ES2644983T3

ES2644983T3 - Proceso para producir fracciones de leche ricas en inmunoglobulinas secretoras

Info

Publication number: ES2644983T3
Application number: ES09746801.1T
Authority: ES
Inventors: Charles Maria Hubert Hensgens; Nanda De Groot
Original assignee: Biosys Health Inc
Current assignee: Biosys Health Inc
Priority date: 2008-05-15
Filing date: 2009-05-11
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2029-05-11
Also published as: JP5762951B2; EP2280999A1; AU2009247031A1; KR20110036001A; CN102124027B; US20110130545A1; JP2011523410A; CN102124027A; CA2724444A1; US8669353B2; RU2010151414A; NZ589297A; CA2724444C; AU2009247031B2; EP2280999B1; BRPI0911994A2; PL2280999T3; WO2009139624A1; CY1119600T1; KR101645957B1

Description

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DESCRIPCION

Proceso para producir fracciones de leche ricas en inmunoglobulinas secretoras Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un proceso para la produccion de composiciones que son ricas en IgA secretora (S-IgA) por fraccionamiento de leche que contiene S-IgA, tal como se define en las reivindicaciones. Dichas composiciones se pueden utilizar en particular para uno o mas entre tratamiento y/o prevencion de infecciones y/o inflamacion de las superficies mucosas, p.ej., tracto gastrointestinal, tracto urogenital, tracto respiratorio, cavidad nasal o cavidad oral, tratamiento y/o prevencion de obesidad y enfermedades relacionadas o tratamiento y/o prevencion de alergias alimentarias en seres humanos o animales que necesitan dicho tratamiento, p.ej., a traves de la incorporacion de dichas composiciones en productos farmaceuticos, productos alimentarios o productos cosmeticos. En particular, la invencion se refiere a un proceso para producir dichas fracciones de leche que comprende las etapas de desgrasado, filtracion y concentracion, tal como se define en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invencion

Los anticuerpos encuentran muchas aplicaciones en la ciencia y la medicina. Es bastante sencillo generar nuevos anticuerpos contra una diana. Para la mayorla de las aplicaciones, se producen anticuerpos a traves de las llamadas llneas celulares del hibridoma que se derivan de la fusion de un anticuerpo que produce linfocitos B con una llnea celular inmortalizada. Dichas celulas del hibridoma pueden cultivarse facilmente y se puede cosechar el anticuerpo desde el sobrenadante de cultivo. Otro metodo para la produccion de anticuerpos es la cosecha desde suero de animales inmunizados. La tecnologla para la crla de animales de granja esta muy extendida y los establos para animales de granja son relativamente baratos.

Lleva demostrandose ya algunas decadas que la produccion de anticuerpos especlficos de inmunogeno en productos de la secrecion mamaria de animales de granja es viable. Inicialmente, se obtuvieron los mejores resultados del calostro, es decir, el primer fluido lacteo que produce la hembra tras el nacimiento de la crla. La leche producida por la hembra despues de la fase calostral se denomina en el presente documento leche madura. El calostro es un producto en gran medida unico que se produce a partir de un estado fisiologico y funcional preciso de la glandula mamaria. En los rumiantes, la principal diferencia en la composicion entre el calostro y la leche madura es el muy alto contenido de inmunoglobulinas calostrales, siendo entre un 80-90 % de las mismas de la clase IgG. Los niveles de anticuerpo en la leche madura son mas bajos en principio (aproximadamente un orden de magnitud), que los que se pueden conseguir en el calostro (Hodgkinson et al., WO 98/54226; Hastings. patente estadounidense No. 5.017.372). Los anticuerpos especlficos de antlgeno derivados de la leche empleados en la mayorla de los estudios cllnicos y precllnicos, por tanto, se derivaban en realidad de calostro y perteneclan predominantemente a la clase IgG (Tollemar et al., Bone Marrow Transpl. 23: 283-290 (1999); Bostwick et al., patente estadounidense No. 5.773.000; Cordle et al., patente estadounidense No. 5.260.057).

La inmunoglobulina A (IgA) es un anticuerpo que desempena un papel crucial en la inmunidad mucosal. IgG se encuentra en las secreciones en una forma especlfica, que se denomina S-IgA, que comprende dlmeros de monomeros de IgA, unidos a traves de la llamada cadena J y comprende ademas el llamado componente secretor que tiene un peso molecular de aproximadamente 435 kDa. En su forma secretora, es la principal inmunoglobulina en las secreciones mucosas, que incluyen las lagrimas, la saliva, el calostro humano /la leche madura, los jugos gastrointestinales, el fluido vaginal y las secreciones de la prostata y el epitelio respiratorio. Como tales, se pueden encontrar en las areas de la mucosa del tracto gastrointestinal, el tracto respiratorio, el tracto urogenital y las cavidades oral/nasal, y actuan para prevenir la colonizacion de patogenos. IgA secretora puede sobrevivir en entornos duros, tales como los tractos digestivo y respiratorio, para proporcionar proteccion contra microbios que se multiplican en secreciones corporales. Estas propiedades hacen que S-IgA sea la inmunoglobulina preferente para su aplicacion en productos para mejorar y/o mantener la salud, sobre todo para el tratamiento y/o prevencion de infecciones y/ inflamacion de las superficies de la mucosa, como la mucosa gastrointestinal y la mucosa del tracto respiratorio, aunque tambien la piel. Entre los ejemplos de dichos productos se incluyen formulas entericas, tales como formulas para lactantes, nutricion cllnica, alimentos y nutraceuticos funcionales; preparaciones farmaceuticas, preparaciones cutaneas y preparaciones de aerosol. Por lo tanto, no es sorprendente que se haya dedicado un gran esfuerzo a producir mayores niveles de IgA (secretora) en leche de rumiante.

En la patente estadounidense US 6.974.573 se describe un proceso para hiperinmunizar un animal de granja contra un antlgeno a traves del paso por la mucosa o las vlas respiratorias y, posteriormente, la administracion del antlgeno a traves de la glandula mamaria o los nodulos linfaticos supramamarios. Se describe el uso de la leche as! obtenida directamente o tras su tratamiento para purificar los anticuerpos (IgA) especlficos de antlgeno.

El fraccionamiento por filtracion de composiciones complejas, como la leche, para producir fracciones ricas en inmunoglobulina se ha descrito anteriormente en la tecnica, si bien la inmensa mayorla de las divulgaciones de la tecnica en este sentido se refieren al aislamiento de IgG, algo que por otra parte no es sorprendente dado el hecho de que es la principal inmunoglobulina en los productos de secrecion mamaria bovinos. En la patente

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estadounidense 2004/0167320 se describe un proceso y un aparato para separar moleculas de interes de mezclas complejas aplicando metodos de filtracion de flujo tangencial. Entre las moleculas de interes adecuadas, de acuerdo con la patente estadounidense US 2004/0167320, se incluyen inmunoglobulinas. Esta solicitud de patente estadounidense contiene un ejemplo de la purificacion de IgG1 de leche en bruto por diafiltracion, describiendose las condiciones y los parametros del proceso con gran detalle. Sin embargo, no se describe la separation de las inmunoglobulinas S-IgA de la leche, mas grandes.

