ES2640295T3

ES2640295T3 - Métodos para evaluar una respuesta inmune a un agente terapéutico

Info

Publication number: ES2640295T3
Application number: ES13158951.7T
Authority: ES
Inventors: Meena Subramanyam; Lakshmi Amaravadi; Eric Wakshull; Frances Lynn; Michael Panzara; Robin Mcdaid Barbour; Julie Elizabeth Taylor
Original assignee: Biogen MA Inc
Current assignee: Biogen MA Inc
Priority date: 2005-04-04
Filing date: 2006-04-04
Publication date: 2017-11-02
Anticipated expiration: 2026-04-04
Also published as: IL186431A; EP3264094B1; JP2014197032A; LT2645106T; HRP20201840T1; ES2536915T3; RS61229B1; EP2645106B2; EP3264094A1; EP1872136A2; CN101351710B; CA3031792A1; ES2536915T5; EP3796003A1; WO2006107962A8; CA2603481C; CN101351710A; DK2645106T3; PL3264094T3; EP2645106A2

Abstract

Un método para detectar una respuesta inmune clínicamente significativa de un anticuerpo de unión a VLA-4 en un sujeto, comprendiendo el método determinar si una muestra biológica de un sujeto a quien se ha administrado un anticuerpo de unión a VLA4 contiene al menos un nivel umbral, clínicamente significativo, de 500 ng/ml de un anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de unión a VLA-4, donde la presencia de al menos el nivel umbral del anticuerpo soluble es indicativa de una disminución de la eficacia o la falta de eficacia del anticuerpo de unión a VLA-4.

Description

DESCRIPCION

Metodos para evaluar una respuesta inmune a un agente terapeutico 5 Solicitudes relacionadas Campo de la invencion.

La invencion se refiere a la evaluacion de pacientes en cuanto a una respuesta inmune a un agente terapeutico, y en 10 particular a una protefna terapeutica, por ejemplo, un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, natalizumab).

Antecedentes de la invencion

Actualmente estan disponibles terapias biologicas para el tratamiento de enfermedades y trastornos tales como 15 rechazo de trasplantes, leucemia, cancer de mama, artritis, esclerosis multiple y la enfermedad de Crohn; y estan en desarrollo numerosas terapias basadas en protefnas adicionales. Los productos terapeuticos biologicos disponibles incluyen AMEVIVE® (alefacept), ZEVALlN® (ibritumomab tiuxetan), ORTHOCLONE® (muromonab-CD3), ENBREL® (etanercept), REOPRO® (abciximab), RITUXAN® (rituximab), SIMULECT® (basiliximab), REMICADE® (infliximab), SYNAGIS® (palivizumab), HERCEPTIN® (trastuzumab), ZENAPAX® (daclizumab), CAMPATH® 20 (alemtuzumab), MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicina), HUMIRA® (adalimumab), AvONEX® (Interferon beta- la), y TYSABRI® (natalizumab). Natalizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado contra integrina a4p1 (VLA- 4). Natalizumab se une a la subunidad a4 de las integrinas a4p1 y a4p7. Natalizumab es util para tratar determinadas enfermedades y afecciones inflamatorias, incluyendo la esclerosis multiple, la enfermedad de Crohn y la artritis reumatoide.

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Debido a que las respuestas inmunes a agentes terapeuticos biologicos pueden tener consecuencias clfnicas, el desarrollo del ensayo de la inmunogenicidad y la validacion es de gran importancia en el campo de los agentes terapeuticos biologicos.

30 Resumen de la invencion

La invencion se refiere a las realizaciones segun se define en las reivindicaciones.

En particular, la invencion se refiere a un metodo para detectar una respuesta inmune clfnicamente significativa de 35 un anticuerpo de union a VLA-4 en un sujeto, comprendiendo el metodo determinar si una muestra biologica de un sujeto a quien se ha administrado un anticuerpo de union a VLA-4 contiene al menos un nivel umbral, clfnicamente significativo, de 500 ng/ml de un anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4, donde la presencia de al menos el nivel umbral del anticuerpo soluble es indicativa de una disminucion de la eficacia o la falta de eficacia del anticuerpo de union a VLA-4.

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La divulgacion proporciona metodos y composiciones para la identificacion, el seguimiento y/o la evaluacion de una respuesta inmune a un agente terapeutico, por ejemplo, una protefna terapeutica, por ejemplo, un anticuerpo terapeutico. El hecho de que un paciente desarrolle cualesquiera anticuerpos a un agente terapeutico (tal como una protefna terapeutica o un anticuerpo terapeutico) puede o puede no correlacionarse con una respuesta clfnica al 45 agente terapeutico. La invencion se basa, en parte, en el descubrimiento de un inesperado nivel de respuesta de anticuerpos que se puede utilizar como un umbral para la deteccion de una respuesta clfnicamente significativa al agente terapeutico. En algunas realizaciones, el nivel de umbral es mayor de lo que habrfa sido predicho utilizando un analisis estadfstico de los pacientes que no han recibido el agente terapeutico. El umbral clfnicamente significativo es generalmente mas alto que el nivel detectable mas bajo de la respuesta inmune en un paciente. Por 50 ejemplo, el nivel de umbral clfnicamente significativo es generalmente de al menos 2 desviaciones estandar por

encima de un nivel de control negativo, por ejemplo, por encima de un nivel medio de pretratamiento de una

poblacion de pacientes sin tratar. En algunas realizaciones, los niveles de umbral mas altos utilizados en los metodos de la invencion resultan en un menor numero de falsos positivos que se identificarfa si el nivel de umbral se basara en un punto de corte del 5 % (por ejemplo, 1,645 desviaciones estandares por encima de la media) para 55 respuestas inmunes observadas en pacientes que no habfan recibido el agente terapeutico. De acuerdo con la

invencion, la presencia de una respuesta inmune detectable en una muestra del paciente no es clfnicamente

significativa, a menos que la respuesta inmune alcance al menos un nivel de umbral predeterminado. La invencion proporciona, entre otros, metodos de identificar un nivel de umbral clfnicamente significativo de la respuesta de anticuerpos a un agente terapeutico (por ejemplo, una protefna terapeutica, por ejemplo, un anticuerpo terapeutico), 60 y metodos de identificacion de pacientes que tienen una respuesta de anticuerpos clfnicamente significativa a un

agente terapeutico. La invencion, en parte, tambien proporciona un nivel de umbral con el que identificar anticuerpos cifnicamente significativos en un sujeto.

Una respuesta inmune a un agente terapeutico (por ejemplo, natalizumab) puede no ser cifnicamente significativa 5 (por ejemplo, puede no mostrar una asociacion significativa con la eficacia clfnica reducida) a menos que la magnitud de la respuesta inmune alcance un nivel de umbral que puede ser predeterminado (por ejemplo, basado en respuestas inmunes obtenidas para diferentes grupos de pacientes). Sorprendentemente, los metodos descritos en el presente no se basan en la comparacion de muestras obtenidas de cada uno de los pacientes antes y despues del tratamiento, ni se basan en la identificacion de la mera presencia de una respuesta inmune detectable al agente 10 terapeutico. En contraposicion, los metodos de la divulgacion se refieren a la deteccion de al menos un nivel de umbral de una respuesta inmune a un agente terapeutico, donde el nivel de umbral puede ser mas alto que el nivel detectable mas bajo de la respuesta inmune, y donde los resultados positivos del ensayo son clfnicamente significativos, en parte, porque el ensayo evita falsos positivos que no tienen ninguna significacion clfnica asociada.

15 En la actualidad, no hay generalmente tecnica aplicable ni patron para la deteccion de una respuesta de anticuerpos clfnicamente significativa a una protefna terapeutica. Diferentes protefnas terapeuticas pueden inducir diferentes tipos de anticuerpos, y la presencia de tales anticuerpos puede o no afectar a la seguridad, farmacocinetica y/o eficacia de una protefna terapeutica. Los metodos actuales de seguimiento de la respuesta de un paciente a un anticuerpo terapeutico implican tfpicamente la comparacion de los niveles de anticuerpos en el suero antes y 20 despues del tratamiento para cada uno de los pacientes la identificacion de la presencia de cualquier respuesta inmune detectable, y a la evaluacion del paciente para determinar si la respuesta inmune detectable se correlaciona con cualquier cuestion de seguridad, farmacocinetica y/o de eficacia. En contraposicion, los metodos de la divulgacion son utiles para identificar a los pacientes con respuestas inmunes clfnicamente significativas al proporcionar ensayos de cribado para la deteccion de niveles de umbral de respuesta clfnicamente significativos.

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De acuerdo con la invencion, una respuesta inmune clfnicamente significativa a un agente terapeutico es una respuesta de anticuerpos que puede afectar a uno o mas parametros clfnicos en un paciente, y/o a la farmacocinetica y/o a la eficacia del agente terapeutico. Generalmente, una respuesta de anticuerpos clfnicamente significativa indica una disminucion de la eficacia o la falta de eficacia del agente terapeutico, o una reaccion adversa 30 al agente terapeutico. Por ejemplo, para la esclerosis multiple, una respuesta de anticuerpos clfnicamente significativa a una protefna terapeutica incluye uno o mas de: (a) la falta de eficacia o al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o mas de disminucion en la eficacia del agente terapeutico para reducir el numero, la gravedad o la tasa de recidiva en el paciente; (b) la falta de eficacia o al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o mas de disminucion en la eficacia del agente terapeutico para ralentizar la progresion de la discapacidad en la Escala 35 Expandida del Estado de Discapacidad (EDSS) o la Escala Funcional Compuesta de Esclerosis Multiple (MSFC); (c) la falta de eficacia o al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o mas de disminucion en la eficacia para reducir el numero o volumen de lesiones hiperintensas de T2 nuevas o de reciente ampliacion o para atenuar el aumento en el volumen de la lesion hiperintensa de T2 en MRI del cerebro, (d) la falta de eficacia o al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 % o mas de disminucion en la eficacia para reducir el numero o el volumen de las 40 lesiones potenciadas con gadolinio en la MRI del cerebro; (e) la falta de eficacia o al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 60 % o mas de disminucion en la eficacia para mejorar la funcion visual; (f) la presencia de un evento adverso serio (por ejemplo, reaccion de hipersensibilidad, por ejemplo, anafilaxis). Con la excepcion de (f), dichas respuestas se evaluan dentro de un periodo determinado de tiempo despues de la administracion del agente, por ejemplo, dentro de 3 meses, 6 meses, 9 meses, o al menos un ano.

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En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos de identificar un nivel de umbral clfnicamente significativo de la respuesta de anticuerpos a un agente terapeutico (por ejemplo, una protefna terapeutica, por ejemplo, un anticuerpo terapeutico). El metodo incluye (a) evaluar el nivel de anticuerpos anti-agente en una poblacion control de pacientes que tienen un trastorno (por ejemplo, determinando el nivel medio o mediano de anticuerpos anti-agente en una 50 poblacion de al menos 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, 100 o mas pacientes que tienen un trastorno y que no han sido tratados con un agente terapeutico objeto durante al menos 3 meses, 6 meses o mas); y (b) seleccionar un nivel de umbral de al menos 2 (por ejemplo, 2, 5, 3, 4, 5 o 6) desviaciones estandares por encima del nivel de anticuerpos anti-agente en la poblacion de control. La presencia de al menos el nivel de umbral de anticuerpos anti-agente en un paciente al que se ha administrado el agente terapeutico (el paciente tratado) se correlaciona con una respuesta 55 clfnicamente significativa en el paciente tratado. Preferiblemente, el mismo reactivo de deteccion (por ejemplo, anticuerpo anti-agente marcado) se utiliza para evaluar al paciente tratado que el que se utiliza para identificar el nivel de anticuerpos anti-agente en la poblacion de control. En una realizacion, el agente terapeutico es un anticuerpo terapeutico, por ejemplo, un anticuerpo anti-VLA-4 21.6 humanizado, por ejemplo, natalizumab. En una realizacion, el trastorno es esclerosis multiple. En algunas realizaciones, el trastorno es una inflamacion del sistema 60 nervioso central (por ejemplo, meningitis, neuromielitis optica, neurosarcoidosis, vasculitis del SNC, encefalitis o

mielitis transversa, ademas de o en lugar de la esclerosis multiple), un rechazo de injerto de tejidos o de organos o una enfermedad de injerto contra huesped, una lesion aguda del SNC (por ejemplo, ictus o lesion de la medula espinal); enfermedad renal cronica; alergia (por ejemplo, asma alergica); diabetes de tipo 1; trastornos inflamatorios del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa); miastenia grave; fibromialgia; una enfermedad 5 artrftica (por ejemplo, artritis reumatoide o artritis psoriasica); un trastorno de la piel inflamatorio/inmune (por ejemplo, psoriasis, vitiligo, dermatitis o liquen plano); lupus eritematoso sistemico; sfndrome de Sjogren; un cancer hematologico (por ejemplo, mieloma multiple, leucemia o linfoma); un cancer solido tal como un sarcoma o un carcinoma (por ejemplo, de pulmon, mama, prostata, o cerebro); o un trastorno fibrotico (por ejemplo, fibrosis pulmonar, mielofibrosis, cirrosis hepatica, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis crescentica, 10 nefropatfa diabetica o fibrosis intersticial renal). En algunas realizaciones, el trastorno es una enfermedad que implica la modulacion de una subunidad a4p1y/o a4p7.

La invencion proporciona metodos para identificar un paciente que tiene una respuesta de anticuerpos clinicamente significativa a una proteina terapeutica, por ejemplo, un anticuerpo terapeutico. El metodo incluye identificar, en una 15 muestra biologica obtenida de un sujeto que tiene un trastorno y al que se ha administrado la proteina terapeutica, la presencia de un nivel de umbral de uno o mas anticuerpos que se unen especfficamente a la proteina terapeutica, donde el nivel de umbral es de al menos 2 (por ejemplo, 2, 5, 3, 4, 5 o 6) desviaciones estandares por encima del nivel de anticuerpos que se unen especfficamente a la proteina terapeutica en una poblacion de control (por ejemplo, una poblacion de pacientes que tienen el trastorno, pero a los que no se les ha administrado la proteina terapeutica 20 en los ultimos 3 meses, 6 meses o mas). En una realizacion, la proteina terapeutica es un anticuerpo terapeutico, por ejemplo, un anticuerpo anti-VLA-4 21.6 humanizado (tambien denominado como AN100226), por ejemplo, natalizumab. En una realizacion, el trastorno es esclerosis multiple. En algunas realizaciones, el trastorno es artritis reumatoide. En ciertas realizaciones, el trastorno es enfermedad de Crohn. En una realizacion, el metodo incluye, ademas, modificar el regimen de tratamiento de un paciente al que se identifica que tiene una respuesta de 25 anticuerpos clinicamente significativa a una proteina terapeutica.

En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos y composiciones para identificar en una muestra biologica obtenida de un sujeto la presencia de un nivel clinicamente significativo de uno o mas anticuerpos que se unen especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico que se administro al sujeto. Aspectos de la 30 divulgacion incluyen el uso de ensayos ELISA para la deteccion de niveles de anticuerpos inducidos que son indicativos de una respuesta inmune clinicamente significativa en un sujeto para la administracion de un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. En una realizacion, la divulgacion proporciona metodos y kits para identificar niveles clinicamente significativos de anticuerpos anti-natalizumab que son indicativos de una respuesta inmune a natalizumab en un sujeto que ha recibido al menos una dosis de natalizumab.

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En un aspecto, la divulgacion proporciona metodos para evaluar y/o modificar un regimen terapeutico basado en una respuesta inmune de un sujeto a un anticuerpo de union a VLA-4.

De acuerdo con un aspecto de la divulgacion, se proporcionan metodos para detectar una respuesta inmune 40 clinicamente significativa a un anticuerpo de union a VLA-4 en un sujeto. Los metodos incluyen determinar si una muestra biologica de un sujeto, al que se ha administrado un anticuerpo de union a VLA-4, contiene un nivel de umbral clinicamente significativo de un anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4, donde la presencia de al menos el nivel de umbral del anticuerpo soluble es indicativa de una respuesta inmune clinicamente significativa al anticuerpo de union a VLA-4. En algunas realizaciones, una respuesta inmune clinicamente 45 significativa al anticuerpo de union a VLA-4 se indica por la presencia de al menos el nivel de umbral de anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA-4 en al menos dos muestras biologicas tomadas del sujeto en diferentes puntos temporales. En determinadas realizaciones, los puntos temporales estan separados por al menos un mes. En algunas realizaciones, al menos el nivel de umbral de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 esta presente en dos muestras biologicas tomadas del sujeto en dos puntos temporales consecutivos. En algunas 50 realizaciones, un nivel de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 se determina: determinando un nivel de actividad de union soluble al anticuerpo de union a VLA-4 en una primera alfcuota de la muestra biologica; y determinando si la actividad de union soluble es especffica para el anticuerpo de union a VLA-4. En ciertas realizaciones, la especificidad de la actividad de union soluble se determina en una segunda alfcuota de la muestra biologica. En algunas realizaciones, un nivel de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA- 55 4 en la muestra biologica se determina comparando los niveles de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-4 marcado, medidos en presencia de dos o mas cantidades diferentes de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado (por ejemplo, niveles medidos en presencia de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado pueden compararse con los niveles medidos en presencia de una cantidad competitiva de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado). En determinadas realizaciones, un nivel de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 60 en la muestra biologica se determina comparando los niveles de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-

