ES2672769T3

ES2672769T3 - Anticuerpos anti-CXCR5 humanizados, derivados de los mismos y sus usos

Info

Publication number: ES2672769T3
Application number: ES08798744.2T
Authority: ES
Inventors: Renata Lee; Vincent Mikol; Elizabeth Allen; Norman Ruetsch; Beatrice Cameron; Thomas Oligino; Nicolas Baurin
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2007-08-29
Filing date: 2008-08-27
Publication date: 2018-06-18
Anticipated expiration: 2028-08-27
Also published as: BRPI0815983A2; SG10201407388XA; US9175087B2; CN104017078A; RS57273B1; NI201000028A; PA8794201A1; KR101667944B1; US8980262B2; TW201741341A; US20180100019A1; EP3354662B1; AR112564A2; ZA201001514B; TR201807983T4; US20130243793A1; IL204173A; US8647622B2; PH12015500248A1; NI201000281A

Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une específicamente al dominio extracelular de CXCR5 humano, en el que el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una de las características a a k: a) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 y un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; b) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende las secuencias de aminoácidos de RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RMSNLAS (SEQ ID NO: 59), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) e IVY (SEQ ID NO: 63); c) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15 y un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; d) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende: (i) las secuencias de aminoácidos de RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSNLAS (SEQ ID NO: 64) y MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60), o las secuencias de aminoácidos de RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSSNLAS (SEQ ID NO: 65) y MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60); y (ii) las secuencias de aminoácidos de GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) e IVY (SEQ ID NO: 63); e) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena ligera variable (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21 y una cadena pesada variable (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; f) el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32 y una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 o SEQ ID NO: 34; g) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende: (i) las secuencias de aminoácidos de RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RMSNLA (SEQ ID NO: 66), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60); las secuencias de aminoácidos de RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSNLA (SEQ ID NO: 67) y MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60); o las secuencias de aminoácidos de RSSKSLLHSSGKTYLY (SEQ ID NO: 58), RLSSLA (SEQ ID NO: 68) y MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60); y (ii) las secuencias de aminoácidos de GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) e IVY (SEQ ID NO: 63). h) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35, y una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 37. i) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41 o SEQ ID NO: 43, y una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 45 o SEQ ID NO: 47; j) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende una cadena ligera variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, y una cadena pesada variable que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 o SEQ ID NO: 57; k) el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo comprende: (i) las secuencias de aminoácidos de RSSKSLLHSSGKTYLYW (SEQ ID NO: 69), RMSNLA (SEQ ID NO: 66), MQHLEYPYT (SEQ ID NO: 60); y (ii) las secuencias de aminoácidos de GFSLIDYGVN (SEQ ID NO: 61), VIWGDGTTY (SEQ ID NO: 62) e IVY (SEQ ID NO: 63); en el que el anticuerpo o fragmento del mismo tiene una Kd de 1 x 10-11 M a 1 x 10-15 M.

Description

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En una realización preferida de la invención, se prepara un panel de mutantes de anticuerpo y se criba para afinidad de unión por el antígeno. Uno o más de los mutantes de anticuerpo seleccionados del cribado se someten opcionalmente a uno o más ensayos de actividad biológica adicional para confirmar que el (los) mutante(s) de anticuerpo tienen propiedades nuevas o mejoradas. En realizaciones preferidas, el mutante de anticuerpo retiene la capacidad de unirse a CXCR5 con una afinidad de unión similar a o mejor/más alta que la del anticuerpo parental.

El (Los) mutante(s) de anticuerpo así seleccionados pueden someterse a modificaciones adicionales, frecuentemente dependiendo del uso previsto del anticuerpo. Tales modificaciones pueden implicar alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, fusión a polipéptido(s) heterólogo(s) y/o modificaciones covalentes. Por ejemplo, un resto de cisteína no implicado en mantener la apropiada conformación del mutante de anticuerpo puede estar sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y para prevenir la reticulación anómala. En cambio, puede añadirse una cisteína al anticuerpo para mejorar la estabilidad (particularmente donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Otro tipo de mutante de anticuerpo tiene un patrón de glucosilación alterado. Esto puede ser logrado delecionando uno o más restos de hidrato de carbono encontrados en el anticuerpo y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glucosilación de anticuerpos normalmente está o bien unida en N a Asn o unida en O a Ser o Thr. Las secuencias de tripéptidos, asparagina-X-serina y asparagina-Xtreonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento comunes, para la unión enzimática de un resto de hidrato de carbono a la cadena lateral de asparagina. La N-acelilgalactosamina, galactosa, fucosa o xilosa, por ejemplos, están unidas a un hidroxiaminoácido, lo más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina. La adición o sustitución de uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original puede potenciar la probabilidad de glucosilación unida en O.

