ES2651510T3 - Anticuerpos similares a receptores de células T específicos para un péptido de WT1 presentado por HLA-A2 - Google Patents

Abstract

Una proteína que enlaza con el antígeno específica para un complejo péptido de WT1/HLA, en donde la proteína que enlaza con el antígeno comprende: (A) una región variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 38, 39 y 40; y una región variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoácidos SEQ ID NOS: 44, 45 y 46; o (B) una VH y VL que comprende la primera y la segunda secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 50 y 52; o (C) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54.

Description

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Anticuerpos similares a receptores de celulas T especificos para un peptido de WT1 presentado por HLA-A2 Descripcion

Campo Tecnico

La presente invencion se refiere de manera general a anticuerpos contra las protemas citosolicas. Mas particularmente, la invencion se refiere a anticuerpos contra la protema del oncogen del tumor de Wilms (WT1), espedficamente anticuerpos que reconocen un peptido de WT1 en conjuncion con un antfgeno de histocompatibilidad principal.

Antecedentes de la Invencion

La protema del oncogen del tumor de Wilms (WT1) es una diana atractiva para inmunoterapia para la mayona de leucemias y una amplia variedad de canceres. La WT1 es un factor de transcripcion de dedos de zinc que se expresa normalmente en tejidos mesodermicos durante la embriogenesis. En tejido adulto normal, la expresion de WT1 se limita a niveles bajos en celulas madre hematopoyeticas CD34+ pero se sobre-expresa en leucemias de multiples linajes y una amplia variedad de tumores solidos (1-2). Mas recientemente, se ha informado que la expresion de WT1 es un marcador de enfermedad residual minima. Aumentar los niveles de transcripcion en pacientes con leucemia mieloide aguda (AML) en remision morfologica ha sido predictivo de recafda clmica manifiesta (3, 4). Ademas, los anticuerpos para WT1 se detectan en pacientes con tumores malignos y tumores solidos, indicando que la WT1 es un antigeno altamente inmunogenico (7).

En la mayor parte, los anticuerpos monoclonales terapeuticos (mAbs) aprobados reconocen estructuras de protemas de la superficie celular. La WT1, sin embargo, es una protema nuclear y, por lo tanto, es inaccesible a la terapia con anticuerpos clasica. Hasta ahora, la inmunoterapia dirigida a WT1 ha estado limitada a enfoques celulares, dirigida exclusivamente a generar respuestas de celulas CD8 T citotoxicas (CTL) espedficas de WT1 que reconocen peptidos presentados en la superficie celular por moleculas MHC Clase I.

Para la induccion de respuestas de CLT, habitualmente se degradan protemas intracelulares por el proteasoma o endo/lisosomas, y los fragmentos de peptido resultantes se enlazan con una molecula MHC clase i o II. Estos complejos peptido-MHC se muestran en la superficie celular donde proporcionan dianas para el reconocimiento de celulas T a traves de la interaccion peptido-MHC (pMHC)-receptor de celulas T (TCR) (8,9). Las vacunaciones con peptidos derivados de la protema WT1 inducen celulas CD8 T citotoxicas HLA restringidas, que con capaces de destruir celulas tumorales.

Para mejorar la eficacia, los antfgenos del cancer pueden ser objetivo con terapia de anticuerpos monoclonales. La terapia de anticuerpos monoclonales (mAb) ha demostrado ejercer efectos antitumorales potentes por mecanismos multiples, incluyendo citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) e inhibicion celular directa o efectos inductores de apoptosis en celulas tumorales que sobre-expresan las moleculas diana. Ademas, los mAb pueden usarse como portadores para administrar espedficamente una fraccion citotoxica como un radionuclido, farmaco citotoxico o toxina a las celulas tumorales (18).

Existira un tremendo beneficio si, ademas, de un enfoque de inmunoterapia celular, estuviese disponible un enfoque de inmunoterapia humoral para apuntar antfgenos tumorales superficiales no celulares. Por lo tanto, un anticuerpo monoclonal (mAb) que imitan un receptor de celulas T en que es espedfico para una diana que comprende un fragmento de una protema intracelular en conjuncion con una molecula MHC, por ejemplo un complejo peptido de WT1/HLA-A2, sena un agente terapeutico nuevo y efectivo individualmente o como un vedculo capaz de administrar reactivos anti-cancengenos potentes, como farmacos, toxinas y elementos radioactivos. Tales mAbs senan tambien utiles como herramientas de diagnostico o pronostico. La WO 2009/108372 divulga anticuerpos similares a TCR dirigidos a complejos peptido/HLA y metodos para generarlos.

Sumario de la Invencion

La presente divulgacion identifica y caracteriza protemas que enlazan con el antfgeno, como anticuerpos, que son capaces de apuntar protemas citosolicas/intracelulares, por ejemplo, la oncoprotema WT1. Los anticuerpos divulgados apuntan a un complejo peptido/MHC como aparecena tfpicamente en la superficie de una celulas tras el procesamiento por el antfgeno de la protema WT1 y la representacion por la celula. A este respecto, los anticuerpos imitan los receptores de celulas T en que los anticuerpos tienen la capacidad de reconocer espedficamente y enlazar con un peptido de una manera restringida por MHC, es decir, cuando el peptido esta enlazado a un antfgeno de MHC. El complejo peptido/MHC recapitula el antfgeno como aparecena tfpicamente en la superficie de una celula tras el procesamiento del antfgeno y presentacion de la protema WT1 a una celula T.

Los anticuerpos divulgados reconoces espedficamente y enlazan con epftopos de un complejo

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peptido/HLA-A2, particularmente un complejo WT1/HLA-A0201. Ejemplos de peptidos que son reconocidos por las protemas que enlazan con el antigeno de la divulgacion como parte de un complejo HLA-peptido incluyen, pero no estan limitadas a, las mostradas en la Tabla 7,por ejemplo, un peptido con la secuencia de aminoacidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1.)

En un aspecto, por lo tanto, la invencion se refiere a un anticuerpo aislado, o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo, que enlaza con un peptido con la secuencia de aminoacidos RMFPNAPYL, cuando dicho peptido esta enlazado con un antigeno de MCH, como HLA-A2 como se define en la reivindicacion 1 anadida.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere a una protema que enlaza con el antfgeno aislada, anticuerpo, o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo, que comprende (A) (i) una region variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 2, 3, y 4; y una region variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC- CDR2 y LC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 8, 9 y 10; (ii) una region variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 20, 21 y 22; y una region variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LCCDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SeQ ID NoS: 26, 27 y 28; (iv) una region variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 56, 57 y 58; y una region variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LCCDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 62, 63 y 64; (v) una region variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 74, 75 y 76; y una region variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LCCDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 80, 81 y 82; o (vi) una region variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 92, 93 y 94; y una region variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LCCDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 98, 99 y 100.

La invencion se refiere a una protema que enlaza con el antfgeno aislada, anticuerpo o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo que comprende una region variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC- CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 38, 39 y 40; y una region variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos seleccionadas de las SEQ ID NOS: 44, 45 y 46.

En otro aspecto, la divulgacion se refiere a una protema que enlaza con el antfgeno aislada, anticuerpo, o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo, que comprende una Vh y una Vl que comprende la primera y segunda secuencias de aminoacidos, respectivamente, seleccionadas de las SEQ ID NOS: 14 y 16; 32 y 34; 68 y 70; 86 y 88; y 104 y 106.

En otro aspecto, la invencion se refiere a una protema que enlaza con el antfgeno aislada, anticuerpo, o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo, que comprende una Vh y una Vl que comprende la primera y segunda secuencias de aminoacidos, respectivamente, SEQ ID NOS: 50 y 52.

En otro aspecto mas, la invencion se refiere a una protema que enlaza con el antfgeno aislada, anticuerpo, o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo, que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada de las SEQ ID NOS: 18, 36, 72, 90, y 108.

En otro aspecto mas, la invencion se refiere a una protema que enlaza con el antfgeno aislada, anticuerpo, o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo, que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 54.

En un aspecto relacionado, la protema que enlaza con el antfgeno aislada comprende una region de enlace con el antfgeno como se divulga en cualquiera de las Tablas 1-8. La protema que enlaza con el antfgeno puede ser una protema de fusion.

En otro aspecto, la invencion se refiere a un inmunoconjugado que comprende un primer componente que es una protema que enlaza con el antfgeno, anticuerpo o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo como se divulga en la presente. El inmunoconjugado comprende un segundo componente que es una citotoxina, un marcador detectable, un radioisotopo, un agente terapeutico, una protema de enlace, o una molecula que tiene una segunda secuencia de aminoacidos. Cuando el segundo componente es una protema de enlace o segundo anticuerpo, la protema de enlace o segundo anticuerpo tiene especificidad de enlace con una diana que es diferente del complejo HLA-peptido para el que la primera es espedfica.

En un aspecto relacionado, por lo tanto, la presente invencion se refiere a un anticuerpo biespedfico que comprende una protema que enlaza con el antfgeno o fragmento funcional de la misma como se describe en la presente.

