ES2589455T3

ES2589455T3 - Método para predecir el riesgo de hipertensión asociado a la terapia antiangiogénesis

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Publication number: ES2589455T3
Application number: ES12750601.2T
Authority: ES
Inventors: Sanne Lysbet De Haas; Paul Delmar; Diether Lambrechts; Stefan Scherer
Original assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Life Sciences Research Partners vzw; F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: Vlaams Instituut voor Biotechnologie VIB; Life Sciences Research Partners vzw; F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2012-08-28
Publication date: 2016-11-14
Anticipated expiration: 2032-08-28
Also published as: NZ620343A; AU2012300986A1; SG2014008585A; JP2014526901A; RU2014110270A; BR112014004763A2; US20140294811A1; KR20140064924A; WO2013030168A1; CA2845386A1; EP3085793A1; EP2751280B1; AR087714A1; IL230783A0; MX2014002307A; ZA201400950B; EP2751280A1; CN103946395A

Abstract

Método para determinar la susceptibilidad de un paciente al desarrollo de hipertensión asociada a una terapia que comprende un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo de VEGF que el bevacizumab, comprendiendo dicho método: (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que sufre de cáncer el genotipo en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4), e (b) identificar un paciente como más o menos susceptible al desarrollo de hipertensión asociada a una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o con un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo de VEGF que el bevacizumab, basándose en dicho genotipo, en el que la presencia del genotipo AA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4) indica que dicho paciente es más susceptible a desarrollar hipertensión que un paciente que presenta un genotipo de GG o AA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4) o en el que la presencia de genotipo GG o AA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4) indica que dicho paciente es menos susceptible a desarrollar hipertensión que un paciente que presenta un genotipo de GA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4).

Description

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método in vitro que comprende:

1.: (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que sufre de cáncer el genotipo en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4), e

2.: (b) identificar un paciente como más o menos susceptible al desarrollo de hipertensión asociada a una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o con un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo de VEGF que el bevacizumab, basándose en dicho genotipo, en el que la presencia del genotipo AA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4) indica que dicho paciente es más susceptible a desarrollar hipertensión que un paciente que presenta un genotipo de GG o AA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4) o en el que la presencia de genotipo GG o AA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4) indica que dicho paciente es menos susceptible a desarrollar hipertensión que un paciente que presenta un genotipo de GA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4). En una realización, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer colorrectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer mamario, cáncer pancreático, cáncer gástrico y cáncer pulmonar, más específicamente cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer mamario, cáncer pancreático y cáncer pulmonar, todavía más específicamente cáncer colorrectal, cáncer renal y cáncer mamario.

En la presente memoria se describe además un método para reducir el riesgo de desarrollar hipertensión asociada a una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo de VEGF que el bevacizumab, comprendiendo dicho método:

1.: (a) determinar en una muestra derivada de un paciente que sufre de cáncer el genotipo en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4),

2.: (b) identificar un paciente como menos susceptible a desarrollar hipertensión asociada a una terapia con un inhibidor de la angiogénesis que comprende bevacizumab o un anticuerpo que se une esencialmente al mismo epítopo de VEGF que el bevacizumab, en el que la presente del genotipo GG o AA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4) indica que dicho paciente es menos susceptible al desarrollo de hipertensión que un paciente que presenta un genotipo de GA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4), y

3.: (c) administrar dicho inhibidor de la angiogénesis en un paciente con el genotipo GG o AA en el polimorfismo rs4444903 (SEC ID nº 4) identificado como menos susceptible al desarrollo de hipertensión según (b). En una realización, el cáncer se selecciona de entre el grupo que consiste de cáncer colorrectal, glioblastoma, cáncer renal, cáncer ovárico, cáncer mamario, cáncer pancreático, cáncer gástrico y cáncer pulmonar, más específicamente cáncer colorrectal, cáncer renal, cáncer mamario, cáncer pancreático y cáncer pulmonar, todavía más específicamente cáncer colorrectal, cáncer renal y cáncer pulmonar.

En una realización, el inhibidor de la angiogénesis se administra como cotratamiento con un agente quimioterapéutico

o régimen de quimioterapia. En una realización adicional, el inhibidor de la angiogénesis se administra con uno o más agentes seleccionados de entre el grupo que consiste de taxanos, tales como docetaxel y paclitaxel, interferón-α, 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecán, gemcitabina-erlotinib y agentes quimioterapéuticos basados en el platino, tales como carboplatino, cisplatino y oxaliplatino. Además, el inhibidor de la angiogénesis puede administrarse como cotratamiento con radioterapia.

En el contexto de la presente invención, la muestra es una muestra biológica y puede ser una muestra de sangre y/o de tejido. En una realización, la muestra es una muestra de sangre, más específicamente una muestra de sangre periférica. En el contexto de la presente invención, la muestra es una muestra de ADN. La muestra de ADN puede ser de ADN de la línea germinal o ADN somático, más específicamente ADN de la línea germinal.