Puede desearse modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para potenciar la eficacia del anticuerpo. Para

Modificaciones covalentes del anticuerpo están incluidas dentro del alcance de la invención. Tales pueden hacerse por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula haciendo reaccionar los restos de aminoácidos dirigidos del anticuerpo con un agente derivatizante orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con el resto del extremo N o extremo C.

Pueden hacerse reaccionar restos de cisteinilo con α-haloacetatos (y aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para dar derivados de carboxilmetilo o carboxiamidometilo. Los restos de cisteinilo también pueden ser derivatizados mediante reacción con bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β-(5imidozoil)propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, 2-piridildisulfuro de metilo, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercura-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol, por ejemplo.

Pueden derivatizarse restos de histidilo mediante reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0. También puede usarse bromuro de p-bromofenacilo, la reacción se realiza preferentemente en cacodilato de sodio 0,1 M a pH 6,0.

Pueden hacerse reaccionar restos de lisinilo y α-terminales con anhídridos de ácido succínico u otro ácido carboxílico para invertir la carga de los restos. Otros reactivos adecuados para derivatizar los restos que contienen α-amino incluyen imidoésteres, tales como picolinimidato de metilo, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea y 2,4-pentanodiona, y el aminoácido puede ser catalizado por transaminasa con glioxilato.

Pueden modificarse restos de arginio mediante reacción con uno o varios reactivos convencionales, tales como fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de restos de arginina frecuentemente requiere condiciones de reacción alcalinas. Además, los reactivos pueden reaccionar con lisina, además del grupo ε-amino de la arginina.

La modificación específica de restos de tirosilo puede hacerse con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano. Por ejemplo, se usan N-acetilimidizol y tetranitrometano para formar especies de O-acetiltirosilo y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los restos de tirosilo pueden ser yodados usando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para su uso en un radioinmunoensayo.

Pueden modificarse grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) mediante reacción con carbodiimidas (R-N=C=C-R'), donde R y R' puede ser grupos alquilo diferentes, tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, pueden convertirse restos aspartilo y glutamilo en restos asparaginilo y glutaminilo mediante reacción con iones amonio.

Los restos glutaminilo y asparaginilo son frecuentemente desamidados a los restos glutamilo y aspartilo correspondientes, respectivamente, en condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de aquellos restos entra dentro del alcance de la presente invención.

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sitios conocidos por afectar la función, por ejemplo, en la región bisagra, en una región que afecta una función efectora o que afecta la unión de Fc, por ejemplo, para la modificación. En una molécula IgG4, puede hacerse sustituciones, usando la numeración de Kabat, en el aminoácido 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, etc., o combinaciones de los mismos, para obtener propiedades deseadas. Por ejemplo, el sustituir la serina 241 por una prolina puede estabilizar las estructuras terciarias y cuaternarias de la molécula (Mol Imm 30(1)105-108, 1993), y el sustituir la leucina 248 por ácido glutámico puede disminuir la(s) función (funciones) efectora(s) (J Imm 164(4)19251033, 2000; y Clin Imm 98(2)164-174, 2001).

Otra propiedad beneficiosa es obtener un derivado de anticuerpo que se une a CXCR5 pero, por ejemplo, no agota los linfocitos B. Esto puede ser ventajoso ya que la producción de anticuerpos en un paciente no está comprometida. El tratamiento con un reactivo tal también facilita una pauta de combinación con un segundo fármaco para una indicación particular que actúa a un nivel distinto de en el linfocito B. Esto puede ser al nivel del linfocito T, por ejemplo.

Por tanto, por ejemplo, se trató 16D7-HC1-LC3 para contener dos sustituciones, S241P y L248E. Los restos de prolina y ácido glutámico confieren propiedades deseadas en una molécula de unión a CXCR5 de interés que lleva una región estructural de IgG4, tal como estabilidad y función efectora reducida.

