ES2599902T3 - Sistema y método de microscopio para obtener datos de muestra normalizados - Google Patents
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Abstract
Un sistema de microscopio para obtener una medida cuantitativa normalizada de datos de muestra objetivo, obtenidos a partir de una medición de intensidad, cuando se representa la imagen de una muestra objetivo por un microscopio (100) que tiene una fuente de luz de excitación (102), un medio óptico (104), un medio de captura de imágenes (112), y un medio de almacenamiento de datos (116), dispuestos conjuntamente para obtener una imagen de la muestra objetivo (107), comprendiendo el sistema de microscopio: el microscopio (100) que tiene la fuente de luz de excitación (102), el medio óptico (104), el medio de captura de imágenes (112), y el medio de almacenamiento de datos (116), dispuestos conjuntamente para obtener la imagen de la muestra objetivo (107); un medio para obtener para la fuente de luz de excitación (102), un factor de corrección de fuente de luz, que comprende un instrumento de calibración y un medio para conmutar el instrumento de calibración dentro y fuera de una trayectoria óptica para permitir que se obtenga una medición de intensidad de luz relativa sustancialmente de manera simultánea con la imagen de muestra objetivo; un medio para iluminar con la fuente de luz de excitación (102) el instrumento de calibración; en el que el instrumento de calibración comprende una superficie de calibración colocada a lo largo de una trayectoria óptica para la iluminación de dispersión sustancialmente uniforme desde la fuente de luz de excitación hacia el medio de captura de imágenes (112) y comprende además un espejo dicromático colocado para reflejar la iluminación desde la fuente de luz de excitación a lo largo de una trayectoria óptica a través del medio óptico (104) hacia la muestra objetivo y para transmitir al menos una parte de la iluminación desde la muestra objetivo hacia el medio de captura de imágenes (112), en el que la superficie de calibración bloquea temporalmente la trayectoria óptica entre el espejo dicromático y el medio óptico (104) durante la calibración y dispersa una parte sustancial de la luz de excitación reflejada a través del espejo dicromático hacia el detector; un medio para aplicar el factor de corrección de fuente de luz a los datos de muestra objetivo, obteniendo de este modo datos de muestra objetivo medidos cuantitativos normalizados, que se normalizan con respecto a la variabilidad de intensidad de luz temporal de la fuente de luz de excitación (102).
Description
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DESCRIPCION
Sistema y metodo de microscopio para obtener datos de muestra normalizados Referenda cruzada a las solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de Estados Unidos N.° 60/944.402, presentada el 15 de junio de 2007.
Campo
La presente invention se refiere, en general, al campo de la microscopla y mas especlficamente a la normalization de los resultados anallticos cuantitativos obtenidos a partir del mismo o de diferentes sistemas de microscopio para permitir las comparaciones entre los mismos.
Antecedentes
A medida que las plataformas de microscopla se convierten en cuantitativas, un metodo simple y una combination de hardware permiten la normalizacion entre estas plataformas que necesitan desarrollarse. Por ejemplo, en las aplicaciones de microscopla de fluorescencia, hay productos disponibles actualmente para medir la intensidad de fluorescencia para un sistema (es decir, microesferas fluorescentes, objetivos fluorescentes), pero que no proporcionan un factor de eficacia global que este relacionado con las variaciones en la construction general de una plataforma de microscopio, o con las variaciones en la fuente de luz independiente de las variaciones de la muestra.
El documento US 2002/168665 A1 desvela un sistema de microscopio que comprende un filtro de excitation, un espejo dicroico y un filtro de densidad neutra configurado como una unidad de cubo. Un cubo de detection de partlculas extranas, un cubo para una referencia, y un cubo de una luz fluorescente estan configurados de acuerdo con una combinacion del filtro de excitacion, el espejo dicroico y el filtro de densidad neutra en la trayectoria de luz de observation y en la trayectoria de iluminacion. Un controlador del sistema cambia la unidad de cubo al cubo para la referencia y abre el obturador en la etapa. Despues de que el procesador de imagenes fotografle la imagen fluorescente de referencia a traves de la camara CCD, el controlador del sistema cierra el obturador. Despues de que el procesador de imagenes fotografle la imagen fluorescente de referencia a traves de la camara CCD, el controlador del sistema cierra el obturador. El procesador de imagen corrige un fondo de referencia y el procesador de archivos almacena la variable de referencia como el archivo reciente. Por lo tanto, el documento US 2002/168665 A1 desvela el uso de un cubo de filtro de referencia pero cuando este se conmuta en su lugar una muestra de referencia se coloca simultaneamente en la localization de la muestra objetivo sustituyendo de este modo la muestra objetivo durante la medicion de referencia.
Sumario
Los sistemas y los procesos descritos en el presente documento proporcionan unos factores de normalizacion para un sistema de microscopla optica dado que puede usarse para normalizar y escalar los resultados de las mediciones cuantitativas. La normalizacion permite la comparacion de los resultados cuantitativos obtenidos a partir de diferentes instrumentos, habiendo sometido los resultados de cada instrumento a la misma normalizacion. Tambien, como una extension de esto, el mismo hardware que contribuye a los factores de normalizacion de eficacia instrumental puede usarse para medir las variaciones en la intensidad de fuente de luz durante un experimento en el que se toman varias exposiciones en una sola plataforma a lo largo del tiempo.
En un aspecto, se hace referencia a un proceso para normalizar una medida cuantitativa de los datos de muestra objetivo representados por imagenes por un sistema optico. El sistema optico tiene una fuente de luz de excitacion, una parte optica, una parte de captura de imagenes, y una parte de almacenamiento de datos. Las diversas partes del sistema optico estan dispuestas cooperativamente para obtener una imagen de la muestra objetivo. Se obtiene un factor de correction de fuente de luz para la fuente de luz de excitacion. El factor de correction de fuente de luz se aplica a los datos de muestra objetivo, obteniendo de este modo unos datos de muestra de destino normalizados con respecto a la variabilidad de intensidad de luz. Se determina una medida cuantitativa de los datos normalizados de muestra objetivo.
En otro aspecto, se hace referencia a un instrumento de calibration para muestrear la iluminacion de una fuente de luz de excitacion de un sistema de microscopla. El sistema incluye una superficie de calibracion colocada a lo largo de una trayectoria optica. La superficie de calibracion dispersa sustancialmente de manera uniforme la iluminacion de la fuente de luz de excitacion hacia una parte de deteccion del sistema de microscopla. El sistema de microscopio incluye un espejo dicromatico colocado para reflejar la iluminacion de la fuente de luz de excitacion a lo largo de una trayectoria optica a traves de un objetivo hacia una muestra objetivo y para transmitir al menos una parte de la iluminacion de la muestra objetivo hacia una parte de deteccion del sistema de microscopla. La superficie
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de calibracion se coloca para bloquear temporalmente la trayectoria optica entre el espejo dicromatico y el objetivo durante la calibracion y dispersar una parte sustancial de la luz de excitacion reflejada por el espejo dicromatico hacia el detector.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un procedimiento para obtener una medicion de datos de muestra objetivo normalizada cuantitativa de un sistema optico. El sistema optico tiene una fuente de luz de excitacion, una parte optica, una parte de detection y una parte de almacenamiento de datos dispuestas cooperativamente para obtener los datos de muestra objetivo. Se obtiene un factor intrlnseco de sistema optico para el sistema optico. El factor intrlnseco de sistema optico se aplica a los datos de muestra objetivo, obteniendo de este modo una medicion de datos de muestra objetivo normalizada con respecto a factores opticos intrlnsecos.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un proceso para obtener una medicion normalizada a partir de un sistema de microscopio que tiene una fuente de luz de excitacion, una parte optica, y una parte de deteccion dispuestas cooperativamente para obtener una imagen de una muestra objetivo. El proceso incluye iluminar con la fuente de luz de excitacion una muestra de calibracion configurada para producir una respuesta normalizada a la iluminacion. Una imagen de muestra de calibracion de la muestra de calibracion iluminada obtenida a traves de la parte optica se captura con la parte de deteccion. Un instrumento de calibracion configurado para dirigir una parte de muestra de la iluminacion desde la fuente de luz de excitacion hacia el detector se ilumina con una fuente de luz de excitacion. Una imagen de muestra de fuente de luz de excitacion de la parte de muestra dirigida se captura con la parte de deteccion, y se determina un factor intrlnseco de maquina para corregir las variaciones a lo largo de la trayectoria optica a partir de la imagen de muestra de calibracion y la imagen de muestra de fuente de luz de excitacion. El factor intrlnseco de maquina puede usarse para compensar una imagen de muestra objetivo para las variaciones intrlnsecas del sistema de microscopio.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a un medio utilizable por ordenador que tiene unas instrucciones legibles por ordenador almacenadas en el mismo para su ejecucion por un procesador para realizar uno o mas de los procesos descritos en el presente documento.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a la senal electromagnetica que lleva las instrucciones legibles por ordenador a obtener una medicion normalizada de un sistema de microscopio que tiene una fuente de luz de excitacion, una parte optica, y una parte de deteccion dispuestas cooperativamente para obtener una imagen de una muestra objetivo, en el que las instrucciones realizan el proceso descrito anteriormente.
En otro aspecto, la invention se refiere a un sistema de microscopio de acuerdo con la revindication adjunta 1. El sistema puede incluir ademas un medio para determinar a partir de la imagen de muestra de calibracion y la imagen de muestra de fuente de luz de excitacion, un factor intrlnseco de maquina para corregir las variaciones a lo largo de la trayectoria optica, el factor intrlnseco de maquina puede usarse para compensar una imagen de muestra objetivo para las variaciones intrlnsecas del sistema de microscopio.
La divulgacion se refiere a un sistema para compensar las mediciones de intensidad de una muestra objetivo en un sistema de microscopio. El sistema incluye una platina para soportar la muestra objetivo, una fuente de luz de excitacion para iluminar la platina de muestra objetivo soportada, una parte de deteccion para detectar una imagen de la muestra objetivo iluminada, y un instrumento de calibracion configurado para la insertion temporal a lo largo de un eje optico entre la fuente de luz de excitacion y la parte de deteccion para redirigir una parte de muestra de la fuente de luz de excitacion a la parte de deteccion durante la calibracion. De manera beneficiosa, el instrumento de calibracion permite la redirection de la fuente de luz de excitacion sin perturbar la muestra objetivo en la platina. El sistema tambien incluye un analizador en comunicacion con la parte de deteccion para determinar un factor de correction de intensidad determinado a partir de la parte de muestra redirigida. El factor de correction de intensidad puede usarse para ajustar las imagenes detectadas de la muestra objetivo iluminada para compensar las variaciones de fuente de luz de excitacion.
La divulgacion se refiere a un proceso para corregir las fluctuaciones de intensidad en un sistema de microscopio de fluorescencia que tiene una fuente de luz de excitacion, una parte optica, y una parte de deteccion dispuestas cooperativamente para obtener una imagen de una muestra objetivo. El proceso incluye la insercion de un elemento de calibracion en una trayectoria optica entre un objetivo y la parte de deteccion. El elemento de calibracion incluye un espejo dicromatico y una superficie de calibracion. El espejo esta adaptado para reflejar la luz desde la fuente de luz de excitacion hacia la superficie de calibracion y para transmitir una muestra de la luz de excitacion de vuelta de la superficie de calibracion hacia el detector. Una variation de intensidad de fuente de luz de excitacion se determina a partir de la muestra de la luz de excitacion de vuelta de la superficie de calibracion. El elemento de calibracion se sustituye con un conjunto de filtro adaptado para reflejar un espectro seleccionado de la fuente de luz de excitacion hacia la muestra objetivo. Un espectro seleccionado de la iluminacion se transmite desde la muestra objetivo hacia la parte de detector. El espectro de luz de emision seleccionado se detecta a partir de la muestra objetivo y el espectro de luz de emision seleccionado de la muestra objetivo se corrige usando la variacion de intensidad determinada de la fuente de luz de excitacion.
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Breve descripcion de los dibujos
Los anteriores y otros objetos, caracteristicas y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la siguiente descripcion mas especifica de las realizaciones preferidas de la invencion, como se ilustra en los dibujos adjuntos en los que los caracteres de referencia similares se refieren a las mismas partes a lo largo de las diferentes vistas. Los dibujos no estan necesariamente a escala, colocandose en su lugar el enfasis en ilustrar los principios de la invencion.
La figura 1 muestra un diagrama de bloques de un sistema de microscopio a modo de ejemplo.
La figura 2 muestra un diagrama esquematico de un instrumento de calibracion construido de acuerdo con los principios de la presente divulgacion.
La figura 3 muestra unas vistas delantera, trasera, lateral izquierda, lateral derecha, superior, e inferior de un instrumento de calibracion a modo de ejemplo construido de acuerdo con los principios de la presente divulgacion.
La figura 4 muestra una vista en perspectiva superior en despiece del instrumento de calibracion de la figura 3.
La figura 5 muestra una variacion temporal de la intensidad de lampara de excitacion obtenida para diferentes instrumentos de calibracion de acuerdo con los principios de la presente divulgacion.
La figura 6 muestra una variacion temporal de los resultados cualitativos para multiples canales de una primera platina de calibracion.
La figura 7 muestra una variacion temporal de los resultados cualitativos para multiples canales de una segunda platina de muestra.
La figura 8 muestra un diagrama de flujo de un proceso para normalizar los resultados del analisis cualitativo de acuerdo con los principios de la presente divulgacion.
La figura 9 muestra un diagrama de flujo de un proceso para obtener los factores de correccion usados en la normalizacion de los resultados del analisis cualitativo de la figura 8.
La figura 10 muestra los resultados comparativos obtenidos usando diferentes sistemas de microscopio sin y con una correccion de acuerdo con los principios de la presente divulgacion.
Las figuras 11A y 11B muestran la comparacion de los datos de muestra no corregidos y corregidos obtenidos de acuerdo con los principios de la presente divulgacion.
La figura 12A muestra los resultados del analisis cualitativo a modo de ejemplo obtenidos a partir de la misma muestra usando diferentes sistemas de microscopio sin normalizacion.
La figura 12B muestra la correccion de los resultados cualitativos de la figura 12A de acuerdo con los principios de la presente divulgacion.
Descripcion detallada
Los sistemas y procesos se describen en el presente documento para obtener resultados analiticos cuantitativos normalizados a partir de un sistema que incluye unos componentes opticos y una fuente de iluminacion. En particular, los sistemas y los procesos relacionados para normalizar el analisis cuantitativo, microscopico de las muestras objetivo, tales como las muestras biologicas. Las muestras biologicas a modo de ejemplo incluyen una celula, un grupo de celulas, una seccion de tejido, una matriz de secciones de tejido (por ejemplo, una matriz de micro tejidos) y combinaciones de uno o mas de cualquiera de los mismos. Las muestras biologicas pueden tratarse con uno o mas tintes. En algunos casos, los tintes son tintes inmunohistoquimicos. En algunos casos, los tintes inmunohistoquimicos son tintes fluorescentes.
En general, un sistema de microscopio incluye una fuente de iluminacion configurada para iluminar una muestra objetivo, la optica configurada para producir una imagen ampliada de la muestra objetivo iluminada, y un detector, tal como una camara digital, configurado para capturar una imagen digital de la imagen ampliada. Los resultados cuantitativos pueden obtenerse a traves de la manipulacion de las imagenes digitales capturadas. Tal manipulacion de imagenes puede incluir las tecnicas de procesamiento de imagenes conocidas por los expertos en la materia. En al menos algunas realizaciones, una o mas de tales capturas de imagenes y la manipulacion de imagenes se realizan con la ayuda de un procesador. El procesador puede incluir un ordenador que implemente las instrucciones
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preprogramadas.
El sistema tambien incluye un dispositivo de calibracion configurado para redirigir una muestra normalizada de la fuente de iluminacion hacia el detector. En al menos algunas realizaciones se configura un procesador de sistema para determinar un factor de correccion para un microscopio dado. El factor de correccion puede determinarse a partir de una medicion de la muestra normalizada de la fuente de iluminacion obtenida usando el dispositivo de calibracion. El factor de correccion puede usarse (por ejemplo, por el procesador) para corregir cualquier variacion en intensidad de una imagen detectada de la muestra objetivo. En algunas realizaciones, un procesador de sistema se configura con instrucciones (por ejemplo, software) para obtener el factor de calibracion. Como alternativa, o ademas, el procesador de sistema se configura con instrucciones para usar el factor de correccion para corregir las imagenes detectadas. Tal calibracion es util para eliminar cualquier resultado cuantitativo, la variabilidad en la intensidad de la fuente de iluminacion dentro del mismo sistema de microscopio, como puede ocurrir a lo largo del tiempo y entre los resultados cuantitativos obtenidos usando diferentes sistemas de microscopio y/o diferentes fuentes de iluminacion.
