ES2532896T5 - Péptidos del MHC de clase II novedosos y potentes derivados de survivina y neurocan - Google Patents

Description

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DESCRIPCIÓN

Péptidos del MHC de clase II novedosos y potentes derivados de survivina y neurocan

La presente invención se refiere a péptidos, ácidos nucleicos y células para su uso en procedimientos inmunoterapéuticos. En particular la presente invención se refiere a la inmunoterapia contra el cáncer. La presente 5 invención se refiere asimismo a epítopos peptídicos de linfocitos T citotóxicos (CTL) asociados a tumores y derivados de la survivina, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores que pueden servir como principios activos farmacéuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales. La presente invención se refiere específicamente a una nueva secuencia peptídica derivada de moléculas HLA de clase II de células tumorales humanas que puede ser utilizada en composiciones vacunales para

10 desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales.

Antecedentes de la invención

Los gliomas son tumores cerebrales originados en las células gliales del sistema nervioso. Las células gliales, llamadas por lo común neuroglía o simplemente glía, son células no neuronales que proporcionan soporte y nutrición, mantienen la homeostasia, forman la mielina e intervienen en la transmisión de señales en el sistema 15 nervioso. Los dos tipos más importantes de glioma son el astrocitoma y el oligodendroglioma, llamados así por el tipo de célula glial que los origina, esto es, astrocitos y oligodendrocitos. En el grupo de los astrocitomas se encuentra el glioblastoma multiforme (denominado en lo sucesivo glioblastoma) que es el tumor cerebral maligno más frecuente en adultos pues supone alrededor del 40% de los tumores cerebrales malignos y alrededor del 50% de los gliomas (CBTRUS, 2006). El glioblastoma invade con agresividad el sistema nervioso central y entre todos los 20 gliomas es el que ostenta el nivel más alto de malignidad (grado IV). Pese a los avances en el tratamiento logrados merced a mejoras en las técnicas de neuroimagen, la microcirugía y las opciones terapéuticas como la temozolomida o la radiación, el glioblastoma sigue siendo incurable (Macdonald, 2001; Burton and Prados, 2000; Prados and Levin, 2000). La mortalidad causada por este tumor cerebral es muy alta: la esperanza de vida media oscila entre 9 y 12 meses desde el diagnóstico. La supervivencia a 5 años durante el período de observación

25 comprendido entre 1986 y 1990 fue del 8,0%. Hasta la fecha, la supervivencia cinco años después del tratamiento agresivo que incluye la resección macroscópica del tumor sigue siendo inferior al 10%(Burton and Prados, 2000; Nieder et al., 2000; Napolitano et al., 1999; Dazzi et al., 2000). A tenor de lo anterior queda patente la necesidad de nuevos procedimientos terapéuticos eficaces.

El grado de indiferenciación de las células tumorales del glioblastoma es el más elevado de todos los tumores

30 cerebrales, lo que explica su alto potencial de migración y proliferación y su elevada invasividad y, por ende, su pronóstico funesto. Los glioblastomas provocan la muerte por el crecimiento rápido, agresivo e infiltrante que demuestran en el cerebro. El crecimiento infiltrante es el responsable del carácter inoperable de estos tumores. Los glioblastomas también son relativamente resistentes a la radioterapia y la quimioterapia, por lo que la recurrencia postratamiento es elevada. Además, la respuesta inmunitaria contra las células neoplásicas resulta claramente

35 ineficaz a la hora de lograr su erradicación total después de la resección y la radioterapia (Roth and Weller, 1999; Dix et al., 1999; Sablotzki et al., 2000).

El glioblastoma se clasifica en primario (de novo) y secundario dependiendo de las diferencias en el mecanismo génico de la transformación maligna que experimentan los astrocitos indiferenciados o las células precursoras gliales. El glioblastoma secundario afecta a personas jóvenes menores de 45 años. A lo largo de 4 o 5 años, en

40 promedio, el glioblastoma secundario evoluciona de un astrocitoma de bajo grado a un astrocitoma indiferenciado. Por el contrario, el glioblastoma primario afecta sobre todo a personas más mayores, con una media de edad de 55 años. Por norma general el glioblastoma primario aparece como un glioblastoma fulminante caracterizado por la progresión del tumor en 3 meses desde el estado sin anomalías clínicas ni patológicas (Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39 (IARC Press, Lyon, Francia, 2000)).

45 El glioblastoma migra a lo largo de los nervios mielinizados y se disemina ampliamente por el sistema nervioso central. En la mayoría de casos el tratamiento quirúrgico sólo consigue un efecto terapéutico limitado (Neurol. Med. Chir. (Tokio) 34, 91-94, 1994; Neurol. Med. Chir. (Tokio) 33, 425-458, 1993; Neuropathology 17, 186-188, 1997) (Macdonald, 2001; Prados and Levin, 2000).

Las células del glioma maligno eluden la detección del sistema inmunitario del anfitrión mediante la producción de

50 agentes inmunodepresores que alteran la proliferación de los linfocitos T y la producción por parte de estos de la citocina inmunoestimulante IL-2 (Dix et al., 1999).

Las neoplasias intracraneales pueden surgir en cualquiera de las estructuras o tipos celulares del SNC: encéfalo, meninges, glándula pituitaria, cráneo, e incluso tejido embrionario residual. La incidencia anual total de tumores cerebrales primarios en Estados Unidos es de 14 casos por 100.000. Los tumores cerebrales primarios más 55 frecuentes son los meningiomas, que representan el 27% de los tumores cerebrales primarios, y los glioblastomas, que suponen el 23% del total (los glioblastomas suponen el 40% de los tumores cerebrales malignos en los adultos). Muchos de esos tumores son agresivos y presentan un alto grado. En la población pediátrica los tumores cerebrales primarios son los tumores sólidos más frecuentes y la segunda causa de muerte por cáncer después de la leucemia.

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A día de hoy prosigue la búsqueda de un tratamiento eficaz contra el glioblastoma. Para combatir tales células neoplásicas se está estudiando la inmunoterapia, o el tratamiento basado en el reclutamiento del sistema inmunitario. Los primeros resultados alentadores en el tratamiento del glioblastoma los obtuvo Northwest Therapeutics con "DCVax Brain" en estudios inmunoterapéuticos en humanos, en el curso de los cuales se pudieron

5 generar respuestas de CTL específicas de antígeno que prolongaron la mediana del tiempo de supervivencia respecto al tratamiento estándar con una toxicidad mínima (Heimberger et al., 2006).

Carcinoma colorrectal

Según la Sociedad Americana contra el Cáncer (American Cancer Society), el cáncer colorrectal (CCR) es el tercer tipo de cáncer más habitual en Estados Unidos puesto que afecta a más de 175.000 nuevos pacientes cada año. En 10 Estados Unidos, Japón, Francia, Alemania, Italia, España y Reino Unido el número de pacientes afectados supera los 480.000. Ello lo convierte en una de las principales causas de muerte por cáncer en los países industrializados. La supervivencia relativa a 1 y 5 años de los enfermos de cáncer colorrectal asciende al 84% y el 64%. Pasados los cinco años, la supervivencia sigue descendiendo hasta el 57% al cabo de diez años del diagnóstico. Cuando el cáncer colorrectal se detecta en un estadio inicial y localizado la supervivencia a 5 años es del 90%, pero sólo el

15 39% de los casos se detectan en ese estadio, principalmente por el escaso alcance de los programas de detección sistemática. Cuando el cáncer alcanza dimensiones regionales y afecta ya a órganos adyacentes o ganglios linfáticos la supervivencia a 5 años disminuye hasta el 68%. Y en el caso de las personas con metástasis a distancia la supervivencia a 5 años vista se reduce al 10%.

Las investigaciones sugieren que el cáncer colorrectal tiene su origen en la interacción entre factores hereditarios y

20 ambientales. En la mayor parte de los casos los pólipos adenomatosos parecen ser los precursores de los tumores colorrectales, aunque el proceso de transición puede durar muchos años. El principal factor de riesgo del cáncer colorrectal es la edad, ya que el 90% de los casos se diagnostican a partir de los 50 años. Otros factores de riesgo referidos por la American Cancer Society son el consumo de alcohol, la alimentación rica en grasas o carnes rojas y una ingesta insuficiente de frutas y verduras. La incidencia sigue aumentando especialmente en zonas como Japón,

25 donde como posibles causas se barajan la adopción de la alimentación de estilo occidental, con la ingesta excesiva de grasas y carne y la reducción del consumo de fibra. Con todo, la incidencia no aumenta al mismo ritmo que en el pasado, lo cual se atribuye al aumento de las exploraciones preventivas y a la extirpación de los pólipos que de lo contrario se habrían convertido en tumores malignos.

A semejanza de la mayoría de los tumores sólidos el tratamiento de primera línea consiste en cirugía, aunque sus

30 ventajas siguen estando limitadas a los pacientes en fase inicial y una parte importante de los casos se diagnostica cuando la enfermedad ya se encuentra en fases avanzadas. El tratamiento de referencia contra el cáncer colorrectal avanzado consiste en regímenes de quimioterapia basados en el fluorouracilo. Los protocolos denominados FOLFOX (leucovorina/5-FU más oxaliplatino en infusión) y FOLFIRI (irinotecán y leucovorina en bolo y 5-FU en infusión continua) constituyen la mayor parte de tales regímenes.

35 La introducción de los citotóxicos de tercera generación como el irinotecán y el oxaliplatino ha renovado las esperanzas de lograr mayor eficacia, pero el pronóstico sigue siendo relativamente malo y el índice de supervivencia suele rondar generalmente los 20 meses cuando la enfermedad es metastásica. Por tanto, sigue existiendo una importante necesidad de mejorar los resultados contra la enfermedad.

Recientemente ha aparecido una nueva generación de medicamentos, agentes dirigidos contra moléculas, como por

40 ejemplo Avastin (bevacizumab) y Erbitux (cetuximab), y cerca de 40 compuestos contra diferentes estadios del cáncer colorrectal se hallan en las últimas etapas de desarrollo clínico. Las combinaciones de varios de estos compuestos aumentan las posibles opciones de tratamiento que cabe esperar en el futuro. La gran mayoría de las sustancias se encuentra en la fase II de desarrollo clínico, siendo el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) la diana de la mayor parte de ellos, puesto que alrededor del 80% de los pacientes afectados por el cáncer

45 colorrectal presentan regulada al alza la expresión de dicho receptor.

En la actualidad se están efectuando ensayos clínicos con pacientes en estadio II que combinan la quimioterapia con los anticuerpos monoclonales (AcM) recientemente autorizados (cetuximab + irinotecán o FOLFOX4; bevacizumab en monoterapia o con FOLFOX4). Se prevén períodos de observación de tres o cuatro años para disponer de resultados estadísticamente significativos de dichos ensayos.

50 Los anticuerpos monoclonales (AcM) que actualmente se utilizan en oncología ofrecen en general buenas garantías de no interferir con la inmunoterapia activa. De hecho, existen datos preclínicos y clínicos (GABRILOVICH 1999) que apuntan a que la disminución del VEGF (lograda por el bevacizumab) contribuye de forma positiva a la activación de los linfocitos T por parte de las células dendríticas (Osada T, Chong G, Tansik R, Hong T, Spector N, Kumar R, Hurwitz HI, Dev I, Nixon AB, Lyerly HK, Clay T, Morse MA.The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell

55 and dendritic cells in cancer patients. 2008 Jan 10.).

Carcinoma de próstata y otros tumores

Con una cifra estimada de 27.050 fallecimientos en 2007, el cáncer de próstata es la principal causa de muerte por cáncer en varones. Aunque los índices de deceso se han reducido entre la población blanca y afroamericana desde principios de los 90, el nivel registrado entre los varones afroamericanos duplica con creces el de los hombres de raza blanca. El cáncer de próstata es el más diagnosticado en los varones. Por motivos que siguen sin estar claros, la incidencia es significativamente mayor entre los varones afroamericanos que entre los de raza blanca. La incidencia del cáncer de próstata ha cambiado notablemente durante los últimos 20 años: experimentó un rápido

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5 incremento entre 1988 y 1992 para reducirse drásticamente entre 1992 y 1995 y volvió a repuntar ligeramente desde 1995.Estas tendencias reflejan en gran parte el aumento de los programas de detección del cáncer de próstata mediante el análisis sanguíneo del antígeno específico de la próstata (PSA). El moderado incremento de la incidencia acaecido durante la última década probablemente pueda atribuirse a la generalización del reconocimiento preventivo del PSA entre los varones menores de 65 años. La incidencia del cáncer de próstata se ha estabilizado entre los mayores de 65 años. Los índices marcaron su máximo entre los hombres de raza blanca en 1992 (237,6 por cada 100.000 varones) y en 1993 entre los varones afroamericanos (342,8 por cada 100.000 varones).

El tratamiento del cáncer de próstata puede implicar la espera en observación, cirugía, radioterapia, ultrasonidos focalizados de alta intensidad (HIFU), quimioterapia, hormonoterapia o cierta combinación de los anteriores. La mejor opción depende de la fase de la enfermedad, de la escala de Gleason y del nivel de PSA. Otros factores

15 importantes incluyen la edad del varón, el estado general de salud y su actitud frente a los posibles tratamientos y los posibles efectos secundarios. Puesto que todos los tratamientos pueden provocar importantes efectos secundarios, como por ejemplo disfunción eréctil e incontinencia urinaria, los debates sobre dichos tratamientos suelen centrarse en equilibrar los objetivos de la terapia y las posibles alteraciones en el estilo de vida.

Cuando el cáncer se ha extendido fuera de la glándula prostática, las opciones de tratamiento cambian significativamente, por lo que la mayor parte de los médicos que tratan el cáncer de próstata utiliza una serie de nomogramas para pronosticar la probabilidad de la propagación. Los tratamientos consistentes en la espera en observación, HIFU, radioterapia, criocirugía y cirugía suelen ofrecerse a los varones cuyo cáncer permanece confinado en la próstata. La terapia hormonal y la quimioterapia suelen reservarse para los casos en que la enfermedad se ha extendido fuera de la próstata, aunque hay excepciones: la radioterapia puede utilizarse para

25 algunos tumores avanzados y la terapia hormonal se emplea para algunos tumores en fase inicial. La crioterapia, la terapia hormonal y la quimioterapia también pueden ofrecerse si el tratamiento inicial falla y el cáncer avanza.

En un número importante de pacientes con carcinoma de próstata que son sometidos a prostatectomía radical por la sospecha clínica de que el crecimiento sigue limitado al órgano, el análisis histológico confirmatorio de la preparación quirúrgica revela que el tumor está extendido a nivel local y se propaga fuera de los límites del órgano. Estos pacientes presentan un elevado riesgo de recidiva local precoz, normalmente detectable como un incremento de los niveles de PSA en términos de una recaída bioquímica. Las opciones terapéuticas en esta situación incluyen la radioterapia externa y la ablación hormonal. No obstante, el valor de estos enfoques terapéuticos, especialmente en lo que concierne a prolongar la supervivencia del paciente a largo plazo, no debe considerarse como probado. Además, deben tenerse en cuenta posibles complicaciones asociadas con el tratamiento, como, por ejemplo, el

35 desarrollo de estenosis uretral (radioterapia), la pérdida de la libido y la impotencia, el riesgo de reducción de las sales cálcicas del esqueleto que puede acarrear o agravar la osteoporosis y el notable incremento del riesgo de fracturas óseas patológicas (ablación hormonal).

Más del 90% de los casos de cáncer de próstata se descubren en los estadios local y regional. El índice de supervivencia relativa a 5 años de los pacientes diagnosticados en dichos estadios se aproxima al 100%. Durante los últimos 25 años, el índice de supervivencia a 5 años de todos los estadios combinados ha pasado del 69% a casi el 90%. Según los datos más recientes, la supervivencia relativa a 10 años es del 93%, mientras que a los 15 años es del 77%. Las espectaculares mejoras de la supervivencia, especialmente a 5 años, son atribuibles en parte a la mayor precocidad de los diagnósticos y a los avances del tratamiento. Con todo, la supervivencia desciende notablemente cuando el cáncer se ha extendido a otros tejidos y órganos.

45 Cáncer de pulmón

Se calcula que en 2007 se diagnosticarán 210.000 nuevos casos en Estados Unidos, cifra que supone en torno al 15% de los diagnósticos de cáncer. La incidencia está cayendo notablemente entre los hombres, desde un máximo de 102 casos por cada 100.000 varones en 1984 hasta 78,5 en 2003. En las mujeres está estabilizándose tras un largo período de incremento. Clínicamente el cáncer de pulmón se divide, a efectos de tratamiento, en dos grupos: el carcinoma microcítico de pulmón (13%) y el no microcítico (87%).

Al cáncer de pulmón se debe la mayor parte de fallecimientos relacionados con el cáncer, tanto en hombres como en mujeres. Se estima que en 2007 se producirán 160.390 fallecimientos, que representan alrededor del 29% del total de muertes por cáncer. Desde 1987, cada año han fallecido más mujeres a causa del cáncer de pulmón que del cáncer de mama. La tasa de mortalidad en la población masculina ha seguido cayendo notablemente entre 1991 y

55 2003, a un ritmo aproximado del 1,9% por año. La mortalidad por cáncer de pulmón entre las mujeres está estabilizándose, tras haber experimentado un aumento incesante durante varias décadas. Estas tendencias en la mortalidad por cáncer de pulmón reflejan el descenso del tabaquismo durante los últimos 30 años.

Las opciones de tratamiento vienen determinadas por el tipo (microcítico o no) y la fase del cáncer, e incluyen cirugía, radioterapia, quimioterapia y terapias biológicas dirigidas, como bevacizumab (Avastin®) y erlotinib (Tarceva®). La cirugía suele ser el tratamiento de elección para los cánceres localizados. Algunos estudios recientes indican que la tasa de supervivencia del cáncer de pulmón no microcítico en fase inicial mejora si tras la cirugía se aplica quimioterapia. Como la enfermedad suele estar extendida cuando se descubre, suelen utilizarse la radioterapia y la quimioterapia, a veces en combinación con la cirugía. La quimioterapia sola o combinada con

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5 radiación es el tratamiento elegido habitualmente para el carcinoma microcítico de pulmón. Con este régimen un alto porcentaje de pacientes experimentan remisión, que en algunos casos es duradera.

El índice de supervivencia relativa para el cáncer de pulmón después de 1 año se ha incrementado ligeramente desde el 37% en 1975-1979 hasta el 42% en 2002, en gran medida gracias a las mejoras en las técnicas quirúrgicas y las terapias combinadas. No obstante, el índice combinado de supervivencia a 5 años para todos los estadios es

10 tan solo del 16%. El índice de supervivencia es del 49% en los casos que son detectados cuando la enfermedad aún está localizada. Pero solo el 16% de los cánceres de pulmón se diagnostica en este estadio inicial.

Tabla 1: Estimación de los nuevos casos de cáncer y de los fallecimientos por sexo en Estados Unidos en 2007 (American Cancer Society. Cancer Facts & Figures, 2007. Atlanta: American Cancer Society, 2007.)

Localización

Estimación de nuevos casos Estimación de fallecimientos

Ambos sexos

Varones Mujeres Ambos sexos Varones Mujeres

Glioma y cerebro

20.500 11.170 9.330 12.740 7.150 5.590

Mama

180.510 2.030 178.480 40.910 450 40.460

Próstata

218.890 218.890 27.050 27.050

Esófago

15.560 12.130 3.430 13.940 10.900 3.040

Colon

112.340 55.290 57.050 52.180 26.000 26.180

Riñón

51.190 31.590 19.600 12.890 8.080 4.810

Páncreas

37.170 18.830 18.340 33.370 16.840 16.530

Carcinomas espinocelulares; neoplasias queratinocíticas de la piel

1.000.000 sin datos sin datos sin datos sin datos sin datos

Leucemia

44.240 24.800 19.440 21.790 12.320 9.470

Pulmón

213.380 114.760 98.620 160.390 89.510 70.880

Linfoma no hodgkiniano

63.190 34.210 28.990 18.660 9.600 9.060

Ovarios

22.430 22.430 15.280 15.280

Melanoma

59.940 33.910 26.030 8.110 5.220 2.890

15 Así pues, sigue existiendo la necesidad de nuevas opciones de tratamiento eficaces y seguras para el glioblastoma, tumor de próstata, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, carcinoma de células claras de células renales, cáncer de pulmón, del SNC, cáncer de ovarios, melanoma, cáncer de páncreas, carcinomas espinocelulares, leucemia y meduloblastoma, así como para otros tumores que muestran una sobreexpresión de survivina, de forma que se mejore el bienestar de los pacientes sin utilizar quimioterapia u otros fármacos que

20 puedan provocar efectos secundarios graves.

