ES2660000T3

ES2660000T3 - Vacunas y microorganismos dependientes de la replicación de aminoácidos no naturales

Info

Publication number: ES2660000T3
Application number: ES09817017.8T
Authority: ES
Inventors: Feng Tian; Brad Hehli
Original assignee: Ambrx Inc
Current assignee: Ambrx Inc
Priority date: 2008-09-26
Filing date: 2009-09-28
Publication date: 2018-03-20
Anticipated expiration: 2029-09-28
Also published as: PE20110480A1; CN102224238A; TR201802361T4; CA2738033C; EA201170493A1; ZA201102717B; US20130280301A1; WO2010037062A1; AU2009296267A1; PL2337846T3; IL236063A0; DK2337846T3; US20110195483A1; MX348657B; CA2738033A1; MX357314B; MX2011003196A; EP2337846B1; NZ607477A; MX343802B

Abstract

Una célula en la que un aminoácido no natural se ha incorporado de forma específica de sitio en un producto génico necesario para la replicación, en la que dicha célula es capaz de replicación en presencia de dicho aminoácido no natural, y tiene una capacidad limitada, o nula, de replicación en ausencia de dicho aminoácido no natural.

Description

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de eficacia para un codón selector dado, de más de aproximadamente un 90% de eficacia para un codón selector dado, más de aproximadamente un 95% de eficacia para un codón selector dado, o más de aproximadamente un 99% de eficacia para un codón selector dado.

Un "tratamiento profiláctico" es un tratamiento administrado a un sujeto que no presenta signos o síntomas de una enfermedad, patología, o trastorno médico, o presenta solo signo o síntomas tempranos de una enfermedad, patología, o trastorno, de tal manera que el tratamiento se administra con el objetivo de disminuir, prevenir, o disminuir el riesgo de desarrollar la enfermedad, patología o trastorno médico. Un tratamiento profiláctico funciona como un tratamiento preventivo frente a una enfermedad o trastorno. Una "actividad profiláctica" es una actividad de un agente, tal como un inmunógeno no natural y/o un anticuerpo, o composición del mismo, que, cuando se administra a un sujeto que no presenta signos o síntomas de una patología, enfermedad, o trastorno (o que presenta solo signos o síntomas tempranos de las mismas) reduce, previene, o disminuye el riesgo del sujeto de desarrollar la patología, enfermedad o trastorno. Un agente o compuesto "profilácticamente útil" (por ejemplo, un inmunógeno no natural y/o un anticuerpo de la descripción, se refiere a un agente o compuesto que es útil para reducir, prevenir, tratar, o disminuir el desarrollo de una patología, enfermedad o trastorno.

Los tratamientos, vacunas, y/o tratamientos profilácticos se pueden administrar a un paciente que lo necesita. Los tratamientos, vacunas, y/o tratamientos profilácticos pueden administrarse también a una variedad de animales incluyendo, aunque no de forma limitativa, ganadería doméstica, tal como vacas, cerdos, cabras, ovejas, pollos, y/u otros animales de granja comunes y mascotas domésticas comunes, por ejemplo, gatos, perros, loros, periquitos, etc.

La expresión "codón selector" se refiere a codones reconocidos por el O-ARNt en el proceso de traducción y no reconocidos por un ARNt endógeno. El bucle anticodón del O-ARNt reconoce el codón selector en el ARNm e incorpora su aminoácido, por ejemplo, un aminoácido seleccionado, tal como un aminoácido artificial, en este sitio en el polipéptido. Los codones selectores pueden incluir, aunque no de forma limitativa, por ejemplo, codones finalizadores, tales como, codones de terminación, incluyendo, aunque no de forma limitativa, codones ámbar, ocre, y ópalo; cuatro o más codones base; codones raros; codones derivados de parejas de bases naturales o no naturales y/o similares. Para un sistema dado, un codón selector puede incluir también uno de los tres codones base naturales, en el que el sistema endógeno no utiliza (o utiliza raramente) dicho codón de tres bases natural. Por ejemplo, esto incluye un sistema que carece de ARNt que reconoce el codón de tres bases natural, y/o un sistema en el que el codón de tres bases natural es un codón raro.

Un ARNt supresor es un ARNt que altera la lectura de un ARN mensajero (ARNm) en un sistema de traducción dado, por ejemplo, proporcionando un mecanismo para incorporar un aminoácido en una cadena polipeptídica en respuesta a un codón selector. Por ejemplo, un ARNt supresor que puede leer a través de un codón incluyendo, aunque no de forma limitativa, un codón de terminación, un codón de cuatro bases, o un codón raro.

La expresión "actividad de supresión" se refiere a la capacidad de un ARNt, por ejemplo, un ARNt supresor, de leer a través de un codón selector. La actividad puede expresarse como un porcentaje de actividad observado en comparación con un control (por ejemplo, careciendo de una sintetasa análoga).

La expresión "sistema de traducción" se refiere a los componentes necesarios para incorporar un aminoácido que se produce naturalmente en una cadena polipeptídica en crecimiento (proteína). Los componentes de un sistema de traducción pueden incluir, por ejemplo, ribosomas, ARNt, sintetasas, ARNm y similares. Los componentes de la presente divulgación pueden añadirse a un sistema de traducción in vitro o in vivo. Los ejemplos de sistemas de traducción incluyen, aunque no de forma limitativa, una célula no eucariota, por ejemplo, una bacteria (tal como E. coli), una célula eucariota, por ejemplo, una célula de levadura, una célula de mamífero, una célula vegetal, una célula de alga, una célula de hongo, una célula de insecto, un sistema de traducción exento de células, por ejemplo, un lisado celular, y/o similares.

Los sistemas de traducción pueden ser celulares o exentos de células, y pueden ser procariotas o eucariotas. Los sistemas de traducción celulares incluyen, aunque no de forma limitativa, preparaciones de organismos completos tales como células o cultivos de células permeabilizadas en los que una secuencia de ácido nucleico deseada se puede transcribir en ARNm y el ARNm traducirse. Los sistemas de traducción exentos de células están comercialmente disponibles y se conocen bien muchos tipos y sistemas diferentes. Los ejemplos de sistemas exentos de células incluyen, aunque no de forma limitativa, lisados procarióticos tales como lisados de Escherichia coli, y lisados eucarióticos tales como extractos de germen de trigo, lisados de células de insectos, lisados de reticulocitos de conejos, lisados de oocitos de conejos y lisados de células humanas. Pueden preferirse extractos o lisados eucarióticos cuando la proteína resultante está glicosilada, fosforilada o modificada de otra forma debido a que muchas de dichas modificaciones son solo posibles en sistemas eucarióticos. Algunos de estos extractos y lisados están disponibles comercialmente (Promega; Madison, Wis.; Stratagene; La Jolla, Calif.; Amersham; Arlington Heights, Ill.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.). Están también disponibles extractos membranosos, tales como extractos de páncreas caninos que contienen membranas ribosómicas, que son útiles para traducir proteínas secretoras.