En una realización, el genotipo se determina mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Además de la descripción detallada de la detección de SNP, posteriormente, la referencia siguiente proporciona recomendaciones para el genotipado de SNP basado en la espectrometría de masas MALDI-TOF, por ejemplo Storm et al., Methods Mol. Biol. 212:241-62, 2003.

3. Detección de polimorfismos de ácidos nucleicos

Las técnicas de detección para evaluar ácidos nucleicos para la presencia de un SNP implican procedimientos bien conocidos en el campo de la genética molecular. Muchos, aunque no todos, los métodos implican la amplificación de ácidos nucleicos. Se proporcionan en la técnica recomendaciones extensas sobre la realización de la amplificación. Entre las referencias ejemplares se incluyen manuales tales como PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (editor H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (editores Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999, incluyendo los suplementos de actualización hasta abril de 2004; Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a edición, 2001). Se dan a conocer métodos generales para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido en Single Nucleotide Polymorphisms: Methods and Protocols, Pui-Yan Kwok, editor, 2003, Humana Press.

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Aunque los métodos típicamente utilizan etapas de PCR, también pueden utilizarse otros protocolos de amplificación. Entre los métodos de amplificación adecuados se incluyen la reacción en cadena de la ligasa (ver, por ejemplo, Wu y Wallace, Genomics 4:560-569, 1988); el ensayo de desplazamiento de cadena (ver, por ejemplo, Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392-396, 1992; patente US nº 5.455.166), y varios sistemas de amplificación basados en la transcripción, incluyendo los métodos descritos en las patentes US nº 5.437.990, nº 5.409.818 y nº 5.399.491; el sistema de amplificación basado en la transcripción (TAS) (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177, 1989); y la replicación de secuencias autosostenida (3SR) (Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878, 1990; documento nº WO 92/08800). Alternativamente pueden utilizarse métodos que amplifican la sonda hasta niveles detectables, tales como la amplificación de Qβ-replicasa (Kramer y Lizardi, Nature 339:401-402, 1989; Lomeli et al., Clin. Chem. 35:1826-1831, 1989). Se proporciona una revisión de los métodos de amplificación conocidos en, por ejemplo, Abramson y Myers, Current Opinion in Biotechnology 4:41-47, 1993.

La detección del genotipo, haplotipo, SNP, microsatélites u otros polimorfismos de un individuo puede llevarse a cabo utilizando cebadores y/o sondas oligonucleótidas. Pueden prepararse oligonucleótidos mediante cualquier método adecuado, habitualmente mediante síntesis química. Pueden sintetizarse oligonucleótidos utilizando reactivos e instrumentos comercialmente disponibles. Alternativamente, pueden obtenerse de fuentes comerciales. Los métodos de síntesis de oligonucleótidos son bien conocidos de la técnica (ver, por ejemplo, Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981, y el método en soporte sólido de la patente US nº 4.458.066). Además, pueden utilizarse modificaciones de los métodos de síntesis anteriormente indicados para impactar deseablemente el comportamiento del enzima con respecto a los oligonucleótidos sintetizados. Por ejemplo, puede utilizarse la incorporación de enlaces fosfodiéster modificados (por ejemplo fosforotioato, metilfosfonatos, fosfoamidato o boranofosfato) o enlaces que no son de un derivado de ácido fosforoso, en un oligonucleótido, con el fin de evitar el corte en un sitio seleccionado. Además, la utilización de los azúcares 2'-amino modificados tiende a favorecer el desplazamiento respecto a la digestión del oligonucleótido al hibridarlo con un ácido nucleico que también es el molde para la síntesis de una cadena nueva de ácidos nucleicos.

El genotipo de un individuo puede determinarse utilizando muchos métodos de detección que son bien conocidos de la técnica. La mayoría de ensayos implica uno de entre varios protocolos generales: hibridación utilizando oligonucleótidos específicos de alelos, extensión de cebador, ligación específica de un alelo, secuenciación o técnicas de separación electroforética, por ejemplo el análisis de polimorfismos conformacionales de cadena sencilla (SSCP) y de heterodúplex. Entre los ensayos ejemplares se incluyen los ensayos de 5'-nucleasa, la incorporación de pigmento terminador dirigida por un molde, los ensayos de oligonucleótidos específicos de alelos de baliza molecular, ensayos de extensión de una sola base y la puntuación de los SNP por secuenciación en tiempo real con pirofosfatos. El análisis de las secuencias amplificadas puede llevarse a cabo utilizando diversas tecnologías, tales como los microchips, los ensayos de polarización de fluorescencia y la espectrometría de masas MALDI-TOF (de tiempo de vuelo con desorción/ionización mediante láser asistida por matriz). Dos métodos que también pueden utilizarse son los ensayos basados en el corte invasivo con nucleasas Flap y metodologías que utilizan sondas-candado.