Los fragmentos de anticuerpos y equivalentes funcionales de la presente invención engloban aquellas moléculas con un grado detectable de unión específica a CXCR5. Un grado detectable de unión incluye todos los valores en el intervalo de al menos el 10-100 %, preferentemente al menos el 50 %, 60 % o 70 %, más preferentemente al menos el 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o el 99 % de la capacidad de unión de un anticuerpo de interés. También están incluidos equivalentes con una afinidad superior al 100 % de la de un anticuerpo de interés.

Las CDR generalmente son de importancia para el reconocimiento de epítopes y la unión de anticuerpo. Sin embargo, pueden hacerse cambios a restos que comprenden las CDR sin interferir con la capacidad del anticuerpo para reconocer y para unirse al epítope relacionado. Por ejemplo, puede hacerse cambios que no afectan el reconocimiento de epítopes, aunque aumenten la afinidad de unión del anticuerpo por el epítope. Varios estudios han medido los efectos de introducir uno o más cambios de aminoácidos en diversas posiciones en la secuencia de un anticuerpo, basándose en el conocimiento de la secuencia de anticuerpo primario, en las propiedades del mismo, tal como unión y nivel de expresión (Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; y Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539).

Así, pueden generarse equivalentes de un anticuerpo de interés cambiando las secuencias de los genes de la cadena pesada y ligera en CDR1, CDR2 o CDR3, o regiones estructurales, usando métodos tales como mutagénesis dirigida al sitio mediada por oligonucleótidos, mutagénesis en casete, PCR propensa a error, barajado de ADN o cepas mutantes de E. coli (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; y Adey et al., 1996. Cap. 16, pp. 277-291, en Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press). Los métodos de cambio de la secuencia de ácidos nucleicos del anticuerpo primario pueden producir anticuerpos con afinidad mejorada (Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; y Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628).

Pueden usarse ciclos repetidos de "selección de polipéptidos" para seleccionar unión de afinidad cada vez más alta por, por ejemplo, la selección de cambios de aminoácidos múltiples que son seleccionados por selección múltiple de ciclos. Tras una primera ronda de selección, que implica una primera región de selección de aminoácidos en el ligando o polipéptido de anticuerpo, se realizan rondas de selección adicionales en otras regiones o aminoácidos del ligando. Los ciclos de selección se repiten hasta que se logran las propiedades de afinidad deseadas.

Anticuerpos mejorados también incluyen aquellos anticuerpos que tienen características mejoradas que se preparan por las técnicas convencionales de inmunización de animales, formación de hibridomas y selección de anticuerpos con características específicas.

"Antagonista" se refiere a una molécula capaz de inhibir una o más actividades biológicas de una molécula diana, tales como señalización por CXCR5. Los antagonistas pueden interferir con la unión de un receptor a un ligando y viceversa, incapacitando o destruyendo células activadas por un ligando, y/o interfiriendo con la activación del receptor o ligando (por ejemplo, activación de tirosina cinasa) o transducción de señales después de la unión del ligando a un receptor. El antagonista puede bloquear completamente las interacciones receptor-ligando o puede reducir sustancialmente tales interacciones. Todos aquellos puntos de intervención por un antagonista deben considerarse equivalentes para los fines de la presente invención. Así, dentro del alcance de la invención están incluidos antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se unen a CXCR5, CXCL13 u otros ligandos de CXCR5, o un complejo de CXCR5 y un ligando del mismo, tal como CXCL13; variantes de la secuencia de aminoácidos o derivados de CXCR5 o CXCL13 que antagonizan la interacción entre CXCR5 y un ligando, tal como CXCL13; CXCR5 soluble, opcionalmente fusionado con una molécula heteróloga tal como una región de inmunoglobulina (por ejemplo, una inmunoadhesina); un complejo que comprende CXCR5 en asociación con otro receptor o molécula biológica; péptidos de secuencia sintética o nativa que se unen a CXCR5; etc.

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"Agonista" se refiere a un compuesto, que incluye una proteína, un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un conjugado, una molécula grande, una molécula pequeña, que activa una o más actividades biológicas de CXCR5. Los agonistas pueden interaccionar con la unión de un receptor a un ligando y vice

Los términos "célula", "línea celular" y "cultivo celular" incluyen la progenie de los mismos. También se entiende que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica, tal como en contenido de ADN, debido a mutación deliberada o accidental. Está incluida progenie de variante que tiene la misma función o propiedad biológica de interés, como se criba en la célula original. Las "células hospedadoras" usadas en la presente invención generalmente son hospedadores procariotas o eucariotas, seleccionados como una elección de diseño.