El dispositivo de calibracion incluye una superficie de dispersion que puede colocarse a lo largo de una trayectoria optica entre la fuente de iluminacion y el detector con el fin de dirigir una parte de dispersion de la luz desde la fuente de iluminacion hacia el detector. La variabilidad en la iluminacion difundida detectada puede usarse para desarrollar un factor de correccion de este tipo.
En otros ejemplos de un procesador de sistema se configura para determinar o acceder a un factor de correccion para el componente optico de un microscopio dado. El factor de correccion puede determinarse a partir de una medicion de la muestra normalizada usando el componente optico del microscopio. El factor de correccion puede usarse (por ejemplo, por el procesador) para corregir cualquier variacion en las caracterlsticas opticas de un microscopio dado que afectan a la intensidad de una imagen detectada de la muestra objetivo.
Sistema de microscopio
Los sistemas y los procedimientos descritos en el presente documento pueden aplicarse, en general, a cualquier sistema de microscopla que incorpore una fuente de iluminacion. Los ejemplos de al menos algunos sistemas de microscopio en los que pueden usarse los sistemas y procesos incluyen, la microscopla optica, la microscopla fluorescente, y la microscopla de barrido laser confocal. Un sistema de microscopla a modo de ejemplo es el instrumento PM-2000™ disponible comercialmente en HistoRx, Inc., de New Haven, CT. Los sistemas y los procesos son especlficamente utiles para los sistemas dirigidos a proporcionar un resultado semicuantitativo o cuantitativo. Las aplicaciones a modo de ejemplo incluyen el uso de la inmunohistoqulmica (IHC) como se usa dentro del campo de la patologla (vease, por ejemplo, Immunohistochemistry and Quantitative Analysis of Protein Expression, por M. Cregger et al., Arch. Pathol. Lab. Med., Vol. 130, julio de 2006 en las pags. 1026-1030). Normalmente, estos resultados se basan en la intensidad de la tincion de una muestra examinada usando el sistema de microscopla. Las muestras pueden ser especlmenes biologicos. Los tintes pueden ser tintes histologicos generales, tintes especiales, IHC, FISH, cromogenicos, fluorescentes, etc.
De acuerdo con Cregger et al., un patologo de diagnostico normalmente interpreta un IHC de acuerdo con un enfoque subjetivo usando un criterio de valoracion positiva-negativa binario o una escala de 3 a 4 puntos. Con la ayuda de un ordenador, puede obtenerse un analisis automatizado de las muestras objetivo usando un programa de ordenador para ayudar a eliminar la variabilidad inherente de la puntuacion basada en el patologo. En inmuno- fluorescencia, un producto fluorescente se deposita en el lugar de un antlgeno, lo que permite la localizacion visual del antlgeno en la muestra. Despues de la captura fotografica, el producto de reaccion puede cuantificarse por el software de analisis de imagenes. Ademas, el antlgeno puede localizarse en una localizacion celular especlfica (por ejemplo, nuclear, organocelular, citoplasmica, membranosa) o extracelular (vease, por ejemplo de Camp et al, Nature Medicine 8 (11) 1323-1327, 2002). Numerosos programas basados en ordenadores se han disenado para el analisis de IHC, tales como BLISS e IHCscore disponibles en Bacus Laboratories, Inc. de Lombard, IL, ACIS de Clarient, Inc., de San Juan Capistrano, CA, y AQUA® analisis del HistoRx, Inc., de New Haven, CT.
En general, para el IHC fluorescente, se obtienen multiples imagenes digitales (por ejemplo, TIFF, JPEG, GIF, mapa de bits, PNG) a partir de la misma muestra de tejido objetivo marcada con anticuerpos especlficos de biomarcadores de protelnas y reactivos de deteccion fluorescentes secundarios. Al optimizar, los tintes fluorescentes proporcionan un intervalo dinamico mas amplio que el disponible por los tintes cromogenicos basados en la absorbancia. Cada una de las imagenes digitales puede obtenerse usando un filtro optico diferente configurado para pasar una respectiva de las senales fluorescentes secundarias. De este modo, se obtiene al menos una imagen digital correspondiente para cada una de las senales fluorescentes secundarias. Para el analisis cuantitativo, las imagenes digitales capturadas se manipulan (por ejemplo, usando un software de procesamiento de imagenes) para obtener una puntuacion respectiva de la muestra de tejido.
Mas especlficamente, los sistemas y los procesos se describen en referencia a un sistema a modo de ejemplo ilustrado en la figura 1.
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Haciendo referenda a la figura 1, un sistema de microscopio de fluorescencia de luz reflejada a modo de ejemplo 100 incluye una fuente de excitacion 102, una lente de objetivo 104, una platina de soporte de muestra 106, un bloque de filtro 108', y un cabezal de observacion 110. La platina de soporte de muestra 106 esta configurada para soportar una muestra bajo ensayo a lo largo de un eje optico y dentro de un plano de enfoque de la lente de objetivo 104. El bloque de filtro 108' tambien se localiza a lo largo del eje optico entre la lente de objetivo 104 y el cabezal de observacion 110. El bloque de filtro 108' es un dispositivo de tres puertos con dos puertos opuestos dispuestos a lo largo del eje optico y un tercer puerto dispuesto fuera del eje. Como se ilustra, el tercer puerto puede ser ortogonal a una llnea que une los dos puertos opuestos.
La iluminacion de la fuente de excitacion 102 se dirige hacia el puerto ortogonal del bloque de filtro 108'. El bloque de filtro 108' redirige una parte de la iluminacion de la fuente de excitacion 102 hacia la lente de objetivo 104. La lente de objetivo 104 incluye preferentemente una relativamente alta apertura numerica, permitiendola de este modo capturar una parte sustancial de la luz de excitacion. La lente de objetivo 104 funciona como un condensador que dirige la luz de excitacion hacia una muestra bajo ensayo colocada sobre la platina. En algunas realizaciones, multiples lentes de objetivo 104 (por ejemplo, 4X, 10X, 20X, 40X, 60X) estan incluidas dentro de un solo porta objetivos (no mostrado). El porta objetivos puede manipularse para poner selectivamente uno diferente de entre las multiples lentes de objetivo 104 en alineacion con el eje optico para ajustar la ampliation de la muestra bajo ensayo.
La iluminacion (emision) de la muestra bajo ensayo se desplaza a lo largo de la trayectoria optica a traves de la lente de objetivo 104 y en el primero de los puertos opuestos del bloque de filtro 108'. Al menos una parte de la iluminacion de muestra continua a lo largo de la trayectoria optica, saliendo del segundo de los puertos opuestos del bloque de filtro 108' hacia el cabezal de observacion 110. Como se describe en mas detalle a continuation, el bloque de filtro 108' filtra selectivamente la iluminacion que pasa a traves del mismo. En la microscopla de fluorescencia, la filtration puede usarse para ver selectivamente las emisiones de los diferentes fluoroforos (por ejemplo, rojo, verde, azul). Como se ilustra, el sistema de microscopio 100 puede incluir diversos bloques de filtro 108', 108”, 108”' (en general 108), cada bloque de filtro 108 esta sintonizado para pasar una longitud de onda de emision seleccionada hacia el cabezal de observacion 110. Los diferentes bloques de filtro 108 pueden almacenarse dentro de un carrusel o torreta 115, lo que permite la rapida selection de un bloque de filtro diferente 108 sin perturbar la muestra bajo ensayo. En algunas realizaciones, los diferentes bloques de filtro 108 estan dispuestos radialmente dentro de la torreta 115 alrededor de un eje de rotation. La torreta 115 esta colocada con su eje de rotation paralelo y hacia un lado del eje optico, de tal manera que uno de los bloques de filtro 108' se alinea con el eje optico. La rotacion de la torreta 115 mueve selectivamente un bloque de filtro 108' fuera de la alineacion y trae otro de los bloques de filtro 108”, 108”' en alineacion con el eje optico.
El cabezal de observacion 110 dirige al menos una parte de la luz desde el bloque de filtro 108 hacia un dispositivo de recogida de imagenes, tal como una camara de dispositivo acoplado de carga (CCD) 112. En algunas realizaciones, el cabezal de observacion 110 incluye adicionalmente uno o mas porta objetivos (no mostrados) que permiten la observacion manual de la muestra bajo ensayo. Un porta objetivos de este tipo puede usarse para ajustar la colocation de una muestra de 107 sobre la platina 106 y coordinar la colocation de la platina 106 antes y durante el ensayo. En algunas realizaciones, se proporciona un primer obturador 117 para controlar el tiempo de exposition de la muestra 107 a la fuente de excitacion 102. Un segundo obturador 114 se proporciona para controlar el tiempo de exposicion de un dispositivo de representation de imagenes, tal como la camara CCD 112. Como se muestra, el obturador 114 puede ser un componente independiente localizado a lo largo de la trayectoria optica entre la muestra bajo ensayo y el cabezal de observacion 110. Como alternativa o ademas, de un obturador independiente 114, el obturador puede estar integrado en la camara CCD 112.
El sistema de microscopio 100 tambien incluye un controlador 116. El controlador 116 puede usarse para controlar el proceso de adquisicion de imagenes general. Preferentemente, el controlador 116 esta en comunicacion con uno o mas subelementos del sistema de microscopio 110 para permitir el control automatizado del sistema 100. En la realization a modo de ejemplo, el controlador 116 esta en comunicacion con una o mas de las fuentes de excitacion 102, un traductor axial 119 (ajuste de enfoque) de la lente de objetivo 104, la camara CCD 112, el obturador 114, la torreta 115, y un controlador de position de platina 118. El controlador 116 puede incluir al menos un microprocesador o un ordenador 116 que funciona bajo el control de un codigo de programa.
En funcionamiento, el controlador 116 puede enviar una senal al controlador de posicion de platina 118 para colocar la platina 106, de tal manera que una region o punto seleccionado 109 de la muestra bajo ensayo se pone en alineacion con el eje optico. El controlador 116 tambien puede enviar una senal al traductor axial 119 configurado para colocar y recolocar la lente de objetivo 104 a lo largo del eje optico con respecto a la platina 106. Para las realizaciones que incluyen un porta objetivos motorizado, el controlador 116 puede enviar una segunda senal al porta objetivos haciendo que rote una seleccionada de las multiples lentes de objetivo 104 en alineacion con el eje optico antes de enfocar. El controlador 116 tambien puede enviar una senal a la torreta 115 provocando una rotacion controlada de la torreta para seleccionar uno de los multiples bloques de filtro 118. En respuesta, la torreta 118 rota, poniendo en alineacion con el eje optico el seleccionado de los bloques de filtro 118. El controlador 116 envla a continuacion una senal a la fuente de excitacion 102 encendiendo la fuente 102, al menos momentaneamente, para iluminar la muestra bajo ensayo. El obturador 114 esta normalmente cerrado bloqueando la trayectoria optica entre
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la muestra bajo ensayo y la camara CCD 112. Para algunos microscopios la fuente de luz 102 se enciende durante la inicializacion del instrumento. Con los microscopios fluorescentes, las lamparas de alta intensidad requieren un periodo de calentamiento para permitir que la intensidad de la fuente 102 se estabilice antes de que se midan las muestras de ensayo.
Para este tipo de sistemas fluorescentes, la fuente de luz 102 puede permanecer encendida durante el funcionamiento. En tales aplicaciones, se usa un primer obturador 117 proporcionado entre la fuente de luz 102 y la muestra de ensayo para bloquear la iluminacion de la muestra hasta que este listo para ver la muestra y adquirir una imagen de la muestra. Tal exposicion limitada de la muestra de ensayo a la iluminacion puede evitar la decoloracion de la muestra. Opcionalmente, se proporciona un segundo obturador 114 dentro de la camara CCD 112. Tras recibir una senal de activacion desde el controlador 116, el primer obturador 117 se abre durante un periodo de exposicion predeterminado antes de cerrarse de nuevo. Una segunda senal de activacion del controlador se envla al segundo obturador 114 asociado con la camara CCD 112. Esta senal controla la exposicion lo que permite que una muestra de la emision de la muestra bajo ensayo alcance la camara CCD 112. Por lo tanto, el primer obturador 117 se abre durante al menos toda la duracion de una exposicion controlada por el segundo obturador 114. En algunas realizaciones, el funcionamiento de los dos obturadores 114, 117 puede controlarse por una senal comun, o de otro modo configurarse para funcionar en sincronizacion. Bajo el control del controlador 116, la camara CCD 112 captura una imagen electronica de la iluminacion de la muestra bajo ensayo. La imagen puede reenviarse al controlador 116 o a un sistema exterior para su analisis.
Con un control independiente opcional de los dos obturadores 114, 117, puede variarse el sincronismo de cada obturador para producir diferentes efectos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, el primer obturador 117 se abre para exponer la muestra de ensayo durante un periodo de tiempo predeterminado y a continuacion se cierra. Esto puede realizarse para exponer una muestra de ensayo luminiscente a la iluminacion de la fuente 102. El segundo obturador 114 podrla hacerse funcionar despues del cierre del primer obturador 117 para muestrear la luminiscencia de la muestra, sin la interferencia de iluminacion de la fuente.
En una realizacion especlfica, el sistema de microscopio de fluorescencia es parte de un sistema de analisis IHC integrado cuantitativo, tal como el sistema PM-2000™ de analisis de AQUA®, disponible comercialmente en HistoRx, Inc., de New Haven, CT. AQUA es una marca comercial registrada de HistoRx, Inc. El sistema de analisis IHC consiste en los siguientes componentes montados en un recinto hermetico a la luz: un microscopio de fluorescencia, tales como el microscopio de epi-fluorescencia Olympus BX51, disponible comercialmente en Olympus America, Inc. de Center Valley, PA; el microscopio esta equipado con un porta objetivos motorizado para controlar la seleccion entre las diferentes lentes de objetivo (por ejemplo, 4X, 10X, 20X, 40X, 60X), y una torreta de filtros motorizada para controlar la seleccion entre la diferente seleccion de cubos de filtro (por ejemplo, en DAPI, Cy2, Cy3, Cy5 y Cy7 o longitudes de onda equivalentes). El sistema tambien incluye una platina motorizada, tal como la Prior Scientific numero de pieza H101A. La tarjeta PCI que impulsa la platina es la platina motorizada de Prior Scientific numero de pieza H252 disponible comercialmente en Prior Scientific, Inc. de Rockland, MA. La tarjeta de control ocupa una ranura de expansion PCE dentro de un controlador de ordenador. El control de enfoque se ve facilitado por el software integrado. El sistema tambien incluye una fuente de luz, tal como el sistema X-CITE 120, disponible comercialmente en EXFO Life Sciences & Industrial Division of Ontario, Canada, que esta equipado con una lampara de haluro de mercurio/metal; una camara digital monocromatica para la captura de imagenes, tal como la camara QUANTIFIRE, disponible comercialmente en OPTRONICS de Goleta, California; y un controlador de ordenador. En la realizacion a modo de ejemplo, el ordenador es un ordenador personal con Windows XP o un entorno de sistema operativo superior.
Normalizacion del instrumento
Con el fin de normalizar los resultados cuantitativos obtenidos usando un sistema especlfico, puede determinarse un factor intrlnseco de sistema para explicar la variabilidad de intensidad de la fuente de excitacion y la variabilidad del dispositivo, es decir, a lo largo de la trayectoria optica. Con el fin de lograr esto, tambien puede obtenerse una medida de la intensidad de fuente de luz de excitacion, por ejemplo usando una herramienta de medicion de intensidad de lampara en llnea. Tambien una medicion de una muestra normalizada o de calibracion, es decir, una platina de microscopio de calibracion puede obtenerse usando el sistema especlfico para definir uno o mas factores de trayectoria opticas. El uso de una platina de calibracion de este tipo es especlficamente util para las aplicaciones de IHC basadas en fluorescencia, en las que las regiones fluorescentes de muestra de la platina de calibracion emiten una radiacion dentro de los respectivos anchos de banda. Las emisiones fluorescentes permiten la caracterizacion de una trayectoria optica en cada una de la una o mas longitudes de onda respectivas. Esta medicion puede obtenerse de manera simultanea o por separado.
Medicion de intensidad de fuente de luz
En general, un proceso o un instrumento para proporcionar la medicion directa de la intensidad de fuente de luz, se incorpora mas convenientemente en el sistema. Un instrumento de muestreo de fuente de luz prevee capturar una muestra de la intensidad de fuente de luz. En algunas realizaciones, una parte muestreada de la intensidad de
fuente de luz se dirige a un detector (por ejemplo, una camara). La medicion de intensidad de fuente de luz puede realizarse independientemente de la parte de optica del sistema.