4 inmovilizado medidos en presencia de dos o mas cantidades diferentes de anticuerpo de union a VLA-4 soluble (por ejemplo, los niveles medidos en presencia de anticuerpo de union a VLA-4 no soluble pueden compararse con los niveles medidos en presencia de una cantidad competitiva de anticuerpo de union a VLA-4 soluble). En algunas realizaciones, un primer nivel de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-4 marcado, medido en presencia 5 de una primera cantidad de VLA-4 no marcado, se compara con un segundo nivel de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-4 marcado, medido en presencia de una segunda cantidad de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado. En algunas realizaciones, el primer y segundo niveles de actividad de union se determinan en una primera y segunda alfcuotas de la muestra biologica. En determinadas realizaciones, la cantidad de anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA-4 se determina utilizando un ensayo ELISA de puente. En algunas 10 realizaciones, un primer nivel de actividad de union al anticuerpo de union a VLA-4 se determina en un primer inmunoensayo para una primera alfcuota de la muestra biologica, y un segundo nivel de actividad de union al anticuerpo de union a VLA-4 se determina en un segundo inmunoensayo para una segunda alfcuota de la muestra biologica, donde el segundo inmunoensayo se enriquece con una mayor cantidad de anticuerpo de union a VLA-4 soluble no marcado que el primer inmunoensayo, y donde la presencia en la muestra biologica de al menos un nivel 15 de umbral de anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA-4 se indica si el primer nivel de actividad de union es mayor que un nivel de referencia y el segundo nivel de la actividad de union es inferior a un porcentaje predeterminado del primer nivel de la actividad de union. En determinadas realizaciones, el nivel de referencia es un nivel de actividad de union, medida para una cantidad de referencia de anticuerpo soluble, al anticuerpo de union a VLA-4. En algunas realizaciones, la cantidad de referencia es de aproximadamente 500 ng/ml (por ejemplo, en una 20 muestra de suero) de un anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA-4. Por ejemplo, la cantidad de referencia puede estar entre aproximadamente 400 ng/ml y aproximadamente 600 ng/ml (por ejemplo, aproximadamente 400 ng/ml, aproximadamente 425 ng/ml, aproximadamente 450 ng/ml, aproximadamente 475 ng/ml, aproximadamente 500 ng/ml, aproximadamente 525 ng/ml, aproximadamente 550 ng/ml, aproximadamente 575 ng/ml, o aproximadamente 600 ng/ml). Se debe apreciar que el nivel de referencia de la actividad de union que corresponde 25 a la cantidad de referencia puede medirse en una muestra diluida (por ejemplo, una muestra que corresponde a una dilucion de 10 veces y contiene de aproximadamente 40 ng/ml a aproximadamente 60 ng/ml, por ejemplo, aproximadamente 50 ng/ml, de un anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA-4). Un nivel de referencia de la actividad de union en un ensayo puede ser proporcionado por cualquier cantidad predeterminada de anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA4 correspondiente a una dilucion apropiada de la cantidad de referencia. En 30 determinadas realizaciones, el anticuerpo de union a VLA-4 es un anticuerpo monoclonal murino humanizado contra VLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo de union a VLA-4 es una forma humanizada del anticuerpo murino mAb 21.6, (por ejemplo, AN100226). En algunas realizaciones, el anticuerpo de union a VLA-4 es natalizumab. En algunas realizaciones, el anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA-4 es un anticuerpo de referencia que se une a natalizumab con una alta afinidad. En algunas realizaciones, el anticuerpo de referencia bloquea la interaccion 35 entre natalizumab y VLA-4. En determinadas realizaciones, el primer y el segundo inmunoensayos estan puenteando los ensayos ELISA. En algunas realizaciones, el primer y el segundo ensayos comprenden un anticuerpo de union a VLA-4 inmovilizado no marcado y un anticuerpo de union a VLA-4 soluble marcado, donde el anticuerpo de union a VLA-4 soluble marcado esta marcado con una enzima, un marcador fluorescente, un marcador de biotina (por ejemplo, el anticuerpo de union a VLA-4 puede estar biotinilado), o un marcador radiactivo. En algunas realizaciones, 40 el primer y el segundo inmunoensayos se llevan a cabo en volumenes de reaccion en paralelo en un unico sustrato de reaccion. En algunas realizaciones, la muestra biologica es una muestra de suero. En determinadas realizaciones, el sujeto es un paciente humano. En algunas realizaciones, el paciente tiene esclerosis multiple. En algunas realizaciones, el paciente tiene artritis reumatoide. En determinadas realizaciones, el paciente tiene la enfermedad de Crohn. En algunas realizaciones, los puntos temporales de al menos dos o mas muestras biologicas 45 obtenidas del sujeto estan separados por al menos 15 dfas, 30 dfas, 45 dfas, 60 dfas, 90 dfas o mas. En determinadas realizaciones, el metodo tambien incluye seleccionar un regimen terapeutico para el sujeto si se detecta un nivel de umbral clfnicamente significativo de un anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 en al menos dos muestras biologicas obtenidas del sujeto. En algunas realizaciones, la seleccion de un regimen terapeutico incluye la evaluacion de una terapia actual del sujeto, la determinacion de una nueva terapia 50 para el sujeto, la modificacion de una terapia actual del sujeto o la detencion de una terapia actual del sujeto. En algunas realizaciones, una terapia actual incluye la administracion del anticuerpo de union a VLA-4 al sujeto.

De acuerdo con otro aspecto de la divulgacion, se proporcionan metodos de seleccion de un regimen terapeutico para un sujeto. Los metodos incluyen someter a ensayo a un sujeto a quien se ha administrado un anticuerpo de 55 union a VLA-4 para determinar la presencia de una respuesta inmune positiva a anticuerpo de union a VLA-4 en un primer y segundo puntos temporales, seleccionar un regimen terapeutico para el sujeto basado en los resultados del ensayo en el primer y segundo puntos temporales, donde la presencia de una respuesta inmune positiva en un punto temporal esta indicada por la presencia de al menos una cantidad umbral clfnicamente significativa de la actividad de union en una muestra biologica obtenida del sujeto en el punto temporal. En algunas realizaciones, el primer y 60 segundo puntos temporales estan separados por un perfodo de tiempo clfnicamente significativo. En determinadas

realizaciones, el perfodo de tiempo cifnicamente significativo es de al menos 30 dfas. En algunas realizaciones, la terapia de anticuerpo de union a VLA4 se continua si se detecta una respuesta inmune negativa en el segundo punto temporal. En algunas realizaciones, se selecciona una terapia distinta de la terapia de anticuerpo de union a VLA-4 si se detecta una respuesta inmune positiva tanto en el primer como en el segundo puntos temporales. En algunas 5 realizaciones, el sujeto tiene esclerosis multiple. En determinadas realizaciones, el sujeto tiene la enfermedad de Crohn. En algunas realizaciones, el sujeto tiene artritis reumatoide.

De acuerdo con otro aspecto mas de la divulgacion, se proporcionan metodos de seleccion de un regimen terapeutico para un sujeto. Los metodos incluyen detectar la presencia de una respuesta inmune clfnicamente 10 significativa a un anticuerpo de union a VLA-4 en al menos dos muestras biologicas obtenidas de un sujeto, donde al sujeto se le ha administrado un anticuerpo de union a VLA-4, y las al menos dos muestras biologicas se obtienen del sujeto en instantes separados por al menos un intervalo de tiempo clfnicamente significativo, y seleccionar un regimen terapeutico basado en la deteccion de una respuesta inmune clfnicamente significativa al anticuerpo de VLA-4 en el sujeto en los instantes en los que se obtienen al menos dos muestras biologicas del sujeto. En algunas 15 realizaciones, el intervalo clfnicamente significativo que separa los instantes en los que las muestras se obtienen del sujeto es al menos de 15 dfas, 30 dfas, 45 dfas, 60 dfas, 90 dfas o mas. En ciertas realizaciones, la seleccion de un regimen terapeutico incluye la evaluacion de una terapia actual del sujeto, la determinacion de una nueva terapia para el sujeto, la modificacion de una terapia actual del sujeto o la detencion de una terapia actual del sujeto. En algunas realizaciones, una terapia actual incluye administrar al sujeto el anticuerpo frente a VLA-4. En algunas 20 realizaciones, la deteccion de la presencia de una respuesta inmune clfnicamente significativa a un anticuerpo de union a VLA-4 comprende determinar si una muestra biologica obtenida de un sujeto al que se ha administrado un anticuerpo de union a VLA-4 contiene un nivel de umbral de un anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4, donde la presencia de al menos el nivel de umbral del anticuerpo soluble es indicativa de una respuesta inmune clfnicamente significativa al anticuerpo de union a VLA-4. En ciertas realizaciones, al menos el nivel de 25 umbral de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 esta presente en dos muestras biologicas tomadas del sujeto en dos puntos temporales consecutivos. En algunas realizaciones, un nivel de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 se determina: determinando un nivel de actividad de union soluble al anticuerpo de union a VLA-4 en una primera alfcuota de la muestra biologica, y determinando si la actividad de union soluble es especffica para el anticuerpo de union a VLA-4. En algunas realizaciones, la especificidad de la actividad 30 de union soluble se determina en una segunda alfcuota de la misma muestra biologica. En ciertas realizaciones, un nivel de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 en la muestra biologica se determina comparando los niveles de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-4 marcado, medidos en presencia de dos o mas cantidades diferentes de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado (por ejemplo, niveles medidos en presencia de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado pueden compararse con los niveles medidos en presencia de 35 una cantidad competitiva de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado). En algunas realizaciones, un nivel de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 en la muestra biologica se determina comparando los niveles de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-4 inmovilizado medidos en presencia de dos o mas cantidades diferentes de anticuerpo de union a VLA-4 soluble (por ejemplo, los niveles medidos en presencia de anticuerpo de union a VLA-4 no soluble pueden compararse con los niveles medidos en presencia de una cantidad 40 competitiva de anticuerpo de union a VLA-4 soluble). En algunas realizaciones, un primer nivel de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-4 marcado, medido en presencia de una primera cantidad de VLA-4 no marcado, se compara con un segundo nivel de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-4 marcado, medido en presencia de una segunda cantidad de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado. En ciertas realizaciones, el primer y segundo niveles de actividad de union se determinan en una primera y segunda alfcuotas de la misma muestra 45 biologica. En algunas realizaciones, la cantidad de anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA-4 se determina utilizando un ensayo ELISA de puente. En algunas realizaciones, un primer nivel de actividad de union al anticuerpo de union a VLA-4 se determina en un primer inmunoensayo para una primera alfcuota de la muestra biologica, y un segundo nivel de actividad de union al anticuerpo de union a VLA-4 se determina en un segundo inmunoensayo para una segunda alfcuota de la muestra biologica, donde el segundo inmunoensayo se enriquece con una mayor 50 cantidad de anticuerpo de union a VLA-4 soluble no marcado que el primer inmunoensayo, y donde la presencia en la muestra biologica de al menos un nivel de umbral de anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA-4 se indica si el primer nivel de actividad de union es mayor que un nivel de referencia y el segundo nivel de la actividad de union es inferior a un porcentaje predeterminado del primer nivel de la actividad de union. En algunas realizaciones, el nivel de referencia es un nivel de actividad de union, medida para una cantidad de referencia de anticuerpo 55 soluble, al anticuerpo de union a VLA-4. En determinadas realizaciones, la cantidad de referencia es de aproximadamente 500 ng. En algunas realizaciones, el anticuerpo de union a VLA-4 es un anticuerpo monoclonal murino humanizado contra VLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo de union a VLA-4 es una forma humanizada del anticuerpo murino mAb 21.6. En algunas realizaciones, el anticuerpo de union a VLA-4 es natalizumab. En determinadas realizaciones, el primer y el segundo inmunoensayos estan puenteando los ensayos 60 ELISA. En algunas realizaciones, el primer y el segundo ensayos comprenden un anticuerpo de union a VLA-4

inmovilizado no marcado y un anticuerpo de union a VLA-4 soluble marcado, donde el anticuerpo de union a VLA-4 soluble marcado esta marcado con una enzima, un marcador fluorescente, un marcador de biotina (por ejemplo, el anticuerpo de union a VLA-4 puede estar biotinilado), o un marcador radiactivo. En algunas realizaciones, el primer y segundo inmunoensayos se llevan a cabo en volumenes de reaccion en paralelo en un unico sustrato de reaccion 5 (por ejemplo, en pocillos separados de una placa de multiples pocillos). En ciertas realizaciones, la muestra biologica es una muestra de suero. En algunas realizaciones, el sujeto es un paciente humano. En algunas realizaciones, el paciente tiene esclerosis multiple. En algunas realizaciones, el paciente tiene artritis reumatoide. En determinadas realizaciones, el paciente tiene la enfermedad de Crohn.

10 Se proporcionan metodos de identificar un nivel de umbral clfnicamente significativo de la respuesta de anticuerpos a un agente terapeutico de protefnas para un paciente que tiene un trastorno. Los metodos incluyen (a) evaluar el nivel de anticuerpos anti-agente en una poblacion control de pacientes que tienen la enfermedad y que no han sido tratados con el agente y (b) seleccionar un nivel de al menos 2 desviaciones estandares por encima del nivel de anticuerpos anti-agente en la poblacion control como un nivel de umbral clfnicamente significativo de la respuesta de 15 anticuerpos en pacientes que tienen la enfermedad y son tratados con el agente. En algunas realizaciones, el agente terapeutico de protefna es un anticuerpo terapeutico o fragmento de union a antfgeno del mismo.

De acuerdo con todavfa otro aspecto de la divulgacion, se proporcionan metodos para identificar un paciente que tiene una respuesta de anticuerpos clfnicamente significativa a una protefna terapeutica. Los metodos incluyen 20 someter a ensayo, en una muestra biologica obtenida de un paciente que tiene un trastorno y al que se ha administrado la protefna terapeutica, para determinar la presencia de un nivel de umbral de anticuerpos que se unen especfficamente a la protefna terapeutica, donde el nivel de umbral es al menos 2 desviaciones estandares por encima del nivel de anticuerpos que se unen especfficamente a la protefna terapeutica en una poblacion control no tratada de los pacientes que tienen la trastorno. En algunas realizaciones, la protefna terapeutica es un anticuerpo 25 terapeutico o fragmento de union a antfgeno del mismo. Por consiguiente, la invencion proporciona metodos para detectar respuestas inmunes clfnicamente significativas a un anticuerpo de union a VLA-4 en un sujeto, determinando si una muestra biologica de un sujeto al que se ha administrado un anticuerpo de union a vLA-4 contiene un nivel de umbral de un anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4, donde la presencia de al menos el nivel de umbral del anticuerpo soluble es indicativo de una respuesta inmune clfnicamente 30 significativa al anticuerpo de union a VLA-4.

Cada una de las limitaciones de la divulgacion puede incluir diversas realizaciones de la divulgacion. Por lo tanto, se anticipa que cada una de las limitaciones de la divulgacion que implica cualquier elemento o combinaciones de elementos puede incluirse en cada uno de los aspectos de la divulgacion.

35

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 ilustra la interferencia de natalizumab libre en un inmunoensayo.

La Figura 2 ilustra la interferencia de natalizumab libre en un ensayo de bloqueo.

40 La Figura 3 muestra una probabilidad de una respuesta inmune clfnicamente significativa en funcion del tiempo despues de una administracion inicial de natalizumab.

La Figura 4 ilustra un efecto general de respuestas inmunes positivas sobre las tasas de recafda. P = Placebo, n = 315. AN = Anticuerpo Negativo, n = 569. TP = Transitoria Positiva, n = 19. PP = Persistente Positiva, n = 37.

La Figura 5 ilustra un efecto de respuestas inmunes positivas sobre las tasas de recafda a lo largo de intervalos de 45 tiempo particulares despues de una administracion inicial de natalizumab (A: 0-3 meses, B: 3-6 meses, C: 6-9 meses y D: 9-12 meses). P = Placebo, n = 315. AN = Anticuerpo Negativo, n = 569. TP = Transitoria Positiva, n = 19. PP = Persistente Positiva, n = 37.

Descripcion detallada de la invencion

50

La presente divulgacion se refiere, en parte, a metodos, composiciones y kits para detectar y monitorizar una respuesta inmune a una protefna terapeutica (por ejemplo, un anticuerpo terapeutico) que se administra a un sujeto. En un aspecto, la invencion proporciona metodos para la identificacion de pacientes con una respuesta inmune clfnicamente significativa a un anticuerpo terapeutico. De acuerdo con la invencion, la presencia de una respuesta 55 inmune detectable no es clfnicamente significativa, a menos que la respuesta inmune alcance un nivel de umbral clfnicamente significativo. Por ejemplo, en estudios clfnicos de natalizumab, un nivel de umbral clfnicamente significativo de la respuesta inmune era sorprendentemente mayor de 1,645 desviaciones estandares (por ejemplo, en mas de aproximadamente 2 desviaciones estandares) por encima de un nivel de control de la respuesta inmune observada para los sujetos que no han recibido el agente terapeutico.

Determinados aspectos de la divulgacion se refieren a metodos para detectar una respuesta inmune cifnicamente significativa contra un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico que se administra a un sujeto. Los aspectos de la divulgacion son particularmente utiles para detectar y monitorizar una respuesta inmune en un sujeto que ha recibido al menos una dosis (por ejemplo, una dosis terapeutica) de un anticuerpo de union a VLA-4. Los aspectos de la 5 divulgacion incluyen identificar y/o monitorizar un sujeto con una respuesta inmune clfnicamente significativa a un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico, evaluar la respuesta inmune, y/o determinar un tratamiento clfnico apropiado (por ejemplo, un regimen terapeutico particular), basado en la naturaleza y/o la extension de la respuesta inmune. La informacion acerca de la respuesta de un sujeto a la administracion de un anticuerpo de union a VLA-4 se puede utilizar para ajustar, disenar y/u optimizar un regimen terapeutico para el sujeto. Por consiguiente, la 10 invencion se refiere a identificar un sujeto que tiene una respuesta inmune clfnicamente significativa a un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. Otro aspecto de la divulgacion se refiere a monitorizar la respuesta inmune de un sujeto a un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. Un aspecto adicional de la divulgacion se refiere a determinar las estrategias terapeuticas apropiadas para el tratamiento de determinadas enfermedades (por ejemplo, esclerosis multiple, enfermedad de Crohn o artritis reumatoide, etc.) basadas en la respuesta inmune de un sujeto a un 15 anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico.

Los anticuerpos de union a VLA-4 se pueden utilizar para tratar un cierto numero de enfermedades y trastornos asociados con la inflamacion. Dichos trastornos incluyen, por ejemplo, la inflamacion del sistema nervioso central (por ejemplo, ademas de esclerosis multiple, meningitis, neuromielitis optica, neurosarcoidosis, vasculitis del SNC, 20 encefalitis y mielitis transversa), rechazo de injerto de tejido u organo o enfermedad de injerto contra huesped, lesion aguda del SNC, por ejemplo, ictus o lesion de la medula espinal; enfermedad renal cronica; alergia, por ejemplo, asma alergica; diabetes tipo 1; trastornos inflamatorios del intestino, por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa; miastenia grave; fibromialgia; trastornos artrfticos, por ejemplo, artritis reumatoide, artritis psoriasica; trastornos inflamatorios/inmunes de la piel, por ejemplo, psoriasis, vitiligo, dermatitis, liquen plano; lupus eritematoso 25 sistemico; sfndrome de Sjogren; canceres hematologicos, por ejemplo, mieloma multiple, leucemia, linfoma; canceres solidos, por ejemplo, sarcomas o carcinomas, por ejemplo, de pulmon, mama, prostata, cerebro; y trastornos fibroticos, por ejemplo, fibrosis pulmonar, mielofibrosis, cirrosis hepatica, glomerulonefritis proliferativa mesangial, glomerulonefritis crescentica, nefropatia diabetica y fibrosis intersticial renal. En algunas realizaciones, el trastorno es una enfermedad efectuada por modulacion de una subunidad a4p1y/o a4p7.