Se pueden utilizar también sistemas de traducción reconstituidos. Se han utilizado también satisfactoriamente

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mezclas de factores de traducción purificados para traducir ARNm en una proteína así como combinaciones de lisados o lisados suplementados con factores de traducción purificados tales como el factor-1 de inicio (IF-1), IF-2, IF-3 (α o β), factor T de alargamiento (EF-Tu), o factores de terminación. Los sistemas exentos de células pueden también acoplarse a los sistemas de transcripción/traducción en los que el ADN se introduce en el sistema, se transcribe en ARNm y el ARNm se traduce como se describe en Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel y col. editores, Wiley Interscience, 1993). El ARN transcrito en el sistema de transcripción eucariota puede estar en la forma de un ARN heteronuclear (ARNhn) o protecciones en extremo 5' (7-metil guanosina) y ARNm madura con una cola poli A en el extremo 3', que puede ser una ventaja en determinados sistemas de traducción. Por ejemplo, los ARNm protegidos se traducen con una alta eficacia en el sistema de lisados de reticulocitos.

La expresión "aminoácido seleccionado" se refiere a cualquier aminoácido que se produce naturalmente o aminoácido no natural deseado. Tal como se usa en el presente documento, la expresión "aminoácido artificial" o "aminoácido codificado de forma no natural" se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado, y/o análogo de aminoácido que no es uno de los 20 aminoácidos que se producen naturalmente o selenocisteína o pirrolisina. Otros términos que se pueden usar de forma sinónima con la expresión "aminoácido codificado de forma no natural" y "aminoácido artificial" son "aminoácido no natural", y aminoácido que no se produce naturalmente", y versiones con varios guiones y sin guiones de los mismos. La expresión "aminoácido codificado no naturalmente" incluye también, aunque no de forma limitativa, aminoácidos que se producen mediante modificación (por ejemplo, modificaciones posteriores a la traducción) de un aminoácido codificado naturalmente (incluyendo, aunque no de forma limitativa, los 20 aminoácidos comunes o pirrolisina y selenocisteína) pero no se incorporan por sí mismos en una cadena polipeptídica en crecimiento mediante el complejo de traducción. Los ejemplos de dichos aminoácidos que no se producen naturalmente incluyen, aunque no de forma limitativa, N-acetilglucosaminil-L-serina, N-acetilglucosaminil-Ltreonina, y O-fosfotirosina.

Aminoácido no natural: Tal como se usa en el presente documento, un aminoácido no natural o un análogo de aminoácido codificado se refiere a cualquier aminoácido, aminoácido modificado, o análogo de aminoácidos diferente que la selenocisteína y/o pirrolisina y los siguiente veinte alfa-aminoácidos clásicos codificados genéticamente: alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina. En diversas realizaciones de la invención, el uno o más aminoácido artificial que se incorpora en el inmunógeno artificial puede ser cualquier aminoácido artificial. Por lo tanto, se apreciará que la citación de aminoácidos artificiales específicos en el presente documento no debe tomarse como limitante sobre la invención. Se ha incorporado una amplia variedad de aminoácidos artificiales en las proteínas codificándolas in vivo, por ejemplo, utilizando los sistemas de traducción que comprenden elementos ortogonales. Véanse, por ejemplo, Liu, y col. (2007) "Genetic incorporation of unnatural amino acids into proteins in mammalian cells" Nat Methods 4:239-244; Wang, y col. (2006) "Expanding the genetic code" Annu Rev Biophys Biomol Struct 35:225-249; Xie & Schultz (2006) "A chemical toolkit for proteins-an expanded genetic code" Nat Rev MoI Cell Biol 7:775-782; Wang y Schultz "Expanding the Genetic Code," Angewandte Chemie Int. Ed, 44(1):34-66 (2005) y Chin, y col. (2003) "An expanded eukaryotic genetic code" Science 301:964-967 para una revisión.

En algunas realizaciones de la presente invención es deseable utilizar aminoácidos no naturales que no son uno de los 20 aminoácidos comunes que se producen naturalmente o los aminoácidos raros que se producen naturalmente, por ejemplo, selenocisteína o pirrolisina. Por ejemplo, los aminoácidos no naturales, p-nitrofenilalanina, psulfotirosina, y p-carboxifenilalanina encuentran uso en diversas realizaciones en el presente documento. En algunas realizaciones, los aminoácidos no naturales pueden incluir, aunque no de forma limitativa: p-nitrofenilalanina; una onitrofenilalanina; una m-nitrofenilalanina; una p-boronilfenilalanina; una o-boronilfenilalanina; una mboronilfenilalanina; una p-aminofenilalanina; una o-aminofenilalanina; una m-aminofenilalanina; una pacilfenilalanina; una o-acilfenilalanina; una m-acilfenilalanina; una p-OMe fenilalanina; una o-OMe fenilalanina; una m-OMe fenilalanina; una p-sulfofenilalanina; una o-sulfofenilalanina; una m-sulfofenilalanina; una 5-nitro His; una 3nitro Tyr; una 2-nitro Tyr; una Leu nitrosustituida; una His nitrosustituida; un De nitrosustituido; un Trp nitrosustituido; un 2-nitro Trp; un 4-nitro Trp; un 5-nitro Trp; un 6-nitro Trp; un 7-nitro Trp; 3-aminotirosina, 2-aminotirosina, Osulfotirosina, 2-sulfoxifenilalanina, 3-sulfoxioxifenilalanina o p-carboxifenilalanina, o-carboxifenilalanina, y mcarboxifenilalanina. Igualmente, Se apreciara que la invención no se limita a aminoácidos no naturales concretos.

Además, en diversas realizaciones de la presente invención, se pueden incorporar aminoácidos artificiales en inmunógenos in vitro, por ejemplo, utilizando procedimientos biosintéticos en los que un ARNt supresor se acila químicamente con un aminoácido artificial deseado y se añade a un extracto in vitro capaz de soportar la biosíntesis del inmunógeno. Para una descripción de dichos procedimientos sintéticos in vitro, véanse, por ejemplo, V. W. Cornish, D. Mendel y P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34:621 (1995); CJ. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, "A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins," Science 244 182-188 (1989); y, J.D. Bain, CG. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, "Biosynthetic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide," J. Am. Chem. Soc. Il l 8013-8014 (1989). Se pueden añadir también aminoácidos artificiales a proteínas producidas de forma natural o sintética mediante las químicas de péptidos sintéticos disponibles (o se pueden convertir aminoácidos naturales en aminoácidos artificiales mediante dichos procedimientos), o mediante procesamiento posterior a la traducción. Igualmente, sin embargo, se apreciará que dichas modificaciones posteriores a la traducción y químicas se llevan a cabo normalmente junto con,

o además de, la incorporación de uno o más aminoácidos artificiales durante la síntesis de una molécula (por

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ejemplo, incorporación directa tal como traducción ortogonal, síntesis en fase sólida, etc.). Por lo tanto, la adición posterior a la traducción o la modificación química de aminoácidos se llevan a cabo normalmente, si es que es posible, solo en moléculas que ya tienen aminoácidos artificiales que se añadieron durante la síntesis de la molécula. Se proporciona a continuación información adicional sobre la incorporación no ortogonal de aminoácidos artificiales en inmunógenos.

Tal como se usa en el presente documento, la expresión "derivado de" se refiere a un componente que está aislado

o preparado utilizando información de una molécula u organismo especificado.