De manera mas general, el proceso o instrumento de muestreo accede a una muestra de la fuente de luz en los niveles de intensidad por debajo de un umbral de saturacion de detector de fuente de luz y por encima de un nivel de 5 ruido. Por ejemplo, la intensidad de fuente de luz puede muestrearse por un sensor electronico dentro de un perlodo de exposicion (por ejemplo, 10 milisegundos). Como alternativa, o ademas, puede atenuarse la fuente de luz para garantizar que la muestra obtenida esta dentro del intervalo de sensibilidad de un dispositivo de deteccion dado.
La intensidad de fuente de luz muestreada puede lograrse usando un radiometro en llnea, lo que resulta en una tension representativa medible de la intensidad de fuente de luz. Tales tensiones medidas pueden procesarse 10 automaticamente por el sistema. Por ejemplo, las tensiones pueden enviarse a un procesador para un procesamiento adicional. En algunas realizaciones, los niveles de tension se convierten en una representacion digital de las tensiones. Dicha conversion puede lograrse usando la conversion analogica a digital, lo que permite el procesamiento digital de la tension muestreada. El procesamiento digital puede lograrse mediante uno o mas de entre un software que se ejecuta en el procesador y un hardware adaptado para el procesamiento de senales 15 digitales.
La intensidad de fuente de luz muestreada puede obtenerse, directa o indirectamente a partir de la fuente de luz. En algunas realizaciones, la intensidad de fuente de luz muestreada se obtiene independiente de al menos algunas otras partes del sistema, tales como las opticas (por ejemplo, una lente de objetivo), que pueden afectar de manera independiente en el resultado muestreado. Como alternativa, o ademas, la intensidad de fuente de luz muestreada 20 se mide en la propia fuente de luz, evitando de este modo cualquier efecto del microscopio.
Cubo de calibracion
Un instrumento especial de calibracion se usa con el proposito de obtener una muestra de la luz con el fin de medir la intensidad de una fuente de luz. El instrumento de calibracion permite una medicion de intensidad de luz relativa a obtenerse sustancialmente de manera simultanea con la imagen de muestra objetivo. Esto se logra conmutando un 25 instrumento de calibracion especial en la trayectoria optica para obtener la medicion de intensidad de luz relativa, y a continuacion fuera de la trayectoria optica para obtener la imagen de muestra. Por ejemplo, si el sistema de microscopla es un sistema fluorescente que usa multiples cubos de filtros pre-cargados en una torreta rotable 115, el instrumento de calibracion puede incluirse como uno de los cubos de filtros (es decir, un cubo de calibracion) dentro de la torreta 115. Esta permitira que el cubo de calibracion se intercambie con los otros cubos de filtro de manera 30 automatica durante el curso de las mediciones.
En general, un cubo de filtro tiene unas aberturas en las caras superior, inferior, y delantera de un bastidor en forma de cubo. La abertura delantera o puerto permite que la luz de la fuente de iluminacion entre en el cubo, despues de lo cual la luz se refleja en una superficie reflectante interior, en general, colocada a 45 grados con respecto al eje de la luz entrante. La superficie reflectante angulada (por ejemplo, un espejo) redirige una parte reflejada de la luz 35 muestreada hacia la abertura inferior o puerto del cubo. En funcionamiento, la luz redirigida puede usarse para iluminar un objetivo (una muestra de tejido, etc.). La luz redirigida se desplaza a lo largo de una trayectoria optica que puede incluir las opticas de objetivos que se proporcionan en los sistemas de microscopio. Al menos alguna parte de la luz de iluminacion puede reflejarse desde la muestra. Para al menos algunas aplicaciones, tambien puede emitirse una luz estimulada desde la muestra, como a traves de la fluorescencia. En cualquiera de los casos, 40 al menos una parte de la luz de la muestra (reflejada y/o emitida) se desplaza de vuelta a lo largo de la misma trayectoria optica, que entra en el cubo desde el puerto inferior. Al menos una parte de la luz que entra en el cubo de calibracion se desplaza a traves de la superficie reflectante angulada del espejo angulado a lo largo de la trayectoria optica y sale a traves de la abertura o puerto superior del cubo y hacia un dispositivo de representacion de imagenes.
45 En algunas realizaciones, el cubo de calibracion es un cubo de filtro modificado en el que se fija una superficie de dispersion de luz para bloquear la abertura inferior. Durante el funcionamiento, la luz que entra en el cubo se refleja en la superficie reflectante angulada interior y se dirige hacia la superficie de dispersion de luz. La luz reflejada ilumina la superficie de dispersion de luz. Al menos una parte de la luz dispersada desde la superficie de dispersion de luz se dirige de vuelta a traves de la superficie reflectante interior, saliendo por la abertura superior del cubo hacia 50 el dispositivo de representacion de imagenes. El mismo cubo de calibracion que tiene la misma superficie de dispersion de luz puede usarse para muestrear la luz de la misma fuente de iluminacion en diferentes momentos y/o en diferentes fuentes de iluminacion. De esta manera, el cubo de calibracion proporciona un medio para muestrear la intensidad de luz dispersada fuera de una superficie normalizada (en lugar de la muestra tlpica) para capturarse por el dispositivo de representacion de imagenes, y puede usarse para determinar una medicion de intensidad de luz 55 normalizada. De manera beneficiosa, tal muestreo puede lograrse sin tener que recolocar una o mas de entre la platina de objetivo y la lente de objetivo.
El cubo de calibracion sirve como una herramienta de acceso en llnea para medir la intensidad de la lampara. En
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cooperacion con un procesador 116 (figura 1), la herramienta de medicion de intensidad no solo permite el seguimiento de las desviaciones de intensidad de la lampara, sino que tambien permite un medio sencillo de normalizar los resultados cuantitativos. La contabilizacion de tales desviaciones de intensidad de la lampara promueve unas medidas de precision de la expresion de biomarcadores en una muestra de tejido. Por ejemplo, los datos de las imagenes capturadas obtenidas por diversos sistemas de microscopla equipados con cubos de calibracion identicamente construidos, normalizados, puede corregirse para eliminar con eficacia cualquier contribucion que de otro modo se habrla atribuido a las variaciones de intensidad de la lampara. Por lo tanto, los resultados del analisis cuantitativo, tales como las puntuaciones AQUA obtenidas a partir de las imagenes corregidas, pueden compararse con una indicacion fiable de las diferencias de muestras objetivo, no con las diferencias del sistema. Los datos de calibracion de fuente de luz obtenidos usando el cubo de calibracion pueden recogerse, almacenarse y accederse desde diferentes aplicaciones de software del sistema, tales como los programas de inicializacion y de configuracion del sistema, programas de adquisicion de imagenes que permiten una interaccion minima del usuario y un tiempo y coste insignificante.
En una realizacion, haciendo referencia a la figura 2, un instrumento de calibracion, o el cubo 130 incluye una carcasa 132 que incluye un primer puerto 134a y un segundo puerto 134b opuesto al primero y alineado con el mismo a lo largo de un eje optico comun. La carcasa 132 tambien incluye un puerto lateral 134c que no esta alineado con el eje optico. Como se ilustra, el puerto lateral 134c es ortogonal a la trayectoria optica. La carcasa 132 tambien incluye una superficie reflectante interior 136 que forma un angulo distinto de cero 0a con el eje optico. La iluminacion se recibe de una fuente de excitacion 102 a traves del puerto lateral 134c. La superficie reflectante 136 esta angulada para redirigir una parte de la luz de excitacion recibida a lo largo del eje optico, a traves del segundo puerto 134b. El cubo de calibracion 130 tambien incluye una superficie de dispersion de luz 137 colocada en relacion con el segundo puerto 134b a dispersar, o devolver la luz de excitacion en una direccion opuesta a lo largo del mismo eje optico. Al menos una parte de la luz de excitacion dispersada pasa a traves de la superficie reflectante y sale de la carcasa 132 a traves del primer puerto 134a. Esta luz dispersada puede detectarse por una camara CCD 112 alineada con el primer puerto 134a.
En ejemplos alternativos, un instrumento de calibracion puede formarse sin una superficie de espejo. Por ejemplo, considerando la misma estructura general del cubo 130 ilustrado en la figura 2, la superficie reflectante interior 136 puede sustituirse por una superficie de dispersion de luz. La superficie de dispersion de luz puede angularse dentro del cubo para promover la redireccion de la luz dispersada de la fuente de iluminacion 102 a traves del puerto lateral 134c.
La superficie de dispersion de luz 137 es en general uniforme, teniendo una superficie que es una superficie mlnimamente reflectante (por ejemplo, una superficie mate) y proporciona una reflectancia/fluorescencia uniforme a traves del campo de vision, que preve tambien medir la uniformidad de la luz muestreada a partir de la fuente de luz. La superficie de dispersion de luz 137 dispersa la luz sustancialmente de manera uniforme. El material que forma la superficie de dispersion de luz 137 deberla ser capaz de soportar altas temperaturas y la intensidad de luz sin degradacion o variacion. El material es preferentemente rlgido o al menos semi-rlgido y no susceptible a amarillearse, degradarse o foto-blanquearse. Ademas, el material deberla poder reproducirse, y ser relativamente barato. En algunas realizaciones, ciertos materiales metalicos, ceramicos o plasticos que cumplan estas condiciones. Los materiales ceramicos, tales como el oro y los objetivos de ceramica blanca estan disponibles comercialmente en Avian Technologies, Inc. de Wilmington, OH. Tales materiales pueden usarse para el filtro de cubo de calibracion 148 (figura 3). Como alternativa, o ademas, estos materiales tambien pueden usarse para las platinas de calibracion normalizadas. En una realizacion alternativa puede usarse una pieza de papel de filtro plana.
En las aplicaciones de microscopio fluorescente, la luz de emision detectada por la camara CCD 112 es sustancialmente mas baja en intensidad que la luz de excitacion. Con el fin de evitar la saturacion de la camara CCD 112 cuando se detecta la propia fuente de excitacion, se incluyen uno o mas filtros entre la fuente de excitacion y la camara 112 para atenuar la luz a un nivel suficientemente bajo. En algunas realizaciones, se proporcionan uno o mas filtros de densidad neutra o grises a lo largo de una trayectoria optica entre la fuente de excitacion 102 y la camara CCD 112. Por ejemplo, se proporciona un primer filtro de densidad neutra 138a en el puerto lateral 134c que atenua la luz de excitacion que entra en la carcasa 132. Un segundo filtro de densidad neutra 138 B se proporciona en el primer puerto 134a que atenua la luz dispersada que vuelve a la camara CCD 112. Los valores de atenuacion de cada filtro 138a, 138b pueden ser los mismos o diferentes, siempre que sus efectos combinados garanticen que la camara CCD 112 no se saturara por la luz dispersada procedente de la fuente de excitacion 102.
EJEMPLO: En una realizacion a modo de ejemplo del cubo de calibracion 130 mostrado en la figura 3, el cubo 130 consiste en una carcasa de filtro OLYMPUS regular o un soporte 140 (cubo de soporte de filtro U-MF2 BX, numero de pieza U-M610 de OLYMPUS) equipado con unos filtros de densidad neutra 142a, 142b en las aberturas de emision y de excitacion 144a, 144b y un espejo dicroico 50/50 146. En algunas realizaciones, los filtros 142a, 142b se mantienen en la proximidad de las aberturas 144a, 144b usando unos bastidores de filtro respectivos 145a, 145b (figura 4).
La parte inferior de la carcasa 140 tiene una superficie de dispersion de luz 137 (figura 2); 148 (figuras 3, 4) montada
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sobre el puerto 144c (figura 3) colocada para bloquear completamente la abertura de muestra 144c. Una vista en perspectiva superior despiezada del cubo de calibracion a modo de ejemplo se muestra en la figura 4.
EJEMPLO: En una realizacion a modo de ejemplo, el cubo de calibracion 130 incluye dos filtros de densidad neutra, 25 mm, tales como el Chroma n.° de cat. 2200a, disponible comercialmente en Chroma Technology Corp. de Rockingham, VT. El cubo 130 tambien incluye un espejo dicroico, un divisor de haz 50/50, tal como el Chroma n.° de cat. 21000, alojado dentro de un soporte de filtro (cubo) 140, tal como el Chroma n.° de cat. 91018. La superficie de dispersion puede incluir un papel de filtro 148, tal como el VWR cat # 28306-153, comercialmente disponible en VWR de West Chester, PA. No es importante usar una marca especlfica de papel de filtro, pero preferentemente se usa el mismo filtro entre todos los cubos de calibracion 130 de los diferentes sistemas de microscopio para garantizar la uniformidad de los resultados. Como se describira a continuacion, aunque esto no es crltico, ya que las mediciones relativas pueden realizarse para los cubos de calibracion 130 usando un papel filtro diferente 148 en comparacion con un cubo de calibracion comun o normalizada. Tal comparacion puede usarse para determinar un desplazamiento a tenerse en cuenta en el proceso de correccion.
En otras realizaciones, el cubo de calibracion 130 incluye un soporte de filtro de microscopio, tal como un cubo de soporte de filtro U-MF2 BX, numero de pieza U-M610 de OLYMPUS, disponible comercialmente en Chroma Technology Corp de Rockingham, VT, cat # 91018. Pueden usarse otros cubos de filtro disponibles comercialmente compatible con el sistema de microscopio. En un ejemplo especlfico, los filtros de densidad neutra son el filtro de densidad neutra ND 1.0 numero de pieza UVND1.0 ND 1.0, 10% de transmitancia, 25 mm, y el filtro de densidad neutra ND 2.0 numero de pieza UVND2.0 ND 2.0, 1% de transmitancia, 25 mm, disponibles comercialmente en Chroma Technology Corp. El divisor de haz/dicroico 50/50 es un divisor de haz 50/50 numero de pieza 21000 de Chroma, 38X26 mm. Un papel de filtro WHATMAN, grado 1, n.° de cat. 1001-125, VWR de West Chester, PA esta fijado a la parte inferior del cubo. De manera beneficiosa, el material de filtro dispersa una cantidad apropiada de luz de nuevo hacia la camara CCD 112, de tal manera que puede adquirirse una imagen por la camara 112 en un perlodo de exposicion razonable. Por ejemplo, el perlodo de exposicion puede elegirse entre aproximadamente 3 y 200 milisegundos. Otros perlodos de exposicion pueden seleccionarse fuera de este intervalo, siempre que sean apropiados para las capacidades de camara aplicables.
La luz dispersada recibida en la camara CCD 112 esta, preferentemente, por debajo del nivel de saturacion de camara para el tiempo de exposicion seleccionado teniendo en consideracion las variaciones en otros conjuntos de cubos que pueden ser mas brillantes o mas tenues. Menos deseable, pero aceptable, es un material de dispersion que proporcione una senal utilizable (por debajo del llmite de saturacion de la camara) para perlodos de exposicion mayores de aproximadamente 200 milisegundos.
Para el uso en la normalizacion de los sistemas, puede instalarse un cubo de filtro de calibracion disenado especialmente 130 dentro de la torreta del sistema de microscopio 100 (figura 1). Este cubo de calibracion 130 sirve como una herramienta de medicion de intensidad de lampara en llnea que proporciona un medio para medir la intensidad de luz de excitacion, mediante el muestreo de la luz dispersada que es directamente proporcional a la intensidad de fuente de luz de excitacion incidente. Por lo tanto, la luz dispersada muestreada puede usarse para realizar un seguimiento de la variacion en la intensidad de luz de la fuente de excitacion durante el uso. Tales variaciones en la intensidad pueden producirse a partir de los efectos a largo plazo de la fuente de excitacion tal como el envejecimiento, en los que la intensidad de la fuente puede disminuirse lentamente durante el proceso normal de envejecimiento. Las variaciones tambien pueden ser el resultado de los efectos a corto plazo que pueden resultar de otros efectos, tales como las variaciones de temperatura ambiente, las variaciones de temperatura de dispositivo del dispositivo de calentamiento, y la tension y la corriente de excitacion entre otros.
Durante la adquisicion de imagenes en la que se obtiene una muestra de la intensidad de luz de fuente de iluminacion, se atenua la luz que se desplaza a traves del filtro de densidad neutra de excitacion 142a, que pasa a traves del divisor de haz 146 y se refleja fuera del material de calibracion 148 (es decir, el objetivo de papel blanco). A continuacion, la luz reflejada (o dispersada) se atenua aun mas en el filtro de densidad neutra de emision 142b y a continuacion se captura por la camara 112 (figura 4). Los filtros de densidad neutra 142a, 142b estan dispuestos de tal manera que la luz de excitacion se atenuada mucho para reducir la intensidad que incide sobre el material de calibracion 148. El filtro de emision 142a permite que pase mas luz y por lo tanto ayuda a reducir la intensidad observada por la camara digital 112.