30

En una realizacion, un anticuerpo de union a VLA-4 es una version humanizada del mAb murino 21.6, por ejemplo, natalizumab. Por consiguiente, los aspectos de la divulgacion se refieren a evaluar la respuesta de un sujeto a natalizumab y determinar los tratamientos apropiados para la esclerosis multiple y otras afecciones o enfermedades inflamatorias que pueden ser tratadas con natalizumab.

35

La invencion se refiere, en parte, a identificar una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, una version humanizada del mAb murino 21.6 tal como natalizumab o AN100226) en un sujeto, y determinar si la respuesta es clfnicamente significativa.

40 Como se usa en el presente documento, "identificar" un sujeto con una respuesta inmune significa detectar o diagnosticar la presencia de una respuesta inmune en un sujeto. Por consiguiente, identificar un sujeto con una respuesta inmune clfnicamente significativa significa detectar o diagnosticar la presencia de una respuesta inmune clfnicamente significativa en un sujeto.

45 Como se usa en el presente documento, un "umbral clfnicamente significativo" para una respuesta de anticuerpos a una protefna terapeutica esta al menos 2 desviaciones estandares por encima de un nivel de referencia de control. En una realizacion, el nivel de umbral para una respuesta inmune clfnicamente significativa a una protefna terapeutica puede estar entre 3 y 6 (por ejemplo, aproximadamente 4 o 5) desviaciones estandares por encima de un nivel de control. El nivel de control puede ser un nivel medio o mediano de actividad de union que esta presente 50 en una poblacion de pacientes (por ejemplo, una poblacion de sujetos con una enfermedad o afeccion tal como esclerosis multiple, enfermedad de Crohn o artritis reumatoide) antes de la exposicion a la protefna terapeutica. En una realizacion, un umbral clfnicamente significativo para los anticuerpos anti-natalizumab es 500 ng/ml de suero del paciente (por ejemplo, un umbral de 50 ng/ml en un ensayo de suero 10 veces diluido).

55 Como se usa en el presente documento, una respuesta inmune es una respuesta inmunogenica a una protefna terapeutica caracterizada por niveles aumentados en el objeto de uno o mas anticuerpos que se unen a la protefna. Por lo tanto, una respuesta inmune se puede caracterizar por la induccion de niveles incrementados de anticuerpos solubles que reconocen (por ejemplo, reconocen especfficamente) y se unen a la protefna, por ejemplo, un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, natalizumab). Una respuesta inmune tfpica es policlonal y puede incluir 60 anticuerpos con diferentes afinidades (y, por lo tanto, diferentes grados de especificidad) para la protefna

terapeutica. Por consiguiente, los metodos de la divulgacion pueden implicar la deteccion de la presencia en un sujeto de uno o mas anticuerpos inducidos que se unen a una protefna terapeutica (por ejemplo, un anticuerpo de union a VLA-4) que fue administrada al sujeto. En algunas realizaciones, los anticuerpos inducidos pueden ser detectados como anticuerpos solubles que estan presentes en una muestra biologica (por ejemplo, una muestra de 5 suero).

Los aspectos de la divulgacion se refieren a ensayos para detectar un nivel de umbral clfnicamente significativo de la actividad de union en una muestra biologica obtenida de un paciente. El nivel de umbral representa un nivel por debajo del cual cualquier actividad de union detectable se considera que no es clfnicamente significativa. Como se 10 usa en el presente documento, la actividad de union se refiere a la cantidad detectada de union a una protefna terapeutica en una muestra biologica. Como se describe en el presente documento, la presencia de actividad de union en una muestra biologica puede reflejar una respuesta policlonal para la administracion de una protefna terapeutica. Por consiguiente, la cantidad de union puede reflejar un agregado de union por diferentes anticuerpos con diferentes afinidades para la protefna. En determinadas realizaciones, la actividad de union se analiza 15 adicionalmente para determinar con mayor confianza si el nivel de union es debido a la presencia de anticuerpos especfficos contra la protefna terapeutica o es debido a otros factores tales como factores reumatoides. La especificidad de una actividad de union puede ser evaluada en ensayos de competicion como se describe en el presente documento.

20 En un aspecto de la divulgacion, un sujeto se identifica como un positivo (es decir, que tiene una respuesta inmune clfnicamente significativa a una protefna terapeutica) solo si una o mas de las muestras obtenidas del sujeto son test-positivas en un ensayo de la divulgacion. Un resultado positivo del ensayo se determina cuando una muestra obtenida de un sujeto contiene al menos un nivel de umbral clfnicamente significativo de actividad de union para la protefna terapeutica, por ejemplo, anticuerpo de union a VLA-4. Sorprendentemente, la presencia de cualquier 25 respuesta inmune detectable a un anticuerpo terapeutico no es clfnicamente significativa. De acuerdo con la divulgacion, los metodos basados en el cribado de pacientes para detectar cualquier nivel de respuesta inmune a un anticuerpo terapeutico identifican muchos pacientes falsos positivos, resultando en una monitorizacion clfnica adicional innecesaria y la ansiedad potencial para pacientes que no tienen una respuesta inmune clfnicamente significativa. Por ejemplo, se detecta un numero excesivo de falsos positivos cuando los pacientes se identifican 30 como positivos en base a una respuesta inmune a un anticuerpo terapeutico que es mayor de 1,645 desviaciones estandares por encima de un nivel medio de actividad de union presente en sujetos que no han recibido el anticuerpo terapeutico. De acuerdo con la divulgacion, la tasa de falsos positivos teorica del 5 % utilizando un corte de 1,645 desviacion estandar es una subestimacion del numero de falsos positivos, ya que el 5 % representa la tasa de falsa deteccion de cualquier respuesta inmune y no la tasa de falsos positivos para una respuesta inmune 35 clfnicamente significativa. Sorprendentemente, elevando el nivel de corte (el nivel por debajo del cual una respuesta se considera que es negativa) a mas de 1,645 desviaciones estandares por encima de un nivel de referencia control, se reduce el numero de falsos positivos sin afectar a la identificacion de sujetos con respuestas inmunes clfnicamente significativas. Se debe apreciar que el umbral debe fijarse en un nivel que resulte en tasas de deteccion aceptables de pacientes con una respuesta inmune clfnicamente significativa. Por lo tanto, a pesar de que el umbral 40 clfnicamente significativo debe fijarse en mas de 1,645 desviaciones estandares por encima de un nivel de referencia pre-inmune, el umbral no debe ser tan alto como para reducir la eficiencia de deteccion de positivos reales.

En un aspecto de la divulgacion, una respuesta inmune de un sujeto puede clasificarse como negativa si las muestras obtenidas del sujeto no dan positivo en un ensayo de la invencion, por ejemplo, no alcanzan el nivel de 45 umbral clfnicamente significativo de la respuesta de anticuerpos. En contraposicion, si un sujeto se identifica como positivo en base a un nivel positivo (un nivel en o por encima de un nivel de umbral clfnicamente significativo) de la actividad de union en un solo ensayo, el paciente puede ser "transitorio" o bien "persistente" positivo. Un transitorio positivo es un paciente que tiene una respuesta inmune positiva al anticuerpo terapeutico durante un perfodo determinado de tiempo, despues del cual el paciente se vuelve negativo. En contraposicion, un persistente positivo 50 es un paciente que es positivo para los niveles clfnicamente significativos de la respuesta inmune durante mas de un perfodo de tiempo especificado. Se debe apreciar que transitorio y persistente son terminos relativos. Por consiguiente, un paciente puede ser clasificado inicialmente como persistente si el paciente da positivo para una respuesta inmune en dos o mas puntos temporales (por ejemplo, a los 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas puntos temporales) separados por intervalos de tiempo clfnicamente significativos. Sin embargo, posteriormente el paciente 55 puede ser reclasificado como transitorio si el paciente da negativo para una respuesta inmune en un ensayo posterior. Los intervalos de tiempo clfnicamente significativos pueden ser de al menos una semana, un mes, un ano o mas. Por ejemplo, el intervalo de tiempo umbral puede estar entre 30 y 180 dfas, aproximadamente 60 dfas, aproximadamente 42 dfas, etc. La presencia de una respuesta inmune transitoria puede ser indicativa de una reduccion transitoria en la eficacia terapeutica. La presencia de una respuesta inmunitaria persistente puede ser 60 indicativa de una eficacia terapeutica persistentemente reducida. Por consiguiente, la presencia de una respuesta

inmune transitoria o persistente puede ser clfnicamente relevante y puede afectar a la naturaleza de un regimen terapeutico en un sujeto que se identifica como transitoriamente positivo o persistentemente positivo. Una respuesta inmune persistente puede requerir una modificacion del regimen terapeutico del sujeto.

5 Como se usa en el presente documento, la expresion "regimen terapeutico" significa un curso de tratamiento para un sujeto. Un regimen terapeutico puede incluir la administracion de un agente o agentes farmaceuticos y/o la aplicacion de una terapia. La seleccion de un regimen puede incluir la seleccion de la cantidad de dosis, el tiempo de la dosis, la frecuencia de la dosis, la duracion del tratamiento, terapias de combinacion con uno o mas agentes farmaceuticos o terapias, y cualesquiera otros aspectos de la toma de decisiones de tratamiento que son utilizados 10 por los expertos en la tecnicas medica y terapeutica. Un regimen terapeutico tambien puede incluir el uso de terapias tales como los procesos o dispositivos que se administran a o se utilizan en un sujeto para la prevencion o el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Los ejemplos de procesos terapeuticos, aunque no pretende ser limitante, incluyen el uso de dispositivos medicos o cirugfa. Por consiguiente, determinar o alterar un regimen terapeutico de un anticuerpo de union a VLA-4 puede implicar determinar o alterar la cantidad de la dosis del 15 anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico que se administra a un sujeto, la frecuencia de administracion, la via de administracion, la duracion del tratamiento (por ejemplo, el numero de dosis que se administran), ya sea para combinar un tratamiento con anticuerpos vLA-4 de union con uno o mas tratamientos adicionales, si se debe interrumpir un tratamiento con anticuerpos de union a VLA-4, si desea utilizar un anticuerpo de union a VLA-4 diferente, y/o si se debe utilizar una combinacion de anticuerpos de union a VLA-4, etc. En una realizacion, la 20 invencion puede implicar determinar si desea utilizar una alternativa terapeutica a un anticuerpo de union a VLA-4, por ejemplo, si se debe utilizar interferon beta.

Los aspectos de la divulgacion se refieren a detectar y/o monitorizar una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 en un ser humano (por ejemplo, un paciente humano). Por consiguiente, como se usa en el presente 25 documento, un sujeto puede ser un sujeto humano. Un sujeto puede ser un paciente humano que tiene una enfermedad o afeccion inflamatoria. Un sujeto puede ser un paciente que ha recibido al menos una dosis de un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, natalizumab). Un sujeto puede ser un paciente que esta siendo (o ha sido) tratado cronicamente con un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, natalizumab). Un sujeto puede ser un paciente que esta siendo (o ha sido) tratado repetidamente con un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, 30 natalizumab). Como se usa en el presente documento, un tratamiento cronico puede implicar la administracion de un anticuerpo de union a VLA-4 a lo largo de un perfodo prolongado de tiempo (por ejemplo, para controlar o gestionar los sfntomas de una enfermedad o afeccion inflamatoria durante el perfodo de tiempo). En contraposicion, un tratamiento repetido puede implicar la repeticion de un curso de tratamiento (por ejemplo, un perfodo de administracion) con un anticuerpo de union a VLA-4 cuando sea necesario (por ejemplo, para tratar sfntomas de una 35 enfermedad inflamatoria cuando empeoran o se "reagudizan"). En una realizacion, se considera que un paciente esta siendo sometido a un tratamiento repetido cuando el sujeto se vuelve a tratar con un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico por primera vez. Se entendera por los expertos en la tecnica que un sujeto tambien puede someterse o ha sido sometido a tratamientos con terapias o procesos en combinacion con o separados del tratamiento con un anticuerpo de union a VLA-4. Se debe apreciar que los aspectos de la divulgacion no se limitan a 40 sujetos humanos. Por consiguiente, un sujeto puede ser un primate no humano, vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato, roedor, u otro sujeto no humano.

Identificacion y monitorizacion de una respuesta inmune

45 En un aspecto, la divulgacion implica identificar y/o monitorizar una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 en un sujeto. En determinadas realizaciones, la identificacion y/o monitorizacion se realiza sometiendo a ensayo una muestra biologica obtenida del sujeto, preferiblemente sangre, en cuanto a la presencia de anticuerpos inducidos que se unen al anticuerpo de union a VLA-4 administrado segun se describe en el presente documento.

50 En un aspecto de la divulgacion, se realiza un ensayo cualitativo en una muestra biologica obtenida de un sujeto, y se identifica la presencia de una respuesta inmune si la muestra biologica contiene anticuerpos contra el anticuerpo de union a VLA-4 en una cantidad mayor que una cantidad umbral. En una realizacion, una cantidad umbral es una cantidad por encima de la cual una respuesta inmune se identifica como clfnicamente relevante, por ejemplo, el nivel umbral se determina segun se describe en el presente documento. Una respuesta inmune clfnicamente relevante 55 puede tener implicaciones clfnicas, por ejemplo, indica que el sujeto debe ser evaluado para determinar si la dosificacion del anticuerpos de union a VLA-4 administrado debe ser modificado, para determinar si otros parametros fisiologicos del paciente deben ser monitorizados, para determinar si se debe realizar un ensayo adicional para una respuesta inmune, o para determinar si se deben tomar las medidas alternativas o adicionales para tratar o controlar el sujeto, etc. Una respuesta inmune clfnicamente relevante puede ser evaluada junto con uno 60 o mas de otros factores. Se debe apreciar que la identificacion de una respuesta inmune clfnicamente relevante no

requiere, por si misma, que se realice un cambio en la terapia o regimen de tratamiento del sujeto.

En otro aspecto de la divulgacion, puede realizarse un ensayo cuantitativo en una muestra biologica para cuantificar la cantidad de anticuerpos (por ejemplo, el tftulo de anticuerpos) contra un anticuerpo de union a VLA-4 que fue 5 administrado a un sujeto. Tambien se pueden analizar resultados cuantitativos para determinar si una respuesta inmune esta por encima de un nivel de umbral clfnicamente significativo.

De acuerdo con la divulgacion, una respuesta inmune contra un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, natalizumab) se puede evaluar en un sujeto a lo largo del tiempo mediante la realizacion de ensayos en muestras 10 obtenidas del sujeto en diferentes puntos temporales. La estrategia de evaluacion multiple permite la monitorizacion de una respuesta inmune de un sujeto al anticuerpo de union a VLA-4 y puede permitir que el regimen de union del anticuerpo a VLA-4 terapeutico que se adapte individualmente a las necesidades terapeuticas del sujeto. Por ejemplo, una muestra puede obtenerse a partir de un sujeto, someterse a ensayo en cuanto a una respuesta inmune al anticuerpo de union a VLA-4 que se ha administrado al sujeto, y en un segundo tiempo posterior, se puede 15 obtener otra muestra del sujeto y se puede someter a ensayo de manera similar. La deteccion y confirmacion de la presencia de una respuesta del anticuerpo en muestras de un sujeto a lo largo del tiempo mediante determinaciones secuenciales a intervalos de tiempo predeterminados permite la monitorizacion de una respuesta inmune a un tratamiento con anticuerpos de union a VLA-4 terapeuticos. La deteccion y monitorizacion de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 administrado tambien permite el ajuste en el tratamiento global del sujeto, por 20 ejemplo ajustando (por ejemplo, modificando o suspendiendo) el tratamiento con el anticuerpo de union a VLA-4 y/o ajustando terapias adicionales (por ejemplo, terapias que modulan la respuesta inmune del sujeto).

La seleccion o el ajuste de un regimen terapeutico puede basarse en una determinacion de una respuesta inmune clfnicamente significativa a un anticuerpo de union a VLA-4 en al menos dos muestras biologicas obtenidas a 25 diferentes tiempos de un sujeto al que se ha administrado un anticuerpo de union a VLA 4. La determinacion de una respuesta inmune clfnicamente significativa de un sujeto al anticuerpo de union a VLA-4 puede indicar que serfa beneficioso iniciar, continuar, ajustar o detener la administracion de un agente farmaceutico especffico y/o la terapia para el sujeto. Por ejemplo, la determinacion de una respuesta inmune clfnicamente significativa a un anticuerpo de union a VLA-4 en al menos dos muestras biologicas obtenidas de un sujeto puede ser la base para alterar la dosis 30 de un agente farmaceutico que se administra al sujeto como parte de un regimen terapeutico actual. El tratamiento se puede cambiar para incluir agentes o terapias farmaceuticos adicionales o para disminuir o aumentar la dosis de un agente o terapia administrado actualmente. Por ejemplo, la identificacion de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 en un sujeto puede sugerir iniciar o continuar un tratamiento con un agente farmaceutico inmunosupresor, etc. En algunas realizaciones, se puede seleccionar un regimen terapeutico inicial en 35 base a la determinacion de una respuesta inmune inicial a un anticuerpo de union a VLA-4 en una sola muestra biologica obtenida de un sujeto que ha sido tratado con un anticuerpo de union a VLA-4. Despues de la seleccion y la administracion de un regimen terapeutico seleccionado, se puede hacer una determinacion posterior de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 en una o mas muestras biologicas posteriores obtenidas del sujeto y puede proporcionar una base para ajustar el regimen terapeutico.

