descrito pero que, a su vez, se correlacionan con la metilacion del ADN.

El termino "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, bisulfito, sulfito de hidrogeno o combinaciones de los mismos, utiles como se divulgan aqrn para distinguir entre las secuencias de dinucleotidos CpG metilados y no metilados.

El termino "ensayo de metilacion" se refiere a cualquier ensayo para determinar el estado de metilacion de una o mas secuencias de dinucleotidos CpG dentro de una secuencia de ADN.

El termino "MS.AP-PCR" (reaccion en cadena de la polimerasa cebada arbitrariamente sensible a la metilacion) se refiere a la tecnologfa reconocido en la tecnica que permite un barrido global del genoma usando cebadores ricos en CG para enfocarse en las regiones con mayor probabilidad de contener dinucleotidos CpG, y descrito por Gonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997.

El termino "MethyLight™" se refiere a la tecnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia reconocida en la tecnica, descrita por Eads et al., Cancer Res. 59: 2302-2306, 1999.

El termino ensayo de "HeavyMetil™", en la realizacion del mismo implementado aqrn, se refiere a un ensayo, en donde las sondas de bloqueo espedficas de la metilacion (tambien denominadas aqrn como bloqueadoras) que cubre las posiciones de CpG entre, o cubierta por los cebadores de amplificacion permiten la amplificacion selectiva espedfica de metilacion de una muestra de acido nucleico.

El termino ensayo de "HeavyMetil ™ MethyLight™", en la realizacion del mismo implementado aqrn, se refiere a un ensayo de HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variacion del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo de MethyLight™ se combina con las sondas de bloqueo de metilacion espedfica cubriendo las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificacion.

El termino "Ms-SNuPE" (Extension del cebador de un solo nucleotido sensible a la metilacion) se refiere al ensayo reconocido en la tecnica descrito por Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997.

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El termino "MSP" (PCR espedfica de la metilacion) se refiere al ensayo de metilacion reconocido en la tecnica descrito por Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 9821 a 9826, 1996, y en la Patente US No. 5,786,146.

El termino "COBRA" (analisis de restriccion combinada con bisulfito) se refiere al ensayo de metilacion reconocido en la tecnica descrito por Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534, 1997.

El termino "MCA" (Amplificacion de una isla CpG metilada) se refiere al ensayo de metilacion descrito por Toyota et al., Cancer Res. 59: 2307-12, 1999, y en el documento WO 00/26401 A1.

El termino "hibridacion" ha de entenderse como un enlace de un oligonucleotido con una secuencia complementaria a lo largo de las lmeas de los emparejamientos de bases de Watson-Crick en el ADN de muestra, que forma una estructura duplex.

"Condiciones de hibridacion rigurosas", tal como se definen aqrn, involucran la hibridacion a 68°C en 5x SSC/solucion de Denhardt 5x/1.0% de SDS, y el lavado en 0.2x SSC/0.1% de SDS a temperatura ambiente, o involucra el equivalente del mismo reconocido en la tecnica (por ejemplo, condiciones en las que se lleva a cabo una hibridacion a 60°C en regulador 2.5 x SSC, seguido por varias etapas de lavado a 37°C en una concentracion baja de regulador, y se mantiene estable). Las condiciones moderadamente rigurosas, como se define aqrn, involucrar la inclusion del lavado en 3x SSC a 42°C, o su equivalente reconocido en la tecnica. Los parametros de concentracion de sal y de temperatura se pueden variar para lograr el nivel optimo de identidad entre la sonda y el acido nucleico objetivo. La orientacion con respecto a tales condiciones esta disponible en la tecnica, por ejemplo, por Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y. .; y Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) en la Unidad 2.10.

Los terminos "Enzimas de restriccion espedficas de la metilacion" o "enzimas de restriccion sensibles a la metilacion" deberan interpretarse unicamente como una enzima que digiere selectivamente un acido nucleico dependiente del estado de metilacion de su sitio de reconocimiento. En el caso de tales enzimas de restriccion que cortan espedficamente si el sitio de reconocimiento no esta metilado o hemimetilado, el corte no se llevara a cabo, o con una eficiencia significativamente reducida, si el sitio de reconocimiento esta metilado. En el caso de tales enzimas de restriccion que cortan espedficamente si el sitio de reconocimiento esta metilado, el corte no se llevara a cabo, o con una eficiencia significativamente reducida si el sitio de reconocimiento no esta metilado. Se prefieren las enzimas de restriccion espedficas de la metilacion, la secuencia de reconocimiento de los cuales contiene un dinucleotido CG (por ejemplo cgcg o cccggg). Se prefieren ademas para algunas realizaciones enzimas de restriccion que no cortan si la citosina en este dinucleotido es metilado en el atomo de carbono C5.

"Enzimas de restriccion no espedficas a la metilacion " o "enzimas de restriccion no sensibles a la metilacion" son enzimas de restriccion que cortan una secuencia de acido nucleico con independencia del estado de metilacion con una eficiencia casi identica. Tambien se les llama "enzimas de restriccion inespedficas de metilacion."

En referencia a las secuencias del arreglo compuesto, la frase "nucleotidos contiguos" se refiere a una region de secuencia contigua de cualquier secuencia contigua individual del arreglo compuesto, pero no incluye una region de la secuencia del arreglo compuesto que incluye un "nodo", como se define aqrn mas arriba.

Los terminos " RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); "se entendera que incluyen todas las variantes de transcripcion de los mismos y todos los promotores y elementos reguladores de los mismos. Adicionalmente puesto que se conoce una pluralidad de los SNP dentro de dichos genes, el termino debe entenderse incluyendo todas las variantes de la secuencia misma.

Se describe un metodo para la deteccion de carcinoma en un sujeto que comprende la determinacion de los niveles de expresion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTDI (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); en una muestra biologica aislada de dicho sujeto en donde la subexpresion y/o la metilacion CpG es indicativa de la presencia o clase de dicho trastorno. Dichos marcadores pueden ser utilizados para el diagnostico de cancer de prostata incluyendo la deteccion temprana durante las etapas de precancerosas de la enfermedad. Los marcadores son particularmente eficientes en la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata malignos tales como el carcinoma de prostata, proveyendo de ese modo medios mejorados para la deteccion precoz, la clasificacion y el tratamiento de dichos trastornos.

La modificacion con bisulfito del ADN es una herramienta reconocida en la tecnica utilizada para evaluar el estatus de metilacion de CpG. La 5-metilcitosina es la modificacion de base covalente mas frecuente en el ADN de las celulas eucariotas. Desempena un papel, por ejemplo, en la regulacion de la transcripcion, en la impronta genetica, y en la tumorigenesis. Por lo tanto, la identificacion de 5-metilcitosina como componente de informacion genetica es de un interes considerable. Sin embargo, las posiciones de 5-metilcitosina no pueden ser identificadas por secuenciacion,

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porque la 5-metilcitosina tiene el mismo comportamiento de apareamiento de bases que la citosina. Por otra parte, la informacion epigenetica transportada por la 5-metilcitosina se pierde completamente, por ejemplo, durante la amplificacion por PCR.

El metodo mas frecuentemente utilizado para el analisis del ADN por la presencia de 5-metilcitosina se basa en el reaccion espedfica del bisulfito con la citosina por medio de la cual, tras la subsecuente hidrolisis alcalina, la citosina se convierte en uracilo que corresponde a la timina en su comportamiento de apareamiento de bases. Significativamente, sin embargo, la 5-metilcitosina permanece sin modificar bajo estas condiciones. Por consiguiente, el ADN original se convierte de tal manera que la metilcitosina, que originalmente no podna distinguirse de la citosina por su comportamiento de hibridacion, ahora puede ser detectada como la unica citosina restante utilizando tecnicas estandar de biologfa molecular reconocidas en la tecnica, por ejemplo, por amplificacion e hibridacion, o por secuenciacion. Todas estas tecnicas se basan en las propiedades diferenciales de apareamiento de bases, que ahora pueden ser totalmente explotadas.

La tecnica anterior, en terminos de sensibilidad, se define mediante un metodo que comprende encerrar el ADN que se va a analizar en una matriz de agarosa, evitando asf la difusion y renaturalizacion del aDn (el bisulfito solo reacciona con ADN monocatenario), y la sustitucion de todas las etapas de precipitacion y purificacion con dialisis rapida (Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24: 5064-6, 1996). Por lo tanto, es posible analizar las celulas individuales para el estado de metilacion, ilustrando la utilidad y sensibilidad del metodo. Una vision general de los metodos reconocidos en el arte para detectar 5- metilcitosina es proporcionada por Rein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26: 2.255, 1998.

La tecnica del bisulfito, salvo algunas excepciones (por ejemplo, Zeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5: 94 - 98, 1997), solo se usa actualmente en investigacion. En todos los casos, se amplifican fragmentos espedficos cortos de un gen conocido despues del tratamiento con bisulfito, y, o bien secuenciados completamente (Olek and Walter, Nat Genet. 1997 17: 275 - 6, 1997), sometidos a una o mas reacciones de extension del cebador (Gonzalgo and Jones, Nucleic Acids Res, 25: 2529 - 31, 1997; el documento WO 95/00669, la patente US No. 6.251.594) para analizar las posiciones individuales de citosina, o tratado por digestion enzimatica (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res., 25: 2532 - 4, 1997). La deteccion por hibridacion tambien ha sido descrita en la tecnica (Olek y colaboradores, WO 99/28498). Ademas, se ha descrito el uso de la tecnica del bisulfito para la deteccion de metilacion con respecto a los genes individuales (Grigg y Clark, Bioessays, 16: 431 - 6, 1994; Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet, 6: 387-95, 1997; Feil R, et al., Nucleic Acids Res, 22: 695 -, 1994; Martin V, et al., Gene, 157: 261 - 4, 1995; los documentos WO 9746705 y WO 9515373).

La presente invencion provee el uso de la tecnica de bisulfito, en combinacion con uno o mas ensayos de metilacion, para la determinacion del estado de metilacion de secuencias de dinucleotidos CpG dentro de SEQ ID NO: 50 y opcionalmente ademas la SEQ ID NO: 1-4; 37-49 y 51-65. Los dinucleotidos CpG metilados genomicos pueden ser metilados o no metilados (alternativamente conocidos como metilados arriba y abajo, respectivamente). Sin embargo, los metodos de la presente invencion son adecuados para el analisis de muestras biologicas de naturaleza heterogenea, por ejemplo, una baja concentracion de celulas tumorales dentro de un fondo de sangre o de eyaculado. En consecuencia, al analizar el estado de metilacion de una posicion de CpG dentro de tal muestra la persona experta en la tecnica puede usar un ensayo cuantitativo para determinar el nivel (por ejemplo, porcentaje, fraccion, relacion, proporcion o grado) de la metilacion en una posicion de CpG particular en oposicion a un estado de metilacion. De acuerdo con el termino estatus de metilacion o estado de metilacion tambien se deben tomar en el sentido de un valor que refleja el grado de metilacion en una posicion CpG. A menos que se indique espedficamente los terminos “hipermetilado” o “sobremetilado” deben ser considerados que significan un nivel de metilacion por encima de la de un punto de corte especificado, en donde dicho corte puede ser un valor que representa el nivel de metilacion promedio o medio para una poblacion dada o es preferiblemente un nivel de corte optimizado. El "corte tambien se denomina aqrn como “umbral". En el contexto de la presente invencion, los terminos “metilado” “hipermetilado” o “sobremetilado” se tendran que incluir un nivel de metilacion por encima de la lmea de corte que sea cero (0)% de metilacion (o sus equivalentes) para todas las posiciones CpG dentro y asociadas con (por ejemplo, en promotor o regiones reguladoras) los genes RASSF2A genes; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION INTRON 1 Y/O EXON 2).

De acuerdo con la presente invencion, la determinacion del estatus de metilacion de secuencias de dinucleotidos CpG dentro de SEQ ID NO: 50 y opcionalmente ademas la SEQ ID NO: 1-4; 37-49 y 51-65 tiene utilidad en el diagnostico de cancer de prostata.

Procedimientos de ensayo de metilacion. Se conocen en la tecnica diversos procedimientos de ensayo de metilacion, y se pueden utilizar en conjuncion con la presente invencion. Estos ensayos permiten la determinacion del estado de metilacion de uno o una pluralidad de dinucleotidos CpG (por ejemplo, islas de CpG) dentro de una secuencia de ADN. Tales ensayos involucran, entre otras tecnicas, la secuenciacion de ADN del aDn tratado con bisulfito, PCR (para la amplificacion espedfica de secuencia), analisis de transferencia tipo Southern, y el uso de enzimas de restriccion sensibles a la metilacion.

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Por ejemplo, la secuenciacion genomica se ha simplificado para el analisis de los patrones de metilacion de ADN y la distribucion de 5-metilcitosina usando tratamiento con bisulfito (Frommer et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89:18271831, 1992). Ademas, se utiliza la digestion con enzimas de restriccion de productos de PCR amplificados a partir de ADN convertido con bisulfito, por ejemplo, el metodo descrito por Sadri & Hornsby (Nucl Acids Res 24:.. 5058-5059, 1996), o COBRA (Analisis de restriccion combinado bisulfito) (Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532-2534, 1997).

COBRA. El analisis COBRA™ es un ensayo de metilacion cuantitativo util para determinar los niveles de metilacion del ADN en los loci de genes espedficos en cantidades pequenas de ADN genomico (Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25: 2532 -2534, 1997). En resumen, la digestion con enzimas de restriccion se utiliza para revelar las diferencias de secuencia que dependen de la metilacion en los productos de la PCR de ADN tratado con bisulfito de sodio. Se introducen primero las diferencias de la secuencia que dependen de la metilacion en el ADN genomico mediante tratamiento estandar con bisulfito de acuerdo con el procedimiento descrito por Frommer et al., (Proc Natl Acad Sci EE.UU. 89: 1827 - 1831, 1992). Se lleva a cabo luego la amplificacion por PCR del ADN convertido con bisulfito utilizando cebadores espedficos para las islas CpG de interes, seguido por la digestion con endonucleasas de restriccion, electroforesis en gel, y la deteccion mediante sondas de hibridacion espedficas marcadas. Los niveles de metilacion en la muestra original de ADN estan representados por las cantidades relativas del producto PCR digerido y no digerido de una forma linealmente cuantitativa a traves de un amplio espectro de niveles de metilacion del ADN. Ademas, esta tecnica puede ser aplicada de forma confiable al ADN obtenido a partir de muestras de tejido microseccionadas embebidas en parafina.

Los reactivos tfpicos (por ejemplo, como se pueden encontrar en un kit tfpico basado en COBRA™) para el analisis COBRA™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para un gen espedfico (o una secuencia de ADN tratada con bisulfito o una isla CpG); una enzima de restriccion y regulador apropiado; oligo de hibridacion en el gen; oligo de hibridacion de control; un kit de marcacion de quinasa para la sonda oligo; y nucleotidos marcados. Ademas, los reactivos de conversion con bisulfito pueden incluir: regulador de desnaturalizacion de ADN; regulador de sulfonacion; reactivos o kits de recuperacion del ADN (por ejemplo, precipitacion, ultrafiltracion, columna de afinidad); regulador de desulfonacion; y componentes de recuperacion del ADN.

Preferiblemente, ensayos tales como las reacciones "MethyLight™" (tecnica de PCR en tiempo real basada en fluorescencia) (Eads ET AL., Cancer Res. 59: 2302 - 2306, 1999), Ms-SNuPE ™ (extension del cebador de un solo nucleotido sensible a la metilacion) (Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res 25: 2529 - 2531, 1997), PCR espedfica para metilacion ("MSP"; Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 9821 - 9826, 1996; patente US No. 5.786.146), y amplificacion de la isla CpG metilada ("MCA"; Toyota et al., Cancer Res. 59: 2307 - 12, 1999) se usan solos o en combinacion con otro de estos metodos.

El ensayo "Heavy Methyl™", la tecnica es un metodo cuantitativo para la evaluacion de diferencias de metilacion basadas en la amplificacion espedfica de metilacion de ADN tratado con bisulfito. Las sondas de bloqueo espedficas de metilacion (tambien denominados en este documento como bloqueadores) que cubre las posiciones de CpG entre, o cubiertas por los cebadores de amplificacion permiten la amplificacion selectiva espedfica de metilacion de una muestra de acido nucleico.

El termino ensayo de "Heavy Methyl™ MethyLight™", en la realizacion del mismo implementado en el presente documento, se refiere a un ensayo de HeavyMethyl™ MethyLight™, que es una variacion del ensayo MethyLight™, en donde el ensayo de MethyLight™ se combina con las sondas de bloqueo espedficas de metilacion que cubren las posiciones de CpG entre los cebadores de amplificacion. El ensayo HeavyMethyl™ tambien se puede usar en combinacion con cebadores de amplificacion espedfica de metilacion.

Reactivos tfpicos (por ejemplo, como podna encontrarse en un kit tfpico basado en MethyLight D) para el analisis HeavyMethyl™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de pCr para los genes espedficos (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG); el bloqueo de los oligonucleotidos; reguladores de PCR optimizados y desoxinucleotidos; y Taq polimerasa.

MSP. La MSP (PCR espedfica para metilacion) permite evaluar el estatus de metilacion de virtualmente cualquier grupo de sitios CpG dentro de una isla CpG, independientemente del uso de enzimas de restriccion sensibles a la metilacion (Herman y colaboradores, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93: 9821 - 9826, 1996; patente de los Estados Unidos No. 5.786.146). En resumen, el ADN se modifica mediante la conversion con bisulfito de sodio de todas las citosinas no metiladas, pero no las citosinas metiladas en uracilo, y posteriormente amplificadas con cebadores espedficos para ADN metilado versus no metilado. MSP requiere solamente pequenas cantidades de ADN, es sensible a 0.1% de alelos metilados de un locus dado de una isla CpG, y se puede realizar en ADN extrafdo de muestras incluidas en parafina. Los reactivos tfpicos (por ejemplo, como se pueden encontrar en un kit tfpico basado en MSP) para el analisis con MSP pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR metilados y no metilados para un gen espedfico (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG), reguladores optimizados para PCR y desoxinucleotidos, y sondas espedficas.

MethyLight™ El ensayo MethyLightMR es un ensayo de metilacion cuantitativa de alto rendimiento que utiliza tecnologfa PCR en tiempo real con base en fluorescencia (TaqMan ™) que no requiere manipulaciones adicionales

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despues de la etapa de PCR (Eads et al., Cancer Res. 59: 2302 - 2306, 1999). En resumen, el proceso MethyLight™ comienza con una muestra mixta de ADN genomico que se convierte, en una reaccion con bisulfito de sodio, en una combinacion mixta de diferencias de secuencia que dependen de la metilacion de acuerdo con procedimientos estandar (el proceso con bisulfito convierte los residuos de citosina no metilados en uracilo). La PCR basada en fluorescencia se realiza en una reaccion "sesgada" (con cebadores de PCR que se superponen en los dinucleotidos CpG conocidos). La discriminacion de la secuencia puede ocurrir ya sea a nivel del proceso de amplificacion o a nivel del proceso de deteccion por fluorescencia.

El ensayo MethyLight™ puede ser usado como una prueba cuantitativa para los patrones de metilacion en la muestra de ADN genomico, en donde la discriminacion de la secuencia se presenta al nivel de la hibridacion de la sonda. En esta version cuantitativa, la reaccion PCR provee una amplificacion espedfica de metilacion en presencia de una sonda fluorescente que se superpone a un sitio particular de metilacion putativa. Se proporciona un control no sesgado para la cantidad de ADN de entrada mediante una reaccion en la que ni los cebadores, ni la sonda recubren ninguno de los dinucleotidos CpG. Alternativamente, se logra una prueba cualitativa para la metilacion genomica mediante sondeo de la combinacion PCR sesgada, ya sea con oligonucleotidos de control que no "cubren" sitios de metilacion conocidos (una version con base en fluorescencia de la tecnica "MSP"), o con los sitios de metilacion potenciales que cubren los oligonucleotidos.

El proceso MethyLight™ se puede utilizar con cualquier sonda adecuada, por ejemplo "TaqMan®", LightCycler® etc. Por ejemplo, el ADN genomico de doble cadena se trata con bisulfito de sodio y es sometido a uno de los dos conjuntos de reacciones de PCR usando sondas TaqMan®; por ejemplo, con los cebadores de MSP y/u oligonucleotidos bloqueadores de HeavyMethyl y sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® esta doblemente marcada con moleculas "reporteras" e "inactivadoras" fluorescentes, y se disena para ser espedfica para una region con contenido relativamente alto de GC de manera que se funde a aproximadamente 100°C de temperatura mas alta en el ciclo de PCR que los cebadores directos e inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca hibridada completamente durante la etapa de hibridacion/extension de la PCR. A medida que la Taq polimerasa sintetiza enzimaticamente una nueva cadena durante la PCR, eventualmente alcanza la sonda TaqMan® hibridada. La actividad 5' a 3' endonucleasa de la Taq polimerasa desplazara entonces la sonda Taqman® digiriendola para liberar la molecula reportera fluorescente para deteccion cuantitativa de su senal ahora no inactivada usando un sistema de deteccion de fluorescencia en tiempo real.

Los reactivos tfpicos (por ejemplo, como los que se pueden encontrar en un kit tfpico con base en MethyLightD) para el analisis MethyLight™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para un gen espedfico (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG); sondas TaqMan®; o sondas Lightcycler®, reguladores optimizados para PCR y desoxinucleotidos; y Taq polimerasa.

El ensayo de QM™ (metilacion cuantitativa) es una prueba cuantitativa alternativa para los patrones de metilacion en muestras de ADN genomico, en donde la discriminacion de secuencia ocurre a nivel de la hibridacion de la sonda. En esta version cuantitativa, la reaccion de PCR provee amplificacion no sesgada en presencia de una sonda fluorescente que superpone un sitio de metilacion putativo particular. Un control no sesgado para la cantidad de ADN de entrada es provee por una reaccion en la que ni los cebadores, ni la sonda recubren ningun dinucleotido CpG. Alternativamente, una prueba cualitativa para la metilacion genomica se logra mediante el sondeo de la combinacion PCR sesgada, ya sea con oligonucleotidos de control que no "cubren" sitios de metilacion conocidos (una version basada en fluorescencia de las tecnicas HeavyMethyl™ y MSP), o con oligonucleotidos que cubren sitios potenciales de metilacion.

El proceso QM™ puede utilizarse con cualquier sonda adecuada, por ejemplo "TaqMan®", LightCycler® etc., en el proceso de amplificacion. Por ejemplo, el ADN genomico de doble cadena se trata con bisulfito de sodio y se somete a cebadores no sesgados y la sonda TaqMan®. La sonda TaqMan® esta doblemente marcada con moleculas "reporteras" e "inactivadoras" fluorescentes, y esta disenada para ser espedfico para una region de contenido de GC relativamente alto de manera que se funde a aproximadamente 10°C de temperatura mas alta en el ciclo de PCR que los cebadores directos o inversos. Esto permite que la sonda TaqMan® permanezca hibridada completamente durante la etapa de hibridacion/extension de la PCR. A medida que la Taq polimerasa sintetiza enzimaticamente una nueva cadena durante la PCR, eventualmente alcanza la sonda TaqMan® hibridada. La actividad 5' a 3' endonucleasa de la Taq polimerasa desplazara entonces la sonda TaqMan® digiriendola para liberar la molecula reportera fluorescente para deteccion cuantitativa de su senal ahora no inactivada usando un sistema de deteccion de fluorescencia en tiempo real.