Normalizacion del cubo de calibracion (CC)
Los cubos de calibracion individuales pueden tener variaciones intrlnsecas debido a las diferencias de material que se contabilizan preferentemente con el fin de normalizar los resultados cuantitativos obtenidos a traves de los instrumentos. En la fabrication, puede identificarse un cubo normalizado universal. Despues de esto, todos los cubos fabricados se comparan con el cubo normalizado universal para muestrear una fuente de luz consistente con cada nuevo cubo y contabilizarse cualquier diferencia inherente, es decir, aplicando una correccion de cubo o un factor de calibracion de cubo (CC). El factor de calibracion de cubo se determina inicialmente, preferentemente, para cada nuevo cubo de calibracion. En algunos casos, el factor de calibracion de cubo puede determinarse
posteriormente de manera periodica para el mantenimiento del sistema, y cuando las propiedades de material de un cubo puedan haber cambiado (es decir, debido al envejecimiento).
EJEMPLO: Con el fin de caracterizar una serie de cubos de calibracion similares, se obtuvieron resultados para cada uno de un lote de cinco cubos (J1-J5) usando la misma fuente de excitacion y configuracion de la camara. Uno 5 de los cubos en concreto (es decir, el J5) fue designado como un cubo de referencia para un grupo. Este cubo podrla denominarse como un cubo normalizado universal. El cubo de referencia J5, junto con los otros cubos a ensayarse, se instalaron simultaneamente en la torreta 115 del sistema de microscopio 100 (figura 1). Se adquirieron unas imagenes de la iluminacion muestreada a partir de la fuente de iluminacion obtenida a traves del cubo de calibracion 130 por la camara digital 112 para cada cubo J1-J5. Las mediciones de intensidad de luz obtenidas de 10 este modo se compararon entre los diferentes cubos de calibracion que se estaban ensayando. Se determino una relacion de intensidad medida para cada cubo de ensayo J1-J4 con la intensidad medida usando el cubo de referencia J5 que representa un factor de calibracion de cubo (CC). En un experimento a modo de ejemplo, se recogieron dieciseis mediciones para cada uno de los diferentes cubos J1-J5. Se determino una relacion de la intensidad obtenida para cada cubo J1-J5 con la intensidad del cubo de referencia J5. La Tabla 1 muestra los 15 valores de CC determinados para los cinco cubos en comparacion con el cubo de referencia (J5). Ya que la construccion de los cubos J1-J5 fue similar, las relaciones de las intensidades estan todas cercanas a 1.
Tabla 1: Factor de calibracion de cubo (Valores de CC)
- N.° de cubo de calibracion
- CC
- CC2
- 0,894
- J1
- 0,929
- J2
- 0,989
- J3
- 0,907
- J4
- 0,883
- J5 (cubo de referencia)
- 1,000
Para determinar los efectos temporales, se midieron las mediciones de intensidad de luz para cada cubo usando el mismo instrumento durante un perlodo de dos dlas. Se tomaron un mlnimo de diez mediciones a traves de cada 20 cubo cada dla (suma de las intensidades de los plxeles en la imagen capturada). Los resultados se muestran graficamente en la figura 5 como una intensidad total promedio en una escala de 0 a 120.000. Los resultados muestran que se reconocieron las fluctuaciones de intensidad de fuente de luz en las mediciones usando todos los cubos J1-J5. Preferentemente, los valores de coeficiente de correlacion R2 entre todos los cubos son relativamente altos (por ejemplo, > 0,95). Los resultados del ensayo sugieren que durante la adquisicion de imagenes del 25 especimen real, puede fluctuar la intensidad de fuente de luz. Estas fluctuaciones pueden ocurrir a lo largo de una duracion corta cada vez que la lampara se enciende y las variaciones lentas ocurren a lo largo del tiempo mientras que una lampara permanece encendida.
Normalizacion de la fuente de luz (LS)
En un procedimiento a modo de ejemplo para determinar una normalizacion de la fuente de luz LS, las intensidades 30 de pixel de una imagen capturada de la superficie de calibracion iluminada se combinan en una suma. Pueden identificarse diferentes intervalos en funcion de los valores de escala de intensidad especlficos usados para los plxeles, as! como el numero de plxeles de la imagen. Los valores LS a modo de ejemplo se obtienen usando el intervalo del sistema AQUA® desde aproximadamente 20.000 a 120.000. A continuacion, puede formarse una relacion a partir del factor LS y un valor de intensidad elegido. Una relacion de este tipo puede usarse para 35 compensar los datos de muestra objetivo para eliminar esencialmente la variacion de fuente de luz. En una realizacion a modo de ejemplo, se forma una relacion con un valor elegido de 100.000 y un factor LS que esta dentro del intervalo del sistema AQUA®.
Medicion de trayectoria optica (OP) de dispositivo
En general, un procedimiento de correccion de trayectoria optica usa una muestra de calibracion (por ejemplo, una 40 platina de calibracion) que proporciona una reflectividad y/o una fluorescencia conocidas que pueden usarse en la medicion directa del dispositivo especlfico o en el rendimiento de la trayectoria optica del sistema. Una muestra de calibracion puede usarse para obtener un factor de correccion para el rendimiento de la trayectoria optica intrlnseca de un sistema de microscopla dado. Cuando los diferentes sistemas de microscopla se corrigen de manera similar, los resultados de muestra objetivo obtenidos a partir de los diferentes sistemas pueden compararse de manera fiable 45 a traves de los diferentes sistemas de microscopla.
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Mas en general, la muestra de calibracion tiene las siguientes caracterlsticas:
• Muestra algunas caracterlsticas de las muestras analizadas normalmente en el sistema (es decir, para los sistemas fluorescentes, estas caracterlsticas pueden incluir la longitud de onda de excitacion/emision);
• construido usando un material uniforme, con propiedades opticas (por ejemplo, la reflectividad) que son reproducibles, estan disponibles, y son baratas;
• durante al menos las aplicaciones fluorescentes, el material uniforme puede ser opaco (es decir, una ceramica, etc.);
• para aplicaciones transparentes de campo claro, el material uniforme atenua la fuente de luz, si es necesario, a un nivel aceptable para el detector; y
• proporciona un blanqueo mlnimo (para los sistemas fluorescentes).
Las variaciones a lo largo de una trayectoria optica de un sistema de microscopla dado no variaran probablemente en un grado significativo a lo largo del tiempo para el mismo sistema. Por lo tanto, no hay necesidad aparente de volver a realizar el procedimiento de correccion de trayectoria optica durante las operaciones normales. En al menos algunas realizaciones, el factor de correccion de trayectoria optica se determina en el momento de la fabricacion. El factor de correccion de trayectoria optica puede re-determinarse despues del mantenimiento (por ejemplo, una limpieza) del sistema de microscopla.
Platinas de control o de calibracion
Una muestra de calibracion de instrumento normalizado (platina de control o platina de calibracion) se usa para adquirir datos en un sistema especlfico a calibrarse para aproximarse a la eficacia de produccion de luz de un sistema de microscopla especlfico y a la configuracion optica.
Por ejemplo, la platina de control puede ser un conjunto de platina de referencia fluorescente XF900, que proporciona una platina de referencia fluorescente azul o verde disponible comercialmente en Omega Optical Inc. de Brattleboro, VT. Otros materiales de muestra uniformes pueden usarse siempre que pueda adquirirse una senal suficiente en cada canal (es decir, la longitud de onda) dentro del tiempo de exposicion de conjunto (por ejemplo, entre aproximadamente 3 y 1000 milisegundos, o un intervalo real de la camara CCD 112) y el material preferentemente demuestra un mlnimo blanqueo a lo largo de un numero normalizado de series. El material de muestra podrla reproducirse de tal manera que puede usarse para normalizar cada instrumento y dimensionarse para ajustar en la platina de microscopio. El material emite o refleja preferentemente una senal luminosa con componentes espectrales en la banda(s) de longitud de onda apropiada a adquirirse a traves de cada cubo de filtro durante el funcionamiento en el sistema de microscopio, en un ambiente de baja reflexion especular. Otros ejemplos incluyen, pero no se limitan a, plasticos de color alternativos, materiales reflectantes de papel y ceramica, superficies metalicas o superficies revestidas con diversas tintas y tintes.
EJEMPLO: Una platina de calibracion se coloco en la platina de un sistema de microscopio 100 previamente fijada con un cubo de calibracion pre-normalizado 130 (figura 2) en la torreta de filtro 115 (figura 1). Dos diferentes platinas de control de instrumentos se testearon: la muestra 1, que tiene un espectro de aproximacion FITC/GFP (excitacion verde) y la muestra 2 que tiene un espectro de aproximacion DAPI/Indo/Fura (excitacion azul). La platina de calibracion 1 se ilumino, y se obtuvo una imagen de la emision de fluorescencia de la muestra a traves de cada uno de los tres diferentes cubos de filtros 108 (figura 1), una para cada canal y el cubo de calibracion. Se realizaron mas de 900 iteraciones durante un perlodo de aproximadamente treinta horas. Resultados cuantitativos, para cada canal por iteracion se calculo una puntuacion de intensidad (“puntuacion AQUA® obtenida”): la intensidad media multiplicada por el tiempo de exposicion multiplicado por la profundidad de bit (es decir, 0-255). La intensidad de luz a traves del canal FITC al usar la muestra 1 fue demasiado brillante lo que indica que este material no es ideal para normalizar las fluctuaciones de luz cuando se adquiera en este canal, veanse los resultados descritos para la muestra 2 a continuation como una alternativa. Los resultados se representaron como la puntuacion de analisis AQUA frente a la iteracion para la platina 1 (figura 6) para las puntuaciones de intensidad de platina de calibracion obtenidas en cada canal Cy3, Cy5 y por separado para el cubo de calibracion. Esencialmente se obtuvo un patron de intensidad de luz identico usando la muestra de control de instrumentos 1 en el canal Cy3, Cy5 y de cubo de calibracion que indicando que la variabilidad es poco probable debido al blanqueo del material de platina de control de instrumentos. Mas bien, la variation es indicativa de la verdadera variabilidad de intensidad de luz inherente al sistema 100. Una disminucion sutil a largo plazo en las mediciones cuantitativas puede observarse durante al menos la primera mitad de las muestras. Superpuesto a esto estan las variaciones relativas a corto plazo en ambas direcciones. Curiosamente, se observan tendencias similares en las mediciones obtenidas para cada uno de los diferentes canales de manera independiente, lo que sugiere que la variacion se debe al menos en parte a las fluctuaciones en la intensidad de la fuente de excitacion.
La variabilidad de fuente de luz se siguio adicionalmente adquiriendo las imagenes de la segunda platina de calibracion (espectros de aproximacion DAPI/Indo/Fura, excitacion azul) a traves de los canales Cy3, Cy5, y FITC, y el cubo de calibracion durante aproximadamente 20 horas para aproximadamente 450 iteraciones. En una realization a modo de ejemplo, los resultados cuantitativos, tales como las “puntuaciones” AQUA derivadas” tratadas anteriormente, se determinaron para cada iteracion. Los resultados se representaron como la puntuacion de analisis
AQUA frente a la iteracion para la platina 2 (figura 7). Esencialmente un patron de intensidad de luz identico resulto del uso de la muestra de control de instrumentos 2 en el canal Cy3, Cy5 y de cubo de calibracion que indica que la variabilidad es poco probable debido al blanqueo del material de platina de control de instrumentos. Mas bien, la variacion es indicativa de la variabilidad de intensidad de luz verdadera inherente al sistema 100. El patron de 5 fluctuacion de luz visto a traves del canal FITC al usar la muestra 2 estaba en la escala y podrla usarse para la normalizacion cuando se adquieran las imagenes en este canal. Un blanqueo modesto del material de platina es evidente como una inclinacion negativa en el canal FITC durante muchas iteraciones. Tal blanqueo es poco probable que afecte negativamente a las imagenes adquiridas en condiciones normales de funcionamiento. Lo ideal serla sustituir la platina de control de instrumentos despues de haberse producido un blanqueo de aproximadamente el 10 10 %. Por ejemplo, despues de 231 series para la muestra 1 y aproximadamente 20 series con la muestra 2.
Normalizacion de trayectoria optica (OP) de instrumento
La medicion de la senal en la camara digital 112 resulta de la luz que se ha desplazado desde la fuente de excitacion 102 (figura 1) a traves del sistema de microscopio 100 y se ha modificado por las propiedades intrlnsecas de ese sistema 100 y la muestra 107 que se esta midiendo. La trayectoria optica de un instrumento 100 puede 15 comprender el tubo de luz que se desplaza desde la lampara de excitacion al microscopio, los cubos de filtro 108 y
la optica asociada para cada canal fluorescente y la lente de objetivo 104 que se usa. Un factor intrlnseco de maquina (OP) que corrige las variaciones a lo largo de esta trayectoria optica puede establecerse para cada dispositivo 100 con el fin de normalizar los resultados obtenidos a traves de los dispositivos 100.
Para calcular el factor intrlnseco de maquina para un sistema especlfico, se adquirieron multiples imagenes (por 20 ejemplo, 16 imagenes) de una platina de control de instrumentos normalizada 107. Para cada sistema que se normaliza, la platina de control de instrumentos 107 era del mismo material con la misma configuration, presumiblemente para producir los mismos resultados, pero para efectos del sistema 100. Inmediatamente despues de la adquisicion de la camara de un solo campo de vision usando un cubo de filtro de luz especificado 108 (por ejemplo, los cubos de filtros FITC, Cy3 o Cy5), la torreta de filtro 115 se giro con el fin de alinear el cubo de 25 calibracion 130 (figura 2). El cubo de calibracion 130 se represento por imagenes de manera separada, sin alterar o la lente de objetivo o la muestra (es decir, la platina de control 107) bajo ensayo. Se fijaron los tiempos de exposition para cada canal. Una relation de la intensidad de cubo de calibracion para la intensidad de senal observada en cada canal proporciono un factor intrlnseco de maquina para la eficacia de la trayectoria optica del sistema de microscopio para cada filtro. Este valor es aplicable para ese sistema en esa configuracion especlfica. La configuracion esta 30 determinada por caracterlsticas tales como la ampliation, el filtro de luz y la optica.
El factor intrlnseco de maquina del sistema tambien puede hacerse a escala referenciandolo a un valor especlfico. El factor intrlnseco de maquina se determino usando los datos obtenidos usando una platina de control de instrumentos no blanqueada, con tiempos de exposicion elegidos para evitar la saturation de multiples series (por ejemplo, cinco series) y en experimentos independientes en diferentes dlas. El valor intrlnseco se calculo para cada serie. El CV % 35 entre los valores intrlnsecos de serie era extremadamente bajo de tal manera que una serie fue efectiva para calcular los valores intrlnsecos.
EJEMPLO: La tabla 2 muestra los factores intrlnsecos de maquina resultantes para cinco instrumentos a traves de los filtros para tres canales: FITC, Cy3 y Cy5.
Tabla 2: Factores intrlnsecos de maquina (Valores OP)
- Instrumento
- FITC-OP Cy3-OP Cy5-OP
- 1
- 1,15 1,14 1,09
- 2
- 1,61 1,49 1,86
- 3
- 1,46 1,38 1,18
- 4
- 1,00 1,00 1,00
- 5
- 1,38 1,07 1,32
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Los factores intrlnsecos de maquina se escalaron adicionalmente como el valor emplrico/el valor intrlnseco, donde el valor emplrico era el valor promedio mas bajo registrado en el sistema especlfico. Los valores intrlnsecos se determinaron usando dos platinas de control de instrumentos azules diferentes y se encontro que podlan reproducirse independientemente de que platina se usase. Se calcularon los valores promedio y los valores del 45 porcentaje de coeficiente de variacion (CV %). Preferentemente, el CV % es menor que aproximadamente el 20 %, mas preferentemente el CV % es menor que aproximadamente el 5 %.
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Normalizacion
Los factores de normalizacion descritos anteriormente (CC, LS, OP) se usaron para transformar los datos cuantitativos recogidos en cada sistema de microscopio individual a los de un sistema idealizado. Cuando se aplica a mas de un sistema, los datos obtenidos de los mismos se normalizan, de tal manera que se mitigo cualquier influencia de las respectivas fluctuaciones del microscopio y de la fuente de luz a los resultados.