Una "célula hospedadora recombinante" o "célula hospedadora" se refiere a una célula que incluye un polinucleótido exógeno, sin tener en cuenta el procedimiento utilizado para la inserción, por ejemplo, captación directa, transducción, emparejamiento f, u otros procedimientos conocidos en la técnica para crear células hospedadoras recombinantes. El polinucleótido exógeno puede mantenerse como un vector no integrado, por ejemplo, un plásmido, o, de forma alternativa, puede integrarse en el genoma del hospedador.

Tal como se usa en el presente documento, el término "medio" o medios" incluye cualquier medio de cultivo, solución, soporte sólido, semisólido, o rígido que pueda soportar o contener cualquier célula hospedadora, incluyendo células hospedadoras bacterianas, células hospedadoras de levaduras, células hospedadoras de insectos, células hospedadoras vegetales, células hospedadoras eucariotas, células hospedadoras de mamíferos, células CHO, células hospedadoras procariotas, E. coli, o células hospedadoras de Pseudomonas, y los contenidos celulares. De esta manera, el término puede abarcar el medio en el que se ha hecho crecer la célula hospedadora, por ejemplo, el medio en el que se hace crecer un cultivo u organismo completo o célula, y el medio puede tener un aminoácido no natural incluido para soportar el crecimiento de organismos o células deficientes en la replicación, incluyendo cualquier medio antes o después de una etapa de proliferación. El término puede abarcar también tampones o reactivos que contienen lisados de células hospedadoras, tales como en el caso donde los antígenos se producen intracelularmente y las células hospedadoras se lisan o perturban para liberar los antígenos o antígenos recombinantes.

"Agente reductor", tal como se usa en el presente documento con respecto al replegado de una proteína, se define como cualquier compuesto o material que mantiene grupos sulfhidrilo en el estado reducido y reduce los enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares. Los agentes reductores adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, ditiotreitol (DTT), 2-mercaptoetanol, ditioeritritol, cisteína, cisteamina (2-aminoetanotiol), y glutatión reducido. Es fácilmente evidente para las personas normalmente expertas en la materia que una amplia variedad de agentes reductores son adecuados para el uso en las composiciones desveladas en el presente documento.

"Agente oxidante", tal como se usa en el presente documento con respecto al replegado de una proteína, se define como cualquier compuesto o material que es capaz de eliminar un electrón de un compuesto que se está oxidando. Los agentes oxidantes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, glutatión oxidado, cistina, cistamina, ditiotreitol oxidado, eritreitol oxidado, y oxígeno. Es fácilmente evidente para las personas normalmente expertas en la materia que es adecuada una amplia variedad de agentes oxidantes para el uso en los procedimientos desvelados en el presente documento.

"Replegado", tal como se usa en el presente documento describe cualquier proceso, reacción o procedimiento que transforma los polipéptidos que contienen enlaces disulfuro desde un estado plegado o desplegado inadecuadamente a una conformación natural o adecuadamente plegada con respecto a los enlaces disulfuro.

"Plegado simultáneo", tal como se usa en el presente documento, se refiere específicamente a procesos, reacciones

o procedimientos de replegado que emplean al menos dos polipéptidos que interactúan entre sí y dan como resultado la transformación de polipéptidos desplegados o plegados inadecuadamente en polipéptidos naturales, plegados adecuadamente.

Un "grupo modificador en el extremo amino" se refiere a cualquier moléculas que se puede unir al extremo amino de un polipéptido. De manera similar, un "grupo modificador en el extremo carboxi" se refiere a cualquier molécula que se puede unir al extremo carboxi de un polipéptido. Los grupos modificadores de extremos incluyen, aunque no de forma limitativa, diversos polímeros, péptidos o proteínas solubles en agua tales como albúmina de suero, u otros restos que aumentan la semivida en suero de los péptidos.

Las expresiones "grupo funcional", "resto activo", "grupo activador", "grupo saliente", "sitio reactivo", "grupo químicamente reactivo" y "resto químicamente reactivo se utilizan en la técnica y en el presente documento para referirse a partes o unidades distintas, definibles de una molécula. Los términos son algunas veces sinónimos en las técnicas químicas y se usan en el presente documento para indicar las partes de moléculas que llevan a cabo alguna función o actividad y son reactivas con otras moléculas.

El término "enlace" o "enlazador" se usa en el presente documento para referirse a grupos o enlaces que normalmente se forman como el resultado de una reacción química y normalmente son enlaces covalentes. Los enlaces hidrolíticamente estables significan que los enlaces son sustancialmente estables en agua y no reaccionan con agua a valores de pH útiles, incluyendo, aunque no de forma limitativa, en condiciones fisiológicas durante un periodo extendido de tiempo, quizás incluso de forma indefinida. Los enlaces hidrolíticamente inestables o

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limitativa, arilo sustituido con 1-3 halógenos, alquilo sustituido o no sustituido, grupos alcoxi o tioalcoxi, o grupos arilalquilo. Cuando un compuesto de la descripción incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona de forma independiente para cada uno de los grupos R', R", R"’ y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos. Cuando R' y R'' se unen al mismo átomo de nitrógeno, se pueden combinar con el átomo de nitrógeno para formar un anillo de 5, 6, o 7 miembros. Por ejemplo, se entiende que -NR’R" incluye, aunque no de forma limitativa, 1-pirrolidinilo y 4-morfolinilo. A partir de la anterior discusión de sustituyentes, un experto en la materia comprenderá que se entiende que el término alquilo incluye grupos que incluyen átomos de carbono unidos a grupos diferentes que los grupos hidrógeno, tales como haloalquilo (incluyendo, aunque no de forma limitativa, -CF3 y -CH2CF3) y acilo (incluyendo, aunque no de forma limitativa, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, y similares).

de forma similar a los sustituyentes descritos para el radical alquilo, los sustituyentes para los grupos arilo y heteroarilo se varían y se seleccionan entre, aunque no de forma limitativa: halógeno, OR’, =O, =NR’, =N-OR’, NR’R", -SR’, -halógeno, -SiR’R"R"’, OC(O)R’, -C(O)R’, CO2R’,-CONR’R", -OC(O)NR’R", -NR"C(O)R’, NR’ C(O)NR"R"’, -NR"C(O)2R’, NRC(NR’R"R"’)=NR"", NR C(NR’R")=NR"’, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2NR’R", NRSO2R’, -CN y -NO2, -R’, -N3, -CH(Ph)2, fluoroalcoxi (C1-C4), y fluoroalquilo (C1-C4), en un número que varía desde cero al número total de valencias abiertas del sistema de anillo aromático; y donde R', R", R"’ y R"" se seleccionan de forma independiente entre hidrógeno, alquilo, heteroalquilo, arilo y heteroarilo. Cuando un compuesto de la descripción incluye más de un grupo R, por ejemplo, cada uno de los grupos R se selecciona de forma independiente para cada uno de los grupos R', R", R"’ y R"" cuando está presente más de uno de estos grupos.

El término "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos, desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, o ribonucleótidos y polímeros de los mismos tanto en forma monocatenaria como bicatenaria. Salvo que esté específicamente limitado, el término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares como el ácido nucleico de referencia y se metabolizan de una manera similar a los nucleótidos que se producen naturalmente. Salvo que esté específicamente limitado de otra forma, el término se refiere también a análogos de oligonucleótidos que incluyen PNA (ácido peptidonucleico), análogos de ADN utilizados en una tecnología de sentido contrario (fosforotioatos, fosforoamidatos, y similares). Salvo que se indique lo contrario, una secuencia de ácido nucleico concreta abarca también implícitamente variantes modificadas conservativamente de las mismas (incluyendo, aunque no de forma limitativa, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia indicada de forma explícita. Específicamente, se pueden conseguir sustituciones de codones degenerados generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más (o todos) codones seleccionados está sustituida con restos de base mixta y/o desoxinosina (Batzer y col., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka y col., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini y col., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).