En otro aspecto mas, la invencion se refiere a acidos nucleicos que codifican protemas que enlazan con el antfgeno, incluyendo anticuerpos y receptores del antfgeno quimericos espedficos para una complejo peptido de

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WT1/HLA, en particular el complejo de peptido de WT1 RMFPNAPYL/HLA-A0201 como se define en la reivindicacion 7.

En otro aspecto relacionado, la invencion se refiere a celulas que comprenden los acidos nucleicos o protemas que enlazan con el antfgeno divulgadas en la presente, incluyendo celulas efectoras inmunes recombinantes, como, celulas T modificadas geneticamente para expresar un receptor del antfgeno quimerico que comprende una region de enlace con el antfgeno de acuerdo con la presente divulgacion. Las celulas que se han disenado para producir anticuerpos de acuerdo con esta divulgacion tambien estan abarcadas por la invencion.

En un aspecto relacionado, la invencion se refiere a vectores que comprenden los acidos nucleicos que codifican las protemas que enlazan con el antigeno divulgadas en la presente, incluyendo vectores que facilitan la expresion y/o secrecion de una protema que enlaza con el antfgeno como un anticuerpo o receptor del antigeno quimerico de acuerdo con la presente divulgacion.

En un aspecto relacionado, la invencion se refiere a composiciones farmaceuticas que comprenden las protemas que enlazan con el antfgeno, anticuerpos, acidos nucleicos, vectores o celulas que comprenden los acidos nucleicos o protemas que enlazan con el antfgeno divulgadas en la presente, junto con un portador farmaceuticamente aceptable.

En otro aspecto, la invencion se refiere a un metodo para detecta WT1 en la superficie de celulas o tejidos usando anticuerpos de WT1 de la invencion.

En otro aspecto mas, la invencion puede usarse en metodos para tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad positiva en WT1, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapeuticamente efectiva de una protema que enlaza con el antfgeno, anticuerpo o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo, acido nucleico que codifica a la protema que enlaza con el antfgeno o anticuerpo o una celula que comprende los acidos nucleicos o protemas como se divulga en la presente. La enfermedad positiva en WT-1 es una leucemia cronica, leucemia aguda o cancer WT1 + seleccionado del grupo que consiste de leucemia mielocftica cronica, mieloma multiple (MM), leucemia linfoblastica aguda (ALL), leucemia mieloide/mielogena aguda (AML), smdrome mielodisplasico (MDS), mesotelioma, cancer de ovario, cancer gastrointestinal, cancer de mama, cancer de prostata y glioblastoma. En algunas realizaciones, al protema que enlaza con el antfgeno o anticuerpo es un conjugado del mismo que tiene una fraccion citotoxica ligada al mismo.

Breve descripcion de los Dibujos

La Figura 1 muestra la secuencia de aminoacidos de la protema del tumor de Wilms (Numero de acceso de GenBank P19544) con algunos peptidos HLA restringidos en negrita. El peptido 121-140 abarca ademas un 9-mer (subrayado), RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1), que, ademas a los analogos del mismo, ha demostrado que induce la actividad de celulas T citotoxicas espedficas de WT1.

La Figura 2 es un grafico que muestra que la vacunacion con peptidos de WT1 induce celulas T citotoxicas contra celulas de leucemia WT1+.

La Figura 3 muestra los resultados de un ELISA de fagos para enlace espedfico de WT1/A2 (WA) frente a control de PBS o R3/HLAA0201 (R3).

La Figura 4 muestra el enlace espedfico de donde se seleccionaron solamente anticuerpos del fago de WT1 que enlazan con celulas T2 pulsadas con el peptido de WT1A.

La Figura 5 muestra la afinidad de enlace de una IgG1 de un anticuerpo de WT1 para el complejo RMF/A0201 probado por titulacion del anticuerpo a varias concentraciones. Los resultados se muestran para celulas T2 pulsadas con 50 ug/ml de RMF (panel superior). El anticuerpo de control se muestra en el panel inferior.

La Figura 6 muestra la dependencia en la densidad del complejo RMF/HLA-A0201 reconocido por el anticuerpo de WT1 en celulas T2 pulsadas con RMF (panel superior) o control, RHAMM-R3 (panel inferior).

La Figura 7 muestra un vector de expresion para la expresion de anticuerpos humanos.

La Figura 8 muestra los resultados de un analisis SDS-PAGE de anticuerpos de WT1/A2 bajo condiciones reductoras y no reductoras.

La Figura 9 muestra los resultados del analisis de enlace cinetico de un anticuerpo de WT1/A2 que demuestra la afinidad del anticuerpo hacia WT1/A2.

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La Figura 10 muestra la afinidad (Kd) del anticuerpo que enlaza con el complejo WT1/A2.

La Figura 11 muestra la intensidad de fluorescencia media (MFI) por citometna de flujo de la titulacion de peptidos en el enlace de algunas realizaciones, mAb clon 5 (panel superior), clon 15 (panel medio) y control (panel inferior) para celulas T2 vivas pulsadas con concentraciones variables de peptido, WT1-A, WT1-A1 o control.

La Figura 12 muestra los resultados de la titulacion de peptido en el enlace de un anticuerpo de WT1, mAb 5 (panel superior), mAb 15 (panel inferior) para celulas T2 pulsadas con concentraciones variables de peptido de WT1A.

La Figura 13 muestra la especificidad de enlace de una realizacion, mAb 5, a diferentes concentraciones (50 |jg/ml superior; 25 jg/ml medio; y 12,5 jg/ml inferior) del peptido (R3, WT1-A1, WT1-A o sin peptido).

La Figura 14 muestra la especificidad de enlace de una realizacion, mAb 15, a diferentes concentraciones (50 jg/ml superior; 25 jg/ml inferior) del peptido (R3, WT1-A1, WT1 -A o sin peptido).

La Figura 15 muestra el enlace dependiente de la dosis de mAbs 5 (panel superior) y 15 (panel inferior) para celulas T2 pulsadas con peptido WT1-A, WT1-A1, o RHAMM-R3.

La Figura 16 muestra el enlace de mAbs 5 y 15 para U266, una lmea celular de mieloma.

La Figura 17 muestra el enlace de mAb 15 para BV173, una lmea celular derivada de un individuo con leucemia aguda (Ph1) positiva.

La Figura 18 muestra el enlace espedfico de ESK1 (#13) para el complejo WT1/A2 en la superficie de celulas T2 pulsadas con peptido de WT1.

Las Figuras 19 y 20 muestran que el anticuerpo de WT1 es capaz de reconocer el peptido de RMF en el que se hace la sustitucion de diferentes posiciones del peptido de RMG con alanina (ver tambien Tabla 10) y que la perdida de enlace observado con la sustitucion de la posicion 1 por ya sea alanina (WT1-A1-B) o tirosina (WT1-A1), no se debio a la reduccion de la afinidad de enlace del peptido para la molecula HLA-A2, ya que ambos peptidos mostraron el enlace mas fuerte en el ensayo de estabilizacion T2 usando el mAb espedfico para la molecula HLA-A2, clon BB7.

La Figura 21 muestra el reconocimiento por el anticuerpo de WT1 del complejo RMF/HLA-A0201 presentado naturalmente en la superficie celular de lmeas celulares de mesotelioma humanas, JMN (WT1+/A0201+) pero no MSTO (WT 1+/HLA-A0201 -).

La Figura 22 muestra el enlace de anticuerpos de WT1 con la lmea celular derivada de CML humana BV173.

La Figura 23 es un analisis Scatchard basado en el enlace del anticuerpo WT1 para celulas JMN y muestra una constante de avidez de aproximadamente 0.2nM.

La Figura 24 muestra el enlace del anticuerpo de WT1 para un panel de celulas de mesotelioma y leucemia.

La Figura 25 muestra los resultados de analisis de citometna de flujo en blastocitos AML doble positivos CD33 y CD34 de un paciente positivo en HLA-A2. ESK1 enlaza con blastocitos de leucemia.

La Figura 26 muestra los resultados de analisis de citometna de flujo sincronizadas en blastocitos AML doble positivos CD33 y CD34 de un paciente negativo en HLA-A2. EL WT1mAb ESK1 no enlazo con los blastocitos.

La Figura 27 muestra ADCC mediada por WT 1 mAb ESK1 contra celulas T2 pulsadas con un peptido RMF.

La Figura 28 muestra la capacidad del anticuerpo de WT1 para mediar ADCC con efectores humanos en la lmea celular JMN y de leucemia (panel inferior) pero no celulas MSTO.

La Figura 29 muestra que los mAbs de WT1 son efectivo contra la lmea celular de leucemia humana BV173 pero no celulas HL60, que no son HLA-A2+.

La Figura 30 muestra el anticuerpo de WT1 induce ADCC contra fibroblastos AML primarios de un paciente positivo en HLA-A2.

La Figura 31 muestra los resultados del tratamiento de BV173 humana en ratones NSG usando anticuerpos de la invencion.