"Transformación" de un organismo celular, célula o línea celular con un ácido nucleico significa introducir un ácido nucleico en la célula diana de manera que el ácido nucleico sea replicable, ya sea como un elemento extracromosómico o por integración cromosómica, y, opcionalmente, se exprese. "Transfección" de una célula o organismo con un ácido nucleico se refiere a la captación del ácido nucleico, por ejemplo, un vector de expresión, por la célula u organismo, tanto si en realidad se expresa como si no cualquier secuencia codificante . Los términos "célula hospedadora transfectada" y "transformada" se refieren a una célula en la que se introdujo un ácido nucleico. Células hospedadoras procariotas típicas incluyen diversas cepas de E. coli. Células hospedadora eucariotas típicas son células de mamífero, tales como células de ovario de hámster chino, o de origen humano. La secuencia de ácidos nucleicos introducida puede ser de la misma especie que la célula hospedadora o de una especie diferente de la célula hospedadora, o puede ser una secuencia de ácidos nucleicos híbrida, que contiene algunos ácidos nucleicos extraños y algunos homólogos.

El término "vector" significa una construcción de ácidos nucleicos, un vehículo, que contiene un ácido nucleico, el transgén, el gen extraño o el gen de interés, que puede estar operativamente unido a secuencias de control adecuadas para la expresión del transgén en un hospedador adecuado. Tales secuencias de control incluyen, por ejemplo, un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia de operador opcional para controlar tal transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión al ribosoma de ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o precisamente una posible inserción genómica. Una vez transformado en un hospedador adecuado, el vector puede duplicarse y funcionar independientemente del genoma del hospedador, o puede en algunos casos integrarse en el genoma de la célula hospedadora. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan indistintamente, ya que plásmido es una forma comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir tales otras formas de vectores que sirven a una función de vehículo equivalente y que son conocidas, o llegan a serlo, en la técnica, tales como virus, moléculas sintéticas que llevan ácidos nucleicos, liposomas y similares.

"Mamífero", para los fines de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, que incluye animales humanos, domésticos y de granja, primates no humanos, y animales de zoológico, para deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc.

Los anticuerpos de interés pueden cribarse o pueden usarse en un ensayo como se describe en el presente documento o como se conoce en la técnica. Frecuentemente, tales ensayos requieren que un reactivo sea detectable, es decir, por ejemplo, esté marcado. La palabra "marca", cuando se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o composición detectable que puede conjugarse directa o indirectamente con una molécula o proteína, por ejemplo, un anticuerpo. La marca puede ella misma ser detectable (por ejemplo, marcas de radioisótopo, partículas o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.

Como se usa en el presente documento, "fase sólida" significa una matriz no acuosa a la que puede adherirse una entidad o molécula, tal como el anticuerpo de la presente invención. Ejemplos de fases sólidas englobadas en el presente documento incluyen aquellas formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, poli(alcohol vinílico) y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras, pueden usarse en una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Así, la fase sólida puede ser un papel, una perla, un plástico, un chip, etc., puede estar hecha de una variedad de materiales, tales como nitrocelulosa, agarosa, poliestireno, polipropileno, silicio, etc., y puede estar en una variedad de configuraciones.

Pueden usarse CXCR5 soluble o fragmentos del mismo, tales como el dominio extracelular (EC), como inmunógenos para generar anticuerpos de interés. El inmunogén puede obtenerse o aislarse de fuentes naturales o puede prepararse recombinantemente. Pueden usarse células completas, tales como células CXCR5+, células derivadas de una fuente natural (por ejemplo, linfocito B, líneas de linfocitos B o líneas de células cancerosas) o células transformadas (o transfectadas) por técnicas recombinantes para expresar, y quizás para expresar en exceso CXCR5, como el inmunogén para preparar los anticuerpos de interés. Por tanto, pueden usarse preparaciones de membrana que llevan CXCR5 o péptidos sintéticos o polipéptidos truncados correspondientes a las regiones EC de CXCR5, como se conoce en la técnica.