Haciendo referencia a la figura 8, un diagrama de flujo de un proceso para normalizar los resultados del analisis cualitativos incluye un procedimiento de inicializacion preliminar 300 seguido de un procedimiento de muestra de ensayo 200. Como parte del procedimiento de inicializacion 300, el instrumento se configura en la etapa 210. La configuracion de instrumento incluye configurar el sistema de microscopio 100 (figura 1) con la fuente de excitacion adecuada 102, los cubos de filtro 108 (figura 1) y el cubo de calibracion 130 (figura 2), garantizado que el controlador 116 (figura 1) incluye el control de programa adecuado, y realizando cualquier rutina de inicializacion que pueda necesitarse para el sistema de microscopio 100 y la camara CCD 112. Una vez que la configuracion del instrumento esta completa, la camara CCD 112 es capaz de obtener imagenes de una muestra bajo ensayo usando el sistema de microscopio 100 bajo el control del controlador 116. Una vez configurado, se obtienen un factor de correccion (CC) para el cubo de calibracion 130 y un factor intrlnseco de maquina (OP) para el sistema de microscopio 100 en la etapa 220. Como se ha descrito anteriormente, el factor intrlnseco de maquina (OP) puede determinarse en el momento de la fabricacion, y/o en el momento del mantenimiento/reparacion del sistema de microscopla y almacenarse para su uso posterior. Por lo tanto, obtener el factor intrlnseco de maquina OP puede incluirse buscando un valor pre-almacenado. Uno o mas de estos factores (CC, OP) pueden almacenarse por el controlador 116, o el analizador de imagenes para su uso posterior en el analisis de imagenes de las muestras de ensayo.
Como parte del procedimiento de ensayo 200, una muestra bajo ensayo se representa mediante imagenes por el sistema 100 en la etapa 230. Un factor de correccion de fuente de luz (LS) se obtiene durante esta etapa. En mas detalle, una muestra de ensayo real 107 se coloca sobre la platina del microscopio 106 y se coloca de tal manera que un punto objetivo 109 se alinea con un eje optico que incluye la lente de objetivo 104 (figura 1). Esta alineacion inicial puede realizarse manualmente a traves del cabezal de observacion 110 (figura 1), automaticamente usando el controlador 116, o a traves de una combinacion de un curso de ajuste manual seguido por un ajuste de controlador fino 116. Para las muestras de ensayo que incluyen una matriz regular de puntos objetivos 109, la muestra de ensayo 107 se alinea preferentemente una vez (por ejemplo, para un punto objetivo 109) y a continuacion se recoloca de nuevo en los puntos objetivos adicionales de ensayo 109 de la muestra 107 usando unos ajustes de desplazamientos preprogramados de la platina 106.
Una vez que el punto objetivo 109 esta alineado con el eje optico, el sistema 100 adquiere una imagen de muestra del punto objetivo 109 usando la camara CCD 112 (figura 1). Para el sistema IHC de fluorescencia a modo de ejemplo, se obtiene una imagen de muestra para una banda de longitud de onda elegida o canal de interes usando uno respectivo de los bloques de filtro 108 (figura 1) correspondiente al canal. El cubo de calibracion 130 (figura 2) se selecciona a traves de la rotacion de la torreta 115 (figura 1). Una imagen de referencia de la fuente de excitacion se obtiene tambien usando el cubo de calibracion 130 para una determinacion de la intensidad de fuente de excitacion. Los cubos de filtro adicionales 108 pueden usarse para obtener imagenes de muestra adicionales a traves de diferentes canales, como se requieran. El orden especlfico en el que se obtienen los canales y las muestras de fuente de excitacion puede variarse, a condicion de que la una o mas imagenes de canal esten relacionadas con la imagen de referencia de fuente de excitacion (por ejemplo, tomada en aproximadamente el mismo momento). Una relacion de este tipo puede lograrse formando una imagen compuesta de las multiples imagenes, o etiquetando de otro modo las imagenes para reflejar su relacion.
Las imagenes de muestra y de referencia pueden enviarse desde la camara 112 al controlador 116 o a un analizador de imagenes separado para su analisis y correccion posteriores en la etapa 240. El analisis de imagenes puede incluir calcular las puntuaciones AQUA para cada uno de los diferentes canales. Uno o mas de los factores de correccion (CC, OP, LS) se aplican en la etapa 250 para obtener resultados corregidos o normalizados. Los datos de salida normalizados para el punto objetivo especlfico 109 de la muestra de ensayo 107 se proporcionan en la etapa 260. El procedimiento de muestra de ensayo 200 puede repetirse para puntos objetivo adicionales 109 de la misma muestra de ensayo 107. El procedimiento de muestra de ensayo 200 tambien puede repetirse para una o mas muestras de ensayo 107 usando los mismos factores de correccion obtenidos en la etapa 220.
En mas detalle, un diagrama de flujo a modo de ejemplo de un procedimiento de inicializacion 300 para obtener los factores de correccion usados en la normalizacion de los resultados del analisis cualitativo se muestra en la figura 9. La camara 112 (figura 1) y el microscopio se inicializan respectivamente en las etapas 310 y 320. Estas etapas pueden realizarse secuencialmente o en paralelo. Los proveedores de la camara 112 y el sistema de microscopio 110 definen normalmente estas etapas de inicializacion 310, 320 en forma de un procedimiento de inicializacion. Uno o mas de los procedimientos de inicializacion pueden automatizarse y producirse como parte de un ciclo de encendido.
A continuacion, la platina de microscopio 106 (figura 1) se inicializa en la etapa 330 para permitir la alineacion
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correcta de las muestras de ensayo durante el ensayo. En algunas realizaciones, una platina de calibracion que incluye una muestra objetivo se coloca sobre la platina de microscopio 106 en la etapa 350. La platina de calibracion se selecciona para proporcionar una respuesta conocida durante la caracterizacion de la trayectoria optica, que puede realizarse en el momento de la fabricacion, o el mantenimiento del sistema de microscopla. Se obtiene una imagen de la platina de calibracion en la etapa 360 y un factor de correccion de trayectoria optica, o factor intrlnseco de maquina (OP) se determina en la etapa 370. El factor intrlnseco de maquina puede almacenarse para su uso posterior durante el funcionamiento normal para eliminar la variabilidad de trayectoria optica entre los diferentes sistemas de microscopla. Esta etapa de determinacion del factor intrlnseco de maquina incluye obtener una imagen de muestra de la fuente de excitacion usando el cubo de calibracion 130 (figura 2) para determinar la intensidad de la fuente de calibracion. Preferentemente, la muestra de fuente de excitacion se obtiene inmediatamente adyacente a la etapa de obtener una imagen de la platina de calibracion para minimizar la probabilidad de una variacion de la intensidad entre las muestras.
A continuacion, se accede al factor de correccion de cubo de calibracion (CC) en la etapa 380. Este valor puede almacenarse en el sistema o introducirse manualmente durante el proceso de inicializacion preliminar 300. Este valor puede obtenerse comparando los resultados obtenidos a partir del cubo de calibracion 130 con los resultados obtenidos usando un cubo de calibracion universalmente normalizado y formulando una relacion de los resultados. Al igual que en el factor de correccion de trayectoria optica, no es necesario que se repita la determinacion del factor de correccion de cubo de calibracion durante el uso normal. Como se ha descrito anteriormente, el cubo de calibracion se construye preferentemente para reducir o eliminar cualquier variabilidad en su rendimiento a lo largo del tiempo. Por lo tanto, una determinacion inicial del factor de correccion de cubo de calibracion puede obtenerse en el momento de su fabricacion (la fabrica mantiene un cubo de calibracion normalizado de “oro” que se usa en la comparacion con los cubos de calibracion fabricados para obtener el factor de correccion). El factor de correccion resultante puede marcarse en el propio cubo de calibracion y/o proporcionarse al procesador para su uso posterior durante la correccion de las imagenes muestreadas. Una vez obtenidos, el factor intrlnseco de maquina (OP) y el factor de correccion de cubo de calibracion (CC) se emiten para un software de analisis de imagenes en la etapa 390 (por ejemplo, leer desde las localizaciones de memoria que contienen los valores pre-almacenados). Esto puede incluir el reenvlo de los factores (OP, CC) al controlador 116 o a un analizador de imagenes separado para el almacenamiento y posterior uso de las imagenes normalizadas de las muestras de ensayo reales. Las etapas 360 y 380 pueden repetirse para los diferentes canales de la misma platina de calibracion y emitirse por separado para el software de analisis de imagenes en la etapa 390. Por lo tanto, el factor intrlnseco de maquina (OP) se determina y se retiene sobre una base por canal y se almacena por separado para el analisis posterior de las muestras de ensayo sobre una base por canal usando el factor intrlnseco de maquina apropiado. En algunas realizaciones, las etapas 360, 380, y 390 pueden repetirse para el mismo canal para permitir la determinacion estadlstica del factor intrlnseco de maquina. Por lo tanto, pueden obtenerse y usarse multiples resultados para cada canal para formular un resultado promedio que se almacena para su uso posterior.
Una ecuacion proporcionada a continuacion (Ec. 1) se utilizo para normalizar los resultados obtenidos para cada sistema 100. El factor de correccion de cubo de calibracion (CC) y los factores intrlnsecos de maquina (OP) se determinaron para cada sistema y se almacenaron para su uso posterior en la manipulacion de los resultados de ensayo. A continuacion, se obtuvieron unos resultados cuantitativos normalizados (puntuacion cuantitativa de especimenen bruto) para un especimen especlfico, o una muestra bajo ensayo. A traves de un proceso de correccion, la puntuacion cuantitativa en bruto se multiplica por los diferentes factores de correccion, para producir un resultado cuantitativo normalizado adecuado para la comparacion entre los diferentes sistemas.
Puntuacion cuantitativa de especimennormalizada =
(puntuacion cuantitativa de especimenen bruto)*(CC)*(OP)*(100000/LS) (Ec. 1)
La ecuacion anterior proporciona un esquema de normalizacion multiplicativo directo usando dos constantes que eran intrlnsecas al cubo de calibracion y al sistema de microscopla (CC y OP). Estos dos factores se escalaron como se ha descrito anteriormente, de tal manera que los datos se normalizaron a un sistema ideal. Por lo tanto, un cubo de calibracion que se aproxima a la “normalizacion de oro” resultarla en un CC que se acerca al 1,0. Del mismo modo, una trayectoria optica que se acerca a una trayectoria optica de referencia normalizada tambien se acercarla al 1,0. En el caso del factor de fluctuacion de fuente de luz (LS), se uso un valor obtenido emplricamente de 100.000 para definir un valor de intensidad ideal para este factor. A continuacion, este valor de 100.000 se dividio por el valor LS especlfico obtenido durante cada medicion. La Tabla 3 muestra el factor de correccion de normalizacion resultante obtenido para cinco instrumentos diferentes.
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Tabla 3: Factor de Normalization para cinco instrumentos
Instrumento Correction: (CC)*(OP)*(100.000)
1 97446
2 116702
3 172794
4 88300
5 132000
El uso de los factores de correction descritos en el presente documento (CC, OP, LS), los datos cuantitativos obtenidos usando los cinco instrumentos diferentes se correlacionaron al instrumento 1. Los resultados de la correlation se ilustran graficamente en la figura 10. Como puede verse en la figura, antes de la correction, las correlaciones de cada instrumento al instrumento 1 dan como resultado unas curvas de no superposition que varlan sustancialmente del instrumento 1. Sin embargo, despues de la aplicacion de los factores de correction, las curvas de correlation corregidos para los cinco instrumentos se superponen sustancialmente al instrumento 1, demostrando un alto grado de correlation para el instrumento 1 y entre si.
EJEMPLO: En el uso, una muestra de ensayo puede incluir una micromatriz de tejido (TMA) que incluye una matriz de muestras de tejido en una unica platina de microscopio. Por ejemplo, se tino una micromatriz de tejido de 36 puntos que inclula muestras de tejido de cancer de mama, BT474, MCF7, T47D muestras de control de llnea de celula. El protocolo de tincion implico una desparafinacion en xileno, una rehidratacion a traves de una serie de cantidades decrecientes de etanol a agua pura, y la recuperation de antlgenos en Tris EDTA. Despues del bloqueo de peroxidasa endogena y bloquear con el background sniper, HER 2, (CB11) y la citoqueratina se aplicaron anticuerpos primarios (Rabbit, Dako) y se aclararon despues de 1 hora. A continuation, se aplicaron Dako Envision anti-raton e Invitrogen alexa 555 GAR. Despues de un extenso lavado, se aplico cy 5 tiramida. Las platinas se lavaron con TBS/Tween 20. Por ultimo, se aplico un medio de montaje con DAPI y se secaron las platinas.
La intensidad de fluorescencia de la tincion del HER2 y la puntuacion AQUA resultantes se recogieron para cada punto de tejido de la micromatriz de tejido usando los instrumentos 1 y 2 incluidos en la Tabla 3.
Las puntuaciones se normalizaron usando la Ec. 2 y la Ec. 3 a continuation.
Puntuacion cuantitativanormalizada =
(puntuaci°n cuantitativa de esp6cimenen bruto Instrumento 1/LSInstrumento 1) 97,446 (Ec- 2)
Puntuacion cuantitativanormalizada =
(puntuaci°n cuantitativa de esp6cimenen bruto Instrumento 2/LSInstrumento 2) 116,702 (Ec- 3)
Las puntuaciones AQUA para cada muestra en la micromatriz de tejido de 36 puntos se adquirieron usando dos instrumentos diferentes. Las puntuaciones AQUA en bruto mostradas en la figura 11A y las puntuaciones AQUA normalizados mostradas en la figura 11B de la micromatriz de tejido de 36 puntos, adquirida en dos instrumentos se representaron graficamente en un formato de representation de dispersion. Los resultados muestran una inclination de la llnea de regresion del coeficiente de correlation del 2,6:1 entre los dos instrumentos que usan las puntuaciones en bruto. Usando los metodos de normalization de la invention, se logro una inclination de la llnea de regresion de los coeficientes de correlation del 0,98:1 entre los dos instrumentos, mostrando que la distribution de las puntuaciones no se vera afectada por la normalization.
Se uso un analisis estadlstico rho de Spearman no parametrico para describir la relation de clasificacion antes y despues de la normalization. El analisis se realizo usando el conjunto de datos de puntuacion AQUA obtenido a partir de dos instrumentos. Los ordenes de clasificacion se asignan del valor original menor (= clasificacion 1) al valor original mayor para cada puntuacion AQUA. El coeficiente de correlation y el Valor-P se calcularon para los conjuntos de datos no normalizados (en bruto) y normalizados. El orden de clasificacion de los datos no se vio afectado por la normalization (Tabla 4).
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Tabla 4. Analisis Rho de Spearman
Datos normalizados Datos en bruto Rho: 0,72 0,721
Valor-P: < 0,0001 < 0,0001
EJEMPLO: la misma micromatriz de tejido de 36 puntos descrita en el ejemplo anterior se obtuvo y se puntuo en cinco instrumentos diferentes.
Los resultados indicaron que el porcentaje de coeficiente de variacion (CV %) de las puntuaciones AQUA en bruto y las puntuaciones AQUA normalizadas para cada punto de tejido de micromatriz de tejido adquirido en los cinco instrumentos diferentes muestra que se logra un CV % significativamente mejor por la normalizacion de los metodos de la divulgacion.
Las tablas 5 y 6 son compilaciones de la inclinacion de la llnea de regresion del coeficiente de correlacion generado con una sola serie de platina en los cinco instrumentos. Las correlaciones basandose en las puntuaciones AQUA en bruto se muestran en la Tabla 5 y las basadas en las puntuaciones AQUA normalizadas se muestran en la Tabla 6. Esta comparacion se realiza con numeros generados a partir de las imagenes validadas.
Tabla 5: Datos en bruto
- Datos en bruto
- Instrumento 1 Instrumento 2 Instrumento 3 Instrumento 4 Instrumento
- Instrumento 1
- N/A 0,44x 2,55x 1,68x 2,51x
- Instrumento 2
- 0,44x N/A 0,17x 3,85x 5,76x
- Instrumento 3
- 2,55x 0,17x N/A 0,66c 0,98x
- Instrumento 4
- 1,68x 3,85x 0,66x N/A 1,50x
- Instrumento 5
- 2,51x 5,76x 0,98x 1,50x N/A
Tabla 6. Datos normalizados
- Datos normalizados
- Instrumento 1 Instrumento 2 Instrumento 3 Instrumento 4 Instrumento
- Instrumento 1
- N/A 0,88x 0,95x 1,09x 0,89x
- Instrumento 2
- 0,88x N/A 0,92x 1,24x 1,00x
- Instrumento 3
- 0,95x 0,92x N/A 1,14x 0,93x
- Instrumento 4
- 1,09x 1,24x 1,14x N/A 1,23x
- Instrumento 5
- 0,89x 1,00x 0,93x 1,23x N/A
El porcentaje de coeficiente de variacion (CV %) de las puntuaciones AQUA® en bruto y las puntuaciones AQUA normalizadas para cada punto de tejido de micromatriz de tejido adquirido en los cinco instrumentos muestra que se logra un CV % significativamente mejor por la normalizacion de los metodos de la divulgacion.
Las puntuaciones AQUA medias para la tincion HER2 de 26 de los 36 puntos de micromatriz de tejido validados se muestran en la figura 12A y la figura 12B. Si bien las tendencias o las comparaciones entre las 36 muestras son similares en cada instrumento, la varianza de puntuacion para cada muestra individual tiene un CV promedio de aproximadamente un 60 % de un instrumento a otro. En comparacion, las puntuaciones medias obtenidas en cada uno de los mismos 5 instrumentos, una vez normalizados figura 12B son mas consistentes, con un CV promedio de aproximadamente un 20 %.