Los reactivos tfpicos (por ejemplo, como se podna encontrar en un tfpico kit basado en QM™) para el analisis QM™ puede incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para el gen espedfico (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG); sondas TaqMan® o LightCycler®; reguladores de PCR optimizados y desoxinucleotidos; y Taq polimerasa.

Ms-SNuPE. La tecnica Ms-SNuPETM es un metodo cuantitativo para evaluar diferencias de metilacion en sitios espedficos CpG con base en el tratamiento con bisulfito del ADN, seguido por la extension del cebador de un solo nucleotido (Gonzalgo y Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529 - 2531, 1997). En resumen, se hace reaccionar el ADN

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genomico con bisulfito de sodio para convertir la citosina no metilada en uracilo, dejando la 5-metilcitosina sin cambios. La amplificacion de la secuencia objetivo deseada es luego realizada usando cebadores de PCR espedficos para el ADN convertido con bisulfito, y se afsla el producto resultante y se utiliza como plantilla para el analisis de metilacion en el(los) sitio(s) CpG de interes. Se pueden analizar pequenas cantidades de ADN (por ejemplo, secciones de patolog^a microseccionadas), y se evita la utilizacion de enzimas de restriccion para determinar el estatus de metilacion en los sitios CpG.

Los reactivos tfpicos (por ejemplo, como se pueden encontrar en un kit tfpico con base en Ms-SNuPETM) para el analisis con Ms-SNuPETM pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para un gen espedfico (o secuencia de ADN tratada con bisulfito o isla CpG); reguladores optimizados para PCR y desoxinucleotidos; kit de extraccion en gel; cebadores de control positivo; cebadores para Ms-SNuPETM para el gen espedfico; regulador de reaccion (para la reaccion Ms-SNuPE); y nucleotidos marcados. Ademas, los reactivos de conversion con bisulfito pueden incluir: regulador de desnaturalizacion de ADN; regulador de sulfonacion; reactivos o kit de recuperacion de ADN (por ejemplo, precipitacion, ultrafiltracion, columna de afinidad); regulador de desulfonacion; y componentes de recuperacion de ADN.

Las secuencias genomicas de acuerdo con SEQ ID NO: 1-4; 37-65, y de origen no natural trataron variantes de los mismos de acuerdo con SEQ ID NO: 5-20; 66-181, se determino que tienen utilidad novedosa para la deteccion temprana, la clasificacion y/o el tratamiento de trastornos de proliferacion celular, en particular, el carcinoma de prostata

En una realizacion la invencion del metodo comprende las siguientes etapas: i) poner en contacto el ADN genomico (preferiblemente aisladas de fluidos corporales) obtenido del sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleotidos CpG metilados y no metilados dentro del gen NFATC3 y opcionalmente al menos un gen adicional seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3- 1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; MN1; KLF8 FGF 13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); (Incluidos el promotor y las regiones reguladoras); y ii) detectar los trastornos proliferativos de celulas de prostata, lo mas preferiblemente, el carcinoma de prostata.

Preferiblemente, se analiza una pluralidad de genes (tambien aqu denominado como un "panel de gen"). Preferiblemente se analizan 2, 3 o 4 genes.

En una realizacion del metodo dicho panel comprende comprende junto a NFATC3 al menos un gen adicional seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); y/o sus promotores o regiones reguladoras. Preferiblemente, dicho grupo comprende el gen HIST1H4K.

El ADN genomico puede ser aislado por cualquier medio estandar en la tecnica, incluyendo el uso de kits disponibles en el mercado. Brevemente, en donde el ADN de interes esta encapsulado por una membrana celular, la muestra biologica debe ser rota y lisada por medios enzimaticos, qmmicos o mecanicos. La solucion de ADN puede entonces ser limpiada de protemas y otros contaminantes, por ejemplo, por digestion con proteinasa K. El aDn genomico se recupera entonces de la solucion. Esto puede llevarse a cabo por medio de una variedad de metodos que incluyen precipitacion por saturacion salina, extraccion organica o enlazamiento de ADN a un soporte en fase solida. La seleccion del metodo se vera afectada por varios factores incluyendo tiempo, costo y cantidad necesaria de ADN. Todos los tipos de muestras clmicas que comprenden la materia neoplasica o materia paraneoplasica son adecuados para uso en el presente metodo, se prefieren las lmeas celulares, cortes histologicos, biopsias, tejido incluido en parafina, fluidos corporales, eyaculado, orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas, celulas aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos. Los fluidos corporales son la fuente preferida de ADN; particularmente preferidos son eyaculado, orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas y celulas aisladas de la sangre.

La muestra de ADN genomico se trata entonces con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleotidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos uno y mas preferiblemente una pluralidad de region(es) objetivo del ADN genomico, en donde cada region objetivo comprende, o se hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia de al menos 16, 50, 100 o 500 nucleotidos contiguos de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65, respectivamente, en donde dichos nucleotidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleotido CpG.

Se prefiere particularmente que dicho reactivo convierta las bases de citosina que estan sin metilar en la posicion 5'en uracilo, timina, u otra base que sea diferente a la citosina en terminos de comportamiento de hibridacion. Sin embargo, en una realizacion alternativa dicho reactivo puede ser una enzima de restriccion sensible a la metilacion.

En donde la muestra de ADN genomico se trata de una manera tal que las bases de citosina que estan sin metilar en la posicion 5' se convierten en uracilo, timina, u otra base que sea diferente a la citosina en terminos de comportamiento

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de hibridacion. Se prefiere que este tratamiento sea llevado a cabo con bisulfito (sulfuro de hidrogeno, bisulfito) y subsecuente hidrolisis alcalina. Tales resultados de tratamiento en la conversion de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 de SEQ ID NO: 5-12; 66-123 (vease la Tabla 1) en donde dicho dinucleotidos CpG estan metilados o SEQ ID NO: 13-20; 124181 en donde dichos dinucleotidos CpG son no metilados (vease Tabla 1).

El ADN tratado se analiza entonces, con el fin de determinar el estado de metilacion del gen NFATC3 y opcionalmente al menos un gen adicional seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); antes del tratamiento.

Preferiblemente, se analiza una pluralidad de genes (en adelante tambien denominado como un "panel de gen") como se describe mas arriba.

Se prefiere particularmente que cada region objetivo comprenda, o se hibride bajo condiciones rigurosas con al menos 16, 50, 100 o 500 nucleotidos contiguos de dichos genes. Se prefiere que la secuencia de dichos genes de acuerdo con SEQ ID NO: 1-4; 37-65 se analiza como se provee en la Tabla 1 y el listado de secuencias adjuntas. El metodo de analisis se puede seleccionar de los conocidos en la tecnica, incluyendo los que se listan en este documento.

Particularmente preferidos son MethyLight™, MSP y el uso de oligonucleotidos bloqueadores (Heavy Methyl™) como se describe aqrn.

Ademas, se prefiere que cualesquier oligonucleotidos utilizados en tales analisis (incluyendo cebadores, oligonucleotidos bloqueadores y sondas de deteccion) deben ser complementarios inversos, identicos, o que se hibriden bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas con al menos un segmento de 16 pares de bases de largo de las secuencias de base de una o mas de SEQ ID NO: 5-20; 66-181 y las secuencias complementarias de las mismas.

La metilacion aberrante, mas espedficamente la hipermetilacion de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); (asf como el promotor y/o regiones reguladoras de la misma) se asocia con la presencia de trastornos proliferativos de celulas de prostata, en particular, el cancer de prostata. En consecuencia, en donde una muestra biologica se presenta dentro de cualquier grado de metilacion, dicha muestra se debe determinar como de un trastorno proliferativo celular, en particular cancer.

La expresion aberrante del ARNm transcrito a partir de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); esta asociada con la presencia de trastornos proliferativos de celulas de prostata, en particular, cancer de prostata en un sujeto. Bajo la expresion (y/o presencia de metilacion) se asocia con la presencia de cancer, y viceversa sobreexpresion (y/o ausencia de metilacion) se asocia con la ausencia de cancer.

La expresion del ARNm de la pluralidad de los genes (aqrn tambien se denomina como un "panel de gen") como se describe mas arriba se puede analizar.

Para detectar la presencia de ARNm que codifica un gen o secuencia genomica, se obtiene una muestra de un paciente. La muestra puede ser cualquier muestra adecuada que comprende materia celular del tumor. Tipos de muestras adecuadas incluyen lmeas celulares, cortes histologicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, eyaculado, orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas, celulas aisladas de la sangre y todas las combinaciones posibles de los mismos. Se prefiere que dichos tipos de muestras sean eyaculado o fluidos corporales seleccionado del grupo que consiste de eyaculado, orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas, celulas aisladas de la sangre.

La muestra puede ser tratada para extraer el ADN contenido en la misma. El acido nucleico resultante de la muestra se analiza a continuacion. Muchas tecnicas se conocen en el estado de la tecnica para determinar los niveles absolutos y relativos de la expresion genica, se utiliza comunmente tecnicas adecuadas para uso en la presente invencion incluyen la hibridacion in situ (por ejemplo FISH), analisis Northern, ensayos de proteccion de RNasa (RPA), microarreglos y tecnicas basadas en PCR tales como PCR cuantitativo y PCR de presentacion diferencial o cualquier otro metodo de deteccion de acido nucleico.

Es particularmente preferido el uso de la tecnica de reaccion en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). El metodo de RT-PCR es bien conocido en la tecnica (por ejemplo, vease Watson and Fleming, supra).

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El metodo RT-PCR puede llevarse a cabo como sigue. El ARN celular total se afsla mediante, por ejemplo, el metodo de isotiocianato de guanidinio estandar y el ARN total se transcribio de forma inversa. El metodo de transcripcion inversa implica la smtesis de ADN en una plantilla de ARN utilizando una enzima transcriptasa inversa y un cebador dT oligonucleotido de terminal 3' y/o cebadores hexameros aleatorios. El ADNc asf producido se amplifica entonces por medio de PCR. (Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989; Krug and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol.152, pp. 316-325, 1987). Es adicionalmente preferida la variante "en tiempo real" de rT- PCR, en donde el producto de PCR se detecta por medio de sondas de hibridacion (por ejemplo, TaqMan™, LightCycler, cebador Molecular beacons™ y Scorpion™) o SYBRGreen. La senal detectada de las sondas o SYBRGreen es entonces cuantificada bien por referencia a una curva estandar o mediante la comparacion de los valores de Ct a la de un estandar de calibracion. El analisis de los genes cuidadores se usa frecuentemente para normalizar los resultados.

En el total del analisis de transferencia Northern o poli(A)+ ARNm se ejecuta en un gel de agarosa desnaturalizante y se detecta por hibridacion con una sonda marcada en el gel secado en sf mismo o en una membrana. La senal resultante es proporcional a la cantidad de ARN objetivo en la poblacion de ARN.

La comparacion de las senales de dos o mas poblaciones de celulas o tejidos revela diferencias relativas en los niveles de expresion genica. La cuantificacion absoluta se puede realizar mediante la comparacion de la senal con una curva estandar generada usando cantidades conocidas de una transcripcion in vitro correspondiente al ARN objetivo. Se espera que los analisis de genes cuidadores, los genes cuyos niveles de expresion se espera que permanezcan relativamente constantes independientemente de las condiciones, a menudo se utilizan para normalizar los resultados, la eliminacion de las diferencias aparentes causados por transferencia desigual de ARN a la membrana o carga desigual de ARN en el gel.

El primer paso en el analisis Northern es aislar el ARN puro, intacto de las celulas o tejido de interes. Debido a que la transferencia Northern distingue los ARN por tamano, la integridad de la muestra influye en el grado en el que una senal se localiza en una banda individual. Muestras de ARN parcialmente degradadas daran como resultado que la senal esta manchada o distribuida sobre varias bandas con una perdida global de la sensibilidad y posiblemente una interpretacion erronea de los datos. En el analisis de transferencia Northern, se pueden utilizar sondas de ADN, ARN y de oligonucleotidos y estas sondas se marcan preferiblemente (por ejemplo, marcadores radiactivos, marcadores de masa, marcadores quimioluminiscentes o marcadores fluorescentes). El tamano del ARN objetivo, no la sonda, determinara el tamano de la banda detectada, por lo que metodos tales como el etiquetado de cebado al azar, que genera sondas de longitudes variables, son adecuados para la smtesis de la sonda. La actividad espedfica de la sonda determinara el nivel de sensibilidad, por lo que se prefiere que se utilicen sondas con altas actividades espedficas.

En un ensayo de proteccion de RNasa (RPA), el ARN objetivo y una sonda de ARN de una longitud definida son hibridados en solucion. Despues de la hibridacion, el aRn es digerido con RNasas espedficas para los acidos nucleicos de cadena sencilla para eliminar cualquier ARN objetivo de cadena sencilla no hibridada y la sonda. Las ARNasas son inactivadas, y el ARN se separa, por ejemplo, por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante. La cantidad de sonda de ARN intacto es proporcional a la cantidad de ARN objetivo en la poblacion de ARN. RPA puede utilizarse para la cuantificacion relativa y absoluta de la expresion genica y tambien para mapear la estructura del ARN, tales los lfmites de intron/exon y sitios de inicio de la transcripcion. El ensayo de proteccion de RNasa es preferible al analisis de transferencia Northern, ya que generalmente tiene un lfmite inferior de deteccion.

Las sondas de ARN antisentido utilizadas en RPA son generados por transcripcion in vitro de una plantilla de ADN con un punto final definido y estan tfpicamente en el rango de 50-600 nucleotidos. El uso de sondas de ARN que incluye secuencias adicionales no homologas al ARN objetivo permite que el fragmento protegido sea distinguido de la sonda de longitud completa. Las sondas de ARN se utilizan tfpicamente en lugar de sondas de ADN debido a la facilidad de generar sondas de ARN de cadena sencilla y la reproducibilidad y fiabilidad de la digestion duplex ARN:ARN con RNasas (Ausubel et al 2003), son particularmente preferidos sondas con altas actividades espedficas.

Es particularmente preferido el uso de microarreglos. El proceso de analisis de microarreglos se puede dividir en dos partes principales. En primer lugar esta la inmovilizacion de secuencias de genes conocidos en portaobjetos de vidrio u otro soporte solido seguido por la hibridacion del ADNc marcado con fluorescencia (que comprende las secuencias que se van a interrogar) a los genes conocidos inmovilizados sobre el portaobjetos de vidrio (u otra fase solida). Despues de la hibridacion, los arreglos son escaneados utilizando un escaner de microarreglos fluorescente. El analisis de la intensidad de fluorescencia relativa de diferentes genes provee una medida de las diferencias en la expresion genica.

Los arreglos de ADN pueden generarse inmovilizando oligonucleotidos presintetizados sobre portaobjetos de vidrio preparados u otras superficies solidas. En este caso, las secuencias de genes representativos se fabrican y se preparan utilizando smtesis de oligonucleotidos estandar y metodos de purificacion. Estas secuencias de genes sintetizados son complementarios a la transcripcion de ArN de los genes RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68

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(REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); y tienden a ser secuencias mas cortas en el rango de 25-70 nucleotidos. Como alternativa, los oligos inmovilizados pueden ser sintetizados qmmicamente in situ en la superficie del portaobjetos. La smtesis de oligonucleotidos in situ involucra la adicion consecutiva de los nucleotidos apropiados con los puntos en el microarreglo; los puntos que no reciben un nucleotido se protegen durante cada etapa del proceso usando mascaras ffsicas o virtuales. Preferiblemente, dichos acidos nucleicos sintetizados son acidos nucleicos bloqueados.

En los experimentos de microarreglos de perfiles de expresion, las plantillas de ARN utilizadas son representativas del perfil de transcripcion de las celulas o tejidos bajo estudio. El ARN es primero aislado de las poblaciones de celulas o tejidos que se van a comparar. Cada muestra de ARN se utiliza entonces como una plantilla para generar ADNc marcado con fluorescencia a traves de una reaccion de transcripcion inversa. El etiquetado fluorescente del ADNc puede realizarse por cualquiera marcado directo o metodos de marcado indirecto. Durante el marcado directo, los nucleotidos fluorescentemente modificados (por ejemplo, Cy®3- o Cy®5-dCTP) se incorporan directamente en el ADNc durante la transcripcion inversa. Alternativamente, el marcado indirecto puede lograrse mediante la incorporacion de nucleotidos modificados con aminoalilo durante la smtesis de ADNc y luego conjugar un colorante de N-hidroxisuccinimida (NHS)-ester con el ADNc modificado con aminoalilo despues de que la reaccion de transcripcion inversa esta completa. Alternativamente, la sonda puede estar sin marcar, pero puede ser detectable mediante el enlazamiento espedfico con un ligando que esta marcado, ya sea directa o indirectamente. Los marcadores y metodos adecuados para marcar ligandos (y sondas) son conocidos en la tecnica, e incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos que pueden ser incorporados por metodos conocidos (por ejemplo, traduccion de muescas o tratamiento con quinasa). Otros marcadores adecuados incluyen, pero no se limitan a biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (por ejemplo, dioxetanos, particularmente dioxetanos activados), enzimas, anticuerpos, y similares.

Para llevar a cabo el analisis de expresion genica diferencial, el ADNc generado a partir de diferentes muestras de ARN se marcan con Cy®3. El ADNc marcado resultante se purifica para eliminar los nucleotidos no incorporados, colorante libre y el aRn residual. Despues de la purificacion, las muestras de ADNc marcadas se hibridan al microarreglo. La rigurosidad de la hibridacion se determina por un numero de factores durante la hibridacion y durante el procedimiento de lavado, incluyendo la temperatura, concentracion ionica, longitud de tiempo y concentracion de formamida. Estos factores se delinean en, por ejemplo, Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989). El microarreglo se escanea despues de la hibridacion utilizando un escaner de microarreglos fluorescente. La intensidad fluorescente de cada punto indica el nivel de expresion del gen analizado; puntos brillantes corresponden a genes fuertemente expresados, mientras que los puntos oscuros indican expresion debil.

Una vez obtenidas las imagenes, se deben analizar los datos sin procesar. En primer lugar, la fluorescencia de fondo se debe restar de la fluorescencia de cada punto. Los datos son entonces normalizados a una secuencia de control, tales como acidos nucleicos anadidos exogenamente (preferiblemente ARN o ADN), o un panel de gen cuidador para dar cuenta de cualquier hibridacion no espedfica, las imperfecciones del arreglo o la variabilidad en la configuracion del arreglo, el marcador de ADNc, la hibridacion o el lavado. La normalizacion de datos permite que sean comparados los resultados de los multiples arreglos.

Tambien se describe un kit para su uso en el diagnostico de trastornos proliferativos de celulas de prostata, lo mas preferiblemente, cancer de prostata en un sujeto de acuerdo con los metodos de la presente invencion, dicho kit comprende: un medio para medir el nivel de transcripcion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF 13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2). Los medios para medir el nivel de la transcripcion pueden comprender oligonucleotidos o polinucleotidos capaces de hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripcion de dicho al menos un gen. El nivel de la transcripcion puede ser determinado por tecnicas seleccionadas del grupo de analisis Northern Blot, PCR de transcriptasa inversa, en tiempo real.

PCR, proteccion de ARNasa, y microarreglos. En otra realizacion de la invencion, el kit comprende ademas medios para obtener una muestra biologica del paciente. Es un kit preferido, que comprende ademas un recipiente que es lo mas preferiblemente adecuado para contener los medios para medir el nivel de transcripcion y la muestra biologica del paciente, y lo mas preferiblemente comprende ademas instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit.

El kit puede comprender (a) una pluralidad de oligonucleotidos o polinucleotidos capaces de hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas a los productos de la transcripcion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); (b) un recipiente, preferiblemente adecuado para contener los oligonucleotidos o polinucleotidos y una muestra biologica del paciente, que comprende los productos de transcripcion en donde los oligonucleotidos o polinucleotidos pueden hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas a los productos de transcripcion, (c) medios para detectar la hibridacion de (b); y, (d) opcionalmente instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit.

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El kit tambien puede contener otros componentes, tales como regulador de hibridacion (donde los oligonucleotidos son para ser utilizados como una sonda) empacados en un recipiente separado. Alternativamente, cuando los oligonucleotidos son para ser utilizados para amplificar una region objetivo, el kit puede contener, empaquetados en recipientes separados, una polimerasa y un regulador de reaccion optimizado para la extension del cebador mediada por la polimerasa, tal como PCR. Preferiblemente, dicha polimerasa es una transcriptasa inversa. Ademas, se prefiere que dicho kit contenga ademas un reactivo de ARNasa.

La presente solicitud describe ademas metodos para la deteccion de la presencia del polipeptido codificado por dichas secuencias de genes en una muestra obtenida de un paciente.

Los niveles aberrantes de expresion de polipeptidos de los polipeptidos codificados por al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; LTD 1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); estan asociados con la presencia de cancer.

Bajo la expresion de dichos polipeptidos se asocia con la presencia de trastornos proliferativos de celulas de prostata, en particular, el cancer de prostata.

Se puede utilizar cualquier metodo conocido en la tecnica para detectar polipeptidos. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a la espectrometna de masa, inmunodifusion, inmunoelectroforesis, metodos inmunoqmmicos, ensayos de aglomerante-ligando, tecnicas inmunohistoqmmicas, ensayos de aglutinacion y de complemento (por ejemplo, vease Basic y Clinical Immunology, Sites y Terr, eds., Appleton & Lange, Norwalk, Conn, pp 217-262,1991). Se prefieren los metodos de inmunoensayo de aglomerante-ligando que incluyen hacer reaccionar anticuerpos con un epftopo o epftopos y desplazar competitivamente un polipeptido marcado o derivado del mismo.

Ciertas realizaciones de la presente invencion comprenden el uso de anticuerpos espedficos para los polipeptidos codificado por los genes RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2).

Tales anticuerpos son utiles para el diagnostico de cancer. En ciertas realizaciones la produccion de anticuerpos monoclonales o policlonales se puede inducir por el uso de un epftopo codificado por un polipeptido de un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (INTRON 1 y/o el exon 2 REGION) como un antfgeno. Tales anticuerpos pueden a su vez ser usados para detectar polipeptidos expresados como marcadores de diagnostico de cancer. Los niveles de tales polipeptidos presentes pueden cuantificarse por metodos convencionales. El enlazamiento de anticuerpo-polipeptido puede ser detectado y cuantificado por una variedad de medios conocidos en la tecnica, tales como marcar con ligandos fluorescentes o radiactivos. Se divulgan kits para realizar los procedimientos antes mencionados, en donde dichos kits contienen anticuerpos espedficos para los polipeptidos investigados.

Numerosos inmunoensayos competitivos y no competitivos de enlazamiento de polipeptido son bien conocidos en la tecnica. Los anticuerpos empleados en tales ensayos pueden estar sin marcar, por ejemplo como se utiliza en pruebas de aglutinacion, o marcados para uso una amplia variedad de metodos de ensayo. Los marcadores que pueden usarse incluyen radionuclidos, enzimas, compuestos fluorescentes, quimioluminiscentes, sustratos enzimaticos o cofactores, inhibidores de enzimas, partmulas, colorantes y similares. Los ensayos preferidos incluyen, pero no se limitan a radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayos enzimaticos, por ejemplo, ensayo de inmunoabsorcion ligados a enzimas (ELISA), inmunoensayos fluorescentes y similares. Los anticuerpos policlonales o monoclonales o epftopos de los mismos se pueden hacer para uso en inmunoensayos mediante cualquiera de una serie de metodos conocidos en la tecnica.