40

La determinacion de una respuesta inmune clfnicamente significativa a un anticuerpo de union a VLA-4 en dos o mas muestras biologicas obtenidas de un sujeto en diferentes puntos temporales puede compararse para evaluar o medir la aparicion, el progreso o la regresion de una respuesta inmune en el sujeto a la terapia de anticuerpo de union a VLA 4. La aparicion de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 en un sujeto puede 45 caracterizarse por un nivel o niveles incrementados de al menos un anticuerpo que se une a un anticuerpo de union a VLA-4, y puede ir acompanada de la aparicion de uno o mas cambios fisiologicos o sfntomas en el sujeto. El progreso de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico puede caracterizarse por un incremento adicional en el nivel del al menos un anticuerpo que se une al anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. Sin embargo, el progreso de una respuesta inmune puede implicar un aumento en el o los niveles de al menos un 50 anticuerpo adicional, y/o una disminucion en el nivel de al menos uno de los anticuerpos que aumentaron con el inicio de la respuesta inmune. Por ejemplo, una respuesta inmune inicial puede ser predominantemente una respuesta de IgM. A medida que progresa la respuesta inmune, los anticuerpos predominantes pueden cambiar de anticuerpos IgM a IgG. El progreso de una respuesta inmune tambien puede ir acompanado de un progreso (por ejemplo, un incremento, disminucion o modificacion) de uno o mas de los cambios o sfntomas fisiologicos iniciales o 55 de la aparicion de uno o mas cambios fisiologicos o sfntomas adicionales. La regresion de una respuesta inmune en un sujeto a un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico puede caracterizarse por una disminucion en el o los niveles de uno o mas anticuerpos que se unen a un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. La regresion de una respuesta inmune tambien puede ir acompanada de una disminucion de determinados cambios o sfntomas fisiologicos. Sin embargo, se debe apreciar que la aparicion, el progreso y/o la regresion de una respuesta inmune a un anticuerpo 60 de union a VLA-4 terapeutico pueden ser clfnicamente asintomaticos, distintos de los cambios detectables en los

niveles de anticuerpos.

El progreso y la regresion de una respuesta inmune clfnicamente significativa a un anticuerpo de union a VLA-4 pueden generalmente ser indicados por el aumento o la disminucion, respectivamente, del nivel de un anticuerpo 5 que se une a un anticuerpo de union a VLA-4 en muestras de un sujeto a lo largo del tiempo. Por ejemplo, si se determina que ningun anticuerpo o un nivel subclfnicamente significativo de un anticuerpo, que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 esta presente en una primera muestra de un sujeto y se determina que un umbral clfnicamente significativo de anticuerpos que se unen especfficamente a un anticuerpo de union a VLA 4 esta presente en una segunda o posterior muestra del sujeto, esto puede indicar la aparicion de una 10 respuesta inmune al anticuerpo de union a VLA-4 en el sujeto. El progreso de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 en un sujeto puede ser indicado por la presencia de un mayor nivel de un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 en una segunda o posterior muestra de un sujeto en comparacion con el nivel presente en la muestra inicial o previa del sujeto. La regresion de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 puede ser indicada por la presencia de un nivel inferior de un anticuerpo que se une 15 especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 en una segunda o posterior muestra de un sujeto en comparacion con el nivel presente en la muestra inicial o previa del sujeto.

En un aspecto de la divulgacion, una respuesta inmune puede ser categorizada como positiva o negativa en funcion de si un nivel de anticuerpos contra un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico esta por encima de un umbral 20 clfnicamente significativo predeterminado. En algunas realizaciones, un umbral clfnicamente significativo es mas de 1,645 (por ejemplo, mas de 2, 3, 4, 5 o 6) desviaciones estandares por encima de un nivel medio de actividad de union medida en sujetos pre-inmunes (es decir, sujetos que no han recibido dosis alguna de anticuerpo VLA-4 terapeutico). En algunas realizaciones, los sujetos son sujetos sanos, y en determinadas realizaciones los sujetos son pacientes enfermos (por ejemplo, pacientes con esclerosis multiple, enfermedad de Crohn o artritis reumatoide). 25 En una realizacion, el nivel de umbral es >0,5 microgramos/ml de suero. En algunas realizaciones, el nivel de umbral es igual a aproximadamente 0,5 microgramos/ml de suero.

En una realizacion, los sujetos a los que se han administrado un anticuerpo de union a VLA-4 pueden ser categorizados como que caen en una al menos una de tres categorfas. Una categorfa, denominada en el presente 30 documento como "negativa", incluye sujetos en los que las actividades de union estan en o por debajo de niveles de umbral clfnicamente significativos (por ejemplo, un sujeto en el que los anticuerpos contra un anticuerpo de union a VLA-4 no se detectan a una concentracion de al menos aproximadamente 500 ng/ml en una muestra biologica (por ejemplo, suero) obtenida del sujeto). Una segunda categorfa, denominada en el presente documento como "transitoria positiva" incluye sujetos en los que se detectan actividades de union por encima de un nivel de umbral 35 solo un numero limitado de veces, por ejemplo, en uno, dos, tres, cuatro, cinco puntos temporales (por ejemplo, anticuerpos contra un anticuerpo de union a VLA-4 no se detectan en un punto temporal posterior separado por al menos 30 dfas a partir del ultimo punto temporal). Una tercera categorfa, denominada en el presente documento como "positiva persistente" incluye sujetos en los que se detectan actividades de union por encima de un nivel de umbral un numero predeterminado de veces, por ejemplo, en dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o mas puntos 40 temporales separados por un intervalo de tiempo umbral mfnimo (por ejemplo, un sujeto en el que se detectan anticuerpos contra un anticuerpo de union a VLA-4 se detectan a una concentracion de al menos aproximadamente 500 ng/ml en dos tres, cuatro, cinco, seis, siete o mas muestras biologicas obtenidas del sujeto en puntos temporales separados por al menos un intervalo de umbral). En algunas realizaciones, el intervalo de umbral es al menos aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o mas dfas. Pacientes que son "persistentes positivos" 45 pueden tener una perdida de eficacia de la terapia de VLA-4 de anticuerpos, mientras que los pacientes "transitorios positivos" tienen plena eficacia restaurada despues de solo una disminucion temporal de la eficacia.

Se debe apreciar que un sujeto negativo puede convertirse en un transitorio positivo. Y, o bien puede convertirse en un persistente positivo si se desarrolla una respuesta inmune positiva y persiste durante un numero especificado de 50 puntos temporales, por ejemplo, al menos dos puntos temporales.

En una realizacion, se puede cambiar una terapia en base a una determinacion de un solo resultado positivo. En otra realizacion, se puede cambiar una terapia en base a una determinacion de que un sujeto es un sujeto transitorio positivo. En aun otra realizacion, se puede cambiar una terapia en base a una determinacion de que un sujeto es un 55 sujeto persistente positivo.

Como se analizo anteriormente, se debe apreciar que los terminos transitorio y persistente son terminos relativos, y que un paciente que parece ser persistentemente positivo puede llegar a ser negativo en un momento posterior. Por consiguiente, los pacientes con respuestas positivas deben ser monitorizados regularmente para evaluar la 60 persistencia de la respuesta positiva, la eficacia de la terapia y/o la presencia de otras manifestaciones clfnicas de

una respuesta inmune positiva.

De acuerdo con la divulgacion, el riesgo de una reduccion en la eficacia terapeutica (por ejemplo, el riesgo de una recafda) aumenta con el periodo de tiempo que persiste una respuesta inmune positiva. Por consiguiente, en un 5 aspecto de la divulgacion, el numero de veces que un paciente da positivo es menos importante que el periodo de tiempo durante el cual el paciente sigue siendo positivo. En una realizacion, un paciente puede ser identificado como en riesgo de una reduccion en la eficacia terapeutica (por ejemplo, en riesgo de una recafda) si se detecta un resultado positivo dentro de los 3 meses de la primera administracion de un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. En una realizacion, este riesgo aumenta si la respuesta inmune positiva persiste durante 3-6 meses, y aumenta 10 adicionalmente si la respuesta inmune positiva persiste durante 6-9 meses, y aumenta aun mas con persistencia durante 9-12 meses despues de la primera administracion del anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. Se debe apreciar que la persistencia durante mas de un ano incluso aumenta aun mas la probabilidad de una recafda. Por consiguiente, diferentes regfmenes terapeuticos pueden ser apropiados para un paciente con una respuesta inmune persistentemente positiva. Sin embargo, se debe apreciar que, incluso en presencia de una respuesta inmune 15 persistentemente positiva, una terapia de anticuerpo terapeutico no necesita interrumpirse, a menos que se vuelva ineficaz (por ejemplo, una perdida de sustancialmente todos eficacia) o causa otras manifestaciones clfnicas negativas.

En algunas realizaciones, el tratamiento con un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico puede ser interrumpido, si 20 el tratamiento es ineficaz o esta perdiendo su eficacia en un paciente que tiene un nivel por debajo del umbral de la respuesta inmune. Una falta de eficacia (o una reduccion de la eficacia) en ausencia de una respuesta inmune clfnicamente significativa puede indicar que la ineficacia del tratamiento se debe a uno o mas factores distintos de una respuesta inmune del paciente al agente terapeutico. Un paciente no sera un transitorio positivo si no se detecta una respuesta positiva. Por consiguiente, se puede considerar un tratamiento alternativo.

25

Se debe apreciar que las actividades de union o los niveles de anticuerpos se pueden comparar con las actividades o niveles pre-inmunes (es decir, medidas antes de la administracion de la primera dosis de anticuerpo de union a VLA-4). Sin embargo, no es necesaria una comparacion con una cantidad pre-inmune tal como se comenta en el presente documento, debido a que se puede identificar una respuesta inmune positiva cuando estan presentes en 30 una muestra del paciente una cantidad umbral (o por encima del umbral) clfnicamente significativa de actividad de union o de niveles de anticuerpos.

Ensayos y metodos de deteccion

35 De acuerdo con aspectos de la divulgacion, se somete a ensayo una cantidad umbral de una respuesta de anticuerpos. Como se analiza en el presente documento, se puede realizar un ensayo cualitativo. Como alternativa, puede llevarse a cabo un ensayo cuantitativo, y en una realizacion los datos cuantitativos puede traducirse en una salida cualitativa (por ejemplo, si la cantidad de anticuerpo es mayor que una cantidad umbral).

40 Se puede utilizar cualquier metodo adecuado para detectar una cantidad de anticuerpo o actividad de union para determinar si es al menos una cantidad o actividad umbral. Los ensayos de deteccion pueden incluir cualquiera de los metodos de inmunodeteccion conocidos para detectar, confirmar, unir, purificar, separar, cuantificar y/o detectar de otra manera en general anticuerpos que se unen especfficamente a una protefna terapeutica especificada, por ejemplo, a un anticuerpo de union a VLA-4, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, las tecnicas de 45 inmunodeteccion pueden incluir, pero no se limitan a, ensayos por inmunoabsorcion ligados a enzimas (ELISA) (que incluyen, pero no se limitan a, un ELISA sandwich estandar o un ELISA de puente), radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunorradiometricos, fluoroinmunoensayos, ensayos quimioluminiscentes, ensayos bioluminiscentes, ensayos de radioinmunoprecipitacion (RIPA) y Western blots. Ademas, las tecnicas de inmunodeteccion pueden incluir metodos basados en sensores opticos tales como resonancia de plasmon superficial (SPR) o filtro de 50 resonancia en modo guiado (BIND). Aunque determinados ejemplos proporcionados en el presente documento se refieren a ensayos que utilizan un anticuerpos de union a VLA-4 inmovilizado unido a una superficie (por ejemplo, un ELISA), un experto en la tecnica reconocera que la divulgacion en algunos aspectos puede incluir ensayos sin union superficial de un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, ensayos de citometrfa de flujo, etc.). Otras tecnicas de inmunodeteccion pueden incluir ensayos inmunorradiometricos (IRMA), fluorometrfa en tiempo retardado (TRF) o 55 electroquimioluminiscencia (ECL). Un cierto numero de metodos de inmunodeteccion utiles han sido descritos en la bibliograffa cientffica tal como, por ejemplo, Doolittle M H y Ben-Zeev 0, 1999; Gulbis B y Galand P, 1993; De Jager R et al., 1993; y Nakamura et al., 1987.

En un aspecto, se realiza un ensayo para detectar la presencia de una actividad de union para un anticuerpo de 60 union a VLA-4 en una muestra biologica. En una realizacion, la especificidad de la actividad de union se puede

evaluar determinando si la actividad de union observada es especffica para el anticuerpo de union a VLA-4 o si es debida a un factor de interferencia que pueda estar presente en la muestra biologica tal como un factor reumatoide u otro factor de union.

5 Aspectos de la invencion pueden incluir un ensayo que implica poner en contacto una muestra biologica con un resto de inmovilizacion para inmovilizar cualquier actividad de union que esta presente en la muestra biologica. Una actividad de union inmovilizada puede ser detectada utilizando un resto de deteccion. Los restos de inmovilizacion y deteccion pueden ser, respectivamente, anticuerpos de union a VLA-4 inmovilizados no marcados y no marcados inmovilizados segun se describe en el presente documento. En una realizacion, un resto de inmovilizacion puede 10 estar unido a un sustrato o superficie solido (por ejemplo, en un pocillo de una placa de multiples pocillos, en la superficie de una placa de ELISA, etc.). En otra realizacion, un resto de inmovilizacion puede estar unido a una perla (por ejemplo, una perla magnetica) a traves de un enlace covalente o de otro tipo (por ejemplo, el resto de inmovilizacion puede estar conjugado a una molecula de biotina y puede estar unido a una perla revestida con estreptavidina a traves de una interaccion biotina-estreptavidina). En algunas realizaciones, la perla se puede fijar a 15 una superficie o una matriz. Por ejemplo, una perla magnetica se puede inmovilizar sobre una superficie magnetica: De manera similar, una perla cargada puede inmovilizarse sobre una superficie cargada (por ejemplo, un electrodo).

Un resultado positivo se puede determinar si la cantidad detectada de la actividad de union (por ejemplo, la cantidad de actividad de union que es capturada por el resto de inmovilizacion) esta por encima de un umbral 20 predeterminado. La especificidad de la actividad de union detectada puede ser evaluada mediante la inclusion de un resto de competencia en el ensayo. El resto de competencia puede ser un anticuerpo de union a VLA-4 no inmovilizado no marcado, que puede ser incluido para competir con las etapas de inmovilizacion y/o deteccion del ensayo. Si la presencia del resto de competencia reduce la actividad de union en al menos un porcentaje o corte predeterminado, se determina que la actividad de union es especffica y se confirma el resultado positivo. Si la 25 presencia del resto de competencia no reduce la actividad de union en al menos un porcentaje o corte predeterminado, se determina que la actividad de union es no especffica y ahora se determina que el resultado positivo inicial es un resultado negativo para una respuesta inmune.

De acuerdo con aspectos de la divulgacion, se pueden utilizar cantidades predeterminadas de inmovilizacion, 30 deteccion y/o restos de competencia. De manera similar, se puede establecer un nivel de umbral inicial de actividad de union utilizando una muestra que contiene una cantidad predeterminada de un anticuerpo que se sabe que se une a un anticuerpo de union a vLA-4. Por ejemplo, puede establecerse un nivel de umbral utilizando entre 10 ng y 1.000 ng (por ejemplo, aproximadamente 50 ng o aproximadamente 500 ng) de un anticuerpo control por ml de ensayo. La cantidad de anticuerpo utilizada para determinar el nivel de umbral determinara la sensibilidad del 35 ensayo. En general, la sensibilidad del ensayo puede ser considerada similar a la cantidad de anticuerpo que es utilizado para determinar el umbral inicial. Se debe apreciar que la cantidad de union en el control puede servir como una referencia que se utiliza para determinar el umbral (por ejemplo, la cantidad umbral puede ser un multiplo o una fraccion de la senal obtenida en el control). Sin embargo, en una realizacion, la senal obtenida en el ensayo de control se utiliza como la cantidad umbral. Tambien debe apreciarse que la sensibilidad del ensayo puede verse 40 afectada por un cierto numero de factores, incluyendo la afinidad y especificidad del anticuerpo de control.

En una realizacion, la especificidad de la actividad de union puede ser evaluada enriqueciendo el ensayo con una cantidad de resto de competencia que es similar a la cantidad de anticuerpo de control que se utilizo para establecer el nivel de umbral de la union. Por ejemplo, un ensayo puede estar enriquecido con entre aproximadamente 10 ng y 45 1.000 ng (por ejemplo, aproximadamente 50 ng o aproximadamente 500 ng) de anticuerpo de union a VLA-4 soluble no marcado por ml de ensayo. Sin embargo, se pueden utilizar otras cantidades de resto de competencia.

Por consiguiente, en algunas realizaciones de la divulgacion, un primer nivel de actividad de union, en una muestra biologica, al anticuerpo de union a VLA-4 se determina en un primer inmunoensayo para una primera alfcuota de la 50 muestra biologica, y un segundo nivel de actividad de union al anticuerpo de union a VLA-4 se determina en un segundo inmunoensayo para una segunda alfcuota de la muestra biologica, donde el segundo inmunoensayo se enriquece con una mayor cantidad de anticuerpo de union a VLA-4 soluble no marcado que el primero inmunoensayo, y se indica la presencia de al menos un nivel de umbral de anticuerpo soluble contra el anticuerpo de union a VLA-4 si el primer nivel de actividad de union es mayor que un nivel de referencia y el segundo nivel de 55 actividad de union es inferior a un porcentaje predeterminado del primer nivel de la actividad de union.

Un experto en la tecnica reconocera que se pueden utilizar diferentes metodos para evaluar y/o monitorizar una respuesta inmune en un sujeto que ha sido tratado con un anticuerpo terapeutico tal como un anticuerpo de union a VLA-4. Por ejemplo, como se ha descrito anteriormente, la evaluacion y/o monitorizacion puede llevarse a cabo 60 determinando si la cantidad de un anticuerpo se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 utilizando un

"corte" de nivel sencillo. Como se usa en el presente documento, el nivel de corte de union es el nivel en o por encima del cual la deteccion aumentada se puntuara como significativa y/o positiva y una determinacion confirmatoria de que la deteccion de un nivel de actividad de union soluble en una muestra biologica refleja el nivel de un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 en la muestra. En otras 5 realizaciones, la identificacion de una respuesta immune al anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico puede llevarse a cabo cuantitativamente para determinar un tftulo de un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 en una muestra biologica de un sujeto.