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La Figura 32 muestra que en puntos temporales posteriores, los ratones tratados con anticuerpo de WT1 solo comenzaron a recaer, mientras que el anticuerpo con efectores curo de 2 a 5 ratones.

La Figura 33 muestra que el anticuerpo de WT1 reduce significativamente la carga tumoral de una manera dependiente de la dosis.

La Figura 34 muestra que el anticuerpo con carbohidrato alterado en Fc(MAGE) es mas activo en ADCC que el anticuerpo original.

Descripcion Detallada de la Invencion

Al poner en practica la presente invencion, se usan muchas tecnicas convencionales en biologfa molecular, microbiologfa, biologfa celular, bioqmmica, e inmunologfa, que estan dentro del estado de la tecnica. Estas tecnicas se describen con mayor detalle en, por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual 3a edicion, J.F. Sambrooky D.W. Russell, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001; Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Melvyn Little, ed. Cambridge University Press 2009; "Cligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, y actualizaciones periodicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., ed., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas et al., 2001). A lo largo de la solicitud se usan las siguientes abreviaturas:

Ab: Anticuerpo

ADCC: citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos

ALL: leucemia linfocftica aguda

AML: leucemia mieloide aguda

APC: celula presentadora de antfgeno

P2M: microglubulina beta-2

BITE: anticuerpo de acoplamiento a celulas T bi-espedfico CAR: receptor del antfgeno quimerico CDC: citotoxicidad dependiente del complemento CMC: citotoxicidad mediada por el complemento

CDR: Region determinante de la complementariedad (ver tambien HVT a continuacion)

Cl: dominio constante de la cadena ligera

CHi: 1erdominio constante de la cadena pesada

CHi, 2, 3: 1er, 2° y 3er dominios constantes de la cadena pesada

CH 2, 3: 2° y 3er dominios constantes de la cadena pesada

CHO: Ovario de hamster chino

CTL: celula T citotoxica

Proporcion E:T: proporcion efector:diana

Fab: fragmento que enlaza con el anticuerpo

FACS: clasificacion celular citometrica asistida por flujo

FBS: Suero bovino fetal

FR: Region marco

HC: Cadena pesada

HLA: antfgeno de leucocito humano

HVR-H: region hipervariable-cadena pesada (ver tambien CDR)

HVR-L: region hipervariable-cadena ligera (ver tambien CDR)

Ig: inmunoglobulina

IRES: Sitio de entrada del ribosoma interno Kd: constante de disociacion Koff: tasa de disociacion Kon: tasa de asociacion

MHC: Complejo principal de histocompatibilidad MM: mieloma multiple

scFv: fragmento variable de la cadena ligera TCR: receptor de celulas T

Vh: cadena pesada variable incluye la region hipervariable de la cadena pesada y la region marco variable de la cadena pesada

Vl: cadena ligera variable incluye la region hipervariable de la cadena ligera y la region marco variable de la cadena ligera

WT1: protema 1 del tumor de Wilms

En la descripcion que sigue, se seguiran ciertas convenciones respecto al uso de terminologfa. Generalmente, los terminos usados en la presente se pretende que se interpreten consistentemente con el

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significado de esos terminos como se conocen por los expertos en la tecnica.

Una "protema que enlaza con el antigeno" es una protema o polipeptido que comprende una region de enlace con el antigeno o porcion de enlace con el antfgeno, es decir, tienen una afinidad fuerte con otra molecula con la que enlaza. Las protemas que enlazan con el antigeno abarcan, anticuerpos, receptores de antigenos quimericos (CARs) y protemas de fusion.

"Anticuerpo" y "anticuerpos" son los terminos que se conocen en la tecnica para referirse a protemas que enlazan con el antigeno del sistema immune. El termino "anticuerpo" como se refiere en la presente incluye anticuerpos de longitud completa totales que tienen una region de enlace con el antfgeno, y cualquier fragmento del mismo en el que se retiene la "porcion de enlace con el antigeno" o "region de enlace con el antfgeno" , o cadenas sencillas, por ejemplo, fragmento variable de la cadena sencilla (scFv), del mismo. Un "anticuerpo" de origen natural es una glicoprotema que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada esta comprendida de una region variable de la cadena pesada (abreviada en la presente como Vh) y una region constante de la cadena pesada (CH). La region constante de la cadena pesada esta comprendida de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta comprendida de una region variable de la cadena ligera (abreviada en la presente como Vl) y una region constante de la cadena ligera Cl. La region constante de la cadena ligera esta comprendida de un domino, Cl. Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad., denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que estan mas conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada Vh y Vl esta compuesta de tres DCRs y cuatro FRs dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el orden siguiente: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactua con un antfgeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en el enlace de la inmunoglobulina con tejidos huesped o factores, incluyendo varias celulas del sistema inmune (por ejemplo celulas efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clasico.

El termino "porcion de enlace con el antfgeno" o "region de enlace con el antigeno" de un anticuerpo, como se usa en la presente, se refiere a esa region o porcion del anticuerpo que enlaza con el antfgeno y que confiere especificad de antfgeno al anticuerpo; los fragmentos de protemas que enlazan con el antfgeno, por ejemplo anticuerpos incluyen uno o mas fragmentos de un anticuerpo que retiene la capacidad de enlazar espedficamente con un antfgeno (por ejemplo, un complejo peptido/HLA). Se ha demostrado que la funcion de enlace con el antfgeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de enlace con el antfgeno abarcados dentro del termino "fragmentos de anticuerpo" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios Vl, Vh, Cl y CH1; un fragmento F(ab)2 que consiste de los dominios Vh y C1; un fragmento Fv que consiste de los dominios Vl y Vh de un unico brazo de un anticuerpo; un fragmento dAB (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546),, que consiste de un dominio Vh; y una region determinante de la complementariedad aislada (CDR).

Ademas, aunque los dos dominios del fragmento Fv, Vl y Vh, estan codificados por genes separados, pueden unirse, usando metodos recombinantes, por un conector sintetico que les permita hacerse como una cadena de protemas sencilla en la que las regiones Vl y Vh se emparejen para formar moleculas monovalentes. Estas se conocen como Fv de cadena sencilla (scFv); ver por ejemplo Bird et al., 1988 Science 242:423-426; y Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la tecnica, y los fragmentos se seleccionan por utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Un "anticuerpo aislado" o "protema de enlace con el antfgeno aislada" es una que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los "anticuerpos sinteticos" o "anticuerpos recombinantes" se generan generalmente usando tecnologfa recombinante o usando tecnicas sinteticas de peptidos conocidas por los expertos en la tecnica.

Tradicionalmente, el complejo MHC-peptido solo podfa ser reconocido por un receptor de celulas T (TCR), limitando nuestra capacidad para detectar un epftopo de interes usando ensayos de lectura basados en celulas T. En la presente divulgacion, se describen protemas que enlazan con el antfgeno, incluyendo los anticuerpos, que tienen una region de enlace con el antfgeno en base a scFvs que se han seleccionado de bibliotecas de presentacion de fagos de scFv humanos usando complejos HLA-peptido recombinantes. Estas moleculas demostraron especificidad exquisita, por ejemplo como se muestra con anticuerpos anti-WT1 que reconocen solamente complejos HLA-A2-RMFPNAPYL. Ademas, junto con su incapacidad para enlazar con complejos HLA que contienen otros peptidos, las moleculas tambien eran incapaces de enlazar con los mismos peptidos, demostrando adicionalmente su especificidad similar a TCR.

Los scFvs de la divulgacion seleccionados por presentacion de fagos se probaron inicialmente por su capacidad de enlazar con peptidos presentados en la superficie de celulas HLA-positivas. T ras incubar celulas T2 en presencia del peptido, podnan usarse anticuerpos etiquetados por fluorescencia para reconocer selectivamente las

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60

65

celulas pulsadas por antigeno usando citometna de flujo.

En algunas realizaciones, la invencion incluye anticuerpos que tienen la secuencia de scFV fusionada con uno o mas dominios constantes de la pesada para formar un anticuerpos con una region Fc de una inmunoglobulina humana para producir una protema bivalente, aumentando la avidez y estabilidad totales del anticuerpo. Ademas, la porcion Fc permite la conjugacion directa de otras moleculas, incluyendo pero no limitada a colorantes fluorescentes, citotoxinas, radioisotopos, etc. con el anticuerpo por ejemplo, para su uso en estudios de cuantificacion de antfgenos, para inmovilizar el anticuerpo para mediciones de afinidad, para la administracion dirigida de un agente terapeutico, para la prueba de citotoxicidad mediada por Fc usando celulas efectoras inmunes y muchas otras aplicaciones.

Los resultados mostrados en la presente resaltan la especificidad, sensibilidad y utilidad de los anticuerpos de la invencion para apuntar a complejos MHC-peptido.