Las protemas se pueden detectar por medio de analisis de transferencia Western. Dicho analisis es estandar en la tecnica, las protemas brevemente se separan por medio de electroforesis por ejemplo SDS-PAGE. Las protemas separadas se transfieren entonces a una membrana adecuada (o papel), por ejemplo, nitrocelulosa, conservando la separacion espacial lograda por electroforesis. La membrana se incuba entonces con un agente de bloqueo para enlazar los restantes lugares adhesivos en la membrana, los agentes utilizados comunmente incluyen protema generica (por ejemplo, protema de la leche). Se agrega entonces un anticuerpo espedfico para la protema de interes, estando dicho anticuerpo marcado de forma detectable, por ejemplo, por los colorantes o medios enzimaticos (por ejemplo, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante). Se detecta entonces la localizacion del anticuerpo en la membrana.

Las protemas se pueden detectar por medio de inmunoqmmica (el uso de anticuerpos para sondear antfgenos espedficos en una muestra). Dicho analisis es estandar en la tecnica, en donde la deteccion de antfgenos en tejidos es conocida como inmunohistoqmmica, mientras que la deteccion en las celulas cultivadas se denomina generalmente

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inmunocitoqmmica. Brevemente el anticuerpo primario para ser detectado por el enlazamiento a su antigeno espedfico. El complejo anticuerpo-antigeno se enlaza entonces mediante un segundo anticuerpo conjugado enzimatico. En la presencia del sustrato y el cromogeno necesario la enzima enlazada se detecta de acuerdo con los depositos de color en los sitios de enlazamiento anticuerpo-antigeno. Hay un amplio rango de tipos adecuados de muestra, la afinidad de anticuerpo-antigeno, tipos de anticuerpos, y metodos de mejora de la deteccion. Por lo tanto las condiciones optimas para la deteccion inmunohistoqmmica o inmunocitoqmmica deben ser determinados por la persona experta en la tecnica para cada caso individual.

Un enfoque para preparar anticuerpos para un polipeptido es la seleccion y preparacion de una secuencia de aminoacidos de la totalidad o parte del polipeptido, sintetizar qmmicamente la secuencia de aminoacidos e inyectarla en un animal apropiado, normalmente un conejo o un raton (Milstein and Kohler Nature 256:495-497, 1975; Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981). Los metodos para la preparacion de los polipeptidos o epttopos de los mismos incluyen, pero no se limitan a la smtesis qmmica, tecnicas de aDn recombinante o aislamiento de muestras biologicas.

En el paso final del metodo se determina el diagnostico del paciente, por lo que la subexpresion es indicativa de la presencia de cancer. El termino subexpresion se considera que significa la expresion en un nivel detectado menos que un corte predeterminado que puede ser seleccionado del grupo que consiste de la media, la mediana o un valor umbral optimizado.

Otro aspecto de divulgacion es un kit para su uso en el diagnostico de cancer en un sujeto de acuerdo con los metodos de la presente invencion, que comprende: un medio para detectar polipeptidos de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2). Los medios para la deteccion de los polipeptidos comprenden, preferiblemente, anticuerpos, derivados de anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos. Los polipeptidos se detectan mas preferiblemente por medio de transferencia Western utilizando un anticuerpo marcado. El kit puede comprender ademas medios para obtener una muestra biologica del paciente. Se prefiere un kit, que comprende ademas un recipiente adecuado para contener los medios para la deteccion de los polipeptidos en la muestra biologica del paciente, y lo mas preferiblemente comprende ademas instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit. En una realizacion preferida, el kit comprende: (a) un medio para detectar polipeptidos de al menos un gen de los genes anteriores; (b) un recipiente adecuado para contener los dichos medios y la muestra biologica del paciente, que comprende los polipeptidos en donde los medios pueden formar complejos con los polipeptidos; (c) un medio para detectar los complejos de (b); y opcionalmente (d) instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit.

El kit tambien puede contener otros componentes tales como reguladores y soluciones adecuadas para el bloqueo, lavado o recubrimiento, empacados en un recipiente separado.

Las realizaciones particulares de la presente invencion, como se define en las reivindicaciones, proveen una aplicacion novedosa del analisis de los niveles de metilacion y/o patrones dentro de dichas secuencias que permiten una deteccion precisa, caracterizacion y/o el tratamiento de carcinoma de prostata. La deteccion temprana del cancer esta directamente relacionado con el pronostico de la enfermedad, y el metodo divulgado permite asf al medico y el paciente tomar mejores y mas decisiones informadas de tratamiento.

Se divulgan usos novedosos para las secuencias genomicas SEQ ID NO: 1-4; 37-65. Tambien se divulgan variantes modificados de la SEQ ID NO: 1-4; 37-65, asf como los oligonucleotidos y/o PNA-oligomeros para el analisis de los patrones de metilacion de citosina dentro de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 o dentro de las variantes modificadas de SEQ ID NO: 1-4; 37-65.

Un objetivo de la invencion comprende el analisis del estado de metilacion de uno o mas dinucleotidos CpG dentro de SEQ ID NO: 50 y opcionalmente ademas la SEQ ID NO: 1-4; 37-49 y 61-65 y secuencias complementarias de las mismas.

La divulgacion provee acidos nucleicos tratados, derivados del genomico SEQ ID NO: 1-4; 37-65, en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genomico en uracilo u otra base que es detectable similar a la citosina en terminos de hibridacion. Las secuencias genomicas en cuestion pueden comprender uno o mas posiciones CpG metiladas consecutivas. Dicho tratamiento comprende preferiblemente el uso de un reactivo seleccionado del grupo que consiste de bisulfito, sulfito de hidrogeno, bisulfito, y combinaciones de los mismos. Se divulga un acido nucleico modificado de origen no natural que comprende una secuencia de al menos 16 bases de nucleotidos contiguos de longitud de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5-20; 66-181. Dicho acido nucleico puede ser de al menos 50, 100, 150, 200, 250 o 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de acido nucleico descrita en la SEQ ID NO: 5-20; 66-181. Se ejemplifica una molecula de acido nucleico que es identica o complementaria a toda o una porcion de las secuencias de SEQ ID NO: 5-20; 66-181 pero no de SeQ ID NO: 1-4; 37-65 o de otro ADN de origen natural.

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Dicha secuencia puede comprender al menos un dinucleotido CpG, TpA o CpA y secuencias complementarias de las mismas. Las secuencias de SEQ ID NO: 5-20; 66-181 proveen versiones modificadas de origen no natural del acido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 1-4; 37-65, en donde la modificacion de cada secuencia genomica da como resultado la smtesis de un acido nucleico que tiene una secuencia que es unica y distinta de dicha secuencia genomica de la siguiente manera. Para cada ADN genomico de cadena en sentido, por ejemplo, SEQ ID NO: 1, se divulgan cuatro versiones convertidas. Una primera version en donde "C" se convierte en "T", pero "CpG" sigue siendo "CpG" (es decir, corresponde al caso en el que, para la secuencia genomica de cadena en sentido, todos los residuos "C" de secuencias de dinucleotidos CpG estan metilados y por lo tanto no se convierten); una segunda version divulga el complemento de la secuencia de ADN genomico divulgado (es decir, cadena antisentido), en donde "C" se convierte en "T", pero "CpG" sigue siendo "CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para todos los residuos "C" de las secuencias de dinucleotidos CpG estan metilados y por consiguiente no se convierten). Las secuencias convertidas sobremetiladas de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 corresponden a la SEQ ID NO: 5-12; 66-123. Se provee una tercera version qmmicamente convertida de cada una de las secuencias genomicas, en donde "C" se convierte en "T" para todos los residuos "C", incluyendo los de las secuencias de dinucleotidos "CpG" (es decir, corresponde al caso donde, para las secuencias genomicas de cadena en sentido, todos los residuos "C" de secuencias de dinucleotidos CpG son no metilados); una cuarta version qmmicamente convertida de cada secuencia, divulga el complemento de la secuencia de ADN genomico divulgado (es decir, cadena antisentido), en donde "C" se convierte en "T" para todos los residuos "C", incluyendo los de las secuencias de dinucleotidos "CpG" (es decir, corresponde al caso en que, por el complemento (cadena antisentido) de cada secuencia genomica, todos los residuos "C" de secuencias de dinucleotidos CpG estan metilados). Las secuencias convertidas submetiladas de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 corresponden a SEQ ID NO: 13-20; 124-181. Vease la Tabla 1 para mas detalles.

De manera significativa, hasta ahora, las secuencias de acidos nucleicos y moleculas de acuerdo con SEQ ID NO: 520; 66-181 no estaban implicadas en o conectadas con la deteccion, clasificacion o tratamiento del cancer.

Se divulgan ademas oligonucleotidos u oligomeros adecuados para uso en los metodos de la invencion para detectar el estado de metilacion de citosina dentro del ADN genomico o tratado (modificado qmmicamente), de acuerdo con SEQ ID NO: 1-4; 37-65 o SEQ ID NO: 5-20; 66-181. Dichos acidos nucleicos de oligonucleotidos u oligomeros proveen medios novedosos de diagnostico. Dicho oligonucleotido u oligomero que comprende una secuencia de acido nucleico que tiene una longitud de al menos nueve (9) nucleotidos que es identica a, se hibrida, bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas (como se define aqm anteriormente), a una secuencia de acido nucleico tratado de acuerdo con SEQ ID NO: 5-20; 66-181 y/o secuencias complementarias de las mismas, o a una secuencia genomica de acuerdo con SEQ ID NO: 1-4; 37- 65 y/o secuencias complementarias de las mismas.

Asf, se divulgan moleculas de acido nucleico (por ejemplo, oligonucleotidos y moleculas de acidos nucleicos peptfdicos (PNA) (PNA-oligomeros)) que se hibridan bajo condiciones de hibridacion moderadamente rigurosas y/o rigurosas a toda o a una porcion de las secuencias de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 o a los complementos de las mismas. Se prefiere particularmente una molecula de acido nucleico que hibrida bajo condiciones de hibridacion moderadamente rigurosas y/o rigurosas a toda o una porcion de las secuencias de SEQ ID NO: 5-20; 66-181 pero no de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 u otro ADN genomico humano.

La porcion identica o hibridacion de los acidos nucleicos de hibridacion es tipicamente de al menos 9, 16, 20, 25, 30 o 35 nucleotidos de longitud. Sin embargo, las moleculas mas largas tienen utilidad.

Preferiblemente, la porcion de hibridacion de los acidos nucleicos de hibridacion de la invencion es al menos 95%, o al menos 98%, o 100% identica a la secuencia, o a una porcion de la misma de la SEQ ID NO: 5-20; 66-181, o a los complementos de las mismas.

La hibridacion de acidos nucleicos del tipo descrito aqm se puede utilizar, por ejemplo, como un cebador (por ejemplo, un cebador de PCR), o una sonda o cebador de diagnostico y/o pronostico. Preferiblemente, la hibridacion de la sonda de oligonucleotido a una muestra de acido nucleico se realiza bajo condiciones rigurosas y la sonda es 100% identica a la secuencia objetivo. El duplex de acido nucleico o la estabilidad del tubrido se expresan como la temperatura de fusion o Tm, que es la temperatura a la que una sonda se disocia de un ADN objetivo. Esta temperatura de fusion se utiliza para definir las condiciones de rigurosidad requeridas.

Para secuencias objetivo que estan relacionadas y sustancialmente identicas a la secuencia correspondiente de la SEQ ID NO: 1-4; 37-65 (tales como variantes alelicas y los SNP), en lugar de identicos, es util establecer primero la temperatura mas baja a la que solo se produce la hibridacion homologa con una concentracion particular de sal (por ejemplo, SSC o SSPE). Entonces, asumiendo que 1% de falta de coincidencia da como resultado una disminucion de 1°C en la Tm, la temperatura del lavado final en la reaccion de hibridacion se reduce en consecuencia (por ejemplo, si se buscan secuencias que tienen > 95% de identidad con la sonda, la temperatura final de lavado se reduce en 5° C). En la practica, el cambio en la Tm puede estar entre 0.50°C y 1.5° C por 1% de falta de coincidencia.

Ejemplos de oligonucleotidos de longitud X (en nucleotidos), segun lo indicado por las posiciones de polinucleotido con referencia a, por ejemplo, SEQ ID NO: 2, incluyen aquellos correspondientes a los conjuntos (conjuntos en sentido y antisentido) de oligonucleotidos que se superponen consecutivamente de longitud X, donde los oligonucleotidos

dentro de cada conjunto que se superpone consecutivamente (que corresponden a un valor dado X) se definen como el conjunto finito de oligonucleotidos Z de las posiciones de nucleotidos:

n hasta (n + (X-I));.

Donde n=1, 2, 3,...(Y-(X-I));

5 donde Y es igual a la longitud (nucleotidos o pares de bases) de la SEQID NO: 2 (6096);.

donde X es igual a la longitud comun (en nucleotidos) de cada oligonucleotido en el conjunto (por ejemplo, X = 20 para un conjunto de 20-mers que se superponen en forma consecutiva); y

donde el numero (Z) de oligomeros que se superponen consecutivamente de longitud X para un determinado SEQ ID NO 1 de longitud Y es igual a Y- (X-I). Por ejemplo Z = 6096

10 - 19 = 6077, ya sea para conjuntos en sentido o antisentido de SEQ ID NO: 2, donde X = 20.

Preferiblemente, el conjunto se limita a los oligomeros que comprenden al menos un dinucleotido CpG, TpG o CpA.

Los ejemplos de oligonucleotidos de 20-mer de la invencion incluyen el siguiente conjunto de 2,261 oligomeros (y el conjunto antisentido complementario de los mismos), indicado por las posiciones de polinucleotido con referencia a SEQ ID NO: 1-4; 37-65; 1-20, 2-21 , 3-22, 4-23, 5-24, y 6077- 6096.

15 Preferiblemente, el conjunto se limita a los oligomeros que comprenden al menos un dinucleotido CpG, TpG o CpA.

Del mismo modo, los ejemplos de oligonucleotidos de 25-mer incluyen el siguiente conjunto de 2,256 oligomeros (y el conjunto antisentido complementario de los mismos), indicado por las posiciones de polinucleotido con referencia a la SEQ ID NO: 2:

1 -25, 2-26, 3-27, 4-28, 5-29, y 6072- 6096.

20 Preferiblemente, el conjunto se limita a los oligomeros que comprenden al menos un dinucleotido CpG, TpG o CpA.

Se divulgan, para cada una de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 (en sentido y antisentido), multiples conjuntos que se superponen consecutivamente de oligonucleotidos u oligonucleotidos modificados de longitud X, donde, por ejemplo, X = 9, 10, 17, 20, 22, 23, 25, 27, 30 o 35 nucleotidos.

Los oligonucleotidos u oligomeros constituyen herramientas efectivas utiles para comprobar los parametros geneticos 25 y epigeneticos de las secuencias genomicas correspondientes a SEQ ID NO: 1-4; 37-65. Los conjuntos preferidos de tales oligonucleotidos u oligonucleotidos modificados de longitud X son aquellos conjuntos que se superponen consecutivamente de oligomeros correspondientes a SEQ ID NO: 1-4; 37-65 (y a los complementos de los mismos). Preferiblemente, dichos oligomeros comprenden al menos un dinucleotido CpG, TpG o CpA.

Oligonucleotidos u oligomeros particularmente preferidos son aquellos en los que la citosina de la secuencia de 30 dinucleotido CpG (o del correspondiente dinucleotido TpG o CpA convertido) esta dentro del tercer medio del oligonucleotido; es decir, donde el oligonucleotido es, por ejemplo, de 13 bases de longitud, el dinucleotidos CpG, TpG o CpA se posiciona dentro de la quinta a la novena desde el extremo 5'.

Los oligonucleotidos tambien pueden ser modificados por el enlazamiento qmmico del oligonucleotido a uno o mas unidades estructurales o conjugados para potenciar la actividad, estabilidad o deteccion del oligonucleotido. Tales 35 unidades estructurales o conjugados incluyen cromoforos, fluoroforos, lfpidos tales como colesterol, acido colico, tioeter, cadenas alifaticas, fosfolfpidos, poliaminas, polietilenglicol (PEG), las unidades estructurales de palmitilo, y otros como se divulga en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 55,514,758, 5,565,552, 5,567,810, 5,574,142, 5,585,481, 5,587,371, 5,597,696 y 5,958,773. Las sondas tambien pueden existir en la forma de un PNA (acido nucleico peptfdico) que tenga propiedades de apareamiento particularmente preferidas. Asf, el oligonucleotido puede 40 incluir otros grupos adjuntos tales como peptidos, y puede incluir agentes de escision activados por hibridacion (Krol et al., BioTechniques 6:958-976, 1988) o agentes de intercalamiento (Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988). Con este fin, el oligonucleotido puede ser conjugado a otra molecula, por ejemplo, un cromoforo, fluoroforo, peptido, agente de entrecruzamiento activado por hibridacion, agente de transporte, agente de escision activado por hibridacion, etc.

El oligonucleotido puede comprender tambien al menos un azucar modificado y/o unidad estructural base reconocido 45 en la tecnica, o puede comprender un esqueleto modificado o enlace internucleosido no natural.

Los oligonucleotidos u oligomeros se utilizan tfpicamente en “conjuntos", que contienen al menos un oligomero para el analisis de cada uno de los dinucleotidos CpG de una secuencia genomica seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 y secuencias complementarias de las mismas, o al correspondiente dinucleotido CpG, TpG o

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CpA dentro de una secuencia de los acidos nucleicos tratados de acuerdo con SEQ ID NO: 5-20; 66-181 y las secuencias complementarias de las mismas. Sin embargo, se anticipa que por factores economicos u otros puede ser preferible analizar una seleccion limitada de los dinucleotidos CpG dentro de dichas secuencias, y el contenido del conjunto de oligonucleotidos se altera en consecuencia.

Por lo tanto, se divulga un conjunto de al menos dos (2) oligomeros (oligonucleotidos y/o PNA-oligomeros) que son utiles para detectar el estado de metilacion de citosina en el ADN genomico tratado (SEQ ID NO: 5-20 ; 66-181), o en el ADN genomico (SEQ ID NO: 1-4; 37-65 y secuencias complementarias de las mismas). Estos oligomeros tambien pueden ser sondas con nombre y permitir el diagnostico y la deteccion de los trastornos proliferativos de celulas de prostata, lo mas preferiblemente, el carcinoma de prostata. El conjunto de oligomeros tambien se puede utilizar para la deteccion de polimorfismos de nucleotido unico (SNP) en el ADN genomico tratado (SEQ ID NO: 5-20; 66 a 181 y las secuencias complementarias de las mismas), o en el ADN genomico (SEQ ID NO: 1 -4; 37-65 y secuencias complementarias de las mismas).

Al menos uno, y mas preferiblemente todos los miembros de un conjunto de oligonucleotidos puede estar enlazado a una fase solida.

Se divulga ademas un conjunto de al menos dos (2) oligonucleotidos que se usan como oligonucleotidos “cebadores para amplificar secuencias de ADN de una de las SEQ ID NO: 1-4, 37-65; SEQ ID NO: 5-20, 66-181; secuencias complementarias de las mismas; o segmentos de las mismas.

Se anticipa que los oligonucleotidos pueden constituir todo o parte de un "arreglo" o "chip de ADN" (es decir, una disposicion de diferentes oligonucleotidos y/o PNA-oligomeros enlazados a una fase solida). Tal arreglo de diferentes oligonucleotidos y/o secuencias de PNA-oligomero puede ser caracterizado, por ejemplo, en que esta dispuesto sobre la fase solida en forma de un retfculo rectangular o hexagonal. La superficie de fase solida puede estar compuesta de silicio, vidrio, poliestireno, aluminio, acero, hierro, cobre, mquel, plata, u oro. La nitrocelulosa asf como plasticos tales como nailon, que pueden existir en la forma de granulos o tambien como matrices de resina, tambien se pueden utilizar. Una vision general de la Tecnica Anterior en la fabricacion arreglos de oligomeros puede ser obtenida de una edicion especial de Nature Genetics (Nature Genetics Supplement, Volume 21 , January 1999, y de la literatura allf citada). Las sondas marcadas fluorescentemente se utilizan frecuentemente para la exploracion de arreglos de ADN inmovilizados. La simple union de colorantes Cy 3 y Cy5 al extremo 5'OH de la sonda espedfica son particularmente adecuados para marcadores de fluorescencia. La deteccion de la fluorescencia de las sondas hibridadas puede llevarse a cabo, por ejemplo, a traves de un microscopio confocal. Los colorantes Cy3 y Cy5, ademas de muchos otros, estan disponibles comercialmente.

Tambien se anticipa que los oligonucleotidos, o secuencias particulares de los mismos, pueden constituir la totalidad o parte de un "arreglo virtual" en donde se utilizan los oligonucleotidos, o secuencias particulares de los mismos, por ejemplo, como "especificadores” como parte de, o en combinacion con una poblacion diversa de sondas marcadas unicas para analizar una mezcla compleja de analitos. Tal metodo, por ejemplo se describe en el documento US 2003/0013091 (numero de serie de Estados Unidos 09/898.743, publicado el 16 de enero de 2003). En tales metodos, se generan suficientes marcadores de tal manera que cada acido nucleico en la mezcla compleja (es decir, cada analito) puede enlazarse de forma unica por un marcador unico y asf se detecta (cada marcador se cuenta directamente, dando como resultado una lectura digital de cada especies moleculares en la mezcla).

Se prefiere particularmente que los oligomeros se utilicen para la deteccion de, o para el diagnostico de trastornos proliferativos de celulas de prostata, lo mas preferiblemente, el carcinoma de prostata.

Lo mas preferiblemente, se determina la presencia o ausencia de trastornos proliferativos de celulas de prostata, lo mas preferiblemente, el cancer de prostata. Esto se logra mediante el analisis del estatus de metilacion de al menos una y mas preferiblemente una pluralidad de, secuencias objetivo que comprenden al menos una posicion CpG comprendiendo dicha secuencia, o la hibridacion bajo condiciones rigurosas con al menos 16, 50, 100 o 500 nucleotidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 y complementos de los mismos.

Preferiblemente se analizan una pluralidad de regiones objetivo (aqrn tambien denominado como un "panel de gen") como se describe mas arriba.

Se divulga ademas un metodo para establecer parametros geneticos y/o epigeneticos de las secuencias genomicas de acuerdo con SEQ ID NO: 1-4; 37-65 dentro de un sujeto mediante el analisis de la metilacion de citosina y polimorfismos de nucleotido unico. Dicho metodo comprende poner en contacto un acido nucleico que comprende al menos una secuencia genomica seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 en una muestra biologica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo o una serie de reactivos, en donde dicho reactivo o serie de reactivos, distingue entre dinucleotidos CpG metilados y no metilados dentro de los acidos nucleicos objetivo.