Donde los grupos sustituyentes están especificados por sus fórmulas químicas convencionales, escritas desde la izquierda a la derecha, abarcan igualmente los sustituyentes químicamente idénticos que resultarían de escribir la estructura desde la derecha a la izquierda, por ejemplo, la estructura CH2O es equivalente a la estructura -OCH2.

El término "sustituyentes" incluye, aunque no de forma limitativa, "sustituyentes no interferentes". Los "sustituyentes no interferentes" son aquellos grupos que dan como resultado compuestos estables. Los sustituyentes o radicales no interferentes adecuados incluyen, aunque no de forma limitativa, halo, alquilo C1-C10, alquenilo C2-C10, alquinilo C2-C10, alcoxi C1-C10, aralquilo C1-C12, alcarilo C1-C12, cicloalquilo C3-C12, cicloalquenilo C3-C12, fenilo, fenilo sustituido, toluilo, xilenilo, bifenilo, alcoxialquilo C2-C12, alcoxiarilo C2-C12, ariloxialquilo C7-C12, oxiarilo C7-C12, alquilsulfinilo C1-C6, alquilsulfonilo C1-C10, --(CH2)m --O--(alquilo C1-C10) en el que m es de 1 a 8, arilo, arilo sustituido, alcoxi sustituido, fluoroalquilo, radical heterocíclico, radical heterocíclico sustituido, nitroalquilo, --NO2, --CN, --NRC(O)--(alquilo C1-C10), --C(O)--(alquilo C1-C10), alquil C2-C10 tioalquilo, --C(O)O--(alquilo C1-C10), --OH, --SO2, =S,-COOH, --NR2, carbonilo, --C(O)--(alquilo C1-C10)-CF3, --C(O)-CF3, --C(O)NR2, --(arilo C1-C10)-S--(arilo C6-C10), --C(O)--(arilo C1-C10), --{CH2)m --O--(--(CH2)m--O--(alquilo C1-C10) en el que cada m es de 1 a 8, -C(O)NR2, --C(S)NR2, --SO2NR2, --NRC(O) NR2,-NRC(S) NR2, las sales de los mismos y similares. Cada R, como se usa en el presente documento es H, alquilo o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, aralquilo, o alcarilo.

El término "halógeno" incluye flúor, cloro, yodo, y bromo.

El término "alquilo", por sí mismo o como parte de otro sustituyente, significa, salvo que se indique otra cosa, una cadena lineal o ramificada, o un radical hidrocarburo cíclico, o una combinación de los mismos, que puede estar completamente saturado, monosaturado o polinsaturado y puede incluir radicales divalentes y multivalentes, que tienen el número de átomos de carbono designado (es decir, C1-C10 significa uno a diez carbonos). Los ejemplos de radicales hidrocarburo saturados incluyen, aunque no de forma limitativa, grupos tales como metilo, etilo, npropilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo, isobutilo, sec-butilo, ciclohexilo, (ciclohexil)metilo, ciclopropilmetilo, homólogos e isómeros de, por ejemplo, n-pentilo, n-hexilo, n-heptilo, n-octilo y similares. Un grupo alquilo insaturado es uno que tiene uno o más dobles enlaces o triples enlaces. Los ejemplos de grupos alquilo insaturados incluyen, aunque no de forma limitativa, vinilo, 2-propenilo, crotilo, 2-isopentenilo, 2-(butadienilo), 2,4-pentadienilo, 3-(1,4-pentadienilo), etinilo, 1-y 3-propinilo, 3-butinilo, y los homólogos e isómeros superiores. Se entiende que el término "alquilo", salvo que se indique de otra manera, incluye aquellos derivados de alquilo definidos con más detalle a continuación, tales como "·heteroalquilo". Los grupos alquilo que se limitan a grupos hidrocarburo se denominan "homoalquilo".

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"Variantes modificadas conservativamente” se aplica tanto a secuencias de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácido nucleico concretas, “variantes modificadas conservativamente” se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en las que el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, en secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifica cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican, todos ellos, el aminoácido alanina. De esta manera, en cada posición en la que una alanina se especifica por un codón, el codón puede alterarse para cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas conservativamente. En el presente documento, toda secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido también describe toda posible variación silente del ácido nucleico. Una persona normalmente experta en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es, de forma ordinaria, el único codón para metionina, y TGG, que es, de forma ordinaria, el único codón para triptófano) puede modificarse para dar como resultado una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

Como para las secuencias de aminoácidos, una persona normalmente experta en la materia reconocerá que las sustituciones, deleciones o adiciones individuales en una secuencia de un ácido nucleico, péptido, polipéptido, o proteína que alteran, añaden o eliminan un único aminoácido o un pequeños porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante modificada conservativamente" en la que la alteración da como resultado de deleción de un aminoácido, la adición de un aminoácido, o la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas por las personas normalmente expertas en la materia. Dichas variantes modificadas conservativamente se suman y no excluyen las variantes polimórficas, homólogos entre especies y alelos de la invención.

Las tablas de sustituciones conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas por las personas normalmente expertas en la materia. Los siguientes ocho grupos contienen aminoácidos que son sustituciones conservativas unos de otros:

1) Alanina (A), Glicina (G);

2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);

3) Asparagina (N), Glutamina (Q);

4) Arginina (R), Lisina (K);

5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);

6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);

7) Serina (S), Treonina (T); y

8) Cisteína (C), Metionina (M)

(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2ª edición (Diciembre 1993)

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad" en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales. Las secuencias son "sustancialmente idénticas" si tienen un porcentaje de restos de aminoácidos o nucleótidos que son iguales (es decir, aproximadamente un 60% de identidad, aproximadamente 65%, aproximadamente 70%, aproximadamente 75%, aproximadamente 80%, aproximadamente 85%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% de identidad sobre una región especificada), cuando se comparan y alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o una región designada medida usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencias (u otros algoritmos disponibles para las personas normalmente expertas en la materia) o mediante alineamiento manual e inspección visual. Esta definición también se refiere a la complementaria de una secuencia de ensayo. La identidad puede existir sobre una región que tiene una longitud de al menos aproximadamente 50 aminoácidos o nucleótidos, o, sobre una región que tiene una longitud de 75-100 aminoácidos o nucleótidos, o, donde no se especifica, a través de la secuencia completa de un polinucleótido o polipéptido. Se puede obtener un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente divulgación, incluyendo los homólogos de especies diferentes del ser humano, mediante un proceso que comprende las etapas de cribar una biblioteca en condiciones de hibridación rigurosas con una sonda marcada que tiene una secuencia de polinucleótidos de la descripción o un fragmento de la misma, y aislar el ADNc de longitud completa y los clones genómicos que contienen dicha secuencia de polinucleótidos. Dichas técnicas de hibridación son bien conocidas el técnico experto.