La determinación de la presencia o ausencia de un alelo particular generalmente se lleva a cabo mediante análisis de una muestra de ácidos nucleicos que se obtiene del individuo que debe analizarse. Con frecuencia, la muestra de ácidos nucleicos comprende ADN genómico. El ADN genómico típicamente se obtiene de muestras de sangre, pero también puede obtenerse de otras células o tejidos.

También resulta posible analizar muestras de ARN para la presencia de alelos polimórficos. Por ejemplo, puede utilizarse ARNm para determinar el genotipo de un individuo en uno o más sitios polimórficos. En este caso, la muestra de ácidos nucleicos se obtiene de células en las que se expresa el ácido nucleico diana, por ejemplo adipocitos. Dicho análisis puede llevarse a cabo mediante en primer lugar la transcripción inversa del ARN diana utilizando, por ejemplo, una transcriptasa inversa vírica y después amplificando el ADNc resultante, o utilizando una reacción combinada a alta temperatura de transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), tal como se describe en las patentes US nº 5.310.652, nº 5.322.770, nº 5.561.058, nº 5.641.865 y nº 5.693.517.

Se describen brevemente las metodologías utilizadas frecuentemente para el análisis de muestras de ácidos nucleicos para detectar los SNP. Sin embargo, puede utilizarse en la invención cualquier método conocido de la técnica para detectar la presencia de sustituciones de nucleótidos individuales.

a. Hibridación específica de alelos

Esta técnica, también denominada comúnmente hibridación de oligonucleótidos específica de alelos (ASO) (por ejemplo Stoneking et al., Am. J. Hum. Genet. 48:70-382, 1991; Saiki et al., Nature 324:163-166, 1986; patente EP nº

235.726 y documento nº WO 89/11548), se basa en distinguir entre dos moléculas de ADN que difieren en una base mediante la hibridación de una sonda oligonucleótida que es específica para una de las variantes con un producto amplificado obtenido a partir de la amplificación de la muestra de ácidos nucleicos. Este método típicamente utiliza oligonucleótidos cortos, por ejemplo de 15 a 20 bases de longitud. Las sondas se diseñan para hibridarse diferencialmente con una variante u otra. Los principios y recomendaciones para el diseño de dicha sonda se

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encuentran disponibles en la técnica, por ejemplo en las referencias citadas en la presente memoria. Las condiciones de hibridación deberían ser suficientemente restrictivas para que se produzca una diferencia significativa de la intensidad de hibridación en diferentes alelos, y producir una respuesta esencialmente binaria, en la que una sonda se hibrida únicamente a uno de los alelos. Algunas sondas se diseñan para hibridarse con un segmento de ADN diana de manera que el sitio polimórfico se alinee con una posición central (por ejemplo en un oligonucleótido de 15 bases en la posición 7; en un oligonucleótido de 16 bases en la posición 8 ó 9) de la sonda, aunque este diseño no resulta necesario.

La cantidad y/o presencia de un alelo se determina mediante la medición de la cantidad de oligonucleótido específico de alelos que se hibrida con la muestra. Típicamente, el oligonucleótido se marca con un marcaje, tal como un marcaje fluorescente. Por ejemplo, se aplica un oligonucleótido específico de alelos en los oligonucleótidos inmovilizados que representan las secuencias de SNP. Tras una hibridación restrictiva y condiciones de lavado, se mide la intensidad de la fluorescencia para cada oligonucleótido SNP.

En una realización, el nucleótido presente en el sitio polimórfico se identifica mediante hibridación bajo condiciones de hibridación específicas de una secuencia, con una sonda oligonucleótida o cebador exactamente complementario a uno de los alelos polimórficos en una región que comprende el sitio polimórfico. La secuencia hibridante de la sonda o cebador y las condiciones de hibridación específicas de una secuencia se seleccionan de manera que un único desapareamiento en el sitio polimórfico desestabiliza el dúplex de hibridación de manera suficiente para que efectivamente no se forme. De esta manera, bajo condiciones de hibridación específicas de una secuencia, se formarán dúplex estables únicamente entre la sonda o cebador y la secuencia alélica exactamente complementaria. De esta manera, los oligonucleótidos de una longitud de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 35 nucleótidos, habitualmente de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos, que son exactamente complementarios a una secuencia alélica en una región que comprende el sitio polimórfico se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención.

En una realización alternativa, el nucleótido presente en el sitio polimórfico se identifica mediante hibridación bajo condiciones de hibridación suficientemente restrictivas con un oligonucleótido sustancialmente complementario a uno de los alelos de SNP en una región que comprende el sitio polimórfico, y exactamente complementario al alelo en el sitio polimórfico. Debido a que los desapareamientos que se producen en sitios no polimórficos son desapareamientos con ambas secuencias alélicas, la diferencia en el número de desapareamientos en un dúplex formado con la secuencia alélica diana y en un dúplex formado con la secuencia alélica no diana correspondiente es igual al existente al utilizar un oligonucleótido exactamente complementario a la secuencia alélica diana. En la presente realización, las condiciones de hibridación se relajan suficientemente para permitir la formación de dúplex estables con la secuencia diana, manteniendo simultáneamente suficiente astringencia para evitar la formación de dúplex estables con las secuencias no diana. Bajo condiciones de hibridación suficientemente restrictivas, sólo se formarán dúplex estables entre la sonda o cebador y el alelo diana. De esta manera, los oligonucleótidos de una longitud de entre aproximadamente 10 y aproximadamente 35 nucleótidos, habitualmente de entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos, que sean exactamente complementarios a una secuencia alélica en una región que comprende el sitio polimórfico y que sean exactamente complementarios a la secuencia alélica en el sitio polimórfico, se encuentran comprendidos dentro del alcance de la invención.