Preferiblemente, dicho metodo comprende las siguientes etapas: En la primera etapa, se obtiene una muestra del tejido que se va a analizar. La fuente puede ser cualquier fuente adecuada, tal como lmeas celulares, cortes

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histologicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, eyaculado, orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas, celulas aisladas de la sangre y todas las posibles combinaciones de los mismos. Se prefiere que dichas fuentes de ADN sean eyaculados o fluidos corporales seleccionados del grupo que consiste de eyaculado, orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas, celulas aisladas de la sangre.

El ADN genomico se afsla de la muestra. El ADN genomico puede ser aislado por cualquier medio estandar en la tecnica, incluyendo el uso de kits disponibles comercialmente. Brevemente, en donde el ADN de interes esta encapsulado por una membrana celular la muestra biologica debe ser interrumpida y sometida a lisis mediante medios enzimaticos, qmmicos o mecanicos. La solucion de ADN puede entonces ser limpiada de protemas y otros contaminantes, por ejemplo, por digestion con proteinasa K. Luego se recupera el ADN genomico a partir de la solucion. Esto puede llevarse a cabo por medio de una variedad de metodos que incluyen precipitacion por saturacion salina, extraccion organica o enlazamiento del ADN a un soporte en fase solida. La seleccion del metodo se vera afectada por varios factores incluyendo tiempo, coste y cantidad requerida de ADN.

En donde el ADN de la muestra no esta encerrado en una membrana (por ejemplo, ADN circulando de una muestra de sangre), se pueden emplear metodos estandar en la tecnica para el aislamiento y/o purificacion de ADN. Tales metodos incluyen el uso de un reactivo de degeneracion de protemas, por ejemplo, sal caotropica, por ejemplo, clorhidrato de guanidina o urea; o un detergente, por ejemplo, dodecil sulfato de sodio (SDS), bromuro de cianogeno. Los metodos alternativos incluyen, pero no se limitan a precipitacion con etanol o precipitacion con propanol, concentracion al vado, entre otros, por medio de una centnfuga. La persona experta en la tecnica tambien puede hacer uso de dispositivos tales como dispositivos de filtro por ejemplo ultrafiltracion, superficies o membranas de silica, partmulas magneticas, partmulas de poliestireno, superficies de poliestirol, superficies con carga positiva, y membrana con carga positiva, membranas cargadas, cargada superficies, membranas de conmutacion cargadas, superficies de conmutacion cargadas.

Una vez se han extrafdo los acidos nucleicos, el ADN genomico de doble cadena se utiliza en el analisis.

En el segundo paso del metodo, la muestra de ADN genomico se trata de una manera tal que las bases de citosina que estan sin metilar en la posicion 5' se convierten en uracilo, timina, u otra base que es diferente a la citosina en terminos de comportamiento de hibridacion. Esto se entiende como "pretratamiento" o "tratamiento" aqrn.

Esto se logra preferiblemente por medio de tratamiento con un reactivo de bisulfito. El termino "reactivo de bisulfito" se refiere a un reactivo que comprende bisulfito, disulfito, sulfito de hidrogeno o combinaciones de los mismos, utiles como se divulga aqrn para distinguir entre secuencias de dinucleotidos CpG metiladas y no metiladas. Metodos de dicho tratamiento son conocidos en la tecnica (por ejemplo PCT/EP2004/01 1715). Se prefiere que el tratamiento con bisulfito se lleve a cabo en presencia de solventes desnaturalizantes tales como, pero no limitados a n -alquilenglicol, en particular dietilen glicol dimetil eter (DME), o en presencia de dioxano o derivados de dioxano. En una realizacion preferida los solventes desnaturalizantes se usan en concentraciones de entre 1% y 35% (v/v). Tambien se prefiere que la reaccion con bisulfito se lleve a cabo en presencia de depuradores tales como, pero no limitados a derivados de cromano, por ejemplo, acido 6-hidroxi-2,5,7,8, tetrametilcromano 2-carboxflico o acido trihidroxibenzoico y derivados de los mismos, por ejemplo, acido galico (vease: PCT/EP2004/01 1715). La conversion con bisulfito se lleva a cabo preferiblemente a una temperatura de reaccion entre 30°C y 70°C, con lo cual la temperatura se incrementa a mas de 85°C durante penodos cortos de tiempo durante la reaccion (vease: PCT/EP2004/011715). El ADN tratado con bisulfito se purifica preferiblemente antes de la cuantificacion. Esto puede llevarse a cabo por cualquier medio conocido en la tecnica, tales como, pero no limitado a, ultrafiltracion, preferiblemente llevada a cabo por medio de columnas Microcon™ (fabricado por Millipore™). La purificacion se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante modificado (vease: PCT/EP2004/01 1715).

En la tercera etapa del metodo, los fragmentos de ADN tratado se amplifican, usando conjuntos de oligonucleotidos cebadores descritos aqrn, y una enzima de amplificacion. La amplificacion de varios segmentos de ADN puede llevarse a cabo simultaneamente en una y el mismo recipiente de reaccion. Tfpicamente, la amplificacion se lleva a cabo utilizando una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Preferiblemente, dichos amplificados son de 100 a 2,000 pares de bases de longitud. El conjunto de oligonucleotidos cebadores incluye al menos dos oligonucleotidos cuyas secuencias son cada una inversas complementarias, identicas, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento de lo menos 16 pares de bases de largo de las secuencias de bases de una de las SEQ ID NO: 5 -20; 66-181 y las secuencias complementarias de las mismas.

De manera alternativa, el estatus de metilacion de las posiciones CpG preseleccionadas dentro de al menos una secuencia genomica seleccionados del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65, se puede detectar mediante el uso de oligonucleotidos de cebadores espedficos de metilacion. Esta tecnica (MSP) se ha descrito en la Patente de Estados Unidos No. 6,265,171 de Herman. El uso de cebadores espedficos de estado de metilacion para la amplificacion de ADN tratado con bisulfito permite la diferenciacion entre acidos nucleicos metilados y no metilados. Pares de cebadores MSP contienen al menos un cebador que se hibrida a un dinucleotido CpG tratado con bisulfito. Por lo tanto, la secuencia de dichos cebadores comprende al menos un dinucleotido CpG. cebadores de MSP espedficos para el ADN no metilado contienen una "T" en la posicion de la posicion C en el CpG. Preferiblemente, por

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lo tanto, se requiere la secuencia de bases de dichos cebadores para comprender una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleotidos que se hibrida con una secuencia de acido nucleico tratado de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 5-20; 66-181 y secuencias complementarias de las mismas, en donde la secuencia de bases de dichos oligomeros comprende al menos un dinucleotido CpG. Una realizacion preferida adicional del metodo comprende el uso de oligonucleotidos bloqueadores (el ensayo HeavyMethyl™). El uso de tales oligonucleotidos bloqueadores se ha descrito por Yu et al, BioTechniques 23:714-720, 1997. Los oligonucleotidos de sonda de bloqueo se hibridan al acido nucleico tratado con bisulfito simultaneamente con los cebadores de PCR. La amplificacion por PCR del acido nucleico se termina en la posicion 5' de la sonda de bloqueo, de tal manera que la amplificacion de un acido nucleico se suprime donde esta presente la secuencia complementaria a la sonda de bloqueo. Las sondas pueden ser disenadas para hibridar con el acido nucleico tratado con bisulfito de una manera espedfica al estado de metilacion. Por ejemplo, para la deteccion de acidos nucleicos metilados dentro de una poblacion de acidos nucleicos no metilados, la supresion de la amplificacion de acidos nucleicos que son no metilados en la posicion en cuestion se llevana a cabo mediante el uso de sondas de bloqueo que comprenden un 'CpA "o" TPA 'en la posicion en cuestion, en oposicion a un "CpG" si se desea la supresion de la amplificacion de acidos nucleicos metilados.

Para los metodos de PCR utilizando oligonucleotidos bloqueadores, la ruptura eficiente de la amplificacion mediada por polimerasa requiere que los oligonucleotidos bloqueadores no sean alargados por la polimerasa. Preferiblemente, esto se logra mediante el uso de los bloqueadores que son 3'-desoxioligonucleotidos, u oligonucleotidos derivados en la posicion 3' con un grupo diferente a un grupo hidroxilo "libre". Por ejemplo, los oligonucleotidos 3'-O-acetilo son representativos de una clase preferida de molecula bloqueadora.

Adicionalmente, la descomposicion mediada por polimerasa de los oligonucleotidos bloqueadores debe ser impedida. Preferiblemente, tal impedimento comprende o bien el uso de una polimerasa que carece de actividad exonucleasa 5' - 3', o el uso de oligonucleotidos bloqueadores modificados que tienen, por ejemplo, puentes tioato en los terminales 5' de los mismos que vuelven a la molecula bloqueadora resistente a la nucleasa. Aplicaciones particulares pueden no requerir de tales modificaciones en 5' del bloqueador. Por ejemplo, si los sitios de enlazamiento del cebador y del bloqueador se superponen, impidiendo asf el enlazamiento del cebador (por ejemplo, con exceso de bloqueador), se impedira sustancialmente la degradacion del oligonucleotido bloqueador. Esto es debido a que la polimerasa no extendera el cebador hacia, y a traves (en la direccion 5'-3) de un proceso bloqueador que da lugar normalmente a la degradacion del oligonucleotido bloqueador hibridado.

Una realizacion particularmente preferida de bloqueador/PCR comprende el uso de oligomeros de acido nucleico peptfdico (PNA) como oligonucleotidos de bloqueo. Tales oligomeros bloqueadores de PNA son idealmente adecuados, ya que ni se descomponen ni tampoco se extienden por la polimerasa.

Preferiblemente, por lo tanto, la secuencia de bases de dichos oligonucleotidos de bloqueo es necesario para comprender una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleotidos que se hibrida con una secuencia de acido nucleico tratado de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 5-20; 66-181 y secuencias complementarias de las mismas, en donde la secuencia de bases de dichos oligonucleotidos comprende al menos un dinucleotido CpG, TpG o CpA.

Los fragmentos obtenidos por medio de la amplificacion pueden portar un marcador directa o indirectamente detectable. Se prefieren los marcadores en forma de marcadores de fluorescencia, radionucleidos o fragmentos separables de moleculas que tienen una masa tfpica que puede ser detectada en un espectrometro de masas. Donde dichos marcadores son marcadores de masa, se prefiere que los amplificados marcados tengan una sola carga neta positiva o negativa, permitiendo ser detectados mejor en el espectrometro de masas. La deteccion puede llevarse a cabo y ser visualizada, por ejemplo, por medio de desorcion de la matriz asistida por laser / espectrometna de masas por ionizacion (MALDI) o usando espectrometna de masas por electroaspersion (ESI).

La espectrometna de masas por desorcion/ionizacion laser asistida de la matriz (MALDI-TOF) es un desarrollo muy eficiente para el analisis de biomoleculas (Karas and Hillenkamp, Anal Chem., 60: 2299 - 301, 1988). Un analito esta embebido en una matriz absorbente de luz. La matriz es evaporada por un pulso de laser corto transportando asf la molecula de analito a la fase de vapor de una manera no fragmentada. El analito se ioniza por colisiones con moleculas de la matriz. Un voltaje aplicado acelera los iones en un tubo de vuelo libre de campo. Debido a sus diferentes masas, los iones se aceleran a diferentes velocidades. Los iones mas pequenos alcanzan el detector antes que los mas grandes. La espectrometna MALDI-TOF es muy adecuada para el analisis de peptidos y protemas. El analisis de acidos nucleicos es algo mas diffcil (Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1: 147 - 57, 1995). La sensibilidad con respecto al analisis de acido nucleico es aproximadamente 100 veces menor que para los peptidos, y disminuye desproporcionadamente al aumentar el tamano del fragmento. Por otra parte, para los acidos nucleicos que tienen una estructura principal con multiples cargas negativas, el proceso de ionizacion a traves de la matriz es considerablemente menos eficiente. En espectrometna MALDI-TOF, la seleccion de la matriz desempena un papel eminentemente importante. Para la desorcion de peptidos, se han encontrado varias matrices muy eficaces que producen una cristalizacion muy fina. En la actualidad existen varias matrices sensibles para ADN, sin embargo, la diferencia de sensibilidad entre los peptidos y los acidos nucleicos no se ha reducido. Esta diferencia en la sensibilidad puede reducirse, sin embargo, modificando qmmicamente el ADN de tal manera que se haga mas similar a un peptido. Por ejemplo, los acidos nucleicos de fosforotioato, en los que se sustituyen los fosfatos habituales de la estructura

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principal con tiofosfatos, se pueden convertir en un ADN de carga neutra usando qmmica de alquilacion sencilla (Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367 - 73, 1995). El acoplamiento de una etiqueta de carga con este ADN modificado produce como resultado un aumento de la sensibilidad de MALDI-TOF al mismo nivel que el encontrado para los peptidos. Una ventaja adicional de etiquetado con carga es la mayor estabilidad del analisis contra las impurezas, que hace que la deteccion de sustratos no modificados sea considerablemente mas diffcil.

En la cuarta etapa del metodo, los amplificados obtenidos durante la tercera etapa del metodo se analizan con el fin de determinar el estado de metilacion de los dinucleotidos CpG antes del tratamiento.

En realizaciones en las que los amplificados fueron obtenidos por medio de la amplificacion por MSP, la presencia o ausencia de un amplificado es en sf misma indicativa del estado de metilacion de las posiciones de CpG cubiertas por el cebador, de acuerdo con las secuencias de bases de dicho cebador.

Los amplificados obtenidos tanto a traves de PCR estandar como espedfica de metilacion pueden analizarse ademas por medio de metodos basados en oligomeros tales como, pero sin limitarse a, tecnologfa de arreglos y tecnologfas con base en una sonda asf como por medio de tecnicas tales como secuenciacion y extension dirigida a la plantilla.

La amplificacion sintetizado en la etapa tres se hibridan subsecuentemente a un arreglo o un conjunto de oligonucleotidos y/o sondas de PNA. En este contexto, la hibridacion se lleva a cabo de la siguiente manera: el conjunto de sondas usadas durante la hibridacion esta compuesto preferiblemente de al menos 2 oligonucleotidos u PNA- oligomeros; en el proceso, los amplificados sirven como sondas que se hibridan con oligonucleotidos previamente enlazados a una fase solida; los fragmentos no hibridados se eliminan subsecuentemente; dichos oligonucleotidos contienen al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleotidos que es complementaria inversa o identica a un segmento de las secuencias de bases especificadas en el presente Listado de Secuencias; y el segmento comprende al menos un dinucleotido CpG, TpG o CpA. La porcion de hibridacion de los acidos nucleicos de hibridacion es tfpicamente de al menos 9, 15, 20, 25, 30 o 35 nucleotidos de longitud. Sin embargo, las moleculas mas largas tienen utilidad.

Preferiblemente, dicho dinucleotido esta presente en el tercio central del oligomero. Por ejemplo, en donde el oligomero comprende un dinucleotido CpG, dicho dinucleotido es preferiblemente del quinto al noveno nucleotido desde el extremo 5' de un 13-mer. Existe un oligonucleotido para el analisis de cada dinucleotido CpG dentro de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65, y las posiciones equivalentes en la SEQ ID NO: 5-20; 66-181. Dichos oligonucleotidos tambien pueden estar presentes en forma de acidos nucleicos peptfdicos., Los amplificados no hibridados son entonces eliminados. Los no hibridados son entonces detectados. En este contexto, se prefiere que los marcadores unidos a los amplificados sean identificables en cada posicion de la fase solida a la que se localiza una secuencia de oligonucleotidos.

El estatus de metilacion genomica de las posiciones de CpG puede determinarse por medio de sondas de oligonucleotidos (como se detalla mas arriba) que se hibridan con el ADN tratado con bisulfito concurrentemente con los cebadores de amplificacion de PCR (en donde dichos cebadores o bien pueden ser espedficos de metilacion o estandar).

Es particularmente preferido el uso de PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia (Heid et al., Genome Res. 6: 986 - 994, 1996; vease tambien la patente de los Estados Unidos No. 6,331,393) empleando una sonda de oligonucleotidos fluorescente doblemente marcada (PCR con TaqMan™, utilizando un sistema de deteccion de secuencias ABI Prism 7700, Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California). La reaccion PCR con TaqMan™ emplea el uso de un oligonucleotido de interrogacion no extendible, llamado sonda TaqMan™, que, en realizaciones preferidas, esta disenado para hibridar con una secuencia rica en GpC localizada entre los cebadores de amplificacion directo e inverso. La sonda TaqMan™ comprende ademas una "unidad estructural reportera" fluorescente y una " unidad estructural inactivadora" unidas covalentemente a unidades estructurales enlazadoras (por ejemplo, fosforamiditas) unidas a los nucleotidos del oligonucleotido TaqMan™. Para el analisis de metilacion dentro de los acidos nucleicos despues del tratamiento con bisulfito, se requiere que la sonda sea espedfica para metilacion, tal como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 6,331,393, tambien conocido como el ensayo MethylLight™. Las variaciones sobre la metodologfa de deteccion TaqMan™ que tambien son adecuadas para uso con la invencion descrita incluyen el uso de tecnologfa de doble sonda (Lightcycler™) o cebadores de amplificacion fluorescentes (tecnologfa Sunrise™). Estas dos tecnicas se puedeN adaptar de una manera adecuada para uso con ADN tratado con bisulfito, y por otra parte para el analisis de metilacion dentro de dinucleotidos CpG.

La cuarta etapa del metodo puede comprender el uso de la extension del oligonucleotido dirigida a la plantilla, tal como MS-SNuPE como se describe por Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25: 2529-2531, 1997.

La cuarta etapa del metodo puede comprender la secuenciacion y subsecuente analisis de la secuencia del amplificado generado en la tercera etapa del metodo (Sanger F., et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU. 74: 5463- 5467, 1977).

Mejor modo

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Lo mas preferiblemente, los acidos nucleicos genomicos se afslan y se tratan de acuerdo con las tres primeras etapas del metodo descrito anteriormente, a saber:

a) obtener, de un sujeto, una muestra biologica que tiene ADN genomico del sujeto;

b) extraer o de otra manera aislar el ADN genomico;

c) tratar el ADN genomico de b), o un fragmento del mismo, con uno o mas reactivos para convertir las bases de citosina que no estan metiladas en la posicion 5 del mismo en uracilo o en otra base que sea detectable en forma distinta a la citosina en terminos de propiedades de hibridacion; y en donde

d) la amplificacion subsecuente al tratamiento en c) se lleva a cabo de una manera espedfica para la metilacion, es decir, mediante el uso de cebadores espedficos de metilacion u oligonucleotidos de bloqueo, y ademas en donde

e) e) la deteccion de los amplificados se lleva a cabo por medio de una sonda de deteccion en tiempo real, como se describe mas arriba.

Preferiblemente, cuando la amplificacion subsecuente de d) se lleva a cabo por medio de cebadores espedficos de metilacion, como se describio anteriormente, dichos cebadores espedficos de metilacion comprenden una secuencia que tiene una longitud de al menos 9 nucleotidos que hibrida con una secuencia de acido nucleico tratado de acuerdo con una de SEQ ID NO: 5-20; 66-181 y secuencias complementarias de las mismas, en donde la secuencia de bases de dichos oligomeros comprenden al menos un dinucleotido CpG.

Etapa e) del metodo, a saber, la deteccion de los amplificados espedficos indicativos del estatus de metilacion de una o mas posiciones de CpG de al menos una secuencia genomica seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 se lleva a cabo por medio de metodos de deteccion en tiempo real como se describio anteriormente.

Se provee adicionalmente un metodo para el analisis del estatus de metilacion del ADN genomico de acuerdo con la invencion (SEQ ID NO: 1-4; 37-65, y complementos de las mismas), sin la necesidad de la conversion con bisulfito. Se conocen metodos en la tecnica en donde un reactivo de enzima de restriccion sensible a la metilacion, o una serie de reactivos de enzimas de restriccion que comprenden reactivo de enzima de restriccion sensible a la metilacion que distinguen entre dinucleotidos CpG metilados y no metilados dentro de una region objetivo se utilizan en la determinacion de la metilacion, por ejemplo, pero no limitado a DMH (vease, por ejemplo, pero no limitado a US 6,605,432 o WO 2006/088978).

En la primera etapa de tales metodos adicionales, la muestra de ADN genomico se afsla del tejido o de fuentes celulares. El ADN genomico puede ser aislado por cualquier medio estandar en la tecnica, incluyendo el uso de kits disponibles comercialmente. Brevemente, en donde el aDn de interes esta encapsulado por una membrana celular la muestra biologica debe ser interrumpida y sometida a lisis mediante medios enzimaticos, qrnmicos o mecanicos. La solucion de ADN puede entonces ser limpiada de protemas y otros contaminantes, por ejemplo, por digestion con proteinasa K. El ADN genomico se recupera entonces de la solucion. Esto puede llevarse a cabo por medio de una variedad de metodos que incluyen precipitacion por saturacion salina, extraccion organica o enlazamiento de ADN a un soporte en fase solida. La seleccion del metodo se vera afectada por varios factores incluyendo tiempo, coste y cantidad necesaria de ADN. Tipos de muestras clmicas AU que comprenden la materia neoplasica o potencialmente neoplasica son adecuadas para uso en el presente metodo, se prefieren las lmeas celulares, cortes histologicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, eyaculado, orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas, celulas aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos. Los fluidos corporales son la fuente preferida de ADN; particularmente preferidos son orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas y celulas aisladas de la sangre.

Una vez que se han extrafdo los acidos nucleicos, el ADN de doble cadena genomico se utiliza en el analisis.

Preferiblemente, el ADN puede escindirse antes del tratamiento con enzimas de restriccion sensibles a la metilacion. Tales metodos son conocidos en la tecnica y pueden incluir tanto medios ffsicos como enzimaticos. Particularmente preferido es el uso de uno o una pluralidad de enzimas de restriccion que no son sensible a la metilacion, y cuyos sitios de reconocimiento son ricos en AT y no comprenden dinucleotidos CG.

El uso de tales enzimas permite la conservacion de las islas CpG y regiones ricas en CpG en el ADN fragmentado. Las enzimas de restriccion no espedfica de metilacion se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste de Msel, Bfal, Cspol, Trull, Tvull, Tru9I, Tvu9I, Mael y Xspl. Particularmente preferido es el uso de dos o tres de tales enzimas. Particularmente preferido es el uso de una combinacion de Msel, Bfal y Cspol.

El ADN fragmentado puede entonces ser ligado a los oligonucleotidos adaptadores con el fin de facilitar la amplificacion enzimatica subsecuente. La ligacion de oligonucleotidos a fragmentos de ADN de extremos romoso y pegajosos se conoce en la tecnica, y se lleva a cabo por medio de la desfosforilacion de los extremos (por ejemplo, utilizando la fosfatasa alcalina de ternera o de camaron) y la ligacion subsecuente utilizando enzimas de ligasa (por ejemplo ligasa

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de ADN de T4) en la presencia de dATPs. Los oligonucleotidos adaptadores son tipicamente de al menos 18 pares de bases de longitud.

En la tercera etapa, el ADN (o fragmentos de los mismos) se digiere entonces con una o mas enzimas de restriccion sensibles a la metilacion. La digestion se lleva a cabo de tal manera que la hidrolisis del ADN en el sitio de restriccion es informativo del estatus de metilacion de un dinucleotido CpG espedfico del gen NFATC3 y opcionalmente de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3- 1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2).