Las moleculas de la invencion se basan en la identificacion y seleccion de fragmentos variables de la cadena sencilla (scFV) usando presentacion de fagos, la secuencia de aminoacidos de la cual confiere la especificidad de las moleculas para el peptido MHC restringido de interes y forma la base de todas las protemas que enlazan con el antfgeno de la divulgacion. La scFv, por lo tanto, puede usarse para disenar una matriz diversa de moleculas de "anticuerpo" incluyendo, por ejemplo, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de los mismos, como minicuerpos Fab y F(ab')2, protemas de fusion, incluyendo fusiones de scFv-Fc, anticuerpos multivalentes, es decir, anticuerpos que tienen mas de una especificidad para el mismo antfgeno o antfgenos diferentes, por ejemplo, anticuerpos que acoplan con celulas T biespedficos (BiTe), tricuerpos, etc. (ver Cuesta et al., Multivalent antibodies: when design surpasses evolution. Trends in Biotechnology 28:355-362 2010).

En una realizacion, en la que la protema que enlaza con el antfgeno es un anticuerpo de longitud completa, las cadenas pesada y ligera del anticuerpos de la invencion pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo puede incluir al menos una, y preferiblemente dos, cadenas pesadas completas, y al menos uno, y preferiblemente dos, cadenas ligeras completas) o puede incluir una porcion de enlace con el antfgeno (un Fab, F(ab')2, Fv o un fragmento Fc de cadena sencilla ("scFv")). En otras realizaciones, la region constate de la cadena pesada del anticuerpo se elige de, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, e IgE. En algunas realizaciones, el isotipo de inmunoglobulina se selecciona de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, mas particularmente, IgG1 (por ejemplo, IgG1 humana). La eleccion del tipo de anticuerpo dependera de la funcion efectora inmune que el anticuerpo esta disenado para provocar.

Al construir una inmunoglobulina recombinante, las secuencias de aminoacidos apropiadas para las regiones constantes de varios isotipos de inmunoglobulina y los metodos para la produccion de una matriz amplia de anticuerpos son conocidos por los expertos en la tecnica.

En una realizacion, el anticuerpo u otra protema de enlace con el antfgeno es un scFV anti-WT1/HLA-A2 o un fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo que tiene una region de enlace con el antfgeno que comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 18 y enlaza espedficamente con un peptido con la secuencia de aminoacidos RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1) en conjuncion con HLA-A0201. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-WT1 es una protema de fusion scFV-Fc o IgG humana de longitud completa con regiones VH y VL o CDRs seleccionadas de la Tabla 1.

Antigeno

WT1 (Ext002 #3)

Peptido

RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1)

CDRs:

1 2 3

VH

GGTFSSYAIS (SEQ ID NO: 2) GIIPIFGTANYAQKFQG (SEQ ID NO: 3) RIPPYYGMDV (SEQ ID NO: 4)

ADN

ggaggcaccticagcag ctatg eta t cage (SEQ ID NO: 5) ggg a tc atccctatctttggtac a g caa a eta ege a cag a a gtt ccagggc (SEQ ID NO: 6) cggattcccccgtaclacggtat ggacgtc (SEQ ID NO: 7)

VL

SGSSSNIGSNYVY (SEQ ID NO: 8) RSNQRPS (SEQ ID NO: 9) AAWDDSLNGW (SEQ ID NO: 10)

ADN

tctggaagcagctccaac ateggaagtaattatgtat ac (SEQ ID NO: 11) aggagtaatcagcggccctca (SEQ ID NO: 12) gcagcatgggatgacagcctg aatggtgtggta (SEQ ID NO: 13)

VH compieta

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLE WMGGliPlFGTANYAGKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYY CARR!PPYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 14)

ADN

caggtg cag ctgg tgcagt ctg g gget g aggtg aaga a g cctgg gtcctcggtga a g gtctcctg c a a g g ett ctg g ag g ca ccttc a g cag eta tgeta tea g ctg g g tg ega ca g g ccc ctg gaca a gg get tg a gtg g atg gga ggg a tcatcccta tctttg g ia cag ca a a eta ege a cag a ag ttcca g g g cagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgag a tetg ag g a c a eg g ccgtgt a tt a ctgtg eg a g a egg attcccccgta eta eggt a tgga cgtctg g qgccaagqqaccacggtcaccqtctcctca (SEQ ID NO: 15)

VL completa

QTWT Q PPSASGTPGQRVTISCSGSSS NIGS N YVYW YQQLPGT APKL LEYRSNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAJSGPRSVDEADYYCAAWDD SLNGVVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 16)

Tabla 1

cn

—I "o

g; 2- 0

N> S

Q.

CD

73

~n cd

11

U 0>

-< o.

I- Q_

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N m

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C CL

=3 O 0 0

Q- _j 0 12

0" o co

CD Q) g (q

0 3 =3 0

O =3

Antigeno

WT1 (ExtQ02#3)

Peptido

RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1)

CDRs:

1 2 3

ADN

cagactgtggtgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgtt ctggaagcagctccaacatcggaagtaattatgtatactggtaccaacagctcccaggaacggcc cccaaactcctcatctataggagtaatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctcca agtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggccccggtccgtggatgaggctgattattactgt gcagcatgggatgacagcctgaatggtgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtcctagg t (SEQ ID NO: 17)

scFv

GTWTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQLPGTAPKL UYRSNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGPRSVDEADYYCAAWDD SLNGVVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGSLEMAQVQLVQSG AEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFG TANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARRIPPYY GMDVWGQGTTVTVSS

(SEQ ID NO: 18)

ADN

cagactgtggtgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgtt ctggaagcagctccaacatcggaagtaattatgtatactggtaccaacagctcccaggaacggcc cccaaactcctcatctataggagtaatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctcca agtctggcacctcagcclccctggccatcagtgggccccggtccgtggatgaggctgattattactgt gcagcatgggatgacagcctgaatggtgtggtattcggcggagggaccaagctgaccgtcctagg ttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggatccctcgagatggc ccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctg caaggcttctggaggcaccttcagcagctatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaag ggcttgagtggatgggagggatcatccctatctttggtacagcaaactacgcacagaagttccagg gcagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctga gatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagacggattcccccgtactacggtatggacgtctg gggccaagggaccacggtcaccgtctcctca (SEQ ID NO: 19)

o m ^ Fo rg nj

(continuacion)

Ariiigeno

WT1 (Ext002 #5)

F'eptido

RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1)

CDRs:

1 2 3

VH

GDSVSSNSAAWN (SEQ ID NO: 20) RTYYGSKWYNDYAVS VKS (SEQ ID NO: 21) GRLGDAFDI (SEQ ID NO: 22)

ADN

ggggacagtgtctctagc aacagtgctgcttggaac (SEQ ID NO: 23) aggacatactacgggtccaag tggtataatgattatgcagtatct gtgaaaagt (SEQ ID NO: 24) ggtcgcttaggggatgcttttga tatc (SEQ ID NO: 25)

VL

RASQSISSYLN (SEQ ID NO: 26) AASSLQS (SEQ ID NO: 27) QQSYSTPLT (SEQ ID NO: 28)

ADN

cgggcaagtcagagcatt agcagctatttaaat (SEQ ID NO: 29) gctgcatccagtttgcaaagt(SEQ ID NO:30) caacagagttacagtacccct ctcact (SEQ ID NO: 31)

VH complsta

QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGL EWLGRTYYGSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTA VYYCARGRLGDAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 32)

ADN

caggtacagctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcacctgt gccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctgcttggaactggatcaggcaglccccatcg agaggccttgagtggctgggaaggacatactacgggtccaagtggtataatgattatgcagtatctg tgaaaagtcgaataaccatcaacccagacacatccaagaaccagttctccctgcagctgaactct gtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgcaagaggtcgcttaggggatgcttttgatatctgg qqccaaqqqacaatgqtcaccQtctcttca (SEQ ID NO: 33)

VL completa

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLT FGGGTKVDIKR (SEQ ID NO: 34)

Tabla 2

cn

—I "o

g; 2- 0

W 0 Q. CD

Zl

~n cd

I1

U 0> -< 0. I- Q_ ^ O CD ^

m q_

O ®

N m

0 LI1

31 D

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-x N (Q 0 CD O

O O

° Q

O °

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Q- —j

0 3! 0" O (/)

0 0 0 to

0 3

=3 0 O =3

Antiyeno

WT1 (ExtG02 #5)

Psptido

RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1)

CDRs:

1 2 3

ADN

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttg ccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagccccta agctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatct gggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaaca gagttacagtacccctctcactttcggcggagggaccaaagtggatatcaaacgt (SEQ ID NO: 35)

scFv

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIY AASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLT FGGGTKVDIKRSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLQQSGPGLVK PSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYGSKWY NDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGRLGDAF DIWGQGTMVTVSS

(SEQ ID NO: 36)