La utilización de oligonucleótidos sustancialmente, no exactamente, complementarios puede resultar deseable en formatos de ensayos en los que la optimización de las condiciones de hibridación es limitada. Por ejemplo, en un formato de ensayo multidiana de oligonucleótido inmovilizado típico, se inmovilizan sondas o cebadores para cada diana en un único soporte sólido. Las hibridaciones se llevan a cabo simultáneamente poniendo en contacto el soporte sólido con una solución que contiene el ADN diana. Debido a que todas las hibridaciones se llevan a cabo bajo condiciones idénticas, las condiciones de hibridación no pueden optimizarse separadamente para cada sonda o cebador. La incorporación de desapareamientos en una sonda o cebador puede utilizarse para ajustar la estabilidad del dúplex en el caso de que el formato de ensayo impida ajustar las condiciones de hibridación. El efecto de un desapareamiento introducido particular sobre la estabilidad de un dúplex es bien conocido, y la estabilidad del dúplex puede tanto estimarse como determinarse empíricamente de modo rutinario, tal como se ha indicado anteriormente. Las condiciones de hibridación adecuadas, que dependen del tamaño y secuencia exactos de la sonda o cebador, pueden seleccionarse empíricamente siguiendo las recomendaciones proporcionadas en la presente memoria y bien conocidas de la técnica. La utilización de sondas o cebadores oligonucleótidos para detectar diferencias de un solo par de bases en la secuencia se describe en, por ejemplo, Conner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:278-282, 1983, y en las patentes US nº 5.468.613 y nº 5.604.099.

El cambio proporcional de estabilidad entre un dúplex de hibridación perfectamente apareado y con un desapareamiento de una sola base depende de la longitud de los oligonucleótidos hibridados. Los dúplex formados con secuencias de sonda más cortas se desestabilizan proporcionalmente más con la presencia de un desapareamiento. Los oligonucleótidos de longitud comprendida entre aproximadamente 15 y aproximadamente 35 nucleótidos con frecuencia se utilizan para la detección específica de secuencia. Además, debido a que los extremos de un oligonucleótido hibridado experimentan una disociación y reapareamiento aleatorios continuamente debido a la energía térmica, un desapareamiento en cualquiera de los extremos desestabiliza el dúplex de hibridación menos que

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d. Secuenciación de ADN y extensiones de bases individuales

Los SNP también pueden detectarse mediante secuenciación directa. Entre los métodos se incluyen, por ejemplo, los métodos basados en la secuenciación dideoxi y otros métodos, tales como la secuenciación de Maxam y Gilbert (ver, por ejemplo, Sambrook y Russell, supra).

Entre otros métodos de detección se incluyen PyrosequencingTM de productos de longitud oligonucleótida. Dichos métodos con frecuencia utilizan técnicas de amplificación, tales como la PCR. Por ejemplo, en la pirosecuenciación, se hibrida un cebador de secuenciación con un molde de ADN de cadena sencilla amplificación por PCR, y se incuba con los enzimas ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa, y los sustratos adenosín-5'-fosfosulfato (APS) y luciferina. Se añade a la reacción el primero de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTP). La ADN polimerasa cataliza la incorporación de los desoxinucleótidos trifosfato en la cadena de ADN en el caso de que sea complementario a la base en la cadena de molde. Cada suceso de incorporación se ve acompañado de la liberación de pirofosfato (PPI) en una cantidad equimolar a la cantidad de nucleótido incorporado. La ATP sulfurilasa convierte cuantitativamente PPi en ATP en presencia de adenosín-5'-fosfosulfato. Este ATP controla la conversión mediada por luciferasa de la luciferina en oxiluciferina, que genera luz visible en cantidades que son proporcionales a la cantidad de ATP. La luz producida en la reacción catalizada por luciferasa se detecta mediante una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) y se observa como un pico en un PyrogramTM. Cada señal de luz es proporcional al número de nucleótidos incorporados. La apirasa, un enzima degradador de nucleótidos, degrada continuamente los dNTP no incorporados y el exceso de ATP. Al completarse la degradación, se añade otro dNTP.