Preferiblemente, se analiza una pluralidad de genes (aqu tambien denominado como un "panel de gen") como se describe mas arriba.

Preferiblemente, la enzima de restriccion espedfica de metilacion se selecciona del grupo que consiste de Bsi El , Hga I, HinPl, Hpy99I, Ava I, Bee AI, Bsa HI, Bisl, BstUI, BshI236I, AccII, BstFNI, McrBC, Glal, Mvnl, HpaII (HapII), Hhal, Acil, Smal, HinPlI, HpyCH4IV, Eagl y mezclas de dos o mas de las enzimas anteriores. Se prefiere una mezcla que contenga las enzimas de restriccion BstUI, HpaII, HpyCH4IV y HinPlI.

En la cuarta etapa, que es opcional, pero preferida, se amplifican los fragmentos de restriccion. Esto se lleva a cabo preferiblemente usando una reaccion en cadena de la polimerasa, y dicha amplificacion puede llevar marcadores detectables adecuados como se discutio anteriormente, a saber los marcadores fluoroforo, radionucleidos y marcadores de masa. Particularmente preferida es la amplificacion por medio de una enzima de amplificacion y al menos dos cebadores que comprenden, en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleotidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a la SEQ ID NO:50 y opcionalmente a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-49, 51-65, y complementos de los mismos. Preferiblemente, dicha secuencia contigua es al menos de 16, 20 o 25 nucleotidos de longitud. En una realizacion alternativa dichos cebadores pueden ser complementarios a los adaptadores enlazados a los fragmentos.

En la quinta etapa se detectan los amplificados. La deteccion puede ser por cualquier medio estandar en la tecnica, por ejemplo, pero no limitado a, analisis de electroforesis en gel, analisis de hibridacion, incorporacion de etiquetas detectables dentro de los productos de PCR, analisis de arreglo de ADN, analisis MALDI o ESI. Preferiblemente, dicha deteccion se lleva a cabo por hibridacion a al menos un acido nucleico o acido nucleico peptfdico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 16 nucleotidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a la SEQ ID NO:50 y opcionalmente a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65, y complementos de las mismas. Preferiblemente, dicha secuencia contigua es de al menos 16, 20 o 25 nucleotidos de longitud.

Subsecuente a la determinacion del estado de metilacion o el nivel de los acidos nucleicos genomicos, se deduce la presencia o ausencia de trastornos proliferativos de celulas de prostata, lo mas preferiblemente, carcinoma de prostata basandose en el estado de metilacion o el nivel de al menos una secuencia de dinucleotido CpG de la SEQ ID NO:50 y opcionalmente uno o mas de 1-4; 3749, 51-65, o un promedio, o un valor que refleje un estado de metilacion promedio de una pluralidad de secuencias de dinucleotidos CpG de la SEQ ID nO:50 y opcionalmente 1-4; 3749, 51-65, en donde la metilacion se asocia con la presencia de trastornos proliferativos de celulas de prostata, lo mas preferiblemente, el cancer de prostata. En donde dicha metilacion se determina por medios cuantitativos, el punto de corte para determinar dicha la presencia de metilacion es preferiblemente cero (es decir, en donde una muestra despliega cualquier grado de metilacion, se determina por tener un estatus metilado en la posicion de CpG analizada). No obstante, se preve que el experto en la tecnica puede desear ajustar dicho valor de corte con el fin de proveer un ensayo de una sensibilidad o especificidad particularmente preferida. De acuerdo con lo anterior dicho valor de corte se puede incrementar (incrementando asf la especificidad), dicho valor de corte puede estar dentro de un rango seleccionado del grupo que consiste de 0% -5%, 5% -10%, 10% -15%, 15 % -20%, 20% -30% y 30% -50%. Particularmente preferidos son los puntos de corte de 10%, 15%, 25% y 30%.

Kits

Por otra parte, se divulga un kit que comprende: un medio para determinar la metilacion de NAFTC3 y opcionalmente al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de rAsSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MmE; RaRB; NKX3- 1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2). Los medios para determinar dicha metilacion comprenden preferiblemente un reactivo que contiene bisulfito; uno o una pluralidad de oligonucleotidos que consisten en, cuyas secuencias en cada caso son identicas, son complementarias, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas, a un segmento de 9 o mas preferiblemente 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 5-20; 66-181; y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo y evaluar el metodo descrito de analisis de metilacion. En una realizacion, la secuencia de bases de dichos oligonucleotidos comprende al menos un dinucleotido CpG, TpG o CpA.

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Dicho kit puede comprender ademas reactivos estandar para la realizacion de un analisis de metilacion espedfica de la posicion de CpG, en donde dicho analisis comprende una o mas de las siguientes tecnicas: MS-SNuPE, MSP, MethyLight™, HeavyMethyl, COBRA, y secuenciacion de acidos nucleicos.

Sin embargo, un kit usado a lo largo de las lmeas de la presente invencion tambien puede contener solamente parte de los componentes antes mencionados.

El kit puede comprender reactivos de conversion con bisulfito adicionales seleccionados del grupo que consiste de: regulador de desnaturalizacion de ADN; regulador de sulfonacion; reactivos o kits de recuperacion de ADN (por ejemplo, precipitacion, ultrafiltracion, columna de afinidad); regulador de sulfonacion; y componentes de recuperacion de ADN.

El kit tambien puede contener, empacados en recipientes separados, una polimerasa y un regulador de reaccion optimizado para la extension del cebador mediada por la polimerasa, tal como PCR. El kit puede comprender ademas medios para obtener una muestra biologica del paciente. Se prefiere un kit, que comprende ademas un recipiente adecuado para contener los medios para determinar la metilacion de NFATC3 y opcionalmente al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; Histl H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF 13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION INTRON 1 y/o EXON 2) en la muestra biologica del paciente, y lo mas preferiblemente comprende ademas instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit. En un ejemplo preferido, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener el dicho reactivo de bisulfito y la muestra biologica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleotidos de cebador que contienen dos oligonucleotidos cuyas secuencias en cada caso son identicas, son complementarias, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento de 9 o mas preferiblemente 18 bases de largo de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 5-20; 66-181; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit. En una realizacion preferida alternativa, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biologica del paciente; (c) al menos un oligonucleotido y/o PNA-oligomero que tiene una longitud de al menos 9 o 16 nucleotidos que es identica a o se hibrida a una secuencia de acido nucleico pretratada de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 5-20; 66-181 y las secuencias complementarias de las mismas; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit.

En un ejemplo alternativo, el kit comprende: (a) un reactivo de bisulfito; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biologica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleotidos de cebador que contienen dos oligonucleotidos cuyas secuencias en cada caso son identicas, son complementarias, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento de 9 o mas preferiblemente 18 base de largo de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 5-20; 66-181; (d) al menos un oligonucleotidos y/o PNA-oligomero que tiene una longitud de al menos 9 o 16 nucleotidos que es identica a o se hibrida a una secuencia de acido nucleico pretratada de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 5-20; 66-181 y las secuencias complementarias de las mismas; y opcionalmente (e) las instrucciones de uso e interpretacion de los resultados del kit.

El kit tambien puede contener otros componentes tales como reguladores y soluciones adecuadas para el bloqueo, lavado o recubrimiento, empacados en un recipiente separado.

Tambien se divulga un kit para su uso en la determinacion de la presencia de y/o diagnostico de trastornos proliferativos de celulas de la prostata, lo mas preferiblemente, carcinoma de prostata, comprendiendo dicho kit: un medio para medir el nivel de transcripcion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; Hist1 H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); y/o un medio para determinar la metilacion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3- 1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2).

Los reactivos tfpicos (por ejemplo, como se podna encontrar en un tfpico kit basado en COBRA™) para el analisis COBRA ™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); enzimas de restriccion y regulador apropiado: oligo de hibridacion del gen; oligo de hibridacion de control; kit de marcacion de quinasa para la sonda oligo; y nucleotidos marcados.

Los reactivos tfpicos (por ejemplo, como se podna encontrar en un tfpico kit basado en MethyLight™) para el analisis MethyLight™ pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR para la secuencia convertida por bisulfito de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TfAp2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-

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1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); sondas espedficas de bisulfito (por ejemplo, TaqMan™ o LightCycle™); reguladores de PCR optimizados y desoxinucleotidos; y Taq polimerasa.

Los reactivos tfpicos (por ejemplo, como se podna encontrar en un tfpico kit basado en Ms-SNuPE™) para el analisis Ms-SNuPE™ puede incluir, pero no se limita a: cebadores de PCR para el gen espedfico (o secuencia de ADN tratado con bisulfito o isla CpG); reguladores optimizados para PCR y desoxinucleotidos; kit de extraccion en gel; cebadores de control positivo; cebadores Ms-SNuPE™ para la secuencia convertida con bisulfito de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; FHST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF 13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2); regulador de reaccion (para la reaccion Ms-SNuPE); y nucleotidos marcados.

Los reactivos tfpicos (por ejemplo, como podna encontrarse en un kit tfpico basado en MSP) para el analisis MSP pueden incluir, pero no se limitan a: cebadores de PCR metilados y no metilados para la secuencia convertida por bisulfito de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; mMe; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2 ), reguladores optimizado para PCR y desoxinucleotidos y sondas espedficas.

Por otra parte, un aspecto adicional es un kit alternativo que comprende un medio para determinar la metilacion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3- 1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF 13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2 ), en donde dichos medios comprenden preferiblemente al menos una enzima de restriccion espedfica de metilacion; uno o una pluralidad de oligonucleotidos cebadores (preferiblemente uno o una pluralidad de pares de cebadores) adecuados para la amplificacion de una secuencia que comprende al menos un dinucleotido CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65; y opcionalmente instrucciones para llevar a cabo y evaluar el metodo descrito de analisis de metilacion. En una realizacion, la secuencia de bases de dichos oligonucleotidos son identicos, son complementarias, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento al menos de 18 bases de largo, de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65.

Dicho kit puede comprender uno o una pluralidad de sondas de oligonucleotidos para el analisis de los fragmentos digeridos, preferiblemente dichos oligonucleotidos son identicos, son complementarias, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento al menos de 16 base de largo de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65.

El kit puede comprender reactivos adicionales seleccionados del grupo que consiste de: regulador (por ejemplo, reguladores de enzimas de restriccion, de almacenamiento de PCR, o de lavado); reactivos o kits de recuperacion de ADN (por ejemplo, precipitacion, ultrafiltracion, columna de afinidad) y componentes de recuperacion de ADN.

El kit puede contener, empacados en recipientes separados, una polimerasa y un regulador de reaccion optimizado para la extension del cebador mediada por la polimerasa, tal como PCR. El kit puede comprender ademas medios para obtener una muestra biologica del paciente. Preferiblemente, el kit comprende: (a) un reactivo de enzima de restriccion sensible a la metilacion; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biologica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleotidos de uno o una pluralidad de acidos nucleicos o acidos nucleicos peptfdicos que son identicos, son complementarios, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento al menos de 9 bases de largo de al menos una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit.

De manera alternativa, el kit puede comprender: (a) un reactivo de enzima de restriccion sensible a la metilacion; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biologica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleotidos cebadores adecuados para la amplificacion de una secuencia que comprende al menos un dinucleotido CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65; y opcionalmente (d) instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit.

En una realizacion alternativa, el kit puede comprender: (a) un reactivo de enzima de restriccion sensible a la metilacion; (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biologica del paciente; (c) al menos un conjunto de oligonucleotidos cebadores adecuados para la amplificacion de una secuencia que comprende al menos un dinucleotido CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65; (d) al menos un conjunto de oligonucleotidos de uno o una pluralidad de acidos nucleicos o acidos nucleicos peptfdicos que son identicos, son complementarias, o hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento al menos de 9 bases de largo de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65 y opcionalmente (e) las instrucciones de uso y la interpretacion de los resultados del kit.

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El kit tambien puede contener otros componentes tales como reguladores y soluciones adecuadas para el bloqueo, lavado o recubrimiento, empacados en un recipiente separado.

Se divulga ademas un kit para uso en el suministro de un diagnostico de la presencia de trastornos proliferativos de celula de prostata, lo mas preferiblemente, el carcinoma de prostata en un sujeto por medio de analisis de enzima de restriccion sensible a la metilacion. Dicho kit comprende un recipiente y un componente de microarreglos de ADN. Dicho componente de microarreglos de ADN es una superficie sobre la cual una pluralidad de oligonucleotidos se inmoviliza en las posiciones designadas y en donde el oligonucleotido comprende al menos un sitio de metilacion CpG. Al menos uno de dichos oligonucleotidos es espedfico para al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF 13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2) y comprende una secuencia de al menos 15 pares de bases de longitud, pero no mas de 200 pb de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65. Preferiblemente, dicha secuencia es de al menos 15 pares de bases de longitud, pero no mas de 80 pares de bases de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65. Se prefiere ademas que dicha secuencia sea de al menos 20 pares de bases de longitud, pero no mas de 30 pares de bases de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65.

Dicho kit de prueba comprende preferiblemente ademas un componente de la enzima de restriccion que comprende uno o una pluralidad de enzimas de restriccion sensibles a la metilacion.

En una realizacion adicional, dicho kit de prueba se caracteriza ademas porque comprende al menos una enzima de restriccion espedfica de metilacion, y en donde los oligonucleotidos comprenden un sitio de restriccion de dichas al menos una enzima de restriccion espedficas de metilacion.

El kit puede comprender ademas uno o varios de los siguientes componentes, que son conocidos en la tecnica para el enriquecimiento de ADN: un componente de protema, dicha protema enlazante selectivamente a ADN metilado; un componente de acido nucleico formador de triplex, uno o una pluralidad de enlaces, opcionalmente en una solucion adecuada; sustancias o soluciones para la realizacion de una ligacion, por ejemplo, ligasas, reguladores; sustancias o soluciones para la realizacion de una cromatograffa de columna; sustancias o soluciones para la realizacion de un enriquecimiento basado en la inmunologfa (por ejemplo, inmunoprecipitacion); sustancias o soluciones para la realizacion de una amplificacion de acido nucleico, por ejemplo, PCR; un colorante o varios colorantes, si se aplica con un reactivo de acoplamiento, si es aplicable en una solucion; sustancias o soluciones para la realizacion de una hibridacion; y/o sustancias o soluciones para la realizacion de una etapa de lavado.

Se divulga ademas una composicion de materia util para detectar, o para el diagnostico de carcinoma de prostata. Dicha composicion comprende al menos un acido nucleico de 18 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de acido nucleico divulgada en la SEQ ID NO: 5-20; 66-181, y una o mas sustancias tomadas del grupo que comprende: 1 a 5 mmol/l de cloruro de magnesio, 100 a 500 pmol/l de dNTP, 0.5-5 unidades de Taq polimerasa, albumina de suero bovino, un oligomero, en particular, un oligonucleotido o (PNA)-oligomero de acido nucleico pepffdico, comprendiendo dicho oligomero en cada caso al menos una secuencia de bases que tiene una longitud de al menos 9 nucleotidos que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a un ADN genomico pretratado de acuerdo con una de las SEQ ID NO: 5-20; 66-181 y las secuencias complementarias de las mismas. Se prefiere que dicha composicion de materia comprenda una solucion reguladora apropiado para la estabilizacion de dicho acido nucleico en una solucion acuosa y permitir reacciones basadas en polimerasa dentro de dicha solucion. Los reguladores adecuados son conocidos en la tecnica y estan disponibles comercialmente.

En ejemplos adicionales dicho al menos un acido nucleico es al menos 50, 100, 150, 200, 250 o 500 pares de bases de longitud de un segmento de la secuencia de acido nucleico divulgada en la SEQ ID NO: 5-20; 66-181.

La materia de la divulgacion es un metodo para la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata en un sujeto que comprende la determinacion de los niveles de expresion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2) en una muestra biologica aislada de dicho sujeto en donde la subexpresion y/o metilacion de CpG es indicativa de la presencia de dicho trastorno.

Preferiblemente, dicho nivel de expresion se determina detectando la presencia, ausencia o nivel de un polipeptido codificado por dicho gen o secuencia de los mismos.

Preferiblemente, dicho polipeptido se detecta por uno o mas medios seleccionados del grupo que comprende analisis western blot, cromatograffa, inmunoensayo, inmunoensayo ELISA, radioinmunoensayo, anticuerpos y combinaciones de los mismos.

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Preferiblemente, dicha expresion se determina detectando la presencia o ausencia de metilacion de CpG dentro de dicho gen, en donde la presencia de metilacion indica la presencia de un carcinoma.

La materia de la divulgacion es ademas un metodo para la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata en un sujeto, que comprende poner en contacto el ADN genomico aislado de una muestra biologica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o serie de reactivos que distinguen entre dinucleotidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una region objetivo del ADN genomico, en donde la region objetivo comprende, o hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia de al menos 16 nucleotidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65, respectivamente, en donde dichos nucleotidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleotido CpG, y en el que la deteccion de carcinoma es, producida al menos en parte.

La materia de la divulgacion es ademas un metodo para la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata, que comprende:

a) extraer o de otra manera aislar el ADN genomico de una muestra biologica obtenida del sujeto; b) tratar el ADN genomico de a), o un fragmento del mismo, con uno o mas reactivos para convertir las bases de citosina que estan sin metilar en la posicion 5 del mismo en uracilo o en otra base que es detectable diferente a la citosina en terminos de propiedades de hibridacion ;

c) poner en contacto el ADN genomico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificacion y al menos un cebador que comprende, una secuencia contigua de al menos 9 nucleotidos que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5-20; 66-181, y complementos de las mismas, en donde el ADN genomico tratado, o el fragmento del mismo o bien se amplifica para producir al menos un amplificado, o no se amplifica; y

d) determinar, basandose en una presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado de metilacion o nivel de al menos un dinucleotido CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65, o un promedio, o un valor que refleja un estado de metilacion promedio o el nivel de una pluralidad de dinucleotidos CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65, en donde al menos uno de la deteccion y el diagnostico de cancer, es producido al menos en parte.

Preferiblemente, el tratamiento del ADN genomico, o el fragmento del mismo en b), comprende el uso de un reactivo seleccionado del grupo que comprende de bisulfito, sulfito de hidrogeno, bisulfito, y combinaciones de los mismos.

Preferiblemente, poner en contacto o amplificacion de c) comprende el uso de al menos un metodo seleccionado del grupo que comprende: el uso de una polimerasa de ADN resistente al calor como la enzima de amplificacion; uso de una polimerasa que carece de la actividad de 5'-3' exonucleasa; uso de una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR); generacion de una molecula de acido nucleico de amplificacion que lleva un marcador detectable.

Preferiblemente, la muestra biologica obtenida del sujeto se selecciona del grupo que comprende las lmeas celulares, cortes histologicos, biopsias, tejido embebido en parafina, fluidos corporales, eyaculado, eyaculado, orina, plasma sangumeo, suero sangumeo, sangre entera, celulas sangumeas aisladas, celulas aisladas de la sangre y combinaciones de los mismos.

Preferiblemente, el metodo comprende, ademas, en la etapa d) el uso de al menos una molecula de acido nucleico o molecula de acido nucleico peptfdico que comprende en cada caso una secuencia contigua de al menos 9 nucleotidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5-20; 66-181, y complementos de las mismas, en donde dicha molecula de acido nucleico o molecula de acido nucleico peptfdico suprime la amplificacion del acido nucleico al que se hibrida.

Preferiblemente, la determinacion en d) comprende la hibridacion de al menos una molecula de acido nucleico o molecula de acido nucleico peptfdico en cada caso que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleotidos de longitud que es complementaria a, o se hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5-20; 66-181, y complementos de las mismas.

Preferiblemente, al menos uno de tales moleculas de acido nucleico de hibridacion o molecula de acido nucleico peptfdico se enlaza a una fase solida.

Preferiblemente, el metodo comprende ademas extender al menos una tal molecula de acido nucleico hibridado por al menos una base de nucleotidos.

Preferiblemente, la determinacion en d), comprende la secuenciacion del amplificado.

Preferiblemente, poner en contacto o amplificacion en c), comprende el uso de cebadores espedficos de metilacion.

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La materia de la divulgacion es ademas un metodo para la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata, que comprende:

a) extraer o de otra manera aislar ADN genomico de una muestra biologica obtenida del sujeto; b) digerir el ADN genomico de a), o un fragmento del mismo, con una o mas enzimas de restriccion sensibles a la metilacion;

c) poner en contacto la digestion con enzimas de restriccion de ADN de b), con una enzima de amplificacion y al menos dos cebadores adecuados para la amplificacion de una secuencia que comprende al menos un dinucleotido CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4,37-65;

d) determinar, sobre la base de una presencia o ausencia de un amplificado el estado de metilacion o nivel de al menos un dinucleotido CpG de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4, 37-65, en el que al menos uno de detectar y clasificar el cancer, es producido, al menos en parte.

Preferiblemente, la presencia o ausencia de un amplificado se determina por medio de la hibridacion con al menos un acido nucleico o acido nucleico peptfdico que es identico, complementario, o se hibrida bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento de al menos 16 bases de largo de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4; 37-65.

La materia de la divulgacion es ademas un acido nucleico tratado para su uso en la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata derivados de SEQ ID NO: 1-4, 37-65 genomicos en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genomico en uracilo u otra base que es detectable diferente a la citosina en terminos de hibridacion.

La materia de la divulgacion es ademas un acido nucleico para uso en la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata, que comprende al menos 9 o al menos 16 nucleotidos contiguos de una secuencia de ADN genomico tratado seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5-20, 66- 181, y las secuencias complementarias de las mismas, en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genomico seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4, 37-65 a uracilo u otra base que es detectable diferente a la citosina en terminos de hibridacion.

La materia de la divulgacion es ademas un acido nucleico para uso en la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata, que comprende al menos 50 nucleotidos contiguos de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5-20, 66 a 181, y secuencias complementarias de las mismas .

Preferiblemente, la secuencia de bases contiguas comprende al menos una secuencia de dinucleotido CpG, TpG o CpA.

La materia de la divulgacion es ademas un acido nucleico para uso en la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata, que comprende al menos 9 o al menos 16 nucleotidos contiguos de una secuencia de ADN genomico tratado seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5-20, 66-181 y las secuencias complementarias de las mismas como medios de diagnostico.

La materia de la divulgacion es ademas un kit adecuado para la determinacion del nivel de expresion mediante la deteccion de la presencia, ausencia o nivel de ARNm transcrito a partir de un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF 13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2), que comprende

a) una pluralidad de oligonucleotidos o polinucleotidos capaces de hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas a los productos de transcripcion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2);

(b) un recipiente adecuado para contener los oligonucleotidos o polinucleotidos y una muestra biologica del paciente, que comprende los productos de transcripcion en donde los oligonucleotidos y polinucleotidos pueden hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas a los productos de la transcripcion;

(c) medios para detectar la hibridacion de (b); y opcionalmente

(d) instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit.

La materia de la divulgacion es ademas un kit adecuado para la determinacion del nivel de expresion mediante la deteccion de la presencia, ausencia o nivel de un polipeptido codificado por un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D;

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CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF1 3; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2), o la secuencia de los mismos, que comprende

(a) un medio para detectar polipeptidos de un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; LTD 1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2);

(b) un recipiente adecuado para contener los dichos medios y la muestra biologica del paciente, que comprende los polipeptidos en donde los medios pueden formar complejos con los polipeptidos; (c) un medio para detectar los complejos de (b).