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El EC, que tiene aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, o porciones del mismo, de CXCR5 puede usarse como el inmunogén. Otras formas del inmunogén útiles para preparar anticuerpos, tales como un conjugado, serán evidentes para aquellos en la materia. Así, puede unirse CXCR5, o porciones del mismo, a una molécula transportadora, tal como albúmina o KLH, que van a usarse como inmunogén. Por supuesto, con células que expresan CXCR5, es el dominio EC que es el inmunogén preferido o porción del inmunogén.

El gen o un ADNc que codifica CXCR5, como se conoce en la técnica, puede clonarse en un plásmido u otro vector de expresión y expresarse en cualquiera de varios sistemas de expresión según métodos muy conocidos para aquellos expertos en la materia, y véase más adelante, por ejemplo. Debido a la degeneración del código genético, pueden usarse una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican proteína CXCR5 o polipéptidos en la práctica de expresar CXCR5 recombinante o productos funcionales del mismo La secuencia de nucleótidos puede variar seleccionando combinaciones basadas en posibles elecciones de codones, tales como aquellos preferidos por la célula hospedadora. Las combinaciones se hacen según el código genético triplete estándar como se aplica a la secuencia de nucleótidos que codifica CXCR5 que existe de forma natural y pueden considerarse todas aquellas variaciones. Así, la secuencia codificante de CXCR5 puede ser recodificada para contener codones que expresan el aminoácido de interés, sin embargo, el codón triplete es uno favorecido por la maquinaria de expresión génica de la célula hospedadora, tal como una célula humana. Puede usarse uno cualquiera de aquellos polipéptidos en la inmunización de un animal, tal como un camélido, u otro sistema para generar anticuerpos que se unen a CXCR5.

Como se ha mencionado anteriormente, el inmunogén CXCR5 puede expresarse, cuando sea beneficioso, como una proteína de fusión que tiene CXCR5 unido a un segmento de fusión, que generalmente es un polipéptido con una o más funciones beneficiosas. El segmento de fusión frecuentemente ayuda en la purificación de proteínas, por ejemplo, permitiendo que la proteína de fusión sea aísle y purifique por cromatografía de afinidad, pero también puede usarse para aumentar inmunogenicidad. Pueden producirse proteínas de fusión cultivando una célula recombinante transformada con una secuencia de ácidos nucleicos de fusión que codifica una proteína unida a cualquiera del extremo carboxilo y/o amino del polipéptido CXCR5. Los segmentos de fusión pueden incluir, pero no se limitan a, regiones Fc de inmunoglobulina, glutatión-S-transferasa, β-galactosidasa, un segmento de poli-histidina capaz de unirse a un ión de metal divalente y proteína de unión a maltosa.

Pueden prepararse moléculas de ácidos nucleicos que codifican mutantes de secuencias de aminoácidos mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Los métodos incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis en casete de una versión mutante o no mutante anteriormente preparada de la molécula de interés (véase, por ejemplo, Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488(1985)).

La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, o fragmento, derivado o análogo del mismo (por ejemplo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo de la invención, un anticuerpo monocatenario de la invención

o una muteína de anticuerpo de la invención) incluye la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo o un fragmento del anticuerpo como se describe en el presente documento. Una vez ha sido obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, el vector para la producción del anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante como se conoce en la técnica. Se construye un vector de expresión que contiene secuencias codificantes de anticuerpos y señales de control transcripcional y traduccional apropiadas. Los métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo.

El vector de expresión se transfiere a una célula hospedadora por técnicas convencionales y las células transfectadas se cultivan entonces por técnicas convencionales para producir un anticuerpo o fragmento de la invención. En un aspecto de la invención, vectores que codifican tanto las cadenas pesadas como las ligeras pueden ser coexpresados en la célula hospedadora para la expresión de la molécula de inmunoglobulina entera, como se detalló en el presente documento.