ADN

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttg ccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagccccta agctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatct gggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaaca gagttacagtacccctctcactttcggcggagggaccaaagtggatatcaaacgttctagaggtg gtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggcccaggtac agctgcagcagtcaggtccaggactggtgaagccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatct ccggggacagtgtctctagcaacagtgctgcttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggc cttgagtggctgggaaggacatactacgggtccaagtggtataatgattatgcagtatctgtgaaaa gtcgaataaccatcaacccagacacatccaagaaccagttctccotgcagctgaactctgtgactc ccgaggacacggctgtgtattactgtgcaagaggtcgcttaggggatgcttttgatatctggggccaa qqqacaatgqtcaccqtctcttca (SEQ ID NO: 37)

o m

N3 hJ

K> g> r~) cn

(continuacion)

Antfgerio

WT1 (ExtG02#13)

Pepiido

RMFPNAPAL(SEQ ID NO: 1)

CDRs:

1 2 3

VH

GYSFTNFWIS (SEQ ID NO: 38) RVDPGYSYSTYSPSF QG (SEQ ID NO: 39) VQYSGYYDWFDP (SEQ ID NO: 40)

ADN

ggatacagcttcaccaact tctggatcagc (SEQ ID NO: 41) sgggttgatcctggctactctta tagcacctacagcccgtccttc caaggc (SEQ ID NO: 42) gtacaatatagtggctactatg actggttcgacccc (SEQ ID NO; 43)

VL

SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 44) SNNQRPS (SEQ ID NO: 45) AAWDDSLNGWV (SEQ ID NO: 46)

ADN

tctggaagcagctccaac a tc g ga ag taatactgt a a ac (SEQ ID NO: 47) agtaataatcagcggccctca (SEQ ID NO: 48) gcagcatgggatgacagcct gaatggttgggtg (SEQ ID NO: 49)

VH complete

GMQLVQSGAEVKEPGESLRISCKGSGYSFTNFWISWVRGMPGKGLE WMGRVDPGYSYSTYSPSFQGHVTISADKSTSTAYLGWIMSLKASDTA MYYCARVQYSGYYDWFDPWGQGTL.VTVSS (SEQ ID NO: 50)

ADN

cag atg cag ctg g tg ca g t ccgga g ca gag gtga a aga g cccg g gga gt ctctg a g g a tctoct gtaagggttctggatacagcttcaccaacttctggatcagctgggtgcgccagatgcccgggaaa ggcctggagtggatggggagggttgatcctggctactcttatagcacctacagcccgtccttccaag gccacgtcaccatctcagctgacaagtctaccagcactgcctacctgcagtggaacagoctgaag gcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagagtacaatatagtggctactatgaclggttcgacc cctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca (SEQ ID NO: 51)

Tabla 3

cn

cn

—I "o

0 ^

zj

^ 0 ~n 0

p "0 0> -< o.

|— CL ^ O CD ^ m q_ O ®

N m

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-x N (Q 0 CD O

O O

c^r ° o

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0. 0 O' =3

13 0

O N O 0

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>8 > =h O O NJ 0

S 3 0

o a)

3 “

0 c±

3 2 ° 0

■§ "O 0 ° cT. °

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0 0 O (Q

£ 3

=3 O 2. = 0 o

Antigeno

WT1 (ExlOG2 #13)

Peptido

RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1)

VL Completa

QAVVTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQVPGTAPK LLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWD DSLNGWVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 52)

ADN

caggctgtggtgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgt tctggaagcagctccaacatcggaagtaatactgtaaactggtaccagcaggtcccaggaacgg cccccaaactcctcatctatagtaataatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctc caagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaggatgaggctgattattac tgtgcagcatgggatgacagcctgaatggttgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcct aggt (SEQ ID NO: 53}

scFv

QAWTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQVPGTAPK LLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWD DSLNGWVFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQMQLV QSGAEVKEPGESLRISCKGSGYSFTNFWISWVRQMPGKGLEWMGR VDPGYSYSTYSPSFQGHVTISADKSTSTAYLQWNSLKASDTAMYYCA RVQYSGYYDWFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 54)

ADN

caggctgtggtgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgt tctggaagcagctccaacatcggaagtaatactgtaaactggtaccagcaggtcccaggaacgg cccccaaactcctcatctatagtaataatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctc caagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaggatgaggctgattattac tgtgcagcatgggatgacagcctgaatggttgggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcct aggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatgg cccagatgcagctggtgcagtccggagcagaggtgaaagagcccggggagtctctgaggatct cctgtaagggttctggatacagcttcaccaacttctggatcagctgggtgcgccagatgcccggga aaggcctggagtggatggggagggttgatcctggctactcttatagcacctacagcccgtccttcca aggccacgtcaccatctcagctgacaagtctaccagcactgcctacctgcagtggaacagcctga aggcctcggacaccgccatgtattactgtgcgagagtacaatatagtggctactatgactggttcga cccctggggccagggaaccctggtcaccgtctoctca (SEQ ID NO: 55)

o m

I'O hj

K> g> r~) cn

(continuacion)

Antfgeno

WT1 (ExtGG2 #15)

F 0 pt i d o

RMFPNAPAL(SEQ ID NO: 1)

CDRs:

1 2 3

VH

GYNFSNKWIG (SEQ ID NO: 56) IIYPGYSDITYSPSFQG (SEQ ID NO: 57) HTALAlGFDY (SEQ ID NO: 56)

ADN

ggctacaactttagcaaca agtggatcggc (SEQ ID NO: 59) a tcatcta tcccg g ttactcg g a ca tea ccta ca g cccgtccttc caaggc(SEQ ID NO: 60) caca cag ctttg gc eg g ctttg actac {SEQ ID NO: 61)

VL

RASQNINKWLA(SEQ ID NO: 62) KASSLES (SEQ ID NO: 63) QQYNSYAT (SEQ ID NO: 64)

ADN

C g g gccag tcaga atatc aataagtggctggcc (SEQ ID NO: 65) aaggcgtctagtttagaaagt (SEQ ID NO: 66) ca a ca at ata atagttat g eg a eg (SEQ ID NO: 67)

VH compieia

QVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYNFSNKWIGWVRQLPGRGLE WIAIIYPGYSDITYSPSFQGRVTISADTSINTAYLHWHSLKASDTAMYYC VRHTALAGFDYWGLGTLVTVSS (SEQ ID NO: 68)

ADN

caggtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagcccggagagtctctgaagatctcctg taagggttctggctacaactttagcaacaagtggatcggctgggtgcgccaattgcccgggagagg cctggagtggatagcaatcatctatcccggttactcggacatcacctacagcccgtccttccaaggc cgcgtcaccatctccgccgacacgtccattaacaccgcctacctgcactggcacagcctgaaggc ctcggacaccgccatgtattattgtgtgcgacacacagctttggccggctttgactactggggcctgg g c accctg g tea ccgtcicctc a (SEQ ID NO; 69)

VL completa

DIGMTGSPSTLSASVGDRVTITCRASGNINKWLAWYQGRPGKAPGLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYAT FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 70)

Tabla 4

—I "o

g; 2-

Q) ^2>

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I- Q-

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0 O

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0 Q)>

0 g

Q- _j 0 2

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CD Q) g (q

0 3 =3 0

O =3

Peptide

RMFPNAPYL(SEQ ID NO: 1)

ADN

g ac atcc a g a tgacccag tctccttcc a ccctgtctg ca tctg tagga gaca g agtca caa tea ettg ccgggccagtca g a a tatcaata a g tggctggcctggtatca g cagaga ccaggg aaagcccct c agctcctg a tct ata a gg egtet a g ttta g a a a g tg g gg tccca leta g g ttca geg g cagt g gate tggg a cag aata ca ctctc a ocatca g c a gcctg ca gcctg atgattttgca aetta ttactg ccaac aatataatagttatgcgacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgt (SEQ ID NO: 711

scFv

DiQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQNINKWLAWYQQRPGKAPQLLI YKASSLESGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYAT FGQGTKVEIKRSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQVQLVQSGAEVKK PGESLKiSCKGSGYNFSNKWtGWVRQLPGRGLEWlAliYPGYSDITYSP SFQGRVTISADTSINTAYLHWHSLKASDTAMYYCVRHTALAGFDYWGL GTLVTVSS (SEQ ID NO: 72)

ADN

g ac atcc ag a tg a ccca g tctcctt cc a ccc tg tctg ca tctgtag g a ga c ag a g tcaca atcacttg cegg g cca g tcag a ata tcaata a gtgg ctg g ectg g ta tea g ca g ag a cc a g gg a aa g cccct cagctc ctg a tet at a a gg eg tet a gtttag a a a g tg gggtc cca teta g g ttc ag eg g ca gtg g a tc tggg a ca g aat a ca ct ctca ccat ca g ca g cctg ca gcctg at g atttt g ca a ettatta ctg ccaa c a a tata a ta g tt a tg eg a cgttcg g cc a ag g g a cca a gg t g ga aatca aa eg ttetaga g g tgg t ggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagaiggcccaggtgcag ctg g tgc a gtc tg g ageag a ggtga a a a a g cc eggag a gtctctg a a gatctc ctgt a a g g g ttet ggctacaactttagcaacaagtggatcggctgggtgcgccaattgcccgggagaggcctggagtg g a tag ca atca tctatcc eg gtta ct egg a cat c a ccta ca g c ccg t ccttcc a ag g ccgc g tc a cc atctccgccgacacgtccattaacaccgcctacctgcactggcacagcctgaaggcctcggacac c g cc atg ta tta 11gtg t g eg a ca ca ca g ctttg g ccg g ctttg a ctactg gggcctg g g caccctggt caccatctcctca (SEQ ID NO: 73)

o m ^ Fo rg nj

K3 ®

r~) cn

(continuacion)

cn cn

35 40 45 50 20 25 30 5 10 15

Antigeno

WT1 (ExtOG2 #18)