Otro método similar para caracterizar las SNP no requiere la utilización de una PCR completa, sino que típicamente utiliza únicamente la extensión de un cebador por una única molécula de ácido dideoxirribonucleico (ddNTP) marcada con fluorescencia, que es complementaria al nucleótido que se investiga. El nucleótido en el sitio polimórfico puede identificarse mediante la detección de un cebador que ha sido extendido en una base y que se encuentra marcado fluorescentemente (por ejemplo Kobayashi et al., Mol. Cell. Probes 9:175-182, 1995).

e. Electroforesis

Los productos de amplificación generados utilizando la reacción en cadena de la polimerasa pueden analizarse mediante la utilización de una electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante. Los diferentes alelos pueden identificarse basándose en las propiedades de fusión dependientes de las diferentes secuencias y en la migración electroforética del ADN en solución (ver, por ejemplo, Erlich, editor, PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, W.H. Freeman and Co., New York, 1992, capítulo 7).

La distinción entre los polimorfismos de los microsatélites puede llevarse a cabo utilizando una electroforesis capilar. La electroforesis capilar permite convenientemente la identificación del número de repeticiones en un alelo particular de un microsatélite. La aplicación de la electroforesis capilar al análisis de los polimorfismos de ADN es bien conocida por el experto en la materia (ver, por ejemplo, Szantai, et al., J Chromatogr A. 1079(1-2):41-9, 2005; Bjorheim y Ekstrom, Electrophoresis 26(13):2520-30, 2005, y Mitchelson, Mol. Biotechnol. 24(1):41-68, 2003).

f. Análisis de polimorfismos a partir de la conformación de cadenas sencillas

Los alelos de las secuencias diana pueden diferenciarse utilizando el análisis de polimorfismos a partir de la conformación de cadenas sencillas, que identifica diferencias de bases a partir de la alteración de la migración electroforética de productos de PCR de cadena sencilla, tal como se describe en, por ejemplo, Orita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86:2766-2770, 1989. Pueden generarse productos amplificados por PCR tal como se ha indicado anteriormente, y calentarse o de otro desnaturalizarse, para formar productos de amplificación de cadena sencilla. Los ácidos nucleicos de cadena sencilla pueden plegarse nuevamente o formar estructuras secundarias que son parcialmente dependientes de la secuencia de bases. Las diferentes movilidades electroforéticas de los productos de amplificación de cadena sencilla puede relacionarse con las diferencias en las secuencias de bases entre los alelos de la diana.

Los métodos de detección de SNP con frecuencia utilizan oligonucleótidos marcados. Los oligonucleótidos pueden marcarse mediante la incorporación de un marcaje detectable, por medios espectroscóicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Entre los marcajes útiles se incluyen los pigmentos fluorescentes, los marcajes radioactivos, por ejemplo 32P, los reactivos electrodensos, enzimas, tales como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina, la biotina, o haptenos y proteínas para los que se dispone de antisueros o anticuerpos monoclonales. Las técnicas de marcaje son bien conocidas de la técnica (ver, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, supra; Sambrook y Russell, supra).

4. Métodos de tratamiento

La dosis de bevacizumab (Avastin®) para los tratamientos de cánceres específicos según EMEA, son las siguientes.

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Para el carcinoma metastásico de colon o recto (CRCm) las dosis recomendadas son de 5 mg/kg ó 10 mg/kg de peso corporal administrados una vez cada 2 semanas, ó 7,5 mg/kg ó 15 mg/kg de peso corporal administrados una vez cada 3 semanas; para el cáncer mamario metastásico (BCm) las dosis recomendadas son de 10 mg/kg de peso corporal administrados una vez cada 2 semanas ó 15 mg/kg de peso corporal administrados una vez cada 3 semanas en forma de una infusión intravenosa, y para el cáncer pulmonar de células no pequeñas (NSCLC) las dosis recomendadas son de 7,5 mg/kg ó 15 mg/kg de peso corporal administrados una vez cada 3 semanas en forma de una infusión intravenosa. El beneficio clínico en los pacientes de NSCLC se ha demostrado con dosis de tanto 7,5 mg/kg como 15 mg/kg. Para más detalles ver la sección 5.1 Pharmacodynamic Properties, Non-small cell lung cancer (NSCLC). Para el cáncer de células renales avanzado y/o metastásico (RCCm), la dosis preferentes son de 10 mg/kg de peso corporal administrados una vez cada 2 semanas en forma de una infusión intravenosa (además de la quimioterapia basada en el platino durante hasta 6 ciclos de tratamiento, seguido de bevacizumab (Avastin®) como agente único hasta la progresión de la enfermedad). Para el glioblastoma una dosis particular fue de 10 mg/kg cada 2 semanas.