Un analisis del ensayo de varianza (ANOVA) para las diferencias significativas entre las medias antes y despues de la normalizacion que usa la hipotesis nula de que los instrumentos son identicos produce un valor de p significativo < 0,05 rechazando de este modo la hipotesis nula que indica que las puntuaciones medias marginales recogidas en multiples instrumentos son diferentes. Despues de la normalizacion el valor de p > 0,05 indica que las puntuaciones medias marginales recogidas en multiples instrumentos ahora no son significativamente diferentes.
A pesar de que las realizaciones a modo de ejemplo se refieren principalmente a la microscopla fluorescente, la invencion puede aplicarse ampliamente a los microscopios opticos en general. Las tecnicas de diversas realizaciones se aplican para la correccion de las variaciones en la intensidad de cualquier fuente de luz que usa un instrumento de calibracion, para la correccion de las variaciones de instrumentos de calibracion que usan los 5 desplazamientos para un instrumento de calibracion universalmente normalizado, y/o para normalizar los efectos de la trayectoria optica a traves de un sistema de microscopla optica especlfico. Por lo tanto, pueden aplicarse en general diversas realizaciones de la invencion a una variedad de microscopios opticos que usan fuentes de iluminacion incoherentes, fuentes de iluminacion polarizadas, y fuentes de iluminacion coherentes, tales como los sistemas de microscopio de barrido laser confocal.
10 Los requisitos de sistema para un sistema de microscopla de fluorescencia a modo de ejemplo se incluyen en la Tabla 7.
Tabla 7: Requisitos del sistema de microscopla fluorescente a modo de ejemplo
- Componente
- Especificaciones objetivo Ejemplo
- Microscopio de Epi-fluorescencia Olympus BX51
- Automatization de platina para facilitar la adquisicion de imagenes (opcional) Sistema HistoRx PM2000™ (platina previa) con el software AQUAsition™ asociado
- Microscopio
- Fuente de luz de fluorescencia de arco de mercurio (Hg). Se recomienda de manera encarecida que las fuentes de luz posean un iris ajustable o un obturador de seguridad si se realizan mediciones de luz Exfo X-cite con iris ajustable
- Filtro/canales de fluorescencia para adaptar DAPI (UV) / Cy3 / Alexa555, y Cy5 / Alexa 647 Ningun ejemplo dado
- Objetivos basados en la resolution de la camara descritos a continuation Objetivos de la serie UPLSAPO de Olympus
- Monitorizacion/ Calibracion
- Platinas normalizadas para proporcionar una referencia para la normalization de microscopio. [Opcional] Capacidad para medir la intensidad de luz entrante al microscopio (en vatios) Platinas de referencia de fluorescencia optica Omega (azul; XF900); [Opcional] radiometro trazable Exfo NIST (numero de pieza P010-00200)
- Camara
- Capacidad monocromatica CCD, resolucion de 8 o 12 bits Camara Optronics QuantiFire XI CCD (2048x2048 pixeles, 7,4 pM/pixel) junto con el objetivo UPLSaPo 20X de Olympus
- Tamano del campo visual (combination camara / Objetivo)
- Combinacion tamano de pixel - aumento del objetivo que proporciona un tamano del campo de vision de entre 671 pM y 888 pM. Calculo del tamano del campo de vision (para camaras con CCD rectangulares, los valores deben calcularse para ambas dimensiones): (Tamano de pixel CCD) * (numero de pixeles CCD) / (aumento del objetivo) Calculo para el hardware de ejemplo: (7,4 pM) * (2048) / (20) = 758 pM campo de vision
- Exposicion de adquisicion
- Las imagenes deben adquirirse con los ajustes de exposicion optimos de tal manera que los pixeles de la imagen no se saturen, sin embargo el intervalo dinamico de intensidad se maximiza
- Ordenador, monitor, teclado, raton
- Windows XP Professional (MSF), equipado con una unidad de DVD-ROM. Monitor de 20” para la visualization de la imagen.
Se comprendera por un experto en la materia, que una o mas de las etapas de obtener los diversos factores de correccion: CC, LS, OP pueden obtenerse automaticamente o al menos semi-automaticamente con la ayuda de un procesador, tal como un ordenador. Como alternativa, o ademas, una o mas de las etapas usadas en determinar los datos de imagen objetivo normalizados y/o una medida cuantitativa de los mismos puede automatizarse, por 5 ejemplo, con la ayuda de un procesador. Por ejemplo, un procesador de este tipo puede implementarse mediante unas instrucciones preprogramadas que se ejecutan en un ordenador. Tal automatizacion facilita la elimination de la variabilidad inherente de la puntuacion basada en el patologo.
Si bien esta invention se ha mostrado y descrito especlficamente con referencias a las realizaciones preferidas de la misma, deberla ser evidente que se han descrito las caracterlsticas operativas unicas. Aunque las realizaciones 10 especlficas se han desvelado en detalle en el presente documento, esto se ha hecho a modo de ejemplo solamente con fines de ilustracion, y no se pretende que sean limitantes con respecto al alcance de las reivindicaciones adjuntas que siguen. En particular, se contempla por los inventores que diversas sustituciones, alteraciones y modificaciones puedan hacerse a la invencion sin alejarse del alcance de la invencion abarcado en las reivindicaciones adjuntas. Por ejemplo, la election de materiales para el filtro, el orden de las etapas de medicion y 15 de analisis, y la configuration de los filtros, la platina, y la fuente de excitation empleada se cree que son cuestion de rutina para un experto en la materia con el conocimiento de las realizaciones descritas en el presente documento.
Claims (10)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un sistema de microscopio para obtener una medida cuantitativa normalizada de datos de muestra objetivo, obtenidos a partir de una medicion de intensidad, cuando se representa la imagen de una muestra objetivo por un microscopio (100) que tiene una fuente de luz de excitacion (102), un medio optico (104), un medio de captura de imagenes (112), y un medio de almacenamiento de datos (116), dispuestos conjuntamente para obtener una imagen de la muestra objetivo (107),comprendiendo el sistema de microscopio:el microscopio (100) que tiene la fuente de luz de excitacion (102), el medio optico (104), el medio de captura de imagenes (112), y el medio de almacenamiento de datos (116), dispuestos conjuntamente para obtener la imagen de la muestra objetivo (107);un medio para obtener para la fuente de luz de excitacion (102), un factor de correccion de fuente de luz, que comprende un instrumento de calibracion y un medio para conmutar el instrumento de calibracion dentro y fuera de una trayectoria optica para permitir que se obtenga una medicion de intensidad de luz relativa sustancialmente de manera simultanea con la imagen de muestra objetivo;un medio para iluminar con la fuente de luz de excitacion (102) el instrumento de calibracion;en el que el instrumento de calibracion comprende una superficie de calibracion colocada a lo largo de una trayectoria optica para la iluminacion de dispersion sustancialmente uniforme desde la fuente de luz de excitacion hacia el medio de captura de imagenes (112) y comprende ademas un espejo dicromatico colocado para reflejar la iluminacion desde la fuente de luz de excitacion a lo largo de una trayectoria optica a traves del medio optico (104) hacia la muestra objetivo y para transmitir al menos una parte de la iluminacion desde la muestra objetivo hacia el medio de captura de imagenes (112), en el que la superficie de calibracion bloquea temporalmente la trayectoria optica entre el espejo dicromatico y el medio optico (104) durante la calibracion y dispersa una parte sustancial de la luz de excitacion reflejada a traves del espejo dicromatico hacia el detector;un medio para aplicar el factor de correccion de fuente de luz a los datos de muestra objetivo, obteniendo de este modo datos de muestra objetivo medidos cuantitativos normalizados, que se normalizan con respecto a la variabilidad de intensidad de luz temporal de la fuente de luz de excitacion (102).
- 2. El sistema de microscopio de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende ademas un medio para aplicar un factor intrlnseco de microscopio a los datos de muestra objetivo, normalizando de este modo los datos de muestra objetivo con respecto al microscopio.
- 3. El sistema de microscopio de acuerdo con la reivindicacion 2, que comprende ademas un medio para obtener el factor intrlnseco de microscopio que comprende:un medio para iluminar, mediante la fuente de luz de excitacion (102), una muestra objetivo de calibracion configurada para producir una respuesta normalizada;un medio para obtener, en respuesta a la iluminacion del objetivo de calibracion, los datos de muestra objetivo medidos; yun medio para determinar el factor intrlnseco de microscopio indicativo del rendimiento relativo del medio optico (104).
- 4. El sistema de microscopio de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende ademas un medio para aplicar un factor de compensacion de instrumento de calibracion a los datos de muestra objetivo, normalizando de este modo los datos de muestra objetivo con respecto al instrumento de calibracion.
- 5. El sistema de microscopio de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que el factor de compensacion de instrumento de calibracion se almacena en el medio de almacenamiento de datos (116) del microscopio.
- 6. El sistema de microscopio de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la muestra objetivo es una muestra biologica.
- 7. El sistema de microscopio de acuerdo con la reivindicacion 6, en el que la muestra biologica se selecciona del grupo que consiste en: una celula; una pluralidad de celulas; una seccion de tejido; una matriz de secciones de tejido; y combinaciones de las mismas.
- 8. El sistema de microscopio de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que la muestra biologica se ha tratado con uno o mas tintes.
- 9. El sistema de microscopio de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el microscopio se selecciona del grupo que consiste en: microscopios opticos que usan fuentes de iluminacion incoherentes; microscopios opticos que usan5 fuentes de iluminacion polarizadas, microscopios opticos que usan fuentes de iluminacion fluorescentes; microscopios que usan fuentes de iluminacion coherentes, tales como los sistemas de microscopio de barrido laser confocal; y combinaciones de los mismos.
- 10. Un metodo para normalizar una medida cuantitativa de los datos de muestra objetivo obtenidos a partir de una medicion de intensidad que usa el sistema de microscopio de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.10
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Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2599902T3 true ES2599902T3 (es) | 2017-02-06 |
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|---|---|---|---|
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Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DK2156370T3 (da) | 2007-05-14 | 2012-01-23 | Historx Inc | Kompartmentadskillelse ved pixelkarakterisering under anvendelse af billeddata-clustering |
| ES2599902T3 (es) | 2007-06-15 | 2017-02-06 | Novartis Ag | Sistema y método de microscopio para obtener datos de muestra normalizados |
| CA2596204C (en) | 2007-08-07 | 2019-02-26 | Historx, Inc. | Method and system for determining an optimal dilution of a reagent |
| WO2009029810A1 (en) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Historx, Inc. | Automatic exposure time selection for imaging tissue |
| AU2009293380B2 (en) | 2008-09-16 | 2016-05-19 | Novartis Ag | Reproducible quantification of biomarker expression |
| SG173902A1 (en) * | 2009-03-05 | 2011-09-29 | Agency Science Tech & Res | A method and system for enhancing a microscopy image |
| US8913127B2 (en) * | 2009-06-01 | 2014-12-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Calibration of imaging device for biological/chemical samples |
| JP5356191B2 (ja) * | 2009-11-26 | 2013-12-04 | オリンパス株式会社 | 蛍光観察装置 |
| WO2012027586A2 (en) | 2010-08-27 | 2012-03-01 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Microscopy imaging device with advanced imaging properties |
| US8466436B2 (en) | 2011-01-14 | 2013-06-18 | Lumencor, Inc. | System and method for metered dosage illumination in a bioanalysis or other system |
| EP2737453B1 (en) * | 2011-07-13 | 2019-12-18 | Leica Biosystems Imaging, Inc. | Standardizing fluorescence microscopy systems |
| US8755633B2 (en) * | 2012-03-14 | 2014-06-17 | Sony Corporation | Automated synchronized navigation system for digital pathology imaging |
| CN103110406B (zh) * | 2013-02-01 | 2014-08-27 | 华中科技大学 | 基于单光源双向光路的乳腺成像系统 |
| US9347852B1 (en) | 2013-05-08 | 2016-05-24 | Thomas DiMatteo | Microscope illumination diagnostic cube |
| CN104251811A (zh) * | 2013-06-28 | 2014-12-31 | 西门子医疗保健诊断公司 | 一种数字显微镜及其图像识别方法 |
| DE102013022538B3 (de) * | 2013-09-03 | 2018-12-13 | Georg-August-Universität Göttingen Stiftung Öffentlichen Rechts | Verfahren zum Erstellen eines Mikroskopbildes und Mikroskopievorrichtung |
| MX357196B (es) * | 2013-10-10 | 2018-06-29 | Halliburton Energy Services Inc | Dispositivo informatico optico y metodo para compensar las fluctuaciones de luz. |
| US8736685B1 (en) * | 2013-12-11 | 2014-05-27 | Anritsu Company | Systems and methods for measuring brightness response of a camera operating in automatic exposure mode |
| US9307231B2 (en) | 2014-04-08 | 2016-04-05 | Lucasfilm Entertainment Company Ltd. | Calibration target for video processing |
| US9641830B2 (en) | 2014-04-08 | 2017-05-02 | Lucasfilm Entertainment Company Ltd. | Automated camera calibration methods and systems |
| US9797767B2 (en) | 2014-08-26 | 2017-10-24 | General Electric Company | Calibration of microscopy systems |
| US10746980B2 (en) | 2014-08-26 | 2020-08-18 | General Electric Company | Calibration of microscopy systems |
| USD751627S1 (en) | 2014-09-30 | 2016-03-15 | Lucasfilm Entertainment Company Ltd. | Camera calibration tool |
| WO2017109057A1 (en) * | 2015-12-23 | 2017-06-29 | Koninklijke Philips N.V. | Fluorescence calibration slide |
| RU2734097C2 (ru) | 2015-12-23 | 2020-10-12 | Конинклейке Филипс Н.В. | Калибровочный слайд для цифровой патологии |
| TWI586957B (zh) * | 2016-06-24 | 2017-06-11 | 諾貝爾生物有限公司 | 多通道螢光檢測系統及其方法 |
| JP6745397B2 (ja) * | 2016-07-21 | 2020-08-26 | シーメンス・ヘルスケア・ダイアグノスティックス・インコーポレーテッドＳｉｅｍｅｎｓ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ． | キュベット間の基準測定値を用いた電源ランプの強度ドリフト効果の除去 |
| US10260941B2 (en) * | 2016-10-04 | 2019-04-16 | Precitec Optronik Gmbh | Chromatic confocal distance sensor |
| DE102016122528A1 (de) | 2016-11-22 | 2018-05-24 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Verfahren zum Steuern oder Regeln einer Mikroskopbeleuchtung |
| DE102016122529A1 (de) | 2016-11-22 | 2018-05-24 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Mikroskop zur Abbildung eines Objekts |
| WO2018194525A1 (en) * | 2017-04-18 | 2018-10-25 | Yeditepe Universitesi | Biochemical analyser based on a machine learning algorithm using test strips and a smartdevice |