Sumario de la invención

Breve descripción de las figuras

La Fig. 1 muestra el resultado de la espectrometría de masas con ESI acoplada a cromatografía de líquidos que identifica el péptido asociado a tumor NCAN-001 en la muestra de glioblastoma GB1006.

25 La Fig. 2 representa el perfil de expresión del ARNm del gen NCAN que codifica el péptido asociado a glioblastoma NCAN-001. La expresión de este gen es nula o muy baja en tejidos normales pero muy elevada en muestras de glioblastoma (GB1006T a GB1011T; NCH359T y NCH361T).

La Fig. 3 representa el perfil de expresión relativo del ARNm del gen BIRC.5. La expresión de este gen es nula o muy baja en tejidos normales pero muy elevada en muestras tumorales.

30 Las Figs. 4a y 4b representan la presencia de linfocitos T CD4+ que segregan IFN específicamente contra el PSMA y la survivina en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en varios intervalos de tiempo tras la vacunación del paciente; análisis realizado con EliSpot de IFN. Intervalos de tiempo: antes de la vacunación (a) y después de 3 (b), 6 (c), 7 (d), 8. (e), 9 (f), 10 (g) y 11 (h) vacunaciones.

La Fig. 5 muestra la presencia de linfocitos T CD4+ que segregan IFN, IL-5, IL-10 y TNFα específicamente

35 contra la survivina en PBMC en tres intervalos de tiempo distintos tras la vacunación del paciente; análisis con un ensayo de ICS. Intervalos de tiempo: después de 1 (a), 3 (b) y 7 (c) vacunaciones.

La Fig. 6 proporciona la respuesta bioquímica de los pacientes 8 y 10 que revela la estabilidad del PSA, con un aumento no superior al 10% respecto al valor inicial del mismo.

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La Fig. 7 proporciona la respuesta bioquímica de los pacientes 11 y 16, que muestra el aumento del tiempo de duplicación del PSA sin que se llegue a estabilizar.

La Fig. 8 proporciona la respuesta bioquímica del paciente 5, que muestra el aumento del tiempo de duplicación del PSA sin que se llegue a estabilizar.

5 La Fig. 9 proporciona la respuesta bioquímica de los pacientes 1, 4, 10, 12 y 13 que no revela ningún cambio en el tiempo de duplicación del PSA durante la vacunación.

La Fig. 10 proporciona la respuesta bioquímica de los pacientes 2, 6, 9, 14, 18 y 19 que no revela ningún cambio en el tiempo de duplicación del PSA durante la vacunación.

La Fig. 11 proporciona la respuesta bioquímica de los pacientes 7, 15 y 17 que revela un descenso transitorio del 10 PSA o bien un aumento del tiempo de duplicación seguido por un descenso de este último.

Los documentos WO 2007/039192, WO 2004/022709, WO 2004/067023, Piesche et al. (Identification of a promiscuous HLA DR-restricted T-cell epitope derived from the inhibitor of apoptosis protein survivin. Hum Immunol. 2007 Jul; 68(7):572-6), y Schmitz et al. (Generation of survivin-specific CD8+ T effector cells by dendritic cells pulsed with protein or selected peptides.Cancer Res. 2000 Sep 1;60(17):4845-9) revelan péptidos derivados de la survivina

15 que se unen a moléculas MHC de clase I o de clase II.

Asimismo, el documento WO 2007/036638 da a conocer un péptido consistente en los aminoácidos 96-110 de la molécula de survivina entera.

Descripción detallada de la invención

Todos los términos utilizados en la presente memoria se definen del modo indicado a continuación a menos que se 20 indique lo contrario.

El término "péptido" designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Los péptidos tienen normalmente 9 aminoácidos de longitud, pero pueden tener de 8 a 16 aminoácidos de longitud.

El término "oligopéptido" designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente

25 mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantenga el epítopo o epítopos adecuados. Los oligopéptidos suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoácidos y mayor de 14, aproximadamente.

El término "polipéptido" designa una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es 30 crucial en la invención, siempre que se mantengan los epítopos adecuados. En contraste con los términos "péptido" y "oligopéptido", el término "polipéptido" se refiere a las moléculas de más de unos 30 residuos de aminoácidos de longitud. Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica dicha molécula es "inmunogénico" (y, por lo tanto, un inmunógeno en la presente invención), si es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En el caso de la presente invención, la inmunogenicidad se define más específicamente como la capacidad para desatar una

35 respuesta por parte de los linfocitos T. Por lo tanto, un inmunógeno sería una molécula que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria y, en el caso de la presente invención, una molécula capaz de inducir una respuesta de los linfocitos T.

Un "epítopo" de linfocito T requiere un péptido corto que esté unido a un receptor MHC de clase I o II, formando un complejo ternario (cadena alfa de MHC de clase I, beta-2-microglobulina y péptido) que puede ser reconocido por un 40 linfocito T que lleve un receptor de linfocito T que coincida y que se una al complejo MHC/péptido con la afinidad adecuada. Los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 14 aminoácidos, y más habitualmente de 9 aminoácidos. Los epítopos de linfocitos T que se unen a moléculas MHC de clase II suelen tener una longitud de entre 12 y 30 aminoácidos. En el caso de los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase II, el mismo péptido y el epítopo del linfocito T correspondiente pueden compartir un segmento central 45 común y diferir en la longitud total como consecuencia de secuencias de flanqueo de diferentes longitudes en dirección ascendente del extremo amino de la secuencia central y descendente con respecto al extremo carboxílico, respectivamente. Los receptores MHC de clase II presentan una conformación más abierta; de la misma manera, los péptidos unidos a receptores MHC de clase II no se enclavan completamente en la estructura de la hendidura de unión al péptido de la molécula MHC de clase II, como ocurre con la hendidura de unión del péptido de la molécula

50 MHC de clase I. Es de notar que éste no es el caso para el péptido con arreglo a la SEC ID n.º 1, puesto que pequeñas variaciones en la longitud del péptido ocasionan un gran descenso de la actividad (véase más abajo).

En el ser humano hay tres locus genéticos diferentes que codifican las moléculas MHC de clase I (las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos [HLA]): HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLAA*01, HLA-A*02 y HLA-A*11 son ejemplos de distintos alelos MHC de clase I que se pueden expresar a partir de

55 esos locus.

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Tabla 2: Los 30 alelos más expresados en diversas poblaciones

Probabilidad de que un alelo se exprese en un individuo (%)

Los 30 alelos más expresados

Alelo

Caucásicos Alelo Afroamericanos Alelo Hispanos Alelo Oriental

A*0201

45,6% C*0401 29,0% A*0201 37,1% A*1101 38,4%

C*0701

27,7% C*0701 25,4% C*0401 25,4% A*2402 33,7%

A*0101

27,4% C*0602 23,0% A*2402 24,9% C*0702 33,3%

A*0301

23,8% A*0201 22,3% C*0702 24,2% C*0102 27,7%

C*0702

21,5% A*2301 20,7% C*0701 20,8% A*3303 23,3%

C*0401

21,2% C*0202 19,0% C*0304 14,4% C*0801 21,6%

B*4402

20,2% A*0301 18,7% A*0301 14,3% C*0304 19,9%

B*0702

18,1% C*0702 18,1% B*0702 13,2% A*0201 18,1%

B*0801

18,1% B*5301 18,1% B*3501 12,8% B*4001 15,2%

C*0501

17,2% B*0702 15,8% C*0602 12,3% C*0401 14,0%

C*0304

16,8% C*1601 15,7% C*0501 11,9% B*5801 13,3%

C*0602

15,7% B*1503 13,9% A*0101 11,4% B*4601 12,7%

A*1101

15,3% B*5801 13,5% A*1101 11,0% B*5101 12,4%

B*4001

13,6% A*6802 12,7% B*5101 10,8% C*0302 12,0%

A*2402

12,1% C*1701 11,7% C*1601 10,6% B*3802 11,4%

B*3501

10,7% B*4501 10,8% B*4403 9,9% A*0207 11,0%

C*0303

10,6% B*4201 10,5% C*0102 9,7% B*1501 9,4%

B*5101

10,4% A*3001 10,4% A*2902 9,7% A*0206 9,3%

C*1203

9,9% B*3501 10,1% C*0802 9,3% C*0303 9,2%

B*1501

9,6% A*0101 10,0% B*1801 9,1% B*1502 9,1%

A*2902

8,9% C*0304 9,3% A*3101 8,9% A*0203 8,8%

A*2601

8,2% A*3002 9,2% B*5201 8,6% B*4403 8,6%

A*3201

8,2% B*0801 8,5% B*1402 8,6% C*1402 8,4%

C*0802

7,7% A*3402 8,4% C*0202 7,6% B*3501 7,2%

A*2501

7,5% A*7401 8,4% C*1203 7,6% C*0602 7,0%

B*5701

7,1% A*3303 8,0% A*2601 7,6% B*5401 6,9%

B*1402

6,7% C*1801 7,3% A*6801 7,1% B*1301 6,6%

C*0202

6,6% A*2902 7,2% B*0801 7,0% B*4002 6,3%

B*1801

6,4% B*4403 6,9% A*3002 6,8% B*5502 6,3%

B*4403

6,4% B*4901 6,9% B*4402 6,5% A*2601 6,0%

Tres locus diferentes del genoma humano albergan los genes MHC de clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP. Los receptores MHC de clase II son heterodímeros que constan de una cadena alfa y una beta, las cuales se insertan en 5 la membrana celular a través de una región transmembranosa. HLA-DRB1*04 y HLA-DRB1*07 son dos ejemplos de alelos MHC de clase II beta que se sabe que están codificados en estos locus. Los alelos de clase II son muy polimorfos: por ejemplo, se han descrito varios cientos de alelos HLA-DRB1 distintos. Por tanto, a efectos terapéuticos y de diagnóstico sería muy deseable contar con un péptido que se una, con la afinidad adecuada, a varios receptores HLA de clase II distintos. Un péptido que se une a varias moléculas HLA de clase II distintas recibe

10 el nombre de ligando promiscuo.

En la presente memoria, la referencia a una secuencia de ADN incluye tanto ADN monocatenario como bicatenario. Por lo tanto, la secuencia específica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, a la doble cadena formada por dicha secuencia con su complementaria (ADN bicatenario) y a la cadena complementaria de dicha secuencia. El término "región codificante" hace referencia a la porción de un gen

15 que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresión de dicho gen en su ambiente genómico natural, por ejemplo, la región que codifica in vivo el producto de expresión natural del gen.

La región codificante puede formar parte de un gen normal, mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizada íntegramente en el laboratorio con procedimientos bien conocidos por los expertos en la síntesis de ADN.

20 El término "secuencia nucleotídica" hace referencia a un heteropolímero de desoxirribonucleótidos.

La secuencia nucleotídica que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintética. Generalmente, los segmentos de ADN que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de la presente invención se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y de oligonucleótidos cortos de enlace, o a partir de una serie de oligonucleótidos, con el fin de proporcionar un gen sintético capaz de ser 25 expresado en una unidad transcripcional recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un

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operón microbiano o vírico.

El término "producto de expresión" define al polipéptido o a la proteína que es el producto natural de la traducción del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por tanto, que codifican el mismo aminoácido o aminoácidos.

El término "fragmento", cuando se refiere a una secuencia de codificación, define una porción de ADN que no comprende la región codificante completa, cuyo producto de expresión retiene esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante completa.

El término "segmento de ADN" hace referencia a un polímero de ADN, en la forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, sin materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permite la identificación, la manipulación y la recuperación del segmento y de sus secuencias nucleotídicas constituyentes mediante procedimientos bioquímicos estándar como, por ejemplo, mediante un vector de clonación. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en dirección 3' (downstream) desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes.

El término "cebador" define una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede aparearse con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3'OH libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.

El término "promotor" define una región de ADN implicada en la unión de la polimerasa de ARN para iniciar la transcripción.

El término "marco de lectura abierto (ORF)" designa una serie de tripletes que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación y que forman una secuencia (potencialmente) traducible en proteína.

El término "aislado" define el material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Dichos polinucleótidos pueden formar parte de un vector o dichos polinucleótidos o polipéptidos pueden formar parte de una composición y seguir siendo aislados en el sentido de que dicho vector o composición no es parte de su entorno natural.

Los polinucleótidos, y los polipéptidos recombinantes o inmunógenos, descritos de acuerdo con la presente invención también pueden presentarse en una forma "purificada". El término "purificado" no implica pureza absoluta; más bien, se utiliza como definición relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan sólo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la materia entienden dichos términos. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta obtener una homogeneidad electroforética. Se contempla expresamente la purificación del material de inicio o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres órdenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se contempla expresamente el polipéptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, el 99,999%, o, al menos, del 99,99% o el 99,9%; y, más convenientemente, del 99% por peso o mayor.

Los ácidos nucleicos y los polipéptidos que son productos de expresión descritos conforme a la presente invención, así como los vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos y/o dichos polipéptidos, pueden utilizarse en "forma enriquecida". Tal y como se usa aquí, el término "enriquecido" significa que la concentración del material es, al menos, unas 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), más ventajosamente 0,01% por peso, y, preferiblemente, aproximadamente de 0,1% al menos, por peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de alrededor del 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% por peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente invención pueden utilizarse, según convenga, en su forma enriquecida

o aislada.

El término "fragmento activo" define un fragmento que genera una respuesta inmunitaria (es decir, que posee actividad inmunógena) cuando se administra − solo u, opcionalmente, con un adyuvante adecuado − a un animal, que puede ser un mamífero como, por ejemplo, un conejo o un ratón, sin excluir a un ser humano; dicha respuesta inmunitaria adopta la forma de estimulación de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor como, por ejemplo, el ser humano. De forma alternativa, el "fragmento activo" también se puede usar para inducir una respuesta de linfocitos T in vitro.

Tal y como se usan aquí, los términos "porción", "segmento" y "fragmento", cuando se utilizan en relación a los polipéptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoácidos, secuencia que es un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido se somete a un tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como la tripsina o la quimotripsina, los oligopéptidos resultantes de

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dicho tratamiento representarán porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido inicial. Esto significa que cualquiera de esos fragmentos, necesariamente y como parte de su secuencia de aminoácidos, va a contener un segmento, fragmento o porción que es sustancialmente idéntica, si no lo es exactamente, a una secuencia de las SEC ID n.º 1, 2 o 3, que corresponde a la estructura natural, o a las proteínas "precursoras" de las SEC ID n.º 1, 2 o

3. Utilizados en relación con los polinucleótidos, dichos términos se refieren a los productos generados por el tratamiento de dichos polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas habituales.

Conforme a la presente invención, el término "identidad porcentual" o "porcentaje idéntico", al referirse a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita después de alinear la secuencia que se va a comparar (la "secuencia comparada") con la secuencia descrita o reivindicada (la "secuencia de referencia") La identidad porcentual se determina entonces con la siguiente fórmula:

Identidad porcentual = 100 [I -(C/R)]

donde C es el número de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada a lo largo de la alineación entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada, donde

(i)

cada base o aminoácido de la secuencia de referencia que no tiene una base o aminoácido alineados en la secuencia comparada y

(ii)

cada hueco (gap) de la secuencia de referencia y

(iii) cada base o aminoácido alineado de la secuencia de referencia que difiere de una base o aminoácido alineado de la secuencia comparada, constituye una diferencia;

y R es el número de bases o aminoácidos de la secuencia de referencia a lo largo de la alineación con la secuencia comparada con cualquier hueco creado en la secuencia de referencia, también contabilizado como una base o un aminoácido.

Si existe una alineación entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad porcentual, calculada como se ha especificado arriba, es aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual mínima especificada, entonces la secuencia comparada guarda la identidad porcentual mínima especificada con la secuencia de referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada arriba resulte menor que la identidad porcentual especificada.

Los péptidos originales descritos aquí se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se especifica de otra manera. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoácido es reemplazado por un aminoácido de estructura y características similares, como en el caso de un aminoácido hidrofóbico que es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, si una leucina se reemplaza por isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homólogas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran con más frecuencia que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las "sustituciones conservadoras".

Las sustituciones conservadoras se definen como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo

1: residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro y Gly); Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu y Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg y Lys); Grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, Ile, Val y Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr y Trp).

Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido ácido por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones "radicales" no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios químicos simples.

Naturalmente, dichas sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoácidos L habituales. De esta forma, aminoácidos D podrían sustituir a los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la invención y, aún así, quedar englobados en la descripción del presente documento. Además, los aminoácidos que contienen grupos R no estándar (es decir, grupos R distintos de los que se encuentran en los 20 aminoácidos comunes de las proteínas naturales) también se pueden usar para hacer sustituciones, con el fin de producir inmunógenos y polipéptidos inmunógenos conformes a la presente invención.

Si se descubre que las sustituciones en más de una posición dan lugar a un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en

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la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán hasta 4 posiciones simultáneamente dentro del péptido.

El término "respuesta de linfocitos T" define la proliferación y la activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotóxicos (CTL) restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de células diana presentadoras naturales de péptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un péptido o con un precursor del mismo; la secreción de citocinas, preferiblemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por péptido; la secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido; o la desgranulación. En el caso de los linfocitos T cooperadores restringidos a MHC de clase II, las funciones efectoras pueden ser la secreción inducida por péptido de citocinas, preferiblemente de IFN-gamma, TNF-alfa, IL-4, IL-5, IL-10 o IL-2, o la desgranulación inducida por péptido. Las funciones efectoras posibles de los CTL y los linfocitos T cooperadores no se limitan a esta lista.

Preferiblemente, cuando los CTL específicos para un péptido derivado de cualquiera de las SEC ID N.º 1 a 3 se prueben contra los péptidos sustituidos, la concentración de péptido a la cual los péptidos sustituidos consiguen la mitad del aumento máximo de la lisis respecto al valor de fondo es como máximo de alrededor de 1 mM, preferiblemente como máximo de alrededor de 1 µM, más preferiblemente como máximo de alrededor de 1 nM, y aún más preferentemente como máximo de alrededor de 100 pM, y más preferentemente como máximo de alrededor de 10 pM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por los CTL de más de un individuo, de al menos dos, y más preferiblemente de tres individuos.

La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos que sean reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para desencadenar una respuesta inmunitaria que es específica contra los antígenos expresados en la superficie de células tumorales y que a través de este mecanismo de acción sea capaz de inducir la regresión, paralice o ralentice el crecimiento del tumor. Actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las defensas humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cáncer.

Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer específicamente y destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos (CTL) entre las células infiltradas en los tumores o en la sangre periférica hace pensar en que tales células desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). A partir del análisis de 415 especímenes de pacientes aquejados de cáncer colorrectal, Galon et al. pudieron demostrar que el tipo, la densidad y la localización de las células inmunitarias en el tejido tumoral son realmente mejores predictores de la supervivencia del paciente que la ampliamente utilizada estadificación TNM de los tumores (Galon et al., 2006).

Las moléculas MHC de clase I presentan péptidos procedentes de la proteólisis de proteínas endógenas, DRiP y péptidos más grandes. Las moléculas de MHC de clase II, presentes mayoritariamente en las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, presentan predominantemente péptidos de proteínas exógenas o transmembrana que son captadas por las APC mediante endocitosis y después son procesadas por las mismas (Cresswell, 1994). Los complejos constituidos por péptidos y moléculas MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T CD8positivos portadores del receptor de linfocito T (TCR) adecuado, mientras que los complejos formados por péptidos y moléculas MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T cooperadores CD4-positivos portadores del TCR apropiado. Es bien sabido que el TCR, el péptido y el MHC están presentes en una relación estequiométrica de

1:1:1.