En un aspecto de la invencion, un ensayo de inmunodeteccion puede ser un ELISA. Como se entendera por los 10 expertos en la tecnica, el termino "ELISA" incluye un cierto numero de protocolos para la inmunodeteccion. Por ejemplo, los metodos ELISA incluyen ELISA sandwich, ELISA puente, etc. En algunas realizaciones, el inmunoensayo ELISA es un ensayo manual. Sin embargo, en algunas realizaciones todo o parte del ELISA puede realizarse roboticamente.

15 En algunas realizaciones de la invencion, un ensayo ELISA incluye el uso de un anticuerpo de union a VLA-4 como un resto diana inmovilizado con el que se reviste una placa de ELISA. La placa de ELISA revestida puede entonces ponerse en contacto con una muestra biologica para la determinacion del nivel de un anticuerpo objeto que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4. En algunas realizaciones, una primera alfcuota de una muestra biologica se somete a ensayo utilizando un ensayo ELISA para determinar la presencia o ausencia de una cantidad 20 umbral de union al anticuerpo de union a VLA-4 diana inmovilizado y una segunda alfcuota de la misma muestra biologica tambien se somete a ensayo utilizando un ELISA para confirmar si un nivel de umbral (o por encima del umbral) de union al anticuerpo de union a VLA-4 diana inmovilizado es o no indicativo de un anticuerpo especffico para el anticuerpo de union a VLA-4. En un aspecto de la invencion, el nivel umbral de actividad de union soluble en una alfcuota es aproximadamente igual al nivel de la actividad de union presente en una muestra de control o de 25 referencia que comprende al menos aproximadamente 50 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng, 400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng o 1.000 ng por ml de un anticuerpo de referencia que se une a un anticuerpo de union a VLA-4. En una realizacion, el nivel de umbral se determina como aproximadamente igual al nivel de actividad de union en una muestra de control o de referencia que contiene aproximadamente 500 ng/ml de un anticuerpo de referencia que se une a un anticuerpo de union a VLA-4. El anticuerpo de referencia puede ser policlonal o monoclonal. El 30 anticuerpo de referencia puede ser un anticuerpo anti-natalizumab murino (por ejemplo, 12C4 descrito en Sheremata et al., 1999, Neurology 52, paginas 1072-1074, incorporado en el presente documento por referencia). Segun se describe en el presente documento, si el nivel de union al anticuerpo de union a VLA-4 diana inmovilizado que esta al menos en el nivel de umbral, y se determina que la actividad de union soluble es la actividad de union de un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4, entonces se identifica una respuesta 35 inmune al anticuerpo de union de VLA-4 en el sujeto.

En general, los metodos ELISA utiles en los metodos de la invencion pueden incluir obtener una muestra biologica de un sujeto al que se ha administrado un anticuerpo terapeutico tal como un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, natalizumab, etc.) y poner en contacto una alfcuota de la muestra con un anticuerpo de inmovilizacion. En 40 algunas realizaciones, el anticuerpo de inmovilizacion puede ser el mismo anticuerpo de union a VLA-4 que se administro al sujeto. El anticuerpo de inmovilizacion captura moleculas o compuestos en la muestra que se unen al anticuerpo, y la muestra se pone en contacto con un segundo resto de deteccion que es capaz de unirse selectivamente a o detectar la molecula o compuesto que se captura (por ejemplo, un segundo anticuerpo marcado). Los ejemplos de restos capaces de unirse selectivamente o detectar el complejo incluyen, pero no se limitan a 45 anticuerpos u otros ligandos que pueden ser marcados utilizando una diversidad de marcadores (por ejemplo, disposicion de union de ligandos de biotina/avidina tal como se conoce en la tecnica). Un experto en la tecnica tambien puede utilizar un tercer anticuerpo marcado. En realizaciones preferidas, el segundo resto es una forma marcada del anticuerpo de inmovilizacion.

50 En algunas realizaciones, un ensayo ELISA incluye el uso del anticuerpo de union a VLA4 terapeutico como un resto diana inmovilizada con el que se reviste una placa de ELISA. La placa de ELISA revestida puede entonces ponerse en contacto con una muestra biologica para la determinacion del nivel de un anticuerpo objeto que se une especfficamente al anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. En algunas realizaciones de la invencion, una primera alfcuota de una muestra biologica se somete a ensayo utilizando un ensayo ELISA para determinar la presencia o 55 ausencia de una cantidad umbral de actividad de union para el anticuerpo de union a VLA4 diana inmovilizado, y una segunda alfcuota de la misma muestra biologica se somete a ensayo utilizando un ELISA para confirmar si un nivel umbral (o por encima del umbral) de la union al anticuerpo de union a VLA-4 diana inmovilizado es o no indicativo de un anticuerpo especffico para el anticuerpo de union a VLA-4. En un aspecto de la divulgacion, el nivel umbral de actividad de union soluble en una alfcuota es aproximadamente igual al nivel de la actividad de union presente en 60 una muestra de control o de referencia que comprende al menos aproximadamente 50 ng, 100 ng, 200 ng, 300 ng,

400 ng, 500 ng, 600 ng, 700 ng, 800 ng, 900 ng o 1.000 ng por ml de un anticuerpo de referencia que se une a un anticuerpo de union a VLA-4. En una realizacion, el nivel de umbral se determina como aproximadamente igual al nivel de actividad de union en una muestra de control o de referencia que contiene aproximadamente 500 ng/ml de un anticuerpo de referencia que se une a un anticuerpo de union a VLA-4. El anticuerpo de referencia puede ser 5 policlonal o monoclonal. El anticuerpo de referencia puede ser un anticuerpo anti-natalizumab murino (por ejemplo, 12C4 descrito en Sheremata et al., 1999, Neurology 52, pagina 1072).

Un anticuerpo de referencia que se une a un anticuerpo de union a VLA-4 puede ser un anticuerpo de referencia que se une a natalizumab (por ejemplo, un anticuerpo que se une a natalizumab con alta afinidad, por ejemplo, con 10 afinidad nanomolar). En algunas realizaciones, un anticuerpo de referencia que se une a natalizumab puede bloquear la union de natalizumab a VLA-4 (por ejemplo, puede inhibir la union de natalizumab a VLA-4 en al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, o mas). El anticuerpo de referencia puede ser un anticuerpo monoclonal murino. El anticuerpo de referencia puede ser un anticuerpo anti- idiotfpico especffico para natalizumab. En algunas realizaciones, el anticuerpo de referencia es el anticuerpo 12C4 15 (disponible de en Maine Biotechnology Services, Inc., Portland ME; vease, por ejemplo, Sheremata et al., 1999, Neurology 52, pagina 1072). 12C4 es un anticuerpo bloqueante que bloquea la union de natalizumab a VLA-4. En algunas realizaciones, el anticuerpo de referencia compite con 12C4 en cuanto a la union con natalizumab. La competencia de union del anticuerpo se puede demostrar utilizando metodos estandares de evaluacion de la capacidad de un anticuerpo de inhibir competitivamente la capacidad del anticuerpo 12C4 de bloquear la union de 20 natalizumab a VLA-4. En algunas realizaciones, la presencia de un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 se determina utilizando un ELISA de puente. En un ELISA de puente, los anticuerpos que se unen especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, de una muestra biologica) actuan como un puente entre el anticuerpo de union a VLA-4 revestido en una placa de ELISA y el anticuerpo de union a VLA-4 marcado de forma detectable en solucion (por ejemplo, no inmovilizado). Por lo tanto, una senal de ELISA 25 despues del procesamiento estandar indica que el marcador detectable se ha enlazado a la fase solida y que esta presente en la muestra biologica una actividad de union soluble.

La puesta en contacto de una alfcuota de la muestra biologica con el anticuerpo inmovilizado bajo condiciones efectivas y durante un perfodo de tiempo suficiente para permitir la formacion de complejos inmunes (complejos 30 inmunes primarios) es generalmente una cuestion de anadir la alfcuota de la muestra biologica al anticuerpo inmovilizado (por ejemplo, un anticuerpo de union a VLA-4 inmovilizado en una placa de ELISA) e incubar la mezcla durante un perfodo de tiempo suficiente para que el anticuerpo inmovilizado forme un complejo inmune con (es decir, se una a) una molecula o compuesto con actividad de union soluble que esta presente en la alfcuota de la muestra biologica. La molecula o compuesto con actividad de union soluble puede ser un anticuerpo inducido que se une 35 especfficamente al anticuerpo de union a VLA-4, o puede ser un anticuerpo o receptor endogeno no inducido que se une al anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, un factor reumatoide [RF] o un anticuerpo anti-Fab). Despues de este tiempo, la mezcla de muestra y anticuerpo (por ejemplo, la placa de ELISA, transferencia de puntos o transferencia Western) generalmente se lavara para separar de la mezcla de ensayo las especies y/o materiales de anticuerpos no unidos.

40

Si se detecta un nivel umbral de actividad de union, una etapa adicional puede implicar confirmar si la actividad de union es indicativa o no de un anticuerpo inducido que se une especfficamente al anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. Para esta etapa de confirmacion, se puede preparar y someter a ensayo una segunda alfcuota de la muestra biologica segun se describe para la primera alfcuota, excepto que tambien se anade al ensayo (por ejemplo, 45 el ensayo de ELISA) una cantidad predeterminada del anticuerpo de union a VLA-4 de competencia no inmovilizado y no marcado. Por ejemplo, la cantidad predeterminada de anticuerpo de competencia puede ser una cantidad no marcada que reduce una senal especffica en un 50 % o mas en un ensayo de control. Si la presencia del anticuerpo de union a VLA-4 no marcado reduce la senal en mas de una cantidad porcentaje esperada, entonces la actividad de union del umbral (o por encima del umbral) se juzga como un indicador positivo en cuanto a la presencia de un 50 anticuerpo que se une especfficamente al anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. En contraposicion, si la presencia del anticuerpo de union a VLA-4 no marcado reduce la senal en menos de una cantidad porcentaje esperada, entonces la actividad de union del umbral (o por encima del umbral) se juzga como negativa para un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4. Se debe apreciar que una senal no especffica puede deberse a factores en suero distintos de un anticuerpo que se une al anticuerpo de union a VLA-4. 55 Como se usa en el presente documento, los terminos "enriquecer" o "enriquecido" se refieren a la adicion de un anticuerpo de union a VLA-4 de competencia soluble no marcado (o marcado de forma diferente) a una muestra o ensayo.

Como se usa en el presente documento, el "porcentaje de reduccion" es el porcentaje del nivel de union determinado 60 en la primera alfcuota. Por lo tanto, por ejemplo, si hay una indicacion de aproximadamente 500 ng/ml equivalentes

de una molecula o compuesto con actividad de union en la primera alfcuota y la inclusion del anticuerpo de union a VLA-4 no marcado en la segunda alfcuota reduce la cantidad de senal en mas de un 40-90 % (por ejemplo, en aproximadamente un 50 % o mas, en aproximadamente un 55 % o mas, en aproximadamente un 60 % o mas, en aproximadamente un 65 % o mas, en aproximadamente un 70 % o mas, en aproximadamente un 75 % o mas, en 5 aproximadamente un 80 % o mas, en aproximadamente un 85 % o mas, en aproximadamente un 90 % o mas), entonces la actividad de union en la muestra biologica se considera indicativa de la presencia de un anticuerpo inducido que se une especfficamente al anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. Pero si la inclusion del anticuerpo de union a VLA-4 no marcado en la segunda alfcuota reduce la cantidad de senal en menos de un 20-40 %, entonces la actividad de union en la muestra biologica no se considera indicativa de la presencia de un anticuerpo 10 inducido que se une especfficamente al anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. En algunas realizaciones, el anticuerpo de competencia puede ser natalizumab no marcado soluble. En algunas realizaciones, el natalizumab no marcado soluble se puede utilizar a una concentracion final de aproximadamente 100 pg/ml. Sin embargo, se puede utilizar cualquier concentracion de natalizumab no marcado libre si resulta en una disminucion predeterminada (por ejemplo, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, o mas) en la senal obtenida para una muestra de control 15 que contiene una cantidad de control de anticuerpo de referencia. Por ejemplo, una muestra de control puede contener aproximadamente 500 ng/ml, aproximadamente 3 pg/ml o cualquier otra cantidad adecuada de anticuerpo de referencia (por ejemplo, 12C4). Como se indica en el presente documento, la presencia en una muestra biologica de un paciente de un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 indica que el sujeto tiene una respuesta inmune clfnicamente significativa al anticuerpo de union a VLA-4.

20

En un ELISA "sandwich" ilustrativo, un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico (por ejemplo, natalizumab) se puede utilizar como el anticuerpo diana y se puede inmovilizar sobre una superficie seleccionada que exhibe afinidad por protefnas tal como un pocillo en una placa de microtitulacion de poliestireno. A continuacion, una muestra de un sujeto que ha tenido al menos una administracion de un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico, por ejemplo, 25 natalizumab, se anade a los pocillos. Despues de la union y/o el lavado para separar materiales no unidos, se pueden detectar moleculas o compuestos de union que se unen al anticuerpo diana. La deteccion puede conseguirse mediante la adicion de un segundo anticuerpo que esta enlazado a un marcador detectable. Adicionalmente, la identidad de la molecula o compuesto de union como un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 puede ser confirmada segun se describio anteriormente en el presente 30 documento.

Como se entendera por los expertos ordinarios en la tecnica, a pesar de las caracterfsticas individuales (por ejemplo, las etapas confirmatorias descritas en el presente documento), en general, los ELISA tienen determinadas caracterfsticas en comun tales como revestimiento, incubacion y union, lavado para separar especies no unidas 35 especfficamente, y deteccion de los complejos inmunes unidos.

En el revestimiento de una placa con un antfgeno o anticuerpo, los pocillos de la placa generalmente se incuban con una solucion del anticuerpo diana, ya sea durante la noche o durante un perfodo especificado de horas. Un tampon de revestimiento puede ser un tampon de revestimiento de fosfato de sodio/BSA u otro tampon de revestimiento 40 adecuado conocido en la tecnica. Los pocillos de la placa se lavaran a continuacion para separar el material adsorbido de forma incompleta. Cualquier superficie disponible restante de los pocillos es entonces "revestida" con una protefna inespecffica que es antigenicamente neutra con respecto a la muestra de ensayo. Esta protefna puede ser albumina de suero bovino (BSA), casefna o disoluciones de leche en polvo, etc. El revestimiento permite el bloqueo de sitios de absorcion no especfficos sobre la superficie de inmovilizacion y reduce asf el fondo provocado 45 por la union no especffica de antisueros sobre la superficie.

En un ELISA, se puede utilizar un medio de deteccion secundario o terciario o un medio de deteccion directo. Cuando se utilizan metodos de deteccion secundarios o terciarios, despues de la union de una protefna o anticuerpo al pocillo, el revestimiento con un material no reactivo para reducir el fondo (por ejemplo, con tampon de bloqueo tal 50 como tampon de bloqueo de Tris-sacarosa u otro tampon de bloqueo reconocido en la tecnica), y el lavado para separar el material no unido, la superficie inmovilizante se pone en contacto con la muestra biologica a ensayar en condiciones eficaces para permitir la formacion de un complejo inmune (antfgeno/anticuerpo). La deteccion del complejo inmune requiere entonces un ligando de union secundario marcado o anticuerpo, y un ligando de union secundario o anticuerpo en conjuncion con un anticuerpo terciario marcado o un tercer ligando de union. En 55 realizaciones preferidas, el segundo ligando de union es un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, el mismo anticuerpo de union a VLA-4 al utilizado para el anticuerpo diana).

Como se usa en el presente documento, la expresion "en condiciones eficaces para permitir la formacion de un complejo inmune" significa que las condiciones incluyen preferiblemente la dilucion de los antfgenos y/o anticuerpos 60 con disoluciones tales como BSA, gamma globulina bovina (BGG), solucion salina tamponada con fosfato

(PBS)/Tween, PBS con casefna y Tween 20, o tampon PBS/BSA con Tween 20. En los metodos de la invencion se pueden utilizar diversos otros diluyentes de ensayo conocidos en la tecnica. Estos agentes anadidos tambien tienden a ayudar en la reduccion de fondo no especffico y pueden incluir NaCl hasta 0,5 M.

5 Como se usa en el presente documento, las condiciones "adecuadas" tambien significan que la incubacion se encuentra a una temperatura o durante un perfodo de tiempo suficiente para permitir la union eficaz. Las etapas de incubacion son tfpicamente de aproximadamente 1 a 2 a 4 horas mas o menos, a temperatures preferiblemente del orden de 25 oC a 27 oC, o puede ser durante la noche a aproximadamente 4 oC. En los metodos de la invencion se pueden utilizar diversos parametros de temperatura y tiempo de ensayo conocidos en la tecnica.

10

Despues de las etapas de incubacion en un ELISA, la superficie de contacto se lava para separar el material no unido. Un proceso de lavado preferido puede incluir el lavado con una solucion tal como PBS/Tween, TBS/Tween, o tampon borato, que tambien puede incluir NaCl hasta 0,5 M. Despues de la formacion de complejos inmunes especfficos entre la muestra de ensayo y el anticuerpo diana, y del posterior lavado, se puede determinar la 15 presencia de incluso cantidades diminutas de complejos inmunes. Se entendera que en los metodos de la divulgacion se pueden utilizar formulaciones tampon de lavado conocidas en la tecnica adicionales.

Para proporcionar medios de deteccion, el segundo o tercer anticuerpo tendra una etiqueta detectable asociada. En determinadas realizaciones, el marcador detectable es una enzima que generara el desarrollo de color tras 20 incubacion con un sustrato cromogenico apropiado. Por lo tanto, por ejemplo, se puede poner en contacto o incubar el primer y el segundo complejo inmunes con un anticuerpo conjugado con ureasa, glucosa oxidasa, fosfatasa alcalina, hidrogeno peroxidasa, u otro anticuerpo conjugado durante un perfodo de tiempo y en condiciones que favorecen el desarrollo de una formacion adicional del complejo inmune (por ejemplo, incubacion durante 2 horas a temperatura ambiente en una solucion con contenido en PBS tal como PBS-Tween).