En la patente estadounidense US 2003/0059512 se describe un metodo y un aparato para la separacion de leche y productos de la leche que implican una o mas etapas de filtracion de flujo cruzado. En particular, en la patente estadounidense US 2003/0059512 se sugiere la separacion de leche desgrasada en una fraction retenida rica en caselna y una faction permeada con empobrecimiento de caselna, fluyendo dicho material permeado a un posterior modulo de filtracion de flujo cruzado adecuado para formar una fraccion retenida enriquecida con macromoleculas como albumina e inmunoglobulinas, que se puede volver a separar y purificar para formar albumina e inmunoglobulinas utilizando, p.ej., cromatografla o filtracion de flujo cruzado. La patente estadounidense 2003/0059512 no contiene ninguna information especlfica de ejemplos que se refieran a la preparation de IgA, y menos aun fracciones de leche enriquecida S-IgA.

En la patente estadounidense US 4.644.056 se describe un proceso para preparar una solution de inmunoglobulinas lacticas o de calostro por tratamiento de calostros o leche. De acuerdo con dicho documento, se acidifica el calostro a un pH de 4,9-5,5 y se somete a filtracion de flujo cruzado en una unidad de filtracion con un tamano de poro medio de 0,1-1,2 pm, tras lo cual se separan los componentes de bajo peso molecular a traves de otra filtracion de flujo cruzado en otra unidad de filtracion con un llmite de separacion de 5-80 kDa. En los ejemplos se describe la diafiltracion del calostro acidificado utilizando dichas unidades de filtracion, produciendo soluciones que contienen principalmente IgG, si bien se notifica tambien la presencia de IgA, S-IgA e IgM en la solucion utilizando inmunoelectroforesis. No obstante, el proceso divulgado en la patente estadounidense US 4.644.056 no es suficiente en absoluto para preparar eficientemente fracciones ricas en S-IgA a partir de leche (no calostral o madura) en buenos rendimiento.

En el documento WO 2006/119560 describe un proceso para el enriquecimiento de IgA por cromatografla de intercambio cationico, modificando as! la composition del producto de protelna del producto resultante, y la patente europea EP 0 479 597 se centra en un proceso para la fabrication de un extracto/concentrado de IgA desprovisto de virus durante el cual se separa la caselna por precipitation con acido y se obtienen IgA por precipitation salina. Dado el hecho de que existe una gran diferencia en el peso molecular, as! como en la forma entre IgA e IgG por un lado y S-IgA por la otra, la aplicacion de los procesos de aislamiento de IgG de la tecnica anterior para aislar S-IGA no esta del todo clara y mucho menos en los casos en los que se requiere una operation eficaz y rendimientos suficientes, es decir, hacer que el metodo sea adecuado para su aplicacion a una production a escala industrial. Tal como se puede deducir de todo esto, la tecnica anterior aun no ha satisfecho la necesidad de contar con un proceso que se puede utilizar para producir eficientemente fracciones de leche ricas en S-IgA (no calostrales). Un objetivo de la presente invencion es el de proporcionar dicho proceso.

Sumario de la invencion

Los autores de la presente invencion han logrado desarrollar un proceso que satisface dicha necesidad. En pocas palabras, la presente invencion, tal como se define en las reivindicaciones independientes y con mas detalle en las reivindicaciones dependientes y en las realizaciones que entran dentro de la principal revindication que se expone mas adelante, proporciona un proceso para la produccion de fracciones de leche ricas en inmunoglobulina A secretora, utilizando una o mas etapas de filtracion de membrana microporosas. La fraccion de leche concentrada obtenida de acuerdo con la presente invencion como tal es adecuada para su incorporation en productos farmaceuticos, productos alimentarios o productos cosmeticos, si bien se contemplan tambien otros procesos corriente abajo. Un protocolo preferente del proceso de la presente invencion proporciona el desgrasado, la microfiltracion y la concentration por ultrafiltracion a traves de una serie de ciclos de diafiltracion. Los autores de la invencion han observado que el proceso de la invencion no requiere la acidificacion de la leche antes de dichas operaciones. El proceso no requiere ningun tipo de operacion que implique una alta temperatura perjudicial para las inmunoglobulinas.

Tal como se ilustra en detalle en los ejemplos mas adelante, el proceso de la presente invencion permite de manera sencilla producir hasta un 75 % o mas, en particular hasta un 85 %, de S-IgA presente originalmente en la leche. Tal como comprenderan las personas especializadas, la presente invencion, en aspectos preferentes, implica el tratamiento de la leche que tiene un alto contenido de S-IgA especlfico de antlgeno, como por ejemplo la leche obtenida de acuerdo con el metodo de hiperimunizacion mucosal de animales de granja que se ha descrito.

El proceso de la invencion, aparte de los altos niveles que se pueden conseguir de manera inesperada, ofrece ventajas de particular interes con vistas a su capacidad de aplicacion a gran escala y de aplicacion en las fabricas de productos lacteos existentes, as! como la capacidad de control de los parametros del proceso que influyen en la calidad y estabilidad de S-IgA.

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Descripcion de las figuras:

Figura 1: diagrama de flujo de un proceso integral de production de fraction de leche de IgG secretora (S-IgA) de acuerdo con una de las realizaciones de la invention, que comprende un aparto de desnatado de la leche (1), un primer tanque de retention (4), un modulo de microfiltracion (6) un segundo tanque de retention (10), un modulo de ultrafiltracion (11), un aparato de secado por pulverization (12) y una fuente de agua (8). En el diagrama de flujo (2) representa una corriente de permeado UF, (3) representa una corriente de material retenido MF, (7) representa la corriente de permeado MF y (9) representa la corriente de material retenido UF.

Figura 2A: el porcentaje acumulativo del total de S-IgA en el permeado de microfiltracion en relation con el volumen total de permeado. La llnea con • representa el permeado, la llnea con la ■ representa el material retenido y la llnea con ▲ representa el total de S-IgA el valor combinado de material permeado y retenido. Los porcentajes se expresan como la media de la llnea ▲.

Figura 2B: el porcentaje acumulativo de S-IgA especlfica de toxina A de C. difficile en el permeado de microfiltracion en relacion con el volumen total de permeado. La llnea con • representa el permeado, la llnea con ■representa el material retenido y la llnea con ▲ representa el total de S-IgA especlfica de toxina A de C. difficile, el valor combinado de material permeado y retenido. Los porcentajes se expresan como la media de la llnea ▲.

Figura 2C: el porcentaje acumulativo de IgG especlfica de toxina A de C. difficile en el material permeado de microfiltracion en relacion con el volumen total de permeado. La llnea con • representa el permeado, la llnea con ■ representa el material retenido y la llnea con ▲ representa el total de IgG especlfica de toxina A de C. difficile, el valor combinado de material permeado y retenido. Los porcentajes se expresan como la media de la llnea ▲.