Los linfocitos T cooperadores CD4-positivos desempeñan un papel importante en la inducción y en el mantenimiento de respuestas eficaces por parte de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos (Wang and Livingstone, 2003; Sun and Bevan, 2003; Shedlock and Shen, 2003).Inicialmente, la sensibilización y la expansión de los CTL en los ganglios linfáticos está sustentada por los linfocitos T CD4+ (Schoenberger et al., 1998). Así pues, un mecanismo podría ser el direccionamiento de los linfocitos CD8+ vírgenes hacia el lugar donde tiene lugar la interacción funcional entre los linfocitos T CD4+ y las APC (Castellino et al., 2006). Por último, la generación de los linfocitos CD8+ de memoria funcionales depende casi siempre de la asistencia de los linfocitos T CD4+ (Sun and Bevan, 2003; Janssen et al., 2003). Por todas esas razones, la identificación de epítopos derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) que sean reconocidos por los linfocitos T CD4-positivos reviste suma importancia para el desarrollo de medicamentos que estimulen una respuesta inmunitaria antitumoral (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). Los linfocitos T cooperadores generan en el seno del tumor un entorno de citocinas que es propicio para los CTL (Qin and Blankenstein, 2000;Mortara et al., 2006) y que atrae a las células efectoras, como por ejemplo los propios CTL, células NK, macrófagos, granulocitos (Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007).

En ausencia de inflamación, la expresión de las moléculas MHC de clase II se circunscribe principalmente a las células del sistema inmunitario, en concreto a las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, como por ejemplo monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos y células dendríticas. En pacientes con cáncer se ha descubierto con sorpresa que las células tumorales expresan moléculas MHC de clase II (Dengjel et al., 2006).

En modelos de mamífero como el ratón se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden inhibir la manifestación de los tumores sin el concurso de las células efectoras CTL (los linfocitos T CD8-positivos) a través de la inhibición de la angiogénesis mediante la secreción de interferón gamma (IFN-γ) (Qin and Blankenstein, 2000). También ha sido propuesta la destrucción directa de las células tumorales por los linfocitos T CD4+ citotóxicos a través de linfotoxinas y granzima B (Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992).

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Además, se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden contrarrestar la progresión tumoral mediante 5 la inducción de respuestas de anticuerpos al reconocer péptidos de antígenos asociados a tumor presentados por moléculas HLA de clase II (Kennedy et al., 2003).

A diferencia de lo que sucede con los péptidos asociados a tumor reconocidos por moléculas HLA de clase I, hasta la fecha el número descrito de ligandos de clase II derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) es pequeño.

Dado que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II suele ser exclusiva de las células del sistema

10 inmunitario (Mach et al., 1996), la posibilidad de aislar péptidos de clase II directamente de tumores primarios no se consideraba factible. Pero Dengjel et al. descubrieron varios epítopos de MHC de clase II en tumores (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006).

Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos de tumor, es decir, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier clase de proteína, como enzimas, receptores, factores de

15 transcripción, etc. que se expresan y, en comparación con células inalteradas del mismo origen, están reguladas al alza en células del tumor correspondiente.

La clasificación actual de los antígenos asociados a tumores (TAA) comprende los siguientes grupos principales (Novellino et al., 2005):

1. Antígenos cáncer-testículo: Los primeros TAA descubiertos que pueden ser reconocidos por linfocitos T

20 pertenecen a esta clase (van der Bruggen et al., 1991), que inicialmente se denominó antígenos cáncer-testículo (CT) porque sus miembros se expresan en tumores humanos histológicamente diferentes y en los tejidos normales solo se encuentran en los espermatocitos/espermatogonias del testículo y ocasionalmente en la placenta. Como las células del testículo no expresan moléculas HLA de clase I y II, estos antígenos no pueden ser reconocidos por los linfocitos T de los tejidos normales y por tanto se consideran como específicos de tumor

25 desde el punto de vista inmunológico. Ejemplos conocidos de antígenos CT son los miembros de la familia MAGE y el NY-ESO-1.

2. Antígenos de diferenciación: estos TAA está presentes tanto en los tumores como en el tejido normal del que deriva el tumor; la mayoría se encuentran en melanomas y en melanocitos normales. Muchas de esas proteínas relacionadas con el linaje melanocítico participan en la biosíntesis de la melanina y no son específicas de tumor,

30 lo que no impide que sean muy utilizadas en la inmunoterapia contra el cáncer. Algunos ejemplos son la tirosinasa y Melan-A/MART-1 en el melanoma y el PSA en el cáncer de próstata.

3. TAA sobreexpresados: Se han detectado genes que codifican TAA de amplia expresión en tumores histológicamente distintos y en numerosos tejidos normales, en general con niveles de expresión más bajos. Es posible que muchos de los epítopos procesados y posiblemente presentados por los tejidos normales lo sean por

35 debajo del límite necesario para ser reconocidos por los linfocitos T, pero que la sobreexpresión por parte de las células tumorales rompa la tolerancia vigente hasta ese momento y desencadene la respuesta antitumoral. Ejemplos destacados de esta clase de TAA son Her-2/neu, survivina, telomerasa o WT1.

4. Antígenos específicos de tumor: estos TAA únicos son fruto de mutaciones de genes normales (como βcatenina, CDK4, etc.) Algunos de esos cambios moleculares están relacionados con la transformación

40 neoplásica y/o su progresión. Los antígenos específicos de tumor generalmente son capaces de inducir potentes respuestas inmunitarias sin riesgo de reacciones autoinmunitarias contra los tejidos normales. Por otro lado, casi siempre estos TAA solo son relevantes para el mismo tumor exacto en el que fueron identificados y normalmente no se encuentran en muchos otros tumores de su tipo.

5. TAA resultantes de modificaciones postraduccionales anormales: Estos TAA pueden surgir a partir de

45 proteínas que no son específicas ni se sobreexpresan en los tumores, pese a lo cual aparecen asociados a tumores por procesos postraduccionales que se activan principalmente en los tumores. Ejemplos de este tipo surgen a raíz de patrones de glucosilación alterados que generan epítopos nuevos en tumores como MUC1 o fenómenos como el ayuste de proteínas durante la degradación que en algunos casos pueden ser específicos de tumor (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004).

50 6. Proteínas de oncovirus: Estos TAA son proteínas virales que podrían desempeñar un papel crítico en el proceso oncogénico y que, como extrañas a causa de su origen no humano, pueden desencadenar una respuesta de los linfocitos T. Ejemplos de tales proteínas son las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano de tipo 16, que se expresan en el carcinoma cervical.

Para que las proteínas sean reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos o asociados a

55 tumor y puedan ser empleadas como parte de un tratamiento, deben cumplir ciertos prerrequisitos. El antígeno debe ser expresado principalmente por células tumorales y no por tejidos sanos normales o, de hacerlo, debe serlo en cantidades comparativamente pequeñas. Y no sólo es conveniente que el antígeno de interés esté presente únicamente en un tipo de tumor, sino que lo esté también en altas concentraciones (número de copias del péptido por célula). Los antígenos específicos de tumor y asociados a tumor proceden a menudo de proteínas que

60 intervienen directamente en la transformación de una célula normal en una célula tumoral a causa de su función, por ejemplo porque intervienen en el control del ciclo celular o en la supresión de la apoptosis. Además, también las dianas ulteriores de las proteínas que son las causantes directas de la transformación pueden estar reguladas al alza y, por tanto, estar asociadas indirectamente al tumor. Tales antígenos asociados indirectamente a los tumores también pueden ser las dianas para una estrategia de vacunación (Singh-Jasuja et al., 2004). En ambos casos es

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5 esencial que la secuencia de aminoácidos del antígeno contenga epítopos, puesto que el péptido (péptido inmunogénico) derivado de un antígeno asociado a tumor debe desencadenar una respuesta de los linfocitos T en condiciones in vitro o in vivo.

Básicamente, cualquier péptido capaz de unirse a una molécula de MHC puede actuar como un epítopo de linfocito

T. Un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de un linfocito 10 T dotado del correspondiente TCR y la ausencia de tolerancia inmunitaria hacia ese epítopo en particular.

Por consiguiente, los TAA son el punto de partida para el desarrollo de una vacuna antitumoral. Los procedimientos para identificar y caracterizar los TAA están basados, entre otros, en el uso de CTL que pueden aislarse de pacientes o de individuos sanos, o en la generación de perfiles de transcripción diferenciales o patrones de expresión peptídica diferenciales entre los tumores y los tejidos normales (Lemmel et al., 2004; Weinschenk et al.,

15 2002).

No obstante, la identificación de genes sobreexpresados o expresados selectivamente en tejidos tumorales o en estirpes de células tumorales humanas no aporta información precisa acerca del uso de los antígenos transcritos de esos genes en la inmunoterapia. Ello se explica porque solo una subpoblación individual de epítopos de esos antígenos resulta adecuada para aplicaciones de ese tipo, puesto que ha de haber un linfocito T con el TCR

20 correspondiente y la inmunotolerancia hacia ese epítopo concreto ha de ser mínima o nula. Por tanto, es importante seleccionar sólo aquellos péptidos derivados de proteínas sobreexpresadas o selectivamente expresadas que sean presentados ligados a moléculas de MHC y que sean diana de linfocitos T funcionales. Un linfocito T funcional se define como un linfocito T que tras la estimulación con un antígeno específico puede sufrir una expansión clonal y ser capaz de ejecutar funciones efectoras ("linfocito T efector").

25 Los linfocitos T cooperadores desempeñan un papel importante en la coordinación de la función efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epítopos reconocidos por los linfocitos T cooperadores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T cooperadores del tipo TH1 apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8+, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra las células tumorales que muestran en su superficie complejos de MHC/péptido asociado a tumor. De esta forma, los epítopos de los péptidos asociados a tumores que

30 son reconocidos por los linfocitos T cooperadores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden servir como principios activos farmacéuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales.

Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinérgicamente al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de los antígenos asociados a tumor reconocidos por los CTL

35 CD8+ (ligando: moléculas de MHC de clase I + epítopo peptídico) o por los linfocitos T cooperadores CD4+ (ligando: moléculas de MHC de clase II + epítopo peptídico) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales.

A la luz de los efectos secundarios graves y los gastos que supone el tratamiento contra el cáncer es evidente la urgente necesidad de mejora de los procedimientos pronósticos y diagnósticos. Así pues, existe la necesidad de descubrir otros factores que puedan servir como biomarcadores para el cáncer en general y el glioblastoma en

40 particular. Existe igualmente la necesidad de identificar factores que puedan ser utilizados en el tratamiento contra el cáncer en general y contra el glioblastoma en particular.

Y es más, no existe ninguna pauta terapéutica pensada para los pacientes con cáncer de próstata que presentan recidiva bioquímica después de la prostatectomía radical, normalmente causada por tumor residual in situ que no ha sido extirpado en presencia de crecimiento localmente avanzado del tumor. Sería deseable contar con nuevas

45 estrategias terapéuticas de menor morbilidad y similar eficacia terapéutica a las estrategias terapéuticas disponibles en estos momentos.

La presente invención proporciona un péptido que es útil para el tratamiento del glioblastoma, el cáncer de próstata y otros tumores que sobreexpresan la survivina y/o el NCAN. De los péptidos descritos en la presente memoria se ha demostrado en parte directamente con técnicas de espectrometría de masas que son presentados de forma natural 50 por moléculas HLA en muestras de glioblastoma humano primario (véanse ejemplo 1 y figura 1), o en el caso de las SEC ID N.º 1 y 2 predichas conforme al algoritmo de predicción SYFPEITHI (Rammensee et al., 1995) son ligandos promiscuos de los alelos HLA-DR HLA-DRB1*01, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*11 y DRB1*15 (véase anexo). A tenor de los datos anteriores y de las frecuencias de dichos alelos DRB1 frecuentes (Mori et al., 1995; Chanock et al., 2004), se puede suponer que el 92% de las personas de raza blanca A*02-positivas expresan como mínimo un alelo

55 DRB1 que se une a esos péptidos (SEC ID 1 y 2). La SEC ID 2 contiene la misma secuencia central que la SEC ID 1, alargada por dos aminoácidos N-terminales de la secuencia natural de la survivina para contener un epítopo de linfocito T de clase I descrito de la survivina (Schmitz et al., 2000).

Se ha demostrado que el gen originario del cual derivan las SEC ID N.º 1 y 2 – survivina – está altamente sobreexpresado en el glioblastoma, el tumor de próstata, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales claras, cáncer de pulmón, SNC, ovario, melanoma (Tamm et al. 1998), cáncer de páncreas, carcinoma espinocelular, leucemia y meduloblastoma en comparación con los tejidos normales (véanse el ejemplo 2 y la figura 2), lo que demuestra el alto grado de asociación del péptido con el tumor, es decir, que dichos

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5 péptidos aparecen claramente expresados en el tejido tumoral pero no en los tejidos normales.

Los péptidos de unión a HLA pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario, específicamente por los linfocitos T. Los linfocitos T destruyen las células que presentan el complejo HLA/péptido reconocido, p. ej. células tumorales de glioblastoma que presentan el péptido derivado de NCAN (SEC ID N.º 3). Los linfocitos T cooperadores activados por los péptidos derivados de la survivina pueden inhibir la vacularización del tumor, pueden atraer a las células

10 efectoras del sistema inmunitario y facilitar la sensibilización y la proliferación de los CTL, así como la respuesta sostenida de los linfocitos TCD8+.

El péptido de la presente invención ha demostrado ser capaz de estimular las respuestas de los linfocitos T (véanse el ejemplo 3 y la figura 3). Así pues, el péptido de la presente invención es útil para generar en un paciente una respuesta inmunitaria con la que destruir células tumorales. La respuesta inmunitaria se puede inducir en el paciente 15 con la administración directa de los péptidos descritos o de sustancias precursoras adecuadas (p. ej. péptidos alargados, proteínas o ácidos nucleicos que codifiquen dichos péptidos), idealmente en combinación con un agente que potencie la inmunogenicidad (un adyuvante). Cabe esperar que la respuesta inmunitaria generada por esa vacunación terapéutica sea muy específica contra las células tumorales porque los tejidos normales no contienen los péptidos diana de la presente invención en un número comparable de copias, lo cual evita el riesgo de reacciones

20 autoinmunitarias perjudiciales contra las células normales del paciente.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender los péptidos en forma libre o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, "una sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a un derivado de los péptidos descritos en el que el péptido es modificado para obtener sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, 25 las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (normalmente la forma neutra del fármaco posee un grupo –NH2 neutro) haciéndola reaccionar con un ácido adecuado. Ácidos adecuados para la preparación de sales ácidas incluyen tanto ácidos orgánicos, p. ej. ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluensulfónico,

30 ácido salicílico y similares, como ácidos inorgánicos, como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. A la inversa, la preparación de sales básicas a partir de grupos ácidos que pueden estar presentes en un péptido se preparan empleando una base farmacéuticamente aceptable como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio, trimetilamina o similares.

En una forma de realización especialmente preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos en 35 forma de sales de ácido acético (acetatos) o ácido clorhídrico (cloruros).

Además de ser útiles para el tratamiento del cáncer, los péptidos descritos en la presente memoria también son útiles para el diagnóstico. Dado que muchos de los péptidos son generados por el glioblastoma y se ha determinado que dichos péptidos no están presentes en tejidos normales, dichos péptidos pueden ser utilizados para diagnosticar la presencia de un cáncer.

40 La presencia de los péptidos reivindicados en biopsias de tejido puede ayudar al anatomopatólogo a diagnosticar un cáncer. La detección de ciertos péptidos mediante anticuerpos, espectrometría de masas u otros procedimientos conocidos en la técnica puede advertir al anatomopatólogo de que el tejido es maligno o está inflamado o enfermo. La presencia de grupos de péptidos puede permitir la clasificación o subclasificación de los tejidos enfermos.

La detección de los péptidos en una muestra de tejido enfermo puede ayudar a decidir si los tratamientos que

45 implican al sistema inmunitario pueden ser beneficiosos, sobre todo si se sabe o se prevé que los linfocitos T estén implicados en el mecanismo de acción. La pérdida de expresión de MHC es un mecanismo conocido con el que las células infectadas o cancerosas logran eludir la vigilancia del sistema inmunitario. Así pues, la presencia de los péptidos indica que dicho mecanismo no es utilizado por las células analizadas.

Los péptidos descritos pueden ser utilizados para analizar las respuestas de los linfocitos contra ellos, como son las

50 respuestas de los linfocitos T o las respuestas de anticuerpos contra el péptido o el péptido unido a moléculas de MHC. Estas respuestas de los linfocitos pueden ser utilizadas como marcadores pronósticos para decidir los pasos posteriores del tratamiento. Dichas respuestas también pueden ser utilizadas como marcadores indirectos en las estrategias de inmunoterapia destinadas a estimular respuestas linfocitarias a través de diferentes medios, como por ejemplo la vacunación con proteínas, ácidos nucleicos, materiales autólogos, o la transferencia adoptiva de

55 linfocitos. En el ámbito de la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los péptidos pueden tenerse en cuenta para la evaluación de efectos secundarios. El control regular de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta valiosa para el seguimiento en trasplantes, por ejemplo con el fin de detectar enfermedades del injerto contra el hospedador y del hospedador contra el injerto.

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Los péptidos pueden usarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHC/péptido. Estos pueden ser utilizados como terapia, para dirigir toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otra aplicación de estos anticuerpos consistiría en dirigir radionúclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnóstico por la imagen como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metástasis pequeñas o determinar el

5 tamaño y la ubicación precisa de los tejidos enfermos.

Además, se pueden utilizar para verificar el diagnóstico histopatológico de cáncer basado en una muestra de biopsia.

La Tabla 3 muestra el péptido conforme a la presente invención correspondiente a la SEC ID N.º 1, y los péptidos tal y como son descritos, sus respectivas SEC ID N.º, los alelos HLA a los que se unen cada uno de ellos y las

10 proteínas originarias de las que pueden surgir dichos péptidos. Reviste especial interés que el péptido conforme a la SEC ID N.º 2 se una tanto a HLA-DR como a HLA-A*02, con lo que puede desencadenar dos respuestas distintas.

Tabla 3: Péptido de la presente invención conforme a la SEC ID N.º 1 y péptidos tal y como se describen

SEC ID Nº:

Código del péptido Secuencia Alelos HLA Proteína(s) originaria(s)

1

BIR-002 TLGEFLKLDRERAKN HLA-DR Survivina

2

BIR-004 ELTLGEFLKLDRERAKN HLA-DR y HLA-A*02 Survivina

3

NCAN-001 VLCGPPPAV HLA-A*02 Neurocan

Survivina

15 La expresión de BIRC5 (survivina), un miembro de la familia de proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAP), es elevada en tejidos fetales y en diversos cánceres humanos, mientras que su expresión está enormemente reducida en los tejidos diferenciados normales del adulto, sobre todo en aquellos cuyo índice de proliferación es bajo. La survivina parece ser capaz de regular tanto la proliferación celular como la muerte celular apoptósica. Aunque la survivina se localiza normalmente en la región citoplasmática de la célula, donde está asociada con un mal

20 pronóstico en el cáncer, también se ha descrito en el núcleo, localización donde indica un pronóstico favorable (O'Driscoll et al., 2003). Se han descrito varios mecanismos de regulación a través de la survivina y de ella misma. La survivina parece estar relacionada con la chaperona molecular Hsp60.En condiciones in vivo, la Hsp60 aparece abundantemente expresada en los tumores humanos primarios en comparación con los correspondientes tejidos normales. El silenciamiento agudo de la Hsp60 con ARN pequeños de interferencia desestabiliza la reserva

25 mitocondrial de survivina, induce la disfunción mitocondrial y activa la apoptosis dependiente de caspasas (Ghosh et al., 2008). Además, la inhibición de Ras libera el "freno" que ejerce la survivina sobre la apoptosis y provoca la activación de la vía apoptósica mitocondrial. Especialmente en el glioblastoma, la resistencia a la apoptosis se puede neutralizar con un inhibidor de Ras dirigido contra la survivina (Blum et al., 2006). Asimismo parece haber una correlación entre la hiperactividad del NF-kappaB en los gliomas y la hiperexpresión de la survivina, uno de los

30 genes diana del factor NF-kappaB. En consecuencia, los genes antiapoptósicos activados por el NF-kappaB están hiperexpresados en muestras tumorales. Y especialmente en el glioblastoma se detectan niveles sumamente elevados de expresión de la survivina (Angileri et al., 2008). Se ha planteado que la sobreexpresión de la survivina en los gliomas cerebrales podría desempeñar un papel importante en la proliferación maligna, los mecanismos antiapoptósicos y la angiogénesis (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006). Se han realizado diversos análisis para estudiar la

35 expresión de la survivina y su repercusión en la supervivencia en el marco del glioblastoma. En resumen, la expresión de la survivina, sobre todo la expresión simultánea en el núcleo y el citoplasma en los tumores astrocíticos apareció relacionada significativamente con el grado de malignidad (con la mayor expresión de survivina en el glioblastoma) y con tiempos de supervivencia global más cortos que los pacientes con tumores negativos para la survivina (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie

40 et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).