Puede utilizarse una variedad de sistemas de hospedador/vector de expresión para expresar las moléculas de anticuerpo de la invención. Tales sistemas de expresión representan vehículos por los que las secuencias codificantes de interés pueden producirse y posteriormente purificarse, pero también representan células que pueden, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, expresar una molécula de anticuerpo de la invención in situ. Se usan comúnmente células bacterianas, tales como E. coli, y células eucariotas para la expresión de una molécula de anticuerpo recombinante, especialmente para la expresión de molécula de anticuerpo recombinante completa. Por ejemplo, células de mamífero, tales como células CHO, conjuntamente con un vector, tales como un que lleva el elemento promotor del gen temprano intermedio principal del citomegalovirus humano, son un sistema de expresión eficaz para anticuerpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); y Cockett et al, Bio/Technology 8:2 (1990)). También pueden usarse plantas y cultivo de células de planta, células de insecto, etc., para preparar las proteínas de interés, como se conoce en la técnica.

Además, se elige una célula hospedadora que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto génico en el modo específico deseado. Tales modificaciones (por ejemplo, glucosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de productos de proteína pueden ser importantes para la función de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento

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postraduccional y la modificación de proteínas y productos génicos. Pueden elegirse líneas celulares apropiadas o sistemas de hospedador para garantizar la correcta modificación y procesamiento del anticuerpo expresado de interés. Por tanto, pueden usarse células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el apropiado procesamiento del transcrito primario, glucosilación y fosforilación del producto génico. Tales células hospedadoras de mamífero incluyen, pero no se limitan a, células CHO, COS, 293, 3T3 o de mieloma.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere expresión estable. Por ejemplo, pueden manipularse líneas celulares que expresan establemente la molécula de anticuerpo. En vez de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, pueden transformarse células hospedadoras con ADN controlado por elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.) y un marcador de selección. Tras la introducción del ADN foráneo, puede dejarse que células manipuladas crezcan durante uno a dos días en un medio enriquecido, y luego se mueven a medios selectivos. El marcador de selección en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren establemente el plásmido en un cromosoma y se expandan en una línea celular. Tales líneas celulares manipuladas no solo son útiles para la producción de anticuerpos, sino que son útiles en el cribado y evaluación de compuestos que interaccionan directamente o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Pueden usarse varios sistemas de selección, que incluyen, pero no se limitan a, timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)), selección de glutamato sintasa en presencia de metionina sulfoximida (Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006 y véase la página web o bibliografía de Lonza Group Ltd.) y los genes de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) en células tk, hgprt o aprt, respectivamente. Por tanto, puede usarse resistencia antimetabolito como la base de selección para los siguientes genes: dhfr, que

Pueden aumentarse los niveles de expresión de una molécula de anticuerpo por amplificación de vector (por ejemplo, véase Bebbington et al., en DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa anticuerpo es amplificable, un aumento en el nivel de inhibidor presente en el cultivo aumentará el número de copias del gen marcador. Como la región amplificada está asociada al gen de anticuerpo, también aumentará la producción del anticuerpo (Crouse et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983)).

La célula hospedadora puede cotransfectarse con dos o más vectores de expresión de la invención, por ejemplo, el primer vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo vector que codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores de selección idénticos que permiten expresión igual de polipéptidos de la cadena pesada y ligera. Alternativamente, puede usarse un único vector que codifica, y es capaz de expresar, tanto los polipéptidos de la cadena pesada como ligera. En tales situaciones, la cadena ligera debe ponerse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); y Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)). Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.

Una vez se ha producido una molécula de anticuerpo de la invención por un animal, sintetizado químicamente o expresado recombinantemente, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, particularmente por afinidad por CXCR5 después de cromatografía en proteína A y de exclusión por tamaño, etc.), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos heterólogos descritos en el presente documento o de otro modo conocidos en la técnica, para facilitar la purificación.

Se usó proteína CXCR5 recombinante, como se ejemplifica en los ejemplos más adelante, para inmunizar ratones para generar los hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales de la presente invención. De entre los monoclonales obtenidos se seleccionaron aquellos con potencial terapéutico beneficioso, por ejemplo, prevención de la unión del ligando de CXCR5 al mismo. Entonces se modificaron los anticuerpos seleccionados para obtener propiedades beneficiosas, tales como tener estabilidad potenciada in vivo.

Los anticuerpos de la presente invención pueden generarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos de la presente invención pueden comprender anticuerpos policlonales, aunque debido a la modificación de anticuerpos para optimizar el uso en el ser humano, además de para optimizar el uso del anticuerpo por sí mismo, se prefieren anticuerpos monoclonales debido a la facilidad de producción y manipulación de proteínas particulares. Métodos de preparación de anticuerpos policlonales son conocidos para el experto (Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. (1988)).