Descripcion detallada de la invencion

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona un proceso para la produccion de una fraccion de leche enriquecida con IgA secretora (S-IgA) que comprende:

• reducir el contenido de grasa de un volumen de leche en bruto que tiene un pH por encima de 5,5 a un valor por debajo de 5,5 % en peso separando la grasa de la leche a una temperatura inferior a 55 °C;

• someter la leche con bajo contenido de grasa que tiene un pH por encima de 5,5 a microfiltracion utilizando una membrana porosa que tiene un tamano de poro promedio dentro del intervalo de 0,1 - 0,45 pm, produciendo un material permeado que contiene S-IgA y un material retenido rico en caselna; y

• concentrar el material permeado de la microfiltracion produciendo la fraccion de leche enriquecida en S-IgA.

Tal como se utilizan en el presente documento, los terminos “IgA secretora” o “S-IgA” se refieren a la inmunoglobulina dimerica que comprende dos monomeros IgA, tal como se encuentra en las secreciones mucosas, incluyendo las lagrimas, la saliva, el calostro y la leche madura, los jugos intestinales y las secreciones del epitelio respiratorio. Tal como se ha senalado anteriormente, este dlmero de IgA tambien comprende la cadena J as! el llamado componente secretorio, con el resultado de un peso molecular de aproximadamente 435 kDa.

La expresion “fraccion de leche enriquecida en S-IgA” se refiere a los productos obtenidos a traves del proceso de la invencion que contienen S-IgA en cantidades relativas significativamente superiores a las de la leche en bruto sin tratar sobre la base del material en seco. En particular, el proceso tiene como objeto separar S-IgA de los constituyentes de leche a granel, tales como llpidos y caselnas. El proceso tambien tiene como resultado la elimination de pequenas sustancias organicas e inorganicas de la leche, como puedan ser pequenas protelnas de suero, mono- y disacaridos y sales. Por lo tanto, la fraccion de leche enriquecida en S-IgA de acuerdo con la invencion comprende normalmente una combination de inmunoglobulinas (S-IgA, IgA, IgM e IgG) y otras protelnas de suero, trazas de mono- y disacaridos y otros componentes que se encuentran normalmente en el suero. El producto que rinde este proceso puede estar en forma llquida (concentrado), as! como en forma solida, tal como se explica mas adelante.

En el presente documento y en las reivindicaciones, el verbo “comprender” y su conjugation se utilizan en su sentido no exhaustivo para significar que los terminos que siguen a la palabra estan incluidos sin excluir artlculos que no se mencionan de manera especlfica. Por otra parte, la referencia a un elemento con un artlculo indefinido “un” o “una” no excluye la posibilidad de que este presente mas de un elemento, a no ser que el contexto dicte que pueda haber uno y solo uno de los elementos. El artlculo indefinido “un” o “una” significan por lo tanto “al menos uno”.

La expresion “leche en bruto” tal como se utiliza en el presente documento se refiere a leche tal como se obtiene directamente de un mamlfero. La leche en bruto antes de ser procesada de acuerdo con la invencion puede tratarse en un procesado de la leche convencional, p. ej., enfriado o refrigeration, para su almacenamiento o similar. Dicho tratamiento, sin embargo, no debera implicar temperaturas excesivas ni la adicion de sustancias qulmicas y/o enzimas que pudieran causar el deterioro de las inmunoglobulinas. Debe advertirse que, tal como entenderan las personas especializadas en la tecnica, el grado de dano causado a las inmunoglobulinas por el calentamiento dependera de la temperatura aplicada, as! como del periodo de tiempo que se expone la leche o la fraccion de leche a dicha temperatura. En una realization preferente de la invencion, se proporciona un proceso que no comprende ninguna etapa u operation en la que la temperatura excede 60 °C, preferentemente, no abarca ninguna etapa en la

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que la temperatura excede 55 °C o, aun mas preferentemente 50 °C, durante mas de 5, 2, 1, 0,5 minutos. Se puede concebir que las necesidades de regulation requieran la inclusion en el proceso de al menos una etapa de pasteurization. Por lo tanto, en otra realization de la invention, el proceso si que comprende una etapa de calentamiento de la leche o la fraction de leche, normalmente, a una temperatura por encima de 70 °C durante 40 segundos, preferentemente hasta 30 segundos.

Tal como se ha indicado anteriormente, el proceso de la invencion comprende la etapa de reduction del contenido de grasa de un volumen de leche en bruto que tiene un pH que excede, 5,5, preferentemente, que excede 5,6, mas preferentemente 5,7, siendo sobre todo preferente 5,8. De acuerdo con una realizacion particularmente preferente del proceso, el pH de la leche en bruto se encuentra en el intervalo de 6-7,5, mas preferentemente dentro del intervalo de 6,3-7. Tal como conocen las personas especializadas en la tecnica, el pH de la leche en bruto se encuentra normalmente dentro del intervalo de 6,5-6,8. De acuerdo con una realizacion particularmente preferente de la invencion, el proceso no comprende la adicion de acido en cantidades que supongan la agregacion de caselna. Sin desear vincularse a ninguna teorla, los autores de la invencion creen que la agregacion de la caselna antes de la microfiltracion tiene un significativo impacto sobre el flujo de la membrana MF de manera que se disminuye la eficiencia global del proceso. Por otra parte, un pH bajo durante el proceso de agregacion de caselna es perjudicial para las inmunoglobulinas. Es sobre todo preferente no acidular la leche en bruto antes de someterla al proceso de la presente invencion.

Las grasas contenidas en la leche producida por los mamlferos estan presentes en mas de un 95 % como globulos esfericos con un diametro en el intervalo de 0,1 a 20 pm. Para reducir el contenido de grasa de la leche en bruto, se puede emplear cualquier metodo conocido. La separation de los globulos de grasa de la leche, es decir, lo que se denomina desnatado, se basa normalmente en la diferencia entre la masa y el volumen (densidad) existente entre globulos y el llquido. Convencionalmente, se distinguen dos tipos de desnatado: el llamado desnatado espontaneo, proporcionando una capa enriquecida con globulos de grasa aglomerados, una operation que se realiza a 5-10 °C durante 10 - 16 horas, y el desnatado centrlfugo en el que se somete leche entera a una rotation centrlfuga de aproximadamente 4000 a 5000 rpm dentro de un apilamiento de discos conicos, para separar de forma continua la nata y la leche desnatada. De acuerdo con una realizacion particularmente preferente de la invencion, se reduce el contenido de grasa de la leche en bruto a un nivel por debajo de 0,1 % en peso, preferentemente menos de 0,075 % en peso. La reduccion del contenido de grasa de la leche antes de la microfiltracion puede potenciar en gran medida la eficacia del proceso ya que los globulos de grasa normalmente presentes en la leche pueden tener un efecto perjudicial para el proceso de filtration, p.ej., obstruction del filtro y flujo reducido.

Despues del desnatado, se somete a microfiltracion (MF) la leche que tiene un pH por encima de 5,5. El termino “microfiltracion” debe entenderse en el presente documento por su significado habitual de un proceso de filtracion que implica el paso a traves de una membrana microporosa, que no dista fundamentalmente de la ultrafiltracion o nanofiltracion, excepto en lo que se refiere al tamano de las moleculas que retiene. La microfiltracion es un proceso de separacion accionada por presion que emplea membranas de un tamano de poro determinado para separar componentes en una solution o una suspension sobre la base de su diferencia de tamano. Aunque se pueden eliminar partlculas mas grandes mediante el uso de filtros de profundidad o que no son de membrana, unicamente un filtro de membrana con el tamano de poro definido con precision puede asegurar una retention cuantitativa.