La sobreexpresión de la survivina también se ha descrito en otros tipos de tumores. En el cáncer de mama, la expresión de la survivina aparece asociada con un grado mayor, así como con menor supervivencia sin progresión (Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004). En estirpes celulares de cáncer de esófago, la actividad promotora de la survivina ha resultado ser 28,5 veces más elevada que en los tejidos normales (Sato et al., 45 2006). La expresión de la survivina en el cáncer colorrectal también está relacionada con el grado patológico y la metástasis ganglionar (Tan et al., 2005). También se ha demostrado que la agresividad del carcinoma de células renales claras está relacionada con la expresión de la survivina. Asimismo, su expresión está inversamente relacionada con la supervivencia dependiente específicamente del cáncer (Kosari et al., 2005). La expresión de la survivina se puede detectar en un conjunto de neoplasias queratinocíticas y lesiones cutáneas hiperproliferativas

50 pero no en la piel normal (Bowen et al., 2004). En estirpes celulares de cáncer de páncreas, la survivina aparecía amplificada en el 58% de las estirpes celulares estudiadas (Mahlamaki et al., 2002). En el carcinoma epidermoide, la expresión de la survivina puede ayudar a identificar los casos con un fenotipo clínico más agresivo e invasivo (Lo et al., 2001).

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Las posibilidades que ofrece la survivina como diana en el tratamiento contra el cáncer han propiciado la realización de estudios con péptidos derivados de la misma en los cuales ha demostrado su inmunogenicidad en pacientes oncológicos al desencadenar respuestas mediadas por los linfocitos T CD8+. Asimismo, la survivina estimuló de forma específica la reactividad de los linfocitos T CD4+ en linfocitos de sangre periférica de los mismos pacientes

5 (Casati et al., 2003; Piesche et al., 2007).

La survivina (SVN, BIRC) se sobreexpresa en multitud de tipos de cáncer distintos, por lo que en general su sobreexpresión se considera vinculada con una menor supervivencia global y un mayor grado de malignidad.

Piesche (2006) reveló como parte de su estudio (véase también (Piesche et al., 2007)), epítopos candidatos restringidos a HLA de clase II y MHC de clase II en la survivina (SVN) y en la proteinasa-3 (PR3), que fueron

10 determinados utilizando el programa informático TEPITOPE (Bian and Hammer, 2004). El análisis con TEPITOPE dio como resultado 6 epítopos candidatos de la SVN y 11 de la PR3 con una alta probabilidad de unión a varios alelos HLA-DR. Los 17 péptidos se estudiaron en experimentos inmunológicos con linfocitos T una vez sintetizados y purificados por cromatografía. Los péptidos manifestaron longitudes variables a consecuencia del solapamiento de epítopos que se consideraron juntos en un péptido (Tabla 4).

15 Tabla 4: Nombres, posición de los AA y secuencias de AA de los péptidos sintéticos de la SVN revelados por Piesche 2006.

Péptido

Posición Secuencia de amino ácido Frecuencia de linfocito T

8,64*10-7 7,2*10-7 8,64*10-7 4,32*10-7 1,73*10-6 8,64*10-7

(Nota: El S88 es en realidad el S98, por lo que Piesche et al. pudieron cometer un error al determinar la posición de este epítopo).

Piesche llevó a cabo experimentos de titulación con los péptidos correspondientes para estimar la afinidad entre el HLA y los péptidos o la avidez del TCR por el complejo péptido-HLA. Cuanto menor es la concentración de péptido 20 mayor es la afinidad de unión de los epítopos peptídicos a las moléculas de MHC, un prerrequisito importante para la presentación natural de los "auténticos" epítopos de linfocito T procedentes del procesamiento intracelular del antígeno proteico. La actividad proliferativa semimáxima medida de los clones de linfocitos T específicos de cada péptido fue: <50 nM en el caso del S10, 400–700 nM en el del S40, 2000–3000 nM en el del S88 y 100–300 nM en el del P58. Piesche indicó, además, que solo el péptido S10 de la SVN desencadenó la proliferación de linfocitos T 25 específicos tras la exposición a proteína SVN recombinante. Esto se demostró en tres clones de linfocitos T específicos del S10 procedentes de donantes diferentes. Piesche et al. investigaron el procesamiento y la presentación de los epítopos peptídicos de la SVN a partir del antígeno natural mediante el cocultivo de clones de linfocitos T específicos del péptido con células dendríticas expuestas a la proteína SVN. Sólo el péptido S10 de la SVN fue capaz de causar la proliferación de los linfocitos T específicos durante la exposición a la proteína SVN

30 recombinante. Esto se demostró en tres clones de linfocitos T específicos del S10 procedentes de donantes diferentes. No se detectó ninguna proliferación específica como respuesta al antígeno natural en los clones de linfocitos T específicos de la PR3.

Además, antígenos tumorales procedentes de células tumorales apoptósicas o necróticas fueron internalizados por APC in vivo, procesados independientemente de las MHC II y presentados a linfocitos T CD4+. Para el reconocimiento

35 por parte de los linfocitos T del auténtico epítopo S10 se expusieron células dendríticas (CD) a lisados de células tumorales procedentes de varias estirpes de células tumorales positivas para la SVN. En el caso del epítopo S10, se detectó el reconocimiento directo in vitro de las CD expuestas al lisado de estirpes de células tumorales Karpas-422, Jurkat y HL-60. Esto se demostró al menos en tres clones de linfocitos T específicos del S10 procedentes de donantes diferentes.

40 A fin de demostrar que el epítopo S10 puede provocar una respuesta inmunitaria en pacientes oncológicos es preciso confirmar la presencia de los correspondientes linfocitos T CD4+ en la sangre de dichos pacientes. Se aislaron PBMC de varios pacientes y se estimularon con el péptido S10. Con ese fin se extrajeron muestras de PBMC de los pacientes antes de iniciar el tratamiento y después del inicio del tratamiento citotóxico-citostático, y como células presentadoras de antígeno/péptido se emplearon los monocitos y los linfocitos B contenidos en la fracción de PBMC. Tras una semana

45 de cultivo, las células se analizaron para determinar la proliferación específica del péptido con un ensayo de incorporación de [3H]-timidina. En tres de los 13 pacientes analizados se detectó la respuesta proliferativa in vitro.

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La aplicación potencial de los epítopos peptídicos en la inmunoterapia depende básicamente de si los linfocitos T CD4+ específicos de péptido responden al antígeno correspondiente. El reconocimiento del antígeno proteico procesado naturalmente en forma de epítopos "auténticos" o "reales" depende en principio de varios factores.

Piesche mostró que el reconocimiento de la proteína solo resultó detectable con el epítopo S10 de la SVN. Con los demás péptidos identificados no se detectó el reconocimiento de la proteína (a saber, SVN: S40 y S88; PR3: P58, P216, P235 y P239). Piesche et al. afirmaron que durante la proteólisis endosómica es importante que los motivos de secuencia presentes no sean degradados, como en el caso de los epítopos "crípticos". En contraste con los epítopos restringidos a MHC de clase I, las moléculas MHC de clase II pueden captar péptidos de longitud variable (12-28) y, por tanto, no es necesaria la escisión de los epítopos peptídicos en longitudes concretas.

Los inventores revelan sorprendentemente en la presente invención que otro epítopo derivado de la survivina que es más corto que el S88, pero también se solapa, la SEC ID N.º 1, generó una potente respuesta inmunitaria en 16 de 19 pacientes in vivo (véase el ejemplo 4). Debido al elevado polimorfismo del locus HLA-DR, esto también demuestra la unión altamente promiscua del péptido de la SEC ID N.º 1 como se había predicho, puesto que la respuesta inmunitaria solo se puede desencadenar con la unión de un péptido a una molécula HLA.

La importancia de los diversos tipos de cáncer en los que se ha descrito la sobreexpresión de la survivina se indica en la Tabla 2. Los tipos de cáncer en los que se describe con frecuencia la sobreexpresión de la survivina fueron responsables de más de 415.000 muertes en 2007 (véase la tabla 1).

Piesche (2006) demostró en condiciones in vitro la presencia de precursores adecuados del péptido S88 en tres de cuatro donantes con alelos HLA-DR solapados. En este caso el peso de las pruebas es demasiado pequeño para deducir la unión promiscua del S88 al HLA-DR, puesto que los resultados se pueden explicar por la unión a dos alelos HLA-DR distintos (p. ej. DR3 y DR11, o DR1 y DR3, o DR11 y DR4). Asimismo, los índices de estimulación obtenidos en un ensayo de proliferación bastante inespecífico (incorporación de [3H]-timidina) en cultivos de PBMC enteras son bastante bajos y no se realizaron con un control positivo (p. ej. una mezcla conocida de péptidos virales fuertemente inmunogénicos) ni controles negativos adecuados (estimulación durante el ensayo de proliferación con un péptido control irrelevante). Los datos sobre las frecuencias de los precursores no fueron confirmados con un segundo ensayo de otro tipo.

Neurocan

El neurocan es un proteoglucano de condroitín sulfato de la familia del lecticán que forma parte de la matriz extracelular del sistema nervioso central. Se expresa principalmente durante los estadios de modelado y remodelado de dicho tejido. El neurocan comienza a aparecer primero en la médula espinal embrionaria a los 16-19 días de vida, en concreto en la región de las motoneuronas ventrales. En el cerebelo del neonato y del adulto la inmunoreactividad del neurocan se observa en la futura sustancia blanca y en las capas de neuronas granulares, neuronas de Purkinje y molecular (Meyer-Puttlitz et al., 1996). En el cerebro de rata embrionario y posnatal, el mensaje del neurocan se distribuye por la corteza, formación hipocámpica, los núcleos caudado y putamen y el neuroepitelio basal del telencéfalo, y su ARNm se halla en el epéndimo y el manto de la médula espinal. La presencia del ARNm del neurocan en zonas en las que no se expresan proteoglucanos sugiere que un corto marco abierto de lectura situado en la secuencia líder en 5’ del neurocan podría actuar como señal de regulación en cis para la modulación de la expresión del mismo en el sistema nervioso central en desarrollo (Engel et al., 1996). El neurocan se une a varios componentes de la matriz extracelular estructural como el hialuronano, la heparina y las tenascinas C y R (Grumet et al., 1994; Zacharias and Rauch, 2006), así como a los factores de crecimiento y movilidad FGF-2, HB-GAM y amfoterina. El neurocan también interactúa con varias moléculas de la superficie celular como N-CAM (Retzler et al., 1996; Friedlander et al., 1994), L1/Ng-CAM (Grumet et al., 1996), TAG1/axonina-1 y una N-acetilgalactosamina-fosforil-transferasa de unión a N-cadherina, y estudios in vitro han demostrado que es capaz de modular las actividades estimuladoras del crecimiento de neuritas y de la unión celular de todas esas moléculas (Rauch et al., 2001; Li et al., 2000).

A semejanza del fosfacán, el neurocan también se une a las neuronas y es un potente inhibidor de la adhesión neuronal y glial y del crecimiento de neuritas. Por su interacción con las moléculas de la matriz extracelular y las moléculas de adhesión de las células neurales podría desempeñar un papel importante en la modulación de la adhesión celular, el crecimiento de neuritas y la transducción de señales a través de la membrana plasmática durante el desarrollo del SNC (Margolis et al., 1996). Cuando se expresa en regiones que albergan pocas moléculas de adhesión, el neurocan podría actuar como barrera contra la migración celular y el crecimiento de los axones. En las regiones que contienen cantidades elevadas de proteínas de adhesión el neurocan podría seguir actuando para mantener ciertos límites al tiempo que permitiría la extensión selectiva de los axones (Grumet et al., 1996). Las lesiones en el sistema nervioso central adulto provocan la liberación de numerosas citocinas y factores de crecimiento que contribuyen a la gliosis reactiva y la síntesis de matriz extracelular. Los estudios in vitro han demostrado que la presencia de TGF-beta1 en el cerebro dañado aumenta enormemente la producción de neurocan por parte de los astrocitos (Smith and Strunz, 2005; Asher et al., 2000). En las lesiones medulares la expresión de neurocan, brevicán y versicán aumenta en el plazo de días en el parénquima medular dañado que rodea la zona de la lesión. Las concentraciones de neurocan aparecen elevadas persistentemente durante las 4 semanas posteriores a la lesión. Por lo que posiblemente interviene en la limitación de la regeneración axonal en las lesiones del SNC.

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Así pues, es probable que el aumento de la expresión del neurocan contribuya a la naturaleza "intolerante" de la cicatriz glial (Jones et al., 2003; Morgenstern et al., 2002; McKeon et al., 1999).

La presente invención proporciona así un péptido consistente en las secuencias de aminoácidos de la SEC ID N.º 1 (TLGEFLKLDRERAKN).

En una forma de realización preferida para el tratamiento del carcinoma de células renales el péptido de la SEC ID N.º 1 se usa en combinación con al menos dos de los péptidos de las SEC ID N.º 4 a 13. El péptido de la SEC ID N.º 1 puede ser administrado por separado o junto con otros péptidos en una formulación.

ID de la secuencia interna

Antígeno Secuencia SEC ID N.º

IMA-MMP-001

Metaloproteinasa de matriz 7 SQDDIKGIQKLYGKRS 4

IMA-ADF-002

Adipofilina VMAGDIYSV 5

IMA-ADF-001

Adipofilina SVASTITGV 6

IMA-APO-001

Apolipoproteína L1 ALADGVQKV 7

IMA-CCN-001

Ciclina D1 LLGATCMFV 8

IMA-GUC-001

GUCY1A3 SVFAGVVGV 9

IMA-K67-001

KIAA0367 ALFDGDPHL 10

IMA-MET-001

Protooncogén c-met YVDPVITSI 11

IMA-MUC-001

MUC1 STAPPVHNV 12

IMA-RGS-001

RGS-5 LAALPHSCL 13

IMA-HBV-001

HBV FLPSDFFPSV 14

En el documento WO 2007/028573 se da a conocer una descripción detallada de los péptidos y los antígenos 10 indicados arriba.

En una forma de realización preferida para el tratamiento del cáncer de colon el péptido de la SEC ID N.º 1 se usa en combinación con al menos dos de los péptidos de las SEC ID N.º 15 a 23, 4, 8, 11 o 12. El péptido de la SEC ID N.º 1 puede ser administrado por separado o junto con otros péptidos en una formulación.

SEC ID Nº:

ID del péptido Secuencia Símbolo del gen Función Se une a MHC

15

C20-001 ALSNLEVTL C20orf42 Implicado en el anclaje del citoesqueleto de actina a la matriz extracelular HLA-A*02

16

NOX-001 ILAPVILYI NOX1 NADPH-oxidasa HLA-A*02

17

ODC-001 ILDQKINEV ODC1 Ornitina-descarboxilasa HLA-A*02

18

PCN-001 KLMDLDVEQL PCNA Proteína auxiliar de la ADNpolimerasa delta HLA-A*02

19

TGFBI001 ALFVRLLALA TGFBI Factor de crecimiento transformante, beta-inducido HLA-A*02

20

TOP-001 KIFDEILVNA TOP2A/TOP2B Topoisomerasa HLA-A*02

21

TGFBI004 TPPIDAHTRNLLRNH TGFBI Factor de crecimiento transformante, beta-inducido HLA-DR

22

CEA-006 SPQYSWRINGIPQQHT CEACAM5 Antígeno carcinoembriónico HLA-DR

8

CCN-001 LLGATCMFV CCND1 Ciclina D1 HLA-A*02

12

MUC-001 STAPPVHNV MUC1 Mucina 1 HLA-A*02

4

MMP-001 SQDDIKGIQKLYGKRS MMP7 Metaloproteinasa 7 HLA-DR

23

CEA-004 YLSGANLNL CEACAM5 Variante del péptido CEA HLA-A*02

11

MET-001 YVDPVITSI MET Protooncogén met HLA-A*02

15 En los documentos EP07014796.2 y US 60/953.161 se da a conocer una descripción detallada de los péptidos y los antígenos indicados arriba.

Los péptidos de la invención tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humana (MHC) de clase–II.

En la presente invención el término "homólogo" se refiere al grado de identidad (véase antes Identidad porcentual)

20 entre las secuencias de dos secuencias de aminoácidos, es decir secuencias peptídicas o polipeptídicas. La susodicha "homología" se determina comparando las dos secuencias alineadas en condiciones óptimas con las secuencias a comparar. Las secuencias que se comparan en la presente memoria pueden tener una adición o deleción (por ejemplo, un hueco o similar) en la alineación óptima de las dos secuencias. La homología de secuencia se puede calcular creando una alineación con el algoritmo ClustalW, por ejemplo (Nucleic Acid Res.,

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22(22): 4673 4680 (1994). Bases de datos públicas proporcionan software para el análisis de secuencias, en concreto, Vector NTI, GENETYX y otras herramientas de análisis.

Una persona versada en la materia será capaz de valorar si los linfocitos T inducidos por una variante del péptido específico serán capaces de reaccionar con el propio péptido (Fong et al., 2001); (Zaremba et al., 1997; Colombetti 5 et al., 2006; Appay et al., 2006).

Por "variante" de la secuencia de aminoácidos los inventores quieren decir que las cadenas laterales de, por ejemplo, uno o dos de los residuos de aminoácidos están alteradas (por ejemplo sustituyéndolas con la cadena lateral de otro residuo de aminoácido natural o alguna otra cadena lateral) de modo que el péptido sigue siendo capaz de unirse a una molécula HLA básicamente de la misma manera que un péptido que consiste en la secuencia 10 de aminoácidos indicada en las SEC ID N.º 1 a 23.Por ejemplo, un péptido se puede modificar para que mejore o al menos mantenga la capacidad para interaccionar y unirse a la hendidura de unión de una molécula MHC adecuada, como HLA-A*02 o -DR, y de un modo que mejore o al menos mantenga la capacidad para unirse al TCR de CTL activados. Estos CTL pueden después reaccionar con células y matar las que expresen un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín definido en los aspectos de la invención. Como se puede 15 deducir de la bibliografía (Rammensee et al., 1997) y de las bases de datos científicas (Rammensee et al., 1999), ciertas posiciones de los péptidos de unión a HLA son normalmente residuos de anclaje que forman una secuencia central que encaja en el motivo de unión del receptor HLA, que está definida por las propiedades polares, electrofísicas, hidrofóbicas y espaciales de las cadenas polipeptídicas que constituyen la hendidura de unión. Así pues, una persona versada en la técnica será capaz de modificar las secuencias de aminoácidos expuestos en las

20 SEC ID N.º 1 a 23, manteniendo los residuos de anclaje conocidos, y será capaz de determinar si tales variantes mantienen la capacidad de unión a moléculas MHC de clase I o II. Las variantes de la presente invención conservan la capacidad para unirse a los TCR de los CTL activados, que después pueden reaccionar con células y matar las que expresan un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín definido en los aspectos de la invención.