En contexto de la presente invención, el inhibidor de la angiogénesis puede administrarse adicionalmente o como coterapia o cotratamiento con uno o más agentes quimioterapéuticos administrados como parte del régimen de quimioterapia estándar conocido de la técnica. Entre los ejemplos de agentes incluidos en dichos regímenes de quimioterapia estándares se incluyen 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecán, gemcitabina, erlotinib, capecitabina, taxanos, tales como el docetaxel y el paclitaxel, interferón-α, vinorelbina y agentes quimioterapéuticos basados en el platino, tales como paclitaxel, carboplatino, cisplatino y oxaliplatino. Entre los ejemplos de cotratamientos para el cáncer pancreático metastásico se incluyen gemcitabina-erlotinib más bevacizumab a una dosis de 5 ó 10 mg/kg de peso corporal administrados una vez cada dos semanas ó 7,5 mg/kg ó 15 mg/kg de peso corporal administrados una vez cada tres semanas. Entre los ejemplos de cotratamientos para el cáncer de células renales se incluyen el interferón-α más bevacizumab a una dosis de 10 mg/kg de peso corporal una vez cada dos semanas. Además, un paciente puede cotratarse con una combinación de irinotecán, 5-fluorouracilo, leucovorina, también denominada IFL, tal como, por ejemplo, un bolo de IFL, con una combinación de oxaliplatino, leucovorina y 5-fluorouracilo, también denominado régimen de FOLFOX4, o con una combinación de capecitabina y oxaliplatino, también denominada XELOX. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en una realización adicional de la invención, el paciente que sufre de una enfermedad maligna o de una enfermedad que implica la angiogénesis fisiológica y patológica se trata con uno

o más agentes quimioterapéuticos, tales como 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecán, gemcitabina-erlotinib, capecitabina y/o agentes quimioterapéuticos basados en el platino, tales como paclitaxel, carboplatino y oxaliplatino. Entre los ejemplos de coterapia o cotratamiento se incluyen 5 mg/kg de bevacizumab (Avastin®) cada dos semanas con un bolo de IFL ó 10 mg/kg de bevacizumab (Avastin®) cada 2 semanas con FOLFOX4 para el cáncer colorrectal metastásico, 15 mg/kg de bevacizumab (Avastin®) cada 3 semanas con carboplatino/paclitaxel para el cáncer pulmonar de células no pequeñas no escamosas y 10 mg/kg de bevacizumab (Avastin®) cada 2 semanas con paclitaxel para el cáncer mamario metastásico. Además, el inhibidor de angiogénesis que debe administrarse puede administrarse como coterapia o como cotratamiento con radioterapia.

5. Kit

La presente exposición se refiere además a una composición diagnóstica o kit que comprende cualesquiera de los oligonucleótidos indicados y opcionalmente medios adecuados de detección.

El kit de la invención ventajosamente puede utilizarse para llevar a cabo un método de la invención y podría utilizarse, inter alia, en una diversidad de aplicaciones, por ejemplo en el campo diagnóstico o como una herramienta de investigación. Las partes del kit de la exposición pueden empaquetarse individualmente en viales o en combinación en recipientes o unidades multirrecipiente. La fabricación del kit sigue preferentemente procedimientos estándares que son conocidos por el experto en la materia. El kit o composiciones diagnósticas puede utilizarse para la detección de uno o más alelos variantes según los métodos de la invención indicados en la presente memoria, utilizando, por ejemplo, técnicas de amplificación tales como las indicadas en la presente memoria.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, en una realización adicional de la presente exposición se proporciona un kit útil para poner en práctica los métodos indicados en la presente memoria, que comprenden oligonucleótidos o polinucleótidos capaces de determinar el genotipo de uno o más SNP. Los oligonucleótidos o polinucleótidos pueden comprender cebadores y/o sondas.

La presente invención se describe en mayor detalle en referencia a las figuras y ejemplos no limitativos siguientes.

Ejemplos

Ejemplo 1:

La determinación genética puede influir sobre la sensibilidad del endotelio al VEGF. De acuerdo con lo anterior y en el contexto de la presente invención, los presentes inventores exploraron la variabilidad en las rutas de señalización subyacentes con el fin de identificar patrones predictivos para el tratamiento antiangiogénico y del desarrollo de hipertensión bajo este régimen terapéutico. En este análisis, se evaluó en 5 ensayos diferentes la correlación entre la

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variabilidad genética en la ruta de señalización de VEGF-A con el resultado clínico de pacientes con diferentes cánceres primarios avanzados. Los cinco ensayos eran ensayos paralelos y aleatorizados que pretendían investigar la eficacia y seguridad de BEV (bevacizumab) en sujetos con cáncer colorrectal metastásico (NO16966), cáncer pancreático metastásico (AVITA), cáncer pulmonar de células no pequeñas no escamosas avanzado o recurrente (AVAIL), cáncer renal metastásico (AVOREN) y cáncer mamario metastásico negativo para HER2 (AVADO).

En la totalidad de los cinco ensayos, se incluyó el muestreo opcional de biomarcadores de ADN para el análisis de los SNP. En total, se dispuso de ADN de línea germinal de 1.346 pacientes. Los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) comunes situados en los factores 1α y 2α inducibles por hipoxia, VEGF-A, sus receptores (VEGFR-1 y VEGFR-2) y otros genes relevantes, se seleccionaron basándose en la literatura y utilizando un enfoque de etiquetado de los SNP (f≥0,1 y r2≤0,8). Se genotiparon con éxito 157 SNP utilizando espectrometría de masas MALDI-TOF. Se calcularon estimaciones de riesgo y supervivencia utilizando análisis de regresión de Cox.