De acuerdo con la invencion, se utiliza una membrana microporosa que tiene un tamano de poro promedio dentro del intervalo de 0,01-1,0 pm. El tamano de poro (o diametro de poro) es una medida de los diametros de los poros. Es de particular preferencia el uso de una membrana microporosa que tenga un tamano de poro promedio de 0,10,45 pm. El intervalo de los tamanos de poro puede estar normalmente distribuido y la distribution puede ser bastante restringida (p.ej., la relation del mas grande al mas pequeno puede ser menos de 2). En el caso de distribuciones grandes y heterogeneidad, el tamano del poro sera bastante menos predecible del caudal que en el caso de una membrana con una distribucion del tamano del poro restringida. Preferentemente, la distribucion del tamano del poro es la suficiente para que la desviacion tlpica del tamano del poro sea menos de 20 por ciento del tamano del poro promedio. En otras realizaciones preferentes, la desviacion tlpica del tamano del poro es menos de 15, 10, 5 o 2 por ciento del tamano del poro promedio. Los metodos para determinar las caracterlsticas del tamano del poro de una membrana microporosa MF son conocidas entre las personas especializadas en la tecnica.

Se dispone (en el mercado) de diferentes tipos de membranas MF, incluyendo microtamices, fabricados de materiales ceramicos, semiconductores o polimericos, incluyendo por ejemplo, oxido de aluminio, oxido de zirconio, oxido de titanio o mezclas de los mismos, nitruro de silicio u otros compuestos a base de silicio o mezclas de los mismos, polisulfonas, fluoropollmeros, celulosa, resinas de poliolefina y polieter sulfonas. Preferentemente, la membrana porosa de la presente invencion es una membrana ceramica. Sin desear vincularse a ninguna teorla, los autores de la invencion creen que las membranas ceramicas ofrecen ventajas con respecto a las membranas polimericas en lo que se refiere a la robustez, la vida util y desde el punto de vista economico, CIP y una pequena distribucion del tamano del poro. Entre los ejemplos preferentes de una membrana de microfiltracion ceramica que se pueden utilizar adecuadamente en el metodo de la presente invencion se incluyen membranas ceramicas membralox, que se componen de un soporte de alumina poroso y una capa de filtracion de alumina, zirconia o titania.

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En lo que se refiere al modo de filtracion MF y/o la configuracion del modulo de filtro, la invencion no esta limitada en particular. Se pueden distinguir fundamentalmente dos modos de filtracion diferentes, es decir, filtracion con flujo directo (FFD), tambien conocido como filtracion de “extremo muerto”, en la que se aplica la corriente de alimentacion perpendicular a la cara de la membrana por la que se pretende hacer pasar el 100 % del fluido a traves de la membrana, y filtracion de flujo tangencial (FFT), tambien conocida como filtracion de flujo cruzado, en la que la corriente de alimentacion pasa paralela a la cara de la membrana a medida que pasa una porcion a traves de la membrana (material permeado) mientras que el resto (material retenido) vuelve a circular hasta el deposito de alimentacion. Entre los ejemplos de diferentes modulos de filtro conocidos en la tecnica que se pueden emplear en uno de estos modos de filtracion se incluyen modulos de fibra hueca, modulos arrollados en espiral, modulos tubulares y modulos de placa.

Las condiciones aplicables durante la microfiltracion pueden variar segun se desee a fin de aumentar el rendimiento total de S-IgA y/u optimizar el tiempo y la eficiencia del procesado. En un proceso tlpico de acuerdo con la invencion, se filtra la leche desnatada con un flujo de 10-100 l/m2 h, preferentemente 10-60 l/m2h, siendo sobre todo preferente 20-50 l/m2h y especialmente 30-35 1/m2 h. El proceso MF implica normalmente una presion interna antes del filtrado dentro del intervalo de 1-bar, preferentemente 2-4,5 bar y especialmente 3-4 bar. La presion de salida esta comprendida normalmente dentro del intervalo de 0,5-5 bar, preferentemente 1-3,5 bar. Preferentemente, pues, la presion aplicada tiene como resultado una presion de transmembrana dentro del intervalo de 1,5-5 bar, mas preferentemente 2-4,5 bar, siendo sobre todo preferente 3-4 bar. Para el proceso MF se mantiene normalmente la temperatura dentro del intervalo de 10-55 °C, preferentemente dentro del intervalo de 15-40 °C, siendo sobre todo preferente dentro del intervalo de 20-35 °C, y especialmente dentro del intervalo de 25-30 °C. Los inventores creen que estas temperaturas proporcionan el optimo compromiso entre el flujo, la permeacion de S-IgA y la estabilidad de inmunoglobulina molecular.

De acuerdo con la invencion, la microfiltracion produce un material permeado que contiene S-IgA y un material retenido rico en caselna. Tal como comprenderan las personas especializadas en la tecnica, esto significa que el material retenido contiene la porcion principal de la caselna de la leche y el material permeado contiene la principal porcion de la protelna de suero de la leche que incluye las inmunoglobulinas de la leche. Por lo tanto, sobre la base del peso de los solidos secos, el contenido de S-IgA del permeado es mas alto que el contenido de S-IgA de la leche en bruto.

De acuerdo con la invencion, posteriormente, se concentra el material permeado de la microfiltracion. El termino “concentracion”, tal como se utiliza en este contexto se refiere a cualquier proceso que elimine cantidades sustanciales de agua, as! como mono- y disacaridos y otros pequenos componentes de la leche de la fraccion permeada. Se puede aplicar cualquier proceso conocido por las personas especializadas en la tecnica, si bien de acuerdo con algunas realizaciones, no debera implicar temperaturas que excedan 55 °C, preferentemente 10-15°C.

En una realizacion particularmente preferente de la invencion, se proporciona un proceso tal como se ha definido en el presente documento, en el que el material permeado de la microfiltracion se concentra sometiendolo a ultrafiltracion. La ultrafiltracion (UF) es una filtracion de membrana en la que la presion hidrostatica fuerza un llquido contra una membrana semipermeable. Los solidos y los solutos de alto peso molecular suspendidos quedan retenidos, mientras que el agua y los solutos de bajo peso molecular atraviesan la membrana. Basicamente, la ultrafiltracion no dista de la microfiltracion o la nanofiltracion, excepto en lo que se refiere al tamano de las moleculas que retiene.

De acuerdo con la invencion, se puede utilizar una membrana porosa que tiene un valor de llmite del filtro dentro del intervalo de 1 -100 kDa. El valor del “peso molecular limite” (“MWCO”) se utiliza en su sentido normal, que indica la capacidad de una membrana microporosa para retener un porcentaje dado de una molecula de determinado peso molecular en solucion (normalmente 90 % de retencion). Es particularmente preferente utilizar una membrana que tenga un valor del peso molecular llmite dentro del intervalo de 10-100 kDa, siendo sobre todo preferente dentro del intervalo de 50-100 kDa.