25 Aquellos residuos de aminoácidos que no contribuyen sustancialmente a las interacciones con el receptor del linfocito T pueden ser modificados sustituyéndolos por otros aminoácidos cuya incorporación no afecte sustancialmente a la reactividad de los linfocitos T y no suprima la unión al MHC pertinente. Así pues, aparte de la condición indicada, el péptido de la invención puede ser cualquier péptido (en cuyo término los inventores incluyen oligopéptidos o polipéptidos), que incluya las secuencias de aminoácidos o una porción o una variante de las

30 mismas tal y como se indican.

Tabla 5: Variantes y motivo del péptido conforme a la SEC ID N.º 3

NCAN

Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Código del péptido

V L C G P P P A V

Variantes

M L

I

L

E

K

I

A G I I A E

L

Y P K L Y

F

F

T Y T H

K

P N

M

M

F

Y

S V

V

R

M

L

Es sabido que los péptidos que son presentados por MHC de clase II están compuestos por una "secuencia central"

dotada de una secuencia de aminoácidos que se ajusta a cierto motivo específico del alelo de HLA y, 35 opcionalmente, de extensiones N-y/o C-terminales que no interfieren con la función de la secuencia central (es

decir, que se consideran irrelevantes para la interacción del péptido y todos o una parte de los clones de linfocitos T

que reconocen la contrapartida natural). Las extensiones N-y/o C-terminales pueden, por ejemplo, tener entre 1 y 10

aminoácidos de longitud, respectivamente. Estos péptidos se pueden utilizar directamente para cargar las moléculas

MHC de clase II o bien la secuencia se puede clonar en vectores de acuerdo con la descripción ofrecida abajo en la 40 presente memoria. Dado que estos péptidos constituyen el producto final del procesamiento de péptidos más

grandes en el interior de la célula, también pueden utilizarse péptidos más largos.

En el caso de los péptidos restringidos a MHC de clase II, la molécula MHC puede presentar varios péptidos

distintos dotados de la misma secuencia central. Como la interacción con el linfocito T reconocedor (cooperador)

depende de la secuencia central de 9 a 11 aminoácidos, el mismo clon de linfocito T (cooperador) puede reconocer 45 varias variantes de longitud. Así pues para la carga directa de moléculas MHC de clase II se pueden usar diversas

variantes de longitud de una secuencia de unión central sin necesidad de ningún procesamiento adicional ni recortes en los extremos N y C-terminal. En consecuencia, las variantes naturales o artificiales que estimulan la reacción cruzada de los linfocitos T con un péptido de la invención son a menudo variantes de longitud.

imagen14

Si se utiliza directamente un péptido más largo de aproximadamente 12 residuos de aminoácidos para unirlo a moléculas MHC de clase II, es preferible que los residuos que flanquean la región de unión a HLA central sean 5 residuos que no afecten sustancialmente a la capacidad del péptido para unirse específicamente a la hendidura de unión de la molécula MHC de clase II o para presentar el péptido al linfocito T (cooperador). No obstante, como se ha indicado arriba, se apreciará que es posible usar péptidos más grandes, p. ej. los codificados por un polipéptido, ya que estos péptidos más grandes pueden ser fragmentados por células presentadoras de antígeno adecuadas. No obstante, en algunos casos se ha demostrado que las regiones que flanquean la secuencia central pueden influir en 10 la unión del péptido a la molécula MHC de clase II o en la interacción del complejo dimérico MHC:péptido con el TCR en ambas direcciones en comparación con un péptido de referencia dotado de la misma secuencia central. Las estructuras terciarias intramoleculares del péptido (p. ej. bucles) normalmente reducen la afinidad hacia el MHC o el TCR. Las interacciones intermoleculares de las regiones flanqueantes con otras partes del MHC o del TCR aparte de la misma hendidura de unión al péptido pueden estabilizar la interacción. Esos cambios de afinidad pueden ser

15 determinantes para que el péptido de MHC de clase II estimule de forma efectiva la respuesta de los linfocitos T (cooperadores).

También es posible que los epítopos de MHC de clase I, aunque suelen tener entre 8 y 10 aminoácidos de longitud, sean generados por el procesamiento de péptidos más largos o proteínas que incluyen el epítopo real. Se prefiere que los residuos que flanquean el epítopo de interés sean residuos que no afecten sustancialmente a la digestión

20 proteolítica necesaria para exponer el epítopo durante el procesamiento.

Los péptidos según la presente invención tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humana (MHC) de clase II. La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC puede ser analizada mediante procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo los descritos en la bibliografía para diferentes alelos de MHC de clase II (p. ej. Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et

25 al., 1995; Tompkins et al., 1993; Boyton et al., 1998).

Un péptido como el descrito, además de la secuencia conforme a cualquiera de las SEC ID N.º 1 a SEC ID N.º 3 o una variante de las mismas puede contener segmentos adicionales de aminoácidos en los extremos N-y/o Cterminales que no forman parte necesariamente del péptido que funciona como un epítopo para el epítopo de moléculas MHC.

30 No obstante, dichos segmentos pueden ser importantes para facilitar la introducción eficaz del péptido conforme a la presente invención en las células. En una forma de realización de la presente invención, el péptido es una proteína de fusión consistente en el péptido conforme a la SEC ID N.º 1 fusionado con los 80 aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo "Ii") tal y como aparece en el NCBI, número de acceso de GenBank X00497 (Strubin, M. et al. 1984).

35 Ejemplos de otros péptidos descritos incluyen péptidos dotados de un subtipo de HLA específico y que son capaces de estimular linfocitos CD8, en que dicho péptido comprende un motivo de aminoácidos de anclaje específico mostrado a continuación en la tabla 6.

Tabla 6: Subtipos de HLA y motivos de anclaje del péptido conforme a la SEC ID N.º 3

Péptido

Subtipo HLA Posición 1 2 3 4 5 6 7 8 9

3

A*02 Código del péptido V L C G P P P A V

Motivo de anclaje

x L x x x x x x V

40 Además, el péptido o variante pueden ser modificados aún más para mejorar la estabilidad y/o la unión a las moléculas de MHC con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria más potente. Los procedimientos para conseguir esa optimización de una secuencia peptídica son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la introducción de enlaces peptídicos inversos o enlaces no peptídicos.

En un enlace peptídico inverso los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino

45 que el enlace peptídico está invertido. Estos peptidomiméticos retro-inversos pueden sintetizarse con procedimientos conocidos en la técnica, como por ejemplo los descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Esta estrategia implica la síntesis de seudopéptidos que contienen cambios en la estructura principal, pero no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al. (1997) demuestran que estos seudopéptidos resultan útiles para la unión al MHC y las respuestas de los linfocitos T cooperadores. Los péptidos retro-inversos, que contienen

50 enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteolisis.

Enlaces no peptídicos son, por ejemplo, -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2-y -CH2SO-. La patente de Estados Unidos 4.897.445 proporciona un procedimiento para la síntesis en fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas polipeptídicas que implica la obtención de polipéptidos con procedimientos estándar y la síntesis del enlace no peptídico mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido en

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

presencia de NaCNBH3.

Péptidos que comprenden las secuencias descritas arriba pueden ser sintetizados con otros grupos químicos añadidos en los extremos amino y/o carboxi, con el fin de mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la afinidad de los péptidos. Por ejemplo, grupos hidrofóbicos como los grupos carbobenzoxilo, dansilo, o t-butiloxicarbonilo pueden añadirse a los extremos amino de los péptidos. De manera similar, se puede colocar un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo en los extremos amino de los péptidos. Asimismo, p. ej. el grupo hidrofóbico tbutiloxicarbonilo, o un grupo amido pueden ser añadidos en los extremos carboxi de los péptidos.

Adicionalmente, todos los péptidos descritos pueden ser sintetizados para alterar su configuración estérica. Por ejemplo, puede utilizarse el isómero D de uno o más de los residuos de aminoácidos del péptido en lugar del isómero L habitual. Y aún más, al menos uno de los residuos de aminoácidos de los péptidos de la invención puede ser sustituido por uno de los consabidos residuos de aminoácidos no naturales. Alteraciones como éstas pueden servir para aumentar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la capacidad de unión de los péptidos de la invención.

De manera similar, un péptido o variante descritos pueden ser modificados químicamente mediante la reacción con aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. Ejemplos de tales modificaciones son bien conocidos en la técnica y aparecen resumidos, por ejemplo, en R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3.ª ed. CRC Press, 2005, que se incorpora en la presente memoria como referencia. La modificación química de aminoácidos incluye, sin ánimo limitativo, la modificación por acilación, amidinación, piridoxilación de lisina, alquilación reductora, trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), transformación de grupos carboxilo en grupos amida y oxidación del grupo sulfhidrilo con ácido perfórmico para convertir la cisteína en ácido cisteico, formación de derivados mercuriales, formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol, reacción con maleimida, carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida y carbamoilación con cianato a pH alcalino, aunque sin limitación a ello. A este respecto, se remite a las personas versadas en la técnica al Capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000), donde hallarán una metodología más extensa relacionada con la modificación química de proteínas.

En resumen, la modificación de, p. ej., los residuos arginilos de las proteínas se basa a menudo en la reacción de compuestos dicarbonilo adyacentes como fenilglioxal, 2,3-butanodiona, y 1,2-ciclohexanodiona para formar un aducto. Otro ejemplo es la reacción de metilglioxal con residuos de arginina. La cisteína se puede modificar sin la modificación simultánea de otros sitios nucleofílicos como sucede con la lisina y la histidina. Así pues, para la modificación de la cisteína hay disponible un gran número de reactivos. Las páginas web de empresas como Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) ofrecen información sobre reactivos concretos.

La reducción selectiva de los puentes disulfuro de las proteínas también es habitual. El tratamiento térmico al cual se someten los productos biofarmacéuticos a veces genera y oxida puentes disulfuro.

El reactivo K de Woodward se puede utilizar para modificar residuos de ácido glutámico concretos. Se puede emplear N-(3-(dimetilamino)propil)-N’-etilcarbodiimida para formar enlaces cruzados intramoleculares entre un residuo de lisina y un residuo de ácido glutámico.

Por ejemplo, el dietilpirocarbonato es un reactivo empleado para la modificación de residuos histidilo en proteínas. La histidina también puede ser modificada con 4-hidroxi-2-nonenal.

La reacción de los residuos de lisina y otros grupos α-amino es útil, por ejemplo, para la unión de péptidos a superficies o para la formación de enlaces cruzados entre proteínas/péptidos. La lisina es el sitio de fijación del poli(etilen)glicol y el principal sitio de modificación en la glucosilación de proteínas. Los residuos de metionina de las proteínas se pueden modificar, por ejemplo, con yodoacetamida, bromoetilamina y cloramina T. Los residuos tirosilo se pueden modificar con tetranitrometano y N-acetilimidazol. La formación de enlaces cruzados por medio de la formación de ditirosina se puede consumar con peróxido de hidrógeno/iones de cobre.

En estudios recientes sobre la modificación del triptófano se han empleado N-bromosuccinimida, 2-hidroxi-5nitrobenzilbromuro o 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-escatol).

La modificación de proteínas y péptidos terapéuticos con PEG se asocia a menudo con una prolongación de la semivida en circulación, mientras que la unión por entrecruzamiento de proteínas con glutaraldehído, diacrilato de polietilenglicol y formaldehído se emplea en la preparación de hidrogeles. La modificación química de alérgenos en inmunoterapia se consigue a menudo mediante la carbamilación con cianato potásico.

Un péptido o variante que está modificado o que incluye enlaces no peptídicos es una forma de realización preferida de la invención. En general, péptidos y variantes (al menos aquellas que contienen enlaces peptídicos entre los residuos de aminoácidos) pueden ser sintetizados, p. ej., utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida por el procedimiento de Fmoc-poliamida, como muestra Lu et al. (1981) y las referencias que aparecen en el mismo. La protección provisional del grupo N-amino se consigue con el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La escisión repetida de este grupo protector muy sensible al pH básico se lleva a cabo con piperidina al 20% en N,Ndimetilformamida. Los grupos funcionales de las cadenas laterales se podrían proteger si se transformaran en éteres de butilo (en el caso de la serina, treonina y tirosina), ésteres de butilo (en el caso del ácido glutámico y aspártico),

imagen15

derivados butiloxicarbonílicos (en la lisina y la histidina), derivados tritilados (en la cisteína) y derivados 4-metoxi2,3,6-trimetilbenzenosulfonílicos (en la arginina). Cuando los residuos C-terminales son glutamina o asparragina se utiliza el grupo 4,4'-dimetoxibenzhidrilo para proteger los grupos funcionales amido de la cadena lateral. El soporte en fase sólida se basa en un polímero de polidimetil-acrilamida constituido por los tres monómeros dimetilacrilamida 5 (monómero estructural), bisacriloiletilendiamina (entrelazante) y acriloilsarcosina metiléster (funcionalizador). El agente escindible que mantiene unido el péptido a la resina es un derivado del ácido 4-hidroximetilfenoxiacético, sensible a pH ácido. Todos los derivados de aminoácidos se añaden en forma de derivados anhídridos simétricos preformados salvo la asparragina y la glutamina, que se añaden utilizando un procedimiento de acoplamiento inverso con N,N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y 10 desprotección se controlan con procedimientos de ensayo con ninhidrina, ácido trinitrobencenosulfónico o isotina. Una vez completada la síntesis, los péptidos se separan del soporte de resina y al mismo tiempo se eliminan los grupos protectores de las cadenas laterales mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% con una mezcla de capturadores (scavengers) al 50%. Los capturadores utilizados normalmente son etanditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo de la elección exacta de los aminoácidos constituyentes del péptido que se está sintetizando. La

15 síntesis de péptidos también es posible combinando metodologías de fase sólida y de fase en solución (véase por ejemplo (Bruckdorfer et al., 2004) y las referencias citadas en la misma).

El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación en vacío y se procede a la trituración con dietiléter para obtener el péptido bruto. Todos los capturadores (scavengers) se eliminan con un procedimiento de extracción simple que con la liofilización de la fase acuosa proporciona el péptido bruto exento de ellos. Los reactivos para la síntesis de

20 péptidos se pueden conseguir en general por ejemplo de Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Reino Unido.

La purificación puede llevarse a cabo mediante una sola o una combinación de técnicas como la recristalización, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por interacción hidrofóbica y (normalmente) cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa utilizando, p. ej., la

25 separación con gradiente de acetonitrilo/agua.

El análisis de los péptidos puede efectuarse utilizando cromatografía de capa fina, electroforesis, en particular electroforesis capilar, extracción en fase sólida (CSPE), cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa, análisis de aminoácidos tras hidrólisis ácida y análisis con espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (FAB), así como análisis con espectrometría de masas MALDI y ESI-Q-TOF.

30 Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico (por ejemplo un polinucleótido) que codifica un péptido de la invención. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, APN, ACN, ARN o combinaciones de los mismos, monocatenarios y/o bicatenarios, o formas nativas o estabilizadas de polinucleótidos, como por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fosforotioato y que pueden contener intrones siempre que codifique el péptido. Por supuesto, sólo los péptidos que contengan residuos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídicos

35 naturales pueden ser codificados por un polinucleótido. Otro aspecto más de la invención proporciona un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido conforme a la descripción.

Se han desarrollado diversos procedimientos para unir polinucleótidos, especialmente ADN, a vectores, por ejemplo a través de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, al segmento de ADN se le pueden añadir prolongaciones de homopolímeros complementarios para insertarlo en el vector de ADN. El vector y el segmento de

40 ADN se unen a continuación por medio de puentes de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.

Otro procedimiento alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores son los ligadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción. Existen ligadores sintéticos comerciales que contienen diversas dianas para las endonucleasas de restricción que facilitan varios proveedores como International Biotechnologies Inc. New

45 Haven, CN, EE. UU.

Un procedimiento deseable para modificar el ADN que codifica el polipéptido de la invención emplea la reacción en cadena de la polimerasa tal y como exponen (Saiki et al., 1988)).Este procedimiento puede ser utilizado para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo diseñando las dianas de restricción adecuadas, o puede ser empleado para modificar el ADN de otros modos útiles conocidos en la técnica. Si se opta por vectores virales, son

50 preferibles los vectores poxvíricos o adenovíricos.

El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) se puede expresar en un hospedador adecuado para producir un polipéptido que comprenda el péptido o variante de la invención. Así pues, el ADN que codifica el péptido de la invención puede ser utilizado conforme a técnicas conocidas, modificado adecuadamente siguiendo las enseñanzas contenidas en la presente memoria para construir un vector de expresión que se emplee para

55 transformar una célula hospedadora a fin de que exprese y produzca el polipéptido de la invención. Tales técnicas incluyen las reveladas en las patentes de EE. UU. N.º 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 y 4.810.648.

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El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) que codifica el péptido que constituye el compuesto de la invención se puede unir con una amplia variedad de secuencias de ADN distintas para introducirlo en un hospedador adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del hospedador, el modo de introducir el ADN en su interior y de si se pretende que se integre o que se mantenga como un episoma.

5 En general, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación apropiada y el marco de lectura correcto para asegurar la expresión. Si es necesario, el ADN se puede enlazar con secuencias nucleotídicas de control que regulan la transcripción o la traducción y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque en general tales controles ya suelen estar incluidos en el propio vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en el hospedador mediante técnicas estándar. En general, el vector no consigue

10 transformar todos los hospedadores, lo que hará necesario seleccionar las células hospedadoras que hayan quedado transformadas. Una técnica de selección consiste en incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios que codifique un rasgo seleccionable en la célula transformada, como por ejemplo de resistencia a antibióticos.

Otra alternativa consiste en incorporar el gen de ese rasgo seleccionable en otro vector con el que se cotransforma

15 la célula hospedadora. Las células hospedadoras que hayan sido transformadas con el ADN recombinante de la invención se cultivarán durante el tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas que las personas versadas en la técnica conocen a la vista de las enseñanzas reveladas en la presente memoria para que el polipéptido pueda expresarse y, finalmente, ser recuperado.

Son muchos los sistemas de expresión conocidos, como bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras

20 (Saccharomyces cerevisiae, etc.), hongos filamentosos (género Aspergillus, etc.), células vegetales, animales o de insectos. Preferiblemente el sistema consistirá en células de mamífero, como las células CHO disponibles de la ATCC Cell Biology Collection.

Un típico vector plasmídico de expresión constitutiva para células de mamífero comprende el promotor del CMV o del SV40 con una cola poli-A adecuada y un marcador de resistencia como la neomicina. Un ejemplo es el pSVL que 25 ofrece Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. UU. Un ejemplo de vector de expresión inducible para mamífero es el pMSG, también suministrado por Pharmacia. Otros vectores plasmídicos de levadura son pRS403-406 y pRS413-416, en general proveídos por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centroméricos de levadura (Ycp).

30 Los vectores dotados del promotor del CMV (por ejemplo de Sigma-Aldrich) proporcionan una expresión transitoria o estable, expresión en el citoplasma o secreción, y marcaje de los extremos N-terminal o C-terminal en varias combinaciones de FLAG, 3xFLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, la purificación y el análisis de la proteína recombinante. Las fusiones con doble etiqueta aportan flexibilidad a la detección.