| DE102017121483B3 (de) | 2017-09-15 | 2019-03-07 | Leica Microsystems Cms Gmbh | Verfahren zur Untersuchung einer multispektralen Probe, Steuereinheit hierfür und Mikroskop-Anordnung |
| EP3699588A4 (en) | 2017-10-19 | 2020-11-25 | Konica Minolta, Inc. | METHOD OF MEASURING THE QUANTITY OF BIOMATERIAL, IMAGE PROCESSING DEVICE, SYSTEM TO SUPPORT PATHOLOGY DIAGNOSIS AND PROGRAM |
| US10724958B2 (en) | 2017-11-06 | 2020-07-28 | Senors Unlimited, Inc. | Imaging devices, imaging arrangements, and imaging methods |
| CN108333147B (zh) * | 2017-12-14 | 2024-04-12 | 中国科学院西安光学精密机械研究所 | 近背向散射光学测量系统 |
| CN110824722B (zh) * | 2018-08-07 | 2021-10-15 | 宁波舜宇光电信息有限公司 | 结构光投射模组组装装置及投射模组的组装、检测方法 |
| EP3614128B1 (en) | 2018-08-22 | 2023-04-26 | F. Hoffmann-La Roche AG | A method to correct signal light intensities measured by a detector of a detection unit in a laboratory instrument |
| CN109187376B (zh) * | 2018-09-17 | 2021-06-18 | 深圳市三束镀膜技术有限公司 | 一种全量程物体表面光谱反射率测试方法 |
| CN109186458B (zh) * | 2018-09-28 | 2019-06-18 | 华中科技大学 | 一种用于色散共焦峰值提取的补偿拟合差分信号方法 |
| ES2853354B2 (es) * | 2020-03-12 | 2022-02-02 | Univ Madrid Carlos Iii | Procedimiento para corregir el efecto de la dispersión de la luz en medidas de microscopio de haz láser plano |
| CN114295554B (zh) * | 2021-12-31 | 2024-02-23 | 中元汇吉生物技术股份有限公司 | 光强检测方法、装置、设备及存储介质 |
Family Cites Families (210)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1914322A (en) * | 1929-01-22 | 1933-06-13 | Everett H Bickley | Device for the comparison of colors |
| US3958122A (en) * | 1974-12-19 | 1976-05-18 | United Technologies Corporation | Exhaust gas analyzer having pressure and temperature compensation |
| DE3037622C2 (de) * | 1980-10-04 | 1987-02-26 | Theodor Prof. Dr.-Ing. 1000 Berlin Gast | Einrichtung zur Bestimmung der Oberflächengüte |
| US4480189A (en) * | 1981-11-20 | 1984-10-30 | Kasei Optonix, Ltd. | Thermoluminescence dosimeter reader |
| US4557599A (en) * | 1984-03-06 | 1985-12-10 | General Signal Corporation | Calibration and alignment target plate |
| DE3429541C2 (de) * | 1984-08-10 | 1992-10-22 | Seidenberg, Jürgen, Dipl.-Ing., 5100 Aachen | Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der Wellenlänge und der Strahlungsleistung einer monochromatischen Lichtquelle |
| US4902131A (en) * | 1985-03-28 | 1990-02-20 | Kabushiki Kaisha Toshiba | Surface inspection method and apparatus therefor |
| US5134662A (en) | 1985-11-04 | 1992-07-28 | Cell Analysis Systems, Inc. | Dual color camera microscope and methodology for cell staining and analysis |
| US4998284A (en) | 1987-11-17 | 1991-03-05 | Cell Analysis Systems, Inc. | Dual color camera microscope and methodology for cell staining and analysis |
| US4927266A (en) * | 1987-03-30 | 1990-05-22 | Anritsu Corporation | Optical signal generating apparatus and optical power meter calibrating system using the same |
| US4892817A (en) * | 1987-09-21 | 1990-01-09 | Biogenex Laboratories | Stable phosphatase substrate composition |
| US4912034A (en) * | 1987-09-21 | 1990-03-27 | Biogenex Laboratories | Immunoassay test device and method |
| US5015098A (en) * | 1987-10-05 | 1991-05-14 | X-Rite, Incorporated | Densitometer with error correction |
| JPH0663758B2 (ja) * | 1987-10-14 | 1994-08-22 | 株式会社東芝 | パターンの測定方法 |
| DE3800427C2 (de) * | 1988-01-09 | 1997-05-28 | Breitmeier Ulrich | Gerät zum Ermitteln des Abstands eines auf einer Prüffläche liegenden Prüfpunktes von einer Referenzfläche |
| US5068909A (en) | 1989-05-18 | 1991-11-26 | Applied Imaging Corporation | Method and apparatus for generating quantifiable video displays |
| US5070455A (en) * | 1989-11-22 | 1991-12-03 | Singer Imaging, Inc. | Imaging system and method using scattered and diffused radiation |
| US5115673A (en) * | 1990-07-20 | 1992-05-26 | The United States Of America As Represented By The United States National Aeronautics And Space Administration | Non-destructive method for determining elastic moduli of material |
| US5244787A (en) | 1991-01-31 | 1993-09-14 | Biogenex Laboratories | Antigen retrieval in formalin-fixed tissues using microwave energy |
| US6411377B1 (en) * | 1991-04-02 | 2002-06-25 | Hitachi, Ltd. | Optical apparatus for defect and particle size inspection |
| US5126577A (en) * | 1991-06-27 | 1992-06-30 | Electro-Optical Industries, Inc. | Infrared target plate handling apparatus with improved thermal control |
| KR960002145B1 (ko) | 1991-07-30 | 1996-02-13 | 가부시기가이샤 히다찌세이사구쇼 | 박막트랜지스터 액정기판의 검사방법 및 그 장치 |
| CA2084099C (en) | 1991-12-06 | 1996-06-18 | James V. Bacus | Method and apparatus for automated cell analysis |
| US5578452A (en) | 1992-01-16 | 1996-11-26 | Biogenex Laboratories | Enhancement of immunochemical staining in aldehyde-fixed tissues |
| US5254845A (en) | 1992-08-18 | 1993-10-19 | Applied Imaging International Limited | Automatic focusing system using focal length-changing element |
| US5889881A (en) | 1992-10-14 | 1999-03-30 | Oncometrics Imaging Corp. | Method and apparatus for automatically detecting malignancy-associated changes |
| US6026174A (en) * | 1992-10-14 | 2000-02-15 | Accumed International, Inc. | System and method for automatically detecting malignant cells and cells having malignancy-associated changes |
| US6252242B1 (en) * | 1992-12-03 | 2001-06-26 | Brown & Sharpe Surface Inspection Systems, Inc. | High speed optical inspection apparatus using Gaussian distribution analysis and method therefore |
| US5427910A (en) * | 1992-12-09 | 1995-06-27 | Compucyte Corporation | Method of cytogenetic analysis |
| US5517193A (en) | 1993-04-30 | 1996-05-14 | International Business Machines Corporation | Meteorological workstation |
| US5587833A (en) * | 1993-07-09 | 1996-12-24 | Compucyte Corporation | Computerized microscope specimen encoder |
| US5492837A (en) * | 1993-08-27 | 1996-02-20 | Biogenex Laboratories | Mounting medium for microscope slide preparations |
| US5439649A (en) * | 1993-09-29 | 1995-08-08 | Biogenex Laboratories | Automated staining apparatus |
| US6136540A (en) * | 1994-10-03 | 2000-10-24 | Ikonisys Inc. | Automated fluorescence in situ hybridization detection of genetic abnormalities |
| US6309601B1 (en) * | 1993-11-01 | 2001-10-30 | Nanogen, Inc. | Scanning optical detection system |
| US5432054A (en) * | 1994-01-31 | 1995-07-11 | Applied Imaging | Method for separating rare cells from a population of cells |
| US5422018A (en) * | 1994-01-31 | 1995-06-06 | Applied Imaging | Centrifuge tube and adaptor |
| US5489386A (en) * | 1994-01-31 | 1996-02-06 | Applied Imaging | Density gradient medium for the separation of cells |
| US6451551B1 (en) | 1994-03-11 | 2002-09-17 | Biogenex Laboratories | Releasing embedding media from tissue specimens |
| US6632598B1 (en) * | 1994-03-11 | 2003-10-14 | Biogenex Laboratories | Deparaffinization compositions and methods for their use |
| US5561556A (en) | 1994-04-21 | 1996-10-01 | Compucyte Corporation | Slide analysis system with slide having self contained microscope analysis information |
| US5672881A (en) * | 1994-09-14 | 1997-09-30 | Glyko, Inc. | Charge-coupled device imaging apparatus |
| US5978497A (en) | 1994-09-20 | 1999-11-02 | Neopath, Inc. | Apparatus for the identification of free-lying cells |
| DE19532897A1 (de) * | 1994-09-27 | 1996-03-28 | Zeiss Carl Fa | Verfahren zur Belichtungssteuerung bei Mikroskopkameras und entsprechendes Photomikroskop |
| US5633945A (en) * | 1994-10-05 | 1997-05-27 | Compucyte Corporation | Accuracy in cell mitosis analysis |
| US5523207A (en) * | 1994-10-17 | 1996-06-04 | Compucyte Corporation | Method for accurate counting of probe spots in cell nuclei |
| GB2294376B (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-10 | Rank Cintel Ltd | Method and apparatus for correcting noise in a film scanner |
| EP0720114B1 (en) | 1994-12-28 | 2001-01-24 | Siemens Corporate Research, Inc. | Method and apparatus for detecting and interpreting textual captions in digital video signals |
| US5694212A (en) | 1995-06-20 | 1997-12-02 | Compucyte Corporation | Method for calibrating specimen with specimen holder of a microscope |
| US5717198A (en) * | 1995-07-10 | 1998-02-10 | Qc Optics, Inc. | Pellicle reflectivity monitoring system having means for compensating for portions of light reflected by the pellicle |
| CA2185511C (en) | 1995-09-15 | 2008-08-05 | Vladimir Dadeshidze | Cytological specimen analysis system with individualized patient data |
| CN1103919C (zh) | 1995-10-30 | 2003-03-26 | 株式会社京都第一科学 | 物质的测定方法及试片 |
| US6151405A (en) | 1996-11-27 | 2000-11-21 | Chromavision Medical Systems, Inc. | System and method for cellular specimen grading |
| EP0864082B1 (en) | 1995-11-30 | 2003-04-02 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Method for automated image analysis of biological specimens |
| US6718053B1 (en) * | 1996-11-27 | 2004-04-06 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Method and apparatus for automated image analysis of biological specimens |
| US6418236B1 (en) * | 1999-06-24 | 2002-07-09 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Histological reconstruction and automated image analysis |
| US6330349B1 (en) | 1995-11-30 | 2001-12-11 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Automated method for image analysis of residual protein |
| US6239868B1 (en) * | 1996-01-02 | 2001-05-29 | Lj Laboratories, L.L.C. | Apparatus and method for measuring optical characteristics of an object |
| US6882873B2 (en) * | 1996-01-17 | 2005-04-19 | Respironics, Inc. | Method and system for determining bilirubin concentration |
| US6165739A (en) | 1996-03-13 | 2000-12-26 | Compucyte Corporation | Multiple simultaneous testing media |
| ATE252158T1 (de) | 1996-05-15 | 2003-11-15 | Biogenex Lab | Nicht-nukleotid verknüpfende reagentien |
| US6292582B1 (en) * | 1996-05-31 | 2001-09-18 | Lin Youling | Method and system for identifying defects in a semiconductor |
| US6458585B1 (en) | 1996-08-14 | 2002-10-01 | Nexell Therapeutics Inc. | Cytokine-free culture of dendritic cells |
| US6404906B2 (en) * | 1997-03-03 | 2002-06-11 | Bacus Research Laboratories,Inc. | Method and apparatus for acquiring and reconstructing magnified specimen images from a computer-controlled microscope |
| US6031930A (en) * | 1996-08-23 | 2000-02-29 | Bacus Research Laboratories, Inc. | Method and apparatus for testing a progression of neoplasia including cancer chemoprevention testing |
| US6272235B1 (en) * | 1997-03-03 | 2001-08-07 | Bacus Research Laboratories, Inc. | Method and apparatus for creating a virtual microscope slide |
| US6396941B1 (en) * | 1996-08-23 | 2002-05-28 | Bacus Research Laboratories, Inc. | Method and apparatus for internet, intranet, and local viewing of virtual microscope slides |
| US5731156A (en) * | 1996-10-21 | 1998-03-24 | Applied Imaging, Inc. | Use of anti-embryonic hemoglobin antibodies to identify fetal cells |
| US5880473A (en) * | 1997-07-28 | 1999-03-09 | Applied Imaging, Inc. | Multifluor-fluorescence in-situ hybridization (M-FISH) imaging techniques using multiple multiband filters with image registration |
| WO1998017992A2 (en) * | 1996-10-25 | 1998-04-30 | Applied Imaging, Inc. | Multifluor-fluorescence in situ hybridization (m-fish) imaging techniques using multiple multiband filters with image registration |
| US5916750A (en) * | 1997-01-08 | 1999-06-29 | Biogenex Laboratories | Multifunctional linking reagents for synthesis of branched oligomers |
| US6087134A (en) * | 1997-01-14 | 2000-07-11 | Applied Imaging Corporation | Method for analyzing DNA from a rare cell in a cell population |
| US5885840A (en) * | 1997-02-10 | 1999-03-23 | Compucyte Corp. | Multiple assays of cell specimens |
| GB9704054D0 (en) * | 1997-02-27 | 1997-04-16 | Univ Cambridge Tech | Assay |
| US5948359A (en) | 1997-03-21 | 1999-09-07 | Biogenex Laboratories | Automated staining apparatus |
| EP0977981B1 (en) * | 1997-04-25 | 2003-07-09 | Universiteit van Amsterdam | Photobleachable luminescent layers for calibration and standardization in optical microscopy |
| US6259807B1 (en) | 1997-05-14 | 2001-07-10 | Applied Imaging Corp. | Identification of objects of interest using multiple illumination schemes and finding overlap of features in corresponding multiple images |
| US6169816B1 (en) * | 1997-05-14 | 2001-01-02 | Applied Imaging, Inc. | Identification of objects of interest using multiple illumination schemes and finding overlap of features in corresponding multiple images |
| US6052190A (en) * | 1997-09-09 | 2000-04-18 | Utoptics, Inc. | Highly accurate three-dimensional surface digitizing system and methods |
| US6002788A (en) | 1997-09-24 | 1999-12-14 | Compucyte Corporation | Method and device for rendering cells observable with laser scanning cytometry |
| US5962234A (en) | 1997-10-20 | 1999-10-05 | Applied Imaging Corporation | Use of anti-embryonic epsilon hemoglobin antibodies to identify fetal cells |
| US6746873B1 (en) * | 1998-02-20 | 2004-06-08 | Xy, Inc. | Vibratory system for a sorting flow cytometer |
| US6699710B1 (en) * | 1998-02-25 | 2004-03-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Tumor tissue microarrays for rapid molecular profiling |
| US6248590B1 (en) * | 1998-02-27 | 2001-06-19 | Cytomation, Inc. | Method and apparatus for flow cytometry |
| US6495106B1 (en) | 1998-03-24 | 2002-12-17 | Biogenex Laboratories | Automated staining apparatus |
| US6818437B1 (en) * | 1998-05-16 | 2004-11-16 | Applera Corporation | Instrument for monitoring polymerase chain reaction of DNA |
| US6606413B1 (en) * | 1998-06-01 | 2003-08-12 | Trestle Acquisition Corp. | Compression packaged image transmission for telemicroscopy |
| US6049220A (en) | 1998-06-10 | 2000-04-11 | Boxer Cross Incorporated | Apparatus and method for evaluating a wafer of semiconductor material |
| US6670194B1 (en) | 1998-08-25 | 2003-12-30 | University Of Washington | Rapid quantitative analysis of proteins or protein function in complex mixtures |
| DE19915057A1 (de) * | 1999-04-01 | 2000-10-19 | Forschungszentrum Borstel | Monoklonale Antikörper gegen das humane Mcm3 Protein, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
| EP1177523B1 (en) | 1999-04-13 | 2013-08-21 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Histological reconstruction and automated image analysis |
| US6876760B1 (en) * | 2000-12-04 | 2005-04-05 | Cytokinetics, Inc. | Classifying cells based on information contained in cell images |
| AU5875900A (en) * | 1999-06-18 | 2001-01-09 | Genomic Solutions, Inc. | An automated, ccd-based microarray imaging system |
| US6524798B1 (en) * | 1999-06-18 | 2003-02-25 | Applied Imaging Corporation | High efficiency methods for combined immunocytochemistry and in-situ hybridization |
| US6453060B1 (en) | 1999-06-29 | 2002-09-17 | Tri Path Imaging, Inc. | Method and apparatus for deriving separate images from multiple chromogens in a branched image analysis system |
| WO2001022350A1 (en) | 1999-07-13 | 2001-03-29 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Apparatus for counting color transitions and areas in real time camera images |
| EP1198956A1 (en) * | 1999-07-13 | 2002-04-24 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Device for applying accurate color thresholds in real time |
| CA2380182A1 (en) * | 1999-08-04 | 2001-02-15 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Method and apparatus for applying color thresholds in light microscopy |