Los diferentes tipos de membranas UF estan disponibles (en el mercado), fabricadas de materiales ceramicos, semiconductores o polimericos, incluyendo por ejemplo oxido de aluminio, oxido de zirconio, oxido de titanio o mezclas de los mismos, nitruro de silicio u otros compuestos a base de silicio o mezclas de los mismos, polisulfonas, fluoropollmeros, celulosa, resinas de poliolefina y polieter sulfonas. Preferentemente, la membrana UF porosa de la presente invencion es una membrana porosa polimerica, si bien tambien se contempla en la invencion el uso de una membrana ceramica. En lo que se refiere al modo de filtracion U y/o configuracion del modulo de filtro, la invencion no esta limitada en particular. Tanto el modo de filtracion de flujo directo (FFD) como el modo de filtracion de flujo tangencial (FFT) pueden ser adecuados para los fines de la invencion. Entre los ejemplos de diferentes modulos de filtro conocidos en la tecnica que se pueden utilizar en uno de estos modos de filtracion se incluyen modulos de fibra hueca, modulos arrollados en espiral, modulos tubulares y modulos de placa.

Las condiciones que se apliquen durante la ultrafiltracion dependeran de una serie de variables, tal como entenderan las personas especializadas en la tecnica. El profesional entrenado sabra como llevar a cabo el proceso y optimizarlo en cada circunstancia en concreto. En un proceso tlpico de acuerdo con la invencion, se filtra el material

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permeado de la microfiltracion con un flujo de 1-50 l/m2h, preferentemente 2,5-40 l/m2h y especialmente 5-30 l/m2h. El proceso UF implica normalmente una presion de entrada ante el filtro dentro del intervalo de 1-6 bar. La presion de salida oscila normalmente dentro del intervalo de 0,5-5 bar. Preferentemente, la presion aplicada tiene como resultado una presion de transmembrana dentro del intervalo de 1,5-6 bar. Para el proceso UF, normalmente, se mantiene la temperatura dentro del intervalo de 10-40 °C, preferentemente dentro del intervalo de 10-25 °C.

La operacion de ultrafiltracion produce la fraccion de leche rica en S-IgA como material retenido y el material permeado empobrecido en S-IgA, que comprende principalmente sales y moleculas organicas pequenas.

Normalmente, el material retenido de UF obtenido contiene protelna en cantidades comprendidas entre 30-90 % en peso, preferentemente 40-85 % en peso, sobre la base del peso de los solidos secos. Dicha protelna comprende las inmunoglobulinas de interes en combinacion con otras protelnas de leche, principalmente protelna de suero, trazas de mono-disacaridos y otros pequenos componentes de la leche. Dependiendo de la membrana utilizada, la etapa UF se puede optimizar para eliminar fracciones de protelnas de suero (as! como otras protelnas) que tienen pesos moleculares por debajo de 10 kDa, preferentemente por debajo de 50 kDa, siendo sobre todo preferente por debajo de 100 kDa, del material retenido de UF que contiene S-IgA. Para este fin, preferentemente, se usa una membrana UF que tiene un MWCO dentro del intervalo de 5-15 kDa o dentro del intervalo de 40-60 kDa o dentro del intervalo de 80-120 kDa, respectivamente. Tambien podran penetrar la membrana de UF pequenas moleculas organicas, as! como inorganicas. Por tanto, la etapa de concentracion por UF tambien puede eliminar significativas fracciones de sustancias como sales y mono- y disacaridos contenidos en la leche.

De acuerdo con una realizacion preferente de la invention, se proporciona un proceso tal como se ha definido en el presente documento, comprendiendo dicho proceso uno o mas ciclos de diafiltracion en los que se combina el material retenido de la microfiltracion con un llquido de diafiltracion y se somete la combinacion de material retenido de la microfiltracion y llquido de diafiltracion a posteriores etapas de microfiltracion y concentracion. Hay varias maneras de realizar la diafiltracion. En las diafiltraciones continuas, se anade el llquido de diafiltracion al deposito de alimentation de la muestra de MF, preferentemente, a la misma velocidad que se genera el filtrado. En una diafiltracion discontinua, se diluye primero la solution y despues se vuelve a concentrar hasta el volumen de partida. A continuation, se repite este proceso hasta que se obtiene el rendimiento requerido de S-IgA desde la corriente de alimentacion de MF. En el proceso de la presente invencion, preferentemente se usa un modo de operacion de diafiltracion continua. En el proceso de la presente invencion, con cada volumen de diafiltracion o ciclo de diafiltracion, se extraera una fraccion de la S-IgA contenida originalmente en el deposito de alimentacion de la muestra de MF. El “volumen de diafiltracion” (o “diavolumen”) se define en el presente documento como el volumen de filtrado recuperado en comparacion con la cantidad de material retenido con la MF. Cuando el volumen del filtrado extraldo es igual al volumen del material retenido cuando empiezan las operaciones de diafiltracion, se ha procesado 1 diavolumen. Por consiguiente, el termino “ciclo de diafiltracion” se refiere al tratamiento, es decir, elimination y recogida, de 1 diavolumen del deposito de alimentacion de la muestra de MF, normalmente se somete colectivamente a la(s) etapa(s) de concentracion corriente arriba las fracciones del material permeado por MF de S- IgA obtenido en todos los ciclos de diafiltracion y/o con el volumen de diafiltracion completo.

Los llquidos adecuados para su uso como llquido de diafiltracion de acuerdo con la presente invencion incluyen agua y soluciones acuosas. Preferentemente, el llquido de diafiltracion es agua o una fraccion acuosa de la leche. De acuerdo con una realizacion particularmente preferente de la invencion, el llquido de diafiltracion es un material permeado de la ultrafiltracion.

De acuerdo con una realizacion preferente de la invencion, se proporciona un proceso, tal como se ha definido en el presente documento, que comprende al menos 6 ciclos de diafiltracion, lo que significa que se recoge el volumen de permeado de MF, excluyendo el volumen de permeado de MF inicial, de 6 veces el volumen de material retenido de la MF cuando empieza la diafiltracion. Incluso mas preferentemente, se proporciona un proceso tal como se ha definido en el presente documento que comprende al menos 6, 8, 10 o 12 ciclos de diafiltracion, incluso mas preferentemente, al menos 13 o 14, siendo sobre todo preferente, al menos 15 ciclos de diafiltracion. Por razonas practicas, el numero de ciclos de diafiltracion en el proceso de la presente invencion no excedera 30, preferentemente, no excedera 20.

La expresion “factor de concentracion volumetrico” (VCF) describe la relation entre el volumen de alimentacion inicial y el volumen de material retenido. Por ejemplo, si se procesan 20 l de material de alimentacion hasta que hayan atravesado 18 l a traves del filtro y quedan 2 l en el material retenido, se obtiene una concentracion de diez veces, por tanto el factor de concentracion volumetrico es 10. Preferentemente, el FCV en la etapa de microfiltracion esta dentro del intervalo de 1,5-8, mas preferentemente dentro del intervalo de 2-6, siendo sobre todo preferente 2.54. El FCV en la etapa de ultrafiltracion normalmente esta dentro del intervalo de 10-30, siendo sobre todo preferente dentro del intervalo de 15-25.