La potente región reguladora promotora del citomegalovirus (CMV) humano ofrece niveles de expresión constitutiva

35 de la proteína muy elevados, de hasta 1 mg/l en células COS. En estirpes celulares menos potentes los niveles de proteínas suelen rondar ~0,1 mg/l. La presencia del origen de replicación del SV40 genera niveles elevados de replicación del ADN en células COS que toleran la replicación del SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen pMB1 (derivado del pBR322) para la replicación en células bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la selección por resistencia a la ampicilina, hGH poliA, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia

40 líder de la preprotripsina (PPT) pueden canalizar la secreción de las proteínas de fusión FLAG hacia el medio de cultivo, donde se pueden purificar por medio de anticuerpos ANTI-FLAG, resinas y placas. En la técnica se conocen otros vectores y sistemas de expresión aptos para el uso con una variedad de células hospedadoras.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora transformada con un vector polinucleotídico de la presente invención. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las células bacterianas pueden ser las 45 células hospedadoras procariotas más adecuadas en determinadas circunstancias; normalmente son cepas de E. coli, como por ejemplo las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE. UU., y RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EE. UU. (N.º ATCC 31343).Las células hospedadoras eucariotas preferidas son células de levadura, de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de ratón, rata, mono o ser humano. Las 50 células hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general están disponibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Las células hospedadoras de mamífero preferidas incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las células embrionarias de ratón suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las células COS-1 de riñón de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las células 293 que son células renales embrionarias humanas. Las

55 células de insecto preferidas son las células Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresión baculovíricos. Se puede encontrar una revisión general referente a la elección de las células hospedadoras más adecuadas por ejemplo en el manual de Paulina Balbás y Argelia Lorence "Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols", Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliografía conocida por las personas versadas en la materia.

60 La transformación de las células hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente invención se consuma con procedimientos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la transformación de células hospedadoras procariotas, véanse por ejemplo Cohen et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110, y Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

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5 Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. La transformación de células de levadura aparece descrita en Sherman et al.(1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, EE. UU. El procedimiento de Beggs (1978) Nature 275,104-109 también resulta útil. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las células de vertebrados, por ejemplo el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o transfección de las células y es perfectamente conocida su aplicación en la transformación de células de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.

Las células transformadas con éxito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presente invención, se

15 pueden identificar con técnicas bien conocidas como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la proteína en el sobrenadante por medio de anticuerpos.

Se apreciará que ciertas células hospedadoras de la invención son útiles para la preparación de péptidos de la invención, por ejemplo las células bacterianas, de levadura e insecto. Con todo, para ciertos procedimientos terapéuticos pueden ser útiles otras células hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar células presentadoras de antígeno como las células dendríticas para expresar los péptidos de la invención de tal forma que puedan ser cargados en las moléculas MHC oportunas. Así pues, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión conforme a la invención.

En una forma de realización preferida la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular

25 una célula dendrítica o célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática (PAP) son en la actualidad objeto de investigación como tratamiento contra el cáncer de próstata (Sipuleucel–T) (Small et al., 2006; Rini et al., 2006).

Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento para la producción de un péptido o de su variante, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de una célula hospedadora y el aislamiento del péptido a partir de dicha célula o de su medio de cultivo.

En otra forma de realización el péptido, el ácido nucleico o el vector expresión de la invención se emplean en el tratamiento del cáncer, preferiblemente como vacuna. Por ejemplo, el péptido puede ser preparado para la inyección por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) o intramuscular (i.m.).Los procedimientos preferidos para la inyección del péptido incluyen s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Los procedimientos

35 preferidos para la inyección del ADN incluyen i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Según el péptido o ADN de que se trate se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 µg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 µg a 500 µg de péptido o ADN. Dosis en esos intervalos se han empleado en ensayos anteriores (Brunsvig et al. 2006; Staehler et al. 2007).

Otro aspecto de la divulgación incluye un procedimiento in vitro para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, comprendiendo dicho procedimiento la puesta en contacto en condiciones in vitro de CTL con moléculas MHC de clase I o II humanas cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno o un constructo artificial que imite a una célula presentadora de antígeno durante un período de tiempo suficiente para activar dichos CTL de una manera específica de antígeno, siendo el antígeno el péptido conforme a la invención. Preferentemente se emplea una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.

Cuando se esté utilizando como antígeno un epítopo de MHC de clase II, los linfocitos T serán linfocitos

45 cooperadores CD4-positivos, preferiblemente del tipo TH1. Las moléculas MHC de clase II se pueden expresar en la superficie de cualquier célula adecuada. Preferiblemente la célula no debe expresar de forma natural moléculas MHC de clase II (de ser así, la célula tendrá que ser transfectada para que exprese dicha molécula). Si, en cambio, la célula expresa de forma natural moléculas MHC de clase II es preferible que sea defectuosa en los mecanismos de procesamiento o presentación de antígenos. De ese modo será posible que la célula que expresa la molécula MHC de clase II quede completamente cargada con el antígeno peptídico escogido antes de activar el linfocito T.

La célula presentadora de antígeno (o célula estimuladora) normalmente presenta moléculas de MHC de clase II en su superficie y preferiblemente es básicamente incapaz de cargar dicha molécula de MHC de clase II con el antígeno seleccionado. La molécula de MHC de clase II puede cargarse fácilmente in vitro con el antígeno seleccionado.

55 Preferiblemente, la célula de mamífero carece del transportador de péptidos TAP o bien este se presenta en un nivel reducido o funciona defectuosamente. Las células adecuadas que carecen del transportador de péptidos TAP incluyen las células T2, RMA-S y de Drosophila. TAP es el transportador relacionado con el procesamiento de los antígenos.

La estirpe celular humana deficiente en carga de péptidos T2 está disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE. UU. con el N.º de catálogo CRL 1992; la estirpe de células de Drosophila Schneider line 2 está disponible en la ATCC con el N.º de catálogo CRL 19863; la estirpe de células de ratón RMA-S está descrita en Karre et al. 1985.

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Preferentemente, la célula hospedadora no expresa sustancialmente moléculas MHC de clase I antes de la

5 transfección. También es preferible que la célula estimuladora exprese una molécula importante que proporcione una señal coestimuladora para los linfocitos T, como B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA 3. Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase I y de las moléculas co-estimuladoras están disponibles públicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.

De forma similar, si se utiliza como antígeno un epítopo de MHC de clase I, los linfocitos T serán CTL CD8-positivos.

10 Si una célula presentadora de antígeno es transfectada para expresar un epítopo de ese tipo, la célula comprenderá preferentemente un vector de expresión capaz de expresar un péptido que contenga la SEC ID N.º 1.

Existen otros procedimientos para generar CTL in vitro. Por ejemplo, los procedimientos descritos en Peoples et al. (1995) y Kawakami et al. (1992) emplean linfocitos autólogos infiltrados en el tumor para generar los CTL. Plebanski et al (1995) recurren a linfocitos autólogos de sangre periférica (PLB) para la preparación de los CTL. Jochmus et al. 15 (1997) describen la producción de CTL autólogos estimulando células dendríticas con el péptido o el polipéptido, o a través de la infección con virus recombinantes. Hill et al. (1995) y Jerome et al. (1993) emplean linfocitos B para la producción de CTL autólogos. Asimismo, para la preparación de CTL autólogos se pueden usar macrófagos estimulados con péptido o polipéptido, o infectados con virus recombinantes. S. Walter et al. 2003 describen la sensibilización in vitro de linfocitos T mediante células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC), que es otro 20 modo adecuado para generar linfocitos T contra el péptido de elección. En este estudio, las aAPC se generaron adhiriendo complejos MHC:péptido preformados a la superficie de partículas de poliestireno (microperlas) con biotina:estreptavidina. Este sistema permite controlar con exactitud la densidad de MHC en las aAPC, lo que permite desencadenar respuestas de linfocitos T específicas de antígeno con una avidez alta o baja a partir de muestras de sangre, de una forma selectiva y altamente eficaz. Además de los complejos MHC:péptido, las aAPC deben

25 incorporar acopladas en su superficie otras proteínas con actividad co-estimuladora como anticuerpos anti-CD28. Tales sistemas de aAPC también precisan a menudo el concurso de factores solubles adecuados, por ejemplo citocinas como la interleucina-12.

Para la preparación de linfocitos T también se pueden utilizar células alogénicas; en el documento WO 97/26328 se describe detalladamente un procedimiento. Por ejemplo, además de células de Drosophila y células T2, para

30 presentar antígenos se pueden usar otras células tales como células CHO, células de insecto infectadas con baculovirus, bacterias, levaduras, células diana infectadas con virus vacunal. Asimismo se pueden utilizar virus vegetales (véase por ejemplo Porta et al. (1994), que describen el desarrollo del virus del mosaico del chícharo como sistema de alto rendimiento para la presentación de péptidos extraños).

Los linfocitos T activados que están dirigidos contra los péptidos de la invención son útiles como tratamiento. Los

35 linfocitos T activados producidos con el susodicho procedimiento reconocerán selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º 1.

Preferiblemente el linfocito T reconoce la célula interaccionando a través de su TCR con el complejo HLA/péptido, por ejemplo uniéndosele. Los linfocitos T son útiles en un procedimiento para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresen de forma aberrante un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos de 40 la invención y al cual se le administre un número eficaz de linfocitos T activados. Los linfocitos T que se le administran al paciente pueden proceder de él mismo y ser activados del modo antes descrito, es decir, son linfocitos T autólogos. Otra alternativa consiste en que los linfocitos T no sean del paciente y procedan de otro individuo. Por supuesto, es preferible que dicho individuo esté sano. Por "individuo sano" los inventores entienden un individuo que goce de buen estado de salud general, preferentemente con un sistema inmunitario competente y,

45 más preferentemente, no sufra ninguna enfermedad que pueda detectarse mediante análisis.

En condiciones in vivo, las células diana de los linfocitos T CD4-positivos conformes a la presente invención pueden ser células del tumor (que a veces expresan MHC de clase II) y/o células estromales circundantes al tumor (células tumorales) (que en ocasiones también expresan MHC de clase II; (Dengjel et al., 2006)).

Los linfocitos T de la presente invención se pueden usar como principios activos de una composición terapéutica.

50 Por tanto, la divulgación también proporciona un procedimiento para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, comprendiendo dicho procedimiento la administración al paciente de un número eficaz de linfocitos T como los definidos arriba.

Por "expresado de forma aberrante" los inventores también quieren decir que el polipéptido está sobreexpresado en

55 comparación con los niveles normales de expresión o que el gen está reprimido en el tejido del que deriva el tumor pero en cambio se expresa en éste. Por "sobreexpresado" los inventores quieren decir que el nivel del polipéptido es como mínimo 1,2 veces mayor que el nivel en el tejido normal; preferiblemente como mínimo 2 veces mayor, y más preferiblemente como mínimo 5 o 10 veces mayor que el del tejido normal.

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Los linfocitos T se pueden obtener por procedimientos conocidos en la materia, como por ejemplo los antes descritos. Los protocolos para la llamada transferencia adoptiva de linfocitos T son perfectamente conocidos y se pueden encontrar por ejemplo en (Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudley et al., 2002; Yee et al., 2002; Dudley et al., 2005); pueden consultarse revisiones en (Gattinoni et al., 2006) y en (Morgan et al., 2006).

5 Cualquier molécula de la invención, ya sea péptido, ácido nucleico, vector de expresión o célula hospedadora es útil para el tratamiento de trastornos caracterizados por células que eluden la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, cualquier molécula de la presente invención puede ser utilizada como medicamento o en la fabricación de un medicamento. La molécula puede ser utilizada sola o combinada con otra molécula o moléculas de la invención o con cualquier molécula o moléculas conocidas.

10 Preferiblemente, el medicamento de la presente invención es una vacuna. La vacuna puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o por vía sistémica de forma i.d., i.m, s.c., i.p. e i.v., o aplicarse ex vivo a células derivadas del paciente o a una línea celular humana que después se administra al paciente, o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias derivadas del paciente que después se le vuelven a administrar. Si el ácido nucleico se administra a células in vitro, puede ser útil que estas células sean

15 transfectadas para que expresen simultáneamente citocinas inmunoestimuladoras, como la interleucina-2.El péptido puede ser sustancialmente puro, o combinarse con un adyuvante inmunoestimulador (véase abajo) o utilizarse en combinación con citocinas inmunoestimuladoras, o bien administrarse mediante otro sistema de liberación adecuado, como por ejemplo liposomas. El péptido también se puede conjugar con un portador adecuado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el manano (véanse WO 95/18145 y Longenecker et al. (1993)). El péptido

20 también se puede etiquetar, o formar proteínas de fusión o moléculas híbridas, entre otros. Se espera que los péptidos cuya secuencia se ofrece en la presente invención estimulen a los linfocitos T CD4 o CD8. No obstante, la estimulación de los CTL CD8 es más eficiente si cuentan con la ayuda de los linfocitos T cooperadores CD4. Así pues, los epítopos de MHC de clase I que estimulan a los CTL CD8, el compañero de fusión o las secciones de una molécula híbrida adecuada proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4-positivos. Los epítopos

25 estimuladores de los CD4 y CD8 son bien conocidos en la técnica e incluyen los identificados en la presente invención.

En un aspecto, la vacuna comprende al menos un péptido dotado de la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID N.º 1 y al menos otro péptido adicional, preferiblemente dos a 50, más preferiblemente dos a 25, incluso más preferiblemente dos a 15 y más preferiblemente dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce,

30 trece, catorce o quince péptidos. Los péptidos pueden derivar de uno o más TAA específicos y se pueden unir a moléculas MHC de clase I y/o II. Preferiblemente al menos un péptido adicional tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEC ID N.º 4 a 23.

El polinucleótido puede ser sustancialmente puro, o estar contenido en un vector o un sistema de liberación adecuado. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, APN, ACN, ARN o una combinación de los mismos. Los 35 procedimientos para diseñar e introducir ese ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia. Se puede consultar una revisión general por ejemplo en Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, o A Mahdavi 2006. Las vacunas polinucleotídicas son fáciles de preparar, pero el mecanismo por el cual tales vectores inducen la respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberación adecuados incluyen los de ADN y/o ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus vacunal, retrovirus, herpesvirus, virus del tipo de

40 adenovirus o híbridos que contienen elementos de varios virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos que son bien conocidos como técnicas para la introducción de ADN. Los procedimientos de introducción físicos, como la "pistola génica", también pueden utilizarse. El péptido o péptidos codificados por el ácido nucleico pueden ser una proteína de fusión, por ejemplo con un epítopo que estimule los linfocitos T para el respectivo CDR opuesto, tal y como se ha indicado antes.

45 El medicamento de la invención también puede incluir uno o varios adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que potencian o estimulan de forma inespecífica la respuesta inmunitaria (p. ej. respuestas inmunitarias mediadas por CTL y linfocitos T cooperadores (TH) contra un antígeno, y podrían ser considerados útiles en el medicamento de la presente invención. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen, entre otros: 1018 ISS, sales de aluminio, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870,893, CpG7909, CyaA, dSLIM, ligandos de flagelina o TLR5 derivados de flagelina,

50 ligando de FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, Imiquimod (ALDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL2, IL-13, IL-21, interferón alfa o beta o derivados pegilados de los mismos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, lípido monofosforilo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, micropartículas de dextrano y PLG, resiquimod, SRL172, virosomas y

55 otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R848, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila, que deriva de la saponina, extractos de micobacterias y miméticos sintéticos de la pared bacteriana, y otros adyuvantes patentados como Detox de Ribi, Quil o Superfos. Se prefieren los adyuvantes como el adyuvante de Freund o el GM-CSF. Con anterioridad se han descrito varios adyuvantes inmunológicos (p. ej. MF59) específicos para las células dendríticas, así como la preparación de los mismos (Dupuis M et al. 1998; Allison 1998). También se

60 pueden usar citocinas. A varias citocinas se las ha atribuido una influencia directa en la migración de las células dendríticas hacia los tejidos linfoides (p. ej. el TNF-α), como parte de un proceso que acelera su maduración hasta convertirlas en células presentadoras de antígeno de los linfocitos T (p. ej., GM-CSF, IL-1 e IL-4) (patente de EE. UU. N.º 5.849.589, incorporada íntegramente en la presente memoria como referencia) y en el que actúan como inmunoadyuvantes (p. ej., la IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al. 1996).

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También se ha descrito que los oligonucleótidos de CpG inmunoestimuladores potencian los efectos de los adyuvantes en vacunas. Sin limitarse a la teoría, los oligonucleótidos de CpG actúan activando el sistema 5 inmunitario innato (no adaptativo) a través de los receptores de tipo Toll (TLR), principalmente el TLR9. La activación del TLR9 desencadenada por los CpG potencia las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno contra una amplia gama de antígenos, incluidos antígenos peptídicos o proteicos, virus vivos o muertos, vacunas de células dendríticas, vacunas de células autólogas y conjugados de polisacáridos, tanto en vacunas profilácticas como terapéuticas. Más importante aún, potencian la maduración y la diferenciación de las células dendríticas, lo cual 10 resulta en una mayor activación de los linfocitos TH1 y una generación más potente de linfocitos T citotóxicos (CTL), incluso sin la ayuda de los linfocitos T CD4. La tendencia hacia la respuesta TH1 provocada por la estimulación del TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes vacunales como el aluminio o el adyuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promueven un sesgo hacia la respuesta TH2. Los oligonucleótidos de CpG muestran incluso una mayor actividad adyuvante cuando se formulan o administran conjuntamente con otros 15 adyuvantes o en formulaciones como micropartículas, nanopartículas, emulsiones de lípidos o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta potente cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmunitaria y permiten reducir las dosis de antígeno aproximadamente en dos órdenes de magnitud, habiendo obtenido en algunos experimentos respuestas de anticuerpos comparables a las conseguidas con la dosis completa de vacuna sin CpG (Krieg et al. 2006).La patente

20 de EE. UU. N.º 6.406.705 B1 describe el uso combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes sin ácidos nucleicos y un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención es un antagonista CpG del TLR9 conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlín, Alemania). También se pueden utilizar otras moléculas que se unen a los TLR como ARN que se unen a TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9.

25 Entre los ejemplos de adyuvantes útiles también se incluyen CpG modificados químicamente (p. ej., CpR, Idera), análogos ARNdc como poli(I:C) y AmpliGen, ARN o ADN bacteriano sin CpG, así como anticuerpos y moléculas pequeñas inmunoactivas como ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafenib, temozolomida, temsirolimús, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 y SC58175, que pueden actuar de forma terapéutica y/o como adyuvantes. Las cantidades y

30 concentraciones de adyuvantes y de aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por las personas versadas en la técnica sin demasiada experimentación. Los adyuvantes preferidos son dSLIM, interferones alfa o beta, CpG7909, IC31, ALDARA (Imiquimod), PeviTer, ARN, tadalafilo, temozolomida y JuvImmune.

La presente invención proporciona un medicamento que es útil para el tratamiento del cáncer, en particular del

35 glioma y del cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer de páncreas, carcinomas espinocelulares y neoplasias queratinocíticas de la piel, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de ovario y melanoma.

La presente invención también contempla un kit que comprende: (a) un envase que contiene una composición farmacéutica como la descrita arriba, en forma de solución o liofilizada; (b) opcionalmente, un segundo envase que

40 contiene un diluyente o una solución de reconstitución para la formulación liofilizada; y (c) opcionalmente, instrucciones para (i) el uso de la solución o (ii) reconstitución y/o uso de la formulación liofilizada.

El kit puede comprender, además, uno o más de los siguientes componentes: (iii) un tampón, (iv) un diluyente, (v) un filtro, (vi) una aguja, o (v) una jeringa. El envase es preferiblemente un frasco, un vial, una jeringa o un tubo de ensayo; puede ser un envase multiusos. Se prefiere que la composición farmacéutica esté liofilizada.

45 Los kits de la presente invención comprenden, preferiblemente, una formulación liofilizada de la presente invención en un envase adecuado e instrucciones para su reconstitución y/o uso. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales (p. ej., viales con doble cámara), jeringas (como jeringas con doble cámara) y tubos de ensayo. El envase puede estar formado por diversos materiales como vidrio o plástico. Preferiblemente el kit y/o envase contienen o van acompañados de instrucciones de reconstitución y/o uso. Por ejemplo, el prospecto puede

50 indicar que la formulación liofilizada debe reconstituirse para obtener ciertas concentraciones de péptidos como las descritas en páginas precedentes. La etiqueta puede indicar, además, que la formulación puede administrarse o está destinada a la administración subcutánea.

El envase que contiene la formulación puede ser un vial multiuso que permita varias administraciones (p. ej., de 2 a 6 administraciones) de la formulación reconstituida. El kit puede comprender, además, un segundo envase que

55 contenga un diluyente adecuado (p. ej., una solución de bicarbonato sódico).