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Tambien se entendera por los expertos en la tecnica que uno o mas controles de calidad positivos y negativos se pueden utilizar en los metodos de la divulgacion. Una muestra de control de calidad positivo puede ser una muestra de suero normal que contiene una cantidad predeterminada de un anticuerpo que se sabe que se une a un anticuerpo de union a VLA-4. Las muestras de control de calidad se pueden hacer reaccionar en paralelo con y bajo 30 las mismas condiciones que las muestras biologicas y de control del ensayo y proporcionan una medida de la funcion del ensayo. Una muestra de control de calidad negativo puede ser una muestra de suero que se sabe no incluye un anticuerpo que se sabe que se une a un anticuerpo de union a VLA-4. Un experto entendera como utilizar reacciones y muestras de control positivo y negativo en un ELISA para confirmar y validar la funcionalidad de las disoluciones y/o sustratos y/o protocolo utilizados en el ensayo. Por ejemplo, un control positivo puede incluir una 35 cantidad conocida de un anticuerpo que se une especfficamente al anticuerpo de union a VLA-4, de manera que cuando se trata en las mismas condiciones que las muestras de ensayo (por ejemplo, la muestra biologica) indica que el ensayo funciona dentro de los parametros esperados. Un ejemplo de un control negativo puede ser una muestra que se sabe que no incluye un anticuerpo que se une especfficamente al anticuerpo de union a VLA-4. Tal control negativo, cuando se trata en las mismas condiciones que la muestra de ensayo (por ejemplo, la muestra 40 biologica), demostrara que la union detectada en una muestra biologica surge de la muestra biologica y no es debida a la contaminacion de componentes del ensayo ni de otro factor no asociado con la muestra biologica. Un ejemplo no limitante de un ensayo abarcado por los metodos de la divulgacion puede implicar los siguientes procedimientos. El revestimiento de los pocillos de una placa de ELISA con una solucion de aproximadamente 0,25 pg/ml de patron de referencia de natalizumab en un tampon e incubacion de la placa revestida durante la noche a temperatura 45 ambiente; lavado de los pocillos de la placa al menos una vez con un tampon de lavado e incubacion de los pocillos de la placa con un tampon de bloqueo durante un mfnimo de 1 hora a temperatura ambiente; dilucion de las muestras de control y de las muestras de cribado en aproximadamente 1:10 en un diluyente de ensayo; dilucion de las muestras de competencia y natalizumab (a aproximadamente 1 mg/ml) juntos en el diluyente de ensayo a una concentracion final de natalizumab de aproximadamente 100 pg/ml y aproximadamente una dilucion final 1:10 de las 50 muestras de competencia; incubacion de muestras de control, muestras de cribado y muestras de competencia aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente y lavado de los pocillos de la placa al menos una vez con tampon de lavado; incubacion de las muestras en los pocillos de la placa durante aproximadamente 60 y 150 minutos a temperatura ambiente y lavado de los pocillos de la placa al menos tres veces con tampon de lavado; adicion de aproximadamente 1001 pl/pocillo de la placa de natalizumab biotinilado diluido a aproximadamente 1:1000 en el 55 diluyente de ensayo, incubacion de la placa durante aproximadamente 60-90 min a temperatura ambiente, y lavado de los pocillos de la placa al menos tres veces con tampon de lavado; adicion de estreptavidina-peroxidasa de rabano picante diluida a razon de aproximadamente 1:5000 en diluyente de ensayo a las muestras en pocillos de la placa, incubacion de la placa durante aproximadamente 60-90 minutos a temperatura ambiente, y lavado de la placa al menos tres veces con tampon de lavado, adicion de una cantidad suficiente de sustrato productor de color a los 60 pocillos de la placa para visualizar la union del anticuerpo, desarrollo de la placa durante varios minutos a

temperatura ambiente, deteniendo el desarrollo mediante la adicion de H2SO4 1 N a los pocillos de la placa; y lectura de los pocillos de la placa, obteniendo asf un resultado.

Tambien se contempla que los reactivos de ELISA descritos en el presente documento pueden estar envasados en 5 un kit que puede ser producido comercialmente para detectar la presencia de y/o medir un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 en una muestra biologica tal como se describe en el presente documento.

Tambien se entendera que los controles para uso en la invencion pueden incluir, ademas de valores 10 predeterminados (tales como valores de umbral clfnicamente significativos identificados segun se describe en el presente documento para una protefna terapeutica particular), muestras de materiales ensayados en paralelo con los materiales experimentales. Los ejemplos incluyen muestras de control negativo (por ejemplo, generadas a traves de la fabricacion) para ser ensayadas en paralelo con las muestras experimentales.

15 Como se usa en el presente documento, una muestra biologica puede ser, pero no esta limitada a, cualquiera de los siguientes: un fluido corporal de un sujeto, incluyendo sangre, suero, plasma, orina, saliva, derrames pleurales, heces, lfquido sinovial, lfquido cefalorraqufdeo, moco e infiltraciones de tejidos. Los fluidos corporales preferidos incluyen sangre, plasma y suero. Como se usa en el presente documento, pueden obtenerse muestras biologicas utilizando metodos bien conocidos por los expertos en las tecnicas medicas relacionadas. Una muestra biologica 20 puede ser obtenida directamente de un sujeto o puede obtenerse de celulas, tejidos o de otro cultivo. Una muestra biologica puede ser reciente o puede haber sido almacenada bajo condiciones adecuadas (por ejemplo, congelada, enfriada rapidamente, etc.) antes de su uso en los metodos de la invencion.

Se debe apreciar que una muestra biologica puede obtenerse de un sujeto a diferentes intervalos de tiempo despues 25 de la administracion de un agente terapeutico. Sin embargo, un agente terapeutico puede tener una caracterfstica en la semivida in vivo, y la cantidad de agente terapeutico libre que esta presente en una muestra biologica disminuira tfpicamente en funcion del tiempo despues de la administracion del agente al sujeto. La presencia de agente terapeutico libre (no marcado y no inmovilizado) en una muestra biologica puede interferir con las reacciones de union y deteccion de la invencion. Por consiguiente, las muestras biologicas deben obtenerse el mayor tiempo 30 posible despues de una administracion terapeutica, por ejemplo en un "valle" en el ciclo de tratamiento. Un "valle" representa las cantidades mas bajas de agente terapeutico libre que estan presentes en un sujeto durante un ciclo de tratamiento. Un valle puede producirse, por ejemplo, tiempo despues de una administracion terapeutica y poco antes de que una posterior administracion terapeutica. Se debe apreciar que el momento del valle puede estar influenciado por muchos factores, incluyendo la cantidad de agente que se administra, la semivida del agente, la 35 frecuencia de administracion, etc. Por ejemplo, una administracion mensual de un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, 300 mg de natalizumab) resulta en un valle aproximadamente 30 dfas despues de una administracion e inmediatamente antes de una administracion posterior. Sin embargo, se debe apreciar que los ensayos de la invencion pueden realizarse en muestras tomadas en diferentes momentos despues de la administracion de tratamiento, con la condicion de que los ensayos sean relativamente insensibles a, o representen la presencia de 40 agente terapeutico libre en la muestra biologica. Cuando se comparan los niveles de actividad de union para diferentes muestras tomadas en diferentes puntos temporales, puede ser particularmente importante obtener cada una de las muestras de una fase similar en el ciclo de tratamiento (por ejemplo, un periodo de tiempo similar despues de una administracion terapeutica) de modo que los resultados pueden interpretarse sin necesidad de corregir las diferencias en los niveles de agente terapeutico libre en las muestras biologicas.

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Se debe apreciar que las muestras biologicas se pueden diluir antes de ser sometidas a ensayo (por ejemplo, 2 veces, 5 veces, l0 veces, 50 veces, 100 veces, e incluyen valores mas altos o mas bajos o cualquier valor entremedias). En una realizacion, una muestra de referencia que contiene una cantidad umbral clfnicamente significativa de anticuerpo de referencia se puede diluir en la misma cantidad que la muestra biologica que se esta 50 ensayando, de manera que la senal obtenida para la muestra biologica puede compararse directamente con la senal obtenida para la muestra de referencia.

En algunas realizaciones, se utilizan una o mas alfcuotas de una muestra biologica. Como se usa en el presente documento, el termino "alfcuota" significa una porcion o parte de la muestra biologica. En algunas realizaciones, se 55 pueden tomar dos o mas alfcuotas de una muestra biologica obtenida de un sujeto y las alfcuotas se pueden someter a ensayo utilizando metodos de la invencion para determinar la presencia de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 en el sujeto. Por ejemplo, se pueden tomar dos alfcuotas sustancialmente equivalentes de una muestra biologica obtenida de un sujeto al que se ha administrado un anticuerpo de union a VLA-4 (por ejemplo, natalizumab), y se puede detectar un nivel de actividad de union soluble en una alfcuota (por ejemplo, una 60 "primera" alfcuota) que se puede determinar. Adicionalmente, la otra alfcuota (por ejemplo, la "segunda" alfcuota) se

puede evaluar utilizando los metodos de la invencion para determinar si la actividad de union soluble detectada en la primera alfcuota, que tambien estarfa presente en la segunda alfcuota en virtud de su origen de muestra comun, es un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4. En algunas realizaciones, si al menos un nivel umbral de union esta presente en la primera alfcuota y se determina que la actividad la actividad de union 5 soluble es la actividad de un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4, se identifica que esta presente en el sujeto una respuesta inmune al anticuerpo de union a VLA-4.

Anticuerpos de union a VLA-4

10 Los aspectos de la divulgacion se refieren a un ensayo o ensayos de deteccion para identificar y/o monitorizar una respuesta inmune a uno o mas anticuerpos de union a VLA-4 terapeuticos que se administran a un sujeto. En determinados aspectos, un ensayo de deteccion implica restos tanto de inmovilizacion como de deteccion. En algunas realizaciones, un ensayo de deteccion puede incluir tambien un resto de competencia. Como se describe en el presente documento, un resto de inmovilizacion se puede utilizar para inmovilizar un anticuerpo inducido (por 15 ejemplo, un anticuerpo de suero) que se une al anticuerpo de union a VLA-4. Un resto de deteccion se puede utilizar para detectar el anticuerpo inmovilizado. Un resto de competencia se puede utilizar para competir con el resto de inmovilizacion y/o de deteccion para la union al anticuerpo inducido con el fin de determinar la especificidad de la union al anticuerpo inducido. Los restos de inmovilizacion y deteccion pueden unirse independientemente a uno o mas anticuerpos que son caracterfsticos de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4. Por 20 consiguiente, los restos de inmovilizacion y deteccion pueden ser el mismo anticuerpo de union a VLA-4 que se administro al sujeto (por ejemplo, el resto de inmovilizacion puede ser una forma inmovilizada del anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico que se administro al sujeto, y el resto de deteccion puede ser una forma marcada del anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico que se administro al sujeto). Sin embargo, en otras realizaciones, cada uno de los restos de inmovilizacion y deteccion, de forma independiente, pueden ser variantes del anticuerpo de union a 25 VLA-4 terapeutico que se administro al sujeto, con la condicion de que los restos de inmovilizacion y deteccion se unan con una afinidad adecuada para detectar uno o mas anticuerpos inducidos (por ejemplo, anticuerpos sericos) contra el anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico. El resto de competencia es tfpicamente una forma no marcada (o diferencialmente marcada) soluble del resto de inmovilizacion o deteccion. Sin embargo, el resto de competencia puede ser una variante del resto de inmovilizacion o deteccion, siempre que compita suficientemente por la union al 30 anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico para determinar la especificidad de la actividad de union detectada en el ensayo.

De acuerdo con aspectos de la divulgacion, uno cualquier o mas anticuerpos de union a VLA-4 (incluyendo natalizumab y/o anticuerpos de union a VLA-4 relacionados) se pueden utilizar terapeuticamente. Por consiguiente, 35 uno cualquiera o mas de los anticuerpos de union a VLA-4 se pueden utilizar como restos de inmovilizacion, deteccion y/o competencia en un ensayo de deteccion de la divulgacion. En una realizacion, un anticuerpo de union a VLA-4 puede ser un anticuerpo IgG (por ejemplo, un anticuerpo IgG4). En otra realizacion, un anticuerpo de union a VLA4 puede ser policlonal o monoclonal. En todavfa otra realizacion, un anticuerpo de union a VLA-4 puede ser una version humanizada de un anticuerpo murino.

40

Natalizumab y anticuerpos de union a VLA-4 relacionados se describen, por ejemplo, en el documento US 5.840.299. mAb 21.6 y HP1/2 son anticuerpos monoclonales murinos ilustrativos que se unen a VLA-4. Natalizumab es una version humanizada de mAb murino 21.6 (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.840.299). Tambien se ha descrito una version humanizada de HP1/2 (vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 45 6.602.503). Se describen varios anticuerpos de union a VLA-4 monoclonales adicionales tales como HP2/1, HP2/4, L25 y P4C2 (por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N.° 6.602.503; Sanchez-Madrid et al., 1986 Eur. J. Immunol., 16:1343-1349; Hemler et al., 1987 J. Biol. Chem. 2:114778-11485; Issekutz y Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147:109 (TA-2 mab); Pulido et al., 1991 J. Biol. Chem., 266(16):10241-10245; y la Patente de Estados Unidos N.° 5.888.507). Muchos anticuerpos de union a VLA-4 utiles interactuan con VLA-4 en celulas, por ejemplo, 50 linfocitos, pero no provocan una agregacion celular. Sin embargo, se ha observado que otros anticuerpos de union a VLA-4 provocan dicha agregacion. HP1/2 no provoca agregacion celular. El MAb HP1/2 (Sanchez-Madrid et al., 1986 Eur. J. Immunol., 16:1343-1349) tiene una potencia extremadamente alta, bloquea la interaccion de VLA-4 tanto con VCAM1 como fibronectina y tiene especificidad para el epftopo B en VLA-4. Este anticuerpo y otros anticuerpos especfficos para el epftopo B (tales como los anticuerpos de union al epftopo B1 o B2; Pulido et al., 1991 55 J. Biol. Chem., 266(16):10241-10245) representan una clase de anticuerpos de union a VLA-4 utiles.

Un anticuerpo de union a VLA-4 ilustrativo tiene una o mas CDR, por ejemplo, las tres CDR de HC y/o las tres CDR de LC de un anticuerpo particular descrito en el presente documento, o CDR que son, en suma, al menos un 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o un 99 % identicas a un anticuerpo de este tipo, por ejemplo, natalizumab. En una 60 realizacion, los bucles hipervariables H1 y H2 tienen la misma estructura canonica que los de un anticuerpo descrito

en el presente documento. En una realizacion, los bucles hipervariables L1 y L2 tienen la misma estructura canonica que los de un anticuerpo descrito en el presente documento.

En una realizacion, la secuencia de aminoacidos de la secuencia de dominio variable HC y/o LC es al menos un 70, 5 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 o un 100 % identica a la secuencia de aminoacidos del dominio variable HC y/o LC de un anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, natalizumab. La secuencia de aminoacidos de la secuencia de dominio variable HC y/o LC puede diferir en al menos un aminoacido, pero no mas de diez, ocho, seis, cinco, cuatro, tres o dos aminoacidos de la secuencia correspondiente de un anticuerpo descrito en el presente documento, por ejemplo, natalizumab. Por ejemplo, las diferencias pueden estar principal o totalmente en las 10 regiones de marco.

Las secuencias de aminoacidos de las secuencias de dominio variable HC y LC pueden ser codificados por una secuencia que se hibrida en condiciones de alta astringencia a una secuencia de acido nucleico descrita en el presente documento o una que codifica un dominio variable o a un acido nucleico que codifica una secuencia de 15 aminoacidos descrita en el presente documento. En una realizacion, las secuencias de aminoacidos de una o mas regiones de marco (por ejemplo, FR1, FR2, FR3 y/o FR4) del dominio variable HC y/o LC son al menos un 70, 80, 85, 90, 92, 95, 97, 98, 99 o un 100 % identicas a las regiones de marco correspondientes de los dominios variables HC y LC de un anticuerpo descrito en el presente documento. En una realizacion, una o mas regiones de marco de cadena pesada o ligera (por ejemplo, FR1, FR2 y FR3 de HC) son al menos un 70, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o un 20 100 % identicas a la secuencia de regiones de marco correspondientes de un anticuerpo de la lfnea germinal humana.

Los calculos de "homologfa" o "identidad de secuencia" entre dos secuencias (las expresiones se utilizan indistintamente en el presente documento) se realizan como se indica a continuacion. Las secuencias se alinean 25 para fines de comparacion optima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoacidos o de acidos nucleicos para la alineacion optima y las secuencias no homologas pueden ignorarse para fines comparativos). La alineacion optima se determina como la mejor puntuacion utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG con una matriz de puntuacion Blossum 62 con una penalizacion por hueco de 12, una penalizacion de extension de hueco de 4 y una penalizacion de hueco de desplazamiento de 30 marco de 5. Luego se comparan los residuos aminoacidos o nucleotidos en las posiciones de aminoacidos o posiciones de nucleotidos correspondientes. Cuando una posicion en la primera secuencia esta ocupada por el mismo residuo aminoacido o nucleotido que la posicion correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moleculas son identicas en esa posicion (tal como se utiliza en el presente documento, "identidad" de aminoacido o acido nucleico es equivalente a "homologfa" de aminoacido o acido nucleico). El porcentaje de identidad entre las 35 dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas compartidas por las secuencias.

El experto en la materia se dara cuenta de que se pueden hacer sustituciones conservativas de aminoacidos en anticuerpos de union a VLA-4 para proporcionar variantes funcionalmente equivalentes, de los anticuerpos, es decir, las variantes conservan las capacidades funcionales de los polipeptidos VLA-4. Como se usa en el presente 40 documento, una "sustitucion de aminoacidos conservativa" se refiere a una sustitucion de aminoacidos que no altera las caracterfsticas de carga o de tamano relativas de la protefna en la que se realiza la sustitucion de aminoacidos. Las variantes pueden prepararse de acuerdo con metodos para alterar la secuencia de polipeptido conocidas para un experto en la tecnica tal como se encuentran en referencias que recopilan tales metodos, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 45 Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., Nueva York. Las variantes funcionalmente equivalentes ilustrativas de anticuerpos de union a VLA-4 incluyen sustituciones de aminoacidos conservativas en las secuencias de aminoacidos de protefnas divulgadas en el presente documento. Las sustituciones conservativas de aminoacidos incluyen sustituciones hechas entre aminoacidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) 50 Q, N; y (g) E, D.