Peptides

RMFPNAPYL (SEQ ID NO: 1)

CDRs:

1 2 3

VH

GFTFDDYGMS (SEQ ID NO: 74) GINWNGGSTGYADS VRG (SEQ ID NO: 75) ERGYGYHDPHDY (SEQ ID NO: 76)

ADN

gggttca cctttg atg a tta t ggcatgagc (SEQ ID NO: 77} ggtatiaattggaatggtggt ag cacagg ttatg cagactc tgtgaggggc (SEQ ID NO: 78) g a g eg tg g eta eg gg ta cca tgatccccatgactac (SEQ ID NO: 79)

VL

GRNNIGSKSVH (SEQ ID NO: SO) DDSDRPS (SEQ ID NO: 81) QVWDSSSDHW (SEQ ID NO: 82)

ADN

gggagaaacaacattgg aaglaaaagtgtgcac g a tg a ta gc g a ccggccct c a caggtgtgggatagtagtagt gatcatgtggta

(SEQ ID NO: 93} (SEQ ID NO: 84) (SEQ ID NO: 85)

VH completa

EVQLVQSGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRGAPGKG LEWVSGINWNGGSTGYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAE DTALYYCARERGYGYHDPHDYWGQGTLVTVSS {SEQ ID NO: 86)

ADN

gaagtgcagctggtgcagtctgggggaggtgtggtacggcctggggggtccctgagactctcct g tg ca gcctctg ggttcacctt tg a t g at ta tg g ca tgagctggg tccg c ca ag ctccag g g aag gggctggagtgggtctctggtattaattggaatggtggtagcacaggttatgcagactctgtgagg g g ccg a ttcac ca tctcca g ag a ca a og c caag a a ctccctg t a tctg caa atga a cagtctg a g a gccg ag g a ca egg ccttgt a tta ctgtgcg a g a g a g eg tggcta egg g tacca tg atccc catgacfaclggggccaaggcaccctggtgaccgtctcctca {SEQ ID NO: 37)

VL completa

QSVVTQPPSVSVAPGKTARITCGRNNIGSKSVHWYQQKPGGAPVL WYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVW DSSSDHVVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 88}

o m

V Fo ro nj <~n

CD

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cn

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CD Q) g (q

0 3 =3 0

O =3

Antigeno

WT1 (ExtQG2 #18)

Peptidos

RMFPNAPYL (SEQID NO: 1)

ADN

cagtctgtcgtgacgcagccgccctcggtgtcagtggccccaggaaagacggccaggattac ctgtgggagaaacaacattggaagtaaaagtgtgcactggtaccagcagaagccaggccag gcccctgtgctggtcgtctatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctgg ctccaactctgggaacacggccaccctgaccatcagcagggtcgaagccggggatgaggcc gactattactgtcaggtgtgggatagtagtagtgatcatgtggtattcggcggagggaccaagct gaccgtcctaggt (SEQ ID NO: 89)

Antigeno

WT1 (Ext002#1fl)

Pcptido

RMFPNAPYL (SEQID NO: 1)

scFv

QSVVTQPPSVSVAPGKTARITCGRNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVL VVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVW DSSSDHWFGGGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGSLEMAEVQLVQ SGGGWRPGGSLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVS GINWNGGSTGYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYY CARERGYGYHDPHDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:

ADN

cagtctgtcgtgacgcagccgccctcggtgtcagtggccccaggaaagacggccaggattac ctgtgggagaaacaacattggaagtaaaagtgtgcactggtaccagcagaagccaggccag gcccctgtgctggtcgtctatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctgg ctccaactctgggaacacggccaccctgaccatcagcagggtcgaagccggggatgaggcc gactattactgtcaggtgtgggatagtagtagtgatcatgtggtattcggcggagggaccaagct gaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggatccc tcgagatggccgaagtgcagctggtgcagtctgggggaggtgtggtacggcctggggggtcc ctgagactctcctgtgcagcctctgggttcacctttgatgattatggcatgagctgggtccgccaag ctccagggaaggggctggagtgggtctctggtattaattggaatggtggtagcacaggttatgca gactctgtgaggggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactccctgtatctgcaa atgaacagtctgagagccgaggacacggccttgtattactgtgcgagagagcgtggctacggg taccatgatccccatgactactggggccaaggcaccctggtgaccgtctcctca (SEQ ID NO: 91)

o m ^ Fo rg nj

(continuacion)

Antigeno

WT1 (ExtG02 #23)

Peptides

RMFPNAPYL (SEQ ID NO. 1)

CDRs:

1 2 3

Peptide

RMFPNAPAL (SEQ ID NO. 1)

VH

GFSVSGTYMG (SEQ ID NO. 92) LLYSGGGTYHPASLQ G (SEQJD NO. m GGAGGGHFDS (SEQ ID NO. 94)

ADN

gggttctccglcagtggcac ctacatgggc(SEQ ID NO, 95) ' ettet tt a t ag tg gtg g eg g ca c ataccacccagcgtccctgca ggge (SEQ ID NO, 96) gaggggcaggaggtggcc actttgactcc (SEQ ID NO. 97)

VL

TGS SSNIGAGYDVH (SEQ ID NO. 98) GNSNRPS (SEQ ID NO. 99) AAWDDSLNGYV (SEQID NO. 100)

ADN

actgg g a g ca c ct cca a c atcggggcagcttatgatgt acac (SEQ ID NO, 101) ggtaacagcaatoggccctca (SEQ ID NO. 102) g cag ca t g ggatg a ca gcct gaatggttatgtc (SEQ ID NO. 103)

VH completa

EVQLVETGGGLLQPGGSLRLSCAASGFSVSGTYMGWVRGAPGKGLE WVALLYSGGGTYHPASLQGRF1VSRDSSKNMVYLGMNSLKAEDTAVY YCAKGGAGGGHFDSWGGGTLVTVSS (SEQ ID NO. 104)

o m

V Fo ro nj

r~i <~n

Tabla 6

Peptido

RMFPNAPAL (SEQ ID NO. 1)

ADN

gaggtgcagctggtggagaccggaggaggcttgctccagccgggggggtccctcagactctcctg tgcagcctctgggttctccgtcagtggcacctacatgggctgggtccgccaggctocagggaaggg aclgg a g tg ggtcgca cttctt ta ta g tg g t g g eg g ca cata cca ccca g eg tccctg cagg gccg attca tcgtctccaga g aca g etc c a ag a atat g g tetatett ca a a tga a ta g cctga a a geegag ga ca egg cegteta ttactgtgcga aaggaggg g cagg aggtg g cc a ctttg a ctcctgg g gcca ag g c accctg g tga ccgtctcctca (SEQ ID NO. 105)

VL complete

QSVLTGPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNfGAGYDVHWYGQLPGTAPK LLiYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLGSEDEADYYCAAWO DSLNGYVFGTGTKLTVLG (SEQ ID NO. 106)

Peptido

RMFPNAPYL (SEQ ID NO. 1)

ADN

cagt ctgtgttg a c g ca g ccg ccctcagtg tetg g gg c ccca g g g ca g a g g g tea cca tctcctg c actg gg agcagctcc a acatcgg gg c ag gttatgatgtaca ctggtac cagcagcttcca gg aac a g ccccca aa ctcctca tet atg g ta aca gcaatcg g ccctcaggg gtccctg accg a tt ctctgg c tcca a g tc tg g ca cc tcag cctccctggc ca tc a gtgggclccagtctg a g gatgagg ctg a tt a tta ctgtg cages tg g g a t g a ca g cctg a a tggtt a tg tetteg g a a clg gg a cca a g ctg a ccg tcct a ggt(SEQTDNO. 107)

scFv

QSVLTGPPSVSGAPGGRVTISCTGSSSNfGAGYDVHWYGQLPGTAPK LLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLGSEDEADYYCAAWD DSLNGYVFG TGTKLTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAEVGLVETGGGLLQPG GSLRLSCAASGFSVSGTYMGWVRQAPGKGLEWVALLYSGGGTYHPA SLQGRFIVSRDSSKNMVYLQMNSLKAEDTAVYYCAKGGAGGGHFDS WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO. 10S)

(continuacion)

Peptido

RMFPNAPYL (SEQ ID NO. 1)