Después de mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final del péptido en la formulación reconstituida es preferiblemente como mínimo de 0,15 mg/ml/péptido (=75 µg) y preferiblemente como máximo de 3 mg/ml/péptido (=1500 µg). El kit puede incluir, además, otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, tales como otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.

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Los kits de la presente invención pueden tener un solo envase que contenga la formulación de las composiciones farmacéuticas acordes con la presente invención acompañado o no de otros componentes (p. ej. otros compuestos o composiciones farmacéuticas de estos otros compuestos) o pueden contar con un envase distinto para cada componente.

5 Preferiblemente, los kits de la invención incluyen una formulación de la invención acondicionada para ser utilizada y administrada conjuntamente con un segundo compuesto (como adyuvantes (p. ej. GM-CSF), un agente de quimioterapia, un producto natural, una hormona o un antagonista, un inhibidor o agente anti-angiogénesis, un inductor de la apoptosis o un quelante) o una composición farmacéutica de los mismos. Los componentes del kit pueden estar preagrupados o cada componente puede estar en un envase separado antes de la administración al

10 paciente. Los componentes del kit pueden proporcionarse en una o varias soluciones líquidas, preferiblemente en una solución acuosa y, con mayor preferencia, en una solución acuosa estéril. Los componentes del kit también pueden facilitarse en forma de sólidos, y pueden convertirse en líquidos añadiendo los disolventes adecuados, que preferiblemente se proporcionan en otro envase distinto.

El envase de un kit terapéutico puede ser un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa, o cualquier otro medio

15 para contener un sólido o líquido. Si hay más de un componente, normalmente el kit contendrá un segundo vial u otro envase para permitir la dosificación por separado. El kit también puede contener otro envase para un líquido farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente el kit terapéutico contendrá un aparato (p. ej., una o varias agujas, jeringas, cuentagotas, pipeta, etc.) para permitir la administración de los agentes de la invención que son componentes del presente kit.

20 La presente formulación puede ser toda aquella que sea adecuada para la administración de los péptidos a través de cualquier vía aceptable como la oral (entérica), nasal, oftálmica, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o transdérmica. Se prefiere la administración subcutánea y, con mayor preferencia, la intradérmica. Se puede utilizar una bomba de infusión para la administración.

A continuación se describirá la presente invención con los ejemplos siguientes que muestran las formas de 25 realización preferidas de la misma a título ilustrativo, sin que con ello se pretenda limitar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1:

Identificación de los péptidos asociados a tumor presentados en la superficie celular

Muestras de tejido

30 Las muestras de tejido sano y tumoral fueron facilitadas por el Hôpital Cantonal Universitaire de Genève (Oncología médica, Laboratorio de inmunología tumoral) y la Neurochirurgische Universitäts-Klinik Heidelberg (Laboratorio de biología molecular). Los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito antes de la intervención quirúrgica. Los tejidos se criogenizaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y permanecieron a -80ºC hasta el aislamiento de los péptidos.

35 Aislamiento de los péptidos HLA de las muestras de tejido

Las mezclas de péptidos HLA de las muestras de tejido criogenizadas se obtuvieron por inmunoprecipitación de los tejidos sólidos siguiendo un protocolo ligeramente modificado (Falk, K., 1991; Seeger, F.H.T., 1999) con el anticuerpo específico de HLA-A*02 BB7.2, el anticuerpo específico de HLA-A, B y C W6/32, sefarosa activada con CNBr, tratamiento con ácido y ultrafiltración.

40 Procedimiento dos:

Las mezclas de péptidos HLA se separaron en función de su hidrofobicidad con cromatografía en fase inversa (sistema Acquity UPLC, Waters) y los péptidos eluidos se analizaron con un espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap (ThermoElectron) equipado con una fuente de ESI. Las mezclas de péptidos se cargaron directamente en una columna microcapilar de sílice fundido (75 µm de d.i. x 250 mm) rellena con material de fase inversa C18 1,7 µm 45 (Waters) aplicando un caudal de 400 nl por minuto. Posteriormente los péptidos se separaron con un gradiente binario de 180 minutos en dos fases desde 10% hasta 33% de B con un caudal de 300 nl por minuto. El gradiente estaba compuesto por solvente A (ácido fórmico al 0,1% en agua) y solvente B (ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo). Para la introducción en la fuente de microESI se empleó un capilar de vidrio recubierto de oro (PicoTip, New Objective). El espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap se hizo operar en el modo dependiente de datos con el 50 procedimiento TOP5. En resumen, se inició un ciclo de barrido con un barrido completo de alta precisión de masa en el orbitrap (R = 30 000), al que siguieron barridos EM/EM también en el orbitrap (R = 7500) con los 5 iones precursores más abundantes y exclusión dinámica de los iones preseleccionados. Los espectros de masas en tándem se interpretaron con SEQUEST y control manual adicional. La secuencia peptídica identificada se confirmó comparando el patrón de fragmentación generado por el péptido natural con el patrón de fragmentación de un 55 péptido de referencia sintético de idéntica secuencia. La Fig. 1 muestra un ejemplo de espectro obtenido de tejido

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tumoral correspondiente al péptido asociado a MHC de clase I NCAN-001

Ejemplo 2

Perfiles de expresión de genes que codifican los péptidos descritos

No todos los péptidos identificados como presentes en la superficie de las células tumorales a través de las

5 moléculas MHC son adecuados para la inmunoterapia, porque la mayoría de ellos proceden de proteínas celulares normales que se expresan en multitud de tipos de células. Muy pocos de esos péptidos están asociados a tumores y probablemente sean capaces de estimular los linfocitos T con una alta especificidad de reconocimiento contra el tumor del cual derivan. A fin de descubrirlos y de minimizar el riesgo de que la vacuna generase autoinmunidad los inventores se centraron en los péptidos derivados de proteínas que aparecen sobreexpresadas en las células

10 tumorales en comparación con la mayoría de los tejidos normales.

El péptido ideal sería el derivado de una proteína que sea exclusiva del tumor y no esté presente en ningún otro tejido. Para identificar los péptidos procedentes de genes dotados con un perfil de expresión similar al ideal los péptidos identificados se asignaron a las proteínas y después a los genes originarios, y se generaron los perfiles de expresión de dichos genes.

15 Fuentes de ARN y preparación

Las muestras de tejido extirpado fueron facilitadas por dos centros clínicos (véase Ejemplo 1); todos los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito. Las muestras de tejido tumoral se criogenizaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y se homogeneizaron a mano en un mortero con nitrógeno líquido. El ARN total se preparó a partir de estas muestras con TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y después se

20 purificaron con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos procedimientos se efectuaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

El ARN total procedente de tejidos humanos sanos se obtuvo por canales comerciales (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemania; Stratagene, Amsterdam, Holanda; BioChain, Hayward, CA, EE. UU.). El ARN de varios individuos (de 2 a 123 individuos) se mezcló de tal modo que el ARN de cada uno de ellos estuviera

25 representado en la misma proporción. Cuatro voluntarios sanos donaron sangre de la que se extrajeron los leucocitos.

La calidad y la cantidad de las muestras de ARN se valoró con Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) y el RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent)

Experimentos con micromatrices

30 El análisis de la expresión génica de todas las muestras de ARN de tejido tumoral y normal se efectuó con micromatrices oligonucleotídicas Affymetrix Human Genome (HG) U133A o HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.). Todos los pasos se llevaron a cabo siguiendo el manual de Affymetrix. En resumen, a partir de 5–8 µg de ARN total se sintetizó ADNc bicatenario con SuperScript RTII (Invitrogen) y el cebador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) siguiendo las indicaciones del manual. La transcripción in vitro se llevó a cabo con el

35 BioArray High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO Diagnostics, Inc., Farmingdale, NY, EE. UU.) en el caso de las matrices U133A y con el GeneChip IVT Labelling Kit (Affymetrix) en el de las matrices U133 Plus 2.0, y después se procedió a la fragmentación del ARNc, a su hibridación y tinción con estreptavidina-ficoeritrina y un anticuerpo anti-estreptavidina biotinilado (Molecular Probes, Leiden, Holanda). Las imágenes se analizaron con el Agilent 2500A GeneArray Scanner (U133A) o con el Affymetrix Gene-Chip Scanner 3000 (U133 Plus 2.0), y los datos se

40 analizaron con el software GCOS (Affymetrix), aplicando los ajustes por defecto en todos los parámetros. Para la normalización se utilizaron 100 genes constitutivos (Housekeeping) suministrados por Affymetrix. Los valores de expresión relativa se calcularon a partir de las relaciones logarítmicas de la señal dadas por el software, y la muestra normal se ajustó de forma arbitraria en 1,0.

El perfil de expresión del gen NCAN del cual procede el péptido NCAN-001 de la presente invención muestra una

45 elevada expresión en el tejido tumoral del glioblastoma mientras que el gen no se expresa o lo hace muy poco en los tejidos normales (Fig. 2).

Ejemplo 3

Motivos peptídicos HLA-DR derivados de la survivina (Swissprot: 015392)

Predicción de epítopos: La predicción de los posibles ligandos de HLA-DR se llevó a cabo con la base de datos

50 virtual SYFPEITHI. En resumen, la secuencia de la survivina se cribó con un patrón de matriz que evalúa cada aminoácido de la secuencia central nonámera de los péptidos 15ámeros que encajan en el motivo HLA-DR correspondiente. A los residuos de anclaje se les dan valores de hasta 10; a otros residuos se les puntúa hasta 3, reflejando las preferencias de aminoácidos para ciertas posiciones dentro del péptido. La puntuación máxima teórica de un péptido candidato oscila entre 28 y 43; las puntuaciones de los abundantes ligandos naturales superan normalmente los 20 puntos.

imagen23

TLGEFLKLDRERAKN (o versiones truncadas) ocupa los primeros puestos de los péptidos en 5 de las 6 predicciones.

DRB1*01 (puntuación teórica máxima 43) 58 FFCFKELEGWEPDDD36 98 LGEFLKLDRERAKN K 28 22 FKNWPFLEGCACTPE28

5 DRB1*03 (puntuación teórica máxima 40) 99 GEFLKLDRERAKN KI 29 10 WQPFLKDHRISTFKN 26 3 APTLPPAWQPFLKDH25

DRB1*04 (puntuación teórica máxima 28) 98 LGEFLKLDRERAKN K 28 10 WQPFLKDHRISTFKN 28 3 APTLPPAWQPFLKDH26

10 DRB1*07 (puntuación teórica máxima 34) 121 KKEFEETAEKVRRAI 24 128 AEKVRRAIEQLAAMD 24 3 APTLPPAWQPFLKDH 22 16 DHRISTFKNWPFLEG 20 28 LEGCACTPERMAEAG18 40 EAGFIHCPTENEPDL 18 93 FEEL TLGEFLKLDRE 16 103 KLDRERAKNKIAKET 16

DRB1*11 (puntuación teórica máxima 38) 98 LGEFLKLDRERAKN K 32 83 GCAFLSVKKQFEELT 24 58 FFCFKELEGWEPDDD22

DRB1*15 (puntuación teórica máxima 34) 95 EL TLGEFLKLDRERA 30 19 ISTFKNWPFLEGCAC 28 55 AQCFFCFKELEGWEP28

15 Pasos para tomar la decisión sobre la secuencia

1. Para cada péptido se precisa una secuencia central nonámera para la unión al HLA-DR. Secuencias centrales predichas:

DRB1*01 F L K L D R E R A DRB1*03 L K L D R E R A K

20 DRB1*04 F L K L D R E R A DRB1*11 F L K L D R E R A DRB1*15 L G E F L K L D R

2. Combinar las secuencias centrales para obtener una secuencia central promiscua:

Combinada: L G E F L K L D R E R A K

25 3. Añadir secuencias flanqueantes hasta obtener la longitud final de 15 aminoácidos:

Final: T L G E F L K L D R E R A K

EJEMPLO 4: Se llevó a cabo un estudio clínico para confirmar la inmunogenicidad del péptido con la SEC ID N.º 1. El objetivo principal del estudio era investigar la respuesta del PSA (antígeno específico de próstata) (PSA-R) a la administración subcutánea de un panel de péptidos específicos de la próstata (vacunación) en pacientes con recidiva bioquímica tras prostatectomía radical sin detección de lesiones metastásicas evidentes.

imagen24

El objetivo secundario del estudio consistió en investigar la tolerabilidad y la viabilidad del tratamiento vacunal en pacientes con carcinoma de próstata, con especial hincapié en los fenómenos inmunitarios en términos de 5 respuesta de los linfocitos T.

El estudio se diseñó como un ensayo prospectivo y aleatorizado de fase I/II para la indicación de "recidiva bioquímica tras prostatectomía radical sin detección de lesiones metastásicas evidentes".

Población del estudio

Como parte de este estudio de fase I/II, se intentó inducir la regresión del PSA como indicador del cese del

10 crecimiento tumoral mediante la vacunación con un panel de péptidos específicos de la próstata en pacientes HLAA*02+ que presentaban recidiva bioquímica tras la prostatectomía radical. La combinación de péptidos específicos de la próstata se administró por vía subcutánea y se evaluó la magnitud de la respuesta inmunitaria en el contexto de varias formas de administración de las estructuras antigénicas.

A diferencia de los estudios de vacunación anteriores, el estudio se centró en el tratamiento de pacientes que

15 presentaban una pequeña carga tumoral todavía indetectable con las técnicas de imagen. Todos los pacientes fueron vacunados del mismo modo utilizando conocidas estructuras antigénicas específicas de la próstata para estimular la respuesta inmunitaria contra las células malignas. Se trató a 19 pacientes.

Tabla 7. Población del estudio

Total

% Mediana Rango

Edad

19 63 55 -77

Tratamiento neo-/adyuvante previo

Ninguno

11 58

Radiación

3 16

Hormonoterapia intermitente

2 11

Rad. + Terapia Horm. Int.

2 11

Rad. + Quimioterapia

1 5

Clasificación TNM en el momento de la prostatectomía radical (RPX)

T2a-c R0

6 32

T3a-c R0

6 32

T2a-c R1

3 16

T3a-c R1

3 16

T3aN2 R0

1 5

Escala de Gleason

5 -7

10 53

8 -10

3 16

Desconocido

6 32

Meses entre la RPX y la vacunación

41 9 -124

Primera recidiva postquirúrgica, meses

14 1 -90

PSA al iniciar la vacunación

0,76 0,14 – 10,8

20 Plan de tratamiento

Una vez descartadas las lesiones metastásicas manifiestas con la tomografía computarizada y la gammagrafía ósea, la vacuna de péptidos específicos contra la próstata se administró por vía subcutánea conforme a las diferentes formas de administración a pacientes con recidiva del PSA que habían sido sometidos a prostatectomía radical (aumento del PSA: elevación del 50% en dos análisis realizados como mínimo con 14 días de diferencia). La vacuna

25 se administró ocho veces los días 0, 7, 14, 28, 42 y 56 (aproximadamente 100 microgramos de cada péptido en cada inyección). Después de cada vacunación y de nuevo el día 70, se midió la concentración de PSA para evaluar la respuesta al tratamiento.

Si se detectaba respuesta del tumor (remisión completa [PSA-RC] o remisión parcial [PSA-RP] o estabilización clínica [sin cambio, PSA-NC]), el paciente recibía la vacuna una vez al mes como tratamiento de mantenimiento con

30 la forma de administración seleccionada en cada caso. La respuesta del paciente al tratamiento de vacunación se evaluó detalladamente del modo indicado a continuación:

Remisión completa (PSA-RC): Normalización de la concentración de PSA inicialmente elevada, confirmada por la medición después de un intervalo mínimo de 4 semanas. La normalización se definió como un valor mínimo del PSA < 0,2 ng/ml, que cabría esperar después de la prostatectomía radical con extirpación completa del tumor o de la próstata.

imagen25

Remisión parcial: a) PSA-RP ≤ 80% (Reducción de un 80% de la concentración de PSA inicialmente elevada,

5 confirmada por la medición después de un intervalo mínimo de 4 semanas); y b) PSA-RP ≤ 50% (Reducción de un 50% de la concentración de PSA inicialmente elevada, confirmada por la medición después de un intervalo mínimo de 4 semanas);

Enfermedad estable (PSA-SD): Ningún cambio significativo durante un período mínimo de cuatro semanas. Esto incluye la estabilización y una reducción inferior al 50% y un aumento inferior al 10%, confirmada por la medición

10 después de un intervalo de al menos 4 semanas.

Progresión (PSA-PD): Aumento de la concentración de PSA superior al 10%. El estudio se daba por concluido para el paciente si aparecía progresión del PSA.

Una vez admitidos los pacientes en el estudio se les administraba la vacuna de epítopos específicos; se tuvieron en cuenta las proteínas que se expresan específicamente en las células epiteliales de la próstata (p. ej. PSMA / PSCA).

15 Además de investigar la eficacia general de la vacuna controlando el crecimiento de las fracciones residuales del tumor mediante la cuantificación regular de las concentraciones de PSA, el estudio investigó los efectos de los diversos procedimientos de vacunación sobre la modulación del sistema inmunitario. Además de la simple administración subcutánea del péptido conforme a la invención solo también se probaron diversas combinaciones con adyuvantes. La vacuna incluyó una combinación de al menos 6 péptidos derivados de PSA, PSCA, PSMA,

20 survivina, TRP-P8 y prosteína, respectivamente. Como control positivo se utilizó un péptido derivado de la MP gripal. Como epítopos para los linfocitos T cooperadores se emplearon péptidos derivados del PSMA y de la survivina. En concreto se empleó Montanide por la liberación lenta y el efecto adyuvante que consigue en las vacunas peptídicas (Montanide consiste en el clásico adyudante incompleto de Freund adaptado para la administración en humanos), que recientemente ha sido descrito muy favorablemente. Con este fin, antes de la administración se mezclaron

25 500 µl de la solución de péptidos con 500 µl de Montanide. Así se obtiene una emulsión de agua en aceite que libera lentamente el antígeno contenido en la fase acuosa durante varias semanas. La estabilidad física de la emulsión es muy alta, y a 4 °C se puede conservar durante más de tres meses sin una separación apreciable de las fases. La liberación lenta de Montanide se ha aprovechado en varios ensayos de vacunación con buenos resultados (Oka et al., 2004).

30 En una rama del estudio se investigó la eficacia de la vacunación con la estimulación simultánea del sistema inmunitario con factores de crecimiento, GM-CSF y solución inyectable Leukine®. El GM-CSF es un adyudante muy habitual en los ensayos de vacunación con péptidos y en varios se ha descrito la potenciación de la respuesta clínica y de los linfocitos T. Inicialmente, el GM-CSF actúa como un factor de reclutamiento y de diferenciación de las células dendríticas que se cree que potencia el número de estas en el punto de inyección de la vacuna. Aunque el

35 GM-CSF no activa por sí solo las células presentadoras de antígeno como las células dendríticas y los macrófagos, sí se ha descrito la activación indirecta en condiciones in vivo (Molenkamp et al., 2005).

Otra rama del estudio investigó la eficacia de la vacunación con la activación simultánea de las células dendríticas mediante el uso epicutáneo de imiquimod. El imiquimod se administró en forma de pomada al 5% (Aldara). Ejerce una potente acción inmunoestimuladora a través de su efecto sobre las células TLR7-positivas (p. ej., células 40 dendríticas plasmocitoides, células de Langerhans, células dendríticas dérmicas), que activa la vía dependiente de MyD88. Las APC activadas liberan citocinas inflamatorias y estimuladoras de los linfocitos T, regulan al alza la coestimulación y migran a los ganglios linfáticos invadidos por el tumor. En modelos con animales se ha demostrado la capacidad del imiquimod para estimular la respuesta de los CTL inducida por los péptidos con la mezcla de los antígenos en la pomada o con la aplicación de Aldara sobre el punto de administración por vía s.c. o inyección i.d.

45 de los antígenos.