La materia de la divulgacion es ademas un kit adecuado para determinar el nivel de expresion mediante la deteccion de la presencia o ausencia de metilacion de CpG dentro de un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF1 3; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2), en donde la presencia de metilacion indica la presencia de un carcinoma, que comprende

(a) un reactivo de bisulfito;

(b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biologica del paciente;

(c) al menos un conjunto de oligonucleotidos que contienen dos oligonucleotidos cuyas secuencias en cada caso son identicas, son complementarias, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento de 9 o mas preferiblemente 18 bases de largo de una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 5-20, 66-181.

La materia de la divulgacion es, ademas, un kit adecuado para determinar el nivel de expresion mediante la deteccion de la presencia o ausencia de metilacion de CpG dentro de un gen seleccionado del grupo que consiste de RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C;

PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; M0BKL2B; IFL TD1 (KRAS); ANXA2; NFATC3; MN1; KLF8; FGF 13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION DE INTRON 1 Y/O EXON 2 ), en donde la presencia de metilacion indica la presencia de un carcinoma, que comprende

(a) un reactivo de enzima de restriccion sensible a la metilacion;

(b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biologica del paciente;

(c) al menos un conjunto de oligonucleotidos de uno o una pluralidad de acidos nucleicos o de acidos nucleicos peptfdicos que son identicos, son complementarias, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento de al menos 9 bases de longitud de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1-4, 37-65; y opcionalmente

(d) instrucciones para el uso y la interpretacion de los resultados del kit.

La materia de la divulgacion es ademas el uso de un metodo descruto aqrn, un acido nucleico y/o un kit descrito aqrn en el diagnostico y/o la deteccion de trastornos proliferativos de celulas de prostata.

Ejemplo 1

El objetivo del presente estudio fue determinar la viabilidad de la medicion de marcadores de metilacion de ADN para el cancer de prostata (de aqrn en adelante tambien denominado como PCa) en los fluidos corporales remotos. En este proceso se utilizo un flujo de circuito de produccion de alta calidad para la orina, los marcadores candidatos se analizaron mediante la tecnologfa de Heavy Metal™ (HM) (Cottrell et al., Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13;32(1):elO) y se demostro que PCa desprende ADN que puede ser detectado por medio de analisis de metilacion tanto en plasma como en orina con alta sensibilidad. Asf, se establecio que los marcadores analizados eran adecuados para el desarrollo de una prueba de deteccion para PCa con base en el analisis de metilacion del ADN.

Objetivos del estudio

El proposito del presente estudio fue realizar una investigacion sobre si los marcadores de metilacion del ADN de PCa pueden medirse en un fluido corporal remoto. El estudio fue disenado para identificar el analito optimo para tal prueba y para generar datos de especificidad y de rendimiento analftico para candidatos marcadores.

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Marcadores candidatos y localizacion de los ensayos

Los marcadores RASSF2 y TFAP2E se identificaron sobre la base de su metilacion en tejidos de cancer de prostata, tal como se determino en un estudio preliminar (no descrito aqm). Los marcadores GSTPi y HIST1H4K hadan sido identificados previamente en un estudio realizado por el solicitante segun lo publicado en la solicitud de patente WO 2005/054517.

El analisis de metilacion se realizo por medio de HeavyMethyl™. El genomico aislado es bisulfito tratado para convertir las citosinas no metiladas en uracilo, en donde las citosinas metiladas se conservan. Los fragmentos del ADN tratado con bisulfito que comprenden dinucleotidos CpG metilados potencialmente se amplifican entonces por medio de PCR. Los cebadores no cubren ninguna de las posiciones de citosina potencialmente metiladas (es decir, no se hibridan con los dinucleotidos CpG genomicos). La amplificacion de fragmentos que comprenden los dinucleotidos CpG no metilados se suprime por medio de un oligonucleotido de bloqueo que se hibrida a dinucleotidos TG. De acuerdo con lo anterior solamente el ADN que fue metilado en la muestra genomico se amplifica. Los fragmentos amplificados se detectan por medio de sondas marcadas de forma detectable adecuadas para uso en reacciones de pCr tal como sondas de deteccion en tiempo real. El cebador de ensayo y las sondas se proveen en el listado de secuencias de acompanamiento como se acuerdan con la Tabla 2.

GSTPi

Ubicacion Cromosomica: 11q13

Gen(es) Cercano(s): el cebador de avance GSTPi HM esta justo corriente arriba del exon 1 y el cebador de retroceso esta justa corriente abajo del exon I de GSTP1.

RASSF2A

Ubicacion Cromosomica: 20pter-P12.1

Gen(es) Cercano(s): w/i la isla CpG del intron 1 del v. 1 transcripto de RASSF2.

HIST1H4K

Ubicacion Cromosomica: 6p22-21.3

Gen(es) Cercano(s): intrones superpuestos H1ST1H4K

TFAP2E

Ubicacion Cromosomica: 1p34.3

Gen(es) Cercano(s): w/i intron 3 de TFAP2E (~ 11 kb corriente abajo del inicio de txn) y ~ 20 kb corriente arriba del inicio txn de KIAA0319L (PKD-1 como gen).

Estudio de tejido

Los ensayos se probaron inicialmente en tejidos normales, NAT y PCa. Los candidatos marcadores que fueron analizadas en la prueba de tejido HM eran todos muy espedficos para la sangre normal y el tejido normal de la prostata. En contraste con estudios anteriores se observo que el ADN del tumor adyacente normal de la prostata (NAT) es casi tan metilado como ADN de tumor de prostata. El NAT (que puede contener BPH) es claramente distinto del tejido de BPH que se ha derivado de los pacientes que no portan tumores prostaticos sin PSA elevado (el origen de muchas muestras de tejido BPH en la prueba de tejido MSP). De hecho, existe evidencia en la literatura que GSTP1 en NAT es metilado (Hanson et al., 2006).

El rendimiento de los marcadores en normal + BPH en comparacion con PCa se provee en la Tabla 3 y la Figura 1. Analisis de analitos remotos

Con el fin de maximizar el equivalente analito en ensayos de PCR en tiempo real (1.5 ml equivalentes), el numero maximo de ensayos en el estudio fue limitado a cuatro, con cada ensayo ejecutado por duplicado para cada muestra.

Coleccion de muestra

Para este estudio, los inventores recolectaron plasma coincidente y orina de un total de 191 hombres, entre ellos 91 hombres con cancer de prostata confirmado por biopsia, 51 hombres sin cancer detectado por biopsia (posteriormente diagnosticados con BPH), y 50 jovenes hombres asintomaticos. En todos los analisis, la clase positiva se compone de

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las muestras de PCa. En el diseno del presente estudio, la definicion de la clase negativa fue un problema ya que no existe un metodo de deteccion que excluye la presencia de PCa con un 100% de certeza. La biopsia tiene una tasa de diagnostico falso negativo de al menos 10%, (Djavan et al., 2000; Mian et al., 2002; Gupta et al., 2005; Hanley et al., 2006), mientras que la medicion de PSA es propensa tanto a falsos negativos como a falsos positivos. Puesto que el objetivo principal del estudio fue demostrar la viabilidad de la medicion de marcadores metilados de PCa en un fluido corporal remoto, los inventores se centraron en una clase negativa que minimizara la probabilidad de falsos positivos. En consecuencia, los hombres jovenes asintomaticos fueron elegidos como la clase negativa "verdadera". Se razono que los jovenes hombres asintomaticos sin historia familiar de cancer de prostata debfan ser verdaderamente negativos para PCa. Puesto que una realizacion de la prueba de PCa es como una continuacion de diagnostico para PSA, los inventores tambien incluyeron una segunda clase negativa de biopsia negativa, muestras de BPH. Un factor de confusion potencial en esta clase es la probable presencia de biopsias falsas negativas. En cinco casos de PCa, solamente se recolecto una muestra de plasma y en diez casos adicionales solamente se recolecto una muestra de orina. Las muestras se recolectaron en multiples sitios. La orina se recolecto despues de un masaje prostatico, las muestras tanto de plasma como de orina se obtuvieron antes de cualquier tratamiento para PCa. Los criterios de inclusion y exclusion fueron disenados para asegurar que los pacientes analizados reflejaran los pacientes potenciales que usanan las pruebas de deteccion de PCa.

Los siguientes criterios de inclusion y exclusion se aplicaron a los pacientes sometidos a biopsia:

Criterios de inclusion:

- Indicacion de biopsia (PSA elevado y/o DRE sospechoso)

- Biopsia programada dentro de 1 semana despues de la recoleccion de muestras

- Edad 40-80 Criterios de exclusion:

Cualquier tratamiento previo para el cancer de prostata Antecedentes de cancer o enfermedad grave en los ultimos 5 anos Smtomas de infeccion del tracto urinario

Los siguientes criterios aplicados a los hombres asintomaticos del grupo de control:

Criterios de inclusion:

- Masculino

- Edad 18-30 Criterio de exclusion:

Cualquier tratamiento previo para o smtomas de cancer de prostata o enfermedad de la prostata Antecedentes de cancer o enfermedad grave en los ultimos 5 anos Smtomas de infeccion del tracto urinario Datos del paciente y caractensticas del tumor

La puntuacion de Gleason (cuando sea apropiado) de las muestras de los pacientes se listan en Tabla 4. Los valores medios de PSA para el cancer de prostata, las muestras negativas de HGPlN y biopsias fueron 18,2 ±33,1, 7,0 ± 3,0 y 8,8 ± 5,2 respectivamente. Las clases negativas de cancer de prostata, hGpIN y biopsias fueron diagnosticadas despues de la recoleccion de la muestra a traves de una biopsia de prostata. El numero medio de nucleos de biopsia para todas las clases de muestra fue de 8, aunque hubo algunas variaciones entre los proveedores.

La extraccion de ADN y tratamiento con bisulfito se llevo a cabo de acuerdo con protocolos estandarizados. Para cada ensayo, 1,5 ml de analito equivalente se llevo a cabo por duplicado.

Rendimiento del marcador, Consideraciones generales

El objetivo inicial del estudio fue desarrollar un panel de marcadores espedficos como una continuacion de diagnostico para las pruebas de PSA de 2,5 ng/ml o mas para hombres mayores de 50 anos de edad para discriminar el cancer de prostata a partir de condiciones no cancerosas. Tal prueba podna ampliarse aun mas como una prueba de

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deteccion del cancer de prostata mas espedfica que competina con la prueba de PSA debido a un rendimiento superior. En el presente estudio, los inventores analizaron los datos de dos maneras diferentes: (i) los inventores utilizaron muestras de cancer de prostata y biopsia negativa para evaluar el desempeno marcadores en el seguimiento a prueba de PSA (aplicacion de diagnostico) y (ii) los inventores utilizaron muestras de cancer de prostata y todas las de no cancer (biopsia negativa y asintomatica) para medir el desempeno de los marcadores en pruebas de deteccion (aplicacion de deteccion). Los inventores reportan ejecucion del marcador para plasma y orina por separado, los inventores tambien proveen un analisis de datos de marcadores individuales y paneles marcadores. Todos los datos se presentan como valores de metilacion sin procesar de media logantmica.

Como prueba de seleccion primaria, el panel de marcadores identificana preferiblemente PCa en hombres mayores de 50 anos de edad con especificidad mejorada en relacion con PSA. Todos los analisis de aplicacion de deteccion utilizan las muestras de PCa, como la clase positiva. Para los propositos del presente estudio, los inventores analizaron los datos para la aplicacion de seleccion con dos clases negativas alternativas. La primera clase negativa analizo los 50 hombres jovenes asintomaticos con probabilidad minima de PCa no detectado. Si bien esta clase negativa representa una prueba negativa "verdadera", no son coincidentes en edad con la poblacion de seleccion PCa objetivo y no incluye ninguna clase de falso positivo probable, por ejemplo, BPH. Por lo tanto, los inventores llevaron a cabo un segundo analisis en el que se analizaron todos los 50 controles de jovenes asintomaticos y todos los 51 controles negativos de biopsia como una clase negativa de tamano de la muestra 101.

En promedio, aproximadamente 20,000,000 pruebas de PSA se llevan a cabo cada ano en los EE.UU., con solo aproximadamente 1,000,000 casos que avanzan a la biopsia (de las cuales aproximadamente 750,000 biopsias son innecesarias). Por lo tanto, menos del 5% de los individuos que actualmente son seleccionados por PSA caen en la clase negativa que esta representada por positivo de PSA BPH - elevado mientras que la gran mayona de poblacion de seleccion objetivo cae en la clase negativa por bajo PSA. Mientras que la clase negativa de solamente hombres jovenes asintomaticos puede representar una sobreestimacion de la capacidad discriminatoria de nuestros marcadores, la clase negativa combinada de hombres jovenes asintomaticos, mas los hombres de la misma edad con biopsia negativa pueden representar una subestimacion de la capacidad discriminatoria de nuestros marcadores.

La sensibilidad y la especificidad de los marcadores individuales (unico) probados por PCR en tiempo real en la orina posterior al masaje a la prostata de pacientes con cancer de prostata en comparacion con los pacientes negativos de biopsia y los individuos de control asintomaticos se muestran en la Tabla 5. La Figura 2 muestra los ensayos de PCR en tiempo real HM de la orina posterior a masajes prostaticos de PCa y la clase I negativa (individuos asintomaticos). La figura 3 muestra en los ensayos de PCR en tiempo real HM de orina posterior a masajes prostaticos de PCa y la clase II negativa (individuos asintomaticos mas negativos de biopsia).

La sensibilidad y la especificidad de los marcadores individuales (unicos) ensayados por PCR en tiempo real en plasma de pacientes con cancer de prostata en comparacion con los pacientes negativos de biopsia y los individuos de control asintomaticos se muestran en la Tabla 6. La Figura 4 muestra los ensayos de PCR en tiempo real HM de plasma de PCa y la clase I negativa (individuos asintomaticos). La Figura 5 muestra los ensayos de pCr en tiempo real HM de plasma de PCa y la clase II negativa (individuos asintomaticos mas negativos de biopsia) de clase negativa. La figura 6 muestra el rendimiento de los ensayos de biomarcadores para la discriminacion de pacientes con PCa de hombres jovenes asintomaticos en la orina y plasma. La Figura 7 muestra el rendimiento de los ensayos de biomarcadores para la discriminacion de PCa de pacientes negativos de biopsia en la orina y plasma.

Como se ilustra en la Tabla 7, en todas las comparaciones de clase negativa y para todos los marcadores, la orina fue el analito mas sensible.

Correlacion de los marcadores con la puntuacion de Gleason

Cantidades crecientes de ADN de marcador metilado correlacionadas con el incremento de la puntuacion de Gleason para todos los marcadores en el plasma. Esto fue cierto para las muestras con altas cantidades de ADN de marcador metilado en la orina (vease especialmente marcadores TFAP2E y RASSF2A), pero en general la correlacion fue menos fuerte en el ADN de la orina que en ADN de plasma. PSA como marcador de PCa en pacientes con PSA elevado (> 4 ng/ml) tambien se correlaciona con el aumento de la puntuacion de Gleason.

Se provee el rendimiento de los paneles de marcadores de seleccion para distinguir el PCa de la clase I negativa I (hombres asintomaticos) en la orina en la Tabla 8.

Se provee el rendimiento de los paneles de marcadores de seleccion para distinguir el PCa de la clase II negativa (hombres asintomaticos y biopsia negativa) en la orina en la Tabla 9.

Se provee el rendimiento de los paneles de marcadores de seleccion para distinguir el PCa de la clase I negativa (hombres asintomaticos) en el plasma en la Tabla 10.

Se provee el rendimiento de los paneles de marcadores de seleccion para distinguir el PCa de la clase II negativa (hombres asintomaticos mas biopsia negativa) en el plasma en la Tabla 11.

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Rendimiento del marcador en aplicaciones de diagnostico: Seguimiento a PSA

Como un seguimiento del diagnostico para la prueba de PSA, los marcadores identificanan preferiblemente PSA en hombres mayores de 50 anos que han sido clasificados como individuos de alto riesgo debido a PSA elevado (> 2.5 ng/ml). Esta es una aplicacion y analisis distinto y requiere una mayor discriminacion en comparacion con la prueba de seleccion. Los positivos falsos en esta aplicacion se derivan de la PSA elevado, clase de BPH negativo en biopsias. Una vez mas, las muestras de PCa representan la clase positiva. Para los propositos de una aplicacion de seguimiento del diagnostico, los inventores analizaron los datos utilizando una clase negativo unica compuesta por las 51 muestras negativas de biopsia. Las AUC de marcadores probados por PCR en tiempo real en la orina posterior a masaje prostatico y plasma de pacientes con cancer de prostata y pacientes negativos de biopsia se proveen en la Tabla l2.

A partir de dicha tabla se puede ver que para todos los marcadores de metilacion analizados, la orina fue el mas sensible analito. Para el PSA total (tratado aqu como un marcador adicional para determinar si hay alguna informacion adicional provista pasada la indicacion de > 4 ng/ml para la biopsia), no hubo diferencia en la sensibilidad entre la orina y plasma.

Rendimiento de los paneles de marcadores

Con el fin de proveer una precision mejorada, las combinaciones de marcadores se establecieron tanto cualitativa como cuantitativamente.

La Tabla 13 provee el rendimiento de los paneles de marcadores de diagnostico para distinguir PCa de biopsia negativa en la orina.

La Tabla 14 provee el rendimiento de los paneles de marcadores de diagnostico para distinguir PCa de biopsia negativa en el plasma.

Discusion

El estudio se realizo sobre muestras de plasma y/o de orina de 91 pacientes con PCa, 51 pacientes de biopsia negativa (con diagnostico de BPH) y 50 hombres jovenes asintomaticos. Se utilizaron ensayos de PCR en tiempo real HM™ para medir la metilacion del ADN de los marcadores candidatos. La cantidad de ADN de marcador metilado se correlaciono con PCa tanto en plasma como en orina, con el ADN de orina que muestra una mayor sensibilidad. Como prueba de seleccion (discriminacion de cancer de PCa de controles asintomaticos utilizando analito en orina), los candidatos marcador de anclaje GSTPi, RASSF2A, HIST1H4K y TFAP2E tienen 63%, 74%, 69% y 47% de sensibilidad al 96% de especificidad, respectivamente. Como seguimiento del diagnostico para pruebas PSA (discriminacion de PCa de los controles negativos de biopsia, todas con PSA elevado), los marcadores tienen 23%, 18%, 28% y 23% de sensibilidad al 95% de especificidad, respectivamente. Un panel de seleccion cuantitativo de marcadores RASSF2A y HIST1H4K produjeron sensibilidad del 94% a 88% de especificidad en contra de individuos asintomaticos. Un panel de diagnostico cuantitativo de marcadores GSTPi y PSA produjo sensibilidad del 83% a 45% de especificidad. El rendimiento de estos marcadores se compara bien con el rendimiento de PSA (sensibilidad del 18% en 98% de especificidad para hombres < 60 anos y 19% de sensibilidad al 94% de especificidad para hombres > 60 anos) en la poblacion de seleccion (Punglia et al., 2003). La metilacion de todos los marcadores se correlaciono bien con la puntuacion de Gleason en el ADN de plasma, pero la correlacion fue menos fuerte en el ADN de la orina.

Conclusiones

A la finalizacion de la presente investigacion, se demostro que los biomarcadores de cancer de prostata basados en ADN metilado se pueden medir en plasma y en orina, con el ADN de orina que muestra una mayor sensibilidad que el de plasma. Ademas, se identificaron marcadores de metilacion del ADN que discriminan pacientes con PCa de controles asintomaticos y aquellos con hiperplasia prostatica benigna (BPH). Las conclusiones principales de este estudio son las siguientes:

1. Marcadores metilados de cancer de prostata pueden ser medidos en plasma y orina de pacientes con PCa.

2. Identificacion de marcadores que discriminan a los pacientes con PCa de aquellos sin PCa.

Ejemplo 2

El objetivo del presente estudio fue determinar la sensibilidad y especificidad de los marcadores de metilacion del ADN para el cancer de prostata (en lo sucesivo, tambien denominado como PCa) en los tejidos. En este estudio, se analizaron 84 PCa, 34 BPH y 35 tejidos normales de la prostata utilizando ensayos de PCR en tiempo real de alta sensibilidad. Por lo tanto, se establecio que los marcadores analizados fueron adecuados para el desarrollo de una prueba de seleccion del PCa con base en analisis de metilacion de ADN.

Objetivos del estudio

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El proposito del presente estudio fue validar en un conjunto de muestras independientes los marcadores de metilacion de ADN de PCa identificados por nuestra tecnologfa de descubrimiento de microarreglos. El estudio fue disenado para generar datos de especificidad y de desempeno analttico para los marcadores candidatos.

Introduccion: Un biomarcador de deteccion del PCa con la capacidad de diagnostico para discriminar PCa de la hiperplasia prostatica benigna (BPH) en pacientes con PSA elevado ofrecena una valiosa herramienta para la administracion de salud publica del PCa. La metilacion del ADN aberrante se produce al principio en la tumorigenesis, es estable, y se puede ensayar en los tejidos y fluidos corporales, haciendolos objetivos de candidatos de biomarcadores atractivos de metilacion de ADN aberrante. Los inventores han demostrado previamente que la hipermetilacion de GSTP1 puede ser detectada en la orina de pacientes con PCa y sirve como un marcador sensible para la identificacion temprana de PCa. Los inventores ahora han llevado a cabo una pantalla ancha de genoma para identificar marcadores que aumentan la especificidad de la deteccion de PCa en muestra remota en un entorno de diagnostico.

Metodos: microarreglos de Affymetrix personalizados con> 50,000 caractensticas se utilizaron para explorar las diferencias de metilacion entre PCa (n=20), BPH (n=17) y los tejidos normales (n = 12) de edades coincidentes. Se descartaron los marcadores con >25% de metilacion mediana en el cancer de vejiga. Los marcadores fueron clasificados por estadfstica de p, la mediana de % de metilacion de PCa y la mediana de % de metilacion de BPH. Los mejores candidatos fueron escogidos para el desarrollo del ensayo de PCR en tiempo real y validados utilizando PCa (n = 84), BPH (n = 34) y los tejidos normales (n = 35) de edades coincidentes.

Resultados: La comparacion produjo un gran numero de marcadores estadfsticamente significativos despues de la correccion de Bonferroni: 145 marcadores para PCa vs. BPH y normales, 148 marcadores para PCa vs. normales, 121 marcadores para PCa vs. BPH, y 61 marcadores para PCa vs. BPH asociados con valores de PSA de > 4 ng/ml. Los 38 mejores marcadores fueron escogidos para el desarrollo del ensayo de PCR en tiempo real. Los resultados del analisis de PCR en tiempo real sobre el tejido de la prostata (Tabla 16) validaron los marcadores y revelaron 4 categonas de marcador: alta sensibilidad y alta especificidad para PCa, alta especificidad pero baja sensibilidad debido a la baja PMR mediana en PCa, alta especificidad pero baja sensibilidad debido a la metilacion de fondo en BPH y, finalmente, los marcadores que se pueden correlacionar con las caractensticas de PCa agresivo. Los resultados de rendimiento para los marcadores seleccionados se muestran en las Figuras 8-20.