Para la comparación de la secuencia, normalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la

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aminoacilación de la ARNt por la ARNt sintetasa, EF-Tu se une al ARNt aminoacilado y lleva este al sitio A del ribosoma. El enlace éster entre el aminoácido cargado y el ARNt está protegido de la hidrólisis espontánea debida a la unión entre EF-Tu y el ARNt aminoacilado. Stortchevoi y col. investigaron los mutantes del par de bases inestables U50:G64 del tRNAfMet de inicio de E. coli en el tallo TΨC, debido a que se encontró que este par de bases era un determinante negativo secundario que bloqueaba la actividad del ARNt en el alargamiento, debido presumiblemente a una interacción debilitada entre el EF-Tu.GTP y el ARNt aminoacilado (JBC 2003 278(20):1767217679). Asimismo, LaRiviere y col. describieron en Science del 5 de octubre de 2001;294(5540):165-8 las contribuciones termodinámicas del aminoácido y el cuerpo del ARNt para la afinidad de unión global con EF-Tu. Ellos indicaron que las contribuciones del cuerpo del ARNt y el aminoácido son independientes entre sí y que se compensan entre sí cuando los ARNt están correctamente acilados. Las alteraciones de la interacción entre EF-Tu.GTP y el ARNt aminoacilado con el aminoácido artificial puede afectar a la eficacia de la carga del ARNt en el sitio A del ribosoma. Se pueden encontrar los sitios de mutaciones potenciales pueden también encontrarse analizando las estructuras cristalinas de los complejos entre el ARNt y otros componentes de la maquinaria de traducción tales como EF-Tu. Por ejemplo, Nissen y col. han indicado que EF-Tu.GTP se une directamente a la estructura principal del fosfato del tallo TΨC del fenilalanil-ARN de transferencia de levadura (Phe-ARNt) (Science 1995 270(5241):1464-1472).

Los procedimientos incluyen opcionalmente analizar la homología de las secuencias de los ARNt y/o las aminoacil ARNt sintetasas para determinar los candidatos potenciales para un O-ARNt, O-RS y/o las parejas de los mismos, que parecen ser ortogonales para un organismo específico. Se pueden usar los programas informáticos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento para el análisis. En un ejemplo, para seleccionar los componentes de la traducción ortogonales potenciales para uso en un organismo procariota, se seleccionan una sintetasa y/o un ARNt que no presentan una homología inusual para los organismos procariotas.

Se puede producir también un combinado de ARNt mediante una estrategia de consenso. Por ejemplo, el combinado de ARNt se produce alineando una pluralidad de secuencias de ARNt; determinando una secuencia consenso; y generando una biblioteca de ARNt que utiliza al menos una parte, la mayoría, o la secuencia consenso completa. Por ejemplo, se puede compilar una secuencia consenso con un programa informático, por ejemplo, el programa GCG pileup. Opcionalmente, se cambiaron las posiciones degeneradas determinadas por el programa para la base más frecuente en aquellas posiciones. Se sintetizó una biblioteca mediante las técnicas conocidas en la materia utilizando la secuencia consenso. Por ejemplo, se puede usar la extensión del solapamiento de los oligonucleótidos en que cada sitio del gen del ARNt se puede sintetizar como una mezcla dopada del 90% de la secuencia consenso y un 10% de una mezcla de las otras 3 bases para proporcionar la biblioteca basada en la secuencia consenso. Se pueden usar también otras mezclas, por ejemplo, 75% de la secuencia consenso y 25% de una mezcla de las otras 3 bases, 80% de la secuencia consenso y 20% de una mezcla de las otras 3 bases, 95% de la secuencia consenso y 5% de una mezcla de las otras 3 bases, etc.

Se pueden generar bibliotecas de los ARNt mutantes utilizando diversas técnicas de mutagénesis conocidas en la materia. Por ejemplo, Se pueden generar ARNt mutantes mediante mutaciones específicas de sitios, mutaciones puntuales aleatorias, recombinación homóloga, transposición de secuencias de ADN u otros procedimientos recurrentes de mutagénesis, la construcción quimérica de cualquier combinación de los mismos.

Se pueden introducir mutaciones adicionales en posición(ones) especificas, por ejemplo, en una(s) posición(ones) no conservativa(s), o en una(s) posición(ones) conservativa(s), en una(s) posición(ones) aleatorizada(s), o una combinación de las mismas en un bucle o región deseado de un ARNt, por ejemplo, un bucle anticodón, el tallo aceptor, el brazo o bucle D, el bucle variable, el brazo o bucle TΨC, otras regiones de la molécula de ARNt, o una combinación de las mismas. Las mutaciones pueden incluir pares de bases emparejados en la región del tallo.

Normalmente, se obtiene un O-ARNt sometiendo a selección negativa una población de células de una primera especie, donde las células comprenden un miembro de la pluralidad de O-ARNt potenciales. la selección negativa elimina las células que comprenden un miembro de la pluralidad de O-ARNt potenciales que está aminoacilado por una aminoacil ARNt sintetasa (RS) que es endógena para las células. Esto proporciona un combinado de ARNt que son ortogonales para la célula de la primera especie.

En determinadas realizaciones de la selección negativa, un(os) codón(ones) selector(es) se introduce(n) en un polinucleótido que codifica un marcador de selección negativo, por ejemplo, una enzima que confiere resistencia a antibióticos, por ejemplo, β-lactamasa, una enzima que confiere un producto detectable, por ejemplo, βgalactosidasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), por ejemplo, un producto tóxico, tal como barnasa, en una posición no esencial, etc. Se puede llevar a cabo la criba/selección haciendo crecer la población de células en presencia de un agente de selección (por ejemplo, un antibiótico, tal como ampicilina). En una realización, se hace variar la concentración del agente de selección.

Por ejemplo, para medir la actividad de los ARNt supresores, se utiliza un sistema de selección que está basado en la supresión in vivo del codón selector, por ejemplo, mutaciones sin sentido o de cambio de marco introducidas en un polinucleótido que codifica un marcador de selección negativo, por ejemplo, un gen de la β-lactamasa (bla). Por ejemplo, variantes de polinucleótidos, por ejemplo, variantes bla, con, por ejemplo, se construyen codones TAG, AGGA, y TGA, en la posición de una determinada posición. Se transforman células, por ejemplo, bacterias, con

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estos polinucleótidos. En el caso de un ARN ortogonal, que no puede cargarse eficazmente mediante E. coli sintetasas endógenas, resistencia a antibióticos, por ejemplo, resistencia a la ampicilina, deben ser aproximadamente o menores que eso para una bacteria transformada sin plásmidos. Si el ARNt no es ortogonal, o si una sintetasa heteróloga capaz de cargar el ARNt se expresa simultáneamente en el sistema, se va a observar un mayor nivel de resistencia al antibiótico, por ejemplo, ampicilina. Se seleccionan células, por ejemplo, bacterias, que son incapaces de crecer en placas de agar LB con concentraciones de antibiótico aproximadamente iguales a las de las células transformadas sin plásmidos.

en el caso de un producto tóxico (por ejemplo, la ribonucleasa barnasa), cuando un miembro de la pluralidad de ARNt potenciales se aminoacila por el hospedador endógeno, por ejemplo, sintetasas de Escherichia coli (es decir, no es ortogonal para el hospedador, por ejemplo, sintetasas de Escherichia coli), el codón selector se suprime y el producto del polinucleótido tóxico producido conduce a la muerte de la célula. Las células que albergan ARNt ortogonal O ARNt no funcional sobreviven.