En otra realizacion mas preferente, se proporciona un proceso tal como se define en el presente documento, en el que el material permeado de MF se diluye con agua o una solucion acuosa, preferentemente, agua esteril, cuando se somete a la etapa de UF, para eliminar mono- y di-sacaridos y otros componentes de la leche pequenos. Esto es de particular interes cuando el proceso de la presente invencion utiliza el material permeado de la ultrafiltracion

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como llquido de diafiltracion, tal como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Normalmente, se anade agua al deposito de alimentacion de la muestra de UF en un volumen dentro del intervalo de 40-60 % del volumen del material retenido tras la concentracion UF inicial con un FCV dentro del intervalo de 10-30.

Una vez completado el proceso de diafiltracion de acuerdo con la invencion, se puede someter la fraccion enriquecida en S-IgA contenida en el deposito de alimentacion de muestra UF a un posterior tratamiento corriente abajo, p.ej., para eliminar el agua y/o para seguir purificando el S-IgA.

En un aspecto preferente de la invencion, se proporciona un proceso, tal como se ha definido en el presente documento, en el que se recoge la fraccion enriquecida en S-IgA obtenida tras la operation final de diafiltracion, tras lo cual se separa el agua de dicha fraccion, p.ej., utilizando un evaporador de vaclo y/o se somete dicha fraccion a una posterior etapa de filtration para reducir el contenido microbiano de la misma y/o se somete dicha fraccion a secado por pulverization, liofilizacion, o se utiliza como material de alimentacion en un proceso de cromatografla para purification de S-IgA.

La posterior etapa de filtracion mencionada se aplica normalmente para reducir la carga bacteriana de la fraccion enriquecida en S-IgA, que puede ser deseable en el caso en el que no se haya reducido dicha carga bacteriana en un grado suficiente en la primera etapa de microfiltracion y/o porque se haya podido introducir contamination microbiana durante una operacion posterior, p.ej., en partes “contaminadas” del sistema. Preferentemente, la etapa comprende una filtracion de tipo extremo muerto utilizando una membrana microporosa que tienen un tamano de poro promedio de 0,05-0,5 pm, mas preferentemente 0,1-0,3 pm.

Secado por pulverizacion se refiere a cualquier proceso que implique la rotura de mezclas llquidas en pequenas gotas (atomization) y la rapida elimination del disolvente de la mezcla en un aparato de secado por pulverizacion, en el que existe una potente fuerza motriz para la evaporation del disolvente desde las gotas. El secado por pulverizacion de acuerdo con la presente invencion se puede realizar adecuadamente pulverizando el material retenido de UF enriquecido en S-IgA en una atmosfera a una temperatura de 100-200 °C, preferentemente 125-175 °C.

El “secado por congelation” o “liofilizacion” es un metodo de secado en frlo que implica la congelation del llquido retenido de UF seguido de la eliminacion o evaporacion por sublimation del agua.

La posterior purificacion de S-IgA puede implicar normalmente intercambio ionico, interaction hidrofobica, modo mixto, cromatografla de afinidad y/o cromatografla por exclusion de tamano o cualquier otro metodo de cromatografla conocido, todos ellos procesos utilizados generalmente en el campo de purificacion inmunoglobulina. En una realization de la invencion preferente en particular, se proporciona un metodo, tal como se ha descrito en el presente documento, que comprende la etapa adicional de someter la fraccion enriquecida en S-IgA a purificacion por cromatografla de afinidad. En la cromatografla de afinidad, se separan las protelnas sobre la base de una interaccion reversible con un ligando. El proceso de cromatografla de afinidad de la presente invencion se basa normalmente en la interaccion especlfica entre inmunoglobulinas, o mas especlficamente (S)-IgA, y un ligando. Dicho ligando se acopla a una matriz de cromatografla. Se puede utilizar un ligando con una alta afinidad para las regiones de la cadena ligera, es decir, la cadena k o A, la cadena pesada, es decir, la cadena a, el componente secretor o la cadena J o una combination de dos o mas regiones o partes especlficas de regiones, p.ej., la cadena pesada y el componente secretor, la cadena pesada y la cadena J, la cadena pesada, el componente secretor y la cadena J. Entre los ejemplos adecuados de dicho ligando se incluyen ligandos naturales o cultivados con tejido sobre la base de anticuerpos o fragmentos de anticuerpo derivados de mamlferos, aves y otras especies como fuente, p.ej., fracciones Fab monoclonales, fracciones de dominio variable de cadena simple o cualquier otro ligando conocido en la tecnica. Se puede llevar a cabo una purificacion adicional siguiendo la description anterior, si se sabe que la fraccion enriquecida en S-IgA contiene anticuerpos contra un antlgeno especlfico, p.ej., si la leche se obtiene de un animal inmunizado contra un antlgeno especlfico, y el objetivo es obtener especlficamente estos anticuerpos con una alta pureza, se puede utilizar el antlgeno especlfico como ligando para la purificacion por afinidad del (S)- IgA. De acuerdo con la presente invencion, se aplica la fraccion retenida de UF, opcionalmente tras las operaciones de tratamiento previo adecuadas, tales como concentracion, a una columna de cromatografla en condiciones que favorezcan la union especlfica del (S)-IgA al ligando. La union del ligando (S)-IgA es especlfica y reversible y el material sin unir se lava a traves de la columna. Se recupera la diana (S)-IgA cambiando las condiciones para favorecer su elucion, o bien especlficamente utilizando un ligando competitivo, o bien de forma no especlfica, cambiando el pH, la concentracion ionica o la polaridad. A continuation, se recoge el (S)-IgA en una forma purificada y concentrada.

Otro aspecto de la invencion se refiere a leche que se utiliza como leche en bruto en un proceso descrito en el presente documento. De acuerdo con una realizacion preferente, dicha leche se obtiene de animales de granja, tal como se ha indicado anteriormente. En un aspecto particularmente preferente de la invencion, se proporciona un proceso, tal como se ha definido en el presente documento, en el que la leche es leche madura recogida despues de la fase calostral de un animal de granja, preferentemente, un animal de granja seleccionado del grupo que consiste en ganado bovino y cabras. Las expresiones “leche madura” y “leche no calostral” se utilizan en el presente documento indistintamente para referirse a la leche secretada despues de la fase calostral que comprende los

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primeros 4 a 7 dlas despues del parto. Normalmente la leche madura se diferencia del calostro por contener cantidades menores de protelnas, entre ellas anticuerpos, y normalmente es constante durante hasta 300 dlas.