Se llevaron a cabo dos tipos de análisis.

1.: 1. Correlación de los marcadores genéticos con PFS y OS.

2.: 2. Correlación de los marcadores genéticos con hipertensión, no clasificada como "no relacionada con el fármaco de estudio"

El SNP rs699946 (SEC ID nº 1), situado en el promotor de VEGF-A, se encontraba asociado a una PFS mejorada en sujetos tratados con bev con un HR alélico de 1,26 (IC al 95% 1,07-1,48, p=0,005). No se observó ningún efecto en los sujetos tratados con placebo, sugiriendo que rs699946 (SEC ID nº 1) podría ser un marcador predictivo de resultado favorable del tratamiento con bevacizumab. Además, el SNP rs11133360 (SEC ID nº 5), situado en el promotor de VEGFR2, se encontraba asociado a una PFS mejorada en sujetos tratados con bevacizumab con un HR alélico de 1,15 (IC al 95% 1,02-1,30, p=0,02). En términos de OS, el SNP rs12505758 (SEC ID nº 2) en VEGFR2 era el más significativamente asociado a una OS mejorada en pacientes tratados con bev (HR alélico=1,50, IC al 95% 1,21-1,86, p=0,0002). No se observaron efectos para rs12505758 (SEC ID nº 2) en pacientes tratados con placebo.

Diez SNP se encontraban asociados a hipertensión inducida por bevacizumab (p<0,05), pero ninguno de ellos sobrepasó el umbral para los ensayos múltiples (p<0,0003). Los dos SNP que mostraban la asociación más fuerte (p<0,01) fueron: rs2305949 (SEC ID nº 3) en KDR (OR alélico=0,93, IC al 95% 0,88-0,98, p=0,0067) y rs4444903 (SEC ID nº 4) en EGF (OR alélico=1,06, IC al 95% 1,02-1,11, p=0,0052). Resulta interesante que rs2305949 (SEC ID n 3) y rs4444903 (SEC ID nº 4) se encontraban estrechamente asociados a cambios de aminoácidos en las posiciones 273 y 708 de KDR y EGF, sugiriendo que estos cambios podrían afectar funcionalmente a ambos genes y contribuir de esta manera a la hipertensión. Cabe destacar que rs11064560 en WNK1 también se encontraba asociado a hipertensión inducida por bevacizumab (OR alélico=1,06, IC al 95% 1,01-1,10, p=0,02), corroborando de esta manera observaciones previas en un número limitado de pacientes [Frey et al., J. Clin. Oncol. 26: (supl. de 20 de mayo, resumen 11003), 2008].

PACIENTES Y MÉTODOS

Muestras

Los protocolos de la totalidad de los 5 ensayos fueron aprobadas por un comité de revisión institucional en cada sitio y pusieron en práctica de acuerdo con la Declaración de Helsinki, buenas prácticas clínicas vigentes de la US Food and Drug Administration y los requisitos éticos y legales exigidos localmente. En total se genotiparon 1.346 sujetos. De entre estos sujetos, 1.225 eran de raza blanca y 121 no eran de raza blanca. Debido a que los pacientes no de raza blanca son genéticamente diferentes de los pacientes de raza blanca y las frecuencias de SNP podrían ser diferentes entre ambos grupos étnicos, los pacientes no de raza blanca fueron omitidos de los análisis posteriores. Todos los pacientes proporcionaron su consentimiento informado para los ensayos de biomarcadores genéticos.

Evaluaciones

Los pacientes se evaluaron según el protocolo de estudio descrito en las referencias siguientes:

 AVITA: Van Cutsem et al., J. Clinc. Oncol. 27, 2231-7 (2009)

 AVAIL: Reck M, von Pawel J, Zatloukal P, et al. Phase III trial of cisplatin plus gemcitabine with either placebo

or bevacizumab as first-line therapy for nonsquamous non-small-cell lung cancer: AVAiL. J Clin Oncol

2009;27(8):1227-34

 AVOREN: Escudier B, Pluzanska A, Koralewski P, Ravaud A, Bracarda S, Szczylik C, et al. Bevacizumab plus

interferon alfa-2a for treatment of metastatic renal cell carcinoma: a randomised, double-blind phase III trial.

Lancet. 2007;370(9605):2103-2111

 AVADO: Miles DW, et al., J Clin Oncol 2010a;28(20):3239-47

 NO16966: Saltz LB, Clarke S, Diaz-Rubio E, et al. Bevacizumab in combination with oxaliplatin-based

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Respecto a los portadores de AA, la HR para los portadores de rs699946 (SEC ID nº 1) AG era de 1,26 (IC al 95% 1,07-1,48, p=0,005). Esto significa que cada alelo G adicional se encontraba asociado a un incremento de 27% del riesgo de progresión o muerte. No se observó ningún efecto en los sujetos tratados con placebo, sugiriendo que rs699946 (SEC ID nº 1) podría ser un marcador predictivo de resultado favorable del tratamiento con bevacizumab.