En una realización, el combinado de ARNt que son ortogonales para un organismo deseado se somete a continuación a una selección positiva en la que un codón selector se coloca en un marcador de selección positiva, por ejemplo, codificado mediante un gen de resistencia a fármacos, tal como un gen de la β-lactamasa. se lleva a cabo la selección positiva en una célula que comprende un polinucleótidos que codifica o comprende un miembro del combinado de ARNt, un polinucleótido que codifica un marcador de selección positiva, y un polinucleótido que codifica una RS análoga. Estos polinucleótidos se expresan en la célula y la célula se hace crecer en presencia de un agente de selección, por ejemplo, ampicilina. A continuación se seleccionan los ARNt para su capacidad de aminoacilarse mediante la sintetasa análoga expresada simultáneamente y para insertar un aminoácido en respuesta a este codón selector. Normalmente, estas células muestran una potenciación en la eficacia de supresión en comparación con las células que albergan ARNt no funcionales, o ARNt que no pueden ser reconocidos eficazmente por la sintetasa de interés. La célula que alberga los ARNt no funcionales o los ARNt que no son reconocidos eficazmente por la sintetasa de interés son sensibles al antibiótico. Por lo tanto, los ARNt que: (i) no son sustratos para el hospedador endógeno, por ejemplo, las sintetasas de Escherichia coli; (ii) pueden aminoacilarse mediante la sintetasa de interés; y (iii) son en la traducción, sobreviven a ambas selecciones.

El rigor de la selección, por ejemplo, la selección positiva, la selección negativa o la selección positiva y negativa, en los procedimientos anteriormente descritos, pueden, opcionalmente, variarse. Por ejemplo, debido a que la barnasa es una proteína extremadamente tóxica, el rigor de la selección negativa puede controlarse introduciendo diferentes números de codones selectores en el gen de la barnasa y/o utilizando un promotor inducible. En otro ejemplo, se hace variar la concentración de la selección del agente de cribado (por ejemplo, ampicilina). En un aspecto, se hace variar el rigor debido a que la actividad deseada puede ser baja durante los ciclos iniciales. De esta manera, se aplican criterios de selección menos rigurosos en los ciclos iniciales y se aplican criterios más rigurosos en los ciclos finales de la selección. En determinadas realizaciones, la selección negativa, la selección positiva, o la selección negativa y la selección positiva pueden repetirse múltiples veces. se pueden usar múltiples marcadores de selección negativa diferentes, marcadores de selección positiva o marcadores de selección negativa y positiva. En determinadas realizaciones, el marcador de selección positiva y negativa puede ser el mismo.

Se pueden utilizar otros tipos de selecciones/cribados en la descripción para producir componentes de traducción ortogonales, por ejemplo, un O-ARNt, una O-RS y una pareja de O-ARNt/O-RS. Por ejemplo, el marcador de selección negativa, el marcador de selección positiva o los marcadores de selección positiva y negativa pueden incluir un marcador que fluoresce o cataliza una reacción luminiscente en presencia de un reactivo adecuado. En otra realización, se detecta un producto del marcador mediante la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) o mediante luminiscencia. Opcionalmente, el marcador incluye un marcador de cribado basado en la afinidad. Véase, Francisco, J. A., y col., (1993) Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 90:10444-8.

Se pueden encontrar procedimientos adicionales para producir un ARNt ortogonal recombinante, por ejemplo, en las solicitudes de patentes de Estados Unidos 10/126.931, titulada "Methods and Compositions for the Production of Orthogonal tRNA-Aminoacyl tRNA Synthetase Pairs" y 10/126.127, titulada "In vivo Incorporation of Unnatural Amino Acids", y en el documente USSN 10/825.867 titulado "EXPANDING THE EUKARYOTIC GENETIC CODE". Véanse también, Forster y col., (2003) Programming peptidomimetic synthetases by translating genetic codes designed de novo. PNAS 100(11):6353-6357; y, Feng y col., (2003), Expanding tRNA recognition of a tRNA synthetase by a single amino acid change, PNAS 100(10): 5676-5681.

Un ARNt de la presente divulgación puede estar aminoacilado con un aminoácido deseado mediante cualquier procedimiento o técnica, incluyendo, aunque no de forma limitativa, aminoacilación química o enzimática.

La aminoacilación puede llevarse a cabo por aminoacil ARNt sintetasas o por otras moléculas enzimáticas, incluyendo, aunque no de forma limitativa, ribozimas. El término "ribozima" es intercambiable con "ARN catalítico" Cech y colaboradores (Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle y col., 1987, Concepts Biochem. 64:221-226) demostraron la presencia de ARN que se producen naturalmente que pueden actuar como catalizadores (ribozimas). Sin embargo, aunque estos catalizadores de ARN natural han mostrado actuar únicamente sobre sustratos de ácido ribonucleico para la escisión y el corte y empalme, el desarrollo reciente de la evolución artificial de ribozimas ha

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(continuación)

SEQ ID NO:: Marca SECUENCIA

4: ácido nucleico E9 RS

5: aminoácido E9 RS imagen48

6: ARNt HL(TAG)3 ADN

7: ARNt HL(TGA)1 ADN imagen49

8: J17 M jannaschii

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ADN

9: cebador FTam11

10: cebador FTam12

11: cebador FTam13 imagen51

12: cebador FTam14 imagen52

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(continuación)

SEQ ID NO:: Marca SECUENCIA

13: cebador FTam15

14: cebador FTam16 imagen53

15: cebador FTam17 imagen54

16: hGH (ADN)

17: D286R mutante de E9

18: Cebador 1 Y31 imagen55

19: Cebador 2 Y31 imagen56

20: Cebador 3 Y31 imagen57

21: Cebador 4 Y31 imagen58

22: Cebador 5 Y31 imagen59

23: Cebador 6 Y31 imagen60

24: Cebador 7 Y31 imagen61

25: Cebador 8 Y31 imagen62

26: Cebador 1 N51 imagen63

27: Cebador 2 N51 imagen64

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(continuación)

SEQ ID NO:: Marca SECUENCIA

28: Cebador 3 N51 imagen65

29: Cebador 4 N51 imagen66

30: Cebador 5 N51 imagen67

31: Cebador 6 N51 imagen68

32: Cebador 7 N51 imagen69

33: Cebador 8 N51 imagen70

34: MAP Y31 Mutante ámbar A12

35: MAP N51 Mutante ámbar D2

Ejemplo 3: Vacuna Ambrx viva para la paratuberculosis de subespecies de Mycobacterium avium

La paratuberculosis de subespecies de Mycobacterium avium (MAP) es un patógeno bacteriano oblidado que produce la enfermedad de Johne en el ganado vacuno y otros rumiantes. Un reciente estudio estimó que el 21% de las ganaderías estadounidenses estaban infectadas, dando como resultado cuantiosas pérdidas económicas en la

5 industria láctea, totalizando más de 200 millones de dólares al año. La enfermedad de Johne solamente se puede tratar con una combinación de antibióticos tales como rifabutina y un macrólido tal como claritomicina. Los regímenes de tratamiento pueden durar años. Una vacuna eficaz contra MAP es fundamental porque las vacunas para la paratuberculosis han estado comercialmente disponibles pero, desafortunadamente, no han sido totalmente eficaces para prevenir la enfermedad.