En una realizacion particularmente preferente de la invencion, dicha leche se obtiene de un animal que ha sido inmunizado con uno o mas antlgenos como para inducir la secrecion de S-IgA especlfica para dichos antlgenos en la leche. Normalmente, la leche madura que se produce de esta forma contiene S-IgA especlfica de antlgeno en cantidades de al menos 0,5 pg/ml, mas preferentemente al menos 15 pg/ml, siendo sobre todo preferente al menos

50 ug/ml. La inmunizacion de los animales de granja para obtener leche no calostral que contiene tltulos de S-IgA especlficos de antlgeno se ha descrito en la patente estadounidense US 6.974.573 y la patente estadounidense relacionada US 7.074.454. En un aspecto particularmente preferente de la invencion, se proporciona un proceso tal como se ha descrito en el presente documento, en el que la inmunizacion del animal comprende la administracion a dicho animal de una primera composicion que comprende dicho uno o mas antlgenos a traves de la mucosa o las vlas respiratorias para hiperinmunizar al animal y la posterior administracion de una segunda composicion que comprende dicho uno o mas antlgenos en la glandula mamaria o un nodulo linfatico supramamario de dicho animal. Este proceso de inmunizacion ha sido descrito en la patente estadounidense US 6.974.573, haciendose referencia de manera especlfica a la divulgacion de dicho documento por su explicacion detallada y las realizaciones preferibles del proceso.

51 bien la invencion no esta limitada a ningun antlgeno especlfico y/o anticuerpos especlficos de antlgeno, entre los antlgenos de interes en particular se incluyen los derivados de Clostridium spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Helicobacter spp. Escherichia spp., Campylobacter spp., Salmonella spp., Cholera spp., Moraxella spp. Heamophilus spp., virus (p.ej., Rotavirus, Norovirus), parasitos (e.g. Gardia lamblia), levaduras (e.g. Candida spp.) y mohos. Los antlgenos de interes de acuerdo con la invencion pueden incluir por ejemplo componente celulares, toxinas, factores de virulencia, factores de adhesion, factores de colonizacion, enzimas, peptidos, polisacaridos unidos a membrana/capsulares de un microorganismo de interes, preferentemente de uno o mas de los microorganismos antes mencionados, as! como protelnas de membrana exterior y factores de virulencia derivados de un virus, preferentemente, los que se han mencionado en el presente documento.

Otra realizacion de la invencion se refiere a un proceso, tal como se ha descrito en el presente documento, en el que la leche se obtiene de un animal de granja que no ha sido sometido a (hiper)inmunizacion activa. Los procesos de la presente invencion proporcionan un producto en forma de producto permeado de microfiltracion de leche en bruto.

Tal como entenderan las personas especializadas en el este campo, dichos productos se presentaran normalmente en forma de polvos deshidratados y/o llquidos concentrados y normalmente tendran un contenido de S-IgA en cantidades de al menos 0,02 % en peso, sobre la base del peso en seco total, preferentemente al menos 0,10 % en peso y siendo lo mas preferente al menos 0,25 % en peso. Ademas de las inmunoglobulinas y otros solidos derivados de la leche, los productos pueden contener cantidades sustanciales de agua y otros materiales vehlculo. El producto obtenido despues de la microfiltracion y la concentracion sin posteriores etapas de purificacion (o antes de ellas) contiene normalmente hasta un 5 % en peso de S-IgA, sobre la base del peso seco. Tal como podran entender las personas especializadas en la tecnica, las posteriores etapas de purificacion, en particular los procesos de cromatografla de afinidad que se han descrito, que se realizan despues de las etapas de microfiltracion y concentracion de la invencion pueden tener como resultado productos que contienen hasta un 100 % en peso de S- IgA.

Los productos descritos son muy adecuados para su incorporation en todo tipo de productos (composiciones) para mantener y/o mejorar la salud, en particular, productos farmaceuticos, productos cosmeticos y/o productos alimentarios para su uso en la prevencion y/o tratamiento de infecciones y/o inflamaciones de la mucosa y/o la piel en un paciente que lo necesita. Dicho paciente puede ser un ser humano, aunque tambien puede ser un animal. En una realizacion preferente, dicho paciente es un ser humano. Entre los ejemplos preferentes de dichos productos de acuerdo con la invencion se incluyen formas de dosis oral de productos farmaceuticos solidos, como comprimidos, capsulas, polvos y plldoras, as! como formulas semi solidas o llquidas, normalmente para administracion oral o topica o inyeccion, como soluciones, suspensiones, cremas, pomadas y formulaciones de aerosol. El producto puede ser una formula enterica, especialmente una formula para lactantes; nutrition cllnica; un alimento funcional y/o un nutraceutico. Los terminos “nutraceutico” y “alimento funcional”, tal como se utilizan en el presente documento se refieren a productos alimentarios y bebidas que se consumen como parte de la dieta habitual, pero que, segun se ha demostrado, suponen beneficios fisiologicos y/o reducen el riesgo de enfermedades cronicas mas alla de las funciones nutricionales basicas. El producto puede ser una composicion terapeutica o cosmetica para su aplicacion sobre la piel, como por ejemplo una crema, una locion o una pomada. El producto se puede proporcionar para su administracion en el tracto respiratorio inferior, p.ej., una formulation de aerosol, o en el tracto respiratorio superior, p.ej., una solution para tomar. En otra realizacion, se proporcionan composiciones para su administracion en la mucosa de la cavidad oral y/o nasal, p.ej., una solucion, suspension o pomada. La composicion puede ser para su administracion en el tracto urogenital, p.ej., una crema, una locion u otra formula llquida.

Los productos pueden ser comprimidos, capsulas, polvos, plldoras, soluciones, suspensiones, productos alimentarios llquidos o solidos, bebidas, lociones, cremas, pomadas y formulaciones de aerosol que comprenden un producto de los procesos que se han descrito en el presente documento.

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Dichos productos se pueden utilizar para el bienestar general y se utilizan normalmente para uno o mas entre tratamiento y/o prevention de infecciones y/o inflamacion de las superficies de la mucosa, p.ej., el tracto gastrointestinal, el tracto urogenital, el tracto respiratorio, la cavidad nasal o la cavidad oral, tratamiento y/o prevencion de la obesidad y enfermedades relacionadas, o tratamiento y/o prevencion de alergias alimentarias.

Ejemplos

Ejemplo 1

Se recogio leche en bruto que contenla inmunoglobulinas especlficas dirigidas contra Clostridium difficile y sus toxinas (toxina A y toxina B) de 3 vacas Holstein-Friesian. No se enfrio la leche despues de ordenarla, sino que se calento directamente a 40 °C. Se proceso la leche en bruto a 40 °C sobre una centrlfuga Clair Milky con una capacidad de 125 l/h para separar la nata de la leche. Se coloco la leche desnatada obtenida (40 l) en el tanque del sistema de la planta piloto de microfiltracion. Se utilizo una planta piloto TetraPak MSF-7 equipada con 7 filtros de 0,1 mm EP3730 Membralox con porosidad gradiente con un area de filtration total de 2,52 m2 para separar las protelnas de suero de las caselnas. Se mantuvo la temperatura de la leche en el proceso a 25-30°C.

Se realizo la ultrafiltracion con un llmite del peso molecular del filtro de 50 KDa y un area de filtro de 2,0 m2. El permeado de este proceso se utiliza como llquido de diafiltrado para la microfiltracion. Se llevo a cabo la ultrafiltracion a temperatura ambiente, controlando as! el flujo para que se produjera suficiente llquido de diafiltracion para realizar la diafiltracion en la microfiltracion. Como tal, el flujo sobre la ultrafiltracion fue del orden de 40 l/m2h.