Conclusiones

A la finalizacion de la presente investigacion, se demostro que los inventores identificaron biomarcadores de cancer de prostata con base en el ADN metilado que son altamente espedficos y sensibles para PCa. Adicionalmente, se identifico al menos un marcador de metilacion de ADN que discrimina pacientes con PCa de alta puntuacion Gleason (Gleason 8-10) a partir de tejidos benignos (GPR68, vease la Figura 10). Las principales conclusiones del presente estudio son las siguientes:

1. Los inventores han identificado varios marcadores de metilacion de ADN previamente no descritos de PCa.

2. Varios de estos marcadores muestran un rendimiento al menos equivalente a GSTP1 para discriminar los tejidos de PCA de tejidos de BPH.

3. Los inventores han identificado marcadores que pueden distinguir PCa patologicamente agresivo de PCa indolente.

Tabla 1: Genes y secuencias de acuerdo con la presente invencion

Gen

SEQ ID NO: Genomicas Cadena en sentido convertida por bisulfito metilado Cadena antisentido convertida por bisulfito metilado Cadena en sentido convertida por bisulfito no metilado Cadena antisentido convertida por bisulfito no metilado

RASSF2A

1 5 6 13 14

TFAP2E

2 7 8 15 16

HIST1H4K

3 9 10 17 18

GSTPi

4 11 12 19 20

MME

37 66 67 124 125

RARB

38 68 69 126 127

NKX3-1

39 70 71 128 129

NPAL3

40 72 73 130 131

ACVR2A

41 74 75 132 133

ARL4C

42 76 77 134 135

PDE4D

43 78 79 136 137

CARTPT

44 80 81 138 139

HIST1H2BD

45 82 83 140 141

CUL1

46 84 85 142 143

MOBKL2B

47 86 87 144 145

IFLTD1; KRAS 48

00 88 89 146 147

ANXA2

49 90 91 148 149

NFATC3

50 92 93 150 151

NFATC3

51 94 95 152 153

MN1

52 96 97 154 155

KLF8

53 98 99 156 157

FGF13

54 100 101 158 159

NKX2-6

55 102 103 160 161

SPG20

56 104 105 162 163

DSE/SART2

57 106 107 164 165

GJA1 (aka CX43)

cn 00 108 109 166 167

GJA1 (aka CX43)

cn CD 110 111 168 169

SPARTA6

60 112 113 170 171

MCC

61 114 115 172 173

GPR68 (region de Intron)

62 116 117 174 175

Tabla 2: Componentes de ensayo de acuerdo con el Ejemplol

Gen

Cebador de avance Cebador de retroceso Bloqueador Oligo de deteccion

GSTPi

21 22 23 24

HIST1H4K

25 26 27 28

RASSF2A

29 30 31 32

TFAP2E

34 35 36 37

Tabla 3: Analisis de rendimiento de los marcadores (normal mas BPH vs. PCa) en prueba de tejido de acuerdo con el 5 Ejemplo 1.

Marcador

AUC Sensibilidad Especificidad

GSTPi

0.90 0.83 0.91

HIST1H4K

0.91 0.83 0.91

RASSF2A

0.93 0.75 0.91

TFAP2E

NA NA NA

Tabla 4: Muestras remotas de acuerdo con el Ejemplo 1.

Tipo de muestra

No. de muestras

Cancer de Prostata - Puntaje de Gleason

4

1

5

5

6

33

7

39

8

8

9

4

Puntaje no disponible

1

Cancer de prostata total:

91

Biopsia Negativa

51

Control asintomatico

50

Tabla 5: Sensibilidad y especificidad de marcadores individuales probados por PCR en tiempo real en la orina posterior 5 a masaje a la prostata de pacientes con cancer de prostata, pacientes con biopsia negativa e individuos de control asintomaticos.

Marcador

Clase I Negativa: Asintomatica Clase II Negativa: Asintomatica + Biopsia(-)

AUC

Sens/Espec Valor p de Wilcoxon AUC Sens/Espec Valor p de Wilcoxon

GSTPi

0.89 0.63 / 0.96 0 0.79 0.31 / 0.96 0

RASSF2A

0.90 0.74 / 0.96 0 0.79 0.24 / 0.96 0

HIST1H4K

0.91 0.69 / 0.96 0 0.77 0.36 / 0.96 0

TFAP2E

0.86 0.47 / 0.96 0 0.77 0.27 / 0.96 0

Tabla 6: Sensibilidad y Especificidad de marcadores individuales probados por PCR en tiempo real en plasma de pacientes con cancer de prostata, pacientes con biopsia negativa e individuos de control asintomaticos.

Marcador

Clase I Negativa: Asintomatica Clase II Negativa: Asintomatica + Biopsia(-)

AUC

Sens/Espec Valor p de Wilcoxon > c o Sens/Espec Valor p de Wilcoxon

GSTPi/ GSTP1

0.61 0.17 / 0.96 0.0063 0.58 0.17 / 0.95 0.0183

RASSF2A

0.68 0.37 / 1.00 0 0.64 0.20 / 0.95 0

HIST1H4K

0.64 0.26 / 0.96 5e-04 0.56 0.16 / 0.95 0.0572

TFAP2E

0.61 0.22/1.00 4e-04 0.56 0.09 / 0.95 0.0128

Tabla 7.

Marcador

Clase I Negativa: Asintomatica Clase II Negativa: Asintomatica + Biopsia(-)

AUC de Orina

AUC de Plasma AUC de Orina AUC de Plasma

GSTPi/ GSTP1

0.89 0.61 0.69 0.55

RASSF2A

0.90 0.68 0.66 0.60

HIST1H4K

0.91 0.64 0.64 0.50

TFAP2E

0.86 0.61 0.65 0.52

Tabla 8: Rendimiento de los paneles de marcadores de seleccion para distinguir PCa de la Clase I negativa (hombres asintomaticos) en orina

Panel de Marcador

% de Sens PCa % de Espec Asintomatico

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

74 96

HIST1H4K

69 96

GSTPi

63 96

TFAP2E

46 100

Paneles Cualitativos:

GSTPi+HIST1H4K

79 98

RASSF2A+HIST1H4K

94 88

Paneles Cuantitativos:

RASSF2A+HIST1H4K

94 88

quadSVM (todos los marcadores, sin PSA)

79 98

5

Tabla 9

Panel de Marcador

% de Sens PCa % de Espec Asintomatico + Biopsia(-)

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

74 76

HIST1H4K

69 68

GSTPi

63 80

TFAP2E

46 88

Paneles Cualitativos:

GSTPi+HIST1H4K

79 72

RASSF2A+HIST1H4K

94 54

Paneles Cuantitativos:

RASSF2A+HIST1H4K

94 58

quadSVM (todos los marcadores, sin PSA)

79 76

Tabla 10: Rendimiento de los paneles de marcadores de seleccion para distinguir PCa de la Clase I Negativa (hombres asintomaticos) en plasma

Panel de Marcador

% de Sens PCa % de Espec Asintomatico

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

37 100

HIST1H4K

26 96

GSTPi

17 94

TFAP2E

22 100

Paneles cualitativos:

RASSF2A+HIST1H4K

41 98

Paneles cuantitativos:

RASSF2A+TFAP2E (TFAP2E usado para normalizar)

CM CO 100

quadSVM (todos los marcadores, sin PSA)

39 96

Tabla 11

Panel de Marcador

% de Sens PCa % de Espec Asintomatico + Biopsia(- )

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

37 91

HIST1H4K

26 88

GSTPi

17 95

TFAP2E

22 92

Paneles cualitativos:

RASSF2A+HIST1H4K

41 88

Paneles cuantitativos:

RASSF2A+TFAP2E (TFAP2E usado para normalizar)

32 92

quadSVM (todos los marcadores, sin PSA)

39 94

5

Tabla 12

Marcador

PCa vs. Biopsia(-)

AUC de Orina

AUC de Plasma

GSTPi/ GSTP1

0.69 0.55

RASSF2A

0.66 0.60

HIST1H4 K

0.64 0.50

TFAP2E

0.65 0.52

***p SA

0.56 0.56

*** Comprueba si el PSA contiene informacion adicional mas alia de lo aportado por el corte de indicacion > 4 ng/ml para biopsia de prostata.

Tabla 13

Panel de Marcador

% de Sens PCa % de Espec Biopsia(-)

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

74 55

HIST1H4K

69 41

GSTPi

63 64

TFAP2E

46 77

Paneles Cualitativos:

GSTPi+HIST1H4K

79 46

RASSF2A+HIST1H4K

94 21

Paneles cuantitativos:

RASSF2A+HIST1H4K

94 27

GSTPi+PSA

83 45

quadSVM (todos los marcadores sin PSA)

79 55

Tabla 14

Panel de Marcador

% de Sens PCa % de Espec Biopsia(-)

Marcadores individuales cuantitativos:

RASSF2A

37 82

HIST1H4K

26 79

GSTPi

17 96

TFAP2E

22 84

Paneles Cualitativos:

RASSF2A+HIST1H4K

41 79

Paneles cuantitativos:

RASSF2A+TFAP2E (TFAP2E usado para normalizar)

32 85

RASSF2A+TFAP2E+PSA (TFAP2E usado para normalizar)

94 22

quadSVM (todos los marcadores, sin PSA)

39 91

quadSVM (todos los marcadores +PSA)

48 87

Tabla 15: Componentes de ensayo de acuerdo con el Ejemplo2

Gen

SEQ ID NO: Genomicas Cebador de avance SEQ ID NO: Cebador de retroceso SEQ ID NO: Sonda de deteccion SEQ ID NO:

MME

37 182 183 184

RARB

38 185 186 187

NKX3-1

39 188 189 190

NPAL3

40 191 192 193

ACVR2A

41 194 195 196

ARL4C

42 197 198 199

PDE4D

43 200 201 202

CARTPT

44 203 204 205

HIST1H2BD

45 206 207 208

CUL1

46 209 210 211

MOBKL2B

47 212 213 214

IFLTD1; KRAS

48 215 216 217

ANXA2

49 218 219 220

NFATC3

50 221 222 223

NFATC3

51 224 225 226

MN1

52 227 228 229

KLF8

53 230 231 232

FGF13

54 233 234 235

NKX2-6

55 236 237 238

SPG20

56 239 240 241

DSE/SART2

57 242 243 244

GJA1 (aka CX43)

58 245 246 247

GJA1 (aka CX43)

59 248 249 250

SPATA6

60 251 252 253

MCC

61 254 255 256

GPR68 (Region de intron 1)

62 257 258 259

Tabla 16: AUC del ensayo de acuerdo con el Ejemplo 2

Cebador de avance SEQ ID NO:

Cebador de retroceso SEQ ID NO: Sonda de deteccion SEQ ID NO: > c o Sensibilidad Especificidad Mediana PCaPMR Mediana BPH PMR

182

183 184 0.82 [0.75, 0.88] 0.66 0.97 0,004 0

185

186 187 0.98 [0.94, 1.00] 0,98 0,95 0,523 0,001

188

189 190 0.76 [0.68, 0.82] 0.51 1.00 0.002 0

191

192 193 0.76 [0.68, 0.82] 0,51 1,00 0,002 0

194

195 196 0.92 [0.87, 0.96] 0.85 0.95 0.025 0

197

198 199 0.95 [0.90, 0.98] 0.90 0.98 0.013 0

200

201 202 0.92 [0.85,0.95] 0.82 0.95 0.212 0,001

203

204 205 0.98 [0.94,1.00] 0,96 0,95 0,718 0,012

206

207 208 0.93 [0.87,0.96] 0.84 0.95 0.154 0

209

210 211 0.71 [0.63,0.78] 0.41 1.00 0,000 0

212

213 214 0.97 [0.92,0.99] 0.96 0.95 0,218 0

215

216 217 0.75 [0.67, 0.82] 0,50 1,00 0,001 0

218

219 220 0.77 [0.69, 0.84] 0.55 0.98 0.004 0.000

221

222 223 0.98 [0.95,1.00] 0,96 0,95 0.329 0

224

225 226 0.98 [0.94,1.00] 0,96 0.95 0.317 0

227

228 229 0.98 [0.95,1.00] 0.96 0,95 0.260 0,001

230

231 232 0.98 [0.94,1.00] 0,98 0,95 0.357 0

233

234 235 0.92 [0.86, 0.96] 0.82 0,95 0.173 0

236

237 238 0.97 [0.95, 0.99] 0.95 0,95 0.187 0,002

239

240 241 0.97 [0.92,0.99] 0,93 0,95 0.297 0,001

242

243 244 0.96 [0.92,0.99] 0.94 0.97 0.089 0

245

246 247 0.95 [0.90,0.98] 0.91 0,95 0.171 0

248

249 250 0.97 [0.93, 0.99] 0.93 0,95 0.173 0,001

251

252 253 0.94 [0.89,0.97] 0.88 0.98 0.033 0

254

255 256 0.77 [0.70,0.84] 0.55 1.00 0.003 0

257

258 259 0.76 [0.68,0.82] 0.51 1.00 0.001 0.000

Ejemplo 3

El objetivo del presente estudio fue determinar la viabilidad de la medicion de biomarcadores de metilacion del ADN para el cancer de prostata (de aqm en adelante tambien denominado como PCa) en la orina posterior a masajes 5 prostatico. En este proceso se utilizo un circuito de produccion bien caracterizado para la orina y 8 biomarcadores candidatos mas GSTP1 se analizaron mediante PCR en tiempo real utilizando tanto sondas de hibridacion como

tecnolog^a HeavyMethyl™ (HM) (Cottrell et al., Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13;32(1):e10.) despues del tratamiento con bisulfito del ADN genomico (vease la Tabla 1).

Se demostro que el PCa desprende ADN que puede ser detectado por medio de analisis de metilacion en la orina con alta sensibilidad. Tambien se demostro que los biomarcadores analizados eran adecuados para el desarrollo de 5 pruebas de deteccion y de diagnostico para el PCa.

Objetivos del estudio

El proposito del presente estudio fue realizar una investigacion sobre si los biomarcadores candidatos de metilacion de ADN espedficos para PCa identificados por la hibridacion de metilacion diferencial (DMH) y validados en los tejidos de la prostata pueden medirse en la orina despues de masaje prostatico. El estudio fue disenado para generar datos 10 de rendimiento de los biomarcadores candidatos cuando se analizan individualmente y en paneles.

Biomarcadores candidatos y Localizacion de ensayos qPCR

El biomarcador GSTP1 de PCa habfa sido identificado previamente en un estudio realizado por el solicitante segun lo publicado en la solicitud de patenten WO 2005/054517. Se identificaron los 8 biomarcadores candidatos como se describe en el documento WO 2005/054517 (P185WO) y subsecuentemente validado en los tejidos de la prostata, 15 como se describe en el Ejemplo 2. Este fue el primer analisis de estos biomarcadores candidatos en la orina despues de masaje prostatico.

El analisis de metilacion se realiza por medio de PCR en tiempo real utilizando tanto sondas de hibridacion (8 biomarcadores candidatos recientemente identificados) y tecnologfa HeavyMethyl™ (biomarcador GSTP1). El ADN genomico aislado fue tratado con bisulfito para convertir las citosinas no metiladas en uracilo, en donde las citosinas 20 metiladas son conservadas. Los fragmentos del ADN tratado con bisulfito que comprenden dinucleotidos CpG metilados potencialmente se amplifican entonces por medio de PCR. Los cebadores no cubren todas las posiciones de citosina potencialmente metiladas (es decir, no se hibridan con los dinucleotidos CpG genomicos). La amplificacion de fragmentos que comprenden los dinucleotidos CpG no metilados se suprime por medio de un oligonucleotido de bloqueo que se hibrida a dinucleotidos TG. De acuerdo con lo anterior solamente el ADN que fue metilado en la 25 muestra genomico se amplifica. Los fragmentos amplificados se detectan por medio de sondas marcadas de forma detectable adecuadas para uso en reacciones de PCR tal como sondas de deteccion en tiempo real. Los cebadores de ensayo y oligos de sondas se proveen en la Tabla 2.

GSTP1

Ubicacion cromosomica: 11q13

30 Gen(es) Cercano(s): Cebador de avance GSTP1 HM esta justo corriente arriba del exon 1 y el Cebador de retroceso esta justo corriente abajo del exon 1 de GSTP1.

KLF8

Ubicacion cromosomica: Xp11.21 Gen(es) Cercano(s): w/i exon 1 de KLF8 35 NFATC3

Ubicacion cromosomica: 16q22.1

Gen(es) Cercano(s): w/i promotor de NFATC3

MOBKL2B

Ubicacion cromosomica: 9p21.2 40 Gen(es) Cercano(s): w/i intron 1 de MOBKL2B

GJA1 (aka CX43)

Ubicacion cromosomica: 6q22.31 Gen(es) Cercano(s): w/i intron 1 de GJA1 MN1

5

10

15

20

25

30

35

40

Ubicacion cromosomica: 22q12.1 Gen(es) Cercano(s): w/i el promotor de MN1 FGF 13

Ubicacion cromosomica: Xq26.3

Gen(es) Cercano(s): w/i intron 1 de FGF 13

CARTPT

Ubicacion cromosomica: 5q13.2

Gen(es) Cercano(s): w/i exon 1 de CARTPT

SPG20

Ubicacion cromosomica: 13q13.3 Gen(es) Cercano(s): w/i intron 1 de SPG20 Diseno del estudio

Con el fin de maximizar el volumen de orina interrogado por un ensayo individual de PCR en tiempo real (1.4 ml equivalentes), el numero maximo de biomarcadores candidatos previamente validados en los tejidos de prostata que pudieron ser analizadas en este estudio fue de nueve, con cada ensayo ejecutado una vez para cada muestra.

Recoleccion de muestra

Para este estudio, los inventores recolectaron orina de un total de 159 hombres, incluyendo 81 hombres con cancer de prostata confirmado por biopsia y 78 hombres sin detectar cancer por biopsia de prostata. En el diseno del presente estudio, la definicion de la clase negativa fue un problema ya que no existe un metodo de deteccion que excluya la presencia de PCa con un 100% de certeza. La biopsia tiene una tasa de diagnostico de falso negativo de al menos 10% (Djavan et al., 2000; Mian et al., 2002; Gupta et al., 2005; Hanley et al., 2006), mientras que la medicion de PSA es propenso tanto a falsos negativos como a falsos positivos.

Las muestras se recolectaron en seis sitios en los Estados Unidos y Alemania. La orina se recolecto despues de un masaje de prostata de 20-60 s antes de cualquier tratamiento para PCa. Los criterios de inclusion y exclusion fueron disenados para asegurar que los pacientes analizados reflejaran los pacientes potenciales que usanan la deteccion de PCa y pruebas de diagnostico.

Los siguientes criterios de inclusion y exclusion se aplicaron a los pacientes sometidos a biopsia de prostata: Criterios de inclusion:

- Indicacion para biopsia (PSA elevado y/o DRE sospechoso)

- Biopsia programada dentro de 1 semana despues de la recoleccion de muestras

- Edad 40-80 Criterio de exclusion:

- Cualquier tratamiento previo para el cancer de prostata

- Antecedentes de cancer o enfermedad grave en los ultimos 5 anos

- Smtomas de infeccion del tracto urinario Datos del paciente y caractensticas del tumor

Las puntuaciones de Gleason (cuando sea apropiado) de las muestras de los pacientes se listan en Tabla 3. Los valores medios de PSA total para el cancer de prostata y pacientes negativos de biopsia fue de 8.3 ± 1,6 y 5.4 ± 0.6, respectivamente. Las clases negativas del cancer de prostata y la biopsia se definieron despues de la recoleccion de la muestra a traves de una biopsia de prostata. La mediana del numero de biopsias previas para pacientes con cancer de prostata y negativos en biopsias fue de 0.5 ± 0,1 y 0.0 ± 0.1, respectivamente.

5

10

15

20

25

30

flujo de circuito de produccion

La extraccion de ADN y el tratamiento con bisulfito se llevaron a cabo de acuerdo con protocolos estandarizados (Lofton-Day et al, Clin Chem 2008 54 (2): 1-10). Para cada ensayo qPCR, 1.4 ml de orina equivalente se analizo una vez.

Rendimiento del biomarcador, Consideraciones Generales

El objetivo del estudio fue determinar el rendimiento de los biomarcadores candidatos en hombres mayores de 50 anos de edad en la discriminacion de cancer de prostata a partir de condiciones no cancerosas. Los datos fueron analizados utilizando los pacientes con cancer de prostata como la clase positiva y los pacientes con biopsia negativa como la clase negativa. En este ejemplo, los inventores informan de un rendimiento del biomarcador solamente para la orina (datos sobre muestras de tejidos se proveen en un Ejemplo 2). Los inventores proveen datos de rendimiento de los biomarcadores individualmente y en paneles.

Los datos de rendimiento (AUC, sensibilidad y especificidad) de los biomarcadores individuales GSTPi, KLF8, NFATC3, MOBKL2B, GJA1/CX23, MN1, FGF13, CARTPT, y SPG20 se muestran en la Tabla 4. Los datos de rendimiento (AUC, sensibilidad y especificidad) para los paneles de biomarcadores se muestran en la Tabla 5. Las curvas ROC para los marcadores en comparacion con GSTP1 se muestran en las Figuras 8-9, 11-12, 16-18 y 20.

Discusion

El estudio se realizo sobre muestras de orina de 81 PCa y 78 pacientes de biopsias negativas. Los ensayos de PCR en tiempo real se utilizaron para medir la metilacion del ADN de los biomarcadores candidatos. La cantidad de ADN de biomarcador metilado se correlaciono significativamente con PCa para GSTP1 y cinco de los biomarcadores candidatos recientemente identificados (KLF8, NFATC3, MOBKL2B, GJA1 y MN1). El rendimiento de estos biomarcadores se comparan favorablemente con el rendimiento de PSA (18% de sensibilidad al 98% de especificidad para hombres <60 anos y 19% de sensibilidad a 94% de especificidad para hombres> 60 anos) en la poblacion de seleccion (Punglia et al., 2003). La sensibilidad de los seis marcadores biologicos significativos en 95% de especificidad vana de 12% para NFATC3 a 26% para KLF8 (Tabla 6).

Conclusiones

La presente investigacion ha demostrado que GSTP1 y todos los biomarcadores de cancer de prostata recientemente identificados se pueden medir en la orina de pacientes con cancer de prostata. Ademas, GSTP1 y cinco de los biomarcadores candidatos identificados recientemente discriminan significativamente a los pacientes con PCa de los pacientes negativos de biopsia. La principal conclusion de este estudio es: Los biomarcadores basados en la metilacion del ADN del cancer de prostata KLF8, NFATC3, MOBKL2B, GJA1 y MN1 se pueden medir en la orina de pacientes con PCa y pueden discriminar significativamente PCa de pacientes negativos de biopsia.