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2 mM durante 48-72 horas a 30°C. Para analizar el crecimiento dependiente de pAF, se hicieron crecer 96 colonias de cada sitio en 1 ml de LB que contenía 50 µg/ml de ampicilina, 50 µg/ml de kanamicina, y pAF 1 mM durante 72 horas a 30°C, también mostrado en la Figura 7, Figura 8, y Figura 9. A continuación, réplicas de estos clones se sembraron en placa de agar que contenía 50 µg/ml de ampicilina, 50 µg/ml de kanamicina, y pAF 2 mM, y agar LB

5 que contenía 50 µg/ml de ampicilina y 50 µg/ml de kanamicina sin pAF. Estas placas de réplicas se hicieron crecer durante 72 horas a 30 °C y a continuación se puntuó el crecimiento. Los clones que mostraron crecimiento solamente en presencia de pAF 2 mM se seleccionaron para análisis posterior.

Ejemplo 8: Selección y maduración de clones

Los clones con dependencia positiva para pAF se seleccionaron para estudio posterior. Estos clones fueron A12 de

10 Y31, C5 de Y31, E3 de Y31, D2 de N51 y H9 de N51. Los clones se volvieron a cribar individualmente y todos crecieron solamente en medios de cultivo que contenían pAF. Todos los clones se secuenciaron para determinar la presencia de un codón ámbar (tag) en el sitio adecuado: Y31 o N51. Los cinco tenían un codón ambar en la situación adecuada. Los clones A12 de Y31 y D2 de N51 se aislaron a continuación, y el plásmido pKD46 se eliminó mediante un tratamiento térmico repetido a 37 grados centígrados.

15 Una vez perdido pKD46 y el gen de resistencia a la ampicilina, las células se transformaron con el plásmido que contenía la enzima I-SceI. Después del tratamiento con esta enzima, se seleccionaron algunos clones que se analizaron para determinar su resistencia a la kanamicina. Los clones sin resistencia a la kanamicina se volvieron a secuenciar y se congelaron en disoluciones madre de glicerol al 10%. Estos clones serán los clones finales de la metionina aminopeptidasa dependiente de pAF.

20 En algunas realizaciones de la presente invención, las tasas de reversión deseadas, consideradas sistemáticamente en la Figura 11, serán inferiores a 10-9 de frecuencia de reversión con un solo cambio. Se analizaron los clones Y31 y N51, y las tasas de reversión se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2:

Clon: Ensayo 1 Ensayo 2

Y31: 2,78 x 10-8 <3 x 10-8 (ninguno detectado)

N51: 6,82 x 10-8 <2 x 10-8 (ninguno detectado)

TABLA 3:

Genes esenciales en E. coli

Alt. Símbolo: Símbolo Producto génico

b0026: ileS Isoleucil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.5)

b0027: IspA Lipoproteína de la peptidasa señal (EC 3.4.23.36)

b0029: ispH* proteína IspH (lytB)

b0083: ftsL Proteína de división celular ftsL

b0084: ftsI Precursor ftsI de la peptidoglicano sintetasa

b0085: murE UDP-N-acetilmuramoilalanil-D-glutamato--2,6-diaminopimelato ligasa (EC 6.3.2.13)

b0088: murD UDP-N-acetilmuramoilalanina--D-glutamato ligasa (EC 6.3.2.9)

b0089: ftsW Proteína de división celular ftsW

b0090: murG UDP-N-acetilglucosamina--N-acetilmuramil-(Pentapéptido) pirofosforilundecaprenol N-acetilglucosamina transferasa (EC 2.4.1.-)

b0091: murC UDP-N-acetilmuramato--alanina ligasa (EC 6.3.2.8)

b0093: ftsQ Proteína de división celular ftsQ

b0094: ftsA Proteína de división celular ftsA

b0095: ftsZ Proteína de división celular ftsZ

b0098: secA subunidad secA de la preproteína translocasa

b0168: map Metionina aminopeptidasa (EC 3.4.11.18)

b0169: rpsB proteína ribosómica S2 de 30S

b0171: pyrH Uridilato quinasa (EC 2.7.4.-)

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(continuación)

Genes esenciales en E. coli

Alt. Símbolo: Símbolo Producto génico

b0172: frr Factor de recirculación del ribosoma

b0174: uppS Undecaprenil pirofosfato sintetasa (EC 2.5.1.31)

b0175: cdsA Fosfatidato citidiltransferasa (EC 2.7.7.41)

b0180: fabZ (3R)-hidroximiristoil-[proteína transportadora de acilo] deshidratasa (EC 4.2.1.-)

b0181: lpxA Acil-[proteína transportadora de acilo]--UDP-N-acetilglucosamina Oaciltransferasa (EC 2.3.1.129)

b0182: lpxB Lípido-A-disacárido sintasa (EC 2.4.1.182)

b0184: dnaE subunidad alfa de la ADN polimerasa III (EC 2.7.7.7)

b0185: accA Acetil-coenzima A carboxilasa carboxil transferasa, subunidad alfa (EC 6.4.1.2)

b0194: proS Prolil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.15)

b0416: nusB N proteína B utilización de sustancia

b0420: dxs 1-desoxi-D-xilulosa 5-fosfato sintasa (EC 4.1.3.37)

b0421: ispA Geranil transferasa (EC 2.5.1.10)

b0470: dnaX subunidad tau de la ADN polimerasa III (EC 2.7.7.7)

b0474: adk Adenilato quinasa (EC 2.7.4.3)

b0526: cysS Cisteinil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.16)

b0634: mrdB Proteína rodA determinante de la forma de bacilo

b0635: mrdA Proteína de unión a penicilina 2

b0640: holA ADN polimerasa III, subunidad delta (EC 2.7.7.7)

b0642: leuS Leucil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.4)

b0680: glnS Glutaminil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.18)

b0893: serS Seril-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.11)

b0914: msbA probable proteína msbA de unión a ATP de transporte

b0918: kdsB 3-desoxi-mano-octulosonato citidililtransferasa (EC 2.7.7.38)

b0930: asnS Asparaginil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.22)

b0954: fabA 3-hidroxidecanoil-[proteína transportadora de acilo] deshidratasa (EC 4.2.1.60)

b1084: rne Ribonucleasa E (EC 3.1.4.-)

b1092: fabD proteína transportadora de malonil CoA trans acilasa (EC 2.3.1.39)

b1093: fabG 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] reductasa (EC 1.1.1.100)

b1098: tmk Timidilato quinasa (EC 2.7.4.9)

b1099: holB ADN polimerasa III, subunidad delta’ (EC 2.7.7.7)

b1116: lolC proteína transmembrana del sistema liberador de lipoproteína lolC

b1117: lold proteína de unión a ATP del sistema liberador de lipoproteína lolD

b1118: lolE proteína transmembrana del sistema liberador de lipoproteína lolE

b1133: trmU ARNt (5-metilaminometil-2-tiouridilato)-metiltransferasa (EC 2.1.1.61)

b1207: prsA Ribosa-fosfato pirofosfoquinasa (EC 2.7.6.1)

b1274: topA ADN topoisomerasa I (EC 5.99.1.2)

b1288: fabI Enoil-[proteína transportadora de acilo] reductasa [NADH] (EC 1.3.1.9)

b1714: pheS Fenilalanil-ARNt sintetasa cadena alfa (EC 6.1.1.20)

b1716: rpIT proteína ribosómica L20 de 50S

b 1718: infC Factor de inicio de la traducción IF-3

b1740: nadE NAD(+) sintetasa dependiente de NH(3) (EC 6.3.5.1)

b1866: aspS Aspartil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.12)