Otra rama del estudio investigó la eficacia de la vacunación con la activación concomitante de las células dendríticas mediante su mezcla con ARNm de la mucina-1 estabilizado con protaminas para activar los TLR 7/8. El ARNm genera una amplia activación de las poblaciones de células inmunitarias de ratón y humanas. La incorporación a la formulación de la proteína polibásica protamina aumenta la semivida del ARNm y propicia la formación de partículas

50 que probablemente prolongan la liberación. Así pues, este adyuvante combina propiedades de liberación lenta con la activación de las APC.

En resumen, las formas de administración de la vacuna incluyeron las siguientes estrategias:

 administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsificada con Montanide  administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsificada en 500 µl de Montanide en combinación con la 55 administración tópica de 225 µl de GM-CSF con el objetivo de lograr una respuesta inmunitaria más potente gracias a la administración simultánea de factores de crecimiento  administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsificada en 500 µl de Montanide en combinación con

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hipertermia local, esta última con el objetivo de lograr una respuesta inmunitaria más potente por el efecto térmico  administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsificada en 500 µl de Montanide en combinación con imiquimod epicutáneo a fin de activar las células dendríticas a través del TLR 7 5  administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsificada en 500 µl de Montanide en combinación con 55 µl de ARNm de mucina-1/protamina a fin de activar las células dendríticas a través de los TLR 7/8

Calendario: La duración total del estudio fue de tres años.

Las vacunas con los péptidos específicos de próstata se administraron a pacientes los días 0, 7, 14, 28, 42 y 56. En los pacientes con enfermedad estable o con respuesta objetiva del tumor (PSA-RC o PSA-RP) las vacunas se 10 administraron una vez al mes por vía i.d. hasta detectar progresión. A tenor de la experiencia hasta la fecha, las inyecciones de péptidos se toleran sin reacciones adversas significativas. Como la respuesta al tratamiento vacunal se evaluó exclusivamente con la serología a través de las concentraciones de PSA, al inicio del estudio se efectuó un análisis para determinar si la vacuna administrada interfería con la medición de las concentraciones de PSA in vitro, de modo que pudiera semejar una respuesta clínica. Los días 0, 7, 14, 28, 42, 56 y 70 se extrajeron muestras

15 de sangre para las analíticas clínicas, la concentración de PSA, el hemograma diferencial, el análisis de FACS y citocinas. Si el tratamiento duraba más de 70 días se practicaba un control regular del PSA cada 6 semanas para detectar oportunamente el fracaso terapéutico.

El tratamiento concluía si se verificaba la progresión de la enfermedad con la elevación continua del PSA.

A partir del día 84 el tratamiento de vacunación se administró cada 4 semanas hasta verificar la progresión o hasta

20 el día 420 (15 meses). Las decisiones referentes a la continuación del tratamiento fuera del estudio en los casos de éxito se tomaron de forma individualizada. Durante el estudio no hubo reacciones adversas imprevistas.

Las analíticas incluyeron pruebas de coagulación, electrolitos, LDH, ß2-M, CK, enzimas hepáticas, bilirrubina, creatinina, ácido úrico, proteína total, coagulación, CRP, hemograma diferencial con extensión, concentración de PSA, citocinas, FACS y Elispot.

25 El análisis de la reacción cutánea a antígenos bacterianos y fúngicos conocidos (48-72 horas después de la administración, hipersensibilidad retardada (DTH), mediada por linfocitos T, se empleó para analizar el sistema inmunitario celular del paciente antes de iniciar el estudio)

Los péptidos necesarios para el estudio (nonapéptidos) se fabricaron en el laboratorio del Dr. Stefan Stevanovic del departamento del catedrático H. G. Rammensee. Los péptidos se purificaron con HPLC y se analizaron con

30 espectrometría de masas. La pureza de los péptidos también se puede verificar con HPLC, espectrometría de masas y secuenciación de Edman. Con estos procedimientos se puede obtener una pureza de hasta el 98% (que se puede considerar el máximo por el estado actual de los procedimientos). Los péptidos sintetizados se disolvieron en DMSO (CryoSure, WAK Chemie Medical GmbH; 10 mg/ml), se diluyeron 1:10 con Ampuwa (Fresenius Kabi), y se fraccionaron en alícuotas en condiciones estériles.

35 Respuesta clínica

En dos pacientes el estudio de TEP-TAC reveló recurrencia local después de detectar el tumor local mediante tacto rectal continuo. En los 17 pacientes restantes la localización de la actividad de la enfermedad no se pudo verificar al acabar el estudio.

Los hemogramas diferenciales y los análisis bioquímicos completos reiterados no revelaron anomalías ni cambios 40 durante el estudio.

Dieciséis de los 19 pacientes reaccionaron al péptido de la survivina II (IFN-g ELISPOT, +/-ICS) conforme a la SEC ID N.º 1. Entre ellos hubo 12 que manifestaron una respuesta de linfocitos T contra la survivina después de la vacunación, dos que ya presentaban linfocitos T anti-survivina antes de ello y otros dos en los que no se pudo determinar si los linfocitos T anti-survivina eran abundantes antes de la vacunación.

45 Respuesta bioquímica

La respuesta completa se definió como todo valor de PSA indetectable según el límite de detección del laboratorio colaborador después de haber presentado inicialmente un valor elevado de PSA. Para confirmar la medición esta tenía que verificarse tras un intervalo mínimo de cuatro semanas. La RP > 80% y > 50% tenían que volver a analizarse al cabo de cuatro semanas. La enfermedad estable se definió como cualquier valor del PSA comprendido

50 entre una reducción inferior al 50% y un aumento inferior al 10% que se volvía a confirmar al cabo de como mínimo cuatro semanas. La enfermedad progresiva se definió como todo aumento del PSA superior al 10% respecto al inicio del tratamiento.

imagen27

La respuesta bioquímica de los pacientes que concluyeron el estudio se siguió controlando hasta que comenzaron a recibir otro tratamiento con radioterapia local o privación de andrógenos. Diecinueve pacientes accedieron a participar y sus datos se analizaron; el período de seguimiento más largo duró alrededor de 3,75 años.

Estabilidad del PSA y aumento del TD

5 Dos pacientes (10,2%) manifestaron estabilización de los valores de PSA según los susodichos criterios de recidiva bioquímica, por los cuales no se produjo ningún aumento del valor del PSA superior al 10% desde el inicio del tratamiento hasta el final del estudio (Fig.6, Tablas 8, 9 y 10). El seguimiento de los dos casos se prolongó hasta 14 y 16 meses después de la última aplicación de la vacuna. La duración media de la estabilidad fue de 24 meses (28 y 31) en el momento de la fecha límite de datos con una media de 18 vacunaciones (14 y 20) aplicadas. Uno de los

10 dos pacientes presentó respuesta parcial >50% durante un período de 9 meses, seguida por un período de lento incremento del PSA con un tiempo de duplicación de 20,5 en comparación con los 9,8 meses observados antes del tratamiento. La recidiva inicial del PSA había comenzado 18 meses después de la extirpación de un tumor pT2pN0 Gleason 5.

En el análisis de los datos el paciente 8 mostró enfermedad estable desde el inicio del programa de vacunación

15 hacía 28 meses. Pero tuvo que abandonarlo al cabo de 10 meses debido a una reacción alérgica después de recibir la 14.ª vacunación. Presentaba una situación desfavorable con tumor pT3b Gleason 3+4 con un valor mínimo del PSA no inferior a 0,6 ng/ml tras la prostatectomía radical y progresión del PSA tras un declive postquirúrgico inicial. El tiempo de duplicación se frenó pasando de 6,6 a 148 meses.

Ambos pacientes recibieron imiquimod dérmico en el punto de aplicación en cada vacunación peptídica (Figuras 9, 20 10 y 11, Tabla 13).

Aumento del TD del PSA sin estabilidad del mismo

El TD del PSA del paciente 11 aumentó de 1,5 a 10,1 meses en los primeros seis meses del estudio. Como había comenzado con un PSA de 10,8 ng/ml y progresó hasta 17,8 ng/ml se le retiró de los procedimientos del estudio para recibir supresión androgénica en monoterapia, sin que se visualizara ninguna lesión maligna en el TEP-TAC.

25 Recibió Aldara como adyuvante.

El paciente 16 comenzó con el tratamiento a base de vacuna acompañada de ARNm de la mucina-1/protamina con un tiempo de duplicación de 6,1 meses. La velocidad del PSA se redujo hasta un tiempo de semivida de 2,7 meses durante cinco meses, seguidos por un repunte calculado estadísticamente del TD del PSA de 14,4 meses que continuaba 16 meses después de comenzar el tratamiento. Su PSA inicial de 0,29 ng/ml se redujo a 0,19 ng/ml

30 durante los 5 primeros meses de tratamiento del estudio, volvió a aumentar a 0,4 ng/ml en los 8 meses siguientes y 19 meses después de iniciar el tratamiento concluyó el estudio conforme al protocolo con 0,41 ng/ml (Fig. 7, Tablas 8 y 10).

Progresión del PSA

El paciente 5 manifestó progresión durante el estudio según el tiempo de duplicación del PSA calculado antes de

35 recibir las vacunas. No obstante, experimentó un declive del PSA con un tiempo de semivida de 20,2 meses después del final del tratamiento durante un período continuo de 10 meses hasta la fecha límite de recogida de datos. Después de concluir las vacunaciones seguía sin recibir ningún tratamiento secundario. Las vacunas se le administraron con Montanide como único adyuvante (Figura 8, Tabla 13).

Tabla 8: Tiempo de duplicación del PSA en meses Tabla 9: Estabilidad del PSA con un aumento no superior al 10% respecto al valor inicial del PSA

Total

% Media geométrica Rango del TD

TD del PSA antes de la vacunación, en meses

19 8,3 1,5–44,8

TD del PSA al final del estudio o al final del seguimiento

18* 11,2 2,2–148

Sin cambio del TD del PSA durante la vacunación

11 58 2,2–44,8

Elevación del TD del PSA continuaba al final del estudio

4 21

Sin cambio del TD del PSA durante la vacunación, pero después descendió

1 5

Descenso provisional del PSA o aumento del TD, seguido por un descenso del TD

3 16

* El TD del PSA que presentaba el paciente 5 al final del estudio o al final del seguimiento no quedó incluido debido al descenso del PSA

imagen28

PSA inicial ng/ml

PSA final del estudio ng/ml PSA final del seguimiento ng/ml Meses desde nivel basal

Pac. 3

0,7 0,51 0,73 31

Pac. 8

1,76 1,84 1,85 28

Tabla 10: Incremento permanente del TD del PSA durante la vacunación, en meses

1.er TD antes de los meses de vacunación

2.º TD antes de los meses de vacunación 3.er TD antes de los meses de vacunación

Pac. 3

9,8 -2,3 20,5

Pac. 8

6,6 148

Pac. 11

1,5 10,1

Pac. 16

6,1 -2,7 14,4

Media geométrica del TD

4,9 25,8

Tabla 11: Sin cambio del TD del PSA durante la vacunación (meses) pero con declive posterior

1.er TD antes de los meses de vacunación

2.º TD durante los meses de vacunación

Pac. 5

3,2 -20,2

Tabla 12: Descenso/estabilidad transitoria del TD del PSA (meses) seguido por aumento acelerado

1.er TD antes de los meses de vacunación

2.º TD durante los meses de vacunación 3.er TD durante los meses de vacunación 4.ºTD durante los meses de vacunación

Pac. 7

3,7 21,5 2,8

Pac. 15

1,3 25,8 -9,9 7,4

Pac. 17

10,2 -1,9 4,8

imagen29

imagen30

Síntesis

Los péptidos se sintetizaron de forma totalmente automática con el sintetizador de péptidos EPS 221 fabricado por Abimed. El programa de síntesis se ajusta a los protocolos indicados por el fabricante. Siempre que es posible se anotan los números de lote de los reactivos empleados en la fabricación de cada lote de péptido.

5 Procesamiento del péptido bruto

El procesamiento del péptido bruto consistió en la separación del mismo de la resina de síntesis y la eliminación de los grupos protectores de las cadenas laterales con TFA / fenol / etanoditiol / tioanisol / agua (90/3,75/1,25/2,5/2,5, porcentajes en volumen) durante 1 h o 3 h (péptidos con arginina). El péptido bruto se precipitó con metil-tertbutiléter, se lavó también con metil-tert-butiléter y dos veces con dietiléter, se secó y el sedimento formado por el

10 péptido se diluyó con ácido acético. De nuevo se volvió a precipitar con dietiléter, se secó, se resuspendió en agua y se liofilizó.

HPLC preparativa

Sistema de HPLC Varian "Star", columna cromatográfica de 250 x 10 mm con C18 y 5 µm (Ziemer). Solvente móvil

A: agua con TFA al 0,1%, solvente móvil B: acetonitrilo con TFA al 0,08%. El gradiente utilizado para la separación 15 está orientado a la hidrofobicidad del péptido. Las fracciones de péptido separadas se liofilizan.

Análisis

Se registró un cromatograma de HPLC y un espectro de masas MALDI de cada péptido para demostrar la identidad (mediante la masa molar reflejada en el espectro de masas) y la pureza (con las áreas de los picos del cromatograma de HPLC).

20 Péptidos sintéticos y estímulos

Los péptidos sintéticos empleados para la estimulación y las pruebas funcionales fueron el epítopo derivado del VIH (HIV gag 164-181: YVDRFYKTLRAEQASQEV, control negativo); el PSMA 459-473: NYTLRVDCTPLMYSL y la survivina 97-111: TLGEFLKLDRERAKN. La enterotoxina estafilocócica B (SEB, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania) se utilizó como control positivo de la estimulación de los linfocitos T CD4+ en el ELISPOT con interferón.

25 Amplificación in vitro de los linfocitos T específicos

Se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica de pacientes con carcinoma de próstata en diferentes intervalos de tiempo durante la vacunación, que se conservaron congeladas en nitrógeno líquido con suero fetal bovino al 90% y DMSO al 10%. Una vez descongeladas, se cultivaron aproximadamente 5 x 106 células (placas de cultivo celular de 24 pocillos, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemania) con medio IMDM complementado con

30 penicilina 50 U/ml, estreptomicina 50 µg/ml (todos de Biowhittaker, Verviers, Bélgica), suero humano termoinactivado al 10% (c.c. pro, Neustadt, Alemania) y beta-mercaptoetanol 50 µM a 37°C y CO2 al 7,5%. El día 1 se añadieron mezclas de péptidos sintéticos de unión a HLA de clase II, cada uno en una concentración de 5 µg/ml, y el cultivo se complementó con IL-2 recombinante humana (r-hIL2, R&D Systems GmbH, Wiesbaden, Alemania) en los días 2, 5, 7 y 9 de la estimulación de los linfocitos T.

35 Ensayo de puntos por inmunoabsorción ligada a enzima (ELISPOT)

La funcionalidad de los linfocitos T expandidos se analizó con un ensayo ELISPOT con interferónsiguiendo las recomendaciones del comité de seguimiento de CIMT (CIMT Monitoring Panel; www.c-imt.org). En suma, las células se recolectaron a los 12 días de cultivo, se lavaron, contaron y sembraron con medio de cultivo en una placa ELISPOT (Millipore, Schwalbach, Alemania). Se analizaron por duplicado o triplicado entre 0,15 y 0,25 x 106 células 40 en presencia de los péptidos sintéticos con una concentración de 2,5 g/ml o bien con SEB en una concentración 1 g/ml. La producción de IFN-γ se detectó con una pareja de anticuerpos monoclonales específicos (1D1-k y 7-B6-1, ambos de Mabtech, Nacka Strand, Suecia) tras 26 horas de incubación a 37°C y CO2 al 7,5%. Se añadieron ExtraAvidina-fosfatasa alcalina y sustrato BCIP/NBT (ambos de Sigma-Aldrich) durante 1 hora y durante 10 min, respectivamente. El análisis ELISPOT se llevó a cabo con lectores ImmunoSpot (Series 3A y 5, Cellular Technology

45 Ltd, Aalen, Alemania).

Tinción intracelular de citocinas

Las células recuperadas del ensayo ELISPOT se siguieron cultivando en presencia de r-hIL2 2 ng/ml durante nueve días más. Después de ese período de reestimulación, las células efectoras se recolectaron, se lavaron y se estimularon en un ensayo estándar con los péptidos a 5 µg/ml o con PMA e ionomicina (50 ng/ml y 1 µM, 50 respectivamente) en presencia de Golgi-STOP (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Después de un período de incubación de 6 horas, las células se lavaron con PBS, FCS al 1% y NaN3 al 0,02% y se tiñeron con los anticuerpos monoclonales (AcM) CD4-APC-Cy7 (BD Biosciences) y CD8-PE-Cy7 (Beckman Coulter) durante 20 min a 4°C y a oscuras. Después de una fase de lavado, las células se

imagen31

permeabilizaron durante 20 min con el reactivo Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) y después se tiñeron durante 30 minutos para visualizar las citocinas intracelulares. Los AcM utilizados fueron: IFN--FITC, IL-10-PE (ambos de BD Biosciences), IL-5-APC (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y TNF--Pacific Blue (Biolegend, San Diego, California, EE. UU.). La adquisición de las células se llevó a cabo con un citómetro Canto II, con software Diva y

5 análisis con FlowJo (BD Biosciences).

Lista de referencias

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Claims (12)

1. imagen1

   REIVINDICACIONES

   1.

   Un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID N.º 1 (TLGEFLKLDRERAKN).

2. 2.

   El péptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho péptido de la SEC ID N.º 1 tiene la capacidad de unirse a una molécula del alelo de HLA HLA-DR.

3. 3.

   El péptido de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dicho péptido es capaz de estimular los linfocitos T CD4 o CD8.

4. 4.

   Una proteína de fusión, que consiste en el péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 fusionado con los aminoácidos N-terminales de la cadena invariable (Ii) asociada al antígeno HLA-DR.

5. 5.

   Un ácido nucleico, que codifica un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un vector de expresión capaz de expresar dicho ácido nucleico.

6. 6.

   El péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o el ácido nucleico o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5 para su uso en medicina.

7. 7.

   Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, en la que dicha célula hospedadora es preferiblemente una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o célula presentadora de antígeno.

8. 8.

   Un procedimiento de producción de un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, comprendiendo el procedimiento el cultivo de la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 7 que expresa el ácido nucleico o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, y el aislamiento del péptido a partir de la célula hospedadora o de su medio de cultivo.

9. 9.

   Un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el ácido nucleico o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, o la célula de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de cáncer, preferiblemente como una vacuna.

10. 10.

    El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho cáncer es seleccionado entre astrocitoma, astrocitoma pilocítico, tumor neuroepitelial disembrioplástico, oligodendrogliomas, ependimoma, glioblastoma multiforme, gliomas mixtos, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma, gangliocitoma central, tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET, p. ej., meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma, ependimoblastoma), tumores del parénquima pineal (p. ej. pineocitoma, pineoblastoma), tumores de células ependimarias, tumores del plexo coroideo, tumores neuroepiteliales de origen incierto (p. ej. gliomatosis cerebral, astroblastoma), glioblastoma, tumor de próstata, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, carcinoma de células renales claras, cáncer de pulmón, del SNC, ovario, melanoma, cáncer de páncreas, carcinomas espinocelulares, leucemia y meduloblastoma, así como otros tumores o cánceres que muestran una sobreexpresión de survivina.

11. 11.

    El péptido para su uso de acuerdo con la reivindicación 9 o 10 en combinación con al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID N.º 4 a 13 para el tratamiento del cáncer renal, o en combinación con al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID N.º 4, 8, 11, 12, y 15 a 23 para el tratamiento del cáncer de colon.

12. 12.

    Un kit que comprende:

    (a)

    un envase que contiene una composición farmacéutica que contiene un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el ácido nucleico o el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 5, o una célula de acuerdo con la reivindicación 7, en solución o en forma liofilizada;

    (b)

    opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o solución de reconstitución para la formulación liofilizada;

    (c)

    opcionalmente, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en las SEC ID N.º 4 a 23, y

    (d)

    opcionalmente, instrucciones de uso de la solución y/o la reconstitución y/o uso de la formulación liofilizada.

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