Tabla 17: Genes y secuencias

Gen

SEQ ID NO: Genomicas Cadena en sentido convertida por bisulfito metilado Cadena antisentido convertida por bisulfito metilado Cadena en sentido convertida por bisulfito no metilado Cadena antisentido convertida por bisulfito no metilado

GSTP1

4 11 12 19 20

KLF8

53 98 99 156 157

NFATC3

50 92 93 150 151

MOBKL2B

47 86 87 144 145

GJA1 (aka CX43)

cn 00 108 109 166 167

MN1

52 96 97 154 155

FGF13

54 100 101 158 159

CARTPT

44 80 81 138 139

SPG20

56 104 105 162 163

Gen

Cebadorde avance Cebador de retroceso Bloqueador Oligo de detection

GSTP1

SEQ ID NO: 21 GGGATTATTT TTATAAGGTT SEQ ID NO: 22 CCCATACTAA AAACTCTAAA C SEQ ID NO: 23 CT AAACCCCA TCCCCAAAAA CACAAACCAC ACA-C3' SEQ ID NO: 24 AGTTTCGTCGTCG T AGTTTTCGTT - Fluor LCred640-

SEQ ID NO: 269 TAGTGAGTACGC GCGGTTCG-PH

KLF8

SEQ ID NO: 230 GT ATTTT AGGTTT TGATTCGCGTG SEQ ID NO: 231 ACTCGTACGAAT CCTCT AAAACG A A NA SEQ ID NO: 232 ACTACCCC ACG AAAT ACCTCGCGC

NFATC3

SEQ ID NO: 221 GCGAAAGTTTCGT TTCGTAGA SEQ ID NO: 222 ACAAAAACCGAA CCGAAAATC NA SEQ ID NO: 223 TCCGAACTCTAAACTC GCGATCGC

MOBKL2B

SEQ ID NO: 212 TATTTTGTAGGCG TTCGCGG SEQ ID NO: 213 CCGACAAAAACA AAAATCGC NA SEQ ID NO: 214 ATCGTCCTTCTTTCGA AATACAAAACTCCGA

GJA1 (aka CX43)

SEQ ID NO: 245 TTTTTCGAGAATG AGGCGG SEQ ID NO: 246 AAAT AAACGCAA CGCTACTACGA NA SEQ ID NO: 247 CGAACGCGTCATCAA CTTCCCGA

MN1

NA

Gen

Cebadorde avance Cebador de retroceso Bloqueador Oligo de detection

SEQ ID NO: 227 TAGTAATCGGAG CGATTTGCG SEQ ID NO: 228 CAAAATATACGA CCCGACGAATA SEQ ID NO: 229 CGTACGT ATCTTCTCG AAATTCCCAACCGC

FGF13

SEQ ID NO: 233 GAGGGGGTTTAG TATGTCGTTCG SEQ ID NO: 234 CGAAACTATAAC GTCGACTCCGA NA SEQ ID NO: 235 AAAACCGAACCGCCG CCGAAAA

CARTPT

SEQ ID NO: 203 GCGTTTGGAATTC GGCG SEQ ID NO: 204 GAATCAACCGTC T AT AAACAACGC NA SEQ ID NO: 205 TCCGCCGACGCTT AA CGTCAATACC

SPG20

SEQ ID NO: 239 AAACAACGAAAT TAAAACGACGAA SEQ ID NO: 240 GAGGGAATTTTTT TCGTTCGAT NA SEQ ID NO: 241 ACGATACTCCGAAAA AACTCCGCGATAAA

Tabla 19: Muestras de pacientes

Tipo de muestra

No. de muestras

Cancer de prostata - Puntuacion de Gleason

4

2

5

3

6

14

7

32

8

3

9

4

10

3

Puntuacion no disponible

20

Cancer de prostata total:

81

Biopsia negativa

78

Tabla 20: Analisis de rendimiento de biomarcadores individuales analizados en la orina posterior a masaje a la prostata de pacientes con cancer de prostata y pacientes con biopsia negativa.

Biomarcador

AUC Sensibilidad Especificidad Valor p de Wilcoxon

GSTP1

0.64 [0.56-0.71] 0.67 0.50 0.0027

KLF8

0.67 [0.59-0.75] 0.58 0.68 0.0000

NFATC3

0.62 [0.54-0.70] 0.51 0.69 0.0026

MOBKL2B

0.58 [0.50-0.66] 0.30 0.86 0.0150

GJA1 (aka CX43)

0.58 [0.50-0.66] 0.34 0.80 0.0385

MN1

0.66 [0.58-0.73] 0.73 0.50 0.0003

FGF13

0.55 [0.47-0.63] 0.49 0.58 0.2406

CARTPT

0.57 [0.49-0.64] 0.53 0.50 0.1345

SPG20

0.6494 [0.40-0.56] 0.05 0.92 0.4415

Tabla 21: Rendimiento de los paneles de biomarcadores para distinguir PCa a partir de pacientes con biopsia negativa 5 en la orina posterior a masaje a la prostata

Panel de Biomarcador

AUC Sensibilidad Especificidad Valor p de Wilcoxon

GSTP1 + PSA Total

0.76 [0.68-0.83] 0.88 0.52 0.0000

KLF8 + PSA Total

0.79 [0.71-0.86] 0.88 0.52 0.0000

MN1 + PSA Total

0.77 [0.69-0.84] 0.84 0.52 0.0000

GSTP1 + KLF8

0.67 [0.57-0.72] 0.57 0.72 0.0001

KLF8 + GJA1 (aka CX43)

0.71 [0.63-0.78] 0.57 0.73 0.0000

GSTP1 + KLF8 + GJA1 (aka CX43)

0.70 [0.62-0.78] 0.56 0.75 0.0000

KLF8 + MOBKL2B

0.66 [0.57-0.73] 0.60 0.60 0.0003

GSTP1 + KLF8 + NFATC3

0.68 [0.60-0.75] 0.64 0.64 0.0001

KLF8 + NFATC3

0.69 [0.61-0.76] 0.74 0.53 0.0000

MN1 + MOBKL2B

0.67 [0.59-0.74] 0.73 0.51 0.0002

KLF8 + MN1

0.68 [0.60-0.75] 0.73 0.51 0.0001

MN1 + GJA1 (aka CX43)

0.68 [0.60-0.75] 0.73 0.51 0.0002

GSTP1 + MN1

0.66 [0.59-0.74] 0.72 0.51 0.0003

Tabla 22: Analisis de rendimiento de los biomarcadores individuales en alta especificidad fija (95%).

Biomarcador

AUC Sensibilidad Especificidad Valor p de Wilcoxon

GSTP1

0.64 [0.56-0.71] 0.15 0.95 0.0027

KLF8

0.67 [0.59-0.75] 0.26 0.95 0.0000

NFATC3

0.62 [0.54-0.70] 0.12 0.95 0.0026

MOBKL2B

0.58 [0.50-0.66] 0.16 0.95 0.0150

GJA1 (aka CX43)

0.58 [0.50-0.66] 0.14 0.95 0.0385

MN1

0.66 [0.58-0.73] 0.19 0.95 0.0003

FGF13

0.55 [0.47-0.63] 0.11 0.95 0.2406

CARTPT

0.57 [0.49-0.64] 0.10 0.95 0.1345

SPG20

0.6494 [0.40-0.56] 0.01 0.95 0.4415

10

Listado de secuencias

<110> Epigenomics AG

<120> Metodos y acidos nucleicos para el proliferativos de celulas de prostata

<130> 536-56 EPT2

<160> 269

<210> 1

<211> 1920

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 1

ccaggctgcc gtagacacag cctttgctct ccagatacct gggaaataga gtgcacgcag tatcactgag gcgcagaggt gctgtggaca cagaaccctc agtctcccta tgaggccact acttagagct gaatgcaaag taagcgctcg cacctgcctc gctcggggcg agagaagacg cagctccgaa ggagggcggg gagaccgcaa cgcgcaccct gcgcccctct gaagcgcgcc tctggggaat ccgcctagaa gacggcggcg aggccctccc cagccctgca cctgccgcgc cccggggatg gggtgggagc gccttcccat caggggtcgt agaaggagga ctagctccaa cggctggggc tccgcgccta cacggcccct cggctcgggg aggaaagagg agacaagaga gggtagggac catcgtggaa aaactttggc cgcgccctgc accttgcgcc gggcatcccg cccgcgcccc gcgccttgcc ttcaccccgg ccgtggagtt ggaaagtggg ggcgccgcgg agcgatcggc gggccgggct caaatccagc gggaccgggc gccccgccct cctcgctccc ttggcctttt tcagccccta ccggatctgc ttcatatcac tctccacccc ttcgccttgc ccccctcctc ttctcccctc ccctctaggg gctgtggctg cgtccccttc cccgccagct cgggctgggg gtggggaggt ggggggggag ctcacctcct tgctgctgcc ctctccaaga tcacccggag ctgtgacagc cactcccagg tccagcggcc tggattcccc aggcagaggt cttattccca aaagggtttg agccggacag ccggccagac gtgacagcaa tgccaaggag cccttttcca tccctggacc tcctggcgcc gctgcaggtt ccctatctac tcagagttct

<210>2

<211> 6096

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 2

taccagtgta agattcaaaa ttcccttttt gctcagtgcc tggacatagc gattcctggg tgcgccttgg gcggagcaga cagagaccct gctagggctt tatgcgccct caccgctgcc

analisis de la

cccgaaaaac

ctgttgagag

gcccagaccc

ggcactctcg

aaatgcagaa

ccaggctgag

aggggaagtg

gcctccccgc

gactggggtc

cgccccacct

cgcgggctca

gccacaactt

ggcgggggtc

caggcgagga

gaggtggggg

cgccagtgcc

gccagctgca

ctggggggct

caggctgggc

ctcctccttc

tcgtccgctg

cttcgccttt

gcggagcttc

cgtccaggct

tgcagggttg

gggatggaga

gaacagtcac

tgtgggattt

gggctaaaca

gccaagtttc

cccagtacac

ccccctcacg

gcactgcaca

cctgcccgtc

gggtggcagg

ctctgctatt

expresion del

acgttctagg

gcctcgcgct

acacggcgcc

gctgtcccca

gtagccgggg

gtcccagcga

cccggagggc

gccggggact

gggcactctc

cgccaggaag

aaaagaagga

tcttcggacc

cgcgcgcccc

ttacggggct

gacgcggaaa

tcgctcccag

tcgcgcccgc

gcttcagctg

aggcggtggc

ctctccctcc

tcctctcttt

cttcctcccc

tcccctccct

cccgccgcca

gggaggatga

cttggcccaa

gctgccctac

tgttttttct

ggccccttcg

tttgtccatt

agaggccctt

tgcctatccc

gtgagatgcc

gccgccccaa

ggcttgggaa

tgcaggcaat

gen asociada con el desarrollo de trastornos

cgccgggatt 60 tggcttctcc 120 cgaggt gaaa 180 gagctctccg 240 ccgcccacgg 300 cctcaggcac 360 caacggcccc 420 gggacctgcc 480 cagggctgtc 540 tctcagagac 600 aggacgcccc 660 caaggcaggc 720 gggagccccg 780 gacccagccg 840 gagagcggcc 900 tgccccgcgc 960 gccgcaggaa 1020 cgcct cggcc 1080 cgcgcgactg 1140 ctccagcccc 1200 tctctcgctc 1260 ttgtctcctg 1320 cccagacaat 1380 gcgattcttc 1440 gctggctccc 1500 gctcctcggt 1560 caagcccacc 1620 aacatcccag 1680 acttggcggg 1740 tctcacctcc 1800 gagcagcccg 1860 caaccctgca 1920

cagggctcca

60

gcgaagctgg

120

gacatgggcg

180

ggacgagccg

240

Claims (23)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   1. Un metodo para detectar trastornos proliferativos de celulas de prostata en un sujeto que comprende determinar la metilacion CpG de NFATC3 en una muestra biologica aislada de dicho sujeto en el que la metilacion de CpG es indicativa de la presencia de dichos trastornos.
2. 2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas determinar el nivel de expresion de al menos un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; y GPR68 (REGION INTRON 1 Y/O EXON 2).
3. 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde dicho nivel de expresion se determina detectando:

   (i) la presencia, ausencia o nivel de ARNm transcrito de dicho al menos un gen;

   (ii) la presencia, ausencia o nivel de un polipeptido codificado por dicho al menos un gen o secuencia del mismo; o

   (iii) la presencia o ausencia de metilacion de CpG dentro de dicho al menos un gen, en donde la presencia de metilacion indica la presencia de un carcinoma.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende poner en contacto el ADN genomico aislado de una muestra biologica obtenida de dicho sujeto con al menos un reactivo, o una serie de reactivos que distingue entre dinucleotidos CpG metilados y no metilados dentro de al menos una region objetivo del genoma ADN, en donde la region objetivo comprende, o hibrida bajo condiciones rigurosas con una secuencia de al menos 16 nucleotidos contiguos de la secuencia de la SEQ ID NO: 50, en donde dichos nucleotidos contiguos comprenden al menos una secuencia de dinucleotido CpG, y por lo que la deteccion de carcinoma se produce, al menos en parte.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende:

   a) extraer o aislar de otra manera el ADN genomico de una muestra biologica obtenida del sujeto;

   b) tratar el ADN genomico de a), o un fragmento del mismo, con uno o mas reactivos para convertir bases de citosina que no estan metiladas en la posicion 5 del mismo en uracilo o en otra base que sea detectable de forma diferente a la citosina en terminos de propiedades de hibridacion ;

   c) poner en contacto el ADN genomico tratado, o el fragmento tratado del mismo, con una enzima de amplificacion y al menos un cebador que comprende una secuencia contigua de al menos 9 nucleotidos que es complementaria o hibrida bajo condiciones moderadamente rigurosas o rigurosas a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 92, 93, 150 y 151, y sus complementos, en donde el ADN genomico tratado o su fragmento se amplifica para producir al menos un amplificado, o no es amplificado; y

   d) determinar, con base en la presencia o ausencia de, o en una propiedad de dicho amplificado, el estado de metilacion o el nivel de al menos un dinucleotido CpG de la secuencia de la SEQ ID NO: 50, o un promedio, o un valor que refleje un estado de metilacion promedio o nivel de una pluralidad de dinucleotidos CpG de la secuencia de la SEQ ID NO: 50, con lo cual al menos uno de la deteccion y el diagnostico de cancer, se produce, al menos en parte.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende:

   a) extraer o aislar de otra manera el ADN genomico de una muestra biologica obtenida del sujeto;

   b) digerir el ADN genomico de a), o un fragmento del mismo, con una o mas enzimas de restriccion sensibles a la metilacion;

   c) poner en contacto la digestion con enzimas de restriccion de ADN de b), con una enzima de amplificacion y al menos dos cebadores adecuados para la amplificacion de una secuencia que comprende al menos un dinucleotido CpG de la SEQ ID NO: 50

   d) determinar, con base en la presencia o ausencia de un amplificado, el estado de metilacion o el nivel de al menos un dinucleotido CpG de la secuencia de la SEQ ID NO: 50, con lo cual al menos uno de la deteccion y el diagnostico de cancer, se produce, al menos en parte.
7. 7. Uso de un acido nucleico tratado para realizar el metodo de la reivindicacion 1, en donde el acido nucleico tratado se deriva de la secuencia genomica de la SEQ ID NO: 50, y en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencoa de ADN genomico a uracilo u otra base que sea detectable diferente a la citosina en terminos de hibridacion.

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40
8. 8. Uso de un acido nucleico para realizar el metodo de la reivindicacion 1, en donde el acido nucleico comprende al menos 9 o al menos 16 nucleotidos contiguos de una secuencia de ADN genomico tratada seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 92, 93, 150 y 151, y sus secuencias complementarias, y en donde el tratamiento es adecuado para convertir al menos una base de citosina no metilada de la secuencia de ADN genomico de la SEQ ID NO: 50 en uracilo u otra base que sea detectable de forma diferente a la citosina en terminos de hibridacion.
9. 9. Uso de un acido nucleico para realizar el metodo de la reivindicacion 1, en donde el acido nucleico comprende al menos 50 nucleotidos contiguos de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste en la SEQ iD NO: 92, 93, 150 y 151, y secuencias complementarias de las mismas.
10. 10. Uso de un kit para realizar el metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, alternativa (i), en donde el kit comprende

    a) una pluralidad de oligonucleotidos o polinucleotidos capaces de hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripcion de un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION INTRON 1 Y/O EXON 2);

    (b) un recipiente adecuado para contener los oligonucleotidos o polinucleotidos y una muestra biologica del paciente que comprende los productos de transcripcion en donde los oligonucleotidos o polinucleotidos pueden hibridar bajo condiciones rigurosas o moderadamente rigurosas con los productos de transcripcion;

    (c) medios para detectar la hibridacion de (b); y opcionalmente

    (d) Instrucciones de uso e interpretacion de los resultados del kit.
11. 11. Uso de un kit para realizar el metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, alternativa (ii), en donde el kit comprende

    (a) un medio para detectar polipeptidos de un gen seleccionado del grupo que consiste en RASSF2A; TFAP2E; HIST1H4K; GSTPi; MME; RARB; NKX3-1; NPAL3; ACVR2A; ARL4C; PDE4D; CARTPT; HIST1H2BD; CUL1; MOBKL2B; IFLTD1 (KRAS); ANXA2; MN1; KLF8; FGF13; NKX2-6; SPG20; DSE/SART2; GJA1 (CX43); SPATA6; MCC; GPR68 (REGION INTRON 1 Y/O EXON 2);

    (b) un recipiente adecuado para contener los dichos medios y la muestra biologica del paciente que comprende los polipeptidos en donde los medios pueden formar complejos con los polipeptidos; y

    (c) un medio para detectar los complejos de (b).
12. 12. Uso de un kit para realizar el metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el kit comprende

    (a) un reactivo de bisulfito;

    (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo de bisulfito y la muestra biologica del paciente;

    (c) al menos un conjunto de oligonucleotidos que contienen dos oligonucleotidos cuyas secuencias en cada caso son identicas, son complementarias, o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento de 9 o mas preferiblemente de 18 bases de longitud de una secuencia seleccionada de la SEQ ID NO: 92, 93, 150 y 151.
13. 13. Uso de un kit para realizar el metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el kit comprende

    (a) un reactivo de enzima de restriccion sensible a la metilacion;

    (b) un recipiente adecuado para contener dicho reactivo y la muestra biologica del paciente;

    (c) al menos un conjunto de oligonucleotidos, uno o una pluralidad de acidos nucleicos o acidos nucleicos peptfdicos que son identicos, son complementarios o se hibridan bajo condiciones rigurosas o altamente rigurosas a un segmento de al menos 9 bases de longitud de la secuencia de la SEQ ID NO: 50; y opcionalmente

    (d) Instrucciones de uso e interpretacion de los resultados del kit.
14. 14. El uso de un metodo de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, un acido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 7 a 9 y/o un kit de acuerdo con las reivindicaciones 10 a 13 en el diagnostico de trastornos proliferativos de celulas de prostata.

    9* 9A

    imagen1

    imagen2

    GSTPi

    imagen3

    imagen4

    HIST1H4K

    imagen5

    imagen6

    RASSF1A

    Vi «

    imagen7

    HLST1H4K

    TFAP2E

    imagen8

    04 OB

    imagen9

    imagen10

    •Normal Cancer de prostata

    Ca'ncer de prostata

    Normal

    Normal

    GSTPi

    RASSF2A

    Normal

    HST1H4K

    TFAP2E

    =i ,

    Ca'ncer de prostata

    Ca'ncer de prostata

    -« ->4 -U -12 -tt -1 -44 02 08 It 2

    ro oo

    imagen11

    imagen12

    HIST1H4K

    Orina

    A

    Orina

    C

    vs. Asintomatico

    valor p de

    Wilcoxon

    .0-

    AUC

    [95% Cl]

    Sens

    (95% espec)

    O.E-

    Marcador
15. 0.89

    [0.82-0 94]

    GSTP1

    63%
16. 0.6-

    < 0.00001

    GSTP1
17. 0.90

    (0.84-095)
18. 0.4-

    RASSF2

    74%

    < 0.00001

    RASSF2
19. 0.91

    [0.85-0.96]
20. 0.2'

    69%

    < 0.00001

    086

    [0.79-6.92]

    47%

    < 0.00001

    1 - Especificidad

    B Plasma

    vs. Asint

    omatico

    Valor p de

    Wilcoxon

    AUC

    [95% Cl]

    Sens

    (95% espec)

    Marcador
21. 0.61

    [0.53-0.70]

    GSTP1

    17%

    0 006
22. 0.68

    [060-0.76]

    RASSF2

    37%

    <0 00001

    0 64

    [0.55-0.72]

    HIST1H4K

    26%

    0 001
23. 0.61

    [0.52-0.691

    TFAP2E

    22%

    0 0004

    A Orina

    vs. Biopsia Neg Valor p de Wil canon

    AUC Sensibilidad

    Marta dor

    [95%Ct| 50% espec 60% «Sp&C 90% esput 95% espec

    GSTP1

    0.69 I0.60-0.7rr 19% *5% 29% ii% 4.00001

    RASSF2

    0 66 |G 56-0.74] 38% 2S% 2i% *o wooi

    MST1H4K

    |0.55~0.73] 60S 34% 24% 0.01

    TFAP2E

    065 10-560,73] B7% 47% 3iH SI'S 0.01

    Marcador

    vs.Biopsia Neg Valor p da Wikoxon

    AUC (95% Cl)

    Sensibilidad

    50% espec

    00% pee 90% espee 95% espec

    GSTP1

    0.SS 10.47«.64| 3«H 76% 20% lit 0.23

    RASSF2

    060 (0.51-0.681 37% fe% 12% 0.0?

    HIST1H4K

    050 10.414. »| 34 Vi 17% 8% 5* 099

    TFAP2E

    0.52 (0.44-0.611 iz% 12ft 1% as 0.30'

    C Biomarcadores PSA

    Marcador

    vs. Biopsia Neg Vaiorp de WilcoKor

    AUC (95% Cl]

    Sensibilidad

    50% espec

    @0% e&pee 90% espec 95% a&psc

    P$A Total

    0-« 10.460.6*1] 5i% 27% 23% i*% 0.31

    //IPSA

    056 I0.4M.K] 60% 2i% 7% 1 4% 0.46

    D Orina

    imagen13

    1 - Especificidad

    Sensibilidad

    imagen14

    _ _ . . . . 53% de sensibilidad a

    B Resultados de onna 50o/o de especificidad

    imagen15

    imagen16

    Sensibilidad

    Fig. 9

    imagen17

    B Resultados de orina 34% de sensibilidad a

    80% de especificidad

    imagen18

    imagen19

    HZ

    220 CI O" SSO- 60- S2M- 91.- 961- C?- S9^- C~

    imagen20

    Ot By

    Sensibilidad

    imagen21

    BResultados de orina 49% de sensibilidad a

    53% de especificidad

    imagen22

    imagen23

    Sensibilidad

    imagen24

    B Resultados de orina 5% de sensibilidad a

    92% de especificidad

    imagen25

    imagen26

    Q-O

    Fig. 13

    imagen27

    imagen28

    imagen29

    Sensibilidad

    imagen30

    B Resultados de orina ?3% de sensibilidad a

    50% de especificidad

    imagen31

    imagen32

    Sensibilidad

    imagen33

    B Resultados de orina 58% de sensibilidad a

    63% de especificidad

    imagen34

    imagen35

    Sensibilidad

    imagen36

    B Resultados de orina ! 30% de sensibilidad a ;

    86% de especificidad

    imagen37

    imagen38

    imagen39

    Eensibilidjd

    imagen40

    B Resultados de orina 51% de sensibilidad a

    €9% de especificidad

    imagen41

    i-Especifieidad

    imagen42