ADN

ca g t ctgtg ttg ac g ca g ccg cc ctca g t gtctg 9 gg cccca g ggc a gag ggt ca ccatctcct g c a otg g g a gca gctcca a catcgg g g ca g gtt a tgatgta cactg g ta cca gca gctt cca gga a c a g ccccca a actcctcatctatggta a ca g caatcggccctc ag gggtccctg a ccg attctctg g c tcca a g tctg g ca cctca gcctc cctggcca tcag tg g gctccagt ctgag g atga gg ctg atta tta ctgtg ca g catg gg a tg a ca gcctg aatg gttatgtcttcgg aactg g gacca agctg a ccgtccta ggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgag atggccgaggtgcagctggtggagaccggaggaggcttgctccagccgggggggtcccfcaga ctctcctgtg cag cctctggg ttctccgtca g tggca ccta catgg g ctgg g tccg c ca ggctccagg g a a g g g a ctgg a gtg g gtcg ca ctt cttta ta g tg g tg g egg ca ca ta ccac cca g cgtccctg c a g g g ccg attcategte tccag aga ca gctcca ag aat a tggtc tatettea a a tg a ata go ctgaaa gccgaggacacggccgtctattactgtgcgaaaggaggggcaggaggtggccactttgactcctg Qggccaaggcaccctqgtqaccgtctcctca (SEQ ID NO. 109)

o m ^ Fo ro nj

(continuacion)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Otras realizaciones de los anticuerpos divulgados y protemas que enlazan con el antigeno abarcan las que comprenden regiones hipervariables y regiones constantes ligeras y pesadas, por ejemplo como se muestra en las Tablas 7 (cadena pesada), 8 (cadena ligera) y 9 (regiones constantes).

Claims (33)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   1. Una protema que enlaza con el antigeno espedfica para un complejo peptido de WT1/HLA, en donde la protema que enlaza con el antfgeno comprende:

   (A) una region variable de la cadena pesada (HC) que comprende HC-CDR1, HC-CDR2 y HC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 38, 39 y 40; y una region variable de la cadena ligera (LC) que comprende LC-CDR1, LC-CDR2 y LC-CDR3 respectivamente, que comprende las secuencias de aminoacidos SEQ ID NOS: 44, 45 y 46; o

   (B) una Vh y Vl que comprende la primera y la segunda secuencias de aminoacidos de SEQ ID NOS: 50 y 52; o

   (C) la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 54.
2. 2. La protema que enlaza con el antigeno de la reivindicacion 1, en donde la protema que enlaza con el antfgeno es un anticuerpo de longitud completa o es un fragmento que enlaza con el antfgeno de dicho anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de Fab, Fab', F(ab')2, Fv y Fv de cadena sencilla (scFv) o es un receptor del antigeno quimerico.
3. 3. La protema que enlaza con el antigeno de la reivindicacion 1 o la reivindicacion enlaza con el antigeno comprende una region marco de la region variable humana.
4. 4. La protema que enlaza con el antfgeno de la reivindicacion 1 o la reivindicacion enlaza con el antfgeno es completamente humana.
5. 5. La protema que enlaza con el antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 conjugada con un agente terapeutico.
6. 6. La protema que enlaza con el antfgeno de la reivindicacion 5, en donde dicho agente terapeutico es un farmaco, toxina, radioisotopo, protema o peptido.
7. 7. Un acido nucleico aislado que codifica una protema que enlaza con el antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
8. 8. Un acido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicacion 7 que comprende:

   (A)

   2, en donde la protema que 2, en donde la protema que

   (i) primera, segunda y tercera secuencias de nucleotidos que consisten de las SEQ ID NOS: 41, 42 y 43; y

   (ii) cuarta, quinta y sexta secuencias de nucleotidos que consisten de las SEQ ID NOS: 47, 48 y 49; o

   (B) primera y segunda secuencias de nucleotidos que consisten de las SEQ ID NOS: 51 y 53; o

   (C) una secuencia de nucleotidos que consiste de la SEQ ID NO: 55.
9. 9. Un vector que comprende un acido nucleico de la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8.
10. 10. Una celula que comprende un acido nucleico de la reivindicacion 7 o la reivindicacion8.
11. 11. La celula de la reivindicacion 10, en donde dicha celula expresa en su superficie una protema que enlaza con el antfgeno de la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2.
12. 12. Un metodo in vitro para detectar WT1 en una celula completa o tejido, dicho metodo comprendiendo:

    (A) poner en contacto una celula o tejido con una protema que enlaza con el antfgeno de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde la protema que enlaza con el antfgeno enlaza espedficamente con un peptido de WT1 que esta enlazado con HLA-A2 y donde dicha protema que enlaza con el antfgeno comprende un marcador detectable;

    (B) determinar la cantidad de protema que enlaza con el antfgeno enlazada con dicha celula o tejido midiendo la cantidad de marcador detectable asociado con dicha celula o tejido, en donde la cantidad de protema que enlaza con el antfgeno enlazada indica la cantidad de WT1 en dicha celula o tejido.
13. 13. Un kit que comprende una protema que enlaza con el antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
14. 14. Una composicion farmaceutica que comprende una protema que enlaza con el antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y un portador farmaceuticamente aceptable.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60

    65
15. 15. Una protema que enlaza con el antigeno de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para su uso en un metodo para el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad positiva en WT1, en donde la enfermedad Positiva en WT1 es una leucemia cronica o leucemia aguda o cancer WT1+; o la enfermedad Positiva en WT1 se selecciona del grupo que consiste de leucemia mielodtica cronica, mieloma multiple (MM), leucemia linfoblastica aguda (ALL), leucemia mieloide/mielogena aguda (AML), smdrome mielodisplasico (MDS), mesotelioma, cancer de ovario, canceres gastrointestinales, cancer de mama, cancer de prostata y glioblastoma.
16. 16. La protema que enlaza con el antigeno para el uso de acuerdo con la reivindicacion 15, en donde dicho anticuerpo es un conjugado que tiene una fraccion citotoxica ligada al mismo.
17. 17. Un acido nucleico de la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8 para su uso en un metodo para el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad positiva en WT1, en donde la enfermedad positiva en WT1 es una leucemia cronica, leucemia aguda o cancer WT1+; o la enfermedad positiva en WT1 se selecciona del grupo que consiste de leucemia mielodtica cronica, mieloma multiple, leucemia linfoblastica aguda (ALL), leucemia mieloide/mielogena aguda (AML), smdrome mielodisplasico (MDS), mesotelioma, cancer de ovario, canceres gastrointestinales, cancer de mama, cancer de prostata y glioblastoma.
18. 18. Una composicion farmaceutica que comprende un acido nucleico de la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8.
19. 19. Un metodo in vitro para destruir celulas WT1+, comprendiendo dicho metodo poner en contacto la celula con una protema que enlaza con el antfgeno de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
20. 20. El metodo de la reivindicacion 19, en donde dicho anticuerpo o fragmento que enlaza con el antfgeno del mismo tiene una fraccion citotoxica ligada al mismo.

    1 mgsdvrdlna llpavpslgg gggcalpvsg aaqwapvldf appgasaygs Iggpapppap

    61 pppppppphs fikqepswgg aepheeqcls aftvhfsgqf tgtagacryg pfgppppsqa

    121 ssgqarmfpn apylpscles qpairnqgys tvtfdgtpsy ghtpshhaaq fpnhsfkhed

    1S1 pmgcqgslge qqysvpppvy gchtptdsct gsqalllrtp yssdnlyqmt sqlecmtwnq

    241 mnlgatlkgv aagssssvkw tegqsnhstg yesdnhttpi lcgaqyrlht hgvfrgiqdv

    301 rrvpgvaptl vrsasetsek rpfmcaypgc nkryfklshl qmhsrkhtge kpyqcdfkdc

    361 errfsrsdql krhqrrhtgv kpfqcktcqr kfsrsdhlkt htrthtgkts ekpfscrwps

    421 cqkkfarsde lvrhhnmhqr nmtklqlal {SEQ ID NO: 11S)

    Figura 1

    106

    Figura 2

    CCS3

    % DE LISIS

    
    ---- K5 4^ an o°5

    
    CXO CCD CCD CCD CCCC5

    
    -_J--------------1--------------1--------------1________I--------------1

    cjn

    f

    107

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22. 0.700 -

    y

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    imagen1

    9-^r 1Q 1

    imagen2

    PHAGE CLONES

    □ CONTROL DE PBS

    imagen3

    Figura 3

    % de Max

    imagen4

    SB

    SB

    HB

    HB

    SB

    Sin peptido EW

    WT1-A1

    WT1-A

    Sin Fago

    Figura 4

    imagen5

    «y»>y»v»'£j< mi rnv,!