Tal como se muestra en la figura 6, se observaron efectos consistentes para rs699946 (SEC ID nº 1) en todos los estudios excepto en AVOREN/BO17705 (cáncer renal), el estudio más pequeño bajo consideración.

Además, el rs11133360 (SEC ID nº 5) se encontraba débilmente asociado (p=0,02) a la PFS (figura 13).

Marcador: Chr BP MAF N HR IC al 95% Valor de p Gen

rs11133360: Chr4 55982752 0,45 579 1,15 (1,02,1,30) 0,02 KDR

Respecto a los portadores de TT, la HR para los portadores de rs11133360 (SEC ID nº 5) CT era de 1,15 (IC al 95% 1,02-1,30, p=0,02). Esto significa que cada alelo C adicional se encontraba asociado a un incremento de 15% del riesgo de progresión o muerte.

Análisis de supervivencia global

Análisis en el subgrupo de pacientes tratados con bevacizumab

En el análisis de asociaciones para la OS, 6/133 marcadores presentaba p<0,05 en los sujetos blancos tratados. Uno de ellos, rs12505758 (SEC ID nº 2) era significativo tras el ajuste de Bonferroni para 158 ensayos. El marcador es un SNP intrónico en KDR (receptor con dominio insertado de quinasa, VEGFR2, FLK1) y se encuentra en LD (r2=0,31) con otro SNP intrónico, rs1531289 en el gen (fuente: HapMap compilación 22; el marcador no se encuentra disponible en HapMap v3 compilación 2). El marcador no se encuentra asociado en sujetos blancos tratados con placebo, por lo tanto puede decirse que presenta cualidades predictivas, pero no pronósticas. Una inspección del gráfico Forest (figura 7) muestra que el efecto se encuentra controlado principalmente por NO16966 (cáncer colorrectal) y BO17705 (AVOREN, cáncer renal). El efecto es débil o nulo en los otros tres estudios.

Marcador: Chr BP MAF N HR IC al 95% Valor de p Gen

rs12505758: Chr4 55966898 0,12 581 1,50 (1,21, 1,86) 2,00E-04 KDR

Respecto a los portadores de TT, la HR para los portadores de rs12505758 (SEC ID nº 2) TC era de HR alélica=1,50 (IC al 95% 1,21-1,86, p=0,0002). Esto significa que cada alelo C adicional se encontraba asociado a un incremento de 50% del riesgo de muerte. No se observaron efectos para rs12505758 (SEC ID nº 2) en pacientes tratados con placebo.

Los gráficos de Kaplan-Meier muestran una proporción de riesgos estimada creciente a medida que crece el número de copias del alelo menor (figura 8).

Información adicional sobre los SNP

Debido a que el SNP rs699946 (SEC ID nº 1) se encuentra localizado en el promotor de VEGF, los presentes inventores examinaron su efecto sobre la expresión de VEGF-A en las muestras de plasma humano. Los presentes inventores encontraron que los portadores de GG presentaban una mediana de expresión de VEGF incrementada en 27% en comparación con los portadores de AG y AA (tipo salvaje). El alelo menor de rs699946 (SEC ID nº 1) se encontraba ligado al alelo menor de rs699947 (D'=0,98, r2=0,23), que es otro SNP de promotor de VEGF que previamente se ha demostrado que se asocia a la respuesta a la terapia con bevacizumab [Schneider et al., J. Clin. Oncol. 26:4672, 2008]. Además, rs699946 (SEC ID nº 1) también se encuentra ligado a rs833058 (-6589 C>T), que emergió como el segundo resultado en VEGF para la PFS en el metaanálisis (D'=0,95, r2=0,35).

Conclusión de la investigación adicional: Los presentes inventores demostraron que el alelo G de rs699946 (SEC ID nº 1) en el promotor de VEGF-A se asocia a una expresión plasmática incrementada de VEGF-A y que rs699946 (SEC ID nº 1) se encuentra ligado a rs699947, otro SNP de promotor de VEGF-A que previamente se ha demostrado que se encuentra asociado a la respuesta al bevacizumab (Schneider et al.).

El rs11133360 (SEC ID nº 5) en VEGFR-2 es un SNP intrónico situado entre los exones que codifica los dominios extracelulares de la proteína VEGFR-2. Los presentes inventores encontraron que las HUVEC homocigóticas para el alelo C menor presentaban una proliferación incrementada al estimularlas con VEGF en comparación con los portadores de CT y TT. Resulta importante que rs11133360 también se encuentra fuertemente ligado a rs2305948 (D'=1), un SNP no sinónimo que induce la sustitución Val297Ile y que se ha informado que afecta a la unión de VEGF a VEGFR-2.

Claims

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