Como se usa en el presente documento, la expresion "se hibrida bajo condiciones de alta astringencia" describe condiciones para hibridacion y lavado. Una orientacion para la realizacion de las reacciones de hibridacion puede encontrarse en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6 . Se describen 55 metodos acuosos y no acuosos en esa referencia y se pueden utilizar. Las condiciones de hibridacion de alta astringencia incluyen hibridacion en 6 x SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o mas lavados en 0,2 x SSC, SDS al 0,1 % a 65 °C o condiciones sustancialmente similares.

Los anticuerpos pueden ser sometidos a ensayo para determinar una propiedad funcional, por ejemplo, union a VLA- 60 4, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 6.602.503.

Generacion de anticuerpos

Anticuerpos que se unen a VLA-4 pueden ser generados mediante inmunizacion, por ejemplo, utilizando un animal.

5 Todo o parte de VLA-4 se puede utilizar como un inmunogeno. Por ejemplo, la region extracelular de la subunidad alfa-4 se puede utilizar como inmunogeno. En una realizacion, el animal inmunizado contiene celulas productoras de inmunoglobulinas con loci de inmunoglobulinas naturales, humanas o parcialmente humanas. En una realizacion, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, es posible disenar cepas de raton deficientes en la produccion de anticuerpos de raton con grandes fragmentos de los loci de Ig 10 humana. Utilizando la tecnologfa de hibridoma, se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales especfficos para antfgenos derivados de los genes con la especificidad deseada. Vease, por ejemplo, XenoMouse™, Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994), Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos N.° 2003-0070185, Patent de Estados Unidos N.° 5.789.650, y el documento WO 96/34096. Tambien se pueden producir anticuerpos no humanos contra VLA-4, por ejemplo, en un roedor. El anticuerpo no humano puede ser 15 humanizado, por ejemplo, segun se describe en la Patente de Estados Unidos N.° 6.602.503, EP 239 400, Patente de Estados Unidos N.° 5.693.761, y Patente de Estados Unidos N.° 6.407.213.

El documento EP 239 400 (Winter et al.) describe la alteracion de anticuerpos mediante sustitucion (dentro de una region variable dada) de sus regiones determinantes de complementariedad (CDR) para una especie con los de otra. 20 Se predice que sera menos probable que anticuerpos sustituidos con CDR provoquen una respuesta inmune en los seres humanos en comparacion con anticuerpos quimericos verdaderos porque los anticuerpos sustituidos con CDR contienen considerablemente menos componentes no humanos. (Riechmann et al., 1988, Nature 332,323327; Verhoeyen et al., 1988, Science 239, 1534-1536). Tfpicamente, las CDR de un anticuerpo murino son sustituidas en las regiones correspondientes en un anticuerpo humano utilizando tecnologfa de acido nucleico 25 recombinante para producir secuencias que codifican el anticuerpo sustituido deseado. Se pueden anadir segmentos de genes de la region constante humana del isotipo deseado (habitualmente gamma I para CH y kappa para CL) y los genes de la cadena pesada y ligera humanizados son co-expresados en celulas de mamffero para producir un anticuerpo humanizado soluble.

30 Queen et al., 1989 Proc Natl Acad Sci U S A. Dec; 86(24):10029-33 y el documento WO 90/07861 han descrito un procedimiento que incluye la eleccion de regiones de marco V humanas mediante analisis por ordenador en cuanto a la optima homologfa de secuencia de la protefna con la region de marco V del anticuerpo murino original, y el modelado de la estructura terciaria de la region V murina para visualizar los residuos de aminoacido marco que es probable que interactuen con las CDR murinas. Estos residuos de aminoacidos murinos se superponen entonces 35 sobre el marco humano homologo. Veanse tambien las Patentes de Estados Unidos N.° 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; y 5.530.101. Tempest et al., 1991, Biotechnology 9, 266-271) utilizan, como patron, los marcos de la region V derivados de las cadenas pesadas y ligeras NEWM y REI, respectivamente, para el injerto de CDR sin la introduccion en los radicales de residuos de raton. Una ventaja de utilizar el enfoque de Tempest et al., para construir anticuerpos humanizados basados en NEWM y REI es que las estructuras tridimensionales de las 40 regiones variables de NEWM y REI son conocidas de la cristalograffa de rayos X y, de este modo, se pueden modelar las interacciones especfficas entre las CDR y residuos de marco de la region V.

Los anticuerpos no humanos pueden ser modificados para incluir sustituciones que insertan secuencias humanas de inmunoglobulina, por ejemplo, residuos de aminoacidos consenso humanos en posiciones particulares, por ejemplo, 45 en una o mas de las siguientes posiciones (preferiblemente al menos cinco, diez, doce, o todas): (en el FR del dominio variable de la cadena ligera) 4L, 35L, 36L, 38L, 43L, 44L, 58L, 46L, 62L, 63L, 64L, 65L, 66L, 67L, 68L, 69L, 70L, 71L, 73L, 85L, 87L, 98L, y/o (en el FR del dominio variable de la cadena pesada) 2H, 4H, 24H, 36H, 37H, 39H, 43H, 45H, 49H, 58H, 60H, 67H, 68H, 69H, 70H, 73H, 74H, 75H, 78H, 91H, 92H, 93H, y/o 103H (de acuerdo con la numeracion de Kabat). Vease, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 6.407.213.

50

Como resultara evidente para un experto en la tecnica, la presente divulgacion tambien proporciona fragmentos F(ab')2, Fab, Fv y Fd; anticuerpos quimericos en los que las regiones Fc y/o FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido reemplazadas por secuencias homologas humanas o no humanas; anticuerpos de fragmentos F(ab')2 quimericos en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido 55 reemplazadas por secuencias humanas y no humanas homologas; anticuerpos de fragmentos Fab quimericos en las que las regiones FR y/o CDR1 y/o cDR2 y/o CDR3 de cadena ligera han sido reemplazadas por secuencias homologas humanas o no humanas; y anticuerpos de fragmentos Fd quimericos, en los que las regiones FR y/o CDR1 y/o CDR2 han sido reemplazadas por secuencias homologas humanas o no humanas.

60 En determinadas realizaciones, un anticuerpo de union a VLA-4 puede ser un anticuerpo VLA-4 de cadena sencilla,

un anticuerpo de dominio sencillo o un Nanobody™. Las caracterfsticas de cada uno de estos tipos de anticuerpos y metodos para su uso son bien conocidas en la tecnica. Los Nanobodies™ son los fragmentos funcionales mas pequenos de anticuerpos y se derivan de anticuerpos de cadena sencilla que se producen de forma natural (vease Ablynx, Belgica; ablynx.com). La tecnologfa Nanobody™ fue desarrollada a partir del descubrimiento de que los 5 camelidos (camellos y llamas) poseen un repertorio unico de anticuerpos completamente funcionales que carecen de cadenas ligeras. La estructura de los Nanobody™ consiste en un dominio variable simple (VHH), una region de bisagra y dos dominios constantes (CH2 y CH3). El dominio VHH clonado y aislado es un polipeptido estable que alberga la capacidad total de union al antfgeno de la cadena pesada original. Los Nanobodies™ combinan las caracterfsticas de los anticuerpos convencionales con caracterfsticas de farmacos de moleculas pequenas. Los 10 Nanobodies™ muestran una alta especificidad para la diana y una baja toxicidad inherente. Adicionalmente, los Nanobodies™ son muy estables, se pueden administrar por medios distintos a la inyeccion y son faciles de fabricar. En determinadas realizaciones, un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico, un resto de inmovilizacion y/o un resto de deteccion pueden ser un Nanobody Nanobody™ humanizado.

15 Production de Anticuerpos

Los anticuerpos monoclonales completamente humanos que se unen a VLA-4 pueden ser producidos, por ejemplo, utilizando esplenocitos humanos cebados in vitro, segun se describe por Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147, 8695. Se pueden preparar por clonacion del repertorio segun se describe por Persson et al., 1991, Proc. Nat. Acad. 20 Sci. USA, 88: 2432-2436 o por Huang y Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. Documento US 5.798.230. Tambien se pueden utilizar grandes bancos de presentacion de fagos humanos no inmunizados para aislar anticuerpos de alta afinidad que se pueden desarrollar como agentes terapeuticos humanos utilizando una tecnologfa de fagos estandar (vease, por ejemplo, Vaughan et al, 1996 Nat Biotechnol. Mar;14(3):309- 14; Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4:1-20; y Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:37125 8; Solicitud de Patente Publicada de Estados Unidos N.° 2003-0232333). Los anticuerpos pueden producirse en celulas procariotas y eucariotas. En una realizacion, los anticuerpos (por ejemplo, scFvs) se expresan en una celula de levadura tal como Pichia (vease, por ejemplo, Powers et al. (2001) J Immunol Methods. 251:123-35), Hanseula, o Saccharomyces.

En una realizacion, los anticuerpos, en particular anticuerpos de longitud completa, por ejemplo, IgG, se producen en 30 celulas de mamffero. Las celulas huesped de mamffero ilustrativas para la expresion recombinante incluyen celulas ovario de hamster chino (celulas CHO) (incluyendo celulas CHO dhfr-, descritas en Urlaub y Chasin (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, segun se describe en Kaufman y Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), lfneas celulares linfocfticas, por ejemplo, celulas de mieloma NS0 y celulas SP2, celulas COS, K562 y una celula de un animal transgenico, por ejemplo, un mamffero 35 transgenico. Por ejemplo, la celula es una celula epitelial mamaria.

Ademas de la secuencia de acidos nucleicos que codifica el dominio de inmunoglobulina, los vectores de expresion recombinantes pueden portar secuencias adicionales tales como secuencias que regulan la replicacion del vector en celulas huesped (por ejemplo, orfgenes de replicacion) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador 40 seleccionable facilita la seleccion de celulas huesped en las que se ha introducido el vector (veanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N.° 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017). Los genes marcadores seleccionables ilustrativos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en celulas huesped dhfr-con seleccion/amplificacion con metotrexato) y el gen neo (para la seleccion de G418).

45 En un sistema ilustrativo para la expresion recombinante de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de longitud completa o una porcion de union a antfgeno del mismo), un vector de expresion recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo se introduce en celulas CHO dhfr-mediante transfeccion mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresion recombinante, los genes de la cadena pesada y ligera del anticuerpo estan cada uno operativamente enlazados a elementos reguladores de 50 potenciador/promotor (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares tales como un elemento regulador de potenciador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador de potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para conducir altos niveles de transcripcion de los genes. El vector de expresion recombinante tambien porta un gen DHFR, que permite la seleccion de celulas CHO que han sido transfectadas con el vector utilizando la seleccion/amplificacion con metotrexato. Las celulas huesped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir 55 la expresion de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Se utilizan tecnicas de biologfa molecular estandares para preparar el vector de expresion recombinante, transfectar las celulas huesped, seleccionar los transformantes, cultivar las celulas huesped, y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Por ejemplo, algunos anticuerpos se pueden aislar mediante cromatograffa de afinidad con una Protefna A o Protefna G. El documento US 6.602.503 tambien describe metodos ilustrativos para la expresion y purificacion 60 de un anticuerpo de union a VLA-4.

Los anticuerpos tambien pueden incluir modificaciones, por ejemplo, modificaciones que alteran la funcion de Fc, por ejemplo, para disminuir o eliminar la interaccion con un receptor de Fc o con C1q, o ambos. Por ejemplo, la region constante de IgG1 humana se puede mutar en uno o mas residuos, por ejemplo, uno o mas de los residuos 234 y 5 237, por ejemplo, de acuerdo con la numeracion en la Patente de Estados Unidos N.° 5.648.260. Otras modificaciones ilustrativas incluyen las descritas en la Patente de Estados Unidos N.° 5.648.260.

Para algunos anticuerpos que incluyen un dominio Fc, el sistema de produccion de anticuerpos puede estar disenado para sintetizar anticuerpos en los que esta glicosilada la region Fc. Por ejemplo, el dominio Fc de 10 moleculas de IgG esta glicosilado en la asparagina 297 en el dominio CH2. Esta asparagina es el sitio para la modificacion con oligosacaridos de tipo biantenario. Esta glicosilacion participa en funciones efectoras mediadas por receptores Fcy y complemento C1q (Burton y Woof (1992) Adv. Immunol. 51:1-84; Jefferis et al. (1998) Immunol. Rev. 163:59-76). El dominio Fc puede ser producido en un sistema de expresion de mamffero que glicosila adecuadamente el residuo correspondiente a la asparagina 297. El dominio Fc tambien puede incluir otras 15 modificaciones pos-traduccionales eucariotas.

Los anticuerpos tambien pueden ser producidos por un animal transgenico. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N.° 5.849.992 describe un metodo para expresar un anticuerpo en la glandula mamaria de un mamffero transgenico. Se construye un transgen que incluye un promotor especffico para la leche y acidos nucleicos que 20 codifican el anticuerpo de interes y una secuencia senal para la secrecion. La leche producida por las hembras de tales mamfferos transgenicos incluye, secretado en su interior, el anticuerpo de interes. El anticuerpo puede ser purificado de la leche, o para algunas aplicaciones, se puede utilizar directamente.

Como se usa en el presente documento, los anticuerpos de union a VLA-4 de la divulgacion pueden ser anticuerpos 25 de union a VLA-4 sustancialmente de longitud completa o fragmentos funcionales de los mismos. Por ejemplo, si un fragmento de un anticuerpo de union a VLA-4 es suficiente para permitir la union especffica por un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4, es un anticuerpo de union a VLA-4 funcional y se puede utilizar en los metodos y kits de la divulgacion. Un experto en la tecnica sera capaz de identificar los fragmentos de anticuerpos de union a VLA-4 y determinar si un fragmento de anticuerpo de union a VLA-4 es un fragmento de 30 anticuerpo de union a VLA-4 funcional, utilizando solo procesos de rutina y ensayos de union. Por lo tanto, las descripciones y ejemplos de metodos de uso de anticuerpos de union a VLA-4 inmovilizados y no inmovilizados que se proporcionan en el presente documento, se aplican tambien al uso de fragmentos de anticuerpos de union a vLA- 4 inmovilizados y no inmovilizados funcionales.

35 Marcadores y deteccion

Los aspectos de la divulgacion incluyen el uso de anticuerpos de protefnas anti-terapeuticas, no inmovilizados (por ejemplo, anticuerpos de union a VLA-4) como restos de deteccion para evaluar la presencia y/o el nivel de actividad de union soluble que esta unido a un anticuerpo inmovilizado contra una protefna terapeutica (por ejemplo, un 40 anticuerpo de union a VLA-4 diana). Los metodos para evaluar la presencia y/o el nivel de actividad de union soluble pueden incluir el uso de uno o mas restos de deteccion marcados (por ejemplo, un anticuerpo de union a VLA-4 que contiene o esta unido a un marcador detectable). Un marcador detectable se define como cualquier resto que se puede detectar utilizando un ensayo. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos funcionales de la divulgacion pueden ser acoplados a los agentes de marcado especfficos para detectar la union de acuerdo con procesos de 45 acoplamiento estandares. Se puede utilizar una amplia diversidad de marcadores detectables tales como los que proporcionan una deteccion directa (por ejemplo, un marcador radiactivo, un fluoroforo [por ejemplo, protefna verde fluorescente (GFP), protefna roja fluorescente (RFP), etc.], un cromoforo, un marcador denso optico o electronico, etc.) o una deteccion indirecta (por ejemplo, una etiqueta de enzima tal como peroxidasa de rabano picante, etc.). Los ejemplos no limitantes de marcadores detectables que han sido unidos a o incorporados en anticuerpos 50 incluyen: enzimas, radiomarcadores, marcadores fluorescentes, moleculas fosforescentes, moleculas quimioluminiscentes, cromoforos, moleculas luminiscentes, moleculas de fotoafinidad, y partfculas de color o ligandos tales como biotina, etc. Ademas, los metodos de deteccion de la divulgacion pueden incluir metodos de electroquimioluminiscencia (ECL).

55 Se puede utilizar una diversidad de metodos para detectar un marcador, dependiendo de la naturaleza del marcador y otros componentes del ensayo. Los marcadores pueden ser detectados directamente a traves de densidad optica o electronica, emisiones radiactivas, transferencias de energfa no radiactiva, etc., o pueden ser detectados indirectamente con conjugados de anticuerpos, conjugados de estreptavidina-biotina, etc. Muchos marcadores detectables adicionales son conocidos en la tecnica, como lo son los metodos para su fijacion a los anticuerpos.

Los anticuerpos marcados de la divulgacion pueden ser anticuerpos que se utilizan in vitro, por ejemplo, en un inmunoensayo tal como un ELISA. Tales anticuerpos marcados de forma detectable pueden ser anticuerpos que tienen un marcador detectable incorporado en el anticuerpo, o pueden ser anticuerpos que estan enlazados a un ligando de union secundario y/o a una enzima (una etiqueta de enzima) que generaran un producto coloreado tras el 5 contacto con un sustrato cromogenico. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen ureasa, fosfatasa alcalina, hidrogenoperoxidasa (de rabano picante) o glucosa oxidasa. Los ligandos de union secundarios preferidos son compuestos de biotina y/o de avidina y estreptavidina. El uso de tales marcadores es bien conocido por los expertos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en las Pat. de Estados Unidos N.°

3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241

10

Se conocen en la tecnica numerosos metodos para la fijacion o conjugacion de un anticuerpo a su marcador detectable. Un metodo de fijacion puede incluir el uso de un complejo de quelato metalico que emplea, por ejemplo, un agente quelante organico tal como anhfdrido de acido dietilentriaminopentaacetico (DTPA); acido etilentriaminetetraacetico; N-cloro-p-toluenosulfonamida; y/o tetracloro-3.alfa-6.alfa. difenilglicouril-3 fijado al 15 anticuerpo (Pat. de Estados Unidos N.° 4.472.509 y 4.938.948). Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden hacer reaccionar con una enzima en presencia de un agente de acoplamiento tal como glutaraldehfdo o peryodato. Los anticuerpos pueden marcarse con marcadores de fluorescefna en presencia de estos agentes de acoplamiento o mediante la reaccion con un isotiocianato. En otras realizaciones, los anticuerpos pueden marcarse mediante derivatizacion, por ejemplo mediante la introduccion selectiva de grupos sulfhidrilo en la region Fc del anticuerpo, 20 utilizando condiciones de reaccion que no alteren el sitio de reconocimiento de anticuerpos.