    8 0

    15

    iu T2-WT1413-0.01 56 10 T2-WT1413-C.1 232 UB T2-VftW3-1 1150 ifl T2-WT1413.10 1372

    ra „

    60 -

    40

    10°

    10^

    10:>

    1 o4

    FL2-H: PE

    100

    IB T2-WT1-cntr-C.01 31.5

    10 T2-VVT1-cntr-C.1 29.5

    60

    10 T2-WT1-cntr-1
26. 37.9

    mAb de Control

    in T2-WT1-cntr-10 31.1

    40

    18

    r>

    m

    FL2-H: PE

    Titulacion por citometria de flub de mAb #13 en celulas T2 pulsadas con peptido de WT1

    Figura 5

    110

    /

    INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA MEDIANA

    <23*3 oe» ga 03

    co

    o CO CO CO CO CO CO CO

    cco

    CO CO CO CO CO CO CO CO

    j____i____i____e____i____l____i____i

    imagen6

    imagen7

    to

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    55s

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    OO OO

    cn

    PEPTIDOS (ug/mi)

    INTENSIDAD DE FLUORESCENCIA MEDIANA

    cjn

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    imagen10

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    ~0

    O

    imagen12

    1 pQD-Hyg-Ext002 CADENA ligera (kappa/iamda) 8312 bp

    AMPICILINA

    pQ8Neo~Ext802 lgG1 de CADENA PESADA 8752 bp

    AMPICILINA

    CfliE ori -

    SV4D P/ori

    DHFR

    SV4D PoliA

    SV4D pA

    PROMOTOR

    HIGROMICINA

    DECMV

    INTRON DE

    pSV4u ori

    b-GLOBINA

    HindIII 3431

    CADENA LIGERA

    BOH pA

    Kappa/Lamda

    L-Xte/ 4186

    CONSTANTE

    -BamH\ (4148}

    Co El on

    SV40 P/ori

    DHFR

    SV40 PoliA

    SV40 pA

    NEOMICINA------\ \

    PROMOTOR

    DECMV

    pS\/40 ori

    INTRON DE

    b-GLOBINA

    Hind III (3431)

    Apa\ (3872)

    80 H pA

    CADENA PESADA CON

    Bamm (4887)

    lgG1 HUMANA CONSTANTE

    Figura 7

    imagen13

    :•

    ..

    '

    ... . ...

    No redutoras

    Condiciones reductoras

    15 #15 I'eSl IsG

    Figura 8

    imagen14

    imagen15

    Cion #5

    Cion #15

    Error in k .<

    K

    [1 /Ms]

    Muestras

    EXT002-Clon #5lgG1
27. 5.4SE-3

    1.12E-4
28. 4.6SE5

    1.17E-3

    EXT002-Clon #15lgG1

    1.88E-3
29. 2.45E5

    r .68E-9

    Figura 10

    9U

    jj v.m8jj

    ____A_____

    (jui/SH) soaiid3d

    o m u 05

    imagen16

    0

    01

    02

    0£

    or

    05

    09

    01

    (|W/Sti) soaildad

    imagen17

    0

    002

    0or

    009 §» 00S 0001 0021

    0

    01

    02

    imagen18

    05

    09

    U

    % <de Max % de Max

    imagen19

    imagen20

    peptido de WTI-A (ug/ml)

    imagen21

    117

    rvj O

    -e* c <3/ O v>3 o o

    wJ* t™i«L

    o

    imagen22

    o

    FL2-H: FL2- Altura

    imagen23

    % de Max

    imagen24

    50 ug/m!

    imagen25

    25 ug/mi

    IdlAI

    60

    50

    40

    30

    20

    10

    0

    imagen26

    iCIon #5 (lOug/rr ICIon #5 (3 ug/mi Isotipo (lOug/mf i Isotipo (3 ug/mi;

    No peptide

    WTl-A

    WTl-Al

    RHAMM-R3

    mAb #5

    imagen27

    1400

    iCIon #15(lug/ml) iCIon #15 {0.1 ug/n Isotipo (lug/ml) i Isotipo (0.1 ug/mi;

    1200

    .>SS

    600

    200

    No peptide WTl-A

    WTl-Al RHAMM-R3

    mAb #15

    Peptidos (50 ug/ml)

    % de Max % de Max

    mAb #5

    imagen28

    mAb #15

    imagen29

    % de Max

    imagen30

    XdW

    imagen31

    1600

    1400

    1200

    1000

    800

    600

    400

    200

    0

    imagen32

    ss #13~10ug/mf s#13-lug/mt #13~0.1ug/mi ss#13-0.01ug/mi sshlgGl-lOug/m! shlgGl-lug/ml sshlgGl-O.lug/ml hlgGl-O.Olug/mi Si 2nd Ab

    Figura 18

    MFl

    imagen33

    Figura 19

    % de Max

    imagen34

    Expresion de HLA-A2 (BB7.2/FITC)

    imagen35

    Figura 20

    125

    % de Max

    % de Max

    P

    B

    P

    ro

    imagen36

    imagen37

    % de Max

    imagen38

    127

    Figura 23

    mum

    RECUENTOS ESPECIFICOS ENLAZADOS

    MMk K> ■CjO euo -fy- *~n

    CvTJ

    errs cun CX> cun CU> cun C^J cun CXD

    Cd>

    irrrrt C» C£X> CXX> cn r£Ca C£> <X=>

    C2>

    o cux o o CX3 cx> o o

    GXS? C3 cus o fim! o

    i 1 _____ _____1™. _____i_____ _____i_____ J __i__

    o

    o

    O

    O

    In

    O

    f'O -

    jno

    O

    5-0

    CJ1

    128

    imagen39

    # Enlace de ESK1/Celula

    imagen40

    imagen41

    imagen42

    imagen43

    wTl

    Targets (E:T ratio: 25:1)

    58 No mAb

    i§#13-30ug/mi

    #13-10ug/m

    s#13-3ug/m

    sshIgGl-3Qug/ml

    sshlgGl-lQug/ml

    sshIgGl-3ug/mi

    ;»W6/32-10ig/ml

    si Mouse isotype-10 ug/mi

    Figure 27

    132

    imagen44

    ummmumiD

    ez>

    o CO —* Ca> —* O)

    CCS)

    !La CO CO 3"

    CO

    -r^ Cfp =5 *S>. 3

    sss ’ 2C3 3; a >

    53

    cr

    imagen45

    mmu

    tfd TO CK3 O O CD

    «k; ^ 22S5C

    OOWI* 4La^

    1£SJ 03 _

    i£- *5. s

    “*” "“ “2

    GZ>

    *SL ^ '«E

    — S3 ^

    “ 3

    □

    cn

    =3"

    3

    >

    % DE LISIS

    imagen46

    □ Sin mAb 11CLON #3

    □ CLON #13

    mm #23

    m CLON #5

    □ CLON #15

    BISOTIPO

    B W6/32

    □IS0TIP0

    DE RATON

    mAbs: IGug/ml

    HLA-A2 ARNm de WT1 ENLACE de mAb BV173 (+) (+) 13,15.23

    HL-6B (-) (+) (-)

    Figura 29

    % de Lisis

    12

    9

    6

    3

    0

    imagen47

    ESK1 Isotipo ESK1 Isotipo

    HLA-A2+ blastocitos HLA-A2- blastocitos

    Figura 30

    Luminiscencia de Avg
30. 8.0x10^ __

    L.,

    8,0*108?j

    I#
31. 4.0x10°'H

    i
32. 2.0x1087'!
33. 0.01

    imagen48

    Solo Tumor IgG * Efectores ESK1 +- Efectores Solo ESK1 Solo Efectores

    5 10 is 20

    Dfa

    imagen49

    Solo Efectores

    Solo Tumor

    it’i-i'ji’i

    II >> Solo ESK1

    1

    Figura 31

    imagen50

    2'S*10'51~ Solo Tumor

    ~~ tgG •+ Efectores ? ..gSKI + Efectores

    a5 L Solo ESK1

    "O

    ro 1.5x10^1— Solo Efectores o c 0)

    c

    E

    -3 s.o*io»j

    Figura 32

    imagen51

    HEK297-mAbs CHO-mAbs Cho-MAGE

    Sin mAb

    1 1 1

    #13-10uq/ml

    1 13 11

    #13-3uq/m

    8 8 15

    #13-lug/m

    3 2 12

    #13-0.3ug/ml

    0 14

    #13-0.1ug/m

    3 5

    #13-0.03ug/m

    0 0

    hlgGl-lGug/ml

    0 0

    hIgGl-3ug/mi

    0 0

    hlqGl-lug/mi

    c 0

    hlcGl -0.3ug/ml

    0

    hlgGl-O.lug/ml

    2

    h!gGl-0.03ug/mi

    0

    ADCC contra JMN por PBMC nuevas (DAS)

    imagen52

    HEK297-mAbS CHO-mAbs ChO-MAGE

    mAbs

    s Sin mAb s #13-10ug/mi #13-3ug/m §s #13-lug/m •8 #13-0.3ug/ml s #13-0.1ug/m s#l3-0.03ug/irt s hlgGl-iQug/mi sbIgGl-3ug/ml shlgGl-lug/ml hXgGl-G.3ug/mi s hlgGl-G.lug/ml shIgGl-G.03s.ig/mi

    Figura 34