61 (continuación)

Genes esenciales en E. coli

Alt. Símbolo: Símbolo Producto génico

b1876: argS Arginil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.19)

b2185: rplY proteína ribosómica L25 de 50S

b2234: nrdA Ribonucléosido-difosfato reductasa 1, cadena alfa (EC 1.17.4.1)

b2235: nrdB Ribonucléosido-difosfato reductasa 1, cadena beta (EC 1.17.4.1)

b2323: fabB 3-oxoacil-[proteína transportadora de acilo] sintasa I (EC 2.3.1.41)

b2400: gltX Glutamil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.17)

b2411: ligA ADN ligasa (EC 6.5.1.2)

b2412: zipA Proteína de división celular zipA

b2496: yfgE Proteína teórica yfgE

b2514: hisS Histidil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.21)

b2563: acpS Holo-[proteína transportadora de acilo] sintasa (EC 2.7.8.7)

b2606: rplS proteína ribosómica L19 de 50S

b2607: trmD ARNt (Guanina-N(1)-)-metiltransferasa (EC 2.1.1.31)

b2609: rpsP proteína ribosómica S16 de 30S

b2610: ffh Partícula de proteína de reconocimiento de señal

b2614: grpE proteína GrpE

b3018: plsC 1-acil-sn-glicerol-3-fosfato aciltransferasa (EC 2.3.1.51)

b3019: parC Subunidad A de la topoisomerasa IV (EC 5.99.1.-)

b3030: parE Subunidad B de la topoisomerasa IV (EC 5.99.1.-)

b3041: ribB 3,4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintasa

b3067: rpoD Factor sigma de la ARN polimerasa rpoD

b3165: rpsO proteína ribosómica S15 de 30S

b3183: yhbZ proteína teórica de unión a GTP yhbZ

b3230: rpsI proteína ribosómica S9 de 30S

b3231: rplM proteína ribosómica L13 de 50S

b3287: def Péptido deformilasa (EC 3.5.1.88)

b3298: rpsM proteína ribosómica S13 de 30S

b3300: secY subunidad secY de la preproteína translocasa

b3301: rplO proteína ribosómica L15 de 50S

b3303: rpsE proteína ribosómica S5 de 30S

b3304: rplR proteína ribosómica L18 de 50S

b3305: rplF proteína ribosómica L6 de 50S

b3307: rpsN proteína ribosómica S14 de 30S

b3309: rplX proteína ribosómica L24 de 50S

b3310: rplN proteína ribosómica L14 de 50S

b3311: rpsQ proteína ribosómica S17 de 30S

b3316: rpsS proteína ribosómica S19 de 30S

b3317: rplB proteína ribosómica L2 de 50S

b3318: rplW proteína ribosómica L23 de 50S

b3319: rplD proteína ribosómica L4 de 50S

b3320: rplC proteína ribosómica L3 de 50S

b3321: rpsJ proteína ribosómica S10 de 30S

b3340: fusA Elongation factor G

62 (continuación)

Genes esenciales en E. coli

Alt. Símbolo: Símbolo Producto génico

b3342: rpsL proteína ribosómica S12 de 30S

b3384: trpS Triptofanil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.2)

b3464: ftsY Proteína de división celular ftsY

b3559: glyS Glicil-ARNt sintetasa, cadena beta (EC 6.1.1.14)

b3633: kdtA ácido 3-desoxi-D-mano-octulosónico transferasa (EC 2.-.-.-)

b3634: coaD Fosfopanteina adeniltransferasa (EC 2.7.7.3)

b3640: dut Desoxiutidina 5’-trifosfato nucleotidohidrolasa (EC 3.6.1.23)

b3648: gmk Guanilato quinasa (EC 2.7.4.8)

b3702: dnaA Proteína dnaA de inicio de la replicación cromosómica

b3730: glmU proteína glmU bifuncional

b3865: engB progable proteína de unión a GTP engB

b3967: murI Glutamato racemasa (EC 5.1.1.3)

b3985: rplJ proteína ribosómica L10 de 50S

b3986: rplL proteína ribosómica de 50S L7/L12

b3987: rpoB Cadena beta de la ARN polimerasa dirigida a ADN (EC 2.7.7.6)

b3988: rpoC Cadena beta de la ARN polimerasa dirigida a ADN (EC 2.7.7.6)

b4052: dnaB Helicasa replicativa del ADN (EC 3.6.1.-)

b4142: groS chaperonina de 10 kDa

b4143: groL chaperonina de 60 kDa

b4147: efp Factor de elongación P

b4200: rpsF proteína ribosómica S6 de 30S

b4226: ppa Pirofosfatasa inorgánica (EC 3.6.1.1)

b4258: valS Valil-ARNt sintetasa (EC 6.1.1.9)

b4361: dnaC Proteína de replicación del ADN dnaC

b4362: dnaT Proteína primosomal I

Ejemplo 9:

Se siembra una cepa del mismo tipo y paso utilizado para la vacuna de la poliomielitis (oral), transformar para incluir mutaciones ámbar en uno o más genes esenciales, y cultivar.

Cultivo celular:

5 i) Los diferentes sustratos celulares para la propagación del virus incluyen una línea celular diploide humana, células de riñón de mono, la línea de células Vero, o cualquier otro tipo de cultivo celular adecuado. ii) Producción de células a gran escala: 1. Preparación del banco de células de trabajo del fabricante (MWCB): MWCB en el caso de cultivos celulares primarios (células derivadas de tejido normal y almacenadas congeladas a menos 70° C) o de cualquier otra línea celular autorizada continua se preparó a partir de las células, y las células se combinaron después de

10 subcultivos en serie dentro del número especificado de cultivos celulares. 2. Se puede usar cualquiera de los siguientes sistemas, siempre que sea adecuado, para el incremento gradual del volumen de células. Frascos sobre rodillos: Crecimiento en frascos sobre rodillos, a partir de cultivos estacionarios tras distribución de células sobre la superficie de vidrio y hasta la máxima densidad celular que se pueda conseguir. Los cultivos en frascos sobre rodillos no se deterioran menos rápidamente ya que pueden tolerar una densidad casi dos veces superior a la de los

15 cultivos estacionarios. Las células de mamífero crecidas en cultivo de monocpa se adaptarán mejor a la técnica de frascos sobre rodillos. Fábricas celulares: Se trata de pilas de placas de cultivo que comparten una puerto de entrada y de salida común. Proporcionan a las células un superficie de crecimiento tan grande como el interior de los frascos sobre rodillos, pero ocupan menos espacio en la incubadora. Son ideales para cultivos celulares adherentes, tienen menor contaminación, riesgo, y son compactos. Sistema Roux flasks Micro-carrier 3. Las muestras de los

20 cultivos celulares de control se incubaron por separado durante al menos dos semanas y se analizaron para determinar evideencias de cambios citopáticos.

Propagación del virus de la polio en cultivos celulares:

63

Claims

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