Por ejemplo, un inmunogén, como se ejemplifica en el presente documento, puede administrarse a diversos animales hospedadores que incluyen, pero no se limitan a, conejos, ratones, camélidos, ratas etc., para inducir la producción de suero que contiene anticuerpos policlonales específicos para CXCR5. La administración del inmunogén puede conllevar una o más inyecciones de un agente inmunizante y, si se desea, un adyuvante. Pueden usarse diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie de hospedador, e

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directamente por células hospedadoras recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de una biblioteca de fagos de anticuerpo. Alternativamente, pueden recuperarse directamente fragmentos F(ab')2-SH de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992). Según otro enfoque, pueden aislarse fragmentos F(ab')2 directamente de cultivo de células hospedadoras recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para el médico habitual. En otras realizaciones, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena individual (Fv) (documento WO 93/16185).

Para algunos usos, que incluyen el uso in vivo de anticuerpos en seres humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos. Se conocen en la técnica métodos de producción de anticuerpos quiméricos, véanse, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989); y las patentes de EE.UU. N.º 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397.

Anticuerpos humanizados derivan de moléculas de anticuerpo generadas en una especie no humana que se une a CXCR5 en la que una o más CDR de la misma se insertan en las regiones FR de una molécula de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden humanizarse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, por ejemplo, injerto de CDR (documentos EPO 239.400; WO 91/09967; y patentes de EE.UU. N.º 5.225.539; 5.530.101; y 5.585.089), inactivación o acondicionamiento superficial (documentos EPO 592.106; EPO 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); y Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)) y barajado de cadenas (patente de EE.UU. N.º 5.565.332).

Un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos de aminoácidos de una fuente que es no humana. Los restos de aminoácidos no humanos se denominan frecuentemente restos de "importación", que normalmente son tomados de un dominio variable de "importación". La humanización puede ser esencialmente realizada siguiendo los métodos de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); y Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), sustituyendo CDR no humanas o porciones de secuencias de CDR con las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU. N.º 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido con la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR están sustituidos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. La región constante de la cadena pesada, que puede incluir uno o más dominios de la cadena pesada, y región bisagra, pueden ser de cualquier clase o subclase para obtener un efecto deseado, tal como una función efectora particular.

Frecuentemente, los restos de la región estructural en las regiones estructurales humanas pueden estar sustituidos con el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, y posiblemente mejorar, la unión al antígeno. Las sustituciones de la región estructural se identifican por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por modelado de las interacciones de los restos de CDR y de la región estructural para identificar restos de la región estructural importantes para la unión al antígeno y comparación de secuencias para identificar restos de la región estructural poco usuales en las posiciones particulares, véanse, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.º 5.585.089; y Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).

Es preferible además que los anticuerpos humanizados retengan la alta afinidad por CXCR5, y retengan o adquieran otras propiedades biológicas favorables. Así, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Comúnmente están disponibles modelos de inmunoglobulina tridimensionales y son conocidos para aquellos expertos en la materia. Están disponibles programas informáticos que ilustran y muestran las probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de la muestra permite el análisis de la probable función de ciertos restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a CXCR5. De esa forma, pueden seleccionarse restos de FR y combinarse de las secuencias de receptor y de importación de manera que la característica del anticuerpo deseado, tal como la elevada afinidad por el antígeno diana, se maximice, aunque son los restos de CDR los que influyen directamente y más sustancialmente en la unión a CXCR5. Las regiones CDR también pueden modificarse para contener uno o más aminoácidos que varían de los obtenidos del anticuerpo parental del que se obtuvo la CDR, para proporcionar propiedades potenciadas o diferentes de interés, tales como unión de mayor afinidad o mayor avidez, por ejemplo.

Pueden manipularse y cambiarse ciertas porciones de las regiones constantes de anticuerpo para proporcionar homólogos de anticuerpo, derivados, fragmentos y similares con propiedades diferentes de o mejores que las observadas en el anticuerpo parental. Así, por ejemplo, muchos anticuerpos IgG4 forman enlaces disulfuro intracatenarios cerca de la región bisagra. El enlace intracatenario puede desestabilizar la molécula bivalente parental que forma las moléculas monovalentes que comprenden una cadena pesada con la cadena ligera asociada. Tales moléculas pueden reasociarse, pero en una base al azar.