La deteccion del marcador detectable en un ensayo de la divulgacion tambien se denomina en el presente documento como detectar la "senal". Los metodos para detectar la senal en un inmunoensayo se conocen bien en la tecnica. En algunas realizaciones importantes de la invencion, la senal de ensayo puede ser detectada utilizando un 25 lector de placas de multiples pocillos (por ejemplo, lector de microplacas) para evaluar la cantidad y/o ubicacion de una senal. La deteccion de la senal puede ser la deteccion optica u otros medios de deteccion adecuados para detectar un marcador detectable utilizado en la divulgacion. Los metodos adicionales para la deteccion de marcadores son bien conocidos en la tecnica y se pueden utilizar en metodos de la divulgacion. Los metodos de la divulgacion incluyen ELISA que tienen una sensibilidad para la deteccion de un anticuerpo que se une 30 especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4, en los que la sensibilidad es al menos aproximadamente 1000 ng, 500 ng o 50 ng. En realizaciones preferidas, la sensibilidad del ELISA para la deteccion de un anticuerpo que se une especfficamente a un anticuerpo de union a VLA-4 es al menos aproximadamente 500 ng.

En general, la deteccion de la formacion de inmunocomplejos se puede lograr a traves de la aplicacion de 35 numerosos enfoques. Estos metodos se basan generalmente en la deteccion de una etiqueta o marcador tal como cualquiera de las etiquetas radiactivas, fluorescentes, biologicas y enzimaticas. Las patentes de Estados Unidos concernientes al uso de tales marcadores incluyen las Pat. de Estados Unidos N.°

3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. Por supuesto, se pueden encontrar ventajas adicionales a traves del uso de un ligando de union secundario tal como una disposicion de union de un 40 segundo anticuerpo y/o ligando de biotina/avidina tal como se conoce en la tecnica.

Se debe apreciar que las tecnicas descritas en el presente documento para obtener y producir un anticuerpo de union a vLA4 (por ejemplo, natalizumab) tambien se pueden utilizar para obtener y producir un anticuerpo de referencia que se une al anticuerpo de union a VLA-4 con alta afinidad (por ejemplo, un anticuerpo de union a 45 natalizumab de alta afinidad (por ejemplo, 12C4).

Kits

La divulgacion tambien se refiere, en parte, a kits para someter a ensayo la presencia de una respuesta inmune a un 50 anticuerpo de union a VLA-4 en una muestra. Un ejemplo de un kit de este tipo puede incluir los anticuerpos mencionados anteriormente, incluyendo, pero no limitados a Natalizumab u otro anticuerpo de union a VLA-4, o un fragmento del mismo. Un kit puede incluir anticuerpos marcados y/o no marcados de forma detectable y puede incluir disoluciones y compuestos marcar de forma detectable un anticuerpo. Un kit de la divulgacion puede incluir tambien uno o mas de los siguientes componentes: placas, pipetas, viales, marcador detectable, disoluciones (por 55 ejemplo, disoluciones de tampon de bloqueo, tampon de lavado, de union, disoluciones diluyentes, etc.), muestras de control positivas y/o negativas y soluciones. Un kit de la divulgacion tambien puede incluir instrucciones por escrito para el uso del kit para la identificacion de una respuesta inmune a un anticuerpo de union a VLA-4 en una muestra biologica. Los kits de la divulgacion tambien pueden incluir componentes adicionales utiles en la realizacion de ensayos de control de ELISA positivo y/o negativo. Un kit de la divulgacion tambien puede incluir equipos tales 60 como lectores de placas y/o instrumentacion robotica para su uso en los metodos de la invencion.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Ensayo de inmunogenicidad de Natalizumab

El formato y diseno del ensayo se baso en un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) puente. Se utilizaron reactivos y procesos estandares adecuados para los ensayos de puente. En resumen, utilizando procesos estandares natalizumab fue adsorbido a la superficie de placas de microtitulacion seguido de una etapa de bloqueo para minimizar la union no especffica de anticuerpos sericos. Se diluyeron controles y muestras y se anadieron a los 10 pocillos. Utilizando procesos estandares, la deteccion de anticuerpos anti-natalizumab unidos se logro mediante la incubacion de las placas con biotina-natalizumab seguido de estreptavidina fosfatasa alcalina (SA-AP). El desarrollo de color fue proporcional a la cantidad de anticuerpo anti-natalizumab unido.

El natalizumab se diluyo a una concentracion especffica en tampon de revestimiento de placa y se incubo en placas 15 de microtitulacion de 96 pocillos de ELISA durante la noche a temperatura ambiente. El volumen recomendado era de 100 pl/pocillo. Las placas se lavaron con tampon de lavado y despues se incubaron con tampon de bloqueo a temperatura ambiente durante >1 h. El volumen de tampon de bloqueo era de 200 pl/pocillo. Las placas se lavaron con tampon de lavado y luego se incubaron con muestras de control de calidad y sujeto (paciente) diluidas en la relacion 1:10 en diluyente de ensayo con o sin natalizumab anadido (100 pg/ml de concentracion final) a temperatura 20 ambiente durante 2 h ± 15 min. El diluyente de ensayo que contiene natalizumab anadido representaba una etapa confirmatoria. El volumen para el diluyente de ensayo era de 100 pl/pocillo. Las placas se lavaron a continuacion en tampon de lavado y luego se incubaron con SA-AP a temperatura ambiente durante 30-35 min. El volumen para la incubacion con SA-AP era de 100 pl/pocillo. Las placas se lavaron a continuacion en tampon de lavado y despues se incubaron con sustrato de AP, fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) a temperatura ambiente durante 45-50 min. El 25 volumen para la incubacion en el sustrato de AP era de 100 pl/pocillo. Despues se anadio solucion de parada (por ejemplo, H2SO4, etc.) directamente a la mezcla de reaccion del sustrato y la densidad optica (DO) se leyo a 405 nm.

Para la aceptacion del ensayo, los controles positivos y negativos tenfan que proporcionar resultados dentro de un valor y una precision predefinidos. Para la evaluacion de los resultados de las muestras de sujetos (pacientes), las 30 muestras fueron juzgadas como negativas si su valor de DO cayo por debajo de la muestra de control de calidad de corte negativo definido. Las muestras tambien se determinaron negativas si su valor de DO se encontraba por encima de la muestra de control de calidad de corte negativo definido y la inhibicion de la senal de la muestra del sujeto (paciente) mediante natalizumab anadido en la etapa confirmatoria era menor que un porcentaje predefinido. Las muestras se determinaron positivas si su valor de DO se encontraba por encima de la muestra de control de 35 calidad de corte negativo definido y la inhibicion de la senal de la muestra del sujeto (paciente) mediante natalizumab anadido en la etapa confirmatoria era mayor que o igual a un porcentaje predefinido.

Ejemplo 2: Ensayo de cribado de una respuesta inmune a un anticuerpo VLA-4

40 Se realizo un ensayo de cribado (segun se describe anteriormente) en muestras de sujetos a los que se habfa administrado natalizumab. La presencia de una respuesta inmune a un anticuerpo VLA-4 se examino en pacientes que habfan sido sometidos a la administracion de natalizumab.

Las muestras biologicas de sujetos a los que se habfa administrado natalizumab se sometieron a ensayo para 45 determinar la presencia de un anticuerpo soluble que se une especfficamente a natalizumab utilizando los metodos descritos en el Ejemplo 1.

Los ensayos inclufan el uso de un mAb de alta afinidad como control positivo. El mAb de alta afinidad detecto anticuerpos de union (por ejemplo, anticuerpos que se unen a natalizumab) que estaban presentes en muestras 50 biologicas de sujetos. El nivel de corte negativo se determino a la concentracion mas baja que restituyo una exactitud/precision aceptable (25 %/25 %); 50 ng/ml en suero al 10 %. La sensibilidad del mAb era de 500 ng/ml en suero puro (no diluido). Con respecto a la sensibilidad, se determino que el mAb detectaba Ab (anticuerpos) anti- natalizumab, pero era insensible a anticuerpos monoclonales humanos irrelevantes. Se determino que la interferencia con el mAb por otras moleculas o componentes de las muestras inclufa la interferencia por parte del 55 farmaco libre en una relacion mAb:farmaco mayor que 1:2. La Figura 1 ilustra los efectos de la interferencia de natalizumab libre con el inmunoensayo para los anticuerpos anti-natalizumab. Tambien se encontro que el factor reumatoide interferfa con el ensayo.

Ademas del ensayo de cribado descrito en los Ejemplos 1 y 2, tambien se realizaron ensayos de caracterizacion 60 para evaluar la union en los ensayos de cribado. Las muestras biologicas de sujetos a los que se habfa administrado

natalizumab se sometieron a ensayo en cuanto la presencia de un anticuerpo soluble que se une especfficamente a natalizumab utilizando un ensayo de bloqueo de citometrfa de flujo. Como control positivo se utilizo un mAb de alta afinidad. El ensayo detecto anticuerpos de bloqueo. El nivel de corte negativo para el mAb utilizado se determino en 3-4 desviaciones estandares por encima de la media de los niveles medidos en sueros obtenidos de pacientes no 5 dosificados. Habfa una tasa de falsos positivos del 5 % y la sensibilidad del ensayo era de 500 ng/ml de suero puro. Se sometio a ensayo la especificidad del mAb y se determino que el mAb detectaba anticuerpos anti-natalizumab, pero se encontro que era insensible a anticuerpos monoclonales humanos irrelevantes. Tambien se examino la interferencia libre de farmacos con el ensayo. El ensayo mostro la presencia de interferencia libre de farmacos. Los resultados de una evaluacion de la interferencia en el ensayo de bloqueo por parte del farmaco libre se muestran en 10 la Figura 2.

Bloqueo de ensayo para natalizumab

Resultados

15

Se compararon los resultados positivos de los ensayos de cribado y bloqueo. Habfa 217 ensayos de bloqueo positivos y 222 ensayos de cribado positivos, por lo tanto, habfa una diferencia de 5 % y un porcentaje de concordancia de 98 %. Por consiguiente, el ensayo de cribado proporciona una medida precisa de la respuesta inmune de un sujeto a un anticuerpo de union a VLA-4 terapeutico.

20

Ejemplo 3

Se realizo un ensayo de cribado (segun se describe en los Ejemplos 1 y 2) en muestras de 625 sujetos a los que se habfa administrado natalizumab. La presencia de una respuesta inmune a un anticuerpo VLA-4 se examino en 25 pacientes que habfan sido sometidos a la administracion de natalizumab. La incidencia de anticuerpos contra natalizumab en los pacientes examinados era: 91 % (569 pacientes) negativos a anticuerpos y 9 % (56 pacientes) positivos a "anticuerpo de union" en cualquier punto temporal, con 3 % (19 pacientes) positivos "transitoriamente" y 6 % (37 pacientes) positivos a "persistentemente". Los pacientes positivos a transitorios tenfan anticuerpos detectables (a una concentracion de >0,5 pg/ml) en un solo punto temporal, pero negativos para anticuerpos en todos los otros 30 puntos temporales. Los pacientes positivos a anticuerpos persistentes tenfan anticuerpos detectables en dos o mas puntos temporales que estaban separados por al menos 42 dfas, o en un solo punto temporal, sin muestras de seguimiento sometidas a ensayo.

La Figura 3 muestra el tiempo de primeros resultados positivos en los pacientes que desarrollaron cualquier 35 anticuerpo. Un seis por ciento de los pacientes desarrollo anticuerpos "persistentes" contra natalizumab. Mas del 90 % de los pacientes positivos a persistentes tenfan primero anticuerpos detectables en la semana 12. Ningun sujeto se convirtio en positivo para los anticuerpos persistentes despues de la semana 36. Los pacientes transitorios positivos tenfan anticuerpos detectables en la semana 12, pero fueron posteriormente anticuerpos negativos.

40 Se analizaron los resultados para determinar la presencia de un efecto de los anticuerpos sobre la tasa de recafda del trastorno original en los pacientes tratados. La Figura 4 ilustra el efecto general de anticuerpos en la tasa de recafda. La tasa de recafda tambien se evaluo para los sujetos con respecto al tiempo transcurrido desde la administracion de natalizumab. Las Figuras 5A-D representan la tasa de recafda a los 0-3 meses, 3-6 meses, 6-9 meses y 9-12 meses, respectivamente.

45

Resultados

Los resultados indicaron que no hay ningun efecto aparente de anticuerpos durante los tres primeros meses de tratamiento. De tres a seis meses, los pacientes positivos a anticuerpos "transitorios" mostraron una disminucion en 50 la eficacia del tratamiento con natalizumab. Los pacientes positivos a anticuerpos "persistentes" mostraron una perdida de eficacia del tratamiento con natalizumab. De seis a doce meses, se restablecio una plena eficacia en los pacientes positivos a anticuerpos "transitorios", pero no en pacientes positivos a anticuerpos "persistentes". Por consiguiente, es importante identificar a los pacientes con anticuerpos transitorios-positivos como una poblacion diana para la terapia continua con anticuerpos de union a VLA-4.

55

EQUIVALENTES

Los terminos y expresiones que se han empleado se utilizan como terminos de descripcion y no de limitacion, y no existe intencion en el uso de tales terminos y expresiones de excluir ningun equivalente de las caracterfsticas 60 mostradas y descritas o partes de las mismas.

Claims

REIVINDICACIONES

I. Un metodo para detectar una respuesta inmune clfnicamente significativa de un anticuerpo de union a VLA-4 en un sujeto, comprendiendo el metodo determinar si una muestra biologica de un sujeto a quien se ha

5 administrado un anticuerpo de union a VLA4 contiene al menos un nivel umbral, clfnicamente significativo, de 500 ng/ml de un anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4, donde la presencia de al menos el nivel umbral del anticuerpo soluble es indicativa de una disminucion de la eficacia o la falta de eficacia del anticuerpo de union a VLA-4.

10 2. El metodo de la reivindicacion 1, donde el nivel de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de

union a VLA-4 se determina:

determinando un nivel de actividad de union de un anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 en una primera alfcuota de la muestra biologica; y 15 determinando si la actividad de union es especffica para el anticuerpo de union a VLA-4.
3. El metodo de la reivindicacion 2, donde la especificidad de la actividad de union soluble se determina

en una segunda alfcuota de la muestra biologica.

20 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde un nivel de anticuerpo soluble que

se une al anticuerpo de union a VLA-4 en la muestra biologica se determina comparando el nivel de actividad de union con respecto a la actividad de union de un anticuerpo de union a VLA-4 marcado medido en presencia de dos o mas cantidades diferentes de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado.

25 5. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde un nivel de anticuerpo soluble que

se une al anticuerpo de union a VLA-4 en la muestra biologica se determina comparando los niveles de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-4 inmovilizado medidos en presencia de dos o mas cantidades diferentes de anticuerpo de union a VLA-4 soluble.

30 6. El metodo de la reivindicacion 4 o 5, donde un primer nivel de actividad de union a un anticuerpo de

union a VLA-4 marcado, medido en presencia de una primera cantidad de VLA-4 no marcado, se compara con un segundo nivel de actividad de union a un anticuerpo de union a VLA-4 marcado, medido en presencia de una segunda cantidad de anticuerpo de union a VLA-4 no marcado.

35 7. El metodo de la reivindicacion 6, donde el primer y segundo niveles de actividad de union se

determinan en una primera y segunda alfcuotas de la muestra biologica.
8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la cantidad de anticuerpo soluble al anticuerpo de union a VLA-4 se determina utilizando un ensayo ELISA de puente.

40
9. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde un primer nivel de actividad de union al anticuerpo de union a VLA-4 se determina en un primer inmunoensayo para una primera alfcuota de la muestra biologica, y un segundo nivel de actividad de union al anticuerpo de union a VLA-4 se determina en un segundo inmunoensayo para una segunda alfcuota de la muestra biologica, donde el segundo inmunoensayo se enriquece

45 con una mayor cantidad de anticuerpo de union a VLA-4 soluble no marcado que el primer inmunoensayo, y donde la presencia en la muestra biologica de al menos un nivel de umbral de anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4 se indica si el primer nivel de actividad de union es mayor que un nivel de referencia de la actividad de union para 500 ng/ml de un anticuerpo soluble que se une al anticuerpo de union a VLA-4, y el segundo nivel de la actividad de union es inferior a un porcentaje predeterminado del primer nivel de la actividad de union.

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10. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el anticuerpo de union a VLA-4 es un anticuerpo monoclonal murino inmovilizado con respecto a VLA-4.

II. El metodo de la reivindicacion 10, donde el anticuerpo de union a VLA-4 es una forma humanizada del 55 anticuerpo murino mAb 21.6.
12. El metodo de la reivindicacion 11, donde el anticuerpo de union a VLA-4 es natalizumab.
13. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, donde el primer y segundo 60 inmunoensayos son ensayos ELISA de puente.
14. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, donde el primer y segundo ensayos

comprenden un anticuerpo de union a VLA-4 no marcado inmovilizado y un anticuerpo de union a VLA-4 marcado

soluble, donde el anticuerpo de union a VLA-4 marcado soluble esta marcado con una enzima, un marcador

5 fluorescente, o un marcador radioactivo.
15. El metodo de la reivindicacion 13 o 14, donde el primer y el segundo inmunoensayos se llevan a cabo en volumenes de reaccion en paralelo en un unico sustrato de reaccion.

10 16. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde la muestra biologica es una

muestra de suero.
17. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el sujeto es un paciente humano.

15 18. El metodo de la reivindicacion 17, donde el paciente tiene esclerosis multiple, artritis reumatoide, o

enfermedad de Crohn.
19. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, donde el metodo comprende las etapas de:

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revestir pocillos de ensayo con natalizumab;

incubar una muestra de control, una muestra de cribado y una muestra de competencia en pocillos de ensayo separados;

anadir natalizumab biotinilado a las muestras en los pocillos de ensayo; y 25 detectar el natalizumab biotinilado utilizando un ensayo con peroxidasa de rabano picante.
20. El metodo de la reivindicacion 19, donde se utiliza natalizumab a una concentracion de 0,25 pg/ml para revestir los pocillos de ensayo.

30 21. El metodo de la reivindicacion 19 o 20, donde la muestra de competencia contiene natalizumab

soluble no marcado a una concentracion final de 100 pg/ml.