| JP2003511697A (ja) | 1999-10-12 | 2003-03-25 | コンネクス・ゲゼルシャフト・ツーア・オプティミエルング・フォン・フォルシュング・ウント・エントヴィックルング・エムベーハー | 便中の酸耐性微生物を検出するためのイムノクロマトグラフィー迅速試験 |
| US7024316B1 (en) * | 1999-10-21 | 2006-04-04 | Dakocytomation Colorado, Inc. | Transiently dynamic flow cytometer analysis system |
| US6852986B1 (en) | 1999-11-12 | 2005-02-08 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Fluorometer with low heat-generating light source |
| JP2001211896A (ja) | 1999-11-26 | 2001-08-07 | Olympus Optical Co Ltd | 画像解析方法、装置、及び記録媒体 |
| GB0001568D0 (en) * | 2000-01-24 | 2000-03-15 | Isis Innovation | Method and apparatus for measuring surface configuration |
| US6778714B1 (en) | 2000-03-10 | 2004-08-17 | Imagexpert, Inc. | Portable image analysis system |
| US6408048B2 (en) | 2000-03-14 | 2002-06-18 | Therma-Wave, Inc. | Apparatus for analyzing samples using combined thermal wave and X-ray reflectance measurements |
| US7236623B2 (en) * | 2000-04-24 | 2007-06-26 | International Remote Imaging Systems, Inc. | Analyte recognition for urinalysis diagnostic system |
| US6518554B1 (en) * | 2000-05-24 | 2003-02-11 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Reverse focusing methods and systems |
| US6522744B1 (en) * | 2000-05-31 | 2003-02-18 | Jung-Hsun Chiang | Volume control apparatus of telephone |
| IL136884A0 (en) | 2000-06-19 | 2001-06-14 | Yissum Res Dev Co | A system for cancer detection and typing and for grading of malignancy |
| KR20030028553A (ko) * | 2000-07-21 | 2003-04-08 | 더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕 | 이미지 모자이크 방법 및 장치 |
| US6816625B2 (en) | 2000-08-16 | 2004-11-09 | Lewis Jr Clarence A | Distortion free image capture system and method |
| US6674058B1 (en) * | 2000-09-20 | 2004-01-06 | Compucyte Corporation | Apparatus and method for focusing a laser scanning cytometer |
| US7262799B2 (en) * | 2000-10-25 | 2007-08-28 | Canon Kabushiki Kaisha | Image sensing apparatus and its control method, control program, and storage medium |
| US7298402B2 (en) | 2000-10-26 | 2007-11-20 | Olympus Corporation | Image-pickup apparatus with expanded dynamic range capabilities |
| US7714301B2 (en) * | 2000-10-27 | 2010-05-11 | Molecular Devices, Inc. | Instrument excitation source and calibration method |
| GB2406908B (en) | 2000-12-04 | 2005-07-27 | Cytokinetics Inc | Classifying cells based on information contained in cell images |
| US20030215936A1 (en) | 2000-12-13 | 2003-11-20 | Olli Kallioniemi | High-throughput tissue microarray technology and applications |
| US6466690C1 (en) | 2000-12-19 | 2008-11-18 | Bacus Res Lab Inc | Method and apparatus for processing an image of a tissue sample microarray |
| JP3576523B2 (ja) * | 2000-12-26 | 2004-10-13 | オリンパス株式会社 | 蛍光輝度測定方法及び装置 |
| US6993169B2 (en) * | 2001-01-11 | 2006-01-31 | Trestle Corporation | System and method for finding regions of interest for microscopic digital montage imaging |
| DE10109130B4 (de) * | 2001-02-24 | 2015-02-19 | Carl Zeiss Microscopy Gmbh | Verfahren zur Aufzeichnung und Darstellung von Fluoreszenzbildern mit hoher räumlicher Auflösung |
| AU2002254162A1 (en) | 2001-03-08 | 2002-09-24 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Apparatus and method for labeling rows and columns in an irregular array |
| US7027932B2 (en) * | 2001-03-21 | 2006-04-11 | Olympus Optical Co., Ltd. | Biochemical examination method |
| JP2002287039A (ja) | 2001-03-22 | 2002-10-03 | Olympus Optical Co Ltd | 顕微鏡用撮影装置 |
| DE10119005A1 (de) | 2001-04-18 | 2002-10-24 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren zur Proteinexpression ausgehend von stabilisierter linearer kurzer DNA in zellfreien in vitro-Transkription/Translations-Systemen mit Exonuklease-haltigen Lysaten oder in einem zellulären System enthaltend Exonukleasen |
| US7219016B2 (en) * | 2001-04-20 | 2007-05-15 | Yale University | Systems and methods for automated analysis of cells and tissues |
| US7123756B2 (en) * | 2001-04-27 | 2006-10-17 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Method and apparatus for standardized fluorescence image generation |
| DE10121064A1 (de) | 2001-04-28 | 2002-10-31 | Evotec Ag | Vorrichtung und Verfahren zur optischen Messung von chemischen und/oder biologischen Proben |
| WO2002098280A2 (en) | 2001-06-04 | 2002-12-12 | Ikonisys Inc. | Method for detecting infectious agents using computer controlled automated image analysis |
| US20040215087A1 (en) | 2001-06-05 | 2004-10-28 | Genero Mario Hugo | Compositions and methods for the detection of biomarkers associated with cardiovascular disease |
| US7133543B2 (en) | 2001-06-12 | 2006-11-07 | Applied Imaging Corporation | Automated scanning method for pathology samples |
| US7116354B2 (en) * | 2001-06-20 | 2006-10-03 | Xenogen Corporation | Absolute intensity determination for a light source in low level light imaging systems |
| JP3788279B2 (ja) * | 2001-07-09 | 2006-06-21 | 株式会社日立製作所 | パターン検査方法及び装置 |
| US7229774B2 (en) | 2001-08-02 | 2007-06-12 | Regents Of The University Of Michigan | Expression profile of prostate cancer |
| US7332290B2 (en) * | 2001-08-02 | 2008-02-19 | The Regents Of The University Of Michigan | Dectection of AMACR cancer markers in urine |
| US6648506B2 (en) | 2001-09-07 | 2003-11-18 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Fluorescence emission ratio imaging thermography for use in heat transfer analysis |
| US6697509B2 (en) * | 2001-10-04 | 2004-02-24 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Method and apparatus for scoring the uptake of markers in cells |
| US7383134B2 (en) * | 2002-01-15 | 2008-06-03 | Piper James R | Method and/or system for analyzing biological samples using a computer system |
| US6780377B2 (en) * | 2002-01-22 | 2004-08-24 | Dakocytomation Denmark A/S | Environmental containment system for a flow cytometer |
| US7205154B2 (en) | 2002-01-31 | 2007-04-17 | Agilent Technologies, Inc. | Calibrating array scanners |
| JP2003284713A (ja) | 2002-03-28 | 2003-10-07 | Konica Corp | 医用画像処理装置、画像処理パラメータの補正方法、プログラム、記憶媒体 |
| JP2003294734A (ja) | 2002-03-29 | 2003-10-15 | Mitsubishi Chemicals Corp | 分子間の相互作用の分析方法 |
| US7376256B2 (en) * | 2002-04-16 | 2008-05-20 | Evotec Oai Ag | Method for analyzing chemical and or biological samples by means of particle images |
| EP1502098B1 (en) | 2002-05-03 | 2008-09-17 | ViaLogy, LLC | Method for characterizing microarray output data |
| US20040027618A1 (en) * | 2002-06-03 | 2004-02-12 | Fuji Photo Film Co., Ltd. | Image defect detecting method |
| US7272252B2 (en) | 2002-06-12 | 2007-09-18 | Clarient, Inc. | Automated system for combining bright field and fluorescent microscopy |
| US20050037406A1 (en) * | 2002-06-12 | 2005-02-17 | De La Torre-Bueno Jose | Methods and apparatus for analysis of a biological specimen |
| AU2003245499A1 (en) | 2002-06-14 | 2003-12-31 | Chromavision Medical Systems, Inc. | Automated slide staining apparatus |
| US20060127946A1 (en) * | 2002-08-16 | 2006-06-15 | Montagu Jean I | Reading of fluorescent arrays |
| US7173663B2 (en) * | 2002-10-31 | 2007-02-06 | Freescale Semiconductor, Inc. | Automatic exposure control system for a digital camera |
| JP2004157018A (ja) * | 2002-11-06 | 2004-06-03 | Dkk Toa Corp | 蛍光検出装置の感度校正方法及び蛍光検出装置 |
| GB2395263A (en) | 2002-11-12 | 2004-05-19 | Qinetiq Ltd | Image analysis |
| GB2396406A (en) | 2002-12-17 | 2004-06-23 | Qinetiq Ltd | Image analysis |
| JP4389445B2 (ja) * | 2003-01-10 | 2009-12-24 | 株式会社ニコン | レーザ顕微鏡 |
| US7062079B2 (en) | 2003-02-14 | 2006-06-13 | Ikonisys, Inc. | Method and system for image segmentation |
| US7233340B2 (en) * | 2003-02-27 | 2007-06-19 | Applied Imaging Corp. | Linking of images to enable simultaneous viewing of multiple objects |
| US7064829B2 (en) * | 2003-03-20 | 2006-06-20 | Timbre Technologies, Inc. | Generic interface for an optical metrology system |
| US7369696B2 (en) * | 2003-04-02 | 2008-05-06 | Ge Healthcare Uk Limited | Classification of cells into subpopulations using cell classifying data |
| US7171054B2 (en) * | 2003-05-01 | 2007-01-30 | Eastman Kodak Company | Scene-based method for determining focus |
| US7084386B2 (en) * | 2003-05-02 | 2006-08-01 | International Business Machines Corporation | System and method for light source calibration |
| JP2004354346A (ja) | 2003-05-30 | 2004-12-16 | Olympus Corp | 測定装置 |
| FI116246B (fi) * | 2003-06-30 | 2005-10-14 | Nokia Corp | Menetelmä ja järjestelmä digitaalisessa kuvannuksessa valotuksen säätämiseksi ja vastaava laite |
| JP4504644B2 (ja) | 2003-08-26 | 2010-07-14 | オリンパス株式会社 | 顕微鏡像撮像装置及び顕微鏡像撮像方法 |
| US8068988B2 (en) * | 2003-09-08 | 2011-11-29 | Ventana Medical Systems, Inc. | Method for automated processing of digital images of tissue micro-arrays (TMA) |
| US20050136509A1 (en) * | 2003-09-10 | 2005-06-23 | Bioimagene, Inc. | Method and system for quantitatively analyzing biological samples |
| US20050136549A1 (en) | 2003-10-30 | 2005-06-23 | Bioimagene, Inc. | Method and system for automatically determining diagnostic saliency of digital images |
| US7316907B2 (en) * | 2003-09-10 | 2008-01-08 | Board Of Regents, The University Of Texas System | 14-3-3 zeta over-expression as a poor prognosis factor, and a therapeutic target in multiple cancer types |
| US7760927B2 (en) * | 2003-09-10 | 2010-07-20 | Bioimagene, Inc. | Method and system for digital image based tissue independent simultaneous nucleus cytoplasm and membrane quantitation |
| DE10343375A1 (de) | 2003-09-17 | 2005-04-28 | Axaron Bioscience Ag | Verfahren zur Detektion und Analyse von Protein-Protein-Interaktionen |
| US20050106712A1 (en) | 2003-11-14 | 2005-05-19 | Eastman Kodak Company | Yellow low fluorescence dye for coated optical bead random array DNA analysis |
| US20050282179A1 (en) | 2003-12-05 | 2005-12-22 | Applera Corporation | Biomarkers for interferon-alpha response in hepatitis C virus infected patients |
| JP2005181244A (ja) * | 2003-12-24 | 2005-07-07 | Yokogawa Electric Corp | 光量分布補正方法およびバイオチップ読取装置 |
| JP4338551B2 (ja) * | 2004-03-04 | 2009-10-07 | 富士フイルム株式会社 | 画像再生方法、画像再生装置及び画像再生プログラム |
| WO2005096225A1 (en) | 2004-03-27 | 2005-10-13 | Bioimagene, Inc. | Method and system for automated detection of immunohistochemical (ihc) patterns |
| US7330250B2 (en) * | 2004-05-18 | 2008-02-12 | Agilent Technologies, Inc. | Nondestructive evaluation of subsurface damage in optical elements |
| WO2005114578A1 (en) | 2004-05-21 | 2005-12-01 | Bioimagene, Inc. | Method and system for automated quantitation of tissue micro-array (tma) digital image analysis |
| WO2006017811A2 (en) | 2004-08-06 | 2006-02-16 | Compucyte Corporation | Multiple-color monochromatic light absorption and quantification of light absorption in a stained sample |
| US20060063190A1 (en) | 2004-09-22 | 2006-03-23 | Tripath Imaging, Inc | Methods and compositions for evaluating breast cancer prognosis |
| WO2006054991A1 (en) | 2004-11-17 | 2006-05-26 | Immunivest Corporation | Magnetic enrichment of circulating cells, fragments and debris for enabling hts proteomics and genomics in disease detection |
| US20060160169A1 (en) * | 2004-12-03 | 2006-07-20 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Cell microarray for profiling of cellular phenotypes and gene function |
| JP2006194711A (ja) | 2005-01-13 | 2006-07-27 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 蛍光発光色素の性能評価方法および性能評価装置 |
| WO2006083969A2 (en) | 2005-02-01 | 2006-08-10 | Amnis Corporation | Blood analysis using a flow imaging cytometer |
| GB0503087D0 (en) | 2005-02-15 | 2005-03-23 | Medical Solutions Plc | Apparatus and method for processing of specimen images for use in computer analysis thereof |
| JP4315119B2 (ja) | 2005-03-29 | 2009-08-19 | セイコーエプソン株式会社 | 液滴吐出装置、パターン形成方法、及び電気光学装置の製造方法 |
| EP2386854A1 (en) | 2005-04-19 | 2011-11-16 | Prediction Sciences LLC | Diagnostic markers of breast cancer treatment and progression and methods of use thereof |
| BRPI0501535B8 (pt) | 2005-04-26 | 2021-07-27 | Mario Augusto Pazoti | método de identificação do guignardia citricarpa |
| AU2006254923A1 (en) | 2005-06-08 | 2006-12-14 | Vanderbilt University | Analysis of tissue samples surrounding malignancies |
| WO2006133460A2 (en) * | 2005-06-09 | 2006-12-14 | Yale University | Methods for diagnosing and treating breast cancer based on a her/er ratio |
| US7557963B2 (en) * | 2005-08-12 | 2009-07-07 | Seiko Epson Corporation | Label aided copy enhancement |
| GB2430026A (en) | 2005-09-09 | 2007-03-14 | Qinetiq Ltd | Automated selection of image regions |
| EP1934607B1 (en) * | 2005-10-13 | 2013-08-28 | Fundação D. Anna Sommer Champalimaud E Dr. Carlos Montez Champalimaud | Multiplex in situ immunohistochemical analysis |
| JP4863692B2 (ja) * | 2005-11-02 | 2012-01-25 | 株式会社島津製作所 | イメージ質量分析装置 |
| US8017927B2 (en) * | 2005-12-16 | 2011-09-13 | Honeywell International Inc. | Apparatus, system, and method for print quality measurements using multiple adjustable sensors |
| US7199360B1 (en) * | 2006-01-13 | 2007-04-03 | Jean Montagu | System and method for calibrating a fluorescence microscope |
| ATE483972T1 (de) | 2006-02-16 | 2010-10-15 | Ventana Med Syst Inc | Reagenzien und verfahren für krebsprognose und pathologische einstufung |
| CA2644594A1 (en) * | 2006-03-01 | 2007-09-07 | The Regents Of The University Of Michigan | Diagnosis and treatment of prostate cancer |
| JP4748719B2 (ja) | 2006-03-02 | 2011-08-17 | 国立大学法人大阪大学 | 生細胞内の特定タンパク質の定量方法および標準蛍光マイクロビーズの作製方法 |
| JP2007271484A (ja) | 2006-03-31 | 2007-10-18 | Toyobo Co Ltd | 細胞成分分析装置の感度を向上する方法 |
| JP4864519B2 (ja) | 2006-04-11 | 2012-02-01 | 浜松ホトニクス株式会社 | 光測定装置、光測定方法、及び光測定プログラム |
| WO2008008500A2 (en) * | 2006-07-13 | 2008-01-17 | Yale University | Methods for making cancer prognoses based on the subcellular localization of biomarkers |
| CN101674820B (zh) * | 2006-12-26 | 2013-09-25 | 药品循环公司 | 在联合治疗中应用组蛋白脱乙酰酶抑制剂并监测生物标志物的方法 |
| DK2156370T3 (da) | 2007-05-14 | 2012-01-23 | Historx Inc | Kompartmentadskillelse ved pixelkarakterisering under anvendelse af billeddata-clustering |
| ES2599902T3 (es) | 2007-06-15 | 2017-02-06 | Novartis Ag | Sistema y método de microscopio para obtener datos de muestra normalizados |
| US7873215B2 (en) * | 2007-06-27 | 2011-01-18 | Seiko Epson Corporation | Precise identification of text pixels from scanned document images |
| CA2604317C (en) | 2007-08-06 | 2017-02-28 | Historx, Inc. | Methods and system for validating sample images for quantitative immunoassays |
| CA2596204C (en) | 2007-08-07 | 2019-02-26 | Historx, Inc. | Method and system for determining an optimal dilution of a reagent |
| WO2009020621A1 (en) | 2007-08-07 | 2009-02-12 | Historx, Inc. | Method and system for determining an optimal dilution of a reagent |
| WO2009029810A1 (en) | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Historx, Inc. | Automatic exposure time selection for imaging tissue |
| TWI335252B (en) * | 2007-11-30 | 2011-01-01 | Ind Tech Res Inst | Calibration strip and the laser calibration system using thereof |
| AU2009293380B2 (en) | 2008-09-16 | 2016-05-19 | Novartis Ag | Reproducible quantification of biomarker expression |
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