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Se observó que modificar los aminoácidos en la región bisagra de moléculas IgG4 puede reducir la probabilidad de formación de enlaces intracatenarios, estabilizando así la molécula de IgG4, que minimizará la probabilidad de formar moléculas biespecíficas. Esa modificación puede ser beneficiosa si un anticuerpo terapéutico es una molécula de IgG4 ya que la estabilidad potenciada minimizará la probabilidad de que la molécula se disocie durante la producción y fabricación, además de in vivo. Un anticuerpo monovalente puede no tener la misma eficacia que la molécula parental bivalente. Por ejemplo, cuando se administra IgG4 bivalente a un paciente, el porcentaje de IgG4 bivalente se deteriora a aproximadamente el 30 % durante un periodo de dos semanas. Una sustitución de aminoácidos en la posición 228 potencia la estabilidad de IgG4. La serina que reside en 228 puede sustituirse con otro aminoácido, tal como uno de los restantes 19 aminoácidos. Un cambio tal puede hacerse particularmente con anticuerpos recombinantes en los que la secuencia codificante de ácidos nucleicos puede mutarse para dar un aminoácido de sustitución en la posición 228. Por ejemplo, S pueden sustituirse con una prolina.

Otro conjunto de aminoácidos adecuados para la modificación incluyen aminoácidos en el área de la bisagra que afectan la unión de una molécula que contiene una cadena pesada con la unión al receptor de Fc e internalización de anticuerpo unido. Tales aminoácidos incluyen, en moléculas IgG1, los restos de aproximadamente 233 a aproximadamente 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly); (SEQ ID NO: 49) de aproximadamente 252 a aproximadamente 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr) (SEQ ID NO: 50) y de aproximadamente 318 (Glu) a aproximadamente 331 (Pro), que incluyen, por ejemplo, Lys320, Lys322 y Pro329.

Son particularmente deseables anticuerpos completamente humanos para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Pueden prepararse anticuerpos humanos mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen los métodos de presentación en fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana, véanse las patentes de EE.UU. N.º 4.444.887 y 4.716.111; y los documentos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. Las técnicas de Cole et al. y Boerder et al. también están disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985); y Boerner et al., J Immunol 147:86 (1991)).

También pueden producirse anticuerpos humanos usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que también expresan ciertos genes de la inmunoglobulina humana. Por ejemplo, pueden introducirse complejos de genes de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera humana al azar o por recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, pueden introducirse la región variable humana, región constante y región de diversidad en células madre embrionarias de ratón, además de los genes de la cadena pesada y ligera humanos. Los genes de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera de ratón pueden convertirse en no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de los loci de inmunoglobulina humana por recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica de la región JH previene la producción endógena de anticuerpos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos son entonces criados para producir descendencia homocigótica que expresa anticuerpos humanos, véase, por ejemplo, Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol

7:33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)).

Los ratones transgénicos se inmunizan del modo normal con un CXCR5, por ejemplo, todo o una porción de CXCR5, tal como el dominio EC del mismo. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CXCR5 pueden obtenerse de los ratones transgénicos inmunizados usando tecnología de hibridomas convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana alojados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de linfocitos B, y posteriormente experimentan cambio de clase y mutación somática. Así, usando una técnica tal, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general, véase Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995). Para una discusión de la producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos de producción de tales anticuerpos, véanse, por ejemplo, los documentos WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; y WO 96/33735; EPO N.º 0 598 877; y las patentes de EE.UU. N.º 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Además, pueden contratarse empresas tales como Amgen (Fremont, CA), Genpharm (San Jose, CA) y Medarex, Inc. (Princeton, NJ) para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra CXCR5 usando tecnología similar a la descrita anteriormente.

Por tanto, podrían prepararse mAb humanos inmunizando ratones trasplantados con leucocitos de sangre periférica humana, esplenocitos o médula ósea (por ejemplo, técnica de triomas de XTL Biopharmaceuticals, Israel). Pueden generarse anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope seleccionado usando una técnica denominada "selección guiada". En ese enfoque, se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítope (Jespers et al., Bio/Technology 12:899 (1988)).

Si se usan técnicas recombinantes, la variante de anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o ser directamente secretada en el medio. Si la variante de anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, el residuo de partículas, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, puede eliminarse, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992) describen un

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