Se puso en funcionamiento la planta piloto con agua en el arranque del experimento. El uso de los modulos de filtro de porosidad gradiente aseguro una presion de transmembrana uniforme en toda el area de la membrana. Se llevaron a cabo los experimentos con una presion de entrada antes del filtro de 3,75 bar y una presion de salida de 2.55 bar despues del filtro. El resultado es una presion de transmembrana de 3,15 bar y una calda de presion de 1,2 bar. Las presiones no cambiaron mucho durante el transcurso del experimento. Se dirigieron los flujos del material permeado y retenido al tanque del sistema. Despues de 10 minutos de estabilizacion, en los que se mezclo la leche desnatada con el agua presente en el volumen muerto de la planta piloto (15 l), se dirigio el flujo del material permeado a un vaso de recogida y se recogio el permeado en volumenes de 10 litros. Cada 10 litros, se tomo una muestra del material permeado y retenido para su analisis. Despues de 40 litros de permeado, el tanque del sistema de la planta piloto quedo vaclo y el concentrado de la leche desnatada habla ocupado el volumen muerto de la planta piloto. Llegado ese momento, se anadieron 10 litros del material permeado del ultrafiltrado al tanque del sistema. Se repitio esta misma operacion hasta que se detuvo el experimento a 300 l de permeado.

A 300 l de permeado se hablan realizado eficazmente 17,3 diafiltraciones en la leche, siendo los primeros 40 l de permeado la concentration de la leche. El factor de concentration de la leche desnatada oscila entre 0,73 y 2,67 en la etapa de concentracion y, durante la diafiltracion, es entre 1,60 y 2,67. A 300 l de permeado, el total de S-IgA, S- IgA especlfica de toxina A de C. difficile e IgG especlfica de toxina A de C. difficile se encontraron en el permeado en porcentajes de 96,6 %, 97,1 % y 105,4 %, respectivamente. Segun lo esperado, el total de S-IgA y S-IgA especlfica de toxina A de C. difficile tuvieron una curva de permeation similar. Estas curvas sin embargo son mas lentas que IgG especlfica de toxina A de C. difficile. El nivel de IgG era ya de un 97 % a 140 l de permeado, por tanto a 6,7 diafiltraciones. La S-IgA necesita aproximadamente 10 diafiltraciones mas para alcanzar el mismo nivel. Los pesos moleculares de IgG (que consisten en 2 cadenas ligeras y 2 cadenas pesadas), S-IgA (un dlmero con una cadena J adicional y un componente secretor) y IgM kDa (una estructura pentamera combinada con cadenas J) son 180, 435 KDa y 900 kDa, respectivamente. Las estructuras de S-IgA e IgG son diferentes, ya que IgG se puede considerar una protelna globular y la S-IgA con su configuration cola-a-cola en la region Fc tiene una region Fc mas de tipo dogal. Esta diferencia de forma y tamano desempena muy probablemente un papel en la diferencia de las diafiltraciones necesarias para filtrar la S-IgA en un alto rendimiento desde la leche. Los flujos sobre la membrana de microfiltracion con los parametros mencionados (25-30 °C, presion interna 3,75 bar, presion externa 2,55 bar) fueron 30-35 l/m2h.

En las figuras 2A, 2B y 2C se puede observar la permeacion del total de S-IgA, S-IgA especlfica toxina A de C. difficile e IgG, respectivamente. En la Tabla 1, se indica la diferencia en el numero de ciclos de diafiltracion realizados para recuperar IgG y S-IgA.

Tabla 1: Comparacion de la recuperation de S-IgA e IgG. Los porcentajes de permeado se expresan como _______________porcentajes de la cantidad inicialmente presente en la leche en bruto_______________

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S-IgA: >75 % >16 >280 l

igG: >95 % 6 130 l

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REIVINDICACIONES

1. Proceso para la produccion de una fraccion de leche enriquecida en IgA secretora (S-IgA), que comprende:

- reducir el contenido de grasa de un volumen de leche en bruto que tiene un pH por encima de 5,5 a un valor por debajo del 0,5 % en peso separando la grasa de la leche a una temperatura inferior a 55 °C;

- someter la leche con bajo contenido de grasa, que tiene un pH por encima de 5,5, a microfiltracion utilizando una membrana porosa que tiene un tamano de poro promedio dentro del intervalo de 0,1 - 0,45 pm, produciendo un material permeado que contiene S-IgA y un material retenido rico en caselna; y

- concentrar el material permeado de la microfiltracion produciendo una fraccion de leche enriquecida en S-IgA.
2. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el pH de la leche durante la microfiltracion esta dentro del intervalo de 6-7,5.
3. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que se concentra el material permeado de la microfiltracion sometiendolo a ultrafiltracion utilizando una membrana porosa que tiene un valor llmite de filtro dentro del intervalo de 1 -100 kDa, preferentemente 50-100 kDa, produciendo la fraccion de leche rica en S-IgA como material retenido y un permeado con empobrecimiento en S-IgA.
4. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho proceso comprende uno o mas ciclos de diafiltracion en los que se combina el material retenido de la microfiltracion con el llquido de diafiltracion y la combinacion del material retenido de microfiltracion y el llquido de diafiltracion se somete a etapas de microfiltracion y concentration posteriores.
5. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 4, que comprende uno o mas ciclos de diafiltracion, en el que el material permeado de la ultrafiltracion se utiliza como llquido de diafiltracion.
6. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, en donde el proceso comprende al menos 6 ciclos de diafiltracion.
7. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el proceso comprende al menos 8 ciclos de diafiltracion.
8. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde el proceso comprende al menos 10 ciclos de diafiltracion.
9. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en donde el proceso comprende al menos 15 ciclos de diafiltracion.
10. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el proceso produce una fraccion de leche enriquecida en S-IgA que contiene un 75 % o mas de la S-IgA presente originalmente en la leche en bruto.
11. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el proceso produce una fraccion de leche enriquecida en S-IgA que contiene un 85 % o mas de la S-IgA presente originalmente en la leche en bruto.
12. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la microfiltracion se realiza utilizando una membrana ceramica y la ultrafiltracion se realiza utilizando una membrana polimerica.
13. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el proceso no comprende ninguna etapa ni operation en las que la temperatura exceda de 60 °C durante mas de 2 minutos.
14. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se recoge el material retenido de la ultrafiltracion obtenido despues de la operacion de diafiltracion final y se seca por pulverization, se liofiliza o se utiliza como material de alimentation en un proceso de cromatografla para la purification de S-IgA.
15. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la leche es leche madura recogida despues de la fase calostral de un animal de granja, preferentemente un animal de granja seleccionado del grupo que consiste en ganado bovino y cabras.
16. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 15, en el que el animal ha sido inmunizado con uno o mas antlgenos para inducir secretion en la leche de S-IgA especlfica para dichos antlgenos.
17. Proceso de acuerdo con la reivindicacion 16, en el que la inmunizacion del animal comprende la administration a dicho animal de una primera composition que comprende uno o mas de dichos antlgenos a traves de la mucosa o

las vlas respiratorias para hiperinmunizar al animal y la posterior administracion de una segunda composition que comprende dicho uno o mas antlgenos en la glandula mamaria o un nodulo linfatico supramamario de dicho animal.